JP5772220B2 - サーチュイン発現増強剤 - Google Patents
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Description
〔1〕下記式(1):
本発明のサーチュイン発現増強剤およびサーチュイン活性促進剤は、下記式(1):
また、「サーチュイン活性促進剤」とは、代謝経路を包括的に制御する酵素であるサーチュインの酵素活性を促進することができる薬剤をいう。
サーチュイン発現増強作用およびサーチュイン活性促進作用は、具体的には、後述の実施例に記載の方法により、それぞれを測定し、公知の化合物であるレスベラトロールの作用と対比することで確認することができる。
したがって、本発明は、前記レスベラトロール誘導体類を有効成分として含有するサーチュイン発現増強剤およびサーチュイン活性促進剤を提供することができる。
トランス−レスベラトロール(東京化成工業(株)社製)1g、p−クマル酸(和光純薬(株)社製)1gをエタノール20mLに溶解し、ミネラルウォーター(商品名「ゲロルシュタイナー」サッポロ飲料(株)製)20mLを加えて、レスベラトロール、p−クマル酸含有溶液(pH=4.6)を得た。このレスベラトロール、p−クマル酸含有溶液をオートクレーブにて130℃、90分間加熱した。得られた反応溶液のうち1mLをメタノールにて50mLにメスアップし、このうち10μLをHPLCにより分析し、UHA1028の生成を確認した。
カラム:逆相用カラム「Develosil(登録商標)C−30−UG−5」(4.6mmi.d.×250mm)
移動相:A・・・H2O(0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)), B・・・アセトニトリル(0.1%TFA)
流速:1mL/min
注入:10μL
検出:254nm
勾配(容量%):80%A/20%Bから20%A/80%Bまで30分間、20%A/80%Bから100%Bまで5分間、100%Bで10分間(全て直線)
理論値C24H24O6(M+):408.4438
分子式C24H24O6
トランス−レスベラトロール700mgをエタノール14mlに溶解し、2.5%NaHCO3水溶液を14ml加えて、レスベラトロール含有溶液(pH9.9)を得た。このレスベラトロール含有溶液をオートクレーブ(SANYO LABO AUTOCLAVE)にて130℃、20分間加熱した。次いで、1回目のオートクレーブ処理にて得られた反応溶液に、エタノール14mlと5.0%NaHCO3水溶液を14ml加え、再度、オートクレーブ(SANYO LABO AUTOCLAVE)にて130℃、20分間加熱した。得られた反応溶液のうち1mLをメタノールにて50mlにメスアップし、このうちの10μlをHPLCにより分析し、UHA4002の生成を確認した。HPLC分析は、実施例1と同様の条件で行った。
理論値C28H23O5(M+):439.4792
分子式C28H23O5
トランス−レスベラトロール1g、シナピン酸(和光純薬(株)社製)1gをエタノール20mLに溶解し、ミネラルウォーター20mLを加えて、レスベラトロール、シナピン酸含有溶液(pH=4.9)を得た。このレスベラトロール、シナピン酸含有溶液をオートクレーブにて130℃、90分間加熱した。得られた反応溶液のうち1mLをメタノールにて50mLにメスアップし、このうち10μLをHPLCにより分析し、UHA9021の生成を確認した。HPLC分析は、実施例1と同様の条件で行った。
理論値C22H20O4(M+):348.3918
分子式C22H20O4
ヒトサーチュインSIRT1に対するレスベラトロール誘導体の活性促進作用を評価するために、SIRT1活性測定用キット「SensoLyte(登録商標)Green SIRT1 Assay Kit」(ANASPEC社製)を用いて測定を行った。
37℃ 10分プレインキュベートし、これにサーチュイン基質溶液を50μL添加した(試料終濃度10μM)。化合物コントロールにはコンポーネントD 50μLを添加した。穏やかに30秒程度撹拌し、37℃で60分インキュベートした。
1×デベロッパー溶液を各ウェルに50μLずつ加えた。撹拌・混合後に37℃ 10分インキュベートし、これを蛍光検出器「Thermo Fluoroskan Ascent」(サーモフィッシャーサイエンティフィック(株)製)にて励起波長485nm、測定波長538nmで測定した。得られたデータをもとに、レスベラトロールを添加した条件の活性を100%とし、各試料を添加した条件の活性を算出した。これらの結果を表1に示した。
また、UHA1028、UHA9021についても、同様にして調べたところ、レスベラトロールと同程度のサーチュイン活性促進作用が確認された。
次にヒト細胞におけるサーチュイン遺伝子SIRT1の発現増強作用を評価するために、ヒト臍帯静脈内皮細胞(Huvec)(LONZA(株)社製)を用いたリアルタイムRT−PCR解析を行った。
次にヒト細胞におけるサーチュインタンパク質発現増強作用を評価するために、Huvecを用いたウェスタンブロット解析を行った。
UHA4002の場合、試料添加後に37℃、5%CO2条件下で2時間培養して細胞を回収した。UHA1028、UHA9021の場合には、試料添加後に37℃、5%CO2条件下で8時間培養して細胞を回収した。
プロテアーゼインヒビターカクテル錠「Complete Mini,EDTA−free」(ロシュ・ダイアグノスティックス(株)製)1錠をリン酸緩衝液PBS(Phosphate Buffered Saline)1.5mLに溶解させ、これをプロテアーゼインヒビター溶液とした。PBS850μLにプロテアーゼインヒビター溶液150μLを混合して細胞破砕液を調整した。
変性させたタンパク質サンプルを全量ゲルに供し、200V、30分間電気泳動した。
電気泳動後、セミドライ式ブロッティング装置「TRANS−BLOT S−D SEMI−DRY TRANSFER CELL」(バイオ・ラッド・ラボラトリーズ(株)製)でPVDF膜(ミリポア(株)社製)にブロッティングした。ここから、「Anti−SIRT1 Rabbit monoclonal Antibody」(一次抗体、abcam社製)、「Anti−Rabbit IgG,HRP−linked Antibody」(二次抗体、Cell Signaling社製)を用いた抗体反応によってサーチュインの検出を行った。これらの結果を図2、図3に示した。
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