JP2013102768A - 診断マーカーとしてのエキソソーム関連マイクロrna - Google Patents
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Abstract
【解決手段】被検体からの生物学的サンプルから単離したガン由来エキソソームに存在する1又はそれより多いマイクロRNAの量を測定することにより、被検体におけるガン又は有害な妊娠転帰を診断する方法。
【選択図】図8
Description
本願は、2007年7月25日出願の米国仮特許出願第60/951,812号及び2008年5月5日出願の米国仮特許出願第61/050,438号(これらの開示の全体が参照により本明細書中に組み込
まれる)の利益を主張する。
本明細書に開示の主題は、ガン及び有害な妊娠転帰(outcome)の診断及び予後の方法に
関する。詳細には、本明細書に開示の主題は、被検体(subject)からの生物学的サンプル
中のガン又は有害な妊娠転帰(pregnancy outcome)と相関付けられる1又はそれより多い
エキソソーム由来マイクロRNAの量を決定することに基づく診断及び予後の方法に関する
。
ガンの早期検出及び診断に適切なガンのバイオマーカーの同定は、被検体の臨床転帰を改善する大きな見込みを有している。これは、曖昧な徴候を示すか若しくは徴候を全く示さない被検体又は健康診断では比較的知見し難い腫瘍を有する被検体にとって特に重要である。早期検出を指向する相当な努力にもかかわらず、早期ステージのガンを診断することができる信頼性のある対費用効果の高いスクリーニング試験はほとんど開発されていない。
を有するほとんどの婦女子は、進行したステージで診断され、75%が卵巣外疾患(extra-ovarian disease)と診断される(Berekら,2003)。婦女子に関連する他のガンと比較して、子宮内膜ガンの73%、乳ガンの55%及び子宮頸ガンの50%がステージI疾患で診断される(Menon及びJacobs,2000)。ステージI卵巣ガンを有する患者の5年生存率は90%を超えるが、進行したステージの卵巣ガン患者は僅か21%しか最初の診断の5年後に生存していない(Berekら,2003)。長期生存率は過去数十年間有意に変化していないので、卵巣ガンの生存率の更なる改善は、早期診断にあると最も見込まれる(Menon及びJacobs,2000)。
疾患再発のモニタリングの両方のために使用される;しかし、CA125の使用は早期ステー
ジのガン検出に関しては限定的である(50〜60%の感受性)。CA125定量化は寛解(remission)モニタリングについてのみ承認されており、一貫して証明されている。CA125は、ステージI疾患を有する婦女子の50%より多くで上昇しているが、進行したステージの卵巣ガンを有する患者の80%より多くで上昇しているので、デノボ卵巣ガン検出には高感度でも特異的でもない。CA125は特異性に乏しい。このことは、とりわけ、良性及び悪性の乳房及び結腸疾患、腹膜刺激物及び良性婦人科疾患と関連する上昇により示されている。
化学的に異なるタンパク質チップアレイへの結合による生物学的標本中のタンパク質の解
析における使用について注目を集めている。ガンの存在を規定するために、ある技術では4つの血清タンパク質をELISAにより検査する一方で、別の技術は、患者血清中の7つの
特異的な血清成分の質量分析又は一般的ペプチドパターンを使用する。SELDI-TOF-MSプロファイリングは、卵巣ガン、乳ガン、前立腺ガン及び肝臓ガンをコントロールと識別するための使用に成功している。
り有意に良好であることが示されている。研究により、SELDI-TOF-MSにより解析される複数タンパク質の組合せの選択は、診断アプローチとして可能性を有することが示されている。卵巣ガンについての有効なスクリーニング試験は、高い感受性及び特異性を達成する必要があり、現時点では、異なるプロテオミック技術及びピークを見分けるために使用されるコンピュータ分析ツールは異なる知見を生じる。SELDI-TOF-MSプロファイリングの病識についてのこれら初期の研究は見込みがあり、その着想は一連の異なるバックグランドで再現可能である;しかし、このアプローチをルーチンの診断試験に変更することは困難なままである。
ィブ又はネガティブ選択)による予備精製は、タンパク質の特定の群を除去することがで
きる。現在の質量分析アプローチのほとんどにおける最大の難題は、感受性よりむしろダイナミックレンジである。優勢なタンパク質又はペプチドの除去は、特定のサンプルから獲得できる情報の内容を大いに増加させることができる一方、アルブミンのような優勢なタンパク質は診断上有意なタンパク質サブセットのキャリアとして機能することができる。卵巣ガン又は任意の他の適応症についてのスクリーニングにこのプラットフォームを適用することを幾らかでも検討する前に、より大きなサンプルサイズ及び独立検証セットの注意深い盲検性を有する更なる研究が必要である。
本要旨は、本明細書に開示の主題の幾つかの実施形態を列挙し、そして多くの場合、これら実施形態の変形及び入替えを列挙する。本要旨は、多くの種々の実施形態の単なる例示である。与えた実施形態の1又は複数の代表的特徴の言及も同様に例示である。典型的には、言及した特徴を有するか又は有しない実施形態が存在することもある;同様に、特
徴は、本要旨に列挙されているかいないかにかかわらず、本明細書に開示の主題の他の実施形態に適用可能である。過剰な反復を回避するために、本要旨は、そのような特徴の可能な全ての組合せを列挙せず、示唆もしない。
ガン進行を評価する方法が提供される。或る実施形態では、この方法は、被検体からの或る期間にわたる一連の生物学的サンプルを用意し;前記一連の生物学的サンプルからmiRNAを含んでなるガン由来エキソソームを単離し;前記一連の生物学的サンプルの各々における1又はそれより多くの前記miRNAの量を決定し;前記一連の生物学的サンプルの各々における前記1又はそれより多いmiRNAの量の無視できない変化を決定して、被検体におけるガンの治療効力及び/又はガン進行を評価することを含んでなる。
り多くの前記miRNAの量を決定し;前記1又はそれより多いmiRNAの量を1又はそれより多いmiRNAコントロールレベルと比較することを含んでなる。次いで、1又はそれより多いmiRNAコントロールレベルに対するガン由来エキソソームからの1又はそれより多いmiRNA
の量の無視できない差に基づいてガンを特徴付ける。或る実施形態では、ガンの特徴付けは、ガンのタイプ、悪性度(grade)及び/又はステージを決定することを含んでなる。更に、或る実施形態では、1又はそれより多いmiRNAの量の決定は、ガン由来エキソソーム中のmiRNAの総量を決定することを含んでなる。
上皮細胞接着分子(抗EpCAM)抗体)を用いる免疫吸着捕捉により非ガン由来エキソソームから分離される。
いmiRNAを標識することを含んでなり、或る実施形態では、次いで各々が1又はそれより
多いmiRNAと選択的に結合する1又はそれより多いポリヌクレオチドプローブで1又はそ
れより多いmiRNAを捕捉することを含んでなる。これら方法の他の実施形態では、1又は
それより多いmiRNAの量の決定は、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を使用して1又は
それより多いmiRNAの量を定量することを含んでなる。更に、これら方法の或る実施形態
では、miRNAは、表2に示される1又はそれより多いmiRNAであり、例えば、miR-21、miR-141、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-203、miR-205及びmiR-214からなる群より選択される1又はそれより多いmiRNAを含む。
り多くの前記miRNAの量を決定し;前記1又はそれより多いmiRNAの量を1又はそれより多いmiRNAコントロールレベルと比較することを含んでなる。被検体は、エキソソームから
の1又はそれより多いmiRNAの量に、1又はそれより多いmiRNAコントロールレベルと比較して無視できない差があれば、有害な妊娠転帰を有すると診断される。或る実施形態では、有害な妊娠転帰は、早期破水、子癇前症、早産、胎内発育遅延及び再発性妊娠喪失からなる群より選択される疾患である。
開示の主題の目的である。この目的は、全体又は一部が本明細書に開示の主題により達成される。
上記に述べた本明細書に開示の主題の目的及び全体又は一部が本明細書に開示の主題により達成される目的、他の目的及び利点は、本明細書に開示の主題についての以下の説明、図面及び非限定的実施例を熟読後に当業者に明らかになる。
本明細書に開示の主題の1又はそれより多い実施形態の詳細を下記の説明に示す。本明細書に開示の主題の他の特徴、目的及び利点は、本明細書、図面及び特許請求の範囲から明らかになる。本明細書中で引用した全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合には、本明細書(定義を含む)が支配する。
長年の特許慣習に従い、本願(特許請求の範囲を含む)で使用するときには、用語「a」
、「an」及び「the」は「1又はそれより多い」を意味する。よって、例えば、「ペプチ
ド」への言及は、複数のそのようなペプチドを含む、という具合である。
は±0.5%、或る実施形態では±0.1%の変動を包含することを意味する。なぜならば、このような変動は開示された方法を実施するために適切であるからである。
4;Calin及びCroce,2006)。低分子(22〜25ヌクレオチド長)の非コーディングRNAである
マイクロRNAは、3'非翻訳領域への結合により標的mRNAの翻訳を抑制する(Esquela-Kerscher及びSlack,2006;Bartel,2004)。miRNAによる標的遺伝子の転写後サイレンシングは、相同mRNAの切断又はタンパク質合成の特異的阻害のいずれかにより起こり得る。
して、有意に異なるmiRNA署名(signature)を示している(Iorioら,2007;Calin及びCroce,2006a;Calin及びCroce,2006b)。Luら(2005)は、白血病及び充実性ガンの分析を実施し、miRNA発現プロフィールが発生系統及び分化状態によりヒトガンを分類し得ると決定した。現在、個々のmiRNAの発現及び特異miRNA署名が多くのヒトガンの診断及び予後と結び付けられている。
過剰発現した。彼らは更に、正常卵巣と比較して、卵巣腫瘍における低メチル化がmiR-21、miR-203及びmiR-205の上方変調(up-modulation)を生じることを証明した。2つの上方変調したmiRNA、miR-200a及びmiR-200cは、検査した3つの組織学的タイプ(漿液細胞、類内膜細胞及び明細胞)全てで増強する一方、miR-200b及びmiR-141の上方変調は、類内膜及び漿液の組織学的タイプにより共有された。一般に、異なる組織学的タイプの卵巣ガン(漿液細胞、類内膜細胞、明細胞及び混合)を正常組織と比較して得られるmiRNA署名は、ほとんどの症例でオーバーラップしていた。卵巣腫瘍の彼らの分析はまた、腫瘍のステージ又は悪性度に関連して異なって発現したmiRNAは存在しないことを証明した。このことは、進行したステージの腫瘍に主として由来するサンプルセットに起因しているようである。
中、「エキソソーム」と呼び、当該分野において膜フラグメント、膜小胞又はマイクロベシクルとしても公知である)を遊離又は脱粒する能力である。驚くべきことにガン細胞に
起源を有するエキソソーム(すなわち、「ガン由来エキソソーム」)に結合しているmiRNA
を最初に同定したデータが本明細書に開示される。本明細書に開示の主題は更に、ガン由来エキソソームから単離したmiRNAが、ガンに罹患した被検体において、ガンを有さない
被検体で測定したmiRNA発現レベル(本明細書では「miRNAコントロールレベル」と呼ぶ)とは異なる(例えば、増加した又は減少した)発現レベルを示すことを最初に開示する。更に、本明細書に開示の主題は、検査被検体の容易に接近可能な生物学的流体からのガン由来エキソソームの単離を提供する。このように、本明細書に開示の主題は、ガン細胞を直接サンプリングする必要のない、容易に接近可能な生物学的サンプルからのガン由来エキソソームのmiRNAの収集及びそのレベルの測定に基づくガンの診断及び予後の方法を最初に提供する。
細胞から遊離されるマイクロベシクル(すなわち、「ガン由来エキソソーム」)を含む)。
これら小さな小胞(直径50〜100nm)は、大きな多小胞性エンドソームに由来し、細胞外環
境中に分泌される。エキソソームの遊離/脱粒の正確な機序は、不明のままである;しか
し、この遊離は、エネルギーを必要とする現象であり、細胞外シグナルによりモジュレートされる。これらは、後期エンドソームの境界膜から陥入により形成され、出芽するようであり、サイトゾルを含有し、膜結合細胞タンパク質の細胞外ドメインを表面に露出する小胞を生じる。電子顕微鏡観察を使用する研究により、細胞外環境中への内部小胞の分泌に至る、原形質膜との多小胞性エンドソームの融合プロフィールが示されている。エキソソーム遊離の速度は、ほとんどの新生物細胞において顕著に増加し、連続して生じる。エキソソームの増加した遊離及びその蓄積は、悪性形質転換プロセスにおいて重要であるようである。ガン細胞に加えて、エキソソームの遊離は、胚起源(例えば、胎盤)の細胞及び活性化リンパ様細胞と関連することも証明されている。
訳抑制を導く一方、植物では、miRNAは標的部位と完全な相同性を示し、メッセージ(mRNA)の分解が優勢である傾向がある。
理学的プロセスに能動的に関与する。例えば、或るmiRNAの調節形式は、細胞の増殖、分
化及びアポトーシスをコントロールすることが見出されている;そして、異常なmiRNAプ
ロフィールは腫瘍形成に関連する。更に、ウイルス感染は、「細胞生存促進(pro-cell survival)」遺伝子をサイレントにするために標的されるmiRNAの増加及びアポトーシス(プログラムされた細胞死)と関連する遺伝子を抑制するmiRNAの減少を引き起こし、よってアポトーシスシグナル伝達を増幅する方向へバランスを傾けることが示唆されている。
選択プロセスは、細胞が生理学的プログラムの方向を新たな遺伝子発現経路に導くように、例えばもはや必要ではなくなったかもしれない特定群の遺伝子発現を弱めることに関与する。標的群の遺伝子発現をmiRNA依存性に弱めることは、細胞を古いプログラムから移行プログラムへ、そして新たなプログラムに出発させる強固で迅速な調節である。この代表例は、胚発生の間に、特定の細胞群が独特な特化された細胞タイプ(例えば、ニューロン、心筋細胞、筋肉など)になるように方向付けられる場合に証明される。
現のmiRNA調節は各特異細胞タイプについて特定のシグナル伝達経路に関係していると考
えられる。例えば、アポトーシスシグナル伝達経路は、生存促進遺伝子メッセージを脱安定化するために標的される一群のmiRNAにより指図され、代わりにアポトーシス促進遺伝
子(pro-apoptosis gene)を優勢にし、よって死亡プログラムを活性化させ得る。別の例は、ガン増殖の制御である;最近の発見により、miRNAはまた、細胞が腫瘍性になることを予防するために必須であり得ることが示されている。例えば、2つのガン遺伝子cMyc及びcRasは、ガンにおいてその発現がダウンレギュレートされる1つのmiRNA種による制御を共有していることが見出されている。換言すれば、このmiRNAの欠如により、cMyc及びcRasの抑制されない発現が可能になり、よってこれら2つの遺伝子はガン細胞中に豊富に存在するようになり、当該細胞は未制御の細胞増殖能を獲得し、新生物成長のステージに設定される。更に、miRNA変異がベルギー起源のヒツジにおける筋肉質(muscularity)の表現型を担っていると報告されている。このことは、プロモーター領域、コーディング領域及びサイレンシング部位に変異の証拠が見出されていない遺伝子疾患と関連する変異がmiRNAに見出され得ることを示唆する。
抗物(opponent)のいずれかの発現を単に抑制することによって、主要な機能又は副次的な機能のいずれかを発揮できることを確実にするように働き得る。よって、或る遺伝子産物は、或る細胞タイプでは、或るシグナル伝達経路の主要な「ハブ」として機能し、別の細
胞タイプでは、副次的な「ハブ」であるか又は全く使用されない可能性がある。「ハブ」遺伝子発現のマイクロRNA制御は、種々の分子が異なるタイプの細胞機能様式(operational modality)に主要か若しくは副次的な「ハブ」として役立つか又は全く役立たないという汎用性を提供する好都合な機序であり得る。
れば、相互作用態様及び発現パターンについての情報は得ることが望ましい。どの群の推定miRNAが特定の細胞タイプで稼動中であり、又は目的とする特定のプロセス又は条件に
関連するかを定量し同定する系及び方法は、各細胞状態がどのように進化し維持されるか及び機能不全の維持がキー遺伝子の発現を調節する独特なmiRNAセットの不適切な減少又
は増加によりどのように幇助されるのかを理解するために有用な情報を提供することができる。このような理解は、多くの疾患(ガン及び有害な妊娠転帰を含む)の診断及び特徴付けに有用であることを証明し得る。
ての重要で正確な決定因子であることが示されている。miRNA遺伝子の発現がヒトガンで
調節解除(deregulated)されることを示す証拠が増えている。miRNAの発現は組織及び発生ステージに高度に特異的であり、最近では、miRNAの発現により腫瘍の分子分類が可能に
なっている。今日まで、miRNAプロファイリングにより分析した全ての腫瘍は、同じ組織
からの正常細胞と比較して有意に異なるmiRNAプロフィールを示している。フローサイト
メトリー的miRNAプロファイリングは、miRNA発現プロフィールがヒトガンを腫瘍の発生系統及び分化状態に従って分類することを証明した。特異的な過剰発現又は過少発現は、特定の腫瘍タイプと相関することが示されている。マイクロRNAの過剰発現は腫瘍サプレッ
サー遺伝子のダウンレギュレーションを生じ得る一方、過少発現はガン遺伝子のアップレギュレーションを導き得る。大規模マイクロアレイ分析により、ガン細胞は、正常細胞と比較して異なるmiRNAプロフィールを示した。228のうち36のmiRNA遺伝子がガン細胞にお
いて正常細胞に対して過剰発現され、21のmiRNA遺伝子がダウンレギュレートされた。階
層的クラスタリング分析(hierarchical clustering analysis)は、このmiRNA署名により
、腫瘍サンプルをその起源の組織に基づいてグループ化することが可能であることを示した。ゲノムの広範なプロファイリング研究は、CLL、乳ガン、グリア芽細胞腫、甲状腺乳
頭状ガン腫、肝細胞ガン腫、卵巣ガン、結腸ガン及び内分泌膵臓腫瘍を含む種々のガンタイプで実施されている。適合した104対の原発性ガン性卵巣組織及び非ガン性卵巣組織の
研究において、異なって発現する43のmiRNAが観察された;28は腫瘍中でダウンレギュレ
ートされ、15は過剰発現した。
びに内分泌膵臓腫瘍)からの、2つの異なる方法により得られたマイクロアレイデータの
統計分析、マイクロアレイの有意性分析(SAM)及びマイクロアレイの予測分析(PAM)により、少なくとも3つの腫瘍タイプで異なって発現する21のmiRNAから構成される共通の署名が証明された。そのリストの上位は、miR-21(6タイプのガン細胞で過剰発現)、miR-17-5p及びmiR-191(5タイプで過剰発現)であった。分析した腫瘍の胚起源は異なっていたので、この知見の有意性は、これら共通のmiRNAが多くの腫瘍タイプで変化する基礎的シグナル伝達経路に関与するということであり得る。腫瘍形成におけるこれら遺伝子の機能の支持として、異なって発現するmiRNAの予想される標的は、既知の腫瘍サプレッサー及びガン遺伝子を標的するものについて顕著に富化されることが見出された。更に、分析した6つ全てのガンタイプで過剰発現した唯一のmiRNAであるmiR-21は、腫瘍サプレッサーPTEN(増殖及び/又は生存経路を阻害するホスファターゼをコードする)を直接標的することが示された。PTENの機能は、乳、卵巣、胃及び前立腺を含む種々のタイプの進行した腫瘍において変更される。
色腫、悪性黒子黒色腫、悪性黒色腫、結節性黒色腫、爪下黒色腫及び表在拡大型黒色腫が挙げられる。
レベル))に基づいて診断を下す。
測定に基づいて、臨床転帰(内科療法を伴うか又は伴わない)の予測、適切な治療の選択(
又は治療が有効か否か)又は現行治療のモニター及び場合によっては治療の変更を提供す
ることができる。更に、本明細書に開示の主題の或る実施形態では、診断(予後を含む)、
治療効力及び/又はガンの進行の評価を容易にするために、時間経過に伴う1又はそれよ
り多いmiRNAの量の複数回の決定を行うことができる。1又はそれより多いガン由来エキ
ソソームmiRNAレベル(すなわち、生物学的サンプル中のmiRNA量)の時間的変化を使用して臨床転帰を予測し、ガンの進行及び/又は施行したガン療法の効力をモニターすることが
できる。このような実施形態では、例えば、治療の過程で、時間経過に伴う生物学的サンプル中の特定miRNAの量の減少を観察することによって、治療の有効性を示し得る。
けられる。他の実施形態では、診断又は予後的miRNAレベルの閾値レベルを設定すること
ができ、被検体サンプル中のmiRNAレベルを単純に閾値レベルと比較することができる。
複数回の測定をなすことができ、レベルの時間変化を診断又は予後の決定に使用することができる。例えば、特異miRNAのレベルを、最初の時点で決定し、第2の時点で再び決定
することができる。このような実施形態では、最初の時点から第2の時点の間でのmiRNA
レベルの増加は、ガンと診断し得るか、又は所与の予後であり得る。同様に、最初の時点から第2の時点の間でのmiRNAレベルの減少は、ガンを示し得るか、又は所与の予後であ
り得る。更に、1又はそれより多いmiRNAレベルの変化の程度は、ガンの重篤度及び/又は疾患進行及び将来の有害な事象のタイムラインと関連付けられ得る。
ができる一方、或る時点の所定miRNAレベル及び第2の時点の第2のmiRNAレベルを測定することもでき、これらレベルの比較が診断情報を提供することを理解する。
がバイオマーカーの存否又はレベルに基づいて起こる可能性が高いか低いかを予想できることをいうものでもない。代わりに、当業者は、用語「予後」は或る経過又は転帰が起こる可能性の増大;すなわち、経過又は転帰が、所与の病的状態を示さない個体と比較したとき、該病的状態を示す被検体において起こる可能性がより高いことをいうものであると理解する。例えば、病的状態を示さない(例えば、miRNAレベルを示さないか、又は減少したレベルのmiRNAレベルを示す)個体では、所与の転帰(例えば、ガン罹患)となる見込みは非常に低いか(例えば、<1%)、又はそのような見込みはない。対照的に、病的状態を示す(例えば、miRNAレベルを示すか、又はコントロールレベルに対して大いに増大したレベルのmiRNAレベルを示す)個体では、所与の転帰(例えば、或る形態/ステージのガンの罹患)となる見込みは高い。或る実施形態では、予後は、所与の予想される転帰の約5%の見込み、約7%の見込み、約10%の見込み、約12%の見込み、約15%の見込み、約20%の見込み、約25%の見込み、約30%の見込み、約40%の見込み、約50%の見込み、約60%の見込み、約75%の見込み、約90%の見込み又は約95%の見込みである。
スラインレベルからの変化は被検体の予後を反映し得、マーカーレベルの変化の程度は、有害な事象の重篤度に関連し得る。統計学的有意性は、しばしば、2又はそれより多い集団を比較し、信頼区間及び/又はp値を決定することにより決定される。例えば、Dowdy及びWearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York, 1983(参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる)を参照。本主題の例示的信頼区間は、90%、95%
、97.5%、98%、99%、99.5%、99.9%及び99.99%である一方、例示的なp値は、0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001及び0.0001である。
でき、生物学的サンプル中の該指標のレベル変化度は、単純に閾値レベル変化度と比較することができる。本明細書に開示の主題のmiRNAレベルに関して好適な閾値レベル変化は
、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約50%、約60%、約75%、約100
%及び約150%である。更に他の実施形態では、「ノモグラム」を確立することができ、
これにより予後又は診断的指標のレベルを、所与の転帰への関連性向と直接関係付けることができる。当業者は、2つの数値を関係付けるためのノモグラムの使用に精通しており、集団の平均ではなく個々のサンプル測定値を言及するので、この測定値の不確定性はマーカー濃度の不確定性と同じであることを理解する。
るmiRNAの同一性、サンプル中に含まれるmiRNAの量的レベル及び/又は別のサンプルに対
するmiRNAの量的レベルの変化についての情報を含む。例えば、サンプルのmiRNAプロフィールは、特定のガンと関連するmiRNAの量的レベル及び/又は量的レベルの変化についての情報を含む。
好ましい哺乳動物は最も好ましくはヒトである。本明細書で使用する場合、用語「被検体」にはヒト被検体及び動物被検体の両方が含まれる。よって、獣医学上の治療的使用が本明細書に開示の主題に従って提供される。
ヒトが消費するために農場で飼育される動物);及び/又はヒトにとって社会的重要性を有する動物(例えば、ペットとして又は動物園で飼われる動物)の治療を提供する。このような動物の例としては、以下のもの挙げられるがそれらに限定されない:肉食動物(例えば
、ネコ及びイヌ);ブタ(swine)(豚(pig)、去勢豚(hog)を含む)及びイノシシ;反芻動物及び/又は有蹄動物(例えば、ウシ(cattle)、去勢ウシ(ox)、ヒツジ、キリン、シカ、ヤギ、バイソン及びラクダ);及びウマ。トリ(bird)の治療もまた提供される。これには、絶滅
危惧にあるもの及び/又は動物園で飼われているもの、並びに鳥(fowl)、より具体的には
家禽(domestic fowl)、すなわち、食用家禽(poultry)(例えばシチメンチョウ、ニワトリ
、アヒル、カモ、ホロホロチョウなど)の種類のトリの治療が含まれる。なぜなら、これ
らは、ヒトにとって経済的重要性を有するからである。よって、家畜化したブタ、反芻動物、有蹄動物、ウマ(競走馬を含む)、食用家禽などを含むがこれらに限定されない家畜の治療も提供される。
る生物学的サンプル中の1又はそれより多いmiRNAの量(定性的な存否を含む)又は量の範
囲である。コントロールレベルの計算の1つの非制限的例として、正常生物学的サンプル(例えば、血液)中の目的の1又はそれより多いmiRNAの量を計算し、全被検体に外挿する
ことができる。
子発現研究に適用される強力なツールであるマイクロアレイ技法である。この技法は、サンプル中の相補鎖を見つけてこれとハイブリダイズすることによって、選択的結合により該相補鎖を捕捉するプローブとして、既知の配列情報を有する多くのポリヌクレオチドを提供する。図1及び8は、マイクロアレイによりエキソソーム由来miRNAを単離し測定す
るための例示的プロトコルのフローチャートを提供する。
合親和性を有する本明細書に開示のプローブに関して、プローブは、標的ポリヌクレオチド配列と100%相補性であり得る。しかし、プローブは、該プローブが標的ポリヌクレオ
チドと特異性を有して結合することができ、サンプルからそれを捕捉できる限り、必ずしも、該標的ポリヌクレオチドに対しその全長にわたって完全に相補性であることを要しない。
のパラメータの値より遥かに重要である。高いレベルの相同性を含む配列を同定及び/又
は単離するための適切なハイブリダイゼーション条件の決定は、当該分野において周知である。高ストリンジェンシーの条件を特定するという目的には、好適な条件は、約200mM
の塩濃度及び約45℃の温度である。
ドプローブを別途に又は同時に使用して行うことができる。例えば、複数のサンプルの効率的な加工処理及びより高い診断及び/又は予後的正確性を提供できる可能性のために、
幾つかのプローブを1つの試験で組み合わせることができる。加えて、当業者は、同じ被検体の(例えば、連続する時点の)複数サンプルを試験する価値を認識する。このような系列サンプルの試験により、miRNAレベルの変化を経時的に同定することが可能になる。miRNAレベルの増加又は減少及びレベルに変化がないことは、疾患状態について有益な情報を提供することができる。
ジッパー対配列、抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグなど)。或る実施
形態では、標識は、可能性のある立体障害を減少させるために、種々の長さのスペーサーアームにより付着される。
ットでも実施することができる。例えば、マイクロタイタープレート又は自動操作を用いて、多数の試験サンプルの加工処理を容易にすることができる。或いは、単一サンプルフォーマットは、時宜に即した様式で、即時の治療及び診断を容易にするように開発され得る。
徴点は、代表的には、介在するスペースにより分離される(しかし、そうである必要はな
い)。アレイの場合、「標的」miRNAは、基体の種々の領域に結合したプローブ(「標的プ
ローブ」)により検出されるべき移動相(体表的には、流体)中の成分として参照されるこ
とがある。
り又は天然の供給源から)予め得られた生体高分子を基体上に堆積させるか、又はインサ
イチュ合成法により作製することができる。得られた生体高分子を体積させる方法としては、(例えば米国特許第5,807,522号に記載のように)ピン若しくは毛細管に搭載し、次い
でそれを表面に接触させること、又は(例えば、PCT公開第WO 95/25116号及び同第WO 98/41531号に記載のような)パルスジェット(例えば、インクジェットヘッド)からの発射による堆積などが含まれるが、これらに限定されない。インサイチュ作製方法としては、ペプチドアレイの合成には米国特許第5,449,754号に記載の方法、ポリヌクレオチド用には米国特許第6,180,351号及びWO 98/41531並びにこれらで引用された参考文献に記載の方法が挙げられる。試薬の堆積にはパルスジェットもまた使用し得る。予め得られた生体高分子の堆積又はインサイチュ法のいずれかによる生体高分子アレイ作製の更なる詳細は、米国特許第6,242,266号、同第6,232,072号、同第6,180,351号及び同第6,171,797号に開示されている。予め得られた生体高分子の堆積又はインサイチュ法によるアレイ作製では、代表的には、アレイが形成される予定か又は形成されている基体表面上の各領域(「アレイ領域」)が、1又はそれより多い試薬に完全に曝される。例えば、いずれの方法でも、アレイ領域は、しばしば、基体及び生体高分子又は生体モノマーの両方に結合する1又はそれより多い試薬に曝されて表面に適切な層を形成する。インサイチュ作製では、アレイ領域はまた、代表的には、酸化薬、脱ブロッキング試薬、任意にキャッピング剤に曝される。同様に、特に予め得られた生体高分子の堆積による作製では、アレイ領域を適切なブロッキング剤に曝して、特徴点がない表面位置を標的への非特異結合からブロックすることが望ましくあり得る。
、(例えば、本実施例で詳細に開示するような)リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)
の使用を含んでなり得る。リアルタイムPCR(RT-PCR)は、サンプル中のmiRNAの存在及び存在量に関する正確で迅速なデータを提供することができる。図2は、RT-PCRによるエキソソーム由来miRNAの単離及び測定の例示的プロトコルのフローチャートを提供する。例示
的方法の更なる詳細は本実施例に記載される。
較して、エキソソームからの1又はそれより多いmiRNAの量に無視できない差が存在すれ
ば、被検体が有害な妊娠転帰の危険を有していると診断することができる。或る実施形態では、有害な妊娠転帰は、子癇前症、早産(例えば、32週間の妊娠期間前の出産)、早期破水、胎内発育遅延及び再発性妊娠喪失からなる群より選択される疾患である。
。例えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual (1989),第2版,Sambrook, Fritsch及びManiatis編,Cold Spring Harbor Laboratory Press,第16章及び第17章;米国特許第4,683,195号;DNA Cloning,第I巻及び第II巻,Glover編,1985;Oligonucleotide Synthesis, M. J. Gait編,1984;Nucleic Acid Hybridization, D. Hames及びS. J. Higgins編,1984;Transcription and Translation, B. D. Hames及びS. J. Higgins編,1984;Culture Of Animal Cells, R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987;Immobilized Cells And Enzymes, IRL Press, 1986;Perbal (1984),Practical Guide To Molecular Cloning;See Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.);Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, J. H. Miller及びM. P. Calos編,Cold Spring Harbor Laboratory, 1987;Methods In Enzymology,第154巻及び第155巻,Wuら編,Academic Press Inc., N.Y.;Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer及びWalker編,Academic Press, London, 1987;Handbook Of Experimental Immunology,第I巻〜第IV巻, D. M. Weir及びC. C. Blackwell編,1986を参照。
以下の実施例は、本明細書に開示の主題の態様を説明するために含まれている。本開示及び当該分野における一般技術レベルに照らせば、当業者は、以下の実施例が例示を意図するに過ぎないこと及び本明細書に開示の主題の範囲から逸脱することなく多くの変更、改変及び修正を用いることができることを理解する。
ソソームから単離できることを開示する。単離したmiRNAは、ガン及び有害な妊娠転帰の
診断ツールとして利用することができる。本実施例はこれら適用の支持を提供する。
患者サンプル及び細胞株
これら実施例は、例示的生物学的流体として、卵巣の漿液性乳頭状腺ガンと診断された婦女子由来の血清(n=50;ステージIについてn=10、ステージIIについてn=10、ス
テージIIIについてn=20及びステージIVについてn=10)、良性卵巣腺腫を有する年齢が適合する婦女子由来の血清(n=10)及び卵巣疾患の証拠がない年齢が適合する婦女子由来の血清(n=10)を利用した。コントロール、良性卵巣疾患を有する患者並びにステージIII及びIVの卵巣ガンは、早期ステージの卵巣ガンを有する患者と年齢が適合することを基準にして選択した。これら実施例は更に、卵巣のIIIc嚢胞腺ガンを有する6人の婦女子から樹立した初代腫瘍細胞培養物及び対応する手術前の血清サンプルの研究のデータを含む。これら材料の全てを、University of LouisvilleのUniversity Human Studies Committeeにより承認されたインフォームドコンセントの下で得た。
腫瘍由来エキソソームは、抗上皮細胞接着分子(EpCAM)を使用する改変磁性活性化細胞
ソーティング(MACS)手順により特異的に単離した。本発明者らの以前の研究により、上皮腫瘍からのエキソソームはその表面にEpCAMを発現し、選択的単離に使用することができ
ることが示されている。正常コントロール、良性疾患を有する患者及び早期ステージ卵巣ガンを有する患者の血清サンプル(2.5ml)を、磁性マイクロビーズ(50μl)にカップリングした抗EpCAMとインキュベートした。これらを混合し、2時間4℃にてインキュベートし
た。LDマイクロカラムをMACSセパレータの磁界中に置き、カラムを500μlのTris-緩衝化
生理食塩水(TBS)でリンスした。磁性免疫複合体をカラムに適用し、未結合(未標識)の材
料を通過させて、廃棄した。カラムを500μlのTBSで4回洗浄した。カラムをセパレータ
から取り出して収集チューブ上に配置することにより、特異的に選択されたエキソソームを回収した。TBS(1ml)をカラムに加え、カラムに共に供給されたプランジャを適用する
ことにより、磁性標識したエキソソームを得た。単離したエキソソーム/マイクロビーズ
をIgG溶出緩衝液(Pierce Chemical Co, Rockford, IL)中に希釈し、複合体を10,000rpmで遠心分離してマイクロビーズとエキソソーム(上清)とを分離した。次いで、上清を100,000gで1時間4℃にて遠心分離した。ペレット化エキソソームを250μlリン酸-緩衝化生理食塩水(PBS)中に再懸濁し、これら腫瘍由来エキソソームをトータルタンパク質アッセイした。タンパク質の量は、標準としてウシ血清アルブミン(BSA)を用いてBradfordマイクロアッセイ法(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)により決定した。
透過電子顕微鏡観察のために、ペレット化エキソソームを、PBS中2.5%(w/v)のグルタ
ルアルデヒド中で固定し、脱水し、エポンに包埋した。超薄切片(65nm)を切り出し、酢酸ウラニル及びレイノルズクエン酸鉛で染色した。切片はJeol 1210透過型電子顕微鏡で検
査した。
mirVana miRNA単離キットを製造業者(Ambion, Austin, TX)の指示に従って用いて、腫
瘍細胞及びエキソソームからトータルRNAを単離した。Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, Foster City, CA)を用いて、RNAの質、miRNA画分の収率及びサイズを分析した。mirVana miRNAアレイ標識キット(Ambion)及びPost Labeling Reactive Dyeキット(Amersham Bioscience, Pittsburgh, PA)を用いて、単離したmiRNAをCy3で3'末端標識した。マイクロRNAプロファイリングは、467のヒト成熟型miRNA用のプローブを含有するマイクロアレイを使用してOcean Ridge Biosciences(Jupiter, FL)が二連で行った。この分析は、Invitrogenにより製造され二連でスポット状に塗布された35〜44量体オリゴヌクレオチドからなるSanger Institute mirBASE v9.0中に存在する467のmiRNAをカバーする特注miRNAアレイを使用した。ハイブリダイゼーション後、GenePix 4000Aアレイスキャナー(Axon Instruments, Union City, CA)を用いてmiRNAアレイを走査し、GeneSpring 7.0ソフトウェア(Silicon Genetics, Redwood City, CA)を用いて生データを規格化及び分析した。miRNAの組の各々を、各サンプルに加えたコントロールmiRNA(Ambion)と比較して表現することによって規格化を行い、アレイ間の比較を可能にした。38のミスマッチ且つシャッフルしたコントロールプローブ及び87の非保存C. elegansプローブを含むネガティブコントロールプローブからのハイブリダイゼーションシグナルに基づいて、閾値及びネガティブコントロールの95番目のパーセンタイル(95th percentile)(TPT95)を計算した。感受性を規定するために、標識反応中にNCode合成miRNAを1/500,000質量比でスパイクし、そのシグナル強度を検出した。特異性については、miR-93、miR-27a及びmiR-152についての完全適合プローブ及び各々について2ミスマッチを使用した。2塩基対ミスマッチプローブは、全てのアレイに対してTPT95以下のシグナルを示した。
の単離まで−70℃にて保存した。残る血清サンプルをその後のエキソソーム単離のために4℃にて保存した。4℃にて24時間後に第2のアリコートから、48時間後に第3のアリコートから、96時間後に第4のサンプルから腫瘍エキソソームを単離した。各エキソソーム調製物からRNAを単離して保存した。同様な研究において、保存された標本(banked specimens)の使用を模擬するために、3つの更なる血清アリコートをエキソソーム及びRNAの単離の前に−70℃にて7〜28日間保存した。
統計学ソフトウェアパッケージSAS9.1(SAS Institute, Cary, NC)を使用してデータを
分析した。各患者群について循環エキソソームのレベルを、3連で行った少なくとも2つ
の別個の実験からの平均±標準偏差として規定した。これら群間の比較は、片側ANOVAに
続く、各集団を事後検定的に比較するTukeyの多重比較により行った。miRNA発現の相対的定量化は、2-ΔΔCt法(Applied Biosystems User Bulletin No. 2)により計算し、デー
タは標的miRNAの相対量(RQ)のlog10として分析し、各サンプルに加えたコントロールmiRNAに関して規格化して、アレイ間の比較を可能にした。各サブセットについてmiRNA分布及び相関を信頼区間と共に計算した。統計学的有意性はp≦0.05に設定した。
良性卵巣疾患及び悪性卵巣疾患を有する婦女子における循環EPCAMポジティブエキソソー
ムの存在
抗EpCAM磁性ビーズを用いてEpCAMポジティブエキソソームを特異的に単離し、これら循環エキソソームをトータルタンパク質についてアッセイし、疾患のステージに対してプロットした(図3A)。年齢が適合する正常ボランティア(コントロール)におけるEpCAMポジティブエキソソームのレベルは、0.039±0.030mg/mlエキソソームタンパク質であった(これは、本アッセイのバックグランドを表した)。良性卵巣疾患を有すると診断された患者は、0.149±0.065mg/mlエキソソームタンパク質を有していた。これはコントロールに対して有意に上昇していた。卵巣ガンを有すると診断された患者は全て、EpCAMポジティブエキソソームレベルの有意な上昇を示した(良性疾患又はコントロールと比較)。ステージIの卵巣ガンを有する婦女子は、0.320±0.056mg/ml循環エキソソームタンパク質を示した。これはコントロール及び良性疾患の両方に対して有意に大きかった(p<0.01)。循環エキソソームのレベルはステージが進行するにつれて増大し、ステージIIのガンは0.640±0.053mg/mlを有し、ステージIIIは0.995±0.084mg/mlを有し、ステージIVは1.42±0.228mg/mlを示した。これら3つのステージに関連するエキソソームレベルは、良性疾患を有する婦女子又はコントロールより有意に大きかった(p<0.001)。得られる画分を電子顕微鏡観察により更に分析した。電子顕微鏡観察により、エキソソームに特徴的なベシクル状構造が示された(図3B)。この材料のエキソソーム性質は、ウェスタンイムノブロッティングによるテトラスパニン、クラスI抗原、胎盤タイプアルカリホスファターゼの存在により更に確証された。
低分子RNAと腫瘍由来エキソソームとの結合
これら単離したエキソソームが低分子RNAを含有するかどうかを同定するために、Bio-Analyzer 2100を用いてエキソソームを調べた(図4)。この分析により、一般には細胞由来RNAで観察される18S及び28S RNAの不在下に、低分子RNAの相当な集団の存在が同定された。続けて、この材料をmiRNAプロファイリングに使用した。
細胞由来miRNAに対するエキソソーム由来miRNAのプロファイリング
467のmiRNAについてプロービングするマイクロアレイ分析(図1)を用いて、細胞由来miRNA及びエキソソーム由来miRNAの両方からの特異miRNAの存在及びレベルを決定した。例示的結果を表1に示す。本発明者らの卵巣腫瘍のmiRNAプロフィールは、以前(Iorioら,2007)に報告された変化を確証した。更に、本発明者らは、467miRNAのうち218は規格化された閾値(細胞及びエキソソームの両方におけるネガティブコントロールプローブシグナルの95番目のパーセンタイルに基づいて計算)を越えることを示した(表2)。218のポジティブmiRNAのうち、175のレベルは、卵巣腫瘍細胞とその対応するエキソソームとの間で有意には異ならなかった。比較により、12のmiRNAは細胞中により高い割合で存在する一方で、31のmiRNAはエキソソーム内で上昇したレベルで存在していた。
キソソーム由来の材料とを相関させるため、同じ患者の元の腫瘍細胞及び循環腫瘍エキソソームからRNA画分を単離した(図5)。マイクロアレイ分析を使用した腫瘍由来miRNAと末梢血由来エキソソームmiRNAとの間の比較は、これらが有意には異ならないことを示した
。更に、腫瘍由来miRNAのレベルは、末梢血由来エキソソームmiRNAのレベルと強い相関を示した(miR-21についてはr=0.77;miR-141についてはr=0.88;miR-200aについてはr=0.76;miR-200bについてはr=0.85;miR-200cについてはr=0.83;miR-203について
はr=0.85;miR-205についてはr=0.91;及びmiR-214についてはr=0.71)。
疾患の存在及びステージとのエキソソームmiRNAの相関
腫瘍エキソソームと循環エキソソームとの間の本発明者らの以前の比較を、進行したステージ患者で行った。特異miRNAと疾患の存在との関連を種々のステージにわたって比較
するために、エキソソームmiRNAの平均強度を決定した。ステージI、II及びIIIの患者間での8つの診断的miRNAの存在は、これらmiRNAのほとんどについて有意には異ならなかっ
た(図6)。miR-200c及びmiR-214は、ステージII及びIIIと比較して、ステージIを有する患者においてより低かった。しかし、全ての場合で、これらmiRNAは、良性疾患に由来す
るエキソソーム中で検出されたレベルを超えて有意に上昇していた。低分子RNA画分は正
常コントロールでは証明できなかった。miRNAの存在を評価する試みはネガティブであっ
た。
エキソソームmiRNAプロフィールの安定性
循環エキソソームmiRNAの測定は診断的であることが本明細書中で示されたので、次に
その安定性という技術的問題に取り組んだ。4℃で短時間(96時間まで)貯蔵された血清サンプルについてmiRNAプロファイリングを行い、強度を比較すると、分析した3つの診断
的miRNAにおいて有意差は観察されなかった(図7A)。血清サンプルを−70℃にてより長時
間貯蔵した場合、マイクロアレイにおけるこれらmiRNAの強度は有意には異ならなかった(図7B)。これら結果は、これらエキソソームmiRNAのレベルが安定で、貯蔵により有意には変化しないことを示している。
マイクロRNA発現プロファイリングは、現在信頼できる分子マーカーを欠いているガン(例えば卵巣ガン)の診断ツールとして使用することができる。以前の研究により、miRNA署名が卵巣ガンの診断マーカー又は予後マーカーとして役立ち得ることが示されているが、これらデータは組織標本における発現に基づいていた。本実施例は、循環腫瘍由来エキソソームとのmiRNAの結合を最初に証明するデータを提供する。以前の研究では、miRNAはヒト卵巣ガンにおいて異常に発現することが示されており、全体のmiRNA発現が正常組織とガン組織とを区別した(Iorioら,2007)。Luら(2005)の研究により、miRNA署名の使用がガン診断における重要な進歩として示されている。彼らの研究は、ガンのmiRNAベースの同定が、mRNA分類より、原発部位不明のガンを正確に診断することにおいて優れていることを示した。しかし、本明細書に開示の主題の前には、生検すべき塊(a mass to be biopsied)が存在しないとmiRNAプロファイリングを使用することはできなかった。
その結果、本発明者らのグループは、他のグループと共に、エキソソームの外部タンパク質成分及びエキソソーム曝露の生物学的結果に焦点を当てた。本実施例では、しかし、本発明者らは、驚くべきことに、循環腫瘍エキソソームと結合した低分子RNA種の存在を最
初に示す(図4)。この低分子RNAは、細胞由来RNAに関係する18S及び28Sを欠いている。更に、本明細書に開示のマイクロアレイ分析は、同定された低分子RNAの少なくとも一部がmiRNAであることを証明した。
腫瘍プロフィールを正確に反映することを示している。本発明者らはまた、肺ガン患者からの腫瘍由来エキソソームが対応する腫瘍miRNA署名と類似するmiRNAを含有していることを観察した(実施例6参照)。循環腫瘍由来エキソソームは、腫瘍マーカー(例えばEpCAM)
を用いて単離することができ、続いてエキソソーム結合miRNAの分析を行う。このアプロ
ーチは生検すべき塊を必要としないという点で非侵襲的であるので、エキソソームmiRNA
プロファイリングは、多くの異なるガンの検出用のスクリーニングツールとして利用することができる。予後(治療抵抗性を含む)を予測する腫瘍組織に関連する特異miRNA(例えば、let-7i、miR-16、miR-21及びmiR-214)が同定されている(Yangら,2008;Blowerら,2008)ので、腫瘍エキソソーム中のその存在はまた、予後の指標としてのエキソソームmiRNAプロファイリングの有用性を更に規定するために評価することができる。エキソソームmiRNAプロファイリングの使用は、このアプローチを無症状個体のスクリーニング及び疾患再発のモニタリングに拡張することができる。
対応する肺腫瘍から単離したmiRNAと比較した、末梢血由来肺腫瘍エキソソームとのmiRNAの相関
非小細胞肺ガン腫(NSCLC)の診断的miRNA署名を示す研究において、特異miRNAは正常肺
組織と比較して過剰発現した(miR-17-3p、miR-21、miR-106a、miR-146、miR-155、miR-191、miR-192、miR-203、miR-205、miR-210、miR-212及びmiR-214)。これら知見と患者由来の材料とを相関させるため、本明細書中上記で開示した図8に示す方法を用いて循環腫瘍エキソソーム及び元の腫瘍からmiRNA画分を単離し、プロファイリングした。mirVana miRNAアレイ標識キット(Ambion)を用いて、単離したmiRNAをCy3で3'末端標識した。miRNAプロファイリングは、467のヒト成熟型miRNA用のプローブを含有するマイクロアレイを使用して二連で行った。ハイブリダイゼーション後、GenePix 4000Aアレイスキャナーを用いてmiRNAアレイを走査し、GeneSpring 7.0ソフトウェア(Silicon Genetics, Redwood City, CA)を用いて生データを規格化及び分析した。miRNAの組の各々を、各サンプルに加えたコントロールマイクロRNA(Ambion)と比較して表現することによって規格化を行い、チップ間の比較を可能にした。
らないことが示された(図9)。このアプローチは、少なくとも12の特異miRNAがNSCLCで上昇していること及びこれら12特異miRNAの関連が循環腫瘍由来エキソソーム中に反映され
ていることを確証した。よって、これらmiRNAの評価は、腫瘍中のそのレベルの代理物と
して使用することができ、したがってガン(この特定の場合にはNSCLC)の存在を診断でき
る。
有害な妊娠転帰との相関のための胎盤由来エキソソームmiRNAプロファイリング
循環エキソソームが有害な妊娠転帰(例えば早産)を診断できるmiRNAを含んでなるかど
うかを決定するために、妊娠被検体の血清サンプルを収集し、磁性ビーズに結合した抗胎盤アルカリホスファターゼ抗体を用いて胎盤組織由来エキソソーム画分を単離した。本明細書中上記で開示した図8に示す方法を用いて、単離した循環胎盤由来エキソソームから及び同じ被検体の胎盤組織から直接miRNAを単離し、プロファイリングした。簡潔には、mirVana miRNAアレイ標識キットを用いて、単離したmiRNAをCy3で3'末端標識した。miRNAプロファイリングは、467のヒト成熟型miRNA用のプローブを含有するマイクロアレイを使用して二連で行った。ハイブリダイゼーション後、GenePix 4000Aアレイスキャナーを用いてmiRNAアレイを走査し、GeneSpring 7.0ソフトウェア(Silicon Genetics, Redwood City, CA)を用いて生データを規格化及び分析した。miRNAの組の各々を、各サンプルに加えたコントロールマイクロRNA(Ambion)と比較して表現することによって規格化を行い、チップ間の比較を可能にした。
単離したmiRNAである。DT2サンプルは、出産予定日まで身ごもった婦女子の胎盤由来エキソソームから単離したmiRNAである。DT3サンプルは、早産した(32週間の妊娠期間前の出
産)婦女子の胎盤組織から単離したmiRNAである。DT4サンプルは、早産した婦女子の胎盤
由来エキソソームから単離したmiRNAである。影付きの細胞は、試験したmiRNAのサンプル中での存在を示す。
及びこれらデータが胎盤からのmiRNAのプロフィールと相関することを示している。この
ように、胎盤細胞により産生されたエキソソームから単離したmiRNAのmiRNAプロフィールは、有害な妊娠転帰の診断目的に利用することができる。
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Claims (19)
- a.被検体から得た生物学的サンプル又は一連の生物学的サンプルの各々から、マイクロRNA(miRNA)を含むエキソソームを単離し;
b.単離したエキソソーム中の1又はそれより多くのmiRNAの量を決定し;
c.前記1又はそれより多いmiRNAの量を1又はそれより多いmiRNAコントロールレベルと比較することを含んでなり、
前記1又はそれより多いmiRNAコントロールレベルに対する前記エキソソームに由来する前記1又はそれより多いmiRNAの量の差を使用して検出、特徴又は評価を決定する、被検体においてガンを検出若しくは特徴決定するか又はガンの治療効力及び/若しくは進行を評価する方法。 - a.被検体から得た生物学的サンプル又は一連の生物学的サンプルの各々から、マイクロRNA(miRNA)を含むエキソソームを単離し;
b.単離したエキソソーム中の1又はそれより多くのmiRNAの量を決定し;
c.前記1又はそれより多いmiRNAの量を1又はそれより多いmiRNAコントロールレベルと比較することを含んでなり、
前記1又はそれより多いmiRNAコントロールレベルに対する前記エキソソームに由来する前記1又はそれより多いmiRNAの量の差を使用して検出、特徴又は評価を決定する、被検体において有害な妊娠転帰を検出若しくは予知するか又は有害な妊婦転帰のリスクを評価する方法。 - 前記ガンが、卵巣ガン、子宮頸ガン、乳ガン、子宮内膜ガン、結腸ガン、前立腺ガン、肺ガン、黒色腫及び膵臓ガンからなる群より選択されるガンである請求項1に記載の方法。
- 前記被検体がヒトである請求項1又は2に記載の方法。
- 前記生物学的サンプル又は前記一連の生物学的サンプルの各々が、乳、血液、血清、血漿、腹水、嚢胞液、胸膜液、腹膜液、脳脊髄液、涙、尿、唾液、痰又はこれらの組合せを含む請求項1又は2に記載の方法。
- 前記エキソソームの単離が、サイズ排除クロマトグラフィーを使用してエキソソームを単離することを含んでなる請求項1又は2に記載の方法。
- 前記エキソソームの単離が、エキソソームを含むクロマトグラフィー画分を遠心分離することを更に含んでなる請求項6に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー画分が空隙容量画分を含む請求項7に記載の方法。
- 前記エキソソームがガン由来エキソソームであり、該ガン由来エキソソームが抗ガン抗原抗体を用いる免疫吸着捕捉により非ガン由来エキソソームから分離される、請求項1に従属する場合の請求項6〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗ガン抗原抗体が抗上皮細胞接着分子(抗EpCAM)抗体である請求項9に記載の方法。
- 前記1又はそれより多いmiRNAの量の決定が、1又はそれより多いmiRNAを標識すること、又は各々が1又はそれより多いmiRNAと選択的に結合する1又はそれより多いポリヌクレオチドプローブで該1又はそれより多いmiRNAを捕捉すること、又はリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を用いて1又はそれより多いmiRNAの量を定量すること、又は前記エキソソーム中のmiRNAの総量を決定することを含んでなる請求項1又は2に記載の方法。
- 前記方法がガンを検出又は特徴決定するか又はガンの治療効力及び/又は進行を評価するために使用され、前記1又はそれより多いmiRNAが、下記の表1:
前記方法が有害な妊娠転帰を検出又は特徴決定するか又は有害な妊娠転帰のリスクを評価するか又は有害な妊娠転帰の治療効力及び/又は進行を評価するために使用され、前記1又はそれより多いmiRNAが、表3:
- 前記決定した1又はそれより多いmiRNAの量に基づいて、ガン又は有害な妊娠転帰の治療法を選択するか、ガン又は有害な妊娠転帰の治療法を改変するか、ガン又は有害な妊娠転帰の治療効力を評価するか、或いはガン又は有害な妊娠転帰の進行を評価することを更に含んでなる請求項1又は2に記載の方法。
- 前記一連の生物学的サンプルが、ガン治療の開始前及び/又はガン発生の前に収集した第1の生物学的サンプルと、ガン治療の開始後又はガン発生の後に収集した第2の生物学的サンプルとを含む請求項1に記載の方法。
- 前記ガンの特徴決定が、ガンのタイプ、悪性度及び/又はステージを決定することを含んでなる請求項1に記載の方法。
- 前記有害な妊娠転帰が、早期破水、子癇前症、早産、胎内発育遅延及び再発性妊娠喪失からなる群より選択される疾患である請求項2に記載の方法。
- 前記コントロールが、
a.前記疾患を有していない被検体からの少なくとも1つのmiRNA遺伝子産物のレベル
b.前記疾患を示していない被検体のサンプルからの少なくとも1つのmiRNA遺伝子産物のレベル
からなる群より選択される請求項1又は2に記載の方法。 - a.ガン又は有害な妊娠転帰を有しているか又は有すると疑われる被検体由来のサンプルから単離したmiRNAを標識し;
b.前記miRNAをmiRNAアレイにハイブリダイズさせ;
c.前記アレイへのmiRNAのハイブリダイゼーションを測定し;
d.参照と比較してガン又は有害な妊娠転帰を代表するサンプル中で異なって発現するmiRNAを同定すること
を含む、miRNA発現とガン又は有害な妊娠転帰との間の相関を特定することを更に含んでなる請求項1又は2に記載の方法。 - 前記異なって発現するmiRNAの同定が、前記サンプルのmiRNAプロフィールを作成し、miRNAプロフィールを評価して該サンプル中のmiRNAが正常サンプルと比較して異なって発現するかどうかを決定することを含んでなる請求項18に記載の方法。
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