CN100491534C - 盐藻26S蛋白酶体亚基RPN10基因的cDNA序列、其编码蛋白及其全长基因序列和克隆方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种盐藻(Dunaliella viridis)中26S蛋白酶体亚基RPN10基因(DvRPN10)的cDNA序列、其编码蛋白以及全长基因序列和克隆方法。本发明提供的关于盐藻RPN10亚基基因的研究对揭示盐藻细胞内泛素/26S蛋白酶体蛋白质降解途径及其耐盐机制，具有一定的理论意义。此外，本发明提供了盐藻26S蛋白酶体RPN10的基因组序列，为进一步研究该基因的表达调控并将其用于抗盐植物的改良奠定了基础，具有一定的实际应用价值。

Description

盐藻26S蛋白酶体亚基RPN10基因的cDNA序列、其编码蛋白及其全长基因序列和克隆方法

技术领域

本发明涉及一种盐藻(Dunaliella viridis)中26S蛋白酶体亚基RPN10基因(DvRPN10)的cDNA序列、其编码蛋白以及全长基因序列和克隆方法。

背景技术

盐藻，又叫杜氏藻，它是一种无细胞壁的单细胞真核绿藻，是已知的最耐盐的真核生物。同时，它对光照、环境pH、温度等变化造成的胁迫也能够很好的耐受。因而被广泛的用来研究植物对各种胁迫的反应机制，特别是耐盐胁迫的机制。

泛素/26S蛋白酶体蛋白质降解途径(ubiquitin/26S proteasome pathway)是真核细胞中蛋白质的选择性降解中一种非常重要的机制。因其高效的降解细胞内蛋白的能力，参与了真核细胞调控的各个方面。在众多26S蛋白酶体亚基中，研究最多就要数RPN10了。最初，人们被发现它在体内能够与多聚泛素链结合。并且由于其特异地识别与那些结合有泛素链的蛋白，它被认为是26S蛋白酶体中主要的泛素蛋白受体。但是后来证明酵母

菌株仍然可以正常生长，只不过对氨基酸类似物比较敏感，这就说明RPN10并不是泛素/26S蛋白酶体途径中唯一的泛素受体且在蛋白降解的过程中起到了加强底物特异性的作用。研究发现在其C末端附近有一段疏水区域能与泛素结合被称为泛素互作基序(UIM)。出乎人们的意料之外，在氨基酸类似物胁迫实验中，这段结构域的缺失并未对酵母的生长产生影响，说明存在其他的结构域参与识别泛素链的功能。在拟南芥的研究中发现，RPN10在ABA信号传导中起到底物特异性的功能。

此外，RPN10还参与了26S蛋白酶体调控区域的结构稳定。在酵母的研究中，RPN10的突变使得蛋白酶体的盖部和基底部在体内易于解离。这说明RPN10参与了两个亚基符合体的联接。研究发现RPN10的N末端存在一个在位置上保守的天冬氨酸(Asp-11)对蛋白酶体的稳定起到了关键的作用。该氨基酸位于N端与保守结构域von Willebrand factor A相关的150个氨基酸区域内。von Willebrand factor A结构域可能也有助于盖部和基底部的联接。

另外，RPN10的功能还可能与其能够结合一系列蛋白有关，包括DSK2和DNA修复蛋白RAD23等。这些蛋白的特征是具有UBL结构域的N末端和泛素结合结构域的C末端。由于UIM和UBI结构域的相互作用，RPN10可能与RAD23/DSK2结合，参与引导泛素化底物进入26S蛋白酶体。

许多研究表明泛素/26S蛋白酶体途径参与了多种环境胁迫和激素的应答。比如，在拟南芥的研究中，Smalle等发现RPN12与细胞分裂数的生长应答有关，参与了稳定了一个或多个细胞分裂素调控因子；而RPN10可能参与了底物专一性功能，在调节脱落酸信号传到的过程中起到了十分重要的作用。此外，RPN10还是Physcomitrellapatens生长发育所必须的。在盐藻和水稻的蛋白组学的研究中人们发现：在高渗的环境下，26S蛋白酶体调控亚基的表达有所上调，这就说明蛋白酶体调控体系在调节渗透胁迫信号传到的过程中起重要作用。

发明内容

本发明的目的之一在于提供盐藻26S蛋白酶体亚基RPN10基因的cDNA。

本发明的目的之二在于提供该cDNA编码的氨基酸序列。

本发明的目的之三在于提供盐藻26S蛋白酶体亚基RPN10基因(DvRPN10)的全长基因。

本发明的目的之四在于提供该DvRPN10基因的克隆方法。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种盐藻26S蛋白酶体亚基RPN10基因的cDNA，其特征在于该cDNA为SEQ NO1所示的碱基序列。

上述的cDNA编码的蛋白，其特征在于该编码蛋白为SEQ NO 2所示的氨基酸序列。

一种盐藻26S蛋白酶体亚基RPN10基因的全长基因，其特征在于该全长基因为SEQ NO3所示的碱基序列。

上述的盐藻26S蛋白酶体亚基RPN10基因的全长基因的克隆方法，其特征在于该方法具有如下步骤：

a.利用限制性内切酶EcoR I/Xho I消化含有26S蛋白酶体亚基RPN10基因的盐藻EST文库质粒释放出目的片段，获得26S蛋白酶体亚基RPN10基因全长cDNA序列；

b.根据上述的cDNA序列设计引物筛选藻基因组BAC文库，得到盐藻26S蛋白酶体亚基RPN10基因的基因组BAC克隆，利用QIAGEN公司的Large-Construct Kit抽提无大肠杆菌基因组污染的BAC质粒，回收的DNA经机械破碎后，回收大小在2～4kb的DNA片段，连接到pUC18载体，构建鸟枪文库；所述的引物序列为：

RPN10P4a：5′ACATCGAGGGCGAGTCCAAC3′

RPN10P4b：5′TGTGCAGCAGTGCATAAGAGC3′

c.大通量提取鸟枪文库的质粒DNA，在MegaBACE 4500上进行序列的测定；每个鸟枪质粒利用M13正反向引物，进行双向测序。共测序480个鸟枪文库质粒，即5块96孔板

d.将上述的480个鸟枪文库质粒的原始数据输入在RedHat Linux平台的并联计算机群中，使用Phred/Phrap/Consed程序拼接所测序列，构建亚克隆并测序以填补出现在序列之中的缺口，得到一段连续的盐藻基因组序列；通过与其cDNA序列的比对，在该连续的盐藻基因组序列中，获得盐藻26S蛋白酶体亚基RPN10基因的全长基因序列。

盐藻是迄今发现的最耐盐的真核生物之一。其极强的耐盐能力及简单的细胞结构使盐藻成为研究植物适应盐胁迫的分子机制的重要模式生物。如今盐胁迫是影响农作物产量的重要因素之一，为了解植物耐盐机制，提高作物耐盐性，对盐藻盐适应机制的研究已成为目前国际上植物耐盐研究的一个热点。泛素/26S蛋白酶体蛋白质降解途径是真核细胞中一种非常重要的选择性蛋白质降解机制，因其高效的降解细胞内异常蛋白的能力，参与了真核细胞调控的各个方面。本发明提供了盐藻26S蛋白酶体RPN10亚基完整的编码序列，并采用实时荧光定量PCR的方法发现了盐藻RPN10受盐胁迫诱导的表达特性。RPN10在细胞内具有多方面的功能，参与并增加了底物蛋白的专一性识别，稳定26S蛋白酶体整体结构和结合泛素化的蛋白。盐藻细胞在高盐胁迫下产生大量异常蛋白，如果这些蛋白积累过量将会影响细胞的正常生理活动。DvRPN10的上升表达有助于专一性地识别这些蛋白，从而降低这些蛋白的胞内含量，维持细胞正常的生理环境，对于盐藻的抗盐机制具有十分重要的意义。因此，本发明提供的关于盐藻RPN10亚基基因的研究对揭示盐藻细胞内泛素/26S蛋白酶体蛋白质降解途径及其耐盐机制，具有一定的理论。此外，本发明提供了盐藻26S蛋白酶体RPN10的基因组序列，为进一步研究该基因的表达调控并将其用于抗盐植物的改良奠定了基础，具有一定的实际应用价值。

附图说明

图1为本发明的盐藻DvRPN10基因在酵母

突变体中功能互补的结果。

图2为生长于不同盐浓度下，本发明的盐藻DvRPN10基因转录水平的实时荧光定量PCR分析结果

图3为盐诱导下，本发明的盐藻DvRPN10基因转录水平的实时荧光定量PCR分析结果。

图4为本发明的盐藻DvRPN10基因的基因结构。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，分子克隆(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd ed.)或植物分子生物学—实验手册(Plant Molecular Biology—A Laboratory Manual，Melody S.Clark编，Springer-verlag Berlin Heidelberg，1997)中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例一：DvRPN10全长编码区序列的克隆与分析

本实验所克隆的基因DvRPN10源于盐藻EST文库。利用限制性内切酶(EcoRI/Xho I)消化含有DvRPN10的盐藻EST文库质粒释放出目的片段并用于以后的实验。经测序分析，DvRPN10最长cDNA片段为1486bp，含有绿藻基因特异的加尾信号TGTAA及poly(A)结构。Vector NTI软件的分析结果显示，DvRPN10最长读码框编码了一个含377个氨基酸的蛋白，蛋白分子量大小为39.4kDa，等电点是4.43，可见DvRPN10所编码的蛋白为偏酸性蛋白。

实施例二：DvRPN10基因序列的测序及拼接

通过筛选盐藻BAC文库，得到含有DvRPN10基因的BAC克隆。利用QIAGEN公司的Large-Construct Kit抽提无大肠杆菌基因组污染的BAC质粒，回收的DNA经机械破碎后，回收大小在2～4kb的DNA片段，连接到pUC18载体，构建鸟枪文库。

大通量提取鸟枪文库的质粒DNA，在MegaBACE4500上进行序列的测定。每个鸟枪质粒利用M13正反向引物，进行双向测序。共测序480个鸟枪文库质粒，即5块96孔板。

在RedHat Linux平台的并联计算机群中，使用Phred/Phrap/Consed程序拼接所测序列。构建亚克隆并测序以填补出现在序列之中的缺口，最终获得DvRPN10全长基因组序列。通过与其编码区序列的比较，得出其基因结构，参见图4。

实施例三：DvRPN10的功能鉴定

为了鉴定DvRPN10的生理功能，本发明做了以下验证。

将DvRPN10的全长编码区序列连接到酵母表达载体pAJ401，再转化酵母突变体。由于酵母RPN10基因的突变，使得酵母突变体对氨基酸类似物敏感，不能在含有6ug/ml刀豆氨酸(精氨酸类似物)的培养基中生长。但转化DvRPN10的酵母突变体仍然对刀豆氨酸敏感，参见图1中的A和B。分析盐藻编码序列的密码子使用频率，发现盐藻和酵母之间存在巨大的密码子使用偏好。为了消除或减弱盐藻基因翻译过程中的密码子偏好，对酵母tRNA基因进行了克隆和修改，将反义密码子为“CCT”酵母tRNA(Arg)基因改为“GCG”和“CCG”。

根据GENEBANK中反义密码子为“CCT”酵母tRNA(Arg)基因序列设计克隆及修改所需引物：

tR(CCU-GCG)J(F)(+)：5’-agtcgacttgatttccatcgtgtaagtttt-3’SalI

tR(CCU-GCG)J(F)(-)：5’-tctccttcgcagggagacgcgttaccatta-3’

tR(CCU-GCG)J(L)(+)：5’-tctccctgcgaaggagaagactgcgggttc-3’

tR(CCU-GCG)J(L)(-)：5’-agtcgaccaactagttattaccactgtggcac-3’Sal I

tR(CCU-CCG)J(F)(+)：5’-agaattcttgatttccatcgtgtaagtttt-3’EcoR I

tR(CCU-CCG)J(F)(-)：5’-tctccttcggagggagacgcgttaccatta-3’

tR(CCU-CCG)J(L)(+)：5’-tctccctccgaaggagaagactgcgggttc-3’

tR(CCU-CCG)J(L)(-)：5’-agaattccaactagttattaccactgtggcac-3’EcoR I

在两个tRNA基因的帮助下，转化了DvRPN10的突变体酵母能够在有6ug/ml刀豆氨酸(精氨酸类似物)的培养基中生长，参见图1中的C和D。这说明1、DvRPN10能够部分恢复酵母突变体的功能缺失。2、经修改的两个tRNA有助于缓解盐藻与酵母的密码子偏好，在DvRPN10的酵母中表达起到了十分重要的作用。

实施例四：DvRPN10在不同盐浓度及3M盐诱导下的表达

参见图2，对于不同稳态盐浓度下的DvRPN10的研究，我们将盐藻细胞在含0.5、1M、2M、3M、4M和5M NaCl的盐藻培养基中进行培养，在2×10⁶cell/ml的时候收集细胞，分别提取盐藻细胞总RNA。上述RNA样品经DNase I消化后，在反转录酶的作用下反转成cDNA，稀释10倍后作为各个实验条件的realtime PCR的模板。

PCR引物：RPN10P7a：5’—ACCCTCGTCAAGATAGCCAAGA—3’

         RPN10P7b：5’—AGCCGATGAGCACATCAGACAG—3’

         DvActinRT+：5′—GCCACTGCTTTAGCTGTTTGC—3′

         DvActinRT-：5′—CCTCATGCTCCCAGATGTTCTA—3′

DvRPN10和DvACTIN的文库质粒经纯化和定量后，按照10倍梯度稀释作为定量PCR的标准曲线，DvACTIN的转录量作为内参。基因DvRPN10的转录变化数据以其在模板中的拷贝数与DvACTIN的拷贝数的比值来作图展示。(见图2)

由于DvRPN10的转录在1M-3M的盐浓度变化中上升了大约3倍，为经一步了解DvRPN10受盐诱导的转录情况，我们对该基因在高盐振荡下的转录进行了研究。我们将生长在1M NaCl的盐藻(2×10⁶cell/ml)转移至含有3.0M NaCl的新鲜盐藻培养基中继续培养，分别在含有3.0M NaCl的新鲜盐藻培养基中继续培养0小时、12小时、24小时、36小时、48小时、60小时、和72小时，然后提取盐藻细胞总RNA。然后以相同的方法检测DvRPN10的转录变化。(见图3)

由上述实验可知，DvRPN10在0.5M至3M盐浓度范围内，受盐诱导表达，高盐浓度下其表达量约是低盐浓度下的3倍，且在3M盐诱导36小时后其表达量开始上升。因此推测其可能参与了盐藻抗盐胁迫晚期的某些重要生理活动。

序列表

<110>上海大学

<120>盐藻26S蛋白酶体亚基RPN10基因的cDNA序列、其编码蛋白及其全长基因

序列和克隆方法

<160>3

<210>1

<211>1486

<212>DNA

<213>盐藻(Dunaliella viridis)

<400>1

<210>2

<211>377

<212>PRT

<213>盐藻(Dunaliella viridis)

<400>2

<210>3

<211>5409

<212>DNA

<213>盐藻(Dunaliella viridis)

<220>

<221>Exon

<222>(557)...(1246)

<220>

<221>Exon

<222>(2009)...(2142)

<220>

<221>Exon

<222>(2700)...(2900)

<220>

<221>Exon

<222>(3366)...(3781)

<220>

<221>Exon

<222>(4341)...(4634)

<400>3

Claims (4)

1.一种盐藻26S蛋白酶体亚基RPN10基因的cDNA，其特征在于该cDNA为SEQNO 1所示的碱基序列。

2.一种根据权利要求1所述的cDNA编码的蛋白，其特征在于编码蛋白为SEQ NO 2所示的氨基酸序列。

3.一种盐藻26S蛋白酶体亚基RPN10基因的全长基因，其特征在于该全长基因为SEQ NO 3所示的碱基序列。

4.一种根据权利要求3所述的盐藻26S蛋白酶体亚基RPN10基因的全长基因的克隆方法，其特征在于该方法具有如下步骤：

a.利用限制性内切酶EcoR I/Xho I消化含有26S蛋白酶体亚基RPN10基因的盐藻EST文库质粒释放出目的片段，获得26S蛋白酶体亚基RPN10基因全长cDNA序列；

b.根据上述的cDNA序列设计引物筛选藻基因组BAC文库，得到盐藻26S蛋白酶体亚基RPN10基因的基因组BAC克隆，利用QIAGEN公司的Large-Construct Kit抽提无大肠杆菌基因组污染的BAC质粒，回收的DNA经机械破碎后，回收大小在2～4kb的DNA片段，连接到pUC18载体，构建鸟枪文库；所述的引物序列为：

RPN10P4a：5＇ACATCGAGGGCGAGTCCAAC3＇

RPN10P4b：5＇TGTGCAGCAGTGCATAAGAGC3＇

c.大通量提取鸟枪文库的质粒DNA，在MegaBACE4500上进行序列的测定；每个鸟枪质粒利用M13正反向引物，进行双向测序；共测序480个鸟枪文库质粒，即5块96孔板；

d.将上述的480个鸟枪文库质粒的原始数据输入在RedHat Linux平台的并联计算机群中，使用Phred/Phrap/Consed程序拼接所测序列，构建亚克隆并测序以填补出现在序列之中的缺口，得到一段连续的盐藻基因组序列；通过与其cDNA序列的比对，在该连续的盐藻基因组序列中，获得盐藻26S蛋白酶体亚基RPN10基因的全长基因序列。

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