JP2015224192A - 脂肪蓄積抑制物質の製造方法および脂肪蓄積抑制剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】二酸化炭素を用いてステビア発酵物から脂肪蓄積抑制物質を製造する方法であって、ステビア発酵物と、超臨界状態、亜臨界状態または液体状態の二酸化炭素とを接触させて前記二酸化炭素に溶解する成分を前記二酸化炭素に移行させる工程Aと、前記成分を二酸化炭素側に移行させたステビア発酵物を親水性極性溶媒と接触させる工程Bとを含み、前記工程Bの後に、前記親水性極性溶媒に含まれる脂肪蓄積抑制物質を分取することを特徴とする。
【選択図】なし
Description
ステビア発酵物と、超臨界状態、亜臨界状態または液体状態の二酸化炭素とを接触させて前記二酸化炭素に溶解する成分を前記二酸化炭素に移行させる工程Aと、
前記成分を二酸化炭素側に移行させたステビア発酵物を親水性極性溶媒と接触させる工程Bとを含み、
前記工程Bの後に、前記親水性極性溶媒に含まれる脂肪蓄積抑制物質を分取することを特徴とする、
脂肪蓄積抑制物質の製造方法を提供するものである。
前記工程Aと工程Bとを同時に実施することを特徴とする、前記脂肪蓄積抑制物質の製造方法を提供するものである。
ステビア発酵物と、超臨界状態、亜臨界状態または液体状態の二酸化炭素とを接触させて前記二酸化炭素に溶解する成分を前記二酸化炭素に移行させる工程Aと、
前記成分を二酸化炭素側に移行させたステビア発酵物を親水性極性溶媒と接触させる工程Bとを含み、
前記工程Bの後に、前記親水性極性溶媒に含まれる脂肪蓄積抑制物質を分取することを特徴とする、
脂肪蓄積抑制物質の製造方法である。また、本発明の第二は、前記製造方法で得た脂肪蓄積抑制物質を有効成分とする、脂肪蓄積抑制剤である。
本発明で使用するステビア植物(学名:Stevia rebaudiana)は、南アメリカを原産とするキク科ステビア属の多年草である。ステビア植物から抽出されるステビオシドやレバウディオサイドAなどのテルペノイド配糖体は甘味料として用いられ、現在、日本、中国、韓国などのアジアでも栽培されている。本発明では、特に、ステビア・レバウディアナ・ベルトニー(Stevia Rebaudiana Bertoni)及びその類縁植物を好適に使用することができる。ステビア植物として、ステビア植物の茎、葉、蕾を持つ前の全草、成熟した植物の根や花も使用することができる。
工程Aは、ステビア発酵物と、液体状態、亜臨界状態または超臨界状態の二酸化炭素(以下、超臨界二酸化炭素等とも称する。)とを接触させて前記二酸化炭素に溶解しうる成分を前記二酸化炭素に移行させる工程である。接触後の超臨界二酸化炭素等を系外に除去することで、ステビア発酵物から前記溶解成分を除去することができる。例えば、図1に示す超臨界二酸化炭素抽出装置を使用することができる。図1において、1は二酸化炭素ボンベ、2は昇圧機、3は予熱管、4は恒温槽、5は反応容器、6は背圧弁、7は受器、8は二酸化炭素排出管、9は抽出物取出管、10は親水性極性溶媒貯蔵部、11は弁、12は受器、13は抽出物である。反応容器5の内部は、符合a、bで示される金網が配設され、かつ上部金網aの上方および下部金網bの下方には、セラミックボールcを載置および充填することができる。反応容器5の下部には二酸化炭素導入口が形成され予熱管2と連設され、反応容器5の上部には排出口が設けられ、背圧弁6および受器7と連設されている。更に、下部側部に、反応容器5内の内容物を排出する排出口が形成され弁11および受器12と連設している。なお、予熱管3および反応容器5は、水を満たした恒温槽4に収納されている。
工程Bは、工程Aによって超臨界二酸化炭素等に溶解する成分を除去したステビア発酵物を親水性極性溶媒と接触させる工程である。工程Bは、工程Aに次いで行うこともでき、工程Aと同時に行うこともできる。
バッチ法とは、反応容器に全量の親水性極性溶媒を仕込み、超臨界二酸化炭素等による抽出を行う方法である。反応容器にステビア発酵物と共にステビア発酵物100質量部(乾燥重量)に対して30〜2000質量部、より好ましくは50〜1000質量部の親水性極性溶媒を仕込み、超臨界二酸化炭素等を反応容器5に導入し、背圧弁6を制御して反応容器5の上部に設けた二酸化炭素排出口から二酸化炭素を受器7側に排出させる。受器7の貯留された抽出物を経時的に分析して超臨界二酸化炭素等による抽出の終了を確認する。その後、反応容器5の内容物を取り出して固液分離すれば、反応容器5に仕込んだ親水性極性溶媒をろ液として分取することができる。この親水性極性溶媒には、ステビア発酵物に含まれる親水性極性物質が含まれている。
前記工程Bで得た親水性極性溶媒には、ステビア発酵物に含まれる親水性極性物質が含まれている。親水性極性溶媒を、図1の受器12に導入すれば、脂肪蓄積抑制物質13を分取することができる。得られた脂肪蓄積抑制物質は、更にシリカゲルカラムクロマトグラフィーや逆相カラムその他により、精製してもよい。
本発明の脂肪蓄積抑制剤は、前記した脂肪蓄積抑制物質を有効成分とするものである。脂肪蓄積抑制剤の剤型としては、丸剤、顆粒剤、散剤、液剤、スプレーなどがある。
ステビア発酵物の調製
日本国北海道産のステビア植物(学名:Stevia rebaudiana)の茎と葉とを乾燥させた乾燥ステビア植物を約1cm以下に粉砕した。粉砕ステビア植物2,000gに酵母菌(Saccharomyces)45g、水4,500gを加えて温度25〜35℃で好気条件下に撹拌すると、発酵が開始した。これを温度25〜35℃にて14日間静置、好気的に発酵させた。発酵物から甘味が消失しており、これを発酵終期とした。上記の発酵物を温度25〜35℃にて10日間乾燥させ、酵母発酵を停止した。これをステビア固体発酵物とする。
図1に示す超臨界二酸化炭素抽出装置を使用した。内径30mm、長さ200mm、内容積約140mlの筒型反応容器の底部に直径6mmのセラミックボールを20粒と金属金網とを固設した。製造例1で得たステビア固体発酵物5gと水50mlとを反応容器に仕込み、その上部に金網を装着し、その上部に直径6mmのセラミックボールを載置した。予熱管と反応容器とを恒温槽で60℃に加温した。二酸化炭素をボンベ圧で80℃まで昇温した後、30MPaまで圧入して、30分間静置した。次いで所定圧で二酸化炭素を7ml/minの流速で4時間送液した。この際、背圧弁から放出される成分を1時間毎に受器に捕集した。4時間後、二酸化炭素の送液を停止し、圧力を徐々に下げて反応容器の圧力を常圧に戻した。
検体に5vol%DMSO水溶液を加えて超音波処理により懸濁し、50mg/mLの試験液原液を調製した。試験液原液を培地で希釈し、検体濃度2,000、1,000及び500μg/mLの試験液を調製した。
マウス脂肪前駆細胞3T3−L1細胞(以下、単に3T3−L1細胞と表記する。ヒューマンサイエンス振興財団から入手)を24ウェルプレートに播種後3日間、ペニシリン−ストレプトマイシンを1容量%、牛胎児血清を10容量%含有するDMEM培地で培養した。培養後に、アディポゲネーシスアッセイキット(ケイマンケミカルカンパニー社製)の脂肪細胞分化剤を投与して脂肪細胞へ分化させた。なお、脂肪細胞分化剤の投与により、試験液の終濃度は、それぞれ1,000、500及び250μg/mLとなった。3日間培養後、培養液を新たに用意した試験液添加培地と交換した。更に4日間培養後、培養上清を除去し、アディポゲネーシスアッセイキットの仕様に従って細胞を固定した後、オイルレッドO溶液で染色した。倒立型位相差顕微鏡にて観察した結果を図2に示す。なお、アディポゲネーシスアッセイキットによる分化誘導を行わないものを前駆細胞(未分化)とし、培地のみを加えたものを未処置対照とし、塩化ベルベリン(和光純薬工業株式会社製)を終濃度1μg/mLとなるように加えたものを陽性対照として、同様に試験を行った結果も併せて図2に示す。
実施例1で使用した粉砕ステビア植物80gに水800mlを加えてレトルトパックに詰め、空気を押し出してヒートシールした。これを、温度85〜90℃、常圧で30分間保持し、殺菌した。次いで、温度35℃、圧力50MPaで21時間反応させた。この反応物は、甘味を示すBrix値が3.1であった。反応後にエキスを固液分離し、ろ液をフリーズドライした。これを未発酵ステビアとする。
未発酵ステビアに5vol%DMSO水溶液を加えて超音波処理により懸濁し、50mg/mLの試験液原液を調製した。この試験液原液を使用して実施例1と同様に脂肪蓄積抑制効果を評価した。実験概要を表1に、脂肪蓄積率を表3および図4に示す。
実施例1で使用した粉砕ステビア植物80gに水800mlを加えてレトルトパックに詰め、空気を押し出してヒートシールした。これを、温度85〜90℃、常圧で30分殺菌した。冷却後、レトルトパックを開封して酵母菌(Saccharomyces)14.4gおよびナリネ菌(Lactobacillus acidophilus)1.6gを添加し、空気を押し出してヒートシールした。温度35℃、圧力50MPaで21時間反応させた。この反応物は、甘味を示すBrix値が3.4であった。
次いで、実施例1と同様に、図1に示す超臨界二酸化炭素抽出装置の反応容器にレトルトパックの内容物を仕込み、80℃、30MPa、流量3.5L/minの条件で二酸化炭素抽出を4時間行った。4時間後、二酸化炭素の送液を停止し、圧力を徐々に下げて反応容器の圧力を常圧に戻した。
(1) 図3〜図5を比較して明らかなように、実施例1、比較例1、比較例2の何れも、1000μg/mlの濃度では、未処理対照よりも脂肪蓄積率が低く、脂肪蓄積抑制率を有することが判明した。これにより、ステビア植物には、脂肪蓄積抑制効果を有する成分が含まれていることが示唆された。
(2) 実施例1では、図3に示すように、オイルレッドO量を指標として、用量依存的な脂肪蓄積抑制率が観察された。図2の培養細胞の顕微鏡像に示すように、1000μg/ml投与、500μg/ml投与および250μg/ml投与との間に培養細胞数の相違がない。脂肪蓄積抑制物質の細胞毒性は低く、オイルレッドO量の低減は、脂肪細胞の脂肪蓄積抑制効果または脂肪産生抑制効果に由来するものと推定された。
(3) 500μg/mlの試料における実施例1、比較例1、比較例2の脂肪蓄積抑制効果の統計学的有意差を評価した結果を図6に示す。実施例1で使用した検体は、比較例1および比較例2に対して、それぞれ一元配置分散分析及びTurkey法による多重比較を行い、有意差が検出された。実施例1、比較例1、比較例2で得た検体は、高圧・高温処理条件を経る点で共通する。相違は、実施例1は好気条件で発酵させているが、比較例1および比較例2は、嫌気・加圧条件を経ている点である。従って、脂肪蓄積抑制効果の相違は、発酵過程の酸素の有無に由来する可能性があると推定された。
2 昇圧機、
3 予熱管、
4 恒温槽、
5 反応容器、
6 背圧弁、
7 受器、
8 二酸化炭素排出管、
9 抽出物取出管、
10 親水性極性溶媒貯蔵部、
11 弁、
12 受器、
13 抽出物
Claims (5)
- 二酸化炭素を用いてステビア発酵物から脂肪蓄積抑制物質を製造する方法であって、
ステビア発酵物と、超臨界状態、亜臨界状態または液体状態の二酸化炭素とを接触させて前記二酸化炭素に溶解する成分を前記二酸化炭素に移行させる工程Aと、
前記成分を二酸化炭素側に移行させたステビア発酵物を親水性極性溶媒と接触させる工程Bとを含み、
前記工程Bの後に、前記親水性極性溶媒に含まれる脂肪蓄積抑制物質を分取することを特徴とする、
脂肪蓄積抑制物質の製造方法。 - 前記ステビア発酵物と前記二酸化炭素との接触が、温度10〜130℃、圧力7〜80MPaであることを特徴とする、請求項1記載の脂肪蓄積抑制物質の製造方法。
- 前記ステビア発酵物が、好気条件で発酵させたステビア発酵物であることを特徴とする、請求項1または2記載の脂肪蓄積抑制物質の製造方法。
- 前記ステビア発酵物と共にステビア発酵物100質量部に対して30〜2000質量部の親水性極性溶媒を超臨界状態または亜臨界状態の二酸化炭素と接触させ、
前記工程Aと工程Bとを同時に実施することを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載の脂肪蓄積抑制物質の製造方法。 - 請求項1〜4のいずれかの製造方法で得た脂肪蓄積抑制物質を有効成分とする、脂肪蓄積抑制剤。
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