JP2013500722A5 - - Google Patents
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Description
表１は、限定されない特定の細胞型のマーカー例のリストを提供する。理論に限定されることなく、マーカー遺伝子は、特定の細胞型に特異的または関連しているか、あるいはマーカー遺伝子は、優性または優先的に特定の細胞型で発現する。特定の実施形態では、本明細書に記載したＣＴＲプロモータは、表１に提示した遺伝子群から選択されたマーカー遺伝子などのプロモータであるか、またはマーカー遺伝子のプロモータ領域を含む。
Claims (31)
- 核酸コンストラクトであって、
（ａ）レポーターをコード化するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、前記ＯＲＦは細胞型関連（ＣＴＲ）プロモータに作動可能に連結し、前記ＣＴＲプロモータは細胞型調節化合物の非存在下では細胞内で背景レベルより上に活性化しない、ＯＲＦ、並びに
（ｂ）第１の標的配列ＲＮＡ１（ＴＳＲ１）をコード化する核酸配列、第２の標的配列ＲＮＡ２（ＴＳＲ２）をコード化する核酸配列、および第３の標的配列ＲＮＡ３（ＴＳＲ３）をコード化する核酸配列であって、これらＴＳＲは蛍光発生オリゴヌクレオチドによって検出され、前記ＴＳＲ３が前記レポーターと同時転写され、前記ＴＳＲ１とＴＳＲ２は前記レポーターＯＲＦと前記ＣＴＲプロモータに隣接し、前記ＴＳＲ１とＴＳＲ２の転写は、前記ＣＴＲプロモータとは異なる恒常的活性型プロモータによりそれぞれ駆動される、核酸配列、
を含む核酸コンストラクト。 - （ａ）前記ＴＳＲの何れもが遺伝子のコード領域ではない、または
（ｂ）前記ＴＳＲの何れもがゲノムの天然配列ではない、
請求項１に記載の核酸コントラスト。 - 前記ＴＳＲの何れもが、遺伝子のコード領域でもゲノムの天然配列でもない、請求項１に記載の核酸コントラスト。
- 前記ＣＴＲプロモータが幹細胞プロモータ、筋細胞特異的プロモータ、または表１
に記載の遺伝子から成る群から選択されるマーカー遺伝子のプロモータである請求項１〜３の何れか１項に記載の核酸コンストラクト。 - 前記幹細胞プロモータ、筋細胞特異的プロモータ、または前記表１に記載の遺伝子から成る群から選択される遺伝子のプロモータが、細胞型調節化合物の非存在下では宿主細胞において背景レベルより上に活性化しない、請求項４に記載の核酸コンストラクトを含む宿主細胞。
- ＣＴＲ因子をコード化する組換え型核酸をさらに含む請求項５に記載の宿主細胞。
- 組換え型細胞を作製する方法であって、
（ａ）請求項１または２に記載の核酸コンストラクトを宿主細胞に導入するステップ、
（ｂ）ＴＳＲ１、ＴＳＲ２、およびＴＳＲ３に相補的な蛍光発生オリゴヌクレオチドを前記宿主細胞に導入するステップ、および
（ｃ）背景レベルより上で、ＴＳＲ１およびＴＳＲ２の両方を転写するが、ＴＳＲ３を転写しない細胞を選択するステップ、
を含む方法。 - 細胞型の正の修飾因子を同定する方法であって、
（ａ）請求項７に記載の組換え型細胞を化合物に接触させるステップ、および
（ｂ）前記レポーターの活性または発現レベルを測定するステップ
を含む方法であって、
前記化合物の非存在下での前記レポーターの活性または発現レベルと比較して、前記化合物の存在下で前記レポーターの活性または発現レベルが増加するならば、前記化合物が細胞型の修飾因子である、方法。 - 前記ＣＴＲプロモータが幹細胞プロモータ、筋細胞特異的プロモータ、または表１
に記載の遺伝子から成る群から選択されるマーカー遺伝子のプロモータである請求項７または８に記載の方法。 - ＣＴＲ因子またはＣＴＲ因子をコード化する組換え型核酸を前記細胞に導入するステップをさらに含む請求項７〜９の何れか１項に記載の方法。
- 筋細胞分化の正の修飾因子を同定する方法であって、
（ａ）請求項５に記載の筋細胞特異的プロモータを含有する宿主細胞を化合物に接触させるステップ、および
（ｂ）前記レポーターの活性または発現レベルを測定するステップ
を含む方法であって、
前記化合物の非存在下での前記レポーターの活性または発現レベルと比較して、前記化合物の存在下で前記レポーターの活性または発現レベルが増加するならば前記化合物が筋細胞分化の修飾因子である、方法。 - 核酸コンストラクトであって、
（ａ）レポーターをコード化するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、前記ＯＲＦは細胞型関連（ＣＴＲ）プロモータに作動可能に連結し、前記ＣＴＲプロモータは細胞内で背景レベルより上に活性化する、ＯＲＦ、および
（ｂ）第１の標的配列ＲＮＡ１（ＴＳＲ１）をコード化する核酸配列、第２の標的配列ＲＮＡ２（ＴＳＲ２）をコード化する核酸配列、および第３の標的配列ＲＮＡ３（ＴＳＲ３）をコード化する核酸配列であって、これらＴＳＲは蛍光発生オリゴヌクレオチドによって検出され、前記ＴＳＲ３が前記レポーターと同時転写され、前記ＴＳＲ１とＴＳＲ２は前記レポーターＯＲＦと前記ＣＴＲプロモータに隣接し、前記ＴＳＲ１とＴＳＲ２の転写は、細胞内で背景レベルより上に活性化せずかつ前記ＣＴＲプロモータとは異なるプロモータによりそれぞれ駆動される、核酸コンストラクト。 - （ａ）前記ＴＳＲの何れもが遺伝子のコード領域ではない、または
（ｂ）前記ＴＳＲの何れもがゲノムの天然配列ではない、
請求項１２に記載の核酸コントラスト。 - 前記ＴＳＲの何れもが、遺伝子のコード領域でもゲノムの天然配列でもない、請求項１２に記載の核酸コントラスト。
- 前記ＣＴＲプロモータが幹細胞プロモータ、筋細胞特異的プロモータ、または表１
に記載の遺伝子から成る群から選択されるマーカー遺伝子のプロモータである請求項１２〜１４の何れか１項に記載の核酸コンストラクト。 - 前記幹細胞プロモータ、筋細胞特異的プロモータ、または前記表１に記載の遺伝子から成る群から選択される遺伝子のプロモータが、宿主細胞において背景レベルより上に活性化する、請求項１５に記載の核酸コンストラクトを含む宿主細胞。
- ＣＴＲ因子をコード化する組換え型核酸をさらに含む請求項１６に記載の宿主細胞。
- 組換え型細胞を作製する方法であって、
（ａ）請求項１２または１３に記載の核酸コンストラクトを宿主細胞に導入するステップ、
（ｂ）ＴＳＲ１、ＴＳＲ２、およびＴＳＲ３に相補的な蛍光発生オリゴヌクレオチドを前記宿主細胞に導入するステップ、および
（ｃ）背景レベルより上で、ＴＳＲ３を転写するが、背景レベルより上で、ＴＳＲ１およびＴＳＲ２を転写しない細胞を選択するステップ、
を含む方法。 - 細胞型の負の修飾因子を同定する方法であって、
（ａ）請求項１８に記載の組換え型細胞を化合物に接触させるステップ、および
（ｂ）前記レポーターの活性または発現レベルを測定するステップ
を含む方法であって、
前記化合物の非存在下での前記レポーターの活性または発現レベルと比較して、前記化合物の存在下で前記レポーターの活性または発現レベルが減少するならば、前記化合物が細胞型の修飾因子である、方法。 - 前記ＣＴＲプロモータが幹細胞プロモータ、筋細胞特異的プロモータ、または表１
に記載の遺伝子から成る群から選択されるマーカー遺伝子のプロモータである請求項１８または１９に記載の方法。 - ＣＴＲ因子またはＣＴＲ因子をコード化する組換え型核酸を前記細胞に導入するステップをさらに含む請求項１８〜２０の何れか１項に記載の方法。
- 筋細胞分化の負の修飾因子を同定する方法であって、
（ａ）請求項１６に記載の筋細胞特異的プロモータを含有する宿主細胞を化合物に接触させるステップ、および
（ｂ）前記レポーターの活性または発現レベルを測定するステップ
を含む方法であって、
前記化合物の非存在下での前記レポーターの活性または発現レベルと比較して、前記化合物の存在下で前記レポーターの活性または発現レベルが減少するならば前記化合物が筋細胞分化の修飾因子である、方法。 - 第一のプロモータはＴＳＲ１の転写を駆動し、第二のプロモータはＴＳＲ２の転写を駆動する、請求項１〜４及び１２〜１５の何れか１項に記載の核酸コンストラクト。
- ＴＳＲ２の転写を駆動する第二のプロモータは、ＴＳＲ１の転写を駆動する第一のプロモータとは異なる、請求項１〜４及び１２〜１５の何れか１項に記載の核酸コンストラクト。
- ＴＳＲ１および／またはＴＳＲ２は、ＣＴＲプロモータおよびレポーターの方向と比較して同方向または逆方向である、請求項１〜４及び１２〜１５の何れか１項に記載の核酸コンストラクト。
- ＴＳＲ１およびＴＳＲ２は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモータ、異種性プロモータ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、核Ｔ７プロモータ、ＳＶ４０初期プロモータ領域、ラウス肉腫ウイルスの３’長い終端反復に含まれるプロモータ、疱疹チミジンキナーゼプロモータ、またはメタロチオネイン遺伝子の制御配列により駆動される、請求項１〜４及び１２〜１５の何れか１項に記載の核酸コンストラクト。
- ＴＳＲ３は細胞選択用のマーカーであり、前記ＣＴＲプロモータは細胞型調節化合物の非存在下では背景レベルより上に活性化しない、請求項１〜４の何れか１項に記載の核酸コンストラクト。
- ＴＳＲ３は細胞選択用のマーカーであり、前記ＣＴＲプロモータは背景レベルより上に活性化する、請求項１２〜１５の何れか１項に記載の核酸コンストラクト。
- 前記宿主細胞は、哺乳類またはヒト細胞である、請求項７または１８に記載の方法。
- 前記核酸コンストラクトが、薬剤抵抗性遺伝子を含まない、請求項１〜４および１２〜１５のいずれか１項に記載の核酸コンストラクトまたは請求項５、６、１６および１７のいずれか１項に記載の宿主細胞。
- 前記核酸コンストラクトまたは核酸コンストラクトを含む前記細胞が、薬剤抵抗性遺伝子を含まない、請求項７〜１１および１８〜２２のいずれか１項に記載の方法。
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