JP2011512840A - サルアデノウイルスSAdV−36、−42.1、−42.2および−44ならびにそれらの用途 - Google Patents
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Abstract
Description
本研究は米国立保健研究所からの助成金NIH助成金番号P30−DK47757により部分的に支援された。米国政府は本発明にある種の権利を有しうる。
発明者は、これとともに提供されるコンパクトディスク上の配列表資料を引用することによりここに組込む。これらのコンパクトディスクは複製で供給され、そしてコンピュータで読み込み可能な形態の「配列表」のみを含有する。これらのディスクはそれぞれ「Copy1」および「Copy2」と表示される。これらのディスク上のファイルは「UPN−U4707PCTsequencelisting.txt」と表示されている。
サルアデノウイルス36(SAdV−36)、サルアデノウイルス42.1(SAdV−42.1)、サルアデノウイルス42.2(SAdV−42.2)、サルアデノウイルス44(SAdV−44)の単離された核酸配列およびアミノ酸配列、ならびにこれらの配列を含有するベクターを本明細書に提供する。本発明のベクターおよび細胞の多数の使用方法もまた提供される。
サル糞便から単離された、サルアデノウイルス36(SAdV−36)、SAdV−42.1、SAdV−42.2およびSAdV−44からの新規核酸およびアミノ酸配列が提供される。組換えタンパク質若しくはフラグメントまたは他の試薬のin vitro製造での使用のための新規アデノウイルスベクターおよびそれらのベクターを製造するためのパッケージング細胞株もまた提供される。治療若しくはワクチンの目的上の異種分子の送達における使用のための組成物がさらに提供される。こうした治療若しくはワクチン組成物は挿入された異種分子を保有するアデノウイルスベクターを含有する。加えて、該新規SAdV−36、SAdV−42.1、SAdV−42.2およびSAdV−44配列は、組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターの製造に必要とされる不可欠のヘルパー機能の提供において有用である。従って、こうした製造法でこれらの配列を使用するヘルパー構築物、方法および細胞株が提供される。
節効果若しくは高められた免疫応答の誘導方法で有用である。SAdV−36キャプシドは、単独で、若しくはそれに対する免疫応答を高めるための有効成分との組合せレジメンで送達し得る。別の局面において、SAdV−36キャプシドを被験体に送達することを含んでなる、それの必要な被験体におけるインターフェロンα産生の誘導方法が提供される。なお別の局面において、培養物中での1種若しくはそれ以上のサイトカインの製造方法が提供される。本方法は、とりわけαインターフェロンを包含するサイトカイン/ケモカイン、を産生するのに適する条件下で、樹状細胞を含有する培養物およびSAdV−36キャプシドをインキュベートすることを伴う。
本発明は、それらが天然に会合している他物質からそれらのそれぞれが単離されているサルアデノウイルス36(SAdV−36)、SAdV−42.1、SAdV−42.2およびSAdV−44の核酸配列およびアミノ酸配列を提供する。
本明細書に提供されるSAdV−36核酸配列は配列番号1のヌクレオチド1ないし36556を包含する。本明細書に提供されるSAdV−42.1核酸配列は配列番号33
のヌクレオチド1ないし37786を包含する。本明細書に提供されるSAdV−42.2核酸配列は配列番号64のヌクレオチド1ないし37820を包含する。本明細書に提供されるSAdV−44核酸配列は配列番号95のヌクレオチド1ないし37711を包含する。本明細書に引用することにより組み込まれる配列表を参照されたい。
99/47691号明細書もまた参照されたい。これらの方法はヒト以外の霊長類のAAV血清型を包含するヒト以外の血清型のAAVの製造でもまた使用しうる。必要なヘルパー機能(例えばE1a、E1b、E2aおよび/若しくはE4 ORF6)を提供するSAdV−36、SAdV−42.1、SAdV−42.2およびSAdV−44配列は、ヒト起源に典型的であるrAAVパッケージング細胞中に存在するいずれかの他のアデノウイルスとの組換えの可能性を最小化若しくは排除する一方で必要なアデノウイルス機能の提供においてとりわけ有用であり得る。従って、SAdV−36、SAdV−42.1、SAdV−42.2若しくはSAdV−44配列の選択された遺伝子若しくはオープンリーディングフレームをこれらのrAAV製造方法で利用しうる。
つ癌細胞を優先的に標的とする。こうした製剤を他の癌治療薬(例えばシスプラチン、タキソールなど)と組合せうる。本明細書に提供されるアデノウイルス配列のなお他の用途は当業者に容易に明らかであろう。
本明細書に記述されるアデノウイルス核酸によりコードされるタンパク質、酵素およびそれらのフラグメントのようなSAdV−36、SAdV−42.1、SAdV−42.2若しくはSAdV−44アデノウイルスの遺伝子産物が提供される。他の方法により生成されるこれらの核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を有するSAdV−36、SAdV−42.1、SAdV−42.2若しくはSAdV−44のタンパク質、酵素およびそれらのフラグメントがさらに包含される。こうしたタンパク質は、上の表1で同定されるオープンリーディングフレームによりコードされるもの、下の表2のタンパク質(配列表中にもまた示される)、ならびに該タンパク質およびポリペプチドのそれらのフラグメントを包含する。
ク質、合成キャプシドタンパク質および組換えキャプシドタンパク質を制限なしに包含する、上で定義されたところのSAdV−36、SAdV−42.1、SAdV−42.2若しくはSAdV−44のキャプシドタンパク質若しくはそれらのフラグメントを含有するいかなるアデノウイルスキャプシドタンパク質も包含する。
C)、コリホスフィン−O(CPO)若しくはタンデム色素、PE−シアニン−5(PC5)およびPE−テキサスレッド(ECD)を包含する。これらの蛍光色素の全部は商業的に入手可能であり、また、それらの用途は当該技術分野に既知である。他の有用な標識はコロイド状金標識を包含する。なお他の有用な標識は放射活性化合物若しくは元素を包含する。加えて、標識は、アッセイで比色シグナルを表すよう機能する多様な酵素系を包含し、例えばグルコース酸化酵素(グルコースを基質として使用する)は生成物として過酸化物を放出し、過酸化物は過酸化酵素、およびテトラメチルベンジジン(TMB)のような水素供与体の存在下で青色として見られる酸化型TMBを産生する。他の例は、ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリホスファターゼ(AP)、ならびに、ATP、グルコースおよびNAD+と反応してとりわけ340nmの波長で増大された吸光度として検出されるNADHを生じるグルコース−6−リン酸脱水素酵素を伴うヘキソキナーゼを包含する。
のフラグメントをこうしたターゲッティングに選択する。送達に適する分子は、本明細書に記述される治療分子およびそれらの遺伝子産物のなかから選択される。脂質、ポリLysなどを包含する多様なリンカーをリンカーとして利用しうる。例えば、サルペントンタンパク質は、Medina−Kauwe LKら、Gene Ther.2001 May;8(10):795−803およびMedina−Kauwe LKら、Gene Ther.2001 Dec;8(23):1753−1761に記述されるものに類似の様式でサルペントン配列を使用する融合タンパク質の製造によりこうした目的上容易に利用しうる。あるいは、サルAdタンパク質IXのアミノ酸配列を、米国特許出願第20010047081号明細書に記述されるとおり細胞表面受容体にベクターの標的を定めるのに利用しうる。適するリガンドはCD40抗原、RGD含有若しくはポリリシン含有配列などを包含する。例えばヘキソンタンパク質および/若しくはファイバータンパク質を包含するなお他のサルAdタンパク質をこれらおよび類似の目的上使用しうる。
本明細書に記述される組成物は、治療若しくはワクチンいずれかの目的上細胞に異種分子を送達するベクターを包含する。本明細書で使用されるところのベクターは、裸のDNA、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソーム、プラスミド若しくはウイルスを制限なしに包含するいかなる遺伝因子も包含しうる。こうしたベクターはSAdV−36、SAdV−42.1、SAdV−42.2および/若しくはSAdV−44のサルアデノウイルスDNAおよびミニ遺伝子を含有する。「ミニ遺伝子」により、選択された異種遺伝子、ならびに宿主細胞中での該遺伝子産物の翻訳、転写および/若しくは発現を駆動するのに必要な他の調節エレメントの組合せを意味している。
ノウイルスシスエレメントを含有し、また、ミニ遺伝子は該5’および3’アデノウイルス配列の間に配置される。SAdV−36、SAdV−42.1、SAdV−42.2および/若しくはSAdV−44に基づくアデノウイルスベクターは付加的なアデノウイルス配列もまた含有しうる。
導入遺伝子の選択、「ミニ遺伝子」のクローニングおよび構築ならびにウイルスベクターへのその挿入に使用される方法は、本明細書に提供される教示を与えられる当該技術分
野の熟練内にある。
導入遺伝子は、目的のポリペプチド、タンパク質若しくは他の産物をコードする導入遺伝子に隣接するベクター配列に異種の核酸配列である。核酸コーディング配列は、宿主細胞中での導入遺伝子の転写、翻訳および/若しくは発現を可能にする様式で調節成分に効果的に連結されている。
れうる。例えばM.L.Donnellyら、J.Gen.Virol.、78(Pt 1):13−21(Jan 1997);Furler,S.ら、Gene Ther.、8(11):864−873(June 2001);Klump H.ら、Gene
Ther.、8(10):811−817(May 2001)を参照されたい。この2AペプチドはIRESよりかなり小さく、空間が制限因子である場合にそれを使用に十分に適するようにする。しかしながら、選択された導入遺伝子はいかなる生物学的に活性の産物若しくは他の産物、例えば研究に所望の産物もコードしうる。
ミニ遺伝子について上で同定された主要エレメントに加え、該ベクターは、本発明により製造されるプラスミドベクターでトランスフェクトされた若しくはウイルスに感染した細胞中でのその転写、翻訳および/若しくは発現を可能にする様式で導入遺伝子に作動可能に連結されている必要な慣習的調節領域もまた包含する。本明細書で使用されるところの「作動可能に連結されている」配列は、目的の遺伝子に隣接する発現制御配列、およびトランスで若しくは少し離れて作用して目的の遺伝子を制御する発現制御配列の双方を包含する。
Curr.Opin.Chem.Biol.、2:512−518(1998)もまた参照されたい)を包含する。他の系は、FK506二量体、カストラジオール(castradiol)を使用するVP16若しくはp65、ジフェノールムリスレロン(diphenol murislerone)、RU486で誘導可能な系(Wangら、Nat.Biotech.、15:239−243(1997)およびWangら、Gene Ther.、4:432−441(1997))ならびにラパマイシンで誘導可能な系(Magariら、J.Clin.Invest.、100:2865−2872(1997))を包含する。いくつかの誘導可能なプロモーターの有効性は時間とともに増大する。こうした場合には、複数のリプレッサーをタンデムに挿入することにより(例えばIRESによりTetRに結合したTetR)こうした系の有効性を高め得る。あるいは、所望の機能についてスクリーニングする前に最低3日待機し得る。この系の有効性を高めるための既知手段により所望のタンパク質の発現を高め得る。(例えばウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(WPRE)を使用して)
ーターならびにベクターエレメントの選択は慣習的であり、そして多くのこうした配列が入手可能である(例えばSambrookら、およびその中に引用される参考文献を参照されたい)。
一態様において、サルアデノウイルスプラスミド(若しくは他のベクター)を使用してアデノウイルスベクターを製造する。一態様においてアデノウイルスベクターは複製欠陥であるアデノウイルス粒子である。一態様において、アデノウイルス粒子はE1aおよび/若しくはE1b遺伝子の欠失により複製欠陥にされている。あるいは、アデノウイルスは、場合によってはE1aおよび/若しくはE1b遺伝子を保持しつつ別の手段により複製欠陥にされている。該アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムに対する他の突然変異、例えば他の遺伝子中の温度感受性突然変異若しくは欠失もまた含有し得る。他の態様において、アデノウイルスベクター中に無傷のE1aおよび/若しくはE1b領域を保持することが望ましい。こうした無傷のE1領域は、アデノウイルスゲノム中のその天然の場所に配置しうるか、若しくは天然のアデノウイルスゲノム中の欠失の部位(例えばE3領域中)に置くことができる。
存在下で該アデノウイルスベクターを培養することにより提供しうる。例えば、1996年5月9日に公開されかつ引用することにより本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第WO96/13597号明細書中の「最小」ヒトAdベクターの製造について記述される技術を参照されたい。
従って、ミニ遺伝子を保有するため使用されるウイルスベクターのサルアデノウイルス遺伝子内容に依存して、ヘルパーアデノウイルス若しくは非複製ウイルスフラグメントが、該ミニ遺伝子を含有する感染性組換えウイルス粒子を製造するのに必要な十分なサルアデノウイルス遺伝子配列を提供するのに必要でありうる。有用なヘルパーウイルスは、アデノウイルスベクター構築物に存在せずかつ/若しくは該ベクターがトランスフェクトされるパッケージング細胞株により発現されない、選択されたアデノウイルス遺伝子配列を含有する。一態様において、該ヘルパーウイルスは複製欠陥でありかつ上述された配列に加えて多様なアデノウイルス遺伝子を含有する。こうしたヘルパーウイルスは、望ましくはE1発現細胞株とともに使用する。
上述された遺伝子のいずれかで欠失された組換えサルアデノウイルス(Ad)を生成するためには、欠失された遺伝子領域の機能を、該ウイルスの複製および感染性に不可欠である場合は、ヘルパーウイルス若しくは細胞株、すなわち補完若しくはパッケージング細胞株により該組換えウイルスに供給しなければならない。多くの状況で、ヒトE1を発現する細胞株を使用してチンパンジーAdベクターをトランス補完し(transcomplement)得る。これは、本発明のチンパンジーAd配列と現在入手可能なパッケージング細胞で見出されるヒトAdE1配列の間の多様性により、現在のヒトE1含有細胞の使用が複製および製造過程の間の複製能力のあるアデノウイルスの生成を予防するため、とりわけ有利である。しかしながら、ある状況では、E1欠失サルアデノウイルスの製造に利用し得るE1遺伝子産物を発現する細胞株を利用することが望ましいであろう。こうした細胞株は記述されている。例えば米国特許第6,083,716号明細書を参照されたい。
ersity Boulevard,Manassas,Virginia 20110−2209から入手可能である。他の適する親細胞株は他の供給源から得ることができる。
一般に、ミニ遺伝子を含んでなるベクターをトランスフェクションにより送達する場合、該ベクターは、約1×104細胞ないし約1×1013細胞、および好ましくは約105細胞に対し約5μgから約100μgまでのDNA、および好ましくは約10ないし約50μgのDNAの量で送達される。しかしながら、宿主細胞に対するベクターDNAの相対量は、選択されるベクター、送達方法および選択される宿主細胞のような因子を考慮に入れて調節してよい。
加される因子により調節されうる。
組換えサルSAdV−36、SAdV−42.1、SAdV−42.2および/若しくはSAdV−44に基づくベクターは、in vitro、ex vivoおよびin vivoでヒト若しくはサル以外の家畜患者への遺伝子移入に有用である。
論を使用して感染細胞を培養し;そして形質導入した細胞を患者に再注入する。これらの組成物は、治療目的上、および保護免疫を誘導することを包含する免疫化のための遺伝子送達にとりわけ良好に適する。
一態様において、上述された組換えベクターを公表された遺伝子治療方法に従ってヒトに投与する。選択された導入遺伝子を持つサルウイルスベクターは、好ましくは生物学的に適合性の溶液若しくは製薬学的に許容できる送達ベヒクルに懸濁して患者に投与しうる。適するベヒクルは滅菌生理的食塩水を包含する。製薬学的に許容できる担体であることが既知かつ当業者に公知の他の水性および非水性の等張の滅菌注入溶液ならびに水性および非水性の滅菌懸濁液を本目的上使用しうる。
06から約1×1015粒子まで、約1×1011ないし1×1013粒子、若しくは約1×109ないし1×1012粒子のウイルスの濃度を含有する約100μLから約100mLまでの担体の範囲にある。投与量は動物の大きさおよび投与経路に依存して変動することができる。例えば、筋肉内注入に適するヒト若しくは家畜の投与量(約80kgの動物について)は、単一部位について1mLあたり約1×109ないし約5×1012粒子の範囲にある。場合によっては複数の投与部位が送達されうる。別の例において、適するヒト若しくは家畜の投与量は、経口製剤について約1×1011ないし約1×1015粒子の範囲にありうる。当業者は、投与経路および該組換えベクターを使用する治療若しくはワクチンの応用に依存してこれらの用量を調節しうる。導入遺伝子の発現のレベル、若しくは免疫原については循環抗体のレベルをモニターして投与量の投与頻度を決定し得る。投与の頻度のタイミングのなお他の決定方法は当業者に容易に明らかであろう。
導入遺伝子によりコードされる有用な治療的産物は、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン(GH)、副甲状腺ホルモン(PTH)、成長ホルモン放出因子(GRF)、卵胞刺激ホルモン(FSH)、黄体化ホルモン(LH)、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)、血管内皮増殖因子(VEGF)、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)、エリスロポエチン(EPO)、結合組織増殖因子(CTGF)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、酸性線維芽細胞増殖因子(aFGF)、上皮成長因子(EGF)、トランスフォーミング増殖因子(TGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、インスリン様増殖因子IおよびII(IGF−IおよびIGF−II)、TGF、アクチビン、インヒビンを包含するトランスフォーミング増殖因子スーパーファミリーのいずれか1種、若しくは骨形成タンパク質(BMP)BMP1〜15のいずれか、ヘレグルイン(heregluin)/ニューレグリン/ARIA/増殖因子のneu分化因子(NDF)ファミリーのいずれか1種、神経成長因子(NGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィンNT−3およびNT−4/5、毛様体神経栄養因子(CNTF)、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)、ニューツリン、アグリン、セマフォリン/コラプシンのファミリーのいずれか1種、ネトリン−1およびネトリン−2、肝細胞増殖因子(HGF)、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグならびにチロシン水酸化酵素を制限なしに包含するホルモンならびに増殖および分化因子を包含する。
なしに包含する免疫系を調節するタンパク質を包含する。免疫系により産生される遺伝子産物もまた本発明で有用である。これらは、免疫グロブリンIgG、IgM、IgA、IgDおよびIgE、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、一本鎖抗体、T細胞受容体、キメラT細胞受容体、一本鎖T細胞受容体、クラスIおよびクラスII MHC分子、ならびに工作された免疫グロブリンおよびMHC分子を制限なしに包含する。有用な遺伝子産物は、補体調節タンパク質、メンブレンコファクタープロテイン(MCP)、崩壊促進因子(DAF)、CR1、CF2およびCD59のような補体調節タンパク質もまた包含する。
T細胞リンパ腫のT細胞受容体の可変領域を包含する。モノクローナル抗体17−1Aおよび葉酸結合ポリペプチドにより認識されるポリペプチドを包含する、腫瘍細胞中でより高レベルで見出されるポリペプチドのような他の腫瘍関連ポリペプチドを、標的ポリペプチドとして使用し得る。
該組換えSAdV−36、SAdV−42.1、SAdV−42.2および/若しくはSAdV−44ベクターは免疫原性組成物としてもまた使用しうる。本明細書で使用され
るところの免疫原性組成物は、それに対する体液性(例えば抗体)若しくは細胞性(例えば細胞傷害性T細胞)応答が、哺乳動物、および好ましくは霊長類への送達後に該免疫原性組成物により送達される導入遺伝子産物に対し開始される組成物である。組換えサルAdは所望の免疫原をコードする遺伝子をそのアデノウイルス配列欠失のいずれかに含有し得る。該サルアデノウイルスは、ヒト起源のアデノウイルスに比較して多様な動物種で生組換えウイルスワクチンとしての使用により良好に適することがありそうであるが、しかしこうした使用に制限されない。該組換えアデノウイルスは、免疫応答の誘導にきわめて重要でありかつ病原体の伝播を制限することが可能な抗原(1種若しくは複数)が同定されておりかつcDNAが利用可能であるいかなる病原体に対する予防的若しくは治療的ワクチンとしても使用し得る。
エラ、東部および西部ウマ脳炎を包含するアルファウイルス属、ならびに風疹ウイルスを包含するルビウイルスを包含するトガウイルス科である。フラビウイルス科は、デング熱、黄熱病、日本脳炎、セントルイス脳炎およびダニ媒介性脳炎ウイルスを包含する。他の標的抗原は、C型肝炎、あるいは伝染性気管支炎ウイルス(家禽)、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス(ブタ)、ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス(ブタ)、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス(ネコ)、ネコ腸内コロナウイルス(ネコ)、イヌコロナウイルス(イヌ)のような多数のヒト以外のウイルスおよび感冒を引き起こしうるヒト呼吸器コロナウイルスならびに/または非A、非B若しくは非C型肝炎を包含するコロナウイルス科から生成しうる。コロナウイルス科内の標的抗原は、E1(M若しくはマトリックスタンパク質ともまた呼ばれる)、E2(S若しくはスパイクタンパク質ともまた呼ばれるS)、E3(HE若しくはヘマグルチン−エルテロース(hemagglutin−elterose)ともまた呼ばれる)糖タンパク質(全コロナウイルスに存在するわけではない)またはN(ヌクレオキャプシド)を包含する。なお他の抗原は、ベシクロウイルス属(例えば水疱性口内炎ウイルス)および一般的リッサウイルス(例えば狂犬病)を包含するラブドウイルス科に対し標的指向化されうる。
性タンパク質若しくはペプチドを使用して融合タンパク質若しくは他の免疫原性分子を形成しうる。例えば、2001年8月2日公開の第WO 01/54719号明細書および1999年4月8日公開の第WO 99/16884号明細書に記述されるHIV−1 Tatおよび/若しくはNef融合タンパク質ならびに免疫化レジメンを参照されたい。本発明は本明細書に記述されるHIVおよび/若しくはSIV免疫原性タンパク質若しくはペプチドに制限されない。加えて、これらのタンパク質に対する多様な改変が記述されているか、若しくは当業者により容易に作成され得る。例えば米国特許第5,972,596号明細書に記述される改変gagタンパク質を参照されたい。さらに、いかなる所望のHIVおよび/若しくはSIV免疫原も単独若しくは組合せで送達しうる。こうした組合せは単一ベクター若しくは複数のベクターからの発現を包含しうる。場合によっては、別の組合せは、タンパク質の形態の免疫原の1種若しくはそれ以上の送達を伴う1種若しくはそれ以上の発現された免疫原の送達を必要としうる。こうした組合せを下により詳細に論考する。
ノヴァン症(鼠径部肉芽腫);およびバルトネラ症を包含する。病原性嫌気性細菌により引き起こされる疾患は破傷風;ボツリヌス中毒;他のクロストリジウム;結核;らい;および他のミコバクテリアを包含する。病原性スピロヘータ疾患は梅毒;トレポネーマ症;イチゴ腫、ピンタおよび風土病性梅毒;ならびにレプトスピラ症を包含する。より高病原性の細菌および病原性真菌により引き起こされる他の感染症は、放線菌症;ノカルジア症;クリプトコックス症、ブラストミセス症、ヒストプラスマ症およびコクシジオイデス真菌症;カンジダ症、アスペルギルス症およびムコール症;スポロトリクス症;パラコクシジオイデス真菌症、ペトリエリジオーシス(petriellidiosis)、トルロプシス症、菌腫およびクロモミコーシス;ならびに皮膚糸状菌症を包含する。リケッチア感染症は、発疹チフス、ロッキー山熱、Q熱およびリケッチア痘を包含する。マイコプラスマおよびクラミジア感染症の例は:マイコプラスマ肺炎;性病性リンパ肉芽腫;オウム病;および周産期クラミジア感染症を包含する。病原性真核生物は病原性原生動物および蠕虫を包含し、また、それらにより生じられる感染症は:アメーバ症;マラリア;リーシュマニア;トリパノソーマ症;トキソプラスマ症;ニューモシスチス カリニ(Pneumocystis carinii);Trichans;トキソプラスマ(Toxoplasma gondii);バベシア症;ジアルジア症;旋毛虫症;フィラリア症;住血吸虫症;線虫;吸虫(trematodes)すなわち吸虫(flukes);および条虫(cestode)(条虫(tapeworm))感染症を包含する。
1、SAdV−42.2および/若しくはSAdV−44ベクターの投与はそれらのT細胞を排除するためのCTLを包含する免疫応答を導き出すことが予期される。RAにおいて、該疾患に関与するTCRの数個の特定の可変領域が特徴づけられている。これらのTCRはV−3、V−14、V−17およびVa−17を包含する。従って、これらのポリペプチドの最低1種をコードする核酸配列の送達はRAに関与するT細胞を標的とすることができる免疫応答を導き出すことができる。MSにおいて、該疾患に関与するTCRの数個の特定の可変領域が特徴づけられている。これらのTCRはV−7およびVa−10を包含する。従って、これらのポリペプチドの最低1種をコードする核酸配列の送達はMSに関与するT細胞を標的とすることができる免疫応答を導き出すことができる。強皮症において、該疾患に関与するTCRの数個の特定の可変領域が特徴づけられている。これらのTCRはV−6、V−8、V−14およびVa−16、Va−3C、Va−7、Va−14、Va−15、Va−16、Va−28ならびにVa−12を包含する。従って、これらのポリペプチドの最低1種をコードする組換えサルアデノウイルスの送達は強皮症に関与するT細胞を標的とすることができる免疫応答を導き出すことができる。
選択された遺伝子の治療レベル若しくは免疫のレベルをモニターしてブースターの必要性(あれば)を決定し得る。血清中のCD8+ T細胞応答若しくは場合によっては抗体力価の評価後に任意のブースター免疫化が望ましいかもしれない。場合によっては、組換えSAdV−36、SAdV−42.1、SAdV−42.2および/若しくはSAdV−44ベクターを、単回投与で、あるいは多様な組合せレジメンで、例えば他の有効成分を必要とする処置のレジメン若しくはクールと組合せで、またはプライム−ブースト(prime−boost)レジメンで送達しうる。多様なこうしたレジメンが当該技術分野で記述されており、そして容易に選択されうる。
V−42.2および/若しくはSAdV−44ベクターをAd以外のベクターと同時若しくは連続送達するレジメン、ならびにSAdV−36、SAdV−42.1、SAdV−42.2および/若しくはSAdV−44ベクターをタンパク質、ペプチドおよび/または他の生物学的に有用な治療若しくは免疫原性化合物と同時若しくは連続送達するレジメンを必要としうる。こうした用途は当業者に容易に明らかであろう。
A.サルアデノウイルス36
糞便サンプルは、チンパンジー(Pan troglodytes)を収容しているテキサス大学M.D.アンダーソンがんセンターマイケル・E.キーリング比較医学研究センター(Michael E.Keeling Center for Comparative Medicine and Research,University of
Texas M.D.Anderson Cancer Center)の床から回収し、そして凍結しかつペンシルバニア大学に送付した。サンプルを融解しかつハンクス平衡塩類溶液に懸濁し、微粒子を遠心分離によりペレットにし、そして0.2ミクロンシリンジフィルターを通して無菌濾過した。各濾過したサンプル100μlを、10%FBS、1%ペニシリン−ストレプトマイシンおよび50μg/mlゲンタマイシンを含むハムF12中で増殖させたA549細胞に接種した。培養約1ないし2週後、接種菌液のいくつかを含む細胞培養物で視覚的細胞変性効果(CPE)が明らかであった。培養物中のアデノウイルスの存在を、内部の1.9kbのヘキソン(超可変(HVR)領域を包含しかつ血清型特異性を賦与する主な原因である領域)のPCR増幅により確認した。PCRに利用したプライマー対はCAGGATGCTTCGGAGTACCTGAG(配列番号126)およびTTGGCNGGDATDGGGTAVAGCATGTT(配列番号127)であった。この領域から得た配列を使用して、アデノウイルス種および血清型の新規性の初期決定を行った。該配列はアデノウイルスサブグループEであることが確認された。
ウイルスの増殖によることが各場合でPCRにより確認された細胞病理を示し;このアッセイは、超可変領域1ないし6にわたるヘキソン遺伝子の一部分の増幅に基づく(L.Crawford−Mikszaら、J Virol 70、1836(Mar.1996))。
糞便サンプルはボノボ(Pan paniscus)を収容しているサンジエゴ動物園の床から回収し、凍結しかつペンシルバニア大学に送付した。サンプルを融解しかつハンクス平衡塩類溶液に懸濁し、微粒子を遠心分離によりペレットにし、そして0.2ミクロンシリンジフィルターで無菌濾過した。各濾過したサンプル100μlを、10%FBS、1%ペニシリン−ストレプトマイシンおよび50μg/mlゲンタマイシンを含むハムF12中で増殖させたA549細胞に接種した。培養約1ないし2週後、接種菌液のいくつかを含む細胞培養物で視覚的細胞変性効果(CPE)が明らかであった。培養物中のアデノウイルスの存在を、内部の1.9kbのヘキソン(超可変(HVR)領域を包含しかつ血清型特異性を賦与する主な原因である領域)のPCR増幅により確認した。PCRに利用したプライマー対はCAGGATGCTTCGGAGTACCTGAG(配列番号126)およびTTGGCNGGDATDGGGTAVAGCATGTT(配列番号127)であった。この領域から得た配列を使用して、アデノウイルス種および血清型の新規性の初期決定を行った。この単離物はアデノウイルスサブグループCであることが確認された。
糞便サンプルはボノボ(Pan paniscus)を収容しているジャクソンビル(フロリダ)動物園の床から回収し、凍結しかつペンシルバニア大学に送付した。サンプルを融解しかつハンクス平衡塩類溶液に懸濁し、微粒子を遠心分離によりペレットにし、そして0.2ミクロンシリンジフィルターで無菌濾過した。各濾過したサンプル100μlを、10%FBS、1%ペニシリン−ストレプトマイシンおよび50μg/mlゲンタマイシンを含むハムF12中で増殖させたA549細胞に接種した。培養約1ないし2週後、接種菌液のいくつかを含む細胞培養物で視覚的細胞変性効果(CPE)が明らかであった。培養物中のアデノウイルスの存在を、内部の1.9kbのヘキソン(超可変(HVR)領域を包含しかつ血清型特異性を賦与する主な原因である領域)のPCR増幅により確認した。PCRに利用したプライマー対はCAGGATGCTTCGGAGTACCTGAG(配列番号126)およびTTGGCNGGDATDGGGTAVAGCATGTT(配列番号127)であり、ここで「N」はいずれかのアミノ酸を表す。この領域から得た配列を使用して、アデノウイルス種および血清型の新規性の初期決定を行った。この単離物はアデノウイルスサブグループCであることが確認された。
糞便サンプルはボノボ(Pan paniscus)を収容しているジャクソンビル(フロリダ)動物園の床から回収し、凍結しかつペンシルバニア大学に送付した。サンプルを融解しかつハンクス平衡塩類溶液に懸濁し、微粒子を遠心分離によりペレットにし、そして0.2ミクロンシリンジフィルターで無菌濾過した。各濾過したサンプル100μlを、10%FBS、1%ペニシリン−ストレプトマイシンおよび50μg/mlゲンタマイシンを含むハムF12中で増殖させたA549細胞に接種した。培養約1ないし2週後、接種菌液のいくつかを含む細胞培養物で視覚的細胞変性効果(CPE)が明らかであった。培養物中のアデノウイルスの存在を、内部の1.9kbのヘキソン(超可変(HVR)領域を包含しかつ血清型特異性を賦与する主な原因である領域)のPCR増幅により確認した。PCRに利用したプライマー対はCAGGATGCTTCGGAGTACCTGAG(配列番号126)およびTTGGCNGGDATDGGGTAVAGCATGTT(配列番号127)であり、ここで「N」はいずれかのアミノ酸を表す。この領域から得
た配列を使用して、アデノウイルス種および血清型の新規性の初期決定を行った。この単離物はアデノウイルスサブグループCであることが確認された。
50名の正常ヒト被験体からの血清サンプル(血液バンクから得た)を、サルアデノウイルス単離物を中和するそれらの能力について試験した。SAdV−36、SAdV−42.2およびSAdV−44に対するヒト血清中和抗体(NAB)反応の頻度と大きさを測定した。
A.SAdV−36(サブグループE)
SAdV−36(種E)DNA(配列番号1)を使用するE1欠失ベクターを記述されるように製造した。
PacI部位により隣接されるSmaI、AscI、AvrII、EcoRV部位を含有するリンカーを、後に続くとおりEcoRIおよびNdeIで切断したpBR322にクローン化する。オリゴマー
pSR6 top
AATTTTAATTAACCCGGGTATCGGCGCGCCTTAACCTAGGGATAGATATCTTAATTAA(配列番号128)および
pSR6 bot
TATTAATTAAGATATCTATCCCTAGGTTAAGGCGCGCCGATACCCGGGTTAATTAA(配列番号129)
を一緒にアニーリングしてリンカーを創製した。
ウイルスDNAをAscIで消化し、そして7958bpの左端フラグメントを、SmaIおよびAscIで消化したpSR6(段階(i)でのように調製した)にクローン化して、pSR6 C36 LEを生じた。
プラスミドpSR6 C36 LE(段階(ii)でのように調製した)をSmaBIおよびNdeIで消化し;NdeI部位をクレノウで充填した。pBleuSK I−PIからのEcoRVフラグメントを連結してpSR5 C36 LE IPを創製した。この段階はSAdV−36のE1遺伝子の欠失を引き起こす。E1欠失の場所に、連結したフラグメントは、それぞれきわめてまれな切断体(cutter)制限酵素I−CeuIおよびPI−SceIの認識部位を持つ。これはE1欠失の場所への導入遺伝子カセットのその後の挿入を可能にする。
プラスミドpSR6 C36 LE IP(段階(iii)でのように調製した)をXbaIおよびEcoRVで消化した。SAdV−36 DNAからの6548bpの右端(XbaI消化物)フラグメントを連結してpC36 LE IP REを創製した。
プラスミドp36 LE IP RE(段階(iv)でのように調製した)をXbaIで消化した。SAdV−36 DNAからの23969bpのフラグメントを連結してpC36 IPを創製した。
SAdV−42.1 DNA(配列番号33)を使用するE1欠失ベクターは、下の「C」部で記述されるところのSAdV−42.2 E1欠失ベクターと同一の様式で、若しくは以下の方法により製造しうる。
SAdV−42.2(サブグループC)DNA(配列番号64)を使用するE1欠失ベクターを記述されるとおり製造した。
PmeI部位により隣接されるSnaBI、FseI、MluI、PacIおよびEcoRV部位を含有するリンカーを、後に続くとおりEcoRIおよびNdeIで切断したpBR322にクローン化した。オリゴマー
P6 Top
AATTGTTTAAACTACGTAATTAGGCCGGCCGCGCACGCGTGTCATTAATTAAGCTAGATATCGTTTAAAC(配列番号130)および
P6 Bot
GTTTAAACGATATCTAGCTTAATTAATGACACGCGTGCGCGGCCGGCCTAATTACGTAGTTTAAACAT(配列番号131)
を一緒にアニーリングしてリンカーを創製した。
プラスミドpSR2(段階(i)でのように調製した)をMluIで消化し、そしてアニーリングしたオリゴマー
951top−CGCGCATATGGATCGATCGCTAGCGATCGATCGAATTC(配列番号132)および
951bot−CGCGGAATTCGATCGATCGCTAGCGATCGATCCATATG(配列番号133)
を連結した。これは、PmeI部位により隣接されるSnaBI、FseI、NdeI、NheI、EcoRI、PacIおよびEcoRV部位を持つリンカーを創製する。pSR7中で、このリンカーはEcoRIからNdeI部位までのpBR322フラグメントを置換する。
PacI部位から伸長する826bpの右端フラグメントを、pSR7(段階(ii)でのように調製した)にEcoRVとPacI部位の間にクローン化して、pSR7 42.2 REを生じた。
New England Biolabs(NEB)PhusionTMキットを、0.5μMの各プライマー、各0.2mMのdNTP、NEB PhusionTM酵素および緩衝液(キット中に供給されるところの)とともに使用した。PCR条件(全3種の反応につき)は、98°30秒間、および(98°10秒間、30秒間のアニーリング、72°15秒間)の25サイクルであった。
42.1−CATCATCAATAATATACCTTATTTTGG(配列番号134)および
42.2−CCCAGATTACGTATAAAACGGAGACTTTGACCC(配列番号135)
は、SAdV−42.2ゲノムDNAの最初の451bpおよび10bpのオーバーハング、すなわち
CATCATCAATAATATACCTTATTTTGGATTGAAGCCAATATGATAATGAGGTGGGCGGAGCGGGGCGGAGTTGGGAGGCGCGGGGCGGGGCGGCGGCGCGGGGCGGGCCGGGAGGTGTGGCGGAAGTTGAGTTTGTAAGTGTGGCGGATGAGACTTGCTAGCGCCGGATGTGGTAAAAGTGACGTTTTTGGAGTGCGACAACGCCCACGGGAAGTGACATTTTTCCCGCGGTTTTTACCGGATGTCGTAGTGAATTTGGGCGTTACCAAGTAAGATTTGGCCATTTTCGCGGGAAAACTGAAATGGGGAAGTGAAATCTGATTAATTTCGCGTTAGTCATACCGCGTAATATTTGCCGAGGGCCGAGGGACTTTGACCGATTACGTGGAGGAATCGCCCAGGTGTTTTTTGAGGTGAATTTCCGCGTTCCGGGTCAAAGT
CTCCGTTTTATACGTAATCTGGG
(配列番号136)
を増幅するよう設計した(鋳型−SAdV−42.2 DNA、61°でアニーリング)。
42.3(CGTTTTATACGTAATCTGGGCAACAGGAGGGGT)(配列番号137)および
42.4(TCGGTCACATCCAGCATCAC)(配列番号138)
を、SAdV−42.2の229bpのフラグメント(SAdV−42.2ゲノムの3223ないし3451bp)およびSnaBI部位を持つ13bpのオーバーハングを含有する242bpのフラグメント
CGTTTTATACGTAATCTGGGCAACAGGAGGGGTGTGTTCCTGCCCTATCAATGCAACTTGAGCCACACCAAGGTCTTGCTAGAGCCCGAAAGCATGTCCAAGGTGAACCTGAACGGGGTGTTTGACATGACCCTGAAGATATGGAAGGTGCTGAGGTACGACGAGACCAGGTCTCGGTGCAGGCCCTGCGAGTGCGGGGGCAAGCATATGAGGAACCAGCCTGTGATGCTGGATGTGACCGA
(配列番号139)
を増幅するよう設計した。
最終PCR産物をNdeIで消化し、そしてSnaBIおよびNdeIで切断したpSR7 42.2 RE(段階(iii)でのように調製した)に連結してpSR7 C42.2 LEREを生じた。このプラスミドをSnaBIで消化し、そして、I−CeuIおよびPI−SceI部位を持つpBleuSK I−PIからのEcoRVフラグメントを連結して、pC42.2 LE delE1 IPを生じた。
SAdV−42.2ウイルスDNAをEcoRIで消化し、そして3767bp右端フラグメントをpSR7 C14 LE delE1 IP(段階(v)でのように調製した)にEcoRIとEcoRVの間にクローン化して、pC42.2IP LE REを生じた。
トのクローニング
プラスミドpC42.2IP LE RE(段階(vi)でのように調製した)をNdeIで消化し、そして16427bpのウイルスのNdeIフラグメントを連結した。該クローンをpC42.2 del Mlu Pacと呼んだ。
プラスミドpC42.2 del Mul Pac(段階(vii)でのように調製した)をMluIおよびPacIで消化し、そして24466bpのウイルスのMluI−PacIフラグメントを連結した。該クローンがpC42.2 IPと呼ばれ、そしてE1欠失、ならびにE1欠失の場所にI−CeuIおよびPI−SceI認識部位を持つSadV−42.2ゲノムDNAの分子クローンである。
SAdV−42.2(サブグループC)DNA(配列番号95)を使用するE1欠失ベクターを記述されるとおり製造した。
PmeI部位により隣接されるSnaBI、FseI、MluI、PacIおよびEcoRV部位を含有するリンカーを、後に続くとおりEcoRIおよびNdeIで切断したpBR322にクローン化した。オリゴマー
P6 Top
AATTGTTTAAACTACGTAATTAGGCCGGCCGCGCACGCGTGTCATTAATTAAGCTAGATATCGTTTAAAC(配列番号130)および
P6 Bot
GTTTAAACGATATCTAGCTTAATTAATGACACGCGTGCGCGGCCGGCCTAATTACGTAGTTTAAACAT(配列番号131)
を一緒にアニーリングしてリンカーを創製した。
左端(PCR、480bpおよび24bp伸長)を、以下のプライマーを使用してpSR2にSnaBIとMluIの間にクローン化した。
フォワードプライマー−pCATCATCAATAATATACCTTATTTTGG(配列番号134)
リバースプライマー−GATCACGCGTCATGCATGCATATGAATACACTCCGCGTCAGCTG(配列番号140)
リバースプライマー配列中の下線を付けられた塩基はそれぞれMluIおよびNdeIの認識部位に対応する。このプラスミドはpSR2 C44 LEを生じた。
PacI部位から伸長するSAdV−44の821bpの右端フラグメントをpSR2
C44 LE(段階(ii)でのとおり調製した)にEcoRVとPacI部位の間にクローン化してpSR2 44 LEREを生じた。
SAdV−44ウイルスDNAをNdeIおよびMluIで消化し、そして9115bpのフラグメントをpSR2 44 LERE(段階(iii)でのとおり調製した)にNdeIとMluIの間にクローン化してpSR2 C44 LERE−2を生じた。
プラスミドpSR2 C44 LERE−2(段階(iv)でのとおり調製した)をMluIおよびPacIで消化し、そして24363bpのウイルスのMluI−PacIフラグメントを連結した。該クローンがpC44 IPと呼ばれ、そしてE1欠失、ならびにE1欠失の場所にI−CeuIおよびPI−SceI認識部位を持つSAdV−44ゲノムDNAの分子クローンである。
H1N1 A型インフルエンザウイルス核タンパク質(NP)(A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai、GenBank受託番号AF389119.1)をコードするヌクレオチド配列をコドン最適化しかつ完全合成した(Celtek
Genes、テネシー州ナッシュビル)。ヒトサイトメガロウイルス初期プロモーター、Promega(ウィスコンシン州マディソン)プラスミドpCI由来の人工イントロン、コドン最適化したA型インフルエンザNPコーディング配列およびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルから構成される発現カセット(およそ2.5kb)をシャトルプラスミド中で構築した。
Royら(“Partial protection against H5N1 influenza in mice with a single dose of a
chimpanzee adenovirus vector expressing
nucleoprotein”、Vaccine 25:6845−6851(August 6,2007))(引用することにより本明細書に組み込まれる)に含有されるプロトコルを以下の実験で使用した。
BALB/cマウス(6〜8週齢)をCharles River Laboratories(マサチューセッツ州ウィルミントン)から購入した。チンパンジーアデノウイルスベクターC36 CMV PI FluA NP(実施例4に記述されるとおり製造した)およびヒトHAdV−5ベクターAdH5−FluA NP(実施例4に一致して製造した)を使用してBALB/cマウス(群あたり5マウス)にワクチン接種した。マウスを腹腔内ケタミン/キシラジンで鎮静し、そして2回の25μl注入に分割した総アデノウイルス投与量(マウスあたり1011ウイルス粒子)を後肢前脛骨に筋肉内に与えた。
ワクチン接種したマウスを免疫化10日後に殺し、そしてそれらおよびそれらのCD8+ T細胞を、インフルエンザ核タンパク質の免疫優性ペプチドTYQRTRALV(配列番号14)で刺激すること、ならびにサイトカイン、インターフェロンγ(IFN−γ)、インターロイキン−2(IL−2)および腫瘍壊死因子−a(TNF−α)について染色することにより分析した。とりわけメモリー集団の形成に関するT細胞応答の質の指標でありうる、多機能性すなわちIL−2およびTNF−aのような複数のサイトカインを分泌することが可能であったCD8+ T細胞のサブセットを決定することは興味深かった。群あたり5マウスからの脾細胞をアッセイした。結果を図1に示す。
Claims (42)
- (a)サルアデノウイルス36(SAdV−36)のヘキソンタンパク質、配列番号11のアミノ酸1ないし941;
(b)SAdV−36のペントンタンパク質、配列番号6のアミノ酸1ないし541;および
(c)SAdV−36のファイバータンパク質、配列番号22のアミノ酸1ないし425よりなる群から選択されるキャプシドタンパク質を含んでなるキャプシドを有し、かつ、前記キャプシドが、宿主細胞中の転写、翻訳および/若しくは発現を指図する発現制御配列に作動可能に連結されている遺伝子配列を保有する異種核酸分子を被包化するものであるアデノウイルス。 - 複製および被包化に必要な5‘および3’アデノウイルスシスエレメントをさらに含んでなる、請求項1に記載のアデノウイルス。
- 前記アデノウイルスがE1遺伝子の全部若しくは一部を欠く、請求項1に記載のアデノウイルス。
- 前記アデノウイルスが複製欠陥である、請求項3に記載のアデノウイルス。
- 前記ウイルスがハイブリッドキャプシドを有する、請求項1に記載のアデノウイルス。
- 前記ベクターが1種以上のSAdV−36キャプシドタンパク質を含んでなる、請求項5に記載のアデノウイルス。
- サルアデノウイルス(SAdV)ヘキソンタンパク質のフラグメントを含有するヘキソンおよびSAdVに対し異種の核酸配列を含んでなるキャプシドを有する組換えアデノウイルスであって、該SAdVヘキソンタンパク質のフラグメントが、長さ約50アミノ酸のN末端若しくはC末端切断を伴う配列番号11のSAdVヘキソンタンパク質であるか、または
配列番号11のアミノ酸残基125ないし443;
配列番号11のアミノ酸残基138ないし441;
配列番号11のアミノ酸残基138ないし163;
配列番号11のアミノ酸残基170ないし176;および
配列番号11のアミノ酸残基404ないし430
よりなる群から選択される、上記組換えアデノウイルス。 - キャプシドがSAdV−36ファイバータンパク質をさらに含んでなる、請求項7に記載の組換えアデノウイルス。
- キャプシドがSAdV−36ペントンタンパク質をさらに含んでなる、請求項7に記載の組換えアデノウイルス。
- 前記アデノウイルスが複製および被包化に必要な5’および3’アデノウイルスシスエレメントを含んでなるシュードタイピングされたアデノウイルスであり、前記シスエレメントがアデノウイルス5’末端逆位配列およびアデノウイルス3’末端逆位配列を含んでなる、請求項7に記載の組換えアデノウイルス。
- アデノウイルスが、宿主細胞中での産物の発現を指図する配列に効果的に連結されている前記産物をコードする核酸配列を含んでなる、請求項7に記載の組換えアデノウイルス
。 - 組換えアデノウイルスが1種若しくはそれ以上のアデノウイルス遺伝子を含んでなる、請求項7に記載の組換えアデノウイルス。
- 組換えアデノウイルスが複製欠陥である、請求項7に記載の組換えアデノウイルス。
- 組換えアデノウイルスがアデノウイルスE1中で欠失されている、請求項13に記載の組換えアデノウイルス。
- 製薬学的に許容できる担体中の請求項1ないし14のいずれかに記載のウイルスを含んでなる組成物。
- 請求項1ないし14のいずれかに記載のウイルスを被験体に送達することを含んでなる、アデノウイルス受容体を有する細胞の標的指向化方法。
- 配列番号1のSAdV−36核酸1ないし36556およびその相補物から選択される、単離されたサルアデノウイルス(SAdV)核酸。
- サルアデノウイルス(SAdV)−36、配列番号1の
(a)5’末端逆位配列(ITR);
(b)アデノウイルスE1a領域;
(c)アデノウイルスE1b領域、若しくはスモールT、ラージTおよびIX領域のオープンリーディングフレームよりなる群のなかから選択されるそのフラグメント;
(d)E2b領域、若しくはpTP、ポリメラーゼおよびIVa2のオープンリーディングフレームよりなる群から選択されるそのフラグメント;
(e)L1領域、若しくは52/55kDタンパク質およびIIIaタンパク質のオープンリーディングフレームよりなる群のなかから選択されるそのフラグメント;
(f)L2領域、若しくはペントン、VII、VおよびpX/Muタンパク質のオープンリーディングフレームよりなる群から選択されるそのフラグメント;
(g)L3領域、またはVI、ヘキソン若しくはエンドプロテアーゼのオープンリーディングフレームよりなる群から選択されるそのフラグメント;
(h)E2a領域、若しくはDNA結合タンパク質(DBP)のオープンリーディングフレーム;
(i)L4領域、若しくは100kDタンパク質、33kDホモログ、22kDタンパク質およびVIIIのオープンリーディングフレームよりなる群から選択されるそのフラグメント;
(j)E3領域、若しくは12.5Kタンパク質、CR1−α、gp19K、CR1−β、CR1−γ、CR1−δ、RID−α、RID−βおよび14.7Kタンパク質のオープンリーディングフレームよりなる群から選択されるそのフラグメント;
(k)L5領域、若しくはファイバータンパク質のオープンリーディングフレーム;
(l)E4領域、若しくはE4 ORF6/7、E4 ORF6、E4 ORF4、E4
ORF3、E4 ORF2およびE4 ORF1のオープンリーディングフレームよりなる群から選択されるそのフラグメント;ならびに
(m)3’ITR
よりなる群の1種若しくはそれ以上から選択されるSAdV核酸配列を含んでなるベクター。 - 請求項18に記載のベクターによりコードされるサルアデノウイルスタンパク質。
- E1a、配列番号32;
E1b、スモールT/19K、配列番号24;
E1b、ラージT/55K、配列番号2;
IX、配列番号3;
52/55D、配列番号4;
IIIa、配列番号5;
ペントン、配列番号6;
VII、配列番号7;
V、配列番号8;
pX、配列番号9;
VI、配列番号10;
ヘキソン、配列番号11;
エンドプロテアーゼ、配列番号12;
100kD、配列番号13;
33kD、配列番号30;
22kD、配列番号26;
VIII、配列番号14;
12.5K、配列番号15;
CR1−α、配列番号27;
gp19K、配列番号16;
CR1−β、配列番号17;
CR1−γ、配列番号18;
CR1−δ、配列番号19;
RID−α、配列番号20;
RID−β、配列番号28;
E3/14.7K、配列番号21;および
ファイバー、配列番号22
よりなる群から選択される1種若しくはそれ以上のサルアデノウイルスタンパク質を含んでなる組成物。 - 請求項20に記載の組成物を被験体に送達することを含んでなる、アデノウイルス受容体を有する細胞の標的指向化方法であって、前記組成物が、ヘキソン、ペントンおよびファイバーから選択される1種若しくはそれ以上のサルアデノウイルス(SAdV)36タンパク質を含んでなる上記方法。
- (a)SAdV−42.1のヘキソンタンパク質、配列番号43のアミノ酸1ないし957;SAdV−42.2のヘキソンタンパク質、配列番号74のアミノ酸1ないし957;SAdV−44のヘキソンタンパク質、配列番号105のアミノ酸1ないし962;(b)SAdV−42.1のペントンタンパク質、配列番号38のアミノ酸1ないし581;SAdV−42.2のペントンタンパク質、配列番号69のアミノ酸1ないし586;SAdV−44のペントンタンパク質、配列番号100のアミノ酸1ないし581;および
(c)SAdV−42.1のファイバータンパク質、配列番号52のアミノ酸1ないし577;SAdV−42.2のファイバータンパク質、配列番号83のアミノ酸1ないし595;SAdV−44のファイバータンパク質、配列番号121のアミノ酸1ないし560
よりなる群から選択されるキャプシドタンパク質を含んでなるキャプシド
(前記キャプシドが、宿主細胞中のその転写、翻訳および/若しくは発現を指図する発現制御配列に作動可能に連結されている遺伝子配列を保有する異種核酸分子を被包化する)を有するアデノウイルス。 - 複製および被包化に必要な5’および3’アデノウイルスシスエレメントをさらに含んでなる、請求項22に記載のアデノウイルス。
- 前記アデノウイルスがE1遺伝子の全部若しくは一部を欠く、請求項22に記載のアデノウイルス。
- 前記アデノウイルスが複製欠陥である、請求項24に記載のアデノウイルス。
- 前記ウイルスがハイブリッドキャプシドを有する、請求項22に記載のアデノウイルス。
- 前記ベクターが、SAdV−42.1、SAdV−42.2およびSAdV−44から選択される1種以上のキャプシドタンパク質を含んでなる、請求項26に記載のアデノウイルス。
- サルアデノウイルス(SAdV)ヘキソンタンパク質のフラグメントを含有するヘキソンおよび該SAdVに対し異種の核酸配列を含んでなるキャプシドを有する組換えアデノウイルスであって、SAdVヘキソンタンパク質のフラグメントが、長さ約50アミノ酸のN末端若しくはC末端切断を伴う配列番号43、74若しくは105のSAdVヘキソンタンパク質であるか、または:
配列番号43、74若しくは105のアミノ酸残基125ないし443;
配列番号43、74若しくは105のアミノ酸残基138ないし441;
配列番号43、74若しくは105のアミノ酸残基138ないし163;
配列番号43、74若しくは105のアミノ酸残基170ないし176;および
配列番号43、74若しくは105のアミノ酸残基404ないし430
よりなる群から選択される、上記組換えアデノウイルス。 - キャプシドが、SAdV−42.1、SAdV−42.2若しくはSAdV−44ファイバータンパク質をさらに含んでなる、請求項28に記載の組換えアデノウイルス。
- キャプシドが、SAdV−42.1、SAdV−42.2若しくはSAdV−44ペントンタンパク質をさらに含んでなる、請求項28に記載の組換えアデノウイルス。
- 前記アデノウイルスが、複製および被包化に必要な5’および3’アデノウイルスシスエレメントを含んでなるシュードタイピングされたアデノウイルスであり、前記シスエレメントがアデノウイルス5’末端逆位配列およびアデノウイルス3’末端逆位配列を含んでなる、請求項28に記載の組換えアデノウイルス。
- アデノウイルスが、宿主細胞中での産物の発現を指図する配列に効果的に連結されている前記産物をコードする核酸配列を含んでなる、請求項28に記載の組換えアデノウイルス。
- 組換えアデノウイルスが1種若しくはそれ以上のアデノウイルス遺伝子を含んでなる、請求項28に記載の組換えアデノウイルス。
- 組換えアデノウイルスが複製欠陥である、請求項28に記載の組換えアデノウイルス。
- 組換えアデノウイルスがアデノウイルスE1中で欠失されている、請求項34に記載の組換えアデノウイルス。
- 製薬学的に許容できる担体中の請求項22ないし35のいずれかに記載のウイルスを含んでなる組成物。
- 請求項22ないし35のいずれかに記載のウイルスを被験体に送達することを含んでなる、アデノウイルス受容体を有する細胞の標的指向化方法。
- 配列番号33のSAdV−42.1核酸1ないし37786およびその相補物;
配列番号64のSAdV−42.2核酸1ないし37820およびその相補物;ならびに配列番号95のSAdV−44核酸1ないし37711およびその相補物
よりなる群から選択される、単離されたサルアデノウイルス(SAdV)核酸。 - サルアデノウイルス(SAdV)−42.1、配列番号33、SAdV−42.2、配列番号64、若しくはSAdV−44、配列番号95の
(a)5’末端逆位配列(ITR);
(b)アデノウイルスE1a領域;
(c)アデノウイルスE1b領域、若しくはスモールT、ラージTおよびIX領域のオープンリーディングフレームよりなる群のなかから選択されるそのフラグメント;
(d)E2b領域、若しくはpTP、ポリメラーゼおよびIVa2のオープンリーディングフレームよりなる群から選択されるそのフラグメント;
(e)L1領域、若しくは52/55kDタンパク質およびIIIaタンパク質のオープンリーディングフレームよりなる群のなかから選択されるそのフラグメント;
(f)L2領域、若しくはペントン、VII、VおよびpX/Muタンパク質のオープンリーディングフレームよりなる群から選択されるそのフラグメント;
(g)L3領域、またはVI、ヘキソン若しくはエンドプロテアーゼのオープンリーディングフレームよりなる群から選択されるそのフラグメント;
(h)E2a領域、若しくはDNA結合タンパク質(DBP)のオープンリーディングフレーム;
(i)L4領域、若しくは100kDタンパク質、33kDホモログ、22kDタンパク質およびVIIIのオープンリーディングフレームよりなる群から選択されるそのフラグメント;
(j)E3領域、若しくは12.5Kタンパク質、CR1−α、gp19K、CR1−β、CR1−γ、RID−α、RID−βおよび14.7Kタンパク質のオープンリーディングフレームよりなる群から選択されるそのフラグメント;
(k)L5領域、若しくはファイバータンパク質のオープンリーディングフレーム;
(l)E4領域、若しくはE4 ORF6/7、E4 ORF6、E4 ORF4、E4
ORF3、E4 ORF2およびE4 ORF1のオープンリーディングフレームよりなる群から選択されるそのフラグメント;ならびに
(m)3’ITR
よりなる群の1種若しくはそれ以上から選択されるSAdV核酸配列を含んでなるベクター。 - 請求項39に記載のベクターによりコードされるサルアデノウイルスタンパク質。
- E1a、配列番号61、92若しくは123;
E1b、スモールT/19K、配列番号54、65若しくは96;
E1b、ラージT/55K、配列番号34、85若しくは116;
IX、配列番号35、66若しくは97;
52/55D、配列番号36、67若しくは98;
IIIa、配列番号37、68若しくは99;
ペントン、配列番号38、69若しくは100;
VII、配列番号39、70若しくは101;
V、配列番号40、71若しくは102;
pX、配列番号41、72若しくは103;
VI、配列番号42、73若しくは104;
ヘキソン、配列番号43、74若しくは105;
エンドプロテアーゼ、配列番号44、75若しくは106;
100kD、配列番号45、76若しくは107;
33kD、配列番号63、94若しくは125;
22kD、配列番号56、87若しくは118;
VIII、配列番号46、77若しくは108;
12.5K、配列番号57、78若しくは109;
CR1−α、配列番号47、88若しくは110;
gp19K、配列番号48、79若しくは111;
CR1−β、配列番号49、80若しくは112;
CR1−γ、配列番号58、89若しくは119;
RID−α、配列番号50、81若しくは113;
RID−β、配列番号51、82若しくは114;
E3/14.7K、配列番号59、90若しくは120;および
ファイバー、配列番号52、83若しくは121
よりなる群から選択される1種若しくはそれ以上のサルアデノウイルスタンパク質を含んでなる組成物。 - 請求項41に記載の組成物を被験体に送達することを含んでなる、アデノウイルス受容体を有する細胞の標的指向化方法であって、前記組成物がヘキソン、ペントンおよびファイバーから選択される1種若しくはそれ以上のサルアデノウイルス(SAdV)42.1、SAdV−42.2若しくはSAdV−44タンパク質を含んでなる、上記方法。
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