DE212016000092U1 - Vorrichtungen zum Nachweis von Biomarkern - Google Patents

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Abstract

Eine Vorrichtung, die Folgendes beinhaltet: eine Scheibe, die eine Vielzahl mikrofluidischer Kanäle einschließt, die sich in einer radialen Richtung aus der Scheibe erstrecken, wobei die mikrofluidischen Kanäle eine Vielzahl von Fängermolekülen, die für mindestens einen Biomarker spezifisch sind, beinhalten, wobei jedes Fängermolekül von der Vielzahl von Fängermolekülen an ein Partikel angeheftet ist.

Description

  • Nach den Bestimmungen des Gebrauchsmustergesetzes unterliegen nur Geräte und Vorrichtungen, wie sie in den anliegenden Schutzansprüchen definiert sind, dem Schutz und dem Gebrauchsmuster, nicht aber Verfahren. Soweit in der nachstehenden Beschreibung gegebenenfalls auf Verfahren Bezug genommen wird, dienen diese Hinweise nur zur exemplarischen Erläuterung der mit den anliegenden Schutzansprüchen geschützten Vorrichtungen und Geräte.
  • Diese Anmeldung beansprucht den Vorteil der Priorität auf die vorläufige US-Patentanmeldung Nr. 62/157,878, eingereicht am 6. Mai 2015, die vorläufige US-Patentanmeldung Nr. 62/183,294, eingereicht am 23. Juni 2015, und die vorläufige US-Patentanmeldung Nr. 62/202,353, eingereicht am 7. August 2015, die jeweils durch Bezugnahme in vollem Umfang in dieses Dokument aufgenommen wird.
  • FACHGEBIET
  • Die vorliegende Offenbarung bezieht sich im Allgemeinen auf den Nachweis von Biomarkern, die mit einem Gesundheitszustand assoziiert sind, z. B. zur Unterstützung bei einer medizinischen Untersuchung und/oder Diagnose.
  • ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
  • Biomarker können nützliche Indikatoren einer potentiellen Krankheit sein. Bei Erkrankungen können jedoch zahlreiche biochemische Spezies und Reaktionen beteiligt sein. Zum Beispiel ist Brustkrebs eine komplexe Erkrankung, die mehrere Wege zum Erzeugen des gleichen Stadiums der Erkrankung mit ähnlichen Symptomen für den Patienten aufweisen kann. Forscher haben zwar nach neuen Biomarkern gesucht, aber die Fähigkeit, auf verschiedene Erkrankungen zu untersuchen, bleibt weiterhin beschränkt. Es liegen Berichte für Krebsantigen 125 (CA 125) und karzinoembryonales Antigen (CEA) als Biomarker für Eierstock- bzw. Kolorektalkrebs vor, während für Brustkrebs bislang noch kein einzelner Biomarker identifiziert worden ist. Die Forschungsarbeit im Verlauf des letzten Jahrzehnts war darauf konzentriert, neue Biomarker zu entdecken, um eine genaue Diagnose von Erkrankungen bereitzustellen, die therapeutische Entscheidungsfindung zu leiten und künftige Erkrankungsmuster vorherzusagen. Bei einigen Erkrankungen wie Brustkrebs handelt es sich jedoch möglicherweise nicht um eine einzelne Erkrankung, sondern um eine genetisch heterogene Gruppe von Erkrankungen. Für solche Zustände kann die Diagnose mit einem einzelnen Biomarker schwierig oder unmöglich sein.
  • ZUSAMMENFASSUNG
  • Die vorliegende Offenbarung schließt eine Vorrichtung ein, die eine Scheibe beinhaltet, die eine Vielzahl mikrofluidischer Kanäle einschließt, die sich in einer radialen Richtung aus der Scheibe erstrecken, wobei die mikrofluidischen Kanäle eine Vielzahl von Fängermolekülen, die für mindestens einen Biomarker spezifisch sind, beinhalten, wobei jedes Fängermolekül von der Vielzahl von Fängermolekülen an ein Partikel angeheftet ist. Die Scheibe kann zum Beispiel von 1 bis 100 mikrofluidische Kanäle, wie etwa von 12 bis 60 mikrofluidische Kanäle, einschließen. In einigen Aspekten kann die Vielzahl mikrofluidischer Kanäle einen ersten Kanal, der eine Vielzahl von ersten Fängermolekülen einschließt, die für einen ersten Biomarker spezifisch sind, und einen zweiten Kanal, der eine Vielzahl von zweiten Fängermolekülen einschließt, die für einen zweiten, von dem ersten Biomarker verschiedenen Biomarker spezifisch sind, beinhalten. Ferner kann zum Beispiel die Vielzahl mikrofluidischer Kanäle einen ersten mikrofluidischen Kanal, der einen ersten Satz von für einen ersten Biomarker spezifischen Fängermolekülen enthält, einen zweiten mikrofluidischen Kanal, der einen zweiten Satz von für einen zweiten, von dem ersten Biomarker verschiedenen Biomarker spezifischen Fängermolekülen enthält, und einen dritten mikrofluidischen Kanal, der einen dritten Satz von für einen dritten, von dem ersten Biomarker und dem zweiten Biomarker verschiedenen Biomarker spezifischen Fängermolekülen enthält, einschließen. Zusätzlich oder alternativ kann die Scheibe mindestens einen Probeneinlass beinhalten, der zum Trennen einer Rohprobe in eine oder mehr Komponenten, wie z. B. zum Trennen des Plasmas von Vollblut, ausgelegt ist.
  • Gemäß einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung kann jedes Fängermolekül an ein Mikrokügelchen angeheftet sein, das einen durchschnittlichen Durchmesser im Bereich von 100 nm bis 10 μm, wie z. B. einen durchschnittlichen Durchmesser von etwa 1 μm aufweist. Jedes Fängermolekül von der Vielzahl von Fängermolekülen kann zum Beispiel einen Antikörper beinhalten, der für mindestens einen Biomarker spezifisch ist. In mindestens einem Beispiel kann jedes Fängermolekül einen Antikörper beinhalten, der für nur einen Biomarker spezifisch ist. In einigen Aspekten kann die Vielzahl von Fängermolekülen Fängermoleküle einschließen, die für Biomarker spezifisch sind, die aus humanem Östrogenrezeptor 2 (Her-2), Matrix-Metallopeptidase-2 (MMP-2), Krebsantigen 15-3 (CA 15-3), Gefäßendothel-Wachstumsfaktor (VEGF) oder Osteopontin (OPN) ausgewählt sind. Zum Beispiel kann die Vielzahl von Fängermolekülen Fängermoleküle einschließen, die für Her-2, MMP-2, CA 15-3 und OPN spezifisch sind. In einigen Aspekten kann die Vielzahl von Fängermolekülen Fängermoleküle einschließen, die für Biomarker spezifisch sind, die aus humanem Östrogenrezeptor 2 (Her-2), Matrix-Metallopeptidase-2 (MMP-2), Krebsantigen 15-3 (CA 15-3), Gefäßendothel-Wachstumsfaktor (VEGF), Osteopontin (OPN), Tumorprotein p53 (p53), Krebsantigen 125 (CA 125), karzinoembryonalem Antigen (CEA) oder Serum-Östrogenrezeptor (SER) ausgewählt sind. Zum Beispiel kann die Vielzahl von Fängermolekülen mindestens einen Antikörper einschließen, der aus den Antikörpern Klon 191924, Klon 36006.211, Klon M8071022 oder Klon 190312 ausgewählt ist. Die Vielzahl von Fängermolekülen kann mindestens ein Fängermolekül oder mehrere Fängermoleküle einschließen, das oder die von einem Blocker blockiert wird oder werden.
  • Gemäß einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung kann die Vielzahl mikrofluidischer Kanäle eine Vielzahl von Nachweismolekülen beinhalten, wobei jedes Nachweismolekül eine nachweisbare Markierung einschließt. In einigen Beispielen kann die Vorrichtung auch eine Energiequelle und/oder einen Detektor, z. B. zum Nachweis des mindestens einen Biomarkers, beinhalten. Zum Beispiel kann der Nachweis darauf ausgelegt sein, Fluoreszenz und/oder Chemilumineszenz nachzuweisen.
  • Die vorliegende Offenbarung schließt ferner Verfahren zum Nachweis von Biomarkern unter Verwendung einer Vorrichtung mit einer beliebigen Kombination der oben besprochenen Merkmale ein. Das Verfahren kann zum Beispiel Folgendes beinhalten: Einführen einer Fluidprobe in mindestens einen mikrofluidischen Kanal der Scheibe; Drehen der Scheibe, so dass die Fluidprobe radial nach außen durch den mindestens einen mikrofluidischen Kanal fließt, um sich mit mindestens einem von der Vielzahl von Fängermolekülen zu vereinigen; und Nachweisen eines Signals von der Scheibe, das einen Hinweis auf ein Vorhandensein von mindestens einem Biomarker der Fluidprobe liefert. Die Fluidprobe kann eine Vielzahl von Biomarkern, die mit einem Gesundheitszustand assoziiert sind, beinhalten. In mindestens einigen Beispielen kann es sich bei dem Gesundheitszustand um Krebs, z. B. Brustkrebs, handeln.
  • Gemäß einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung kann die Fluidprobe, die in den (die) mikrofluidischen Kanal (Kanäle) der Scheibe eingeführt wird, mindestens einen Biomarker beinhalten, der aus humanem Östrogenrezeptor 2 (Her-2), Matrix-Metallopeptidase-2 (MMP-2), Krebsantigen 15-3 (CA 15-3), Gefäßendothel-Wachstumsfaktor (VEGF), Osteopontin (OPN), Tumorprotein p53 (p53), Krebsantigen 125 (CA 125), karzinoembryonalem Antigen (CEA) oder Serum-Östrogenrezeptor (SER) ausgewählt ist. Zum Beispiel kann die Vielzahl von Fängermolekülen Fängermoleküle einschließen, die für mit Brustkrebs assoziierte Biomarker spezifisch sind, wie z. B. Fängermoleküle, die für mindestens einen Biomarker, ausgewählt aus humanem Östrogenrezeptor 2 (Her-2), Matrix-Metallopeptidase-2 (MMP-2), Krebsantigen 15-3 (CA 15-3), Gefäßendothel-Wachstumsfaktor (VEGF), Osteopontin (OPN), Tumorprotein p53 (p53), Krebsantigen 125 (CA 125), karzinoembryonalem Antigen (CEA) oder Serum-Östrogenrezeptor (SER), spezifisch ist.
  • In einigen Aspekten kann die Fluidprobe Blut beinhalten oder aus Blut erhalten werden. Zum Beispiel kann die Fluidprobe menschliches Blut, menschliches Blutplasma oder menschliches Blutserum beinhalten. In einigen beispielhaften Verfahren der vorliegenden Offenbarung kann das Nachweisen des Signals von der Scheibe das Nachweisen eines Fluoreszenzsignals eines Nachweismoleküls, das an den mindestens einen Biomarker in der Fluidprobe angeheftet ist, einschließen. Zusätzlich oder alternativ kann das Nachweisen des Signals von der Scheibe das Nachweisen von Chemilumineszenz einschließen. Ferner kann das Nachweisen des Signals von der Scheibe zum Beispiel das Analysieren der Fluidprobe mit einem optischen Lesegerät einschließen, um ein Vorhandensein oder Fehlen des mindestens einen Biomarkers in der Fluidprobe zu ermitteln. Das Vorhandensein des mindestens einen Biomarkers kann einen Hinweis auf eine medizinische Diagnose einer Erkrankung liefern. Zum Beispiel kann der mindestens eine Biomarker eine Vielzahl von mit Brustkrebs assoziierten Biomarkern einschließen. In einigen Aspekten kann das Verfahren das Vergleichen eines Spiegels von jedem Biomarker von der Vielzahl von Biomarkern in einer ersten von einem Individuum erhaltenen Fluidprobe mit einem Spiegel von jedem Biomarker von der Vielzahl von Biomarkern in einer zweiten von einem Individuum erhaltenen Fluidprobe einschließen. Die erste und zweite Fluidprobe können von dem Individuum erhalten werden, nachdem ein Zeitraum, wie etwa eine oder mehr Wochen oder ein oder mehr Monate, verstrichen ist. Zum Beispiel kann die erste Fluidprobe mindestens eine Woche, bevor die zweite Fluidprobe von dem Individuum erhalten wird, von dem Individuum erhalten worden sein. Eine Differenz der Spiegel von einem oder mehr Biomarkern kann einen Hinweis auf eine medizinische Diagnose einer Erkrankung und/oder auf ein Fortschreiten der Erkrankung im Laufe der Zeit liefern.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die beigefügten Zeichnungen, die in diese Offenbarung aufgenommen worden sind und einen Teil dieser Offenbarung darstellen, veranschaulichen verschiedene Ausführungsbeispiele und dienen zusammen mit der Beschreibung dazu, die Prinzipien der offenbarten Ausführungsformen zu erläutern. Alle Merkmale einer hierin beschriebenen Ausführungsform (z. B. Zusammensetzung, medizinische Vorrichtung, Behandlungsverfahren usw.) können mit einer anderen Ausführungsform kombiniert werden und sind im Rahmen der vorliegenden Offenbarung eingeschlossen.
  • 1 zeigt eine beispielhafte mikrofluidische Scheibe in Übereinstimmung mit einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung.
  • 2 zeigt eine beispielhafte mikrofluidische Scheibe in Übereinstimmung mit einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung.
  • 3 ist eine Schemazeichnung, die die Fängermoleküle, die an ein Mikrokügelchen angeheftet sind, in Übereinstimmung mit einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung veranschaulicht.
  • 4 ist eine Schemazeichnung eines beispielhaften Assays unter Verwendung einer mikrofluidischen Scheibe in Übereinstimmung mit einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung.
  • 5 zeigt beispielhafte Komponenten einer Vorrichtung in Übereinstimmung mit einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung.
  • 6 zeigt einen beispielhaften Behälter einer Vorrichtung in Übereinstimmung mit einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung.
  • 7 ist ein Schaubild, das Fluoreszenzmessungen für Krebsantigen 15-3 (CA 15-3) zeigt.
  • 8 ist ein Schaubild, das Fluoreszenzmessungen für Matrix-Metallopeptidase-2 (MMP-2) zeigt.
  • 9 ist ein Schaubild, das Fluoreszenzmessungen für humanen Östrogenrezeptor 2 (Her-2) zeigt.
  • 10 ist ein Schaubild, das Fluoreszenzmessungen für Osteopontin (OPN) zeigt.
  • 11 ist ein Schaubild, das Fluoreszenzmessungen für Gefäßendothel-Wachstumsfaktor (VEGF) zeigt.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
  • Die Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung können einen bestehenden Bedarf an alternativen Untersuchungs- und Diagnosemöglichkeiten decken, indem sie mehrere, gegenseitig komplementäre Biomarker für einen empfindlichen diagnostischen Assay bereitstellen. Die Aspekte der vorliegenden Offenbarung können bestimmte Vorteile bei der Untersuchung von Patienten, u. a. von großen Populationen, auf Brustkrebs und andere Erkrankungen und Gesundheitszustände bieten.
  • Die vorliegende Offenbarung schließt das Verwenden eines Panels von mehreren Biomarkern ein, um z. B. die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass der Eintritt verschiedener Gesundheitszustände nachgewiesen wird. Das gleichzeitige Testen eines Panels von zwei oder mehr Biomarkern kann einen kombinierten Effekt mit einem größeren als dem von einem einzelnen Biomarker gebotenen Vorhersagewert bereitstellen. Die Panels von hierin beschriebenen Biomarkern können mit einer geeigneten Analyseplattform analysiert werden. In einigen Fällen ist nur eine geringe Menge der Probe von einem Patienten, wie z. B. Blut, Plasma oder eine andere geeignete Fluid- oder Gewebeprobe, erforderlich. Beispiele für geeignete Vorrichtungen sind insbesondere mikrofluidische Vorrichtungen, wie etwa die Vorrichtung Pandora CDx (POC Medical Systems) und andere mikrofluidische Plattformen. 1 und 2 zeigen beispielhafte Scheiben, die mikrofluidische Kanäle gemäß einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung beinhalten und unten besprochen werden. In mindestens einem Beispiel beinhaltet ein Array für Brustkrebs mehrere zur Analyse auf einer mikrofluidischen Vorrichtung geeignete Biomarker.
  • Die Singularformen „ein“, „eine“ und „der/die/das“ schließen die Bezugnahme auf die Pluralformen ein, wenn nichts anderes aus dem Kontext hervorgeht.
  • Die Begriffe „ungefähr“ und „etwa“ beziehen sich darauf, dass etwas fast das Gleiche ist wie eine angegebene Zahl oder ein angegebener Wert. Wie hierin verwendet, sollten die Begriffe „ungefähr“ und „etwa“ im Allgemeinen so verstanden werden, dass sie ±5% einer angegebenen Menge oder eines angegebenen Werts umfassen.
  • Die Aspekte der vorliegenden Offenbarung schließen das Testen einer biologischen Probe von einem Individuum auf einen oder mehr Biomarker ein, die mit einem Gesundheitszustand, wie etwa mit einer Erkrankung, assoziiert sind. Ferner können gemäß einigen Aspekten Daten zum Vorhandensein oder Fehlen verschiedener Biomarker sowie zu der Menge oder dem Spiegel jedes in der Probe vorhandenen Biomarkers analysiert werden, um diagnostische Informationen für das Individuum zu erhalten. Die Daten gestatten es möglicherweise, zu ermitteln, wie wahrscheinlich es ist, dass die Diagnose korrekt ist.
  • Eine Probe kann von einem beliebigen Individuum von Interesse erhalten oder gewonnen werden, einschließlich Säugerindividuen wie z. B. menschlichen Individuen, z. B. Patienten. Zu den Säugerindividuen zählen sowohl menschliche als such nicht-menschliche Wesen. Beispielhafte Säuger, für die Proben gemäß den Verfahren hierin analysiert werden können, sind insbesondere Menschen, nicht menschliche Primaten, Hunde, Katzen, Mäuse Rinder, Pferde und Schweine.
  • Eine Probe kann Blut und/oder andere flüssige Proben biologischen Ursprungs, feste Gewebeproben wie etwa eine Biopsieprobe, Gewebekultur oder daraus gewonnene Zellen sowie deren Nachkommenschaft beinhalten. Eine Probe kann eine einzelne Zelle oder mehr als eine einzelne Zelle, z. B. eine Vielzahl von Zellen beinhalten. Proben können klinische Proben, Zellen in Kulturen, Zellüberstände und/oder Zelllysate einschließen. In einigen Aspekten kann eine Probe krebsartigen Ursprungs sein, z. B. kann sie aus krebsartigen Geweben erhalten worden sein. Zum Beispiel kann die Probe aus krebsartigen Brustgeweben erhalten worden sein.
  • In einigen Aspekten kann eine Probe durch eine oder mehrere Verfahrensweisen oder Behandlungsschritte manipuliert oder verarbeitet werden, nachdem sie von einem Individuum beschafft worden sind. Zum Beispiel kann eine Probe mit einem oder mehr Reagenzien behandelt, verflüssigt und/oder für bestimmte Komponenten angereichert werden. Zum Anreichern einer Probe kann zum Beispiel das Konzentrieren von einem oder mehr Bestandteilen der Probe zählen, um beim Nachweis, bei der Analyse und/oder Identifikation dieses Bestandteils zu helfen. In mindestens einem Beispiel kann eine Probe auf ein oder mehr Zielproteine und/oder Polynucleotide angereichert werden, bevor die Probe den Fängermolekülen ausgesetzt wird, um das (die) Ziel(e) zu binden und nachzuweisen.
  • Der Begriff „Biomarker“ bezieht sich im Allgemeinen auf einen chemischen oder biochemischen Indikator, der mit einem oder mehr Gesundheitszuständen assoziiert ist. Ein Biomarker kann insbesondere ein Molekül von Interesse oder ein Anteil eines Moleküls von Interesse sein, das nachgewiesen und/oder analysiert werden soll. Beispielhafte Biomarker sind u. a. beispielsweise Peptide, Proteine, DNA-Sequenzen und RNA-Sequenzen. Die Begriffe „Polypeptid“, „Oligopeptid“, „Peptid“ und „Protein“ können hierin austauschbar verwendet werden, um auf Polymere von Aminosäuren beliebiger Länge Bezug zu nehmen, die eventuell chemische Modifikationen einschließen können. Ein solches Polymer kann linear oder verzweigt sein, kann modifizierte Aminosäuren beinhalten und/oder kann von Nicht-Aminosäuren unterbrochen sein. Die Aminosäurepolymere können natürlich modifiziert oder durch eine Intervention modifiziert werden. Zum Beispiel kann das Modifizieren der Aminosäurepolymere gemäß der vorliegenden Offenbarung durch Bilden einer Disulfidbindung, durch Glycosylierung, Lipidierung, Acetylierung, Phosphorylierung oder eine andere Manipulation oder Modifikation, wie etwa Konjugation mit einer Markierungskomponente, erfolgen. Die Aminosäurepolymere können Polypeptide, die ein oder mehr Analoga einer Aminosäure beinhalten (zum Beispiel einschließlich unnatürlichen Aminosäuren), sowie andere chemische/biochemische auf dem Fachgebiet bekannte Modifikationen einschließen.
  • Zu den Biomarkern gemäß der vorliegenden Offenbarung zählen genetische Marker, z. B. DNA-Sequenzen eines Organismus, die nützlich sein können, um die Charakteristika dieses Organismus zu identifizieren. Zum Beispiel können zu den genetischen Markern, die mit einer Erkrankung oder einem anderen Gesundheitszustand assoziiert sind, eine oder mehr Änderungen, Variationen und/oder Mutationen einer DNA-Sequenz, verglichen mit einer DNA-Sequenz, die nicht mit der Erkrankung oder dem anderen Gesundheitszustand assoziiert ist, zählen. Ein Biomarker oder eine Kombination von Biomarkern kann mit einem bestimmten körperlichen Zustand oder Gesundheitszustand, z. B. mit einer Erkrankung oder einem Erkrankungsstatus, assoziiert sein. Zum Beispiel kann der oder können die Biomarker mit Brustkrebs, z. B. Brustkrebs im Spätstadium, assoziiert sein.
  • Zu den Biomarkern die gemäß der vorliegenden Offenbarung nachgewiesen und/oder analysiert werden können, zählen insbesondere Folgende: humaner Östrogenrezeptor 2 (Her-2), Matrix-Metallopeptidase-2 (MMP-2), Matrix-Metalloproteinase 9 (MMP-9), Krebsantigen 15-3 (CA 15-3), Krebsantigen 125 (CA 125), Krebsantigen 27.29 (CA 27.29), karzinoembryonales Antigen (CEA), Gefäßendothel-Wachstumsfaktor (VEGF), epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF), tumorspezifischer Wachstumsfaktor (TSGF), tumorspezifischer Wachstumsfaktor (TSGF), Osteopontin (OPN), Tumorprotein p53 (p53), Serum-Östrogenrezeptor (SER), Serum-Progesteronrezeptor (SPR), BRCA-1-Protein, BRCA-2-Protein, prostataspezifisches Antigen (PSA), Troponin T, Troponin I, C-reaktives Protein (CRP), Homocystein, Myoglobin, Kreatinkinase, adrenocorticotropes Hormon (ACTH), Alpha-Fetoprotein (AFP), Anterior-Gradient 3 (AGR3), Apolipoprotein A1 (Apo-A1), D-Dimer (DD), Dermcidin, hochmolekulares Kininogen (HMWK), Leptin, Myeloperoxidase (MPO), makrophagenmigrationshemmender Faktor (MIF), mit mucinartigem Karzinom assoziiertes Antigen (MCA), Plasminogenaktivator-Inhibitor-1 (PAI-1), Prolactin, löslicher CD40-Ligand (sCD40L), löslicher epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor (sEGFR), lösliches Gefäßzell-Adhäsionsmolekül 1 (sVCAM-1), löslicher Gefäßendothel-Wachstumsfaktorrezeptor 1 (sVEGFR1), löslicher Gefäßendothel-Wachstumsfaktorrezeptor 2 (sVEGFR2), Gewebepolypeptidantigen (TPA), Thymidylatsynthase (TS), Urokinase-Plasminogenaktivator (uPA), Vitamin-D-bindendes Protein (VDBP) und Vitronectin (VN). Diese Biomarker können Fragmente, Spleißvarianten und/oder Peptide voller Länge oder beliebige andere Variationen einschließen. Es versteht sich, dass die vorliegende Offenbarung nicht auf die aufgelisteten Biomarker beschränkt ist und dass zusätzliche Biomarker für die hierin beschriebenen Systeme, Vorrichtungen und Verfahren eingeschlossen sind und erwogen werden.
  • Der Begriff „Fängermolekül“ bezieht sich im Allgemeinen auf ein Molekül, das an ein Ziel binden kann (z. B. an ein Zielmolekül, wie etwa einen Biomarker). Zum Beispiel kann ein Fängermolekül eine Bindungsstelle oder eine Vielzahl von zwei oder mehr Bindungsstellen aufweisen. Die Fängermoleküle gemäß der vorliegenden Offenbarung können in der Lage sein, nur an ein Ziel zu binden (z. B. bei einem Fängermolekül, das nur für ein bestimmtes Ziel spezifisch ist), an eine ausgewählte Zahl von Zielen zu binden (z. B. bei einem Fängermolekül, das für zwei oder mehr Ziele spezifisch ist) oder an eine Vielzahl von Ziel- und Nicht-Zielspezies zu binden.
  • In einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung kann ein Biomarker an ein Fängermolekül binden. Es wird von einem Molekül oder einer anderen chemischen/biochemischen Spezies gesagt, dass sie „Bindung“ zeigt, wenn dieses oder diese häufiger, rascher, mit längerer Dauer und/oder größerer Affinität mit einem oder mehr bestimmten Ziel(en) reagiert (reagieren) oder assoziiert ist (sind) als mit alternativen Substanzen (z. B. anderen Zielen oder Nicht-Zielspezies). Zum Beispiel kann ein Fängermolekül an ein Ziel „binden“, wenn es mit größerer Affinität, Avidität, leichter und/oder mit längerer Dauer an dieses anheftet als an andere Substanzen. In mindestens einem Beispiel kann das Fängermolekül ein Antikörper sein, der spezifisch oder mindestens bevorzugt an ein Ziel bindet (z. B. ein Antigen, für das der Antikörper spezifisch ist), und zwar mit größerer Affinität, Avidität, leichter und/oder mit längerer Dauer als der Antikörper an andere Substanzen bindet (z. B. an Nicht-Zielpeptide oder -proteine). Ein Fängermolekül, das spezifisch oder bevorzugt an ein erstes Ziel bindet, kann, muss aber nicht spezifisch oder bevorzugt an ein zweites Ziel binden. In einigen Aspekten kann zum Beispiel ein Fängermolekül an zwei oder mehr Ziele binden, wobei die Art der Bindung mit jedem Ziel etwa gleich sein kann oder verschieden sein kann (z. B. kann das Fängermolekül größere Affinität für ein Ziel als für ein anderes Ziel aufweisen). Als solches ist für die „Bindung“ nicht unbedingt eine ausschließliche Bindung erforderlich (diese kann aber eingeschlossen sein). In einigen Aspekten kann eine Bezugnahme auf „Bindung“ sich auf eine bevorzugte Bindung beziehen, z. B. eine Bevorzugung einer Reaktion oder Assoziierung mit einem oder mehr Zielen im Vergleich mit anderen Spezies oder Substanzen. Es versteht sich auch, dass das Konzept der „Bindung“ das Konzept der Spezifität einschließt, z. B. selektive Anheftung zwischen zwei Spezies (z. B. einem Fängermolekül und einem Ziel). Eine spezifische Bindung kann biochemisch als sättigungsfähig charakterisiert sein (da die nicht spezifische Bindung nicht sättigungsfähig ist). Ferner können die Ziele gemäß einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung um Bindung an eine oder mehr spezifische Bindungsstellen eines Fängermoleküls konkurrieren. Die kompetitive Bindung kann biochemisch demonstriert werden.
  • Das (die) Fängermolekül(e) können zum Beispiel einen oder mehr Antikörper, Peptide, Proteine oder eine Kombination davon einschließen. Zu den beispielhaften Fängermolekülen, die für die vorliegende Offenbarung geeignet sind, zählen insbesondere RNA, DNA, Peptide, Antikörper, Aptamere und proteinbasierte Aptamere. In mindestens einer Ausführungsform ist das Fängermolekül ein Antikörper. In einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung können Fängermoleküle mit Blockern blockiert sein, wie z. B. Serum, in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünntem Serum und anderen auf dem Fachgebiet bekannten Blockern.
  • Fängermoleküle gemäß der vorliegenden Offenbarung können z. B. monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper, Antikörperfragmente (z. B. Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fe usw.), chimäre Antikörper, einkettige variable Fragmente (scFvs), Mutanten davon, Fusionsproteine, die einen Antikörperanteil beinhalten, und/oder ein beliebiges anderes Polypeptid beinhalten, das eine Antigenerkennungsstelle der benötigten Spezifität beinhaltet (z. B. einschließlich Antikörpermimetika).
  • Ein „Antikörper“ bezieht sich im Allgemeinen auf ein Immunglobulinmolekül, das in der Lage ist, spezifisch an mindestens ein Ziel zu binden (z. B. ein für den Antikörper spezifisches Antigen). Antikörper können mindestens eine Antigenerkennungsstelle oder Antigenbindungsstelle aufweisen, die sich in einer variablen Region des Antikörpers befinden kann. Antikörper gemäß der vorliegenden Offenbarung können in der Lage sein, spezifisch an ein Ziel wie etwa ein Kohlenhydrat, Polynucleotid, Lipid, Polypeptid oder ein anderes Ziel durch mindestens eine Antigenerkennungsstelle des Antikörpers zu binden. Bei den Antikörpern kann es sich um von Mäusen, Ratten, Kaninchen, Hühnern, Menschen stammende Antikörper oder solche eines beliebigen anderen Ursprungs handeln, einschließlich humanisierten Antikörpern. Fängermoleküle wie etwa Antikörper können rekombinant hergestellt und unter Verwendung eines beliebigen geeigneten Verfahrens exprimiert werden. Ferner können die Antikörper in einigen Aspekten mittels Phagen-Display-Technologie rekombinant hergestellt werden. Beispiele für die Expressions- und Produktionsverfahren sind in US-Patenten 5,565,332 ; 5,580,717 ; 5,733,743 und 6,265,150 und in Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433–455 (1994) zu finden. Die vorliegende Offenbarung ist nicht auf eine bestimmte Quelle von Antikörpern oder eine bestimmte Art der Antikörperherstellung beschränkt. Zum Beispiel können Antikörper mittels Hybridom, Phagenselektion, rekombinanter Expression, transgenen Tieren oder anderen Verfahren hergestellt werden.
  • Wie hierin verwendet, umfasst der Begriff „Antikörper“ nicht nur intakte polyklonale und monoklonale Antikörper, sondern auch Fragmente davon (z. B. Fab, Fab', F(ab')2, Fv), einkettige variable Fragmente (ScFv), Mutanten davon, Fusionsproteine, die einen Antikörperanteil beinhalten, und eine beliebige andere modifizierte Konfiguration des Immunglobulinmoleküls, die eine Antigenerkennungsstelle der benötigten Spezifität beinhaltet. Der Antikörper kann ein Antikörper einer beliebigen Klasse sein, insbesondere IgG, IgA oder IgM (einschließlich einer beliebigen Unterklasse davon) und Antikörper, die zu keiner besonderen Klasse gehören. Immunglobuline können in Abhängigkeit von der Antikörper-Aminosäuresequenz der konstanten Domäne ihrer schweren Ketten verschiedenen Klassen zugewiesen werden. Es gibt fünf Hauptklassen von Immunglobulinen: IgA, IgD, IgE, IgG und IgM, und mehrere von diesen können noch weiter in Unterklassen (Isotypen) eingeteilt werden, z. B. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 und IgA2. Die schwerkettigen konstanten Domänen, die den verschiedenen Klassen von Immunglobulinen entsprechen, werden als alpha, delta, epsilon, gamma bzw. mu bezeichnet. Jede Immunglobulinklasse kann eine deutlich verschiedene Untereinheitstruktur und dreidimensionale Konfiguration aufweisen.
  • Der Begriff „Fv“ bezieht sich im Allgemeinen auf ein Antikörperfragment, das eine komplette Antigenerkennungs- und -bindungsstelle beinhaltet. In einer zweikettigen Fv-Spezies kann diese Region ein Dimer aus einer schwerkettigen variablen Domäne (VH) und einer leichtkettigen variablen Domäne (VL) in einer engen, nicht kovalenten Assoziation einschließen. In einer einkettigen Fv-Spezies kann eine schwerkettige und eine leichtkettige variable Domäne durch einen flexiblen Polypeptid-Linker kovalent verknüpft sein, so dass die leichte und die schwere Kette sich in einer Dimerstruktur assoziieren können, die analog zu der Struktur einer zweikettigen Fv-Spezies ist. In dieser Konfiguration können drei komplementaritätsbestimmende Regionen (CDRs) von jeder variablen Domäne interagieren, um eine Antigenbindungsspezifität auf der Oberfläche des VH-VL-Dimers bereitzustellen. In einigen Aspekten kann jedoch eine einzelne variable Domäne (oder die Hälfte eines Fv, die nur drei für ein Antigen spezifische CDRs beinhaltet) die Fähigkeit aufweisen, ein Antigen zu erkennen und zu binden, obwohl die einzelne variable Domäne eine geringere Affinität gegenüber dem Antigen aufweisen kann als die Affinität der gesamten Bindungsstelle.
  • Ein „monoklonaler Antikörper“ bezieht sich im Allgemeinen auf eine homogene Antikörperpopulation, wobei der monoklonale Antikörper Aminosäuren beinhaltet, die an der selektiven Bindung eines Antigens beteiligt sind. Zu den monoklonalen Antikörpern, die für die vorliegende Offenbarung geeignet sind, zählen natürlich vorkommende und nicht natürlich vorkommende Aminosäuren. Eine Population monoklonaler Antikörper kann mindestens teilweise spezifisch oder hochspezifisch sein, in dem Sinne, dass sie, im Gegensatz zu polyklonalen Antikörpern, im Allgemeinen auf eine einzelne Antigenstelle gerichtet sind. Die hierin eingeschlossenen monoklonalen Antikörper schließen intakte monoklonale Antikörper und monoklonale Antikörper voller Länge ein, sowie Fragmente davon (z. B. Fab, Fab', F(ab')2, Fv), einkettige (ScFv), Mutanten davon, Fusionsproteine, die einen Antikörperanteil beinhalten, und jede andere modifizierte Konfiguration des Immunglobulinmoleküls, die eine Antigenerkennungsstelle mit dieser Spezifität und der Fähigkeit zum Binden eines Antigens beinhaltet (siehe die obige Besprechung von Antikörpern).
  • Gemäß einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung kann ein Fängermolekül ein Peptidepitop von zwei oder mehr aufeinanderfolgenden (d. h. sequentiellen) Aminosäuren binden. Die Aminosäure(n), die das Zielepitop bilden, können linear oder verzweigt sein und können eine oder mehr Aminosäuren beinhalten, die natürlich oder durch eine Intervention modifiziert wurden. Zum Beispiel können die Aminosäuren durch Bilden einer Disulfidbindung, durch Glycosylierung, Lipidierung, Acetylierung, Phosphorylierung oder eine andere Manipulation oder Modifikation, wie etwa Konjugation mit einer Markierungskomponente, modifiziert sein. In einigen Aspekten kann (können) die Aminosäure(n), die das Zielepitop bildet (bilden), ein oder mehr Analoga einer Aminosäure (zum Beispiel einschließlich unnatürlicher Aminosäuren) sowie andere Modifikationen beinhalten. In einigen Aspekten ist das Ziel ein hierin beschriebener Proteinbiomarker.
  • In einigen Ausführungsformen kann das Fängermolekül sein genetisch verwandtes Zielepitop mit einer Bindungsreaktionsaffinität von mindestens etwa 10–7 M, mindestens 10–8 M oder mindestens etwa 10–9 M oder einer engeren Bindung binden. In einigen Ausführungsformen kann eine Bindungsinteraktion um mindestens das Zweifache, mindestens das Fünffache oder einen Bereich von mindestens dem 10-Fachen bis mindestens dem 100-Fachen oder mehr gegenüber zufälligen Bindungsinteraktionen in der Reaktion diskriminieren.
  • In einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung können ein oder mehr Fängermoleküle an eine Oberfläche angeheftet sein, z. B. auf einer Oberfläche immobilisiert sein. Wie hierin verwendet, schließt der Begriff „immobilisiert“ ein, auf einer Oberfläche, wie z. B. einem Mikrokügelchen immobilisiert, an diese gebunden und/oder mit dieser verknüpft zu sein. In mindestens einigen Beispielen können die Fängermoleküle an Mikrokügelchenoberflächen angeheftet sein oder auf diesen immobilisiert sein. Ein Mikrokügelchen kann ein Partikel sein, der eine im Allgemeinen gekrümmte Gestalt aufweist. In mindestens einem Beispiel können die Mikrokügelchen kugelförmig mit einem gleichförmigen Durchmesser sein. Die Mikrokügelchen gemäß der vorliegenden Offenbarung können starr sein und eine Oberfläche aufweisen, die glatt oder porös ist oder die sowohl glatte als auch poröse Anteile einschließt. Ein Mikrokügelchen kann ein Material oder eine Kombination von Materialien beinhalten. Die Mikrokügelchen können in einigen Ausführungsformen magnetische Eigenschaften aufweisen, wobei die Mikrokügelchen z. B. ein magnetisches Material oder eine Kombination von Materialien beinhalten.
  • Gemäß einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung können die Mikrokügelchen einen durchschnittlichen Durchmesser zwischen etwa 10 nm und etwa 100 µm, wie etwa von etwa 50 nm bis etwa 50 µm, von etwa 100 nm bis etwa 10 µm, von etwa 100 nm bis etwa 5 µm, von etwa 500 nm bis etwa 5 µm, von etwa 100 nm bis etwa 1 µm, von etwa 1 µm bis etwa 50 µm, von etwa 5 µm bis etwa 10 µm oder von etwa 10 µm bis etwa 50 µm aufweisen. Zum Beispiel können die Mikrokügelchen einen durchschnittlichen Durchmesser von etwa 10 nm, etwa 100 nm, etwa 500 nm, etwa 1 µm, etwa 5 µm, etwa 10 µm, etwa 50 µm oder etwa 100 µm aufweisen.
  • Die Verknüpfung eines Fängermoleküls mit einer Oberfläche kann kovalent oder nicht kovalent sein. Das Verknüpfen von Fängermolekülen mit den Mikrokügelchen kann durch (ein) beliebige(s) geeignete(s) Verfahren erzielt werden. Zum Beispiel können die Oberflächen der Mikrokügelchen mit einer oder mehr chemischen funktionalen Gruppen funktionalisiert sein, z. B. mit Fängermolekülen konjugiert sein. Beispielhafte funktionale Gruppen sind insbesondere Amin-, Thiol-, Phosphat-, Alkyl-, Alken-, Alkin-, Aren-, Alkohol-, Keton-, Aldehyd-, Carboxyl- und Alkoxygruppen. In mindestens einem Beispiel können die Mikrokügelchen mit Antikörpern oder mit einer beliebigen anderen Fängereinheit wie im Folgenden beschrieben konjugiert sein.
  • 3 ist eine Schemazeichnung, die ein Mikrokügelchen 300 zur Verwendung in einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung zeigt. Wie gezeigt, können zwei verschiedene Typen von Fängermolekülen 305, 306 an die Oberfläche des Mikrokügelchens 300 angeheftet sein. Jedes Fängermolekül 305, 306 kann kovalent über eine beliebige geeignete chemische Verknüpfungsgruppe oder -einheit des Fängermoleküls 305, 306 und/oder der Oberfläche des Mikrokügelchens 300 an die Oberfläche gebunden sein, so dass eine Bindungsstelle 307, 308 der jeweiligen Fängermoleküle 305, 306 zum Binden an ein Ziel zur Verfügung steht. Wird das Fängermolekül 305 mit einer Probe vereinigt, die eine Vielzahl von Biomarkern 313, 314 beinhaltet, kann es selektiv an den Biomarker 313, nicht aber an den Biomarker 314 binden. Ferner ist das Fängermolekül 306 möglicherweise nicht spezifisch für den Biomarker 314, so dass es nicht an den Biomarker 314 bindet. Daher kann der Biomarker 313 über seine Assoziation mit dem Mikrokügelchen und dem Fängermolekül 305 nachgewiesen werden, wohingegen der Biomarker 314 möglicherweise nicht nachgewiesen wird.
  • Während 3 ein Beispiel veranschaulicht, bei dem verschiedene Typen von Fängermolekülen an ein einzelnes Mikrokügelchen angeheftet sind (z. B. zum Fangen und Nachweisen verschiedener Ziele), kann eine Vielzahl oder ein Satz von Mikrokügelchen nur einen Typ von Fängermolekül einschließen, so dass die Mikrokügelchen für ein Ziel spezifisch sind. Zum Beispiel können ein oder mehr Fängermoleküle, das (die) für einen bestimmten Biomarker spezifisch ist (sind), an jedes von einer Vielzahl von Mikrokügelchen angeheftet sein. Jedes von der Vielzahl von Mikrokügelchen kann die gleiche Größe, Gestalt und chemische Zusammensetzung wie die anderen Mikrokügelchen aufweisen, oder die Vielzahl von Mikrokügelchen können mindestens ein Mikrokügelchen mit einer verschiedenen Größe, Gestalt und/oder chemischen Zusammensetzung als mindestens ein anderes von der Vielzahl von Mikrokügelchen einschließen.
  • In einigen Beispielen kann das (können die) Fängermolekül(e) markiert sein, wobei sie z. B. mindestens eine nachweisbare Markierung beinhalten (z. B. einen chemischen Tag oder ein Sondenmolekül). Zum Beispiel kann das (können die) Fängermolekül(e) eine Markierung beinhalten, die durch eine analytische Technik nachweisbar ist, wie etwa durch optischen Nachweis, z. B. Fluoreszenz, Chemilumineszenz oder Elektrochemilumineszenz. In einigen Aspekten kann das (können die) Fängermolekül(e) einen fluoreszierend markierten Antikörper oder ein fluoreszierend markiertes Protein einschließen.
  • Einige Aspekte der vorliegenden Offenbarung schließen das Analysieren einer Probe in einem diagnostischen Assay zur Bestimmung des Vorhandenseins oder Fehlens von einem oder mehr Biomarkern und/oder zur Messung der Menge von einem oder mehr Biomarkern in der Probe ein. In mindestens einer Ausführungsform kann der Assay ein oder mehr Fängermoleküle beinhalten. Zum Beispiel kann der Assay eine Vielzahl oder einen Satz von Fängermolekülen beinhalten. In einigen Ausführungsformen kann der Satz mindestens zwei deutlich verschiedene Fängermoleküle beinhalten, wobei jedes deutlich verschiedene Fängermolekül ein verschiedenes Ziel (z. B. einen Biomarker, wie etwa ein Peptid) erkennen kann. Der Satz von Fängermolekülen kann zwischen 2 und 80 Fängermoleküle beinhalten. In einigen Ausführungsformen kann der Satz von Fängermolekülen mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 oder 80 oder mehr deutlich verschiedene Fängermoleküle beinhalten. In mindestens einem Beispiel schließt der Satz von Fängermolekülen 5, 6 oder 7 deutlich verschiedene Fängermoleküle ein, die jeweils spezifisch für einen verschiedenen Biomarker sind, der in Verbindung mit einem bestimmten Gesundheitszustand, z. B. Krebs, steht. In einem anderen Beispiel schließt der Satz von Fängermolekülen 12 deutlich verschiedene Fängermoleküle ein, die jeweils für einen verschiedenen Biomarker spezifisch sind, der in Verbindung mit einem bestimmten Gesundheitszustand steht. In noch einem anderen Beispiel schließt der Satz von Fängermolekülen zwischen 20 und 60 deutlich verschiedene Fängermoleküle ein, die jeweils für einen verschiedenen Biomarker spezifisch sind, der in Verbindung mit einem bestimmten Gesundheitszustand steht. In einigen Beispielen können zusätzlich zu den hierin beschriebenen Fängermolekülen und Fängermolekülsätzen noch ein oder mehrere andere das Ziel bindende Mittel verwendet werden.
  • Die Wahl der Fängermoleküle kann sich nach der gewünschten Anwendung und/oder den Biomarkern, die in der Probe nachgewiesen werden sollen, richten. Das (die) Fängermolekül(e) kann (können) für einen oder mehr Biomarker von einem Satz von Biomarkern, z. B. einem Biomarker-Panel, spezifisch sein. Wie oben besprochen können die Fängermoleküle Antikörper einschließen, die für Biomarker spezifisch sind, die mit einem bestimmten Gesundheitszustand assoziiert sind. In einigen Aspekten kann jedes Fängermolekül für einen Biomarker in dem Panel spezifisch sein.
  • Beispielhafte Panels können 1 bis 80 Biomarker beinhalten, z. B. 1 bis 60 Biomarker, 1 bis 40 Biomarker, 1 bis 30 Biomarker, 1 bis 20 Biomarker, 1 bis 15 Biomarker, 1 bis 12 Biomarker, 2 bis 60 Biomarker, 2 bis 15 Biomarker, 2 bis 12 Biomarker, 3 bis 60 Biomarker, 3 bis 20 Biomarker, 3 bis 12 Biomarker, 4 bis 60 Biomarker, 4 bis 12 Biomarker, 4 bis 8 Biomarker, 5 bis 60 Biomarker, 5 bis 40 Biomarker, 5 bis 20 Biomarker, 5 bis 12 Biomarker, 5 bis 7 Biomarker, 6 bis 20 Biomarker oder 6 bis 12 Biomarker, obwohl auch Panels mit mehr als 20 Biomarkern hierin eingeschlossen sind. Zum Beispiel kann das Panel 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 oder 80 oder mehr Biomarker einschließen.
  • Alle oder ein Teilsatz der Biomarker eines Panels können mit einer Erkrankung oder einem anderen Gesundheitszustand assoziiert sein. Zum Beispiel können ein oder mehr Biomarker eines Panels mit einer Erkrankung wie z. B. Krebs (einschließlich Brustkrebs, Prostatakrebs oder Eierstockkrebs), einer Atemwegserkrankung und/oder Herzerkrankung assoziiert sein. Zu den Biomarkern, die mit Atemwegserkrankungen assoziiert sind, können z. B. Biomarker zählen, die mit Influenza A, Influenza B, Anthrax, Pest und/oder verschiedenen Allergenen assoziiert sind. In mindestens einem Beispiel schließt das Biomarker-Panel 5, 6 oder 7 in Verbindung mit einem bestimmten Gesundheitszustand, z. B. Krebs, stehende Biomarker ein.
  • In einigen Ausführungsformen können die nachzuweisenden Biomarker mit Brustkrebs assoziiert sein. In einigen beispielhaften Verfahren der vorliegenden Offenbarung können zu den Biomarkern für ein Brustkrebs-Panel insbesondere Her-2, MMP-2, CA 15-3, VEGF, OPN, p53, CA 125, CEA und/oder SER zählen. Zum Beispiel kann ein Biomarker-Panel, das für diagnostische Informationen zu Brustkrebs nützlich ist, mindestens einen Biomarker einschließen, der aus Her-2, MMP-2, CA 15-3, VEGF, OPN, p53, CA 125, CEA oder SER ausgewählt ist. In einigen Aspekten kann das Biomarker-Panel jeden von Her-2, MMP-2, CA 15-3, VEGF, OPN, p53, CA 125, CEA und SER einschließen. Gemäß einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung kann das Biomarker-Panel mindestens zwei Biomarker, die aus CA 15-3, OPN, Her-2, MMP-2 und VEGF ausgewählt sind, beinhalten. Zum Beispiel kann das Biomarker-Panel CA 15-3, OPN, Her-2, MMP-2 und VEGF beinhalten. Zu den Beispielen für Sequenzkennungen in der Online-Datenbank des HUGO Gene Nomenclature Committee für solche Marker zählen Her-2 (X03363), MMP-2 (NM_004530), CA 15-3 (NM_002456), VEGF (MGC70609), OPN (NM_001040058), p53 (NM_000546), CA 125 (Q8WX17) und SER (NP 000116.2).
  • Gemäß einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung können die Fängermoleküle Antikörper beinhalten, die für Brustkrebs-Biomarker spezifisch sind. In einigen Ausführungsformen können die Fängermoleküle spezifisch für Her-2, MMP-2, CA 15-3, VEGF, OPN, p53, CA 125 und SER sein. In einigen Ausführungsformen können die Fängermoleküle spezifisch für Her-2, MMP-2, CA 15-3 und OPN sein. Beispielhafte, für Brustkrebsmarker spezifische Fängerantikörper sind insbesondere: (1) Anti-Her-2 (z. B. monoklonaler anti-humaner ErbB2-Antikörper, Katalognr. MAB1129, Klon-Nr. 191924, geliefert von R&D Systems), (2) Anti-Matrix-Metallopeptidase 2 (MMP-2) (z. B. monoklonaler anti-humaner MMP-2-Antikörper, Katalognr. MAB902, Klon-Nr. 36006.211, geliefert von R&D Systems), (3) Anti-CA-15-3 (z. B. monoklonaler anti-humaner CA-15-3-Antikörper, Katalognr. 10-C03, Klon-Nr. M8071022, geliefert von Fitzgerald Industries), (4) Anti-Osteopontin (OPN) (z. B. monoklonaler anti-humaner Osteopontin-Antikörper, Katalognr. MAB1433, Klon-Nr. 190312, geliefert von R&D Systems), und (5) Anti-Gefäßendothel-Wachstumsfaktor (VEGF) (z. B. gereinigter anti-humaner VEGF-Maus-Antikörper, Katalognr. AHGO114, Klon-Nr. A183C 13G8, geliefert von ThermoFisher Scientific). In einigen Ausführungsformen kann es sich bei den Fängermolekülen um Klon 191924, Klon 36006.211, Klon M8071022 und Klon 190312 handeln.
  • Zu den beispielhaften Biomarkern für ein Prostatakrebs-Panel (z. B. Biomarker, die nützlich sind, um diagnostische Informationen zu Prostatakrebs zu erhalten) zählt insbesondere PSA. Zu den beispielhaften Biomarkern für ein Eierstockkrebs-Panel (z. B. Biomarker, die nützlich sind, um diagnostische Informationen zu Eierstockkrebs zu erhalten) zählt insbesondere CA 125. Zu den beispielhaften Biomarkern für ein Herzerkrankungs-Panel (z. B. Biomarker, die nützlich sind, um diagnostische Informationen zu Herzerkrankungen zu erhalten) zählen insbesondere Troponin T, Troponin I, CRP, Homocystein, Myoglobin und/oder Kreatinkinase. Das (die) zum Nachweisen der obigen Biomarker-Panels verwendete(n) Fängermolekül(e) können für einen oder mehr Biomarker des Panels spezifisch sein. Zum Beispiel können die Fängermoleküle Antikörper beinhalten, die für die mit jeder der jeweiligen Erkrankungen oder jedem der Gesundheitszustände assoziierten Biomarker spezifisch sind.
  • Die Anzahl der Fängermoleküle in einem Satz von Fängermolekülen kann von einem oder mehr der folgenden Parameter abhängen: von den erwogenen Verwendungen und Anwendungen des Satzes von Fängermolekülen, von der Komplexität der Probe, von der durchschnittlichen Größe der Proteine in der Probe, von der Häufigkeit, mit der das genetisch verwandte Zielepitop in einer Probe vorhanden ist oder voraussichtlich vorhanden sein wird, von der Bindungsaffinität und/oder Spezifität der Fängermoleküle, von der Kenntnis des Zielproteins (der Zielproteine) und/oder von der Stabilität der Fängermoleküle.
  • Gemäß einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung kann sich das „Nachweisen“ auf das Identifizieren des Vorhandenseins, Fehlens und/oder der Menge eines Ziels oder einer anderen nachzuweisenden Spezies beziehen. Der Nachweis kann visuell und/oder unter Verwendung einer beliebigen geeigneten Vorrichtung erfolgen, wie z. B. eines Scanners und/oder Detektors. Ferner kann jede geeignete analytische Technik für den Nachweis verwendet werden, insbesondere optische Techniken. Zu den nicht einschränkenden Beispielen für Techniken, die beim Nachweis gemäß der vorliegenden Offenbarung verwendet werden können, zählen Absorptionsvermögen, Fluoreszenz, Chemilumineszenz und Elektrochemilumineszenz.
  • Der Nachweis eines an ein Fängermolekül gebundenen Ziels (z. B. eines Biomarkers) kann unter Verwendung einer nachweisbaren Markierung erfolgen. Zum Beispiel kann ein Nachweismolekül, das für ein Ziel spezifisch ist, an das Ziel binden (wobei z. B. das Ziel auch an ein Fängermolekül gebunden ist), um das Ziel nachzuweisen. In einigen Beispielen können die Nachweismoleküle Nachweis-Antikörper beinhalten. Solche Nachweis-Antikörper können für ein Biomarkerziel spezifisch sein, z. B. in ähnlicher Weise wie die Spezifität einiger Fänger-Antikörper für ein Biomarkerziel, wie bereits oben besprochen. Zu den beispielhaften Nachweismolekülen, die für die vorliegende Offenbarung geeignet sind, zählen insbesondere (1) Anti-Her-2 (z. B. polyklonale anti-humane Ziegen-ErbB2-Antikörper, Katalognr. AF-1129, geliefert von R&D Systems), (2) Anti-MMP-2 (z. B. polyklonale anti-humane Ziegen-MMP-2-Antikörper, Katalognr. AF-902, geliefert von R&D Systems), (3) Anti-CA-15-3 (z. B. monoklonale anti-humane CA-15-3-Antikörper, Katalognr. 10-C03B, Klon-Nr. M8071021, geliefert von Fitzgerald Industries), (4) Anti-Osteopontin (z. B. polyklonale anti-humane Ziegen-Osteopontin-Antikörper, Katalognr. AF-1433, R&D Systems), und (5) Anti-VEGF (z. B. biotinkonjugierte polyklonale anti-humane Kaninchen-VEGF-Antikörper, Katalognr. AHG9119, geliefert von ThermoFisher Scientific).
  • Nachweismoleküle können unter Verwendung beliebiger geeigneter Verfahren markiert werden. In einigen Beispielen können die Nachweismoleküle mindestens eine nachweisbare Markierung beinhalten (z. B. einen chemischen Tag oder ein Sondenmolekül), die durch eine analytische Technik wie etwa einen optischen Nachweis nachgewiesen werden kann, z. B. Absorptionsvermögen, Fluoreszenz, Chemilumineszenz oder Elektrochemilumineszenz. Zum Beispiel kann die nachweisbare Markierung fluoreszierende Mittel, kolorimetrische Mittel, magnetische Mittel oder elektrische Mittel oder eine beliebige Kombination davon beinhalten. Zu den fluoreszierenden Mitteln zählen insbesondere Quantenpunkte und Fluorophore, wie u. a. Alexa Fluor® 546 Färbemoleküle und Alexa Fluor® 488 Färbemoleküle, produziert von ThermoFisher Scientific, Phycoerythrin (PE) und Allophycynin (APC). In einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung kann ein Nachweismolekül eine oder mehr nachweisbare Markierungen einschließen, bevor es an ein Ziel bindet (siehe z. B. 4 unten). In anderen Aspekten können eine oder mehr nachweisbare Markierungen zugegeben werden, nachdem ein Nachweismolekül an das Ziel gebunden ist. Zum Beispiel kann, nach dem Binden eines Ziels an ein Fängermolekül (z. B. nachdem sich das Fängermolekül an ein Mikrokügelchen angeheftet hat) und an ein Nachweismolekül, um somit einen Fängermolekül/Ziel/Nachweismolekül-Komplex zu binden, der Komplex dann mit einer oder mehr nachweisbaren Markierungen gemischt werden, so dass die nachweisbaren Markierungen reagieren und sich an den Komplex anheften. Die Zugabe der nachweisbaren Markierung(en) kann in einer gesonderten Reaktionskammer durchgeführt werden. Zum Beispiel kann, nach dem Bilden des Fängermolekül/Ziel/Nachweismolekül-Komplexes, der Komplex vor der Reaktion mit der (den) nachweisbaren Markierung(en) mittels eines Dichtemediums von den eventuell ungebundenen/nicht umgesetzten Reagenzien getrennt werden.
  • In einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung kann der Assay eine kompetitive Bindung einschließen. Zum Beispiel können die Fängermolekül-Mikrokügelchenreagenzien, mit denen die mikrofluidische Scheibe vorgeladen ist, ein Nachweismolekül mit einer nachweisbaren Markierung einschließen. Wenn eine Probe, die ein Ziel beinhaltet, mit den Reagenzien gemischt wird, kann das Ziel mit dem Nachweismolekül konkurrieren, um an das Fängermolekül-Mikrokügelchen zu binden. Die Reagenzienmenge kann so gewählt werden, dass bei Fehlen von Zielen ein hohes Signal nachgewiesen wird, wodurch ein Bezugssignal bereitgestellt wird. Eine im Verhältnis zu dem Bezugssignal verringerte Signalmenge kann auf das Vorhandensein von Zielen hinweisen (die z. B. die Nachweismoleküle durch Binden an die Fängermolekül-Mikrokügelchen verdrängen). Die Verringerung des Signals im Verhältnis zu dem Bezugssignal kann verwendet werden, um die Konzentration des Ziels zu ermitteln. Dieser Typ von Assay kann nützlich für Ziele mit beschränkter Größe oder Zahl von Epitopen sein, z. B. unter anderem für kleine Proteine mit nur einem Epitop.
  • Beispielhafte Vorrichtungen
  • Vorrichtungen, die für verschiedene Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung geeignet sind, können Point-of-care-Tests bereitstellen, um z. B. diagnostische Informationen für einen Patienten gleichzeitig oder in zeitlicher Nähe und an dem Ort der Patientenversorgung zu erhalten. Zum Beispiel kann die Vorrichtung tragbar und/oder in sich abgeschlossen sein. Ferner können Vorrichtungen gemäß der vorliegenden Offenbarung verwendet werden, um mehrere Ziele (z. B. Biomarker) gleichzeitig in einem Multiplex-Assay zu messen.
  • In einigen Aspekten kann die Vorrichtung mikrofluidische Kanäle zum Durchführen eines Multiplex-Assays einschließen. Auf einer mikrofluidischen Plattform kann zum Beispiel ein relativ geringes Probenvolumen (z. B. in der Größenordnung von Mikrolitern (μl)) ausreichen, um die Spiegel für eine Vielzahl von Biomarkern zu messen. Zum Beispiel kann die Vorrichtung ein mikrofluidisch-basiertes Immunoassay-Nachweisgerät sein, das eine mikrofluidische Scheibe, einen Motor zum Steuern der Drehgeschwindigkeit der Scheibe und einen Detektor wie etwa ein optisches Lesegerät, z. B. zum Messen von Biomarkern, beinhaltet. In einigen Ausführungsformen kann die mikrofluidische Scheibe Mikrokügelchen, die mit spezifischen Fänger-Antikörpern konjugiert sind, und einen geeigneten Satz von Reagenzien für Bindungs-, Nachweis- und Trennprozesse enthalten. Mikrofluidische Vorrichtungen gemäß der vorliegenden Offenbarung können ein beliebiges der Merkmale einschließen, die in der vorläufigen US-Patentanmeldung Nr. 62/202,353 offenbart werden, die durch Bezugnahme in dieses Dokument aufgenommen wird.
  • Mikrofluidische Scheiben der vorliegenden Offenbarung können einen oder mehr Kanäle beinhalten, die eine Reihe von miteinander verbundenen Kammern einschließen, wobei Reagenzien und Probe gemischt werden können und/oder durch Anwenden einer Zentrifugalkraft von Kammer zu Kammer bewegt werden können. Daher kann die mikrofluidische Scheibe zum Beispiel den Kanal (die Kanäle), durch den (die) das Fluid fließt, und die Kammern, wo Reagenzien aufbewahrt und/oder mit einer in einem diagnostischen Assay der Scheibe zugegebenen Probe gemischt werden, bereitstellen.
  • Der Kanal oder die Kanäle der mikrofluidischen Scheibe kann (können) jede geeignete Gestalt, u. a. beispielsweise rund, trapezförmig, dreieckig oder andere geometrische Gestalten haben. Die Kanäle können gerade, gekrümmt, zickzackförmig, U-förmig sein oder andere Konfigurationen haben, die z. B. von der Anwendung und Funktion des Kanals abhängen. Kanalgrößen können auf der Grundlage von einem oder mehreren Faktoren gewählt werden, wie etwa von Typ(en) und/oder Anzahl der in einer Probe zu analysierenden Ziele (z. B. Biomarker), Typ(en) und/oder Anzahl von Fängermolekülen, die in der Scheibe zum Binden mit dem (den) Ziel(en) aufbewahrt werden, das Wesen der Bindung zwischen Zielen und Fängermolekülen, unter anderen Faktoren. In einigen beispielhaften Scheiben können die Kanäle etwa 0,01 Mikrometer bis 5 Millimeter tief und 0,01 Mikrometer bis etwa 5 Millimeter breit sein. Zum Beispiel kann die Tiefe der Kanäle im Bereich von etwa 0,05 Mikrometer bis etwa 5 Millimeter liegen und der Durchmesser von etwa 0,01 Mikrometer bis etwa 1 Zentimeter oder mehr betragen. Die Fluidkapazität der Kanäle kann je nach der Anwendung im Bereich von etwa 1 Nanoliter bis etwa 1 ml oder mehr liegen.
  • Die mikrofluidischen Scheiben können aus einem beliebigen Material oder einer Kombination von Materialien hergestellt sein, das (die) für den Assay geeignet ist (sind). Zum Beispiel kann die mikrofluidische Scheibe ein oder mehr Polymere oder Copolymere beinhalten. Zu den beispielhaften, für die hierin beschriebenen mikrofluidischen Scheiben geeigneten Materialien zählen insbesondere Polypropylen, Polystyrol, Polyethylen, Acrylate wie etwa Poly(methylmethacrylat) (PMMA), cyclische Olefinpolymere (COP), cyclische Olefincopolymere (COP), Polydimethylsiloxan (PDMS), Polyacrylamide und Kombinationen davon.
  • 1 zeigt eine beispielhafte mikrofluidische Scheibe 100, die einen mikrofluidischen Kanal beinhaltet, der eine Reihe von miteinander verbundenen Kammern einschließt, durch die während eines Assays Fluid fließen kann. Die Anzahl und das Design der Kammern kann auf die jeweiligen Ziele, die nachgewiesen werden sollen, und auf die verwendeten Reagenzien zugeschnitten sein. Wie gezeigt, kann der Kanal zum Beispiel einen Probeneinlass 102, eine Probenzubereitungskammer 104, eine Mess- und Reaktionskammer 106, eine Trennkammer 108 und eine Nachweiskammer 110 einschließen. Die Scheibe 100 kann eine mittige Öffnung 105 einschließen, z. B. um die Scheibe 100 an eine strombetriebene Komponente zum Antreiben der Rotation der Scheibe 100 während eines Assays zu koppeln. In einer beispielhaften Verfahrensweise wird eine Probe, z. B. eine Blutprobe, die den Biomarker von Interesse einschließt, zu dem Probeneinlass 102 der mikrofluidischen Scheibe 100 zugegeben. Im Allgemeinen kann ein Aliquot der Rohprobe (z. B. Vollblut oder ein anderes biologisches Fluid) im Bereich von etwa 1 µl bis etwa 300 µl oder mehr (ca. ein bis mehrere Tropfen) zu dem Einlass zugegeben werden, wie etwa von etwa 1 µl bis etwa 280 µl, von etwa 1 µl bis etwa 250 µl, von etwa 1 µl bis etwa 220 µl, von etwa 1 µl bis etwa 200 µl, von etwa 1 µl bis etwa 180 µl, von etwa 1 µl bis etwa 150 µl, von etwa 1 µl bis etwa 120 µl, von etwa 1 µl bis etwa 100 µl, von etwa 1 µl bis etwa 80 µl, 1 µl bis etwa 80 µl, von etwa 1 µl bis etwa 40 µl, von etwa 1 µl bis etwa 20 µl, von etwa 1 µl bis etwa 6 µl, von etwa 20 µl bis etwa 250 µl, von etwa 20 µl bis etwa 200 µl, von etwa 50 µl bis etwa 100 µl, von etwa 50 µl bis etwa 250 µl, von etwa 100 µl bis etwa 200 µl, von etwa 5 µl bis etwa 80 µl oder von etwa 2 µl bis etwa 5 µl. Zum Beispiel kann ein Aliquot der Probe von etwa 1 µl, etwa 2 µl, etwa 3 µl, etwa 4 µl, etwa 5 µl, etwa 6 µl, etwa 20 µl, etwa 40 µl, etwa 60 µl, etwa 80 µl, etwa 100 µl, etwa 120 µl, etwa 150 µl, etwa 180 µl, etwa 200 µl, etwa 220 µl, etwa 240 µl, etwa 250 µl, etwa 280 µl oder etwa 300 µl verwendet werden. Während die Scheibe rotiert, kann die Probe durch den Kanal radial nach außen fließen.
  • In einigen Ausführungsformen können die mikrofluidischen Scheiben ein Ventilsystem mit relativ schmalen Kanälen, z. B. zum Regeln des Fluidflusses, einschließen. Zum Beispiel kann die mikrofluidische Scheibe 100 von 1 ein Ventil 111 zwischen der Probenzubereitungskammer 104 und der Mess- und Reaktionskammer 106 und/oder zwischen der Mess- und Reaktionskammer 106 und der Trennkammer 108 einschließen. Ventile können Widerstand gegen Fluidfluss durch die Kanäle bereitstellen, bis genügend Kraft bereitgestellt wird, um einen solchen Widerstand zu überwinden. Ein Beispiel für Kraft zum Überwinden eines solchen Widerstands kann Zentrifugalkraft, die durch Drehen der Scheibe bei Schwellengeschwindigkeit angewendet wird, einschließen. Jedes Ventil kann dazu ausgelegt sein oder so angepasst werden, dass es einer besonderen Rotationsgeschwindigkeit oder -geschwindigkeiten entspricht, z. B. so dass selektiv auf verschiedene Kammern zugegriffen werden kann, um das Fluid zu einem gewünschten Zeitpunkt gemäß den Betriebsvorgängen der Vorrichtung zu bewegen.
  • Die Probenzubereitungskammer 104 kann eine eventuelle Vorverarbeitung der Probe vor dem Mischen mit den Reagenzien, die in der Scheibe 100 aufbewahrt sind, bereitstellen. Zum Beispiel können verschiedene Komponenten der Probe getrennt werden, z. B. über einen Filter, so dass nur ein Anteil der ursprünglichen Probe zur Analyse durch den Kanal fließen kann. Zum Beispiel kann der Probeneinlass 102 so ausgelegt sein, dass er Vollblut in Plasma, Serum und Zellkomponenten trennt. In einigen Beispielen kann die Menge der Probenkomponente (z. B. Blutplasma), die zur Analyse mit den Reagenzien gemischt wird, im Allgemeinen im Bereich von etwa 1 µl bis etwa 6 µl liegen. Zum Beispiel kann die Menge der Probe oder Probenkomponente, die für einen Multiplex-Assay gemäß der vorliegenden Offenbarung ausreicht, im Bereich von etwa 2 µl bis etwa 5 µl liegen, z. B. ein Probenaliquot von etwa 1 µl, etwa 2 µl, etwa 3 µl, etwa 4 µl, etwa 5 µl oder etwa 6 µl. Überschüssige Probe und/oder eventuelle Komponenten einer Rohprobe, die nicht zur Analyse verwendet werden, können in eine Abfallkammer abgetrennt werden, die z. B. in Kommunikation mit der Mess- und Reaktionskammer 106 steht.
  • Die Mess- und Reaktionskammer 106 kann die Probe mit den Fängermolekülen vereinigen, z. B. zum Binden von Zielen an die Fängermoleküle, und das angemessene Volumen für die nachfolgenden Schritte des Assays ermitteln. Somit können zum Beispiel Reagenzien, die Fängermoleküle beinhalten, die an Mikrokügelchen angeheftet sind (siehe z. B. 3) vor einem Assay auf die Scheibe vorgeladen und darin aufbewahrt werden. In einigen Beispielen kann die Scheibe 100 eine Messkammer zum Abmessen des angemessenen Probevolumens für die Analyse beinhalten, welche separat von der Reaktionskammer ist, wo die Reagenzien zum Mischen mit der Probe aufbewahrt werden können, wenn die Probe in die Reaktionskammer eintritt. Es können Reagenzien außer den Fängermolekül-Mikrokügelchen in flüssiger, gelförmiger oder lyophilisierter Form vorhanden sein, so dass die Fängermolekül/Mikrokügelchen in dem (den) flüssigen, gelförmigen oder lyophilisierten Material(ien) suspendiert sind. Wenn ein Anteil der Reagenzien lyophilisiert ist, kann die Probe oder Probenkomponente, die zur Analyse in die Mess- und Reaktionskammer 106 eingeführt wird (z. B. das Blutplasma), das (die) lyophilisierte(n) Material(ien) rekonstituieren.
  • Die Trennkammer 108 und die Nachweiskammer 110 (die das Ende des mikrofluidischen Kanals beinhalten kann) können die Sammlung des gebundenen Fängermolekül-Mikrokügelchen/Ziel-Komplexes bereitstellen, um das Ziel nachzuweisen. Zum Beispiel können die Kanäle ein Dichtemedium, z. B. mit einer geringeren Dichte als die Mikrokügelchen und einer größeren Dichte als die ungebundenen Reagenzien, wie etwa Ficoll, beinhalten. Nach der Reaktion mit der Probe können die Mikrokügelchen durch das Dichtemedium in der Trennkammer 108 bewegt werden, um sie von anderen Reagenzien zu trennen und die Sammlung der Kügelchen in einem Pellet in der Nachweiskammer 110 zu erlauben. Das Pellet kann dann durch einen Detektor analysiert werden, um das Vorhandensein und/oder die Konzentration von Zielen zu ermitteln und analysieren.
  • 2 zeigt eine beispielhafte Scheibe 200, die eine Vielzahl mikrofluidischer Kanäle gemäß einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung beinhaltet. Jeder Kanal kann mindestens einen Probeneinlass 202, mindestens eine Probenzubereitungskammer 204, mindestens eine Messkammer 206, mindestens eine Reaktionskammer 207, mindestens eine Trennkammer 208 und mindestens eine Nachweiskammer 210 beinhalten oder in Kommunikation mit dieser stehen. Zum Beispiel können die Kanäle sich in regelmäßig beabstandeten Intervallen radial nach außen erstrecken. In einigen Aspekten kann die Zahl der Trennkammern 208 und Nachweiskammern 210 (zum Nachweisen eines Ziels) größer sein als die Zahl der Probeneinlässe 202. Wie gezeigt, schließt zum Beispiel die Scheibe 200 12 Probeneinlässe 202 ein, wobei jeder Probeneinlass in eine Probenzubereitungskammer 204 führt. Jede der 12 Probenzubereitungskammern 204 steht in Kommunikation mit 5 Messkammern 206. Jede Messkammer 206 führt in eine Reaktionskammer 207 (wo z. B. Reagenzien in die Scheibe 200 vorgeladen werden können), eine Trennkammer 208 und eine Nachweiskammer 210. Somit kann die Scheibe 200 insgesamt 60 Kanäle aufweisen, womit sie die Analyse von 12 verschiedenen Proben und 5 verschiedenen Biomarkern pro Probe bereitstellt (z. B. wenn jede Reaktionskammer 207 ein Reagenz einschließt, das für einen verschiedenen Biomarker spezifisch ist). Jeder Kanal kann ein oder mehr Ventile einschließen, die Ventil 111 von 1 ähneln. Die mikrofluidische Scheibe 200 kann eine mittige Öffnung 205 einschließen, die Öffnung 105 der Scheibe 100 in 1 ähnelt.
  • 4 zeigt eine Schemazeichnung eines beispielhaften Assays unter Verwendung einer mikrofluidischen Scheibe 400 gemäß einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung, die beliebige der Merkmale der mikrofluidischen Scheiben 100 und/oder 200 einschließen kann, die oben besprochen werden. Die Scheibe 400 kann eine Vielzahl von Kanälen einschließen, wobei jeder Kanal eine Messkammer 406 und eine Reaktionskammer 407, eine Trennkammer 408 und eine Nachweiskammer 410 einschließt. Nach der Rotation der Scheibe 400 kann Fluid durch die Kanäle radial nach außen fließen. Wie gezeigt, können zwei Probeneinlässe 402 zwischen zwei Kanälen aufgeteilt sein, z. B. bei Kammer 406. Somit kann ein Aliquot einer Fluidprobe (z. B. Vollblut), das zu jedem Probeneinlass 402 zugegeben wird, zwischen zwei Kanälen aufgeteilt werden. Die Größen und Konfigurationen der Kanäle können gestatten, dass sich ein vorgegebenes Probevolumen durch den Kanal vorwärtsbewegt, um mit den Reagenzien gemischt zu werden. In einigen Aspekten kann zum Beispiel Kammer 406 dazu dienen, eine angemessene Probenmenge für jede Reaktionskammer 407 zu messen. Während dies in 4 nicht gezeigt ist, können die Probeneinlässe 402 in Probenzubereitungskammern führen, wie dies oben besprochen wurde, z. B. um verschiedene Komponenten der Probe zu trennen, bevor ein angemessenes Probevolumen gemessen wird, die mit den Reagenzien zur Analyse gemischt werden soll.
  • Jede Reaktionskammer 407 kann in die mikrofluidische Scheibe 400 vorgeladene Reagenzien enthalten. Die Reagenzien können eine Vielzahl von Mikrokügelchen 420 mit kovalent an die Oberfläche angehefteten Fängermolekülen 421 einschließen, so dass eine Bindungsstelle am freien Ende jedes Fängermoleküls 421 für das Binden mit einem Ziel der Probe verfügbar ist. 4 zeigt ein beispielhaftes Mikrokügelchen 420 mit vier an die Oberfläche angehefteten Fängermolekülen 421, doch es können auch mehr oder weniger als vier Fängermoleküle 421 pro Mikrokügelchen 420 verwendet werden. Die Reagenzien können auch eine Vielzahl von Nachweismolekülen 425 einschließen, wobei jedes Nachweismolekül eine Bindungsstelle 425a zum Binden an ein Ziel und eine Nachweismarkierung 425b wie etwa ein fluoreszierendes Mittel einschließt. Die Fängermoleküle 421 und die Nachweismoleküle 425 können für das (die) gleiche(n) Ziel(e), die nachgewiesen werden sollen, spezifisch sein.
  • In einigen Aspekten kann jede Reaktionskammer 407 Fängermoleküle 421 und/oder Nachweismoleküle 425 einschließen, die für das (die) gleiche(n) Ziel(e) wie die anderen Reaktionskammern 407 der Scheibe 400 spezifisch sind. In anderen Beispielen kann mindestens einer der Kanäle Fängermoleküle 421 und/oder Nachweismoleküle 425 einschließen, die für (ein) andere(s) Ziel(e) spezifisch sind als mindestens ein weiteres der Kanäle der Scheibe 400. In nochmals anderen Beispielen kann jeder Kanal der mikrofluidischen Scheibe 400 verschiedene Fängermoleküle 421 und/oder Nachweismoleküle 425 einschließen, so dass in jedem Kanal oder jeder Trennkammer 408 verschiedene Ziele gefangen und nachgewiesen werden können. Ferner kann die Scheibe 400 Fängermoleküle 421 und/oder Nachweismoleküle 425 einschließen, die in der gleichen Reaktionskammer 407 vorgeladen sind und für verschiedene Ziele spezifisch sind. Zum Beispiel kann eine einzelne Reaktionskammer 407 eine erste Vielzahl von Fängermolekülen 421 (z. B. angeheftet an Mikrokügelchen 420), die für ein erstes Ziel spezifisch sind, und eine Vielzahl von Fängermolekülen 421 (z. B. angeheftet an Mikrokügelchen 420), die für ein zweites, von dem ersten Ziel verschiedenes Ziel spezifisch sind, beinhalten.
  • Die Probe, die in die Probeneinlässe 402 eingeführt wird, kann ein oder mehr Ziele, z. B. Biomarker 415, einschließen. Zum Beispiel kann es sich bei dem Biomarker 415, der in der Probe nachgewiesen werden soll, um Antikörper handeln, und die Fängermoleküle 421 können Antikörper fangen. Somit kann zum Beispiel jedes Fängermolekül 421 an einen Biomarker 415 binden, so dass jedes Mikrokügelchen 420 vier Biomarker 415 bindet, wie dies schematisch in 4 gezeigt ist. Ferner kann jedes Nachweismolekül 425 an einen der Biomarker 415 binden, die an die Mikrokügelchen 420 angeheftet sind, und somit einen Nachweiskomplex 430 bilden.
  • Die Nachweiskomplexe 430 können zu der Trennkammer 408 fließen. In einigen Aspekten kann ein Dichtemedium wie oben besprochen verwendet werden, um die Nachweiskomplexe 430 von ungebundener Probe und/oder Reagenzien (z. B. ungebundenen Nachweismolekülen 425) in der Trennkammer 408 zu trennen, wie dies schematisch in 4 gezeigt ist (Illustration der Trennkammer 408, links). Nach Anwendung einer ausreichenden Zentrifugalkraft aufgrund der Rotation der Scheibe 400 können die Nachweiskomplexe 430 sich von der Trennkammer 408 zu der Nachweiskammer 410 bewegen, um sich in einem Pellet 409 an der Basis der Nachweiskammer 410 zu sammeln, wie dies auch schematisch in 4 gezeigt ist (Illustration der Trennkammer 408, rechts). Die Trennkammern 408 und/oder Nachweiskammern 410 der Scheibe 400 können die gleiche Gestalt oder verschiedene Gestalten aufweisen. Wie gezeigt, schließt zum Beispiel die Scheibe 400 13 Kanäle mit Nachweiskammern 410 mit einer allgemein konischen, V-förmigen Basis und 3 Kanäle mit Nachweiskammern 411 mit einer flachen Basis ein.
  • Wenn es sich bei dem Nachweisverfahren um Chemilumineszenz oder Elektrochemilumineszenz handelt, kann die Scheibe 400 ein geeignetes Substrat/Reagenz einschließen, das in die Nachweiskammern 410 und/oder 411 vorgeladen ist, so dass der Fängermolekül-Mikrokügelchen/Ziel-Komplex mit dem Substrat/Reagenz reagieren kann, um Licht (z. B. ultraviolettes, sichtbares oder Infrarot-Licht) für den Nachweis zu erzeugen. In einigen Aspekten kann das Substrat/Reagenz in einer gesonderten Reservoirkammer vorhanden sein, und die Zugabe zu dem Pellet 409 kann in der gleichen Kammer, wo das Pellet erzeugt wurde (z. B. Nachweiskammer 410), oder in einer gesonderten Kammer, wo das Pellet 409 und das Substrat/Reagenz vereinigt werden, erfolgen.
  • Wie oben erwähnt, schließen einige Aspekte der vorliegenden Offenbarung Biomarker ein, die mit einer bestimmten Erkrankung oder einem anderen Gesundheitszustand assoziiert sind. Zum Beispiel kann eine mikrofluidische Scheibe (die im Wesentlichen der Scheibe 400 von 4 ähneln kann) einen Satz von Fängermolekülen einschließen, die für ein Panel von mit Brustkrebs assoziierten Biomarkern spezifisch sind. Die Fängermoleküle können auf Mikrokügelchen immobilisiert sein, die in der mikrofluidischen Scheibe aufbewahrt werden. Die Biomarker können zwei oder mehr Biomarker beinhalten, die aus Her-2, MMP-2, CA 15-3, OPN, p53, VEGF, CA 125, CEA und SER ausgewählt sind. Zum Beispiel kann die Vorrichtung Fängermoleküle, die für CA 15-3 und OPN spezifisch sind, oder Fängermoleküle, die für Her-2, MMP-2, CA 15-3 und OPN spezifisch sind, einschließen.
  • Daher kann zum Beispiel die Vielzahl von Fängermolekülen eine Vielzahl von Fänger-Antikörpern einschließen, die für mit Brustkrebs assoziierte Biomarker spezifisch sind. In einigen Aspekten kann die Vielzahl von Fänger-Antikörpern mindestens zwei der folgenden Fänger-Antikörper einschließen: (1) Anti-Her-2 (z. B. monoklonaler anti-humaner ErbB2-Antikörper, Katalognr. MAB1129, Klon-Nr. 191924, geliefert von R&D Systems), (2) Anti-Matrix-Metallopeptidase 2 (MMP-2) (z. B. monoklonaler anti-humaner MMP-2-Antikörper, Katalognr. MAB902, Klon-Nr. 36006.211, geliefert von R&D Systems), (3) Anti-CA-15-3 (z. B. monoklonaler anti-humaner CA-15-3-Antikörper, Katalognr. 10-C03, Klon-Nr. M8071022, geliefert von Fitzgerald Industries), (4) Anti-Osteopontin (OPN) (z. B. monoklonaler anti-humaner Osteopontin-Antikörper, Katalognr. MAB1433, Klon-Nr. 190312, geliefert von R&D Systems) und (5) Anti-Gefäßendothel-Wachstumsfaktor (VEGF) (z. B. gereinigter anti-humaner Maus-VEGF, Katalognr. AHGO114, Klon-Nr. A183C 13G8, geliefert von ThermoFisher Scientific). In mindestens einem Beispiel schließt der Satz von Fängermolekülen Folgendes ein: (1) Anti-Her-2 (z. B. monoklonaler anti-humaner ErbB2-Antikörper, Katalognr. MAB1129, Klon-Nr. 191924, geliefert von R&D Systems), (2) Anti-Matrix-Metallopeptidase 2 (MMP-2) (z. B. monoklonaler anti-humaner MMP-2-Antikörper, Katalognr. MAB902, Klon-Nr. 36006.211, geliefert von R&D Systems), (3) Anti-CA-15-3 (z. B. monoklonaler anti-humaner CA-15-3-Antikörper, Katalognr. 10-C03, Klon-Nr. M8071022, geliefert von Fitzgerald Industries) und (4) Anti-Osteopontin (OPN) (z. B. monoklonaler anti-humaner Osteopontin-Antikörper, Katalognr. MAB1433, Klon-Nr. 190312, geliefert von R&D Systems). Jeder Kanal kann dem Testen von Folgendem entsprechen: dem Testen eines einzelnen Biomarkers (der z. B. für einen einzelnen Biomarker spezifische Fängermoleküle einschließt) oder dem Testen von mehreren Biomarkern (die z. B. Fängermoleküle, die für zwei oder mehr Biomarker spezifisch sind, oder eine Vielzahl von Fängermolekülen, die jeweils für einen unterschiedlichen Biomarker spezifisch sind, einschließen).
  • Vorrichtungen gemäß der vorliegenden Offenbarung können eine Nachweiskomponente zum Nachweisen eines Ziels (z. B. Biomarkers), das wie oben besprochen über Fängermoleküle an Mikrokügelchen gebunden ist, einschließen. 5 zeigt ein beispielhaftes Vorrichtung, die eine mikrofluidische Scheibe 500, eine Energiequelle wie etwa einen Motor 550 und eine Nachweiskomponente 560 beinhaltet. Die Scheibe 500 kann ein beliebiges der Merkmale der Scheiben 100, 200 und/oder 400, die oben besprochen werden, beinhalten, einschließlich z. B. einer Vielzahl von Kanälen 503 und einer mittigen Öffnung 505. Die Kanäle 503 können in Kommunikation mit einer Vielzahl von Nachweiskammern stehen, die aufeinanderfolgend mit A bis P markiert sind, wie gezeigt. Die Scheibe kann über einen Schaft 540 betriebsfähig mit dem Motor 550 gekoppelt sein, so dass der Motor 550 Energie für die Rotation der Scheibe 500 über den Schaft 540 liefern kann. Der Motor kann die Rotation der Scheibe 500 entgegen dem Uhrzeigersinn (in der Richtung des in 5 gezeigten Pfeils) und/oder im Uhrzeigersinn mit einer vorbestimmten Geschwindigkeit oder einer Reihe vorbestimmter Geschwindigkeiten steuern.
  • Die Nachweiskomponente 560 kann dazu ausgelegt sein, das Vorhandensein von Zielen nachzuweisen, indem sie Signale von Nachweismolekülen misst, die an die Ziele gebunden sind und in den jeweiligen Nachweiskammern A bis P am Rand oder in der Nähe des Rands der Scheibe 500 gesammelt worden sind. Zum Beispiel kann die Nachweiskomponente 560 Absorptionsvermögen, Fluoreszenz, Chemilumineszenz oder Elektrochemilumineszenz oder einen beliebigen anderen Typ von Signalen von einer nachweisbaren Markierung der Scheibe 500 nachweisen. Die Menge eines Ziels in jeder Nachweiskammer A bis P (und somit die Konzentration des Ziels in der ursprünglichen Probe) kann auf der Grundlage des nachgewiesenen Signals, der Lage jeder der Nachweiskammern A bis P im Verhältnis zu den anderen und den Rotationscharakteristika der Scheibe 500 ermittelt werden. Falls zum Beispiel die Sammlung des Signals beginnt, wenn die Nachweiskomponente 560 mit der Nachweiskammer A ausgerichtet ist, dann kann, während die Scheibe 500 rotiert, die Menge des von Nachweiskammer A gesendeten Signals von der Menge des von den Nachweiskammern B bis P gesendeten Signals unterschieden werden, und zwar auf der Grundlage der Rotationsgeschwindigkeit und der Lage von Nachweiskammer A. Daher kann die Nachweiskomponente 560 für jede volle Rotation der Scheibe 500 ein Signal für jede der Nachweiskammern A bis P sammeln. Wenn die Nachweiskammern A bis P verschiedene Ziele enthalten (z. B. aufgrund der Verwendung verschiedener Fängermoleküle zum Binden an die Ziele, wie oben besprochen), können die Konzentrationen mehrerer in der Probe vorhandener Ziele gleichzeitig oder im Wesentlichen gleichzeitig bestimmt werden.
  • In einigen Aspekten kann die Nachweiskomponente 560 ein optischer Detektor sein, der eine Lichtquelle 565 zum Erzeugen von Licht, einen Detektor 567 und Optiken 562 (z. B. Spiegel und/oder Linsen), die Licht von der Lichtquelle 565 zu der Scheibe 500 leiten und von der Scheibe 500 ausgesendetes Licht zu dem Detektor 567 umleiten, beinhalten. In mindestens einer Ausführungsform beinhaltet die Nachweiskomponente Lichtanregung bei unterschiedlichen Wellenlängen im sichtbaren Bereich und auch außerhalb des sichtbaren Bereichs, insbesondere eine Laseranregung oder eine LED-Anregung und einen CMOS-Sensor zum Nachweis spezifischer Wellenlängen, wobei ein oder mehr angemessene Filter und/oder zweifarbige Strahlenteiler verwendet werden.
  • Die Nachweiskomponente 560 kann ferner ein Lesegerät zum Analysieren von Daten vom Detektor 567 und einen Bildschirm zum Anzeigen der Ausgabe von dem Lesegerät einschließen. Das Lesegerät kann optisch sein. In einigen Ausführungsformen kann die Nachweiskomponente 560 ein Bildgebungssystem einschließen, das z. B. eine CCD-Kamera (Kamera mit einem ladungsgekoppelten Element) beinhaltet. Die Ausgabe von dem Bildgebungssystem kann auf einem Computerbildschirm oder einer anderen Benutzerschnittstelle oder einem anderen Sichtgerät angezeigt werden, z. B. insbesondere auf einem Flüssigkristallanzeige-Gerät (LCD-Gerät). In einigen Aspekten kann die Ausgabe von dem Bildgebungssystem zu einer fernen Benutzerschnittstelle übertragen werden, wie etwa zu einem Tablet-Computer oder anderen computergesteuerten Gerät wie etwa einem Laptop oder Smartphone. Die Daten können mittels Kabel- oder kabelloser Kommunikation übertragen werden, insbesondere mittels Bluetooth, und/oder können auf fernen Servern, z. B. in der Internet-Cloud, gespeichert oder archiviert werden.
  • 6 zeigt ein beispielhaftes Gehäuse 600 einer Vorrichtung gemäß einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung. Das Gehäuse kann zum Beispiel die Vorrichtung von 5 enthalten. In einigen Aspekten kann das Gehäuse 600 eine Abdeckung (die z. B. wie gezeigt über Scharniere oder einen anderen geeigneten Mechanismus bewegt werden kann) und eine Tür 620 einschließen, die zum Einlegen und Entnehmen einer mikrofluidischen Scheibe geöffnet und geschlossen werden kann.
  • Das Analysieren einer Probe gemäß der vorliegenden Offenbarung kann das Ermitteln eines Werts oder eines Satzes von Werten, die mit einer gegebenen Probe assoziiert sind, durch eine oder mehr quantitative und/oder qualitative Messungen einschließen. Zum Beispiel schließt das „Analysieren“ gemäß einigen Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung Folgendes ein: das Messen von Expressionsspiegeln der Bestandteile in einer von einem Individuum erhaltenen Probe und das Vergleichen der Spiegel mit Bestandteilspiegeln in einer Probe oder einem Satz von Proben von dem gleichen Individuum (wobei die Proben z. B. zu verschiedenen Zeiten entnommen werden, um das Fortschreiten eines potenziellen Gesundheitszustands zu beurteilen) oder von (einem) anderen Individuum (Individuen) (z. B. zum Vergleich mit einer bestätigten medizinischen Diagnose einer Erkrankung oder dem Nichtvorliegen einer Erkrankung bei einem anderen Individuum). Die gemäß der vorliegenden Offenbarung erhaltenen Daten können das Vorhandensein oder Fehlen eines spezifischen Biomarker oder spezifischer Biomarker in der Probe oder das Vorhandensein oder Fehlen der Vielzahl von Biomarkern in der Probe einschließen. In einigen Ausführungsformen können die Daten die Konzentration einer Vielzahl von Biomarkern in einer Probe und ihr relatives Vorhandensein im Vergleich mit einem physiologischen Spiegel einschließen, um z. B. die Überexpression, normale Expression oder Unterexpression einer Vielzahl von Biomarkern zu bestimmen.
  • In mindestens einer Ausführungsform beinhaltet die Punktbewertung der Probe das Analysieren der Daten und Ausgeben eines Punktwerts. Ein „Punktwert“ kann insbesondere ein Wert oder ein Satz von Werten sein, die für analytische, vergleichende, diagnostische und/oder andere Zwecke gemäß der vorliegenden Offenbarung ausgewählt und/oder verwendet werden können. In einigen Ausführungsformen kann zum Beispiel ein Punktwert verwendet werden, um den Gesundheitszustand oder die Krankheit eines Individuums zu beurteilen, z. B. auf der Grundlage einer gemessenen Menge von einem oder mehr Bestandteilen (z. B. Zielen, wie etwa Biomarkern) einer von dem Individuum erhaltenen Probe.
  • Die Analyse der Daten kann die Verwendung eines Vorhersagemodells einschließen. Ein „Vorhersagemodell“ kann insbesondere ein mathematisches Konstrukt sein, das unter Verwendung eines Algorithmus oder einer Kombination von Algorithmen zum Gruppieren von Datensätzen entwickelt wurde, z. B. um die Unterscheidung der gruppierten Daten zu erlauben. Ein Vorhersagemodell gemäß der vorliegenden Offenbarung kann unter Verwendung jedes geeigneten mathematischen und/oder statistischen Verfahrens entwickelt werden, insbesondere der Hauptkomponentenanalyse (PCA) und/oder linearen Diskriminanzanalyse (LDA). In einigen Beispielen schließen die gruppierten Daten Daten für jeden Biomarker eines Biomarker-Panels ein.
  • Die PCA ist eine Technik, die verwendet werden kann, um multidimensionelle Datensätze zum Verringern der Dimensionen für die Analyse zu reduzieren. Mathematisch lässt sich die PCA als eine orthogonale lineare Transformation definieren, die Daten in ein neues Koordinatensystem transformiert, so dass die größte Varianz durch eine beliebige Projektion der Daten auf die erste Koordinate fällt (diese wird als die erste Hauptkomponente bezeichnet), die zweitgrößte Varianz auf die zweite Koordinate, und so weiter. Die PCA kann als Werkzeug bei der explorativen Datenanalyse und zum Erstellen von Vorhersagemodellen verwendet werden. Die PCA kann auch eine Berechnung der Eigenwertzerlegung einer Datenkovarianzmatrix oder Singulärwertzerlegung einer Datenmatrix einschließen, z. B. nach dem Mittelzentrieren der Daten für jedes Attribut. Die Ergebnisse einer PCA können in Bezug auf die Komponentenpunktwerte und Lasten besprochen werden.
  • Die LDA ist ein Verfahren, das verwendet werden kann, um die lineare Kombination von Merkmalen zu finden, die zwei oder mehr Klassen von Objekten oder Ereignissen am besten trennt. Die resultierende Kombination kann als linearer Klassifizierer oder alternativ für die Reduktion der Dimensionalität vor einer später erfolgenden Klassifikation verwendet werden.
  • Die vorliegende Offenbarung schließt ein Verfahren zur Punktbewertung einer Probe von einem Individuum ein, wobei das Verfahren z. B. das Kategorisieren einer menschlichen Probe unter Verwendung quantitativer Daten, die mit einer Vielzahl von Biomarkern assoziiert sind, beinhaltet, wobei die Biomarker mit einer bestimmten Erkrankung oder einem anderen Gesundheitszustand, z. B. Brustkrebs, assoziiert sind. Zum Beispiel kann das Verfahren zum Kategorisieren der Probe Daten verwenden, die mit einer Vielzahl von mit Brustkrebs assoziiierten Biomarkern assoziiert sind. In einigen Aspekten schließt die Vielzahl von mit Brustkrebs assoziierten Biomarkern mindestens CA 15-3 und OPN ein. Zu den zusätzlichen Biomarkern können z. B. Her-2, MMP-2, VEGF, p53, CA 125, CEA und/oder SER zählen. Zum Beispiel kann die Vielzahl von Biomarkern CA 15-3, OPN, Her-2 und MMP-2 oder CA 15-3, OPN, Her-2, p53, CA 125, CEA und SER einschließen. In mindestens einer Ausführungsform verwendet das Verfahren zum Kategorisieren einer Probe Daten, die mit den folgenden Biomarkern assoziiert sind: CA 15-3, OPN, Her-2 und MMP-2.
  • Die Analyse gemäß einigen Verfahren der vorliegenden Offenbarung kann das Kategorisieren einer Probe (z. B. Kategorisieren der Spiegel von Biomarkern einer Probe gemäß einem Biomarker-Panel) in Kategorien gemäß einem Punktwert, der mit dem Vorhersagemodell produziert wird, einschließen. Die Überexpression von Biomarkern kann im Allgemeinen als ein Anzeichen einer Erkrankung verstanden werden. Auf der Grundlage der Menge an Überexpression können ein angemessener Punktwert und eine angemessene Kategorie zugewiesen werden. Es liegen Berichte zu Erkrankungskategorien und den entsprechenden Biomarkerspiegeln vor. Siehe beispielsweise US-Patentanmeldungs-Publikation Nr. 2008/0200342 A1, die durch Bezugnahme in dieses Dokument aufgenommen wird. Zu den Kategorien können zum Beispiel eine Kategorisierung als gesund (z. B. frei von der Erkrankung), eine Kategorisierung als im Frühstadium der Erkrankung befindlich und eine Kategorisierung als im Spätstadium der Erkrankung befindlich zählen. Zum Beispiel kann die Kategorisierung aus einer Kategorisierung als gesund, einer Kategorisierung als im Frühstadium der Erkrankung befindlich oder einer Kategorisierung als im Spätstadium der Erkrankung befindlich ausgewählt sein.
  • Diagnostische Informationen, die gemäß der vorliegenden Offenbarung erhalten wurden, können mit Bezugsdaten von Biomarkerspiegeln verglichen werden, die für Patienten mit einer bestätigten Diagnose der gleichen Erkrankung oder dem gleichen Gesundheitszustand gemessen wurden. Die Wahrscheinlichkeit, dass die Diagnose korrekt ist, kann berechnet werden, z. B. als eine lineare Regression der Daten zur Errechnung von Spezifität und Sensitivität des Panels. Die Wahrscheinlichkeit, dass die Kategorisierung korrekt ist, kann modellabhängig und/oder biomarkerabhängig sein und kann zu mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 87%, mindestens 90% oder mindestens 95% korrect sein. In einigen Ausführungsformen kann eine Wahrscheinlichkeit, dass die Kategorisierung korrekt ist, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 87%, mindestens 90% oder mindestens 95% betragen. In einem Beispiel kann ein einzelner Biomarker zur Untersuchung von Patienten mit Brustkrebs einen Vorhersagewert von weniger als 70% bereitstellen, wohingegen ein Panel von gleichzeitig getesteten Biomarkern einen kombinierten Effekt bereitstellen können, um den Vorhersagewert auf mehr als 90%, z. B. auf einen Vorhersagewert von 91%, zu erhöhen.
  • Wie oben erwähnt, können bei der Entwicklung oder beim Fortschreiten einer Erkrankung oder eines anderen Gesundheitszustands im Laufe der Zeit einige oder alle Biomarker eines Biomarker-Panels überexprimiert werden und weiterhin überexprimiert werden. Daher kann das Messen der Biomarker zu verschiedenen Zeitpunkten (z. B. über Monate und/oder Jahre hinweg, gemäß dem Stadium oder der Aggressivität der Erkrankung) Informationen zum Fortschreiten der Erkrankung bei dem Individuum bereitstellen. Zum Beispiel können Biomarkerspiegel alle 1, 2, 3 oder 4 Wochen, alle 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 oder 12 Monate oder alle 1, 2, 3, 4 oder 5 Jahre gemessen werden. Für jeden Satz von Messungen eines Biomarker-Panels kann ein Punktwert bestimmt werden, wie dies oben besprochen wurde. In einigen Aspekten kann ein erster Punktwert (der z. B. auf den beim ersten Mal gemessenen Spiegeln von Biomarkern in einem Biomarker-Panel basiert) für eine erste von einem Individuum erhaltenen Probe mit einem zweiten Punktwert (der z. B. auf den zu einem zweiten, späteren Zeitpunkt gemessenen Spiegeln für das gleiche Biomarker-Panel basiert), der für eine zweite von dem Individuum erhaltene Probe bestimmt wird, verglichen werden. Dieser Vergleich kann auch verwendet werden, um z. B. den Fortschritt oder die Wirksamkeit der Therapie für die Behandlung der Erkrankung zu ermitteln. Eine Differenz zwischen dem ersten Punktwert und dem zweiten Punktwert kann auf ein Erkrankungsstadium hinweisen, wie etwa auf ein Brustkrebs-Erkrankungsstadium. In einigen Ausführungsformen kann der Punktwert verwendet werden, um eine neoplastische Brusterkrankung, wie etwa Brustkrebs, zu diagnostizieren.
  • Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Offenbarung veranschaulichen, ohne jedoch in ihrem Wesen einschränkend zu sein. Es versteht sich, dass die vorliegende Offenbarung zusätzliche Ausführungsformen, die mit der vorstehenden Beschreibung und den folgenden Beispielen vereinbar sind, umfassen.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1
  • Ein Multiplex-Assay für ein Panel von 5 Biomarkern von Brustkrebs wird unter Verwendung einer mikrofluidischen Scheibe wie folgt durchgeführt:
    • (1) Von einem Individuum wird eine Vollblutprobe durch Einstich in die Fingerbeere oder Venenpunktion erhalten.
    • (2) Ein Tropfen des Bluts wird über eine Einweg-Transfermesspipette in eine Einlasskammer der Scheibe eingeführt.
    • (3) Die Scheibe wird in eine mikrofluidische Vorrichtung gelegt, die einen Motor als Energiequelle und einen optischen Detektor enthält, und die Abdeckung der Vorrichtung wird geschlossen. Die Scheibe wird so positioniert, dass sie mit dem Motor (der die Richtung und Geschwindigkeit der Scheibenrotation steuert) gekoppelt ist und oberhalb des Detektors positioniert wird, wobei der Detektor zur Peripherie der Scheibe hin liegt. Die Vorrichtung schließt ein Programm zum Ausführen eines Brustkrebsuntersuchungs-Assays durch Rotation der Scheibe in einer Reihe von vorbestimmten Geschwindigkeiten wie in den folgenden Schritten (4) bis (11) beschrieben ein. Das Assay-Programm wird aktiviert.
    • (4) Die Scheibe wird mit 1000 Umdrehungen pro Minute (U/min) gedreht, um die Probe von der Einlasskammer in eine Bluttrennkammer zu transferieren.
    • (5) Dann wird die Scheibe mit 3000 U/min gedreht, um die Blutzellen von dem Plasma im Blut zu trennen.
    • (6) Dann wird die Scheibe mit 250 U/min gedreht, um das Plasma in einzelne Messkammern (5 µl Plasma in jede Messkammer) zu befördern, die in Kommunikation mit der Bluttrennkammer stehen.
    • (7) Dann wird die Scheibe mit 750 U/min gedreht, um zusätzliches Plasma in eine Abfallkammer, die in Kommunikation mit den Messkammern steht, auszusondern.
    • (8) Dann wird die Scheibe mit 1000 U/min gedreht, um das Plasma aus den Messkammern in jeweilige Inkubationskammern, die in Kommunikation mit den Messkammern stehen, zu bewegen. Jede Inkubationskammer enthält Reagenzien (Fänger-Antikörper, die an Mikrokügelchen angeheftet sind, Nachweis-Antikörper und beliebige Zusatzstoffe wie etwa Salze und/oder Puffer zum Steuern des pH-Werts), die für einen der Biomarker des Panels spezifisch sind, um den Biomarker zu analysieren. Die Reagenzien schließen die Mikrokügelchen (angeheftet an die Fängermoleküle) ein, die in flüssigen, gelförmigen oder lyophilisierten Material(ien) suspendiert sind.
    • (9) Die Scheibe wird mit 300 U/min in einer einzelnen Richtung oder abwechselnd mit dem Uhrzeigersinn und entgegen dem Uhrzeigersinn gedreht, um die Rekonstitution der Reagenzien und die Kinetik der Reaktion zwischen den Biomarkern und den Reagenzien zu verbessern.
    • (10) Dann wird die Scheibe mit 2000 U/min gedreht, um die inkubierte Probe in Trennkammern zu bewegen, die in Kommunikation mit den jeweiligen Inkubationskammern stehen, wo die an Mikrokügelchen gebundenen Biomarker im Innern der jeweiligen Nachweiskammern an der Peripherie der Scheibe Pellets bilden.
    • (11) Während die Scheibe weiter bei 2000 U/min gedreht wird, wird der Nachweis der Biomarker der Pellets durch den optischen Detektor durchgeführt, der unter der Ebene der Scheibe in der Nähe der Nachweiskammern positioniert ist.
    • (12) Das Rohsignal (Fluoreszenz, Lumineszenz und/oder Absorption) wird erfasst, verstärkt und analysiert. Das Signal wird erfasst und wird mit jedem Biomarker korreliert, um die Konzentration jedes Biomarkers in der ursprünglichen Blutprobe zu bestimmen.
  • Beispiel 2
  • Mikrofluidische Scheiben in Übereinstimmung mit der vorliegenden Offenbarung wurden verwendet, um Fluoreszenzmessungen für verschiedene Konzentrationen der folgenden Brustkrebs-Biomarker vorzunehmen: CA 15-3, MMP-2, Her-2, OPN und VEGF. Die Schritte des Assays ähneln im Wesentlichen denen von Beispiel 1. Die Fluoreszenz wurde in relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU) gemessen. Die Ergebnisse sind in 7 bis 11 gezeigt. Jede Scheibe schloss 12 Einlässe ein, wobei jeder Einlass in Kommunikation mit 5 Messkammern stand und jede Messkammer in Kommunikation mit einer Reaktionskammer, einer Trennkammer und einer Nachweiskammer stand (insgesamt 60 Kanäle). Für jede Probe wurde ein Aliquot von 5 µl humanem Plasma, versetzt mit bekannten Konzentrationen der jeweiligen Biomarker, verwendet. Für jeden Biomarker wurde eine Scheibe verwendet, wobei unterschiedliche Konzentrationen des Biomarkers in die verschiedenen Einlässe zugegeben wurden. Die Inkubationszeit für die Reaktion betrug in jedem Fall 15 Minuten.
  • Es wurden die folgenden Fänger-Antikörper und Nachweis-Antikörper verwendet, wobei die Fänger-Antikörper auf mit Carboxylgruppen funktionalisierten Siliziumkügelchen mit einem Durchmesser von 1 µm immobilisiert waren und die Nachweis-Antikörper mit Phycoerythrin (PE) konjugiert waren:
    • – CA 15-3: Fänger-Antikörper = Anti-CA-15-3; Nachweis-Antikörper = Anti-CA-15-3
    • – MMP-2: Fänger-Antikörper = Anti-MMP-2; Nachweis-Antikörper = Anti-MMP-2
    • – Her-2: Fänger-Antikörper = Anti-Her-2; Nachweis-Antikörper = Anti-Her-2
    • – OPN: Fänger-Antikörper = Anti-OPN; Nachweis-Antikörper = Anti-OPN
    • – VEGF: Fängermolekül = Anti-VEGF; Nachweis-Antikörper = Anti-VEGF
  • Die Probe wurde durch Zentrifugalkräfte vom Probeneinlass zu den anderen Kammern/Abteilungen der mikrofluidische Kreise hin bewegt, wobei der letzte Schritt darin bestand, ein Pellet der mit dem Fänger-Antikörper konjugierten Kügelchen im Innern der Nachweiskammer am Rand der Scheibe zu erstellen, wo die Gesamtfluoreszenz des Pellets erfasst wurde.
  • Die Offenbarung und Beispiele sollten lediglich als beispielhaft betrachtet werden, und der wahre Umfang und das wahre Wesen der vorliegenden Offenbarung wird durch die folgenden Ansprüche angezeigt.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Patentliteratur
    • US 5565332 [0038]
    • US 5580717 [0038]
    • US 5733743 [0038]
    • US 6265150 [0038]

Claims (35)

  1. Eine Vorrichtung, die Folgendes beinhaltet: eine Scheibe, die eine Vielzahl mikrofluidischer Kanäle einschließt, die sich in einer radialen Richtung aus der Scheibe erstrecken, wobei die mikrofluidischen Kanäle eine Vielzahl von Fängermolekülen, die für mindestens einen Biomarker spezifisch sind, beinhalten, wobei jedes Fängermolekül von der Vielzahl von Fängermolekülen an ein Partikel angeheftet ist.
  2. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Vielzahl mikrofluidischer Kanäle einen ersten Kanal, der eine Vielzahl von ersten Fängermolekülen einschließt, die für einen ersten Biomarker spezifisch sind, und einen zweiten Kanal, der eine Vielzahl von zweiten Fängermolekülen einschließt, die für einen zweiten, von dem ersten Biomarker verschiedenen Biomarker spezifisch sind, beinhaltet.
  3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Scheibe 12 bis 60 mikrofluidische Kanäle einschließt.
  4. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei jedes Fängermolekül an ein Mikrokügelchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser im Bereich von 100 nm bis 10 µm angeheftet ist.
  5. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei jedes Fängermolekül an ein Mikrokügelchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser im Bereich von etwa 1 µm angeheftet ist.
  6. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei jedes Fängermolekül von der Vielzahl von Fängermolekülen einen Antikörper beinhaltet.
  7. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vielzahl von Fängermolekülen Fängermoleküle einschließt, die für Biomarker spezifisch sind, die aus humanem Östrogenrezeptor 2 (Her-2), Matrix-Metallopeptidase-2 (MMP-2), Krebsantigen 15-3 (CA 15-3), Gefäßendothel-Wachstumsfaktor (VEGF) oder Osteopontin (OPN) ausgewählt sind.
  8. Vorrichtung nach Anspruch 7, wobei die Vielzahl von Fängermolekülen für Her-2, MMP-2, CA 15-3 und OPN spezifische Fängermoleküle einschließt.
  9. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vielzahl von Fängermolekülen Fängermoleküle einschließt, die für Biomarker spezifisch sind, die aus humanem Östrogenrezeptor 2 (Her-2), Matrix-Metallopeptidase-2 (MMP-2), Krebsantigen 15-3 (CA 15-3), Gefäßendothel-Wachstumsfaktor (VEGF), Osteopontin (OPN), Tumorprotein p53 (p53), Krebsantigen 125 (CA 125), karzinoembryonalem Antigen (CEA) oder Serum-Östrogenrezeptor (SER) ausgewählt sind.
  10. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vielzahl von Fängermolekülen mindestens einen Antikörper einschließt, der aus den Antikörpern Klon 191924, Klon 36006.211, Klon M8071022 oder Klon 190312 ausgewählt ist.
  11. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vielzahl von Fängermolekülen von einem Blocker blockierte Fängermoleküle einschließt.
  12. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die ferner eine Energiequelle und einen Detektor beinhaltet.
  13. Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei der Detektor dazu ausgelegt ist, Fluoreszenz oder Chemilumineszenz nachzuweisen.
  14. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vielzahl mikrofluidischer Kanäle einen ersten mikrofluidischen Kanal, der einen ersten Satz von für einen ersten Biomarker spezifischen Fängermolekülen enthält, einen zweiten mikrofluidischen Kanal, der einen zweiten Satz von für einen zweiten, von dem ersten Biomarker verschiedenen Biomarker enthält, und einen dritten mikrofluidischen Kanal, der einen dritten Satz von für einen dritten, von dem ersten Biomarker und dem zweiten Biomarker verschiedenen Biomarker enthält, einschließt.
  15. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Scheibe mindestens einen Probeneinlass beinhaltet, der dazu ausgelegt ist, Plasma von Vollblut zu trennen.
  16. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vielzahl mikrofluidischer Kanäle eine Vielzahl von Nachweismolekülen beinhaltet, wobei jedes Nachweismolekül eine nachweisbare Markierung einschließt.
  17. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vorrichtung zum Durchführen eines Verfahrens zum Nachweis von Biomarkern eingerichtet ist.
  18. Vorrichtung nach Anspruch 17, wobei das Verfahren Folgendes beinhaltet: Einführen einer Fluidprobe in mindestens einen mikrofluidischen Kanal der Scheibe; Drehen der Scheibe, so dass die Fluidprobe radial nach außen durch den mindestens einen mikrofluidischen Kanal fließt, um sich mit mindestens einem von der Vielzahl von Fängermolekülen zu vereinigen; und Nachweisen eines Signals von der Scheibe, das einen Hinweis auf ein Vorhandensein von mindestens einem Biomarker der Fluidprobe liefert.
  19. Vorrichtung nach Anspruch 18, wobei die Fluidprobe eine Vielzahl von Biomarkern beinhaltet, die mit einem Gesundheitszustand assoziiert sind.
  20. Vorrichtung nach Anspruch 19, wobei der Gesundheitszustand Brustkrebs ist.
  21. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei die Fluidprobe mindestens einen Biomarker, ausgewählt aus humanem Östrogenrezeptor 2 (Her-2), Matrix-Metallopeptidase-2 (MMP-2), Krebsantigen 15-3 (CA 15-3), Gefäßendothel-Wachstumsfaktor (VEGF), Osteopontin (OPN), Tumorprotein p53 (p53), Krebsantigen 125 (CA 125), karzinoembryonalem Antigen (CEA) Vorrichtung Serum-Östrogenrezeptor (SER), beinhaltet.
  22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 17 bis 21, wobei die Vielzahl von Fängermolekülen Fängermoleküle einschließt, die für mit Brustkrebs assoziierte Biomarker spezifisch sind.
  23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 17 bis 22, wobei die Vielzahl von Fängermolekülen Fängermoleküle einschließt, die für mindestens einen Biomarker, ausgewählt aus humanem Östrogenrezeptor 2 (Her-2), Matrix-Metallopeptidase-2 (MMP-2), Krebsantigen 15-3 (CA 15-3), Gefäßendothel-Wachstumsfaktor (VEGF), Osteopontin (OPN), Tumorprotein p53 (p53), Krebsantigen 125 (CA 125), karzinoembryonalem Antigen (CEA) oder Serum-Östrogenrezeptor (SER), spezifisch sind.
  24. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 17 bis 23, wobei jedes Fängermolekül an ein Mikrokügelchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser im Bereich von 100 nm bis 10 µm angeheftet ist.
  25. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 17 bis 24, wobei jedes Fängermolekül an ein Mikrokügelchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von etwa 1 µm angeheftet ist.
  26. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 17 bis 25, wobei jedes Fängermolekül von der Vielzahl von Fängermolekülen einen Antikörper beinhaltet.
  27. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 26, wobei die Fluidprobe Blut beinhaltet oder aus Blut erhalten ist.
  28. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 27, wobei die Fluidprobe menschliches Blut, menschliches Blutplasma oder menschliches Blutserum beinhaltet.
  29. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 28, wobei das Nachweisen des Signals von der Scheibe das Nachweisen eines Fluoreszenzsignals eines Nachweismoleküls, das an den mindestens einen Biomarker angeheftet ist, einschließt.
  30. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 28, wobei das Nachweisen des Signals von der Scheibe das Nachweisen von Chemilumineszenz einschließt.
  31. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 30, wobei das Nachweisen des Signals von der Scheibe das Analysieren der Fluidprobe mit einem optischen Lesegerät einschließt, um ein Vorhandensein oder Fehlen des mindestens einen Biomarkers in der Fluidprobe zu ermitteln.
  32. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 17 bis 31, wobei die Vielzahl von Fängermolekülen mindestens einen Antikörper einschließt, der aus den Antikörpern Klon 191924, Klon 36006.211, Klon M8071022 oder Klon 190312 ausgewählt ist.
  33. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 32, wobei das Vorhandensein des mindestens einen Biomarkers einen Hinweis auf eine medizinische Diagnose einer Erkrankung liefert.
  34. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 33, wobei der mindestens eine Biomarker eine Vielzahl von mit Brustkrebs assoziierten Biomarkern einschließt und das Verfahren das Vergleichen eines Spiegels von jedem Biomarker von der Vielzahl von Biomarkern in einer ersten von einem Individuum erhaltenen Fluidprobe mit einem Spiegel von jedem Biomarker von der Vielzahl von Biomarkern in einer zweiten von einem Individuum erhaltenen Fluidprobe einschließt.
  35. Vorrichtung nach Anspruch 34, wobei die erste Fluidprobe mindestens eine Woche, bevor die zweite Fluidprobe von dem Individuum erhalten wird, von dem Individuum erhalten wird.
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