CN102864224A - 一种血清microRNAs试剂盒及其应用 - Google Patents
一种血清microRNAs试剂盒及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102864224A CN102864224A CN2012103336513A CN201210333651A CN102864224A CN 102864224 A CN102864224 A CN 102864224A CN 2012103336513 A CN2012103336513 A CN 2012103336513A CN 201210333651 A CN201210333651 A CN 201210333651A CN 102864224 A CN102864224 A CN 102864224A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- serum
- mir
- cervical cancer
- mirnas
- centrifugal
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 title claims abstract description 46
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 title claims abstract description 24
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 title abstract 2
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims abstract description 31
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 claims abstract description 21
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 claims abstract description 21
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 claims abstract description 21
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 108091059199 miR-200a stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 108091062762 miR-21 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 108091041631 miR-21-1 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 108091044442 miR-21-2 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 108091085564 miR-25 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 108091080167 miR-25-1 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 108091083056 miR-25-2 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 108091088477 miR-29a stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 108091029716 miR-29a-1 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 108091092089 miR-29a-2 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 108091066559 miR-29a-3 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 108091039994 miR-486 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 abstract 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 19
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 12
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 11
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 6
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 3
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 210000003677 hemocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229940000351 hemocyte Drugs 0.000 description 2
- 206010025482 malaise Diseases 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 1
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000002000 scavenging effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于生物技术制药领域，具体涉及一种血清microRNAs试剂盒及其应用。本发明在基因组范围内通过solexa测序筛选出在正常人和患者血清中表达存在明显差异的一组miRNAs，然后利用RT-qPCR法进行了两个阶段独立样本的复筛和验证,筛出了由5个miRNAs（miR-21,miR-29a,miR-200a,miR-25和miR-486-5p）组成的宫颈癌血清指纹谱。本发明通过ROC曲线分析，发现筛选出的这组血清miRNAs标志物对于诊断宫颈癌具有较高的灵敏度和特异性。由此制备了一种能用于宫颈癌早期检测的诊断试剂盒。所述组合、方法能够用于宫颈癌的早期检测，具有高特异性、高效性、高灵敏度、检测成本低、取材方便、样本易存放等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术制药领域，具体涉及一种血清microRNAs试剂盒及其应用。
背景技术
宫颈癌是女性常见恶性肿瘤之一，是指发生在子宫阴道部及宫颈管的恶性肿瘤。宫颈癌的发病率仅次于乳腺癌，居于女性肿瘤发病率的第二位，全球每年约有50万宫颈癌新发病例，占所有癌症新发病例比重高达5%，我国每年新发宫颈癌病例约为13.2万，属于高发区。宫颈癌的死亡率也很高，全球每年约有23万女性死于宫颈癌，我国每年约有3万女性死于宫颈癌。采取有效的诊断方法，早期诊断早期治疗，能够有效降低癌症的发生率，提高治愈率。
MicroRNAs(miRNA)是一类长度约为22nt的非编码单链小分子RNA，miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇等形式存在于基因组中，并且大部分定位于基因间隔区，在进化上高度保守，MiRNA的转录独立于其他基因，不具有开放阅读框（ORF）所以不翻译成蛋白质，而是在体内多种生理过程中起到调控作用，包括细胞增殖、分化、凋亡等。本实验室前期通过系统的研究发现miRNAs稳定地存在于哺乳动物的血清中。血清中稳定存在多种miRNA的发现也引起了人们对其来源和产生方式的研究和探索。目前认为血清中的miRNA与相关组织的分泌密切相关。
MiRNAs具有内在的调控基因表达的功能，提示那些在肿瘤中特异性表达的miRNAs可能在肿瘤的发生和发展的过程中发挥特殊的作用，近期，在对肿瘤患者血清miRNAs变化机制的研究中发现，在肿瘤中高表达的miRNA可能发挥与癌基因相似的作用，而在肿瘤中低表达的miRNA可能与抑癌基因有相似的作用，这对于肿瘤的临床诊断、治疗方案的选择和预后具有指导意义。
与组织检测方法相比，以血清作为检测样本具有取材方便、基本无创伤性、可连续体外检测等优点。构建肿瘤特异性血清microRNA表达谱，有望成为一种基于血清检测癌症的分子标记。
发明内容
本发明的需要解决的问题是通过检测宫颈癌血清中miRNA的表达水平,筛选并鉴定能够作为宫颈癌检测标志物的血清miRNAs, 进行血清miRNA检测试剂盒的研制。
1．本发明首先在基因组范围内通过solexa测序筛选出在正常人和患者血清中表达存在明显差异的一组miRNAs；然后利用RT-qPCR法进行了两个阶段独立样本的复筛和验证；最后利用ROC曲线法分析其灵敏度和特异性。
2．血清采集均严格按照如下步骤进行：收集患者和正常人全血，在室温下3000g离心10min去除血细胞并收集血清，然后将收集的血清在4℃条件下，12000g离心15min，进一步去除残留的血细胞，离心后收集血清置于-80℃冰箱保存待用。
3．一组由5种血清miRNAs组成的宫颈癌血清诊断标志物，分别是miR-21, miR-29a, miR-200a, miR-25和miR-486-5p。ROC曲线分析结果显示，对比传统血清SCC和CA125检测，血清miRNAs标志物具有高灵敏度和特异性。
本发明与现有技术相比其有益效果是：筛选出的疾病特异血清miRNA，进行血清miRNA检测试剂盒的研制，该芯片可以识别宫颈癌病人的发病及分级情况，实现宫颈癌早期诊断的目的。本发明的主要创新点包括：血清miRNA是一种新型生物标志物；血清miRNA监测是一种系统、全面的检测试剂盒，与组织检测方法相比，以血清作为检测样本具有取材方便、基本无创伤性，本发明采用严密、多阶段的验证和评价体系。
四、附图说明
图1 为5种血清miRNAs在宫颈癌患者和正常人中表达存在明显差异；
图2 由5种血清miRNAs组成的宫颈癌标志物的ROC曲线分析结果
图3 为本发明实验设计流程
五、具体实施方式
1、进行Solexa测序实验时，我们分别混合了20例宫颈癌患者（每人2ml）和20位健康对照（每人2ml）的血清。每组混合血清的总RNA是严格按照Trizol LS Reagent(Invitrogen, Carlsbad, CA)的人工操作指南提取的。
1) 将收集的血清样本包括AMI组和正常对照组的血清分别进行混合，得到两组混合血清，体积均为40 ml，分别提取混合血清RNA。
2) 按混合血清体积（均为40 ml）2:1的比例加入TRIzol，用力震荡均匀后，室温静置15min，然后加入TRIzol 1/5体积的氯仿，用力震荡均匀，室温静置15min。
3) 静置结束后10000 g，4℃，离心15 min，离心毕收集上清。
4) 将3）中收集的上清置于除酶管子中，加入上清等体积的水饱和酚，用力震荡均匀后10000 g，4℃，离心5 min。
5) 离心毕，收集上清，加入上清1/2体积的水饱和酚和1/2体积的氯仿，用力震荡均匀后10000 g，4℃，离心5 min。
6) 离心毕，收集上清，加入上清等体积的氯仿，用力震荡均匀后10000 g，4℃，离心5 min。
7) 离心毕，收集上清，加入上清等体积的异丙醇，用力震荡均匀后在冰上沉淀 1 h后10000 g，4℃，离心30 min。
8) 离心毕，去上清，留沉淀，先用3 ml 75%的乙醇逐个清洗管子，然后用3 ml 的TRIzol清洗乙醇洗涤后的管子。乙醇清洗后分装到除酶的2 ml的离心管后12000 g，4℃，离心15 min。
9) 离心毕，取沉淀，用8）中洗管壁的TRIzol分别再次完全溶解沉淀，加入Trizol 1/5体积的氯仿，混匀室温静置10 min后12000 g，4℃，离心15 min。
10) 离心毕，取上清，加入上清等体积异丙醇，冰上静置15 min后12000 g，4℃，离心15 min。
11) 离心毕，去上清，留沉淀，用1 ml 75％的DEPC乙醇加入沉淀中涡漩后12000 g，4℃，离心15 min。
12) 离心毕，去上清，留沉淀，待沉淀干燥后加50 ul DEPC水至RNA完全溶解，测定RNA浓度。
2、在做RT-qPCR实验时，我们用酚/氯仿抽提法在200μl血清中提取RNA。
13) 将250 μl血清放入已除酶的1.5 ml离心管中，加入250 μl DEPC水稀释，涡旋混匀。
14) 混匀毕，加入250 μl水饱和酚并剧烈震荡，室温静置两分钟，然后加入250 μl 氯仿，剧烈震荡在室温静置5 min后4℃，12000 g，离心5 min。
15) 离心毕，取上清，加入上清1/10体积的醋酸钠溶液（C=3M/L，pH=5.3）并加入上清两倍体积的异丙醇，涡旋混匀后-20℃静置30 min，4℃，12000 g离心20 min。
16) 离心毕，去上清，留RNA沉淀，加入1 ml 75% DEPC乙醇，涡旋混匀，洗涤RNA沉淀，洗涤毕4℃，12000 g，离心20 min。
17) 离心毕，去上清，留沉淀，在室温下晾干沉淀约10 min后加入20 μl DEPC水，溶解RNA沉淀。待RNA完全溶解之后放入-80℃低温冰箱留存待用。
3、本文使用TaqMan探针引物(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 利用RT-qPCR技术定量分别检测特异性miRNA和基因的表达。针对每一miRNA均设计了一个含相同茎环结构（stem-loop structure）的基因特异性反向引物，将所有的基因特异性反向引物混合，再进行逆转录，就可以得到含相同茎环结构的总cDNA混合物，最后再进行PCR反应。茎环结构设计可以杜绝基因特异性反向引物之间的非特异性反应的干扰，同时由于茎环序列一致，所以PCR时反向引物是通用的，正向引物则要拖长一个尾巴以增加Tm值，通过这些实验设计的辅助，就可以成功扩增22bp左右的成熟体miRNA了。
Claims (2)
1.一种血清microRNAs试剂盒，其特征是由5种血清miRNAs组成的宫颈癌血清检测标志物，5种标志物为miR-21, miR-29a, miR-200a, miR-25和miR-486-5p。
2. 权利要求1所述血清microRNAs试剂盒在宫颈癌细胞检测中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2012103336513A CN102864224A (zh) | 2012-09-11 | 2012-09-11 | 一种血清microRNAs试剂盒及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2012103336513A CN102864224A (zh) | 2012-09-11 | 2012-09-11 | 一种血清microRNAs试剂盒及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102864224A true CN102864224A (zh) | 2013-01-09 |
Family
ID=47443349
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2012103336513A Pending CN102864224A (zh) | 2012-09-11 | 2012-09-11 | 一种血清microRNAs试剂盒及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102864224A (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003057914A2 (en) * | 2002-01-07 | 2003-07-17 | Norchip A/S | METHOD FOR DETECTING HUMAN PAPILLOMAVIRUS mRNA |
| WO2009036332A1 (en) * | 2007-09-14 | 2009-03-19 | Asuragen, Inc. | Micrornas differentially expressed in cervical cancer and uses thereof |
| CN101755208A (zh) * | 2007-07-25 | 2010-06-23 | 路易斯维尔大学研究基金会公司 | 作为诊断标记物的外来体相关微rna |
| CN101988062A (zh) * | 2009-07-30 | 2011-03-23 | 江苏命码生物科技有限公司 | 宫颈癌检测标记物及其检测方法、试剂盒和生物芯片 |
-
2012
- 2012-09-11 CN CN2012103336513A patent/CN102864224A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003057914A2 (en) * | 2002-01-07 | 2003-07-17 | Norchip A/S | METHOD FOR DETECTING HUMAN PAPILLOMAVIRUS mRNA |
| CN101755208A (zh) * | 2007-07-25 | 2010-06-23 | 路易斯维尔大学研究基金会公司 | 作为诊断标记物的外来体相关微rna |
| WO2009036332A1 (en) * | 2007-09-14 | 2009-03-19 | Asuragen, Inc. | Micrornas differentially expressed in cervical cancer and uses thereof |
| CN101988062A (zh) * | 2009-07-30 | 2011-03-23 | 江苏命码生物科技有限公司 | 宫颈癌检测标记物及其检测方法、试剂盒和生物芯片 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103882119B (zh) | 用于检测SFRP2基因CpG岛甲基化的引物、方法和试剂盒 | |
| CN104152452B (zh) | 一种与肝癌相关的血液miRNA标志物及其应用 | |
| CN104152567B (zh) | miRNA-199a在制备诊断试剂盒中的用途 | |
| CN103173448A (zh) | 早期肺腺癌miRNA特异表达谱及其反转录引物和用途 | |
| CN101824464A (zh) | miRNA表达谱在预测肺癌病人对放射治疗敏感性方面的应用 | |
| CN104388561A (zh) | 肝癌生物标记物及其用途 | |
| CN105177174A (zh) | 用于结肠癌诊断的miRNA生物标志物及检测试剂盒 | |
| CN103074430B (zh) | 检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用引物、试剂盒及方法 | |
| KR20130029079A (ko) | 플라즈마 마크로알엔에이로 구성된 간암 진단 마커 및 간암 진단의 새로운 방법 | |
| CN102839179B (zh) | 一种鉴别肺癌亚型的microRNA标志物及其应用 | |
| CN101914526A (zh) | 血清或血浆中微小rna的提取方法 | |
| CN110699457B (zh) | 检测肺癌的引物组和试剂盒 | |
| CN109593852B (zh) | 一种与鼻咽癌辅助诊断相关的血清miRNA标志物及其应用 | |
| CN102876788B (zh) | 一种肺癌骨转移荧光定量pcr检测试剂盒 | |
| CN102876789B (zh) | 一种检测肺癌骨转移试剂盒 | |
| CN110241211A (zh) | 诊断结直肠癌的分子组合标志物及检测试剂盒 | |
| CN110257514A (zh) | 一种新的食管癌血液miRNA标志物及其应用 | |
| CN102864224A (zh) | 一种血清microRNAs试剂盒及其应用 | |
| CN109266751B (zh) | 用于鼻咽癌诊断的生物标志物组合以及应用 | |
| CN107043770B (zh) | 一组结核病相关的外周血淋巴细胞miRNA及其应用 | |
| CN109266750B (zh) | 用于鼻咽癌诊断的生物标志物以及应用 | |
| CN103173449A (zh) | 与食管癌术后早期复发和预后相关的miRNA标志物及其应用 | |
| CN104152566B (zh) | miRNA-26a的用途 | |
| CN109536612B (zh) | 一种与鼻咽癌辅助诊断相关的血浆miRNA标志物及其应用 | |
| CN103571929A (zh) | 无损检测细胞miRNA的表达量及确定细胞类型与状态的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20130109 |