JP2011501214A - サンプルの構造化照明システム - Google Patents

Abstract

本発明は、サンプル（１４）の三次元顕微鏡検査のための構造化照明システム（８）に関する。システム（８）は、コヒーレント光ビーム（Ｉ_N，Ｉ_-N，Ｉ₀）の生成に適合されたビーム生成手段（９，１０）と、後方焦点面（ＰＦＡ）を有し、自身の焦点合わせ面（ＰＭＰ）にサンプル（１４）が配置可能であるレンズ（１２）と、ビームがレンズ（１２）の焦点合わせ面（ＰＭＰ）でコリメートされた状態で干渉するように前記光ビームを後方焦点面（ＰＦＡ）に集束させる焦点合わせ手段（１９）と、を備え、ビーム生成手段（９， １０）が、レンズ光軸に対して非対称な少なくとも２つの異なる回折ビーム（Ｉ_N、Ｉ₀）、（Ｉ_-N、Ｉ₀）を生成すべく光信号（２２）を回折するようプログラムさ
れた光空間変調器（１０）を備え、光空間変調器（１０）は、少なくとも２つのコヒーレントビームの各々に一定の位相項を適用する計算機を備えていることを特徴とする。

Description

本発明は、サンプルの三次元顕微鏡検査のための構造化照明システムに関する。
非特許文献１は、そのようなサンプルの三次元顕微鏡検査のための構造化照明システムについて記載している。

上記文献では、サンプルの照明は可動グリッドにより構成されている。そのような構造により、いわゆる従来の顕微鏡に比べてシステムの軸方向の分解能が増強可能となっているが、側方の分解能の増強は可能となっていない。

本発明は、より詳細には、サンプルの三次元顕微鏡検査のための構造化照明システムであって、
コヒーレント光ビームを生成するビーム生成手段と、
後方焦点面を有し、レンズの焦点合わせ面にサンプルを配置可能にするレンズと、
レンズの焦点合わせ面でビームがコリメートされた状態で干渉するように、前記光ビームを後方焦点面に集束させる焦点合わせ手段と、を備えている。

かかるサンプルの三次元顕微鏡検査のための構造化照明システムは、より詳細には非特許文献２から公知である。
上記文献では、図１に示されているように、照明システム１は、光源２と、ビーム生成手段を形成する回折ネットワーク３であって、光源２からただ２つのコヒーレント回折ビーム４ａおよび４ｂのみを生成するようにフィルタ７に接続された回折網すなわち回折ネットワーク３と、顕微鏡のレンズ６の後方焦点面ＰＦＡでコヒーレントビーム４ａおよび４ｂを集束させるレンズ５と、レンズ６の焦点合わせ面ＰＭＰに配置されたサンプル１８とを備えている。コヒーレントビーム４ａおよび４ｂは、対称の次数ｐおよび−ｐを有する回折ビームである。

このようなサンプルの三次元顕微鏡検査のための構造化照明システムは、側方分解能が増強されていると共に、全視野で測定可能であるという利点を有する。
しかしながら、主な欠点は、かかるシステムがいわゆる従来の顕微鏡と類似の軸方向分解能しか有していない（つまり約０．４マイクロメートル）ことである。

従って、本発明の目的は、かかるサンプルの三次元顕微鏡検査のための構造化照明システムにおける軸方向分解能を増強することにある。
特許文献１はかかる目標に達することを目指したもので、上述したようなサンプルの三次元顕微鏡検査のための構造化照明システムについて記載しており、ここではコヒーレントビームが、コヒーレントビームのうちの２つのコヒーレントビームがレンズ光軸に対して非対称的な状態になっている。詳しくは、特許文献１は、照明システムの軸方向分解能を増強するために１、０、および−１の回折次数を有するビームを使用している。

しかしながら、特許文献１は、回折ビームを生成するために単純なグリッドを使用すると共に、軸方向測定を行うためのサンプルの軸方向への変位の実行については開示していない。

ここで、従来通りに、例えばピエゾ電気システム等の機械システムにより変位を実行すると、精度に重要な損失を引き起こし、システムの分解能が低減する。

米国特許出願公開第２００７／０１７１５１９号

Wilson et al. "Confocal Mcroscopy by Aperture Correlation" 1998 Gustaffson et al. "Extended Resolution Fluorescence Microscopy", 1999.

本発明の1つの目的は、従来の照明システムに比べて軸方向分解能の増強が可能なサン
プルの三次元顕微鏡検査のための構造化照明システムを提供することにある。
本発明の基礎となっているアプローチは、機械的変位のないサンプルの軸方向変位のシミュレートにある。

本発明の別の目的は、従来の照明システムに比べて軸方向の分解能と側面方向の分解能の両方の増強が可能なサンプルの三次元顕微鏡検査のための構造化照明システムを提供することにある。つまり、軸方向の分解能は約０．３マイクロメートルに、側方の分解能は約０．１マイクロメートルに達する。

本発明の別の目的は、動的現象の研究に匹敵する取得速度である１ヘルツ以上を維持しつつ、かかる上記性能に達することを可能にすることにある。

上記の目標の少なくとも１つは、上述したようなサンプルの三次元顕微鏡検査のための構造化照明システムにより達成され、ビーム生成手段が、レンズ光軸に対して非対称な少なくとも２つの異なる回折ビームを生成すべく光信号を回折するようプログラムされた光空間変調器を備え、光空間変調器は、前記光軸に対して非対称な少なくとも２つのコヒーレントビームの各々に一定の位相項を適用する計算機を備えている。

上記本発明により、およびより詳しくはビーム生成手段により生成されるコヒーレント手段がレンズの光軸に対して非対称な少なくとも２つのビームを備えるという事実により、サンプルは、コヒーレントではあるが軸方向に対称ではないビームによって照らされる。そして、レンズとサンプルの間の距離を変更するか、またはサンプルにおける照明の軸方向への変位により、この対称性の欠如、より詳しくはサンプルの２つの軸方向位置の間の照明の差に由来する、対称性の欠如を用いることが可能である。次に、上述の非特許文献２のＧｕｓｔａｆｆｓｏｎらのシステムに比べて軸方向の分解能を増強し、より詳細には０．３ミリメートル未満の軸方向分解能を得ることが可能となる。本発明によれば、この軸方向の移動は、各コヒーレントビームに位相項を適用することにより、光空間変調器を用いてシミュレートされる。よって、測定には機械的移動を必要とせず、このため機械的損失が低減される。

レンズの光軸に対して非対称な２つのビームは、より詳細にはそれぞれ回折次数がｎおよびｐの回折ビームであり、ｎ＋ｐはゼロとは異なる。
さらに、本発明では、非特許文献２のＧｕｓｔａｆｆｓｏｎらのシステムと同様に、側方分解能は約０．１マイクロメートルに維持される。

従って、本発明のシステムは全視野イメージングシステムであるので、１Ｈｚよりも大
きい速度が得られる。
本発明によれば、照明の三次元構造がこのように得られ、公知の側方エンコードに加えて照明の軸方向エンコードを行うことが可能である。

本発明の有利な実施形態について以下に説明する。
本発明の１つの態様によれば、ビーム生成手段は、光信号を生成する光源を備え得る。
好ましくは、ビーム生成手段は３つのコヒーレントビームを生成するように構成され、３つのコヒーレントビーム中の少なくとも２つのコヒーレントはレンズ光軸に対して非対称である。本発明の範囲内で、そのような３つのコヒーレントビームの生成により、レンズ光軸に対して対称な構造化された視野と、２つの非対称のコヒーレントビームのみによるいくらかの照明に比べて軸方向分解能に関して２倍の利得とが得られる。

好ましくは、ビーム生成手段は、回折によって生成される３つのコヒーレントビームが、対称な回折次数を有する２つの回折ビームと、ゼロに等しい回折次数を有する１つのビームとに相当するように構成される。この場合、対称な次数Ｎおよび−Ｎを有するビームは、ゼロに等しい回折次数を有するビームと共に、光軸に対して非対称な２対のビームを形成し、これは本発明の範囲内で使用可能である。

より詳細には、対称な回折次数を有する２つの回折ビームは、同じ強度を有してもよいし、２つの対称な回折次数は、ゼロに等しい回折次数を有するビームの強度が対称な回折次数を有する回折ビームのうちの１つの強度の４倍に等しくなるように選択されてもよい。そして、この場合に、軸方向分解能の増強が良いことが実証される。

レンズの光軸ｚに垂直なｘ−ｙ平面での側方測定を可能にするために、計算機は、２つの非対称的なコヒーレントビームのうちの１つを他方のコヒーレントビームに対して位相シフトさせるようプログラムされてもよい。この実施例は、サンプルの干渉パターンの側方変位を可能にするという利点を有し、従って、光空間変調器のプログラム化による回折格子の側方変位のシミュレートを可能にするという利点を有する。これにより、システムコンポーネントを物理的に変位させずに側方測定を行うことが可能となる。

従来技術の三次元顕微鏡検査のための構造化照明システム。 本発明の１実施形態によるサンプルの三次元顕微鏡検査のための構造化照明システム。 図２を参照しつつ、図示されたシステムにおける光ビームの経路。

ここで、本発明の１つの実施形態を添付図面を参照しながら説明する。
図２は、本発明の１実施形態によるサンプルの三次元顕微鏡検査のための構造化照明システムを示す。

図３は、図２を参照しつつ、図示されたシステムにおける光ビームの経路を示す。
図中、特段の定めがない限り、同じ参照符号は同様な技術的特徴を示す。
図２に示されているように、本発明の第１実施形態によれば、サンプルの三次元顕微鏡検査用の構造化照明のためのシステム８は、コヒーレントかつ直線偏光した光信号を生成するよう適合された光源９を備えている。光源９は例えばレーザビームである。システム８はさらに、光源９から受け取った光信号から、３つのそれぞれの強度を有する３つの回折ビームＩ_N，Ｉ_-N，Ｉ₀を生成するようにプログラムされた光空間変調器１０を備えている。回折ビームＩ_NおよびＩ_-Nは対称な次数Ｎを有するビームであり、ビームＩ₀はゼロに等しい次数を有するビームである。

ビームＩ₀とビームＩ_Nはレンズの光軸に対して非対称である。同様に、ビームＩ₀とビ
ームＩ_-Nもレンズの光軸に対して非対称である。
回折ビームＩ_NおよびＩ_{- N}の次数は、ゼロに等しい次数のビームＩ₀の強度が、それら
のビームの４倍の強度に等しくなるように選択される。すなわちＩ₀＝４Ｉ_N＋４Ｉ_{- N}で
ある。従って、この場合に軸方向の分解能の増強がより良好であることが実証される。

光源９から受け取った光信号を光空間変調機１０のサイズに適合させるために、光信号を例えば５〜１０倍に広げるために、光源９と光空間変調機１０との間に図示しない無限焦点装置を配置することも可能である。

光空間変調機１０の出口では、回折ビームが新たな無限焦点装置１１を通過し、色収差補正レンズ１９により顕微鏡１３のレンズ１２の後方焦点面ＰＦＡに集束される。無限焦点装置１１の倍率は、回折角度が顕微鏡１３のレンズ１２の直径に適合されるように選択される。

サンプル１４は、例えば蛍光点物体の形をしており、顕微鏡１３のレンズ１２の焦点合わせ面ＰＭＰに配置され、焦点合わせ面ＰＭＰで３つの回折ビームＩ_N、_{- N}、およびＩ₀
は干渉する。

上述のシステム８は、サンプル１４に対する照明の三次元構造を可能にする。実際のところ、３つの回折次数を用いると、レンズにより送られる視野がタルボット（Talbot）効果を示す。

動作の際、側方面ｘ−ｙでの測定を実施するために、光空間変調器１０は、レンズの焦点合わせ面の３つの回折ビームにより生成された干渉パターンを側方に変位させるようにプログラムされる。そのような焦点合わせにより、変調器を物理的に変位させなくても、３つの回折ビームを生成する回折ネットワークの側方変位をシミュレートすることが可能となる。かかる側方変位のシミュレートに加え、蛍光点物体の位置が、いくつかのイメージを組み合わせることによるかまたは該イメージのフーリエ変換によりそれ自体公知の方法で測定される。例えば、回折ネットワークの２つの現実のまたはシミュレートした位置に対して受け取った蛍光の強度間の差によって、回折ネットワークの種々の現実またはシミュレートした位置を決定できる。

さらに、動作の際、軸方向ｚに従う測定を実施するために、サンプル１４とレンズ１２との間の光学距離が偏光される。この目的で、サンプル１４の付近に配置されたピエゾ電気面１５を使用するか、またはレンズ１２を軸方向に移動させることが可能である。本発明によれば、この移動すなわち変位を、一定の位相項を光空間変調器１０内のすべてのピクセルに適用するよう変調器１０をプログラミングすることによりシミュレートすることも可能である。

上述したように、そして周知のタルボット効果のおかげで、蛍光点物体の軸方向の位置が、例えばレンズ１２とサンプル１４の間の２つの現実のまたはシミュレートした距離について受け取った蛍光の強度間の差により、測定される。

図３では、本発明の照明システムでの、光ビームの経路が示される。本発明によれば、光源９は平面波２２の形をした光信号を生成する。この平面波はビーム生成手段２１により回折され、３つの回折次数Ｉ₀，Ｉ_NおよびＩ_-Nのみを生成することが可能となる。このようなビーム生成手段は、図２を参照しながら説明した光空間調節器１０に対応する。回折ビームＩ₀，Ｉ_NおよびＩ_-Nは平面波である。焦点合わせ手段１９は、例えばレンズまた
は色収差補正レンズ１９に相当するが、そのようなビームを顕微鏡１３のレンズ１２の現実の焦点面ＰＦＡに向かって収束させる。従って、ビームＩ₀，Ｉ_NおよびＩ_-Nは、平面波の形で焦点合わせ面ＰＭＰにて干渉し、焦点合わせ面ＰＭＰに位置するサンプル１４に関する測定が行われる。

ここで本発明の別の解決策について説明する。
レンズの焦点合わせ面で干渉する３つのコヒーレントビームを生成することが可能なビーム生成手段について上述した。軸方向分解能を増大させる効果はビームＩ₀，Ｉ_NおよびＩ_-Nに対して最適となり、次数Ｎおよび−ＮはＩ₀＝４Ｉ_N＋４Ｉ_{- N}となるように上述の
ように選択される。

しかしながら、軸方向分解能を増大させる効果は、回折ビームが、レンズの光軸に対して非対称な少なくとも２つのコヒーレントビームがレンズ１２の焦点合わせ面ＰＭＰで干渉するものである限り得られることを理解すべきである。実際、この場合、ビームの軸方向対称性は壊れ、サンプル１４をレンズ１２に対して変位させるか、または上述のようにかかる変位をシミュレートすることにより、サンプル１４の軸方向位置についての情報を得ることが可能である。

これとは逆に、図１を参照すると、レンズ６に対するサンプル１８の変位は、２つのビーム４ａおよび４ｂがレンズ光軸に比べて対称的であるため、非特許文献２のＧｕｓｔａｆｆｓｏｎらに記載のシステム１の範囲には効果がないことに留意する。そのような軸方向の変位は、正確な軸方向の測定を可能にしない。

上記発明が、従来の焦点顕微鏡検査に比べて、約１０倍の軸方向分解能を増強することを可能にすることが実証された。
さらに、図２を参照しつつ説明した光空間変調器の利用は、システムの機械的変位を回避し、そのため測定精度を高めるという利点を有する。

上述のシステム８は、既存の照明システムと共に既存顕微鏡１３にも容易に適合され得る。
この場合、上述の実施形態では、顕微鏡１３は既存のレンズ１２を備えた既存の顕微鏡であってよく、照明システムは、ビームＩ_N，Ｉ_-N，Ｉ₀がレンズ１２の後方焦点面ＰＦＡに集束するように適合される。かくして、全視野観察を可能にする分解能の増強された新しい顕微鏡が得られる。

Claims (8)

1. サンプル（１４）の三次元顕微鏡検査のための構造化照明システム（８）であって、
   コヒーレント光ビーム（Ｉ_N、Ｉ_-N、Ｉ₀）を生成するビーム生成手段（９，１０）と、
   後方焦点面（ＰＦＡ）を有し、レンズの焦点合わせ面（ＰＭＰ）にサンプル（１４）を配置可能にするレンズ（１２）と、
   前記ビームがレンズ（１２）の焦点合わせ面（ＰＭＰ）でコリメートされた状態で干渉するように、前記光ビームを後方焦点面（ＰＦＡ）に集束させる焦点合わせ手段（１９）と、を備え、
   前記ビーム生成手段（９，１０）が、レンズ光軸に対して非対称な少なくとも２つの異なる回折ビーム（Ｉ_N、Ｉ₀）、（Ｉ_-N、Ｉ₀）を生成すべく光信号（２２）を回折するよ
   うプログラムされた光空間変調器（１０）を備え、光空間変調器（１０）は、前記少なくとも２つのコヒーレントビームの各々に一定の位相項を適用する計算機を備えていることを特徴とする、システム。
2. 前記ビーム生成手段は、光信号（２２）を生成する光源（９）を備えている請求項１に記載のシステム。
3. 前記少なくとも２つの非対称的なコヒーレントビームはそれぞれ回折次数ｎおよびｐの回折ビームであり、ｎ＋ｐはゼロではない請求項１または２に記載のシステム。
4. 前記ビーム生成手段（１０，９）は３つのコヒーレントビーム（Ｉ_N、Ｉ_-N、Ｉ₀）を生成し、該３つのコヒーレントビーム中の少なくとも２つのコヒーレントビーム（Ｉ_N、Ｉ_-N
   、Ｉ₀）はレンズ光軸に対して非対称である請求項１〜３のいずれか一項に記載のシステ
   ム。
5. 前記ビーム生成手段（１０，９）は、回折により生成された前記３つのコヒーレントビームが、対称な回折次数を有する２つの回折ビームと、ゼロに等しい回折次数を有する１つのビームとに相当するように適合されている請求項４に記載のシステム。
6. 対称的な回折次数を有する２つの回折ビームは等しい強度を有し、ゼロに等しい回折次数を有するビームの強度が対称的な回折次数を有する回折ビームのうちの１つの強度の４倍に等しくなるように２つの対称的な回折次数が選択される請求項５に記載のシステム。
7. 前記計算機は、２つの非対称的なコヒーレントビームのうちの１つを他方のコヒーレントビームに対して位相シフトさせる請求項１〜６のいずれか一項に記載のシステム。
8. 請求項１〜７のいずれか一項に記載の構造化照明システム（８）を備えた顕微鏡。

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