JP2000308486A

JP2000308486A - 細菌検出法

Info

Publication number: JP2000308486A
Application number: JP2000045025A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Nakayama; 浩中山
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Holdings Corp
Priority date: 1999-02-22
Filing date: 2000-02-22
Publication date: 2000-11-07

Abstract

(57)【要約】【課題】煩雑な作業を必要とすることなく、迅速かつ特
異的に細菌を検出することができる細菌検出法を提供す
ること。【解決手段】測定対象細菌を検出するための方法であっ
て、細菌に特異的に結合しそして増殖するバクテリオフ
ァージを、細菌に結合させる工程であって、ここで、該
バクテリオファージ内に存在している発光タンパク質を
発現する遺伝子が細菌の内部に導入され、細菌の内部で
遺伝子の産物であるタンパク質が産生される、工程；お
よび細菌の外部から非侵襲の状態で外因子を与え、これ
により存在する細菌のみを特異的に発光させる工程を包
含する、方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、発光遺伝子を挿入
したバクテリオファージを用いて、特異的にかつ簡便に
細菌を検出および同定する方法に関する。本発明の方法
は、細菌を測定あるいは検出する手段として利用するこ
とができ、特に環境、食品及び医療の分野に有用であ
る。

【０００２】

【従来の技術】細菌の存在を決定し、そしてそれらの型
を同定する多くの試験が存在する。それらのほとんど
は、未同定の細菌を含有する試料を各種の特定の培地で
培養した後、培養学的特徴、形態学的特徴、生理学的特
徴、抗生物質に対する感受性、種々の着色物質の吸収、
血清学的特徴等を観察することに基づいて行われる。し
かし、これらの従来の方法においては、目的の細菌を選
択的に増殖させ、目的以外の細菌の増殖を妨げるため
に、培地等の選択が必要とされる。このような要求のた
めに、従来の方法では目的の有機体（細菌）を単離した
後、それを同定するためにかなりの時間を要する。

【０００３】上記の問題を解決するために、検出可能な
機能を発現するタンパク質を産生するための外来遺伝子
を細菌に取り込ませ、これを発現させることにより細菌
を検出する方法が開発されている。

【０００４】従来の生物発光を利用した細菌検出法で
は、代表的には、ルシフェラーゼ酵素とその基質である
ルシフェリンとを用いて、細菌由来のアデノシン三リン
酸（ＡＴＰ）の存在下で反応させることにより発光を得
ていた。この従来の方法によれば、あらかじめルシフェ
ラーゼとルシフェリンとを混合した反応溶液を用意して
おき、サンプル（例えば、肉）を破砕した後、この破砕
物あるいは破砕後抽出した溶液に先の反応液を加える。
サンプルに細菌が含まれていれば、発光が観察される。
これは、破砕により、細菌中に含まれていたアデノシン
三リン酸（ＡＴＰ）が菌体外部に漏出して、このＡＴＰ
の作用により先の反応溶液において発光反応が生じるた
めである。発光強度を測定することにより細菌が検出さ
れる。（特開平５−３０９９７号公報を参照のこと）し
かし、この測定系では、サンプルに存在している細菌以
外の細胞由来ＡＴＰも測定してしまう。そのため、誤動
作が生じ易い、あるいは実質的な感度が低下し易いとい
う問題点がある。

【０００５】他方、バクテリオファージなどのベクター
にあらかじめルシフェラーゼを発現する遺伝子を導入
し、このウイルスを細菌に感染させる方法も知られてい
る。この方法では、遺伝子導入の後、ルシフェリンを細
菌の外部から侵襲的に導入させ、細胞内のＡＴＰを利用
した酵素反応によって発光させる。発光強度を測定する
ことにより細菌が検出される（特公平６−３４７５７号
公報を参照のこと）。この技術を用いる場合、ルシフェ
リンの導入を細菌細胞に対して侵襲的な手法によって行
うため、すべての細胞あるいは多くの細胞が破壊され
る。結果として、上述した誤動作および感度低下の問題
を解決するという観点から、必ずしも満足できるもので
はない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記課題の
解決を意図するものであり、発光反応を生じさせるため
の要素を細菌細胞に対して非侵襲的に与えることによっ
て、試料中に存在する特定の細菌種のみを、特異的に、
高感度で、迅速かつ確実に検出および同定する方法を提
供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明の方法を用いれ
ば、細菌を破砕しあるいは傷つけることがなく、そし
て、細菌の内部のみで発光反応を生じさせ得る。そのた
め、誤動作がなくかつ高感度な細菌の測定ができる。従
って、本発明の方法によって、煩雑な作業を必要とする
ことなく、迅速かつ特異的に細菌を検出および同定する
ことが可能となる。

【０００８】特に、発光タンパク質として、グリーンフ
ルオレセントプロテインなどの、発光のために基質を必
要としないタンパク質を使用することによって、ルシフ
ェラーゼ−ルシフェリン系を利用する（上記）方法の欠
点である、細菌の外部から侵襲的に外因子を与える工程
を容易に省略することができる。

【０００９】本発明により、測定対象細菌を検出および
同定するための方法が提供される。この方法は、以下の
工程を包含する：上記細菌に特異的に結合しそして増殖
するバクテリオファージを、上記細菌に結合させる工程
（ここで、上記バクテリオファージ内に存在している発
光タンパク質を発現する遺伝子が上記細菌の内部に導入
され、上記細菌の内部で上記遺伝子の産物であるタンパ
ク質が産生される）；および、上記細菌の外部から非侵
襲の状態で外因子を与える工程（これにより存在する上
記細菌のみを特異的に発光させる）である。

【００１０】１つの実施態様において、測定対象である
上記細菌は以下からなる群から選択される：ロドスピリ
ルム、クロマチウム、クロロビウム、ミクソコッカス、
アルカンギウム、シストバクター、ポリアンギウム、サ
イトファーガ、ベギアトア、シモンシエラ、リューコト
リックス、アクロマチウム、ペロネーマ、スピロヘー
タ、スピリルム、シュードモナス、アゾトバクター、リ
ゾビウム、メチロモナス、ハロバクテリウム、腸内細
菌、ヴィブリオ、バクテロイデス、ナイセリア、ヴェイ
ヨネラ、アンモニアまたは亜硝酸酸化細菌、硫黄代謝細
菌、酸化鉄および／または酸化マンガン沈着細菌、シデ
ロカプサ、メタノバクテリウム、好気性および／または
通性嫌気性ミクロコッカス、ストレプトコッカス、嫌気
性ペプトコッカス、バチルス、乳酸桿菌、コリネフォル
ム細菌、プロピオン酸菌、アクチノミセス、マイコバク
テリウム、フランキア、アクチノプラーネス、デルマト
フィルス、ノカルディア、ストレプトミセス、ミクロモ
ノスポラ、リケッチア、バルトネラ、アナプラズマ、ク
ラミディア、マイコプラズマ、およびアコレプラズマ
属。

【００１１】１つの実施態様において、上記バクテリオ
ファージは以下からなる群から選択される：Ｔ４、Ｐ
２、Ｔ２、Ｔ７、λ、ＭＶ−Ｌ２、ＰＲＤ１、ＰＭ２、
ＭＶ−Ｌ１、φＸ１７４、ｆｄ、ＭＳ２、φ6、ＦＥＬ
ＩＸ０１、およびＧ４７。

【００１２】１つの実施態様において、上記の発光タン
パク質は、グリーンフルオレセントプロテイン（ＧＦ
Ｐ）、またはブルーフルオレセントプロテイン（ＢＦ
Ｐ）である。

【００１３】１つの実施態様において、本発明の方法で
使用される上記外因子は光である。

【００１４】

【発明の実施の形態】本発明の測定対象細菌を検出およ
び同定する方法は、細菌にバクテリオファージ（以下、
単に「ファージ」ともいう）を結合させ、予めファージ
内に存在している発光タンパク質を発現する遺伝子を細
菌の内部に導入する工程（結合工程）と、その後、細菌
の外部から外因子を与えて、当該細菌のみを特異的に発
光させる工程（発光工程）とを含む。すなわち、結合工
程において、発光タンパク質をコードする遺伝子を有す
るバクテリオファージを細菌に感染させる。上記結合工
程は、感染したファージを宿主細菌内で増殖させること
をさらに包含し得、それによって発光タンパク質をコー
ドする遺伝子を増幅し得る。感染ファージは、宿主であ
る細菌細胞が破壊される直前まで、通常、少なくとも約
１０²個〜１０⁴個ファージ粒子／細菌細胞まで増殖し
得、そしてそれ故、発光タンパク質遺伝子が少なくとも
約１０²〜１０⁴倍増幅され得ることになる。この遺伝子
から産生された発光タンパク質を、次の発光工程におい
て、外因子を与えることにより発光させ、目的とする細
菌を検出する。

【００１５】本発明の方法により測定可能な対象細菌の
限定的ではない例としては、以下のものが挙げられる：
Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ（ロドスピリル
ム）、Ｃｈｒｏｍａｔｉａｃｅａｅ（クロマチウム）、
Ｃｈｌｏｒｏｂｉａｃｅａｅ（クロロビウム）、Ｍｙｘ
ｏｃｏｃｃａｃｅａｅ（ミクソコッカス）、Ａｒｃｈａ
ｎｇｉａｃｅａｅ（アルカンギウム）、Ｃｙｓｔｏｂａ
ｃｔｅｒａｃｅａｅ（シストバクター）、Ｐｏｌｙａｎ
ｇｉａｃｅａｅ（ポリアンギウム）、Ｃｙｔｏｐｈａｇ
ａｃｅａｅ（サイトファーガ）、Ｂｅｇｇｉａｔｏａｃ
ｅａｅ（ベギアトア）、Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａｃｅａ
ｅ（シモンシエラ）、Ｌｅｕｃｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ
（リューコトリックス）、Ａｃｈｒｏｍａｔｉａｃｅａ
ｅ（アクロマチウム）、Ｐｅｌｏｎｅｍａｔａｃｅａｅ
（ペロネーマ）、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａｃｅａｅ（ス
ピロヘータ）、Ｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ（スピリル
ム）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ（シュードモ
ナス）、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ（アゾトバ
クター）、Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ（リゾビウム）、
Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ（メチロモナ
ス）、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（ハロバクテ
リウム）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（腸
内細菌）、Ｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ（ヴィブリオ）、
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ（バクテロイデス）、Ｎ
ｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ（ナイセリア）、Ｖｅｉｌｌ
ｏｎｅｌｌａｃｅａｅ（ヴェイヨネラ）、アンモニアま
たは亜硝酸酸化細菌（Ｏｒｇａｎｉｓｍｓｏｘｉｄｉ
ｚｉｎｇａｍｍｏｎｉａｏｒｎｉｔｒｉｔｅ）、
硫黄代謝細菌（Ｏｒｇａｎｉｓｍｓｍｅｔａｂｏｌｉ
ｚｉｎｇｓｕｌｆｅｒａｎｄｓｕｌｆｅｒｃｏｍ
ｐｏｕｎｄｓ）、酸化鉄および／または酸化マンガン沈
着細菌（Ｏｒｇａｎｉｓｍｓｄｅｐｏｓｉｔｉｎｇｉ
ｒｏｎａｎｄ／ｏｒｍａｎｇａｎｅｓｅｏｘｉｄ
ｅｓ）、Ｓｉｄｅｒｏｃａｐｓａｃｅａｅ（シデロカプ
サ）、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（メタ
ノバクテリウム）、好気性および／または通性嫌気性
（Ａｅｒｏｂｉｃａｎｄ／ｏｒｆａｃｕｌｔａｔｉｖ
ｅｌｙａｎａｅｒｏｂｉｃ）Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃ
ｅａｅ（ミクロコッカス）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａ
ｃｅａｅ（ストレプトコッカス）、嫌気性（Ａｎａｅｒ
ｏｂｉｃ）、Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ（ペプトコ
ッカス）、Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ（バチルス）、Ｌａ
ｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ（乳酸桿菌）、コリネフ
ォルム細菌（Ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍｇｒｏｕｐｏｆ
ｂａｃｔｅｒｉａ）、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒ
ｉａｃｅａｅ（プロピオン酸菌）、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃ
ｅｔａｃｅａｅ（アクチノミセス）、Ｍｙｃｏｂａｃｔ
ｅｒｉａｃｅａｅ（マイコバクテリウム）、Ｆｒａｎｋ
ｉａｃｅａｅ（フランキア）、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎａ
ｃｅａｅ（アクチノプラーネス）、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈ
ｉｌａｃｅａｅ（デルマトフィルス）、Ｎｏｃａｒｄｉ
ａｃｅａｅ（ノカルディア）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｔａｃｅａｅ（ストレプトミセス）、Ｍｉｃｒｏｍｏｎ
ｏｓｐｏｒａｃｅａｅ（ミクロモノスポラ）、Ｒｉｃｋ
ｅｔｔｓｉａｃｅａｅ（リケッチア）、Ｂａｒｔｏｎｅ
ｌｌａｃｅａｅ（バルトネラ）、Ａｎａｐｌａｓｍａｔ
ａｃｅａｅ（アナプラズマ）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｃｅ
ａｅ（クラミディア）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｔａｃｅ
ａｅ（マイコプラズマ）、およびＡｃｈｏｌｅｐｌａｓ
ｍａｔａｃｅａｅ（アコレプラズマ）属。このように、
本発明においては、ファージに感染するいわゆるファー
ジ型細菌のいずれもが測定対象細菌となり得る。

【００１６】本発明を実施するに当っては、上記のよう
な測定対象細菌に対して特異的に結合しそして増殖する
性質を有するファージを選ぶことが所望される。対象細
菌に特異的に結合するファージ、つまりファージと細菌
の特定の特異的な組み合わせは当該分野で公知である。

【００１７】有用なファージは、例えば、Ａｍｅｒｉｃ
ａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
（ＡＴＣＣ）から入手可能である。入手可能な株の詳細
は、例えば、ＡＴＣＣによる「Ｃａｔａｌｏｇｕｅｏ
ｆＢａｃｔｅｒｉａ＆Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ
ｓ」に公表されている。

【００１８】自然界に存在する利用可能なバクテリオフ
ァージの限定的でない例としては、Ｔ４、Ｐ２、Ｔ２、
Ｔ７、λ、ＭＶ−Ｌ２、ＰＲＤ１、ＰＭ２、ＭＶ−Ｌ
１、φＸ１７４、ｆｄ、ＭＳ２、φ6、ＦＥＬＩＸ０
１、およびＧ４７が挙げられる。これらの各ファージに
ついて、それぞれ特異的に結合する細菌が知られてい
る。例えば、Ｔ４、Ｐ２、Ｔ２、Ｔ７、λ、φＸ１７
４、およびＭＳ２ファージは、腸内細菌、例えば、大腸
菌を検出する場合に望ましいファージの例である。φ６
およびＰＭ２は、シュードモナスを検出する場合に望ま
しいファージの例である。ＦＥＬＩＸ０１は、サルモネ
ラ菌を検出する場合に望ましいファージの例である。

【００１９】寄託された公知のファージに加えて、適切
な環境からファージを単離することによっても、所望の
ファージを入手し得る。適切な環境とは、好ましくは、
測定対象細菌自体が見出される環境である。ファージを
単離するための技術は、当業者に公知である（例えば、
ＬｏｅｓｓｎｅｒおよびＢｕｓｓｅ、Ａｐｐｌｉｅｄａ
ｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｙ、第５６巻、第１９１２〜１９１８頁（１９９
０）、および「Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ」Ｉｎｔ
ｅｒｓｃｉｅｎｃｅＩｎｃ．第４４７〜４５５頁
（１９５９）を参照のこと）。

【００２０】これらのファージまたはその他のウィルス
を、測定対象細菌に特異的に結合しそして増殖し得るよ
うに改変して使用することも可能である。例えば、クロ
ーニング用に改良されたファージ（例えば、ＥＭＢＬ
３、ＥＭＢＬ４）が市販されている。ファージまたはそ
の他のウイルスを組換えＤＮＡ技術を用いて改変する手
法は当業者に公知である。

【００２１】異質ＤＮＡが、いくつかの方法でベクター
中に導入され得る。例えば、発光に寄与するタンパク質
をコードする遺伝子が、当業者に公知の方法でバクテリ
オファージのＤＮＡ中に導入され得る。

【００２２】細菌にバクテリオファージを感染させるた
めの手法としては、当該分野で公知の通常の感染条件が
使用され得る。ファージの感染は非常に株または種特異
的であるので、目的の遺伝子（ＤＮＡ）を所定の細菌細
胞中に導入し得るか否かは、通常、ファージの種類によ
って限定される。一部のファージは、密接に関係するバ
クテリアのいくつかの種を感染し得る。大部分は、単一
種の株のみを感染することが知られている。したがっ
て、このようなファージの公知の感染スペクトルを考慮
し、特定のファージを選択することによって、試料中に
存在する特定の株または細菌種を特異的に同定すること
が可能である。

【００２３】任意の検出可能な機能をコードするＤＮＡ
を有するベクターを、バクテリオファージの感染によっ
て標的の細菌に取り込ませ、これを発現させることによ
って検出可能な機能を有する標的の細菌のみを検出し得
る。代表的には、本発明に好ましい検出可能な機能は発
光、特に蛍光であるが標的の細菌に取り込ませ、発現さ
れる限りこれに限定されない。発光タンパク質として、
例えば、グリーンフルオレセントプロテイン（ＧＦＰ）
およびブルーフルオレセントプロテイン（ＢＦＰ）など
が用いられ得る。本発明に特に好ましい発光タンパク質
は、ＧＦＰである。上記検出可能な機能を誘発する外因
子は、発光タンパク質の場合には光である。但し、外因
子として光に限定されないことはいうまでもない。用い
る検出可能な機能に応じて、音、電磁波、磁気、圧力な
どの適切な外因子を用い得る。

【００２４】ＧＦＰは、オワンクラゲが産生する発光タ
ンパク質であり、発光のために基質を必要としない。そ
の遺伝子はオワンクラゲからクローニングされており、
２３８アミノ酸残基からなる分子量２６，９００のタン
パク質である。オワンクラゲの体内では、ＧＦＰは、別
の発光タンパク質であるエクオリンが出す青色の蛍光を
うけて、緑色の蛍光を出す。励起スペクトルのピークは
５０８ｎｍである。ＧＦＰを有するように形質転換され
た大腸菌、酵母など形質転換体に適切な波長の励起光を
照射すれば、発光が生じる。

【００２５】発光タンパク質を発現する遺伝子におい
て、発光タンパク質をコードする構造遺伝子は、天然由
来の遺伝子および合成遺伝子のいずれであってもよい。
ＧＦＰまたはＢＦＰと同様の発光特性を有する他の発光
タンパク質もまた、本発明において好ましく利用し得
る。

【００２６】このようにして発光させた細菌の検出に
は、フォトメーター、ケミルミネッセンスリーダー、シ
ンチレーションカウンター、ルミノメーターなどの公知
の手段を使用することができる。これらの装置により、
発光反応によって生成される光子量を測定する事が可能
である。また、高感度フィルム（例えば、ポラロイド社
（６１１，６６７）、アマシャム社（ハイパーフィルム
ＭＰ）、フジフィルム（Ｘ線フィルムＲＸ）などから市
販されている）に感光させること、および高感度ビデオ
カメラを用いた画像解析によって検出することもまた可
能である。

【００２７】本発明の方法によれば、所望の発光タンパ
ク質をコードする遺伝子を、測定対象細菌に特異的に結
合しそして増殖するバクテリオファージに組み込み、こ
のファージと測定対象細菌とを適当な温度下（１０〜４
０℃）で混合することによって細菌にファージを感染さ
せる。その後、外因子を加えることにより、測定対象細
菌が検出される。

【００２８】本発明の方法によれば、標的細菌の存在の
有無を検出するだけでなく、細菌濃度と検出される光子
量との関係を示す標準曲線を作製することによって、光
子量の計測に基づく標的細菌の定量もまた可能となる。

【００２９】以下に、本発明の実施の具体例として、発
光タンパク質としてグリーンフルオレセントプロテイン
（ＧＦＰ）を使用する細菌検出方法を記載する。バクテ
リオファージとしてＦＥＬＩＸ０１を用いて、ＦＥＬＩ
Ｘ０１ファージが特異的に結合し得る測定対象細菌であ
るサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍ
ｕｒｉｕｍＳＬ１０２７株）を測定した。いうまでも
なく、以下の実施例は例示であり、本発明を限定するも
のではない。

【００３０】

【実施例】１．培地栄養培地（ｎｕｔｒｉｅｎｔｂｒｏｔｈｎｏ．２、
八洲薬品より入手）を細菌の培養に使用した。バクテリ
オファージ溶液の調製には、栄養培地に０．１５ｇ／Ｌ
のＣａＣｌ₂を添加した培養液を使用した。ＣａＣｌ₂含
有培養液のｐＨは、７．０に調整した。バクテリオファ
ージの培養および力価測定は、栄養培地に１．５％の寒
天を添加した寒天培地上で行った。

【００３１】２．細菌Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍＳＬ１０２７株を、ア
メリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）か
ら入手した。

【００３２】３．バクテリオファージストックの調製ＦＥＬＩＸ０１バクテリオファージを、Ｂ．Ａ．Ｄ．
Ｓｔｏｃｋｅｒ，ＳｔａｎｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ，Ｃａｌｉｆ．から入手
した。ＦＥＬＩＸ０１バクテリオファージをサルモネラ
ＳＬ１０２７株に感染させ、栄養培地寒天の表面で感染
株を培養することによって増殖させた。培地の表面に
０．００５Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を
流し込み、これを回収することによって、ファージを収
集した。０℃にて３０分間の１５，０００×ｇでの遠心
分離によって細菌および寒天の破片を除去した。次い
で、１５℃にて９０分間の６２，０００×ｇでの遠心分
離によってセシウムクロライド−エチジウムブロマイド
密度勾配（１．７および１．５ｇ／ｃｍ³）中で、ファ
ージを濃縮した。紫外線照射して可視化されたバクテリ
オファージの部分を、遠心分離ポリアロマーチューブの
側部から注射針を差し込んで採集した。０．００５Ｍの
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して一晩透析
して、ＣｓＣｌを除去した。

【００３３】４．ＦＥＬＩＸ０１バクテリオファージＤ
ＮＡの調製ｓｓＰＨＡＧＥ^TM ＤＮＡＳＰＩＮキット（ＢＩＯ
１０１）はＰＥＧ沈殿法を用いて一本鎖ＤＮＡを単離す
るためのキットである。このキットを用いて、上記のバ
クテリオファージストックからDNAを単離した。得られ
た一本鎖ＤＮＡを鋳型として用いて、ランダムプライマ
ーを使用してＰＣＲ反応を行い、二本鎖のバクテリオフ
ァージＤＮＡを得た。

【００３４】５．ＦＥＬＩＸ０１バクテリオファージＤ
ＮＡへのＧＦＰ遺伝子の挿入上記で得られたＦＥＬＩＸ０１ファージＤＮＡを制限酵
素ＨｉｎｄＩＩＩで切断した。同じＨｉｎｄＩＩＩで切
断したオワンクラゲＡｅｑｕｏｒｅａｖｉｃｔｏｒｅ
ａ由来のＧＦＰの約１．１ｋｂの遺伝子断片をリガーゼ
を用いて互いに連結した。このようにして、ＧＦＰ遺伝
子を含む組換えファージＤＮＡを作製した。

【００３５】６．GFP遺伝子を含むＦＥＬＩＸ０１ファ
ージ粒子の生成細菌ウイルスタンパク質混合液にＤＮＡを加えて試験管
内で感染性ファージ粒子を得る、インビトロパッケージ
ング法（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆｔ
ｈｅＧｅｎｅ，ＪａｍｅｓＤ．Ｗａｔｓｏｎ
ら、１９８８）を使用して上記の組換えファージＤＮＡ
からファージ粒子を得た。得られたファージ粒子を、バ
クテリオファージストックの調製の節に記載したよう
に、増殖させ、そして精製した。このバクテリオファー
ジをすぐに使用しない場合は、液体窒素の上方に配置し
た低温試験管中で無菌溶解物として貯蔵した。

【００３６】７．ファージ粒子でのサルモネラＳＬ１０
２７株の感染サルモネラＳＬ１０２７株を、ｎｕｔｒｉｅｎｔ培地中
で、ＧＦＰ遺伝子を含むＦＥＬＩＸ０１ファージに感染
させた。１２５ｍｌの三角フラスコに１０ｍｌの培地を
入れた。この培地にサルモネラＳＬ１０２７株を接種
し、そして１０⁴〜１０⁶細胞／ｍｌになるまで、３７℃
の水浴中で浸透しながらインキュベートした。次いで、
同じフラスコに、３×１０⁸ＰＦＵ／ｍｌの濃度になる
ようにファージ粒子を添加した。コントロールとして、
サルモネラ菌を含まないフラスコについても同時に実験
を行った。

【００３７】これらのフラスコを振盪機を備えた３７℃
の水浴中で２００ｒｐｍで振盪しながらインキュベート
した。２時間後、フラスコ中の培養液の蛍光を測定し
た。

【００３８】８．発光の測定各培養液から５０μｌのサンプルを採取して、１から１
０³細胞／ｍｌの細胞濃度になるように段階希釈してポ
リスチレンキュベットに入れ、測定機器に備えた温度制
御されたキュベットホルダーに配置して、分光光度法測
定を行った。蛍光を３９６ｎｍでの励起波長を用いて４
９０〜５２０ｎｍで、ＳＬＭＡｍｉｎｃｏＢｏｗｍ
ａｎＡＢ２蛍光光度計（Ｆｉｓｈｅｒ；Ｐｉｔｔｓｂ
ｕｒｇｈ，ＰＡ；カタログ＃１４３８５９９１Ｆ）を使
用して測定した。

【００３９】サルモネラ菌を含むフラスコおよびサルモ
ネラ菌を含まないフラスコの両方に関して蛍光を測定し
た。サルモネラ菌を含まない管から得られた測定値をバ
ックグラウンドとして、サンプル培養物管から得られた
測定値から減算し、得られた値を、発光量としてサルモ
ネラ菌濃度に対してプロットした（図１）。

【００４０】

【発明の効果】以上のように本発明により、高感度に、
高い信頼性で細菌を検出できる細菌検出法を得ることが
できる。

【００４１】本発明の方法を利用することにより、煩雑
な作業を必要とすることなく、迅速かつ特異的に細菌を
検出および測定することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、サルモネラ菌の検出結果を示す図であ
る。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】測定対象細菌を検出するための方法であ
って、該細菌に特異的に結合しそして増殖するバクテリ
オファージを、該細菌に結合させる工程であって、ここ
で、該バクテリオファージ内に存在している発光タンパ
ク質を発現する遺伝子が該細菌の内部に導入され、該細
菌の内部で該遺伝子の産物であるタンパク質が産生され
る、工程；および該細菌の外部から非侵襲の状態で外因
子を与え、これにより存在する該細菌のみを特異的に発
光させる、工程、を包含する、方法。
【請求項２】前記細菌が、ロドスピリルム、クロマチ
ウム、クロロビウム、ミクソコッカス、アルカンギウ
ム、シストバクター、ポリアンギウム、サイトファー
ガ、ベギアトア、シモンシエラ、リューコトリックス、
アクロマチウム、ペロネーマ、スピロヘータ、スピリル
ム、シュードモナス、アゾトバクター、リゾビウム、メ
チロモナス、ハロバクテリウム、腸内細菌、ヴィブリ
オ、バクテロイデス、ナイセリア、ヴェイヨネラ、アン
モニアまたは亜硝酸酸化細菌、硫黄代謝細菌、酸化鉄お
よび／または酸化マンガン沈着細菌、シデロカプサ、メ
タノバクテリウム、好気性および／または通性嫌気性ミ
クロコッカス、ストレプトコッカス、嫌気性ペプトコッ
カス、バチルス、乳酸桿菌、コリネフォルム細菌、プロ
ピオン酸菌、アクチノミセス、マイコバクテリウム、フ
ランキア、アクチノプラーネス、デルマトフィルス、ノ
カルディア、ストレプトミセス、ミクロモノスポラ、リ
ケッチア、バルトネラ、アナプラズマ、クラミディア、
マイコプラズマ、およびアコレプラズマ属からなる群か
ら選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記バクテリオファージが、Ｔ４、Ｐ
２、Ｔ２、Ｔ７、λ、ＭＶ−Ｌ２、ＰＲＤ１、ＰＭ２、
ＭＶ−Ｌ１、φＸ１７４、ｆｄ、ＭＳ２、φ6、ＦＥＬ
ＩＸ０１、およびＧ４７からなる群から選択される、請
求項１に記載の方法。
【請求項４】前記発光タンパク質が、グリーンフルオ
レセントプロテイン（ＧＦＰ）、またはブルーフルオレ
セントプロテイン（ＢＦＰ）である、請求項１に記載の
方法。
【請求項５】前記外因子が光である、請求項１に記載
の方法。
【請求項６】試料中に存在する細菌を同定するための
方法であって、該細菌に特異的に結合しそして増殖するバクテリオファ
ージを、該細菌に結合させる工程であって、ここで、該
バクテリオファージ内に存在している発光タンパク質を
発現する遺伝子が該細菌の内部に導入され、該細菌の内
部で該遺伝子の産物であるタンパク質が産生される、工
程；および該細菌の外部から非侵襲の状態で外因子を与
え、これにより存在する該細菌のみを特異的に発光させ
る、工程、を包含する、方法。