KR102242639B1 - 간 섬유화 진단용 바이오마커 miRNA4668-5p - Google Patents

간 섬유화 진단용 바이오마커 miRNA4668-5p Download PDF

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KR102242639B1
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연종은
이영선
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고려대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 miRNA 4668-5p을 간 섬유화 진단을 위한 바이오마커로 제공할 함으로써 간 생검을 대체할 수 있고, 특히, 비알코올성 지방간 환자에서 나쁜 예후를 보이는 진행된 섬유화의 조기 진단을 통해 조기 치료가 가능하게 한다. 아울러, 본 발명은 miRNA 4668-5p의 발현 수준 조절을 통해 간 섬유화의 예방 또는 치료가 가능하게 하며, 간 섬유화 약물 개발을 위한 방법을 제공하여 높은 부가가치를 창출할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

간 섬유화 진단용 바이오마커 miRNA4668-5p {Biomaker miRNA4668-5p for diagnosing liver fibrosis}
혈액 또는 혈청의 생물학적 시료로부터 비침습적 체외진단을 위한 간 섬유화 진단용 바이오마커 조성물 등에 관한 것이다.
비알코올 지방간질환은 영상의학 검사나 간 조직검사에서 간 조직에 지방침착이 나타나는 경우, 이러한 지방간의 원인으로서 알코올, 약물 및 다른 요인들이 배제되었을 때 진단할 수 있는 질환이다. 병리 기전상 정상 간이 비알코올 지방간에서 비알코올 지방간염을 거쳐 비알코올 지방간연관 간경변증으로 진행할 수 있는데 비알코올 지방간질환은 이러한 일련의 질환을 모두 포괄하는 용어이다. 국내 연구에서의 비알코올 지방간질환유병률은 진단 방법에 따라 큰 차이가 있다. 비알코올 지방간질환을 간 조직검사로 확진할 때 유병률은 51.4%라는 연구 결과가 있으며 초음파검사로 진단한 경우 그보다 낮은 16~33%정도로 나타난 바 있다.
비만(특히 복부비만), 제2형 당뇨병, 이상지질혈증, 대사증후군 등이 비알코올 지방간질환의 독립적인 위험인자인 것으로 확인된다. 이는 인슐린저항성과 간의 지방대사장애가 선행되면서 비알코올 지방간질환이 시작된다는 병리 기전과 맥을 같이 한다. 또한, 비알코올 지방간질환환자는 각종 대사 질환을 함께 갖고 있는 경우가 많고 당뇨병과 심혈관계 질환의 위험도가 높다는 대규모 코호트 연구 결과들이 있다. 그러나 비알코올 지방간질환이 대사증후군처럼 제2형 당뇨병과 심혈관계 질환의 예측인자가 될 수 있는지에 대해서는 아직 명확하지 않다.
간 조직검사는 비용이 비싸고, 해석하는데 있어서 전문가가 필요하며, 합병증의 위험이 있기 때문에, 2018년 미국간학회 가이드라인에서는 비알코올 지방간질환선별검사로서 간조직검사를 권고하지 않고, 지방간염이나 진행된 간섬유화증이 의심되는 경우, 다른 질환의 배재가 필요한 경우에만 권고하고 있다. 하지만, 비알코올 지방간질환환자군은 정상 대조군에 비해 전체 사망률이 높고, 특히 지방간염으로 진행한 경우 심혈관 질환 사망률이 증가한다. 비음주자들의 건강검진에서 복부 영상검사상 지방간질환이 관찰되고 간기능 검사가 이상을 보이는 경우가 많으므로 비알코올 지방간질환의 가능성을 염두에 두고 진단과 치료법에 대해 생각해볼 필요가 있다.
비알코올 지방간질환은 조직학적인 염증이나 섬유화 여부가 예후에 큰 영향을 주기 때문에 아직까지는 간 조직검사가 기준 진단 검사이다. 그러나, 간 조직검사가 갖고 있는 고비용, 침습성 및 합병증 발생의 위험 때문에 일차의료에서 이용하기에는 무리가 있다. 또한, 적은 간 조직으로 전체 간 상태를 반영할 수 없고 아직까지 단일 병리 진단 기준이 없으며 병리 검사자 간의 진단 일치도가 낮을 수 있다. 그러므로 간 조직검사 대신 영상의학 검사와 생화학 검사를 통해 비알코올 지방간질환의 조직학적 중증도를 평가하려는 노력이 많이 진행되어 왔다.
이에, 비알코올 지방간질환의 진단과 중증도 구분을 위한 비침습적인 방법에 대한 관심이 증가하고 있으나, miRNA를 이용한 연구는 아직도 많이 부족한 실정이다. 종래 PCR을 이용하여 miRNA 분석을 하고, 이를 진단에 이용하고자 하는 시도가 있었으나, 수 천개의 miRNA중 일부를 선택하여 PCR을 통하여 분석한 결과라는 한계가 있다. 또한, 국내 연구진에 의하여 비알코올성 지방간염 진단을 위한 특허가 출원되어 있으나, 이는 동물실험을 통한 결과라는 한계가 있다.
KR 10-2013-0070347 KR 10-2013-0070349
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 혈액 또는 혈청 시료의 miRNA 4668-5p를 간 섬유화 진단용 바이오마커로 제공하고, 간 섬유화 진단용 키트, 간 섬유화 진단방법, 간 섬유화 치료약제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 miRNA 4668-5p의 발현 억제제를 포함하는 간 섬유화 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 miRNA 4668-5p을 포함하는 간 섬유화진단용 바이오마커를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 miRNA 4668-5p는 서열번호 1 (AGGGAAAAAAAAAAGGAUUUGUC)의 염기서열을 포함하거나 이로 이루어진 것일 수 있으며, 혈액 또는 혈청 시료로부터 분리되는 엑소좀 유래의 것으로서 상기 진단은 비침습적 체외진단일 수 있다.
또한, 본 발명은 혈액 또는 혈청 시료로부터 miRNA 4668-5p를 검출할 수 있는제제를 포함하는 간 섬유화 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 miRNA 4668-5p는 엑소좀 유래의 miRNA일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 제제는 miRNA 4668-5p에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 및/또는 프로브일 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 간 섬유화 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다:
(1) 개체로부터 분리된 혈액 또는 혈청 시료에서 엑소좀을 분리하는 단계;
(2) 상기 엑소좀에서 miRNA 4668-5p의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(3) 상기 (2) 단계에서 측정된 miRNA 4668-5p의 발현 수준을 정상 대조군의 발현 수준과 비교하여 정상 대조군의 발현 수준보다 높은 경우 간 섬유화가 진행된 것으로 판정하는 단계.
또한, 본 발명은 상기 정보제공방법의 각 단계를 시계열적으로 포함하는 간 섬유화 진단방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 (2) 단계에서 miRNA 4668-5p의 발현 수준 측정은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩에 의해 수행되는 것 일 수 있다.
또한, 본 발명은 miRNA 4668-5p의 발현을 억제하는 제제를 포함하는 간 섬유화 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 miRNA 4668-5p의 발현을 억제하는 제제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 간 섬유화 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 간 섬유화 예방 또는 치료 약제의 제조를 위한 miRNA 4668-5p의 발현을 억제하는 제제의 용도를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 miRNA 4668-5p의 발현을 억제하는 제제는 siRNA, 앱타머(aptamer), 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
또한, 본 발명은 (1) 간 세포에 후보물질을 처리하고 miRNA 4668-5p의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (2) miRNA 4668-5p의 발현 수준이 감소한 경우 상기 후보물질을 간 섬유화 치료제로 선정하는 단계;를 포함하는 간 섬유화 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 (1) 단계의 간 세포는 인간 간성상세포(hepatic stellate cell)일 수 있으며, 유전공학적으로 miRNA 4668-5p의 과발현이 유도된 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 간 섬유화는 비알코올성 지방간 환자에서 진행된 섬유화일 수 있다.
본 발명은 비침습적 생물학적 시료로부터 간 섬유화 진행 정도를 확인할 수 있는 바이오마커를 제공함으로써 간 조직검사에 소요되는 의료 비용을 절감할 수 있고, 조직검사에 따른 합병증 위험을 감소시킬 수 있다.
또한, 비알코올 지방간질환에서 나쁜 예후를 보이는 진행된 섬유화를 조기에진단하여 환자의 진료 계획 수립에 도움이 되고 환자의 예후 호전에 크게 기여할 것으로 기대된다.
또한, 본 발명은 상기 바이오마커 발현을 억제하여 간 섬유화를 예방 또는 치료에 기여할 수 있고, 상기 바이오마커의 발현 수준을 조절할 수 있는 약물을 간 섬유화 예방 또는 치료용 약제로 제공할 수 있는바, 간 섬유화 약물 개발에 새로운 플랫폼을 제공할 수 있다.
도 1은 진행된 간섬유화 (F3,4) 군과 진행되지 않은 간섬유화 (F0,1,2) 군의 miRNA 발현 heat map이다.
도 2는 LX-2 세포주에 miRNA 4668-5p 발현을 억제 (A), 과발현 (B) 했을 때, 섬유화 유전자 발현 수준 변화를 확인한 도면이다.
본 발명자들은 간 조직검사를 대체할 수 있는 비알코올 지방간질환의 진단과 중증도 구분을 위한 비침습적 방법에 대해 예의 연구한 결과 본 발명을 완성하였다.
구체적으로, 본 발명자들은 비알코올 지방간질환으로 진단된 환자의 혈청 샘플에서 엑소좀을 분리한 후 엑소좀에서 miRNA의 발현 프로파일을 제작하고, 섬유화 stage 0~2로 진단된 25명의 환자와 섬유화 stage 3, 4로 진단된 16명의 환자 프로파일을 비교 분석하였다. 그 결과, 통계적으로 유의한 발현량의 차이를 나타내는 61개의 miRNA를 확인하였으며, 그 중에서 miRNA4668-5p는 특히 진행된 간섬유화군과 진행되지 않은 간섬유화군 간에 가장 큰 발현의 차이를 나타내어, miRNA4668-5p을 간섬유화 진행 정도를 판별할 수 있는 바이오마커로 이용할 수 있음을 확인하였다(실시예 1 참조).
이에, 본 발명은 miRNA4668-5p를 비알코올성 지방간 환자의 섬유화 진행 정도 판별을 위한 바이오마커로 제공한다.
상기 miRNA4668-5p은 엑소좀 유래의 것일 수 있다. 엑소좀(exosome)이란 30~100nm의 크기를 갖는 작은 세포막성 수포로서 다양한 세포에서 분비되며, 혈액, 혈청, 소변, 또는 타액 등과 같은 체액에서 발견된다.
이어서, 보다 구체적으로 본 발명자들은 miRNA4668-5p의 발현 증가가 간 섬유화에 미치는 영향을 확인하기 위하여 인간 간성상세포에서의 miRNA4668-5p의 발현을 조절하고 섬유화 진행과 관련된 유전자 TGFb1, Col1a1, 및 a-SMA의 발현 수준 변화를 관찰하였다. 그 결과, miRNA 4668-5p의 과발현을 유도한 경우 섬유화 진행과 관련된 유전자의 발현이 증가하고, 반대로 miRNA 4668-5p의 발현을 억제하는 경우 섬유화 진행과 관련된 유전자의 발현이 감소함을 확인하였다(실시예 2 참조).
상기 결과로부터, 간성상세포에 miRNA 4668-5p의 처리가 간 섬유화 진행을 유도함을 알 수 있었으며, miRNA 4668-5p의 작용을 억제함으로써 간 섬유화를 예방 또는 치료할 수 있음을 알 수 있다.
이에, 본 발명은 miRNA4668-5p의 간 섬유화 진단을 위한 바이오마커로 제공할 수 있으며, 상기 miRNA4668-5p을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 간 섬유화 진단 키트를 제공할 수 있다.
본 발명에서 “진단”이란 특정 질병 또는 질환에 대한 한 개체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 개체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 개체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 개체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함한다.
또한, 본 발명의 간 섬유화 진단 키트는 생물학적 시료로부터 엑소좀 유래의 miRNA 4668-5p를 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함할 수 있으며, 상기 제제란 miRNA 4668-5p의 발현 수준을 확인함으로써 마커의 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미한다. 본 발명에서 miRNA 4668-5p 발현 수준 측정 제제로서 miRNA 4668-5p에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머, 프로브, 및/또는 항체를 사용할 수 있으며, 유전자 발현 정도를 측정하는데 이용되는 공지의 방법, 예를 들면 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하거나, 프로브를 이용한 혼성화 반응을 통하여 실시하여 miRNA 4668-5p의 발현 수준을 측정할 수 있다. 또한, 상기 키트에는 상기 측정 제제 이에외도 검출을 용이하게 하는 당업계에 공지된 여러 도구, 시약, 예를 들어 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 안정화제 등이 포함될 수 있다.
본 발명에서 생물학적 시료는 비침습적 시료일 수 있으며, 상기 비침습적 시료는 혈액, 혈청, 소변, 또는 타액일 수 있고, 바람직하게는 혈액 또는 혈청일 수 있고, 더욱 바람직하게는 혈청일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 miRNA 4668-5p는 이를 구성하는 올리고뉴클레오티드의 작용성 등가물, 예를 들어, miRNA 4668-5p 올리고뉴클레오티드의 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, 마이크로RNA-1236 핵산분자와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants) 및 모방체(mimic)를 포함하는 개념이다.
본 발명에서 "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 상기 miRNA에 상보적으로 결합하여 발현을 억제하는 염기서열로서, 이에 제한되지는 않으나 antisenseRNA, antagonist mRNA를 포함한다.
본 발명에서 “프라이머”는 짧은 자유 수산화기를 가지는 핵산서열로서 상보적인 템플레이트와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산서열을 말한다. 본 발명의 프라이머는 예를 들면, 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법과 같은 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
본 발명에서 “프로브”는 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 수개 내지 수백개의 염기로 이루어진 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어 특정 mRNA의 존재유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드 프로브, 단쇄 DNA 프로브, 이중쇄 DNA 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고 비오틴, FITC, 로다민, DIG 등으로 표지되거나 방사선 동위 원소 등으로 표지될 수 있다.
본 발명에서 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 예로서 RT-PCR 키트의 경우, 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 (1) 개체로부터 분리된 혈액 또는 혈청 시료에서 엑소좀을 분리하는 단계; 및 (2) 상기 엑소좀에서 miRNA 4668-5p의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하는 간섬유화 진단을 위한 정보제공방법을 제공할 수 있으며, 상기 (2) 단계에서 측정된 miRNA 4668-5p의 발현 수준을 정상 대조군의 발현 수준과 비교하여 정상 대조군의 발현 수준보다 높은 경우 간 섬유화가 진행된 것으로 진단할 수 있다.
상기 mRNA 발현 수준 측정은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), 정량적 중합효소반응(quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블롯팅(Northern blotting), 또는 DNA 칩 방식으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 간성상세포에서 miRNA 4668-5p의 억제를 통해 간 섬유화와 관련된 유전자의 발현 감소를 유도할 수 있음을 확인하였는바, miRNA 4668-5p의 발현 억제제를 포함하는 간 섬유화 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
또한, 간 세포에 후보물질을 처리하고 miRNA 4668-5p의 발현 수준을 측정하고, miRNA 4668-5p의 발현량이 감소하는 경우 상기 후보물질을 간 섬유화 치료제로 선정하는 단계를 포함하는 간 섬유화 치료제의 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 miRNA의 발현 억제제는 miRNA 4668-5p에 특이적인 억제제를 사용하는 것을 특징으로 하며, 상기 발현 억제제는 miRNA4668-5p의 발현량을 감소시키거나 분해를 촉진함으로써 세포 내 miRNA 4668-5p의 수준을 감소시키거나 miRNA 4668-5p와 특이적으로 결합하여 그 활성을 감소시키는 것일 수 있으며, siRNA, 앱타머(aptamer), 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 화합물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다. 상기 화합물은 항산화제, 세포성장에 영향을 미치는 물질 및 세포신호전달물질 중 miRNA의 발현을 억제시키는 화합물이라면 어느 것이든지 사용할 수 있다. 하지만 이에 한정되지 않으며 miRNA 4668-5p의 발현을 억제하는 물질이라면 어느 것이든지 사용할 수 있다.본 발명에서 "siRNA"는 이중가닥의 RNA가 다이서에 의해 절단되어 생성되는 21-25 뉴클레오티드 크기의 작은 RNA 조각으로 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 발현을 억제하는 것을 말한다. 본 발명의 목적상 miRNA-4668-5p에 특이적으로 결합하여 상기 miRNA의 발현을 억제하는 것을 의미한다. siRNA는 화학적으로 또는 효소학적으로 합성될 수 있다. siRNA의 제조방법으로는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, siRNA를 직접 화학적으로 합성하는 방법, 시험관 내(in vitro) 전사를 이용한 siRNA의 합성법, 시험관 내(in vitro) 전사에 의해 합성된 긴 이중-가닥 RNA를 효소를 이용하여 절단하는 방법, shRNA 발현 플라스미드나 바이러스성 벡터의 세포내 전달을 통한 발현법 및 PCR(polymerase chain reaction) 유도 siRNA 발현 카세트(cassette)의 세포 내 전달을 통한 발현법 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 miRNA 억제제의 세포 내로의 도입은 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 공동-침전법, 전기천공법 및 리포좀 이용법 등을 이용하여 실시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 예방이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 간 조직의 섬유화또는 그에 따른 이상을 지연시키는 모든 행위를 의미하고, 치료란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 간 조직의 섬유화와 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다. 또한, 본 발명의 간 섬유화 치료용 약학적 조성물의 투여 대상 개체는 포유류라면 제한되지 아니하나, 바람직하게는 인간일 수 있고, 보다 구체적으로 비알코올 지방간질환 환자일 수 있다.
본 발명에서 약학적 조성물(pharmaceutical composition)은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제, 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 "담체(carrier)"란 비이클(vehicle)이라고도 불리며, 세포 또는 조직 내로의 단백질 또는 펩타이드의 부가를 용이하게 하는 화합물을 의미하는 것으로서, 예를 들어 디메틸술폭사이드(DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직 내로의 많은 유기물의 투입을 용이하게 하는 통상 사용되는 담체이다.
본 발명에서 "희석제(diluent)"란 대상 단백질 또는 펩타이드의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 단백질 또는 펩타이드를 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물로 정의된다. 버퍼 용액에 용해되어 있는 염은 당해 분야에서 희석제로 사용된다. 통상 사용되는 버퍼 용액은 포스페이트 버퍼 식염수이며, 이는 인간 용액의 염 상태를 모방하고 있기 때문이다. 버퍼 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 버퍼 희석제가 화합물의 생물학적 활성을 변형하는 일은 드물다. 여기에 사용된 아젤라산을 함유하는 화합물들은 인간 환자에게 그 자체로서, 또는 결합 요법에서와 같이 다른 성분들과 함께 또는 적당한 담체나 부형제와 함께 혼합된 약학적 조성물로서, 투여될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 간 섬유화 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 분해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구, 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 근육 주입, 정맥내 주입, 피하 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 대용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
[실시예]
실시예 1. miRNA 발현 heat map 제작
조직검사를 통해서 비알코올 지방간질환으로 진단된 환자 41명의혈청 샘플을 수집하여 분석하였다. 41명중 25명은 진행되지 않은 간 섬유화 (섬유화 stage 0, 1, 2) 16명은 진행된 간 섬유화 (섬유화 stage 3, 4) 로 진단된 환자였다. 이들 환자에서 수집된 혈청에서 엑소좀 분리 키트를 이용하여 엑소좀을 분리 후에, 엑소좀에서 miRNA의 발현을 분석하였다. miRNA의 발현 분석은 mircroarry를 통하여 진행되었고, 총 2578 개의 miRNA 발현을 분석하였다.
진행되지 않은 간섬유화 환자 25명 그룹과, 진행된 간섬유화 환자 16명 그룹에서 miRNA발현을 비교한 결과, 양군에서 log 1.5 배 이상 차이를 보이면서 통계적인 유의성을 나타낸 61개의 miRNA를 확인하였다. 진행된 간섬유화 환자군에서 40가지의 miRNA 가 유의하게 증가하였고, 21가지의 miRNA는 유의하게 감소하였다. 그 중에서 miRNA4668-5p는 양 군에서 가장 유의한 차이를 보이는 miRNA였으며, 진행된 간섬유화 군에서 진행되지 않은 간섬유화 군에 비하여 9.27 배의 발현 차이를 보였다. 따라서, 비알코올 지방간 질환 환자의 혈청 엑소좀에서 miRNA 4668-5p의 발현을 분석하여, 진행된 간섬유화를 진단할 수 있을 것으로 기대되며, 향후 유용한 바이오마커로서 이용할 수 있겠다.
실시예 2. miRNA 4668-5p와 발현과 간 섬유화 진행과의 관계 확인
miRNA 4668-5p가 간 섬유화에 미치는 영향을 분석하기 위하여, 간에서 섬유화 진행에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 인간 간성상세포 세포주 (LX-2 cell line)에 miRNA 4668-5p를 과발현 시켰을 때와 상기 miRNA를 억제하였을 때 섬유화 진행과 관련된 유전자(TGFb1, Col1a1, a-SMA)의 발현 변화를 확인하였다. 구체적으로, miRNA 4668-5p 과발현은 miRNA 4668-5p를 제조하여 세포에 도입(transfection)하여 유도하였고, miRNA 4668-5p의 억제는 miRNA 4668-5p를 타겟으로 하는 siRNA를 제조하여 세포에 도입함으로써 유도하였다. 상기 세포에 도입되는 각각의 miRNA와 siRNA는 Applied Biosystems'에 의뢰하여 제조하였으며, 세포에의 도입은Lipofectamine RNAiMAX Transfection을 이용하여 수행하였다.
그 결과, 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, miRNA 4668-5p를 과발현했을 때 섬유화 진행과 관련된 유전자의 발현이 유의하게 증가하였고, 반대로 miRNA 4668-5p를 억제시켰을 때는 섬유화 진행과 관련된 유전자의 발현이 유의하게 감소되었다.
이 결과를 바탕으로 하여 miRNA를 target으로 하여 간섬유화의 진행을 차단하는 치료제 개발에도 miRNA 4668-5p 가 이용될 수 있겠다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Korea University Research and Buisness Foundation <120> Biomaker miRNA4668-5p for diagnosing liver fibrosis <130> DHP19-720 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 agggaaaaaa aaaaggauuu guc 23

Claims (12)

  1. miRNA 4668-5p을 포함하는, 간섬유화 진단용 바이오마커 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 miRNA 4668-5p는 혈액 또는 혈청의 생물학적 시료의 엑소좀 유래인 것을 특징으로 하는, 간 섬유화 진단용 바이오마커 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 간섬유화는 비알코올성 지방간의 간섬유화인 것을 특징으로 하는, 간 섬유화 진단용 바이오마커 조성물.
  4. 혈액 또는 혈청의 생물학적 시료로부터 엑소좀 유래의 miRNA 4668-5p를 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는, 간섬유화 진단용 키트.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 제제는 miRNA 4668-5p에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 간섬유화 진단용 키트.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 간섬유화는 비알코올성 지방간의 간섬유화인 것을 특징으로 하는, 간섬유화 진단용 키트.
  7. 하기 단계를 포함하는 간섬유화 진단을 위한 정보제공방법:
    (1) 개체로부터 분리된 혈액 또는 혈청 시료에서 엑소좀을 분리하는 단계;
    (2) 상기 엑소좀에서 miRNA 4668-5p의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (3) 상기 (2) 단계에서 측정된 miRNA 4668-5p의 발현 수준을 정상 대조군의 발현 수준과 비교하여 정상 대조군의 발현 수준보다 높은 경우 간 섬유화가 진행된 것으로 판정하는 단계.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 (2) 단계에서 miRNA 4668-5p의 발현 수준 측정은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는, 간 섬유화 진단을 위한 정보제공방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 간섬유화는 비알코올성 지방간의 간섬유화인 것을 특징으로 하는, 간 섬유화 진단을 위한 정보제공방법.
  10. miRNA 4668-5p의 발현을 억제하는 제제를 포함하는, 간 섬유화 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 제제는 siRNA, 앱타머(aptamer), 및 안티센스 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 miRNA 발현 억제제인 것을 특징으로 하는, 간 섬유화 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 삭제
  12. 하기 단계를 포함하는, 간 섬유화 치료제의 스크리닝 방법:
    (1) 간 세포에 후보물질을 처리하고 miRNA 4668-5p의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (2) miRNA 4668-5p의 발현 수준이 감소한 경우 상기 후보물질을 간 섬유화 치료제로 선정하는 단계.
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