JP2012044989A - イソマルトオリゴ糖の製造及びその使用 - Google Patents

Abstract

【課題】糖類の基質からイソマルトオリゴ糖（「IMO」）を製造する方法、及びその使用を提供する。
【解決手段】マルトジェニック酵素及び追加のIMO前駆体の存在下で、アスペルギルス（Aspergiluus）種転化酵素は、デンプンスラリーからIMOを製造することができる。トランスグルコシダーゼ酵素として機能する転化酵素の能力はIMO糖化の同時に起こるメカニズムを与える。
【選択図】なし

Description

技術分野
本技術は、一般的に、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）及び/又はアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）から得られた転化酵素を用いてイソマルトオリゴ糖を製造する方法、及びその使用に関する。本方法は、糖類基質からイソマルトオリゴ糖を製造する。

優先権
本願は、2010年8月24日に出願された米国仮出願第61/376,545号の優先権を請求し、その全体的な内容は本明細書に参照によって組み込まれる。

背景
以下の記載は、読者の理解を助けるために提供する。提供する情報又は引用する文献は先行技術であるとは認められない。

イソマルトオリゴ糖（「IMO」又は「IMO（複数）」）は、α-(1,4)-及び/又はα-(1,6)-グルコシド結合の混合物を有する、混合された連結オリゴ糖である。IMOは、イソマルトース、パノース、イソマルトトリオース、イソマルトテトラオース、イソパノース、及び他の高分枝オリゴ糖、例えばフルクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、キシロオリゴ糖及びゲンチオオリゴ糖を含む。IMO製造は、複雑な酵素プロセスを経て起こり、それによって出発の新規な物質は、マルトース基質、例えばコーンシロップに変換される。次いで、IMOは、酵素触媒トランスグルコシド反応によって合成される。

IMOは、機能性健康食品オリゴ糖（「FHFO」）として分類されるオリゴ糖群に属する。IMOは、規則的な基準で消費される時に健康の増進に関連し、時には「プレバイオテクス」と称されることがある。プレバイオテクスは、共生又は有益な微生物の成長を刺激することによって個体に対して生物的効果を発揮する、非-消化性物質、例えば食物繊維と定義される。IMOは、食品及び飲料で用いられる甘味製品として使用することができる。

1つの局面によれば、本開示は、イソマルトオリゴ糖組成物の製造方法であって、以下のステップ：（a）デンプンスラリーを液状酵素と接触させ；及び（b）ステップ（a）の生成物をマルトゲニック酵素及び転化酵素と接触させること、ここで、該マルトゲニック酵素及び該転化酵素は、別個に、順次又は同時に接触されて、イソマルトオリゴ糖（「IMO」）を製造する、を含む、方法を提供する。

1つの実施態様では、マルトゲニック酵素及び転化酵素は、同時に接触される。1つの実施態様では、スラリーは、デンプンの重量で15％〜45％を含む。1つの実施態様では、転化酵素は、（b）のすべての反応物の重量で、少なくとも0.0009％である。1つの実施態様では、転化酵素は、（b）のすべての反応物の重量で、2％未満である。1つの実施態様では、（b）は、2を超え10未満のpHで起こる。1つの実施態様では、(b）は、10℃を超え85％未満の温度で起こる。

1つの局面では、イソマルトオリゴ糖は、イソマルトース、分枝グルコース。DP3グルコース、α-1,4及び/又はα-1,6結合を有するDP3グルコース、パノース、イソマルトトリオース、イソマルトテトラオース、イソマルトペンタオース、イソマルトヘキサオース、及びイソマルトヘプトース、又はそれらの組合せからなる群より選択される。1つの実施態様は、製造されたイソマルトオリゴ糖の少なくとも10％はパノースである。1つの実施態様では、本方法は、イソマルトオリゴ糖を精製することを更に含む。

1つの実施態様では、液状酵素は、α-アミラーゼである。1つの実施態様では、マルトゲニック酵素はβ-アミラーゼである。1つの実施態様では、転化酵素は、トランスグルコシダーゼ活性を有する。1つの実施態様では、転化酵素は、アスペルギルス（Aspergillus）転化酵素である。1つの実施態様では、アスペルギルス転化酵素は、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）転化酵素である。更に又はあるいは、ある実施態様では、アスペルギルス転化酵素は、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）転化酵素である。

1つの実施態様では、スラリーは、1以上のデンプン及び液体から形成される。1つの実施態様では、この1以上のデンプンは、トウモロコシデンプン、米デンプン、麦デンプン、タピオカ、ジャガイモデンプン、サツマイモデンプン、サゴデンプン、大麦デンプン、熱/酸処理デンプン、真珠デンプン、蝋状トウモロコシデンプン、サトウモロコシデンプン、高アミローストウモロコシデンプン、液状デキストロース、及びそれらの組合せから成る群より選択される。1つの実施態様では、デンプンはトウモロコシデンプンである。

1つの局面では、イソマルトオリゴ糖組成物は、（a）デンプンスラリーを液状酵素と接触すること；及び（b）（a）の生成物をマルトゲニック酵素及び転化酵素と接触することを含む、イソマルトオリゴ糖組成物の製造方法であって、該マルトゲニック酵素及び転化酵素が別個に、続いて又は同時に接触される、製造方法によって製造される。

1つの局面では、少なくとも1つの食品成分及びイソマルトオリゴ糖を含む食品は、（a）デンプンスラリーを液状酵素と接触すること；及び（b）（a）の生成物をマルトゲニック酵素及び転化酵素と接触することを含む、イソマルトオリゴ糖組成物の製造方法であって、該マルトゲニック酵素及び転化酵素が別個に、続いて又は同時に接触される、製造方法によって製造される。

図１は、慣用的及び同時の糖化反応を示すチャートである。 図２は、慣用的及び同時の糖化反応中にIMO含量の変化を示すグラフである。

詳細な説明
本明細書には、オリゴ糖、特にIMOを製造する方法が開示される。更に、本明細書には、目的に適ったIMO製造のための改善された方法を与えるステップを用いて、IMOの商業的製造のための方法、ステップ、及び反応が開示される。

以下の詳細な説明では、詳細な説明に記載された例証的実施態様、図面及び特許請求の範囲は、限定することを意味しない。本明細書に示された主題の趣旨又は範囲から逸脱することなく、他の実施態様も利用することができ、他の変更もしてもよい。以下の説明では、多数の用語は広く使用される。以下に記載の用語は、全体として明細書を参照することによってより十分に理解される。単位、接頭語及び記号は、その許容されたSI形式で表記することができる。

本明細書で使用される用語「a」及び「an」は、単数形が明らかに特定されないならば、「1以上」を意味する。従って、例えば、「炭水化物」への言及は、2以上の炭水化物の混合物、及び単一の炭水化物を含む。

本明細書で使用される「約」は、当業者によって理解され、それが使用される文脈に拠ってある程度変化することになる。当業者に明瞭でない用語の使用が存在する場合には、使用される文脈を考慮すると、「約」は、特定の用語まで、あるいは特定の用語のプラスマイナス10％を意味することになる。

本明細書で使用される用語「炭水化物」は、ポリヒドロキシ-アルデヒド又は-ケトン及びそこから得られる化合物を含むと当業者に理解される。炭水化物は、少なくとも1つの基本的な単糖ユニットからなる化合物を含むことができる。それらは、単一の炭水化物及び複雑な炭水化物として分類される。単一の炭水化物は、単糖及び二糖である。複雑な炭水化物は、多糖、又は単糖の直鎖もしくは分枝鎖から成る大分子である。

本明細書で使用される用語「液状シロップ」又は「液化シロップ」は、炭水化物基質、例えば、α-アミラーゼに限定されない液状酵素と反応したデンプンを言う。液状シロップは、液状反応によって製造される。

本明細書で使用される用語「液状反応」は、混合物中の1以上の炭水化物の粘性を減少させ、及び/又は流動性を増加する、酵素的又は化学的反応を言う。

本明細書で使用される用語「トランスグルコシド」又は「トランスグルコシダーゼ」とは、新規なα-1,6結合を形成するための、加水分解反応及び/又は移行反応を触媒する、酵素又は活性を言う。これらの酵素は、トランスグルコシダーゼ及び転化酵素を含むが、これらに限定されない。

本明細書で使用される用語「液状酵素」又は「液化酵素」は、多くのα-アミラーゼ又は他のアミラーゼの1つでよい。液状酵素は、デンプンの流動性又は粘性、すなわちデンプン流動化に影響を与える。例示的なデンプン液状酵素は、α-アミラーゼを含む。

本明細書で使用される用語「マルトゲニック酵素」は、より大きな炭水化物ポリマーからマルトースの製造を触媒する酵素を言う。マルトゲニック酵素は、多くのβ-アミラーゼ又は他のアミラーゼの1つでよい。マルトゲニック反応はマルトースを製造する。

本明細書で使用される用語「転化酵素」又は「転化酵素（複数）」は、新規なα-1,6結合を形成するための、加水分解反応及び/又は移行反応を触媒する、酵素の種類を言う。転化酵素は、トランスグリコシル化反応を介して単糖を転化することによって糖類の合成を触媒する。例えば、本発明に有用な転化酵素は、トランスグリコシダーゼ活性を有し、すなわち、グルコシド結合を加水分解することによって糖類の加水分解を触媒する。転化酵素は、植物、動物、細菌、又は真菌の転化酵素でよい。1つの実施態様では、転化酵素は、アスペルギルス属の転化酵素である。例として、限定されるものではないが、ある実施態様では、転化酵素は、アスペルギルス・ニガー及び/又はアスペルギルス・オリザエから得られる。本明細書で用いる「トランスグリコシダーゼ活性を有する転化酵素」又は「本技術の転化酵素」は、糖化反応を触媒することができる転化酵素を言う。

本明細書で使用される用語「糖化反応」又は「糖化」は、マルトゲニック及びトランスグルコシド反応を介して液状シロップをIMOに変換するプロセスを言う。本明細書に記載の糖化反応は、1以上のステップ又は反応において起こり得、そのステップ又は反応は、別個に、順次又は同時に起こる。

IMO製造の方法
本技術は、IMO製造のための改良された方法を包含する。別個の、順次の又は同時の糖化反応に加えて、炭水化物基質が液状酵素と反応して、IMO生成物を製造する時に、IMO製造の改良された方法は起こる。

1つの局面では、本技術は、イソマルトオリゴ糖組成物の製造方法であって、以下のステップ：（a）デンプンスラリーを液状酵素と接触させ；及び（b）ステップ（a）の生成物をマルトゲニック酵素及び転化酵素と接触させること、ここで、該マルトゲニック酵素及び該転化酵素は、別個に、順次又は同時に接触されて、イソマルトオリゴ糖を製造する、を含む、方法を提供する。

ある実施態様では、本明細書に記載の本方法は、第1の糖化反応及び第2の糖化反応、又は同時の糖化反応を含む。1つの実施態様では、第1の糖化反応は、マルトゲニック生成物、すなわちマルトース又はマルトースシロップ、の製造をもたらす。第2の糖化反応は、トランスグルコシド活性を有する転化酵素のような1以上の酵素をマルトゲニック生成物に適用し、それによってマルトゲニック生成物のいくらか又はすべてがIMOに変換されることを含む。1つの実施態様では、原料、すなわちデンプンスラリーの、マルトースへの変換は、第1の糖化反応、すなわちマルトゲニック反応中に起こる。IMOの製造は、第2の糖化反応、すなわちトランスグルコシド反応中に起こる。ここで、トランスグルコシド活性を有する転化酵素は当該反応中に使用される。

基質
本方法は、炭水化物基質を用いる。本明細書に記載されている用語「炭水化物」又は「淡水化物基質」は、特に制限されないが、デンプン、天然非修飾デンプン、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、タピオカデンプン、ジャガイモデンプン、サツマイモデンプン、サゴデンプン、大麦デンプン、熱/酸処理デンプン（デキストリン)、真珠デンプン、蝋状トウモロコシデンプン、サトウモロコシデンプン、高アミローストウモロコシデンプン、高固体含量の液状デキストロース、及びそれらの組合せを言う。

1つの実施態様では、炭水化物基質はデンプン基質である。デンプン基質は、特に限定されないが、トウモロコシデンプンでよい。1つの実施態様では、炭水化物基質は、デンプンスラリーである。本明細書に記載の用語「スラリー」は、特に限定されないがデンプン顆粒のような不溶性成分を含む水溶性混合物を言う。場合によっては、用語「スラリー」又は「シロップ」又は「懸濁液」は、本明細書では交換的に使用される。本明細書に記載の用語「デンプン基質」又は「デンプンスラリー」は、デンプンと組み合わせた溶液を言う。ここで、デンプンは式（C₆H₁₀O₅)x（xは任意の数でよい）を有する複雑な多糖炭水化物からなる任意の材料である。液体は、任意の水溶性媒体、例えば水でよい。

1つの実施態様では、デンプンスラリーは、1以上の様々な形態のデンプンを含む。米国特許第7,638,151号明細書に記載されているように、デンプンの1つの形態は、アミロース、すなわち直鎖多糖である。デンプンの他の形態は、アミロペクチン、すなわち分枝鎖多糖である。アミロースは、D-グルコース単位のすべてがα-(1,4)-結合、すなわち「α-(1,4)-結合」又は「1,4-α-グルコシル結合」によって連結されている、長い非分枝鎖を含む。アミロペクチンは、高度に分枝しており、その骨格グルコシド結合はα-(1,4)-結合であり、しかし、分枝点はα-(1,6)-結合も与える。本明細書で使用される用語「結合」又は「結合（複数）」は、グルコース又は他の分子が結合されている炭素部分の数を言う。

α（アルファ）及びβ（ベータ）の接頭語は、それぞれ、該結合が炭素環に対してアキシャルか又はエカトリアルかを示す。したがって、アルファ結合は環に対してエカトリアルであり、β結合はアキシャルである。

1つの実施態様では、デンプン基質の量又は濃度、すなわちデンプンスラリーの濃度は、1〜60％、5〜45％、10〜40％、20〜40％又は25〜35％の可溶性固体（「ds」）の濃度を有する水溶性スラリーでよい。本明細書に記載される用語「可溶性固体」又は「ds」は、溶液に懸濁している固体すなわちデンプンのパーセンテージを言う。1つの実施態様では、スラリーのpHは、5.8〜6.1である。1つの局面では、本技術は、5〜25、10〜25、15〜23又は18〜22°Bxのデンプンスラリーの濃度又は密度を提供する。1つの実施態様では、デンプンスラリーの密度は、19〜22°Bxである。本明細書で用いる「°Bx」又は「Baum」密度は、特定の温度でのデンプンスラリーの特定の比重の関数として測定される。

液状反応
1つの実施態様では、デンプンスラリーは、液化酵素と接触され、それによって液状シロップを製造する。1つの実施態様では、液状は、デンプンの主な成分の酵素的分解を含んでよい。1つの実施態様では、アミロースは、α-アミラーゼ、例えばα-(1,4)-グルカン-4-グルカノヒドロラーゼによって加水分解することができる。α-アミラーゼは、α-(1,4)-結合を加水分解して、グルコース、マルトース、マルトトリオース及び高糖質の混合物を与える。例えば、米国特許第4,113,509号明細書参照。アミロースは、β-アミラーゼによって加水分解してもよい。β-アミラーゼは、非還元末端から始まって連続的なマルトース単位を開裂して、定量的にマルトースを与える。α-及びβ-アミラーゼもアミロペクチンを加水分解する。α-アミラーゼもβ-アミラーゼもアミロペクチンの分枝点のα-(1,6)-結合を加水分解することができない。アミロペクチンに対する完全なβ-アミラーゼ作用の最終生成物は、大きな、高度分枝コア又はβ-リミットデキストリンである。脱分枝酵素、例えばプルラナーゼ、α-(1,6)-グルカン-6-グルカンヒドロラーゼ、又はα-(1,6)-グルコシダーゼは、分枝点のα-(1,6)-結合を加水分解することができる。本明細書で用いる用語「脱分枝酵素」は、α-(1,6)-結合の加水分解を触媒する酵素を言う。代表的な脱分枝酵素は、α-デキストリン-エンド-(1,6)-α-グルコシダーゼ、リミットデキストリナーゼ、立脱分枝酵素又は(1,6)-グルカノヒドロラーゼとしても知られているプルラナーゼである。例えば、Schulein et al., Characterization of a New Class of Thermoohilic Pulllanases from Bacillus acidopullulyticus, Annals of the New York Academy of Sciences, Vol. 434, Issue 1, pp.271-74 (2006）参照。

1つの局面では、液化酵素は、細菌、真菌、植物又は他の起源から得られた、単離された又は抽出された酵素である。1つの実施態様では、細菌起源は、バチルス（Bacillus）属α-アミラーゼである。1つの実施態様では、α-アミラーゼは、B.サブチリス（subtilis）、B.リッケニフォーミス（licheniformis）、B.ステアロサーモファイラス（stearothermophilis）、B.コアギュランス（coagulans）、B.アミロリケファシエンス（amyloliquefacines)、及びB.レンタス（lentus）から選択される少なくとも1つの細菌起源から得られるものを含む、バチルス属から得られる。1つの実施態様では、B.リッケニフォーミス又はB.ステアロサーモファイラスから得られるα-アミラーゼは、液状酵素である。別の実施態様では、α-アミラーゼ以外のアミラーゼは、液状酵素として使用される。

1つの実施態様では、液化酵素は、デンプンスラリーと接触されて、液化又は溶解されたデンプンの粘性を減少させる。不溶性デンプン成分は、デキストリン化を介して可溶性物質に変換される。本明細書で使用する用語「デキストリン化」は、デンプンの、可溶性多糖又はオリゴ糖に変換を言う。1つの実施態様では、1以上の液化酵素は、デンプンスラリーに添加される。液化酵素は、0.0001〜10％、0.001〜5％又は0.01〜1％（w/w/ds）の量で、手動で又は自動で、スラリーに添加されてよい。1つの実施態様では、液化酵素は、0.40〜0.70％、0.50〜0.60％又は0.55％（w/w/ds）の量でスラリーに添加されてよい。1つの実施態様では、液化酵素は、0.55％（w/w/ds）の量でスラリーに添加されてよい。

1つの実施態様では、液状酵素濃度は、デンプンスラリーのdsに対して、液化酵素の0.001〜5％又は0.005〜1％（w/w/ds）である。1つの実施態様では、液状酵素濃度は、デンプンスラリーのdsに対して、液化酵素の0.015〜0.035％又は0.022〜0.025％（w/w/ds）である。別の実施態様では、0.04〜0.07％、0.05〜0.06％又は0.04〜0.05％（w/w/ds）の液状酵素濃度が使用される。1つの実施態様では、液状酵素濃度は、デンプンスラリーのdsに対して0.045％（w/w/ds）である。

1つの実施態様では、液化酵素は、好適な温度で、15〜210分、60〜210分、90〜180分又は120〜150分間、デンプンスラリーと反応する。1つの実施態様では、液化酵素は、好適な温度で、約130分、デンプンスラリーと反応する。液化酵素は、90〜125℃、95〜115℃、100〜110℃又は100〜108℃の温度で、手動又は自動で該スラリーに添加してよい。1つの実施態様では、液状反応のpHは、4.0〜8.0、5.0〜7.0又は5.8〜6.1の範囲で維持される。当業者は、液状反応のpHが、必要ならば、酸又は塩基、例えば塩酸（「HCl」）又は水酸化ナトリウム（「NaOH」）の好適な量の使用及び適用によって維持することができることを理解するだろう。1つの実施態様では、IMO前駆体を含む液状シロップは、液状反応を介して生成される。

マルトゲニック反応
1つの実施態様では、デンプンスラリーは、液化酵素と接触され、次いでマルトゲニック酵素と接触され、それによってマルトースを生成する。1つの実施態様では、デンプンスラリーはマルトゲニック酵素的官能基を含む液化酵素と接触され、それによってマルトースを含む液状シロップを生成する。本明細書で使用される用語「マルトゲニック酵素」は、炭水化物をマルトース及びその誘導体に変換する酵素を言う。マルトゲニック酵素の例は、α-アミラーゼ及びβ-アミラーゼから得られる真菌、細菌、及び植物を含むが、これらに限定されない。本明細書で使用される用語「マルトース」は、α-(1,4)-D-グルコシド結合によって連結された2つのグルコシル残基を有する二糖を言う。1つの実施態様では、マルトースは、マルトース豊富なスラリー又はシロップすなわち液状シロップから生成される。

ある実施態様では、糖化反応は、液化炭水化物基質すなわち液状シロップの加水分解を含む。糖化反応は、マルトゲニック反応及びトランスグルコシド反応を含み、その反応は別個に、順次に又は同時に起こり得る。糖化反応は、一般的に、液状シロップに1以上の糖化酵素を加えることによって達成される。1つの実施態様では、β-アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、転化酵素、プルラナーゼ及びそれらの組合せから選ばれる1以上の酵素は、液状シロップと反応して、IMO又はIMO前駆体を生成する。本明細書で使用される「IMO前駆体」は、IMOを形成するために必要とされるIMOの任意の構成成分を含む組成物を言う。1つの実施態様では、IMO前駆体は、マルトース又はその誘導体である。

ある実施態様では、液状シロップの加水分解は、マルトゲニック酵素の存在下で起こる。1つの実施態様では、マルトゲニック酵素は、β-アミラーゼである。α-アミラーゼは、α-アミラーゼをデンプン基質と接触させることがマルトースを生成することができる程度で、マルトゲニックなものがあるが、β-アミラーゼの使用は、様々な基質とのその接触が、他の糖類例えばグルコースを除いて、IMO前駆体すなわちマルトースの増加した量を提供する点で有利である。例えば米国特許第4,970,158号及び同4,647,538号参照。1つの実施態様では、β-アミラーゼは、植物、細菌酵素、又は熱安定性細菌、β-アミラーゼである。好適なβ-アミラーゼが天然並びに組換え及び突然変異のβ-アミラーゼでよいことは当業者であれば容易に理解される。本明細書で使用される用語「β-アミラーゼ」は、α-(1,4)-グルコシド結合の加水分解を触媒してよってマルトース単位を放出する酵素を言う。β-アミラーゼは、糖鎖の非還元末端から連続的なマルトース単位を除くことに関して、多糖におけるα-(1,4)-D-グルコシド結合の加水分解に影響を与える酵素としても記載されている。例えば米国特許第7,638,151号参照。

1つの実施態様では、マルトゲニック反応は、少なくとも12、20、72又は120時間（「h」）行われる。1つの実施態様では、マルトゲニック反応は、40℃、50℃、55℃、60℃及び65℃から90℃の範囲の温度で行われる。1つの実施態様では、マルトゲニック反応は、60〜65℃の温度で起こる。1つの実施態様では、マルトゲニック反応は、4.0〜、5.0〜、5.5〜、6.0〜7.0のpHのアルカリで起こる。1つの実施態様では、マルトゲニック反応のpHは、5.0〜5.5である。当業者は、マルトゲニック反応のpHが、必要ならば、好適な量の酸又は塩基、例えば塩酸（「HCl」）又は水酸化ナトリウム（「NaOH」）の使用及び適用によって維持することができることを理解するだろう。

ある実施態様では、本方法は、液状酵素に存在する溶解されたマルトースの量の機能としてのマルトゲニック反応中に適用されたマルトゲニック酵素の好適な量を含む。このために、炭水化物すなわちデンプンの液化後に、液状シロップの溶解されたマルトース含量が決定され、マルトゲニック酵素の好適な量がマルトゲニック反応に適用される。マルトゲニック酵素の量は、添加されるべき特定のマルトゲニック酵素、及び液状シロップの総重量すなわちシロップの固形含量に因って、0.0001〜10％（w/w)、又は0.0005〜1％(w/w）又は0.001〜0.25％(w/w）の範囲である。

1つの実施態様では、0.0001〜10％（w/w）プルラナーゼは、マルトゲニック反応中の糖化反応に適用される。1つの実施態様では、0.001〜1％（w/w）プルラナーゼは、マルトゲニック反応中の糖化反応に適用される。別の実施態様では、0.05〜0.1％（w/w）プルラナーゼは、マルトゲニック反応中の糖化反応に適用される。

1つの実施態様では、マルトゲニック酵素及び/又はプルラナーゼは、0.001〜1％(w/w）の濃度で35〜40°BxのBx相対密度で、第1の糖化又はマルトゲニック反応に加えてよい。本明細書に記載される用語「Brix相対濃度」、「Brix」又は「°Bx」は、所定の温度での溶液の糖含量を測定するための周知のハイドロメータ目盛を言う。従って、単位°Bxは、水溶液中の溶解された糖類の指標を言う。Brixスケールは、糖水溶液（全体の溶解された固体含量）の100グラム当たりに存在する糖のグラム数を測定する。例えば、1.0°Bxの指標は、溶液中の糖の10mg/mlを言う。1つの実施態様では、0.01〜0.1％（w/w）のマルトゲニック酵素及び/又はプルラナーゼは、35〜40°Bxの第1の糖化反応又はマルトゲニック反応に適用される。1つの実施態様では、β-アミラーゼは、第1の糖化反応に適用されるマルトゲニック反応である。1つの実施態様では、β-アミラーゼ及びプルラナーゼは第1の糖化反応に適用される。

1つの実施態様では、β-アミラーゼは、プルラナーゼの存在下又は非存在下で、0.005〜5％（w/w）、0.01〜1％（w/w）又は0.02〜0.05％（w/w）の濃度で、35〜40°Bxの第1の糖化反応又はマルトゲニック反応に適用される。別の実施態様では、プルラナーゼは、0.005〜5％（w/w）、0.01〜1％（w/w）又は0.02〜0.05％（w/w）の濃度で、35〜40°Bxの第1の糖化反応又はマルトゲニック反応に適用される。1つの実施態様では、プルラナーゼは、0.025％（w/w）の濃度で、35〜40°Bxの第1の糖化反応又はマルトゲニック反応に適用される。

ある実施態様では、マルトゲニック反応は、10〜100時間（「h」）で進行する。1つの実施態様では、マルトゲニック反応は、15〜30時間で進行する。1つの実施態様では、マルトゲニック反応は、20〜24時間で進行する。1つの実施態様では、マルトゲニック反応は、50〜70時間で進行する。別の実施態様では、マルトゲニック反応は、55〜65時間で進行する。1つの実施態様では、マルトゲニック反応は、アルカリpHで進行する。1つの実施態様では、マルトゲニックのpHは、4.0〜7.0である。別の実施態様では、マルトゲニック反応は、5.5〜5.8のpHで起こる。当業者は、マルトゲニック反応のpHが、必要ならば、好適な量の酸又は塩基、例えば塩酸（「HCl」）又は水酸化ナトリウム（「NaOH」）の使用及び適用によって維持することができることを理解するだろう。

トランスグルコシド反応
グルコース部分及びその誘導体の転移 は、トランスグルコシド酵素の存在下で起こり得る。マルトゲニック反応及びトランスグルコシド反応は、特定の反応に適用される糖化酵素によって、別個に、順次に、又は同時に起こり得る。1つの実施態様では、同時の糖化反応は、転化酵素の存在下で起こる。1つの実施態様では、同時の糖化反応は、マルトゲニック反応及びトランスグルコシド反応を含む。例えば、トランスグルコシド反応は、マルトゲニック反応と同時に起こることがあり、それによって同時の糖化反応を与える。本明細書で使用される「同時の糖化反応」は、一時的に及び空間的に近接して起こる、第1の糖化反応及び第2の糖化反応を言う。同時の糖化反応では、第1の糖化反応の生成物は、第2の糖化反応での基質としての使用のために直ちに利用される。1つの実施態様では、同時の糖化反応は、マルトゲニック酵素及びトランスグルコシド活性を有する転化酵素の存在下で起こる。本技術の別の局面では、マルトゲニック基質と反応する転化酵素を開示する。1つの実施態様では、トランスグルコシド活性を有する転化酵素は、マルトゲニック基質と反応する。

1つの実施態様では、トランスグルコシド反応は、マルトゲニック反応の生成物に1以上の糖化酵素を添加することによって連続的に達成される。1つの実施態様では、1以上の酵素は、β-アミラーゼ、トランスグリコシダーゼ、転化酵素、プルラナーゼ及びそれらの組合せからなる群より選ばれ、そして、マルトゲニック反応の液状シロップ又は生成物と反応して、トランスグルコシド反応中にIMOを生成する。1つの実施態様では、転化酵素は、液状シロップと反応してトランスグルコシド反応中にIMOを生成するトランスグルコシド酵素である。別の実施態様では、アスペルギルス属転化酵素は、液状シロップと反応してトランスグルコシド反応中にIMOを生成するトランスグルコシド酵素である。

別の実施態様では、トランスグルコシド反応は、2以上の酵素によって触媒される。例えば、トランスグリコシダーゼ活性を有する転化酵素とトランスグリコシダーゼ（「TG」）との組合せは、糖化反応で使用することができる。1つの実施態様では、トランスグルコシド酵素は、アスペルギルス属のTGである。1つの実施態様では、トランスグルコシド酵素は、アスペルギルス・ニガーのTGである。本明細書に先に記載したように、TGはトランスグルコシダーゼとして機能するが、転化酵素の使用は、様々なデンプン-及びマルトース-型基質との接触が、TGを用いる慣用的な方法を比べて高いIMO製造を提供する点で、有利である。

1つの実施態様では、トランスグルコシド反応、すなわち第2の糖化反応は10〜100時間で行われる。1つの実施態様では、第2の糖化反応は、30〜90時間で起こる。1つの実施態様では、第2の糖化反応は、48〜72時間起こる。1つの実施態様では、第2の糖化反応は、10〜100時間、30〜90時間又は48〜72時間、50〜70℃の温度で加熱される。別の実施態様では、第2の糖化反応は、10〜100時間、30〜90時間又は48〜72時間、55〜65℃の温度で加熱される。1つの実施態様では、第2の糖化反応は、60〜65℃の温度で起こる。1つの実施態様では、反応は、4.0〜、5.0〜、5.5〜、6.0〜7.0のpHのアルカリで起こる。1つの実施態様では、第2の糖化反応のpHは、5.0〜5.5である。当業者は、第2の糖化反応のpHが、必要ならば、好適な量の酸又は塩基、例えば塩酸（「HCl」）又は水酸化ナトリウム（「NaOH」）の使用及び適用によって維持することができることを理解するだろう。

ある実施態様では、転化酵素の好適な量は、液状シロップの量の関数としての同時糖化反応に適用される。そのため、炭水化物すなわちデンプンの液化後に、シロップの溶解されたマルトース含量は決定され、好適な量の酵素が同時糖化反応に適用される。酵素の量は、液状シロップの総重量すなわち乾燥固形含量に依拠して変動することになる。添加酵素を適用することに加えて、1以上のマルトゲニック酵素も同時糖化反応に適用される。

1つの実施態様では、0.0001〜10％(w/w）の転化酵素が、糖化反応に糖化酵素として適用される。1つの実施態様では、0.001〜5％(w/w）の転化酵素が、糖化反応に糖化酵素として適用される。1つの実施態様では、0.01〜1％(w/w）の転化酵素が、糖化反応に適用される。1つの実施態様では、0.05〜0.5％(w/w）の転化酵素が、糖化反応に適用される。1つの実施態様では、0.16％(w/w）の転化酵素が、糖化反応に適用される。

糖化酵素は、液状シロップのBrix濃度が35〜40°Bxである先に記載の濃度で、単独で又は組み合わせて、手動で又は自動で、同時糖化反応に適用することができる。1つの実施態様では、液状シロップのBrix濃度は36°Bxである。1つの局面では、糖化反応はあるマルトゲニック生成物のいくらか又はすべてをIMOに変換する。

IMO精製及びその使用
ある実施態様では、本方法は、IMO反応から無関係の物質を除くステップを含む。無関係の物質は、未反応の原料及び変性タンパク質、炭水化物及びデンプンを含むがこれらに限定されない。ある実施態様では、精製は、濾過、沈殿及び凝集、それらの変更及びそれらの組合せを含むがこれらに限定されない。1つの実施態様では、IMOシロップは、濾過装置を用いて濾過される。濾過装置は濾過を押圧し、助けるものであり、ドラムフィルタ；回転ドラムフィルタ；パーライト；セライト；及びそれらの組合せを含む。

ある実施態様では、本方法は脱色ステップを含む。脱色は、IMO生成物又はIMOシロップを、色を誘発する物質を除くことができる物質、例えば顆粒の活性炭で処理することによって達成される。1つの実施態様では、IMOシロップは、60〜90℃又は70〜75℃の温度で顆粒活性炭で充填したカーボンカラム上を通過される。1つの実施態様では、IMOシロップは、36°Bxで10分〜15時間、カーボンカラム上を通過することができる。1つの実施態様では、IMOシロップは、36°Bxで1〜15時間、カーボンカラム上を通過することができる。別の実施態様では、IMOシロップは、36°Bxで5〜15時間、カーボンカラム上を通過することができる。

ある実施態様では、本方法は、IMOシロップからのイオン性成分の分離を含む。IMOシロップからイオン種を除くことができる分離のための第1の手段は、イオン交換樹脂、限外濾過、逆浸透、及び当業者に容易に知られている他のクロマトグラフ技術を含むが、これらに限定されない。1つの実施態様では、第1の分離ステップは、40〜74℃又は55〜60℃の温度で行われる。

1つの実施態様では、分離のための第1の手段は、カチオン交換樹脂、アニオン交換樹脂、又はそれらの組合せを更に含む。好適なカチオン樹脂体積は、IMOシロップの体積基準で、0.1〜100％（v/v）又は1〜5％（v/v）を含む。1つの実施態様では、アニオン交換樹脂を使用してもよい。好適なアニオン樹脂体積は、IMOシロップの体積基準で、0.1〜100％（v/v）又は2〜10％（v/v）を含む。

1つの実施態様では、イオン交換は、イオン交換カラム上をIMOシロップを通過させることによって達成される。1つの実施態様では、イオン交換カラムは、カチオン交換樹脂、アニオン交換樹脂又はその両方を含む。1つの実施態様では、イオン交換カラム中のIMOシロップの流速は、0.1 ml/分〜1000 l/分又は10〜50 l/分である。

1つの実施態様では、IMOシロップは別箇の交換樹脂を用いて処理される。そのために、IMOシロップはカチオン性交換樹脂を最初に通過させ、次いでアニオン性交換樹脂を通過させる。1つの実施態様では、IMOシロップは追加的に又は代替的にカチオン性及びアニオン性樹脂種を含む樹脂を通過させる。1つの実施態様では、転送ポンプは、本明細書に記載の交換樹脂上にIMOを通過させるために使用される。1つの実施態様では、イオン交換クロマトグラフィーは40〜75℃で実施される。1つの実施態様では、イオン交換クロマトグラフィーは55〜60℃で実行される。

ある実施態様では、本方法はIMOシロップを所望の湿度又は固体含量に濃縮することを含む。1つの実施態様では、IMOシロップは、30〜75°Bx、40〜50°Bx又は45〜50°Bxに濃縮される。そのために、IMOシロップは、IMOシロップを濃縮するために水分を除くための手段を介して処理される。1つの実施態様では、水分を除くための手段は濃縮である。1つの実施態様では、連続的又は非連続的なMechanical Vapor Recompressor（「MVR」）が使用できる。当該分野で知られている他の濃縮又は蒸発装置、例えばトリプル型エバポレータも使用することができ、当業者に容易に理解されるだろう。

1つの実施態様では、IMOシロップが濃縮された後に、触媒的IMO水素化が行われる。1つの実施態様では、触媒は、プラチナ属金属、例えばプラチナ、パラジウム、ロジウム及びルテニウムを含む。非貴金属触媒、例えばニッケル、ニッケルアロイ、ラネイニッケル及びウルシバラニッケルも本技術のための触媒として使用できる。

1つの局面では、本技術は、本明細書に記載されている方法を用いて生成されるIMOを提供する。本方法は様々なIMOを生成するために使用することができる。1つの実施態様では、分枝グルコース、DP3グルコース、パノース、イソマルトトリオース、イソマルトテトラオース、イソマルトヘプトース又はそれらの組み合わせが生成される。

1つの実施態様では、本方法を用いて生成されたIMOは、食品添加物又は甘味料と使用することができる。1つの実施態様では、IMOシロップ、スラリー、分離した不溶性成分、及び/又は分離した溶解性成分を濃縮及び乾燥することによって、小麦粉又は他の乾燥粉末がそこから得られる。得られた粉末又は小麦粉は、IMOの存在が例えば食料品、すなわち朝食シリアル、ペースト又は食品添加物及び焼き食品に望まれる組成物に組み込まれる。本明細書に記載される用語「食品添加物」又は「食品添加物（複数）」は、振りかける（sprinkle-on）物質しての、他の食品の製造における使用のための成分としての、及び/又は食品及及び/又は液体に添加される局所成分としての、IMO又はIMO（複数）の使用を言う。

別の実施態様では、乾燥粉末は、食品サプリメントに組み込まれる。乾燥粉末の食品サプリメントへの組み込みは、任意の許容されるサプリメント又は形態で提供される。栄養サプリメントは、硬いか又は柔らかいかのいずれかで、粉末、粒子、ビーズ、溶液又は懸濁液として組成物を含む、マトリックス、例えば薬物粉末、結晶、顆粒、小粒子（マイクロメータのオーダーにサイズ化された粒子、例えばマイクロスフェア及びマイクロカプセルを含む）、粒子（ミリメータのオーダーにサイズ化された粒子を含む）、ビーズ、マイクロビーズ、ペレット、ピル、マイクロ錠剤、圧縮錠剤又は擦り込み錠、湿製錠剤又は擦り込み錠で、及びカプセルで、経口投与のために調合することができる。栄養補助食品はまた、液体中の溶液又は懸濁液として、ゲルカプセルに組み込まれた液体として、あるいは投与又は直腸投与用の任意の他の簡便な形態として、座薬、浣腸又は他の簡便な形態として、経口投与のために調合することができる。IMOはまた制御された放出系として提供される。

本技術は、以下の実施例によって更に説明され、それは本発明を少しも限定するものと解釈してはならない。以下の実施例は、本技術を追求するIMOを生成し及び製造するための方法を説明する。実施例では、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）転化酵素は、マルトース型（コーンシロップ）基質からIMOを製造するために使用される。別の起源、例えばアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）から得られる転化酵素も使用できることを理解されたい。マルトースの加水分解及びトランスグルコシル化はIMO製造のために必須である。慣用的なIMO製造は、2ステップの糖化プロセスを経て実行される。この2つの反応は、別個の又は連続的なマルトゲニック及びトランスグルコシル化反応を含む。慣用的な方法を用いて、β-アミラーゼは、先ず糖化シロップと反応してマルトースを生成し、トランスグルコシダーゼ、すなわちTGを次いで加えるとIMOを生成する。しかしながら、更に以下で記載するように改良された同時方法を用いることにより、β-アミラーゼの存在下で転化酵素をIMO製造用の液状シロップに同時に加えることが可能である。したがって、以下の実施例は、アスペルギルス・ニガー由来の転化酵素が、これまで発見されていないトランスグルコシドメカニズムを介してマルトース基質からIMOを製造する機能的な可能性を有していることを証明するものである。

実施例１−IMO製造のための慣用的方法
デンプンスラリーを1kgのコーンスターチ及び1.5kgの水を終濃度19〜22°Bxのなるように容器に加えることによって調製した。液化酵素、0.04〜0.05%（w/w/ds）のバチルス・リッケニフォーミス（Novo Nordisk, デンマーク）由来の熱安定性α-アミラーゼをこのスラリーに5.8〜6.1のpHで、105℃で10分間で加えた。次いで、液化されたシロップをタンクに2時間通過させることによって、このシロップを第2の液化プロセスに供し、それによって、最終10〜12デキストロース等量（「DE」）シロップを生成する。液化されたスラリーは、次いで、60〜65℃で5.0〜5.5のpHで、48〜72時間、0.052％（w/w）の大麦（Genencor, Rochester, NY）由来のβ-アミラーゼ及び0.07％（w/w）のバチルス・リッケニフォーミス（Amano Pharmaceuticals, 日本）由来のプルラナーゼを添加することによって、第1の糖化反応に供した。第2の糖化反応は、アスペルギルス・ニガー（Genencor, Rochester, NY）由来のトランスグルコシダーゼの0.1%（w/w）溶液を加え、該混合物を55〜60℃で48〜72時間反応させることによって行った。未反応物質は濾過によって糖化溶液から除き、糖化溶液を活性炭で処理して色を除いた。糖化溶液を、60〜75℃の温度で、約30分〜3時間、顆粒の活性炭で充填した炭素カラムを通過させた。該溶液からイオン性成分を30〜50℃で5〜10m³/時間の流速でクロマトグラフ的に分離するために、カチオン、アニオン、及び混合床の交換樹脂（Samyng Genex, 韓国）を使用した。最後に、IMOシロップをMVRエバポレータによって約75°Bxに濃縮した。

実施例２−転化酵素を用いるIMO製造のための同時方法
デンプンスラリーを1kgのコーンスターチ及び1.5kgの水を終濃度19〜22°Bxのなるように容器に加えることによって調製した。液化酵素、0.04〜0.05%（w/w/ds）の熱安定性α-アミラーゼ（実施例１に記載）をこのスラリーに5.8〜6.1のpHで、100〜108℃で2〜2.5時間で加えた。次いで、液化されたスラリーを次いで単一糖化ステップに供した。ここで、0.052％（w/w）の大麦（Genencor, Rochester, NY）由来のβ-アミラーゼ、0.07％（w/w）のバチルス・リッケニフォーミス（Amano Pharmaceuticals, 日本）由来のプルラナーゼ、及び0.16％（w/w）のアスペルギルス・ニガー転化酵素を液化スラリーに35〜40°Bxの終濃度でpH 5.0〜5.5で加えた。糖化混合物を60〜65℃で48〜72時間反応させた。未反応物質は濾過によって糖化溶液から除いた。糖化溶液を活性炭で処理して実施例１に記載のように色を除いた。実施例１に記載されたように溶液からのイオン性成分を分離するために、イオン交換樹脂を利用した。最後に、IMOシロップをMVRエバポレータによって約75°Bxに濃縮した。図１参照。

実施例３−IMO製造のための慣用的方法と同時方法との比較
本実施例は、糖化中のIMO量の変化を比較した。慣用的方法と同時方法について、反応を上記のようにいった。図2は、オリゴ糖の乾燥基準パーセンテージ（DB％）が慣用的方法と同時方法について同一であった、ことを示している。横座標は完全な糖化反応のための、時間の長さ（時間）を示し、DB％は、縦軸に示される。図２参照。

実施例４−慣用的方法と同時方法についての糖プロファイルの比較
別個の実験では、IMO糖プロファイルを慣用的及び同時の方法について比較した。表1に示すように、総IMO製造プロファイルは、慣用的及び同時の方法について同一であった。表1に示すように、総IMO製造は、イソマルトース；分枝グルコース；DP3グルコース；パノース；イソマルトトリオース；イソマルトテトラオース；及びイソマルトヘプトースを含む。

したがって、先の実施例で示したように、スペルギルス・ニガーから単離された転化酵素葉、トランスグルコシダーゼ活性を有する。この新規な転化酵素は、マルトース基質と接触し反応する能力を有する予想外の特徴を含む。この新規な転化酵素は、驚くべきことに及び予想外にも、同時の単一ステップの糖化反応を触媒することによってIMOを製造する慣用的方法を改善する。この新規な方法は、IMOを製造するために必要とされる時間及びエネルギーを減らすことによってIMO製造コストを減少させるだろう。

本開示は、本願に記載の特定の実施態様の点から限定されない。当業者に明らかなように、多くの修飾及び変更がその趣旨及び範囲を逸脱することなくなされる。本明細書に列挙されたもの加えて、本開示の範囲内の機能的に等価な方法及び機器は、先の記載から当業者には明らかであろう。かかる修飾及び変更は、添付のクレームの範囲内にある意図である。本開示は、添付のクレームの用語によってのみ限定されず、かかるクレームによって権利を与えられる等価な範囲全体を含む。本開示は、特定の方法、試薬、化合物、組成物又は生物的系、勿論これらは変動してよい、に限定されないことを理解されたい。本明細書で使用される用語は特定の実施態様のみを記載する目的のためであり、限定するものではないことも理解されたい。

加えて、本開示の特徴及び局面がマーカッシュ群の点で記載される場合には、当業者は、本開示がそれによってマーカッシュ群の任意の個々のメンバ又はメンバのサブグループの点からも記載されることを理解するだろう。

当業者によって理解されるように、任意の及びすべての目的のために、特に、記載説明を提供する点で、本明細書に開示されたすべての範囲はまた、任意の及びすべての可能性のあるサブレンジ及びそのサブレンジの組合せを含む。任意の記載された範囲は、少なくとも2等分、3等分、4等分、5等分、10等分などに分割された同一の範囲を可能ならしめるものとして、容易に理解することができる。非限定的な例として、本明細書で議論された各々の範囲は、下部3分の1、中部3分の1、上部3分の1等に容易に分割され得る。当業者によって理解されるように、「まで」、「少なくとも」、「超」、「未満」等を含むがこれらに限定されない全ての用語は、引用された数字を含み、そして、上で議論したようにサブレンジにその後に分割されうる範囲を言う。最後に、当業者によって理解されるように、ある範囲は各々個別のメンバを含む。したがって、例えば、1〜3個の成分を有する基は、1、2又は3個の成分を有する基を言う。同様に、1〜5個の成分を有する基は、1、2、3、4又は5個の成分を有する基を言う。

様々な局面及び実施態様を本明細書に開示してきたが、他の局面及び実施態様は当業者に明らかである。本明細書に開示された様々な局面及び実施態様は、例証の目的のためであり、限定する意図ではなく、真の範囲及び趣旨は以下の特許請求の範囲によって示される。

Claims (22)

1. イソマルトオリゴ糖組成物の製造方法であって、以下のステップ：
   （a）デンプンスラリーを液状酵素と接触させ；及び
   （b）ステップ（a）の生成物をマルトゲニック酵素及び転化酵素と接触させること、
   ここで、該マルトゲニック酵素及び該転化酵素は、別個に、順次又は同時に接触されて、イソマルトオリゴ糖（「IMO」）を製造する、
   を含む、方法。
2. 前記マルトゲニック酵素及び前記転化酵素がステップ（a）の生成物と同時に接触されて、IMOを製造する、請求項１記載の方法。
3. 前記スラリーが、デンプン重量で15％〜45％を含む、請求項１記載の方法。
4. 前記転化酵素が、ステップ（b）のすべての反応物の重量で少なくとも0.0009％である、請求項１記載の方法。
5. 前記転化酵素が、ステップ（b）のすべての反応物の重量で2％未満である、請求項１記載の方法。
6. ステップ（b）が2超〜10未満のpHで起こる、請求項１記載の方法。
7. ステップ（b）が10℃超〜85℃未満の温度で起こる、請求項１記載の方法。
8. 前記イソマルトオリゴ糖が、イソマルトース、分枝グルコース。DP3グルコース、α-1,4及び/又はα-1,6結合を有するDP3グルコース、パノース、イソマルトトリオース、イソマルトテトラオース、イソマルトペンタオース、イソマルトヘキサオース、及びイソマルトヘプトース、又はそれらの組合せから選択される、請求項１記載の方法。
9. 前記の製造されたイソマルトオリゴ糖の少なくとも10％がパノースである、請求項８記載の方法。
10. イソマルトオリゴ糖を精製することを更に含む、請求項１記載の方法。
11. 前記液状酵素がα-アミラーゼである、請求項１記載の方法。
12. 前記マルトゲニック酵素が、β-アミラーゼ又は真菌α-アミラーゼである、請求項１記載の方法。
13. 前記転化酵素が、トランスグルコシダーゼ活性を有する、請求項１記載の方法。
14. 前記転化酵素が、アスペルギルス（Aspergillus））転化酵素である、請求項１記載の方法。
15. 前記アスペルギルス（Aspergillus）転化酵素が、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）転化酵素又はアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）転化酵素である、請求項１４記載の方法。
16. 前記スラリーが、1以上のデンプン及び液体から形成される、請求項１記載の方法。
17. ステップ（b）にプルラナーゼを加えることを更に含む、請求項１記載の方法。
18. 前記1以上のデンプンが、トウモロコシデンプン、米デンプン、麦デンプン、タピオカ、ジャガイモデンプン、サツマイモデンプン、サゴデンプン、大麦デンプン、熱/酸処理デンプン、真珠デンプン、蝋状トウモロコシデンプン、サトウモロコシデンプン、高アミローストウモロコシデンプン、液状デキストロース、及びそれらの組合せから成る群より選択される、請求項１記載の方法。
19. 前記デンプンがトウモロコシデンプンである、請求項１８記載の方法。
20. 請求項１記載の方法に従って製造されたイソマルトオリゴ糖組成物。
21. 請求項１記載の方法に従って製造されたイソマルトオリゴ糖を含む食品添加物。
22. 少なくとも1つの食品成分及び請求項１記載のイソマルトオリゴ糖を含む食品。

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