WO2014156462A1 - 白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導剤 - Google Patents

白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導剤 Download PDF

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white
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康弘 新家
明宣 來住
泰治 松川
松居　雄毅
泰正 山田
山田　一郎
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Definitions

  • the present invention provides a white adipocyte brown-like adipocyte differentiation-inducing agent containing a cyclization reaction product of hydroxystilbenes obtained by a very simple method and a synthesis method applicable to foods, and the white adipocyte
  • the present invention relates to foods, pharmaceuticals or quasi drugs containing brownish adipocyte differentiation inducers.
  • Tamiflu registered trademark
  • shikimic acid contained in octagon as a crude drug
  • pioglitazone which is an insulin sensitizer, was obtained by a study of derivative synthesis using clofibrate as a lead compound.
  • the derivatization technology used in pharmaceuticals can withstand the use as pharmaceuticals due to the complexity of the synthesis method and the high production cost, but for example, as a highly functional food raw material or additive However, many of them cannot withstand their use because of the cost and safety regulations.
  • preventive medicine aims to prevent illness by ingesting healthy things from daily life. Under such circumstances, preventive medicine and food are closely related.
  • adipocytes There are two types of adipocytes that make up mammalian adipose tissue: white adipocytes and brown adipocytes.
  • White adipocytes have the role of accumulating energy ingested mainly in the form of triglycerides, while brown adipocytes have the role of converting the accumulated energy into heat.
  • Brown adipocytes originate from myoblasts and are adipocytes colored brown by containing a large number of mitochondria inside the cells. However, uncoupling protein 1 (UCP1) is expressed in mitochondria. It is an adipocyte having a role of producing heat by function and converting accumulated energy into heat (Non-patent Document 1).
  • Brown adipose tissues composed of brown adipocytes are found in early childhood, and the amount of the tissue decreases as it grows. Conventionally, it has been considered that brown adipocytes do not express brown adipocytes more than white adipocytes because stem cells derived from white adipocytes are different from white adipocytes. However, in recent years, the existence of “brown-like adipocytes” that show the same response as brown adipocytes in white adipose tissue has been revealed (Non-patent Document 2). Brown-like adipocytes are adipocytes that are derived from white adipocytes but have much more mitochondria than white adipocytes and can efficiently convert the accumulated lipid energy into heat energy.
  • Non-patent Document 3 reports a compound having an effect of amplifying UCP1 gene expression on human visceral fat cells, but browning of white adipocytes is not observed, and the concentration of action is very high. The browning of white adipocytes, such as difficulty in achieving an effective concentration in the body, has not yet been realized.
  • FGFs fibroblast growth factors
  • Patent Document 4 describes a compound that promotes the production of FGF-21 and has an effect of reducing visceral fat.
  • Patent Document 2 describes FGF-21 and a glucagon-like peptide-1 receptor agonist, antidiabetic It is described that a therapeutic agent for type 2 diabetes comprising a drug, a dipeptidyl peptidase-4 inhibitor, is useful.
  • Patent Document 3 describes that it is useful for the treatment of metabolic diseases to extend the half-life of FGF-21 using an FGF-21 derivative.
  • cold stimulation promotes an increase in blood FGF-21 concentration and promotes browning of white fat, and FGF-21 has attracted attention as one of the inducers of browning of white fat.
  • Non-Patent Document 6 reports targeting FGF-21 are only for the purpose of improving metabolic disorders, and no specific proposal has been made as a means for browning white adipocytes.
  • Resveratrol is a kind of hydroxystilbenes that are abundant in grape skin and peanut red skin, and is known as a plant-derived compound with various activities such as anti-fungal, anti-bacterial, anti-inflammatory, etc. (Non-Patent Document 7). Furthermore, resveratrol has been reported to have a function of suppressing differentiation into fat cells and accumulation of fat through promotion of sirtuin expression (Non-patent Document 8).
  • Non-patent Document 9 resveratrol has been reported on the gene expression enhancing effect of uncoupling protein UCP2 specifically expressed in white adipocytes (Patent Document 4), until now, resveratrol has been reported to be brown from white adipocytes to brown. There is no mention of the differentiation effect on adipocytes.
  • JP 2011-241195 A Japanese Patent Publication No. 2013-518035 Japanese Patent Publication No. 2012-515747 JP 2010-24208 A International Publication No. 2013/061455
  • the present inventors have conducted extensive studies to establish a method for inducing differentiation of white adipocytes into brown-like adipocytes and to establish a production method thereof. Surprisingly, it succeeded in producing a new compound showing an action of inducing differentiation of white adipocytes into brown-like adipocytes and a composition containing the compound by a simple and safe method of heat treatment under conditions.
  • the present invention has been completed.
  • the subject of the present invention is a white adipocyte containing a novel compound having an excellent effect of inducing differentiation of white adipocytes into brown-like adipocytes, which has not been seen so far in hydroxystilbenes such as resveratrol. It is to provide a brown-like adipocyte differentiation inducer. Another object of the present invention is to induce the differentiation of brown-like adipocytes into white adipocytes, which has an excellent differentiation-inducing action of white adipocytes into brown-like adipocytes and can be produced safely and inexpensively. It is providing the agent composition and its manufacturing method. Another subject of the present invention is to provide foods, pharmaceuticals and quasi drugs containing the brown adipocyte differentiation inducer of white adipocytes or the brown adipocyte differentiation inducer composition of white adipocytes. There is to do.
  • R 1 to R 8 are a hydrogen atom, a hydroxy group, a saturated or unsaturated linear or branched alkoxy group having 1 to 10 carbon atoms, or 10 saturated or unsaturated, linear or branched alkyl groups, and R 1 to R 8 may be the same or different.
  • An agent for inducing differentiation of white adipocytes into brown-like adipocytes characterized by containing a compound represented by: or a pharmaceutically acceptable salt thereof, [2] The agent for inducing differentiation of white adipocytes into brown-like adipocytes according to [1], wherein the hydroxystilbenes are resveratrol, [3] The agent for inducing differentiation of white adipocytes into brown-like adipocytes according to the above [1] or [2], wherein R 1 to R 8 are all hydrogen atoms in the formula (1), [4] A composition obtained by heating resveratrol under alkaline conditions, Formula (2):
  • a composition for inducing differentiation of white adipocytes into brown-like adipocytes comprising the three types of resveratrol polymerized compounds represented by: [5] The composition for inducing differentiation of white adipocytes into brown-like adipocytes according to [4] above, wherein the phenol content per solid content of 20 mg / mL is 100 ⁇ g / mL or less, [6] A food, pharmaceutical or quasi-drug containing the agent for inducing differentiation of white adipocytes into brown-like adipocytes according to any one of [1] to [3], [7] A food, medicine or quasi-drug containing the composition for inducing differentiation of white adipocytes into brown-like adipocytes according to [4] or [5], [8] Steps (a) to (c): (A) a step of contacting a solution obtained by heating resveratrol under alkaline conditions with a solid adsorbent and recovering an adsorbed
  • the compound represented by the above formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof used in the present invention induces differentiation from white adipocytes to brown-like adipocytes, which is markedly superior to hydroxystilbenes which are precursors. It has an action and is useful as a novel metabolic syndrome treatment and prevention substance.
  • composition for inducing differentiation of white adipocytes into brown-like adipocytes according to the present invention can be produced safely and inexpensively by heating resveratrol under alkaline conditions.
  • composition of the present invention because it has a remarkably excellent white fat cell-to-brown adipocyte differentiation-inducing action that is a new action that the resveratrol precursor does not have, it can be used for novel treatment and prevention of metabolic syndrome Useful.
  • the composition of the present invention is an excellent differentiation inducer from white adipocytes to brown-like adipocytes without performing the isolation and purification step of the compound represented by the formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the composition of the present invention can provide a safer resveratrol heat treatment composition by effectively reducing phenol that tends to be generated when resveratrol is heated under alkaline conditions. Is possible.
  • FIG. I-1 shows UCP1 gene in adipocytes after differentiation induction performed in Example I-2, cell death-inducing DFFA-like effector a (Cidea) which is a brown-like adipocyte marker gene, cytochrome which is a mitochondrial marker gene It is a graph which shows the relative expression level of each gene of c oxidase polypeptide 7A1 (Cox7a1).
  • FIG. I-2 shows the UCP1 gene, the mitochondrial marker gene cytochrome c oxidase polypeptide 7A1 (COX7a1), and the brown-like adipocyte marker gene in the adipocytes after normal subcutaneous fat differentiation induction performed in Example I-3.
  • FIG. II-1 shows a chromatogram of the reaction solution of resveratrol performed in Example II-1.
  • FIG. II-2 shows FGF-21 in adipocytes immediately after differentiation induction performed in Example II-2, peroxisome proliferator-activated receptor ⁇ coactivator 1 ⁇ (PGC-1 ⁇ ), which is a transcriptional coactivator.
  • PPC-1 ⁇ peroxisome proliferator-activated receptor ⁇ coactivator 1 ⁇
  • FIG. II-3 shows FGF-21, PGC-1 ⁇ , Cidea, a peroxisome proliferator-activated receptor ⁇ coactivator 1 ⁇ that is a transcriptional coactivator in matured adipocytes performed in Example II-3.
  • 2 is a graph showing the relative expression level of each gene of (PGC-1 ⁇ ) and UCP1.
  • FIG. II-4 is a graph showing the relative expression level of each gene of PGC-1 ⁇ , UCP1, COX7a1, and CITED1 in adipocytes after induction of normal subcutaneous fat differentiation performed in Example II-4.
  • FIG. III-1 shows a chromatogram of the reaction solution of resveratrol performed in Example III-1.
  • FIG. III-2 is a graph showing the relative expression levels of the FGF-21, PGC-1 ⁇ , PGC-1 ⁇ , and CITED1 genes in the adipocytes immediately after differentiation induction performed in Example III-2.
  • the cyclization reaction product of hydroxystilbenes used in the present invention is: Formula (1):
  • R 1 to R 8 are a hydrogen atom, a hydroxy group, a saturated or unsaturated linear or branched alkoxy group having 1 to 10 carbon atoms, or 10 saturated or unsaturated, linear or branched alkyl groups, and R 1 to R 8 may be the same or different. Or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the saturated or unsaturated linear or branched alkoxy group having 1 to 10 carbon atoms represented by R 1 to R 8 is not particularly limited, but preferably Is a linear or branched alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms. Specific examples thereof include methoxy group, ethoxy group, n-propoxy group, isopropoxy group, n-butoxy group, isobutoxy group, s-butoxy group, t-butoxy group and the like. Further, the saturated or unsaturated linear or branched alkyl group having 1 to 10 carbon atoms represented by R 1 to R 8 is not particularly limited, but preferably 1 to 1 carbon atoms.
  • R 1 ⁇ R 8 is a hydrogen atom, more preferably R 1 ⁇ R 8 are all hydrogen atoms.
  • the carbon-carbon double bond may be trans or cis.
  • the compound represented by the formula (1) may be a mixture of a cis isomer and a trans isomer.
  • Examples of the pharmaceutically acceptable salt of the compound represented by the formula (1) include alkali metal salts such as lithium salt, sodium salt and potassium salt; alkaline earth salts such as magnesium salt, calcium salt and barium salt.
  • These pharmaceutically acceptable salts can be used alone or in admixture of two or more.
  • the compound represented by the formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof (hereinafter also referred to as the compound represented by the formula (1)) can differentiate white adipocytes into brown-like adipocytes. Has an inducing action. Specifically, this adipocyte differentiation inducing action can be measured by the method described in Examples I-2 and I-3 described later.
  • the compound represented by the formula (1) can be obtained by heat treatment under alkaline conditions using hydroxystilbenes as a raw material compound.
  • Hydroxystilbenes are those of formula (5):
  • R 1 to R 4 are each a hydrogen atom, a hydroxy group, a saturated or unsaturated linear or branched alkoxy group having 1 to 10 carbon atoms, or 10 saturated or unsaturated, linear or branched alkyl groups, and R 1 to R 4 may be the same or different. And a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the saturated or unsaturated linear or branched alkoxy group having 1 to 10 carbon atoms represented by R 1 to R 4 is not particularly limited, but is preferably Is a linear or branched alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms. Specific examples thereof include methoxy group, ethoxy group, n-propoxy group, isopropoxy group, n-butoxy group, isobutoxy group, s-butoxy group, t-butoxy group and the like. Further, the saturated or unsaturated linear or branched alkyl group having 1 to 10 carbon atoms represented by R 1 to R 4 is not particularly limited, but preferably 1 to 1 carbon atoms.
  • R 1 ⁇ R 4 is a hydrogen atom
  • resveratrol R 1 ⁇ R 4 are all hydrogen atoms is more preferred.
  • Examples of the pharmaceutically acceptable salt of the compound represented by the formula (5) include alkali metal salts such as lithium salts, sodium salts and potassium salts; alkaline earth salts such as magnesium salts, calcium salts and barium salts.
  • These pharmaceutically acceptable salts can be used alone or in admixture of two or more.
  • the hydroxystilbenes used as the raw material compound may be naturally derived or chemically synthesized chemical products with high purity.
  • the naturally occurring raw material compound does not need to be completely purified, and a mixture containing other compounds can also be used.
  • the hydroxystilbenes preferably contain a total of 5% by weight or more in terms of hydroxystilbenes.
  • a raw material for example, an extract from a raw material such as grape skin, wine, wine concentrated powder, meringo, lingonberry, peanut peel, itadori, a freeze-dried product of the extract, or the like may be used.
  • hydroxystilbenes are suspended and dissolved in a suitable solvent.
  • a suitable solvent it is also possible to make it melt
  • the mixing ratio of water and organic solvent and the type of organic solvent are not particularly limited, and may be not completely dissolved as long as hydroxystilbenes are sufficiently dispersed.
  • only water or a mixed solution of water and methanol, water and ethanol, or the like can be used, but it is more preferable to perform only with water from the viewpoint of safety and cost.
  • ethanol is used as a solvent for safety and legal purposes. It is desirable to use water, water-containing ethanol.
  • the concentration of hydroxystilbenes in a mixed solution obtained by suspending and dissolving hydroxystilbenes in a solvent as described above is not particularly limited, but hydroxystilbenes
  • concentration of hydroxystilbenes is preferably adjusted to be higher than the concentration at which the hydroxystilbenes are saturated with respect to each solvent.
  • the pH of the hydroxystilbene-containing solution is adjusted to be alkaline.
  • an alkalinizing agent may be added to adjust the pH, or the solvent pH may be adjusted in advance when preparing the hydroxystilbene-containing solution. Also good. If the pH at the start of the heating reaction of the hydroxystilbene-containing solution is 8.0 or more, the reaction described later proceeds efficiently, and if the pH exceeds 13.0, other reactions and decomposition of the target compound occur simultaneously. On the other hand, since it occurs, the recovery amount of the final hydroxystilbene polymer compound group decreases. Accordingly, the pH at the start of the reaction is preferably 8.0 to 13.0.
  • the alkalinizing agent is not particularly limited, but sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium bicarbonate, sodium carbonate and the like are preferable from the viewpoint of safety, efficiency and cost.
  • a buffer solution may be used, but this is not always necessary.
  • the hydroxystilbene-containing solution adjusted to be alkaline is heated.
  • the hydroxystilbenes are cyclized to produce the compound represented by the formula (1).
  • the cyclization reaction refers to a reaction in which hydroxystilbenes are polymerized to form a 6-membered ring.
  • resveratrol as a hydroxystilbene is cyclized to form a compound represented by formula (2):
  • the carbon-carbon double bond may be trans or cis as in the compound represented by the formula (1). Including mixtures of cis and trans isomers.
  • the resveratrol polymerization compound represented by the formula (3) or formula (4) may be a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the pharmaceutically acceptable salt of the resveratrol polymerization compound represented by the formula (3) or the formula (4) include alkali metal salts such as lithium salt, sodium salt, potassium salt; magnesium salt, calcium Alkaline earth metal salts such as salts and barium salts; Aluminum salts; Metal hydroxide salts such as aluminum hydroxide salts; Alkylamine salts, dialkylamine salts, trialkylamine salts, alkylenediamine salts, cycloalkylamine salts, arylamines Amine salts such as salts, aralkylamine salts and heterocyclic amine salts; amino acid salts such as ⁇ -amino acid salts and ⁇ -amino acid salts; peptide salts or primary, secondary, tertiary or A quaternary amine salt etc. are mentioned.
  • These pharmacologically acceptable salts
  • the compound represented by the formula (1) and the resveratrol polymerized compounds represented by the formulas (2) to (4) are collectively referred to as a hydroxystilbene cyclization reaction product.
  • the heating temperature of the hydroxystilbene-containing solution is preferably adjusted to 110 ° C. or higher.
  • pressure heating is desirable.
  • a hydroxystilbene-containing solution is put in an open container, the container is heated at a high temperature exceeding the boiling point of the solvent, a hydroxystilbene-containing solution is put in a sealed container, and the container is heated, using a retort apparatus or an autoclave. It is preferable to heat at least partially such that the temperature of the hydroxystilbene-containing solution reaches 110 ° C. or higher, such as by heating under pressure, using a device such as a supercritical device or pressure cooker.
  • the temperature of the hydroxystilbene-containing solution is uniformly 120 ° C. to 180 ° C.
  • the heating time is not limited as in the case of the heating temperature, and may be a time condition in which the target reaction efficiently proceeds.
  • the heating time depends on the heating temperature, and it is desirable to set the heating time according to the heating temperature. For example, when heating near 130 ° C., a heating time of 5 minutes to 270 minutes is desirable.
  • the production amount of a desired compound can be adjusted by adjusting the heating time. For example, when the compound represented by the formula (1) is produced, it may be about 5 to 60 minutes.
  • the resveratrol polymer represented by the above formulas (2) to (4) when it is produced, it may be about 10 minutes to 270 minutes. Further, the heating may be performed once or may be repeated repeatedly in a plurality of times. When heating in multiple steps, it is preferable to add a new solvent.
  • the completion of the production reaction of the hydroxystilbene cyclization reaction product by the heating may be judged by confirming the production amount of each compound by component analysis by HPLC, for example.
  • the hydroxystilbene cyclization reaction product is produced by a process using only safe raw materials, as described later in the state of a mixture containing the hydroxystilbene cyclization reaction product, It can be used for quasi drugs.
  • a naturally-derived resveratrol is dissolved in a water-containing ethanol solvent, the pH is adjusted to be alkaline with sodium hydroxide or sodium bicarbonate, and the reaction is heated, the resulting liquid reactant is converted into food. It can be used as one of raw materials for pharmaceuticals, quasi drugs and the like.
  • the concentration of the reaction product can be increased by increasing the concentration of the hydroxystilbene cyclization reaction product.
  • the said reaction material can be refine
  • the concentration and purification can be performed by a known method.
  • the hydroxystilbene cyclization reaction product can be concentrated by extraction with a solvent extraction method such as chloroform, ethyl acetate, ethanol, or methanol, or a supercritical extraction method with carbon dioxide gas.
  • concentration and purification can be performed using column chromatography or HPLC.
  • a membrane treatment method such as a recrystallization method or an ultrafiltration membrane or desalting can be used.
  • the hydroxystilbene cyclization reaction product can be adsorbed and then eluted and then easily concentrated and purified.
  • the synthetic adsorbent include aromatic synthetic adsorbents such as Diaion (registered trademark) HP series and Sepabeads (registered trademark) SP series manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation, and Amberlite (registered trademark) manufactured by Organo Corporation. ) Styrenic synthetic adsorbents such as XAD series.
  • a powdery solid can be obtained by removing the solvent by subjecting the concentrate or purified product to vacuum drying or freeze drying, if necessary.
  • reaction a solution obtained by heating resveratrol under alkaline conditions as described above (hereinafter referred to as reaction)
  • reaction liquid a solution obtained by heating resveratrol under alkaline conditions as described above
  • Also referred to as a liquid has a tendency to generate phenol. Therefore, it can be obtained by removing the phenol by subjecting the reaction liquid to the treatment described in the following steps (a) to (c).
  • steps (a) to (c) it is sufficient if the concentration of phenol in the reaction solution is lowered, and one step may be selected, or two or more steps may be combined. Further, the same process may be repeated.
  • the solid adsorbent used in the step (a) includes various synthetic adsorbents and silica gel.
  • the synthetic resin include aromatic synthetic adsorbents such as Diaion (registered trademark) HP series and Sepabead (registered trademark) SP series manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation, and Amberlite (registered trademark) XAD manufactured by Organo Corporation.
  • examples thereof include soft gels based on styrene-based synthetic adsorbents such as series, dextran and agarose such as Sephadex series manufactured by GE Healthcare Japan, and Sepharose series.
  • the silica gel include chemically bonded porous spherical silica gel whose surface is modified with an octadecylsilyl group or the like.
  • the method for bringing these solid adsorbents into contact with the reaction liquid is not particularly limited.
  • a method in which a solid adsorbent is filled in a column and the reaction liquid is passed (hereinafter also referred to as column method), or a tank is used.
  • a reaction solution and a solid adsorbent are put in contact with stirring (hereinafter also referred to as a tank method).
  • the column method is preferred because of the ease of handling when the solid adsorbent and the reaction solution are in contact.
  • the temperature when the reaction solution and the adsorbent are brought into contact with each other is not particularly limited, but is preferably 10 to 30 ° C.
  • Phenol mixed in the reaction solution passes without adsorbing when the column method is used, when using a synthetic adsorbent, and when using a soft gel, it is expressed by the above formulas (2) to (4).
  • silica gel which is eluted at a different transit time from the resveratrol polymer compound, it can be removed by changing the composition of the solution at the time of elution.
  • the purification using the solid adsorbent not only removes the phenol mixed in the reaction solution, but also desalinates and purifies the purified product to obtain a resveratrol polymer compound represented by the formulas (2) to (4). It is also possible to increase the concentration.
  • Examples of the method for adjusting the reaction solution to pH 7 or less in the step (b) include addition of an acidic substance to the reaction solution.
  • an acidic substance for example, hydrochloric acid, a citric acid, etc. are mentioned.
  • As a method for precipitating the resveratrol polymerization compound represented by the formulas (2) to (4) in the reaction solution adjusted to pH 7 or less there is a method of forming an aqueous solution having an organic solvent concentration of 10% or less by volume. Raised.
  • the organic solvent concentration is preferably 5% or less, more preferably water only.
  • the method for collecting the precipitate is not particularly limited, and it is sufficient that the insoluble matter can be collected, and examples thereof include filtration and centrifugation.
  • step (c) as a method of heating the reaction solution, the composition obtained in the step (a) or the aqueous solution containing the composition obtained in the step (b), evaporated water vapor is used.
  • a method that is not refluxed is desirable.
  • the heating conditions may be any conditions that allow the contained water to evaporate, and the aqueous solution is preferably treated at a temperature of 50 to 130 ° C., preferably 80 to 100 ° C. for 10 minutes to 12 hours.
  • Phenol can be removed from the resveratrol heat treatment composition by the treatments as described in the steps (a) to (c), and further, a method such as steam distillation or steam stripping, activated carbon or a synthetic adsorbent is used. By using it, it is possible to obtain a higher-quality resveratrol heat treatment composition by removing phenol substantially completely. Further, if necessary, the resveratrol heat treatment composition can be made into a powdery solid by removing the solvent by drying under reduced pressure or freeze drying.
  • the resveratrol heat-treatment composition obtained as described above contains not only the resveratrol polymer compound represented by the above formulas (2) to (4) but also a significantly reduced phenol content. It is. Specifically, the phenol concentration in the methanol solution of the resveratrol heat treatment composition adjusted to a concentration of 20 mg / mL solid content is 100 ⁇ g / mL or less, preferably 50 ⁇ g / mL, more preferably 5 ⁇ g / mL. is there.
  • the hydroxystilbenes cyclization reaction product obtained as described above has an action of inducing differentiation of whiter adipocytes into brownish adipocytes, as compared with the raw material hydroxystilbenes.
  • the metabolic syndrome can be prevented and improved by this brown-like adipocyte differentiation-inducing action.
  • the brown adipocyte differentiation-inducing agent for white adipocytes of the present invention containing the compound represented by the above formula (1) as an active ingredient, or the resveratrol weight represented by the above formulas (2) to (4)
  • the composition of the present invention containing a compound compound as an active ingredient is useful as a novel preventive and / or therapeutic agent for metabolic syndrome.
  • stimulates the said white adipocyte to the brown-like fat cell is an effect
  • the brown-like adipocyte differentiation inducing agent for white adipocytes of the present invention may contain only the compound represented by the formula (1), but the compound represented by the formula (1) is ethanol. Alternatively, it may be a solution dissolved in a solvent such as an ethanol-containing aqueous solution, or may be made into an emulsion or suspension by a known method. Further, the composition of the present invention may contain only the compounds represented by the formulas (2) to (4), but the compounds represented by the formulas (2) to (4) may be ethanol or A solution dissolved in a solvent such as an ethanol-containing aqueous solution may be used, or an emulsion or suspension may be prepared by a known method. The content of the hydroxystilbene cyclization reaction product in the brown-like adipocyte differentiation inducer or inducer composition of white adipocytes of the present invention may be 0.001% by weight or more.
  • the dose of the white adipocyte brown-like adipocyte differentiation-inducing agent or the composition of the present invention includes the patient's sex, age, physiological state, pathological condition (such as progress of obesity), formulation form, and administration route. Depending on the frequency of administration, the concentration of the active ingredient in the drug, etc., it can be appropriately selected from a wide range.
  • the content of the hydroxystilbene cyclization reaction product per day for an adult is about 0.01 to 500 mg / kg, preferably It may be about 0.1 to 100 mg / kg. Administration may be divided, for example, once or several times per day.
  • the white adipocyte brown-like adipocyte differentiation-inducing agent of the present invention or the composition of the present invention may be formulated as a pharmaceutical product.
  • a pharmaceutical product There are no particular limitations on the form of the preparation, and examples include parenteral preparations such as injections, suppositories, eye drops, ointments, aerosols, tablets, coated tablets, powders, fine granules, granules, capsules, and liquids. , Pills, suspensions, emulsions, lozenges, chewable tablets, syrups and other oral preparations.
  • pharmaceutically acceptable carriers, excipients, lubricants, binders, disintegrants, diluents, stabilizers, tonicity agents, pH adjusters, buffers, etc. are used. It is done.
  • Carriers and excipients include, for example, lactose, sucrose, sodium chloride, glucose, maltose, mannitol, erythritol, xylitol, maltitol, inositol, dextran, sorbitol, albumin, urea, starch, calcium carbonate, kaolin, crystalline cellulose , Silicic acid, methylcellulose, glycerin, sodium alginate, gum arabic and mixtures thereof.
  • Examples of the lubricant include purified talc, stearate, borax, polyethylene glycol, and a mixture thereof.
  • Examples of the binder include simple syrup, glucose solution, starch solution, gelatin solution, polyvinyl alcohol, polyvinyl ether, polyvinyl pyrrolidone, carboxymethyl cellulose, shellac, methyl cellulose, ethyl cellulose, water, ethanol, potassium phosphate, and a mixture thereof. Can be mentioned.
  • disintegrant examples include dry starch, sodium alginate, agar powder, laminaran powder, sodium hydrogen carbonate, calcium carbonate, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, sodium lauryl sulfate, stearic acid monoglyceride, starch, lactose and mixtures thereof. Is mentioned.
  • diluent examples include water, ethyl alcohol, macrogol, propylene glycol, ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, and mixtures thereof.
  • stabilizer examples include sodium pyrosulfite, ethylenediaminetetraacetic acid, thioglycolic acid, thiolactic acid, and a mixture thereof.
  • Examples of the isotonic agent include sodium chloride, boric acid, glucose, glycerin and a mixture thereof.
  • Examples of the pH adjuster and buffer include sodium citrate, citric acid, sodium acetate, sodium phosphate, and mixtures thereof.
  • the brown adipocyte differentiation-inducing agent for white adipocytes of the present invention or the composition of the present invention comprises a filler, a solubilizer, a dispersant, a suspending agent, an emulsifier, an antioxidant, a bacterial inhibitor, a colorant, A flavoring agent, a flavoring agent, etc. may be included.
  • the white adipocyte brown-like adipocyte differentiation inducer of the present invention or the composition of the present invention may be formulated into a food form. It does not specifically limit as food, For example, a drink, alcoholic beverage, jelly, confectionery, functional food, health food, health-oriented food, etc. are mentioned. In consideration of preservability, portability, ease of ingestion and the like, confectionery is preferable, and among confectionery, hard candy, soft candy, gummy candy, tablet, chewing gum and the like are preferable.
  • the content of the hydroxystilbene cyclization reaction product in the food is usually 0.001. About 20% by weight.
  • the brown adipocyte differentiation inducer of white adipocytes of the present invention or the composition of the present invention may be formulated into a quasi-drug form.
  • a quasi-drug for example, nutritional supplement quasi-drugs, such as a drink, are preferable.
  • the content of the hydroxystilbene cyclization reaction product as an active ingredient in the quasi-drug is usually about 0.001 to 30% by weight.
  • the brown adipocyte differentiation-inducing agent for white adipocytes of the present invention or the composition of the present invention is not only applied to humans, but also non-human animals such as rats, mice, guinea pigs, rabbits, sheep, pigs, You may mix
  • feed for example, livestock feed used for sheep, pigs, cattle, horses, chickens, etc., feed for small animals used for rabbits, rats, mice, etc., feed for seafood used for eel, Thailand, yellowtail, shrimp, etc., dogs,
  • the pet food used for a cat, a small bird, a squirrel, etc. is mentioned.
  • trans-resveratrol is used as the hydroxystilbenes, but other hydroxystilbenes can be obtained by the same reaction.
  • Example I-1 Production, isolation and purification of hydroxystilbene derivative UHA4003
  • the hydroxystilbene derivative UHA4003 was produced, isolated and purified. That is, 700 mg of trans-resveratrol (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) was dissolved in 14 mL of ethanol, and 14 mL of 2.5% aqueous sodium hydrogen carbonate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added. A trol-containing solution (pH 9.9) was obtained. This resveratrol-containing solution was heated at 130 ° C.
  • a hydroxystilbene derivative (hereinafter referred to as UHA4003) was obtained from a peak seen in the vicinity.
  • Example I-2 Verification of brown-like adipocyte differentiation-inducing action indicator gene expression of white adipocytes of UHA4003
  • 3T3-L1 cells mouse-derived preadipocytes
  • 3T3-L1 preadipocytes usually differentiate and mature into white adipocytes through a differentiation induction process.
  • cell death induction DFFA-like effector a (Cidea) gene that is hardly observed in white adipocytes due to differentiation induction into brown-like adipocytes and increased expression of CITED1 gene specifically expressed in brown-like adipocytes, brown fat Transcriptional coactivator PGC-1 ⁇ whose expression is enhanced in cells and brown-like adipocytes, increased expression level of cytochrome c oxidase polypeptide 7A1 (Cox7a1) gene expressed in mitochondria, and cytochrome c oxidase expressed specifically in mitochondria Increased protein expression level and increased expression of uncoupling protein (UCP1) gene are observed.
  • CIP1 uncoupling protein
  • FGF-21 is known as one of the factors that promote differentiation into brown-like adipocytes, and there are several effects brought about by the enhanced expression of FGF-21.
  • PGC-1 ⁇ it is considered that the expression of PGC-1 ⁇ is promoted and white adipocytes are induced into brown adipocytes. Therefore, differentiation induction of white adipocytes into brown-like adipocytes was confirmed using the expression level of each gene of Cidea, Cox7a1 and UCP1 as an index.
  • rosiglitazone which is a synthetic agonist of PPAR ⁇
  • UHA4003 Two types of samples, rosiglitazone, which is a synthetic agonist of PPAR ⁇ , and UHA4003 were used as samples. Each sample was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at a concentration of 0.2 mM and 2 mM and used for the test.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the culture is 10% fetal bovine serum (Footal Bovine Serum: FBS Biologic industries), 1% antibiotic-antimycotic ("Antibiotic-Antimycotic", “Dulbecco's GIBCO”) “Eagle medium” (DMEM, trade name, manufactured by Sigma) was used.
  • Adipocytes used in the test were prepared according to a conventional method.
  • the test was conducted as follows. A 12-well dish (manufactured by Corning) for cell culture was seeded with 1 mL of 3T3-L1 cells at a concentration of 5 ⁇ 10 4 cells / mL and cultured under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 for 24 hours. After 24 hours, the DMEM medium was replaced with a DMEM medium adjusted so that UHA4003 had a final concentration of 20 ⁇ M or rosiglitazone had a final concentration of 1 ⁇ M, and the culture was continued to reach 100% confluence and further cultured for 48 hours.
  • the medium was added to 1 mL of differentiation DMEM supplemented with 1%, 0.5%, and 0.1% of insulin, dexamethasone, and isobutylmethylxanthine attached to “AdipoInducer Reagent” (trade name, manufactured by Takara Bio Inc.), respectively.
  • Each sample was added and exchanged to a final concentration of 20 ⁇ M and 1 ⁇ M, and differentiation was induced for 48 hours under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the culture medium was replaced with 2 mL of maintenance culture DMEM supplemented with 1% of insulin, and further cultured for 1 week to mature adipocytes.
  • what added 0.5% of only DMSO which is a solvent was set as control.
  • Real-time RT-PCR analysis was performed according to a conventional method.
  • “ECO Realtime RT-PCR system” (trade name, manufactured by Illumina) was used.
  • Primers include Cidea forward primer (primer ID: MA104629-F), Cidea reverse primer (primer ID: MA104629-R), Cox7a1 forward primer (primer ID: MA106801-F), and Cox7a1 reverse primer (primer ID: MA106801-R). ), UCP1 forward primer (primer ID: MA027561-F) and UCP1 reverse primer (primer ID: MA027561-R) were used.
  • the internal standard of the intracellular gene is ⁇ -actin, and as its primers, an ACTB forward primer (primer ID: MA050368-F) and an ACTB reverse primer (primer ID: MA050368-R) (all of the above 8 types of primers are Takara Bio). Used).
  • a real-time RT-PCR reagent (trade name: SYBR (registered trademark) Premix EX taq II (Tli RNaseH Plus), manufactured by Takara Bio Inc.) was used for the reaction.
  • the reaction solution was contained in a 48-well PCR plate (manufactured by Illumina), 2 ⁇ (SYBR Premix EX taq II (Tli RNaseH Plus)) 5 ⁇ L, forward primer (50 ⁇ M) 0.08 ⁇ L, reverse primer (50 ⁇ M) 0.08 ⁇ L. 2 ⁇ L of the reverse transcription reaction solution and 2.84 ⁇ L of dH 2 O (total amount 10 ⁇ L) were mixed, and “95 ° C. ⁇ 30 seconds ⁇ “ 95 ° C. ⁇ 15 seconds ⁇ 60 ° C. ⁇ 1 minute ” ⁇ 40 cycles ⁇ 95 ° C. ⁇ 15 seconds PCR reaction was carried out with the program “ ⁇ 55 ° C. ⁇ 15 seconds ⁇ 95 ° C. ⁇
  • Rosiglitazone is a synthetic agonist and its effect is stronger compared to UHA4003, but UHA4003 is a compound with a merit that can be obtained by a much simpler method, and brown-like adipocytes of white adipocytes that are extremely strong like rosiglitazone It was shown that the possibility of having a differentiation-inducing action is high.
  • Example I-3 Verification of brown-like adipocyte differentiation-inducing action indicator gene expression for normal human subcutaneous fat of UHA4003
  • Normal preadipocytes usually differentiate into white adipocytes, but are induced to differentiate into brown-like adipocytes, so that expression of UCP-1 gene that is hardly observed in white adipocytes and expression of Cox7a1 gene expressed in mitochondria Increased amount and increased expression of CBP / p300-interacting transactivator (CITED1) gene expressed specifically in brownish adipocytes are observed. Therefore, differentiation induction of white adipocytes into brown-like adipocytes was confirmed using the expression levels of the CITED1, Cox7a1, and UCP1 genes as indices.
  • CITED1 CBP / p300-interacting transactivator
  • PPAR ⁇ agonists rosiglitazone and UHA4003 were used as samples. Each sample was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at an appropriate concentration and used for the test.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • Subcutaneous fat-derived normal human preadipocytes manufactured by Lonza Japan
  • 10% FBS and 2 mM glutamine 10% FBS and 2 mM glutamine
  • GA-1000 preadipocyte basal medium-2 (PMB-2 medium, Lonza Japan)
  • PGM-2 medium adipocyte basal medium-2
  • rosiglitazone was added to PGM-2 medium to a final concentration of 2 ⁇ M or UHA4003 to a final concentration of 40 ⁇ M, added in 0.5 ml increments, and further cultured for 48 hours.
  • PGM-2 differentiation medium PGM-2 medium supplemented with various additional factors (human insulin, IBMX, dexamethasone, indomethacin) attached to the kit
  • rosiglitazone at a final concentration of 1 ⁇ M or UHA4003
  • Additional 1 ml of differentiation medium added to a final concentration of 20 ⁇ M was added to differentiate and mature adipocytes. What was cultured for 10 days after the additional addition was used for the test.
  • a solvent to which only 0.5% of DMSO as a solvent was added was used.
  • RNA was extracted and purified in the same manner as in Example I-2, and reverse transcription reaction and real-time RT-PCR were performed.
  • Primers include CITED1 forward primer (primer ID: HA204404-F), CITED1 reverse primer (primer ID: HA204404-R), COX7A1 forward primer (primer ID: HA133646-F) and COX7A1 reverse primer (primer ID: HA133646-R) ), UCP1 forward primer (primer ID: HA158451-F) and UCP1 reverse primer (primer ID: HA158451-R).
  • the internal standard of the intracellular gene is ⁇ -actin, and as its primers, an ACTB forward primer (primer ID: HA067803-F) and an ACTB reverse primer (primer ID: HA067803-R) (all of the above 8 types of primers are Takara Bio). Used).
  • Example II-1 Preparation and purification of a composition containing a resveratrol polymerization compound
  • Preparation and purification of a composition containing a resveratrol polymerization compound were performed according to the following procedure. 1 g of trans-resveratrol (manufactured by TECNO SCIENCE Co., Ltd.) is dissolved in 10 mL of ethanol, and 10 mL of a 10% aqueous solution of sodium hydrogen carbonate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is added to prepare a resveratrol-containing solution ( pH 9.9) was obtained. This resveratrol-containing solution was heated at 130 ° C.
  • a resveratrol-polymerized compound-containing solution was prepared for 90 minutes in an autoclave to prepare a resveratrol-polymerized compound-containing solution.
  • the resveratrol polymer compound-containing solution was diluted and dissolved with 1 L of distilled water, and supplied to 400 g of synthetic adsorbent Diaion (registered trademark) HP-20 (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation). After washing with 1 L of distilled water, elution was performed with 1 L of 100% ethanol. The solvent was removed by drying under reduced pressure to obtain 200 mg of a resveratrol polymerization compound-containing composition (hereinafter referred to as a derivative-containing composition).
  • the obtained polymerization compound composition was dissolved in methanol at a concentration of 2 mg / mL, 10 ⁇ L of which was analyzed by HPLC.
  • HPLC analysis was performed under the following conditions.
  • the obtained chromatogram is shown in Figure II-1.
  • a plurality of peaks different from the peak of resveratrol could be detected, and thus a composition containing a plurality of produced compounds could be obtained.
  • the compounds contained in the peaks shown in (1), (2) and (3) of Fig. II-1 were isolated by preparative HPLC and dried by a conventional method.
  • the compound contained in the peaks shown in (1) and (2) was a light brown powdery substance
  • the compound contained in the peak shown in formula (3) was a brown powdery substance.
  • the molecular weights of the three kinds of compounds were measured with a high-resolution negative-FAB-MS (Fast Atom Bombardment-Mass Spectrometry) according to the method described in Example 2 of JP2011-251914A, and nuclear magnetic field was measured.
  • NMR nuclear magnetic field
  • the compound contained in the peak of (1) is a compound represented by the above formula (3) (hereinafter referred to as UHA4002)
  • the compound contained in the peak of (2) is the above. It was found to be a compound represented by the formula (2) (hereinafter referred to as UHA4003).
  • Table 1 shows the 1 H nuclear magnetic resonance spectrum and 13 C nuclear magnetic resonance spectrum. The values were ⁇ and ppm, and the solvent was measured with DMSO-d 6 .
  • Example II-2 Verification of expression index gene for action of inducing differentiation of brown adipocytes in white adipocytes of a derivative-containing composition
  • evaluation was performed using 3T3-L1 cells (mouse-derived preadipocytes) in the same manner as in Example I-2.
  • differentiation induction of white adipocytes into brown-like adipocytes was confirmed using the expression levels of each gene of FGF-21, PGC-1 ⁇ and Cox7a1 as an index.
  • rosiglitazone which is a synthetic agonist of PPAR ⁇
  • derivative-containing composition prepared in Example II-1.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • Adipocytes used in the test were prepared according to a conventional method.
  • the test was conducted as follows. A 12-well dish (manufactured by Corning) for cell culture was seeded with 1 mL of 3T3-L1 cells at a concentration of 5 ⁇ 10 4 cells / mL and cultured under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 for 24 hours. After 24 hours, the DMEM medium was replaced with a DMEM medium adjusted to a final composition concentration of 20 ⁇ g / mL or rosiglitazone to a final concentration of 1 ⁇ M, and the culture was continued to 100% confluence, followed by further incubation for 48 hours.
  • the medium was added to 1 mL of differentiation DMEM supplemented with 1%, 0.5%, and 0.1% of insulin, dexamethasone, and isobutylmethylxanthine attached to “AdipoInducer Reagent”, respectively, and each sample was adjusted to a final concentration of 20 ⁇ g / mL, 1 ⁇ M. They were added and exchanged so that differentiation was induced for 48 hours under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 . In addition, what added 0.5% of only DMSO which is a solvent was set as control.
  • RNA extraction kit in the same manner as in Example I-2, and use the obtained RNA as the instruction manual for the reverse transcription reagent for 2-step real-time RT-PCR.
  • the reverse transcription reaction was performed accordingly.
  • a diluted solution obtained by diluting the obtained reverse transcription reaction solution 5-fold with a diluent for real-time RT-PCR was used for real-time RT-PCR analysis.
  • Real-time RT-PCR analysis was performed according to a conventional method. For the analysis, “ECO Realtime RT-PCR system” (trade name, manufactured by Illumina) was used.
  • Primers include FGF-21 forward primer (primer ID: MA-126886-F), FGF-21 reverse primer (primer ID: MA-126886-R), PGC-1 ⁇ forward primer (primer ID: MA-114509-F) ), PGC-1 ⁇ reverse primer (primer ID: MA-114509-R), Cox7a1 forward primer (primer ID: MA106801-F) and Cox7a1 reverse primer (primer ID: MA106801-R).
  • the internal standard of the intracellular gene is ⁇ -actin, and as its primers, an ACTB forward primer (primer ID: MA050368-F) and an ACTB reverse primer (primer ID: MA050368-R) (all of the above 8 types of primers are Takara Bio). Used).
  • Real-time RT-PCR reagent (trade name: SYBR (registered trademark) Select Master Mix, manufactured by life technologies) was used for the reaction.
  • the reaction solution was 2 ⁇ (SYBR Select Master Mix) 5 ⁇ L, forward primer (50 ⁇ M) 0.08 ⁇ L, reverse primer (50 ⁇ M) 0.08 ⁇ L, reverse transcription reaction solution 2 ⁇ L.
  • dH 2 O 2.84 ⁇ L total amount 10 ⁇ L
  • ⁇ -actin and FGF-21 PGC-1 ⁇ and Cox7a1 Ct values (Threshold Cycle: the number of cycles to reach a certain amount of amplification (threshold)) in each cell obtained from FGF-21, PGC-1 ⁇ and Cox7a1
  • Threshold Cycle the number of cycles to reach a certain amount of amplification (threshold)
  • the expression level of the FGF-21 gene which is one of the inducers of brown-like adipocytes, and the expression level of the PGC-1 ⁇ gene accompanying the expression of the FGF-21 gene was It was found that it sometimes increased significantly, and further, it was revealed that the expression level of Cox7a1, which is a mitochondrial marker gene, was significantly increased.
  • Rosiglitazone is a synthetic agonist and its effect is stronger compared to the derivative-containing composition.
  • thiazolidine compounds such as rosiglitazone have strong side effects such as edema and heart failure, and are problematic in safety.
  • the derivative-containing composition is a composition having a merit obtained by a much simpler method, and its precursor compound resveratrol is widely distributed in nature and is an extremely safe compound. Furthermore, since hydroxystilbenes such as resveratrol are widely distributed in nature including polymers, they are rich in food experience. Therefore, it was shown that the product of the present invention is a useful composition that is highly safe and has a high possibility of inducing differentiation of white adipocytes into brown-like adipocytes, which is extremely strong like rosiglitazone.
  • Example II-3 Verification of expression of a marker gene for inducing differentiation of brown adipocytes in white adipocytes of a derivative-containing composition
  • the derivative-containing composition induces differentiation of white adipocytes into brown-like adipocytes with the cells immediately after differentiation induction. Therefore, in Example II-3, the induced cells remained after maturation.
  • the maintenance of brown-like adipocyte traits was evaluated using mature adipocytes. The evaluation was based on the expression level of each gene of FGF-21, PGC-1 ⁇ , and cell death-inducing DFFA-like effector a (Cidea), which is a brown-like adipocyte marker gene.
  • brown-like adipocytes respond to stimulation with adrenaline. Since the expression level of the UCP1 gene was enhanced, the induction of differentiation of white adipocytes into brown-like adipocytes was confirmed using the expression level of UCP1 gene when adrenaline was added to the matured adipocytes as an index.
  • Example II-2 In the same manner as in Example II-2, the same composition and compound were added to induce differentiation of 3T3-L1 preadipocytes. After induction of differentiation for 48 hours, the culture medium was replaced with 2 mL of maintenance culture DMEM supplemented with 1% of insulin, and further cultured for 1 week to mature adipocytes. For stimulation with adrenaline, matured cells were replaced with 2 mL of maintenance culture DMEM supplemented with 1 ⁇ M L-adrenaline (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), cultured for 2 hours, and the response was verified. .
  • the same primers as used in Example II-2 were used for the FGF-21, PGC-1 ⁇ , and ACTB genes, and the PGC-1 ⁇ forward primer (primer ID: MA125505) was used for the PGC-1 ⁇ gene.
  • ⁇ -actin and FGF-21 PGC-1 ⁇ , PGC-1 ⁇ , Cidea and UCP1 Ct values (Threshold Cycle: the number of cycles reaching a certain amplification amount (threshold)) in each cell obtained from FGF-21,
  • the relative values of the gene expression levels of PGC-1 ⁇ , PGC-1 ⁇ , Cidea and UCP1 were calculated. The results are shown in Fig. II-3.
  • the expression level of the FGF-21 gene which is one of the inducers of brownish adipocytes, and the expression of the FGF-21 gene significantly increased. Furthermore, it was found that the expression level of Cidea, a brown-like adipocyte marker gene, and the expression level of PGC-1 ⁇ , whose expression is enhanced in brown adipocytes, are significantly increased. It was. In addition, the effect of enhancing the expression of the UCP1 gene by the addition of adrenaline is 3.1 times that of the control by the addition of adrenaline, compared with the presence or absence of adrenaline, whereas rosiglitazone is 6.2 times the present invention product.
  • the expression level was greatly increased by 6.7 times, and the characteristics observed only in brownish adipocytes were observed. That is, by adding the composition of the present invention, it is clear that 3T3-L1 preadipocytes are induced to differentiate into brown-like adipocytes and maintain the traits of brown-like adipocytes after maturation, It was shown that the composition of the present invention is highly likely to have an action of inducing differentiation of white adipocytes into brown-like adipocytes.
  • Example II-4 Verification of expression index gene for induction of brown-like adipocyte differentiation on normal human subcutaneous fat of a derivative-containing composition
  • rosiglitazone which is a PPAR ⁇ agonist
  • a derivative-containing composition Two types of compositions, rosiglitazone, which is a PPAR ⁇ agonist, and a derivative-containing composition were used as samples. Each sample was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at an appropriate concentration and used for the test.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • Subcutaneous fat-derived normal human preadipocytes (manufactured by Lonza Japan) were cultured in the same manner as in Example I-3, except that the sample was changed.
  • RNA was extracted and purified in the same manner as in Example II-2, and reverse transcription reaction and real-time RT-PCR were performed.
  • Primers include CITED1 forward primer (primer ID: HA204404-F), CITED1 reverse primer (primer ID: HA204404-R), PGC-1 ⁇ forward primer (primer ID: HA172103-F), PGC-1 ⁇ reverse primer (primer ID) : HA172103-R), COX7A1 forward primer (primer ID: HA133646-F) and COX7A1 reverse primer (primer ID: HA133646-R), UCP1 forward primer (primer ID: HA158451-F) and UCP1 reverse primer (primer ID: HA158451) -R) was used.
  • the internal standard of the intracellular gene is ⁇ -actin, and as its primers, an ACTB forward primer (primer ID: HA067803-F) and an ACTB reverse primer (primer ID: HA067803-R) (all of the above 10 primers are Takara Bio). Used).
  • the expression level of the CITED1 gene which is a marker gene of brownish adipocytes, was significantly increased when the derivative-containing composition was added, and further, the mitochondrial marker gene COX7A1 It was revealed that the expression level of was significantly increased. It was also found that the expression levels of the UCP1 gene and PGC-1 ⁇ gene were significantly increased. That is, it shows that human subcutaneous fat-derived normal preadipocytes that originally differentiate into white adipocytes differentiated into brownish adipocytes in the presence of the derivative-containing composition. That is, it was shown that the derivative-containing composition of the present invention has a very strong white adipocyte differentiation-inducing action into brown-like adipocytes.
  • the addition of the derivative-containing composition significantly increased the amount of mitochondrion in the cells, and the white adipocytes changed to brownish adipocytes.
  • the derivative-containing composition was shown to have an excellent differentiation-inducing effect on brownish adipocytes. It can also be seen that the derivative-containing composition is superior in that it can be prepared at low cost from food ingredients in one step, compared to rosiglitazone, which is a synthetic agonist that is expensive to manufacture.
  • Example II-5 Pharmaceutical containing the composition of the present invention
  • 1 g of the derivative-containing composition obtained in the same manner as in Example II-1 was dissolved in ethanol, and the resulting solution was adsorbed on microcrystalline cellulose and dried under reduced pressure.
  • 10 parts of the adsorbent of the present invention 23 parts of corn starch, 12 parts of lactose, 8 parts of carboxymethyl cellulose, 32 parts of microcrystalline cellulose, 4 parts of polyvinylpyrrolidone, 3 parts of magnesium stearate, 8 parts of talc, and tableting, A compressed tablet containing the product of the present invention was obtained.
  • Example II-6 Quasi-drug containing the composition of the present invention
  • 10 mL of an ethanol solution obtained by dissolving 1.2 g of the derivative-containing composition obtained in the same manner as in Example II-1 in ethanol, 20 g of taurine, 0.12 g of vitamin B1 nitrate, 0.6 g of sodium benzoate, 4 g of acid, 60 g of sugar and 10 g of polyvinylpyrrolidone were dissolved in purified water, and the total amount was made up to 1000 mL.
  • the pH was adjusted to 3.2 using dilute hydrochloric acid.
  • 50 ml of 1000 ml of the obtained solution was filled in a glass bottle and sterilized at 80 ° C. for 30 minutes to obtain a drink as a quasi drug.
  • Example III-1 Preparation and purification of a composition containing a resveratrol polymerization compound
  • Preparation and purification of a composition containing a resveratrol polymerization compound were performed according to the following procedure.
  • To 40 g of trans-resveratrol (manufactured by TECNO SCIENCE), 400 mL of 10% aqueous sodium carbonate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is added to obtain a resveratrol-containing aqueous solution (pH 9.9). It was.
  • This resveratrol-containing solution was heated at 128 ° C. for 120 minutes in a pressure cooker (zero vitality pan, manufactured by Asahi Light Metal Industry Co., Ltd.) to prepare a resveratrol polymer compound-containing solution (Comparative Product 1).
  • prototypes 1 to 4 were prepared from the comparative product 1 as follows.
  • the total amount of Comparative Product 1 was supplied to 4.0 kg of synthetic adsorbent Diaion (registered trademark) HP-20 (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation). After washing with 24 L of distilled water, elution was performed with 16 L of 100% ethanol. The solvent was removed by drying under reduced pressure to obtain 22 g of a resveratrol polymer compound-containing composition (hereinafter referred to as a derivative-containing composition) (Prototype 1).
  • a derivative-containing composition resveratrol polymer compound-containing composition
  • the obtained comparative product 1 and prototypes 1 to 4 were dissolved in methanol at a concentration of 2 mg / mL, and 10 ⁇ L thereof was analyzed by HPLC in the same manner as in Example II-1.
  • a chart of prototype 4 is shown in Figure III-1 as a representative example.
  • the obtained reaction solution was analyzed by HPLC, a plurality of peaks different from the peak of resveratrol could be detected, and thus a composition containing a plurality of produced compounds could be obtained.
  • the compounds contained in the peaks shown in (1), (2) and (3) of Fig. III-1 were isolated by preparative HPLC and dried by a conventional method.
  • the compound contained in the peaks shown in (1) and (2) was a light brown powdery substance
  • the compound contained in the peak shown in formula (3) was a brown powdery substance.
  • the compound contained in the peak is a compound represented by the above formula (3) (hereinafter referred to as UHA4002), and the compound contained in the peak of (2) is a compound represented by the above formula (2) (hereinafter referred to as UHA4003).
  • the compound contained in the peak of (3) was found to be a compound represented by the above formula (4) (hereinafter referred to as UHA4022).
  • Test Example III-1 Measurement of phenol concentration in a composition containing a resveratrol polymerization compound
  • concentration of phenol contained in Comparative Product 1 prepared in Example III-1 and Prototypes 1 to 4 was measured using a gas chromatograph mass spectrometer.
  • Comparative product 1 and prototypes 1 to 4 were each dissolved in methanol at a concentration of 20 mg / mL, 1 mL of which was compared and analyzed for the concentration of phenol contained in a gas chromatograph mass spectrometer (JMS-Q1000MC, manufactured by JEOL Ltd.) did.
  • JMS-Q1000MC gas chromatograph mass spectrometer
  • Gas chromatograph mass spectrometry was performed under the following conditions.
  • Equipment used is Rtx (registered trademark) -200MS (0.25 mmid ⁇ 30 m, film thickness 0.25 ⁇ m, manufactured by RESTEK), SPME fiber (50/30 ⁇ m, DVB / CAR / PDMS, manufactured by Spellco), GC-MS Used was JMS-Q1000GC K9 (manufactured by JEOL Ltd.).
  • the SPME fiber was subjected to preheating (65 ° C., 1 minute), adsorption time (30 minutes), desorption time (10 minutes), and inlet temperature (250 ° C.).
  • the GC conditions were as follows: temperature conditions (50 ° C. for 10 minutes ⁇ 320 ° C.
  • a calibration curve was prepared using phenol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), the phenol concentration of each prototype and comparative product was measured, and the phenol content per solid content of 20.0 mg / mL was measured. The measurement results are shown in Table 2.
  • each prototype has a phenol concentration of 1/20 or less compared to the comparative product 1 obtained immediately after production with a pressure cooker, and in particular, the prototype 4 in which two processes are performed is 1/500 or less. Diminished. Accordingly, it has been clarified that the products of the present invention such as prototypes 1 to 4 are products in which phenol contained in the invention products that had been overlooked in the conventional products is reduced to a very small amount.
  • Example III-2 Verification of expression index gene for induction of brown-like adipocyte differentiation in white adipocytes of a derivative-containing composition
  • evaluation was performed using 3T3-L1 cells (mouse-derived preadipocytes) in the same manner as in Example II-2.
  • differentiation induction of white adipocytes into brown-like adipocytes was confirmed using the expression levels of each gene of FGF-21, PGC-1 ⁇ , PGC-1 ⁇ , and CITED1 as an index.
  • rosiglitazone which is a synthetic agonist of PPAR ⁇
  • prototype 4 obtained in Example III-1
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • Adipocytes used in the test were prepared according to a conventional method.
  • the test was performed in the same manner as in Example II-2 except that the sample was changed.
  • RNA was extracted and purified from the cells using an RNA extraction kit in the same manner as in Example II-2, and the obtained RNA was subjected to a two-step real-time RT-PCR reverse transcription reagent.
  • the reverse transcription reaction was performed according to the instruction manual.
  • a diluted solution obtained by diluting the obtained reverse transcription reaction solution 5-fold with a diluent for real-time RT-PCR was used for real-time RT-PCR analysis.
  • Real-time RT-PCR analysis was performed according to a conventional method. For the analysis, “ECO Realtime RT-PCR system” (trade name, manufactured by Illumina) was used.
  • Primers include FGF-21 forward primer (primer ID: MA-126886-F), FGF-21 reverse primer (primer ID: MA-126886-R), PGC-1 ⁇ forward primer (primer ID: MA-114509-F) ), PGC-1 ⁇ reverse primer (primer ID: MA-114509-R), PGC-1 ⁇ forward primer (primer ID: MA125505-F), PGC-1 ⁇ reverse primer (primer ID: MA125505-R), CITED1 forward primer ( Primer ID: MA104748-F) and CITED1 reverse primer (Primer ID: MA104748-R) were used.
  • the internal standard of the intracellular gene is ⁇ -actin, and as its primers, an ACTB forward primer (primer ID: MA050368-F) and an ACTB reverse primer (primer ID: MA050368-R) (all of the above 8 types of primers are Takara Bio). Used).
  • the expression level of the FGF-21 gene which is one of the inducers of brownish adipocytes (upper left), and the expression of the PGC-1 ⁇ gene accompanying the expression of the FGF-21 gene
  • the amount (upper right figure) was found to increase significantly when the derivative-containing composition was added.
  • the expression level of Cited1 which is a marker gene of brownish adipocytes (lower right figure), and the expression level of PGC-1 ⁇ (Lower left figure) was found to increase significantly.
  • Rosiglitazone is a synthetic agonist and its effect is stronger compared to the derivative-containing composition.
  • the derivative-containing composition is a composition having a merit obtained by a much simpler method, and its precursor compound resveratrol is widely distributed in nature and is an extremely safe compound.
  • hydroxystilbenes such as resveratrol are widely distributed in nature including polymers, they are rich in food experience. Therefore, it was shown that the product of the present invention is a useful composition that is highly safe and has a high possibility of inducing differentiation of white adipocytes into brown-like adipocytes, which is extremely strong like rosiglitazone.
  • the addition of the derivative-containing composition significantly increased the amount of mitochondria in the cells and markedly induced differentiation of white adipocytes into brown-like adipocytes. From these results, it was shown that the derivative-containing composition has an excellent effect of inducing differentiation into brownish adipocytes. It can also be seen that the derivative-containing composition is superior in that it can be prepared at low cost from food ingredients in one step, compared to rosiglitazone, which is a synthetic agonist that is expensive to manufacture.
  • Example III-3 Pharmaceutical containing the composition of the present invention
  • 1 g of the derivative-containing composition obtained in the same manner as in Example III-1 was dissolved in ethanol, and the resulting solution was adsorbed on microcrystalline cellulose and dried under reduced pressure.
  • 10 parts of the adsorbent of the present invention 23 parts of corn starch, 12 parts of lactose, 8 parts of carboxymethyl cellulose, 32 parts of microcrystalline cellulose, 4 parts of polyvinylpyrrolidone, 3 parts of magnesium stearate, 8 parts of talc, and tableting, A compressed tablet containing the product of the present invention was obtained.
  • Example III-4 Quasi-drug containing the composition of the present invention
  • 10 mL of an ethanol solution obtained by dissolving 1.2 g of the derivative-containing composition obtained in the same manner as in Example III-1, in ethanol, 20 g of taurine, 0.12 g of vitamin B1 nitrate, 0.6 g of sodium benzoate, 4 g of acid, 60 g of sugar and 10 g of polyvinylpyrrolidone were dissolved in purified water, and the total amount was made up to 1000 mL.
  • the pH was adjusted to 3.2 using dilute hydrochloric acid.
  • 50 ml of 1000 ml of the obtained solution was filled in a glass bottle and sterilized at 80 ° C. for 30 minutes to obtain a drink as a quasi drug.
  • Example III-5 Food containing the composition of the present invention
  • 1 g of the derivative-containing composition obtained in the same manner as in Example III-1 was dissolved in 100 mL of ethanol in advance, 500 g of sugar and 400 g of starch syrup were mixed and dissolved in this, 100 g of fresh cream, 20 g of butter, 70 g of condensed milk, emulsifier 1
  • the pressure was reduced by ⁇ 550 mmHg in a vacuum kettle, and the mixture was concentrated at 115 ° C. to obtain a milk hard candy having a moisture value of 3.0% by weight.
  • This milk hard candy is not only easy to eat as a confectionery, but also can be used as a functional food that reduces differentiation of preadipocytes into mature adipocytes and is expected to prevent obesity.

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Abstract

　ヒドロキシスチルベン類の環化反応生成物であって、式（１）：（但し、式（１）中、Ｒ1～Ｒ8は、水素原子、ヒドロキシ基、炭素数１～１０の飽和又は不飽和の、直鎖状又は分岐鎖状のアルコキシ基、あるいは炭素数１～１０の飽和又は不飽和の、直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基であり、Ｒ1～Ｒ8はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。） で表される化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含有することを特徴とする、白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導剤に関する。

Description

白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導剤
　本発明は、非常に簡便な方法かつ食品でも応用可能な合成方法によって得られるヒドロキシスチルベン類の環化反応生成物を含有する白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導剤、及び前記白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導剤を含む食品、医薬品又は医薬部外品に関する。
　化合物の誘導体化技術は、化合物の高機能化を目的に医薬品の開発等で広く使われている。たとえば、抗インフルエンザ薬として広く用いられているタミフル（登録商標）は、生薬である八角に含まれるシキミ酸を誘導体化して得られている。他にも、インスリン抵抗性改善薬であるピオグリタゾンはクロフィブラートをリード化合物とする誘導体合成の研究により得られたものである。
　しかし、医薬品等で使用される誘導体化技術は、その合成方法の煩雑さや生成コストの高さから医薬品としての用途には耐えるが、たとえば機能性の高い食品原材料、もしくは添加物としての用途としては、コスト、安全性の法規面からそれらの用途には耐えないものが多い。
　一方、高齢化社会が到来した先進国においてその医療費の増大は社会問題化しており、病気を事前に予防する予防医学の発達が求められている。医薬品や特別な医療行為による対処療法的なこれまでの医学とは異なり、予防医学では日常生活から健康によいものを摂取することで病気を未然に防ぐことを目的としている。そのような現状から予防医学と食品は深い関わりがある。
　哺乳動物の脂肪組織を構成する脂肪細胞には白色脂肪細胞と褐色脂肪細胞の二種類が存在する。白色脂肪細胞は主にトリグリセリドの形で摂取したエネルギーを蓄積する役割を持ち、一方、褐色脂肪細胞は蓄積されたエネルギーを熱へと変換する役割がある。褐色脂肪細胞は筋芽細胞を起源に発生し、細胞内部に多数のミトコンドリアを含むことで褐色に色づいている脂肪細胞であるが、ミトコンドリア中に発現する脱共役タンパク質（Ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１；ＵＣＰ１）の働きにより熱産生を行い、蓄積されたエネルギーを熱へと変換する役割を持っている脂肪細胞である（非特許文献１）。
　褐色脂肪細胞により構成される褐色脂肪組織は、幼児期に多数見受けられ、成長するに従いその組織量は減少する。従来、褐色脂肪細胞は白色脂肪細胞とは由来する幹細胞が異なることから白色脂肪細胞より褐色脂肪細胞は発現しないと考えられてきた。しかし、近年、白色脂肪組織中に褐色脂肪細胞と同様の応答を示す「褐色様脂肪細胞」の存在が明らかとなってきた（非特許文献２）。褐色様脂肪細胞は白色脂肪細胞由来ながらミトコンドリアの存在量が白色脂肪細胞と比較して格段に多く、蓄積された脂質エネルギーを効率よく熱エネルギーへと変換できる脂肪細胞である。この報告は、ヒト成人にも褐色様脂肪組織を増やすことができる可能性があることを明らかにし、白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導が肥満症や糖尿病の新たな、そして根本的な治療方法として注目されている。
　しかしながら、白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化を誘導することは難しく、確認されている方法は、長期間の寒冷刺激や、アドレナリンによる刺激、ペルオキソーム増殖剤応答性受容体（ＰＰＡＲγ）アゴニストの添加（非特許文献３）等のみであり、加えて、すべて、皮下脂肪細胞のみに分化誘導効果が限定される。また、特許文献１にてヒト内臓脂肪細胞に対しＵＣＰ１遺伝子の発現増幅効果のある化合物が報告されているが、白色脂肪細胞の褐色化は見られず、且つ、作用濃度が非常に高く、生体内での有効濃度の達成が難しい等、白色脂肪細胞の褐色化は、現状、実現には至っていない。
　加えて、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦｓ：Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒｓ）は、アミノ酸配列の相同性からヒトにおいて現在２２種類存在することが明らかにされている（非特許文献４）。ＦＧＦ－２１は、脂肪の分解促進と蓄積の抑制、高コレステロール血症、糖尿病（高血糖、インスリン抵抗性）及び肥満の改善に関わる可能性があることが報告されている（非特許文献５）。例えば、特許文献１にはＦＧＦ－２１の産生を促し、内臓脂肪量の減少効果のある化合物が記載されており、特許文献２にはＦＧＦ－２１とグルカゴン様ペプチド－１受容体アゴニスト、抗糖尿病薬、ジペプチジルペプチダーゼ－４阻害剤からなる２型糖尿病治療薬が有用であることが記載されている。あるいは、特許文献３にはＦＧＦ－２１誘導体を用いＦＧＦ－２１の半減期を延長することが代謝疾患の治療に有用であることが記載されている。このような中で、近年、寒冷刺激が血中のＦＧＦ－２１濃度の上昇を促し、白色脂肪の褐色化を促す報告があり、ＦＧＦ－２１は白色脂肪の褐色化誘導因子の一つとして注目されている（非特許文献６）。しかしながら、これまでのところ、ＦＧＦ－２１をターゲットとした報告は代謝障害の改善を目的とするもののみであり、白色脂肪細胞の褐色化への手段として具体的な提案はなされていない。
　一方、いわゆる「フレンチパラドックス」と言われる赤ワインの有用な生理効果は、レスベラトロールの抗酸化能を始めとして各種の生理活性機能が一因であるとされている。レスベラトロールはブドウ果皮やピーナッツ赤皮に多く含まれるヒドロキシスチルベン類の一種で、サーチュインを介したカロリー制限効果をはじめ、抗真菌、抗細菌、抗炎症等さまざまな活性を有する植物由来化合物として知られている（非特許文献７）。さらに、レスベラトロールには、サーチュインの発現促進を介した脂肪細胞への分化及び脂肪の蓄積を抑える働きが報告されている（非特許文献８）。しかし、アカゲザルに対する実験の結果、カロリー制限という行為自体が延命に有用な効果があるか疑問がもたれている中（非特許文献９)、レスベラトロールが持ち合わせるサーチュインを介したカロリー制限効果もヒトに対する効果は定かではない。さらに、レスベラトロールには、白色脂肪細胞に特異的に発現する脱共役タンパク質ＵＣＰ２の遺伝子発現亢進効果について報告があるものの（特許文献４）、これまで、レスベラトロールについて、白色脂肪細胞から褐色様脂肪細胞への分化効果について言及されたものは一切無い。
　このように、今日に至るまで、食欲の抑制や脂肪吸収抑制ではない、脂肪細胞そのものの性質を変化させ、代謝を変化させることでメタボリックシンドロームを予防・治療する根本的な治療・予防剤、及びそれらを含む機能性食品の開発が望まれてきたが、これまでのところすべての白色脂肪細胞に対して十分な効果が認められるような物質は見つかっておらず、早期の開発が望まれていた。
　現在、発酵、抽出、有機合成等様々な方法を用いて数多くの化合物が取得され、食料品や医薬品等の幅広い分野に利用されているが、有用性と実用性を両立させるものは数が限られている。さらに未だ報告されていない新規な化合物では合成原料のコストや単離技術の難しさから有用性と実用性を両立させることはより困難とされている。
　これに対して、本発明者らは、単離も容易であり、かつ簡便な方法で、さらに食品由来の成分を用いて新規な化合物を合成する画期的な方法を見出しているが（特許文献５）、これらの化合物の用途範囲にはさらに画期的な用途が数多くあるものと推察される。
特開２０１１－２４１１９５号公報 特公表２０１３－５１８０３５号公報 特公表２０１２－５１５７４７号公報 特開２０１０－２４２０８号公報 国際公開第２０１３／０６１４５５号
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｓｃｉ． ２０１１ Ｏｃｔ ２８；１：３５ Ｃｅｌｌ．２０１２　Ｊｕｌ　２０；１５０（２）：３６６－３７６ Ｎａｔ　Ｍｅｄ． ２０１３　Ｏｃｔ；１９（１０）：１２５２－６３ Ｇｅｎｏｍｅ　Ｂｉｏｌ．　２００１；２（３）：ＲＥＶＩＥＷＳ３００５ Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ． ２０１０ Ｊａｎｕａｒｙ； ９１(１)： ２５４Ｓ？２５７Ｓ Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ２０１２ Ｆｅｂ　１；２６(３)：２７１－８１ 坪田　一男監修、「レスベラトロールの基礎と応用」、シーエムシー出版、２０１２年 Ｎａｔｕｒｅ．２００４ Ｊｕｎｅ １７；４２９(６９９３)：７７１ Ｎａｔｕｒｅ．２０１２ Ｓｅｐ　１３；４８９（７４１５）：３１８
　本発明者らは、前記の状況を鑑みて、白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導作用を示す化合物の探索と、その製造方法を確立すべく鋭意検討した結果、ヒドロキシスチルベン類をアルカリ条件下で加熱処理するという簡便且つ安全な方法により、意外にも、白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導作用を示す新たな化合物及び該化合物を含む組成物を製造することに成功し、本発明を完成するに至った。
　したがって、本発明の課題は、これまでレスベラトロール等のヒドロキシスチルベン類には見られなかった、優れた白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導作用を有する新規化合物を含有する白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導剤を提供することにある。
　また、本発明の別の課題は、優れた白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導作用を有し、且つ安全安価に作製することが可能な白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞の分化誘導剤組成物及びその製造方法を提供することにある。
　また、本発明の別の課題は、前記白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導剤又は白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞の分化誘導剤組成物を含有する食品、医薬品及び医薬部外品を提供することにある。
　即ち、本発明の要旨は、
〔１〕ヒドロキシスチルベン類の環化反応生成物であって、式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
（但し、式（１）中、Ｒ1～Ｒ8は、水素原子、ヒドロキシ基、炭素数１～１０の飽和又は不飽和の、直鎖状又は分岐鎖状のアルコキシ基、あるいは炭素数１～１０の飽和又は不飽和の、直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基であり、Ｒ1～Ｒ8はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）
で表される化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含有することを特徴とする、白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導剤、
〔２〕前記ヒドロキシスチルベン類がレスベラトロールである前記〔１〕に記載の白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導剤、
〔３〕前記式（１）においてＲ1～Ｒ8が全て水素原子である前記〔１〕又は〔２〕に記載の白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導剤、
〔４〕レスベラトロールをアルカリ性条件下で加熱して得られる組成物であって、
　式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
、式（３）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
及び式（４）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
で示される３種類のレスベラトロール重合化合物を含有する白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導剤組成物、
〔５〕さらに固形分２０ｍｇ／ｍＬあたりのフェノール含有量が１００μｇ／ｍＬ以下である前記〔４〕に記載の白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導剤組成物、
〔６〕前記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導剤を含有する食品、医薬品又は医薬部外品、
〔７〕前記〔４〕又は〔５〕に記載の白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導剤組成物を含有する食品、医薬品又は医薬部外品、
〔８〕（ａ）～（ｃ）の工程：
（ａ）レスベラトロールをアルカリ性条件下で加熱して得られる溶液を固体吸着剤と接触させ、吸着成分を回収する工程、
（ｂ）レスベラトロールをアルカリ性条件下で加熱して得られる溶液をｐＨ７以下に調整、析出させ、析出物を回収する工程、
（ｃ）レスベラトロールをアルカリ性条件下で加熱して得られる溶液、又は上記（ａ）の工程で得られる組成物、又は上記（ｂ）の工程で得られる組成物を含有する水溶液を加熱する工程、
からなる群より選ばれる、一つ以上の工程により、含有するフェノールを除去する工程を有することを特徴とする、前記〔４〕又は〔５〕に記載の白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導剤組成物の製造方法、
に関する。
　本発明で用いる前記式（１）で表される化合物又はその薬学的に許容可能な塩は、前駆物質であるヒドロキシスチルベン類よりも顕著に優れた白色脂肪細胞から褐色様脂肪細胞への分化誘導作用を有しており、新規なメタボリックシンドローム治療及び予防物質として有用である。
　本発明の白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導剤組成物（以下、本発明の組成物ともいう）は、レスベラトロールをアルカリ性条件下で加熱することで安全安価に製造することができ、しかも、前駆物質であるレスベラトロールが持ち合わせない新しい作用である顕著に優れた白色脂肪細胞から褐色様脂肪細胞への分化誘導作用を有しているため、新規なメタボリックシンドローム治療及び予防に有用である。
　本発明の組成物は、前記式（１）で表される化合物又はその薬学的に許容可能な塩の単離精製工程を行わなくても優れた白色脂肪細胞から褐色様脂肪細胞への分化誘導作用を有しているため、より生産性がよく、より安価に白色脂肪細胞から褐色様脂肪細胞への分化誘導剤を提供することが可能である。
　また、本発明の組成物は、レスベラトロールをアルカリ性条件下で加熱する際に発生する傾向があるフェノールを効果的に低減することでより安全なレスベラトロール加熱処理組成物を提供することが可能である。
　また、本発明の白色脂肪細胞から褐色様脂肪細胞への分化誘導剤又は組成物を食品、医薬品又は医薬部外品に配合することで、新規なメタボリックシンドローム予防又は改善用の食品、医薬品又は医薬部外品を提供することができる。
図I－１は、実施例I－２で実施した分化誘導後の脂肪細胞中のＵＣＰ１遺伝子、褐色様脂肪細胞マーカー遺伝子である細胞死誘導ＤＦＦＡ様エフェクターａ（Ｃｉｄｅａ）、ミトコンドリアマーカー遺伝子であるシトクロムｃオキシダーゼポリペプチド７Ａ１（Ｃｏｘ７ａ１）の各遺伝子の相対発現量を示すグラフである。 図I－２は、実施例I－３で実施した正常皮下脂肪分化誘導後の脂肪細胞中のＵＣＰ１遺伝子、ミトコンドリアマーカー遺伝子であるシトクロムｃオキシダーゼポリペプチド７Ａ１（ＣＯＸ７ａ１）、褐色様脂肪細胞マーカー遺伝子であるＣＢＰ／ｐ３００－インターアクティングトランスアクチベーター（ＣＩＴＥＤ１）の各遺伝子の相対発現量を示すグラフである。 図II－１は、実施例II－１で実施したレスベラトロールの反応溶液のクロマトグラムを示す。 図II－２は、実施例II－２で実施した分化誘導直後の脂肪細胞中のＦＧＦ－２１、転写コアクチベーターであるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ補助活性化因子１α（ＰＧＣ－１α）、ミトコンドリアマーカー遺伝子であるシトクロムｃオキシダーゼポリペプチド７Ａ１（Ｃｏｘ７ａ１）の各遺伝子の相対発現量を示すグラフである。 図II－３は、実施例II－３で実施した成熟化した脂肪細胞中のＦＧＦ－２１、ＰＧＣ－１α、Ｃｉｄｅａ、転写コアクチベーターであるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ補助活性化因子１β（ＰＧＣ－１β）、ＵＣＰ１の各遺伝子の相対発現量を示すグラフである。 図II－４は、実施例II－４で実施した正常皮下脂肪分化誘導後の脂肪細胞中のＰＧＣ－１β、ＵＣＰ１、ＣＯＸ７ａ１、ＣＩＴＥＤ１の各遺伝子の相対発現量を示すグラフである。 図III－１は、実施例III－１で実施したレスベラトロールの反応溶液のクロマトグラムを示す。 図III－２は、実施例III－２で実施した分化誘導直後の脂肪細胞中のＦＧＦ－２１、ＰＧＣ－１α、ＰＧＣ－１β、ＣＩＴＥＤ１の各遺伝子の相対発現量を示すグラフである。
　以下、本発明について詳細に説明する。
　本発明で用いる、ヒドロキシスチルベン類の環化反応生成物は、
式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
（但し、式（１）中、Ｒ1～Ｒ8は、水素原子、ヒドロキシ基、炭素数１～１０の飽和又は不飽和の、直鎖状又は分岐鎖状のアルコキシ基、あるいは炭素数１～１０の飽和又は不飽和の、直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基であり、Ｒ1～Ｒ8はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）
で表される化合物又はその薬学的に許容可能な塩である。
　前記式（１）において、Ｒ1～Ｒ8で表される炭素数１～１０の飽和又は不飽和の、直鎖状又は分岐鎖状のアルコキシ基は、特に限定されるものではないが、好ましくは炭素数１～４の直鎖状又は分岐鎖状のアルコキシ基である。その具体例としては、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ－ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓ－ブトキシ基、ｔ－ブトキシ基等が挙げられる。
　また、Ｒ1～Ｒ8で表される炭素数１～１０の飽和又は不飽和の、直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基は、特に限定されるものではないが、好ましくは炭素数１～５の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基であり、その具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓ－ブチル基、ｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、イソペンチル基、ｔ－ペンチル基、ネオペンチル基等が挙げられる。
　中でも、前記Ｒ1～Ｒ8のうち１つ以上が水素原子であることが好ましく、Ｒ1～Ｒ8が全て水素原子であることがより好ましい。
　前記式（１）で表される化合物において、炭素－炭素２重結合は、トランス又はシスであってよい。また、前記式（１）で表される化合物として、シス体とトランス体との混合物であってもよい。
　前記式（１）で表される化合物の薬学的に許容可能な塩としては、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩、バリウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩；アルミニウムヒドロキシド塩等の金属ヒドロキシド塩；アルキルアミン塩、ジアルキルアミン塩、トリアルキルアミン塩、アルキレンジアミン塩、シクロアルキルアミン塩、アリールアミン塩、アラルキルアミン塩、複素環式アミン塩等のアミン塩；α－アミノ酸塩、ω－アミノ酸塩等のアミノ酸塩；ペプチド塩又はそれらから誘導される第１級、第２級、第３級若しくは第４級アミン塩等が挙げられる。これらの薬学的に許容可能な塩は、単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
　前記式（１）で表される化合物又はその薬学的に許容可能な塩（以下、前記式（１）で表される化合物ともいう。）は、白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化を誘導する作用を有する。この脂肪細胞分化誘導作用は、具体的には後述の実施例I－２、I－３に記載の方法によって測定することができる。
　前記式（１）で表される化合物は、ヒドロキシスチルベン類を原料化合物としてアルカリ性条件下で加熱処理することで得られる。
　ヒドロキシスチルベン類とは、式（５）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
（但し、式（５）中、Ｒ1～Ｒ4は、水素原子、ヒドロキシ基、炭素数１～１０の飽和又は不飽和の、直鎖状又は分岐鎖状のアルコキシ基、あるいは炭素数１～１０の飽和又は不飽和の、直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基であり、Ｒ1～Ｒ4はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）
で示されるヒドロキシスチルベン誘導体及びその薬学的に許容可能な塩である。
　前記式（５）において、Ｒ1～Ｒ4で表される炭素数１～１０の飽和又は不飽和の、直鎖状又は分岐鎖状のアルコキシ基は、特に限定されるものではないが、好ましくは炭素数１～４の直鎖状又は分岐鎖状のアルコキシ基である。その具体例としては、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ－ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓ－ブトキシ基、ｔ－ブトキシ基等が挙げられる。
　また、Ｒ1～Ｒ4で表される炭素数１～１０の飽和又は不飽和の、直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基は、特に限定されるものではないが、好ましくは炭素数１～５の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基であり、その具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓ－ブチル基、ｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、イソペンチル基、ｔ－ペンチル基、ネオペンチル基等が挙げられる。中でも、前記Ｒ1～Ｒ4のうち１つ以上が水素原子であることが好ましく、Ｒ1～Ｒ4が全て水素原子であるレスベラトロールがより好ましい。
　前記式（５）で表される化合物の薬学的に許容可能な塩としては、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩、バリウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩；アルミニウムヒドロキシド塩等の金属ヒドロキシド塩；アルキルアミン塩、ジアルキルアミン塩、トリアルキルアミン塩、アルキレンジアミン塩、シクロアルキルアミン塩、アリールアミン塩、アラルキルアミン塩、複素環式アミン塩等のアミン塩；α－アミノ酸塩、ω－アミノ酸塩等のアミノ酸塩；ペプチド塩又はそれらから誘導される第１級、第２級、第３級若しくは第４級アミン塩等が挙げられる。これらの薬学的に許容可能な塩は、単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
　前記原料化合物として使用されるヒドロキシスチルベン類は、天然由来のものであっても、化学合成された純度の高い化成品であってもよい。天然由来の原料化合物としては、完全に精製されたものである必要はなく、他の化合物を含む混合物も使用できる。
　ただし、前記式（１）で表される化合物の生成効率や回収率を高める観点からは、前記ヒドロキシスチルベン類としては、ヒドロキシスチルベン類換算で、合計５重量％以上含有されたものが原料として望ましい。このような原料としては、例えばブドウ果皮、ワイン、ワイン濃縮パウダー、メリンジョ、リンゴンベリー、ピーナッツ果皮、イタドリ等の原料からの抽出物や該抽出物の凍結乾燥品等を使用してもよい。さらに、これらの抽出物をカラム等で精製し、レスベラトロール等のヒドロキシスチルベン類の含有量を高めたものを使用することが好ましい。
　本発明では、ヒドロキシスチルベン類を適切な溶媒に懸濁、溶解させる。前記溶媒としては、水、水と有機溶媒の混合液や、有機溶媒のみに溶解させることも可能である。水と有機溶媒の配合比や、有機溶媒の種類については特に制限はなく、また、ヒドロキシスチルベン類が十分に分散していれば、完全に溶解していなくともよい。中でも、水のみや、水とメタノール、水とエタノール等の混合液を使用することができるが、より好ましくは水のみで行うことが、安全性やコスト面から好ましい。前記の加熱反応後に得られる組成物に最終的な精製を十分に適用せず、その組成物を食品、医薬品、医薬部外品等に使用する場合には、安全性や法規面から溶媒としてエタノールや水、含水エタノールを使用することが望ましい。
　前記のようにヒドロキシスチルベン類を溶媒に懸濁、溶解して得られる混合溶液（以下、ヒドロキシスチルベン類含有溶液ともいう）中のヒドロキシスチルベン類の濃度については、特に制限はないが、ヒドロキシスチルベン類の濃度が高いほど、溶媒使用量が少ない等のメリットもあるため、ヒドロキシスチルベン類の濃度は各々の溶媒に対しヒドロキシスチルベン類がそれぞれ飽和する濃度以上に調整することが好ましい。
　次に、前記ヒドロキシスチルベン類含有溶液のｐＨをアルカリ性となるように調整する。調整方法として、例えば、ヒドロキシスチルベン類含有溶液を調製した後にアルカリ化剤を添加しｐＨを調整してもよいし、前述のヒドロキシスチルベン類含有溶液の調製時に前もって溶媒のｐＨを調整しておいてもよい。ヒドロキシスチルベン類含有溶液の加熱反応開始時のｐＨは８．０以上であれば、効率的に後述の反応が進むので好ましく、ｐＨ１３．０を越えると反応と同時に、他の反応や目的化合物の分解も一方で生じるために最終的なヒドロキシスチルベン類重合化合物群の回収量が低下する。したがって、反応開始時のｐＨは８．０～１３．０が望ましい。
　前記アルカリ化剤としては、特に制限はないが、安全性、効率及びコスト面からは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム等が好ましい。反応時のｐＨ変化を極力抑える場合が生じた際には、緩衝溶液を用いてもよいが、必ずしも必要な手法ではない。
　次に、アルカリ性に調整されたヒドロキシスチルベン類含有溶液を加熱する。この加熱により、ヒドロキシスチルベン類どうしを環化反応させ、前記式（１）で表される化合物の生成を行う。本発明において環化反応とは、ヒドロキシスチルベン類どうしが重合反応することで６員環を形成する反応をいう。
　また、本発明では、ヒドロキシスチルベン類としてレスベラトロールどうしを環化反応させることで、式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
で表される化合物に加えて、式（３）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
及び式（４）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
で表されるレスベラトロール重合化合物が生成することも確認している。
　前記式（３）又は式（４）で表されるレスベラトロール重合化合物においても、式（１）で表される化合物と同様に、炭素－炭素２重結合は、トランス又はシスであってよく、シス体とトランス体との混合物を含む。
　また、前記式（３）又は式（４）で表されるレスベラトロール重合化合物としては、その薬学的に許容可能な塩であってもよい。
　前記式（３）又は式（４）で表されるレスベラトロール重合化合物の薬学的に許容可能な塩としては、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩、バリウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩；アルミニウムヒドロキシド塩等の金属ヒドロキシド塩；アルキルアミン塩、ジアルキルアミン塩、トリアルキルアミン塩、アルキレンジアミン塩、シクロアルキルアミン塩、アリールアミン塩、アラルキルアミン塩、複素環式アミン塩等のアミン塩；α－アミノ酸塩、ω－アミノ酸塩等のアミノ酸塩；ペプチド塩又はそれらから誘導される第１級、第２級、第３級若しくは第４級アミン塩等が挙げられる。これらの薬理的に許容し得る塩は、単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
　以下、前記式（１）で表される化合物及び式（２）～（４）で表されるレスベラトロール重合化合物をまとめてヒドロキシスチルベン類環化反応生成物という。
　前記環化反応を効率的に進ませるために、ヒドロキシスチルベン類含有溶液の加熱温度は１１０℃以上に調整することが好ましい。また、使用する溶媒の沸点から考え、加圧加熱が望ましい。例えば、開放容器にヒドロキシスチルベン類含有溶液を入れ、溶媒の沸点を超える高温で前記容器を加熱する、密閉容器にヒドロキシスチルベン類含有溶液を入れ、前記容器を加熱する、レトルト装置やオートクレーブを用いて加圧加熱する、超臨界装置やプレッシャークッカー等の装置を用い加圧加熱する等、少なくとも部分的にヒドロキシスチルベン類含有溶液の温度が１１０℃以上に達するように加熱することが好ましい。前記ヒドロキシスチルベン類環化反応生成物の回収効率面から、ヒドロキシスチルベン類含有溶液の温度が均一に１２０℃～１８０℃になることが、さらに好ましい。加熱時間も加熱温度と同様に限られたものではなく、効率的に目的の反応が進行する時間条件とすればよい。特に、加熱時間は加熱温度との兼ね合いによるものであり、加熱温度に応じた加熱時間にすることが望ましい。例えば、１３０℃付近で加熱する場合は、５分～２７０分の加熱時間が望ましい。また、前記加熱時間を調整することで所望の化合物の生成量を調整することができる。例えば、式（１）で表される化合物を生成させる場合には、５分～６０分程度でもよい。また、前記式（２）～（４）で表されるレスベラトロール重合化合物を生成させる場合には、１０分～２７０分程度にしてもよい。
　また、加熱は、一度でもよいし、複数回に分けて繰り返し加熱してもよい。複数回に分けて加熱する場合、溶媒を新たに追加して行うことが好ましい。
　前記加熱による前記ヒドロキシスチルベン類環化反応生成物の生成反応の終了は、例えば、ＨＰＬＣによる成分分析により各化合物の生成量を確認して判断すればよい。
　また、安全な原料のみを用いた工程により前記ヒドロキシスチルベン類環化反応生成物を製造した場合には、前記ヒドロキシスチルベン類環化反応生成物を含む混合物の状態で後述のように食品、医薬品、医薬部外品等に使用することが可能である。例えば、天然由来のレスベラトロールを含水エタノール溶媒に溶解し、水酸化ナトリウムや炭酸水素ナトリウムでアルカリ性となるようにｐＨ調整を行い、加熱反応させた場合には、得られる液状の反応物を食品、医薬品、医薬部外品等の原料の一つとして使用することが可能である。
　また、風味の改良やさらなる高機能化を望む場合は、前記反応物を濃縮してヒドロキシスチルベン類環化反応生成物の濃度を高めることができる。また、必要に応じて前記反応物を精製し、式（１）で表される化合物の純品を得ることもできる。前記濃縮や精製は、公知の方法で実施可能である。例えば、クロロホルム、酢酸エチル、エタノール、メタノール等の溶媒抽出法や炭酸ガスによる超臨界抽出法等で抽出してヒドロキシスチルベン類環化反応生成物を濃縮できる。また、カラムクロマトグラフィーやＨＰＬＣを利用して濃縮や精製を施すことも可能である。また、前記濃縮や精製には、再結晶法や限外ろ過膜等の膜処理法や脱塩も使用できる。
　中でも、合成吸着剤を用いることで、前記ヒドロキシスチルベン類環化反応生成物を吸着させ、その後、溶出することで容易に濃縮、精製ができる。前記合成吸着剤としては、例えば、三菱化学株式会社製のダイヤイオン（登録商標）ＨＰシリーズ、セパビーズ（登録商標）ＳＰシリーズ等の芳香族系合成吸着剤、オルガノ株式会社製のアンバーライト（登録商標）ＸＡＤシリーズ等のスチレン系合成吸着剤等が挙げられる。
　また、前記濃縮物や精製物を、必要に応じて、減圧乾燥や凍結乾燥して溶媒を除去することで、粉末状の固形物を得ることができる。
　また、前記式（２）～（４）で表されるレスベラトロール重合化合物を含む組成物を得る場合、前記のようにレスベラトロールをアルカリ性条件下で加熱して得られる溶液（以下、反応液ともいう）にはフェノールが生成する傾向があることから、以下の（ａ）～（ｃ）の工程に記載の処理を前記反応液に施すことによりフェノールを除去することで得られる。
（ａ）反応液を固体吸着剤と接触させ、吸着成分を回収する工程
（ｂ）反応液をｐＨ７以下に調整、析出させ、析出物を回収する工程
（ｃ）反応液、又は上記（ａ）の工程で得られる組成物、又は上記（ｂ）の工程で得られる組成物を含有する水溶液を加熱する工程
　前記（ａ）～（ｃ）の工程は、反応液中のフェノールの濃度が下がればよく、一つの工程を選択してもよいし、２以上の工程を組み合わせてもよい。また、同じ工程を繰り返してもよい。
　前記（ａ）工程において使用される固体吸着剤としては、各種の合成吸着剤やシリカゲルが挙げられる。合成樹脂としては、例えば、三菱化学株式会社製のダイヤイオン（登録商標）ＨＰシリーズ、セパビーズ（登録商標）ＳＰシリーズ等の芳香族系合成吸着剤、オルガノ株式会社製のアンバーライト（登録商標）ＸＡＤシリーズ等のスチレン系合成吸着剤、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製のＳｅｐｈａｄｅｘシリーズや、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅシリーズ等のデキストランやアガロース等を母体としたソフトゲルが挙げられる。またシリカゲルとしては例えば、オクタデシルシリル基等で表面を修飾された化学結合型多孔性球状シリカゲル等が挙げられる。
　これらの固体吸着剤と前記反応液とを接触させる方法としては特に限定はなく、例えばカラムに固体吸着剤を充填し前記反応液を通液する方法（以下、カラム法ともいう）、あるいはタンクに反応液と固体吸着剤とを入れ攪拌して接触させる方法（以下、タンク法ともいう）等がある。しかしながら、固体吸着剤と反応液の接触時の取り扱いの容易さからカラム法が好ましい。前記反応液と吸着剤とを接触させる場合の温度は、特に限定はないが１０～３０℃が好ましい。反応液中に混在するフェノールは、カラム法を用いた場合、合成吸着剤を用いた場合は吸着せず通過する、また、ソフトゲルを用いた場合は前記式（２）～（４）で表されるレスベラトロール重合化合物とは異なる通過時間にて溶出される、シリカゲルを用いた場合は溶出時の溶液の組成を変更することで除去することが可能である。
　前記固体吸着剤を用いる精製により、反応液に混入したフェノールの除去が行えるだけではなく、前記精製物を脱塩精製し、式（２）～（４）で表されるレスベラトロール重合化合物の濃度を高めることも可能である。
　前記（ｂ）工程において反応液をｐＨ７以下に調整する方法としては、前記反応液への酸性物質の添加等が挙げられる。前記酸性物質としては特に限定は無いが、溶液を酸性にする物質であればよく、例えば、塩酸、クエン酸等が挙げられる。
　前記ｐＨ７以下に調整した反応液中で式（２）～（４）で表されるレスベラトロール重合化合物を析出させる方法としては、有機溶媒濃度が容量パーセントを１０％以下の水溶液にする方法が上げられる。有機溶媒濃度としては、好ましくは５％以下、より好ましくは水のみである。
　前記析出物を回収する方法としては、特に限定は無いが、不溶物を回収できればよく、濾過や遠心分離法等が挙げられる。
　前記（ｃ）工程において、反応液、又は上記（ａ）の工程で得られる組成物、又は上記（ｂ）の工程で得られる組成物を含有する水溶液を加熱する方法としては、蒸発した水蒸気が還流されない方法が望ましい。その方法としては特に限定は無いが、オイルバス、プレート式蒸発装置等を用いる方法が挙げられる。
　また、加熱条件としては、含有する水が蒸発する条件であればよく、水溶液の液温が５０～１３０℃に、好ましくは８０～１００℃に、１０分～１２時間で処理することが好ましい。
　前記（ａ）～（ｃ）工程のような処理によりレスベラトロール加熱処理組成物からフェノールを除去することが可能であるが、さらに水蒸気蒸留やスチームストリッピング等の方法、活性炭や合成吸着剤を用いることにより、フェノールを実質上完全に除去することで、より高品質のレスベラトロール加熱処理組成物を得ることもできる。
　また、必要に応じて、減圧乾燥や凍結乾燥して溶媒を除去することで、レスベラトロール加熱処理組成物を粉末状の固形物とすることもできる。
　以上のようにして得られるレスベラトロール加熱処理組成物は前記式（２）～（４）に表されるレスベラトロール重合化合物を含むだけでなく、フェノールの含有量を顕著に低減されたものである。具体的には、固形分２０ｍｇ／ｍＬの濃度に調整したレスベラトロール加熱処理組成物のメタノール溶液中のフェノール濃度が１００μｇ／ｍＬ以下であり、好ましくは５０μｇ／ｍＬ、より好ましくは５μｇ／ｍＬである。
　以上のようにして得られるヒドロキシスチルベン類環化反応生成物は、原料であるヒドロキシスチルベン類に比べて、より強力な白色脂肪細胞からの褐色様脂肪細胞への分化を誘導する作用を有しており、この褐色様脂肪細胞分化誘導作用により、メタボリックシンドロームの予防、改善を図ることができる。したがって、前記式（１）で表される化合物を有効成分として含有する本発明の白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導剤又は前記式（２）～（４）に表されるレスベラトロール重合体化合物を有効成分として含有する本発明の組成物は、新規のメタボリックシンドローム予防剤及び／又は治療剤として有用である。なお、前記白色脂肪細胞からの褐色様脂肪細胞への分化を誘導する作用は、原料であるヒドロキシスチルベン類には見られない作用である。
　また、本発明の白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導剤は、前記式（１）で表される化合物のみを含有していてもよいが、前記式（１）で表される化合物をエタノール又はエタノール含有水溶液等の溶媒に溶解した液剤としたり、公知の方法で乳剤、懸濁剤としたりしてもよい。また、本発明の組成物は、前記式（２）～（４）で表される化合物のみを含有していてもよいが、前記式（２）～（４）で表される化合物をエタノール又はエタノール含有水溶液等の溶媒に溶解した液剤としたり、公知の方法で乳剤、懸濁剤としたりしてもよい。
　本発明の白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導剤又は誘導剤組成物中の前記ヒドロキシスチルベン類環化反応生成物の含有量は、０．００１重量％以上であればよい。
　本発明の白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導剤又は本発明の組成物の投与量としては、患者の性別、年齢、生理的状態、病態（肥満の進み具合等）、製剤形態、投与経路、投与回数、薬剤における有効成分濃度等に応じて広い範囲から適宜選択できるが、例えば、成人１日当たり、ヒドロキシスチルベン類環化反応生成物の含有量が０．０１～５００ｍｇ／ｋｇ程度、好ましくは０．１～１００ｍｇ／ｋｇ程度であればよい。投与は、例えば、１日当たり１回又は数回に分けてもよい。
　本発明の白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導剤又は本発明の組成物は、医薬品として製剤化してもよい。この製剤形態としては特に限定されず、例えば、注射剤、坐剤、点眼剤、軟膏剤、エアゾール剤等の非経口剤、錠剤、被覆錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、トローチ剤、チュアブル錠、シロップ剤等の経口剤等が挙げられる。製剤化の際には、薬学的に許容される担体、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、希釈剤、安定化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤等が用いられる。
　担体や賦形剤としては、例えば、乳糖、ショ糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、マルトース、マンニトール、エリスリトール、キシリトール、マルチトール、イノシトール、デキストラン、ソルビトール、アルブミン、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、メチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム及びこれらの混合物等が挙げられる。
　滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール及びこれらの混合物等が挙げられる。
　結合剤としては、例えば、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、エチルセルロース、水、エタノール、リン酸カリウム及びこれらの混合物等が挙げられる。
　崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖及びこれらの混合物等が挙げられる。
　希釈剤としては、例えば、水、エチルアルコール、マクロゴール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類及びこれらの混合物等が挙げられる。
　安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸、チオグリコール酸、チオ乳酸及びこれらの混合物等が挙げられる。
　等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ホウ酸、ブドウ糖、グリセリン及びこれらの混合物等が挙げられる。
　ｐＨ調整剤及び緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、クエン酸、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム及びこれらの混合物等が挙げられる。
　さらに本発明の白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導剤又は本発明の組成物は、増量剤、可溶化剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、抗酸化剤、細菌抑制剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を含んでいてもよい。
　また、本発明の白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導剤又は本発明の組成物を食品の形態に製剤化してもよい。食品としては特に限定されず、例えば、飲料、アルコール飲料、ゼリー、菓子、機能性食品、健康食品、健康志向食品等が挙げられる。保存性、携帯性、摂取の容易さ等を考慮すると、菓子類が好ましく、菓子類の中でも、ハードキャンディ、ソフトキャンディ、グミキャンディ、タブレット、チューイングガム等が好ましい。
　本発明の白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導剤又は本発明の組成物を食品の形態に製剤化する場合、ヒドロキシスチルベン類環化反応生成物の該食品における含有量は、通常０．００１～２０重量％程度である。
　また、本発明の白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導剤又は本発明の組成物を医薬部外品の形態に製剤化してもよい。医薬部外品としては特に限定されないが、例えば、ドリンク剤等の栄養補助医薬部外品が好ましい。この場合、有効成分であるヒドロキシスチルベン類環化反応生成物の医薬部外品における含有量は、通常０．００１～３０重量％程度である。
　また、本発明の白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導剤又は本発明の組成物は、ヒトに対してだけでなく、非ヒト動物、例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー等の哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類等の治療剤又は飼料に配合してもよい。飼料としては、例えばヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ニワトリ等に用いる家畜用飼料、ウサギ、ラット、マウス等に用いる小動物用飼料、ウナギ、タイ、ハマチ、エビ等に用いる魚介類用飼料、イヌ、ネコ、小鳥、リス等に用いるペットフードが挙げられる。
　次に、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はかかる実施例にのみ限定されるものではない。ここでは、ヒドロキシスチルベン類としてトランス－レスベラトロールを用いているが他のヒドロキシスチルベン類でも同様の反応で化合物が得られる。
（実施例I－１：ヒドロキシスチルベン類誘導体ＵＨＡ４００３の生成及び単離・精製）
　特開２０１３－２８５６０号公報の実施例１に記載の方法に従って、ヒドロキシスチルベン類誘導体ＵＨＡ４００３の生成、単離、精製を行った。すなわち、トランス－レスベラトロール（東京化成工業（株）製）７００ｍｇをエタノール１４ｍＬに溶解し、２．５％炭酸水素ナトリウム（和光純薬工業（株）社製）水溶液を１４ｍＬ加えて、レスベラトロール含有溶液（ｐＨ９．９）を得た。このレスベラトロール含有溶液をオートクレーブ（三洋電機製、「ＳＡＮＹＯ　ＬＡＢＯ　ＡＵＴＯＣＬＡＶＥ」、以下同じ）にて１３０℃、２０分間加熱した。次いで、１回目のオートクレーブ処理にて得られた反応溶液に、エタノール１４ｍＬと５．０％炭酸水素ナトリウム水溶液を１４ｍＬ加え、再度、オートクレーブにて１３０℃、２０分間加熱した。得られた反応溶液をＨＰＬＣで分析したところ、いくつかのピークで示される化合物が確認できた。
　なお、前記ＨＰＬＣは以下条件にて行った。
カラム：逆相用カラム「Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ（登録商標）Ｃ－３０－ＵＧ－５」（４．６ｍｍｉ．ｄ．×２５０ｍｍ）
移動相：Ａ・・・Ｈ2Ｏ（０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）），　Ｂ・・・アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
注入：１０μＬ
検出：２５４ｎｍ
勾配（容量％）：８０％Ａ／２０％Ｂから２０％Ａ／８０％Ｂまで３０分間、２０％Ａ／８０％Ｂから１００％Ｂまで５分間、１００％Ｂで１０分間（全て直線）
　次いで、複数のピーク化合物を分取して、ＨＰＬＣ、高分解能ＦＡＢ－ＭＳ（Ｆａｓｔ Ａｔｏｍ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ－Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）、核磁気共鳴測定より純度、構造を確認したところ、上記ＨＰＬＣ分析条件において溶出時間１６分付近に見られるピークからヒドロキシスチルベン類誘導体（以下ＵＨＡ４００３）を得た。
　なお、前記ＵＨＡ４００３を核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定に供したところ、１Ｈ－ＮＭＲ、１３Ｃ－ＮＭＲ及び各種２次元ＮＭＲデータの解析から、前記ＵＨＡ４００３が前記式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
で表される構造を有することを確認した。
（実施例I－２：ＵＨＡ４００３の白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導作用指標遺伝子発現の検証）
　白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導作用を評価するために、３Ｔ３－Ｌ１細胞（マウス由来前駆脂肪細胞）を用いて評価を行った。３Ｔ３－Ｌ１前駆脂肪細胞は通常、分化誘導過程を経て、白色脂肪細胞へと分化、成熟する。しかし、褐色様脂肪細胞へと分化誘導されることで白色脂肪細胞ではほとんど観察されない細胞死誘導ＤＦＦＡ様エフェクターａ（Ｃｉｄｅａ）遺伝子や褐色様脂肪細胞特的に発現するＣＩＴＥＤ１遺伝子の発現亢進、褐色脂肪細胞及び褐色様脂肪細胞にて発現が亢進する転写コアクチベーターＰＧＣ－１β、ミトコンドリアに発現するシトクロムｃオキシダーゼポリペプチド７Ａ１（Ｃｏｘ７ａ１）遺伝子の発現量の増加、及びミトコンドリア特異的に発現するシトクロムｃオキシダーゼタンパク質の発現量の増大、脱共役タンパク質（ＵＣＰ１）遺伝子の発現亢進が観察されるようになる。加えて、非特許文献６に言及があるように、褐色様脂肪細胞への分化を促す因子の一つとしてＦＧＦ－２１が知られており、ＦＧＦ－２１の発現亢進がもたらすいくつかの効果の一つとして、ＰＧＣ－１αの発現亢進を促し、白色脂肪細胞が褐色用脂肪細胞へと誘導されると考えられている。
　そこで、前記遺伝子の中から、Ｃｉｄｅａ、Ｃｏｘ７ａ１及びＵＣＰ１の各遺伝子の発現量を指標に、白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導を確認した。
　試料にはＰＰＡＲγの合成アゴニストであるロシグリタゾン（Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）及びＵＨＡ４００３の２種類を用いた。各試料をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、和光純薬工業（株）社製）に０．２ｍＭ、２ｍＭの濃度で溶解させて試験に使用した。
　培養は、１０％ウシ胎児血清（Ｆｏｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）、１％アンチバイオティック－アンチマイコティック（「Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ」、ギブコ（ＧＩＢＣＯ）社製）を含む「Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　ｍｅｄｉｕｍ」（ＤＭＥＭ、商品名、Ｓｉｇｍａ社製）を用いていった。試験に使用する脂肪細胞は定法に従って調製した。
　試験は以下のように行った。細胞培養用１２ｗｅｌｌディッシュ（コーニング社製）に３Ｔ３－Ｌ１細胞を５×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で１ｍＬ播種して３７℃、５％ＣＯ2条件下で２４時間培養した。２４時間後、ＤＭＥＭ培地をＵＨＡ４００３が終濃度２０μＭ、又はロシグリタゾンが終濃度１μＭとなるように調整したＤＭＥＭ培地に交換し培養を続け、１００％コンフルエントとし、さらに４８時間培養した。次に、培地を「ＡｄｉｐｏＩｎｄｕｃｅｒ　Ｒｅａｇｅｎｔ」（商品名、タカラバイオ（株）社製）付属のインスリン、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチンをそれぞれ１％、０．５％、０．１％添加した分化用ＤＭＥＭ１ｍＬに、各試料を終濃度２０μＭ、１μＭとなるように添加、交換し、３７℃、５％ＣＯ2条件下で４８時間分化誘導した。４８時間の分化誘導後、インスリンを１％添加した維持培養用ＤＭＥＭ２ｍＬに交換し、さらに１週間培養を行い、脂肪細胞の成熟化を行った。なお、溶媒であるＤＭＳＯのみを０．５％添加したものをコントロールとした。
　培養終了後、細胞よりＲＮＡ抽出キット（商品名：ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡ　ＩＩ、タカラバイオ（株）製）を用いて全量ＲＮＡを抽出・精製した。得られたＲＮＡを２ステップリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ用逆転写試薬（商品名：ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴＭａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ、タカラバイオ（株）製）の取扱説明書に準じて逆転写反応を行った。
　つまり５×（Ｐｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ　ＲＴ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ）２μＬ及び全量ＲＮＡ　５００ｎｇを混合し、ＲＮａｓｅ　Ｆｒｅｅ　ｄＨ2Ｏで全量を１０μＬにした。ＰＣＲ用サーマルサイクラー（商品名：ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を使用して１サイクルが「３７℃×１５分→８５℃×５秒」であるプログラムにて逆転写反応を行った。逆転写反応液をリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ用希釈試薬（商品名：ＥＡＳＹ　Ｄｉｌｕｔｉｏｎ、タカラバイオ（株）製）にて５倍希釈した希釈液をリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ解析に使用した。
　リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ解析は定法に従って行った。解析には、「ＥＣＯ　Ｒｅａｌｔｉｍｅ　ＲＴ―ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ」（商品名、イルミナ（株）製）を使用した。プライマーには、Ｃｉｄｅａフォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ１０４６２９－Ｆ）、Ｃｉｄｅａリバースプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ１０４６２９－Ｒ）、Ｃｏｘ７ａ１フォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ１０６８０１－Ｆ）及びＣｏｘ７ａ１リバースプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ１０６８０１－Ｒ）、ＵＣＰ１フォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ０２７５６１－Ｆ）及びＵＣＰ１リバースプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ０２７５６１－Ｒ）を使用した。細胞内遺伝子の内部標準はβ－アクチンとし、そのプライマーとして、ＡＣＴＢフォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ０５０３６８－Ｆ）及びＡＣＴＢリバースプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ０５０３６８－Ｒ）（前記８種のプライマーはいずれもタカラバイオ（株）製）を使用した。
　反応にはリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ試薬（商品名：ＳＹＢＲ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｘ　ＥＸ　ｔａｑＩＩ（Ｔｌｉ　ＲＮａｓｅＨ　Ｐｌｕｓ）、タカラバイオ（株）製）を使用した。反応液は４８ウェルＰＣＲプレート（イルミナ（株）製）中に、２×（ＳＹＢＲ　Ｐｒｅｍｉｘ　ＥＸ　ｔａｑ　ＩＩ（Ｔｌｉ　ＲＮａｓｅＨ　Ｐｌｕｓ））５μＬ、フォワードプライマー（５０μＭ）０．０８μＬ、リバースプライマー（５０μＭ）０．０８μＬ、逆転写反応液２μＬ及びｄＨ2Ｏ　２．８４μＬ（総量１０μＬ）を混合して『９５℃×３０秒→「９５℃×１５秒→６０℃×１分」×４０サイクル→９５℃×１５秒→５５℃×１５秒→９５℃×１５秒』のプログラムにてＰＣＲ反応を行った。
　得られた各細胞中のβ－アクチンとＣｉｄｅａ、Ｃｏｘ７ａ１及びＵＣＰ１のＣｔ値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ　Ｃｙｃｌｅ：一定の増幅量（閾値）に達するサイクル数）からＣｉｄｅａ及びＣｏｘ７ａ１、ＵＣＰ１の各遺伝子発現量の相対値を算出した。結果を図I－１に示した。
　その結果、ロシグリタゾン添加時と同様に、褐色様脂肪細胞のマーカー遺伝子であるＣｉｄｅａ遺伝子発現量がＵＨＡ４００３添加時に有意に増大していることが見いだされ、さらに、ミトコンドリアマーカー遺伝子であるＣｏｘ７ａ１の発現量が有意に増大していることが明らかになった。また、ＵＣＰ１遺伝子の発現量も有意に増加していることが明らかになった。ロシグリタゾンは合成アゴニストであり、その効果はＵＨＡ４００３と比較すると強いが、ＵＨＡ４００３は遥かに簡便な方法で得られるメリットのある化合物であり、且つ、ロシグリタゾン同様極めて強い白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導作用を有する可能性が高いことが示された。
（実施例I－３：ＵＨＡ４００３の正常ヒト皮下脂肪に対する褐色様脂肪細胞分化誘導作用指標遺伝子発現の検証）
　３Ｔ３－Ｌ１細胞を用いて見られた、白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導作用を評価するために、ヒト皮下脂肪由来正常前駆脂肪細胞（ロンザ・ジャパン社）を用いて評価を行った。正常前駆脂肪細胞は通常白色脂肪細胞へと分化するが、褐色様脂肪細胞へと分化誘導されることで白色脂肪細胞ではほとんど観察されないＵＣＰ－１遺伝子の発現や、ミトコンドリアに発現するＣｏｘ７ａ１遺伝子の発現量の増加、及び褐色様脂肪細胞特異的に発現するＣＢＰ／ｐ３００－インターアクティングトランスアクチベーター（ＣＩＴＥＤ１）遺伝子の発現亢進が観察されるようになる。そこで、ＣＩＴＥＤ１、Ｃｏｘ７ａ１及びＵＣＰ１の各遺伝子の発現量を指標に、白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導を確認した。
　試料にはＰＰＡＲγアゴニストであるロシグリタゾン及びＵＨＡ４００３の２種類を用いた。各試料をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、和光純薬工業（株）社製）に適当な濃度で溶解させて試験に使用した。
　皮下脂肪由来正常ヒト前駆脂肪細胞（ロンザ・ジャパン社製）を １０％のＦＢＳと２ｍＭグ ルタミン、及びＧＡ－１０００を前駆脂肪細胞基本培地（Ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ　Ｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ－２；ＰＭＢ－２培地　ロンザ・ジャパン社製）に添加した前駆脂肪細胞培養培地（ＰＧＭ－２）で４日間前培養後、細胞をＥＤＴＡ－トリプシン液で回収し、ＰＧＭ－２培地に８ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｍｌの 割合で懸濁し、細胞培養用１２－ｗｅｌｌプ レートに０．５ｍｌづ つ植え込んだ。５％の ＣＯ2存 在下、３７℃で２４培養後、ロシグリタゾンを終濃度２μＭ、又はＵＨＡ４００３を終濃度４０μＭとなるようにＰＧＭ－２培地に添加し、０．５ｍｌづつ加えさらに４８時間培養した。培養後、ＰＧＭ－２本分化培地（ＰＧＭ－２培地に、キット付属の各種添加因子（ヒトインスリン、ＩＢＭＸ、デキサメタゾン、インドメタシン）を添加したもの）に、さらにロシグリタゾンを終濃度１μＭ、又はＵＨＡ４００３を終濃度２０μＭとなるように添加した分化用培地を１ｍｌ追添加し、脂肪細胞の分化、成熟化を行った。追添加後１０日間培養を行ったものを試験に使用した。コントロールには溶媒であるＤＭＳＯのみを０．５％添加したものを使用した。
　実施例I－２と同様の方法でＲＮＡを抽出、精製し、逆転写反応、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲを行った。プライマーには、ＣＩＴＥＤ１フォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ２０４４０４－Ｆ）、ＣＩＴＥＤ１リバースプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ２０４４０４－Ｒ）、ＣＯＸ７Ａ１フォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ１３３６４６－Ｆ）及びＣＯＸ７Ａ１リバースプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ１３３６４６－Ｒ）、ＵＣＰ１フォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ１５８４５１－Ｆ）及びＵＣＰ１リバースプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ１５８４５１－Ｒ）を使用した。細胞内遺伝子の内部標準はβ－アクチンとし、そのプライマーとして、ＡＣＴＢフォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ０６７８０３－Ｆ）及びＡＣＴＢリバースプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ０６７８０３－Ｒ）（前記８種のプライマーはいずれもタカラバイオ（株）製）を使用した。
　得られた各細胞中のβ－アクチンとＣＩＴＥＤ１、ＣＯＸ７Ａ１及びＵＣＰ１のＣｔ値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ　Ｃｙｃｌｅ：一定の増幅量（閾値）に達するサイクル数）からＣＩＴＥＤ１及びＣＯＸ７Ａ１、ＵＣＰ１の各遺伝子発現量の相対値を算出した。結果を図I－２に示した。
　その結果、ロシグリタゾン添加時と同様に、褐色様脂肪細胞のマーカー遺伝子であるＣＩＴＥＤ１遺伝子発現量がＵＨＡ４００３添加時に有意に増大していることが見いだされ、さらに、ミトコンドリアマーカー遺伝子であるＣＯＸ７Ａ１の発現量が有意に増大していることが明らかになった。また、ＵＣＰ１遺伝子の発現量も有意に増加していることが明らかになった。つまり、本来白色脂肪細胞へと分化するヒト皮下脂肪由来正常前駆脂肪細胞がＵＨＡ４００３存在下で褐色様脂肪細胞へと分化したことを示す。即ち、ＵＨＡ４００３に極めて強い白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導作用を有することが示された。
　以上の実施例I－２、I－３の結果から、ＵＨＡ４００３を添加することで、細胞内のミトコンドリア量が有意に増加し、白色脂肪細胞からの褐色様脂肪細胞への分化が顕著に誘導されていることから、ＵＨＡ４００３は、褐色様脂肪細胞への分化誘導効果が優れていることが示された。
　また、ＵＨＡ４００３は、製造コストがかかる合成アゴニストであるロシグリタゾンと比べて、ワンステップで、食品成分から安価に調製することが可能である点でも優れていることがわかる。
（実施例II－１：レスベラトロール重合化合物を含有する組成物の作製及び精製）
　レスベラトロール重合化合物を含有する組成物の作製、及び精製を以下の手順で行った。トランス－レスベラトロール（（株）ＴＥＣＮＯ　ＳＣＩＥＮＣＥ社製）１ｇをエタノール１０ｍＬに溶解し、１０％炭酸水素ナトリウム（和光純薬工業（株）社製）水溶液を１０ｍＬ加えて、レスベラトロール含有溶液（ｐＨ９．９）を得た。このレスベラトロール含有溶液をオートクレーブにて１３０℃、９０分間加熱し、レスベラトロール重合化合物含有溶液を作製した。
　次いで、レスベラトロール重合化合物含有溶液を蒸留水１Ｌで希釈・溶解させ、４００ｇの合成吸着剤ダイヤイオン（登録商標）ＨＰ－２０（三菱化学株式会社製）に全量供した。蒸留水１Ｌで洗浄後、１００％エタノール１Ｌで溶出させた。減圧乾燥にて溶媒を除去し、レスベラトロール重合化合物含有組成物（以下、誘導体含有組成物という。）２００ｍｇを得た。得られた重合化合物組成物を２ｍｇ／ｍＬの濃度でメタノールに溶解させ、そのうち１０μＬをＨＰＬＣにより分析した。
　ＨＰＬＣ分析は下記の条件にて行った。
カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ　ＰＡＫ　ＵＧ８０カラム（４．６ｍｍＩ．Ｄ.×２５０ｍｍ、資生堂株式会社製）
移動相Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、和光純薬株式会社製）／Ｈ2Ｏ
移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル（和光純薬株式会社製）
勾配（容量％）：１００％Ａ／０％Ｂから０％Ａ／１００％Ｂまで３３分、０％Ａ／１００％Ｂを７分（すべて直線）
　得られたクロマトグラムを図II－１に示す。得られた反応溶液をＨＰＬＣで分析したところ、レスべラトロールのピークとは異なる複数のピークが検出できたことから、生成された複数の化合物を含む組成物が取得できた。
　次に、得られた反応物のうち、図II－１の（１）、（２）、（３）に示されるピークに含まれる化合物を分取ＨＰＬＣにより単離し、常法により乾燥したところ、（１）、（２）に示されるピークに含まれる化合物は淡褐色粉末状の物質、式（３）に示されるピークに含まれる化合物は褐色粉末状の物質となった。
　次いで、前記３種類の化合物の分子量を、特開２０１１－２５１９１４号公報の実施例２に記載の方法に従って、高分解能Ｎｅｇａｔｉｖｅ－ＦＡＢ－ＭＳ（Ｆａｓｔ Ａｔｏｍ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ－Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）にて測定し、核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定を行った結果、（１）のピークに含まれる化合物は、前記式（３）で表される化合物（以下、ＵＨＡ４００２という。）、（２）のピークに含まれる化合物は前記式（２）で表される化合物（以下、ＵＨＡ４００３という。）であることがわかった。
　一方、（３）のピークに含まれる化合物は、今までに報告されていない新規化合物であった。
　すなわち、高分解能Ｎｅｇａｔｉｖｅ－ＦＡＢ－ＭＳによる測定値は６４７．２１４４であり、理論値との比較から、以下の分子式を得た。
理論値Ｃ42Ｈ31Ｏ7（Ｍ－Ｈ-）：６４７．２１４８
分子式Ｃ42Ｈ32Ｏ7
　そして、核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定に供し、1Ｈ－ＮＭＲ、13Ｃ－ＮＭＲ及び各種２次元ＮＭＲデータの解析から、前記（３）のピークに含まれる化合物が前記式（４）で表される構造を有する新規化合物（以下、ＵＨＡ４０２２という。）であることを確認した。
　なお、前記ＮＭＲ測定値については、ＵＨＡ４０２２を
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
として、その1Ｈ核磁気共鳴スペクトル、13Ｃ核磁気共鳴スペクトルを表１に示す。
値はδ、ｐｐｍで、溶媒はＤＭＳＯ－ｄ6で測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　また、ＵＨＡ４０２２の物理化学的性状は、以下のようになった。
（性状）
褐色粉末
（溶解性）
水：難溶
メタノール：溶解
エタノール：溶解
ＤＭＳＯ：溶解
クロロホルム：難溶
酢酸エチル：難溶
（実施例II－２：誘導体含有組成物の白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導作用指標遺伝子発現の検証）
　白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導作用を評価するために、実施例I－２と同様に、３Ｔ３－Ｌ１細胞（マウス由来前駆脂肪細胞）を用いて評価を行った。本実施例では、ＦＧＦ－２１、ＰＧＣ－１α及びＣｏｘ７ａ１の各遺伝子の発現量を指標に、白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導を確認した。
　試料にはＰＰＡＲγの合成アゴニストであるロシグリタゾン（Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）及び実施例II－１にて作製した誘導体含有組成物の２種類を用いた。各試料をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、和光純薬工業（株）社製）に０．２ｍＭ、２０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させて試験に使用した。
　培養は、１０％ウシ胎児血清、１％アンチバイオティック－アンチマイコティックを含む「Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　ｍｅｄｉｕｍ」を用いていった。試験に使用する脂肪細胞は定法に従って調製した。
　試験は以下のように行った。細胞培養用１２ｗｅｌｌディッシュ（コーニング社製）に３Ｔ３－Ｌ１細胞を５×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で１ｍＬ播種して３７℃、５％ＣＯ2条件下で２４時間培養した。２４時間後、ＤＭＥＭ培地を組成物濃度が終濃度２０μｇ／ｍＬ、又はロシグリタゾンが終濃度１μＭとなるように調整したＤＭＥＭ培地に交換し培養を続け、１００％コンフルエントとし、さらに４８時間培養した。次に、培地を「ＡｄｉｐｏＩｎｄｕｃｅｒ　Ｒｅａｇｅｎｔ」付属のインスリン、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチンをそれぞれ１％、０．５％、０．１％添加した分化用ＤＭＥＭ１ｍＬに、各試料を終濃度２０μｇ／ｍＬ、１μＭとなるように添加、交換し、３７℃、５％ＣＯ2条件下で４８時間分化誘導した。なお、溶媒であるＤＭＳＯのみを０．５％添加したものをコントロールとした。
　培養終了後、実施例I－２と同様にして、細胞よりＲＮＡ抽出キットを用いて全量ＲＮＡを抽出・精製し、得られたＲＮＡを２ステップリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ用逆転写試薬の取扱説明書に準じて逆転写反応を行った。
　次いで、得られた逆転写反応液をリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ用希釈試薬にて５倍希釈した希釈液をリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ解析に使用した。
　リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ解析は定法に従って行った。解析には、「ＥＣＯ　Ｒｅａｌｔｉｍｅ　ＲＴ―ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ」（商品名、イルミナ（株）製）を使用した。プライマーには、ＦＧＦ－２１フォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ－１２６８８６－Ｆ）、ＦＧＦ－２１リバースプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ－１２６８８６－Ｒ）、ＰＧＣ－１αフォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ－１１４５０９－Ｆ）、ＰＧＣ－１αリバースプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ－１１４５０９－Ｒ）、Ｃｏｘ７ａ１フォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ１０６８０１－Ｆ）及びＣｏｘ７ａ１リバースプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ１０６８０１－Ｒ）を使用した。細胞内遺伝子の内部標準はβ－アクチンとし、そのプライマーとして、ＡＣＴＢフォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ０５０３６８－Ｆ）及びＡＣＴＢリバースプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ０５０３６８－Ｒ）（前記８種のプライマーはいずれもタカラバイオ（株）製）を使用した。
　反応にはリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ試薬（商品名：ＳＹＢＲ（登録商標）Ｓｅｌｅｃｔ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ、ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を使用した。反応液は４８ウェルＰＣＲプレート（イルミナ（株）製）中に、２×（ＳＹＢＲ　Ｓｅｌｅｃｔ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ）５μＬ、フォワードプライマー（５０μＭ）０．０８μＬ、リバースプライマー（５０μＭ）０．０８μＬ、逆転写反応液２μＬ及びｄＨ2Ｏ　２．８４μＬ（総量１０μＬ）を混合して『５０℃×２分→９５℃×２分→「９５℃×１５秒→６０℃×１分」×４０サイクル→９５℃×１５秒→５５℃×１５秒→９５℃×１５秒』のプログラムにてＰＣＲ反応を行った。
　得られた各細胞中のβ－アクチンとＦＧＦ－２１、ＰＧＣ－１α及びＣｏｘ７ａ１のＣｔ値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ　Ｃｙｃｌｅ：一定の増幅量（閾値）に達するサイクル数）からＦＧＦ－２１、ＰＧＣ－１α及びＣｏｘ７ａ１の各遺伝子発現量の相対値を算出した。結果を図II－２に示した。
　その結果、ロシグリタゾン添加時と同様に、褐色様脂肪細胞の誘導因子の一つであるＦＧＦ－２１遺伝子、及びＦＧＦ－２１遺伝子の発現に伴いＰＧＣ－１α遺伝子の発現量が誘導体含有組成物添加時に有意に増大していることが見いだされ、さらに、ミトコンドリアマーカー遺伝子であるＣｏｘ７ａ１の発現量が有意に増大していることが明らかになった。ロシグリタゾンは合成アゴニストであり、その効果は誘導体含有組成物と比較すると強い。しかし、ロシグリタゾンを始めとするチアゾリジン系化合物はヒトに対して浮腫・心不全等の副作用が強く、安全性に問題のある化合物である。これに対し、誘導体含有組成物は遥かに簡便な方法で得られるメリットのある組成物であり、且つ、その前駆化合物であるレスベラトロールは自然界に広く分布し、安全性の極めて高い化合物である上、レスベラトロールを始めとするヒドロキシスチルベン類は重合物を含め自然界に広く分布していることから食経験も豊富な化合物である。故に、本発明品は安全性が高い上に、ロシグリタゾン同様極めて強い白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導作用を有する可能性が高い、有用な組成物であることが示された。
（実施例II－３：誘導体含有組成物の白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導作用指標遺伝子発現の検証）
　実施例II－２では誘導体含有組成物が褐色様脂肪細胞へと白色脂肪細胞を分化誘導することを分化誘導直後の細胞を持ち評価したので、実施例II－３では該誘導細胞が成熟後も褐色様脂肪細胞の形質を維持していることを、成熟脂肪細胞を用い評価した。評価は、ＦＧＦ－２１、ＰＧＣ－１α及び褐色様脂肪細胞マーカー遺伝子である細胞死誘導ＤＦＦＡ様エフェクターａ（Ｃｉｄｅａ）の各遺伝子の発現量、加えて、褐色様脂肪細胞はアドレナリンによる刺激に応答し、ＵＣＰ１遺伝子の発現量を亢進することから成熟化後の脂肪細胞にアドレナリンを添加した場合のＵＣＰ１遺伝子の発現量を指標に、白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導を確認した。
　実施例II－２と同様の方法で、同じ組成物及び化合物を添加し、３Ｔ３－Ｌ１前駆脂肪細胞の分化誘導を行った。４８時間の分化誘導後、インスリンを１％添加した維持培養用ＤＭＥＭ２ｍＬに交換し、さらに１週間培養を行い、脂肪細胞の成熟化を行った。アドレナリンによる刺激は、成熟化を行った細胞に対し、Ｌ－アドレナリン（和光純薬工業（株）社製）を１μＭ添加した維持培養用ＤＭＥＭ２ｍＬに交換し、２時間培養を行い、応答を検証した。
　１週間の成熟化後、又は、アドレナリン刺激後、実施例II－２と同様の方法で全量ＲＮＡを抽出、精製し、逆転写反応を行いリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ解析を実施した。解析に使用したプライマーは、ＦＧＦ－２１、ＰＧＣ－１α、ＡＣＴＢの各遺伝子については実施例II－２と同じものを使用し、ＰＧＣ－１β遺伝子については、ＰＧＣ－１βフォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ１２５５０５－Ｆ）、ＰＧＣ－１βリバースプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ１２５５０５－Ｒ）、Ｃｉｄｅａ遺伝子については、Ｃｉｄｅａフォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ１０４６２９－Ｆ）、Ｃｉｄｅａリバースプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ１０４６２９－Ｒ）ＵＣＰ１遺伝子については、ＵＣＰ１フォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ０２７５６１－Ｆ）及びＵＣＰ１リバースプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ０２７５６１－Ｒ）（いずれも、タカラバイオ（株）製）を使用した。
　得られた各細胞中のβ－アクチンとＦＧＦ－２１、ＰＧＣ－１α、ＰＧＣ－１β、Ｃｉｄｅａ及びＵＣＰ１のＣｔ値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ　Ｃｙｃｌｅ：一定の増幅量（閾値）に達するサイクル数）からＦＧＦ－２１、ＰＧＣ－１β、ＰＧＣ－１α、Ｃｉｄｅａ及びＵＣＰ１の各遺伝子発現量の相対値を算出した。結果を図II－３に示した。
　その結果、ロシグリタゾン添加時と同様に、褐色様脂肪細胞の誘導因子の一つであるＦＧＦ－２１遺伝子、及びＦＧＦ－２１遺伝子の発現に伴いＰＧＣ－１α遺伝子の発現量が有意に増大していることが見いだされ、さらに、褐色様脂肪細胞マーカー遺伝子であるＣｉｄｅａの発現量や、褐色脂肪細胞にて発現が亢進されるＰＧＣ－１βの発現量が有意に増大していることが明らかになった。くわえて、アドレナリン添加によるＵＣＰ１遺伝子の発現亢進効果は、アドレナリン添加有無を比較すると、コントロールがアドレナリンの添加により３．１倍となるのに対し、ロシグリタゾンは６．２倍、本発明品である誘導体含有組成物を添加した場合は６．７倍と大きくその発現量を亢進し、褐色様脂肪細胞のみに見られる特徴が観察された。つまり、本発明の組成物を添加することで、３Ｔ３－Ｌ１前駆脂肪細胞は褐色様脂肪細胞へと分化誘導され、成熟化後も褐色様脂肪細胞の形質を維持していることが明らかとなり、本発明の組成物が、極めて強い白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導作用を有する可能性が高いことが示された。
（実施例II－４：誘導体含有組成物の正常ヒト皮下脂肪に対する褐色様脂肪細胞分化誘導作用指標遺伝子発現の検証）
　３Ｔ３－Ｌ１細胞を用いて見られた、白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導作用を評価するために、実施例I－３と同様にして、ヒト皮下脂肪由来正常前駆脂肪細胞（ロンザ・ジャパン社）を用いて、ＣＩＴＥＤ１、Ｃｏｘ７ａ１及びＵＣＰ１の各遺伝子の発現量を指標に、白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導を確認した。
　試料にはＰＰＡＲγアゴニストであるロシグリタゾン及び誘導体含有組成物の２種類を用いた。各試料をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、和光純薬工業（株）社製）に適当な濃度で溶解させて試験に使用した。
　皮下脂肪由来正常ヒト前駆脂肪細胞（ロンザ・ジャパン社製）の培養は、試料を変えた以外は、実施例I－３と同様にして行った。
　実施例II－２と同様の方法でＲＮＡを抽出、精製し、逆転写反応、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲを行った。プライマーには、ＣＩＴＥＤ１フォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ２０４４０４－Ｆ）、ＣＩＴＥＤ１リバースプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ２０４４０４－Ｒ）、ＰＧＣ‐１βフォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ１７２１０３－Ｆ）、ＰＧＣ‐１βリバースプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ１７２１０３－Ｒ）、ＣＯＸ７Ａ１フォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ１３３６４６－Ｆ）及びＣＯＸ７Ａ１リバースプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ１３３６４６－Ｒ）、ＵＣＰ１フォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ１５８４５１－Ｆ）及びＵＣＰ１リバースプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ１５８４５１－Ｒ）を使用した。細胞内遺伝子の内部標準はβ－アクチンとし、そのプライマーとして、ＡＣＴＢフォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ０６７８０３－Ｆ）及びＡＣＴＢリバースプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ０６７８０３－Ｒ）（前記１０種のプライマーはいずれもタカラバイオ（株）製）を使用した。
　得られた各細胞中のβ－アクチンとＣＩＴＥＤ１、ＰＧＣ－１β、ＣＯＸ７Ａ１及びＵＣＰ１のＣｔ値からＣＩＴＥＤ１、ＰＧＣ－１β、ＣＯＸ７Ａ１、ＵＣＰ１の各遺伝子発現量の相対値を算出した。結果を図II－４に示した。
　その結果、ロシグリタゾン添加時と同様に、褐色様脂肪細胞のマーカー遺伝子であるＣＩＴＥＤ１遺伝子発現量が誘導体含有組成物添加時に有意に増大していることが見いだされ、さらに、ミトコンドリアマーカー遺伝子であるＣＯＸ７Ａ１の発現量が有意に増大していることが明らかになった。また、ＵＣＰ１遺伝子、ＰＧＣ－１βの各遺伝子の発現量も有意に増加していることが明らかになった。つまり、本来白色脂肪細胞へと分化するヒト皮下脂肪由来正常前駆脂肪細胞が誘導体含有組成物存在下で褐色様脂肪細胞へと分化したことを示す。即ち、本発明の誘導体含有組成物に極めて強い白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導作用を有することが示された。
　以上の実施例II－２、II－３、II－４の結果から、誘導体含有組成物を添加することで、細胞内のミトコンドリア量が有意に増加し、白色脂肪細胞からの褐色様脂肪細胞への分化が顕著に誘導されていることから、誘導体含有組成物は、褐色様脂肪細胞への分化誘導効果が優れていることが示された。
　また、誘導体含有組成物は、製造コストがかかる合成アゴニストであるロシグリタゾンと比べて、ワンステップで、食品成分から安価に調製することが可能である点でも優れていることがわかる。
（実施例II－５：本発明の組成物を含有する医薬品）
　実施例II－１と同様にして得られた誘導体含有組成物１ｇをエタノールに溶解し、得られた溶液を微結晶セルロースに吸着させて、減圧乾燥した。本発明品吸着体１０部、コーンスターチ２３部、乳糖１２部、カルボキシメチルセルロース８部、微結晶セルロース３２部、ポリビニルピロリドン４部、ステアリン酸マグネシウム３部、タルク８部を混合し打錠することで、本発明品を含む打錠剤を得た。
（実施例II－６：本発明の組成物を含有する医薬部外品）
　実施例II－１と同様にして得られた誘導体含有組成物１．２ｇをエタノールに溶解させて得られたエタノール溶液１０ｍＬ、タウリン２０ｇ、ビタミンＢ１硝酸塩０．１２ｇ、安息香酸ナトリウム０．６ｇ、クエン酸４ｇ、砂糖６０ｇ及びポリビニルピロリドン１０ｇを精製水に溶解し、全量を１０００ｍＬにメスアップした。なお、ｐＨは、希塩酸を用いて３．２に調整した。得られた溶液１０００ｍＬのうち５０ｍＬをガラス瓶に充填し、８０℃で３０分間滅菌して、医薬部外品であるドリンク剤を得た。
（実施例III－１：レスベラトロール重合化合物を含有する組成物の作製及び精製）
　レスベラトロール重合化合物を含有する組成物の作製、及び精製を以下の手順で行った。トランス－レスベラトロール（（株）ＴＥＣＮＯ　ＳＣＩＥＮＣＥ社製）４０ｇに、１０％炭酸ナトリウム（和光純薬工業（株）社製）水溶液を４００ｍＬ加えて、レスベラトロール含有水溶液（ｐＨ９．９）を得た。このレスベラトロール含有溶液を圧力鍋（ゼロ活力なべ、アサヒ軽金属工業株式会社製）にて１２８℃、１２０分間加熱し、レスベラトロール重合化合物含有溶液を作製した（比較品１）。
　次いで、比較品１から以下のように試作品１～４を調製した。
　比較品１を、４．０ｋｇの合成吸着剤ダイヤイオン（登録商標）ＨＰ－２０（三菱化学株式会社製）に全量供した。蒸留水２４Ｌで洗浄後、１００％エタノール１６Ｌで溶出させた。減圧乾燥にて溶媒を除去し、レスベラトロール重合化合物含有組成物（以下、誘導体含有組成物という。）２２ｇを得た（試作品１）。
　また、比較品１に対し濃塩酸（和光純薬工業（株）社製）を適当量加え、ｐＨ試験紙にて確認しながら溶液をｐＨ７以下に調整、水に不溶な成分を濾過回収し、３０ｇを得た（試作品２）。
　さらに、比較品１に対し濃塩酸を適当量加え、ｐＨ試験紙にて確認しながら溶液をｐＨ７以下に調整を行ったうえ、調整産物を３Ｌの蒸留水に懸濁、オイルバス（アズワン社製）を用い、誘導体含有組成物を８５℃に２時間維持することを２回繰り返し、誘導体組成物得た（試作品３）。
　加えて、試作品１を３Ｌの蒸留水に懸濁し、オイルバスを用い、誘導体含有組成物を８５℃に２時間維持することを２回繰り返し、誘導体組成物を得た（試作品４）。
　得られた比較品１、試作品１～４を２ｍｇ／ｍＬの濃度でメタノールに溶解させ、そのうち１０μＬを実施例II－１と同様にしてＨＰＬＣにより分析した。
　得られたクロマトグラムのうち、代表例として試作品４のチャートを図III－１に示す。得られた反応溶液をＨＰＬＣで分析したところ、レスべラトロールのピークとは異なる複数のピークが検出できたことから、生成された複数の化合物を含む組成物が取得できた。
　次に、得られた反応物のうち、図III－１の（１）、（２）、（３）に示されるピークに含まれる化合物を分取ＨＰＬＣにより単離し、常法により乾燥したところ、（１）、（２）に示されるピークに含まれる化合物は淡褐色粉末状の物質、式（３）に示されるピークに含まれる化合物は褐色粉末状の物質となった。
　次いで、前記３種類の化合物の分子量を、特開２０１１－２５１９１４号公報の実施例２に記載の方法に従って、高分解能Ｎｅｇａｔｉｖｅ－ＦＡＢ－ＭＳにて測定し、ＮＭＲ測定を行った結果、（１）のピークに含まれる化合物は、前記式（３）で表される化合物（以下、ＵＨＡ４００２という。）、（２）のピークに含まれる化合物は前記式（２）で表される化合物（以下、ＵＨＡ４００３という。）（３）のピークに含まれる化合物は前記式（４）で表される化合物（以下ＵＨＡ４０２２という。）であることがわかった。
（試験例III－１：レスベラトロール重合化合物を含有する組成物中のフェノール濃度の測定）
　実施例III－１にて作成した比較品１、及び試作品１～４に含まれるフェノールの濃度を、ガスクロマトグラフ質量分析計を用いて測定した。比較品１、及び試作品１～４をそれぞれ２０ｍｇ／ｍＬの濃度でメタノールに溶解させ、そのうち１ｍＬをガスクロマトグラフ質量分析計（ＪＭＳ－Ｑ１０００ＭＣ，日本電子株式会社製）により含有フェノール濃度を比較、分析した。
　ガスクロマトグラフ質量分析は次の条件にて行った。使用機器は、Ｒｔｘ（登録商標）－２００ＭＳ（０．２５ｍｍｉｄ×３０ｍ、膜厚０．２５μｍ、ＲＥＳＴＥＫ社製）、ＳＰＭＥファイバー（５０／３０μｍ、ＤＶＢ／ＣＡＲ／ＰＤＭＳ、スペルコ社製）、ＧＣ－ＭＳは、ＪＭＳ－Ｑ１０００ＧＣ　Ｋ９（日本電子社製）を用いた。ＳＰＭＥファイバーの条件は、前加熱（６５℃、１分）、吸着時間（３０分）、脱着時間（１０分）、注入口温度（２５０℃）で行った。また、ＧＣの条件は、温度条件（５０℃で１０分→３２０℃まで１０℃／分→３２０℃で１０分）、スプリット（比：２０）、キャリアガス（ヘリウム）で行った。
　フェノール（和光純薬社製）を用い検量線を作成し、各試作品及び比較品のフェノール濃度を測定し、固形分２０．０ｍｇ／ｍＬあたりのフェノール含有量を測定した。測定結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　測定の結果、圧力鍋による生産直後で得られる比較品１と比較して各試作品はフェノール濃度が２０分の１以下、中でも、工程を２つ実施した試作品４は１５００分の１以下に減少した。したがって、試作品１～４等の本発明品は従来品では混入が見過ごされていた発明品に含まれるフェノールが、極めて微小な量に減少させた製品であることが明らかとなった。
（実施例III－２：誘導体含有組成物の白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導作用指標遺伝子発現の検証）
　白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞分化誘導作用を評価するために、実施例II－２と同様にして、３Ｔ３－Ｌ１細胞（マウス由来前駆脂肪細胞）を用いて評価を行った。本実施例では、ＦＧＦ－２１、ＰＧＣ－１α及びＰＧＣ－１β、ＣＩＴＥＤ１の各遺伝子の発現量を指標に、白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導を確認した。
　試料にはＰＰＡＲγの合成アゴニストであるロシグリタゾン（Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）及び実施例III－１にて得られた試作品４の２種類を用いた。各試料をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、和光純薬工業（株）社製）に０．２ｍＭ、２０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させて試験に使用した。
　培養は、１０％ウシ胎児血清、１％アンチバイオティック－アンチマイコティックを含む「Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　ｍｅｄｉｕｍ」を用いていった。試験に使用する脂肪細胞は定法に従って調製した。
　試験は試料を変えた以外は、実施例II－２と同様にして行った。
　３Ｔ３－Ｌ１細胞の培養終了後、実施例II－２と同様にして、細胞よりＲＮＡ抽出キットを用いて全量ＲＮＡを抽出・精製し、得られたＲＮＡを２ステップリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ用逆転写試薬の取扱説明書に準じて逆転写反応を行った。
　次いで、得られた逆転写反応液をリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ用希釈試薬にて５倍希釈した希釈液をリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ解析に使用した。
　リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ解析は定法に従って行った。解析には、「ＥＣＯ　Ｒｅａｌｔｉｍｅ　ＲＴ―ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ」（商品名、イルミナ（株）製）を使用した。プライマーには、ＦＧＦ－２１フォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ－１２６８８６－Ｆ）、ＦＧＦ－２１リバースプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ－１２６８８６－Ｒ）、ＰＧＣ－１αフォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ－１１４５０９－Ｆ）、ＰＧＣ－１αリバースプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ－１１４５０９－Ｒ）、ＰＧＣ－１βフォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ１２５５０５－Ｆ）、ＰＧＣ－１βリバースプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ１２５５０５－Ｒ）、ＣＩＴＥＤ１フォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ１０４７４８－Ｆ）、ＣＩＴＥＤ１リバースプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ１０４７４８－Ｒ）を使用した。細胞内遺伝子の内部標準はβ－アクチンとし、そのプライマーとして、ＡＣＴＢフォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ０５０３６８－Ｆ）及びＡＣＴＢリバースプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ０５０３６８－Ｒ）（前記８種のプライマーはいずれもタカラバイオ（株）製）を使用した。
　ＰＣＲ反応やプログラムは、実施例II－２と同様にして行った。
　得られた各細胞中のβ－アクチンとＦＧＦ－２１、ＰＧＣ－１α、ＰＧＣ－１β及びＣＩＴＥＤ１のＣｔ値からＦＧＦ－２１、ＰＧＣ－１αＰＧＣ－１β、ＣＩＴＥＤ１の各遺伝子発現量の相対値を算出した。結果を図III－２に示した。
　その結果、ロシグリタゾン添加時と同様に、褐色様脂肪細胞の誘導因子の一つであるＦＧＦ－２１遺伝子の発現量（左上図）、及びＦＧＦ－２１遺伝子の発現に伴いＰＧＣ－１α遺伝子の発現量（右上図）が誘導体含有組成物添加時に有意に増大していることが見いだされ、さらに、褐色様脂肪細胞のマーカー遺伝子であるＣｉｔｅｄ１の発現量（右下図）や、ＰＧＣ－１βの発現量（左下図）が有意に増大していることが明らかになった。ロシグリタゾンは合成アゴニストであり、その効果は誘導体含有組成物と比較すると強い。しかし、ロシグリタゾンを始めとするチアゾリジン系化合物はヒトに対して浮腫・心不全等の副作用が強く、安全性に問題のある化合物である。これに対し、誘導体含有組成物は遥かに簡便な方法で得られるメリットのある組成物であり、且つ、その前駆化合物であるレスベラトロールは自然界に広く分布し、安全性の極めて高い化合物である上、レスベラトロールを始めとするヒドロキシスチルベン類は重合物を含め自然界に広く分布していることから食経験も豊富な化合物である。故に、本発明品は安全性が高い上に、ロシグリタゾン同様極めて強い白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導作用を有する可能性が高い、有用な組成物であることが示された。
　以上の実施例III－２の結果から、誘導体含有組成物を添加することで、細胞内のミトコンドリア量が有意に増加し、白色脂肪細胞からの褐色様脂肪細胞への分化が顕著に誘導されていることから、誘導体含有組成物は、褐色様脂肪細胞への分化誘導効果が優れていることが示された。
　また、誘導体含有組成物は、製造コストがかかる合成アゴニストであるロシグリタゾンと比べて、ワンステップで、食品成分から安価に調製することが可能である点でも優れていることがわかる。
（実施例III－３：本発明の組成物を含有する医薬品）
　実施例III－１と同様にして得られた誘導体含有組成物１ｇをエタノールに溶解し、得られた溶液を微結晶セルロースに吸着させて、減圧乾燥した。本発明品吸着体１０部、コーンスターチ２３部、乳糖１２部、カルボキシメチルセルロース８部、微結晶セルロース３２部、ポリビニルピロリドン４部、ステアリン酸マグネシウム３部、タルク８部を混合し打錠することで、本発明品を含む打錠剤を得た。
（実施例III－４：本発明の組成物を含有する医薬部外品）
　実施例III－１と同様にして得られた誘導体含有組成物１．２ｇをエタノールに溶解させて得られたエタノール溶液１０ｍＬ、タウリン２０ｇ、ビタミンＢ１硝酸塩０．１２ｇ、安息香酸ナトリウム０．６ｇ、クエン酸４ｇ、砂糖６０ｇ及びポリビニルピロリドン１０ｇを精製水に溶解し、全量を１０００ｍＬにメスアップした。なお、ｐＨは、希塩酸を用いて３．２に調整した。得られた溶液１０００ｍＬのうち５０ｍＬをガラス瓶に充填し、８０℃で３０分間滅菌して、医薬部外品であるドリンク剤を得た。
（実施例III－５：本発明の組成物を含有する食品）
　実施例III－１と同様にして得られた誘導体含有組成物１ｇをあらかじめ１００ｍＬのエタノールに溶解させ、これに砂糖５００ｇ、水飴４００ｇを混合溶解し、生クリーム１００ｇ、バター２０ｇ、練乳７０ｇ、乳化剤１．０ｇを混合した後、真空釜にて－５５０ｍｍＨｇ減圧させ、１１５℃の条件下で濃縮し、水分値３．０重量％のミルクハードキャンディを得た。このミルクハードキャンディは、菓子として食べ易いものであることはもちろん、前駆脂肪細胞より成熟脂肪細胞への分化を低減し、肥満の予防を期待した機能性食品としても利用できる。

Claims (8)

  1. 　ヒドロキシスチルベン類の環化反応生成物であって、式（１）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （但し、式（１）中、Ｒ1～Ｒ8は、水素原子、ヒドロキシ基、炭素数１～１０の飽和又は不飽和の、直鎖状又は分岐鎖状のアルコキシ基、あるいは炭素数１～１０の飽和又は不飽和の、直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基であり、Ｒ1～Ｒ8はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）
    で表される化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含有することを特徴とする、白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導剤。
  2. 　前記ヒドロキシスチルベン類がレスベラトロールである請求項１に記載の白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導剤。
  3. 　前記式（１）においてＲ1～Ｒ8が全て水素原子である請求項１又は２に記載の白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導剤。
  4. 　レスベラトロールをアルカリ性条件下で加熱して得られる組成物であって、
    　式（２）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     、式（３）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     及び式（４）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     で示される３種類のレスベラトロール重合化合物を含有する白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導剤組成物。
  5. 　さらに固形分２０ｍｇ／ｍＬあたりのフェノール含有量が１００μｇ／ｍＬ以下である請求項４に記載の白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導剤組成物。
  6. 　請求項１～３のいずれかに記載の白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導剤を含有する食品、医薬品又は医薬部外品。
  7. 　請求項４又は５に記載の白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導剤組成物を含有する食品、医薬品又は医薬部外品。
  8. 　（ａ）～（ｃ）の工程：
    （ａ）レスベラトロールをアルカリ性条件下で加熱して得られる溶液を固体吸着剤と接触させ、吸着成分を回収する工程、
    （ｂ）レスベラトロールをアルカリ性条件下で加熱して得られる溶液をｐＨ７以下に調整、析出させ、析出物を回収する工程、
    （ｃ）レスベラトロールをアルカリ性条件下で加熱して得られる溶液、又は上記（ａ）の工程で得られる組成物、又は上記（ｂ）の工程で得られる組成物を含有する水溶液を加熱する工程、
    からなる群より選ばれる、一つ以上の工程により、含有するフェノールを除去する工程を有することを特徴とする、請求項４又は５に記載の白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞への分化誘導剤組成物の製造方法。
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