JP2013542229A - フラボノイド誘導体、製造方法及び医薬品としての用途 - Google Patents

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Abstract

本発明は、フラボノイド誘導体、製造方法及び抗糖尿病医薬品としての用途に関する。
構造は式１に示す

式１
式中、Ｒ1及びＲ2は同一/又は異なって置換基で、水素原子、ハロゲン、シアノ、ハイドロキシ、トリフルオロメチル、チオメチル、ベンジル、炭素数Ｃ１−Ｃ８の直鎖アルキル/又は分枝鎖アルキル、炭素数Ｃ１−Ｃ８の直鎖アルコキシ/又は分枝鎖アルコキシを示す。
薬理実験結果より、フラボノイド誘導体がインスリン抵抗性Hep-G2細胞のグルコース消耗を著しく増加し、又は骨格筋細胞（L6GLUT4myc）グルコーストランスポーター４の転位を促進する作用を示し、細胞のグルコース摂取を著しく増加する。フラボノイド誘導体が骨格筋細胞グルコーストランスポーター４の転位を促進する作用を明らかにして、その薬理作用メカニズムの一つは、細胞中のAMPKを活性化し、さらにダウンストリームＡＣＣをリン酸化させて、抗糖尿病作用を果たす。

Description

本発明は、フラボノイド誘導体、製造方法及び抗糖尿病医薬品としての用途に関する。
糖尿病はインスリン絶対的に/又は相対的に不足して起こる高血糖及び合併症に伴う内分泌代謝的な、多発する疾患で、1型、2型糖尿病と分けられる。糖尿病はヒトの健康に深刻な害を与え、生涯にわたる慢性疾患である。不治の病気ではないか、今までに確実な治す方法はない。1990年代の初めから、社会の発展、人口の高齢化の傾向に伴い、糖尿病は世界的な病気になっている。先進国におけて、がん、心血管・脳血管疾患に次ぐ、糖尿病が世界に注目の公衆衛生上の大きな問題となっている。中国では、有病率は15年前の0.67％から3.21パーセントの現在レベルに増加し、大都市の有病率は5〜6％に達していて、糖尿病患者数は4000万人を超える。現在、臨床一般的に使用される薬剤とは、ビグアニド、スルホニル尿素、α-グルコシダーゼ阻害剤、チアゾリジンジオン類、およびGLP-1Rアゴニスト主に使われている。その中で、良い効果、持続的な血糖降下作用を有するメトホルミンが基本的な糖尿病治療薬の一つになっている。既存の合成薬物は確実な血糖下げる効果があるが、副作用あり、それに合併症の発生、長期使用の二次無効を防ぐことはできない。そのため、マルチターゲット、合併症を防ぐ作用を持つ、強い効果を有する天然由来な薬物を探すことは非常に重要な意義と実用な価値を持っている。
本発明者らは、いくつかのフラボノイドは、糖尿病に対する治療効果を有することを見出した。例えば、Jung等（Effect of citrus flavonoids on lipid metabolism and glucose-regulating enzyme mRNA levels in type-2 diabetic mice, IJBCB, 2006, 38, 1134-1145.）、Ong等（Insulinomimetic effects of myricetin on lipogenesis and glucose transport in rat adipocytes but not glucose transport translocation. Biochem Pharmacol. 1996, 51(4):423-429.）、Mahmood等（Antidiabetic effects of quercetin in streptozocin-induced diabetic rats, Comparative Biochemistry and Physiology Part C 135 (2003) 357-364.）及びEliandra de Sousa等（Hypoglycemic Effect and Antioxidant Potential of Kaempferol-3,7-O-(r)- dirhamnoside from Bauhinia forficata Leaves, J. Nat. Prod. 2004, 67, 829-832.）のグループはヘスペリジン、ミリセチン等のフラボノイドが脂質代謝を改善、インスリン様の作用を示すことを報告した。Yoshikawa等はミリセチン、ケルセチン等のフラボノイドがα−グルコシダーゼを抑制することを報告した（Antidiabetic principles of natural medicines.II. Aldose reductase and alpha-glucosidase inhibitors from Brazilian natural medicine, the leaves of Myrcia multiflora DC. (Myrtaceae): structures of myrciacitrins I and II and myrciaphenones A and B. Chem Pharm Bull (Tokyo), 1998, 46(1):113-119.）。さらに曹麗らはプエラリンが抗糖尿病作用を示すことを報告した（糖尿病マウスにおけるプエラリンがインスリン抵抗性に対しての影響,中草薬,2006,37(6):901-904）。これらの化合物は投与量高い、薬効が低く、臨床の意義がないと見られ、ある化合物の活性が陽性対照薬との比較が欠く。当研究室の発明特許（ZL200610015591.5, CN）には漢方薬―委陵菜より単離、構造同定した抗糖尿病活性成分−委陵菜フラボンが開示されている（その構造は式１）。
式１
薬物動態学的研究により、委陵菜フラボン構造の中、グルコースの部分が薬物動態に関する置換基で（代謝時間を延長する）、シンナモイルとケンフェロール部分構造はファーマコフォアである。従って、本発明は委陵菜フラボン構造を基にづいて、シンナモイルとケンフェロールとのエーテル結合する誘導体を合成し始める。
喜ばしいことで、発明者らが実験で確かめたフラボノイド誘導体の活性はメトホルミンと比べ相当する/又はより強いことを示した。そして、その抗糖尿病分子メカニズムの一つを明らかにした。この様な構造の化合物は糖尿病の治療に対して重要な応用価値を有する。
本発明の目的は、抗糖尿病作用を有するフラボノイド化合物及び糖尿病治療剤を提供することにある。
本発明は、以下の技術的解決策によって達成される。
本発明は、フラボノイド誘導体またはその薬学的に許容される塩を提供する。その構造式は式2で示す。
式2
式中、Ｒ1及びＲ2は同一/又は異なって置換基で、それぞれが独立に水素原子、ハロゲン、シアノ、ハイドロキシ、ベンジル、炭素数Ｃ１−Ｃ８の直鎖アルキル/又は分枝鎖アルキル、炭素数Ｃ１−Ｃ８の直鎖ハロアルキル/又は分枝鎖ハロアルキル、炭素数Ｃ１−Ｃ８の直鎖アルコキシ/又は分枝鎖アルコキシを示す。
そのなかで、前記（式２）の置換基Ｒ2は、水素原子、ハイドロキシ、炭素数Ｃ１−Ｃ８の直鎖アルコキシ/又は分枝鎖アルコキシを優選し、さらに水素原子を優選する。
前記のハロゲンは、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が表され、フッ素、塩素を優先する。
前記のアルキル、ハロアルキル、アルコキシ中の炭素数Ｃ１−Ｃ4を優先し、さらに1又は2を優先する。
前記のハロアルキル、即ちハロゲン化アルキルで、トリフルオロメチルを優先する。
前記のフラボノイド化合物は、以下の構造を優先する：
さらに、上記フラボノイド化合物I-1, I-2, I-3, I-4, I-8, I-9, I-10, I-11, I-12, I-14及びI-16が優選され、さらにI-3, I-4, I-9, I-10, I-11, I-12が優先され、最も好ましくはI-12である。
または、本発明は式2で示すフラボイド化合物またはその薬学的に許容される塩の合成方法を提供する。
その特徴は、式３に示す反応スキームにより合成される。
式3
式２に示すフラボノイド化合物又はたはその薬学的に許容される塩は以下の優選手順より合成される：
(1)それぞれの置換ベンズアルデヒドをアセトンで溶かし、４Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を入れ、反応温度は25−40度、かき混ぜる時間は15min-12h，反応終った後、反応液のpH値が中性に調節され、酢酸エチルで抽出、乾燥、濃縮したエキスを再結晶/又はカラムクロマトグラフィーで精製し、中間体IIシリーズが得られた。
(2)中間体IIをTHFで溶かし、その中にピロリドン-ヒドロトリブロマイドのTHF溶液を滴下して、室温で反応、一夜経ち、濾過、濃縮して得た残留物をカラムクロマトグラフィーで精製し、中間体IIIシリーズが得られた。
(3)ケンペロールを1,4 -ジオキサンで溶かし、無水炭酸カリウムを入れ、１ｈ還流し、中間体IIIのジオキサン溶液を滴下して、続けて還流1.5-12ｈ。反応が終った後、減圧濃縮でジオキサンを除き、pH値を酸性にして、酢酸エチルで抽出、乾燥、濃縮物をカラムクロマトグラフィー（Toyopear HW-40C）で分離、分取薄層クロマトグラフィーで精製して目的生成物Ｉシリーズが得られた。
もう一方、本発明は前記のフラボノイド又はその薬学的に許容される塩を医薬品としての用途、特に糖尿病治療剤への用途を提供する。
さらに、本発明前記のフラボノイド又はその薬学的に許容される塩をインスリン抵抗性に関する糖尿病治療剤への用途を提供する。
または、本発明は前記のフラボノイド又はその薬学的に許容される塩を骨格筋細胞グルコーストランスポーター４の転位に関する糖尿病治療剤への用途を提供する。
さらに、本発明は前記のフラボノイド又はその薬学的に許容される塩をAMPK活性に関する糖尿病治療剤への用途を提供する。
フラボノイド誘導体が骨格筋細胞グルコーストランスポーター４の転位に対する促進作用 異なる用量の化合物I-12が骨格筋細胞GLUT4転位に対する促進作用 フラボノイド誘導体I-12がAMP活性化プロテインキナーゼ（AMPK）およびアセチル補酵素Aのカルボキシラーゼ（ACC）リン酸化に対する影響
以下、実施例より本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
実施例１．
化合物IIシリーズの合成法
反応フラスコに置換されたベンズアルデヒドを適当に入れ、過剰のアセトンを加え、室温で原料を完全溶けるように撹拌した。そして、反応フラスコに1.5当量の4mol/L水酸化ナトリウムを入れ、40度で撹拌し、TLCで反応を完了させるまでにチェックする。反応液を減圧濃縮し、過剰のアセトンを除きる。残留物に1mol/L希塩酸を加え、弱酸性のpH値にし、ジクロロメタンで三回に抽出し、抽出液を合わせ、無水硫酸マグネシウムで乾燥、濾過、濃縮して残留物を得た。次にフラッシュシリカゲルカラムでエキスを分離、式4に示す化合物IIシリーズを得た。
実施例2
化合物IIIシリーズの合成法
反応フラスコにある量の化合物IIを入れ、テトラヒドロフランで溶かす。その中にピロリドン-ヒドロトリブロマイド(Pyrrolidone Hydrotribromide，PHT)のTHF溶液をゆっくり滴下して、室温で撹拌、反応する24ｈ/又はTLCで反応を完了させるまでにチェックする。反応終った後に濾過、減圧濃縮し、テトラヒドロフランを除きる。残留物をフラッシュシリカゲルカラムで分離、式5に示す化合物IIIシリーズを得た。
実施例3
化合物Iシリーズの合成法
反応フラスコにケンペロール（1.2当量）、無水炭酸カリウム（1.2当量）をいれ、ジオキサン5ml加え、ケンペロールを充分に溶かし、撹拌しながら加熱還流する1.5hの後、化合物III（1当量）を2mlジオキサンで溶かし、その溶液を還流状態の反応液に30minにかけて緩慢に滴下する。反応液を続けて還流し、TLCで反応を完了させるまでにチェックする。反応終った後、室温まで冷却、濾過、減圧濃縮し、テトラヒドロフランを除きる。残留物に希塩酸を加え、弱酸性のpH値にして、酢酸エチルで抽出し、抽出液を無水硫酸マグネシウムで乾燥、濾過、濃縮する。濃縮物をカラムクロマトグラフィー（Toyopear HW-40C）で分離、溶媒はジクロロメタン−メタノール(1:1, V/V)で溶出し、得た各画分をさらに分取薄層クロマトグラフィーで精製して、式6に示すフラボノイド誘導体が得た。
3.1 3-O-[(E)-4-(4-ヒドロキシフェニル)-2-オキソブト-3-エン-1-イル]ケンペロール (I-1) の合成
原料化合物III-1を上記実施例3の合成法で合成、分離精製して黄色い固体を得て、収率は18.5%。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 12.56 (1H, s, OH), 10.27 (1H, br s, OH), 10.12 (1H, br s, OH), 8.05 (2H, d, J = 8.9 Hz), 7.59 (1H, d, J = 16.1 Hz), 7.52 (2H, d, J = 8.6 Hz), 6.92 (2H, d, J = 8.9 Hz), 6.84 (1H, d, J = 16.1 Hz), 6.81 (2H, d, J = 8.6 Hz), 6.47 (1H, d, J = 2.1 Hz), 6.22 (1H, d, J = 2.0 Hz), 5.02 (2H, s). 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 194.6, 178.0, 164.7, 161.6, 160.7, 156.8, 155.7, 143.6, 136.8, 131.2, 131.0, 125.6, 121.0, 119.3, 116.4, 116.0, 104.5, 99.1, 94.2, 75.6, 60.2. ESI-MS m/z: 445.3 [M-H]-.
3.2 3-O-[(E)-4-(4-(ベンジルオキシ)フェニル)-2-オキソブト-3-エン-1-イル]ケンペロール(I-2) の合成
原料化合物III-2を上記実施例3の合成法で合成、分離精製して黄色い固体を得て、収率は21.3%。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 12.57 (1H, s, OH), 10.90 (1H, br s, OH), 10.28 (1H, br s, OH), 8.05 (2H, d, J = 8.9 Hz), 7.65-7.61 (3H, m), 7.47-7.45 (2H, m), 7.42-7.38 (2H, m), 7.36-7.32 (1H, m), 7.07(2H, d, J = 8.8 Hz), 6.94-6.90 (3H, m), 6.47 (1H, d, J = 2.0 Hz), 6.22 (1H, d, J = 2.0 Hz), 5.16 (2H, s), 5.04 (2H, s). 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 194.7, 178.0, 164.7, 161.6, 161.0, 160.7, 156.8, 155.7, 143.0, 137.1, 136.8, 131.0, 130.9, 128.9, 128.4, 128.3, 127.4, 121.0, 120.5, 116.0, 115.8, 104.5, 99.1, 94.2, 75.6, 69.9. ESI-MS m/z: 535.5 [M-H]-.
3.3 3-O-[(E)-4-(4-メトキシフェニル)-2-オキソブト-3-エン-1-イル]ケンペロール(I-3) 的合成
原料化合物III-3を上記実施例3の合成法で合成、分離精製して黄色い固体を得て、収率は19.2%。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 12.57 (1H, s, OH), 10.89 (1H, br s, OH), 10.29(1H, br s, OH), 8.05 (2H, d, J = 8.9 Hz), 7.63 (1H, d, J = 16.1 Hz), 7.63 (2H, d, J = 8.8 Hz), 6.98 (2H, d, J = 8.8 Hz), 6.92 (2H, d, J = 8.9 Hz), 6.91 (1H, d, J = 16.4 Hz), 6.46 (1H, d, J = 2.0 Hz), 6.22 (1H, d, J = 2.0 Hz), 5.04 (2H, s), 3.80 (3H, s). 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 194.7, 178.0, 164.7, 161.9, 161.6, 160.7, 156.8, 155.7, 143.1, 136.7, 131.0, 127.2, 121.0, 120.3, 116.0, 114.9, 104.5, 99.1, 94.2, 75.6, 55.8. ESI-MS m/z: 459.3 [M-H]-.
3.4 3-O-[(E)-4-(4-エトキシフェニル)-2-オキソブト-3-エン-1-イル]ケンペロー ル(I-4) 的合成
原料化合物III-4を上記実施例3の合成法で合成、分離精製して黄色い固体を得て、収率は17.3%。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 12.57 (1H, s, OH), 10.90 (1H, s, OH), 10.28 (1H, s, OH), 8.05 (2H, d, J = 8.7 Hz), 7.63 (1H, d, J = 16.5 Hz), 7.61 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.29 (2H, d, J = 8.0 Hz), 6.97 (2H, d, J = 8.6 Hz), 6.93 (2H, d, J = 8.5 Hz), 6.90 (1H, d, J = 14.6 Hz), 6.47 (1H, d, J = 1.5 Hz), 6.22 (1H, d, J = 1.5 Hz), 5.04 (2H, s), 4.07 (2H, q), 1.34 (3H, t). 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 194.2, 177.5, 164.2, 161.1, 160.7, 160.2, 156.3, 155.2, 142.6, 136.3, 130.5, 130.4, 126.5, 121.1, 120.5, 119.7, 115.5, 114.8, 104.0, 98.6, 93.7, 75.2, 63.3, 14.5. ESI-MS m/z: 473.4 [M-H]-.
3.5 3-O-[(E)-(2-オキソ-4-フェニルブト-3-エン-1-イル)]ケンペロール(I-5)的合成
原料化合物III-5を上記実施例3の合成法で合成、分離精製して黄色い固体を得て、収率は17.6%。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 12.56 (1H, s, OH), 10.89 (1H, s, OH), 10.27 (1H, s, OH), 8.05 (2H, d, J = 8.8 Hz), 7.67 (1H, d, J = 16.0 Hz), 7.69-7.67 (2H, m), 7.45-7.43 (3H, m), 7.05 (1H, d, J = 16.4 Hz), 6.93 (2H, d, J = 8.8 Hz), 6.47 (1H, d, J = 1.9 Hz), 6.22 (1H, d, J = 1.9 Hz), 5.08 (2H, s). 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 194.9, 178.0, 164.7, 161.6, 160.7, 156.8, 155.7, 143.1, 136.8, 134.7, 131.2, 131.0, 129.4, 129.0, 122.8, 121.0, 116.0, 104.5, 99.1, 94.2, 75.7. ESI-MS m/z: 429.4 [M-H]-.
3.6 3-O-[(E)-(2-オキソ-4-(p-トリル)ブト-3-エン-1-イル]]ケンペロール(I-6) 的合成
原料化合物III-6を上記実施例3の合成法で合成、分離精製して黄色い固体を得て、収率は13.4%。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 12.56 (1H, s, OH), 10.88 (1H, br s, OH), 10.27 (1H, br s, OH), 8.05 (2H, d, J = 8.9 Hz), 7.63 (1H, d, J = 16.2 Hz), 7.57 (1H, d, J = 8.1 Hz), 7.25 (2H, d, J = 8.0 Hz), 6.99 (1H, d, J = 16.3 Hz), 6.47 (1H, d, J = 2.0 Hz), 6.22 (1H, d, J = 2.0 Hz), 5.06 (2H, s), 2.34 (3H, s). 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 194.9, 178.0, 164.7, 161.6, 160.7, 156.8, 155.7, 143.2, 141.3, 136.8, 132.0, 131.9, 131.0, 129.1, 121.8, 121.0, 116.0, 104.5, 99.1, 94.2, 75.7, 21.5. ESI-MS m/z: 443.4 [M-H]- .
3.7 3-O-[(E)-4-(3-ヒドロキシ-4-メトキシフェニル)-2-オキソブト-3-エン-1-イル]ケンペロール(I-7)の合成
原料化合物III-7を上記実施例3の合成法で合成、分離精製して黄色い固体を得て、収率は12.4%. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 12.57 (1H, s, OH), 10.89 (1H, s, OH), 10.27 (1H, s, OH), 9.25(1H, s, OH), 8.05 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.55 (1H, d, J = 16.0 Hz), 7.12 (2H, s), 6.97 (1H, d, J = 8.5 Hz), 6.92 (2H, d, J = 8.4 Hz), 6.82 (1H, d, J = 16.0 Hz), 6.47 (1H, s), 6.22 (1H, s), 5.02 (2H, s), 3.82 (3H, s). 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 194.1, 177.5, 164.2, 161.1, 160.2, 156.3, 155.2, 150.4, 146.7, 143.1, 136.3, 130.5, 127.0, 121.8, 120.5, 119.7, 115.5, 114.2, 112.0, 104.0, 98.6, 93.7, 75.1, 55.6. ESI-MS m/z: 475.4 [M-H]-
3.8 3-O-[(E)-4-(3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニル)-2-オキソブト-3-エン-1-イル]ケンペロール(I-8)
原料化合物III-8を上記実施例3の合成法で合成、分離精製して黄色い固体を得て、収率は13.5%. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 12.58 (1H, s, OH), 10.89 (1H, s, OH), 10.26 (1H, s, OH), 9.70(1H, br s, OH), 8.06 (2H, d, J = 8.8 Hz), 7.59 (1H, d, J = 16.1Hz), 7.30 (1H, d, J = 1.5 Hz), 7.13 (1H, d, J = 8.2 Hz, J = 1.5Hz), 6.92 (2H, d, J = 8.8 Hz), 6.90 (1H, d, J = 16.1 Hz), 6.47 (1H, d, J = 1.9 Hz), 6.22 (1H, d, J = 2.0 Hz), 5.04 (2H, s), 3.82 (3H, s). 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 194.5, 178.0, 164.7, 161.6, 160.7, 156.8, 155.7, 150.2, 148.4, 144.0, 136.8, 131.0, 126.2, 124.0, 121.0, 119.7, 116.1, 116.0, 112.0, 104.5, 99.1, 94.2, 75.5, 56.1. ESI-MS m/z: 475.4 [M-H]-.
3.9 3-O-[(E)-4-(4-(tert-ブチル)フェニル)-2-オキソブト-3-エン-1- イル]ケンペロール (I-9)
原料化合物III-9を上記実施例3の合成法で合成、分離精製して黄色い固体を得て、収率は17.3%. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 12.55 (1H, s, OH), 10.84 (1H, s, OH), 10.25 (1H, s, OH), 8.06 (2H, s, J = 2.0 Hz), 7.65 (1H, d, J = 16.3 Hz), 7.60 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.46 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.00 (1H, d, J = 16.2Hz), 6.93 (2H, d, J = 9.0 Hz), 6.47 (1H, d, J = 2.2 Hz), 6.22 (1H, d, J = 2.0 Hz), 5.07 (2H, s), 1.29 (9H, s). 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ194.9, 178.0, 164.7, 161.6, 160.7, 156.8, 155.7, 154.2, 143.1, 136.8, 132.0, 131.0, 128.9, 126.3, 122.0, 121.0, 116.0, 104.5, 99.1, 94.2, 75.7, 35.1, 31.3. ESI-MS m/z: 485.2 [M-H]-.
3.10 3-O-[(E)-4-(4-イソプロピルフェニル)-2-オキソブト-3-エン-1- イル]ケン ペロール(I-10)
原料化合物III-10を上記実施例3の合成法で合成、分離精製して黄色い固体を得て、収率は21.2%. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 12.55 (1H, s, OH), 8.05 (1H, d, J = 8.9 Hz), 7.64 (1H, d, J = 16.2 Hz), 7.59 (2H, d, J = 8.2 Hz), 7.30 (2H, d, J = 8.2 Hz), 7.00 (1H, d, J = 16.3 Hz), 6.93 (2H, d, J = 8.9 Hz), 6.47 (1H, d, J = 2.0 Hz), 6.22 (1H, d, J = 2.0 Hz), 5.06 (2H, s), 2.91 (1H, m), 1.20 (6H, d, J = 6.9Hz). 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 194.9, 178.0, 164.7, 161.6, 160.7, 156.8, 155.7, 152.0, 143.2, 136.7, 132.3, 132.0, 131.0, 129.2, 127.4, 126.6, 116.0, 104.5, 99.1, 94.2, 75.7, 60.2, 33.9, 24.0. ESI-MS m/z: 471.2 [M-H]-.
3.11 3-O-[(E)-4-(3-クロロ-4-ヒドロキシフェニル)-2-オキソブト-3-エン-1-イ ル]ケンペロール(I-11)
原料化合物III-11を上記実施例3の合成法で合成、分離精製して黄色い固体を得て、収率は13.5%. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 12.57 (1H, s, OH), 10.89 (2H, s, OH), 10.28 (1H, s, OH), 8.06 (2H, d, J = 8.6 Hz), 7.75 (1H, s), 7.58 (1H, d, J = 16.2 Hz), 7.50 (1H, d, J = 8.5 Hz), 7.02 (1H, d, J = 8.5 Hz), 6.93 (2H, d, J = 8.7 Hz), 6.92 (1H, d, J = 15.6 Hz), 6.48 (1H, s), 6.22 (1H, s), 5.04 (2H, s). 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 194.1, 177.5, 164.2, 161.1, 160.2, 156.3, 155.5, 155.2, 141.6, 136.2, 130.5, 130.3, 128.8, 126.5, 120.5, 120.4, 120.3, 116.9, 115.5, 104.0, 98.6, 93.7, 75.1. ESI-MS m/z: 479.9 [M-H]-.
3.12 3-O-[(E)-4-(4-シアノフェニル)-2-オキソブト-3-エン-1-イル]ケンペロー ル (I-12)
原料化合物III-12を上記実施例3の合成法で合成、分離精製して黄色い固体を得て、収率は20.1%. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 12.53 (1H, s, OH), 10.89 (1H, s, OH), 10.25 (1H, s, OH), 8.04 (2H, d, J = 8.9 Hz), 7.91-7.86 (4H, m), 7.70 (1H, d, J = 16.4 Hz), 7.19 (1H, d, J = 16.4 Hz), 6.47 (1H, d, J = 2.0 Hz), 6.22 (1H, d, J = 2.0 Hz), 5.10 (2H, s). 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ195.0, 177.9, 167.6, 164.7, 163.5, 161.6, 160.7, 159.0, 156.8, 155.7, 142.4, 140.8, 139.3, 136.7, 133.2, 133.1, 131.0, 129.6, 126.0, 121.0, 119.0, 116.0, 112.9, 104.5, 99.2, 94.2, 75.9. ESI-MS m/z: 453.9 [M-H]-.
3.13 3-O-[(E)-4-(4-ブロモフェニル)-2-オキソブト-3-エン-1-イル]ケンペロール (I-13)
原料化合物III-13を上記実施例3の合成法で合成、分離精製して黄色い固体を得て、収率は13.1%. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 12.53 (1H, s, OH), 10.87 (1H, s, OH), 10.25 (1H, s, OH), 8.04 (2H, d, J = 8.7 Hz), 7.63 (4H, m), 7.07 (1H, d, J = 16.3 Hz), 6.92 (2H, d, J = 8.7 Hz), 6.47 (1H, d, J = 1.5 Hz), 6.22 (1H, d, J = 1.6 Hz), 5.07 (2H, s). 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 194.9, 177.9, 164.7, 161.6, 160.7, 156.8, 155.7, 141.7, 136.7, 134.0, 132.4, 131.0, 130.9, 124.5, 123.6, 121.0, 116.0, 104.5, 99.2, 94.2. ESI-MS m/z: 507.6 [M-H]-.
3.14 3-O-[(E)-4-(4-フルオロフェニル)-2-オキソブト-3-エン-1-イル]ケンペロール(I-14)
原料化合物III-14を上記実施例3の合成法で合成、分離精製して黄色い固体を得て、収率は19.2%. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 12.54 (1H, s, OH), 10.36 (1H, br s, OH), 10.00 (1H, br s, OH), 8.03 (2H, d, J = 8.2 Hz), 7.75-7.65 (3H, m), 7.29-7.25 (2H, m), 7.00 (1H, d, J = 16.0 Hz), 6.93 (2H, d, J = 8.4 Hz), 6.50 (1H, s), 6.24 (1H, s), 5.06 (2H, s). 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ194.9, 177.9, 165.1, 164.9, 162.7, 161.6, 160.8, 156.8, 155.7, 141.9, 136.7, 131.4, 131.3, 131.0, 130.4, 122.8, 121.0, 116.6, 116.4, 116.0, 104.5, 99.2, 94.3, 75.7, 63.3. ESI-MS m/z: 447.1 [M-H]-.
3.15 3-O-[(E)-4-(4-クロロフェニル)-2-オキソブト-3-エン-1-イル]ケンペロール(I-15)
原料化合物III-15を上記実施例3の合成法で合成、分離精製して黄色い固体を得て、収率は12.4%. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 12.60 (1H, s, OH), 10.97 (1H, br s, OH), 10.34 (1H, br s, OH), 8.10 (2H, d, J = 8.9 Hz), 7.76 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.71 (1H, d, J = 16.4 Hz), 7.55 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.12 (1H, d, J = 16.4 Hz), 6.97 (2H, d, J = 8.9 Hz), 6.53 (1H, d, J = 2.0 Hz), 6.27 (1H, d, J = 2.0 Hz), 5.13 (2H, s).13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 194.9, 178.0, 164.7, 161.6, 160.7, 156.8, 155.7, 141.7, 136.7, 135.7, 133.7, 131.0, 130.7, 129.5, 123.5, 121.0, 116.0, 104.5, 99.2, 94.2, 75.8, 63.3. ESI-MS m/z: 463.8 [M-H]-.
3.16 3-O-[(E)-4-(3,4-ジクロロフェニル)-2-オキソブト-3-エン-1-イル]ケンペ ロール(I-16)
原料化合物III-16を上記実施例3の合成法で合成、分離精製して黄色い固体を得て、収率は24.5%. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 12.54 (1H, s, OH), 10.90 (1H, s, OH), 10.26 (1H, s, OH), 8.05 (2H, d, J = 8.6 Hz), 8.02 (1H, s), 7.69 (2H, s), 7.63 (1H, d, J = 16.3 Hz), 7.15 (1H, d, J = 16.3 Hz), 6.91 (2H, d, J = 8.6 Hz), 6.47 (1H, s), 6.22 (1H, s), 5.08 (2H, s). 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 194.4, 177.4, 170.3, 164.2, 161.1, 160.2, 156.3, 155.2, 139.7, 136.2, 135.1, 132.8, 131.8, 131.0, 130.5, 130.2, 128.3, 124.3, 120.5, 115.5, 112.8, 104.0, 98.6, 93.7, 75.3, 59.7. ESI-MS m/z: 498.3 [M-H]-.
式6
実施例4 薬理実験
4.1フラボノイド誘導体がインスリン抵抗性Hep-G2細胞のグルコース消耗に対する影響
4.1.1実験方法
ヒト肝細胞Hep-G2のインスリン抵抗性モデルの作製
高濃度インスリンでインスリン抵抗性(IR)の細胞モデルを誘発する。インスリン(10-7mol/L)を含まる高グルコースDMEM培地で36hに培養したのち、pH値4の高グルコースDMEM培養液で3分ごとに4回洗い流し、再びPBS溶液2回洗って、細胞上のインスリンを除く。インスリン(10-7mol/L)を含まる高グルコースDMEM培地で36hに培養したHep-G2細胞をインスリン抵抗性細胞（IR細胞）として、インスリン含まっていない培養液に培養したHep-G2細胞をコントロール細胞とする。
試薬調製
各化合物をDMSOで溶かし、それぞれに六つ/又は八つのの溶液濃度に調製し、高グルコースDMEM培地に加える(各化合物溶液中のDMSO終濃度を0.1％にする)。
4.1.2検出指標
グルコース消耗量:化合物を加えた24時間後、グルコース検出用キットで96ウェルプレート中、細胞上清中の残存グルコース含有量を検出する。
データの統計
各グループのデータをmean±sdで示し、SPSS16.0の統計ソフトで各フループの細胞グルコース消耗量に分散分析及びグループ間の平均値を比較し、各化合物がインスリン抵抗性Hep-G2細胞のグルコース消耗量を増加するの量及び増加率を計算し、さらに50%効果濃度EC50を得る。
増加率＝(化合物組グルコース消耗量−モデル組グルコース消耗量)/モデル組グルコース消耗量X 100%
4.1.3 実験結果
実験結果より、フラボノイド誘導体はインスリン抵抗性Hep-G2細胞のグルコース消耗を著しく増加し、その中、化合物I-12がもっとも強い活性を示した。
表4.1化合物 I-xがンスリン抵抗Hep-G2細胞のグルコース消耗を増加する作用
4.2グルコーストランスポーター４過剰表現の骨格筋細胞（L6GLUT4myc）で抗糖尿病化合物をスクリニンーグする
フラボノイド誘導体が骨格筋細胞（L6GLUT4myc）グルコーストランスポーター４転位の促進作用
4.2.1実験の原理
GLUT4は骨格筋中の主なグルコーストランスポーターで、基礎状態に大部分のGLUT4は細胞質小胞に位置する。インスリン刺激によりGLUT4は細胞膜に転位し、より多いのグルコースを細胞内に輸送する。GLUT4は骨格筋中の最も主要なグルコーストランスポーターで、それにGLUT4がグルコースを輸送することは骨格筋におけるグルコース代謝の律速段階である。従って、細胞膜にあるGLUT4の量が細胞のグルコース摂取量に反映する。定量的にGLUT4の転位を検出するため、我々は安定なGLUT4myc過剰表現のラット骨格筋細胞L6GLUT4mycを用いて実験する。本実験はELISA方法で抗myc抗体、及び西洋ワサビペルオキシダーゼ(horseradish peroxidase, HRP)標識の二次抗体を使用し、O-フェニレンジアミンを触媒して、その反応物は492nmで最大吸収を示し、その吸収値は細胞膜上のGLUT4mycのレベルを反映する。
4.2.2実験方法
試薬調製
各化合物をDMSOで溶かし、それぞれに二つ/又は五つの溶液濃度グルップに調製し、保存する。使う時に低グルコースDMEM培地で1:1000に(各化合物溶液中のDMSO終濃度を0.1％にする)希釈し、一つ濃度の化合物グループをトリプリケートにする。対照グループには0.1％DMSOで、ブランクグループはいずれの処理をしない、又は陽性対照薬としてインスリンで使用。
4.2.3結合抗体の吸光度分析法で細胞膜上GLUT4mycの含量測定
筋管細胞に分化したL6GLUT4mycを低グルコースDMEMで4時間インキュベートし、異なる濃度の化合物溶液を加え、24時間インキュベートする。インスリングループに500 μl /ウェルでインスリンを加え、終濃度を100 nmol/Lにし、20minインキュベートする。次にウェルプレートを氷の上に置き、4oC状態の1 mM Ca2+ 及び1 mM Mg2+ を含まるPBS溶液[PBS(+)]で3回洗い流し、各ウェルに3％パラホルムアルデヒド（PFA）0.25mlを加え、氷上で10分間の後、室温で20分間の後、PFAを捨て、PBS(+)で2回洗い流し、各ウェルに0.1 mMのグリシン750 μlを加え、室温で10分間後、PBS(+)で2回洗い流し、5％（v / v）のスキムミルクでクローズして10分間後、抗-mycポリクローナル抗体を200 μl（1:250）加え、室温で1時間インキュベートする。その次にPBS(+)で6回洗い流し、各ウェルにHRP-バウンドのヤギ抗ウサギIgG (1:5000)200 μlを加え、室温で1時間インキュベートし、再びPBS(+)で6回洗い流し、各ウェルにO-フェニレンジアミン (OPD)溶液1 mlを加え、暗室で10−20分間反応した後、各ウェルに 3MHCl 250 μlを入れ、反応を中止する。上澄み液を取り，マイクロプレートリーダーで492nmに吸光度を測定する。
データの統計
実験結果は化合物グループのOD値が対照グループOD値に対する倍数で各グループ細胞膜上GLUT4mycの転位を比較する。
SPSS16.0の統計ソフトで分析する。単一因子の分散分析(One-Way ANOVA)でグループ間を比較する。統計的有意性は、5％（P <0.05）のレベルであった。
4.2.4 実験結果
本実験の結果より、フラボノイド誘導体は骨格筋細胞（L6GLUT4myc）グルコーストランスポーター４の転位を促進する作用を示し(図1及び図2)、細胞のグルコース摂取を著しく増加する。その中、化合物I-12がもっとも強い活性を示し、2及び5μg/mLの化合物I-12は骨格筋細胞グルコーストランスポーター４の転位を促進する作用がインスリンより強いことを示した。
4.3 Western Blot方法でフラボノイド化合物がAMPK及びACCリン酸化に対する影響の評価
4.3.1糖尿病発生発展におけるAMPK経路の作用
AMP活性化プロテインキナーゼ(AMP-activated protein kinase, AMPK)経路は細胞のグルコース取り込みを刺激する主経路である。細胞は何らの応激でATP生成減少/又は消耗増加することによりAMP/ ATP比が増加し、AMPKが活性化され、AMPKは代謝調節のハブとして、そのダウンストリームの分子をリン酸化し、グルコース、脂質代謝を調節する。運動、低酸素状態、浸透圧上昇の刺激によるAMPK経路は活性化され、そして、GLUT4を細胞膜に転位させ、グルコース摂取を促進する。
ACCはAMPKのダウンストリームのターゲット蛋白質の一つで、生理的な状態でACCはアセチル補酵素Aを触媒し、カルボキシル化してマロニル補酵素Aになり、そしてミトコンドリアの脂肪酸酸化が抑制され、脂質代謝に影響を与える。AMPKはACCをリン酸化し、ACCが失活、脂肪生成を減少させる。
本実験はWestern Blot方法でフラボノイド化合物がHepG2細胞のAMPK及びACCリン酸化に対する影響を評価し、各化合物が糖、脂質代謝を調節メカニズムはAMPKシグナル経路との関係を明らかにする。
4.3.2実験方法
サンプル作製：飢餓後のHepG2細胞に各化合物を加え、2時間インキュベートした後、PBSで2回洗い流し、RIPAの細胞ライセートを入れ、氷上で20分間の後、それを13000 rpm/min、4oC遠心10 min間後，上清液をBCA分析法で蛋白質濃度を測定し、ローディングバッファーでサンプルの蛋白質濃度を40μg/30μlに希釈して、65oC加熱する15 minの後，-20oCで保存する。
ウエスタンブロット（Western blotting）分析：
7.5％アクリルアミド-SDSゲル2個を電気泳動槽に挿し、泳動液を入れる。サンプルのロード：電圧は80Vで電気泳動し、サンプルストリップが分離ゲルに至ったときに、電圧を110Vに上昇させて、サンプルストリップが底に接近する時に電気泳動を終了。ウェット・ツー・フィルム：110 V、2時間で膜に転写し、5％BSA溶液中にPVDF膜を入れ、1時間クローズする。その膜を一次抗体溶液に入れ、氷の上に1時間揺れ、続けて4°Cで一夜経ち、PVDF膜をTBST溶液で15分間ごとに4回洗い、二次抗体溶液にいれ、室温で1時間揺れた後、TBST溶液で15分間ごとに4回洗い、ECL発色、暗室でエクスポージャーする。
4.3.3 実験結果
図3に示すように、化合物I-12はHep-G2細胞中のAMPKを活性化し、リン酸化レベルを上昇させ、さらにダウンストリームＡＣＣのリン酸化を促進した。
上記各薬理実験の結果により、本発明は合成したフラボノイド誘導体がインスリン抵抗性Hep-G2細胞のグルコース消耗を著しく増加し、細胞のグルコース摂取を増加させる。又は、フラボノイド誘導体I-2，I-3，I-10，I-12，及びI-14は骨格筋細胞（L6GLUT4myc）グルコーストランスポーター４の転位を促進する作用を示し、骨格筋細胞のグルコース摂取と利用を著しく促進することを表した。本発明提供したフラボノイド誘導体は抗糖尿病作用を示し、糖尿病治療剤として用いられる。
特に、本発明において特許請求した化合物は一般に抗糖尿病活性を示した上に、発明者らは予想外に一部分の優選化合物の活性がメトホルミンと相当する/又はより強い活性を示した。例えば、置換基R２がHである時、或は具体的に化合物I-1, I-3, I-4, I-6, I-9, I-10, I-12及びI-13の活性がメトホルミンと相当する/又はより強い活性を示して、特に化合物I-3, I-4, I-6, I-9, I-10, I-12はメトホルミンより強い活性を示した。
さらに、骨格筋細胞（L6GLUT4myc）グルコーストランスポーター４の転位、及びAMPK経路に相関するシグナル分子に対する評価の結果により、本発明提供した活性化合物の抗糖尿病活性が強い、特に化合物I-12は最も強い活性を示し、2及び5μg/mLの化合物I-12は骨格筋細胞グルコーストランスポーター４の転位を促進する作用がインスリンより強いことを示した。もう一方、本発明において特許請求した化合物は骨格筋細胞グルコーストランスポーター４の転位を著しく促進する作用を始めて証明され、その薬理作用メカニズムの一つは、細胞中のAMPKを活性化し、さらにダウンストリームのＡＣＣリン酸化を促進することにより抗糖尿病作用を果たす。
薬学研究者たちが抗糖尿病活性の化合物を探し続けていて、許容された活性を持つ化合物の発見は抗糖尿病薬物研究に対し重要な意義を持っている。本発明において特許請求した化合物の構造より、フラボン骨格の置換基はすべてヒドロキシで限定され、それに３位にメチレンよりシンナモイルとC-C結合した置換基の構造は、今まで公開している抗糖尿病活性化合物の構造より著しく異なっている。本領域の研究者らは現在に一般的なフラボノイド化合物構造より改造を行い、シンナモイル置換基を特定な３位に位置し、またブラボン骨格のすべての置換基をヒドロキシに限定した本発明の化合物が得られることは非常に難しいと見られる。即ち、本発明の化合物構造は本領域の研究者らに対し、容易に見出せないことである。
さらに、本発明に述べている置換基が厳格的に限定されているので、それを含まる化合物が非常に限られていている。さらに本発明において代表的な化合物が各薬理実験で評価したことにより本領域に許容された強い抗糖尿病活性示し、本発明は相関研究より大きな進歩であった。
特に、本発明の優選した化合物がメトホルミンと相当する活性/又はより強い抗糖尿病活性を示し、特に2及び5μg/mLのフラボノイド誘導体I-12は骨格筋細胞グルコーストランスポーター４転位を促進する作用がインスリンより強いことを示した。さらに、フラボノイド誘導体の抗糖尿病作用メカニズムの一つを明らかにした。本領域の研究者らは現在にある技術より上記のことを予想/又は推測できないことであり、即ち本発明の化合物は予想できない発明な効果である。一般的な抗糖尿病活性を有する化合物に対し、本発明の化合物はより重要な価値を持っている。

Claims (10)

  1. フラボノイド誘導体またはその薬学的に許容される塩、その構造は式１で示す：
    式１
    式中、Ｒ1及びＲ2は同一/又は異なって置換基で、それぞれが独立に水素原子、ハロゲン、シアノ、ハイドロキシ、ベンジル、炭素数Ｃ１−Ｃ８の直鎖アルキル/又は分枝鎖アルキル、炭素数Ｃ１−Ｃ８の直鎖ハロアルキル/又は分枝鎖ハロアルキル、炭素数Ｃ１−Ｃ８の直鎖アルコキシ/又は分枝鎖アルコキシを示す。
  2. 請求項１に記載のフラボノイド誘導体またはその薬学的に許容される塩、上記（式１）の置換基R２は水素原子、ヒドロキシ、炭素数Ｃ１−Ｃ８の直鎖アルコキシ/又は分枝鎖アルコキシである。
  3. 請求項１に記載のフラボノイド誘導体またはその薬学的に許容される塩、上記（式１）の置換基R２は水素原子である。
  4. 請求項１に記載のフラボノイド誘導体またはその薬学的に許容される塩は以下の構造式を有する。
  5. 請求項４に記載のフラボノイド誘導体またはその薬学的に許容される塩より、I-3, I-4, I-6, I-9, I-10, I-12が選ばれる。
  6. 請求項４に記載のフラボノイド誘導体またはその薬学的に許容される塩より、I-12が選ばれる。
  7. 請求項１−６のいずれかに記載のフラボノイド誘導体またはその薬学的に許容される塩の製造法の特徴は、式２に示す反応スキームにより製造される。
    式２
    式中、置換基R１、R２は、請求項１−６のいずれかに記載したこと。
  8. 請求項７に記載する製造法の特徴は、以下の手順より製造される：
    (1)それぞれの置換ベンズアルデヒドをアセトンで溶かし、４Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を入れ、反応温度は25−40度で、かき混ぜる時間は15min-12h。反応終った後、反応液のpH値が中性に調節され、酢酸エチルで抽出、乾燥、濃縮した残留物を再結晶/又はカラムクロマトグラフィーで精製し、中間体IIシリーズが得られた。
    (2)中間体IIをTHFで溶かし、その中にピロリドン-ヒドロトリブロマイドのTHF溶液を滴下して、室温で反応、一夜経ち、濾過、濃縮して得た残留物をカラムクロマトグラフィーで精製し、中間体IIIシリーズが得られた。
    (3)ケンペロールを1,4 -ジオキサンで溶かし、無水炭酸カリウムを入れ、１ｈ還流し、中間体IIIのジオキサン溶液を滴下して、続けて還流1.5-12ｈ。反応が終った後、減圧濃縮でジオキサンを除き、pH値を酸性にして、酢酸エチルで抽出、乾燥、濃縮物をカラムクロマトグラフィー（Toyopear HW-40C）で分離、分取薄層クロマトグラフィーで精製して目的生成物Ｉシリーズが得られた。
  9. 請求項１−６のいずれかに記載のフラボノイド誘導体またはその薬学的に許容される塩はインスリン抵抗性に関する糖尿病治療剤としての用途。
  10. 請求項１−６のいずれかに記載のフラボノイド誘導体またはその薬学的に許容される塩は骨格筋細胞グルコーストランスポーター４の転位に関する糖尿病治療剤としての用途。
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