JP2013081483A - 膵臓癌に関連するマイクロrna発現プロファイル - Google Patents
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Abstract
【解決手段】被験体が膵臓癌に罹患しているのか、もしくは膵臓癌を発症する危険性があるのかを診断する方法が提供される。本方法は、被験体の膵臓由来の生体試料における少なくとも1つのmiR遺伝子産物のレベルを測定する手順を含む。生体試料におけるmiR遺伝子産物のレベルが対照試料における対応するmiR遺伝子産物のレベルに比べて変化することによって、被験体が膵臓癌に羅患していることか、もしくは膵臓癌を発症する危険性があることのいずれかが示される。
【選択図】図1
Description
本発明は、アメリカ合衆国のNational Institute of Healthによるグラント番号CA107435によって少なくとも部分的にサポートされる。The Ohio State UniversityのTissue Procurement Shared Resourceは、National Cancer InstituteのグラントP30 CA16058によって資金援助される。米国合衆国政府は、本発明において一定の権利を有する。
本願は、2006年3月2日に出願された米国仮特許出願第60/778,271号に基づく。米国仮特許出願第60/778,271号の利益は、本明細書によって特許請求され、そしてその開示は本明細書中に参考として援用される。
膵臓癌は、米国の癌関連の死亡で4番目の主要原因である。この5年間の年間死亡率は約3万人であり、毎年診断される新症例の数とほとんど同じである。膵臓癌の予後はすべての癌の中で最悪であり、死亡率/発現率の比は0.99である。米国の膵臓癌の発現率は、10万人当たり約9人である。これらの思わしくない数字は、発現率と死亡率とが増加傾向にあることを反映しており、検出法および診断法の進歩が見られないことや、治療計画における進展が不十分であることに起因する。
本発明は、膵臓腺癌において発現が変化するmiRNAの同定に一部基づく。
があるのかを診断する別の方法も提供する。本方法は、(a)被験体の膵臓由来の試験試料を提供する手順であって、前記試験試料が複数のmiR遺伝子産物を含む、手順;(b)試験試料におけるmiR遺伝子産物の発現レベルを検定して、試験試料のmiR発現プロファイルを得る手順;(c)試験試料のmiR発現プロファイルを、対照試料から作成された対応するmiR発現プロファイルと比較する手順を含む。試験試料のmiR発現プロファイルと対照試料のmiR発現プロファイルとの差によって、被験体が膵臓癌に羅患していることか、もしくは膵臓癌を発症する危険性があることのいずれかが示される。
子産物を有する癌細胞を含む被験体の膵臓から第1の試験試料を得る手順;(b)被験体に治療レジメンを施す手順;(d)ある期間後に被験体の膵臓から第2の試験試料を得る手順;および(e)第1および第2の試験試料におけるアップレギュレートされたmiR遺伝子産物のレベルを比較する手順によって評価される。第2の試験試料におけるアップレギュレートされたmiR遺伝子産物レベルが第1の試験試料よりも低いことによって、その治療レジメンが被験体における膵臓癌の進行抑制に効果的であることが示される。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
(項目1)
被験体が膵臓癌に罹患しているのか、もしくは膵臓癌を発症する危険性があるのかを診断する方法であって、前記被験体の膵臓由来の生体試料における少なくとも1つのmiR遺伝子産物のレベルを測定する手順であって、前記生体試料における前記miR遺伝子産物のレベルが対照試料における対応するmiR遺伝子産物のレベルに比べて変化することによって、前記被験体が膵臓癌に羅患していることか、もしくは膵臓癌を発症する危険性があることのいずれかであることが示される、手順を含む、方法。
(項目2)
前記miR遺伝子産物が、MIR‐034b、MIR‐092‐2‐P、MIR‐096‐P、MIR‐129‐2、MIR‐130a‐P、MIR‐133b、MIR‐139、MIR‐188b‐P、MIR‐192、MIR‐200a‐P、MIR‐204、MIR‐210、MIR‐299‐P、MIR‐302d、MIR‐337、MIR‐371、MIR‐378、MIR‐383、MIR‐422b、MIR‐423、MIR‐375、let‐7a‐2‐P、let‐7b、let‐7c、let‐7d、let‐7f‐1、let‐7i、MIR‐001‐2、MIR‐007‐1、MIR‐015a、MIR‐015b、MIR‐016‐1、MIR‐019b‐1‐P、MIR‐021、MIR‐023a、MIR‐024‐1,2、MIR‐027a,b、MIR‐029a,c、MIR‐030d、MIR‐032、MIR‐092‐1、MIR‐098、MIR‐099a、MIR‐100、MIR‐107、MIR‐125b‐1、MIR‐126、MIR‐128a、MIR‐132、MIR‐136、MIR‐142‐P、MIR‐145‐P、MIR‐152、MIR‐155、MlR‐181a,c、MIR‐196a‐2、MIR‐212、MIR‐213、MIR‐215、MIR‐218‐1,2、MIR‐221、MIR‐222‐P、MIR‐301、MIR‐328、MIR‐331‐P、MIR‐345、MIR‐367、MIR‐376、MIR‐424およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記miR遺伝子産物が、let‐7b、let‐7c、let‐7d、let‐7f‐1、let‐7i、MIR‐015a、MIR‐015b、MIR‐016‐1、MIR‐021、MIR‐023a、MIR‐024‐1,2、MIR‐027a,b、MIR‐098、MIR‐099a、MIR‐100、MIR‐125b‐1、MIR‐126、MIR‐132、MIR‐142‐P、MIR‐145‐P、MIR‐152、MIR‐155、MIR‐181a,c、MIR‐196a‐2、MIR‐212、MIR‐213、MIR‐218‐1,2,、MIR‐221、MIR‐222‐P、MIR‐301、MIR‐331‐P、MIR‐345、MIR‐376およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記生体試料におけるmiR遺伝子産物のレベルが、前記対照試料におけるその対応するmiR遺伝子産物のレベルよりも低い、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記miR遺伝子産物が、MIR‐092‐2‐P、MIR‐096‐P、MIR‐129‐2、MIR‐133b、MIR‐139、MIR‐188b‐P、MIR‐204、MIR‐299‐P、MIR‐337、MIR‐371、MIR‐383、MIR‐375およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目4に記載の方法。
(項目6)
前記miR遺伝子産物がMIR‐139である、項目5に記載の方法。
(項目7)
前記miR遺伝子産物がMIR‐096‐Pである、項目5に記載の方法。
(項目8)
前記miR遺伝子産物がMIR‐375である、項目5に記載の方法。
(項目9)
前記生体試料における前記miR遺伝子産物のレベルが、前記対照試料におけるその対応するmiR遺伝子産物のレベルよりも高い、項目1に記載の方法。
(項目10)
前記miR遺伝子産物が、let‐7a‐2‐P、let‐7b、let‐7c、let‐7d、let‐7f‐1、let‐7i、MIR‐001‐2、MIR‐007‐1、MIR‐015a、MIR‐015b、MIR‐016‐1、MIR‐019b‐1‐P、MIR‐021、MIR‐023a、MIR‐024‐1,2、MIR‐027a,b、MIR‐029a,c、MIR‐030d、MIR‐032、MIR‐092‐1、MIR‐098、MIR‐099a、MIR‐100、MIR‐107、MIR‐125b‐1、MIR‐126、MIR‐128a、MIR‐132、MIR‐136、MIR‐142‐P、MIR‐145‐P、MIR‐152、MIR‐155、MIR‐181a,c、MIR‐196a‐2、MIR‐212、MIR‐213、MIR‐215、MIR‐218‐1,2、MIR‐221、MIR‐222‐P、MIR‐301、MIR‐328、MIR‐331‐P、MIR‐345、MIR‐367、MIR‐376、MIR‐424およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目9に記載の方法。
(項目11)
前記miR遺伝子産物が、let‐7b、let‐7c、let‐7d、let‐7f‐1、let‐7i、MIR‐007‐1、MIR‐015a、MIR‐015b、MIR‐016‐1、MIR‐021、MIR‐023a、MIR‐024‐1,2、MIR‐027a,b、MIR‐030d、MIR‐098、MIR‐099a、MIR‐100、MIR‐125b‐1、MIR‐126、MIR‐132、MIR‐142‐P、MIR‐145‐P、MIR‐152、MIR‐155、MIR‐181a,c、MIR‐196a‐2、MIR‐212、MIR‐213、MIR‐218‐1,2、MIR‐221、MIR‐222‐P、MIR‐301、MIR‐331‐P、MIR‐345、M
IR‐376およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目9に記載の方法。
(項目12)
前記miR遺伝子産物が、let‐7b;let‐7d;let‐7f;let‐7i、MIR‐015a;MIR‐015b;MIR‐016‐1;MIR‐021;MlR‐023a、MIR‐024、MIR‐100;MIR‐125b;MIR‐132、MIR‐155、MIR‐181a、MIR‐181c;MIR‐212;MIR‐221;MIR‐301;MIR‐376aおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目9に記載の方法。
(項目13)
前記miR遺伝子産物が、let‐7a‐2‐P、let‐7b、let‐7c、let‐7d、let‐7f‐1、let‐7i、MIR‐015b、MIR‐019b‐1‐P、MIR‐098、MIR‐128a、MIR‐136、MIR‐152、MIR‐155、MIR‐181a、MIR‐196a‐2、MIR‐212、MIR‐215、MIR‐218‐1、MIR‐218‐2、MIR‐301、MIR‐328、MIR‐331‐P、MIR‐424およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目9に記載の方法。
(項目14)
前記miR遺伝子産物が、let‐7b、let‐7d、let‐7f‐1、let‐7i、MIR‐155、MIR‐181a、MIR‐212、MIR‐301およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目9に記載の方法。
(項目15)
前記miR遺伝子産物がMIR‐155である、項目9に記載の方法。
(項目16)
前記miR遺伝子産物がMIR‐007‐1である、項目9に記載の方法。
(項目17)
前記miR遺伝子産物がMIR‐021である、項目9に記載の方法。
(項目18)
被験体が膵臓癌に罹患しているのか、もしくは膵臓癌を発症する危険性があるのかを診断する方法であって、
(a)前記被験体の膵臓由来の試験試料を提供する手順であって、前記試験試料が複数のmiR遺伝子産物を含む、手順;
(b)前記試験試料における前記miR遺伝子産物の発現レベルを検定して、前記試験試料のmiR発現プロファイルを得る手順;
(c)前記試験試料の前記miR発現プロファイルを、対照試料から作成された対応するmiR発現プロファイルと比較する手順であって、前記試験試料の前記miR発現プロファイルと前記対照試料の前記miR発現プロファイルとの差によって、前記被験体が膵臓癌に羅患していることか、もしくは膵臓癌を発症する危険性があることのいずれかが示される、手順
を含む、方法。
(項目19)
前記複数のmiR遺伝子産物が、細胞内のmiR遺伝子の補体全長の実質部分に相当する、項目18に記載の方法。
(項目20)
前記複数のmiR遺伝子産物が、細胞内のmiR遺伝子の補体全長の約95%に相当する、項目18に記載の方法。
(項目21)
前記複数のmiR遺伝子産物が、細胞内のmiR遺伝子の補体全長の約90%に相当する、項目18に記載の方法。
(項目22)
前記複数のmiR遺伝子産物が、細胞内のmiR遺伝子の補体全長の約80%に相当する、項目18に記載の方法。
(項目23)
前記複数のmiR遺伝子産物が、細胞内のmiR遺伝子の補体全長の約70%に相当する、項目18に記載の方法。
(項目24)
前記複数のmiR遺伝子産物が、細胞内のmiR遺伝子の補体全長の約60%に相当する、項目18に記載の方法。
(項目25)
前記複数のmiR遺伝子産物が、MIR‐139、MIR096‐P、MIR‐375、let‐7b、let‐7d、let‐7f‐1、let‐7i、MIR‐155、MIR‐181a、MIR‐212、MIR‐301、MIR‐007‐1、MIR‐021およびそれらの組み合わせからなる群から選択される1つ以上のmiR遺伝子産物を含む、項目18に記載の方法。
(項目26)
前記対照試料が正常膵組織から得られる、項目1〜25に記載の方法。
(項目27)
前記試験試料が、癌または前癌性であることが疑われる膵臓の領域から得られる、項目1〜25に記載の方法。
(項目28)
前記miR遺伝子産物がmiRNA前駆体である、項目1〜25に記載の方法。
(項目29)
前記miR遺伝子産物が成熟型miRNAである、項目1〜25に記載の方法。
(項目30)
前記miR遺伝子産物のレベルが、増幅に基づく検定を使用して測定される、項目1〜29に記載の方法。
(項目31)
前記増幅に基づく検定が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT‐PCR)、定量的RT‐PCR、リアルタイム定量的RT‐PCRおよびin situ PCRからなる群から選択される、項目30に記載の方法。
(項目32)
前記miR遺伝子産物のレベルが、ハイブリダイゼーションに基づく検定を使用して測定される、項目1〜29に記載の方法。
(項目33)
前記ハイブリダイゼーションに基づく検定が、ノーザンブロット解析、in situハイブリダイゼーション、溶液ハイブリダイゼーション、リボヌクレアーゼ防御検定、RNAマイクロアレイ分析ならびにDNAまたはcDNAマイクロアレイ分析からなる群から選択される、項目32に記載の方法。
(項目34)
前記miR遺伝子産物のレベルが、前記試料における前記対応するmiR遺伝子コピーを測定することによって判定される、項目1〜29に記載の方法。
(項目35)
前記生体試料が膵組織、膵腫瘍または膵臓細胞を含む、項目1〜34に記載の方法。
(項目36)
前記生体試料が膵液の試料を含む、項目1〜34に記載の方法。
(項目37)
膵臓癌に羅患しているか、もしくは膵臓癌を発症する危険性がある被験体における膵臓癌を診断するためのキットであって、
(a)前記被験体の膵臓由来の生体試料における少なくとも1つのmiR遺伝子産物のレベルを測定する手段、および
(b)前記生体試料における前記miR遺伝子産物のレベルを、対照試料における対応するmiR遺伝子産物のレベルと比較する手段
を含み、
前記生体試料における前記miR遺伝子産物のレベルと、前記対照試料における前記対応するmiR遺伝子産物のレベルとの間で検出された差によって、前記被験体が膵臓癌に羅患していることか、もしくは膵臓癌を発症する危険性があることのいずれかであることが示される、
キット。
(項目38)
膵臓癌を発症する危険性がある被験体をスクリーニングする方法であって、前記被験体の膵臓から得た生体試料中の膵臓癌に関連した、少なくとも1つのmiR遺伝子産物またはmiR遺伝子産物の組み合わせのレベルを評価する手順であって、前記生体試料におけるmiR遺伝子産物またはmiR遺伝子産物の組み合わせのレベルが、対照試料における対応するmiR遺伝子産物のレベルに比べて変化することによって、前記被験体に膵臓癌を発症する危険性があることが示される、手順を含む、方法。
(項目39)
前記生体試料が、正常であるか、もしくは前癌性の疑いがある膵組織を含む、項目38に記載の方法。
(項目40)
対照細胞よりも多くのmiR遺伝子産物を含む膵臓癌細胞を有する被験体における膵臓癌の進行を抑制する方法であって、前記膵臓癌細胞内の前記miR遺伝子産物の量を減少させることができる有効量の阻害剤分子を前記被験体に投与する手順を含む、方法。
(項目41)
前記miR遺伝子産物が、let‐7a‐2‐P、let‐7b、let‐7c、let‐7d、let‐7f‐1、let‐7i、MIR‐001‐2、MIR‐007‐1、MIR‐015a、MIR‐015b、MIR‐016‐1、MIR‐019b‐1‐P、MIR‐021、MIR‐023a、MIR‐024‐1,2、MIR‐027a,b、MIR‐029a,c、MIR‐030d、MIR‐032、MIR‐092‐1、MIR‐098、MIR‐099a、MIR‐100、MIR‐107、MIR‐125b‐1、MIR‐126、MIR‐128a、MIR‐132、MIR‐136、MIR‐142‐P、MIR‐145‐P、MIR‐152、MIR‐155、MIR‐181a,c、MIR‐196a‐2、MIR‐212、MIR‐213、MIR‐215、MIR‐218‐1,2、MIR‐221、MIR‐222‐P、MIR‐301、MIR‐328、MIR‐331‐P、MIR‐345、MIR‐367、MIR‐376、MIR‐424およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目40に記載の方法。
(項目42)
前記miR遺伝子産物が、let‐7b、let‐7c、let‐7d、let‐7f‐1、let‐7i、MIR‐007‐1、MIR‐015a、MIR‐015b、MIR‐016‐1、MIR‐021、MIR‐023a、MIR‐024‐1,2、MIR‐027a,b、MIR‐030d、MIR‐098、MIR‐099a、MIR‐100、MIR‐125b‐1、MIR‐126、MIR‐132、MIR‐142‐P、MIR‐145‐P、MIR‐152、MIR‐155、MIR‐181a,c、MIR‐196a‐2、MIR‐212、MIR‐213、MIR‐218‐1,2、MIR‐221、MIR‐222‐P、MIR‐301、MIR‐331‐P、MIR‐345、MIR‐376およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目40に記載の方法。
(項目43)
前記miR遺伝子産物が、let‐7b;let‐7d;let‐7f;let‐7i、MIR‐015a;MIR‐015b;MIR‐016‐1;MIR‐021;MlR
‐023a、MIR‐024、MIR‐100;MIR‐125b;MIR‐132、MIR‐155、MIR‐181a、MIR‐181c;MIR‐212;MIR‐221;MIR‐301;MIR‐376aおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目40に記載の方法。
(項目44)
miR遺伝子産物が、let‐7a‐2‐P、let‐7b、let‐7c、let‐7d、let‐7f‐1、let‐7i、MIR‐015b、MIR‐019b‐1‐P、MIR‐098、MIR‐128a、MIR‐136、MIR‐152、MIR‐155、MIR‐181a、MIR‐196a‐2、MIR‐212、MIR‐215、MIR‐218‐1、MIR‐218‐2、MIR‐301、MIR‐328、MIR‐331‐P、MIR‐424およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目40に記載の方法。
(項目45)
前記miR遺伝子産物が、let‐7b、let‐7d、let‐7f‐1、let‐7i、MIR‐155、MIR‐181a、MIR‐212、MIR‐301およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目40に記載の方法。
(項目46)
前記miR遺伝子産物がMIR‐155である、項目40に記載の方法。
(項目47)
前記miR遺伝子産物がMIR‐007‐1である、項目40に記載の方法。
(項目48)
前記miR遺伝子産物がMIR‐021である、項目40に記載の方法。
(項目49)
前記miR遺伝子産物が成熟型miRである、項目40〜48に記載の方法。
(項目50)
前記阻害剤分子が前記miR遺伝子産物の転写後のサイレンシングを引き起こす、項目40〜48に記載の方法。
(項目51)
前記阻害剤分子が前記miR遺伝子産物の成熟を阻害する、項目40〜48に記載の方法。
(項目52)
前記阻害剤分子が前記miR遺伝子産物のアンチセンスオリゴヌクレオチドである、項目40〜48に記載の方法。
(項目53)
前記阻害剤分子が低分子干渉RNA(siRNA)である、項目40〜48に記載の方法。
(項目54)
前記阻害剤分子が、前記miR遺伝子産物についてコードする遺伝子とともに3重らせんを形成することができる分子である、項目40〜48に記載の方法。
(項目55)
前記阻害剤分子がリボザイムである、項目40〜48に記載の方法。
(項目56)
前記阻害剤分子が送達剤とともに裸のRNAとして投与される、項目40〜54に記載の方法。
(項目57)
前記阻害剤分子が、前記阻害剤分子をコードする核酸として投与される、項目40〜54に記載の方法。
(項目58)
対照細胞よりも少ないmiR遺伝子産物を含む膵臓癌細胞を有する被験体における膵臓癌の進行を抑制する方法であって、前記miR遺伝子産物に対応する有効量の単離された
miR遺伝子産物を前記被験体に投与する手順を含む、方法。
(項目59)
前記miR遺伝子産物が、MIR‐092‐2‐P、MIR‐096‐P、MIR‐129‐2、MIR‐133b、MIR‐139、MIR‐188b‐P、MIR‐204、MIR‐299‐P、MIR‐337、MIR‐371、MIR‐383、MIR‐375およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目58に記載の方法。
(項目60)
前記miR遺伝子産物がMIR‐139である、項目58に記載の方法。
(項目61)
前記miR遺伝子産物がMIR‐096‐Pである、項目58に記載の方法。
(項目62)
前記miR遺伝子産物がMIR‐375である、項目58に記載の方法。
(項目63)
前記単離されたmiR遺伝子産物が前記機能性成熟型miRである、項目58〜62に記載の方法。
(項目64)
前記単離されたmiR遺伝子産物が、ヘアピンのループ部を含むmiR前駆体ヘアピン配列を含むオリゴヌクレオチドである、項目58〜62に記載の方法。
(項目65)
前記単離されたmiR遺伝子産物が、前記ヘアピンを有さない2本鎖のmiR前駆体を含むオリゴヌクレオチドである、項目58〜62に記載の方法。
(項目66)
前記単離された遺伝子産物が送達剤とともに裸のRNAとして投与される、項目58〜62に記載の方法。
(項目67)
前記単離された遺伝子産物が、前記単離されたmiR遺伝子産物をコードする核酸として投与される、項目58〜62に記載の方法。
(項目68)
前記核酸が組換えプラスミドまたは組換えウイルスベクターである、項目67に記載の方法。
(項目69)
項目40〜57に記載の阻害剤分子と薬学的に許容される担体とを含む、被験体における膵臓癌を治療するための薬学的組成物。
(項目70)
項目58〜66に記載の単離されたmiR遺伝子産物と薬学的に許容される担体とを含む、被験体における膵臓癌を治療するための薬学的組成物。
(項目71)
項目67〜68に記載の単離されたmiR遺伝子産物をコードする核酸と薬学的に許容される担体とを含む、被験体における膵臓癌を治療するための薬学的組成物。
(項目72)
被験体における膵臓癌の進行を抑制する治療レジメンの有効性を判定する方法であって、
(a)対照細胞に比べてアップレギュレートされたmiR遺伝子産物を有する癌細胞を含む前記被験体の膵臓から第1の試験試料を得る手順;
(b)前記被験体に前記治療レジメンを施す手順;
(d)ある期間後に前記被験体の膵臓から第2の試験試料を得る手順;ならびに
(e)前記第1および前記第2の試験試料における前記アップレギュレートされたmiR遺伝子産物のレベルを比較する手順であって、前記第2の試験試料における前記アップレギュレートされたmiR遺伝子産物レベルが前記第1の試験試料よりも低いことによって、前記治療レジメンが前記被験体における膵臓癌の進行抑制に効果的であることが示さ
れる、手順
を含む、方法。
(項目73)
被験体における膵臓癌の進行を抑制する治療レジメンの有効性を判定する方法であって、
(a)対照細胞に比べてダウンレギュレートされたmiR遺伝子産物を有する癌細胞を含む前記被験体の膵臓から第1の試験試料を得る手順;
(b)前記被験体に前記治療レジメンを施す手順;
(d)ある期間後に前記被験体の膵臓から第2の試験試料を得る手順;および
(e)前記第1および前記第2の試験試料における前記ダウンレギュレートされたmiR遺伝子産物のレベルを比較する手順であって、前記第2の試験試料における前記ダウンレギュレートされたmiR遺伝子産物レベルが前記第1の試験試料よりも高いことによって、前記治療レジメンが前記被験体における膵臓癌の進行抑制に効果的であることが示される、手順
を含む、方法。
(項目74)
膵臓癌用抗癌剤を同定する方法であって、
(a)膵臓癌細胞を含む生体試料において過剰発現する少なくとも1つのmiR遺伝子産物の発現レベルを測定し、これにより前記miR遺伝子産物の試験前の発現レベルについてのデータを作成する手順;
(b)前記生体試料に試験剤を接触させる手順;
(c)手順(b)の後に前記生体試料における前記miR遺伝子産物の発現レベルを測定し、これにより試験後の発現レベルについてのデータを作成する手順;および
(d)前記miR遺伝子産物の試験後の発現レベルを試験前の発現レベルと比較する手順であって、前記miR遺伝子産物の前記試験後の発現レベルが低下することによって、前記試験剤が膵臓癌の抗癌性を有することが示される、手順
を含む、方法。
(項目75)
膵臓癌用抗癌剤を同定する方法であって、
(a)膵臓癌細胞を含む生体試料において過小発現する少なくとも1つのmiR遺伝子産物の発現レベルを測定し、これにより前記miR遺伝子産物の試験前の発現レベルについてのデータを作成する手順;
(b)前記生体試料に試験剤を接触させる手順;
(c)手順(b)の後に前記生体試料における前記miR遺伝子産物の発現レベルを測定し、これにより試験後の発現レベルについてのデータを作成する手順;および
(d)前記miR遺伝子産物の前記試験後の発現レベルを前記試験前の発現レベルと比較する手順であって、前記miR遺伝子産物の前記試験後の発現レベルが上昇することによって、前記試験剤が膵臓癌の抗癌性を有することが示される、手順
を含む、方法。
本発明は、膵臓腺癌(以下、「膵臓癌」)の被験体から得られた生体試料における発現が特定の対照試料に比べて変化した特定のマイクロRNA遺伝子産物の同定に一部基づく。本発明は、被験体が膵臓癌に罹患しているのか、もしくは膵臓癌を発症する危険性があるのかを診断する方法を包含する。本発明はまた、膵臓癌を発症する危険性があると考えられる被験体をスクリーニングする方法、膵臓癌の進行を抑制することによって膵臓癌を治療する方法、ならびにこのような治療に使用することができる薬学的化合物も提供する。また、膵臓癌を抑制する治療レジメンの有効性を判定する方法、および膵臓癌用抗癌剤を同定する方法も提供される。本発明はまた、上述の方法の実施に適切な各種キットも包含する。
のまたはクラスター形成されたmiRNA前駆体に転写されるmiR遺伝子によってコードされると考えられる。
North Am.16:37‐52;Matsubayashi,H.,et al.,(2005),Clinical Cancer Research 11:573‐583;およびGrφnburg,M.,et al.,(2004)Journal
of Proteome Research,3(5),1042‐1055に記載の通り、当該技術分野で既知である。対応する対照試料は、被験体の影響を受けていない膵
組織から、すなわち正常被験体または正常被験体群から得ることができる。次いで、対照試料は、被験体の試料において特定のmiR遺伝子から産生されたmiR遺伝子産物のレベルを、対照試料由来の対応するmiR遺伝子産物レベルと比較できるように、被験体由来の試験試料とともにプロセッシングされる。
す列挙したmiR遺伝子産物のいずれかの組み合わせを評価することによって、診断することができると理解される。いくつかの例においては、膵臓腺癌に固有に関連するmiR遺伝子産物が評価される。
り、例えば、全体が参考として本明細書で援用される、米国特許出願第2006/0078924号の説明を参照されたい。
Acid Hybridization,A Practical Approach,B. Hames and S. Higgins,eds.,IRL Press,Washington,D.C.(1985)などに記載される通り、周知である。一般的に、このようなアニーリングが起こるかどうかは、とりわけ、ポリヌクレオチドおよび相補形の長さ、pH、温度、1価および2価の陽イオンの存在、ハイブリダイズ領域におけるGヌクレオチドとCヌクレオチドの割合、培地の粘度、ならびに変性剤の存在に影響される。このような変数は、ハイブリダイゼーションに必要な時間に影響を及ぼす。従って、好ましいアニーリング条件は特定の用途により異なる。しかし、このような条件は、過度の実験を行うことなく当業者により慣例的に判定することができる。相補性は完全である必要がなく、標的配列と本教示内容の1本鎖核酸との間のハイブリダイゼーションの最小限の妨げとなる塩基対ミスマッチが少数存在する可能性があることが理解されるであろう。しかし、塩基対ミスマッチの数が、最小限のストリンジェントな条件下でもハイブリダイゼーションが行われないほどに多い場合、配列は一般的に相補的な標的配列でない。従って、本明細書における相補性とは、プローブまたはプライマーが、本教示内容の目的を達成するために選択された反応条件下でハイブリダイズする上で、標的配列に対して十分に相補的であることを意味する。
ml)(Griffiths‐Jones,S.,The micro‐RNA Registry.Nucleic Acids Res,2004.32(1):p.D109‐11)におけるmiRNAレジストリにおいて入手可能な既知のmiRNA種の公表された配列から産生することができる。標識DNAおよびRNAプローブの調製方法、ならびに標的ヌクレオチド配列にこれらをハイブリダイズする条件は、当該技術分野で既知であり、例えば、開示内容が参考として本明細書で援用される、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,J.Sambrook et
al.,eds.,2nd edition,Cold Spring Harbor
Laboratory Press,1989,Chapters 10 and 11に記載されている。
とりわけ、ハイブリダイゼーションに基づく検定および増幅に基づく検定を含む。
。このような検定において、対応するmiR核酸配列は、増幅反応(例えば、PCR)の鋳型の役割を果たす。定量的増幅では、増幅産物の量が元の試料における鋳型の量に比例する。適切な対照に対する比較により、上で考察した原理に従って、使用される特異的プローブに対応するmiR遺伝子のコピー数の指標が得られる。TaqManプローブを使用したリアルタイム定量的PCRの方法は、当該技術分野で周知である。リアルタイム定量的PCRの詳細なプロトコルは、例えば、Heid et al.,1996,Real time quantitative PCR.Genome Res.,10:986‐994に示されている。
et al.,Nat.Genet.,23(1):41‐6,(1999)などを参照されたい。
られる「良性組織」と区別される場合がある。異なる状態の膵組織の発現プロファイルを比較することによって、これらの状態のそれぞれにおいてどの遺伝子が重要であるのか(遺伝子のアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションの両方を含む)に関する情報が得られる。この情報の使用は、膵臓癌組織または正常膵組織に特異的に発現される配列の同定、ならびに異なる予後の転帰をもたらす特異な発現によって、いくつかの方法で可能となる。例えば、特定の治療レジメンは、(例えば、特定の患者の長期の予後を改善するように化学療法薬が作用するかどうかを判定するために)評価される場合がある。同様に、診断は、患者の試料を既知の発現プロファイルと比較することにより実施または確認される場合がある。さらに、これらの遺伝子発現プロファイル(または個体遺伝子)によって、膵臓癌発現プロファイルを抑制するかもしくは予後不良プロファイルを予後良好プロファイルに変える候補薬のスクリーニングが可能となる。
胞においてアップレギュレートされたmiR遺伝子産物のレベルを低下させることにより、および/または癌細胞においてダウンレギュレートされたmiR遺伝子産物のレベルを上昇させることにより)癌特異的miR遺伝子産物のレベルを変化させることによって、膵臓癌の治療を成功させることができる。
質的に精製された形態で存在することができるか、もしくはmiR遺伝子産物が送達された細胞内に存在することができる。
示内容全体が参考として本明細書で援用される、米国特許出願第2004/00141号(Yang et al.)に記載)が含まれる。
al.(2002),Nat.Biotechnol.20:505‐508を参照されたい。
子で置換してAAV2/5ベクターを作製することができる。異なるキャプシドタンパク質血清型を発現するAAVベクターを作製するための技法は、当該技術分野の範囲内に含まれる。例えば、開示内容全体が参考として本明細書で援用される、Rabinowitz,J.E.et al.,(2002),J.Virol.76:791‐801を参照されたい。
されたかどうかを容易に判定することができる。抑制は、遺伝子発現のレベル(すなわち、miR遺伝子産物をコードするmiR遺伝子の転写を抑制することによる)またはプロセッシングのレベル(例えば、成熟型の活性miRへのmiR前駆体のプロセッシングを抑制することによる)で生じる可能性がある。
酵素RNA分子、または3重らせんをmiR遺伝子により形成することができる分子が含まれる。抑制化合物の別の種類は、miR遺伝子産物プロモーターの高メチル化を引き起こし、それによりmiR遺伝子の発現を低下させる。これらの化合物のそれぞれは、特定のmiR遺伝子産物を標的として、miR遺伝子産物を破壊するか、miR遺伝子産物の破壊を誘導するか、さもなければmiR遺伝子産物のレベルを低下させることができる。
with’antagomirs,’Nature 438(7068):685‐9に記載されている。
、例えばG残基のストレッチを有するものを選択することができる。これらの分子が、GC対に富んだDNA2本鎖と3重らせんを形成するのである。この場合、プリン残基の大半は、標的2本鎖の内の1本鎖に位置し、3本鎖中の3本の鎖を横切るGGCトリプレットを生成させる。あるいは、いわゆる「スイッチバック」核酸分子を作製することにより、3重らせん形成のために標的とされる可能性のある配列を増加させることができる。スイッチバック分子は、交互に5’‐3’、3’‐5’様式で合成され、その結果、それらは2本鎖の最初の1本の鎖と塩基対合し、次いでもう一方の鎖と塩基対合することになり、2本鎖分子の一方の鎖上のプリンまたはピリミジンのいずれかの相当大きなストレッチの必要性がなくなる。
合するモノクローナル抗体)が適切である。
,U.S.A.,18:6949‐53を参照されたい。さらに、RESによる取り込みの減少は、肝臓および脾臓におけるリポソームの著しい蓄積を防止することによってステルスリポソームの毒性を低下させる。従って、オプソニン化抑制部分によって修飾されるリポソームは、腫瘍細胞へのmiR遺伝子産物またはmiR遺伝子発現抑制化合物(またはそれらをコードする配列を含む核酸)の送達に非常に適している。
ウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、乳酸カルシウム)の添加剤が含まれる。本発明の薬学的組成物は、液体形態で使用するためにパッケージすることができるか、もしくは凍結乾燥することができる。
データを作成する手順;および(d)前記miR遺伝子産物の試験後の発現レベルを試験前の発現レベルと比較する手順であって、過小発現したmiR遺伝子産物の試験後の発現レベルが上昇することによって、試験剤が膵臓癌の抗癌性を有することが示される、手順を含む。
リアルタイム定量的PCR検定を使用して、ヒト膵臓癌(腺癌)、良性対組織、正常な膵臓、慢性膵炎および膵臓癌細胞株の臨床検査材料における200超のmiRNA前駆体の発現を測定した。膵臓癌を正常かつ良性の膵臓と区別した固有のmiRNAサインを同定した。リアルタイム定量的RT‐PCRのために使用される方法は、開示内容全体が参考として本明細書で援用される、Jiang,J.,et al.(2005),Nucleic Acids Res 33:5394‐5403;Schmittgen T.D.,et al.(2004),Nucleic Acids Res 32:E43;および2005年2月24日出願の米国仮出願第60/656,109号に詳述されている。また、実験手順および結果は、開示内容全体が参考として本明細書で援用される、Lee et al.,(2006)Int.J.Cancer 120:1046‐1054に報告されている。
組織の入手:この研究において解析された組織試料は、オクラホマ大学ヘルスサイエンスセンターおよびオハイオ州立大学で膵臓の一部の切除のための外科手術を受けた患者に由来するものであった。試料の採集は、施設の施設内倫理委員会の方針および慣行に適合したものであった。外科的な検体の切除と同時に、研究員は直ちにその組織を外科病理検査室に移した。病理部は、検体のグロス分析を実施し、研究のために、癌と思われる膵組織および正常と思われる膵組織を選んだ。各試料をクライオバイアル内に配置し、液体窒素中で急速冷凍し、解析を行うまで‐150℃で保存した。次に、外科的な検体を提供する研究所によって次病理学的解析を行い、それにより研究のために採取された試料の組織変化を確認した。RNA解析を実施した研究機関によって、隣接する良性組織にセカンドレベルの精度管理を行った。組織のスライドを、RNAが単離された組織に直接隣接する凍結組織の切片から準備した。これらのスライドを、良性組織が膵臓腫瘍細胞を含むかどうかを判定するために、本発明者等(W.L.F.)の内の1人が検査した。残りの腫瘍を含む良性組織については、この研究に含めなかった。検体に関する臨床データを付録の表1に示す。
L45、Panc03.27およびPanc10.05。細胞株を、標準条件を使用して、10%FBSまたは他の最適化された完全培地を含むRPMI1640培地中で培養した。
2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies、米国カリフォルニア州パロアルト)を使用して評価した。RNA完全性番号(RIN)は、Imbeaud,S.,et al.(2005),Nucleic Acids Res 33,e56におけるプロトコルに従って、Agilent 2100エキスパートソフトウェアのRINアルゴリズムを使用して判定された。RIN≧4のRNA試料をこの研究に含めた(図3)。しばらくRNAをRNアーゼフリーのDNAase Iで処理し、222のmiRNA前駆体と18S rRNAとに対する遺伝子特異的プライマーを使用してcDNAを1μgのトータルRNAから合成した。222のmiRNA前駆体の発現は、リアルタイム定量的PCR検定を使用して測定した。cDNAの各試料中の各miRNA前駆体遺伝子について重複PCRを行った。平均CTを重複PCRから判定した。相対的遺伝子発現を2‐(C TmiRNA ‐C T18S rRNA )として算出した。相対的遺伝子発現には、データの提示を単純化するために、106を乗算した。生の相対的miRNA前駆体発現データを図4に示す。
た。
内部コントロール遺伝子のバリデーション:膵組織はリボヌクレアーゼが豊富であり、RNA単離時には自己分解の可能性を低下させるように注意する必要がある。膵組織から単離されるRNAの完全性を確認するため、約100ngの各RNA試料を、Agilent 2100 Bioanalyzerを使用して検定した。52の組織において、RIN≧4(中央値7.6、範囲4.3〜9.6、(図3))であった。
、データの統計学的フィルタリングは、発現データの前処理の必要な手順であると慣習的に判断される。試料および遺伝子の階層的クラスタリングは、結果として生じた112のmiRNAについて実施した。フィルタリングされたデータの階層的クラスタリングによって、本発明者等は、結果として生じた4つの試料クラスターにおける異なる発現パターンを有するmiRNAの主要な群を同定することができた(図7)。1つのクラスターは、細胞株のみを含んでいた。別のクラスターは、6つのすべての正常膵臓および15の良性組織の内の9つを含んでいた。3番目のクラスターは、4つの慢性膵炎検体および1つの良性組織を含んでいた。最後に、大きなクラスターは、28の腫瘍の内の28および5つの良性組織を含んでいた(図7)。
以下では、膵管腺癌において初めての詳細なmiRNA発現プロファイリング研究の結果を報告する。発現プロファイリングによって、膵管腺癌において異常に発現する多数のmiRNAが同定された。
いた可能性がある。別の可能性としては、それらの試料が腫瘍に隣接する組織から得られるので、良性組織の一部に前癌性の変化がすでに発現していたというものである。この考え方を支持するものとしては、大部分の良性試料(および慢性膵炎も)が発現地形図において正常膵臓と腫瘍との間にあるという事実がある(図8)。この観察は、miRNA発現プロファイリングによって、これらの良性組織において起きた前癌性の変化を検出できるということを示す。
実施例1において使用されたリアルタイムPCR検定によって、miRNA前駆体が定量化されるが、活性の成熟型miRNAは定量化されない。リアルタイムPCR分析において使用したのと同一のRNAについてノーザンブロット法を実施して、成熟型miRNAが前駆体miRNAと相関したかを確認した。
al.(2004),Nucleic Acids Res 32:E43に既述したように実施した。成熟型miRNAに対する逆相補鎖のDNAオリゴヌクレオチドをプローブとして使用した。ブロットを首尾よくストリップし、3回まで再プローブした。
実施例1に記載されたリアルタイムPCRデータを、市販されるリアルタイムPCR検定を使用して確認し、成熟型miRNAを増幅および定量化した。成熟型miRNA発現は、PAMから、上位28位までの異常に発現したmiRNAについて確認した。以下の組織に由来するcDNAを検定した:6つの正常膵臓、16の膵臓腺癌およびPAMから正常であると予測された10の隣接良性組織。
細胞型miRNA発現を、RT in situ PCRを使用して検討した。miR‐221、miR‐376aおよびmiR‐301は、上位で特異に発現したmiRNA(表1)の中のものであり、かつ正常膵臓および膵炎よりも腫瘍および細胞株において発現が増加したことから、in situ PCRのために選択した(図7)。本発明者等は特にmiR‐376aの細胞型発現に関心があったが、それは、Poy M.N.,et al.(2004),Nature 432,226‐30において膵細胞からクローニングされたためであった。本発明者等の結果から、miR‐221およびmiR‐376aは、腫瘍細胞に局在したが、良性膵腺房または間質細胞(図11)または良性の管(図示せず)には局在しなかったことが示された。また、miR‐301は、腫瘍に局在した(データ未掲載)。
SA 96,12754‐9に既述したように実施した。概略説明すると、最適プロテアーゼ消化時間は、レポーターヌクレオチドジゴキシゲニンdUTPの非特異的組み込みを使用して判定した。最適プロテアーゼ消化の後、RNアーゼフリーのDNアーゼ(1試料当たり10U、Boehringer Mannheim、米国インディアナ州インディアナポリス)における一晩のインキュベーションとrTth系およびジゴキシゲニンdUTPを使用したワンステップRT/PCRとを行った。色素原は、ニトロブルーテトラゾリウムおよび対比染色としてヌクレアファストレッドを有するブロモクロロインドリルホスフェート(NBT/BCIP)であった。miR‐221、miR‐301およびmiR‐376aの前駆体に対するプライマー配列は、実施例1におけるプロファイリングのために使用されたものと同様であった。陰性対照においては、プライマーの除外および無関係な(ヒトパピローマウイルスに特異的な)プライマーによる置換が行われたが、それはこのウイルスが膵組織に感染しないためであった。RT in situ PCRは、保存状態のホルマリン固定パラフィン包埋試料1050005A2(T)において行った(図3)。
正常な膵臓組織に特異的であるか、あるいは正常な膵臓組織において濃縮されるかのいずれかのmiRNAを同定するために、184の成熟型miRNAの発現を、22の正常なヒト組織におけるリアルタイムPCRを使用して測定した。これらの組織には、脂肪、膀胱、脳、子宮頚部、大腸、食道、心臓、腎臓、肝臓、肺、骨格筋、卵巣、膵臓、胎盤、前立腺、脾臓、小腸、気管、胸腺、甲状腺、精巣、および正常なB細胞が含まれる。膵臓特異的miRNAは、膵臓においては高発現で、他の21の正常組織においては発現がほとんど検出されないmiRNAと定義された。膵臓濃縮miRNAは、膵臓組織における発現が他の21の組織の平均よりも10倍以上のmiRNAと定義された。膵臓濃縮miRNAは、他の組織の一部に存在してもよい。膵臓特異的miRNAには、miR‐216やmiR‐217が含まれる。膵臓濃縮miRNAには、miR‐7、miR‐148aおよびmiR‐375が含まれる。
膵臓癌において特異に発現するmiRNAを同定するために、9つの膵臓癌腫瘍と、膵
疾患のない6人のドナーからの膵臓とにおけるリアルタイムPCRを使用して、184の成熟型miRNAの発現を測定した。成熟型miRNAは、市販されるリアルタイムPCR検定(TaqMan(登録商標)マイクロRNA検定、Applied Biosystems、米国カリフォルニア州フォスターシティー)を使用して測定した。この検定は、実施例3で説明した通りに実施された。リアルタイムPCRデータは、ヒートマップとして示され、管理されない階層的クラスタリングを使用して解析された(図15)。多少のmiRNAの発現が15の試料のすべてにおいて検知されず、これらのmiRNAはヒートマップに含めなかった。多くの成熟型miRNAは、正常膵臓よりも膵臓腫瘍における発現が増加した。ヒートマップはまた、成熟型miRNA発現プロファイルによって、膵臓腫瘍と正常とを区別することが、その両者が樹状図の分かれた分枝として出現するために可能になることを示す。正常に比べた腫瘍における成熟型miRNA発現の倍率変化およびp値を、図16に示す。
いくつかの方法を使用して、成熟型miR‐21の発現は、膵臓腺癌細胞に局在し、膵臓の腺房、間質および他の非癌細胞には局在しなかったことを示した。(図17)in situ RT‐PCRは、正常膵臓の切片(A)および膵臓癌(B)に適用され、miR‐21の発現増加が腫瘍に局在することを示した。膵管腺癌および正常な(非癌)膵臓管を、レーザー顕微解剖を使用していくつかの検体から単離した。RNAを顕微解剖組織から単離し、次いで18S rRNA内部コントロールと同様に成熟型miR‐21をリアルタイムPCRによって定量化した。成熟型miR‐21は、正常膵臓管(C)よりも顕微解剖腫瘍組織において実質的に増加した。前に記載された通りに成熟型miRNAの市販されるリアルタイムPCR検定を使用して、膵臓腫瘍の9つの検体および6つの正常膵臓検体において、成熟型miR‐21を検定した。成熟型miR‐21発現は、腫瘍(D)において増加した。成熟型miR‐21発現を、2つの正常膵臓上皮細胞株および転移癌に由来する3つと原発性膵臓癌に由来する4つとを含む7つのヒト膵臓癌細胞株におけるリアルタイムPCRによって定量化した。成熟型miR‐21発現は、正常膵臓細胞株(E)よりも7つの膵臓癌細胞株のすべてにおいて増加した。
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