JP2015027960A - レスベラトロール加熱処理組成物を用いた遅筋形成促進剤 - Google Patents

Abstract

【課題】レスベラトロールよりも優れた遅筋形成促進剤組成物及び持久力向上剤組成物、ならびに前記遅筋形成促進剤組成物を含有する医薬品又は医薬部外品を提供すること。
【解決手段】レスベラトロールをアルカリ条件下で加熱処理して得られることを特徴とする遅筋形成促進剤組成物ならびに前記遅筋形成促進剤組成物を含有する医薬品又は医薬部外品。
【選択図】なし

Description

本発明は、レスベラトロールをアルカリ条件下で加熱処理する方法によって得られる組成物を有効成分とする遅筋形成促進剤及び持久力向上剤、遅筋形成促進剤を含有する医薬品及び医薬部外品に関するものである。

レスベラトロールは優れた機能性を多く有している。たとえば、血管拡張作用（非特許文献１）、抗動脈硬化作用（非特許文献２）、アミロイドβ分泌抑制作用（非特許文献３）などがある。このような現状から本発明者らはこれまでに、レスベラトロールを用いたユニークな化合物の合成及びその用途の開発を行ってきた（特許文献１）。

レスベラトロールには運動機能や筋肉のエネルギー代謝に有用な効果を示すことも先行技術で報告されている。たとえばレスベラトロールを有効成分とする持久力向上剤（特許文献２）、レスベラトロールを有効成分とするミトコンドリア生合成増強剤（特許文献３）が報告されている。

筋肉組織は体内最大のエネルギー消費器官であることから、そのエネルギー代謝を亢進することは、肥満症、糖尿病、循環器系疾患の予防や治療に高い効果を有している。そのため筋肉組織のエネルギー代謝の亢進作用を有するレスベラトロールは健康維持に有用な機能性を有しているといえる。

しかし、より効率的な方法として筋肉自体を代謝機能の高い組織に変換する方法が考えられる。そのターゲットとして考えられるのが遅筋である。遅筋は脂肪を主なエネルギー源とするタイプの筋肉であり、持久力に富む筋肉である。遅筋を発達させることは、有酸素運動の効果をより効果的に発揮させるために重要である。レスベラトロールは遅筋の発達を促進させることが示唆される報告がある（非特許文献４）。

また、レスベラトロールはヒト臨床試験においてその有用性を発揮するためには、多量のレスベラトロールを摂取する必要がある。たとえば、１日１５０ｍｇのレスベラトロールを３０日間摂取することで筋肉組織の代謝に重要な因子であるＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）が活性化されることが報告され（非特許文献５）、同時にインスリン抵抗性指数であるＨＯＭＡ−Ｒの改善も認められているが、このような量を毎日摂取することは現実的に困難である。

特開２０１１−２５１９１４号公報 特許第４７３９１６１号公報 特表２０１２−５２４０３３号公報

Ｇｅｅｒａｌ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７，ｐ３６３−３６６（１９９６） ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１６，ｐ５３３−５４０（２００５） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８０，ｐ３７３７７−３７３８２（２００５） Ｃｅｌｌ，１２７，ｐ１−１４（２００６） Ｃｅｌｌ，１３４，ｐ４０５−４１５（２００８）

本発明者らはこれまでにレスベラトロールの高機能化について様々に検討しており、その一例としてレスベラトロールを高温あるいは高圧下で加熱処理することにより、高機能な新規レスベラトロール誘導体の合成に成功している（特許文献１）。これらの合成方法は簡便であることのみならず、食品にも応用可能な安全性に優れた合成方法である点が優れたものである。
そして、本発明者らは種々合成方法を検討していく中で、レスベラトロールをアルカリ条件下で加熱処理することによって得られる組成物が遅筋形成促進作用を有することを見出すことに成功し、本発明を完成するに至った。

したがって、本発明は、レスベラトロールよりも優れた遅筋形成促進剤組成物及び持久力向上剤組成物、ならびに前記遅筋形成促進剤組成物を含有する医薬品又は医薬部外品を提供することを目的とする。

本発明の要旨は、
〔１〕レスベラトロールをアルカリ条件下で加熱処理して得られることを特徴とする遅筋形成促進剤組成物、
〔２〕式（１）：

、式（２）：

及び式（３）：

で示される３種類のレスベラトロール重合化合物を含有する前記〔１〕記載の遅筋形成促進剤組成物、
〔３〕レスベラトロールをアルカリ条件下で加熱処理して得られることを特徴とする持久力向上剤組成物、
〔４〕前記式（１）、式（２）及び式（３）で示される３種類のレスベラトロール重合化合物を含有する前記〔３〕記載の持久力向上剤組成物、
〔５〕前記遅筋形成促進剤組成物を含有する医薬品又は医薬部外品、
に関する。

本発明の遅筋形成促進剤組成物及び持久力向上剤組成物（以下、本発明の組成物ともいう）は、レスベラトロールをアルカリ条件下で加熱することで安全安価に製造することができ、しかも、前駆物質であるレスべラトロールよりも優れた遅筋形成促進作用を有していることから、新規の遅筋形成促進剤及び遅筋形成促進作用に関連する持久力向上剤として有用である。

図１は実施例１で製造した本発明の組成物のクロマトグラムを示す。番号はそれぞれ１：レスベラトロール、２：ＵＨＡ４００２、３：ＵＨＡ４００３、４：ＵＨＡ４０２２に対応している。 図２は実施例３で行った培養筋管細胞中のミオシン重鎖の定量結果を示す。レスベラトロールもしくは本発明の組成物で処理した筋管細胞中の遅筋型ミオシンと速筋型ミオシンをウェスタンブロット解析によって定量し、その比（遅筋型／速筋型）を算出している。本発明の組成物によって遅筋型ミオシン比率が向上していることがわかる。 図３は実施例４で行った培養筋管細胞中の遺伝子発現を定量ＰＣＲによって定量した結果を示す。定量したのは、遅筋型トロポニン１であるＴｎｎｉ１、遅筋で発現が上昇するＰＧＣ−１βを定量した。その結果、両遺伝子の発現量が本発明の組成物によって増加していることがわかる。

以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の遅筋形成促進剤組成物及び持久力向上剤組成物は、レスベラトロールをアルカリ条件下で加熱処理することで得られることを特徴とする。

本発明において、「遅筋形成促進剤」はヒト又は非ヒト動物の筋肉において遅筋形成が促進させることができる薬剤をいう。また「持久力向上剤」は、いずれもヒト又は非ヒト動物の筋肉において遅筋形成が促進させることで持久力の向上ができる薬剤をいう。
ヒト又は非ヒト動物の筋肉での遅筋形成は、具体的には、後述の実施例に記載の方法により測定することで確認することができる。

本発明者らは、鋭意検討した結果、レスベラトロールを加熱処理することで、有害な試薬や工程を必要とせずに、遅筋形成促進作用を有する組成物を効率的で安全に製造することができることを見出した。

本発明では、原料としてレスベラトロールを用いる。

レスベラトロールにはトランス体とシス体の構造異性体が存在するが、加熱や紫外線によってトランス体とシス体の変換が一部生じる。したがって、本発明では、レスベラトロールとしては、トランス体でもシス体でも、あるいはトランス体とシス体の混合物であってもよい。

また、レスベラトロールには、薬学的に許容可能な塩も含まれる。薬学的に許容可能な塩としては、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩、バリウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩；アルミニウムヒドロキシド塩等の金属ヒドロキシド塩；アルキルアミン塩、ジアルキルアミン塩、トリアルキルアミン塩、アルキレンジアミン塩、シクロアルキルアミン塩、アリールアミン塩、アラルキルアミン塩、複素環式アミン塩等のアミン塩；α−アミノ酸塩、ω−アミノ酸塩等のアミノ酸塩；ペプチド塩又はそれらから誘導される第１級、第２級、第３級若しくは第４級アミン塩等が挙げられる。これらの薬学的に許容可能な塩は、単独で又は２種以上を混合して用いることができる。

前記レスベラトロールは、ブドウ果皮から抽出・精製した天然由来のものであっても、化学合成された純度の高い化成品であってもよい。天然由来のレスベラトロールを用いる場合は、完全に精製されたものである必要はなく、後述のように所望の生成反応が進み最終的に本発明の組成物が得られることから、レスベラトロール以外の成分を含む混合物も使用できる。
ただし、有効性を十分に発揮させる組成物を生成させるためには一定量のレスベラトロールが必要なことから、レスベラトロール換算で１重量％以上含有された混合物が原料として望ましい。
前記レスベラトロールを含有する混合物としては、ブドウ果皮、ワイン、ワイン濃縮パウダー、メリンジョ、リンゴンベリー、ピーナッツ、イタドリ根もしくは根茎、パッションフルーツ種子等の原料からの抽出物、これらの抽出物の凍結乾燥品等が挙げられる。

本発明では、レスベラトロールを適切な溶媒に溶解させる。この際、溶媒が水のみであれば、レスベラトロールの水への溶解度が著しく低いために、水と有機溶媒の混合液や、有機溶媒のみに溶解させればよい。水と有機溶媒の配合比や、有機溶媒の種類については特に制限はなく、レスベラトロールが十分に溶解すればよい。中でも、メタノールやエタノールのみの溶媒や、水とメタノール、水とエタノール等の混合液を使用することが、安全性やコスト面から好ましい。前記の加熱反応後に得られる組成物に対して最終的な精製を十分に適用せずにその組成物を医薬品、医薬部外品等に使用する場合には、安全性や法規面から溶媒としてエタノールや含水エタノールを使用することが望ましい。

前記のようにして得られるレスベラトロールを含有する溶液（以下、レスベラトロール含有溶液ともいう。）中のレスベラトロールの濃度について特に制限はないが、レスベラトロールの濃度が高いほど、溶媒使用量が少なくてすむ等のメリットもあるため、レスベラトロールの濃度は各々の溶媒に対しレスベラトロールがそれぞれ飽和する濃度近くが好ましい。
また、レスベラトロールは前記溶液中において生成反応前に完全に溶解していなくともよい。

次に、前記レスベラトロール含有溶液のｐＨをアルカリ性となるように調整する。調整方法として、例えば、レスベラトロール含有溶液を調製した後にアルカリ化剤を添加してｐＨを調整してもよいし、前記溶液の調製時に前もって溶媒のｐＨを調整しておいてもよい。レスベラトロール含有溶液の加熱開始時のｐＨは８．０以上であれば、効率的に後述のように複数の有用なレスべラトロール重合化合物を生成する反応が進むので好ましく、ｐＨ１３．０を超えると反応と同時に、他の反応や目的化合物の分解も一方で生じるために最終的なレスベラトロール重合化合物群の回収量が低下する傾向がある。したがって、反応開始時のｐＨは８〜１３．０が望ましい。

前記アルカリ化剤としては、特に制限はないが、安全性、効率及びコスト面からは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなどが望ましい。反応時のｐＨ変化を極力抑える場合が生じた際には、緩衝溶液を用いてもよいが、必ずしも必要な手法ではない。

次に、アルカリ性に調整されたレスベラトロール含有溶液を加熱処理する。この加熱処理により、レスベラトロールどうしを環化反応させることで、有用な化合物が生成する。このような有用な化合物としては、式（１）：

、式（２）：

、式（３）：

で示される種類のレスベラトロール重合化合物が挙げられる。

前記レスベラトロール重合化合物において、炭素‐炭素２重結合は、トランス体又はシス体であってもよく、シス体とトランス体との混合物を含む。

前記レスベラトロール重合化合物としては、その薬学的に許容可能な塩であってもよい。

前記レスベラトロール重合化合物の薬学的に許容可能な塩としては、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩； マグネシウム塩、カルシウム塩、バリウム塩等のアルカリ土類金属塩； アルミニウム塩；アルミニウムヒドロキシド塩等の金属ヒドロキシド塩； アルキルアミン塩、ジアルキルアミン塩、トリアルキルアミン塩、アルキレンジアミン塩、シクロアルキルアミン塩、アリールアミン塩、アラルキルアミン塩、複素環式アミン塩等のアミン塩； α−アミノ酸塩、ω−アミノ酸塩等のアミノ酸塩；ペプチド塩又はそれらから誘導される第１級、第２級、第３級若しくは第４級アミン塩等が挙げられる。これらの薬理的に許容し得る塩は、単独で又は２種以上を混合して用いることができる。

本発明において前記レスベラトロール重合体化合物を形成するための環化反応とは、レスベラトロールどうしが重合反応することで６員環を形成する反応をいう。
前記環化反応を効率的に進ませるために、レスベラトロール含有溶液の加熱温度は１１０℃以上に調整することが好ましい。また、使用する溶媒の沸点から考え、加圧加熱が望ましい。例えば、開放容器にレスベラトロール含有溶液を入れ、溶媒の沸点を超える高温で前記容器を加熱する、密閉容器にレスベラトロール含有溶液を入れ、前記容器を加熱する、レトルト装置やオートクレーブを用いて加圧加熱する、超臨界装置やプレッシャークッカー等の装置を用い加圧加熱する等、少なくとも部分的にレスベラトロール含有溶液の温度が１１０℃以上に達するように加熱することが好ましい。前記レスベラトロール重合化合物などの回収効率面から、レスベラトロール含有溶液の温度が均一に１１０℃〜１５０℃になることが、さらに好ましい。加熱時間も加熱温度と同様に限られたものではなく、効率的に目的の反応が進行する時間条件とすればよい。特に、加熱時間は加熱温度との兼ね合いによるものであり、加熱温度に応じた加熱時間にすることが望ましい。例えば、１３０℃付近で加熱する場合は、３０〜１２０分の加熱時間が望ましい。また、加熱は、一度でもよいし、複数回に分けて繰り返し加熱してもよい。複数回に分けて加熱する場合、蒸発した溶媒を補うために溶媒を新たに追加して行うことが好ましい。

前記加熱処理による前記式（１）〜（３）で表されるレスベラトロール重合化合物などの生成反応の終了は、例えば、後述のようにＨＰＬＣによる成分分析により生成量を確認して判断すればよい。具体的には、前記の生成をクロマトグラム上で確認されているかを評価すればよい。
なお、前記式（１）〜（３）で表されるレスベラトロール重合化合物の生成量については、本発明の組成物中に多いほど遅筋形成促進作用が強くなるので好ましいが、具体的には、それぞれの総量が本発明の組成物中に１重量％以上であればよい。
また、式（１）、式（２）、式（３）で表されるレスベラトロール重合化合物のそれぞれの含有比率については特に限定はない。

また、風味面での改良やさらなる高機能化を望む場合は、前記反応物を濃縮して式（１）〜（３）で表されるレスベラトロール重合化合物の濃度を高める、あるいは前記反応物を脱塩精製し、式（１）〜（３）で表されるレスベラトロール重合化合物の濃度を高めたものを得ることができる。前記濃縮や精製は、公知の方法で実施可能である。例えば、クロロホルム、酢酸エチル、エタノール、メタノール等の溶媒抽出法や炭酸ガスによる超臨界抽出法等で抽出して式（１）〜（３）で表されるレスベラトロール重合化合物を濃縮できる。また、カラムクロマトグラフィーを利用して濃縮や精製を施すことも可能である。たとえば担体として合成吸着剤を用いて濃縮することが可能である。また、前記濃縮や精製には、再結晶法や限外ろ過膜等の膜処理法も適用可能である。
中でも、合成吸着剤を用いることで、前記式（１）〜（３）で表されるレスベラトロール重合化合物を吸着させ、その後、溶出することで容易に濃縮、精製ができる。前記合成吸着剤としては、例えば、三菱化学株式会社製のダイヤイオン（登録商標）ＨＰシリーズ、セパビーズ（登録商標）ＳＰシリーズなどの芳香族系合成吸着剤、オルガノ株式会社製のアンバーライト（登録商標）ＸＡＤシリーズなどのスチレン系合成吸着剤などが挙げられる。

また、前記濃縮物や生成物を必要に応じて、減圧乾燥や凍結乾燥して溶媒除去することで、粉末状の固形物を得ることができる。

なお、本発明の組成物を安全な原料のみを用いて製造した場合には、そのまま医薬品又は医薬部外品に使用することが可能である。例えば、天然由来のレスベラトロールを含水エタノール溶媒に溶解し、水酸化ナトリウムや炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなどのアルカリ化剤を添加して加熱処理した場合には、得られる反応液を医薬品又は医薬部外品の原料の一つとして使用することが可能である。

また、得られた組成物は公知の方法を用いて溶解性を向上させてもよい。たとえばシクロデキストリンを添加する方法などが挙げられるが、特に限定はない。

以上のようにして得られる式（１）〜（３）で表されるレスベラトロール重合化合物を含む本発明の組成物は、レスベラトロールよりも優れた遅筋形成促進作用を有する。したがって、本発明の組成物は、優れた遅筋形成促進剤及び遅筋形成促進に関連する持久力向上剤として好適に使用することができる。

本発明の組成物は、有効成分として組成物のみからなるものであってもよいが、前記組成物をエタノール又はエタノール含有水溶液等の溶媒に溶解した液剤としたり、公知の方法で乳剤、懸濁剤としたりしてもよい。液材、乳剤又は懸濁剤中の本発明の組成物の含有量は、固形分として０．００１重量％以上であればよい。

本発明の組成物は、医薬品として製剤化してもよい。この製剤形態としては特に限定されず、例えば、注射剤、坐剤、点眼剤、軟膏剤、エアゾール剤等の非経口剤、錠剤、被覆錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、トローチ剤、チュアブル錠、シロップ剤等の経口剤等が挙げられる。製剤化の際には、薬学的に許容される担体、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、希釈剤、安定化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤等が用いられる。

担体や賦形剤としては、例えば、乳糖、ショ糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、マルトース、マンニトール、エリスリトール、キシリトール、マルチトール、イノシトール、デキストラン、ソルビトール、アルブミン、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、メチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム及びこれらの混合物等が挙げられる。

滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール及びこれらの混合物等が挙げられる。
結合剤としては、例えば、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、エチルセルロース、水、エタノール、リン酸カリウム及びこれらの混合物等が挙げられる。

崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖及びこれらの混合物等が挙げられる。

希釈剤としては、例えば、水、エチルアルコール、マクロゴール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類及びこれらの混合物等が挙げられる。
安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸、チオグリコール酸、チオ乳酸及びこれらの混合物等が挙げられる。

等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ホウ酸、ブドウ糖、グリセリン及びこれらの混合物等が挙げられる。
ｐＨ調整剤及び緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、クエン酸、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム及びこれらの混合物等が挙げられる。

さらに本発明の組成物は、増量剤、可溶化剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、抗酸化剤、細菌抑制剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を含んでいてもよい。

また、錠剤、丸剤、顆粒剤、顆粒を含有するカプセル剤の顆粒は、必要により、ショ糖等の糖類、マルチトール等の糖アルコールで糖衣を施したり、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等でコーティングを施したりすることもできる。また、胃溶性又は腸溶性物質のフィルムで被覆してもよい。また、製剤の溶解性を向上させるために、公知の可溶化処理を施すこともできる。

本発明の組成物を使用する場合、例えば、本発明の組成物の摂取量は、所望の効果が得られるような量であれば特に制限されず、通常その態様、患者の年齢、性別、体質その他の条件、疾患の種類並びにその程度等に応じて適宜選択されるが、例えば、成人１日当たり、固形分として約０．１ｍｇ〜１，０００ｍｇ／ｋｇ程度とするのがよく、これを１日に１〜４回に分けて摂取することができる。

また、本発明の組成物を医薬部外品の形態に製剤化してもよい。医薬部外品としては特に限定されないが、例えば、ドリンク剤等の栄養補助医薬部外品が好ましい。この場合、有効成分であるエキスの医薬部外品における含有量は、固形分として０．００１〜３０重量％程度であればよい。

また、本発明の組成物は、安全性に優れたものであるので、ヒトに対してだけでなく、例えば、非ヒト動物、例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー等の哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類等の治療剤又は飼料に配合してもよい。飼料としては、例えばヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ニワトリ等に用いる家畜用飼料、ウサギ、ラット、マウス等に用いる小動物用飼料、ウナギ、タイ、ハマチ、エビ等に用いる魚介類用飼料、イヌ、ネコ、小鳥、リス等に用いるペットフードが挙げられる。

次に、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はかかる実施例にのみ限定されるものではない。

（実施例１：レスベラトロール重合化合物を含有する組成物の作製）
レスベラトロール（株式会社テクノサイエンス製）１ｇをエタノール１０ｍＬに溶解した。炭酸水素ナトリウム（和光純薬株式会社製）１ｇを蒸留水１０ｍＬに溶解した。両溶液を混合してレスベラトロール含有溶液（ｐＨ＝９．９）を得た。これをオートクレーブで１３０℃、９０分間加熱して、レスべラトロール重合化合物含有溶液を作製した。
次いで、レスベラトロール重合化合物含有溶液を蒸留水１Ｌで希釈・溶解させ、４００ｇの合成吸着剤ダイヤイオン（登録商標）ＨＰ−２０（三菱化学株式会社製）に全量供した。蒸留水１Ｌで洗浄後、１００％エタノール１Ｌで溶出させた。減圧乾燥にて溶媒を除去し、レスベラトロール重合化合物含有組成物（以下、重合化合物含有組成物という。）２００ｍｇを得た。得られた重合化合物含有組成物を２ｍｇ／ｍＬの濃度でメタノールに溶解させ、そのうち１０μＬをＨＰＬＣにより分析した。

ＨＰＬＣ分析は下記の条件にて行った。
カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ ＵＧ８０カラム（４．６ｍｍＩ．Ｄ.×２５０ｍｍ、資生堂株式会社製）
移動相Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、和光純薬株式会社製）／Ｈ₂Ｏ
移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル（和光純薬株式会社製）
勾配（容量％）：１００％Ａ／０％Ｂから０％Ａ／１００％Ｂまで３３分、０％Ａ／１００％Ｂを７分（すべて直線）

得られたクロマトグラムを図１に示した。図１に示す結果よりレスベラトロールをアルカリ条件下で加熱処理することにより、（１）に示されるレスベラトロールのピークとは異なる複数のピークが検出できたことから、生成された複数の化合物を含む組成物が取得できた。
次に、得られた反応物のうち、図１の（２）、（３）、（４）に示されるピークに含まれる化合物を分取ＨＰＬＣにより単離し、常法により乾燥したところ、（２）、（３）に示されるピークに含まれる化合物は淡褐色粉末状の物質、式（３）に示されるピークに含まれる化合物は褐色粉末状の物質となった。

次いで、前記３種類の化合物の分子量を、特開２０１１−２５１９１４号公報の実施例２に記載の方法に従って、高分解能Ｎｅｇａｔｉｖｅ−ＦＡＢ−ＭＳ（Ｆａｓｔ Ａｔｏｍ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ−Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）にて測定し、核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定を行った結果、（２）のピークに含まれる化合物は、前記式（１）で表される化合物（以下、ＵＨＡ４００２という。）、（３）のピークに含まれる化合物は前記式（２）で表される化合物（以下、ＵＨＡ４００３という。）であることがわかった。

一方、（４）のピークに含まれる化合物（以下、ＵＨＡ４０２２という。）は、今までに報告されていない新規化合物であったため、実施例２に示す方法にて同定した。

（実施例２：ＵＨＡ４０２２の同定）
実施例１で得られた（４）で示したピークに含まれる化合物を分取ＨＰＬＣにより単離し、常法により乾燥したところ、褐色粉末状の物質を７２．６ｍｇ得た。この物質をＵＨＡ４０２２と命名した。

次いで、前記ＵＨＡ４０２２の分子量を高分解能Ｎｅｇａｔｉｖｅ−ＦＡＢ−ＭＳにて測定したところ、測定値は６４７．２１４４であり、理論値との比較から、以下の分子式を得た。
理論値Ｃ₄₂Ｈ₃₁Ｏ₇（Ｍ−Ｈ^-）：６４７．２１４８
分子式Ｃ₄₂Ｈ₃₂Ｏ₇

次に、前記ＵＨＡ４０２２を核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定に供し、¹Ｈ−ＮＭＲ、¹³Ｃ−ＮＭＲ及び各種２次元ＮＭＲデータの解析から、前記ＵＨＡ４０２２が前記式（３）で表される構造を有する新規化合物であることを確認した。したがって、前記式（３）で表される新規化合物は本発明の方法で効率的に生成できることが示された。

なお、前記ＮＭＲ測定値については、ＵＨＡ４０２２を

として、その¹Ｈ核磁気共鳴スペクトル、¹³Ｃ核磁気共鳴スペクトルを表１に示す。
値はδ、ｐｐｍで、溶媒はＤＭＳＯ−ｄ₆で測定した。

また、ＵＨＡ４０２２の物理化学的性状は、以下のようになった。
（性状）
褐色粉末
（溶解性）
水：難溶
メタノール：溶解
エタノール：溶解
ＤＭＳＯ：溶解
クロロホルム：難溶
酢酸エチル：難溶

（実施例３：遅筋型ミオシンの定量）
次に、重合化合物含有組成物（本発明品）の遅筋形成促進作用を評価するために、培養筋管細胞を用いた遅筋型ミオシンの定量を行った。

レスベラトロール及び本発明品はＤＭＳＯに溶解させたものを使用した。培養筋管細胞は培養筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２細胞，ＤＳファーマ株式会社製）を分化させることによって得た。つまり、Ｃ２Ｃ１２細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）、１％アンチバイオティック−アンチマイコティック（Ａｎｔｉ−Ａｎｔｉ、ギブコ（ＧＩＢＣＯ）社製）を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ、ＤＭＥＭ、シグマ社製）で５ｘ１０⁴ｃｅｌｌ／Ｄｉｓｈに調整し、１２ｗｅｌｌプレート（コーニング社製）に播種した。３７℃、５％ＣＯ₂条件下で４８時間培養した。これにレスベラトロール及び本発明品を３、１μｇ／ｍＬ（ＤＭＳＯ ０．５％添加）した２％馬血清（ＨＳ、ライフテクノロジージャパン社製）、１％Ａｎｔｉ−Ａｎｔｉ含有ＤＭＥＭに交換し、１週間培養した。その際、陰性対象としてＤＭＳＯ、陽性対象として非特許文献４にてＩｎ ｖｉｖｏで遅筋形成促進作用が認められているペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体δ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ δ、ＰＰＡＲδ）であるＧＷ５０１５１６を使用した。培養終了後、ＲＩＰＡバッファーで細胞を溶解させてタンパク質を抽出した。

抽出したタンパク質はＰｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（サーモサイエンティフィック社製）にて定量を行い、定法に従いＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供した。つまり、タンパク質５μｇに１／５量のＬａｅｍｍｌｉバッファー（１０％ドデシル硫酸ナトリウム、１００ｍＭジチオトレイトール、３０％グリセロール、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８）を添加し、９６℃で５分加熱変性させた。ゲルにはＣｒｉｔｅｒｉｏｎ ＴＧＸ Ｇｅｌ（Ａｎｙ ｋＤ、バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社製）を使用した。
変性させたタンパク質サンプルを全量ゲルに供し、２００Ｖ、４０分間電気泳動した。電気泳動後、セミドライ式ブロッティング装置（ＴＲＡＮＳ−ＢＬＯＴ Ｓ−Ｄ ＳＥＭＩ−ＤＲＹ ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＣＥＬＬ，バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社製）でＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）に転写し、イムノブロック（ＤＳファーマ社製）にてブロッキングした。ここから、抗遅筋型ミオシン抗体（アバカム社製）と抗マウスＩｇＧＨＲＰ結合抗体（ＣＳＴジャパン社製）を用いて遅筋型ミオシンを検出した。同時に抗速筋型ミオシン抗体（アバカム社製）と抗マウスＩｇＧＨＲＰ結合抗体を用いて速筋型ミオシンの検出も行った。検出されたバンドを画像解析ソフトＩｍａｇｅＪにてバンド強度を算出し、遅筋型ミオシンと速筋型ミオシンの比を算出した。結果は図２に示した。

図２の結果より、重合化合物含有組成物は、レスベラトロールよりも遅筋型ミオシン量の比が増加していることが示された。この作用はレスベラトロールよりも高く、本発明の組成物はレスベラトロールよりも優れた遅筋形成促進作用を有することが示された。

（実施例４：遅筋関連の遺伝子発現定量）
次にミオシンタイプにおいて遅筋形成が認められた重合化合物含有組成物で遅筋に関連する遺伝子の発現量を評価するために、培養筋管細胞を用いてＰＰＡＲγ ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ−１β（ＰＧＣ−１β）、遅筋型トロポニン１（Ｔｎｎｉ１）遺伝子発現の定量を行った。

試料及び細胞培養は実施例２に準じて行った。培養終了後、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（ライフテクノロジージャパン社製）を用いてＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡを２ステップリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ用逆転写試薬（商品名：ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、タカラバイオ（株）製）の取扱説明書に準じて逆転写反応を行った。

つまり５×（Ｐｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標） ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）４μＬ及び全量ＲＮＡ １μｇを混合し、ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ｄＨ₂Ｏで全量を１０μＬにした。ＰＣＲ用サーマルサイクラー（商品名：ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を使用して１サイクルが「３７℃×１５分→８５℃×５秒」であるプログラムにて逆転写反応を行った。逆転写反応液を滅菌超純水にて１０倍希釈した希釈液をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析に使用した。

リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析は定法に従って行った。解析には、ＥＣＯ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＲＴ―ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ」（商品名、イルミナ（株）製）を使用した。ＰＧＣ−１βプライマーには、ＰＧＣ−１βフォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ１２５５０５−Ｆ）及びＰＧＣ−１βリバースプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ１２５５０５−Ｒ）を使用した。ＴｎｎｉプライマーにはＴｎｎｉ１フォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ１１０７７９−Ｆ）及びＴｎｎｉ１リバースプライマー（プライマーＩＤ: ＭＡ１１０７７９−Ｒ）を使用した。細胞内遺伝子の内部標準はβ−アクチンとし、そのプライマーとして、ＡＣＴＢフォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ０６７８０３−Ｆ）及びＡＣＴＢリバースプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ０６７８０３−Ｒ）（前記６種のプライマーはいずれもタカラバイオ（株）製）を使用した。

反応にはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ試薬（商品名：ＳＹＢＲ Ｓｅｌｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、ライフテクノロジージャパン社製）を使用した。反応液は４８ウェルＰＣＲプレート（イルミナ（株）製）中に、２×ＳＹＢＲ Ｓｅｌｅｃｔ ２．５μＬ、フォワードプライマー（５０μＭ）０．０４μＬ、リバースプライマー（５０μＭ）０．０４μＬ、逆転写反応液１μＬ及び（ｄＨ₂Ｏ）１．４２μＬ（総量５μＬ）を混合した。各遺伝子の解析には『５０℃×２分→９５℃×３０秒→「９５℃×５秒→６５℃×３０秒」×４０サイクル→９５℃×１５秒→５５℃×１５秒→９５℃×１５秒』のプログラムにてＰＣＲ反応を行った。

得られた各細胞中のβ−アクチンと各遺伝子のＣｔ値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ：一定の増幅量（閾値）に達するサイクル数）から各遺伝子発現量の相対値を算出した。統計処理はＴ検定による有意差検定を行った。結果を図３に示した。

図３より、重合化合物含有組成物により遅筋関連遺伝子がレスベラトロールよりも有意に増加していた。従って、本発明の組成物がレスベラトロールよりも優れた遅筋形成促進作用を有することが遺伝子発現レベルからも示された。

（実施例５：本発明品を含有する医薬品）
実施例１と同様にして得られた重合化合物含有組成物１ｇをエタノールに溶解し、得られた溶液を微結晶セルロースに吸着させて、減圧乾燥した。重合化合物含有組成物の吸着体１０部、コーンスターチ２３部、乳糖１２部、カルボキシメチルセルロース８部、微結晶セルロース３２部、ポリビニルピロリドン４部、ステアリン酸マグネシウム３部、タルク８部を混合し打錠することで、本発明品を含む打錠剤を得た。

（実施例６：本発明品を含有する医薬部外品）
実施例１と同様にして得られた重合化合物含有組成物１．２ｇをエタノールに溶解させて得られたエタノール溶液１０ｍＬ、タウリン２０ｇ、ビタミンＢ１硝酸塩０．１２ｇ、安息香酸ナトリウム０．６ｇ、クエン酸４ｇ、砂糖６０ｇ及びポリビニルピロリドン１０ｇを精製水に溶解し、全量を１０００ｍＬにメスアップした。なお、ｐＨは、希塩酸を用いて３．２に調整した。得られた溶液１０００ｍＬのうち５０ｍＬをガラス瓶に充填し、８０℃で３０分間滅菌して、医薬部外品であるドリンク剤を得た。

Claims (5)

1. レスベラトロールをアルカリ条件下で加熱処理して得られることを特徴とする遅筋形成促進剤組成物。
2. 式（１）：
   

   

   、式（２）：
   

   

   及び式（３）：
   

   

   で示される３種類のレスベラトロール重合化合物を含有する請求項１記載の遅筋形成促進剤組成物。
3. レスベラトロールをアルカリ条件下で加熱処理して得られることを特徴とする持久力向上剤組成物。
4. 式（１）：
   

   

   、式（２）：
   

   

   及び式（３）：
   

   

   で示される３種類のレスベラトロール重合化合物を含有する請求項３記載の持久力向上剤組成物。
5. 請求項１又は２記載の遅筋形成促進剤組成物を含有する医薬品又は医薬部外品。

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