JP2013524291A - マイクロ操作ツールを無衝突で位置決めする方法 - Google Patents
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Abstract
Description
純粋濃縮された細胞培養の分子分析、さらには単一細胞の分子分析は、薬理ゲノミクス及びプロテオミクスの重要な前提であり、将来的には患者の医療プロファイリングにとってさらに重要となる可能性がある。従来は、細胞操作(例えば細胞収集またはマイクロ注入)における機械的及びプロセス工学的な制限のせいで、このターゲットを達成することは困難であり、相当な時間的コストをかけずには達成できなかった。とりわけ、遺伝子型と表現型を特定するのに必要とされる、非常に小さなサンプルからの単一細胞及び希少細胞の分離は非常に難しい。というのも、研究員が単一細胞を顕微鏡下で検出し、検出された細胞を毛管を使って操作しなければならないからである。
それゆえ、本発明の課題は、サンプル表面の全体にわたって操作ツールを完全自動で正確かつ損傷なしに位置決めすることを可能にする、マイクロ操作ツールの無衝突位置決め方法を提供することである。この課題は請求項1に記載の特徴を備えた方法により解決される。本発明の特に有利な実施形態は従属請求項において規定されている。
a)第1の開口数NA1を有する第1の顕微鏡対物レンズの焦点をサンプル担体表面上の少なくとも1つの点Pに合わせることによって、前記少なくとも1つの点の焦点位置ZPを求める。
b)マイクロ操作ツールを顕微鏡の光軸上に位置決めする。
c)上記顕微鏡対物レンズの焦点を又は第1の開口数NA1よりも小さな第2の開口数NA2を有する第2の顕微鏡対物レンズの焦点をマイクロ操作ツールの先端に合わせることによって、マイクロ操作ツールの焦点位置ZMを求める。
d)所定の許容差プロファイルΔZを考慮して降下距離ZA(P)を次の式
ZA(P)=ZM−ZP−ΔZ
によって計算する。ここで、
ΔZ=ΔZM+ΔZP
であり、ΔZMは操作ツールの位置を求めるときの所定の許容差であり、ΔZPはサンプル担体の位置を求めるときの所定の許容差である。
e)マイクロ操作ツールを降下距離ZA(P)だけ降下させることによって点Pに位置決めする。
ここで、λは観察光の波長であり、nは顕微鏡対物レンズとサンプル担体の間の媒質の屈折率であり、Miはi番目の対物レンズの倍率であり、eは観察に使用されるビデオカメラの解像度である。
c1)操作ツールの先端における第1の点Q1に焦点を合わせることによって、第1の点Q1の焦点位置ZQ1を求める。
c2)前記点Q1の焦点位置ZQ1と操作ツールの先端における第2の点Q2の焦点位置ZQ2とが等しくなるまで、操作ツールをその軸を中心として回転させ、前記Q1に焦点を合わせるために改めて顕微鏡対物レンズを調節する。
c3)操作ツールの先端における第3の点Q3に焦点を合わせることによって、第3の点Q3の焦点位置ZQ3を求める。
c4)焦点位置ZQ1、ZQ2及びZQ3が等しくなるまで、サンプル担体の平面に平行な軸回りに操作ツールを傾斜させ、点Q3に焦点を合わせるために改めて顕微鏡対物レンズを調節する。
c5)操作ツールの焦点位置をZA=ZQ1に定める。
操作ツールの傾斜角ないし捩れ角を補償することによって、サンプルと相互作用する操作ツールの端面の形状も考慮されるので、操作ツールのサンプル担体に対する位置を較正する際に極めて高い正確度を達成することが可能である。このことは、引き延ばされた毛管又は先端が或る角度をもって研磨ないし折られているような毛管の場合に特に重要である。実際、これによって確実に、毛管の開口部又は操作ツールの活動側がサンプルから均一かつ最小の距離に位置決めされ、毛管の場合であれば、この小さな距離のおかげで最適な吸い込み又は洗い流し作用を実現することができる。操作ツールをその軸を中心として回転させる際、好ましくは全体として最大±5°までの刻みが実行される。これはしかし懸念されるべきことではない。というのも、毛管は既に予め方向マーカーを用いて大まかに調節されているからである。毛管の傾斜角についても同じことが当てはまる。例えば、毛管は電気駆動装置によって好ましくは最大±2°の小さな刻みで傾けられ、同様に前もって角度指示によって傾斜角が大まかに調節される。
まず導入として、任意の単一細胞又は希少細胞の自動化された分離について説明する。なお、この分離は細胞識別、細胞収集、細胞放出の3つのステップで行われる。その後で、図面を参照しながら本発明の有利な実施形態を説明する。
Claims (10)
- 顕微鏡を用いてマイクロ操作ツールをサンプル担体に対して無衝突で位置決めする方法であって、
a)第1の開口数NA1を有する顕微鏡対物レンズの焦点を前記サンプル担体の表面の少なくとも1つの点Pに合わせることによって、当該少なくとも1つの点の焦点位置ZPを求めるステップと、
b)前記マイクロ操作ツールを前記顕微鏡の光軸上に位置決めするステップと、
c)前記顕微鏡対物レンズの焦点を又は前記第1の開口数NA1よりも小さな第2の開口数NA2を有する第2の顕微鏡対物レンズの焦点を前記マイクロ操作ツールの先端に合わせることによって、前記マイクロ操作ツールの焦点位置ZMを求めるステップと、
d)所定の許容差プロファイルΔZを考慮して、降下距離ZA(P)を次の式
ZA(P)=ZM−ZP−ΔZ
によって計算するステップであって、
ΔZ=ΔZM+ΔZP
であり、ΔZMは前記操作ツールの位置を求めるときの所定の許容差であり、ΔZPは前記サンプル担体の位置を求めるときの所定の許容差である、ステップと、
e)前記マイクロ操作ツールを前記降下距離ZA(P)だけ降下させることによって前記点Pに位置決めするステップ
を有することを特徴とする方法。 - 前記ステップe)の前に、i番目の顕微鏡対物レンズ(i>1又はi>2)のそれぞれに対し、前記顕微鏡対物レンズの開口数を増大させながら(NAi>NAi-1)前記ステップc)及びd)を繰り返す、請求項1に記載の方法。
- 前記ステップe)の前に、前記サンプル担体の表面における所定の複数の点Pj(j=1,2,...)に対して前記ステップa)〜d)を実行し、各点Pjについて降下距離ZA(Pj)をデータベースに格納し、格納された降下距離ZA(Pj)を考慮しながら、各点Pjに対して前記ステップe)を実行する、請求項1、2又は3に記載の方法。
- 前記ステップe)の前に、前記サンプル担体の表面の直線上に並んでいない3つの点P1、P2、P3に対して前記ステップa)〜c)を実行し、求められた焦点位置ZP1、ZP2、ZP3から平面の方程式E(P)を計算し、前記ステップd)において、前記サンプル担体の表面の任意の点Pjについて降下距離ZA(Pj)をZA(Pj)=ZM−E(Pj)−ΔZにより計算する、請求項1から4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ステップc)において、前記焦点位置ZMとして前記操作ツールの先端の位置を求める、請求項1から5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ステップc)において、以下のステップ、すなわち、
c1)前記操作ツールの先端における第1の点Q1に焦点を合わせることによって、前記第1の点Q1の焦点位置ZQ1を求めるステップと、
c2)前記点Q1の焦点位置ZQ1と前記操作ツールの先端における第2の点Q2の焦点位置ZQ2とが等しくなるまで、前記操作ツールを前記操作ツールの軸を中心として回転させ、前記Q1に焦点を合わせるために改めて顕微鏡対物レンズを調節するステップと、
c3)前記操作ツールの先端における第3の点Q3に焦点を合わせることによって、前記第3の点Q3の焦点位置ZQ3を求めるステップと、
c4)前記焦点位置ZQ1、ZQ2及びZQ3が等しくなるまで、前記サンプル担体の平面に平行な軸回りに前記操作ツールを傾斜させ、前記点Q3に焦点を合わせるために改めて前記顕微鏡対物レンズを調節するステップと、
c5)前記操作ツールの焦点位置をZA=ZQ1に定めるステップ
を実行することによって前記操作ツールの捩れ角及び傾斜角を補償する、請求項6に記載の方法。 - 前記ステップa)においてさらに、第1の顕微鏡対物レンズの焦点を載置容器の表面の点Rに合わせることによって前記点Rの焦点位置Zcapを求める、請求項1から7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記サンプル担体の表面の点及び/又は前記載置容器の表面の点を、位置決めテーブルを用いて前記サンプル担体及び/又は前記載置容器をシフトさせることによって動かす、請求項1から8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記焦点位置の測定を光学式距離測定システムによって行う、請求項1から9のいずれか1項に記載の方法。
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