JP2012208115A

JP2012208115A - 生体関連物質検出用ゲルマイクロアレイの製造方法

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Publication number: JP2012208115A
Application number: JP2012054350A
Authority: JP
Inventors: Chuhei Otsuki; 宙平大槻
Original assignee: Mitsubishi Rayon Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Rayon Co Ltd
Priority date: 2011-03-15
Filing date: 2012-03-12
Publication date: 2012-10-25
Anticipated expiration: 2032-03-12
Also published as: JP5660468B2

Abstract

【課題】マイクロアレイ全体において均質なゲルスポットを形成すること。
【解決手段】以下の工程を含む、生体関連物質検出用マイクロアレイの製造方法。
（１）複数本の中空繊維を、中空繊維の各繊維軸が同一方向となるように３次元に配列し、その配列を樹脂で固定することにより、中空繊維束を製造する工程
（２）必要に応じて、前記中空繊維の中空部に液体を導入し、一定時間保持させる工程
（３）キャプチャープローブを含むゲル前駆体溶液を中空繊維の中空部に導入する工程
（４）水相中で、中空繊維の中空部に充填されたゲル前駆体溶液を重合させる工程
（５）中空繊維束を繊維の長手方向に交叉する方向で切断して薄片化する工程。
【選択図】図１

Description

本発明は、生体関連物質検出用マイクロアレイの製造方法に関する。

近年、多数遺伝子の一括発現解析を可能とするＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡチップ法）と呼ばれる分析法が開発されている。このようなＤＮＡマイクロアレイの一例として、複数の区画を有し、各区画が孔や中空繊維により形成されており、キャプチャープローブを含むゲル状物が各区画に保持されている生体関連物質検出用マイクロアレイが提案されている（特許文献１及び特許文献２参照）。

このようなマイクロアレイは、例えば以下の（１）〜（３）を順次行う方法により製造される。（１）複数本の有機材料からなる中空繊維を、中空繊維の各繊維軸が同一方向となるように３次元に配列し、その配列を樹脂で固定した中空繊維束を製造する工程；（２）キャプチャープローブを含むゲル前駆体溶液を各中空繊維の中空部に導入し、反応させることで、キャプチャープローブを含むゲル状物を中空繊維の中空部に保持する工程；（３）中空繊維束を繊維の長手方向に交叉する方向で切断して薄片化する工程。

このような製造方法は、平面基板にプローブを固定化する際に使用するフォトリソグラフィー法やスポッティング法と比較すると、高価な製造設備を必要とせず、安定した品質のものが大量に生産できるという利点を有する。

また、当該製造方法で製造されたマイクロアレイによれば、キャプチャープローブを含むゲル状物を中空繊維の中空部に保持するため、単に平面基板にキャプチャープローブを保持するマイクロアレイと比較して、一区画により多くの量のキャプチャープローブを保持することができるので、高い検出感度を達成することができる。さらには、電気泳動によるハイブリダイゼーション反応を行うことができるので、検査時間の短縮にもつながる。

国際公開第００／４０９４２号パンフレット国際公開第０１／９８７８１号パンフレット特開平１１−１０８９２８号公報特開２００１−１３３４５３号公報特開２００５−３７３０３号公報特許３８３４５１９号公報

しかしながら、前記のマイクロアレイは、外側（外周）に配置されるに従って、配列された中空繊維の中空部に保持されたゲル状物（以下、「ゲルスポット」という）を介して固定化されたキャプチャープローブの検体捕捉能力、即ちゲルに固定化されたオリゴＤＮＡ（キャプチャープローブ）と検体との反応性が低くなることがあった。即ち、マイクロアレイ全体において均質なゲルスポットが形成されないことがあった。

そこで、本発明の主な目的は、マイクロアレイ全体において均質なゲルスポットを有するマイクロアレイを製造する方法を提供することにある。

本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、中空繊維中に充填されたゲル前駆体溶液を水相中で重合させることにより上記課題を達成することを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は、以下の工程を含む生体関連物質検出用マイクロアレイの製造方法に関する。
（１）複数本の中空繊維を、中空繊維の各繊維軸が同一方向となるように３次元に配列し、その配列を樹脂で固定することにより、中空繊維束を製造する工程
（２）必要に応じて、前記中空繊維の中空部に液体を導入し、一定時間保持させる工程
（３）キャプチャープローブを含むゲル前駆体溶液を中空繊維の中空部に導入する工程
（４）水相中で、中空繊維の中空部に充填されたゲル前駆体溶液を重合させる工程
（５）中空繊維束を繊維の長手方向に交叉する方向で切断して薄片化する工程。

本発明によれば、中空繊維の中空部に保持されたゲルスポット中のプローブの検体捕捉能力（検体との反応性）が配置された位置によって差異が生じることのない（マイクロアレイ全体において均質なゲルスポットを有する）マイクロアレイを製造することができる。

配列固定器具の概念図である。実施例１で得られたマイクロアレイのゲルスポットの一部を示す顕微鏡写真である。比較例１で得られたマイクロアレイのゲルスポットの一部を示す顕微鏡写真である。作製したマイクロアレイのスポット配列を示す概念図である。

本発明に係る生体関連物質検出用マイクロアレイ（以下、「マイクロアレイ」ということがある。）の製造方法における各工程について、以下に詳細に説明する。

（１）複数本の中空繊維を、中空繊維の各繊維軸が同一方向となるように３次元に配列し、その配列を樹脂で固定することにより、中空繊維束を製造する工程（第１工程）
（１−１）中空繊維
「中空繊維」の成分は限定されず、有機材料を主成分とする中空繊維が好ましい。有機材料を主成分とする中空繊維としては、例えば、ナイロン６、ナイロン６６、芳香族ポリアミド等のポリアミド系中空繊維、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカーボネート等のポリエステル系中空繊維、ポリアクリロニトリル等のアクリル系中空繊維、ポリエチレンやポリプロピレン等のポリオレフィン系中空繊維、ポリメタクリル酸メチル等のポリメタクリレート系中空繊維、ポリビニルアルコール系中空繊維、ポリ塩化ビニリデン系中空繊維、ポリ塩化ビニル系中空繊維、ポリウレタン系中空繊維、フェノール系中空繊維、ポリフッ化ビニリデンやポリテトラフルオロエチレン等からなるフッ素系中空繊維、ポリアルキレンパラオキシベンゾエート系中空繊維等が挙げられる。

当該中空繊維の製造方法は限定されず、特許文献３に記載されたような公知の方法で製造することができる。例えば、溶融紡糸法が好ましく、ノズルとしては馬蹄型やC型ノズル、２重管ノズルなどを使用することができる。本発明においては、連続した均一な中空部を形成させることができる点で２重管ノズルを用いるのが好ましい。

本発明で使用する中空繊維は多孔質であってもよく、溶融紡糸法又は溶液紡糸法に延伸法、ミクロ相分離法、抽出法などの公知の多孔化技術を組み合わせることにより得ることができる。多孔度は特に限定されるものではないが、繊維材料単位長さ辺りに固定化される生体高分子の密度を高めるという観点から、比表面積が大きくなるように高い多孔度であることが望ましい。

中空繊維の内径は限定されず、本発明により得られるマイクロアレイを使用する実験目的や実験等に応じて適宜選択することができる。中空繊維の内径は、１０〜２０００μｍが好ましく、１５０〜１０００μｍがより好ましい。

また、必要に応じて、中空繊維にはカーボンブラック等の黒色顔料を適量含有させたものを用いることもできる。黒色顔料を含有することにより、検出する際にゴミ等の夾雑物由来の光学的ノイズを軽減することができたり、また、樹脂の強度を上げたりすることができる。顔料の含有量は限定されず、中空繊維のサイズやマイクロアレイの使用目的等に応じて適宜選択することができる。顔料の含有量は、例えば０．１〜１０質量％とすることができ、０．５〜５質量％が好ましく、１〜３質量％がより好ましい。

（１−２）中空繊維束
上記中空繊維の複数本を、中空繊維の各繊維軸が同一方向となるように３次元に配列し、その配列が乱れないように接着剤等の樹脂で固定して、中空繊維束を得ることができる。

中空繊維束を製造する方法としては、例えば、粘着シート等のシート状物に複数本の中空繊維を所定の間隔をもって平行に配置し、シート状とした後、このシートを螺旋状に巻き取る方法（特許文献３）が挙げられる。

また、複数の孔が所定の間隔をもって設けられた多孔板２枚を孔部が一致するように重ねあわせ、それらの孔部に、中空繊維を通過させ、２枚の多孔板の間隔を開き、２枚の多孔板間の、中空繊維の周辺に硬化性樹脂原料を充満させ硬化させる方法（特許文献４）が挙げられる。

硬化性樹脂原料としては、ポリウレタン樹脂、エポキシ樹脂等の有機材料からなるものが好ましい。より詳細には、以下に例示する有機高分子等から構成される１種類以上の材料から形成されているものが好ましい。

有機高分子としては、ポリウレタン、シリコン樹脂、エポキシ樹脂などのゴム材料や、ナイロン６、ナイロン６６、芳香族ポリアミド等のポリアミド系樹脂、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカーボネート等のポリエステル系樹脂、ポリアクリロニトリル等のアクリル系樹脂、ポリエチレンやポリプロピレン等のポリオレフィン系樹脂、ポリメタクリル酸メチル等のポリメタクリレート系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、ポリ塩化ビニリデン系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、フェノール系樹脂、ポリフッ化ビニリデンやポリテトラフルオロエチレン等からなるフッ素系樹脂、ポリアルキレンパラオキシベンゾエート系樹脂等が挙げられる。

有機高分子にはカーボンブラック等の黒色顔料を適量含有させることもできる。黒色顔料を添加することにより、検出する際にゴミ等の夾雑物由来の光学的ノイズを軽減することができたり、また、樹脂の強度を上げたりすることができる。

また、有機系のブロックを使用することもでき、有機系ブロックにレーザー等により複数の貫通孔を形成させて、マイクロアレイを作ることもできる。各貫通孔は有機系のブロックに互いに平行に配置され、所定の間隔をもって形成されることが好ましい。貫通孔の形状は、正方形、長方形、円形等である。円形の場合、その直径は１０〜２０００μｍ程度である。また貫通孔の配置は、同心円状、らせん状等である。貫通孔は１０〜１０，０００孔／ｃｍ^２の密度でブロックに形成することができる。

更に、隣接する中空繊維の外表面を相互に融着することによっても中空繊維束を製造することもできる。

配列の固定は、配列した中空繊維の全長又は所定部分に対して行う。配列した中空繊維の少なくとも一方の端部から適当な長さの部分は固定しない状態とすることもできる。

本発明で配列する中空繊維の数、すなわちスポットの数は限定されず、目的とする実験等に応じて適宜選択することができる。従って、中空繊維同士の距離も、マイクロアレイの面積と配列する中空繊維の数等に応じて適宜選択することができる。

（２）必要に応じて、前記中空繊維の中空部に液体を導入し、一定時間保持させる工程（第２工程）
第２工程は任意であり、当該工程を行っても行わなくても良い。第２工程を行うことにより、マイクロアレイ全体において、より均質なゲルスポットを有するマイクロアレイを得ることができるので好ましい。

第２の工程では、第１の工程で得られた中空繊維束の各中空繊維の中空部に、液体を導入する工程である。本工程は、気相中で行っても良いし、水相中で行っても良い。

液体を導入する方法としては、例えば特許文献５記載の方法が挙げられる。より詳細には、一端を封止した中空繊維の中空部を一旦真空にしておき、該中空繊維の開放しているもう一端の先端部分を液体に浸漬させた後、圧力を真空から常圧にして、中空部内と外側との圧力差を利用して液体を中空部へ導入する方法などが挙げられる。この方法の他に、中空繊維の両端を開放しておき、片方の先端部を液体に浸漬させて、もう片方から吸い上げて中空部へ液体を導入してもよい。

中空繊維の中空部に導入した液体は、一定時間保持させた後、排出させる。一定時間とは、導入した液体の一部が中空繊維の中空部内壁面から中空繊維中に浸透するのに要する時間である。当該時間は、中空繊維の中空部に満たされた液体が十分に中空部内壁面から中空繊維に浸透できれば限定されない。例えば、自然拡散により液体を中空繊維へ浸透させる場合は、少なくとも３時間以上保持させることが好ましく、より好ましくは１０時間、更に好ましくは１５時間以上である。また、中空繊維の中空部へ液体を導入した後、該中空繊維束の外側を真空にして、中空部内側と外側の圧力差を利用して中空部に導入した液体の一部を強制的に浸透させることもできる。

ここで使用する液体の種類は、後の工程でゲルが中空繊維の中空部に十分に保持されるのを妨げないものであれば限定されず、ゲルの種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、水、緩衝液等を使用することができ、ゲル前駆体溶液の溶媒として水を好適に使用することから、水が好ましい。

液体を一定時間保持させた後、中空繊維の中空部へ導入した余剰の液体を排出させる。排出させる方法は、例えば特許文献５記載の方法で行うことができる。より詳細には、液体を導入した中空繊維の中空部を再び真空にして、導入した液体を排出させる方法がある。この他、中空繊維の片端から吸引することもできるし、片端から気体を中空部に吹き込んで中空繊維端のもう一方の端から液体を押し出すこともできる。また、気体を吹き込む代わりに、下で述べるゲル前駆体溶液を導入することによろい液体を押し出すこともできる。

（３）キャプチャープローブを含むゲル前駆体溶液を中空繊維の中空部に導入する工程（第３工程）
第３の工程では、キャプチャープローブを含むゲル前駆体溶液を導入する。本工程は、気相中で行っても良いし、水相中で行っても良い。

「キャプチャープローブ」とは、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）、アミノ酸、ペプチド、糖、脂質、抗体、さらには化学結合、物理結合などの相互作用により生体関連物質を検出しうる有機化合物、無機化合物等をいう。それらは、生細胞からの抽出、化学合成等により調製される。

例えば、生細胞からのＤＮＡの調製は、Ｂｌｉｎらの方法（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．３．２３０３（１９７６））等により行うことができる。また、ＲＮＡの調製は、Ｆａｖａｌｏｒｏらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５．７１８（１９８０））等により行うことができる。

「生体関連物質」とは、生体内に存在する高分子有機化合物のことをいい、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）、アミノ酸、ペプチド、糖、脂質、抗体を例示することができる。

「ゲル前駆体溶液」とは、架橋構造を形成してゲル化をもたらす化学物質を含む溶液をいう。例えば、単量体、多官能性単量体、重合開始剤及び水等を含む溶液である。また、アルギン酸等の多糖類と二価のイオン及び水を含む溶液、又はゼラチン等のタンパク質、タンパク質のアミノ酸残基と結合性のある多官能性単量体及び水を含む溶液であってもよい。

単量体としては、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルアミノエトキシエタノール、Ｎ−アクリロイルアミノプロパノール、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン、ヒドロキシエチルメタクリレート、（メタ）アクリル酸及びアリルデキストリン等が挙げられる。多官能性単量体としては、メチレンビス（メタ）アクリルアミド、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。

単量体成分の濃度は特には限定されず、単量体の種類、目的とするゲルの種類等に応じて適宜選択することができる。単量体成分の濃度は、例えば０．５〜２０質量％とすることができ、１〜１０質量％が好ましく、３〜５質量％がより好ましい。また、例えば、アクリルアミド系単量体の場合は２．５〜１０質量％程度、好ましくは３〜７質量％、より好ましくは３〜５質量％とすることができる。

上記ゲル前駆体溶液は、例えば、微細な針を有するシリンジに前記溶液を吸引し、各中空繊維の中空部に針を差し込むことにより導入すればよい。また、中空繊維束の一方の端部が固定されていない場合は、以下の方法によりゲル前駆体溶液を中空繊維内へ導入することもできる。即ち、まず中空繊維束とゲル前駆体溶液をデシゲーター内に設置する。次いで、中空繊維束の中空繊維が固定されていない端部を、この溶液中に浸し、デシゲーター内を減圧状態し、中空繊維の中空部にこの溶液を導入すればよい。

（４）水相中で、中空繊維の中空部に充填されたゲル前駆体溶液を重合させる工程（第４工程）
第４工程では、先（第３）の工程で中空繊維束に充填されたゲル前駆体溶液を、水相中で重合させる。水相中でゲル前駆体溶液を重合させることにより、マイクロアレイ中の全スポットにおいて均質なゲルスポットを得ることができる。従って、本発明で得られたマイクロアレイを使用することにより、より精度の優れた測定結果を得ることができる。

本明細書中における水相中とは、水中だけでなく、水蒸気濃度が高い環境中も含む。水蒸気濃度が高いとは、例えば、５５℃において５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上のことをいう。

ゲル前駆体溶液が充填された中空繊維束を水相中に置く方法としては何ら限定されない。例えば、中空繊維束を直接水中に浸漬させてもよい。その際、中空繊維束にかける静水圧は限定されず、効率良く重合が行われれば良い。静水圧は５０Ｎ／ｍ^２以上とすることが好ましく、１００Ｎ／ｍ^２以上とすることがより好ましい。５０Ｎ／ｍ^２以上とすることにより、重合が十分に行われ、均一なキャプチャープローブを有するマイクロアレイを得ることができる。また、加湿可能な気密性容器に中空繊維束を入れ、飽和水蒸気を吹き込んで加湿してもよい。

次いで、中空繊維の中空部に導入されたゲル前駆体溶液を重合させることにより、キャプチャープローブを含むゲル状物を中空繊維の中空部に保持させる。重合条件は特には限定されず、使用するゲル前駆体の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、ゲル前駆体としてアクリルアミド系の単量体を使用する場合、ラジカル系重合開始剤を使用して重合することができ、ラジカル系重合開始剤の中でも、アゾ系開始剤を利用した熱重合反応による重合がより好ましい。

キャプチャープローブは目的に応じて必要な種類（数）を準備することができる。例えば、中空繊維の数と同一の数のキャプチャープローブを準備し、各中空繊維に互いに異なる１種類のキャプチャープローブを導入することができる。また、複数の中空繊維に同じキャプチャープローブを導入することもできる。

（５）中空繊維束を繊維の長手方向に交叉する方向で切断して薄片化する工程（第５工程）
第５工程では、先（第４）の工程を経て得られた中空繊維束を繊維の長手方向に交叉する方向で、好ましくは直交する方向で切断して、薄片化を行う。

切断の方法は、薄片化することができれば限定されない。例えば、ミクロトーム、レーザー等により行うことができる。得られる薄片の厚みは限定されず、実験の目的等に応じて適宜選択することができる。薄片の厚みは、例えば５ｍｍ以下とすることができ、０．１〜１ｍｍが好ましい。

生体関連物質検出用マイクロアレイ
このようにして得られた生体関連物質検出用マイクロアレイは、最外周に位置するスポットさえもキャプチャープローブの検体捕捉能力（キャプチャープローブと検体との反応性）を十分に備えた、すなわちマイクロアレイ全体において均質なゲルスポットを有するマイクロアレイである。

本発明により得られるマイクロアレイが均質なゲルスポットを有することは、顕微鏡による観察で確認することができる。また、均質な検体捕捉能力を有することは、蛍光等で標識されたモデル検体を用いた実験により確認することができる。

蛍光で標識されたモデル検体を用いた実験に使用する場合、本発明で得られたマイクロアレイは、内側のスポットの蛍光シグナル強度の平均値に対する最外周スポットの蛍光シグナル強度の平均値で表される蛍光強度比（＝最外周スポットの蛍光シグナル強度の平均値／内側のスポットの蛍光シグナル強度の平均値）が０．７〜１．２、好ましくは０．８〜１．１５、より好ましくは０．９〜１．１０である。当該範囲内にあると、そのマイクロアレイは全体的に均質であるといえるからである。

ここで、「最外周のスポット」とは、図４で例示されるようにマイクロアレイにおいて最も外側に位置するスポットのことである。例えば、１６列×１６列のマイクロアレイにおいては６０スポット存在することになる。また、「内側のスポット」とは、最外周のスポット以外のスポットのことをいう。例えば、１６列×１６列のマイクロアレイにおいては１９６スポット存在することになる。

蛍光シグナル強度を測定する方法は限定されず、例えば、特許文献６に記載された公知の方法で測定することができる。より詳細には、マイクロアレイと検体とを６５℃で１６時間ハイブリダイゼーション反応した後、洗浄バッファーを用いて未結合の検体を除去し、マイクロアレイに蛍光物質の励起波長を有する光を照射し（必要により複数の時間）、発せられる蛍光を検出機で測定することができる。ハイブリダイゼーション反応および洗浄方法については、特に限定されず、教本ＤＮＡマイクロアレイ実戦マニュアル（羊土社）などに記載された公知の方法を使用することができる。

蛍光物質の種類も限定されず、下記表１に例示する蛍光物質を使用することができる。これらの蛍光色素を用いて検体に標識する方法としては、例えば、検体調製を行う段階で、検体を増幅させる際に予めビオチン修飾したUTPを検体の塩基配列中に導入し、蛍光色素を修飾したストレプトアビジンを使って間接的に蛍光標識する方法、具体的には、アンビョン社製MessageAmp（登録商標）ＩＩ−Biotin Enhanced KitのInstruction Manual記載の方法、あるいはA Highly Reproducible, Linear, and Automated Sample Preparation Method for DNA Microarrays, David R. Dorris, Ramesh Ramakrishnan, Dionisios Trakas, et al., Genome Res. 2002 12: 976-984記載の方法などが利用できる。その他、臭化エチジウムなどのDNAインターカレーターに蛍光色素を修飾して直接的に検体を標識する方法も使用できる。

以下、具体的態様について実施例で説明する。

＜実施例１＞
（１）キャプチャープローブの調製
配列番号１（gctgcgaaat cactctatcc ttcccatgga cttacctgcc ggtatagcgt）の５’末端がアミノ化された核酸をＤＮＡ合成装置で合成した（インビトロジェン社にて受託合成）。この核酸を１００ｐｍｏｌ／μＬの濃度になるように滅菌水に溶解し、アミノ化核酸溶液を調製した。

この溶液５μＬに、２５ｍＭ炭酸１水素ナトリウム−２５ｍＭ炭酸２水素ナトリウム水溶液２．５μＬ及び１０ｍＭのメタクリル酸無水物溶液（ＤＭＳＯに溶解）２．５μＬを添加し、２５℃で３０分間インキュベートした。

４０μＬの滅菌水を加えて反応を停止し、ビニル基で修飾された核酸溶液（以下、キャプチャープローブ溶液）を得た。

（２）中空繊維束の製造
図１に示す配列固定器具を利用して中空繊維束を製造した。なお、図中のｘ、ｙ、ｚは直交の３次元軸であり、ｘ軸は繊維の長手方向と一致する。

まず、直径０．３２ｍｍの孔が、孔の中心間距離を０．１２ｍｍとして、縦横各１６列で合計２５６個設けられた厚さ０．１ｍｍの多孔板２枚を準備した。これらの多孔板を重ね合わせて、そのすべての孔に、外径２８０μｍ、内径１８０μｍ、長さ１５０ｍｍのポリカーボネート中空繊維を１本づつ、通過させた。

Ｘ軸方向に各繊維に０．１Ｎの張力をかけた状態で２枚の多孔板の位置を移動させて、中空繊維の一方の端部から２０ｍｍの位置と１００ｍｍの位置の２ヶ所に固定した。即ち、２枚の多孔板の間隔を８０ｍｍとした。次いで、多孔板間の空間の周囲３面を板状物で囲った。このようにして上部のみが開口状態にある容器を得た。

次に、この容器の上部から容器内に樹脂原料を流し込んだ。樹脂としては、ポリウレタン樹脂接着剤（日本ポリウレタン工業（株）ニッポラン４２７６、コロネート４４０３）の総質量に対し、２．５質量％のカーボンブラックを添加したものを使用した。２５℃で１週間静置して樹脂を硬化させた。次いで多孔板と板状物を取り除き、中空繊維束を得た。得られた中空繊維束をデシケーター中に入れ内部を窒素置換した後、１６時間静置した。

（３）中空繊維束の中空部を水で飽和させる処理
水の入った容器を準備し、前述のデシゲーター内に設置した。デシケーター内を減圧状態にしたのち、中空繊維束の繊維束が固定されていない一方の中空繊維の端部（以下、端部と称す）を水に浸漬した。デシケーター内に窒素ガスを封入し、中空繊維の中空部に水を導入した。

中空繊維の中空部に水を導入した状態で１６時間放置した。１６時間後、中空部の水を真空減圧により放出した。中空繊維束の吸水率（吸水率（％）＝〔（中空部に水を導入し１６時間保持後、中空部の水を放出した後の中空繊維束質量）−（水を導入する前の中空繊維束の質量）〕／水を導入する前の中空繊維束の質量×１００）は１．４％であった。

（４）ゲル前駆体溶液の中空繊維中空部への導入
表２に示す水溶液Ａを調製し、デシゲーター内に設置した。前述の方法と同様に端部から水溶液Ａを吸引し、中空繊維の中空部に導入した。

（５）中空繊維束を水相中に配置する工程
水溶液Ａを導入後、一旦デシケーターから中空繊維束を取り出して、予め脱気処理および窒素置換処理を施した５００ｍＬの純水が入った容器に、封止していない方の中空繊維の先端を上側にし、該先端が純水に接触しないように注意深く中空繊維の接着部が完全に漬かるように中空繊維束を浸漬させた。この時、中空繊維束を浸漬させた容器内にある中空繊維束の接着部の最上部で水圧を計測すると、５０Ｎ／ｍ^２であった。

（６）重合反応
次いで、前記の中空繊維束を浸漬させた純水の入った容器を前記デシケーター内に設置し、５５℃で３時間、重合反応を実施した。

（７）薄片化
重合反応終了後、ミクロトームを用い、中空繊維束を中空繊維の長手方向に直角方向に厚さ２５０μｍに薄片化した。このようにして、２５６個のキャプチャープローブを含むゲルスポットを搭載した厚さ２５０μｍのマイクロアレイを１００枚得た。

（８）マイクロアレイの評価
ゲルスポットは、顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ社製蛍光顕微鏡エクリプスＥ６００対物レンズ×１０ＮＡ＝０．３）を使用して観察した。

水を満たした光透過性のシャーレにマイクロアレイを浸漬し、シャーレを顕微鏡のステージに載せ、シャーレの底部より白色光を照射した。レンズのピントを調整しながら、前述で得た１００枚のマイクロアレイに関して、最外周に配置されたゲルスポットとその内側に配置されたゲルスポットをそれぞれ顕微鏡にて観察した。

その結果、すべてのマイクロアレイにおいて、最外周に配置されたゲルスポットとその内側のゲルスポットでピントの合う位置に差異は認められず、均質なゲルスポットが形成されていることが確認された。観察結果の一部を図２に示した。

＜比較例１＞
前述の（５）の処理を行わない以外は、実施例１と同様に操作を行った。その結果、すべてのマイクロアレイで最外周とその内側のゲルスポットとでピントの合う位置に差異が認められた。観察結果の一部を図３に示した。

＜実施例２＞
次に、本発明の製造方法で作製したマイクロアレイの各スポットの検出シグナル強度を評価するために、モデル検体となるオリゴＤＮＡを使ってハイブリダイゼーション反応を行った。

（１）マイクロアレイの製造
実施例１のキャプチャープローブの配列を配列番号２（tctcgaaagg cttcctactc ggctgtgagt ctttacggca accctgtccg gtattgggaa atctt）（インビトロジェン社にて受託合成）に変更した以外は、実施例１の（１）から（７）と同様の方法でマイクロアレイを製造した。

（２）モデル検体の蛍光標識
まず、配列番号２と相補の配列となる配列番号３（aagatttccc aataccggac agggttgccg taaagactca cagccgagta ggaagccttt cgaga）（インビトロジェン社にて受託合成）の１ｐｍｏｌ／μＬの超純水溶液を調製した。

次に、モデル検体の標識液をクレアテック社製の蛍光標識試薬PlatinumBright（登録商標）を使って以下の通り調製した。先に調製したオリゴDNA（配列番号３）の溶液１pmol／μLとPlatinumBright（登録商標）の構成品であるPlatinumBright647 infrared（励起光６４７nm、蛍光６６５nmの蛍光標識剤）及び同じく同試薬の構成品である10x Labeling Solutionの表３の通り配合した溶液を調製した。

表３の配合で溶液を以下の手順で蛍光標識剤とオリゴDNAとを反応させることにより、蛍光標識液を調整した。

まず、表３で配合した溶液２０μＬを８５℃で３０分インキュベートして、反応させた。次に、PlatinumBright（登録商標）の構成品である精製カラム（KREAPure purification columns）をボルテックスで内容物をよく攪拌した後、カラムの先を折り、ふたを１／４開けて２ｍＬのチューブにのせて、１４，０００ｒｐｍで１分遠心した。得られた溶出液を捨て、Ｄ．Ｗ．３００μＬ加えて、再度１４，０００ｒｐｍで１分間遠心した。その後、カラムを１．５ｍＬのチューブに移し、先の反応させた標識液を樹脂用にロードし、更に１４，０００ｒｐｍで１分遠心させた。

（３）ハイブリダイゼーション
（２）で調製した標識液から１μＬを計り取り、表４に記載された組成でハイブリダイゼーション溶液を作製した。

次に、先に製造したマイクロアレイをハイブリダイゼーション溶液２００μＬにハイブリチャンバー内で完全に浸漬させ、設定温度６５℃で１６時間ハイブリオーブン中にてインキュベートした。

（４）洗浄
６５℃で１６時間インキュベートした後、マイクロアレイをハイブリチャンバーから取り出し、以下の手順で洗浄操作を行った。

まず、ハイブリダイゼーション後のマイクロアレイをチャンバーからピンセットを用いて取り出し、あらかじめ６５℃にしておいた洗浄バッファーＡ（０．１２ＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ／０．１２ＭＮａＣｌ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０溶液：１０ｍｌ）の入ったチューブにマイクロアレイを浸漬させ、６５℃で２０分間静置した。

次に、６５℃にしておいた洗浄バッファーＡ（０．１２Ｍ−ＮａＣｌ／０．０５％−Ｔｗｅｅｎ２０溶液：１０ｍｌ）の入った別のチューブに入れ替えて、さらに６５℃で２０分間静置した。

その後、６５℃にしておいた洗浄バッファーＢ（０．１２ＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ／０．１２ＭＮａＣｌ溶液１０ｍｌ）の入ったチューブに入れ替えて、６５℃で１０分間静置した。

（５）蛍光シグナル強度の検出
本発明の方法で得たマイクロアレイを５枚用意し、それぞれ検出用のチャンバーに載せ、マイクロアレイを洗浄バッファーＢで満たした。次にマイクロアレイを載せたチャンバーを冷却ＣＣＤカメラ式蛍光顕微鏡の試料台に載せ、波長６５０ｎｍで４秒間励起光をマイクロアレイに照射し、発光される蛍光の強度をそれぞれ測定した。

＜比較例２＞
キャプチャープローブの配列として配列番号２のものを使用した以外は比較例１と同様の方法でマイクロアレイを作製し、実施例２と同じモデル検体を使用して、実施例２と同様の方法で、ハイブリダイゼーション反応を行い、各スポットの蛍光シグナル強度データを取得した。

蛍光シグナル強度の比較
本発明の方法の効果を調べるために、以下の通りマイクロアレイの検出シグナル強度のバラツキを実施例２と比較例２で比較した。

（イ）蛍光シグナル強度のＣＶの比較
まず、測定したマイクロアレイの全スポット（２５６スポット）の蛍光シグナル強度の変動係数ＣＶ（ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｏｆｖａｒｉａｔｉｏｎ）、即ち全スポットの蛍光シグナル強度値の標準偏差をその平均値で除した値をマイクロアレイ５枚についてそれぞれ算出し、その平均値を求めた。実施例２と比較例２とで比較したところ、比較例２のＣＶが約２６％であったのに対し、実施例２のＣＶは１０％未満であった（表５）。

（ロ）スポット位置における蛍光シグナル強度の比較
次に、最外周スポット（６０スポット）の蛍光シグナル強度の平均値を内側のスポット（１９６スポット）の蛍光シグナル強度の平均値で割った値をそれぞれ５枚のマイクロアレイについて算出し、その値の５枚の平均値を実施例２と比較例２とで比較した。なお、最外周スポットと内側のスポットの位置は図４に示した。

その結果、実施例２で得られた数値は０．９４であり、均質なゲルスポットを有するマイクロアレイが得られたことが確認できた。これに対して、比較例２では０．４４であった（表５）。

以上の結果から、本発明の方法により各スポットの蛍光シグナル強度がより均一になることが確認できた。

１配列固定器具
１１孔部
２１多孔板
３１中空繊維
４１板状物

Claims

以下の工程を含む、生体関連物質検出用マイクロアレイの製造方法。
（１）複数本の中空繊維を、中空繊維の各繊維軸が同一方向となるように３次元に配列し、その配列を樹脂で固定することにより、中空繊維束を製造する工程
（２）キャプチャープローブを含むゲル前駆体溶液を中空繊維の中空部に導入する工程
（３）水相中で、中空繊維の中空部に充填されたゲル前駆体溶液を重合させる工程
（４）中空繊維束を繊維の長手方向に交叉する方向で切断して薄片化する工程。
工程（１）の後、工程（２）の前に、中空繊維の中空部に液体を導入し、一定時間保持させる工程を含む、請求項１記載の方法。
水相中が、水中又は５５℃において５０％以上の水蒸気濃度の環境中である、請求項１又は２記載の方法。
水相中が、５０Ｎ／ｍ^２以上の静水圧を有する水中である、請求項４記載の方法。