JP6070367B2 - 白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導剤 - Google Patents

Description

本発明は、非常に簡便な方法かつ食品でも応用可能な合成方法によって得られるヒドロキシスチルベン類の環化反応生成物を含有する白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導剤に関するものである。

化合物の誘導体化技術は、化合物の高機能化を目的に医薬品の開発などで広く使われている。たとえば、抗インフルエンザ薬として広く用いられているタミフル（登録商標）は、生薬である八角に含まれるシキミ酸を誘導体化して得られている。他にも、インスリン抵抗性改善薬であるピオグリタゾンはクロフィブラートをリード化合物とする誘導体合成の研究により得られたものである。

しかし、医薬品などで使用される誘導体化技術は、その合成方法の煩雑さや生成コストの高さから医薬品としての用途には耐えるが、たとえば機能性の高い食品原材料、もしくは添加物としての用途としては、コスト、安全性の法規面からそれらの用途には耐えないものが多い。

一方、高齢化社会が到来した先進国においてその医療費の増大は社会問題化しており、病気を事前に予防する予防医学の発達が求められている。医薬品や特別な医療行為による対処療法的なこれまでの医学とは異なり、予防医学では日常生活から健康に良いものを摂取することで病気を未然に防ぐことを目的としている。そのような現状から予防医学と食品は深い関わりがある。

哺乳動物の脂肪組織を構成する脂肪細胞には白色脂肪細胞と褐色脂肪細胞の二種類が存在する。白色脂肪細胞は主にトリグリセリドの形で摂取したエネルギーを蓄積する役割を持ち、一方、褐色脂肪細胞は蓄積されたエネルギーを熱へと変換する役割がある。褐色脂肪細胞は筋芽細胞を起源に発生し、細胞内部に多数のミトコンドリアを含むことで褐色に色づいている脂肪細胞であるが、ミトコンドリア中に発現する脱共役タンパク質（Ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １；ＵＣＰ１）の働きにより熱産生を行う（非特許文献１）。

褐色脂肪細胞により構成される褐色脂肪組織は、幼児期に多数見受けられ、成長するに従いその組織量は減少する。由来幹細胞が異なることから白色脂肪細胞より褐色脂肪細胞は発現しないと考えられてきたが、近年、白色脂肪組織中に褐色脂肪細胞と同様の応答を示す「褐色様脂肪細胞」の存在が明らかとなってきた（非特許文献２）。褐色様脂肪細胞は白色脂肪細胞由来ながらミトコンドリアの存在量が白色脂肪細胞と比較して格段に多く、蓄積された脂質エネルギーを効率よく熱エネルギーへと変換することから、白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導は肥満症や糖尿病の根本治療方法として注目されている。

しかしながら、白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化を誘導することは難しく、確認されている方法は、長期間の寒冷刺激や、アドレナリンによる刺激（非特許文献１）、ペルオキソーム増殖剤応答性受容体（ＰＰＡＲγ）アゴニストの添加（非特許文献３）などのみであり、加えて、すべて、皮下脂肪細胞のみに分化誘導効果が限定される。また、特許文献１にてヒト内臓脂肪細胞に対しＵＣＰ１遺伝子の発現増幅効果のある化合物が報告されているが、作用濃度が非常に高く、生体内での有効濃度の達成が難しく、且つ、白色脂肪細胞の褐色化に対する言及も無い。

一方、いわゆる「フレンチパラドックス」と言われる赤ワインの有用な生理効果は、レスベラトロールの抗酸化能を始めとして各種の生理活性機能が一因であるとされている。レスベラトロールはブドウ果皮やピーナッツ赤皮に多く含まれるヒドロキシスチルベン類の一種で、サーチュインを介したカロリー制限効果をはじめ、抗真菌、抗細菌、抗炎症などさまざまな活性を有する植物由来化合物として知られている（非特許文献４）。さらに、レスベラトロールには、サーチュインの発現促進を介した脂肪細胞への分化及び脂肪の蓄積を抑える働きが報告されている（非特許文献５）。しかし、アカゲザルに対する実験の結果、カロリー制限という行為自体が延命に有用な効果があるか疑問がもたれている中（非特許文献６)、レスベラトロールが持ち合わせるサーチュインを介したカロリー制限効果もヒトに対する効果は定かではない。さらに、レスベラトロールには、白色脂肪細胞に特異的に発現する脱共役タンパク質ＵＣＰ２の遺伝子発現亢進効果について報告があるものの（特許文献２）、これまで、レスベラトロールについて、白色脂肪細胞から褐色様脂肪細胞への分化効果について言及されたものは一切無い。

このように、今日に至るまで、食欲の抑制や脂肪吸収抑制ではない、脂肪細胞そのものの性質を変化させ、代謝を変化させることでメタボリックシンドロームを予防・治療する根本的な治療・予防剤、及びそれらを含む機能性食品の開発が望まれてきたが、これまでのところすべての白色脂肪細胞に対して十分な効果が認められるような物質は見つかっておらず、早期の開発が望まれていた。

特開２０１１−２４１１９５号公報 特開２０１０−２４２０８号公報

Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｓｃｉ． ２０１１ Ｏｃｔ ２８；１：３５ Ｃｅｌｌ．２０１２ Ｊｕｌ ２０；１５０（２）：３６６−７６９ Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．２０１２ Ｍａｒ ７；１５(３)：３９５−４０４ レスベラトロールの基礎と応用、シーエムシー出版 Ｎａｔｕｒｅ．２００４ Ｊｕｎｅ １７；４２９(６９９３)：７７１ Ｎａｔｕｒｅ．２０１２ Ｓｅｐ １３；４８９（７４１５）：３１８

本発明者らは、前記の状況を鑑みて、白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導作用を示す化合物の探索と、その製造方法を確立すべく鋭意検討した結果、ヒドロキシスチルベン類をアルカリ条件下で加熱処理するという簡便且つ安全な方法により、意外にも、白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導作用を示す新たな化合物を製造することに成功し、本発明を完成するに至った。したがって、本発明の課題は、これまでヒドロキシスチルベン類には見られなかった、優れた白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導作用を有する新規化合物を含有する白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導剤を提供することにある。

即ち、本発明の要旨は、ヒドロキシスチルベン類の環化反応生成物であって、式（１）：

（但し、式（１）中、Ｒ₁〜Ｒ₈は、水素原子、ヒドロキシ基、炭素数１〜１０の飽和又は不飽和の、直鎖状又は分岐鎖状のアルコキシ基、あるいは炭素数１〜１０の飽和又は不飽和の、直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基であり、Ｒ₁〜Ｒ₈はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）
で表される化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含有することを特徴とする白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導剤に関する。

本発明で用いる前記式（１）で表される化合物又はその薬学的に許容可能な塩は、前駆物質であるヒドロキシスチルベン類よりも顕著に優れた白色脂肪細胞から褐色様脂肪細胞への分化誘導作用を有しており、新規なメタボリックシンドローム治療及び予防物質として有用である。
また、本発明の白色脂肪細胞から褐色様脂肪細胞への分化誘導剤を食品、医薬品又は医薬部外品に配合することで、新規なメタボリックシンドローム予防又は改善用の食品、医薬品又は医薬部外品を提供することができる。

図１は、実施例２で実施した分化誘導後の脂肪細胞中のＵＣＰ１遺伝子、褐色様脂肪細胞マーカー遺伝子である細胞死誘導ＤＦＦＡ様エフェクターａ（Ｃｉｄｅａ）、ミトコンドリアマーカー遺伝子であるシトクロムｃオキシダーゼポリペプチド７Ａ１（Ｃｏｘ７ａ１）の各遺伝子の相対発現量を示すグラフである。 図２は、実施例３で実施した正常皮下脂肪分化誘導後の脂肪細胞中のＵＣＰ１遺伝子、ミトコンドリアマーカー遺伝子であるシトクロムｃオキシダーゼポリペプチド７Ａ１（ＣＯＸ７ａ１）、褐色様脂肪細胞マーカー遺伝子であるＣＩＴＥＤ１の各遺伝子の相対発現量を示すグラフである。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明で用いる、ヒドロキシスチルベン類の環化反応生成物は、
式（１）：

（但し、式（１）中、Ｒ₁〜Ｒ₈は、水素原子、ヒドロキシ基、炭素数１〜１０の飽和又は不飽和の、直鎖状又は分岐鎖状のアルコキシ基、あるいは炭素数１〜１０の飽和又は不飽和の、直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基であり、Ｒ₁〜Ｒ₈はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）
で表される化合物又はその薬学的に許容可能な塩である。

前記式（１）において、Ｒ₁〜Ｒ₈で表される炭素数１〜１０の飽和又は不飽和の、直鎖状又は分岐鎖状のアルコキシ基は、特に限定されるものではないが、好ましくは炭素数１〜４の直鎖状または分岐鎖状のアルコキシ基である。その具体例としては、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓ−ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基などが挙げられる。
また、Ｒ₁〜Ｒ₈で表される炭素数１〜１０の飽和又は不飽和の、直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基は、特に限定されるものではないが、好ましくは炭素数１〜５の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基であり、その具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ｔ−ペンチル基、ネオペンチル基などが挙げられる。
中でも、前記Ｒ₁〜Ｒ₈のうち１つ以上が水素原子であることが好ましく、Ｒ₁〜Ｒ₈が全て水素原子であることがより好ましい。

前記式（１）で表される化合物において、炭素−炭素２重結合は、トランスまたはシスであってよい。また、前記式（１）で表される化合物として、シス体とトランス体との混合物であってもよい。

前記式（１）で表される化合物の薬学的に許容可能な塩としては、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩、バリウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩；アルミニウムヒドロキシド塩等の金属ヒドロキシド塩；アルキルアミン塩、ジアルキルアミン塩、トリアルキルアミン塩、アルキレンジアミン塩、シクロアルキルアミン塩、アリールアミン塩、アラルキルアミン塩、複素環式アミン塩等のアミン塩；α−アミノ酸塩、ω−アミノ酸塩等のアミノ酸塩；ペプチド塩又はそれらから誘導される第１級、第２級、第３級若しくは第４級アミン塩等が挙げられる。これらの薬学的に許容可能な塩は、単独で又は２種以上を混合して用いることができる。

前記式（１）で表される化合物又はその薬学的に許容可能な塩（以下、前記式（１）で表される化合物ともいう。）は、白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化を誘導する作用を有する。この脂肪細胞分化誘導作用は、具体的には後述の実施例２、３に記載の方法によって測定することができる。

前記式（１）で表される化合物は、ヒドロキシスチルベン類を原料化合物としてアルカリ条件下で加熱処理することで得られる。

ヒドロキシスチルベン類とは、式（２）：

（但し、式（２）中、Ｒ₁〜Ｒ₄は、水素原子、ヒドロキシ基、炭素数１〜１０の飽和又は不飽和の、直鎖状又は分岐鎖状のアルコキシ基、あるいは炭素数１〜１０の飽和又は不飽和の、直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基であり、Ｒ₁〜Ｒ₄はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）
で示されるヒドロキシスチルベン誘導体及びその薬学的に許容可能な塩である。

前記式（２）において、Ｒ₁〜Ｒ₄で表される炭素数１〜１０の飽和又は不飽和の、直鎖状又は分岐鎖状のアルコキシ基は、特に限定されるものではないが、好ましくは炭素数１〜４の直鎖状または分岐鎖状のアルコキシ基である。その具体例としては、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓ−ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基などが挙げられる。
また、Ｒ₁〜Ｒ₄で表される炭素数１〜１０の飽和又は不飽和の、直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基は、特に限定されるものではないが、好ましくは炭素数１〜５の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基であり、その具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ｔ−ペンチル基、ネオペンチル基などが挙げられる。中でも、前記Ｒ₁〜Ｒ₄のうち１つ以上が水素原子であることが好ましく、Ｒ₁〜Ｒ₄が全て水素原子であるレスベラトロールがより好ましい。

前記式（２）で表される化合物の薬学的に許容可能な塩としては、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩、バリウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩；アルミニウムヒドロキシド塩等の金属ヒドロキシド塩；アルキルアミン塩、ジアルキルアミン塩、トリアルキルアミン塩、アルキレンジアミン塩、シクロアルキルアミン塩、アリールアミン塩、アラルキルアミン塩、複素環式アミン塩等のアミン塩；α−アミノ酸塩、ω−アミノ酸塩等のアミノ酸塩；ペプチド塩又はそれらから誘導される第１級、第２級、第３級若しくは第４級アミン塩等が挙げられる。これらの薬学的に許容可能な塩は、単独で又は２種以上を混合して用いることができる。

前記原料化合物として使用されるヒドロキシスチルベン類は、天然由来のものであっても、化学合成された純度の高い化成品であっても良い。天然由来の原料化合物としては、完全に精製されたものである必要はなく、他の化合物を含む混合物も使用できる。
ただし、前記式（１）で表される化合物の生成効率や回収率を高める観点からは、前記ヒドロキシスチルベン類としては、ヒドロキシスチルベン類換算で、合計５重量％以上含有されたものが原料として望ましい。このような原料としては、例えばブドウ果皮、ワイン、ワイン濃縮パウダー、メリンジョ、リンゴンベリー、ピーナッツ果皮、イタドリ等の原料からの抽出物や該抽出物の凍結乾燥品等を使用してもよい。

本発明では、ヒドロキシスチルベン類を適切な溶媒に溶解させる。この際、溶媒が水のみであると、ヒドロキシスチルベン類の水への溶解度がいずれも低いために、水と有機溶媒の混合液や、有機溶媒のみに溶解させることが好ましい。水と有機溶媒の配合比や、有機溶媒の種類については特に制限はなく、ヒドロキシスチルベン類が十分に溶解すれば良い。中でも、メタノールやエタノールのみの溶媒や、水とメタノール、水とエタノール等の混合液を使用することが、安全性やコスト面から好ましい。前記の生成反応後に得られる組成物に最終的な精製を十分に適用せず、その組成物を食品、医薬品、医薬部外品等に使用する場合には、安全性や法規面から溶媒としてエタノールや水、含水エタノールを使用することが望ましい。

前記のようにヒドロキシスチルベン類を溶媒に溶解して得られる混合溶液中のヒドロキシスチルベン類の濃度については、特に制限はないが、それぞれの濃度が高いほど、溶媒使用量が少ない等のメリットもあるため、ヒドロキシスチルベン類の濃度は各々の溶媒に対しヒドロキシスチルベン類がそれぞれ飽和する濃度近くに調整することが好ましい。

次に、前記ヒドロキシスチルベン類含有溶液のｐＨをアルカリ性となるように調整する。調整方法として、例えば、ヒドロキシスチルベン類含有溶液を調製した後にアルカリ化剤を添加しｐＨを調整しても良いし、前述のヒドロキシスチルベン類含有溶液の調製時に前もって溶媒のｐＨを調整しておいても良い。ヒドロキシスチルベン類含有溶液の反応開始時のｐＨは８．０以上であれば、効率的に後述の反応が進むので好ましく、ｐＨ１３．０を越えると反応と同時に、他の反応や目的化合物の分解も一方で生じるために最終的なヒドロキシスチルベン類重合化合物群の回収量が低下する。したがって、反応開始時のｐＨは８．０〜１３．０が望ましい。

前記アルカリ化剤としては、特に制限はないが、安全性、効率及びコスト面からは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウムが望ましい。反応時のｐＨ変化を極力抑える場合が生じた際には、緩衝溶液を用いても良いが、必ずしも必要な手法ではない。

次に、アルカリ性に調整されたヒドロキシスチルベン類含有溶液を加熱する。この加熱により、ヒドロキシスチルベン類どうしを環化反応させ、前記式（１）で表される化合物の生成を行う。本発明において環化反応とは、ヒドロキシスチルベン類どうしが重合反応することで６員環を形成する反応をいう。前記環化反応を効率的に進ませるために、ヒドロキシスチルベン類含有溶液の加熱温度は１１０℃以上に調整することが好ましい。また、使用する溶媒の沸点から考え、加圧加熱が望ましい。例えば、開放容器にヒドロキシスチルベン類含有溶液を入れ、溶媒の沸点を超える高温で前記容器を加熱する、密閉容器にヒドロキシスチルベン類含有溶液を入れ、前記容器を加熱する、レトルト装置やオートクレーブを用いて加圧加熱する等、少なくとも部分的に溶液温度が１１０℃以上に達するように加熱することが好ましい。回収効率面から、溶液温度が均一に１２０℃〜１８０℃になることが、さらに好ましい。加熱時間も加熱温度と同様に限られたものではなく、効率的に目的の反応が進行する時間条件とすればよい。特に、加熱時間は加熱温度との兼ね合いによるものであり、加熱温度に応じた加熱時間にすることが望ましい。例えば、１３０℃付近で加熱する場合は、５分〜６０分の加熱時間が望ましい。また、加熱は、一度でも良いし、複数回に分けて繰り返し加熱しても良い。複数回に分けて加熱する場合、溶媒を新たに追加して行うことが好ましい。

前記加熱による前記式（１）で表される化合物の生成反応の終了は、例えば、ＨＰＬＣによる成分分析により生成量を確認して判断すればよい。

また、安全な原料のみを用いた工程により前記式（１）で表される化合物を製造した場合には、前記式（１）で表される化合物を含む混合物の状態で後述のように食品、医薬品、医薬部外品等に使用することが可能である。例えば、天然由来のレスベラトロールを含水エタノール溶媒に溶解し、水酸化ナトリウムや炭酸水素ナトリウムでアルカリ性となるようにｐＨ調整を行い、加熱反応させた場合には、得られる液状の反応物を食品、医薬品、医薬部外品等の原料の一つとして使用することが可能である。

また、風味の改良やさらなる高機能化を望む場合は、前記反応物を濃縮して式（１）で表される化合物の濃度を高める、あるいは前記反応物を精製し、式（１）で表される化合物の純品を得ることができる。前記濃縮や精製は、公知の方法で実施可能である。例えば、クロロホルム、酢酸エチル、エタノール、メタノール等の溶媒抽出法や炭酸ガスによる超臨界抽出法等で抽出して式（１）で表される化合物を濃縮できる。また、カラムクロマトグラフィーを利用して濃縮や精製を施すことも可能である。また、前記濃縮や精製には、再結晶法や限外ろ過膜等の膜処理法も使用できる。

前記式（１）で表される化合物を前記反応物から分離して回収する場合には、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等を用いてもよい。

また、前記濃縮物や精製物を、必要に応じて、減圧乾燥や凍結乾燥して溶媒を除去することで、粉末状の固形物を得ることができる。

以上のようにして得られる式（１）で表される化合物は、原料であるヒドロキシスチルベン類に比べて、より強力な白色脂肪細胞からの褐色様脂肪細胞への分化を誘導する作用を有しており、この褐色様脂肪細胞分化誘導作用により、メタボリックシンドロームの予防、改善を図ることができることから、この式（１）で表される化合物を有効成分として含有する本発明の薬剤は、新規のメタボリックシンドローム予防剤及び／又は治療剤として有用である。なお、前記白色脂肪細胞からの褐色様脂肪細胞への分化を誘導する作用は、原料であるヒドロキシスチルベン類には見られない作用である。

本発明の白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導剤は、前記式（１）で表される化合物のみを含有していてもよいが、前記式（１）で表される化合物をエタノール又はエタノール含有水溶液等の溶媒に溶解した液剤としたり、公知の方法で乳剤、懸濁剤としたりしてもよい。本発明の白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導剤中の前記式（１）で表される化合物の含有量は、０．００１重量％以上であればよい。

本発明の白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導剤の投与量としては、患者の性別、年齢、生理的状態、病態（肥満の進み具合等）、製剤形態、投与経路、投与回数、薬剤における有効成分濃度等に応じて広い範囲から適宜選択できるが、例えば、成人１日当たり、式（１）で表される化合物の含有量が０．０１〜５００ｍｇ／ｋｇ程度、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ程度であればよい。投与は、例えば、１日当たり１回又は数回に分けてもよい。

本発明の白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導剤は、医薬品として製剤化してもよい。この製剤形態としては特に限定されず、例えば、注射剤、坐剤、点眼剤、軟膏剤、エアゾール剤等の非経口剤、錠剤、被覆錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、トローチ剤、チュアブル錠、シロップ剤等の経口剤等が挙げられる。製剤化の際には、薬学的に許容される担体、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、希釈剤、安定化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤等が用いられる。

担体や賦形剤としては、例えば、乳糖、ショ糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、マルトース、マンニトール、エリスリトール、キシリトール、マルチトール、イノシトール、デキストラン、ソルビトール、アルブミン、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、メチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム及びこれらの混合物等が挙げられる。

滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール及びこれらの混合物等が挙げられる。
結合剤としては、例えば、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、エチルセルロース、水、エタノール、リン酸カリウム及びこれらの混合物等が挙げられる。

崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖及びこれらの混合物等が挙げられる。

希釈剤としては、例えば、水、エチルアルコール、マクロゴール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類及びこれらの混合物等が挙げられる。
安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸、チオグリコール酸、チオ乳酸及びこれらの混合物等が挙げられる。

等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ホウ酸、ブドウ糖、グリセリン及びこれらの混合物等が挙げられる。
ｐＨ調整剤及び緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、クエン酸、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム及びこれらの混合物等が挙げられる。

さらに本発明の白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導剤は、増量剤、可溶化剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、抗酸化剤、細菌抑制剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を含んでいてもよい。

また、本発明の白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導剤を食品の形態に製剤化してもよい。食品としては特に限定されず、例えば、飲料、アルコール飲料、ゼリー、菓子、機能性食品、健康食品、健康志向食品等が挙げられる。保存性、携帯性、摂取の容易さ等を考慮すると、菓子類が好ましく、菓子類の中でも、ハードキャンディ、ソフトキャンディ、グミキャンディ、タブレット、チューイングガム等が好ましい。

本発明の白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導剤を食品の形態に製剤化する場合、式（１）で表される化合物の該食品における含有量は、通常０．００１〜２０重量％程度である。

また、本発明の白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導剤を医薬部外品の形態に製剤化してもよい。医薬部外品としては特に限定されないが、例えば、ドリンク剤等の栄養補助医薬部外品が好ましい。この場合、有効成分である式（１）で表される化合物の医薬部外品における含有量は、通常０．００１〜３０重量％程度である。

また、本発明の白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導剤は、ヒトに対してだけでなく、非ヒト動物、例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー等の哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類等の治療剤又は飼料に配合してもよい。飼料としては、例えばヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ニワトリ等に用いる家畜用飼料、ウサギ、ラット、マウス等に用いる小動物用飼料、ウナギ、タイ、ハマチ、エビ等に用いる魚介類用飼料、イヌ、ネコ、小鳥、リス等に用いるペットフードが挙げられる。

次に、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はかかる実施例にのみ限定されるものではない。ここでは、ヒドロキシスチルベン類としてトランス−レスベラトロールを用いているが他のヒドロキシスチルベン類でも同様の反応で化合物が得られる。

（実施例１：ヒドロキシスチルベン類誘導体ＵＨＡ４００３の生成及び単離・精製）
特開２０１３−２８５６０号公報の実施例１に記載の方法に従って、ヒドロキシスチルベン類誘導体ＵＨＡ４００３の生成、単離、精製を行った。すなわち、トランス−レスベラトロール（東京化成工業（株）製）７００ｍｇをエタノール１４ｍＬに溶解し、２．５％炭酸水素ナトリウム（和光純薬工業（株）社製）水溶液を１４ｍＬ加えて、レスベラトロール含有溶液（ｐＨ９．９）を得た。このレスベラトロール含有溶液をオートクレーブ（三洋電機製、「ＳＡＮＹＯ ＬＡＢＯ ＡＵＴＯＣＬＡＶＥ」、以下同じ）にて１３０℃、２０分間加熱した。次いで、１回目のオートクレーブ処理にて得られた反応溶液に、エタノール１４ｍＬと５．０％炭酸水素ナトリウム水溶液を１４ｍＬ加え、再度、オートクレーブにて１３０℃、２０分間加熱した。得られた反応溶液をＨＰＬＣで分析したところ、いくつかのピークで示される化合物が確認できた。

なお、前記ＨＰＬＣは以下条件にて行った。
カラム：逆相用カラム「Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ（登録商標）Ｃ−３０−ＵＧ−５」（４．６ｍｍｉ．ｄ．×２５０ｍｍ）
移動相：Ａ・・・Ｈ₂Ｏ（０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））， Ｂ・・・アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
注入：１０μＬ
検出：２５４ｎｍ
勾配（容量％）：８０％Ａ／２０％Ｂから２０％Ａ／８０％Ｂまで３０分間、２０％Ａ／８０％Ｂから１００％Ｂまで５分間、１００％Ｂで１０分間（全て直線）

次いで、複数のピーク化合物を分取して、ＨＰＬＣ、高分解能ＦＡＢ−ＭＳ（Ｆａｓｔ Ａｔｏｍ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ−Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）、核磁気共鳴測定より純度、構造を確認したところ、上記ＨＰＬＣ分析条件において溶出時間１６分付近に見られるピークから式（３）で示すヒドロキシスチルベン類誘導体（以下ＵＨＡ４００３）を得た。

なお、前記ＵＨＡ４００３を核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定に供したところ、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲおよび各種２次元ＮＭＲデータの解析から、前記ＵＨＡ４００３が前記式（３）で表される構造を有することを確認した。
また、ＵＨＡ４００３について、本発明者らは、これまでに抗癌作用（特開２０１１−２５１９１４号公報）、レプチン抵抗性改善作用（特開２０１３−２８５６０）、成熟脂肪細胞肥大化抑制作用（特願２０１１−２３９３５９）、抗炎症作用（特願２０１２−０４１７５５）、成熟脂肪細胞のＵＣＰ−２発現促進作用（特願２０１２−２１８６１９）等を有することを確認しているが、白色脂肪細胞より褐色様脂肪細胞への分化誘導に対する効果については確認しておらず、一般的にも未だ知られていない。

（実施例２：ＵＨＡ４００３の白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導作用指標遺伝子発現の検証）
白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導作用を評価するために、３Ｔ３−Ｌ１細胞（マウス由来前駆脂肪細胞）を用いて評価を行った。３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞は通常、分化誘導過程を経て、白色脂肪細胞へと分化、成熟する。しかし、褐色様脂肪細胞へと分化誘導されることで白色脂肪細胞ではほとんど観察されないＣｉｄｅａ遺伝子の発現や、ミトコンドリアに発現するＣｏｘ７ａ１遺伝子の発現量の増加、及びミトコンドリア特異的に発現するシトクロムｃオキシダーゼタンパク質の発現量の増大、ＵＣＰ１遺伝子の発現亢進が観察されるようになる。そこで、Ｃｉｄｅａ、Ｃｏｘ７ａ１及びＵＣＰ１の各遺伝子の発現量を指標に、白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導を確認した。

試料にはＰＰＡＲγの合成アゴニストであるロシグリタゾン（Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）及びＵＨＡ４００３の２種類を用いた。各試料をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、和光純薬工業（株）社製）に０．２ｍＭ、２ｍＭの濃度で溶解させて試験に使用した。

培養は、１０％ウシ胎児血清（Ｆｏｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）、１％アンチバイオティック−アンチマイコティック（「Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ」、ギブコ（ＧＩＢＣＯ）社製）を含む「Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ」（ＤＭＥＭ、商品名、Ｓｉｇｍａ社製）を用いていった。試験に使用する脂肪細胞は定法に従って調製した。

試験は以下のように行った。細胞培養用１２ｗｅｌｌディッシュ（コーニング社製）に３Ｔ３−Ｌ１細胞を５×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で１ｍＬ播種して３７℃、５％ＣＯ₂条件下で２４時間培養した。２４時間後、ＤＭＥＭ培地をＵＨＡ４００３が終濃度２０μＭ、又はロシグリタゾンが終濃度１μＭとなるように調整したＤＭＥＭ培地に交換し培養を続け、１００％コンフルエントとし、さらに４８時間培養した。次に、培地を「ＡｄｉｐｏＩｎｄｕｃｅｒ Ｒｅａｇｅｎｔ」（商品名、タカラバイオ（株）社製）付属のインスリン、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチンをそれぞれ１％、０．５％、０．１％添加した分化用ＤＭＥＭ１ｍＬに、各試料を終濃度２０μＭ、１μＭとなるように添加、交換し、３７℃、５％ＣＯ₂条件下で４８時間分化誘導した。４８時間の分化誘導後、インスリンを１％添加した維持培養用ＤＭＥＭ２ｍＬに交換し、さらに１週間培養を行い、脂肪細胞の成熟化を行った。なお、溶媒であるＤＭＳＯのみを０．５％添加したものをコントロールとした。

培養終了後、細胞よりＲＮＡ抽出キット（商品名：ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡ ＩＩ、タカラバイオ（株）製）を用いて全量ＲＮＡを抽出・精製した。得られたＲＮＡを２ステップリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ用逆転写試薬（商品名：ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴＭａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、タカラバイオ（株）製）の取扱説明書に準じて逆転写反応を行った。

つまり５×（Ｐｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）２μＬ及び全量ＲＮＡ ５００ｎｇを混合し、ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ｄＨ₂Ｏで全量を１０μＬにした。ＰＣＲ用サーマルサイクラー（商品名：ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を使用して１サイクルが「３７℃×１５分→８５℃×５秒」であるプログラムにて逆転写反応を行った。逆転写反応液をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ用希釈試薬（商品名：ＥＡＳＹ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ、タカラバイオ（株）製）にて５倍希釈した希釈液をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析に使用した。

リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析は定法に従って行った。解析には、「ＥＣＯ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＲＴ―ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ」（商品名、イルミナ（株）製）を使用した。プライマーには、Ｃｉｄｅａフォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ１０４６２９−Ｆ）、Ｃｉｄｅａリバースプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ１０４６２９−Ｒ）、Ｃｏｘ７ａ１フォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ１０６８０１−Ｆ）及びＣｏｘ７ａ１リバースプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ１０６８０１−Ｒ）、ＵＣＰ１フォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ０２７５６１−Ｆ）及びＵＣＰ１リバースプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ０２７５６１−Ｒ）を使用した。細胞内遺伝子の内部標準はβ−アクチンとし、そのプライマーとして、ＡＣＴＢフォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ０５０３６８−Ｆ）及びＡＣＴＢリバースプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ０５０３６８−Ｒ）（前記８種のプライマーはいずれもタカラバイオ（株）製）を使用した。

反応にはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ試薬（商品名：ＳＹＢＲ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ ｔａｑＩＩ（Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）、タカラバイオ（株）製）を使用した。反応液は４８ウェルＰＣＲプレート（イルミナ（株）製）中に、２×（ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ ｔａｑ ＩＩ（Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ））５μＬ、フォワードプライマー（５０μＭ）０．０８μＬ、リバースプライマー（５０μＭ）０．０８μＬ、逆転写反応液２μＬ及びｄＨ₂Ｏ ２．８４μＬ（総量１０μＬ）を混合して『９５℃×３０秒→「９５℃×１５秒→６０℃×１分」×４０サイクル→９５℃×１５秒→５５℃×１５秒→９５℃×１５秒』のプログラムにてＰＣＲ反応を行った。

得られた各細胞中のβ−アクチンとＣｉｄｅａ、Ｃｏｘ７ａ１及びＵＣＰ１のＣｔ値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ：一定の増幅量（閾値）に達するサイクル数）からＣｉｄｅａ及びＣｏｘ７ａ１、ＵＣＰ１の各遺伝子発現量の相対値を算出した。結果を図１に示した。

その結果、ロシグリタゾン添加時と同様に、褐色様脂肪細胞のマーカー遺伝子であるＣｉｄｅａ遺伝子発現量がＵＨＡ４００３添加時に有意に増大していることが見いだされ、さらに、ミトコンドリアマーカー遺伝子であるＣｏｘ７ａ１の発現量が有意に増大していることが明らかになった。また、ＵＣＰ１遺伝子の発現量も有意に増加していることが明らかになった。ロシグリタゾンは合成アゴニストであり、その効果はＵＨＡ４００３と比較すると強いが、ＵＨＡ４００３は遥かに簡便な方法で得られるメリットのある化合物であり、且つ、ロシグリタゾン同様極めて強い白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導作用を有する可能性が高いことが示された。

（実施例３：ＵＨＡ４００３の正常ヒト皮下脂肪に対する褐色様脂肪細胞分化誘導作用指標遺伝子発現の検証）
３Ｔ３−Ｌ１細胞を用いて見られた、白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導作用を評価するために、ヒト皮下脂肪由来正常前駆脂肪細胞（ロンザ・ジャパン社）を用いて評価を行った。正常前駆脂肪細胞は通常白色脂肪細胞へと分化するが、褐色様脂肪細胞へと分化誘導されることで白色脂肪細胞ではほとんど観察されないＵＣＰ−１遺伝子の発現や、ミトコンドリアに発現するＣｏｘ７ａ１遺伝子の発現量の増加、及び褐色様脂肪細胞特異的に発現するＣＢＰ／ｐ３００‐ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ（ＣＩＴＥＤ１）遺伝子の発現亢進が観察されるようになる。そこで、ＣＩＴＥＤ１、Ｃｏｘ７ａ１及びＵＣＰ１の各遺伝子の発現量を指標に、白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導を確認した。

試料にはＰＰＡＲγアゴニストであるロシグリタゾン及びＵＨＡ４００３の２種類を用いた。各試料をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、和光純薬工業（株）社製）に適当な濃度で溶解させて試験に使用した。

皮下脂肪由来正常ヒト前駆脂肪細胞（ロンザ・ジャパン社製）を １０％のＦＢＳと２ｍＭグ ルタミン、及びＧＡ−１０００を前駆脂肪細胞基本培地（Ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ−２；ＰＭＢ−２培地 ロンザ・ジャパン社製）に添加した前駆脂肪細胞培養培地（ＰＧＭ−２）で４日間前培養後、細胞をＥＤＴＡ−トリプシン液で回収し、ＰＧＭ−２培地に８ｘ１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｍｌの 割合で懸濁し、細胞培養用１２−ｗｅｌｌプ レートに０．５ｍｌづ つ植え込んだ。５％の ＣＯ₂存 在下、３７℃で２４培養後、ロシグリタゾンを終濃度２μＭ、又はＵＨＡ４００３を終濃度４０μＭとなるようにＰＧＭ−２培地に添加し、０．５ｍｌづつ加えさらに４８時間培養した。培養後、ＰＧＭ−２本分化培地（ＰＧＭ−２培地に、キット付属の各種添加因子（ヒトインスリン、ＩＢＭＸ、デキサメタゾン、インドメタシン）を添加したもの）に、さらにロシグリタゾンを終濃度１μＭ、又はＵＨＡ４００３を終濃度２０μＭとなるように添加した分化用培地を１ｍｌ追添加し、脂肪細胞の分化、成熟化を行った。追添加後１０日間培養を行ったものを試験に使用した。コントロールには溶媒であるＤＭＳＯのみを０．５％添加したものを使用した。

実施例２と同様の方法でＲＮＡを抽出、精製し、逆転写反応、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。プライマーには、ＣＩＴＥＤ１フォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ２０４４０４−Ｆ）、ＣＩＴＥＤ１リバースプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ２０４４０４−Ｒ）、ＣＯＸ７Ａ１フォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ１３３６４６−Ｆ）及びＣＯＸ７Ａ１リバースプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ１３３６４６−Ｒ）、ＵＣＰ１フォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ１５８４５１−Ｆ）及びＵＣＰ１リバースプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ１５８４５１−Ｒ）を使用した。細胞内遺伝子の内部標準はβ−アクチンとし、そのプライマーとして、ＡＣＴＢフォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ０６７８０３−Ｆ）及びＡＣＴＢリバースプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ０６７８０３−Ｒ）（前記８種のプライマーはいずれもタカラバイオ（株）製）を使用した。

得られた各細胞中のβ−アクチンとＣＩＴＥＤ１、ＣＯＸ７Ａ１及びＵＣＰ１のＣｔ値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ：一定の増幅量（閾値）に達するサイクル数）からＣＩＴＥＤ１及びＣＯＸ７Ａ１、ＵＣＰ１の各遺伝子発現量の相対値を算出した。結果を図２に示した。

その結果、ロシグリタゾン添加時と同様に、褐色様脂肪細胞のマーカー遺伝子であるＣＩＴＥＤ１遺伝子発現量がＵＨＡ４００３添加時に有意に増大していることが見いだされ、さらに、ミトコンドリアマーカー遺伝子であるＣＯＸ７Ａ１の発現量が有意に増大していることが明らかになった。また、ＵＣＰ１遺伝子の発現量も有意に増加していることが明らかになった。つまり、本来白色脂肪細胞へと分化するヒト皮下脂肪由来正常前駆脂肪細胞がＵＨＡ４００３存在下で褐色様脂肪細胞へと分化したことを示す。即ち、ＵＨＡ４００３に極めて強い白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導作用を有することが示された。

以上の実施例２、３の結果から、ＵＨＡ４００３を添加することで、細胞内のミトコンドリア量が有意に増加し、白色脂肪細胞からの褐色様脂肪細胞への分化が顕著に誘導されていることから、ＵＨＡ４００３は、褐色様脂肪細胞への分化誘導効果が優れていることが示された。
また、ＵＨＡ４００３は、製造コストがかかる合成アゴニストであるロシグリタゾンと比べて、ワンステップで、食品成分から安価に調製することが可能である点でも優れていることがわかる。

Claims (1)

1. ヒドロキシスチルベン類の環化反応生成物であって、式（１）：
   

   

   （但し、式（１）中、Ｒ₁〜Ｒ₈は、水素原子、ヒドロキシ基、炭素数１〜１０の飽和又は不飽和の、直鎖状又は分岐鎖状のアルコキシ基、あるいは炭素数１〜１０の飽和又は不飽和の、直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基であり、Ｒ₁〜Ｒ₈はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）
   で表される化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含有することを特徴とする、白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導剤。

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