JP2014063151A - 顕微鏡用照明光学系およびこれを用いた顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】物体面の走査や高度に制御された照明系を必要とすることなく、高品質なセクショニング効果が得られる３次元蛍光顕微鏡に好適な照明光学系を提供する。
【解決手段】照明光学系は、物体面１０１に配置された試料を観察する顕微鏡において該物体面を照明する。該照明光学系の瞳面に、互いにコヒーレントな複数の光源領域Ａ，Ｂ，Ｃが互いに離れて配置され、該複数の光源領域のそれぞれの中心ｃＡ，ｃＢ，ｃＣと該照明光学系の瞳の中心ｃＰとの距離ｄＡ，ｄＢ，ｄＣとの距離のうち、少なくとも１つの距離を他の距離と異ならせる。
【選択図】図１６

Description

本発明は、顕微鏡において試料を照明する顕微鏡用照明光学系に関し、特に３次元蛍光顕微鏡に好適な顕微鏡用照明光学系に関する。

顕微鏡、特に蛍光顕微鏡による生体試料の観察は、医学への応用を含む生物学的研究にとって不可欠である。ただし、通常の蛍光顕微鏡で厚みのある試料を観察すると、試料内部の光が透過した全ての高さ位置にある画像が重畳された画像が観察される。つまり、ピントが合っている高さ位置の平面（合焦平面）の画像以外に、ピントが外れた高さ位置にある平面（非合焦平面）のぼけ画像が重畳されて観察される。このように、通常の蛍光顕微鏡においては、所望の合焦平面の画像だけを選択的に分離して取り出すことができない。所望の合焦平面の画像だけを選択的に分離して取り出す効果は、「セクショニング効果」と呼ばれている。

種々の機構に基づいてセクショニング効果が得られるように構成された蛍光顕微鏡は、３次元蛍光顕微鏡と称され、通常の蛍光顕微鏡とは区別される。セクショニング効果があると、任意の合焦面の画像を計算機上で積層して立体的な３次元画像を作り出すことができる。すなわち、これまで経験豊富な病理医等が脳内で行っていた細胞配置の立体視が、デジタル処理によって誰にでも行えるようになる。

代表的な３次元蛍光顕微鏡として、共焦点顕微鏡がある。これは、合焦平面から来る光の集光点にピンホールを配置することにより、所望の合焦平面から来る光のみを通過させ、非合焦平面から来る収束度合いの緩い光を遮蔽する方式である。この方式は、高いセクショニング効果を持つが、一度に撮像できる領域が点状に狭いため、試料の全領域を観察するためには走査が必要である。

一方、計算機による画像処理を援用してセクショニング効果を実現する方法として、構造化照明法がある（非特許文献１参照）。この方式では、物体面において照明強度が、例えば正弦波状に変化するような状況を作り、その位相をずらすことによって正弦波構造が平行移動した複数枚の画像を取得する。その後、計算機上でその複数枚の画像を処理することによりセクショニング効果を得る。この方式は、高い精度で位相、すなわち位置を制御された正弦波構造を作り出すことが必要である。

さらにランダムに生成されたスペックルを照明として利用する方法も知られている（特許文献１および非特許文献２〜６参照）。この方法もまた計算機による画像処理を用いるが、物体面の照明強度がランダムなスペックルに依存するため、最終画像に不均一な強度むらが発生することが避けられないという欠点を持つ。

米国特許公開２０１０／０２２４７９６号公報

M. A. A. Neil and T. Wilson, "Method of obtaining optical sectioning by using structured light in a conventional microscope," Opt. Lett. 22, 1905 (1997). C. Ventalon and J. Mertz, "Quasi-confocal fluorescence sectioning with dynamic speckle illumination," Opt. Lett. 30, 3350-3352 (2005). C. Ventalon and J. Mertz, "Dynamic speckle illumination microscopy with translated versus randomized speckle patterns," Opt. Express 14, 7198-7209 (2006). C. Ventalon, R. Heintzmann, and J. Mertz, "Dynamic speckle illumination microscopy with wavelet prefiltering," Opt. Lett. 32, 1417-1419 (2007). Daryl Lim, Kengyeh K. Chu, and Jerome Mertz,"Wide-field fluorescence sectioning with hybrid speckle and uniform-illumination microscopy," Opt. Lett. 33, 1819-1821 (2008). Daryl Lim, N.Ford,Kengyeh K. Chu, and Jerome Mertz,"Optically sectioned in vivo imaging with speckle illumination HiLo microscopy" Journal of Biomedical Optics. 16, 016014 (2011).

以上のことから、物体面の走査や高度に制御された照明系を必要とすることなく、高品質なセクショニング効果が得られる３次元蛍光顕微鏡の開発が望まれている。

本発明は、このような３次元蛍光顕微鏡を実現するために特に好適な照明光学系を提供する。

本発明の一側面としての照明光学系は、物体面に配置された試料を観察する顕微鏡において該物体面を照明する照明光学系であって、該照明光学系の瞳面に、互いにコヒーレントな複数の光源領域が互いに離れて配置され、該複数の光源領域のそれぞれの中心と該照明光学系の瞳の中心との距離のうち、少なくとも１つの距離が他の距離と異なることを特徴とする。

なお、上記顕微鏡用照明光学系と、該顕微鏡用照明光学系により照明された試料を観察するための対物光学系とを有する顕微鏡も、本発明の他の一側面を構成する。

本発明の照明光学系を用いることにより、物体面の走査や照明系に対する高度な精度を必要とすることなく、高品質なセクショニング効果が得られる３次元蛍光顕微鏡を実現することができる。

一様照明された物体Ｏを表す図である。 スペックル照明された物体Ｏを表す図である。 図１と図２の差分を表す図である。 図３中の点（ｘ，ｙ）の近傍における強度の空間分散値を計算する領域を模式的に表す図である。 σ（ｘ，ｙ，ｚ）のｘ−ｙ方向の不均一性を表す図である。 （ａ）はｃｏｍｂ関数状の照明光強度分布を実現するための瞳関数の例を表す図であり、（ｂ）はその瞳関数を用いたときにできる実際の照明光強度分布を表す図である。 図６（ａ）の瞳関数を持つ照明光学系を用いたときに試料中のｚ＝±２μｍの平面にできる照明光強度分布を示す図である。 図６（ａ）の瞳関数を持つ照明光学系を用いて物体Ｏ２を照明した際に、試料中のｚ＝０μｍの平面で観察される蛍光強度分布を示す図である。 （ａ）は本発明の実施例１において瞳関数Ｐ２を示す図であり、（ｂ）は該Ｐ２を持つ照明光学系を用いたときに試料中のｚ＝０μｍの平面における照明光強度分布を示す図である。 図９（ａ）の瞳関数を持つ照明光学系を用いて物体Ｏ２を照明した際に、試料中のｚ＝０μｍの平面で観察される蛍光強度分布を示す図である。 本発明の実施例の照明光学系の３次元蛍光顕微鏡における配置例を示す模式図である。 非特許文献５，６に記載のランダムスペックルを照明に用いる方法で得られた物体Ｏ２の像を表す図である。 本発明の実施例１における瞳関数Ｐ２を備えた照明光学系が形成する格子状照明を用いた場合の物体Ｏ２の像を表す図である。 本発明の実施例２で示された２つの光源点を持つ瞳関数とその瞳関数を持つ照明光学系を用いたときに試料中のｚ＝０μｍの平面における照明光強度分布を示す図である。 実施例２で示された２つの光源点を持つ瞳関数を備えた照明光学系が形成する縞状照明を用いた場合の物体Ｏ２の像を表す図である。 実施例の瞳関数を説明する図である。 通常の顕微鏡の概略図である。 照明ユニットの１番目の実施例の概略図である。 照明ユニットの１番目の実施例において、３つの光束を用いる構成を示す図である。 照明ユニットの２番目の実施例の概略図である。 照明ユニットの３番目の実施例の概略図である。 実施例４の遮光部材の概略図である。 実施例５の概略図である。

以下、本発明の実施例について図面を参照しながら説明する。

本発明の実施例である顕微鏡用照明光学系は、例えば、発光機構が蛍光または燐光である自家発光体としての試料を観察する３次元顕微鏡に適用することができる。顕微鏡のタイプとしては、落射型顕微鏡および透過型顕微鏡のいずれでもよい。

具体例として、実施例の顕微鏡用照明光学系は、デジタルスライドスキャナーに使用する被検サンプルである蛍光染色された試料を観察する顕微鏡に適用することができる。デジタルスライドスキャナーは、生物学や病理学的検査等で使用するプレパラートを高速でスキャンし、高解像度なデジタルデータに変換する装置である。さらに、実施例の顕微鏡用照明光学系は、例えば、開口数（ＮＡ）の大きな投影光学系を備えるデジタルスライドスキャナーや通常の蛍光顕微鏡にセクショニング効果を付与する手段として使用し得る。

まず、実施例の顕微鏡用照明光学系について詳しく説明する前に、従来用いられてきたスペックルを用いる方法の問題について説明する。

非特許文献５，６には、一様な強度で照明された画像１とスペックルで照明された画像２の２枚の画像を用いて、合焦平面にある蛍光物体の画像のみを抽出する方法が開示されている。それによれば、まず計算機により画像１と画像２の強度差を示す画像３を作成する。物体をスペックルで照明するためには、コヒーレントな励起光を光源に持つ照明光学系の瞳にすりガラス等のランダムな位相擾乱を与える物体を挿入すればよい。ここでは、説明を簡単にするために、蛍光物体の強度分布をＯ（ｘ，ｙ，ｚ）として、Ｏ（ｘ，ｙ，ｚ）＝δ（ｚ）であるようなものを考える。以下の説明では、蛍光物体の強度分布Ｏ（ｘ，ｙ，ｚ）を物体Ｏと略称することがある。物体Ｏは、ｚ＝０の平面にだけ局所的に存在し、ｘ−ｙ方向は一様な強度分布を持つような仮想的な物体である。そして、ｚ＝０を合焦平面とする。また、ｚ＝±ａ（ａ＞０）の平面を、非合焦平面の代表とする。

図１（ａ）は、一様な強度分布を持つ照明で物体Ｏを照明し、合焦平面にピントを合わせて観察したときに得られる画像である。この一様な強度分布を持つ照明によって撮影された像をＩｓ（ｘ，ｙ，ｚ）とする。また、図１（ｂ）は、同様の照明で非合焦平面にピントを合わせて観察したときに得られる画像である。これらの画像が上述した画像１に相当する。

また、図２（ａ）はスペックルで物体Ｏを照明し、合焦平面にピントを合わせて観察したときにえられる画像である。また、図２（ｂ）は、同様の照明で非合焦平面にピントを合わせて観察したときに得られる画像である。これらの画像が上述した画像２に相当する。

さらに、図３（ａ）は、図１（ａ）に示す画像の強度分布と図２（ａ）に示す画像の強度分布との差分を示す画像である。また、図３（ｂ）は、図１（ｂ）に示す画像の強度分布と図２（ｂ）に示す画像の強度分布との差分を示す画像である。これらの画像が上述した画像３に相当する。

図１（ａ），（ｂ）から明らかなように、通常の一様な照明を用いて撮像すると、実際に物体Ｏが存在するｚ＝０にピントを合わせたとき得られる画像と、本来物体Ｏが存在しないｚ＝±ａ（ａ＞０）にピントを合わせたときに得られる画像とが全く同一で区別できない。これにより、通常の蛍光顕微鏡にはセクショニング効果がないことが分かる。

非特許文献５，６には、これらのデータから実際の蛍光物体の強度分布Ｏを反映したデータを抽出する方法が開示されている。具体的には、図３（ａ），（ｂ）に示す画像を計算機に取り込んで、点（ｘ，ｙ）の近傍の領域（図４中に白枠で示す領域）の強度差の空間分散値σを計算する。そして、このようにして得られた分散値のマップσ（ｘ，ｙ，ｚ）を作成する。このとき、図３（ａ），（ｂ）から容易に想像できるように、合焦平面からの光を処理した画像に相当する図３（ａ）の画像では、白黒のコントラストが鮮鋭であるため、σ（ｘ，ｙ，０）は高い値となる。一方、非合焦平面からの光を処理した画像に対応する図３（ｂ）に示す画像は、スペックル像のぼけによりコントラストがほとんどない画像である。このため、σ（ｘ，ｙ，ａ）はほぼ一様に０に近い値となる。

したがって、以下の式（１）を用いてＩ（ｘ，ｙ，ｚ）を計算すれば、Ｉ（ｘ，ｙ，ｚ）はσ（ｘ，ｙ，ｚ）によってセクショニング効果を獲得した画像となる。すなわち、Ｉ（ｘ，ｙ，０）は値を持つが、Ｉ（ｘ，ｙ，ａ）はほとんど値を持たない。
Ｉ（ｘ，ｙ，ｚ）＝Ｉｕ（ｘ，ｙ，ｚ）・σ（ｘ，ｙ，ｚ） ．．．（１）
ここで、Ｉｕ（ｘ，ｙ，ｚ）は、高さｚの位置に焦点が合うように通常の一様な照明を用いて撮像された画像である。

このようにして、実際の物体Ｏに近い画像を計算機上で再構成できる。しかし、この方法には、照明として本質的にランダム現象であるスペックル現象を利用するため、不可避な欠点を有する。以下、この欠点について説明する。

本来期待されるＩ（ｘ，ｙ，０）は、図１（ａ）に示すようなｘ−ｙ方向に均質なＩｕ（ｘ，ｙ，０）である。つまり、σ（ｘ，ｙ，０）もｘ−ｙ方向に均質であることが期待される。しかし、実際には、σ（ｘ，ｙ，０）が決してｘ−ｙ方向に均質とならないことを図５に示す。これはスペックルが一様な分布をしていないことに起因する、いわゆる照明むらであって、これが最終的なＩ（ｘ，ｙ，０）の画質を大きく劣化させる。

そこで、本実施例では、この照明むらによる画質劣化を防止しつつ、セクショニング効果を持った照明方法を提供する。以下、その原理について説明する。

本実施例は、以下の数学的事実に立脚している。一般に、式（２）で表される関数を、ｃｏｍｂ関数という。

ｃｏｍｂ（ｘ，ｙ）＝Σδ（ｘ−ｍｐ）δ（ｙ−ｎｐ） ．．．（２）
ここで、δはディラックのデルタ関数を表し、ｐは無限大の値をとる点同士の座標軸に沿った方向の間隔（ピッチ）である。また、和記号は、−∞＜ｍ，ｎ＜∞の整数でとる。

このｃｏｍｂ関数に関する数学的事実は、式（３）で示すように、そのフーリエ変換もまた、ピッチが１／ｐのｃｏｍｂ関数となっていることである。

Ｆ[ｃｏｍｂ（ｘ，ｙ）]（ｆ，ｇ）＝Σδ（ｆ−ｍ／ｐ）δ（ｇ−ｎ／ｐ） ．．．（３）
ここで、Ｆはフーリエ変換を表す記号であり、ｆ，ｇはそれぞれｘ，ｙに対応する空間周波数を表す。

一般に、光学系の瞳における振幅分布Ｐ（ｆ，ｇ）（瞳関数）をフーリエ変換したものが像面での振幅分布になる。光学系が照明光学系である場合、像面での振幅分布の絶対値二乗が、試料物体を照明する光の強度分布となる。そこで、照明光学系のＰ（ｆ，ｇ）をｃｏｍｂ関数状にしておけば、ｃｏｍｂ関数状の照明光が実現することが期待される。ｃｏｍｂ関数状の照明光は、物体面上において均一のピッチで均一の強度の光が分布しているものであるから、照明むらが発生することがないと期待される。

非特許文献５，６には、物体面上での照明光のピッチができるだけ細かい方が図４で示されるσの計算領域を小さくできるため、水平方向の解像性能が良くなることが記載されている。したがって、照明光学系の瞳面上におけるピッチは可能な限り大きい方がよい。実際には、光学系の瞳は有限の大きさしか持たないため、式（３）で表されるようなｆ−ｇ方向に無限に続くような照明を実現することはできない。しかしながら、ｃｏｍｂ関数の最小構成単位だけを瞳面上の振幅分布として採用しても、照明むらのない照明光を実現できる。

このことを図６を用いて示す。図６（ａ）は、Ｐ（ｆ，ｇ）として、式（２）で示されるｃｏｍｂ関数に表れる最小の正方形を採用した照明を示す。また、図６（ｂ）はそのときに物体面上にできる照明強度である。ここで、使用波長λ＝５００ｎｍ、開口数ＮＡ＝０．７である。また、照明光学系の瞳は、半径を１として規格化したものを用いており、このときの振幅を持つ位置の座標は、
（１／√２，１／√２）
（-１／√２，１／√２）
（-１／√２，-１／√２）
（１／√２，-１／√２）
である。

図６（ｂ）に示すように周期的な照明光で照明された物体に前述したσ（ｘ，ｙ，０）を計算する方法を用いれば、照明むらがないため、非常に均一性の高いσ（ｘ，ｙ，０）が得られる。

しかし、図６（ａ）に示すように与えられる照明には大きな欠点がある。このような照明光学系の瞳関数Ｐ（ｆ，ｇ）を用いたとき、像面（すなわち物体面）から離れた場所での照明分布はほとんどぼけないことが知られている。その様子を図７に示す。

図７は、ｚ＝±２．０μｍの位置での照明光の分布を示す。図７を図６（ｂ）と比較すると、ほとんどぼけが確認できないことが分かる。このような状況下で問題となる事態を説明するために、物体Ｏ２（ｘ，ｙ，ｚ）＝δ（ｚ＋１）＋δ（ｚ−１）を考える。ｚの単位はμｍとする。

物体Ｏ２を撮像する場合には、もちろんｚ＝０で強度を持ってはならない。もし強度を持ったとしても、それはｚ＝±１における画像の強度よりも非常に低いものであることが必要である。

今、物体Ｏ２の上側のｚ＝１に位置する蛍光物体も下側のｚ＝−１に位置する蛍光物体もほぼ同様の照明形状で照明したとする。ところが、図６（ａ）に示すように与えられる照明はそのぼけ量が小さい。このため、ｚ＝０の位置に上側の蛍光物体から来るｃｏｍｂ関数状の蛍光と下側の蛍光物体から来るｃｏｍｂ関数状の蛍光とがぴったり重なり合って非常にコントラストの高い光強度分布が形成される。このｚ＝０において形成される光強度分布を、図８に示す。前述したようにコントラストの高い状態は、σ（ｘ，ｙ，０）の値を高止まりさせる。結果として、本当は物体Ｏ２の存在しないはずのｚ＝０の位置にあたかも蛍光物体が存在するかのような画像が得られてしまう。

そこで、本実施例では、この問題を解決するための照明光学系の瞳面上での瞳関数（振幅分布）Ｐ（ｆ，ｇ）として、図９（ａ）に示すＰ２（ｆ，ｇ）を用いる。Ｐ２（ｆ，ｇ）は、照明光学系の半径１で規格化された瞳面での直交座標系において、以下の座標で示す瞳内の３点または該３点が作る三角形と相似な三角形の３頂点に、互いにコヒーレントな点光源を配置することを特徴とする。
（−１／√２＋ａ，１／√２＋ｂ）
（−１／√２＋ａ，−１／√２＋ｂ）
（１／√２＋ｂ，−１／√２＋ａ）
これら座標中のａ，ｂは実数である。

言い換えれば、瞳関数Ｐ２（ｆ，ｇ）では、図１６に示すように、照明光学系の瞳面に互いにコヒーレントな複数の光源領域Ａ，Ｂ，Ｃが互いに離れて配置されている。そして、該複数の光源領域Ａ，Ｂ，Ｃのそれぞれの中心ｃＡ，ｃＢ，ｃＣと該照明光学系の瞳の中心ｃＰとの距離ｄＡ，ｄＢ，ｄＣのうち、少なくとも１つの距離が他の距離と異なる。ここにいう光源領域は、微小な領域を有するとみなせる点光源も含む。また、光源領域は、瞳の半径に対する大きさの割合が０．３未満の領域であることが好ましい。少なくとも１つの距離が他の距離と異なるとは、すべての距離が異なっていてもよいし、１つの距離のみが他の２以上の同じ距離と異なっていてもよいという意味である。

瞳関数（振幅分布）Ｐ２（ｆ，ｇ）を用いて実際にできる物体面上での格子状の照明光強度分布を図９（ｂ）に示す。瞳面上の振幅を持つ３点を結んでできる直角二等辺三角形もｃｏｍｂ関数の繰り返し単位であるため、形成される照明形状も図６（ｂ）に示す照明強度と似通ったものになる。それぞれのスポットの形状は若干楕円形に近い形状をしているが、照明むらは全くない。このように複数のコヒーレント光源を原点（瞳の中心）に対して意図的に非対称に配置したＰ２の効果は、照明光を斜入射させるために、ｚが変化すると照明光の強度分布が横ずれすることに現れる。

この効果を検証するため、再び物体Ｏ２の上側のｚ＝１に位置する蛍光物体と下側のｚ＝−１に位置する蛍光物体がそれぞれＰ２により形成される照明によって位置ずれして照明される状況を考える。この状況では、ｚ＝０の位置において上側の蛍光物体から来る蛍光と下側の蛍光物体から来る位置ずれした蛍光とが、ぴったり重なり合わずにずれて重なることで、非常にコントラストの低い光強度分布が形成される。その様子を図１０に示す。図１０を図８と比較すると、図１０の方がコントラストの低い画像になっている。従って、本実施例によれば、ｚ＝０付近の本来物体が存在しない領域が不用意に解像してしまうことを抑えられることが分かる。

以上説明した本実施例の照明方法（つまりは照明光学系）によれば、非特許文献５，６にて開示された方法と合わせて用いることで、強度むらのない良好な画像が、長時間を要する走査を行うことなく得られる。

次に、３次元蛍光顕微鏡における本実施例の照明光学系の好適な配置例を図１１を用いて説明する。図１１において、１００は落射型３次元蛍光顕微鏡である。

１１０は照明光学系であり、対物レンズ１０２およびイメージセンサ（撮像素子）１０３により構成される顕微鏡本体に対して付加することができる構成を有する。１０１は物体面に配置された物体（試料）である。

照明光学系１１０において、１１１はコヒーレントな光源であり、蛍光試料を励起できる波長のレーザ等を用いることができる。１１２は回折格子、プリズムまたは光ファイバ等の光学素子であり、光源１１１から発せられた１本のビームを複数本（例えば、３本）に分ける作用を有する。光学素子１１２は、上記回折格子やプリズム等に限られず、照明光学系１１０の瞳面１１３に対して本実施例が特徴とする瞳関数形状を実現できるものであればどのようなものでもよい。本実施例における瞳関数形状の形成方法は、顕微鏡または半導体露光装置に関する技術者にとっては容易な方法により実現可能であり、例えば、計算機生成ホログラム（ＣＧＨ）を利用することができる。

分けられたビームはダイクロイックミラー１１４を介して対物レンズ（対物光学系）１０２を通過し、物体１０１を格子状の照明光強度分布によって照明する。物体１０１から出た蛍光は、対物レンズ１０２を通過した後、ダイクロイックミラー１１４を通過し、さらに対物レンズ１０２を通過してイメージセンサ１０３上に結像する。イメージセンサ１０３による撮像によって得られ、不図示のモニタに表示された画像が観察者によって観察される。

以上の説明においては、照明光学系の瞳面上の点光源は３点としたが、点光源数は３点に限定されない。点光源数が３点であるとき、物体１０１には、各点光源の位置に対応した入射角を持つ３つの光束が照射され、図９ｂに示されるような格子状のパターンが生成される。実施例２においてさらに詳しく説明するように、点光源数が２点であっても本発明の方法は問題なく実施できる。

照明光学系の瞳面上における振幅分布Ｐ（ｆ，ｇ）として、２つの点光源を採用した場合、物体１０１には図１４ｂで示されるような縞模様が生成される。図１４ａで示すように、２点の点光源が瞳中心に対して非対称に配置されているため、フォーカス座標ｚが変化すると縞模様の強度分布が横ずれする。このことは、既に説明した非対称な３つの点光源の場合と同様である。従って瞳中心に対して対称でない２つの点光源を設定した場合も非対称な３つの点光源の場合と同様に強度ムラのない良好なセクショニング画像を得ることができる。

以下、照明光学系の瞳面に互いにコヒーレントな複数の光源領域が互いに離れて配置され、複数の光源領域のそれぞれの中心と該照明光学系の瞳の中心との距離のうち少なくとも１つの距離が他の距離と異なることで得られる照明光の強度パターンをまとめて非対称構造照明と呼ぶ。

以上、本発明の実施形態の概略を説明した。本発明を適用すれば、通常の蛍光顕微鏡に対して、非対称構造照明と一様な強度分布を持つ照明の両方を実現するための照明ユニットを取り付けることで高品質なセクショニング効果をもつ３次元蛍光顕微鏡システムを構築する事ができる。また、照明ユニットは簡単かつ原状復帰が可能な改造を通常の蛍光顕微鏡に施すだけで実現できる。以下、この照明ユニットの具体的な実施形態について説明する。

３次元蛍光顕微鏡を実現するためには（ａ）実質的に一様な強度分布を持つ励起光で照明した時の（以後、単に一様照明と呼ぶことがある）蛍光試料の像１と（ｂ）非対称構造照明による蛍光試料の像２を各々撮影、取得する必要がある。

そこでまず、非対称構造照明を実現する照明ユニットの構成および手段を述べる。蛍光画像はＣＣＤなどのイメージセンサを用いて取得されるものとし、通常の蛍光顕微鏡は、カメラポートを複数持つことが一般的であるため、以下の説明でもカメラポートが複数存在することを前提とする。また接眼観察系は、以下の説明において本質的役割を果たさないため図内の記載および説明を省略する。

図１７は通常の蛍光顕微鏡の構造概略図である。なお、以下の説明において、共通する部材には共通する番号を付す。また同じ機能を有する異なる部材についても同一の番号を付すことがある。

水銀ランプ、レーザなどの励起光源（不図示）からの励起光３０１（点線）は、通常の蛍光顕微鏡２００の内部に導かれ、励起光用フィルタ２０１を通って所定の波長域を持つ光束となり、ダイクロイックミラー１１４に到達する。ダイクロイックミラー１１４は、蛍光試料の励起波長と蛍光の波長の概ね中間にあたる波長よりも短波長の光を反射し、反対に長波長の光を透過する。従って励起光３０１はダイクロイックミラー１１４により反射され、対物レンズ１０２−Ａを通って、物体１０１に照射される。物体１０１から発せられた蛍光３０２（実線）と、物体１０１によって反射・散乱された励起光３０３（１点鎖線）が対物レンズ１０２−Ａを通ってダイクロイックミラー１１４に達する。ダイクロイックミラー１１４において蛍光３０２のほとんどは透過し、蛍光用フィルタ２０３に達するが、物体１０１によって反射・散乱された励起光３０３のほとんどは反射される。

なお、励起光用フィルタ２０１とダイクロイックミラー１１４および蛍光用フィルタ２０３の３部材は、３体で１つのユニットとして構成され、ターレットなどで回転して着脱、交換可能になっている場合がほとんどである。

蛍光用フィルタ２０３を透過した蛍光３０２は、折り曲げミラー２０２を経て、結像レンズ１０２−Ｂを通り、ハーフミラー２０４で光路を２つに分割される。その一部は第１のカメラポート２１１に導かれ、そこに設置されたＣＣＤなどのイメージセンサ１０３上に結像する。残りは第２のカメラポート２１２に達する。第１および第２のカメラポート２１１、２１２は、物体１０１に共役な位置に設けられており、イメージセンサ１０３の像面は物体１０１と共役な面に設置される。該第１および第２のカメラポート２１１、２１２の内部にある物体１０１と光学的に共役な面を以降、カメラポート内共役面などと呼ぶ。

通常の蛍光顕微鏡を含む最近の大多数の顕微鏡は無限遠補正方式を採用しており、試料からの蛍光は対物レンズで平行光束となり、結像レンズまで平行光束の形で伝搬し、結像レンズで集光される仕組みとなっている。また、一般に顕微鏡は像側、物体側ともにテレセントリックな光学系である。以上の条件により、無限遠補正方式を採用する顕微鏡においては、試料は対物レンズの前側焦点に位置するときに合焦していることになり、結像レンズの後側焦点に結像する。また対物レンズの後側焦点と結像レンズの前側焦点の位置は一致している。カメラポート内共役面と結像レンズの後側焦点は、光軸方向の位置が一致している。

物体上に非対称構造照明を実現するためには、励起光を所定の入射角を持つ互いにコヒーレントな複数の光束に分割し、かつ複数の光束が物体面において重なりあう干渉領域をつくることが必要である。以下、互いにコヒーレントな光束を単に光束と呼ぶことがある。既存の通常の蛍光顕微鏡に対してこのような非対称構造照明を実現する際、どこから励起光を入射させるかが問題になるが、本発明では前述したようにカメラポートを持つ通常の蛍光顕微鏡では、カメラポート内共役面と物体面が共役の関係にあることに注目する。

特に、第１のカメラポート２１１にＣＣＤなどのイメージセンサ１０３を配置し、第２のカメラポート２１２から非対称構造照明用の複数の光束に分けられた励起光を入射させることを考える。そうすると、該複数の光束に分けられた励起光を第２のカメラポート２１２から顕微鏡内に入れ、結像レンズ１０２−Ｂ、対物レンズ１０２−Ａ、物体１０１というように、通常の物体の結像と逆の光路を辿らせて、試料に励起光を照射することができる。カメラポートと試料が共役な位置にあることから、入射した複数の光束がカメラポート内共役面で重なっていれば、それらは物体面でも重なりをもち、互いに干渉し合って非対称構造照明を実現することが保証される。
非対称構造照明のパターンのピッチは、複数の光束の物体面への入射角によって規定される。これらの角度は、カメラポートに入射する複数の光束の光軸に対してなす角度により規定できる。具体的には、カメラポート内共役面に対する物体の結像倍率をｍとし、各光束の物体面への入射角をθ_２とすると、カメラポートに入射する光束の光軸に対してなす角度θ_１は、
ｓｉｎθ_１＝ｓｉｎθ_２／ｍ
を満たすように決めればよい。

次に入射させる励起光の光学的性質について説明する。ここで非対称構造照明に用いる光源はコヒーレントであることが必要であるため、レーザ光源を用いるとよい。レーザ光源としては、励起波長域内に発振波長を持つ半導体レーザ、ガスレーザなどを使用する事が可能である。レーザ光についての重要な概念の一つにビームウエストがある。ビームウエストはレーザビームのビーム径が最小となる位置であり、レーザビームのビーム径は、ビームウエストでのビーム径よりも伝搬の前後で大きくなる。またレーザ光の波面の曲率半径は、ビームウエストにおいて極大（平面）となることが知られている。非対称構造照明の強度パターンへの歪みを軽減するため、複数の光束の各波面は物体面において平面になっていることが望ましい。従って非対称構造照明を形成するための複数の光束は、物体面上で各々ビームウエストを形成するような複数のレーザビームからなっているとよい。以上、通常の蛍光顕微鏡を用いて非対称構造照明を実現する方法と、好ましい条件について説明してきた。

次に複数の光束をつくる照明ユニットの構成と、照明ユニットを通常の蛍光顕微鏡に取り付けるために必要な改造について説明する。

図１８は、非対称構造照明用の照明ユニットを通常の蛍光顕微鏡に取り付けて構成される３次元顕微鏡システムの概略図である。接眼観察系については、図内の記載および説明を省略する。図１８は複数の光束が２つの光束からなり、縞状のパターンを物体面に投影する場合を例示的に想定している。

４００は、照明ユニットであり、通常の蛍光顕微鏡２００とは、第２のカメラポート２１２において、マウント部材５００で接続されている。照明ユニット４００内には蛍光試料を励起するためのレーザ光源１１１があり、レーザビーム３０１（点線）を発する。レーザビーム３０１は第１の光路調整系４１０に入射する。光路調整系４１０は、折り曲げミラー４１１〜４１４からなり、レーザビーム３０１はこの順番に４枚の折り曲げミラーで反射され、集光レンズ４０１に入射する。集光レンズ４０１およびコリメータレンズ４０２を通ったレーザビーム３０１は、第２の光路調整系４２０に入射する。

光路調整系４２０は、折り曲げミラー４２１〜４２４からなり、レーザビーム３０１はこの順番に４枚の折り曲げミラーで反射されたのち、マッハツェンダー光学系４３０に入射する。マッハツェンダー光学系４３０に入射したレーザビーム３０１は、ハーフミラー４３１で強度分割され２つのレーザビーム３０１−Ａと３０１−Ｂに分かれる。レーザビーム３０１−Ａは折り曲げミラー４３３で反射され、ハーフミラー４３４に至る。一方レーザビーム３０１−Ｂは、折り曲げミラー４３２で反射され、ハーフミラー４３４に達する。両レーザビーム３０１はハーフミラー４３４により、強度が半減する。その後レーザビーム３０１は、マウント部材５００および第２のカメラポート２１２を通って通常の蛍光顕微鏡２００内に入射する。

これ以降、２つのレーザビーム３０１−Ａ、３０１−Ｂは、ハーフミラー２０４、結像レンズ１０２−Ｂ、折り曲げミラー２０２、対物レンズ１０２−Ａを通って物体１０１に達する。ここでマッハツェンダー光学系４３０内のハーフミラー４３１、折り曲げミラー４３２、折り曲げミラー４３３、ハーフミラー４３４は、各々、不図示の角度調整機構を持つ。該角度調整機構によりマッハツェンダー光学系２つのレーザビーム３０１−Ａ、３０１−Ｂが第２のカメラポート２１２において重なり合い、各々所定の入射角物体面を照射するように調整することができる。

ここからは、物体１０１上に形成されるビームウエストの好適なビーム径および該ビーム径を実現するための光学系のパラメータの設定について説明する。

物体１０１上のビーム径は、物体１０１上の照明領域を規定するものであり、観察領域を十分カバーする大きさである必要がある。対物レンズ１０２−Ａの焦点距離をｆ_ｏｂｊ、結像レンズ１０２−Ｂの焦点距離をｆ_ｔｕｂｅとすると物体１０１からイメージセンサ１０３までの結像倍率ｍはｍ＝ｆ_ｔｕｂｅ／ｆ_ｏｂｊ で表される。イメージセンサ１０３の有効撮像領域の対角の長さの１／２を Ｗ_{ｉｍａｇｅ}とし、物体１０１上での有効撮像領域の対角の長さの１／２ をＷ_ｏｂｊとするとＷ_ｏｂｊ＝Ｗ_{ｉｍａｇｅ}／ｍ となる。従って物体１０１上のビーム径をＷ_{ｉｍａｇｅ}／ｍ もしくはそれ以上に設定することが必要になる。以下、物体１０１上のビーム径をＷ_{ｉｍａｇｅ}／ｍとして説明する。

ビームウエストの位置およびビームウエストでのビーム径は、レンズを通すことによって変換できる。レンズ透過前後のビームウエストにおけるビーム幅（１／ｅ^２ 半径）をそれぞれｗ_１、ｗ_２とし、レンズ透過前後のビームウエストからレンズまでの距離をそれぞれｄ_１、ｄ_２とする。また、レンズの焦点距離をｆ、レーザの波長をλとすれば式（４）の関係が成り立つ。 ｗ^２ ＝ ｗ_１ ^２・ｆ^２／｛（ｆ−ｄ_１）^２＋（π・ｗ_１ ^２／λ）^２｝
ｄ_２＝ｆ＋（ｗ_２／ｗ_１）^２・（ｄ_１−ｆ） …（４）
さらに、ビームウエストがｗ_ｏであるレーザビームのビームウエストから距離ｚだけ離れた位置でのビーム径をｗ（ｚ）、その位置におけるビーム波面の曲率半径Ｒ（ｚ）、ビームウエストから十分離れた位置でのビーム発散角（半角）をθ_ｗｏとすれば、式（５），（６）の関係が成り立つ。

ｗ（ｚ）^２＝ｗ_ｏ ^２｛１＋（ｚ・λ／（π・ｗ_ｏ ^２））^２｝｝
Ｒ（ｚ）＝ｚ・｛１＋（π・ｗ_ｏ ^２／（ｚ・λ））^２｝ …（５）
θ_ｗｏ＝λ／（π・ｗ_ｏ） …（６）
式（４）を用いてレンズの前側焦点位置にビームウエストを置いてレンズに入射させる場合を考える。これはｄ_１＝ｆとおくことに相当し、式（４）の第２式により、ｄ_２＝ｆを得る。従って、レンズ透過後のビームウエスト位置はレンズの後側焦点位置に一致することが分かる。また、式（４）の第１式でｄ_１＝ｆとおいて、変形するとｗ_１・ｗ_２＝ｆ・λ／πの関係があることがわかる。

以上のことから、物体１０１上のビームウエストにおけるビーム径をＷ_ｏｂｊとするためには、対物レンズ１０２−Ａの前側焦点に生成されるビームウエストでのビーム径をＷ_{ｏｂｊ−ｆｒｏｎｔ}として、
Ｗ_{ｏｂｊ−ｆｒｏｎｔ}＝ｆ_ｏｂｊ／・λ／（π・Ｗ_ｏｂｊ）
の関係を満たさなくてはならない。

同様にして第２のカメラポート２１２におけるビームウエスト径Ｗ_{ｐｏｒｔ２}は、
Ｗ_{ｐｏｒｔ２}＝ｆ_ｔｕｂｅ・λ／（π・Ｗ_{ｏｂｊ−ｆｒｏｎｔ}）
で規定される。

ここに元のＷ_{ｏｂｊ−ｆｒｏｎｔ}の式を代入すると、
Ｗ_{ｐｏｒｔ２}＝ｆ_ｔｕｂｅ・λ／（π・ｆ_ｏｂｊ・λ／（π・Ｗ_ｏｂｊ））
＝Ｗ_ｏｂｊ・ｆ_ｔｕｂｅ／ｆ_ｏｂｊ＝Ｗ_ｏｂｊ・ｍ＝Ｗ_{ｉｍａｇｅ}
となる。

このように物体面１０１で必要とされる照明領域をもとにして、それを実現するために各ビームウエストで達成されるべきビーム径を式（４）を用いて定めていくことができる。なお、上記式からわかるように結像倍率ｍを変えても第２のカメラポート２１２でのビーム径Ｗ_{ｐｏｒｔ２}は変わらない。

ビームウエストの伝搬についてさらに説明する。レーザビーム３０１は、レーザ光源１１１の発光部においてあるビームウエスト径を持っている。レーザ光源はその光源ごとに異なった固有ビームウエスト径およびビームの発散角をもつ。これらビームウエスト径、波面、発散角の関係は、すでに説明した式（４）〜式（６）により定まる。具体的にいえば、多くのガスレーザのようにビームウエストがサブミリからミリメートル程度である場合、可視波長領域ではビームの開き角はミリラジアン単位である。これに対し、多くの半導体レーザではビーム径はミクロン単位であり、発散角は数１０ミリラジアンから数１００ミリラジアンとなる。

図１８に示した構成は、レーザ光源１１１としてガスレーザのように発光部において比較的ビーム径が大きく、開き角が比較的小さい場合に好適な構成である。レーザ光源１１１から発せられたレーザビーム３０１は、第１の光路調整系４１０を通って所定の光路長を与えられた後、集光レンズ４０１により、集光され、前述の式（４）に従って集光レンズ４０１の焦点近傍にビームウエストを形成する。さらにコリメータレンズ４０２により第２のカメラポート２１２内共役面にビームウエストを形成する。このとき、第２のカメラポート２１２内共役面にビームウエストが形成され、該ビームウエストでのビーム径が前述したＷ_{ｐｏｒｔ２}となるように集光レンズ４０１とコリメータレンズ４０２の焦点距離および集光レンズ４０１とコリメータレンズ４０２間の間隔を調整する必要がある。この調整は光路調整系４１０内の折り曲げミラー４１２および４１３を平行移動することにより光路長を変更して行うことができる。同様に、光路調整系４２０内の折り曲げミラー４２２および４２３を平行移動することにより光路長を適切なものに調整する。

なお、前述したとおり、対物レンズ１０２−Ａの焦点距離を変えて倍率を変えても第２のカメラポート２１２におけるビームウエストでのビームウエスト径は変える必要はない。このため、上に述べた集光レンズ４０１の焦点距離、コリメータレンズ４０２の焦点距離、レンズ間隔、光路長は、一度設定すれば以降変更の必要はない。しかし、試料を染色する蛍光染料の種類を変えた場合など、励起光源の波長が変わった場合や光源発光部のビーム径が変更された場合はこの限りではない。すなわち、集光レンズ４０１の焦点距離、コリメータレンズ４０２の焦点距離および集光レンズ４０１とコリメータレンズ４０２間の間隔を適切に設定し直し、第１および第２の光路調整系４１０，４２０を再調整する必要がある。このような状況に対応するため、コリメータレンズ４０２を焦点距離可変レンズとすると同時に集光レンズ４０１を光軸方向に移動可能にしておくとよい。

半導体レーザのようにレーザ光源の発光部の径が小さく発散角が比較的大きい場合は、図１８中の集光レンズ４０１の位置に形成されるビームウエストを該半導体レーザの発光部と見立てる。そして、コリメータレンズ４０２以降の構成をそのまま用いることで、同様にビームウエストを設定することができる。光ファイバでレーザ光束を導光する場合も、ファイバ出口を集光レンズ４０１の位置に形成されるビームウエストと見立ててコリメータレンズ４０２以降の構成をそのまま用いることができる。

３本のレーザビームを用いる場合は、図１８内のマッハツェンダー光学系４３０の代わりに図１９に示す３分岐光学系を用いればいい。ここで４６１は、入射光束を反射が１／３、透過が２／３の強度比で分割するハーフミラーであり、４６２、４６５、４６７は通常のハーフミラーで、それ以外の４６３、４６４，４６６は折り曲げミラーである。

図１８に戻り、照明ユニットを通常の蛍光顕微鏡に取り付けるために必要な改造について説明する。まず、図１７で図示されている励起光用フィルタ２０１とダイクロイックミラー１１４および蛍光用フィルタ２０３を、ターレットを回転するなどしてはずす。次に蛍光用フィルタ２０３またはこれと同等の光学特性を持つフィルタをハーフミラー２０４と第１のカメラポート２１１の間に設置する。これにより、励起光であるレーザビーム３０１−Ａおよび３０１−Ｂの物体１０１による反射光３０３をブロックし、イメージセンサ１０３に入射することを防ぐ。蛍光用フィルタ２０３は、イメージセンサ１０３の直前に取り付けることもできる。この改造は蛍光用フィルタ２０３の設置位置の変更に過ぎず簡単に行うことができる上、原状への復帰も容易となる。

次に、複数光束を得る別の構成について説明する。図２０は、回折格子１１２により光束の分割を行う方式の実施形態を説明する図である。ここでの説明は、図１８ですでに説明したマッハツェンダー光学系を用いた実施形態と異なる部分を重点的に説明し、共通する部分の説明は簡単に行うか省略する。

照明ユニット４００は、図１８で示した実施例と同様に、第２のカメラポート２１２のカメラポート内共役面にビームウエストを形成する。しかし、本実施例では、第２のカメラポート２１２の直前に回折格子１１２を配置することにより、レーザビーム３０１を２つのレーザビーム３０１−Ａと３０１−Ｂに分割する。回折格子１１２は例えば厚さのある屈折率分布型回折格子で構成される。厚さのある屈折率分布型の回折格子では、素子内の屈折率は３次元的に変化する。屈折率の分布の仕方を最適化することにより、０次回折光と１次回折光にほとんどの光強度を等分し、それ以外の−１次などの回折次数の回折光に分配されるエネルギーを低く抑えるよう設定できることが知られている。１次回折光の回折角度は屈折率分布のピッチにより所望の角度に調整できる。

光源から射出された光束を複数に分割して第２のカメラポート２１２に入射させるためには、他にも可能な構成がある。図２１に示す構成例も光束分割手段として回折格子を用いるが、既に図２０を用いて説明されたものとは異なるタイプの構成例である。不図示のレーザ光源からの射出された光束は、不図示の集光レンズにより光ファイバ４５２に入射され、照明ユニット４００に導かれる。光ファイバ４５２の出口から発散されたレーザ光束３０１は、コリメータレンズ４０２でほぼ平行光束となって回折格子１１２に入射し０次回折光束と１次回折光束に分かれる。該２つの光束は、集光レンズ４０４の焦点面１１３で集光されたのち第２のコリメータレンズ４０５で第２のカメラポート２１２のカメラポート内共役面にビームウエストを形成し、第２のカメラポート２１２から通常の蛍光顕微鏡２００に入る。

なお照明ユニット４００を構成する照明光学系の瞳面１１３では、第２のカメラポート２１２に入射する光束の入射角に対応した、異なった位置に各光束が集光する。

ここで集光レンズと第２のコリメータレンズからなる光学系により、回折格子１１２と第２のカメラポート２１２が共役となるように設定することができる。このように設定すれば分離された該２つの光束は、第２のカメラポート２１２で重ねることができる。また、平行光束を回折格子１１２に対して零でない角度で入射させるように設定すれば、物体１０１上に非対称構造照明を実現することができることは明らかである。

次に一様照明の実現方法について説明する。一様照明は、通常の蛍光顕微鏡が元来備えていた落射照明光学系を用いて実現することができる。しかしながら、３次元画像を構築するためにはフォーカス座標を少しずつ変えて撮った多数枚のセクショニング画像が必要である。これらの多数のセクショニング画像を取得するためには、非対称構造照明から一様照明（またはその逆）への頻繁な切り替えを行わなくてはならない。その切り替えが生じるたびに照明ユニットを取り外して蛍光顕微鏡を原状復帰し、元の落射照明光学系に戻すとしたら、時間的に大変不利である。そればかりか、光学フィルタ類とダイクロイックミラーが格納されたターレットを頻繁に操作し、これら光学素子の付け替えを行うと不要な振動や像ズレを発生させる要因にもなりかねない。

従って、逐一照明ユニットを外して顕微鏡を原状復帰させることにより一様照明を実現することは現実的ではない。そこで考えられる代替手段としては、複数の光束のうち、１つを除いて遮光しその光束だけが物体を照明するようにすること（第１の方法）や、偏光の自由度を活用して複数の光束が物体上で干渉しないようにすること（第２の方法）などが挙げられる。上記第１の方法は、たとえば図１８中の光束３０１−Ａを遮光する部材をハーフミラー４３１と折り曲げミラー４３３の間に設置することによって実現できる。該遮光部材（遮光素子）は、非対称構造照明と一様照明を切り替えるタイミングに従ってその挿入・退避を繰り返すような可動機材とともに使用することができる。上記第２の方法は、直線偏光したビームを用いる場合に好適である。例えば１／２波長板などの偏光素子を用いることにより、分割された２つのビームのうち、片方のビームの偏光方向をもう一方のビームの偏光方向に対して９０度回転させれば、これら２つのビームはもはや物体面で干渉することなく、一様照明が実現できる。一様照明を実現するためのいずれの方法も後に実施例で具体的に詳しく説明する。

これまで説明してきた方法を用いれば、通常の蛍光顕微鏡に対して簡単かつ原状復帰容易な改造を施し照明ユニットを取り付ければ、高品質なセクショニング効果をもつ３次元蛍光顕微鏡システムを構築する事ができる。なお、非対称構造照明のパターンの位置ずれは、該パターンに周期性がある限り、最終的な画質に影響を及ぼさない。なぜなら、セクショニング効果を得るための計算機処理で必要とされるのは、画像の各点近傍で算出された強度分布の標準偏差値であるが、該各点近傍はパターンの一周期以上にわたる領域であるからである。

以下、瞳関数Ｐ２をもつ照明光学系を備えた蛍光顕微鏡の詳細について実施例１および２を、照明ユニットの具体的構成について、実施例３〜５を用いて説明する。

実施例１は、図１１で示されるような構成を有する顕微鏡用照明光学系であって、光学パラメータとして、波長λ＝５００ｎｍ、ＮＡ＝０．７を有する。物体としてはＯ２を採用する。該照明光学系の瞳関数Ｐ２は、図９（ａ）に示すように、瞳内に式（４）で示される３点または該３点が作る三角形と相似な三角形の３頂点に互いにコヒーレントな点光源を配置したものとして表される。式（４）中のａ，ｂは、ａ＝０．２、ｂ＝０．１である。

非特許文献５，６にて開示されたランダムスペックルを照明に用いる方法と本実施例の瞳関数Ｐ２を有する照明光学系が形成する格子状照明を用いる方法とを比較する。

図１２には、ランダムスペックルを照明に用いる方法で得られた物体Ｏ２の像を示している。図１２（ａ）は、像をｙ＝０μｍの平面で切断したときのｘ−ｚ平面（断面）を示す。本来、蛍光物体があるはずのｚ＝±１μｍの位置に像が解像しているが、強度分布が不均一である。図１２（ｂ）は、ｚ＝１μｍにおけるｘ−ｙ平面での像を示す。全体的に照明むらが大きい様子が分かる。図１２（ｃ）は、像をｘ＝ｙ＝０μｍの直線で切断したときの断面を示す。ｚ方向に強度が非対称であり、コントラストも０．４程度にとどまっている。図１２（ｄ）は、ｙ＝０μｍ、ｚ＝１μｍの直線上における画像である。強度の不均一性が観察される。

一方、図１３には、本実施例の瞳関数Ｐ２を有する照明光学系が形成する格子状照明を用いる方法による物体Ｏ２の像を示している。図１３（ａ）は像をｙ＝０μｍの平面で切断したときのｘ−ｚ平面（断面）を示す。本来、蛍光物体があるはずのｚ＝±１μｍの位置に像が解像しており、強度分布はおおむね均一である。図１３（ｂ）は、ｚ＝１μｍにおけるｘ−ｙ平面での像を示す。全体的に照明むらが低水準に抑制されている。図１３（ｃ）は、像をｘ＝ｙ＝０μｍの直線で切断したときの断面を示す。ｚ方向において強度が対称であり、コントラストも０．７以上と十分に得られている。図１３（ｄ）は、ｙ＝０μｍ、ｚ＝１μｍの直線上における画像である。強度はおおむね均一である。

実施例１においては照明光学系の瞳面上の点光源を３点とした場合について説明したが、本発明において点光源の数は３つである必要はなく、２つでもよいし４つ以上でもよい。このことを示すために、実施例２として、２点の点光源を用いて、セクショニング効果を持たせた例を示す。

本実施例での照明光学系の瞳関数を図１４（ａ）に示す。ここでは、２つの点光源の瞳面上での座標は（０，０．９）、（０，−０．５）である。この瞳関数によって物体面に形成される照明光強度分布を図１４（ｂ）に示す。このような瞳関数は、図１１中の光学素子１１２として回折格子等を用いて、コヒーレントな光源１１１としての点光源を２つに分離することによって容易に形成できる。この結果、物体面では二光束干渉によって縞模様が生じる。 図１５は、本実施例の２つの点光源が配置された瞳関数を有する照明光学系が形成する格子状照明を用いる方法による物体Ｏ２の像を示している。図１５（ａ）は、像をｙ＝０μｍの平面で切断したときのｘ−ｚ平面（断面）を示す。本来、蛍光物体があるはずのｚ＝±１μｍの位置に像が解像しており、強度分布はおおむね均一である。図１５（ｂ）は、ｚ＝１μｍにおけるｘ−ｙ平面での像を示す。全体的に照明むらが低水準に抑制されている。図１５（ｃ）は、像をｘ＝ｙ＝０μｍの直線で切断したときの断面を示す。ｚ方向において強度が対称であり、コントラストも０．７以上と十分に得られている。図１５（ｄ）は、ｙ＝０μｍ、ｚ＝１μｍの直線上における画像である。強度はおおむね均一である。

このように、本発明においては、光源領域の数は２以上（複数）であればいくつでもよい。

実施例１，２の照明光学系を用いた３次元顕微鏡により２５６×２５６×２５６の画素数で撮像を行った場合に処理に要した時間は３．３３ＧＨｚのＣＰＵを搭載したワークステーションで１分以内である。専用のプログラムを作成し、並列分散環境やグラフィックアクセラレータ等のハード機器を最適化して用いれば、共焦点顕微鏡が走査に要する時間よりも短い時間で画像を得ることが十分可能である。

実施例３においては、以下に示す顕微鏡の倍率など具体的な数値（規定値）を使って、照明領域の設定とビームウエストおよびビーム径の設定に関する数値例を提示し、図２２で示される構成が実施可能であることを示す。
・イメージセンサ１０３の対角の１／２の長さ：Ｗ_{ｉｍａｇｅ}＝４ｍｍ
・対物レンズ１０２−Ａの焦点距離：ｆ_ｏｂｊ＝４ｍｍ
・結像レンズ１０２−Ｂの焦点距離：ｆ_ｔｕｂｅ＝１６０ｍｍ
・物体１０１からイメージセンサ１０３への結像倍率：ｍ＝４０倍
・レーザ光源１０１の波長：λ＝４８８ｎｍ
・集光レンズ４０１の焦点距離：ｆ_１＝１５ｍｍ
・レーザ光源１１１発光部の半径：ｗ_ｏ＝０．２６ｍｍ
下に示す表１において、レーザ光源１０１の波長を除く光学パラメ―タの単位はｍｍである。以上のように規定値を決めると、その他の光学パラメータの値はこれらの規定値を用いて計算される。以下では、上記その他の光学パラメータの値が現実的な値となっていることを示す。本実施例で使用される数値例は表１においてまとめられており、表の上段は規定値、表の下段は規定値から定まる下記各パラメータの値を示している。
・レーザ光源１１１発光部から第１の光路調整系４１０を経て集光レンズ４０１へと至る光路長：ｄ_０
・集光レンズ４０１の焦点付近に生成されるビームウエストのビーム径：ｗ_１
・焦点距離が可変なコリメータレンズの焦点距離：ｆ_２
・集光レンズ４０１と集光レンズ４０１の焦点付近に生成されるビームウエスト間との距離：ｄ_１
・集光レンズ４０１の焦点付近に生成されるビームウエストとコリメータレンズ４０２との距離：ｄ_２
・コリメータレンズ４０２から光路調整系４２０、マッハツェンダー系４３０を経て第２のカメラポート２１２のカメラポート内共役面へと至る光路長：ｄ_３
・第２のカメラポート２１２のカメラポート内共役面に生成されるビームウエストのビーム径：Ｗ_port2
今、集光レンズ４０１とコリメータレンズ４０２との距離ｄ_２を９８．７７５４ｍｍ＋１５．２ｍｍに設定する。このとき、レーザ光源１１１発光部から第１の光路調整系４１０を経て集光レンズ４０１へと至る光路長ｄ_０を９３３．８９８ｍｍに調整すれば、非対称構造照明がなされる領域は想定通りＷ_{ｉｍａｇｅ}＝４ｍｍで与えられる。

なお、図２２における照明ユニット４００と第２のカメラポート２１２との接続部分には、ＣマウントかＴマウントなどの一般的なマウントが用いられることが多い。例えば接続にＣマウントを用いた場合、光軸に垂直な方向の取り付け誤差は±０．１ｍｍ程度である。本実施例においては、非対称構造照明がなされる領域をＷ_{ｉｍａｇｅ}＝４ｍｍで規定しており、この値に対する取り付け誤差は２．５％程度の値である。Ｃマウントの光軸に垂直な方向の取り付け誤差が生じると、物体１０１においてイメージセンサ１０３で撮像される領域と非対称構造照明がなされる領域が水平方向にずれることになる。しかし画像の外側２．５％程度の領域に照明の不具合が起こっても通常は問題ない。一方、マウントによる接合に際して、光軸方向の誤差が生じる可能性も考えられる。今、光軸方向のずれを±０．１ｍｍ程度と仮定する。式（４）によって計算するとこの誤差により対物レンズ１０２−Ａの焦点である物体面とそこに形成されるビームウエストの光軸方向のずれは、６３ｎｍ程度となる。この値は対物レンズ１０２−Ａの焦点深度より十分小さいため無視してよい。

本実施例は、図１８を用いて説明した構成において、非対称構造照明の形成に用いる複数の光束のうち、１光束を残してその他の光束を遮光し、結果として１つの光束だけが物体を照明するようにする方法に関する。ここでは例として図２１を参照しながら説明を行う。回折格子１１２によって生成された複数の光束はレンズ４０４によって照明光学系の瞳１１３上に集光し、複数のスポットを形成する。照明光学系の瞳１１３は、対物レンズ１０２−Ａの瞳と共役な関係にある。そこで、図２２に示されているような遮光マスク５０１を、照明光学系の瞳１１３もしくはその共役な個所の近傍に配置すれば、複数のスポットの光透過率を制御することができる。

図２２（ａ）は上記複数の光束が２つからなる場合に、図２２（ｂ）は該複数の光束が３つからなる場合にそれぞれ好適な遮光マスク５０１の構造の一例を示したものである。

図２２において複数のスポットのうち、遮光対象のスポットは５０２−Ａ、５０２−Ｂとして示されており、遮光マスク５０１の一部に配置された遮光部５０３−Ａ、５０３−Ｂを移動させて遮光対象のスポットは５０２−Ａ、５０２−Ｂを遮光することができる。こうすれば、残った１つのスポットに対応する光束のみが物体面に照射され、一様照明が実現される。遮光部の移動は、たとえば円盤状の遮光マスク５０１を光軸周りに回転させることで容易に行うことができる。再び非対称構造照明を行う必要がある場合は、遮光マスク５０１を再び移動させ、複数のスポットが遮光されない状況に戻せばよい。

遮光部の移動方法は光軸周りの回転に限らず、上で記した操作を実現するものであれば何でもよい。例えば遮光マスク５０１をスライドさせて光路上に出し入れするようなものでもよい。またその駆動方式も問わない。遮光マスク５０１上に面積の小さな遮光部５０３を多数配置すると、遮光マスク５０１をほんの少し移動するだけで非対称構造照明と一様照明のモード切り替えが可能になる。

遮光部５０３の実現方法は、一般の光に対して透過率の極めて低い部材で構成するほか、特定の偏光状態にある光を選択的に遮断するような偏光素子を用いてもよい。さらに電気的信号により、光透過率などの素子特性を動的に変更することができる液晶偏光板などを遮光部５０３として用いれば、遮光マスク５０１を移動させる必要すらなくなる。

本実施例ではビームを複数の光束に分けるための分岐部を備え、各光束の偏光を制御することにより非対称構造照明と一様照明の切り替えを実現するための光学系の構成例を示す。図２３はそのような構成を示した概略図である。図２３（ａ）に記載された照明光学系の構成は、図２１に記載された照明光学系と類似点が多いため、共通する構成の説明を省略し、光源から第２のカメラポート２１２に至るまでの光路構成のみを説明することにする。不図示の光源から出射した光はファイバ４５２でコリメータレンズ４０２まで導かれ、平行光束に変換される。なお、ここで考える光源は可干渉性光源とし、紙面に垂直な方向に直線偏光しているものとする。偏光成形素子４７１は例えば１／２波長板であって、その光学軸を該平行光束の偏光方向に対し４５°傾けて設置しておけば、上記平行光束は紙面の垂直方向の直線偏光成分と（ｓ波）と紙面奥行き方向の直線偏光成分（ｐ波）に分けられる。

次に素子４７２、４７３、４７４からなるビーム干渉光学系４３０の構成について説明する。ｓ波は偏光ビームスプリッタ４７２によって反射される。一方、ｐ波は偏光ビームスプリッタ４７２を透過する。偏光ビームスプリッタ４７２によって反射されたｓ波は第２のカメラポート２１２まで直接伝搬するが、偏光ビームスプリッタ４７２を透過したｐ波は折り曲げミラー４７３へと向かい、そこで向きを変えられる。向きを変えられたｐ波は光軸に垂直でｐ波偏光方向から４５°傾いた軸を持つ１／２波長板４７４によってｓ波に変換された後、第２のカメラポート２１２に到達する。第２のカメラポート２１２の位置において、上記の２光束は共にｓ波なので、第２のカメラポート２１２及び物体１０１上で可干渉性を有し、非対称構造照明を形成することができる。

一方、一様照明を実現するためには、偏光形成素子４７１通過後の偏光状態がｓ波のみ、もしくはｐ波のみになるように設定すればよい。そうすれば、第２のカメラポート２１２にはｓ波かｐ波の１光束のみが到達し、一様照明を形成できる。また、図２３では例示的に２光束干渉による非対称構造照明の生成を前提とした説明を行ったが、偏光による光束分岐部を追加すれば３光束以上の干渉を生成する事も可能である。さらに、該複数の光束が分岐してから第２のカメラポート２１２に各光束が到達するまでの光路に適宜偏光素子を追加し、各光束の偏光状態を最適なものに調整することは任意である。

図２３（ａ）に記載の２光束間の角度θの正弦は、第２のカメラポート２１２のカメラポート内共役面の物体１０１に対する横倍率βに反比例する。より具体的には、対物レンズ１０２−Ａの開口数をＮＡ、ＮＡに対応する瞳の半径をｒ、試料面の媒質の屈折率をｎ、照明光学系の瞳１１３におけるスポット同士の間隔をｄとすると、角度θの正弦は式（７）で表される。

例として、ＮＡ＝０．９５かつｄ／ｒ＝１、β＝４０とすると、ｓｉｎθ＝０．０２４となり角度θはかなり小さくなる。このとき、物理的な干渉を避けるために、偏光ビームスプリッタ４７２と折り曲げミラー４７３の間隔を例えば５ｃｍ確保しようとすると、これら２つの素子と第２のカメラポート２１２のカメラポート内共役面との距離は２ｍ程度必要になる。これにより、照明ユニットのコンパクトさが損なわれる。この問題を解決するためには図２３（ｂ）に示すようにビーム干渉光学系４３０に、ビームエキスパンダ４７６（倍率ｍ_ｅｘｐ）を挿入し、２つの光束がなす角度をｍ_ｅｘｐ倍に拡大すればよい。これにより、実用的な大きさの照明ユニットを構成することが可能になる。

以上説明した各実施例は代表的な例にすぎず、本発明の実施に際しては、各実施例に対して種々の変形や変更が可能である。

蛍光顕微鏡やデジタルスライドスキャナー等の顕微鏡に使用可能な照明光学系を提供できる。

１１０ 照明光学系
１１１ コヒーレント光源
１１３ 照明光学系の瞳（レンズ）

Claims (14)

1. 物体面に配置された試料を照明する照明光学系であって、
   該照明光学系の瞳面に、互いにコヒーレントな複数の光源領域が互いに離れて配置され、
   前記複数の光源領域のそれぞれの中心と該照明光学系の瞳の中心との距離のうち、少なくとも１つの距離が他の距離と異なることを特徴とする照明光学系。
2. 前記試料は、自家発光体であることを特徴とする請求項１に記載の照明光学系。
3. 前記自家発光体である試料の発光機構は、蛍光または燐光であることを特徴とする請求項２に記載の照明光学系。
4. 請求項１から３のいずれか一項に記載の照明光学系と、
   前記試料の像を形成する投影光学系とを有することを特徴とする顕微鏡。
5. 前記物体面と光学的に共役な位置に配置された第１及び第２のカメラポートを更に有し、
   前記第１のカメラポートは、前記試料を撮像するための撮像素子を含み、
   前記第２のカメラポートは、互いに可干渉な複数の平行光束を入射させることによって、前記照明光学系の瞳面に前記瞳の半径に対する大きさの割合が０．３未満の互いにコヒーレントな前記複数の光源領域を形成することを特徴とする請求項４に記載の顕微鏡。
6. 前記第２のカメラポートは、前記物体面と光学的に共役な位置において、前記互いに可干渉な複数の平行光束がビームウエストを形成し且つ互いに重なりあうように、前記互いに可干渉な複数の平行光束を前記物体面に対して入射角を持って入射させることを特徴とする請求項５に記載の顕微鏡。
7. 前記第１のカメラポートと、前記物体面から前記第２のカメラポートへ向かう光路と前記物体面から前記第１のカメラポートへ向かう光路との分岐する位置との間に、励起光を遮断し、且つ蛍光もしくは燐光を透過する光学素子が配置されていることを特徴とする請求項５又は６に記載の顕微鏡。
8. 前記互いに可干渉な複数の平行光束のうち少なくとも１つを遮光する状態といずれの光束も遮光しない状態とに切り替えるための可動な遮光素子を有することを特徴とする請求項５から７のいずれか一項に記載の顕微鏡。
9. 前記遮光素子は、蛍光もしくは燐光の波長に対して遮光をすることを特徴とする請求項８に記載の顕微鏡。
10. 前記遮光素子は、少なくとも１つの偏光素子からなることを特徴とする請求項８又は９に記載の顕微鏡。
11. 前記互いに可干渉な複数の平行光束の干渉性を制御するための機構を備えることを特徴とする請求項５から１０のいずれか一項に記載の顕微鏡。
12. 前記少なくとも１つの偏光素子によって、前記互いに可干渉な複数の平行光束の偏光方向を調整するための機構を備えることを特徴とする請求項１０に記載の顕微鏡。
13. 前記顕微鏡は蛍光顕微鏡であることを特徴とする請求項５から１２のいずれか一項に記載の顕微鏡。
14. 前記顕微鏡は、落射型顕微鏡または透過型顕微鏡であることを特徴とする請求項から５から１３のいずれか一項に記載の顕微鏡。