JP4222903B2 - 生体関連物質検出用マイクロアレイの製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、遺伝子解析等に使用される生体関連物質検出用マイクロアレイに関する。

近年、多数遺伝子の一括発現解析を可能とするＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡチップ法）と呼ばれる分析法が開発されている。

このようなDNAマイクロアレイの例として、複数の区画を有し、各区画が孔や中空繊維により形成されており、キャプチャープローブを含むゲル状物が各区画に保持されている生体関連物質検出用マイクロアレイが提案されている（特許文献１及び特許文献２参照）。

これらのマイクロアレイは、例えば以下の(1)〜(3)を順次行う方法により製造される。

(1) 複数本の有機材料からなる中空繊維を、中空繊維の各繊維軸が同一方向となるように３次元に配列し、その配列を固定して、中空繊維束を製造する工程。

(2) キャプチャープローブを含むゲル前駆体溶液を各中空繊維の中空部に導入し、キャプチャープローブを含むゲル状物を中空繊維の中空部に保持する工程。

(3) 中空繊維束を繊維の長手方向に交叉する方向で切断して薄片化する工程。

この製造方法は、フォトリソグラフィー法やスポッティング法と比較して高価な製造設備を必要とせず、製造工程が簡略化できるという利点を有する。

また、これにより製造されたマイクロアレイは、キャプチャープローブを含むゲル状物を中空繊維の中空部に保持するため、単にシートの表面にキャプチャープローを保持する場合と比較して、一区画により多くの量のキャプチャープローブを保持することができる。さらには電気泳動によるハイブリダイゼーション反応を行うことができる。
国際公開第００／４０９４２号 国際公開第０１／９８７８１号

しかし、上記のマイクロアレイは、中空繊維の中空部に保持されているゲル状物に空洞を生じている場合がある。また、中空繊維の内壁とその中空部に保持されているゲル状物との界面に隙間を生じている場合がある。そのようなマイクロアレイを検査に使用した場合、空洞や隙間に検体が優先的に流れ、ゲル状物に含まれているキャプチャープローブの一部しか検体との反応に利用されない。

本発明は上記の問題点を解決したマイクロアレイの製造方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、前記問題が生じる原因を調べたところ、中空繊維の中空部にゲル前駆体溶液を導入する際、前記溶液中の水分が中空繊維の中空部から漏出することにより、ゲル状物の空洞や隙間が生じることが分かった。このような現象は予測もしえなかったことである。

この現象に対して、まず中空繊維束を水で飽和した後、各中空繊維の中空部にキャプチャープローブを含むゲル前駆体溶液を導入することにより、前記問題が解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は,以下の(1)〜(4)の工程を順次行うことを含む生体関連物質検出用マイクロアレイの製造方法である。

(1) 複数本の有機材料からなる中空繊維を、中空繊維の各繊維軸が同一方向となるように３次元に配列し、その配列を固定して、中空繊維束を製造する工程。

(2) 中空繊維束を水で飽和する工程。

(3) キャプチャープローブを含むゲル前駆体溶液を各中空繊維の中空部に導入し、キャプチャープローブを含むゲル状物を中空繊維の中空部に保持する工程。

(4) 中空繊維束を繊維の長手方向に交叉する方向で切断して薄片化する工程。

中空繊維束を水で飽和した後、各中空繊維の中空部にキャプチャープローブを含むゲル前駆体溶液を導入することにより、中空繊維の中空部に保持されたゲル状物の空洞がなく、また中空繊維界面とゲル状物との間に隙間がないマイクロアレイを製造することができる。

本発明は、以下の(1)〜(4)の工程を順次行うことを含む生体関連物質検出用マイクロアレイの製造方法である。

(1) 複数本の有機材料からなる中空繊維を、中空繊維の各繊維軸が同一方向となるように３次元に配列し、その配列を固定して、中空繊維束を製造する工程。

(2) 中空繊維束を水で飽和する工程。

(3) キャプチャープローブを含むゲル前駆体溶液を各中空繊維の中空部に導入し、キャプチャープローブを含むゲル状物を中空繊維の中空部に保持する工程。

(4) 中空繊維束を繊維の長手方向に交叉する方向で切断して薄片化する工程。

第１の工程で、複数本の有機材料からなる中空繊維を、中空繊維の各繊維軸が同一方向となるように３次元に配列し、その配列を固定して、中空繊維束を製造される。

「有機材料からなる中空繊維」としては、例えば、ナイロン６、ナイロン６６、芳香族ポリアミド等のポリアミド系中空繊維、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカーボネート等のポリエステル系中空繊維、ポリアクリロニトリル等のアクリル系中空繊維、ポリエチレンやポリプロピレン等のポリオレフィン系中空繊維、ポリメタクリル酸メチル等のポリメタクリレート系中空繊維、ポリビニルアルコール系中空繊維、ポリ塩化ビニリデン系中空繊維、ポリ塩化ビニル系中空繊維、ポリウレタン系中空繊維、フェノール系中空繊維、ポリフッ化ビニリデンやポリテトラフルオロエチレン等からなるフッ素系中空繊維、ポリアルキレンパラオキシベンゾエート系中空繊維等が挙げられる。

中空繊維の内径は任意に設定できる。好ましくは、10〜2000μmである。また中空繊維にはカーボンブラック等の黒色顔料を適量含有させたものを用いることもできる。

上記中空繊維の複数本を、中空繊維の各繊維軸が同一方向となるように３次元に配列し、その配列が乱れないように接着剤等で固定して、中空繊維束を得る。

中空繊維束を製造する方法としては、例えば、粘着シート等のシート状物に複数本の中空繊維を所定の間隔をもって平行に配置し、シート状とした後、このシートを螺旋状に巻き取る方法（特開平11-108928号公報参照）が挙げられる。

また、複数の孔が所定の間隔をもって設けられた多孔板２枚を孔部が一致するように重ねあわせ、それらの孔部に、中空繊維を通過させ、２枚の多孔板の間隔を開き、２枚の多孔板間の、中空繊維の周辺に硬化性樹脂原料を充満させ硬化させる方法（特開2001-133453号公報参照）が挙げられる。

接着剤としては、ポリウレタン樹脂、エポキシ樹脂等を用いることができる。接着剤にはカーボンブラック等の黒色顔料を適量含有させたものを用いることもできる。

また、隣接する中空繊維の外表面を相互に融着することによって中空繊維束を製造することもできる。

配列の固定は、配列した中空繊維の全長又は所定部分に対して行う。配列した中空繊維の少なくとも一方の端部から適当な長さの部分は固定しない状態とすることもできる。

第２の工程では、第１の工程で製造した中空繊維束を水で飽和する。中空繊維束を水で飽和するには、例えば、中空繊維の中空部に水を充填した状態で保存する方法、中空繊維束を水中に浸漬し保存する方法、水蒸気で満たされた密閉系中に中空繊維束を保存する方法等が挙げられる。

第３の工程では、第２の工程で得られた中空繊維束の各中空繊維の中空部にキャプチャープローブを含むゲル前駆体溶液を導入し、キャプチャープローブを含むゲル状物を中空繊維の中空部に保持する。

「キャプチャープローブ」とは、核酸、アミノ酸、ペプチド、糖、脂質、抗体、さらには化学結合、物理結合などの相互作用により生体関連物質を検出しうる有機化合物、無機化合物等をいう。それらは、生細胞からの抽出、化学合成等により調製される。

例えば、生細胞からのDNAの調製は、Blinらの方法(Nucleic Acids Res.3.2303(1976))等により行うことができる。また、RNAの調製は、Favaloroらの方法(Methods.Enzymol.65.718(1980))等により行うことができる。

「ゲル前駆体溶液」とは、架橋構造を形成してゲル化をもたらす化学物質を含む溶液をいう。例えば、単量体、多官能性単量体、重合開始剤、及び水等を含む溶液である。また、アガロース、アルギン酸ナトリウムなどの多糖類、ゼラチン等のタンパク質等である。

単量体としては、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルアミノエトキシエタノール、Ｎ−アクリロイルアミノプロパノール、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン、ヒドロキシエチルメタクリレート、（メタ）アクリル酸及びアリルデキストリン等が挙げられる。多官能性単量体としては、メチレンビス（メタ）アクリルアミド、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。

単量体成分の濃度は単量体の種類にもよるが、例えばアクリルアミド系単量体の場合は２〜２０質量％程度である。

上記ゲル前駆体溶液は、例えば、微細な針を有するシリンジに前記溶液を吸引し、各中空繊維の中空部に針を差し込むことにより導入する。

また、中空繊維束の一方の端部が固定されていない場合は、以下の方法によりゲル前駆体溶液を中空繊維内へ導入することもできる。

即ち、まず中空繊維束とゲル前駆体溶液をデシゲーター内に設置する。次いで、中空繊維束の中空繊維が固定されていない端部を、この溶液中に浸し、デシゲーター内を減圧状態し、中空繊維の中空部にこの溶液を導入する。

ゲル前駆体溶液の導入後、所定の条件でゲル化を実施することにより、中空繊維内にゲル状物が保持される。ゲル化の条件は、使用したゲル前駆体の種類により適宜選択される。

キャプチャープローブは目的に応じて必要な種類（数）が準備される。例えば、中空繊維の数と同一の数のキャプチャープローブを準備し、各中空繊維に互いに異なる１種類のキャプチャープローブを導入することができる。また、複数の中空繊維に同じキャプチャープローブを導入することもできる。

次に、第４の工程を説明する。第４の工程では、第３の工程で得られた中空繊維束を繊維の長手方向に交叉する方向で、通常は直交する方向で、切断して薄片化を行う。

切断は、ミクロトーム、レーザー等により行われる。得られる薄片の厚みは、5mm以下であり、好ましくは0.1mm〜1mmである。

次に第２の発明について説明する。第２の発明では、第１の発明の製造方法と工程順序が相違する。即ち、以下の(1)〜(4)の工程を順次行うことを含む生体関連物質検出用マイクロアレイの製造方法である。

(1) 有機材料からなる中空繊維を水で飽和する工程。

(2) キャプチャープローブを含むゲル前駆体溶液を有機材料からなる中空繊維の中空部に導入し、キャプチャープローブを含むゲル状物を中空繊維の中空部に保持する工程。

(3) 各繊維軸が同一方向となるように複数本の前記中空繊維を３次元に配列し、その配列を固定して、中空繊維束を製造する工程。

(4) 中空繊維束を繊維の長手方向に交叉する方向で切断して薄片化する工程。

上記の各工程は、第１の発明に準じて行うことができる。

次に第３の発明について説明する。第３の発明は、以下の(1)〜(4)の工程を順次行うことを含む生体関連物質検出用マイクロアレイの製造方法。

(1) 互いに平行に配置された複数の貫通孔を含む有機材料からなるブロックを製造する工程。

(2) ブロックを水で飽和する工程。

(3) キャプチャープローブを含むゲル前駆体溶液を各貫通孔に導入し、キャプチャープローブを含むゲル状物を貫通孔に保持する工程。

(4) ブロックを貫通孔の長手方向と交叉する方向で切断して薄片化する工程。

「有機材料からなるブロック」とは、有機高分子等から構成されるブロックをいい、1種類以上の材料から形成されている。

有機高分子としては、ポリウレタン、シリコン樹脂、エポキシ樹脂などのゴム材料や、ナイロン６、ナイロン６６、芳香族ポリアミド等のポリアミド系樹脂、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカーボネート等のポリエステル系樹脂、ポリアクリロニトリル等のアクリル系樹脂、ポリエチレンやポリプロピレン等のポリオレフィン系樹脂、ポリメタクリル酸メチル等のポリメタクリレート系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、ポリ塩化ビニリデン系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、フェノール系樹脂、ポリフッ化ビニリデンやポリテトラフルオロエチレン等からなるフッ素系樹脂、ポリアルキレンパラオキシベンゾエート系樹脂等が挙げられる。

また有機高分子にはカーボンブラック等の黒色顔料を適量含有させることもできる。

有機系のブロックには、レーザー等により複数の貫通孔が形成される。各貫通孔は有機系のブロックに互いに平行に配置され、所定の間隔をもって形成されることが好ましい。貫通孔の形状は、正方形、長方形、円形等である。円形の場合、その直径は10〜2000μm程度である。また貫通孔の配置は、同心円状、らせん状等である。貫通孔は10〜10,000孔／cm²の密度でブロックに形成される。

以後の工程は第１の発明に準じて行うことができる。

上記いずれの製造方法で得られた薄片も生体関連物質検出用のマイクロアレイとして遺伝子検出等に使用される。

（１）キャプチャープローブの調製
配列番号１の５’末端がアミノ化された核酸を合成した。この核酸を100pmol/μlの濃度になるように滅菌水に溶解し、アミノ化核酸溶液を調製した。

配列番号１；
gctgcgaaat cactctatcc ttcccatgga cttacctgcc ggtatagcgt
この溶液5μlに、25mM炭酸１水素ナトリウム−25mM炭酸2水素ナトリウム水溶液を2.5μl及び10mMのメタクリル酸無水物溶液（DMSOに溶解）2.5μlを添加し、25℃で30分間反応を行った。

40μlの滅菌水を加え、反応を停止し、ビニル基で修飾された核酸溶液（以下、キャプチャープローブ溶液）を得た。

（２）中空繊維束の製造
図１に示す配列固定器具を利用して中空繊維束を製造した。なお、図中のｘ、ｙ、ｚは直交の3次元軸であり、ｘ軸は繊維の長手方向と一致する。

まず、直径0.32mmの孔が、孔の中心間距離を0.12mmとして、縦横各16列で合計256個設けられた厚さ0.1mmの多孔板２枚を準備した。これらの多孔板を重ね合わせて、そのすべての孔に、外径280μm、内径180μm、長さ150mmのポリカーボネート中空繊維を１本づつ、通過させた。

Ｘ軸方向に各繊維に0.1Nの張力をかけた状態で２枚の多孔板の位置を移動させて、中空繊維の一方の端部から20mmの位置と100mmの位置の２ヶ所に固定した。即ち、２枚の多孔板の間隔を80mmとした。

次いで、多孔板間の空間の周囲３面を板状物で囲った。このようにして上部のみが開口状態にある容器を得た。

次に、この容器の上部から容器内に樹脂原料を流し込んだ。樹脂としては、ポリウレタン樹脂接着剤（日本ポリウレタン工業（株）ニッポラン4276、コロネート4403）の総重量に対し、2.5質量％のカーボンブラックを添加したものを使用した。２５℃で１週間静置して樹脂を硬化させた。次いで多孔板と板状物を取り除き、中空繊維束を得た。

得られた中空繊維束をデシケーター中に入れ内部を窒素置換した後、16時間静置した。

（３）中空繊維束の水による飽和処理
水の入った容器を準備し、前述のデシゲーター内に設置した。デシケーター内を減圧状態にしたのち、中空繊維束の繊維束が固定されていない一方の端部（以下、端部と称す）を水に浸漬した。デシケーター内に窒素ガスを封入し、中空繊維の中空部に水を導入した。

中空繊維の中空部に水を導入した状態で16時間放置した。16時間後、中空部の水を真空減圧により放出した。

なお、中空繊維束の吸水率は1.4質量%であった。

（４）重合反応
表１に示す水溶液Ａを調製し、デシゲーター内に設置した。前述の方法と同様に端部から水溶液Ａを吸引し、中空繊維の中空部に導入した。導入後、窒素雰囲気下、55℃で３時間、重合反応を実施した。

〈表１〉

（５）薄片化
重合反応終了後、ミクロトームを用い、中空繊維束を中空繊維の長手方向に直角方向にスライスした。

厚さが約５００μmのマイクロアレイを１００枚得た。

（６）マイクロアレイの評価
ゲル状物の形状は、顕微鏡（Nikon社製 蛍光顕微鏡エクリプス E600 対物レンズ×１０ NA＝０．３）を使用して観察した。

水を満たした光透過性のシャーレにマイクロアレイを浸漬し、シャーレを顕微鏡のステージにのせ、シャーレの底部より白色光を照射した。

レンズのピントを調整しながら、前述で得た１００枚のマイクロアレイに関して、そのゲル表面及び内部を顕微鏡にて観察した。

結果、すべてのマイクロアレイにおいて、中空繊維の中空部に保持されたゲル状物に空洞はなかった。また、中空繊維界面とゲル状物との間に隙間はなかった。

＜比較例１＞
前述の（３）の処理を行わない以外は、実施例１と同様に操作を行った。

結果、７８枚のマイクロアレイでゲル状物に空洞が生じた。また、中空繊維界面とゲル状物との間に隙間が生じた。

＜実施例２＞
水溶液Ａの代わりに表２に示す水溶液Ｂを使用した以外は、実施例１と同様の方法で操作した。

結果、すべてのマイクロアレイにおいて、中空繊維の中空部に保持されたゲル状物に空洞はなかった。また、中空繊維界面とゲル状物との間に隙間はなかった。

＜比較例２＞
中空繊維集束物の水による飽和処理を行わない以外は、実施例２と同様に操作した。結果、５６枚のマイクロアレイでゲル状物に空洞が生じた。また、中空繊維界面とゲル状物との間に隙間が生じた。

多数遺伝子の一括発現解析を可能とするＤＮＡマイクロアレイ法に使用される。

配列固定器具の概念図である。

符号の説明

１ 配列固定器具
１１ 孔部
２１ 多孔板
３１ 中空繊維
４１ 板状物

配列番号１：合成DNA

Claims (3)

1. 以下の（１）〜（４）の工程を順次行うことを含む生体関連物質検出用マイクロアレイの製造方法。
   （１） 複数本の有機材料からなる中空繊維を、それらの中空繊維の各繊維軸が同一方向となるように配列し、その配列を固定して、中空繊維束を製造する工程。
   ・ 前記中空繊維の中空部に水を導入し、水を導入した状態で放置し、その後に水を放出する工程。
   （３） キャプチャープローブを含むゲル前駆体溶液を各中空繊維の中空部に導入し、中空部内で重合反応を行い、キャプチャープローブを含むゲル状物を中空繊維の中空部に保持する工程。
   （４） 中空繊維束を繊維の長手方向に交叉する方向で切断して薄片化する工程。
2. 以下の（１）〜（４）の工程を順次行うことを含む生体関連物質検出用マイクロアレイの製造方法。
   （１） 有機材料からなる中空繊維の中空部に水を導入し、水を導入した状態で放置し、その後に水を放出する工程。
   （２） キャプチャープローブを含むゲル前駆体溶液を前記中空繊維の中空部に導入し、中空部内で重合反応を行い、キャプチャープローブを含むゲル状物を中空繊維の中空部に保持する工程。
   （３） 複数本の前記中空繊維をそれらの繊維軸が同一方向となるように配列し、その配列を固定して、中空繊維束を製造する工程。
   （４） 中空繊維束を繊維の長手方向に交叉する方向で切断して薄片化する工程。
3. 以下の（１）〜（４）の工程を順次行うことを含む生体関連物質検出用マイクロアレイの製造方法。
   （１） 互いに平行に配置された複数の貫通孔を含む有機材料からなるブロックを製造する工程。
   （２） ブロックの貫通孔に水を導入し、水を導入した状態で放置し、その後に水を放出する工程。
   （３） キャプチャープローブを含むゲル前駆体溶液を各貫通孔に導入し、貫通孔内で重合反応を行い、キャプチャープローブを含むゲル状物を貫通孔に保持する工程。
   （４） ブロックを貫通孔の長手方向と交叉する方向で切断して薄片化する工程。

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