CN103209971A - 黄酮衍生物、制备方法及其医药用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种黄酮类衍生物、衍生物制备及其在抗糖尿病药物方面的用途。其结构为式1所示：式1，结构中R1和R2可以相同也可以不同，代表氢原子，卤素，氰基，羟基，三氟甲基，硫甲基，苄氧基，C1-C8的直链或支链烷基，C1-C8的直链或支链烷氧基。药理实验结果表明，黄酮类衍生物能够显著增加胰岛素抵抗的Hep-G2细胞葡萄糖消耗量，而且具有不同程度的促进骨骼肌细胞（L6GLUT4myc）葡萄糖转运子4的转位的作用，能够显著增加细胞对葡萄糖的摄取利用，首次证明了黄酮类衍生物能够显著促进骨骼肌细胞葡萄糖转运子4的转位，其作用机制之一是通过激活细胞AMPK磷酸化，并使下游ACC发生磷酸化而起到抗糖尿病作用。

Description

说 明 书 黄酮衍生物、 制备方法及其医药用途 技术领域
本发明涉及一类新黄酮衍生化合物、 制备方法及其作为抗糖尿病药物的应用。 属于药物 化学领域。
背景技术
糖尿病是由于胰岛素绝对或相对不足引起的以高血糖和多并发症并存为特征的内分泌代 谢性常见病、 多发病， 可分为 1型和 2型糖尿病， 是一种严重危害人体健康的常见慢性终身 疾病。 糖尿病不是不治之症， 但到目前为止， 还没有一个国家能根治。 进入 20世纪 90年代 以来， 随着社会的发展， 人口老龄化的趋势， 糖尿病已经成为一种世界性疾病， 在工业发达 国家它仅次于癌症、 心脑血管疾病， 糖尿病已成为世界各国关注的重大公共卫生问题。 在我 国， 其发病率从 15年前的 0.67%上升到目前的 3.21 % , 大城市的患病率已经达到 5〜6%， 我 国的糖尿病患者已超过 4000万。 目前临床上常用药物， 主要为双胍类、 磺脲类、 糖苷酶抑 制剂、 噻唑垸二酮类， 以及 GLP-1R激动剂肽类药物， 其中， 二甲双胍由于疗效较好、 稳定 而持续的降血糖作用而成为治疗糖尿病的基础药物之一。 现有的合成药物虽然降血糖作用明 显， 但有不同程度的毒副作用， 也不能有效防止并发症的产生， 而且长期服用容易产生继发 性失效。 因此， 寻找既具有多靶点作用、 防止并发症， 又药效强的天然来源有效药物具有非 常重要的现实意义和很高的应用价值。
本发明人经研究发现某些黄酮类化合物对糖尿病具有一定的治疗效果。如 Jung等 (Effect of citrus flavonoids on lipid metabolism and glucose-regulating enzyme m NA levels in type-2 diabetic mice, IJBCB, 2006， 38， 1134-1145.)、 Ong等 Clnsulinomimetic effects of myricetin on lipogenesis and glucose transport in rat adipocytes but not glucose transport translocation.
Pharmacol. 1996， 51(4):423-429. )、 Mahmood 等 （ Antidiabetic effects of quercetin in streptozocin-induced diabetic rats, Comparative Biochemistry and Physiology Part C 135 (2003) 357-364. ) 和 Eliandra de Sousa 等 ( Hypoglycemic Effect and Antioxidant Potential of Kaempferol-3,7-0-(r)-dirhamnoside from Bauhinia forficata Leaves, J. Nat. Prod. 2004， 67， 829-832. ) 报道了橙皮苷、 杨梅酮等黄酮类化合物的提高脂代谢和拟胰岛素样等作用； Yoshikawa 等 ί艮道了 ( Antidiabetic principles of natural medicines.il. Aldose reductase and alpha-glucosidase inhibitors from Brazilian natural medicine, the leaves of Myrcia multiflora DC. (Myrtaceae): structures of myrciacitrins I and II and myrciaphenones A and B. Chem Pharm Bull (Tokyo), 1998, 46(1): 113-119. ) 杨梅素、 槲皮素等黄酮的 α-糖苷酶抑制作用， 以及曹丽等报道 了葛根素的抗糖尿病作用（葛根素对糖尿病小鼠踌岛素抵抗的影响， 中草药， 2006 , 37 (6)：, 901-904. )。 这些化合物作用剂量大药效低， 临床意义不大， 有的缺乏阳性对照药的比较。 本 实验室发明专利 （ZL200610015591.5 ) 公开了一个从中药委陵菜中分离鉴定的抗糖尿病活性 成分-委陵菜黄酮， 其结构如式 1所示， 对委陵菜黄酮进行药代动力学研究发现， 结构中糖的 部分为药代动力学基团（延长代谢吋间）， 而肉桂酰基和山奈酚母核为药效基团， 因此， 本发 明以委陵菜黄酮的结构为基础， JSit肉 酰基¾1^奈酚毋核昀醚化衍生物的合成。 令人欣喜 替换页 （细则第 26条） 说 明 书
的是， 发明人进行实验验证的黄酮醚化衍生物的活性达到或超过了二甲双胍的活性水平， 并 初步阐明了抗糖尿病分子作用机制。 这样的化合物结构对于糖尿病的治疗具有重要的应用价 值。
式 1
发明内容
本发明的目的是提供具有抗糖尿病作用的黄酮类化合物以及所述化合物在用于制备治 疗抗糖尿病药物中的用途。
本发明是通过下述技术方案加以实现的：
一方面， 本发明提供了一 盐， 其结构式如式 2所示：
式 2 结构中 和1 2可以相同也可以不同， 并且各自独立地代表氢， 素， 氰基， 羟基， 苄 氧基， C1-C8的直链或支链垸基， C1-C8的直链或支链卤代垸基， C1-C8的直链或支链浣氧 基。
其中所述取代基 R1优选为氢、 羟基、 C1-C8的直链或支链垸氧基， 更优选为氢。 所述卤素代表氟、 氯、 溴、 碘， 优选为氟、 氯。
所述垸基、 卤代垸基、 垸氧基中的碳数优选为 1-4， 更优选为 1或 2。
所述卤代烷基即卤素取代的烷基， 优选为三氟甲基。
所述黄酮类化合物优选
R. Ri R2
1-1 . OH H 1-9 i-Bu H
1-2 OBn H no '•-Pr H
1-3 OMe H Ml OH CI
1-4 OCH2CH3 H 1-12 CN H
1-5 H H 1-13 Br H
1-6 CH3 H 1-14 F H
1-7 OMe OH 1-15 CI H
1-8 OH OMe M6 CI CI 进一步地， 所述黄酮类化合物优选为 1-1,1-2, 1-3， 1-4, 1-5, 1-6, 1-9, 1-10, 1-12, 1-13, 和 1-14 更优选为 1-3, 1-4， 1-6, 1-9, 1-10, 1-12, 最优选为 1-12。
另一方面， 本发明还提供了式 2所述黄酮类化合物或其药学上可接受的盐的制备方法， 其特征在于通过式 3所示的反应路线制备：
式 3 优选地， 式 2所述黄酮类化合物或其药学上可接受的盐通过如下步骤制备：
(1)将相应的取代苯甲醛溶解于丙酮中，加入 4N氢氧化钠水溶液，反应温度为 25-40度， 搅拌时间为 15min到 12h， 反应结束后， 调节 pH值为中性， 乙酸乙酯萃取， 干燥， 过滤， 浓 縮后得粗品， 粗品经重结晶或柱层析纯化得到系列中间体 II。
(2)将中间体 II溶解于 THF中， 向其中滴加吡咯院酮三溴氢化物的 THF溶液， 室温反 应过夜， 过滤浓缩后可得到粗品， 粗品经柱层析得系列中间体 III。
(3)将山奈酚溶解于 1,4-二氧六环中， 加入无水碳酸钾， 回流 lh, 滴加中间体 III的二氧 六环溶液， 继续回流 1.5h-12h。 反应结束后， 减压除去二氧六环， 调节 pH值为酸性， 乙酸乙 酯萃取， 干燥， 浓缩， 过滤得粗品， 粗品经凝胶柱层析、 制备薄层色谱法纯化后得系列目标 产物 I。
再一方面， 本发明提供了如前所述的黄酮衍生物或其药学上可接受的盐在制药中的用 途， 尤其是在制备治疗糖尿病药物中的用途。
进一步地， 本发明提供了如前所述的黄酮衍生物或其药学上可接受的盐在制备治疗与胰 岛素抵抗细胞活性相关的抗糖尿病药物中的用途。
进一步地， 本发明提供了如前所述的黄酮衍生物或其药学上可接受的盐在制备治疗与骨 骼肌细胞葡萄糖转运子 4(GLUT4)转位相关的抗糖尿病药物中的用途。
另外， 本发明还提供了如前所述的黄酮衍生物或其药学上可接受的盐在制备治疗与腺苷 酸活化蛋白激酶活性相关的抗糖尿病药物中的用途。
附图说明
图 1 : 黄酮衍生物对骨骼肌细胞葡萄糖转运子 4 (GLUT4) 转位的促进作用
图 2: 不同浓度的化合物 1-12对骨说骼肌细胞 GLUT4转位的促进作用
图 3: 黄酮衍生物 1-12对腺苷酸活化蛋白激酶 （AMPK) 和乙酰辅酶 A羧化酶 （ACC) 磷酸化的影响
书
具体实施方式
通过以下实施例具体说明本发明的内容。 在本发明中， 以下所述的实例是为了更好地阐 述本发明， 而不是用来限制本发明的范围。
实施例 1.
系列化合物 II的合成通法
称取适量取代苯甲醛于反应瓶中， 加入过量丙酮， 室温下搅拌使原料充分溶解。 于室温 下向反应瓶中加入 1.5当量 4mol/L氢氧化钠溶液，反应液于 40°C下搅拌。 TLC监测至反应完 全。 于减压状态下浓縮反应液， 除去过量丙酮。 向残余物中加入 lmol/L稀盐酸调节 pH值为 弱酸性。 用适量二氯甲垸萃取 3次， 合并有机相。 有机相用无水硫酸镁干燥， 过滤， 浓缩得 粗品， 粗品经快速硅胶柱层析得到 4所示的系列化合物 II。
R. R2 Ri R2
1-1 OH H 1-9 /-Bu H
1-2 OBn H 1-10 i'-Pr H
1-3 OMe H 1 11 OH CI
1-4 OCH2CH3 H 1-12 CN H
1-5 H H 1-13 Br H
1-6 CH3 H 1-14 F H
1-7 OMe OH 1-15 CI H
1-8 OH OMe 1-16 CI CI 实施例 2.
系列化合物 III的合成通法：
称取适量化合物 II于反应瓶中， 加入四氢呋喃使其溶解。 称取 1.2当量的吡咯垸酮三溴 氢化物 （Pyrrolidone Hydrotribromide, PHT) 溶解于适量四氢呋喃中， 将该溶液于室温下缓慢 滴加到反应瓶中。 滴毕后于室温下搅拌 24h， 或 TLC监测至反应完全。 反应结束后过滤除去 白色不溶物， 收集滤液。 在减压状态下除去滤液中的四氢呋喃， 浓缩物经快速硅胶柱色谱后 得到式 5所示的系列化合物 III。
说
1-1 H 书 1-9 i-Bu H
1-2 OBn H 1-10 -Pr H
1-3 OMe H Ml OH CI
1-4 OCH2CH3 H 1-12 CN H
1-5 H H 1-13 Br H
1-6 CH3 H 1-14 F H
1-7 OMe OH 1-15 CI H
1-8 OH OMe M6 CI CI 式 5
实施例 3.
系列化合物 I的合成通法：
称取山奈酚 （1.2当量)， 无水 K2C03 (1.2当量)于三颈瓶中， 加入二氧六环 5ml使山奈酚 充分溶解， 反应液于回流状态下搅拌 1.5h后， 将化合物 III (1当量） 溶解于 2ml二氧六环， 将该溶液滴加至回流状态下的反应液中， 约半小时滴毕。 反应液继续回流。 TLC监测化合物 III消失后， 将反应液冷却至室温，减压状态下除去二氧六环， 向残余物中加入稀盐酸调节 pH 值至酸性， 乙酸乙酯萃取， 有机相用无水硫酸镁干燥， 过滤， 浓缩。 粗品经 HW-40c凝胶柱 色谱分离， 二氯甲浣 -甲醇 (1 : 1 , VA 为流动相， 得到各组分后经制备薄层色谱法纯化得到式 7 所示的各黄酮醚化衍生物。
3.1 3-< -[(E)-4-(4-羟基苯基) -3-烯 -2-酮丁基]山奈酚 （1-1) 的合成
以化合物 III-1为原料按上述方法制备经分离纯化后得黄色固体， 产率 18.5%。 'H-NMR (400 MHz, DMSO-i¾: δ 12.56 (1Η, s， OH), 10.27 (1H, br s, OH), 10.12 (1H, br s， OH), 8.05 (2H, d, J = 8.9 Hz), 7.59 (1H, d, J = 16.1 Hz), 7.52 (2H, d, J = 8.6 Hz), 6.92 (2H, d, J = 8.9 Hz), 6.84 (1H, d, J = 16.1 Hz), 6.81 (2H, d, J = 8.6 Hz), 6.47 (1H, d, J = 2.1 Hz), 6.22 (1H, d, J = 2,0 Hz), 5.02 (2H, s). 13C-丽 R (100 MHz, DMSO-^): δ 194.6, 178.0, 164.7, 161 ,6， 160.7, 156.8, 155.7, 143.6, 136.8, 131.2, 131.0, 125.6, 121.0, 119.3, 116.4, 116.0, 104.5, 99.1, 94.2, 75.6, 60.2. ESI-MS 说 明 书
m/z: 445.3 [M-H]-.
3.2 3-0-[(E)-4- (4-苄氧基苯基) -3-烯 -2-酮丁基]山奈酚 (1-2) 的合成
以化合物 ΙΠ-2为原料按上述方法制备经分离纯化后得黄色固体， 产率 21.3%。 ^-NMR (400 MHz, DMS0- ): δ 12.57 (IH, s, OH), 10.90 (IH, br s, OH), 10.28 (IH, br s, OH), 8.05 (2H， d, J = 8.9 Hz), 7.65-7.61 (3H， m), 7.47-7.45 (2H, m), 7.42-7.38 (2H, m), 7.36-7.32 (IH, m)， 7.07(2H, d, J= 8.8 Hz), 6.94-6.90 (3H, m), 6.47 (IH, d, J= 2.0 Hz), 6.22 (IH, d, J= 2.0 Hz), 5.16 (2H, s)， 5.04 (2H, s). 13C-NMR (100 MHz, DMSO-rf6): δ 194.7, 178.0, 164.7, 161.6, 161.0, 160.7, 156.8, 155.7, 143.0, 137.1, 136.8， 131.0, 130.9, 128.9, 128.4, 128.3, 127.4, 121.0, 120.5, 116.0, 115.8, 104.5， 99.1， 94.2, 75.6， 69.9. ESI-MS m/z: 535.5 [M-H]-.
3.3 3- 0-[(E)-4-(4-甲氧基苯基) -3-烯 -2-酮丁基]山奈酚 (1-3) 的合成
以化合物 ΠΙ-3为原料按上述方法制备经分离纯化后得黄色固体， 产率 19.2°/。。 'H-NMR (400 MHz, DMS0- ): δ 12.57 (IH, s, OH), 10.89 (IH, br s, OH), 10.29(1H, br s， OH), 8.05 (2H， d, J= 8.9 Hz), 7.63 (IH, d, J= 16.1 Hz), 7.63 (2H, d, J= 8.8 Hz), 6.98 (2H, d, J= 8.8 Hz), 6.92 (2H， d, J= 8.9 Hz), 6.91 (IH, d, J = 16.4 Hz), 6.46 (IH, d, J = 2.0 Hz), 6.22 (IH, d, J = 2.0 Hz), 5.04 (2H, s), 3.80 (3H, s). 13C-画 R (100 MHz, DMSO-i¾): δ 194.7, 178.0, 164.7, 161.9, 161.6, 160.7, 156.8, 155.7, 143.1, 136.7, 131.0, 127.2, 121.0, 120.3, 116.0, 114.9, 104.5, 99.1, 94.2, 75.6， 55.8. ESI-MS m/z: 459.3 [M-H]'.
3.4 3-0-[(E)-4-(4-乙氧基苯基) -3-烯 -2-酮丁基]山奈酚 (14) 的合成
以化合物 ΠΙ-4为原料按上述方法制备经分离纯化后得黄色固体， 产率 17.3% 'H-NMR (400 MHz, DMSO-i g): δ 12.57 (IH, s, OH), 10.90 (IH, s, OH), 10.28 (IH, s, OH), 8.05 (2H, d, J=
8.7 Hz), 7.63 (IH, d, j= 16.5 Hz), 7.61 (2H, d, J= 8.5 Hz), 7.29 (2H, d, J= 8.0 Hz), 6.97 (2H, d, J = 8.6 Hz), 6.93 (2H, d, J = 8.5 Hz), 6.90 (1H， d, J= 14.6 Hz), 6.47 (1H， d, J= 1.5 Hz), 6.22 (IH, d, J = 1.5 Hz), 5.04 (2H, s), 4.07 (2H, q), 1.34 (3H, t). 13C-NMR (100 MHz, DMSO- )： δ 194.2, 177.5， 164.2, 161.1, 160.7， 160.2, 156.3, 155.2, 142.6, 136.3, 130.5, 130.4, 126.5, 121.1, 120.5, 119.7, 115.5, 114.8, 104.0, 98.6, 93.7, 75.2, 63.3, 14.5. ESI-MS m/z: 473.4 [M-H]'.
3.5 3-0-[(E)-4-苯基 -3-烯 -2-酮丁基]山奈酚 (1-5) 的合成
以化合物 ΠΙ-5为原料按上述方法制备经分离纯化后得黄色固体， 产率 17.6%。 'H-NMR (400 MHz, DMSO- 6): δ 12.56 (IH, s, OH), 10.89 (IH, s， OH), 10.27 (IH, s, OH), 8.05 (2H, d, J=
8.8 Hz), 7.67 (IH, d, J= 16.0 Hz), 7.69-7.67 (2H, m), 7.45-7.43 (3H, m)， 7.05 (1H， d, J= 16.4 Hz), 6.93 (2H, d, J= 8.8 Hz), 6.47 (IH, d, J= 1.9 Hz), 6.22 (IH, d, J = 1.9 Hz), 5.08 (2H, s). 13C-NMR (100 MHz, DMSO-i/6): 5 194.9, 178.0, 164.7, 161.6, 160.7, 156.8, 155.7， 143.1, 136.8, 134.7, 131.2, 131.0, 129.4, 129.0, 122.8, 121.0, 116.0, 104.5， 99.1, 94.2, 75.7. ESI-MS m/z: 429.4 [M-H]".
3.6 3-0-[(E)-4-(4-甲基苯基) -3-烯 -2-酮丁基]山奈酚 (1-6) 的合成
以化合物 ΠΙ-9为原料按上述方法制备经分离纯化后得黄色固体， 产率 13.4%。 'H-NMR (400 MHz, DMSO- ): δ 12.56 (IH, s, OH), 10.88 (IH, br s, OH), 10.27 (IH, br s, OH), 8.05 (2H, d, J = 8.9 Hz), 7.63 (IH, d, J = 16.2 Hz), 7.57 (IH, d, J = 8.1 Hz), 7.25 (2H, d, J = 8.0 Hz), 6.99 (IH, d, J = 16.3 Hz), 6.47 (IH, d, J = 2.0 Hz), 6.22 (IH, d, J = 2.0 Hz), 5.06 (2H, s)， 2.34 (3H, s). 说 明 书
"C-NMR (100 MHz, OMSO-d6): δ 194.9, 178.0, 164.7, 161.6, 160.7, 156.8, 155.7， 143.2, 141.3, 136.8, 132.0, 131.9, 131.0, 129.1, 121.8, 121.0, 116.0, 104.5, 99.1 , 94.2, 75.7, 21.5. ESI-MS m z: 443.4 [M-H]"
3.7 3-0-[(Ε)-4-(3-羟基， 4-甲氧基苯基) -3-烯 -2-酮丁基]山奈酚 (1-7) 的合成
以化合物 ΠΙ-18为原料按上述方法制备经分离纯化后得黄色固体， 产率 12.4%。 'itNMR (400 MHz, DMSO-i¾: δ 12.57 (IH, s, OH), 10.89 (IH, s, OH), 10.27 (IH, s, OH), 9.25(1H, s, OH), 8.05 (2H, d, J= 8.4 Hz), 7.55 (IH, d, J= 16.0 Hz), 7.12 (2H, s), 6.97 (IH, d, J= 8.5 Hz), 6.92 (2H, d, J = 8.4 Hz), 6.82 (IH, d, J = 16.0 Hz), 6.47 (IH, s)， 6.22 (IH, s)， 5.02 (2H， s), 3.82 (3H， s). 13C-NMR (100 MHz, DMSO-c/6): δ 194.1， 177.5, 164.2, 161.1, 160.2， 156.3, 155.2, 150.4, 146.7, 143.1, 136.3, 130.5, 127.0, 121.8, 120.5, 119.7, 115.5, 114.2, 112.0, 104.0, 98.6, 93.7, 75.1， 55.6. ESI-MS m/z: 475.4 [M-H]"
3.8 3-0-[(E)-4-(3-甲氧基， 4-羟基苯基) -3-烯 -2-酮丁基]山奈酚 (1-8) 的合成
以化合物 ΠΙ-19为原料按上述方法制备经分离纯化后得黄色固体， 产率 13.5%。 -NMR (400 MHz, DMS0- ): δ 12.58 (IH, s, OH), 10.89 (IH, s, OH), 10.26 (IH, s, OH), 9.70(1H, br s, OH), 8.06 (2H, d, J = 8.8 Hz), 7.59 (IH, d, J= 16.1 Hz), 7.30 (IH, d, J = 1.5 Hz), 7.13 (IH, d, J = 8.2 Hz, J = 1.5Hz), 6.92 (2H, d, J = 8.8 Hz), 6.90 (IH, d, J = 16.1 Hz), 6.47 (1H， d, J = 1.9 Hz), 6.22 (lH, d, J= 2.0 Hz), 5.04 (2H, s), 3.82 (3H, s). 13C-NMR (100 MHz, DMSO-c?6): δ 194.5, 178.0, 164.7, 161.6, 160.7, 156.8, 155.7, 150.2， 148.4, 144.0, 136.8, 131.0， 126.2, 124.0, 121.0, 119.7,
116.1, 116.0, 112.0, 104.5, 99.1, 94.2， 75.5, 56.1. ESI-MS m/z: 475.4 [M-H]".
3.9 3-0-[(E)-4-(4-叔丁基苯基) -3-烯 -2-酮丁基]山奈酚 (1-9) 的合成
以化合物 111-11为原料按上述方法制备经分离纯化后得黄色固体， 产率 17.3%。！H-NMR (400 MHz, DMSO-£¾): δ 12.55 (IH, s, OH), 10.84 (IH, s, OH), 10.25 (IH, s, OH), 8.06 (2H, s, J= 2.0 Hz), 7.65 (IH, d, J= 16.3 Hz), 7.60 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.46 (2H, d, J= 8.4 Hz), 7.00 (IH, d, J = 16.2Hz), 6.93 (2H, d, J= 9.0 Hz), 6.47 (1H， d， J= 2.2 Hz), 6.22 (1H， d， J= 2.0 Hz), 5.07 (2H, s), 1.29 (9H, s). 13C-NMR (100 MHz, DMSO-i¾) 8194.9, 178.0, 164.7, 161.6, 160.7, 156.8, 155.7,
154.2, 143.1, 136.8, 132.0, 131,0, 128.9, 126.3, 122.0, 121.0, 116.0, 104.5, 99.1, 94.2, 75.7, 35.1, 31.3. ESI-MS m/z: 485.2 [M-H]-.
3.10 3-0-[(E)-4-(4-异丙基苯基) - 3-烯 -2-酮丁基]山奈酚 (1-10) 的合成
以化合物 111-10为原料按上述方法制备经分离纯化后得黄色固体， 产率 21.2%。 'H-NMR (400 MHz, DMSO-rf6): δ 12.55 (IH, s, OH), 8.05 (IH, d, J = 8.9 Hz), 7.64 (IH, d, J = 16.2 Hz), 7.59 (2H, d, j = 8.2 Hz), 7.30 (2H, d, J = 8.2 Hz), 7.00 (1H， d, J = 16.3 Hz), 6.93 (2H, d, J = 8.9 Hz), 6.47 (IH, d, J= 2.0 Hz), 6.22 (IH, d, J = 2.0 Hz), 5.06 (2H, s), 2.91 (IH, m)， 1.20 (6H, d, J = 6.9Hz). 13C-NMR (100 MHz, DMSO-^): δ 194.9, 178.0, 164.7， 161.6， 160.7, 156.8, 155.7, 152.0, 143.2, 136.7, 132.3, 132.0, 131.0, 129.2, 127.4, 126.6, 116.0, 104.5, 99.1, 94.2, 75.7, 60.2, 33.9, 24.0. ESI-MS m/z: 471.2 [M-H]-.
3.1 1 3-0-[(E)-4-(3-氯， 4-羟基苹基) -3-烯 -2-酮丁基]山奈酚 (1-11) 的合成
以化合物 111-21为原料按上述方法制备经分离纯化后得黄色固体， 产率 Π.5%。 'H-NMR (400 MHz, DMSO-£¾): 5 12.57 (IH, s, OH), 10.89 (2H, s, OH), 10.28 (IH, s, OH), 8.06 (2H, d, J =
8.6 Hz), 7.75 (IH, s), 7.58 ( H, d, J = 16.2 Hz), 7.50 (IH, d, J = 8.5 Hz), 7.02 (IH, d, J = 8.5 Hz), 6.93 (2H, d, J = 8.7 Hz), 6.92 (IH, d, J = 15.6 Hz), 6.48 (IH, s), 6.22 (IH, s), 5.04 (2H, s). 13C-NMR (100 MHz, DMSO-c¾): δ 194.1, 177.5, 164.2, 161.1, 160.2, 156.3， 155.5, 155.2, 141.6, 136.2, 130.5, 130.3, 128.8, 126.5, 120.5, 120.4, 120.3, 116.9, 115.5, 104.0, 98.6, 93.7, 75.1. ESI-MS m/z: 479.9 [M-H]".
3.12 3-0-[(E)-4<4-氰基苯基) -3-¾-2-酮丁基]山奈酚 (1-12) 的合成
以化合物 111-12为原料按上述方法制备经分离纯化后得黄色固体， 产率 20.1%。 'H-NMR (400 MHz, DMS0- ): δ 12.53 (IH, s, OH), 10.89 (IH, s, OH), 10.25 (IH, s, OH), 8.04 (2H, d, J =
说
8.9 Hz), 7.91-7.86 (4H, m)， 7.70 (1H， d, J= 16.4 Hz), 7.19 (1H， d, J = 16.4 Hz), 6.47 (IH, d, J = 2.0 Hz), 6.22 (IH, d, J = 2.0 Hz), 5.10 (2H, s). 13C-NMR (100 MHz, DMSO-de) δ 195.0, 177.9, 167.6, 164.7, 163.5, 161.6, 160.7, 159.0， 156.8, 155.7, 142.4， 140.8, 139.3, 136.7, 133.2, 133.1, 书
131.0, 129.6, 126.0, 121.0, 119.0， 116.0， 112.9, 104.5, 99.2, 94.2, 75.9. ESI-MS m/z: 453.9 [M-H]
3.13 3-0-[(E)- 4-(4-溴苯基 )-3-烯 -2-酮丁基]山奈酚 (1-13) 的合成
以化合物 111-16为原料按上述方法制备经分离纯化后得黄色固体， 产率 13.1%。 'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 12.53 (IH, s, OH), 10.87 (IH, s, OH), 10.25 (IH, s, OH), 8.04 (2H, d, J =
8.7 Hz), 7.63 (4H, m), 7.07 (IH, d, J= 16.3 Hz), 6.92 (2H, d, J= 8.7 Hz), 6.47 (IH, d, J= 1.5 Hz), 6.22 (IH, d, J = 1.6 Hz), 5.07 (2H, s). 13C-NMR (100 MHz, DMSO- )： δ 194.9, 177.9, 164.7, 161.6, 160.7, 156.8, 155.7, 141.7, 136.7, 134.0, 132.4, 131.0, 130.9, 124.5, 123.6, 121.0, 116.0,
104.5, 99.2, 94.2. ESI-MS m/z: 507.6 [M-H]-.
3.14 3-0-[(E)-4-(4-氟苯基 )-3-稀 -2-酮丁基]山奈酚 (1-14) 的合成
以化合物 111-14为原料按上述方法制备经分离纯化后得黄色固体， 产率 19.2%。 'H-NMR (400 MHz, DMS0- ): δ 12.54 (IH, s, OH), 10.36 (IH, br s， OH), 10.00 (1H， br s， OH), 8.03 (2H, d, j= 8.2 Hz), 7.75-7.65 (3H， m)， 7.29-7.25 (2H, m), 7.00 (IH, d, J= 16.0 Hz), 6.93 (2H, d， J= 8.4 Hz), 6.50 (IH, s), 6.24 (IH, s), 5.06 (2H, s). ,3C-N R (100 MHz, DMSO- ) 5194.9, 177.9, 165.1, 164.9, 162.7, 161.6, 160.8, 156.8, 155.7, 141.9, 136.7， 131.4, 131.3, 131.0, 130.4, 122.8, 121.0,
116.6, 116.4, 116.0, 104.5, 99.2, 94.3, 75.7, 63.3. ESI-MS m/z: 447.1 [M-H]
3.15 3-0-[(E)-4-(4-氯苯基 )-3-烯 -2-酮丁基]山奈酚 (1-15)
以化合物 111-15为原料按上述方法制备经分离纯化后得黄色固体， 产率 12.4%。 'H-NMR (400 MHz, DMSO-i¾): δ 12.60 (IH, s, OH), 10.97 (IH, br s, OH), 10.34 (IH, br s, OH), 8.10 (2H, d, J= 8.9 Hz), 7.76 (2H， d, J = 8.5 Hz), 7.71 (IH, d, J = 16.4 Hz), 7.55 (2H, d， J = 8.5 Hz), 7.12 (IH, d, J = 16.4 Hz), 6.97 (2H， d, J = 8.9 Hz), 6.53 (IH, d， J = 2.0 Hz), 6.27 (IH, d， J = 2.0 Hz), 5.13 (2H， s).13C-NMR (100 MHz, DMSO-rf6): δ 194.9, 178.0, 164.7, 161.6, 160.7, 156.8, 155.7,
141.7, 136.7, 135.7, 133.7, 131.0, 130.7, 129.5, 123.5, 121.0, 116.0, 104.5, 99.2, 94.2, 75.8, 63.3. ESI-MS m z: 463.8 [M-H]-.
3.16 3-( -[(E)-4-(3, 4-二氯苯基) -3-烯 -2-酮丁基]山奈酚 (1-16) 的合成
以化合物 ΠΙ-22为原料按上述方法制备经分离纯化后得黄色固体， 产率 24.5%。 ^-NMR (400 MHz, DMSO- 6): δ 12.54 (1Η, s, OH), 10.90 (1H， s， OH), 10.26 (1H, s, OH), 8.05 (2H， d, J = 8.6 Hz), 8.02 (1H, s)， 7.69 (2H, s)， 7.63 (1H, d, J= 16.3 Hz), 7.15 (1H, d，J= 16.3 Hz), 6.91 (2H, d, J = 8.6 Hz), 6.47 (1H， s), 6.22 (1H, s)， 5.08 (2H, s). 13C-NMR (100 MHz, OMSO-d6) δ 194.4, 177.4, 170.3, 164.2, 161.1 , 160.2, 156.3, 155.2, 139.7, 136.2, 135.1, 132.8, 131.8, 131.0, 130.5, 130.2, 128.3, 124.3, 120.5, 115.5, 112.8， 104.0, 98.6, 93.7, 75.3, 59.7. ESI-MS m/z: 498.3 [M-H]".
说
Ri R2 Ri R2
1-1 OH H 1-9 /-Bu H
1-2 OBn H 1-10 -Pr H
书
1-3 OMe H Ml OH CI
1-4 OCH2CH3 H 1-12 CN H
1-5 H H 1-13 Br H
1-6 CH3 H 1-14 F H
1-7 OMe OH 1-15 CI H
1-8 OH OMe 1-16 CI CI 式 6 实施例 4药理实验
4. 1黄酮类似物对胰岛素抵抗的 Hep-G2细胞葡萄糖消耗影响
4. 1. 1实验方法
胰岛素抵抗人肝细胞株 Hep-G2模型的制备
采用高浓度胰岛素诱导培养法复制胰岛素抵抗 (IR)细胞模型， 以含胰岛素 (l(T7m0l/L)的高糖 DMEM培养基， 孵育时间为 36小时， 用 pH=4的高糖 DMEM培养液冲洗 4次， 每次 3分钟， 再用 PBS液冲洗 2次， 洗去细胞表面的胰岛素。 将在含有 Kr7m0l/L胰岛素培养液中孵育 36小 时的 Hep-G2细胞称为胰岛素抵抗细胞（IR细胞)， 在不含胰岛素的培养液中孵育的 Hep-G2细 胞称为对照细胞。
药物处理
各化合物分别用 DMSO溶解后， 加入高糖 DMEM培养基中, 各个药物均设 6-8个浓度 (各化合物溶液中 DMSO的终浓度均为 0.1%)。
4. 1. 2检测指标
葡萄糖消耗量： 于加药后 24小时， 用葡萄糖检测试剂盒检测 96孔板内细胞上清液中剩余 的葡萄糖含量， 计算出各组细胞对于培养液中葡萄糖的消耗量。 数据统计
各组数据以 mean±sd表示，以 SPSS16.0统计软件对各组细胞的葡萄糖消耗量进行方差分 析和组间均值比较， 计算各化合物增加胰岛素抵抗细胞 Hep-G2葡萄糖消耗量， 计算增长率， 进一步得出半数有效浓度 EC5()。
增长率 = (加药组葡萄糖消耗量-模型组葡萄糖消耗量) /模型组葡萄糖消耗量 X 100%
4. 1. 3. 实验结果
实验结果表明，.黄酮类衍生物能够显著增加胰岛素抵抗的 Hep-G2细胞葡萄糖消耗量， 其中化合物 1-12的活性最强。 表 4. 1化合物 I-x增加胰岛说素抵抗细胞 Hep-G2葡萄糖消耗量的作用
编号 ' EC50 (μΜ)
1-1 0.368 1-9 0.013
书
1-2 0.658 1-10 0.015
1-3 0.149 1-11 3.555
1-4 0.042 1-12 0.003
1-5 0.473 1-13 0.393
1-6 0.010 1-14 0.669
1-7 5.070 1-15 1.075
1-8 6.190 1-16 2.587 二甲双胍 0.270
4.2. 葡萄糖转运子 4过表达骨骼肌细胞株 (L6GLUT4 nyc)筛选抗糖尿病化合物： 黄酮 类似物对骨骼肌细胞 （L6GLUT4m_yC) 葡萄糖转运子 4 (GLUT4 ) 转位的促进作用
4. 2. 1 实验原理
GLUT4是骨骼肌中主要的葡萄糖转运子，基础状态下， 大部分 GLUT4位于胞 囊泡上。 GLUT4可响应胰岛素的作用转位到细胞膜上， 从而转运更多的葡萄糖进入细胞。 GLUT4不 仅是骨骼肌中最主要的葡萄糖转运子，而且 GLUT4转运葡萄糖的过程也是葡萄糖在骨骼肌中 代谢的限速步骤。 因此， 细胞膜上的 GLUT4 数量反应了细胞葡萄糖摄取量。 为了定量检测 GLUT4的转位， 我们应用稳定过表达 GLUT4 _yc的 L6大鼠骨骼肌细胞株 L6GLUT4^c。实 验采用类 ELISE方法， 在保持细胞膜完整的状态下， 应用抗 / 的抗体， 再加辣根过氧化物 酶 (horseradish peroxidase, HRP)标记的抗 myc抗体的二抗,催化底物邻苯二胺发生氧化反应，反 应产物在 492nm处有最大吸收值，该吸收值的大小反应了转位至细胞膜上的 GLUT4;njC的水 平。
4. 2. 2 实验方法
化合物预处理 说 明 书
各化合物均设 2-5个浓度，分别用 DMSO溶解后储存，用时在低糖 DMEM培养基中 1： 1000 稀释 （各化合物溶液中 DMSO的终浓度均为 0.1%)。
各化合物组均设 2-5个浓度， 每个浓度设 3个复孔。 对照组为 0.1% DMSO; 空白组没有 任何处理。 以胰岛素为阳性对照组。
4. 2. 3偶联抗体的吸光度分析法测定细胞膜上 GLUT4 ^C的含量
将培养板中分化为肌管的 L6GLUT4/^C细胞以低糖 DMEM培养 4 h后， 加入不同浓度 的化合物孵育 24 h， 实验结束前 20 min, 胰岛素组加入 500 μΐ /孔 insulin使其终浓度为 100 nmol/L,然后立即将培养板置于冰上，用预冷至 4°C的含有 1 mM Ca2+和 1 mM Mg2+的 PBS 溶液 [PBS(+)] 洗涤 3次，每孔加入 0.25 ml 3% 聚甲醛 （PFA) 于冰上固定 10 min，在移至 室温放置 20 min。 弃去 PFA, 用 PBS(+)快速洗 2次后， 每孔加入 750 μΐ的 0.1 mM甘氨酸， 室温 10 min。 然后用 PBS(+) 洗 2次， 用 5%(v/v) 脱脂牛奶封闭细胞 10 min后加入 200 μΐ 抗-^ c多克隆抗体 (1:250) 室温孵育 l h l h后用 PBS(+)洗 6次， 洗去未与细胞结合的抗体， 吸干 PBS(+),每孔加入 200 μΐ偶联 HRP的山羊抗兔 IgG (1 :5000) 室温孵育 1 h,再用 PBS(+) 洗 6次以洗去游离的抗体， 吸干 PBSW, 迅速加入新鲜配制的底物邻苯二胺（OPD) 溶液， 每孔 l ml, 暗室放置反应 10-20 min后每孔加入 250μ1 3M HC1终止反应， 混勾后， 吸取上清 液， 以酶标仪在 492nm处测定吸光值。
数据统计
化合物处理组与对照组 OD值均减去空白组 (只用二抗孵育， 而未用一抗孵育) OD值。 实 验结果以化合物处理组 OD值相对于对照组 OD值的倍数来比较细胞膜上 GLUT4m^的转位。
GLUT4w >c的转位倍数 =OD -s )/ OD
采用 SPSS10.0 统计软件包进行统计学分析。 组间比较采用单因素方差分析 (One-Way ANOVA)。 以尸 <0.05作为判断差别显著性的标准。
4. 2. 4 实验结果
参照附图 1 和 2， 本实验结果表明， 黄酮类衍生物具有不同程度的促进骨骼肌细胞 ( L6GLUT4/» ) 葡萄糖转运子 4转位的作用， 能够显著增加骨骼肌细胞对葡萄糖的摄取利 用， 其中以化合物 1-12的作用最强， 在浓度 2, 5 g/mL时， 对骨骼肌细胞葡萄糖转运子 4转 位的促进作用强于胰岛素。
4. 3 Western Blot方法检测黄酮类化合物对 AMPK及其底物 ACC磷酸化的影响
4.3.1 AMPK途径在糖尿病发生发展中的作用
腺苷酸活化蛋白激酶 (AMP-activated protein kinase, AMPK)途径是刺激细胞葡萄糖摄取的 主要通路。当细胞受到任何引起 ATP生成减少与消耗增加的应激刺激时，ΑΜΡ/ΑΤΡ比值 增加， AMPK则被激活， 活化后的 AMPK作为代谢调节的枢纽磷酸化其下游底物， 发挥调 节糖、脂代 的作用。有研究证明 AMPK通路在运动、缺氧、渗透压增加等刺激下激活， AMPK 的激活使得 GLUT4转位至细胞膜从而发挥促进葡萄糖摄取的作用。
ACC是 AMPK的直接下游底物靶蛋白之一， 生理情况下， ACC催化乙酰辅酶 A羧基化 形成丙二酰辅酶 A，后者可以间接抑制线粒体脂肪酸氧化，影响脂肪代谢。 AMPK能够使 ACC 说 明 书
磷酸化从而失活， 减少脂肪形成。
实验釆用 Western Blot法观察黄酮化合物对 HepG2细胞内 AMPK蛋白磷酸化以及 ACC 磷酸化的影响，从而说明测试化合物调节葡萄糖糖与脂质代谢的机制与 AMPK蛋白信号通路 的关系。
4.3.2实验方法
样品制备： 饥饿 HepG2细胞后， 加入含有测试化合物的培养液作用 2 h， 倒掉培养液， · 以 PBS洗 2次， 加入预冷的 RIPA细胞裂解液， 碎冰上放置 20 min， 放入 -30QC冰箱 10 min 后，置冰上待融化，收集细胞裂解液， 13000 φπι/min, 4°C离心 10 min，移取上清液于 eppendorf 管中，加入 5倍体积缓冲液混勾。于 65°C加热 15 min, -20°C贮存，上样前 37°C下融化 10 min, 离心 (1000rpm/min， lmin)。
蛋白免疫印迹 （Western blotting) 分析： 新鲜配置 7.5 % 的丙烯酰胺 -SDS凝胶两块， 于 电泳槽中以新配置的电泳溶液浸没， 冲洗上样孔， 样品上样。 80 V电泳， 待样品条带进入分 离胶， 将电压调至 90 V, l h后， 将电压调至 110 V, 当样品条带近底部时， 结束电泳。 湿法 转膜， 转膜电压为 110 V, 转膜时间为 2 h， 然后将 PVDF膜放入 10%BSA溶液室温封闭 l h。 取出蛋白膜放入一抗中， 冰上缓慢摇动 l h， 4°C冰箱中过夜后取出膜， TBST洗洚 15 min x 4 次， 将 PVDF膜转入相应的辣根过氧化物酶 (HRP)标记的二抗， 室温缓慢摇动 lh, 回收二抗， TBST ¾t¾ 15 min x 4 ECL显色， 暗室曝光。
4. 3. 3 实验结果
通过附图 3可以看出， 化合物 1-12能够显著激活 Hep-G2细胞 AMPK磷酸化， 并使下游 ACC发生磷酸化
上述各种药理评价结果表明， 本发明所合成的黄酮醚化衍生物能够不同程度地增强增加 胰岛素抵抗细胞 Hep-G2葡萄糖消耗量， 增加葡萄糖的利用; 另外， 所测试的黄酮类衍生物 1-2， 1-3， 1-10, 1-12， 和 1-14都具有不同程度的促进骨骼肌细胞 （L6GLUT4m_yc) 葡萄糖转 运子 4的转位的作用， 提示能够显著增加骨骼肌细胞对葡萄糖的摄取利用， 表明本发明合成 的黄酮衍生物具有抗糖尿病作用， 可用于治疗糖尿病。
尤其是， 在本发明要求保护的化合物普遍具有抗糖尿病活性的基础上， 发明人意外地发 现，其中部分优选结构的化合物，例如当 R2为 H时，或者具体的说，例如 1-1， 1-3, 1-4, 1-5, 1-9, 1-10, 1-11， 1-12和 1-16 具有与二甲双胍相当， 甚至更优的活性水平， 例如， 其中在相同条件 下 1-3, 1-4， 1-9, 1-10， 1-11, 1-12的活性明显优于二甲双胍。
进一步以骨骼肌细胞（L6GLUT4ff^C)葡萄糖转运子 4转位模型和 AMPK途径中相关蛋 白的评价表明， 本发明的活性化合物抗糖尿病活性强， 特别是化合物 1-12的作用最强， 在浓 度 2, 5 g/raL时， 对骨骼肌细胞葡萄糖转运子 4转位的促进作用强于胰岛素。 另一方面， 首 次证明了本发明要求保护的黄酮类衍生物能够显著促进骨骼肌细胞葡萄糖转运子 4的转位， 其作用机制之一是通过激活细胞 AMPK磷酸化， ·并使下游 ACC发生磷酸化而起到抗糖尿病 作用。
发明人认为， 研究人员一直在寻找具有抗糖尿病活性的化合物， 每获得一类具有可接受 活性水平的化合物结构对于制备抗糖尿病的药物都具有重要的意义。 本发明要求保护的化合 物从结构上看， 黄酮母核上的取代基均被限定为羟基， 并且在其 3位通过亚甲基联接取代的 肉桂酰基结构， 这样的结构相对于现有技术中公开的具有抗糖尿病活性的化合物结构具有很 大差别， 本领域技术人员难以根据现有技术中公开的普通黄酮化合物结构， 经过如此特殊的 结构修饰， 将取代的肉桂酰基联接到黄酮母核的特定位置， 并且将母核上的所有取代基均限 定为羟基， 从而获得本发明要求保护的化合物， 即本发明的化合物结构对于本领域技术人员 来说并不是显而易见的。
进一步地， 由于本发明的基团限定非常严格， 使得其中包含的化合物结构十分有限， 并 且其中具有代表性的化合物结构经多种活性测定方法均显示出本领域可接受的抗糖尿病活 性， 可见本发明己经具有了显著的进步。.
尤其是， 本发明中的优选化合物在说活性测试中显示出了与二甲双胍相当甚至更优的抗糖 尿病活性， 特别是黄酮衍生物 1-12在浓度 2.0和 5.(^g mL时, 对骨骼肌细胞葡萄糖转运子 4 转位的促进作用强于胰岛素， 并且首次发现了天然黄酮类衍生物的抗糖尿病作用分子机制， 这些都是本领域技术人员根据现有技术无法预测和书推断的内容， 即本发明的化合物具有预料 不到的技术效果。 相对于一般意义上的抗糖尿病活性化合物来说， 本发明具有更加重要的应 用价值。

Claims (10)

  1. 权 利 要 求 书
    一种黄酮衍生物或其 1所示:
    式 1 其中， Ri和 R2可以柑同也可以不同， 并且各自独立地代表氢， 卤素， 氰基， 羟基， 苄 氧基， C1-C8的直链或支链烷基， C1-C8的直链或支链卤代垸基， C1-C8的直链或支链烷氧 基。
  2. 2、 如权利要求 1所述的黄酮衍生物或其药学上可接受的盐， 其中所述取代基 为氢、 羟基、 C1-C8的直链或支链烷氧基。
  3. 3、 如权利要求 1所述的黄酮衍生物或其药学上可接受的盐， 其中所述取代基 为氢。
  4. 4、 如权利要求 1所述的黄酮衍生物或其药学上可接受的盐， 其具有如下结构：
    Ri R2 R2
    1-1 OH H 1-9 /-Bu H
    1-2 OBn H 1-10 /-Pr H
    1-3 OMe H 1 11 OH CI
    Ϊ-4 OCH2CH3 H 1-12 CN H
    1-5 H H 1-13 Br H
    1-6 CH3 H 1-14 F H
    1-7 OMe OH 1-15 CI H
    1-8 OH OMe M6 Ci CI
  5. 5、如权利要求 4所述的黄酮衍生物或其药学上可接受的盐， 其选自 1-3， 1-4， 1-6， 1-9， 1-10， 1-12。
  6. 6、 如权利要求 4所述的黄酮衍生物或其药学上可接受的盐， 其选自 1-12。
  7. 7、如权利要求 1-6任意一项所述的黄酮衍生物或其药学上可接受的盐的制备方法，其特 征在于通过式 2所示的反应路线制备： 权 利 要 求 书
    其中取代基 R1和 R2如权利要求 1-6中任意一项所述。
  8. 8、 如权利要求 7所述的制备方法， 其特征在于是通过如下步骤制备-
    (1)将相应的取代苯甲醛溶解于丙酮中，加入 4N氢氧化钠水溶液，反应温度为 25-40度， 搅拌时间为 15min到 12h, 反应结束后， 调节 pH值为中性， 乙酸乙酯萃取， 干燥， 过滤， 浓 缩后得粗品， 粗品经重结晶或柱层析纯化得到系列中间体 II。
    (2)将中间体 II溶解于 THF中， 向其中滴加吡咯垸酮三溴氢化物的 THF溶液， 室温反 应过夜， 过滤浓缩后可得到粗品， 粗品经柱层析得系列中间体 III。
    (3)将山奈酚溶解于 1,4-二氧六环中， 加入无水碳酸钾， 回流 lh， 滴加中间体 III的二氧 六环溶液， 继续回流 1.5h-12h。 反应结束后， 减压除去二氧六环， 调节 pH值为酸性， 乙酸乙 酯萃取， 千燥， 浓缩， 过滤得粗品， 粗品经凝胶柱层析、 制备薄层色谱法纯化后得系列目标 产物 I。
  9. 9、如权利要求 1-6任意一项所述的黄酮衍生物或其药学上可接受的盐在制备治疗与胰岛 素抵抗细胞活性相关的糖尿病药物中的用途。
  10. 10、 如权利要求 1-6任意一项所述的黄酮衍生物或其药学上可接受的盐在制备治疗与骨 骼肌细胞葡萄糖转运子 4的转位相关的抗糖尿病药物中的用途。
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