JP2015018266A - 解析方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】鮮明な画像を短い露出時間で、ひいてはリアルタイムに撮ることができる発光試料撮像方法、発光細胞撮像方法および対物レンズを提供することを課題とする。本発明の発光試料撮像方法では、開口数(NA)および投影倍率(β)で表される(NA÷β)2の値が0.01以上である対物レンズ2と、集光レンズ3と、0℃程度の冷却CCDカメラ4と、モニタ5と、を用いて、発光試料であるサンプル1を短い露出時間で、ひいてはリアルタイムに撮像する。
【選択図】図1
Description
一般に、顕微鏡観察における空間分解能εは、下記数式1で表される。
ε=0.61×λ÷NA ・・・(数式1)
(数式1において、λは光の波長であり、NAは開口数である。)
また、観察範囲の直径dは、下記数式2で表される。
d=D÷M ・・・(数式2)
(数式2において、Dは視野数であり、Mは倍率である。なお、視野数は一般に22から26である。)
従来、顕微鏡用対物レンズの焦点距離は国際規格で45mmとされていた。そして、最近では、焦点距離を60mmとする対物レンズが使われはじめている。この焦点距離を前提にしてNAが大きい、つまり空間分解能が高いレンズを設計すると作動距離(WD)は一般には0.5mm程度であり、また長WD設計のものでも8mm程度であった。このような対物レンズを用いた場合、観察範囲は0.5mm径程度である。
NA'=NA÷β ・・・(数式3)
(数式3において、NAは入射開口角(開口数)であり、NA'は射出開口角であり、βは投影倍率である。)
一般の対物レンズにおいて、NA'は高々0.04であり、NA'2は0.0016である。また、現在市販されている一般的な顕微鏡の対物レンズにおける像の明るさ(NA/β)2の値を調査したところ、図4に示すように、0.0005から0.002の範囲であった。
そこで、光量の少ない発光を画像で観察するためには、大きなNAと小さいβの特性を有する対物レンズが必要である。そして、結果的に、当該対物レンズは大口径となる傾向がある。なお、このような対物レンズでは、励起光投影の機能を考慮することなく機能を単純化して設計、製造しやすくすることが求められる。
図10に示すように、図9の画像Aの発光強度と画像Bの発光強度との間に有意差があること、および図9の画像Bの発光強度と画像Cの発光強度との間に有意差があることを、各画像の発光強度のばらつき(画像の発光強度が取り得る範囲)に基づいて定量的に検出することができた。また、図10において図9の画像Aの発光強度は負の値も含むので、図9の画像Aは発光画像観察に適さないことが図10から分かる。したがって、以上の検討から、対物レンズの(NA/β)2の値が0.01以上であれば、充分且つ確実に細胞の発光画像観察を行うことができることが示された。つまり、細胞の発光画像観察に適する対物レンズの(NA/β)2の値は0.01以上であることが示された。
2 対物レンズ
3 集光レンズ
4 CCDカメラ
5 モニタ
Claims (5)
- 発光試料を撮像する発光試料撮像方法において、
開口数(NA)および投影倍率(β)で表される(NA÷β)2の値が0.01以上である対物レンズを用いること
を特徴とする発光試料撮像方法。 - 前記発光試料は発光タンパク質であること
を特徴とする請求項1に記載の発光試料撮像方法。 - 前記発光タンパク質は、導入された遺伝子から発現されたものであること
を特徴とする請求項2に記載の発光試料撮像方法。 - ルシフェラーゼ遺伝子を導入した発光細胞を撮像する発光細胞撮像方法において、
開口数(NA)および投影倍率(β)で表される(NA÷β)2の値が0.01以上である対物レンズを用いること
を特徴とする発光細胞撮像方法。 - 発光試料を撮像する発光試料撮像方法で用いる対物レンズにおいて、
開口数(NA)および投影倍率(β)で表される(NA÷β)2の値が0.01以上であること
を特徴とする対物レンズ。
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