JP2014512178A - 合成抗微生物効果 - Google Patents
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Abstract
本発明は、生物防除の分野に関し、特に、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）株及び／又はラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）株を含有する、抗微生物組成物に関する。更に、本発明は、そのような抗微生物組成物の、そのような抗微生物組成物を含有する食料、飼料及び医薬製品を製造するための使用、そのような食料、飼料及び医薬製品を製造する方法、並びにそのような食料、飼料及び医薬製品の望まれない微生物の含有量を減少させる方法に関する。
【選択図】図２
【選択図】図２
Description
本発明は、生物防除の分野に関し、特に、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）株及び／又はラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）株を含有する、抗微生物組成物に関する。更に、本発明は、そのような抗微生物組成物の、そのような抗微生物組成物を含有する食料、飼料及び医薬製品を製造するための使用、そのような食料、飼料及び医薬製品を製造する方法、並びにそのような食料、飼料及び医薬製品の望まれない微生物の含有量を減少させる方法に関する。
生物防御培養株（Ｂｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｃｕｌｔｕｒｅ）は、化学的保存料の代替品として、様々な食品用途に使用されている。乳製品において、酵母やカビによるコンタミネーションは、当該乳製品の棚寿命（ｓｈｅｌｆ ｌｉｆｅ）を限定し得る。酵母及びカビのコンタミネーションの顕著な問題を経験する製品分野として、フレッシュチーズが挙げられる。
これらの問題を解決するための生物防御溶液は、乳業分野で開発されてきた。市場において最も有名で恐らく最も一般に使用される抗真菌生物防御溶液は、Ｄａｎｉｓｃｏ製のＨＯＬＤＢＡＣ（商標）ＹＭ−ｂ及びＨＯＬＤＢＡＣ（商標）ＹＭ−Ｃであり、これらのいずれも、プロピオニバクテリア（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａ）及びラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の亜種の組み合わせを含有する。
プロピオン酸細菌を乳酸細菌と一緒に微生物の阻害のために使用することは、特許出願ＵＳ ２００５／００９５３１８及びＷＯ ２００４／０４１３０５に開示されている。
プロピオニバクテリア亜種（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｓｓｐ．）は、主にプロピオン酸の生産に加えて酢酸及び他の代謝物の生産を通じて、抗真菌活性に寄与すると考えられている。
しかしながら、これらの種は、産業スケールでの生産にかなりの費用かかり、また、プロピオン酸の生産は、最終的な乳製品に臨まれない変質を生じさせる可能性がある。
乳製品用の市販の他の抗真菌生物防御溶液として、Ｓａｃｃｏ製のＬｙｏｆａｓｔ ＬＰＲＡ及びＢＩＯＰＲＯＸ製のＡｒｏｍａ−Ｐｒｏｘ（登録商標）ＲＰ８０が挙げられる。これらの製品のいずれも、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）及びラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）の組み合わせを含有する。Ｔｈａｒｍａｒａｊ ａｎｄ Ｓｈａｈ （２００９）は、チーズベースのディップにおける生物防御乳酸菌の候補のスクリーニングを記載している。単一の株として試験されたラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）及びラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）は、酵母及びカビに対して最大の阻害効果を示した。しかしながら、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）及びラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）の組み合わせについては、試験されなかった。
従って、抗真菌効果を損なわずにプロピオニバクテリア亜種（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｓｓｐ．）の使用を控えられる、改善された生物防御溶液を開発することには、産業上の受容が存在する。
本発明は乳及び乳製品中のコンタミナントとして知られる細菌及び真菌微生物の増殖の阻害に顕著に効果的な乳酸菌の新規株を同定した。更に、本発明は、特定の乳酸菌が、他種の乳酸菌と組み合わされたとき、顕著な相乗的抗微生物効果を発揮することを見出した。組み合わせられた２種類の細菌の抗微生物効果は、驚くべきことに、当該２種類の細菌を単独で用いた場合の効果の合計を上回る。
従って、本発明の第一の側面は、１つ以上のラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）株及び１つ以上のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）株を含有する、抗微生物組成物に関する。好ましい態様において、当該抗微生物組成物は、（ａ）ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１２６９７及びラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６並びにそれらの突然変異株からなる群から選択される１つ以上のラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）株、並びに（ｂ）ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７及びその突然変異株からなる群から選択される１つ以上のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）株を含有する。他の好ましい側面において、本発明は、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１２６９７、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７及びそれらの突然変異株から選択される１つ以上の株を含有する抗微生物組成物を提供し、ここで当該突然変異株は、出発材料として供託された前記株を使用して取得される。
本発明の組成物は、ヒト及び動物用の食料、飼料及び医薬製品等における、真菌、細菌及びそれらの混合物から選択される望まれない微生物の繁殖を阻害出来るという利点を提供する。真菌、例えば酵母及びカビの増殖の予防及び／又は阻害が、特に想定される。従って、好ましい態様において、「抗微生物」という用語は、「抗真菌」として理解されるべきである。従って、本発明の第二の側面は、食料、飼料及び医薬製品の調製における、第一の側面の抗微生物組成物の使用に関する。
第三の側面は、真菌、細菌及びその混合物からなる群から選択される望まれない微生物の増殖を阻害するための第一の側面の抗微生物組成物の使用に関する。特に、本発明の組成物は、乳業のプロセス、例えば乳の発酵プロセスにおける既知のコンタミナントである真菌及び細菌の増殖を阻害及び／又は予防するのに使用され得る。
第四の側面は、医薬製品としての第一の側面の抗微生物組成物の使用に関する。当該医薬製品は、好ましくは、細菌又は真菌、好ましくはカビが感染した患者を治療するのに使用される。
第五の側面は、本発明の第一の側面の抗微生物組成物を含有する食料、飼料又は医薬製品に関する。
本発明の第六の側面は、本発明の第五の側面の食料、飼料又は医薬製品を製造する方法に関し、当該方法は、当該食料、飼料又は医薬製品の製造の過程で、本発明の第一の側面の抗微生物組成物を添加する工程を含む。ここで、当該方法は、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）株とラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）株を組み合わせて含有する抗微生物組成物の添加を含み、当該組成物は、１つ以上のラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）株及び１つ以上のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）株が、当該食料、飼料又は医薬製品に対して、それぞれ１ｘ１０６ｃｆｕ／ｇ以上、好ましくは５ｘ１０６ｃｆｕ／ｇ以上、又はそれぞれ１ｘ１０６ｃｆｕ／ｍｌ以上、好ましくは５ｘ１０６ｃｆｕ／ｍｌ以上、あるいは当該食料、飼料又は医薬製品の表面に、１ｘ１０５ｃｆｕ／ｃｍ２、好ましくは１ｘ１０７ｃｆｕ／ｃｍ２の濃度となるように添加される。そして、当該製造の過程で、製造パラメーターは、１つ以上のラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）株及び１つ以上のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）株の濃度が増大し、又は一定となるように制御される。
第七の側面において、本発明は、Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ （ＤＳＭＺ）に受入番号ＤＳＭ２４６１６で供託されたラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１２６９７、又はその突然変異株に関し、当該突然変異株は、出発材料として供託された当該株を使用して取得される。
第八の側面において、本発明は、Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ （ＤＳＭＺ）に受入番号ＤＳＭ２４６５２で供託されたラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６、又はその突然変異株に関し、当該突然変異株は、出発材料として供託された当該株を使用して取得される。
Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ （ＤＳＭＺ）に受入番号ＤＳＭ２４６５１で供託されたラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７；
Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ （ＤＳＭＺ）に受入番号ＤＳＭ２４６５１で供託されたラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７；
第九の側面において、本発明は、Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ （ＤＳＭＺ）に受入番号ＤＳＭ２４６５１で供託されたラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７、又はその突然変異株に関し、当該突然変異株は、出発材料として供託された当該株を使用して取得される。
定義
本明細書中で使用されたとき、「乳酸菌」は、糖の発酵において主に生産される酸として乳酸を含む酸を生産する、グラム陽性微小好気性又は嫌気性細菌を指す。産業上最も有用な乳酸菌は、ラクトコッカス亜種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、ストレプトコッカス亜種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ． ）、ラクトバチルス亜種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ． ）、ロイコノストック亜種（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｓｐｐ． ）、シュードロイコノストック亜種（Ｐｓｅｕｄｏｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｓｐｐ． ）、ペディオコッカス亜種（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ． ）、ブレビバクテリウム亜種（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ． ）、エンテロコッカス亜種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）を含む「ラクトバチラレス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）」目に属する。これらは、単独で、又は他の乳酸菌と組み合わせて、食品用培養株としてしばしば使用される。
本明細書中で使用されたとき、「乳酸菌」は、糖の発酵において主に生産される酸として乳酸を含む酸を生産する、グラム陽性微小好気性又は嫌気性細菌を指す。産業上最も有用な乳酸菌は、ラクトコッカス亜種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、ストレプトコッカス亜種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ． ）、ラクトバチルス亜種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ． ）、ロイコノストック亜種（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｓｐｐ． ）、シュードロイコノストック亜種（Ｐｓｅｕｄｏｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｓｐｐ． ）、ペディオコッカス亜種（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ． ）、ブレビバクテリウム亜種（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ． ）、エンテロコッカス亜種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）を含む「ラクトバチラレス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）」目に属する。これらは、単独で、又は他の乳酸菌と組み合わせて、食品用培養株としてしばしば使用される。
ラクトバチルスｓｐ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）及びストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の種の細菌を含む乳酸菌は、通常、乳業において、バルク出発育苗物（ｂｕｌｋ ｓｔａｒｔｅｒ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）のための凍結又は凍結乾燥培養株として、又は、発酵器しくはチーズ等の乳製品の生産のために発酵ベセルやバットに直接播種することを意図したいわゆるＤｉｒｅｃｔ Ｖａｔ Ｓｅｔ（ＤＶＳ）培養株として供給される。そのような乳酸菌培養株は、一般に、「出発培養株（ｓｔａｒｔｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ）」又は「出発株（ｓｔａｒｔｅｒ）」と称される。
本明細書中、「中温性（ｍｅｓｏｐｈｉｌｅ）」という用語は、中等度の温度（１５℃〜４０℃）で最も繁殖する微生物を指す。産業上最も有用な中温性細菌は、ラクトコッカス亜種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）及びロイコノストック亜種（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｓｐｐ．）を含む。本明細書中、「中温発酵」という用語は、約２２℃〜約３５℃の間の温度での発酵を指す。「中温発酵乳製品」という用語は、中温性出発培養株の中温発酵により調製された発酵乳製品を指し、そのような発酵乳製品として、バターミルク、サワーミルク、カルチャードミルク、スメタナ、サワークリーム及びフレッシュチーズ、例えばクアーク、トバログ及びクリームチーズが挙げられる。
本明細書中、「好熱性」という用語は、４３℃超の温度で最も繁殖する微生物を指す。産業上最も有用な好熱性細菌として、ストレプトコッカス亜種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）及びラクトバチルス亜種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）が挙げられる。本明細書中、「好熱発酵」という用語は、約３５℃を上回る温度、例えば約３５℃〜約４５℃での発酵を指す。「好熱発酵乳製品」という用語は、好熱性出発培養株の好熱発酵により調製された発酵乳製品を指し、そのような発酵乳製品として、セットヨーグルト、スタードヨーグルト及び飲用ヨーグルトが挙げられる。
「乳」という用語は、任意の哺乳類、例えばウシ、羊、ヤギ、バッファロー又はラクダ等を搾乳して得た乳分泌物として理解されるべきである。好ましい態様において、乳は、牛乳である。また、乳は、植物材料から生産したタンパク質／脂肪溶液、例えば投入をも含む。
「乳基質」という用語は、本発明の方法に係る発酵に供され得る任意の生乳／調製乳材料を指す。従って、有用な乳基質は、限定されないが、タンパク質を含有する任意の乳又は乳様製品の溶液／懸濁物、例えば全乳又は低脂肪乳、スキムミルク、バターミルク、再構築乳粉、練乳、乾燥乳、ホエイ、ホエイ透過物、ラクトース、ラクトースの結晶化からの母液、ホエイタンパク質濃縮物、又はクリームを含む。明らかに、乳基質は任意の哺乳類由来であってもよく、例えば実質的に純粋な哺乳類の乳、又は再構築乳粉である。発酵の前に、当該技術分野で公知の方法に従い乳基質は均質化又は殺菌されてもよい。
本明細書中、「均質化」という用語は、可溶性懸濁物又は乳液を取得するための激しい混合を意味する。均質化が発酵の前に実施される場合、それは、乳脂肪が乳から分離しない程度に小さなサイズに分散するように実施されるべきである。これは、乳を小さなオリフィスで高圧をかけることにより達成され得る。
本明細書中、「殺菌」とは、生きた生物、例えば微生物を減少又は死滅させるために乳基質を処理することを意味する。好ましくは、殺菌は、一定時間特定の温度で乳基質を維持することにより達成される。当該特定の温度は、通常加熱により達成される。殺菌温度及び時間は、特定の細菌、例えば有害な細菌を死滅又は不活性化するように選択され得る。急速冷却工程が続いてもよい。
本発明における「発酵」は、微生物の作用により炭水化物がアルコール又は酸に変換されることを意味する。好ましくは、本発明の方法は、ラクトースを乳酸に変換することを含む。
乳製品の生産に使用される発酵プロセスは周知であり、当業者は、温度、酸素量、微生物の量及び特性、並びに処理時間等の適切な処理条件をどのように選択するかを心得ている。自明であるが、発酵条件は、本発明の達成を支持するように、即ち固体（チーズ等）又は液状（例えば発酵乳製品）の乳製品を取得するように選択される。
本明細書中、「望まれない微生物」は、病原性の、及び／又は食料、飼料若しくは医薬製品を劣化させる、細菌及び真菌、例えば酵母等の微生物を意味する。
望まれない微生物に関して「阻害する」及び「阻害すべき」という用語は、例えば、抗微生物組成物を添加した、食料製品中、及び／又は食料製品表面上の望まれない微生物の数又は密度又は増殖率が、そのような抗微生物組成物を添加していない食料製品中、及び／又は食料製品表面上よりも少ないことを意味する。
本明細書において、「突然変異」という用語は、遺伝子操作、放射線照射及び／又は化学処理等の手段により作製された、本発明の株に由来する株として理解されるべきである。突然変異は、機能的に同等の突然変異、例えば親株と比較して実質的に同一、又は改善された特徴を有する（例えばジアセチル生産、粘性、ゲル強度、口腔被膜（ｍｏｕｔｈ ｃｏａｔｉｎｇ）、風味、ポスト酸性化（ｐｏｓｔ ａｃｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、酸性化速度及び／又はファージロバスト性（ｐｈａｇｅ ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ））突然変異である。そのような突然変異は、本発明の一部である。特に、「突然変異」という用語は、エタンメタンスルホン酸（ＥＭＳ）又はＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトログアニジン（ＮＴＧ）等の化学変異原やＵＶ光等による処理を含む通常使用される任意の突然変異形成処理に本発明の株を供することにより取得された株、又は自然発生した突然変異を指す。突然変異は、複数の突然変異形成処理（１つの処理は、スクリーニング／選択工程が続く突然変異形成処理として理解されるべきである）に供されたものでもよいが、好ましくは、２０以下、又は１０以下又は５以下の処理（又はスクリーニング／選択工程）が実施されるのが望ましい。好ましい突然変異において、親株と比較して、細菌ゲノム中のヌクレオチドの５％未満、又は１％未満、又は０．１％未満が、別のヌクレオチドに変化し、又は欠失している。
本願の記載における「当該」、「前記」、「１つの」という用語、及びこれらの類似語（特に特許請求の範囲）は、他の言及が無い限り、又は明確に否定していない限り、単数及び複数の両方を包含すると想定される。「含む」、「有する」、「含有する」、及び「包含する」という用語は、他に言及が無い限り、非限定的用語（即ち「含むがそれに限定されない」を意味する）として理解されるべきである。本明細書中の数値範囲の記載は、他に言及が無い限り、単に当該範囲内の各個別の数値を個別に参照する簡単な方法と見なされることが意図され、各個別の数値は、それらが個別に本明細書中に記載されているかのように本明細書中に包含される。本明細書中に記載される全ての方法は、本記載中に他の言及が無い限り、又は明確に否定されていない限り、任意の適切な順番で実施され得る。本明細書中の任意の及び全ての例実施例、又は例示的用語（「例えば」等）は、本発明をより良く明示することのみを意図しており、他の言及が無い限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中のいずれの用語も、本発明の実施に必須の明示されていない要素であることを示唆するものとして解釈されるべきではない。
発明の実施及び側面
発明者らは、カビ及び酵母等の望まれない微生物に対して有効な２つの異なる乳酸菌株の１つ又はそれらの混合物を含有する抗微生物組成物を提供するために、鋭意スクリーニングと研究を行った。
発明者らは、カビ及び酵母等の望まれない微生物に対して有効な２つの異なる乳酸菌株の１つ又はそれらの混合物を含有する抗微生物組成物を提供するために、鋭意スクリーニングと研究を行った。
本発明は、酵母及びカビ等の広範囲の微生物に対して最も効果的な単一又は組み合わせの株を見つけるために、２００株のラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）及びラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）の候補をスクリーニングした。スクリーニングは、可能な限り中温性発酵乳製品を模倣した乳ベースの培地を用いたモデルアッセイにおいて行われ、当該培地に、出発培養株を、生物防御株の候補と共に、又は単独で添加し、そしてそれを、中温性発酵乳製品において採用される条件下で発酵させた。標的の微生物は、中温性発酵乳製品から単離された。Ｄａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓ， Ｄｅｎｍａｒｋから提供されたＨＯＬＤＢＡＣ（商標）培養株、並びに乳酸菌及びプロピオン酸細菌のいずれも含有する完全ＨＯＬＤＢＡＣ（商標）ＹＭ−Ｂ及びＨＯＬＤＢＡＣ（商標）ＹＭ−Ｃから単離した乳酸菌を、ベンチマークとして使用した。
ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）及びラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）の中から１７個の候補が、２５℃で試験したとき、ベンチマークの乳酸菌と同等に、又はより顕著に、１２個の指標のカビを阻害した。従って、第一の側面において、本発明は、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）又はラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）の１つ以上の株を含有する抗微生物組成物に関する。
同定した９個の候補株も、低温条件下で試験したときベンチマークの乳酸菌と同程度の活性を示し、特に、受入番号ＤＳＭ２４６５１のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７、受入番号ＤＳＭ２４６１６のラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１２６９７ 、及び受入番号ＤＳＭ２４６５２のラクトバチルス・ラモノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６の３つの株は、非常に有効であることが示された。これらの３つの株は、Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ （ＤＳＭＺ）に供託された。
これらの株は、いわゆるボトルアッセイで試験したとき、ＨＯＬＤＢＡＣ（商標）培養株と比較して、単一で、様々な酵母に対して、顕著な、あるいは有意な効果を発揮した。従って、これらの単一の株は、抗微生物剤としての使用に非常に適している。好ましい態様において、本発明は、以下の群：
Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ （ＤＳＭＺ）に受入番号ＤＳＭ２４６１６で供託されたラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１２６９７、
Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ （ＤＳＭＺ）に受入番号ＤＳＭ２４６５２で供託されたラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６、
Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ （ＤＳＭＺ）に受入番号ＤＳＭ２４６５１で供託されたラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７；
及びそれらの突然変異株から選択される１つ以上の株を含有し、ここで当該突然変異株が、出発材料として供託された前記株を使用して取得される、抗微生物組成物を提供する。
Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ （ＤＳＭＺ）に受入番号ＤＳＭ２４６１６で供託されたラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１２６９７、
Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ （ＤＳＭＺ）に受入番号ＤＳＭ２４６５２で供託されたラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６、
Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ （ＤＳＭＺ）に受入番号ＤＳＭ２４６５１で供託されたラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７；
及びそれらの突然変異株から選択される１つ以上の株を含有し、ここで当該突然変異株が、出発材料として供託された前記株を使用して取得される、抗微生物組成物を提供する。
特に好ましい態様において、本発明の抗微生物組成物は、抗微生物活性を有する一つの剤として、上記株又はそれらの突然変異の１つを含有する。
上記３つの株とは別に、本発明は、これらの株由来の突然変異、即ち出発材料として供託されたＣＨＣＣ１２７７７、ＣＨＣＣ１２６９７又はＣＨＣＣ１４２２６株の一つを使用して取得される突然変異株をも想定する。突然変異株は、例えば遺伝子操作、放射線照射、ＵＶ照射、化学処理、及び／又はゲノムに変化を誘導する任意の方法を使用して、上記出発材料から作製されてもよい。本発明の突然変異は、特定の細菌又は真菌、好ましくはカビの増殖を阻害又は予防し得る。当該突然変異は、例えばコンタミナントとして酵母Ｋ． ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｐ． ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｙ． ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ又はＣ． ｓａｋｅの一つを使用する実施例２に記載のアッセイ等で判定したとき、その親株と比較して、８０％以上、９０％以上、９５％以上、又は１００％以上の抗微生物、例えば抗真菌活性を有する。
これらの株の望まれない微生物に対する阻害効果は、下記実施例に記載されるように、適切な保存期間中、適切な温度で、ボトルを保存することにより判定され得る。
一般に、この方法が実施されるべき適切な温度は、具体的な食料、飼料又は医薬製品が通常保存及び／又は製造される温度に依存する。製品が通常保存される温度は、５℃〜２６℃、好ましくは約８℃である。
当該温度での保存時間は、当該食料、飼料又は医薬製品が通常保存される期間（棚寿命）に依存する。通常の保存期間は、７〜２８日、好ましくは約２１日である。
２つの株の組み合わせを試験すると、最も有効な単一の株の組み合わせは、添加された細胞の合計の濃度が単一での試験の場合と２つの株の組み合わせでの試験の場合とで同じであっても、それらの株を単独で使用した場合よりも良好であった。ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７とラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１２６９７の組み合わせ、又はラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７及びラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６の組み合わせは、ベンチマークの培養株であるＤａｎｉｓｃｏ， ＤｅｎｍａｒｋのＨＯＬＤＢＡＣ（商標）ＹＭ−Ｂ及びＨＯＬＤＢＡＣ（商標）ＹＭ−Ｃよりも効果的であった。
従って、好ましい態様において、本発明は、１つ以上のラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）及び１つ以上のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）を含有する抗微生物組成物に関し、当該１つ以上のラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）は、受入番号ＤＳＭ２４６１６のラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１２６９７、受入番号ＤＳＭ２４６５２のラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６、及びそれらの突然変異株から選択され、ここで、当該突然変異株は、出発材料として供託された上記株を使用して取得される。
他の好ましい態様において、１つ以上のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）は、受入番号ＤＳＭ２４６５１のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７及びその突然変異株からなる群から選択され、ここで当該突然変異株が、出発材料として供託された前記株を使用して取得される。
更なる態様において、本発明は、１つ以上のラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）及び１つ以上のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）を含有する抗微生物組成物、より好ましくは抗真菌組成物に関し、ここで、
当該１つ以上のラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）は、受入番号ＤＳＭ２４６１６のラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１２６９７、受入番号ＤＳＭ２４６５２のラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６、及びそれらの突然変異株から選択され、ここで、当該突然変異株は、出発材料として供託された上記株を使用して取得され、かつ
当該１つ以上のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）は、受入番号ＤＳＭ２４６５１のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７及びその突然変異株からなる群から選択され、ここで当該突然変異株が、出発材料として供託された前記株を使用して取得される。
当該１つ以上のラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）は、受入番号ＤＳＭ２４６１６のラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１２６９７、受入番号ＤＳＭ２４６５２のラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６、及びそれらの突然変異株から選択され、ここで、当該突然変異株は、出発材料として供託された上記株を使用して取得され、かつ
当該１つ以上のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）は、受入番号ＤＳＭ２４６５１のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７及びその突然変異株からなる群から選択され、ここで当該突然変異株が、出発材料として供託された前記株を使用して取得される。
１つ以上のラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ） ＣＨＣＣ１２６９７及び１つ以上のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ） ＣＨＣＣ１２７７７を含有する抗微生物組成物が、特に好ましい。同様に、１つ以上のラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ） ＣＨＣＣ１４２２６及び１つ以上のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ） ＣＨＣＣ１２７７７を含有する抗微生物組成物も、本発明において特に好ましい。
典型的には、前記抗微生物組成物は、凍結、乾燥、又は凍結乾燥濃縮物等の濃縮形態の細菌を含有し、典型的には、生細胞の濃度は、組成物１ｇあたり１０４〜１０１２ｃｆｕ（コロニー形成単位）であり、例えば１０４ｃｆｕ／ｇ以上、例えば１０５ｃｆｕ／ｇ以上、例えば１０６ｃｆｕ／ｇ以上、例えば１０７ｃｆｕ／ｇ以上、例えば１０８ｃｆｕ／ｇ以上、例えば１０９ｃｆｕ／ｇ以上、例えば１０１０ｃｆｕ／ｇ以上、例えば１０１１ｃｆｕ／ｇ以上である。従って、本発明の抗微生物組成物は、好ましくは、凍結、乾燥又は凍結乾燥の形態で、例えばＤｉｒｅｃｔ Ｖａｔ Ｓｅｔ（ＤＶＳ）培養株として存在する。しかしながら、本明細書中で使用されるとき、抗微生物組成物は、当該凍結、乾燥又は凍結乾燥細胞濃縮物を、水又はＰＢＳ等の液体媒体中に懸濁することにより取得される液体であってもよい。本発明の抗微生物組成物が懸濁物である場合、生細胞の濃度は、組成物１ｍｌあたり１０４〜１０１２ｃｆｕ（コロニー形成単位）であり、例えば１０４ｃｆｕ／ｍｌ以上、例えば１０５ｃｆｕ／ｍｌ以上、例えば１０６ｃｆｕ／ｍｌ以上、例えば１０７ｃｆｕ／ｍｌ以上、例えば１０８ｃｆｕ／ｍｌ以上、例えば１０９ｃｆｕ／ｍｌ以上、例えば１０１０ｃｆｕ／ｍｌ以上、例えば１０１１ｃｆｕ／ｍｌ以上である。
前記組成物は、更なる成分として、凍結保護剤及び／又は公知の添加物、例えば酵母抽出物、糖類及びビタミン、例えばビタミンＡ， Ｃ， Ｄ， Ｋ又はビタミンＢ類のビタミン等の栄養素を追加で含有してもよい。本発明の組成物に追加され得る適切な凍結保護剤は、マンニトール、ソルビトール、トリポリリン酸ナトリウム、キシリトール、グリセロール、ラフィノース、マルトデキストリン、エリスリトール、スレイトール、トレハロース、グルコース及びフルクトース等の、微生物の凍結耐性を改善する成分である。他の添加物として、炭水化物、香料、鉱物、酵素（例えばレンネット、ラクターゼ及び／又はホスホリパーゼ）が挙げられる。
ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ） 株及びラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）株を含有する本発明の抗微生物組成物において、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ） 株とラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）株の比率、例えばラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ） 株とラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）株の濃度又は個数の比率は、好ましくは１：１００〜１００：１、好ましくは１：１０〜１０：１である。
本発明の抗微生物組成物は、微生物分解及び／又は酵母及びカビによるコンタミネーションを受けやすい任意の食料、飼料及び医薬製品に使用され得る。これらは、限定されないが、乾燥品を含む果物及び野菜、穀物及び穀物由来の製品、乳製品、獣肉、鶏肉及び海産物が含まれる。特に好ましい態様において、前記組成物は、乳製品及び／又は獣肉及び鶏肉に使用される。好ましい態様において、本発明の組成物は、ヨーグルト、トバログ、サワークリーム、クリームチーズ等の乳製品に調製において添加物として使用される。
本発明の抗細菌組成物は、真菌及び細菌並びにそれらの混合物からなる群から選択される望まれない微生物の阻害にも使用され得る。本発明の組成物は、乳発酵プロセス等の乳業のプロセスにおけるありふれたコンタミナントである、真菌及び細菌の増殖を阻害及び／又は防止するのに、特に有用である。
特に好ましい態様において、本発明の抗微生物組成物は、酵母及びカビ等の真菌に対して使用される。これは、当該組成物が、乳業のプロセス、特に乳発酵プロセスにおいてコンタミネーションを引き起こす、真菌の増殖を阻害及び／又は防止するのに使用されることを意味する。本発明の抗微生物組成物は、酵母、例えば、クリヴェロマイケス（Ｋｌｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）（例えばＫ． マルキシアヌス（ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、Ｋ． ラクティス（ｌａｃｔｉｓ））、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）（例えばＰ． （フェルメンタンス（ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ））、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）（例えばＹ． リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）（例えばＣ． サケ（ｓａｋｅ））等の属の酵母；又はカビ、例えば、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）（例えばＰ． ナルギオヴェンス（ｎａｌｇｉｏｖｅｎｓｅ）、Ｐ． コムネ（ｃｏｍｍｕｎｅ）、Ｐ． クルストサム（ｃｒｕｓｔｏｓｕｍ）、Ｐ． ブレビコンパクツム（ｂｒｅｖｉｃｏｍｐａｃｔｕｍ）、Ｐ． グラブラム（ｇｌａｂｒｕｍ））、ムコール亜種（Ｍｕｃｏｒ ｓｏｐ．）、クラジオスポリウム亜種（Ｃｌａｄｉｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｓｐ．）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（例えばＡ． ヴェルシコロール（ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ））、デバロマイケス（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ）（例えばＤ． ハンセニイ（ｈａｎｓｅｎｉｉ））等の属のカビの増殖を阻害及び／又は防止するのに使用され得る。クリヴェロマイケス・マルキシアヌス（Ｋｌｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、ヤロウィア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、ペニシリウム・ナルギオヴェンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｎａｌｇｉｏｖｅｎｓｅ）、クラディオｓポリウム亜種（Ｃｌａｄｉｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｓｐ．）、ペニシリウム・コムネ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ）、ムコール亜種（Ｍｕｃｏｒ ｓｓｐ．）、ペニシリウム・ブレヴィコンパクツム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｂｒｅｖｉｃｏｍｐａｃｔｕｍ）、アスペルギルス・ヴェルシコロール（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、ペニシリウム・クルストスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｒｕｓｔｏｓｕｍ）、クルイヴェロマイケス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、及び／又はデバロマイケス・ハンセニイ（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ ｈａｎｓｅｎｉｉ）の増殖の阻害及び／又は防止に、本発明の抗微生物組成物を使用するのが特に好ましい。
本発明の第一の側面の抗微生物組成物は、病原性真菌、好ましくは病原性酵母の感染を治療するための医薬組成物として使用されてもよい。
上記のように、本発明の一つの側面は、本発明の第一の側面の抗微生物組成物を含有する、食料、飼料又は医薬製品に関する。
好ましい態様において、そのような食料製品は、果物及び果物由来の製品、野菜及び野菜由来の製品、穀物及び穀物由来の製品、乳製品、獣肉、鶏肉及び海産物並びにそれらの混合物からなる群から選択される。
より好ましい態様において、前記食料製品は乳製品であり、好ましくは、中温又は好熱発酵乳製品、例えばフレッシュチーズ、ヨーグルト、サワークリーム又はトバログである。
他の好ましい態様において、前記食料製品は、獣肉又は鶏肉である。好ましい態様において、前記医薬製品は、本発明の第一の側面の抗微生物組成物を、病原性微生物を阻害し、当該病原性微生物に関連する症状を緩和するために、ヒト又は動物に投与するのに有用な製品である。そのような症状の例として、酵母感染に関連する症状が挙げられる。そのような態様において、前記医薬製品は、抗微生物組成物を含有する単位投与剤形であってもよい。好ましくは、当該単位投与剤形は、カプセル又は錠剤であってもよい。しかしながら、当該単位投与剤形は、粘膜又は皮膚への適用に適するものでもよく、その場合、ペースト、クリーム、軟膏等の形態である。
本発明の他の側面は、本発明の第五の側面の食料、飼料又は医薬製品を製造する方法に関し、当該方法は、当該食料、飼料又は医薬製品を製造する過程で、本発明の第一の側面の抗微生物組成物を添加する工程を含む。
好ましい態様において、１つ以上のラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）株又はラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）の濃度は、当該食料、飼料又は医薬製品に対して、１ｘ１０６ｃｆｕ／ｇ以上、好ましくは５ｘ１０６ｃｆｕ／ｇ以上、最も好ましくは１ｘ１０８ｃｆｕ／ｇ以上であり、又は１ｘ１０６ｃｆｕ／ｍｌ以上、好ましくは５ｘ１０６ｃｆｕ／ｍｌ以上、最も好ましくは１ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌ以上でありあるいは、当該食料、飼料又は医薬製品の表面に対して、１ｘ１０５ｃｆｕ／ｃｍ２以上、好ましくは５ｘ１０５ｃｆｕ／ｃｍ２以上、最も好ましくは１ｘ１０７ｃｆｕ／ｃｍ２以上である。
前記食料、飼料又は医薬製品が、１つ以上のラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）株及びラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）を含有する組成物を添加することにより製造される場合、当該１つ以上のラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）株又はラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）の濃度は、それぞれ、当該食料、飼料又は医薬製品に対して、１ｘ１０６ｃｆｕ／ｇ以上若しくは１ｘ１０６ｃｆｕ／ｍｌ以上、又は当該食料、飼料又は医薬製品の表面に対して、１ｘ１０５ｃｆｕ／ｃｍ２以上である。好ましくは、当該１つ以上のラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）株又はラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）の濃度は、それぞれ、当該食料、飼料又は医薬製品に対して、５ｘ１０６ｃｆｕ／ｇ以上若しくは５ｘ１０６ｃｆｕ／ｍｌ以上、又は当該食料、飼料又は医薬製品の表面に対して、５ｘ１０５ｃｆｕ／ｃｍ２以上である。更なる態様において、当該１つ以上のラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）株又はラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）の濃度は、それぞれ、当該食料、飼料又は医薬製品に対して、１ｘ１０８ｃｆｕ／ｇ以上若しくは１ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌ以上、又は当該食料、飼料又は医薬製品の表面に対して、１ｘ１０７ｃｆｕ／ｃｍ２以上である。
好ましい態様において、前記製造パラメーターは、当該製造の過程で、１つ以上のラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）株又はラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）の濃度が増大し、又は一定となるようにコントロールされる。
本発明の抗微生物組成物は、混合可能な食料、飼料又は医薬組成物と混合され、及び／又はそれらに適用されることにより最も簡便に使用されるが、固体の食料製品の表面、又はそのような製品の内部を、注射により処理するのも有効である。更に他の態様において、前記組成物は、マリネ、パン粉、シーズニングラブ（ｓｅａｓｏｎｉｎｇ ｒｕｂ）、蜜、着色料混合物等として適用されてもよく、重要な基準は、前記抗微生物が、細菌による分解並びに酵母及びカビでコンタミネーションする表面上で利用可能となっていることである。尚も他の態様において、前記組成物は、食料の容器に当該組成物を適用し、そして当該容器を食料表面に適用して、食料表面と接触させてもよい。使用される適切な量は、処理される具体的な食料製品、及び食料表面への組成物の適用に使用される方法に依存し得るが、単純な実験により決定することが出来る。
大変好ましい態様において、前記方法は、１つ以上の発酵工程を含んでもよく、そして前記抗微生物組成物は、そのような１つ以上の発酵工程の前に、間に、又は後に、前記食料、飼料又は医薬製品に添加されてもよい。
尚もより好ましい態様において、前記方法は、ラクトバチルスＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）及びロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）から選択される属の１つ以上の株、例えばラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）の１つ以上の株、及びストレプトコッカス・テルモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の１つ以上の株、又は例えばラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． Ｌａｃｔｉｓ）の１つ以上の株、ロイコノストック・メセンテロイデス亜種クレモリス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ． Ｃｒｅｍｏｒｉｓ）の１つ以上の株、及びラクトコッカス・ラクティス亜種ジアセチラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ） の１つ以上の株を含有する出発培養株を用いて乳基質を発酵させることを含む。
本発明の最後の側面は、Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ （ＤＳＭＺ）に受入番号ＤＳＭ２４６１６で供託されたラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１２６９７又はその突然変異株、Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ （ＤＳＭＺ）に受入番号ＤＳＭ２４６５２で供託されたラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６又はその突然変異株、Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ （ＤＳＭＺ）に受入番号ＤＳＭ２４６５１で供託されたラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７又はその突然変異株；に関し、ここで当該突然変異株は、出発材料として供託された前記株を使用して取得される。
出発材料として供託された前記株を使用することにより、当業者が、公知の突然変異形成技術又は再単離技術を用いて、本明細書中に記載の関連する特徴及び長所を保持する更なる突然変異を容易に取得出来ることは、当業者にとって明白である。従って、第一の側面における「その突然変異」という用語は、出発材料として供託された前記株を使用することにより取得される突然変異株に関する。
本発明の態様は、非限定的な例示を用いて、以下に記載される。
実施例１：Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７及びＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１２６９７の単独及び組み合わせ使用の、様々な酵母及びカビによるコンタミネーションの阻害効果の半定量的判定
Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７及びＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１２６９７の単独及び組み合わせの阻害効果の半定量的試験のために、寒天アッセイが使用され、これはフレッシュチーズの製造プロセス及び製品を模倣するものである。
Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７及びＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１２６９７の単独及び組み合わせの阻害効果の半定量的試験のために、寒天アッセイが使用され、これはフレッシュチーズの製造プロセス及び製品を模倣するものである。
全脂肪（３．５％ｗ／ｗ）均質化乳を７９±１℃で２０分間熱処理し、そして急冷した。市販の出発培養株（Ｃｈｒ． Ｈａｎｓｅｎ Ａ／Ｓ， Ｄｅｎｍａｒｋ製Ｆ−ＤＶＳ ＣＨＮ−１９）を０．１μ／ｌで播種し、当該播種された乳を２２０ｍｌボトルに分注した。これらのボトルにＬｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７及び／又はＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１２６９７を、合計で５ｘ１０６ＣＦＵ／ｍｌの濃度で播種し、そして１つのボトルを、前記出発培養物のみ播種された参照物とした。更に、酸性化の速度の指標とするため、そして標的の酵母及びカビをより容易に検出出来る青緑色の培地を得るため、ｐＨ表示薬のブロムクレゾールパープル及びブロムクレゾールグリーンが５％添加された。全てのボトルを２９±１℃のウォーターバスでインキュベートし、これらの条件で、ｐＨが４．６０±０．１に達するまで発酵させた。発酵後、これらのボトルを氷上で急冷し、凝塊を破壊するように強く振り混ぜた。そして、当該発酵乳を温度が４０℃に達するまで加熱し、一度溶解させて６０℃に冷却した５％滅菌寒天溶液を４０ｍｌ添加した。この発酵乳と寒天の溶液を滅菌ペトリ皿に注ぎ、これらのプレートをＬＡＦベンチで３０分間乾燥させた。
選択された酵母及びカビを、クライヴェロマイケス・マルキシアヌス（Ｋｌｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、ピキア・フェルメンタンス（Ｐｉｃｈｉａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）及びカンジダ・サケ（Ｃａｎｄｉｄａ ｓａｋｅ）について、それぞれ１０４、１０３、及び１０２ＣＦＵ／スポットで滴下した。十分に出芽した胞子の懸濁物を、１０００、１００、１０倍に希釈し、ペニシリウム・ナルギオヴェンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｎａｌｇｉｏｖｅｎｓｅ）ムコール亜種（Ｍｕｃｏｒ ｓｓｐ．）、ペニシリウム・コミューン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ）及びクラジオスポリウム亜種（Ｃｌａｄｉｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｓｐ．）については希釈されなかった。当該プレートを７±１℃でインキュベートし、これらが、酵母及びカビの増殖の為に主に試験された。
寒天アッセイの結果を図１に示す。出発培養株のみで発酵させた乳から作製した寒天プレート（参照）上では、全ての試験された酵母及び株は、活発な増殖を示した。しかしながら、Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７又はＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１２６９７が乳発酵の過程で存在したとき、得られたプレートにおいて、全ての濃度のＫ．マルキシアヌス（Ｋ． ｍａｒｘｉａｎｕｓ）及びＹ．リポリティカ（Ｙ． ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の増殖が阻害された。更に、Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７又はＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１２６９７が乳発酵の過程で存在していたとき、それらのプレート上に滴下した全てのカビにおいて、顕著な阻害が観察された。Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７及びＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１２６９７のいずれも、単独の株として添加した場合、Ｐ．フェルメンタンス（Ｐ． ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）又はＣ．サケ（Ｃ． ｓａｋｅ）株に対して阻害効果を引き起こさなかった。しかしながら、Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７及びＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１２６９７の両方の存在下で乳を発酵させた場合、１０３、及び１０２ＣＦＵ／スポットの低目の濃度で滴下されたＰ．フェルメンタンス（Ｐ． ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）の増殖の阻害が観察され、そしてクラディオスポリウム亜種（Ｃｌａｄｉｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｓｐ．）及びムコール亜種（Ｍｕｃｏｒ ｓｓｐ．）は、Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７又はＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１２６９７が単独で添加された場合よりも強力に増殖を阻害した。これらの結果は、Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７及びＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１２６９７の２つの株が、一定の相乗的抗真菌効果を有することを示している。
実施例２：Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７及びＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１２６９７の単独及び組み合わせ使用の、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に対する阻害効果の半定量的判定
Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７及びＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１２６９７の単独及び組み合わせの阻害効果の半定量的試験のために、寒天アッセイが使用され、これはフレッシュチーズの製造プロセス及び製品を模倣するものである。
Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７及びＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１２６９７の単独及び組み合わせの阻害効果の半定量的試験のために、寒天アッセイが使用され、これはフレッシュチーズの製造プロセス及び製品を模倣するものである。
全脂肪（３．５％ｗ／ｗ）均質化乳を７９±１℃で２０分間熱処理し、そして急冷した。市販の出発培養株（Ｃｈｒ． Ｈａｎｓｅｎ Ａ／Ｓ， Ｄｅｎｍａｒｋ製Ｆ−ＤＶＳ ＣＨＮ−１９）を０．１μ／ｌで播種し、当該播種された乳を１ｌボトルに分注した。これらのボトルにＬｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７及び／又はＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１２６９７を、合計で５ｘ１０６ＣＦＵ／ｍｌの濃度で播種し、そして１つのボトルを、前記出発培養物のみ播種された参照物とした。更に、２つのボトルには、ＣＨＮ−１９出発培養株と共に、ＨＯＬＤＢＡＣ（商標） ＹＭ−Ｂ （５０ＤＣＵ／１００Ｌ； Ｄａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓ， Ｄｅｎｍａｒｋ）又はＨＯＬＤＢＡＣ（商標） ＹＭ−Ｃ （２０ ＤＣＵ／１００Ｌ； Ｄａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓ， Ｄｅｎｍａｒｋ）を播種した。全てのボトルを２９±１℃のウォーターバスでインキュベートし、これらの条件で、ｐＨが４．６０±０．１に達するまで発酵させた。発酵後、これらのボトルを氷上で急冷し、凝塊を破壊するように強く振り混ぜた。
各ボトルの内容物をより小さいプラスチックカップに分注し、フレッシュチーズ製品のコンタミナントとして単離されたヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）を播種した。２つの別個のカップに、１％ （ｖ／ｗ）の体積で、最終的なＹ．リポリティカ（Ｙ． ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の発酵乳製品中のコンタミネーションレベルが１ｘ１０２ＣＦＵ／ｇとなるように播種された。前記プラスチックカップを目張りし、８±１℃で保管した。当該発酵乳製品を、酵母グルコースクロラムフェニコール（ＹＧＣ）寒天上に生理食塩水ペプトンで１０倍に希釈してプレーティングし、有酸素インキュベーションで５日間２５℃で培養することにより、Ｙ．リポリティカ（Ｙ． ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のコンタミネーションレベルを判定した。更に、発酵乳資料のｐＨは、保管の期間を通して測定された。
図２に記載されたように、Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７及びＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１２６９７のいずれも、発酵前に出発培養株ＣＨＮ−１９と共に単独の株として使用されたとき、Ｙ．リポリティカ（Ｙ． ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の増殖は阻害された。いずれの株も、ＨＯＬＤＢＡＣ（商標） ＹＭ−Ｂ及びＨＯＬＤＢＡＣ（商標） ＹＭ−Ｃよりも顕著な阻害を引き起こした。更に、Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７及びＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１２６９７が組み合わせて使用されたとき、各株が単独で使用された場合と比較して、相乗的な阻害効果が認められた。Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７及びＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１２６９７は、組み合わせて使用されるとき、前記発酵乳中のＹ．リポリティカ（Ｙ． ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の誘導期及び定常期のいずれにおいても細胞カウントに影響を及ぼし、この相乗効果は、これらの種類の製品の棚寿命の延長に貢献し得る。
実施例３：Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７及びＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６の単独及び組み合わせ使用の、様々な酵母及びカビのコンタミナントに対する阻害効果の半定量的判定
Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７及びＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６の単独及び組み合わせの阻害効果の半定量的試験のために、寒天アッセイが使用され、これはフレッシュチーズの製造プロセス及び製品を模倣するものである。
Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７及びＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６の単独及び組み合わせの阻害効果の半定量的試験のために、寒天アッセイが使用され、これはフレッシュチーズの製造プロセス及び製品を模倣するものである。
全脂肪（３．５％ｗ／ｗ）均質化乳を７９±１℃で２０分間熱処理し、そして急冷した。市販の出発培養株（Ｆ−ＤＶＳ ＣＨＮ−１９）を０．１μ／ｌで播種し、当該播種された乳を２２０ｍｌボトルに分注した。これらのボトルにＬｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７及び／又はＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６を、合計で５ｘ１０６ＣＦＵ／ｍｌの濃度で播種し、そして１つのボトルを、前記出発培養物のみ播種された参照物とした。更に、酸性化の速度の指標とするため、そして標的の酵母及びカビをより容易に検出出来る青緑色の培地を得るため、ｐＨ表示薬のブロムクレゾールパープル及びブロムクレゾールグリーンが５％添加された。全てのボトルを２９±１℃のウォーターバスでインキュベートし、これらの条件で、ｐＨが４．６０±０．１に達するまで発酵させた。発酵後、これらのボトルを氷上で急冷し、凝塊を破壊するように強く振り混ぜた。そして、当該発酵乳を温度が４０℃に達するまで加熱し、一度溶解させて６０℃に冷却した５％滅菌寒天溶液を４０ｍｌ添加した。この発酵乳と寒天の溶液を滅菌ペトリ皿に注ぎ、これらのプレートをＬＡＦベンチで３０分間乾燥させた。
選択された酵母及びカビを、クライヴェロマイケス・マルキシアヌス（Ｋｌｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、ピキア・フェルメンタンス（Ｐｉｃｈｉａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）及びカンジダ・サケ（Ｃａｎｄｉｄａ ｓａｋｅ）について、それぞれ１０４、１０３、及び１０２ＣＦＵ／スポットで滴下した。十分に出芽した胞子の懸濁物を、１０００、１００、１０倍に希釈し、ペニシリウム・ナルギオヴェンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｎａｌｇｉｏｖｅｎｓｅ）ムコール亜種（Ｍｕｃｏｒ ｓｓｐ．）、ペニシリウム・コミューン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ）及びクラジオスポリウム亜種（Ｃｌａｄｉｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｓｐ．）については希釈されなかった。当該プレートを７±１℃でインキュベートし、これらが、酵母及びカビの増殖の為に主に試験された。
寒天アッセイの結果を図３に示す。出発培養株のみで発酵させた乳から作製した寒天プレート（参照）上では、全ての試験された酵母及び株は、活発な増殖を示した。しかしながら、Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７が乳発酵の過程で存在したとき、得られたプレートにおいて、全ての濃度のＫ．マルキシアヌス（Ｋ． ｍａｒｘｉａｎｕｓ）及びＹ．リポリティカ（Ｙ． ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の増殖が阻害された。Ｌｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６においても、得られたプレートにおいて、全ての濃度のＫ．マルキシアヌス（Ｋ． ｍａｒｘｉａｎｕｓ）及び最低濃度から２番目までのＹ．リポリティカ（Ｙ． ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の増殖が阻害された。Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７又はＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６が単一の株として添加された場合であっても、それらは低濃度のＰ．フェルメンタンス（Ｐ． ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）に対して僅かな阻害効果を示した。しかしながら、Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７及びＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６が乳発酵の過程で両方とも存在している場合、１０２ＣＦＵ／ｓｐｏｔの最低の濃度で添加されたＰ．フェルメンタンス（Ｐ． ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）の増殖が阻害された。カビにおいて、Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７又はＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６が乳発酵の過程で存在する場合、顕著な阻害が認められた。Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７及びＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６の組み合わせが使用された場合、クラディオスポリウム亜種（Ｃｌａｄｉｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｓｐ．）の増殖は、Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７又はＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６が単独で添加された場合と比較して、より強力に阻害された。これらの結果は、Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７及びＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６の２つの株が一定の相乗的抗真菌効果を有することを示す。
実施例４：Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７及びＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６の単独及び組み合わせ使用の、クリヴェロマイケス・マルキシアヌス（Ｋｌｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）に対する阻害効果の半定量的判定
Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７及びＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６の単独及び組み合わせの阻害効果の半定量的試験のために、寒天アッセイが使用され、これはフレッシュチーズの製造プロセス及び製品を模倣するものである。
Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７及びＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６の単独及び組み合わせの阻害効果の半定量的試験のために、寒天アッセイが使用され、これはフレッシュチーズの製造プロセス及び製品を模倣するものである。
全脂肪（３．５％ｗ／ｗ）均質化乳を７９±１℃で２０分間熱処理し、そして急冷した。市販の出発培養株（Ｆ−ＤＶＳ ＣＨＮ−１９）を０．１μ／ｌで播種し、当該播種された乳を１ｌボトルに分注した。これらのボトルにＬｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７及び／又はＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６を、合計で５ｘ１０６ＣＦＵ／ｍｌの濃度で播種し、そして１つのボトルを、前記出発培養物のみ播種された参照物とした。更に、２つのボトルには、ＣＨＮ−１９出発培養株と共に、ＨＯＬＤＢＡＣ（商標） ＹＭ−Ｂ （５０ＤＣＵ／１００Ｌ）又はＨＯＬＤＢＡＣ（商標） ＹＭ−Ｃ （２０ ＤＣＵ／１００Ｌ）を播種した。全てのボトルを２９±１℃のウォーターバスでインキュベートし、これらの条件で、ｐＨが４．６０±０．１に達するまで発酵させた。発酵後、これらのボトルを氷上で急冷し、凝塊を破壊するように強く振り混ぜた。
各ボトルの内容物をより小さいプラスチックカップに分注し、フレッシュチーズ製品のコンタミナントとして単離されたクリヴェロマイケス・マルキシアヌス（Ｋｌｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）を播種した。２つの別個のカップに、１％ （ｖ／ｗ）の体積で、最終的なクリヴェロマイケス・マルキシアヌス（Ｋｌｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）の発酵乳製品中のコンタミネーションレベルが１ｘ１０２ＣＦＵ／ｇとなるように播種された。前記プラスチックカップを目張りし、８±１℃で保管した。当該発酵乳製品を、酵母グルコースクロラムフェニコール（ＹＧＣ）寒天上に生理食塩水ペプトンで１０倍に希釈してプレーティングし、有酸素インキュベーションで３〜５日間２５℃で培養することにより、クリヴェロマイケス・マルキシアヌス（Ｋｌｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）のコンタミネーションレベルを判定した。更に、発酵乳資料のｐＨは、保管の期間を通して測定された。
図４に示すように、Ｋ． マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）の増殖は、発効前にＣＨＮ−１９出発培養株と共にＬｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７及びＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６の両方が単一の株として使用されて存在するとき、阻害された。実施例２に見られるように、Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７は、ＨＯＬＤＢＡＣ（商標） ＹＭ−Ｂ及びＨＯＬＤＢＡＣ（商標） ＹＭ−Ｃよりも顕著に強力なＫ． マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）の阻害を引き起こしたが、Ｌｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６により引き起こされる阻害は、ＨＯＬＤＢＡＣ（商標）培養株と同等であった。Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７及びＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６が組み合わせて使用されるとき、各株が単独で使用された場合の阻害効果と比較して、協調的な阻害効果が認められた。組み合わせて使用されるとき、Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７及びＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６は、発酵乳中でのＫ． マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）の増殖を遅延させ、この種類の製品の棚寿命の延長に貢献し得る。
実施例５：Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１４６７６及びＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ５３６６の単独及び組み合わせ使用の、様々なカビのコンタミナントに対する阻害効果の半定量的判定
Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１４６７６及びＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ５３６６の単独及び組み合わせの阻害効果の半定量的試験のために、寒天アッセイが使用され、これはヨーグルトの製造プロセス及び製品を模倣するものである。
Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１４６７６及びＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ５３６６の単独及び組み合わせの阻害効果の半定量的試験のために、寒天アッセイが使用され、これはヨーグルトの製造プロセス及び製品を模倣するものである。
均質化乳（１．５％ｗ／ｗ）を９５℃で５分間熱処理し、そして急冷した。市販の出発培養株（Ｃｈｒ． Ｈａｎｓｅｎ Ａ／Ｓ， Ｄｅｎｍａｒｋ 製Ｆ−ＤＶＳ ＹＣ−３５０）を０．０２％で播種し、当該播種された乳を２２０ｍｌボトルに分注した。これらのボトルにＬｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１４６７６、Ｌｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ５３６６、及びそれらの２つの組み合わせを、合計で１ｘ１０７ＣＦＵ／ｍｌの濃度で播種した。前記出発培養物のみ播種された１つのボトルを、参照物とした。更に、酸性化の速度の指標とするため、そして標的の酵母及びカビをより容易に検出出来る青緑色の培地を得るため、ｐＨ表示薬のブロムクレゾールパープル及びブロムクレゾールグリーンが全てのボトルに５％添加された。全てのボトルを４３±１℃のウォーターバスでインキュベートし、これらの条件で、ｐＨが４．６０±０．１に達するまで発酵させた。発酵後、これらのボトルを氷上で急冷し、凝塊を破壊するように強く振り混ぜた。そして、当該発酵乳を温度が４０℃に達するまで加熱し、一度溶解させて６０℃に冷却した５％滅菌寒天溶液を４０ｍｌ添加した。この発酵乳と寒天の溶液を滅菌ペトリ皿に注ぎ、これらのプレートをＬＡＦベンチで３０分間乾燥させた。
選択されたカビのペニシリウム・ナルギオヴェセ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｎａｌｇｉｏｖｅｓｅ）（１Ｏｘ）、ペニシリウム・コミューン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ）（１ＯＯｘ）、アスペルギルス・ヴェルシコロール（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）（１ＯＯｘ）及びペニシリウム・クルストスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｒｕｓｔｏｓｕｍ）（１ＯＯｘ）の完全に出芽した胞子懸濁物を、前記プレート上に滴下した。これらのプレートを７℃でインキュベートし、適切な通常のインターバル後、カビの増殖を試験した。
寒天アッセイの結果を、図５に示す。試験された全てのカビは、出発培養株（参照）のみで発酵させた乳から作製した寒天プレート上で、極めて良好に増殖した。しかしながら、乳発酵の過程でＬｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１４６７６又はＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ５３６６が存在していたプレートは、全てのカビの増殖を抑制した。更に、Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１４６７６及びＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ５３６６が乳発酵の過程で組み合わせて存在していたプレート上に滴下された、ペニシリウム・コミューン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ）、アスペルギルス・ヴェルシコロール（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）及びペニシリウム・クルストスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｒｕｓｔｏｓｕｍ）の増殖は、顕著な阻害が認められた。
実施例６：Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１４６７６及びＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６の単独及び組み合わせ使用の、様々なカビのコンタミナントに対する阻害効果の半定量的判定
Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１４６７６及びＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６の単独及び組み合わせの阻害効果の半定量的試験のために、寒天アッセイが使用され、これはヨーグルトの製造プロセス及び製品を模倣するものである。
Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１４６７６及びＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６の単独及び組み合わせの阻害効果の半定量的試験のために、寒天アッセイが使用され、これはヨーグルトの製造プロセス及び製品を模倣するものである。
均質化乳（１．５％ｗ／ｗ）を９５℃で５分間熱処理し、そして急冷した。市販の出発培養株（Ｃｈｒ． Ｈａｎｓｅｎ Ａ／Ｓ， Ｄｅｎｍａｒｋ 製Ｆ−ＤＶＳ ＹｏｆｌｅｘＲ Ｍｉｌｄ）を０．０２％で播種し、当該播種された乳を２２０ｍｌボトルに分注した。これらのボトルにＬｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１４６７６、Ｌｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６、及びそれらの２つの組み合わせを、合計で１ｘ１０７ＣＦＵ／ｍｌの濃度で播種した。前記出発培養物のみ播種された１つのボトルを、参照物とした。更に、酸性化の速度の指標とするため、そして標的の酵母及びカビをより容易に検出出来る青緑色の培地を得るため、ｐＨ表示薬のブロムクレゾールパープル及びブロムクレゾールグリーンが全てのボトルに５％添加された。全てのボトルを４３±１℃のウォーターバスでインキュベートし、これらの条件で、ｐＨが４．６０±０．１に達するまで発酵させた。発酵後、これらのボトルを氷上で急冷し、凝塊を破壊するように強く振り混ぜた。そして、当該発酵乳を温度が４０℃に達するまで加熱し、一度溶解させて６０℃に冷却した５％滅菌寒天溶液を４０ｍｌ添加した。この発酵乳と寒天の溶液を滅菌ペトリ皿に注ぎ、これらのプレートをＬＡＦベンチで３０分間乾燥させた。
選択されたカビのペニシリウム・ナルギオヴェセ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｎａｌｇｉｏｖｅｓｅ）（１Ｏｘ）、ペニシリウム・コミューン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ）（１ＯＯｘ）、アスペルギルス・ヴェルシコロール（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）（１ＯＯｘ）及びペニシリウム・クルストスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｒｕｓｔｏｓｕｍ）（１ＯＯｘ）の完全に出芽した胞子懸濁物を、前記プレート上に滴下した。これらのプレートを７℃でインキュベートし、適切な通常のインターバル後、カビの増殖を試験した。
寒天アッセイの結果を、図６に示す。試験された全てのカビは、出発培養株（参照）のみで発酵させた乳から作製した寒天プレート上で、極めて良好に増殖した。しかしながら、乳発酵の過程でＬｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１４６７６又はＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６が存在していたプレートは、全てのカビの増殖を抑制した。更に、Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１４６７６及びＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６が乳発酵の過程で組み合わせて存在していたプレート上に滴下された、ペニシリウム・コミューン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ）、アスペルギルス・ヴェルシコロール（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）及びペニシリウム・クルストスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｒｕｓｔｏｓｕｍ）の増殖は、顕著な阻害が認められた。
実施例７：Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７及びＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６の単独及び組み合わせ使用の、様々なカビのコンタミナントに対する阻害効果の半定量的判定
Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７及びＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６の単独及び組み合わせの阻害効果の半定量的試験のために、寒天アッセイが使用され、これはヨーグルトの製造プロセス及び製品を模倣するものである。
Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７及びＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６の単独及び組み合わせの阻害効果の半定量的試験のために、寒天アッセイが使用され、これはヨーグルトの製造プロセス及び製品を模倣するものである。
均質化乳（１．５％ｗ／ｗ）を９５℃で５分間熱処理し、そして急冷した。市販の出発培養株（Ｃｈｒ． Ｈａｎｓｅｎ Ａ／Ｓ， Ｄｅｎｍａｒｋ 製Ｆ−ＤＶＳ ＹｏｆｌｅｘＲ Ｍｉｌｄ）を０．０２％で播種し、当該播種された乳を２２０ｍｌボトルに分注した。これらのボトルにＬｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７、Ｌｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６、及びそれらの２つの組み合わせを、合計で１ｘ１０７ＣＦＵ／ｍｌの濃度で播種した。前記出発培養物のみ播種された１つのボトルを、参照物とした。更に、酸性化の速度の指標とするため、そして標的の酵母及びカビをより容易に検出出来る青緑色の培地を得るため、ｐＨ表示薬のブロムクレゾールパープル及びブロムクレゾールグリーンが全てのボトルに５％添加された。全てのボトルを４３±１℃のウォーターバスでインキュベートし、これらの条件で、ｐＨが４．６０±０．１に達するまで発酵させた。発酵後、これらのボトルを氷上で急冷し、凝塊を破壊するように強く振り混ぜた。そして、当該発酵乳を温度が４０℃に達するまで加熱し、一度溶解させて６０℃に冷却した５％滅菌寒天溶液を４０ｍｌ添加した。この発酵乳と寒天の溶液を滅菌ペトリ皿に注ぎ、これらのプレートをＬＡＦベンチで３０分間乾燥させた。
選択されたカビのペニシリウム・ナルギオヴェセ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｎａｌｇｉｏｖｅｓｅ）（１Ｏｘ）、ペニシリウム・コミューン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ）（１ＯＯｘ）、アスペルギルス・ヴェルシコロール（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）（１ＯＯｘ）及びペニシリウム・クルストスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｒｕｓｔｏｓｕｍ）（１ＯＯｘ）の完全に出芽した胞子懸濁物を、前記プレート上に滴下した。これらのプレートを７℃でインキュベートし、適切な通常のインターバル後、カビの増殖を試験した。
寒天アッセイの結果を、図７に示す。試験された全てのカビは、出発培養株（参照）のみで発酵させた乳から作製した寒天プレート上で、極めて良好に増殖した。しかしながら、乳発酵の過程でＬｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７又はＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６が存在していたプレートは、全てのカビの増殖を抑制した。更に、Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７及びＬｂ．ラムノサス（Ｌｂ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６が乳発酵の過程で組み合わせて存在していたプレート上に滴下された、全てのカビの増殖は、顕著な阻害が認められた。
Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７を用いて作製したサワークリームでのチャレンジ試験
Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７を単一株として用いた場合の、Ｐ・コミューン（Ｐ． ｃｏｍｍｕｎｅ）、アスペルギルス・ヴェルシコロール（Ａ． ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、Ｐ・ブレヴィコンパクツム（Ｐ． ｂｒｅｖｉｃｏｍｐａｃｔｕｍ）、Ｐ・クルストスム（Ｐ． ｃｒｕｓｔｏｓｕｍ）及びペニシリウム・グラブルム（Ｐ． ｇｌａｂｒｕｍ）に対する阻害作用を視覚的に試験するために、サワークリームを調製した。
Ｌｂ．パラカゼイ（Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７を単一株として用いた場合の、Ｐ・コミューン（Ｐ． ｃｏｍｍｕｎｅ）、アスペルギルス・ヴェルシコロール（Ａ． ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、Ｐ・ブレヴィコンパクツム（Ｐ． ｂｒｅｖｉｃｏｍｐａｃｔｕｍ）、Ｐ・クルストスム（Ｐ． ｃｒｕｓｔｏｓｕｍ）及びペニシリウム・グラブルム（Ｐ． ｇｌａｂｒｕｍ）に対する阻害作用を視覚的に試験するために、サワークリームを調製した。
滅菌した高脂肪乳に、市販の異発酵（ｈｅｔｅｒｏｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅ）出発培養株（Ｃｈｒ． Ｈａｎｓｅｎ Ａ／Ｓ， Ｄｅｎｍａｒｋ製Ｆ−ＤＶＳ ＤＳＧ−２０００）を０．０１％で播種した。当該乳に、更にＯＬＤＢＡＣ（商標） ＹＭ−Ｂ （ １０ＤＣＵ／１００Ｌ）又はラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７ （５ｘ１０６ ＣＦＵ／ｇ）を播種した。１つのバッチは、参照として出発培養株のみ播種した。
当該乳を、ｐＨが４．６０±０．０５に達するまで２８±１℃で発酵させ、サワークリームが後処理された。当該サワークリームを撹拌して２０±１℃まで冷まし、７℃±１℃で保管した。
サワークリームを調製した翌日、サワークリームの表面コンタミナントとして様々なカビがサワークリームの表面上にスポットあたり胞子１００個となるように播種された。カビの増殖は、４５日間７℃±１℃での保管後に視覚的に評価された。
サワークリームの試験の結果を、図８に示す。Ｐ・コミューン（Ｐ． ｃｏｍｍｕｎｅ）（Ｍ６）、Ａ・ヴェルシコロール（Ａ． ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）（Ｍ７）、Ｐ・ブレヴィコンパクツム（Ｐ． ｂｒｅｖｉｃｏｍｐａｃｔｕｍ）（Ｍ１）、Ｐ・クルストスム（Ｐ． ｃｒｕｓｔｏｓｕｍ）（Ｍ１０）及びペニシリウム・グラブルム（Ｐ． ｇｌａｂｒｕｍ）（Ｍ８）は、出発細胞株のみ（上段）、又は出発培養株及びＨＯＬＤＢＡＣ（商標） ＹＭ−Ｂ培養株（中段）で発酵させた乳から作製したサワークリーム上で、活発に増殖した。対照的に、乳発酵の過程でラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７が存在していた場合、試験されたカビの全てにおいて、増殖が阻害された。
実施例９：ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１２６９７を用いて作製したトバログでのチャレンジ試験
ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１２６９７を単一株として用いた場合の、ムコール亜種（ｍｕｃｏｒ ｓｓｐ．）に対する阻害作用を視覚的に試験するために、トバログを調製した。
ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１２６９７を単一株として用いた場合の、ムコール亜種（ｍｕｃｏｒ ｓｓｐ．）に対する阻害作用を視覚的に試験するために、トバログを調製した。
滅菌した低脂肪乳に、市販の出発培養株（Ｃｈｒ． Ｈａｎｓｅｎ Ａ／Ｓ， Ｄｅｎｍａｒｋ製Ｆ−ＤＶＳ ＣＨＮ−１９）を０．０１％で播種した。当該乳に、更にＯＬＤＢＡＣ（商標） ＹＭ−Ｂ （５ＤＣＵ／１００Ｌ）又はラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１２６９７ （５ｘ１０６ ＣＦＵ／ｇ）を播種した。１つのバッチは、参照として出発培養株のみ播種した。
当該乳を、ｐＨが４．６０±０．０５に達するまで２８±１℃で発酵させた。湯浸温度（ｓｃａｌｄｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）は、３８〜４０℃とした。吸引後、カードを１ｂａｒで３０分間与圧した。
トバログを調製した翌日、トバログ（１００ｇ）の表面上に、表面コンタミナントとしてムコール亜種（ｍｕｃｏｒ ｓｓｐ．）が、ピペットで２回、スポットあたり胞子１００個となるように播種された。カビの増殖は、１８日間７℃±１℃での保管後に視覚的に評価された。
トバログ試験の結果を、図９に示す。出発培養株ＣＨＮ−１９のみを用いて発酵させた乳から作製されたトバログ上では、ムコール亜種（ｍｕｃｏｒ ｓｓｐ．）は活発に増殖したことを示す。当該カビは、出発培養株とＨＯＬＤＢＡＣ（商標） ＹＭ−Ｂ培養株を用いて培養した乳から作製したトバログでも活発に増殖し、それには及ばないが出発培養株とＨＯＬＤＢＡＣ（商標） ＹＭ−Ｃ培養株を用いて培養した乳から作製したトバログでも増殖した。しかしながら、乳の発酵の過程でラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１２６９７が存在していた場合、ムコール亜種（ｍｕｃｏｒ ｓｓｐ．）増殖の顕著な阻害が確認された。
実施例１０：ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６を用いて作製したヨーグルトでのチャレンジ試験
ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６を単一株として用いた場合の、Ｐ・ブレヴィコンパクツム（Ｐ． ｂｒｅｖｉｃｏｍｐａｃｔｕｍ）、Ｐ・コミューン（Ｐ． ｃｏｍｍｕｎｅ）、アスペルギルス・ヴェルシコロール（Ａ． ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）及びＰ・クルストスム（Ｐ． ｃｒｕｓｔｏｓｕｍ）に対する阻害作用を視覚的に試験するために、脂肪分１．５％のヨーグルトを調製した。
ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６を単一株として用いた場合の、Ｐ・ブレヴィコンパクツム（Ｐ． ｂｒｅｖｉｃｏｍｐａｃｔｕｍ）、Ｐ・コミューン（Ｐ． ｃｏｍｍｕｎｅ）、アスペルギルス・ヴェルシコロール（Ａ． ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）及びＰ・クルストスム（Ｐ． ｃｒｕｓｔｏｓｕｍ）に対する阻害作用を視覚的に試験するために、脂肪分１．５％のヨーグルトを調製した。
均質化した乳（脂肪分１．５％）を、ウォーターバス中の１Ｌボトル中で、９５±１℃で５分間加熱処理し、そして急速に冷却した。市販の出発培養株（Ｃｈｒ． Ｈａｎｓｅｎ Ａ／Ｓ， Ｄｅｎｍａｒｋ製Ｆ−ＤＶＳ ＹＦ−Ｌ９０１）が０．０２％で播種された。当該乳に、更にＨＯＬＤＢＡＣ（商標） ＹＭ−Ｂ （２０ＤＣＵ／１００Ｌ）又はラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６（１ｘ１０７ ＣＦＵ／ｇ）を播種した。１つのボトルは、参照として出発培養株のみ播種した。
当該乳を、ｐＨが４．６０±０．０５に達するまで４３±１℃で発酵させた。形成されたヨーグルトをカップに注ぎ（１００ｇ）、７±１℃で保存した。
ヨーグルトを調製した翌日、２つのヨーグルトのカップ中の表面コンタミナントとして様々なカビがヨーグルトの表面上にスポットあたり胞子１００個となるように播種された。カビの増殖は、４５日間７℃±１℃での保管後に視覚的に評価された。
ヨーグルト試験の結果を、図１０に示す。Ｐ・ブレヴィコンパクツム（Ｐ． ｂｒｅｖｉｃｏｍｐａｃｔｕｍ）（Ｍ１）、Ｐ・コミューン（Ｐ． ｃｏｍｍｕｎｅ）（Ｍ６）、アスペルギルス・ヴェルシコロール（Ａ． ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）（Ｍ７）Ｐ・クルストスム（Ｐ． ｃｒｕｓｔｏｓｕｍ）（Ｍ１０）は、
出発培養株ＹＦ−Ｌ９０１のみ（上段）、又は出発培養株及びＨＯＬＤＢＡＣ（商標） ＹＭ−Ｂ培養株（中段）を用いて発酵させた乳から作製されたヨーグルト上で、活発に増殖したことを示す。対照的に、乳の発酵の過程でラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６が存在していた場合、試験された全てのカビにおいて、増殖の阻害が確認された。
出発培養株ＹＦ−Ｌ９０１のみ（上段）、又は出発培養株及びＨＯＬＤＢＡＣ（商標） ＹＭ−Ｂ培養株（中段）を用いて発酵させた乳から作製されたヨーグルト上で、活発に増殖したことを示す。対照的に、乳の発酵の過程でラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６が存在していた場合、試験された全てのカビにおいて、増殖の阻害が確認された。
実施例１１：トバログ中のＫ．ラクティス（Ｋ． ｌａｃｔｉｓ）に対するラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７の阻害効果の定量的判定
ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７を単一株として用いた場合の、Ｋ．ラクティス（Ｋ． ｌａｃｔｉｓ）に対する阻害効果を定量的に試験するため、トバログが調製された。
ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７を単一株として用いた場合の、Ｋ．ラクティス（Ｋ． ｌａｃｔｉｓ）に対する阻害効果を定量的に試験するため、トバログが調製された。
滅菌した低脂肪乳に、市販の出発培養株（Ｃｈｒ． Ｈａｎｓｅｎ Ａ／Ｓ， Ｄｅｎｍａｒｋ製Ｆ−ＤＶＳ ＣＨＮ−１９）を０．０１％で播種した。当該乳に、更にＯＬＤＢＡＣ（商標） ＹＭ−Ｂ （２０ＤＣＵ／１００Ｌ）又はラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７ （５ｘ１０６ ＣＦＵ／ｇ）を播種した。１つのバッチは、参照として出発培養株のみ播種した。
当該乳を、ｐＨが４．６０±０．０５に達するまで２８±１℃で発酵させた。湯浸温度（ｓｃａｌｄｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）は、３８〜４０℃とした。吸引後、カードを１ｂａｒで３０分間与圧した。
トバログを調製した翌日、約１０ｇのトバログの試料ブロックを切り出し、それらをストマッカーバッグ（ｓｔｏｍａｃｈｅｒ ｂａｇ）中に納めた。当該ブロックに、細い針を用いて内部に酵母を１０．０００ ＣＦＵ／ｍｌで２回接種した。当該バッグは当該トバログを覆い、テープで密封された。
当該試料を７±１℃で保存し、適切な間隔で、Ｋ．ラクティス（Ｋ． ｌａｃｔｉｓ）のコンタミネーションのレベルが解析された。解析は、１ｇのトバログ、更にサリンペプトンの適切な１倍希釈液を、Ｙｅａｓｔ Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ （ＹＧＣ）寒天上にプレーティングし、それを２５℃で５日間好気的にインキュベーションすることにより行われた。
図１１に示すように、発酵前に出発培養株ＣＨＮ−１９と共にラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７が存在していたトバログにおいて、Ｋ．ラクティス（Ｋ． ｌａｃｔｉｓ）のの増殖は阻害された。ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７は、市販の培養株ＨＯＬＤＢＡＣ（商標） ＹＭ−Ｂよりも顕著に高い阻害を引き起こした。
実施例１２：トバログ中のＫ．ラクティス（Ｋ． ｌａｃｔｉｓ）に対するラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１２６９７の阻害効果の定量的判定
ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１２６９７を単一株として用いた場合の、Ｋ．ラクティス（Ｋ． ｌａｃｔｉｓ）に対する阻害効果を定量的に試験するため、トバログが調製された。
ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１２６９７を単一株として用いた場合の、Ｋ．ラクティス（Ｋ． ｌａｃｔｉｓ）に対する阻害効果を定量的に試験するため、トバログが調製された。
滅菌した低脂肪乳に、市販の出発培養株（Ｃｈｒ． Ｈａｎｓｅｎ Ａ／Ｓ， Ｄｅｎｍａｒｋ製Ｆ−ＤＶＳ ＣＨＮ−１９）を０．０１％で播種した。当該乳に、更にＯＬＤＢＡＣ（商標） ＹＭ−Ｂ （５ＤＣＵ／１００Ｌ）又はラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１２６９７ （５ｘ１０６ ＣＦＵ／ｇ）を播種した。１つのバッチは、参照として出発培養株のみ播種した。
当該乳を、ｐＨが４．６０±０．０５に達するまで２８±１℃で発酵させた。湯浸温度（ｓｃａｌｄｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）は、３８〜４０℃とした。吸引後、カードを１ｂａｒで３０分間与圧した。
トバログを調製した翌日、約１０ｇのトバログの試料ブロックを切り出し、それらをストマッカーバッグ（ｓｔｏｍａｃｈｅｒ ｂａｇ）中に納めた。当該ブロックに、細い針を用いて内部に酵母を１０．０００ ＣＦＵ／ｍｌで２回接種した。当該バッグは当該トバログを覆い、テープで密封された。
当該試料を７±１℃で保存し、適切な間隔で、Ｋ．ラクティス（Ｋ． ｌａｃｔｉｓ）のコンタミネーションのレベルが解析された。解析は、１ｇのトバログ、更にサリンペプトン中の適切な１倍希釈物を、Ｙｅａｓｔ Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ （ＹＧＣ）寒天上にプレーティングし、それを２５℃で５日間好気的にインキュベーションすることにより行われた。
図１１に示すように、発酵前に出発培養株ＣＨＮ−１９と共にラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１２６９７が存在していたトバログにおいて、Ｋ．ラクティス（Ｋ． ｌａｃｔｉｓ）のの増殖は阻害された。ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１２６９７は、市販の培養株ＨＯＬＤＢＡＣ（商標） ＹＭ−Ｂよりも顕著に高い阻害を引き起こした。
実施例１３：ヨーグルト中のデバロマイケス・ハンセニイ（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ ｈａｎｓｅｎｉｉ）に対するラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６の阻害効果の定量的判定
ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６を単一株として用いた場合の、デバロマイケス・ハンセニイ（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ ｈａｎｓｅｎｉｉ）に対する阻害効果を定量的に試験するため、ヨーグルトが調製された。
ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６を単一株として用いた場合の、デバロマイケス・ハンセニイ（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ ｈａｎｓｅｎｉｉ）に対する阻害効果を定量的に試験するため、ヨーグルトが調製された。
均質化乳（１．５％ｗ／ｗ）を１Ｌボトル中のウォーターバスで９５℃で５分間熱処理し、そして急冷した。市販の出発培養株（Ｃｈｒ． Ｈａｎｓｅｎ Ａ／Ｓ， Ｄｅｎｍａｒｋ 製Ｆ−ＤＶＳ ＹＦ−Ｌ９０１）を０．０２％で播種した。当該乳に、更に、ＨＯＬＤＢＡＣ（商標） ＹＭ−Ｂ （２０ＤＣＵ／１００Ｌ）又はラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６（１ｘ１０７ＣＦＵ／ｍｌ）を播種した。前記出発培養物のみ播種された１つのボトルを、参照物とした。
当該乳を、ｐＨが４．６０±０．１に達するまで、４３℃±１℃で発酵させた。作製されたヨーグルトをカップ（１００ｇ）に注ぎ、７℃±１℃で保存した。
ヨーグルトを調製した翌日、２つのヨーグルトのカップ中に、２０ＣＦＵ／ｇとなるように、カップあたり１ｍｌの酵母を播種した。当該酵母は、ヨーグルト中に均一に分散させられた。当該カップに蓋をして、７℃で保存し、適切な間隔でＤ．ハンセニイ（Ｄ． ｈａｎｓｅｎｉｉ）のコンタミネーションが解析された。解析は、１ｇのヨーグルト、更にサリンペプトンの適切な１倍希釈液を、Ｙｅａｓｔ Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ （ＹＧＣ）寒天上にプレーティングし、それを２５℃で５日間好気的にインキュベーションすることにより行われた。
図１２に示すように、Ｄ．ハンセニイ（Ｄ． ｈａｎｓｅｎｉｉ）の増殖は、発酵前に出発培養株ＹＦ−Ｌ９０１と共にラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６が存在していた場合、阻害された。当該株は、市販の培養株ＨＯＬＤＢＡＣ（商標） ＹＭ−Ｂよりも顕著に高度な阻害を引き起こした。
供託及び当業者の解決法
出願人は、下記の供託された微生物の試料が、当該特許が登録査定を受けるまでに、必ず当業者に利用可能となっているべきことを要求する。
出願人は、下記の供託された微生物の試料が、当該特許が登録査定を受けるまでに、必ず当業者に利用可能となっているべきことを要求する。
ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１２６９７は、２０１１年３月１日に、Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ （Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ； ＤＳＭＺ）， Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒ． ７Ｂ， Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇに、受入番号ＤＳＭ２４６１６で、供託された。
ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６は、２０１１年３月１５日に、Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ （Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ； ＤＳＭＺ）， Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒ． ７Ｂ， Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇに、受入番号ＤＳＭ２４６５２で、供託された。
ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７は、２０１１年３月１５日に、Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ （Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ； ＤＳＭＺ）， Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒ． ７Ｂ， Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇに、受入番号ＤＳＭ２４６５１で、供託された。
以上の供託は、特許手続を目的とする微生物の供託の国際的承認についてのブダペスト条約に従い行われた。
参考文献
ＵＳ ２００５／００９５３１８ （Ｓｃｈｗｅｎｎｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．）
ＷＯ ２００４／０４１３０５ （Ｖａｌｉｏ Ｌｔｄ）
Ｔｈａｒｍａｒａｊ， Ｎ． ＆ Ｓｈａｈ， Ｎ．Ｐ． （２００９） Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｇａｉｎｓｔ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｙｅａｓｔｓ ａｎｄ ｍｏｌｄｓ ｉｎ ｃｈｅｅｓｅ−ｂａｓｅｄ ｄｉｐｓ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． ４４： １９１６− １９２６．
ＵＳ ２００５／００９５３１８ （Ｓｃｈｗｅｎｎｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．）
ＷＯ ２００４／０４１３０５ （Ｖａｌｉｏ Ｌｔｄ）
Ｔｈａｒｍａｒａｊ， Ｎ． ＆ Ｓｈａｈ， Ｎ．Ｐ． （２００９） Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｇａｉｎｓｔ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｙｅａｓｔｓ ａｎｄ ｍｏｌｄｓ ｉｎ ｃｈｅｅｓｅ−ｂａｓｅｄ ｄｉｐｓ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． ４４： １９１６− １９２６．
Claims (24)
- １つ以上のラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）株及び１つ以上のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）株を含有する、抗微生物組成物。
- 前記１つ以上のラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）株が、受入番号ＤＳＭ２４６１６のラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１２６９７、受入番号ＤＳＭ２４６５２のラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６、及びそれらの突然変異株からなる群から選択され、ここで当該突然変異株が、出発材料として供託された前記株を使用して取得される、請求項１に記載の抗微生物組成物。
- 前記１つ以上のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）株が、受入番号ＤＳＭ２４６５１のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７及びその突然変異株からなる群から選択され、ここで当該突然変異株が、出発材料として供託された前記株を使用して取得される、請求項１又は２のいずれかに記載の抗微生物組成物。
- 以下の群：
Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ （ＤＳＭＺ）に受入番号ＤＳＭ２４６１６で供託されたラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１２６９７、
Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ （ＤＳＭＺ）に受入番号ＤＳＭ２４６５２で供託されたラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６、
Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ （ＤＳＭＺ）に受入番号ＤＳＭ２４６５１で供託されたラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＨＣＣ１２７７７；
及びそれらの突然変異株から選択される１つ以上の株を含有し、ここで当該突然変異株が、出発材料として供託された前記株を使用して取得される、抗微生物組成物。 - 食料、飼料又は医薬製品の調製における、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗微生物組成物の使用。
- 新菌類及び細菌並びにそれらの混合物からなぐ群から選択される望まれない微生物を阻害するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗微生物組成物の使用。
- 前記望まれない微生物は、真菌、酵母及びカビである、請求項６に記載の使用。
- 医薬製品としての、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗微生物組成物の使用。
- 請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗微生物組成物を含有する、食料、飼料又は医薬製品。
- 果物及び果物由来の製品、野菜及び野菜由来の製品、穀物及び穀物由来の製品、乳製品、獣肉、鶏肉及び海産物並びにそれらの混合物からなる群から選択される、請求項９に記載の食料製品。
- 乳製品である、請求項１０に記載の食料製品。
- 前記乳製品が、中温性又は好熱性発酵乳製品、ヨーグルトである、請求項１１に記載の食料製品。
- 獣肉又は鶏肉である、請求項１０に記載の食料製品。
- 請求項１〜４のいずれか１校に記載の組成物を含有する単位投与剤形である、請求項９に記載の医薬製品。
- 前記単位投与剤形がカプセル又は錠剤である、請求項１０に記載の医薬製品。
- 食料、飼料又は医薬製品、特に請求項９〜１５のいずれか１項に記載の食料、飼料又は医薬製品を製造する方法であって、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗微生物組成物が当該食料、飼料又は医薬製品に添加される工程を含む、当該製造方法。
- 請求項１６に記載の製造方法であって、
（ａ）前記食料、飼料又は医薬製品の製造の過程で、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗微生物組成物を、１つ以上のラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）株及び１つ以上のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）株が、当該食料、飼料又は医薬製品に対して１ｘ１０６ｃｆｕ／ｇ以上又は１ｘ１０６ｃｆｕ／ｍｌ以上、又は当該食料、飼料又は医薬製品の表面に１ｘ１０５ｃｆｕ／ｃｍ２の濃度となるように添加する工程、並びに
（ｂ）１つ以上のラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）株及び１つ以上のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）株の濃度が増大し、又は一定となるように、当該製造の過程で製造パラメーターを制御する工程
を含む、当該製造方法。 - １つ以上の発酵工程を含む、請求項１６又は１７のいずれかに記載の方法。
- ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）及びロイコノストックＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃから選択される属の１つ以上の株を含む出発培養を用いて乳基質を発酵させる工程を含む、請求項１８に記載の方法。
- 前記工程（ａ）における抗微生物組成物を食料、飼料又は医薬製品に添加する工程が、当該抗微生物組成物を食料、飼料又は医薬製品に混ぜ込むことを含む、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の方法。
- 前記工程（ａ）における抗微生物組成物を食料、飼料又は医薬製品に添加する工程が、当該抗微生物組成物を食料、飼料又は医薬製品の表面に適用することを含む、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の方法。
- Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ （ＤＳＭＺ）に受入番号ＤＳＭ２４６１６で供託された、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１２６９７株、又は出発材料として供託された当該株を使用して取得されるその突然変異株。
- Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ （ＤＳＭＺ）に受入番号ＤＳＭ２４６５２で供託された、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＨＣＣ１４２２６株、又は出発材料として供託された当該株を使用して取得されるその突然変異株。
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