JP2014518312A - Ｓｍｂ方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）生成物を供給混合液から回収するためのクロマトグラフィー分離方法であって、溶離剤として水性有機溶媒を含む複数の連結したクロマトグラフィーカラムを有する擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置に供給混合液を導入することを含み、装置が、少なくとも第一ゾーンおよび第二ゾーンを含む複数のゾーンを有し、各ゾーンが、前記複数の連結したクロマトグラフィーカラムから液体が収集され得る抽出液流および抽残液流を有し、（ａ）より極性が高い成分とともにＰＵＦＡ生成物を含む抽残液流が第一ゾーンのカラムから収集され、第二ゾーンの隣接していないカラムに導入され、かつ／または（ｂ）より極性が低い成分とともにＰＵＦＡ生成物を含む抽出液流が第二ゾーンのカラムから収集され、第一ゾーンの隣接していないカラムに導入され、前記ＰＵＦＡ生成物が供給混合液の異なる成分から各ゾーンで分離され、水性有機溶媒が水性アルコール以外である方法を提供する。

Description

本発明は、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）およびその誘導体を精製するための改善されたクロマトグラフィー分画方法に関する。特に、本発明は、ＰＵＦＡおよびその誘導体を精製するための、改善された擬似または実移動床式クロマトグラフィー分離方法に関する。

脂肪酸、特にＰＵＦＡおよびその誘導体は生物学的に重要な分子の前駆物質であり、それらは、血小板凝集、炎症および免疫応答などの生物機能の調節において重要な役割を果たす。したがって、ＰＵＦＡおよびその誘導体は、ＣＮＳ状態；糖尿病性神経症を含めた神経障害；心血管疾患；炎症性皮膚疾患を含めた全身免疫系および炎症状態が含まれる幅広い病態を治療する上で、治療的に有用であり得る。

ＰＵＦＡは、植物油および海産油などの天然原料に見出される。しかし、そうしたＰＵＦＡは、飽和脂肪酸および多くの他の不純物との混合状態でそうした油中に存在することが多い。したがって、ＰＵＦＡは、栄養学的または医薬的に使用する前に、望ましくは精製されるべきである。

残念ながらＰＵＦＡは極めて脆弱である。したがって、酸素の存在下で加熱すると、それらは、異性化、過酸化およびオリゴマー化しやすい。したがって、純粋な脂肪酸を調製するためのＰＵＦＡ生成物の分画および精製は困難である。真空下でさえ、許容できない生成物分解が蒸留によって起こり得る。

擬似および実移動床式クロマトグラフィーは既知の手法であり、当業者に熟知されている。動作の原理は、液体溶離剤相および固体吸着剤相の向流移動を含む。この動作によって、この方法を経済的に実行可能なものとする、溶媒の最小限の使用が可能になる。そうした分離技術は、炭化水素、工業化学物質、油、糖およびＡＰＩを含めた多様な分野において、いくつかの適用を見出してきた。そうした分離技術は、ＰＵＦＡおよびその誘導体を精製するのにも適用されてきた。

良く知られているように、従来の固定床式クロマトグラフィーシステムでは、成分が分離される混合液が容器に浸透する。この容器は、通常円筒形であり、典型的にはカラムと称される。カラムは、高い流体透過性を示す、（通常、固定相と呼ばれる）多孔性材料の充填物を含む。混合液の各成分の浸透速度はその成分の物理的性質に依存し、その結果連続的におよび選択的にカラムから成分が出る。したがって、固定相に強く固定する傾向があるために緩徐に浸透する成分もあれば、弱く固定する傾向があり、カラムからより急速に出る成分もある。多くの異なる固定床式クロマトグラフィーシステムが提案されており、分析および工業生産の両方の目的に使用されている。

それとは対照的に、擬似移動床式システムは、互いに連続してつながれた、吸着剤を含むいくつかの個々のカラムからなる。溶離剤は、第一の方向でカラムを通過させられる。このシステムの供給原料および溶離剤の注入ポイントならびに分離した成分の収集ポイントは、一連の弁によって周期的にシフトされる。全体的な効果は、固形吸着剤の移動床を含む単一カラムの動作を擬似することである。したがって、擬似移動床システムは、従来の固定床式システムのように、溶離剤が通過させられる固形吸着剤の固定床を含むカラムからなるが、擬似移動床システムでは、動作は、連続向流移動床を擬似するようなものである。

擬似移動床式クロマトグラフィーのための方法および設備は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２，９８５，５８９、ＵＳ３，６９６，１０７、ＵＳ３，７０６，８１２、ＵＳ３，７６１，５３３、ＦＲ−Ａ−２１０３３０２、ＦＲ−Ａ−２６５１１４８およびＦＲ−Ａ−２６５１１４９を含めたいくつかの特許に記載されている。このトピックは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、「Preparative and Production Scale Chromatography」、GanetsosおよびBarker編、Marcel Dekker Inc、New York、1993においても詳細に論じられている。

実移動床式システムは、擬似移動床システムに動作が類似している。しかし、供給混合液および溶離剤の注入ポイントならびに分離した成分の収集ポイントを弁のシステムによってシフトするのではなく、その代わりに、一連の吸着ユニット（すなわちカラム）を供給および排出ポイントに対して物理的に移動する。重ねて、動作は連続向流移動床を擬似するようなものである。

実移動床式クロマトグラフィーのための方法および設備は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ６，９７９，４０２、ＵＳ５，０６９，８８３およびＵＳ４，７６４，２７６を含めたいくつかの特許に記載されている。

擬似および実移動床式技術は、通常、二成分混合液を分離することのみに適する。したがって、より極性が高い成分は溶離剤とともに移動し、抽残液流として収集されることになり、より極性が低い成分は吸着剤とともに移動し、抽出液流として収集されることになる。したがって、擬似または実移動床式技術を使用して、極性および非極性の両方の不純物を含む粗製の混合液から所望の生成物を分離することは難しい。このことによって、例えば、魚油からＰＵＦＡ生成物を精製する際のそうした手法の適用性が制限される。

したがって、従来、擬似または実移動床式技術を使用してＰＵＦＡを天然油から分離する場合は、通常、擬似または実移動床式技術を使用して得られる中間生成物を精製する前に、天然油を予備的な分離ステップ（例えば固定カラムクロマトグラフィー）にかけることが最初に必要である（例えばＥＰ−Ａ−０６９７０３４を参照されたい）。典型的には、最初の精製ステップによって極性または非極性成分が除去されることにより、本質的に二成分の混合液が作られ、次いでこれは、移動床式クロマトグラフィーにかけられる。

二成分混合液を分離するこの方法を、図１を参照して例示する。擬似または実連続向流クロマトグラフィー分離方法のコンセプトは、複数のセクションに、より正確には、カラムの底部から頂部に至る、重ねられた４つのサブゾーンＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶに分けられた固定相Ｓを含む垂直のクロマトグラフィーカラムを考えることによって説明される。溶離剤は、ポンプＰによってＩＥにおいて底部で導入される。分離すべき成分ＡおよびＢの混合液は、サブゾーンＩＩとサブゾーンＩＩＩの間のＩＡ＋Ｂで導入される。主にＢを含む抽出液は、サブゾーンＩとサブゾーンＩＩの間のＳＢで収集され、主にＡを含む抽残液はサブゾーンＩＩＩとサブゾーンＩＶの間のＳＡで収集される。

擬似移動床システムの場合は、固定相Ｓの擬似下方移動は、導入および収集ポイントが固相に対して移動することによって引き起こされる。実移動床式システムの場合は、固定相Ｓの下方移動は、様々なクロマトグラフィーカラムが導入および収集ポイントに対して移動することによって引き起こされる。図１では、溶離剤は上方に流れ、混合液Ａ＋ＢはサブゾーンＩＩとサブゾーンＩＩＩの間に注入される。成分は、クロマトグラフィーの固定相とのその相互作用、例えば多孔性媒体への吸着に従って移動することになる。固定相に対してより強い親和性を示す成分Ｂ（より緩徐な移動成分）はより緩徐に溶離剤によって引きずられ、遅れてその後に続くことになる。固定相に対してより弱い親和性を示す成分Ａ（より速い移動成分）は、溶離剤によって容易に引きずられることになる。適切なパラメーターセット、特に各ゾーンの流速が正確に推定および制御される場合は、固定相に対してより弱い親和性を示す成分Ａは、サブゾーンＩＩＩとサブゾーンＩＶの間に抽残液として収集されることになり、固定相に対してより強い親和性を示す成分Ｂは、サブゾーンＩとサブゾーンＩＩの間に抽出液として収集されることになる。

したがって、図１に概略的に図示する従来の移動床システムは二成分分画に限定されることが認識されるであろう。

したがって、より急速なおよびより緩徐な移動成分の両方（すなわち、より極性が高いおよびより極性が低い不純物）からＰＵＦＡまたはその誘導体を分離して本質的に純粋なＰＵＦＡまたはその誘導体を生成することができる、単一の擬似または実移動床式クロマトグラフィー分離方法が必要である。この方法が標準的な温度および圧力条件下で動作する安価な溶離剤を含んでいることは、さらに望ましい。

水性有機溶媒の溶離剤を使用する単一の擬似または実移動床式装置を用いてＰＵＦＡ生成物を効率的に精製できることが、驚いたことに今や見出されている。したがって、本発明は、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）生成物を供給混合液から回収するためのクロマトグラフィー分離方法であって、溶離剤として水性有機溶媒を含む複数の連結したクロマトグラフィーカラムを有する擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置に供給混合液を導入することを含み、装置が、少なくとも第一ゾーンおよび第二ゾーンを含む複数のゾーンを有し、各ゾーンが、前記複数の連結したクロマトグラフィーカラムから液体が収集され得る抽出液流および抽残液流を有し、（ａ）より極性が高い成分とともにＰＵＦＡ生成物を含む抽残液流が第一ゾーンのカラムから収集され、第二ゾーンの隣接していないカラムに導入され、かつ／または（ｂ）より極性が低い成分とともにＰＵＦＡ生成物を含む抽出液流が第二ゾーンのカラムから収集され、第一ゾーンの隣接していないカラムに導入され、前記ＰＵＦＡ生成物が供給混合液の異なる成分から各ゾーンで分離され、水性有機溶媒が水性アルコール以外である方法を提供する。

本発明の方法によって得られるＰＵＦＡ生成物も提供する。

本発明の方法によって生成されるＰＵＦＡ生成物は、高い収率で生成され、高純度である。さらに、典型的には、ＰＵＦＡの蒸留から発生する特有の不純物の含有量は非常に低い。本明細書で使用する場合、用語「異性体不純物」は、典型的には、ＰＵＦＡ含有天然油を蒸留する間に生成される不純物を意味するのに使用される。これらには、ＰＵＦＡ異性体、過酸化およびオリゴマー化生成物が含まれる。

二成分混合液を分離するための擬似または実移動床式方法の基本原理を図示する図である。 より急速なおよびより緩徐な移動成分（すなわち、より極性が高いおよびより極性が低い不純物）からＥＰＡを分離するのに適した本発明の第一の好ましい実施形態を図示する図である。 より急速なおよびより緩徐な移動成分（すなわち、より極性が高いおよびより極性が低い不純物）からＤＨＡを分離するのに適した本発明の第二の好ましい実施形態を図示する図である。 より急速なおよびより緩徐な移動成分（すなわち、より極性が高いおよびより極性が低い不純物）からＥＰＡを分離するのに適した本発明の第一の好ましい実施形態をより詳細に図示する図である。 より急速なおよびより緩徐な移動成分（すなわち、より極性が高いおよびより極性が低い不純物）からＤＨＡを分離するのに適した本発明の第二の好ましい実施形態をより詳細に図示する図である。 より急速なおよびより緩徐な移動成分（すなわち、より極性が高いおよびより極性が低い不純物）からＥＰＡを分離するのに適した本発明の第一の好ましい実施形態の代替方法をより詳細に図示する図である。 より急速なおよびより緩徐な移動成分（すなわち、より極性が高いおよびより極性が低い不純物）からＤＨＡを分離するのに適した本発明の第二の好ましい実施形態の代替方法をより詳細に図示する図である。 より急速なおよびより緩徐な移動成分（すなわち、より極性が高いおよびより極性が低い不純物）からＥＰＡを精製するための本発明の特に好ましい実施形態を図示する図である。 より急速なおよびより緩徐な移動成分（すなわち、より極性が高いおよびより極性が低い不純物）からＥＰＡを精製するための本発明の特に好ましい実施形態の代替方法を図示する図である。 より急速なおよびより緩徐な移動成分（すなわち、より極性が高いおよびより極性が低い不純物）からＥＰＡを精製するための、本発明の特に好ましい実施形態を図示する図である。 ＳＭＢによって生成されたＥＰＡ生成物のＧＣ分析を示す図である。 ＳＭＢ方法で得られた第一抽出液および抽残液流のＧＣ ＦＡＭＥＳトレースを示す図である。 ＳＭＢ方法で得られた第二抽出液および抽残液流のＧＣ ＦＡＭＥＳトレースを示す図である。 ＳＭＢによって生成されたＤＨＡ生成物のＧＣ ＦＡＭＥＳトレースを示す図である。 蒸留によって生成されたＤＨＡ生成物のＧＣ ＦＡＭＥＳトレースを示す図である。 溶離剤が水性アセトニトリルであるクロマトグラフィー手法を使用して生成されたＥＰＡ生成物のＧＣトレースを示す図である。

用語「多価不飽和脂肪酸」（ＰＵＦＡ）は、１つより多い二重結合を含む脂肪酸を指す。そうしたＰＵＦＡは当業者に周知である。本明細書で使用する場合、ＰＵＦＡ誘導体は、モノ、ジもしくはトリグリセリド、エステル、リン脂質、アミド、ラクトンまたは塩の形のＰＵＦＡである。トリグリセリドおよびエステルが好ましい。エステルがより好ましい。エステルは、典型的にはアルキルエステル、好ましくはＣ_１〜Ｃ_６アルキルエステル、より好ましくはＣ_１〜Ｃ_４アルキルエステルである。エステルの例としては、メチルおよびエチルエステルが挙げられる。エチルエステルが最も好ましい。

本明細書で使用する場合、用語「ＰＵＦＡ生成物」は、典型的には栄養学的または医薬的に有効な、１種もしくは複数の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）および／またはそれらの誘導体を含む生成物を指す。典型的には、ＰＵＦＡ生成物は、単一のＰＵＦＡまたはその誘導体である。あるいは、ＰＵＦＡ生成物は、２つ以上、例えば２種のＰＵＦＡまたはそれらの誘導体の混合液である。

本明細書において使用する場合、用語「ゾーン」は、溶離剤として水性有機溶媒を含み、供給混合液流に対する１つまたは複数の注入ポイント、水および／または有機溶媒に対する１つまたは複数の注入ポイント、前記複数の連結したクロマトグラフィーカラムから液体が収集され得る抽残液分岐流ならびに前記複数の連結したクロマトグラフィーカラムから液体が収集され得る抽出液分岐流を有する、複数の連結したクロマトグラフィーカラムを指す。典型的には、各ゾーンは、供給混合液に対する注入ポイントを１つだけ有する。一実施形態では、各ゾーンは、水性有機溶媒溶離剤に対する注入ポイントを１つだけ有する。別の実施形態では、各ゾーンは、水および／または有機溶媒に対する注入ポイントを２つ以上有する。

用語「抽残液」は当業者に周知である。実および擬似移動床式クロマトグラフィーとの関係においては、それは、固体吸着剤相と比較して、液体溶離剤相とともにより急速に移動する成分の流れを指す。したがって抽残液流は、供給流と比較して、典型的には、より極性が高い成分が豊富であり、より極性が低い成分が欠乏している。

用語「抽出液」は当業者に周知である。実および擬似移動床式クロマトグラフィーとの関係においては、それは、液体溶離剤相と比較して、固体吸着剤相ともにより急速に移動する成分の流れを指す。したがって、抽出液流は、供給流と比較して、典型的には、より極性が低い成分が豊富であり、より極性が高い成分が欠乏している。

本明細書で使用する場合、同じ装置のカラムに適用する際には、用語「隣接していない」は、１個または複数のカラム、好ましくは３個以上のカラム、より好ましくは５個以上のカラム、最も好ましくは約５個のカラムによって隔てられたカラムを指す。

したがって、（ａ）より極性が高い成分とともにＰＵＦＡ生成物を含む抽残液流が第一ゾーンのカラムから収集され、第二ゾーンの隣接していないカラムに導入される場合は、第一ゾーンから収集される抽残液流は、第二ゾーン用の供給混合液である。（ｂ）より極性が低い成分とともにＰＵＦＡ生成物を含む抽出液流が第二ゾーンのカラムから収集され、第一ゾーンの隣接していないカラムに導入される場合は、第二ゾーンから収集される抽出液流は、第一ゾーン用の供給混合液である。

典型的には、ＰＵＦＡ生成物は、少なくとも１種のω−３またはω−６ＰＵＦＡ、好ましくは少なくとも１種のω−３ＰＵＦＡを含む。ω−３ＰＵＦＡの例としては、αリノレン酸（ＡＬＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサトリエン酸（ＥＴＥ）、エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）が挙げられる。ＳＤＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡが好ましい。ＥＰＡおよびＤＨＡがより好ましい。ω−６ＰＵＦＡの例としては、リノール酸（ＬＡ）、γリノレン酸（ＧＬＡ）、エイコサジエン酸、ジホモγリノレン酸（ＤＧＬＡ）、アラキドン酸（ＡＲＡ）、ドコサジエン酸、アドレン酸およびドコサペンタエン（ω−６）酸が挙げられる。ＬＡ、ＡＲＡ、ＧＬＡおよびＤＧＬＡが好ましい。

一実施形態では、ＰＵＦＡ生成物は、ＥＰＡおよび／またはＥＰＡエチルエステル（ＥＥ）である。

別の実施形態では、ＰＵＦＡ生成物は、ＤＨＡおよび／またはＥＰＡエチルエステル（ＥＥ）である。

さらに別の実施態様では、ＰＵＦＡ生成物は、ＥＰＡとＤＨＡおよび／またはＥＰＡ ＥＥとＤＨＡ ＥＥとの混合液である。

本発明の方法によって分画するための適切な供給混合液は、植物および動物の油および脂肪を含めた天然供給源から、ならびに遺伝子改変された植物、動物、および酵母を含めた微生物から得られる油を含めた合成供給源から得ることができる。例としては、魚油、藻類および微細藻類の油ならびに植物油、例えばルリチシャ油、エキウム（Echium）油および月見草油が挙げられる。一実施形態では、供給混合液は魚油である。別の実施形態では、供給混合液は藻類油である。所望のＰＵＦＡ生成物がＥＰＡおよび／またはＤＨＡの場合は、藻類油が特に適切である。所望のＰＵＦＡ生成物がＧＬＡである場合は、遺伝子改変されたベニバナ油が特に適切である。所望のＰＵＦＡ生成物がＥＰＡの場合は、遺伝子改変された酵母が特に適切である。

供給混合液は、本発明の方法によって分画する前に化学的な処理を受けてもよい。例えばそれは、グリセリドのエステル転移反応またはグリセリドの加水分解を受けてもよく、続いてある場合には、結晶化、分子蒸留、尿素分画、硝酸銀または他の金属塩溶液を用いる抽出、ヨードラクトン化または超臨界流体分画などの選択的方法を受けてもよい。

供給混合液は、ＰＵＦＡ生成物ならびに少なくとも１種のより極性が高い成分および少なくとも１種のより極性が低い成分を典型的には含む。より極性が低い成分は、本発明の方法で使用する吸着剤への固着性がＰＵＦＡ生成物よりも強い。動作中に、そうしたより極性が低い成分は、液体溶離剤相に優先して、固体吸着剤相とともに典型的には移動する。より極性が高い成分は、本発明の方法で使用する吸着剤への固着性がＰＵＦＡ生成物よりも弱い。動作中に、そうしたより極性が高い成分は、固体吸着剤相に優先して、液体溶離剤相とともに典型的には移動する。一般に、より極性が高い成分は抽残液流中に分離されることになり、より極性が低い成分は抽出液流中に分離されることになる。

より極性が高い成分およびより極性が低い成分の例としては、（１）天然油（例えば海産油または植物油）に存在する他の化合物、（２）貯蔵、精製および前の濃縮ステップの間に形成される副産物ならびに（３）前の濃縮または精製ステップの間に利用される溶媒または試薬からの混入物が挙げられる。

（１）の例としては、他の望ましくないＰＵＦＡ；飽和脂肪酸；ステロール、例えばコレステロール；ビタミン；ならびにポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）、ポリ芳香族炭化水素（ＰＡＨ）殺虫剤、塩素系殺虫剤、ダイオキシンおよび重金属などの環境汚染物質が挙げられる。ＰＣＢ、ＰＡＨ、ダイオキシンおよび塩素系殺虫剤は、全て極めて非極性の成分である。

（２）の例としては、ＰＵＦＡ生成物からの異性体、および酸化または分解生成物、例えば脂肪酸の自己酸化ポリマー生成物またはその誘導体が挙げられる。

（３）の例としては、供給混合液から飽和または一不飽和脂肪酸を除去するために添加され得る尿素が挙げられる。

好ましくは、供給混合液はＰＵＦＡ含有海産油、より好ましくはＥＰＡおよび／またはＤＨＡを含む海産油である。

本発明の方法によって濃縮ＥＰＡを調製するための典型的な供給混合液は、５０〜７５％のＥＰＡ、０から１０％のＤＨＡならびに他の必須ω−３およびω−６脂肪酸を含めた他の成分を含む。

本発明の方法によって濃縮ＥＰＡを調製するための好ましい供給混合液は、５５％のＥＰＡ、５％のＤＨＡならびに他の必須ω−３およびω−６脂肪酸を含めた他の成分を含む。ＤＨＡはＥＰＡよりも極性が低い。

本発明の方法によって濃縮ＤＨＡを調製するための典型的な供給混合液は、５０〜７５％のＤＨＡ、０から１０％のＥＰＡならびに他の必須ω−３およびω−６脂肪酸を含めた他の成分を含む。

本発明の方法によって濃縮ＤＨＡを調製するための好ましい供給混合液は、７５％のＤＨＡ、７％のＥＰＡならびに他の必須ω−３およびω−６脂肪酸を含めた他の成分を含む。ＥＰＡは、ＤＨＡより極性が高い。

本発明の方法によってＥＰＡとＤＨＡとの濃縮混合液を調製するための典型的な供給混合液は、３３％を超えるＥＰＡおよび２２％を超えるＤＨＡを含む。

本発明の方法は、前記クロマトグラフィー装置において複数のゾーンを必要とする。典型的には、２つ以上のゾーンが使用される。ゾーンの数は特に制限されないが、一般に２から５つのゾーンが存在する。好ましくは２つまたは３つのゾーンが存在し、より好ましくは２つのゾーンが存在する。

典型的には、本発明の方法で使用する装置の各ゾーンで分離される成分は、異なる極性を有する。

典型的には、ａ）各ゾーンに存在する水性有機溶媒の溶離剤は、異なる水：有機溶媒比率を有し、かつ／または
（ｂ）各ゾーンで抽出液および抽残液流を介して収集された液体が同一ゾーンに再循環される速度は、各ゾーンで供給混合液の異なる成分からＰＵＦＡ生成物を分離できるように調整される。

本発明の方法で使用する装置が２つのゾーンを有する場合は、本発明は、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）生成物を供給混合液から回収するためのクロマトグラフィー分離方法であって、溶離剤として水性有機溶媒を含む複数の連結したクロマトグラフィーカラムを有する擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置に供給混合液を導入することを含み、装置が、第一ゾーンおよび第二ゾーンを有し、各ゾーンが、前記複数の連結したクロマトグラフィーカラムから液体が収集され得る抽出液流および抽残液流を有し、（ａ）より極性が高い成分とともにＰＵＦＡ生成物を含む抽残液流が第一ゾーンのカラムから収集され、第二ゾーンの隣接していないカラムに導入され、かつ／または（ｂ）より極性が低い成分とともにＰＵＦＡ生成物を含む抽出液流が第二ゾーンのカラムから収集され、第一ゾーンの隣接していないカラムに導入され、前記ＰＵＦＡ生成物がより極性が低い供給混合液成分から第一ゾーンで分離され、前記ＰＵＦＡ生成物がより極性が高い供給混合液成分から第二ゾーンで分離され、水性有機溶媒が水性アルコール以外である方法を、典型的には提供する。

典型的には、本発明の方法で使用する装置が２つのゾーンを含む場合は、第一ゾーンの溶離剤は、第二ゾーンの溶離剤よりも多くの有機溶媒を含み、第二ゾーンは、システムにおける溶離剤の流れに対して、第一ゾーンの下流にある。したがって、システムの溶離剤は、第一ゾーンから第二ゾーンに典型的には移動する。逆に、固体吸着剤相は、第二ゾーンから第一ゾーンに典型的には移動する。典型的には、２つのゾーンは重ならない。すなわち、両方のゾーンに存在するクロマトグラフィーカラムはない。

本発明のさらなる実施形態では、装置は、第一ゾーン、第二ゾーンおよび第三ゾーンを有する。第一、第二および第三ゾーンに存在する水性有機溶媒の溶離剤の水：有機溶媒比率は、典型的には異なる。当業者には明らかなように、このことによって、異なる極性を有する不純物を各ゾーンで除去できるという結果になる。

好ましくは、装置が３つのゾーンを有する場合は、第一ゾーンの溶離剤は、第二ゾーンおよび第三ゾーンの溶離剤より多くの有機溶媒を含み、第一ゾーンは、システムにおける溶離剤の流れに対して、第二および第三ゾーンの上流にある。典型的には、第二ゾーンの溶離剤は、第三ゾーンの溶離剤より多くの有機溶媒を含み、第二ゾーンは、システムにおける溶離剤の流れに対して、第三ゾーンの上流にある。典型的には、第一ゾーンでは、前記ＰＵＦＡ生成物は、ＰＵＦＡ生成物より極性が低い供給混合液成分から分離される。典型的には、第二ゾーンでは、前記ＰＵＦＡ生成物は、ＰＵＦＡ生成物より極性が低いが第一ゾーンで分離された成分より極性が高い供給混合液成分から分離される。典型的には、第三ゾーンでは、前記ＰＵＦＡ生成物は、ＰＵＦＡ生成物より極性が高い供給混合液成分から分離される。

さらなる実施形態では、第一ゾーンでは、前記ＰＵＦＡ生成物は、ＰＵＦＡ生成物より極性が低い供給混合液成分から分離され、第二ゾーンでは、前記ＰＵＦＡ生成物は、ＰＵＦＡ生成物より極性が高い供給混合液成分から分離され、第三ゾーンでは、前記ＰＵＦＡ生成物は、ＰＵＦＡ生成物より極性が高く、さらに第二ゾーンで分離された成分より極性が高い供給混合液成分から分離される。

３つのゾーンを有するそうした仕組みは、ＤＨＡおよびＥＰＡより極性が低い不純物を含み、さらにＥＰＡより極性が高い不純物を含む混合液からＥＰＡおよびＤＨＡを分離するのに適するであろう。第一ゾーンでは、ＤＨＡおよびＥＰＡより極性が低い成分が抽出液流として除去され、ＤＨＡ、ＥＰＡおよびＥＰＡより極性が高い成分を含む抽残液流が収集され、第二ゾーンに導入される。第二ゾーンでは、ＤＨＡは抽出液流として除去され、ＥＰＡおよびＥＰＡより極性が高い成分を含む抽残液流が収集され、第三ゾーンに導入される。第三ゾーンでは、ＥＰＡより極性が高い成分が抽残液流として除去され、精製されたＥＰＡが抽出液流として収集される。本実施形態では、精製されたＥＰＡが、精製されたＰＵＦＡ生成物である。そうした仕組みは、二次的なＰＵＦＡも回収することができるという利点を有する。この場合、二次的なＰＵＦＡは、抽出液流として第二ゾーンから収集されたＤＨＡである。

典型的には、本発明のクロマトグラフィー分離方法では、前記ＰＵＦＡ生成物に加えて、さらなる二次的なＰＵＦＡ生成物が収集される。好ましくは、ＰＵＦＡ生成物はＥＰＡであり、さらなる二次的なＰＵＦＡ生成物はＤＨＡである。

本発明のさらなる実施形態では、ＥＰＡとＤＨＡとの濃縮混合液であるＰＵＦＡ生成物を収集するように装置が構成される。したがって、ＥＰＡ、ＤＨＡ、ＥＰＡおよびＤＨＡより極性が高い成分、ならびにＥＰＡおよびＤＨＡより極性が低い成分を含む供給混合液が使用される。第一ゾーンでは、ＥＰＡおよびＤＨＡより極性が低い材料が除去される。第二ゾーンでは、ＥＰＡおよびＤＨＡより極性が高い材料が除去され、ＥＰＡとＤＨＡとの濃縮混合液がＰＵＦＡ生成物として収集される。

本発明の方法を特徴づける多数のゾーン、特に２つのゾーンを有して装置が構成される限り、本発明の方法を目的として、任意の既知の擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置を利用することができる。ＵＳ２，９８５，５８９、ＵＳ３，６９６，１０７、ＵＳ３，７０６，８１２、ＵＳ３，７６１，５３３、ＦＲ−Ａ−２１０３３０２、ＦＲ−Ａ−２６５１１４８、ＦＲ−Ａ−２６５１１４９、ＵＳ６，９７９，４０２、ＵＳ５，０６９，８８３およびＵＳ４，７６４，２７６に記載されているそうした装置は、本発明の方法に従って構成されれば、全て使用することができる。

装置で使用するカラム数は特に制限されない。当業者なら、使用するのに適したカラム数を容易に決定することができるであろう。カラム数は、典型的には８個以上、好ましくは１５個以上である。より好ましい実施形態では、１５または１６個のカラムが使用される。別のより好ましい実施形態では、１９または２０個のカラムが使用される。別のより好ましい実施形態では、３０個以上のカラムが使用される。典型的には、５０個以下、好ましくは４０個以下のカラムが存在する。

各ゾーンは、典型的には、カラム総数のほぼ均等な割り当てからなる。したがって、２つのゾーンで構成された装置の場合は、各ゾーンは、システムのクロマトグラフィーカラム総数のほぼ半分から典型的にはなる。したがって、第一ゾーンは、４個以上、好ましくは８個以上、より好ましくは約８個のカラムを典型的には含む。第二ゾーンは、４個以上、好ましくは７個以上、より好ましくは７個または８個のカラムを典型的には含む。

装置で使用するカラムの寸法は特に制限されておらず、精製される供給混合液の容積に依存することになる。当業者なら、使用するのに適したサイズのカラムを容易に決定することができるであろう。各カラムの直径は、典型的には１０から５００ｍｍの間、好ましくは２５から２５０ｍｍの間、より好ましくは５０から１００ｍｍの間、最も好ましくは７０から８０ｍｍの間である。各カラムの長さは、典型的には１０から２００ｃｍの間、好ましくは２５から１５０ｃｍの間、より好ましくは７０から１１０ｃｍの間、最も好ましくは８０から１００ｃｍの間である。

各ゾーン中のカラムは、典型的には同じ寸法を有するが、ある種の適用に関しては、異なる寸法を有してもよい。

カラムの流速は、一連のカラムにわたる最大圧力によって制限され、カラムの寸法および固相の粒径に依存することになる。当業者なら、効率的な脱着を確実にするために各カラム寸法について必要とされる流速を容易に確立することができるであろう。一般に、より大きな直径のカラムは、カラムを通る直線的な流動を維持するのにより大きな流速を必要とする。

上記で概要を述べた典型的なカラムサイズに関して、および２つのゾーンを有する装置に関しては、典型的には、第一ゾーン中への溶離剤の流速は、１から４．５Ｌ／分、好ましくは１．５から２．５Ｌ／分である。典型的には、第一ゾーンからの抽出液の流速は、０．１から２．５Ｌ／分、好ましくは０．５から２．２５Ｌ／分である。第一ゾーンからの抽出液の一部を第一ゾーン中に再循環させる実施形態では、再循環の流速は、典型的には０．７から１．４Ｌ／分、好ましくは約１Ｌ／分である。典型的には、第一ゾーンからの抽残液の流速は、０．２から２．５Ｌ／分、好ましくは０．３から２．０Ｌ／分である。第一ゾーンからの抽残液の一部を第一ゾーン中に再循環する実施形態では、再循環の流速は、典型的には０．３から１．０Ｌ／分、好ましくは約０．５Ｌ／分である。典型的には、第一ゾーン中への供給混合液の導入の流速は、５から１５０ｍＬ／分、好ましくは１０から１００ｍＬ／分、より好ましくは２０から６０ｍＬ／分である。

上記で概要を述べた典型的なカラムサイズに関して、および２つのゾーンを有する装置に関しては、典型的には、第二ゾーン中への溶離剤の流速は、１から４Ｌ／分、好ましくは１．５から３．５Ｌ／分である。典型的には、第二ゾーンからの抽出液の流速は、０．５から２Ｌ／分、好ましくは０．７から１．９Ｌ／分である。第二ゾーンからの抽出液の一部を第二ゾーン中に再循環する実施形態では、再循環の流速は、典型的には０．６から１．４Ｌ／分、好ましくは０．７から１．１Ｌ／分、より好ましくは約０．９Ｌ／分である。典型的には、第二ゾーンからの抽残液の流速は、０．５から２．５Ｌ／分、好ましくは０．７から１．８Ｌ／分、より好ましくは約１．４Ｌ／分である。

当業者なら認識するように、様々な抽出液および抽残液流を介して液体が収集されるまたは除去される速度への言及は、ある時間内に除去される液体の容積、典型的にはＬ／分を指す。同様に、液体が同一ゾーン中に、典型的には同一ゾーンの隣接したカラムに再循環される速度への言及は、ある時間内に再循環される液体の容積、典型的にはＬ／分を指す。

典型的には、第一ゾーンからの抽出液流、第一ゾーンからの抽残液流、第二ゾーンからの抽出液流および第二ゾーンからの抽残液流の１つまたは複数の一部は、同一ゾーン、典型的には同一ゾーンの隣接したカラムに再循環する。

この再循環は、別のゾーンの隣接していないカラムに抽出液または抽残液流を供給することとは異なる。むしろ、再循環は、抽出液または抽残液流の一部をあるゾーンから同一ゾーン、典型的には同一ゾーンの隣接したカラムに再供給することを含む。

第一または第二ゾーンから抽出液または抽残液流を介して収集された液体が同一ゾーンに再循環される速度は、その流れを介して収集された液体が、同一ゾーン、典型的には同一ゾーンの隣接したカラムに再供給される速度である。このことは、図９を参照して理解することができる。第一ゾーンの抽出液の再循環速度は、カラム２の底部から収集された抽出液がカラム３の頂部に供給される速度、すなわちカラム３の頂部への液体の流速である。第二ゾーンの抽出液の再循環速度は、カラム１０の底部で収集された抽出液がカラム１１の頂部に供給される速度、すなわち、カラム１１の頂部への液体の流速である。

抽出液および／または抽残液流の再循環は、その流れを介して収集された液体を容器に供給して、次いで、ある量のその液体をその容器から同一ゾーンにポンプで戻すことによって、典型的にはもたらされる。この場合、特定の抽出液または抽残液流を介して収集された液体の、典型的には同一ゾーンの隣接したカラムへの再循環速度は、液体が、同一ゾーンに、典型的には隣接したカラムに容器からポンプで戻される速度である。

当業者なら認識するように、溶離剤および供給原料流を介してあるゾーンに導入される液体の量は、あるゾーンから除去され、同一ゾーンに再循環される液体の量と釣り合っている。したがって、図９を参照すれば、抽出液流については、第一または第二ゾーンへの溶離剤（脱着剤）の流速（Ｄ）は、そのゾーンから抽出液流を介して収集された液体が容器に蓄積する速度（Ｅ１／Ｅ２）を、抽出液が同一ゾーンに再循環される速度（Ｄ−Ｅ１／Ｄ−Ｅ２）に加えたものに等しい。あるゾーンの抽残液流については、あるゾーンに抽出液が再循環される速度（Ｄ−Ｅ１／Ｄ−Ｅ２）を、あるゾーンに供給原料が導入される速度（Ｆ／Ｒ１）に加えた速度は、そのゾーンから抽残液流を介して収集された液体が容器に蓄積する速度（Ｒ１／Ｒ２）を、抽残液が同一ゾーンに再循環される速度（Ｄ＋Ｆ−Ｅ１−Ｒ１／Ｄ＋Ｒ１−Ｅ２−Ｒ２）に加えたものに等しい。

あるゾーンからの特定の抽出液または抽残液流から収集された液体が容器に蓄積する速度は、その抽出液または抽残液流をそのゾーンから除去する正味の速度と考えることもできる。

典型的には、第一ゾーンから抽出液流を介して収集された液体が第一ゾーンに再循環される速度は、第二ゾーンから抽出液流を介して収集された液体が第二ゾーンに再循環される速度とは異なり、かつ／または第一ゾーンから抽残液流を介して収集された液体が第一ゾーンに再循環される速度は、第二ゾーンから抽残液流を介して収集された液体が第二ゾーンに再循環される速度とは異なる。

各ゾーンで抽出液および／または抽残液流を介して収集された液体が同一ゾーンに再循環される速度を変化させることは、他の抽出液および抽残液流に存在するより極性が高いおよびより極性が低い成分の量を変化させる効果がある。したがって、例えば、抽出液の再循環速度が低下すると、そのゾーンの抽残液流まで運ばれる、そのゾーンのより極性が低い成分が少なくなる。抽出液の再循環速度が高くなると、そのゾーンの抽残液流まで運ばれる、そのゾーンのより極性が低い成分が多くなる。このことは、例えば、図６に示す本発明の特定の実施形態で理解することができる。第一ゾーンで抽出液流を介して収集された液体が同一ゾーンに再循環される速度（Ｄ−Ｅ１）は、第一ゾーンで任意の成分Ａが抽残液流まで運ばれる程度（Ｒ１）に影響を及ぼす。

典型的には、第一ゾーンから抽出液流を介して収集された液体が第一ゾーンに再循環される速度は、第二ゾーンから抽出液流を介して収集された液体が第二ゾーンに再循環される速度より速い。好ましくは、より極性が高い成分とともにＰＵＦＡ生成物を含む抽残液流が第一ゾーンのカラムから収集され、第二ゾーンの隣接していないカラムに導入され、第一ゾーンから抽出液流を介して収集された液体が第一ゾーンに再循環される速度は、第二ゾーンから抽出液流を介して収集された液体が第二ゾーンに再循環される速度より速い。

あるいは、第一ゾーンから抽出液流を介して収集された液体が第一ゾーンに再循環される速度は、第二ゾーンから抽出液流を介して収集された液体が第二ゾーンに再循環される速度より遅い。

典型的には、第二ゾーンから抽残液流を介して収集された液体が第二ゾーンに再循環される速度は、第一ゾーンから抽残液流を介して収集された液体が第一ゾーンに再循環される速度より速い。好ましくは、より極性が低い成分とともにＰＵＦＡ生成物を含む抽出液流が第二ゾーンのカラムから収集され、第一ゾーンの隣接していないカラムに導入され、第二ゾーンから抽残液流を介して収集された液体が第二ゾーンに再循環される速度は、第一ゾーンから抽残液流を介して収集された液体が第一ゾーンに再循環される速度より速い。

あるいは、第二ゾーンから抽残液流を介して収集された液体が第二ゾーンに再循環される速度は、第一ゾーンから抽残液流を介して収集された液体が第一ゾーンに再循環される速度より遅い。

ステップ時間、すなわち、供給混合液および溶離剤の注入ポイントと収集画分の様々な分岐ポイントとをシフトする間の時間は、特に制限されず、使用するカラムの数および寸法ならびに装置を通る流速に依存することになる。当業者なら、本発明の方法で使用するのに適したステップ時間を容易に決定することができるであろう。ステップ時間は、典型的には１００から１０００秒、好ましくは２００から８００秒、より好ましくは約２５０から約７５０秒である。いくつかの実施形態では、１００から４００秒、好ましくは２００から３００秒、より好ましくは約２５０秒のステップ時間が適する。他の実施形態では、６００から９００秒、好ましくは７００から８００秒、より好ましくは約７５０秒のステップ時間が適する。

本発明の方法では、実移動床式クロマトグラフィーが好ましい。

実および擬似移動床システム用の当技術分野で既知の従来の吸着剤を本発明の方法で使用できる。各クロマトグラフィーカラムは、同一または異なる吸着剤を含んでいてもよい。典型的には、各カラムは同じ吸着剤を含む。一般に使用されるそうした材料の例としては、ポリマービーズ、好ましくはＤＶＢ（ジビニルベンゼン）と網状化したポリスチレン；およびシリカゲル、好ましくはＣ８またはＣ１８アルカン、特にＣ１８と結合した逆相シリカゲルがある。Ｃ１８結合逆相シリカゲルが好ましい。本発明の方法で使用する吸着剤は、好ましくは非極性である。

吸着剤固定相材料の形状は、例えば、球状のまたは非球状のビーズ、好ましくは実質的に球状のビーズであってもよい。そうしたビーズは、５から５００ミクロン、好ましくは１０から５００ミクロン、より好ましくは１５から５００ミクロン、より好ましくは４０から５００ミクロン、より好ましくは１００から５００ミクロン、より好ましくは２５０から５００ミクロン、さらにより好ましくは２５０から４００ミクロン、最も好ましくは２５０から３５０ミクロンの直径を典型的には有する。いくつかの実施形態では、５から３５ミクロン、典型的には１０から３０ミクロン、好ましくは１５から２５ミクロンの直径を有するビーズを使用することができる。いくつかの好ましい粒径は、擬似および実移動床式方法で過去に使用されたビーズの粒径よりも幾分大きい。より大きな粒子を使用することによって、システムで使用される溶離剤の圧力をより低くすることができる。ひいては、これは、費用節約、効率および装置の寿命の点から利点を有する。より大きな粒径の吸着剤ビーズが、（その付随する利点を伴って）分解能を少しも低下させることなしに、本発明の方法で使用できることが驚いたことに見出された。

吸着剤は、１０から５０ｎｍ、好ましくは１５から４５ｎｍ、より好ましくは２０から４０ｎｍ、最も好ましくは２５から３５ｎｍの孔径を典型的には有する。

本発明の方法で使用する溶離剤は、水性アルコール以外の水性有機溶媒である。

水性有機溶媒は、水および１種もしくは複数のエーテル、エステル、ケトンもしくはニトリルまたはそれらの混合液を典型的には含む。

エーテル溶媒は当業者に周知である。エーテルは、典型的には短鎖エーテルである。エーテルは典型的には式Ｒ−Ｏ−Ｒ’のものであり、式中、ＲおよびＲ’は同一または異なっており、直鎖または分枝状のＣ_１〜Ｃ_６アルキル基を表す。Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル基は、好ましくは無置換である。好ましいエーテルとしては、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテルおよびメチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）が挙げられる。

エステル溶媒は当業者に周知である。エステルは、典型的には短鎖エステルである。エステルは典型的には式Ｒ−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’のものであり、式中、ＲおよびＲ’は同一または異なっており、直鎖または分枝状のＣ_１〜Ｃ_６アルキル基を表す。好ましいエステルとしては、酢酸メチルおよび酢酸エチルが挙げられる。

ケトン溶媒は当業者に周知である。ケトンは典型的には短鎖ケトンである。ケトンは典型的には式Ｒ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ’のものであり、式中、ＲおよびＲ’は同一または異なっており、直鎖または分枝状のＣ_１〜Ｃ_６アルキル基を表す。Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル基は、好ましくは無置換である。好ましいケトンとしては、アセトン、メチルエチルケトンおよびメチルイソブチルケトン（ＭＩＢＫ）が挙げられる。

ニトリル溶媒は当業者に周知である。ニトリルは典型的には短鎖ニトリルである。ニトリルは典型的には式Ｒ−ＣＮのものであり、式中、Ｒは直鎖または分枝状のＣ_１〜Ｃ_６アルキル基を表す。Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル基は、好ましくは無置換である。好ましいニトリルとしては、アセトニトリルが挙げられる。

水性有機溶媒は、好ましくは水性アセトニトリルである。

水性有機溶媒が水性アセトニトリルである場合は、溶離剤は、３０重量％までの水、残りのアセトニトリルを典型的には含む。好ましくは、溶離剤は、５から２５重量％の水、残りのアセトニトリルを含む。より好ましくは、溶離剤は、１０から２０重量％の水、残りのアセトニトリルを含む。さらにより好ましくは、溶離剤は、１５から２５重量％の水、残りのアセトニトリルを含む。

水性アルコールは、水および１種または複数の短鎖アルコールを典型的には含む。短鎖アルコールは、１から６個の炭素原子を典型的には有する。アルコールの例としては、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ｉ−プロパノール、ｎ−ブタノール、ｉ−ブタノール、ｓ−ブタノールおよびｔ−ブタノールが挙げられる。

典型的には、溶離剤は超臨界状態でない。典型的には、溶離剤は液体である。

典型的には、装置全体の溶離剤の水：有機溶媒の平均比率は、０．１：９９．９から３０：７０容積部、好ましくは０．１：９９．９から９：９１容積部、より好ましくは０．２５：９９．７５から７：９３容積部、さらにより好ましくは０．５：９９．５から６：９４容積部である。

各ゾーンの溶離剤の溶離力は、典型的には異なる。好ましくは、第一ゾーンの溶離剤の溶離力は、第二ゾーンおよびそれ以降のゾーンの溶離剤の溶離力より大きい。実際には、これは、各ゾーンの水および有機溶媒の相対量を変化させることによって達成される。有機溶媒の選択によっては、それらは水よりも強力な脱着試薬であり得る。あるいは、それらは、水よりも強力でない脱着試薬であり得る。例えば、アセトニトリルは水よりも強力な脱着試薬である。したがって、水性有機溶媒がアセトニトリルである場合は、第一ゾーンの溶離剤中のアセトニトリルの量は、第二ゾーンおよびそれ以降のゾーンの溶離剤のアセトニトリルの量より典型的には多い。

各ゾーンに存在する水性有機溶媒が異なる水有機溶媒含有量を有する実施形態では、第一ゾーンの溶離剤の水：有機溶媒比率は、典型的には５：９５から２５：７５容積部、好ましくは１０：９０から１５：８５容積部である。あるいは、第一ゾーンの溶離剤の水：有機溶媒比率は、０：１００から５：９５容積部、好ましくは０．１：９９．９から２．５：９７．５容積部、より好ましくは０．２５：９９．７５から２：９８容積部、最も好ましくは０．５：９９．５から１．５：９８．５容積部でもよい。

これらの実施形態では、第二ゾーンの溶離剤の水：有機溶媒比率は、典型的には１０：９０から３０：７０容積部、好ましくは１５：８５から２０：８０容積部である。あるいは、第二ゾーンの溶離剤の水：有機溶媒比率は、３：９７から７：９３容積部、好ましくは４：９６から６：９４容積部、より好ましくは４．５：９５．５から５．５：９４．５容積部でもよい。

各ゾーンに存在する水性有機溶媒が異なる水有機溶媒含有量を有する特に好ましい実施形態では、第一ゾーンの溶離剤の水：有機溶媒比率は、０．５：９９．５から１．５：９８．５容積部であり、第二ゾーンの溶離剤の水：有機溶媒比率は、４．５：９５：５から５．５：９４．５容積部である。

各ゾーンで抽出液および抽残液流を介して収集された液体が同一ゾーンに再循環される速度が、各ゾーンで供給混合液の異なる成分からＰＵＦＡ生成物を分離できるように調整される実施形態では、各ゾーンの溶離剤の水：有機溶媒比率は、同じでもよいし、異なっていてもよい。典型的には、各ゾーンの溶離剤の水：有機溶媒比率は、０．５：９９．５から５．５：９４．５容積部である。一実施形態では、第一ゾーンの溶離剤の水：有機溶媒比率は、第二ゾーンの溶離剤の水：有機溶媒比率より低い。別の実施形態では、第一ゾーンの溶離剤の水：有機溶媒比率は、第二ゾーンの溶離剤の水：有機溶媒比率より高い。さらなる実施形態では、第一ゾーンの溶離剤の水：有機溶媒比率は、第二ゾーンの溶離剤の水：有機溶媒比率と同じである。

上記で言及した各ゾーンの水と有機溶媒の比率はゾーン全体の平均比率であることが認識されるであろう。

典型的には、各ゾーンの溶離剤の水：有機溶媒比率は、ゾーンの１個または複数のカラムに水および／または有機溶媒を導入することによって制御される。したがって、例えば，第二ゾーンよりも低い第一ゾーンの水：有機溶媒比率を達成するためには、水は、典型的には、第一ゾーンに第二ゾーンよりもゆっくりと導入される。いくつかの実施形態では、実質的に純粋な有機溶媒および実質的に純粋な水を、各ゾーンの異なるポイントで導入することができる。これら２つの流れの相対的な流速は、ゾーン全体の全体的な溶媒プロファイルを決定する。他の実施形態では、異なる有機溶媒／水混合液を、各ゾーンの異なるポイントで導入することができる。それは、異なる有機溶媒：水比率を有する２つ以上の異なる有機溶媒／水混合液を、ゾーンに導入することを含む。本実施形態の有機溶媒／水混合液の相対的な流速および相対的な濃度は、ゾーン全体の全体的な溶媒プロファイルを決定する。各ゾーンの溶離剤の水：有機溶媒比率が同じである他の実施形態では、同じ有機溶媒／水混合液が各ゾーンに導入される。

典型的には、本発明の方法は、１５から５５℃、好ましくは２０から４０℃、より好ましくは約３０℃で行われる。したがって、本方法は典型的には室温で行われるが、高温で行うこともできる。

本発明の方法は、１つのゾーン（例えば第一ゾーン）に供給流を導入し、ＰＵＦＡ生成物が豊富な第一中間流を収集し、第一中間流を別のゾーン（例えば第二ゾーン）に導入することを含む。したがって、装置が２つのゾーンを有する場合は、この方法は、（ａ）第一中間流を第一ゾーンから収集し、それを第二ゾーンに導入すること、または（ｂ）第一中間流を第二ゾーンから収集し、それを第一ゾーンに導入することのいずれかを含む。このようにして、極性がより高いおよびより低い成分の両方からＰＵＦＡ生成物を単一方法で分離することができる。

（ａ）より極性が高い成分とともにＰＵＦＡ生成物を含む抽残液流が第一ゾーンのカラムから収集され、第二ゾーンの隣接していないカラムに導入される、または（ｂ）より極性が低い成分とともにＰＵＦＡ生成物を含む抽出液流が第二ゾーンのカラムから収集され、第一ゾーンの隣接していないカラムに導入される。

特に好ましい実施形態では、装置は２つのゾーンを有し、本発明の方法は、
（ｉ）供給混合液を第一ゾーンに導入し、ＰＵＦＡ生成物が豊富な第一抽残液流およびＰＵＦＡ生成物が欠乏している第一抽出液流を除去すること、ならびに
（ｉｉ）第一抽残液流を第二ゾーンに導入し、ＰＵＦＡ生成物が欠乏している第二抽残液流を除去し、第二抽出液流を収集してＰＵＦＡ生成物を得ること
を含む。

この特に好ましい実施形態は、供給混合液からＥＰＡを精製するのに適する。

この特に好ましい実施形態を図２に図示する。ＰＵＦＡ生成物（Ｂ）ならびにより極性が高い（Ｃ）およびより極性が低い（Ａ）成分を含む供給混合液Ｆが、第一ゾーンに導入される。第一ゾーンでは、最も極性が低い成分（Ａ）が、抽出液流Ｅ１として除去される。ＰＵＦＡ生成物（Ｂ）およびより極性が高い成分（Ｃ）が、抽残液流Ｒ１として除去される。抽残液流Ｒ１は、次いで第二ゾーンに導入される。第二ゾーンでは、より極性が高い成分（Ｃ）が抽残液流Ｒ２として除去される。ＰＵＦＡ生成物（Ｂ）が、抽出液流Ｅ２として収集される。

本実施形態を、図４でより詳細に図示する。図４は、各ゾーンへの有機溶媒の脱着剤（Ｄ）および水（Ｗ）の導入ポイントが示されていることを除いて、図２と同じである。有機溶媒の脱着剤（Ｄ）および水（Ｗ）は、共に溶離剤を構成する。（Ｄ）相は典型的には実質的に純粋な有機溶媒であるが、ある種の実施形態では、主に有機溶媒を含む有機溶媒／水の混合液でもよい。（Ｗ）相は典型的には実質的に純粋な水であるが、ある種の実施形態では、主に水を含む有機溶媒／水の混合液、例えば９８％水／２％アセトニトリルの混合液でもよい。

この特に好ましい実施形態のさらなる例示を図６に示す。ここでは、別個の水注入ポイントは存在せず、代わりに水性有機溶媒の脱着剤が（Ｄ）で注入される。

抽残液および抽出液流への分離は、各ゾーン内の溶離剤の脱着力を変化させることによって促進され得る。これは、溶離剤の有機溶媒（または有機溶媒が豊富な）成分および水（または水が豊富な）成分を各ゾーンの異なるポイントで導入することによって実現することができる。したがって、典型的には、システムにおける溶離剤の流れに対して、有機溶媒は、抽出液分岐ポイントの上流で導入され、水は、抽出液分岐ポイントとゾーンへの供給物の導入ポイントとの間で導入される。このことを図４に示す。

あるいは、分離は、抽出液および抽残液流を介して２つのゾーンから収集された液体が同一ゾーンに再循環される速度を変化させることによって促進され得る。

典型的には、この特に好ましい実施形態では、第一ゾーンから抽出液流を介して収集された液体が第一ゾーンに再循環される速度は、第二ゾーンから抽出液流を介して収集された液体が第二ゾーンに再循環される速度より速い、または第一ゾーンの溶離剤の水：有機溶媒比率は、第二ゾーンのそれよりも低い。

この特に好ましい実施形態では、第一ゾーンの第一抽残液流は、第一ゾーンの溶離剤の流れに対して、第一ゾーンに供給混合液を導入するポイントの下流で典型的には除去される。

この特に好ましい実施形態では、第一ゾーンの第一抽出液流は、第一ゾーンの溶離剤の流れに対して、第一ゾーンに供給混合液を導入するポイントの上流で典型的には除去される。

この特に好ましい実施形態では、第二ゾーンの第二抽残液流は、第二ゾーンの溶離剤の流れに対して、第二ゾーンに第一抽残液流を導入するポイントの下流で典型的には除去される。

この特に好ましい実施形態では、第二ゾーンの第二抽出液流は、第二ゾーンの溶離剤の流れに対して、第二ゾーンに第一抽残液流を導入するポイントの上流で典型的には収集される。

典型的には、この特に好ましい実施形態では、有機溶媒または水性有機溶媒は、第一ゾーンの溶離剤の流れに対して、第一抽出液流を除去するポイントの上流で、第一ゾーンに導入される。

典型的には、この特に好ましい実施形態では、水が、第一ゾーンに導入される場合は、水は、第一ゾーンの溶離剤の流れに対して、供給混合液の導入ポイントの上流ではあるが第一抽出液流を除去するポイントの下流で、第一ゾーンに導入される。

典型的には、この特に好ましい実施形態では、有機溶媒または水性有機溶媒は、第二ゾーンの溶離剤の流れに対して、第二抽出液流を除去するポイントの上流で、第二ゾーンに導入される。

典型的には、この特に好ましい実施形態では、水が、第二ゾーンに導入される場合は、水は、第二ゾーンの溶離剤の流れに対して、第一抽残液流を導入するポイントの上流ではあるが第二抽出液流を除去するポイントの下流で、第二ゾーンに導入される。

別の特に好ましい実施形態では、装置は２つのゾーンを有し、方法は、
（ｉ）供給混合液を第二ゾーンに導入し、ＰＵＦＡ生成物が欠乏している第一抽残液流およびＰＵＦＡ生成物が豊富な第一抽出液流を除去すること、ならびに
（ｉｉ）第一抽出液流を第一ゾーンに導入し、ＰＵＦＡ生成物が欠乏している第二抽出液流を除去し、第二抽残液流を収集してＰＵＦＡ生成物を得ること
を含む。

この特に好ましい実施形態は、供給混合液からＤＨＡを精製するのに適する。

この実施形態を図３に図示する。ＰＵＦＡ生成物（Ｂ）ならびにより極性が高い（Ｃ）およびより極性が低い（Ａ）成分を含む供給混合液Ｆが、第二ゾーンに導入される。第二ゾーンでは、より極性が高い成分（Ｃ）が抽残液流Ｒ１として除去される。ＰＵＦＡ生成物（Ｂ）およびより極性が低い成分（Ａ）が、抽出液流Ｅ１として収集される。抽出液流Ｅ１は、次いで第一ゾーンに導入される。第一ゾーンでは、より極性が低い成分（Ａ）が、抽出液流Ｅ２として除去される。ＰＵＦＡ生成物（Ｂ）は、抽残液流Ｒ２として収集される。

本実施形態をより詳細に図５に図示する。有機溶媒の脱着剤（Ｄ）および水（Ｗ）の各ゾーンへの導入ポイントが示されていることを除いて、図５は、図３と同じである。上記のように、（Ｄ）相は典型的には実質的に純粋な有機溶媒であるが、ある種の実施形態では、主に有機溶媒を含む有機溶媒／水混合液でもよい。（Ｗ）相は典型的には実質的に純粋な水であるが、ある種の実施形態では、主に水を含む有機溶媒／水の混合液、例えば９８％水／２％アセトニトリル混合液でもよい。

この特に好ましい実施形態のさらなる例示を図７に示す。ここでは、別個の水注入ポイントは存在せず、代わりに水性有機溶媒の脱着剤が（Ｄ）で注入される。

典型的には、本実施形態では、第二ゾーンから抽残液流を介して収集された液体が第二ゾーンに再導入される速度は、第一ゾーンから抽残液流を介して収集された液体が第一ゾーンに再導入される速度より速い、または第一ゾーンの溶離剤の水：有機溶媒比率は、第二ゾーンのそれより低い。

この第二の特に好ましい実施形態では、第二ゾーンの第一抽残液流は、第二ゾーンの溶離剤の流れに対して、第二ゾーンへの供給混合液の導入ポイントの下流で典型的には除去される。

この第二の特に好ましい実施形態では、第二ゾーンの第一抽出液流は、第二ゾーンの溶離剤の流れに対して、第二ゾーンへ供給混合液を導入するポイントの上流で典型的には収集される。

この第二の特に好ましい実施形態では、第一ゾーンの第二抽残液流は、第一ゾーンの溶離剤の流れに対して、第一ゾーンへの第一抽出液流の導入ポイントの下流で典型的には収集される。

この第二の特に好ましい実施形態では、第一ゾーンの第二抽出液流は、第一ゾーンの溶離剤の流れに対して、第一ゾーンへの第一抽出液流の導入ポイントの上流で典型的には除去される。

典型的には、この第二の特に好ましい実施形態では、有機溶媒または水性有機溶媒は、第二ゾーンの溶離剤の流れに対して、第一抽出液流を除去するポイントの上流で、第二ゾーンに導入される。

典型的には、この第二の特に好ましい実施形態では、水が、第二ゾーンに導入される場合は、水は、第二ゾーンの溶離剤の流れに対して、供給混合液の導入ポイントの上流ではあるが第一抽出液流を除去するポイントの下流で、第二ゾーンに導入される。

典型的には、この第二の特に好ましい実施形態では、有機溶媒または水性有機溶媒は、第一ゾーンの溶離剤の流れに対して、第二抽出液流を除去するポイントの上流で、第一ゾーンに導入される。

典型的には、この第二の特に好ましい実施形態では、水が、第一ゾーンに導入される場合は、水は、第一ゾーンの溶離剤の流れに対して、第一抽残液流を導入するポイントの上流ではあるが第二抽出液流を除去するポイントの下流で、第一ゾーンに導入される。

本発明の好ましい実施形態では、擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置は、１５個のクロマトグラフィーカラムからなる。これらは、カラム１から１５と称される。１５個のカラムは、カラム１の底部がカラム２の頂部に連結し、カラム２の底部がカラム３の頂部に連結し、．．．など、連続して配置される。これは、場合によっては保持容器を介して、再循環流を次のカラムに入れてもよい。このシステムを通じての溶離剤の流れは、カラム１からカラム２、カラム２からカラム３などである。このシステムを通じての吸着剤の流れは、カラム１５からカラム１４、カラム１４からカラム１３などである。

最も好ましい実施形態では、第一ゾーンは、上記で論じたようにつながっている８個の隣接したカラム、カラム１から８から典型的にはなる。この最も好ましい実施形態では、第二ゾーンは、上記で論じたようにつながっている７個のカラム、カラム９から１５から典型的にはなる。誤解を避けるために、第一ゾーンのカラム８の底部は、第二ゾーンのカラム９の頂部に連結している。

最も好ましい実施形態を図８に図示する。ＰＵＦＡ生成物（Ｂ）ならびにより極性が高い（Ｃ）およびより極性が低い（Ａ）成分を含む供給混合液Ｆは、第一ゾーンのカラム５の頂部に導入される。有機溶媒の脱着剤は、第一ゾーンのカラム１の頂部に導入される。水は、第一ゾーンのカラム４の頂部に導入される。第一ゾーンでは、より極性が低い成分（Ａ）は、抽出液流Ｅ１としてカラム２の底部から除去される。ＰＵＦＡ生成物（Ｂ）およびより極性が高い成分（Ｃ）は、抽残液流Ｒ１としてカラム７の底部から除去される。抽残液流Ｒ１は、次いでカラム１３の頂部で第二ゾーンに導入される。有機溶媒の脱着剤は、第二ゾーンのカラム９の頂部に導入される。水は、第二ゾーンのカラム１２の頂部に導入される。第二ゾーンでは、より極性が高い成分（Ｃ）は、抽残液流Ｒ２としてカラム１５の底部で除去される。ＰＵＦＡ生成物（Ｂ）は、抽出液流Ｅ２としてカラム１０の底部で収集される。

この最も好ましい実施形態では、有機溶媒は、第一ゾーンのカラム１の頂部に典型的には導入される。

この最も好ましい実施形態では、水は、第一ゾーンのカラム４の頂部に導入される。

この最も好ましい実施形態では、有機溶媒は、第二ゾーンのカラム９の頂部に典型的には導入される。

この最も好ましい実施形態では、有機溶媒は、第二ゾーンのカラム１２の頂部に典型的には導入される。

この最も好ましい実施形態では、供給流は、第一ゾーンのカラム５の頂部に典型的には導入される。

この最も好ましい実施形態では、第一抽残液流は典型的には、第一ゾーンのカラム７の底部から収集され、第二ゾーンのカラム１３の頂部に導入される。第一抽残液流は、カラム１３に導入される前に、場合によっては容器に収集されてもよい。

この最も好ましい実施形態では、第一抽出液流は、第一ゾーンのカラム２の底部から、典型的には除去される。第一抽出液流は、場合によっては容器に収集され、第一ゾーンのカラム３の頂部に再導入されてもよい。

この最も好ましい実施形態では、第二抽出液流は、第二ゾーンのカラム１５の底部から、典型的には除去される。

この最も好ましい実施形態では、第二抽出液流は、第二ゾーンのカラム１０の底部から典型的には収集される。この第二抽出液流は、精製されたＰＵＦＡ生成物を典型的には含む。第二抽出液流は、場合によっては容器に収集され、第二ゾーンのカラム１１の頂部に再導入されてもよい。

典型的には、この最も好ましい実施形態では、第一ゾーンの水：有機溶媒比率は、第二ゾーンの水：有機溶媒比率より低い。

さらなる最も好ましい実施形態を図９に図示する。ＰＵＦＡ生成物（Ｂ）ならびにより極性が高い（Ｃ）およびより極性が低い（Ａ）成分を含む供給混合液Ｆが、第一ゾーンのカラム５の頂部に導入される。水性有機溶媒の脱着剤が、第一ゾーンのカラム１の頂部に導入される。第一ゾーンでは、より極性が低い成分（Ａ）が、抽出液流Ｅ１としてカラム２の底部から除去される。ＰＵＦＡ生成物（Ｂ）およびより極性が高い成分（Ｃ）が、抽残液流Ｒ１としてカラム７の底部から除去される。抽残液流Ｒ１は、次いでカラム１２の頂部で第二ゾーンに導入される。水性有機溶媒の脱着剤が、第二ゾーンのカラム９の頂部に導入される。第二ゾーンでは、より極性が高い成分（Ｃ）が、抽残液流Ｒ２としてカラム１４の底部で除去される。ＰＵＦＡ生成物（Ｂ）は、抽出液流Ｅ２としてカラム１０の底部で収集される。

この最も好ましい実施形態では、水性有機溶媒は、第一ゾーンのカラム１の頂部に典型的には導入される。

この最も好ましい実施形態では、水性有機溶媒は、第二ゾーンのカラム９の頂部に典型的には導入される。

この最も好ましい実施形態では、供給流は、第一ゾーンのカラム５の頂部に典型的には導入される。

この最も好ましい実施形態では、第一抽残液流は典型的には、第一ゾーンのカラム７の底部から収集され、第二ゾーンのカラム１２の頂部に導入される。第一抽残液流は、カラム１２に導入される前に、場合によっては容器に収集されてもよい。

この最も好ましい実施形態では、第一抽出液流は、第一ゾーンのカラム２の底部から典型的には除去される。第一抽出液流は、場合によっては容器に収集され、一部が、第一ゾーンのカラム３の頂部に再導入されてもよい。第一ゾーンから抽出液流を介して収集された液体の、第一ゾーンへ戻される再循環の速度は、液体が、この容器からカラム３の頂部にポンプで注入される速度である。

この最も好ましい実施形態では、第二抽残液流は、第二ゾーンのカラム１４の底部から、典型的には除去される。

この最も好ましい実施形態では、第二抽出液流は、第二ゾーンのカラム１０の底部から典型的には収集される。この第二抽出液流は、精製されたＰＵＦＡ生成物を典型的には含む。第二抽出液流は、場合によっては容器に収集され、一部が、第二ゾーンのカラム１１の頂部に再導入されてもよい。第二ゾーンから抽出液流を介して収集された液体の、第二ゾーンに戻される再循環の速度は、液体が、この容器からカラム１１の頂部にポンプで注入される速度である。

この最も好ましい実施形態では、第一ゾーンから抽出液流を介して収集された液体が第一ゾーンに再循環される速度は、第二ゾーンから抽出液流を介して収集された液体が第二ゾーンに再循環される速度より典型的には速い。

この最も好ましい実施形態では、水性有機溶媒の溶離剤は、各ゾーンで実質的に同じである。

本発明のさらに好ましい実施形態では、擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置は、１９個のクロマトグラフィーカラムからなる。これらは、カラム１から１９と称される。１５個のカラムは、カラム１の底部がカラム２の頂部に連結し、カラム２の底部がカラム３の頂部に連結するなどのように連続して配置される。このシステムを通じての溶離剤の流れは、カラム１からカラム２、カラム２からカラム３などである。このシステムを通じての吸着剤の流れは、カラム１９からカラム１８、カラム１８からカラム１７などである。

本実施形態では、第一ゾーンは、上記で論じたようにつながっている１０個の隣接したカラム、カラム１から１０から典型的にはなる。第二ゾーンは、上記で論じたようにつながっている８個のカラム、カラム１１から１９から典型的にはなる。

このさらに好ましい実施形態を図１０に図示する。ＰＵＦＡ生成物（Ｂ）ならびにより極性が高い（Ｃ）およびより極性が低い（ＡおよびＡ’）成分を含む供給混合液Ｆが、第一ゾーンのカラム７の頂部に導入される。１００％の有機溶媒を含む第一脱着剤（Ｄ１）が、第一ゾーンのカラム１の頂部に導入される。水／有機溶媒混合液（好ましくは２％のアセトニトリルおよび９８％の水）を含む第二脱着剤（Ｄ２）が、第一ゾーンのカラム５の頂部に導入される。第一ゾーンでは、より極性が低い成分（Ａ’）および（Ａ）が、抽出液流Ｅ１’およびＥ１としてカラム１および４の底部からそれぞれ除去される。ＰＵＦＡ生成物（Ｂ）およびより極性が高い成分（Ｃ）が、抽残液流Ｒ１としてカラム１０の底部から除去される。次いで、抽残液流Ｒ１が、カラム１７の頂部で第二ゾーンに導入される。水／有機溶媒混合液（好ましくは２％のアセトニトリルおよび９８％の水）を含む第二脱着剤（Ｄ２）が、第二ゾーンのカラム１１の頂部に導入される。第二ゾーンでは、より極性が高い成分（Ｃ）が、抽残液流Ｒ２としてカラム１９の底部で除去される。ＰＵＦＡ生成物（Ｂ）が、抽出液流Ｅ２としてカラム１４の底部で収集される。

この好ましい実施形態では、有機溶媒は、第一ゾーンのカラム１の頂部に典型的には導入される。

この好ましい実施形態では、２％ＭｅＣＮ／９８％水混合液が、第一ゾーンのカラム５の頂部に典型的には導入される。

この好ましい実施形態では、２％ＭｅＣＮ／９８％水混合液が、第二ゾーンのカラム１１の頂部に典型的には導入される。

この好ましい実施形態では、供給流は、第一ゾーンのカラム７の頂部に典型的には導入される。

この好ましい実施形態では、第一抽残液流は、典型的には、第一ゾーンのカラム１０の底部から収集され、第二ゾーンのカラム１７の頂部に導入される。第一抽残液流は、カラム１７に導入される前に、場合によっては容器に収集されてもよい。

この好ましい実施形態では、抽出液流は、第一ゾーンのカラム１および４の底部から典型的には除去される。カラム４の底部から収集された抽出液流は、場合によっては容器に収集され、第一ゾーンのカラム５の頂部に再導入されてもよい。

この好ましい実施形態では、第二抽残液流は、第二ゾーンのカラム１９の底部から典型的には除去される。

この好ましい実施形態では、第二抽出液流は、第二ゾーンのカラム１４の底部から典型的には収集される。この第二抽出液流は、精製されたＰＵＦＡ生成物を典型的には含む。第二抽出液流は、場合によっては容器に収集されて、第二ゾーンのカラム１５の頂部に再導入されてもよい。

典型的には、この最も好ましい実施形態では、第一ゾーンの水：有機溶媒比率は、第二ゾーンの水：有機溶媒比率より低い。

本発明の方法によって、従来のクロマトグラフィー手法を用いて可能であったよりもはるかに高い純度のＰＵＦＡ生成物を実現することができる。本発明の方法によって生成されるＰＵＦＡ生成物は、特に好都合な不純物プロファイルも有し、それは、既知の手法によって調製された油で観察されるものとは全く異なる。したがって、本発明は、ＰＵＦＡ生成物、例えば本発明の方法によって得られるＰＵＦＡ生成物を含む組成物にも関する。

実際には、本発明の方法は、通常、コンピューターによって制御される。したがって、本発明は、本明細書で定義したようにクロマトグラフィー装置を制御するためのコンピュータープログラムであって、実行時に、装置に指示して本発明の方法を実施させるコード手段を含むコンピュータープログラムを提供する。

以下の実施例は、本発明を例示するものである。
実施例

参考例１
図８に概略的に図示するシステムによって、固定相として結合Ｃ１８シリカゲル（粒径３００μｍ）および溶離剤として水性メタノールを用いる実移動床式クロマトグラフィーシステムを使用して、魚油に由来する供給原料（５５重量％ＥＰＡ ＥＥ、５重量％ＤＨＡ ＥＥ）を分画する。図８に示すように、１５個のカラム（直径：７６．２９ｍｍ、長さ９１４．４０ｍｍ）を連続してつなぐ。

８つの異なる事例に対する動作パラメーターおよび流速は以下の通りである。以下の条件の場合には、ＥＰＡ ＥＥは、高水準の純度（ＧＣ ＦＡＭＥＳによれば８５から９８％）で生成される。ゾーン１の抽出液および抽残液ならびにゾーン２の抽出液および抽残液のＧＣ ＦＡＭＥＳトレースを、それぞれに図１１および１２として示す。

参考例１ａ
ステップ時間：７５０秒
サイクル時間：２００分
供給原料（Ｆ）の供給速度：７０ｍｌ／分
脱着剤（Ｄ）の供給速度：８５０ｍｌ／分
抽出液の速度：４２５ｍｌ／分
抽残液の速度：４９５ｍｌ／分

参考例１ｂ
ステップ時間：２５０秒
サイクル時間：６６．６７分
供給原料（Ｆ）の供給速度：２１０ｍｌ／分
脱着剤（Ｄ）の供給速度：２５５０ｍｌ／分
抽出液の速度：１２７５ｍｌ／分
抽残液の速度：１４８５ｍｌ／分

参考例１ｃ
ステップ時間：５００秒
サイクル時間：１３３．３３分
供給原料（Ｆ）の供給速度：２５ｍｌ／分
第一ゾーンにおける脱着剤の供給速度（Ｄ１）：２０５０ｍｌ／分
第一ゾーンにおける抽出液の容器蓄積速度（Ｅ１）：１１２５ｍｌ／分
第一ゾーンにおける抽出液の再循環速度（Ｄ１−Ｅ１）：９２５ｍｌ／分
第一ゾーンにおける抽残液の速度（Ｒ１）：９５０ｍｌ／分
第二ゾーンにおける脱着剤の供給速度（Ｄ２）：１７００ｍｌ／分
第二ゾーンにおける抽出液の容器蓄積速度（Ｅ２）：９００ｍｌ／分
第二ゾーンにおける抽出液の再循環速度（Ｄ２−Ｅ２）：８００ｍｌ／分
第二ゾーンにおける抽残液の速度（Ｒ２）：８００ｍｌ／分

参考例１ｄ
ステップ時間：２５０秒
サイクル時間：６６．６７分
供給原料（Ｆ）の供給速度：５０ｍｌ／分
第一ゾーンにおける脱着剤の供給速度（Ｄ１）：４１２５ｍｌ／分
第一ゾーンにおける抽出液の容器蓄積速度（Ｅ１）：２２５０ｍｌ／分
第一ゾーンにおける抽出液の再循環速度（Ｄ１−Ｅ１）：１８７５ｍｌ／分
第一ゾーンにおける抽残液の速度（Ｒ１）：１９２５ｍｌ／分
第二ゾーンにおける脱着剤の供給速度（Ｄ２）：３３７５ｍｌ／分
第二ゾーンにおける抽出液の容器蓄積速度（Ｅ２）：１８００ｍｌ／分
第二ゾーンにおける抽出液の再循環速度（Ｄ２−Ｅ２）：１５７５ｍｌ／分
第二ゾーンにおける抽残液の速度（Ｒ２）：１５７５ｍｌ／分

参考例１ｅ
ステップ時間：５００秒
サイクル時間：１３３．３３分
供給原料（Ｆ）の供給速度：５０ｍｌ／分
第一ゾーンにおける脱着剤の供給速度（Ｄ１）：４０００ｍｌ／分
第一ゾーンにおける抽出液の容器蓄積速度（Ｅ１）：２２５０ｍｌ／分
第一ゾーンにおける抽出液の再循環速度（Ｄ１−Ｅ１）：１７５０ｍｌ／分
第一ゾーンにおける抽残液の速度（Ｒ１）：１８００ｍｌ／分
第二ゾーンにおける脱着剤の供給速度（Ｄ２）：３２００ｍｌ／分
第二ゾーンにおける抽出液の容器蓄積速度（Ｅ２）：１７５０ｍｌ／分
第二ゾーンにおける抽出液の再循環速度（Ｄ２−Ｅ２）：１４５０ｍｌ／分
第二ゾーンにおける抽残液の速度（Ｒ２）：１４５０ｍｌ／分

参考例１ｆ
ステップ時間：２５０秒
サイクル時間：６６．６７分
供給原料（Ｆ）の供給速度：１００ｍｌ／分
第一ゾーンにおける脱着剤の供給速度（Ｄ１）：４０５０ｍｌ／分
第一ゾーンにおける抽出液の容器蓄積速度（Ｅ１）：２１００ｍｌ／分
第一ゾーンにおける抽出液の再循環速度（Ｄ１−Ｅ１）：１９５０ｍｌ／分
第一ゾーンにおける抽残液の速度（Ｒ１）：２０５０ｍｌ／分
第二ゾーンにおける脱着剤の供給速度（Ｄ２）：３３００ｍｌ／分
第二ゾーンにおける抽出液の容器蓄積速度（Ｅ２）：１７００ｍｌ／分
第二ゾーンにおける抽出液の再循環速度（Ｄ２−Ｅ２）：１６００ｍｌ／分
第二ゾーンにおける抽残液の速度（Ｒ２）：１６００ｍｌ／分

参考例１ｇ
ステップ時間：５００秒
サイクル時間：１３３．３３分
供給原料（Ｆ）の供給速度：２５ｍｌ／分
第一ゾーンにおける脱着剤の供給速度（Ｄ１）：１２７５ｍｌ／分
第一ゾーンにおける抽出液の容器蓄積速度（Ｅ１）：７５０ｍｌ／分
第一ゾーンにおける抽出液の再循環速度（Ｄ１−Ｅ１）：５５０ｍｌ／分
第一ゾーンにおける抽残液の速度（Ｒ１）：５７５ｍｌ／分
第二ゾーンにおける脱着剤の供給速度（Ｄ２）：１２７５ｍｌ／分
第二ゾーンにおける抽出液の容器蓄積速度（Ｅ２）：９５０ｍｌ／分
第二ゾーンにおける抽出液の再循環速度（Ｄ２−Ｅ２）：３２５ｍｌ／分
第二ゾーンにおける抽残液の速度（Ｒ２）：３２５ｍｌ／分

参考例１ｈ
ステップ時間：２５０秒
サイクル時間：６６．６７分
供給原料（Ｆ）の供給速度：５０ｍｌ／分
第一ゾーンにおける脱着剤の供給速度（Ｄ１）：２５５０ｍｌ／分
第一ゾーンにおける抽出液の容器蓄積速度（Ｅ１）：１５００ｍｌ／分
第一ゾーンにおける抽出液の再循環速度（Ｄ１−Ｅ１）：９５０ｍｌ／分
第一ゾーンにおける抽残液の速度（Ｒ１）：１０００ｍｌ／分
第二ゾーンにおける脱着剤の供給速度（Ｄ２）：２０００ｍｌ／分
第二ゾーンにおける抽出液の容器蓄積速度（Ｅ２）：９００ｍｌ／分
第二ゾーンにおける抽出液の再循環速度（Ｄ２−Ｅ２）：６００ｍｌ／分
第二ゾーンにおける抽残液の速度（Ｒ２）：６００ｍｌ／分

参考例２
エイコサテトラエン酸エチルエステル（ＥＴＡ ＥＥ）、ＥＰＡ ＥＥ、それらの異性体およびＤＨＡ ＥＥを含む魚油に由来する供給原料を、図１０に概略的に図示するシステムによって、固定相として結合Ｃ１８シリカゲル（粒径４０〜６０μｍ）および溶離剤として水性メタノールを用いる実移動床式クロマトグラフィーシステムを使用して分画した。図１０に示すように、１９個のカラム（直径：１０ｍｍ、長さ：２５０ｍｍ）を連続してつなぐ。

動作パラメーターおよび流速は以下の通りである。

サイクル時間：６００秒
供給原料（Ｆ）の供給速度：０．５ｍｌ／分
第一ゾーンへの脱着剤（Ｄ１、１００％メタノール）の供給速度：６ｍｌ／分
第一ゾーンへの脱着剤（Ｄ２、９９％メタノール／１％水）の供給速度：６ｍｌ／分
第一ゾーンからの抽出液（Ｅ１’）の速度：３ｍｌ／分
第一ゾーンからの抽出液（Ｅ１）の速度：１．９ｍｌ／分
第一ゾーンからの抽残液（Ｒ１）の速度：４．６ｍｌ／分
第二ゾーンへの脱着剤（Ｄ２、９７％メタノール／３％水）の供給速度：６ｍｌ／分
第二ゾーンからの抽出液（Ｅ２）の速度：２．４ｍｌ／分
第二ゾーンからの抽残液（Ｒ２）の速度：４．６ｍｌ／分

重ねて、ＥＰＡ ＥＥは、（９０重量％を超える、９５重量％を超える、９８重量％を超える）高水準の純度で生成された。

参考例３
魚油に由来する供給原料（５５重量％ＥＰＡ ＥＥ、５重量％ＤＨＡ ＥＥ）を、図８に概略的に図示するシステムによって、固定相として結合Ｃ１８シリカゲル（粒径３００μｍ、粒子多孔度１５０オングストローム）および溶離剤として水性メタノールを用いる実移動床式クロマトグラフィーシステムを使用して分画した。図８に示すように、１５個のカラム（直径：１０ｍｍ、長さ：２５０ｍｍ）を連続してつなぐ。

動作パラメーターおよび流速は以下の通りである。

サイクル時間：３８０秒
供給原料（Ｆ）の供給速度：０．５ｍｌ／分
第一ゾーンへの脱着剤（Ｄ、９８．５％メタノール／１．５％水）の供給速度：９ｍｌ／分
第一ゾーンへの水が豊富な相（Ｗ、８５％メタノール／１５％水）の供給速度：３．１ｍｌ／分
第一ゾーンからの抽出液（Ｅ１）の速度：４ｍｌ／分
第一ゾーンからの抽残液（Ｒ１）の速度：８．６ｍｌ／分
第二ゾーンへの脱着剤（Ｄ、９７％メタノール／３％水）の供給速度：１０．８ｍｌ／分
第二ゾーンへの水が豊富な相（Ｗ、８５％メタノール／１５％水）の供給速度：３．１ｍｌ／分
第二ゾーンからの抽出液（Ｅ２）の速度：４．１ｍｌ／分
第二ゾーンからの抽残液（Ｒ２）の速度：１０．３ｍｌ／分

ＥＰＡ ＥＥは、高水準の純度（＞９５％純度）で生成された。生成物のＧＣトレースを図１３として示す。

参考例４
魚油に由来する供給原料（７０重量％ＤＨＡ ＥＥ、７重量％ＥＰＡ ＥＥ）を、図８に概略的に図示するシステムによって、固定相として結合Ｃ１８シリカゲル（粒径３００μｍ）および溶離剤として水性メタノールを用いる実移動床式クロマトグラフィーシステムを使用して分画する。図８に示すように、１５個のカラム（直径：７６．２９ｍｍ、長さ：９１４．４０ｍｍ）を連続してつなぐ。

動作パラメーターおよび流速は以下の通りである。

ステップ時間：６００秒
サイクル時間：１６０分
供給原料（Ｆ）の供給速度：２５ｍｌ／分
第一ゾーンにおける脱着剤の供給速度（Ｄ１）：２０６２．５ｍｌ／分
第一ゾーンにおける抽出液の速度（Ｅ１）：９００ｍｌ／分
第一ゾーンにおける抽残液の速度（Ｒ１）：１１８７．５ｍｌ／分
第二ゾーンにおける脱着剤の供給速度（Ｄ２）：１５００ｍｌ／分
第二ゾーンにおける抽出液の速度（Ｅ２）：４５０ｍｌ／分
第二ゾーンにおける抽残液の速度（Ｒ２）：１０５０ｍｌ／分

ＤＨＡ ＥＥは、高水準の純度（ＧＣ ＦＡＭＥＳによれば＞９７％）で生成される。ゾーン２の抽出液のＧＣ ＦＡＭＥＳトレースを図１４として示す。

参考例５
魚油に由来する供給原料（３３重量％ＥＰＡ ＥＥ、２２重量％ＤＨＡ ＥＥ）を、図８に概略的に図示するシステムによって、固定相として結合Ｃ１８シリカゲル（粒径３００μｍ）および溶離剤として水性メタノールを用いる実移動床式クロマトグラフィーシステムを使用して分画する。図８に示すように、１５個のカラム（直径：７６．２９ｍｍ、長さ：９１４．４０ｍｍ）を連続してつなぐ。

動作パラメーターおよび流速は以下の通りである。

ステップ時間：３８０秒
サイクル時間：１０１．３３分
供給原料（Ｆ）の供給速度：４０ｍｌ／分
第一ゾーンにおける脱着剤の供給速度（Ｄ１）：１９５０ｍｌ／分
第一ゾーンにおける抽出液の速度（Ｅ１）：８２５ｍｌ／分
第一ゾーンにおける抽残液の速度（Ｒ１）：１１６５ｍｌ／分
第二ゾーンにおける脱着剤の供給速度（Ｄ２）：１４２５ｍｌ／分
第二ゾーンにおける抽出液の速度（Ｅ２）：７８７．５ｍｌ／分
第二ゾーンの抽残液の速度（Ｒ２）：６３７．５ｍｌ／分

ＥＰＡ ＥＥとＤＨＡ ＥＥとの混合液は、高水準の純度（ＥＰＡ ＥＥとＤＨＡ ＥＥとの合計が＞８０％）で生成される。

参考例６
ＳＭＢによって生成された２種のＰＵＦＡ生成物に存在する環境汚染物質の量を蒸留によって調製された同様の油と比較することを目的として、実験を行った。これらの油の汚染物質プロファイルを以下の表１に示す。

参考例７
蒸留によって調製された同等の油と比較して、ＳＭＢによって調製された油に存在する異性体不純物の量を決定することを目的として、実験を行った。

ＳＭＢによって調製された、ＤＨＡが豊富な油のＧＣトレースを図１４として示す。ＧＣトレース中に異性体不純物の形跡はない。

蒸留によって調製された油のＧＣトレースを図１５として示す。ＤＨＡのピークより長い溶出時間を有する４つのピークは、ＤＨＡ異性体に対応する。このＧＣトレースから、蒸留によって調製された油が約１．５重量％の異性体不純物を含むことを理解することができる。

参考例８
ＳＭＢによって生成された、ＥＰＡが豊富な２種の生成物を、蒸留によって生成されたＥＰＡが豊富な油と比較した。それらの構成成分であるＰＵＦＡの重量％分析を以下に示す。

参考例９
ＳＭＢによって生成された、ＥＰＡ／ＤＨＡが豊富な生成物を、蒸留によって生成されたＥＰＡ／ＤＨＡが豊富な油と比較した。それらの構成成分であるＰＵＦＡの重量％分析を以下に示す。

参考例１０
魚油に由来する供給原料（５５重量％ＥＰＡ ＥＥ、５重量％ＤＨＡ ＥＥ）を、固定相としてＣ１８シリカゲル（粒径２０ミクロン、粒子多孔度６０オングストローム）および溶離剤として水性アセトニトリル（１９重量％水、８１重量％アセトニトリル）で充填した単一クロマトグラフィーカラム（直径３０ｃｍ、長さ６０ｃｍ）による固定床式クロマトグラフィーシステムを使用して分画した。９００ｍｌの供給原料を、２２００ｍｌ／分の流速でカラムを通過させた２２Ｌの溶離剤を使用して精製した。

収集したＥＰＡ画分のＧＣ ＦＡＭＥＳトレースを図１６として示す。

魚油に由来する供給原料（５５重量％ＥＰＡ ＥＥ、５重量％ＤＨＡ ＥＥ）を、図８に概略的に図示するシステムによって、固定相として結合Ｃ１８シリカゲル（粒径３００ミクロン、粒子多孔度１５０オングストローム）および溶離剤として水性アセトニトリルを用いる実移動床式クロマトグラフィーシステムを使用して分画する。図８に示すように、１５個のカラム（直径：７６．２９ｍｍ、長さ：９１４．４０ｍｍ）を連続してつなぐ。

動作パラメーターおよび流速は、以下の通りである。

ステップ時間：６００秒
サイクル時間：１６０分
供給原料（Ｆ）の供給速度：５５ｍｌ／分
第一ゾーンにおける脱着剤の供給速度（Ｄ１）：３０００ｍｌ／分
第一ゾーンにおける抽出液の速度（Ｅ１）：１８００ｍｌ／分
第一ゾーンにおける抽残液の速度（Ｒ１）：１４５５ｍｌ／分
第二ゾーンにおける脱着剤の供給速度（Ｄ２）：１４００ｍｌ／分
第二ゾーンにおける抽出液の速度（Ｅ２）：６００ｍｌ／分
第二ゾーンにおける抽残液の速度（Ｒ２）：９４５ｍｌ／分

Ａ より極性が低い成分
Ａ’ より極性が低い成分
Ｂ ＰＵＦＡ生成物
Ｃ より極性が高い成分
Ｄ 脱着剤
Ｄ１ 第一脱着剤
Ｄ２ 第二脱着剤
Ｅ１ 抽出液流
Ｅ１’ 抽出液流
Ｅ２ 抽出液流
Ｆ 供給混合液、供給原料
Ｒ１ 抽残液流
Ｒ２ 抽残液流
Ｗ 水が豊富な相

Claims (28)

1. 多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）生成物を供給混合液から回収するためのクロマトグラフィー分離方法であって、溶離剤として水性有機溶媒を含む複数の連結したクロマトグラフィーカラムを有する擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置に供給混合液を導入することを含み、装置が、少なくとも第一ゾーンおよび第二ゾーンを含む複数のゾーンを有し、各ゾーンが、前記複数の連結したクロマトグラフィーカラムから液体が収集され得る抽出液流および抽残液流を有し、（ａ）より極性が高い成分とともにＰＵＦＡ生成物を含む抽残液流が第一ゾーンのカラムから収集され、第二ゾーンの隣接していないカラムに導入され、かつ／または（ｂ）より極性が低い成分とともにＰＵＦＡ生成物を含む抽出液流が第二ゾーンのカラムから収集され、第一ゾーンの隣接していないカラムに導入され、前記ＰＵＦＡ生成物が供給混合液の異なる成分から各ゾーンで分離され、水性有機溶媒が水性アルコール以外である、方法。
2. 第一ゾーンからの抽出液流、第一ゾーンからの抽残液流、第二ゾーンからの抽出液流および第二ゾーンからの抽残液流の１つまたは複数の一部が、同一ゾーン、典型的には同一ゾーンの隣接したカラムに再循環する、請求項１に記載の方法。
3. （ａ）各ゾーンに存在する水性有機溶媒の溶離剤が、異なる水：有機溶媒比率を有し、かつ／または
   （ｂ）各ゾーンで抽出液および抽残液流を介して収集された液体が同一ゾーンに再循環される速度が、各ゾーンで供給混合液の異なる成分からＰＵＦＡ生成物を分離できるように調整される、請求項１または２に記載のクロマトグラフィー分離方法。
4. 第一ゾーンから抽出液流を介して収集された液体が第一ゾーンに再循環される速度が、第二ゾーンから抽出液流を介して収集された液体が第二ゾーンに再循環される速度とは異なり、かつ／または第一ゾーンから抽残液流を介して収集された液体が第一ゾーンに再循環される速度が、第二ゾーンから抽残液流を介して収集された液体が第二ゾーンに再循環される速度とは異なる、請求項３に記載のクロマトグラフィー分離方法。
5. 装置が、第一ゾーンおよび第二ゾーンを有し、前記ＰＵＦＡ生成物がより極性が低い供給混合液成分から第一ゾーンで分離され、前記ＰＵＦＡ生成物がより極性が高い供給混合液成分から第二ゾーンで分離される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
6. ＰＵＦＡ生成物が少なくとも１つのω−３ＰＵＦＡを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
7. ＰＵＦＡ生成物がＥＰＡおよび／またはＤＨＡを含む、請求項６に記載の方法。
8. クロマトグラフィー分離方法において、前記ＰＵＦＡ生成物に加えて、さらなる二次的なＰＵＦＡ生成物が回収される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
9. ＰＵＦＡ生成物がＥＰＡであり、さらなる二次的なＰＵＦＡ生成物がＤＨＡである、請求項８に記載の方法。
10. クロマトグラフィーカラムが実質的に球状のビーズを吸着剤として含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
11. ビーズがＣ１８結合シリカゲルから形成される、請求項１０に記載の方法。
12. 実質的に球状のビーズが２５０から５００μｍの直径を有する、請求項１０または１１に記載の方法。
13. 溶離剤が、水とエーテル、エステル、ケトンまたはニトリルとの混合液である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
14. 溶離剤が水とアセトニトリルとの混合液である、請求項１３に記載の方法。
15. 第一ゾーンの溶離剤が第二ゾーンの溶離剤よりも多くの有機溶媒を含み、第二ゾーンが、システムにおける溶離剤の流れに対して、第一ゾーンの下流にある、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
16. 第一ゾーンの溶離剤の水：有機溶媒比率が１０：９０から１５：８５容積部であり、第二ゾーンの溶離剤の水：有機溶媒比率が１５：８５から２０：８０容積部である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
17. 第一および第二ゾーンの溶離剤の水：有機溶媒比率が、水および／または有機溶媒を第一および第二ゾーンの１個または複数のカラムに導入することによって制御される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
18. 第一ゾーンから抽出液流を介して収集された液体が第一ゾーンに再循環される速度が、第二ゾーンから抽出液流を介して収集された液体が第二ゾーンに再循環される速度より速い、請求項２から１７のいずれか一項に記載の方法。
19. （ｉ）供給混合液を第一ゾーンに導入し、ＰＵＦＡ生成物が豊富な第一抽残液流およびＰＵＦＡ生成物が欠乏している第一抽出液流を除去すること、ならびに
    （ｉｉ）第一抽残液流を第二ゾーンに導入し、ＰＵＦＡ生成物が欠乏している第二抽残液流を除去し、第二抽出液流を収集してＰＵＦＡ生成物を得ること
    を含む、請求項５から１８のいずれか一項に記載の方法。
20. （ｉ）供給混合液を第二ゾーンに導入し、ＰＵＦＡ生成物が欠乏している第一抽残液流およびＰＵＦＡ生成物が豊富な第一抽出液流を除去すること、ならびに
    （ｉｉ）第一抽出液流を第一ゾーンに導入し、ＰＵＦＡ生成物が欠乏している第二抽出液流を除去し、第二抽残液流を収集してＰＵＦＡ生成物を得ること
    を含む、請求項５から１８のいずれか一項に記載の方法。
21. 擬似または実移動床式クロマトグラフィー装置が１５個のクロマトグラフィーカラム１から１５を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
22. 第一ゾーンが８個の隣接したカラム１から８からなる、請求項５から２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 第二ゾーンが７個の隣接したカラム、９から１５からなる、請求項５から２２のいずれか一項に記載の方法。
24. （ａ）有機溶媒がカラム１に導入され、かつ／または（ｂ）有機溶媒がカラム９に導入され、かつ／または（ｃ）水がカラム４に導入され、かつ／または（ｄ）水がカラム１２に導入される、請求項２１から２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 水性有機溶媒がカラム１および／またはカラム９に導入される、請求項２１から２３のいずれか一項に記載の方法。
26. 第一抽残液流がカラム７から収集され、カラム１３に導入される、請求項２１から２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 装置が、第一ゾーン、第二ゾーンおよび第三ゾーンを有し、（ａ）第一ゾーンの溶離剤が第二および第三ゾーンの溶離剤より多くの有機溶媒を含み、第一ゾーンが、システムにおける溶離剤の流れに対して、第二および第三ゾーンの上流にあり、（ｂ）第二ゾーンの溶離剤が第三ゾーンの溶離剤より多くの有機溶媒を含み、第二ゾーンが、システムにおける溶離剤の流れに対して、第三ゾーンの上流にあり、前記ＰＵＦＡ生成物がＰＵＦＡ生成物より極性が低い供給混合液成分から第一ゾーンで分離され、前記ＰＵＦＡ生成物がＰＵＦＡ生成物より極性が低いが第一ゾーンで分離された成分より極性が高い供給混合液成分から第二ゾーンで分離され、前記ＰＵＦＡ生成物がＰＵＦＡ生成物より極性が高い供給混合液成分から第三ゾーンで分離される、請求項１に記載の方法。
28. 請求項１から２７のいずれか一項に定義されたクロマトグラフィー装置を制御するためのコンピュータープログラムであって、実行時に、請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法を実施するように装置に指示するコード手段を含む、コンピュータープログラム。

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