WO2009090341A2 - Systeme d ' illuminations structuree d ' un echantillon en microscopie tridimensionelle - Google Patents
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Definitions
- the invention relates to a structured illumination system for three-dimensional microscopy of a sample.
- the illumination of the sample is structured by a movable grid.
- Such structuring allows an improvement in the axial resolution of the system compared to a so-called conventional microscope but it does not improve the lateral resolution.
- the invention more particularly relates to a structured illumination system for three-dimensional microscopy of a sample comprising:
- beam generation means arranged to generate coherent light beams
- an objective having a rear focal plane, the objective being arranged so that the sample is likely to be positioned in the objective focusing plane;
- focusing means arranged to focus the light beams in the rear focal plane so that the beams interfere in a collimated manner in the focus plane of the objective.
- the illumination system 1 comprises a light source 2, a diffraction grating 3 forming the beam generation means, the diffraction grating 3 being coupled to a filter 7 so as to generate only two coherent diffracted light beams 4a and 4b from the light source 2, a lens 5 arranged to focus the coherent beams 4a and 4b in the rear focal plane PFA of a microscope objective 6, a sample 18 being positioned in the focus plane PMP of the objective 6.
- the coherent beams 4a and 4b are diffracted beams having symmetrical orders p and
- Such a structured illumination system for the three-dimensional microscopy of a sample has the particular advantage of having an improved lateral resolution and allowing measurements in the field.
- An object of the invention is to improve the axial resolution in such a structured illumination system for three-dimensional microscopy of a sample.
- the application US 2007/0171519 aims to achieve this goal and describes a structured illumination system for three-dimensional microscopy of a sample as described above in which the coherent beams are such that two of the coherent beams are unsymmetrical relative to each other. to the optical axis of the lens.
- the application 2007/0171519 uses beams of diffraction orders 1, 0 and -1 to improve the axial resolution of the illumination system.
- this document uses a simple grid to generate the diffracted beams, and it does not describe how axial displacement of the sample is performed for axial measurements.
- An object of the invention is to provide a structured illumination system for three-dimensional microscopy of a sample to improve the axial resolution compared to a conventional illumination system.
- the original approach underlying the invention is to simulate the axial displacement of the sample without mechanical displacement.
- Another object of the invention is to provide a structured illumination system for the three-dimensional microscopy of a sample for improving both the axial resolution and the lateral resolution with respect to a conventional illumination system. That is to say to achieve axial resolutions of the order of 0.3 micrometers, and lateral resolutions of the order of 0.1 microns.
- Another object of the invention is to achieve such performance while maintaining an acquisition rate compatible with the study of dynamic phenomena, that is to say greater than or equal to 1 Hertz.
- the beam generating means comprises a spatial light modulator programmed to diffracting a light signal so as to generate at least two coherent diffracted beams not symmetrical with respect to the optical axis of the objective, the spatial light modulator comprising a calculator arranged to apply a constant phase term to each of said at least two coherent beams not symmetrical with respect to the optical axis.
- the sample is illuminated by coherent but non-coherent beams. symmetrical in the axial direction. Therefore, it is possible, by a modification of the distance between the objective and the sample or an axial displacement of the illumination in the sample, to use this non-symmetry, in particular from the difference in illumination between two axial positions of the sample. This thus makes it possible to improve the axial resolution with respect to the Gustaffson et al. mentioned above, and in particular to obtain an axial resolution of less than 0.3 micrometers. According to the invention, this axial displacement is simulated by means of the spatial light modulator by applying a phase term to each of the coherent beams. Thus, the measurement does not require any mechanical displacement and the mechanical losses are therefore reduced.
- the two beams that are not symmetrical with respect to the optical axis of the objective are in particular diffracted diffraction beams of n and p diffraction order with n + p different from 0.
- the lateral resolution maintained around 0.1 micrometers, as in the Gustaffson et al. above.
- the system according to the invention is an imaging system full field, a rate greater than 1 Hz can be obtained.
- a three-dimensional structuring of the illumination has thus been realized, which makes it possible to carry out an axial coding of the illumination in addition to the lateral coding known per se.
- the beam generating means may comprise a light source capable of generating a light signal.
- the beam generating means can be arranged to generate three coherent beams, at least two coherent beams among the three coherent beams being unsymmetrical with respect to the optical axis of the objective.
- the generation of these three coherent beams makes it possible to obtain a structuring of the field symmetrical with respect to the optical axis of the objective and a gain of a factor of two in axial resolution with respect to a lighting with only two coherent beams not symmetrical.
- the beam generation means are arranged so that the three coherent beams generated by diffraction correspond to two diffracted beams of symmetrical diffraction orders and to a zero diffraction order beam.
- the symmetric order beams N and N form, with the zero diffraction order beam, two pairs of beams that are not symmetrical with respect to the optical axis that can be used in the context of the invention.
- the two diffracted beams of diffraction order symmetric diffraction orders can be chosen such that the intensity of the zero diffraction order beam is equal to four times the intensity of one of the order diffracted beams.
- symmetrical diffraction Indeed, it is demonstrated that the improvement of the axial resolution is the best in this case.
- the computer can be programmed so as to phase out one of said at least two coherent beams unsymmetrical with respect to the other.
- This embodiment has the advantage of allowing a lateral displacement of the interference pattern in the sample and thus simulates the lateral displacement of a diffraction grating by programming the spatial light modulator. It thus makes it possible to carry out lateral measurements without physical displacement of the components of the system.
- FIG. 2 represents a structured illumination system for three-dimensional microscopy of a sample according to one embodiment of the invention
- FIG. 3 shows the light beam paths in a system as illustrated with reference to FIG. 2.
- a structured illumination system 8 for the three-dimensional microscopy of a sample comprises a light source 9 able to generate a coherent and polarized light signal. linearly.
- the light source 9 is for example a laser. It also comprises a spatial light modulator 10 in transmission or reflection programmed to generate, from the light signal received from the source 9, three diffracted beams of respective intensity IN, IN and LO.
- the diffracted beams IN and LN are N symmetric order beams, and the beam Io corresponds to a zero order beam.
- the beams Io and IN are non-symmetrical with respect to the optical axis of the lens. Similarly, the beams I 0 and L N are unsymmetrical with respect to the optical axis of the objective.
- the light signal received from the source 9 it is possible to position a not shown afocal device between the source 9 and the spatial light modulator 10 so as to widen the signal bright, for example five to ten times.
- the diffracted beams pass through a new afocal device 11 and are focused in the rear focal plane PFA of a microscope objective 12 by an achromatic doublet 19.
- the magnification factor of the afocal device 1 1 is chosen so that the diffraction angles are adapted to the diameter of the objective 12 of the microscope 1 3.
- a sample 14 for example in the form of a fluorescent point object, is positioned in the PMP focusing plane of the objective 12 of the microscope 13 at which the three diffracted beams IN, IN and Io interfere.
- the system 8 described above allows a three-dimensional structuring of the illumination to the sample 14.
- the use of three diffraction orders reveals a Talbot effect in the field transmitted by the objective.
- the spatial light modulator 10 is programmed so as to laterally shift the interference pattern generated by the three diffracted beams in the objective focusing plane.
- This programming makes it possible to simulate a lateral displacement of a diffraction grating generating the three diffracted beams without the modulator physically moving.
- the position of the fluorescent point object is measured in a manner known per se by combining several images or their Fourier transform for different real or simulated positions of the diffraction grating, for example by difference between the intensity the fluorescence received for two real or simulated positions of the diffraction grating.
- the optical distance between the sample 14 and the objective 12 is modified.
- a piezoelectric plate 15 positioned at the level of the sample. 14 or axially moving the objective 12.
- the axial position of the fluorescent point object for example by difference between the intensity of the fluorescence received for two real or simulated distances between the objective 12 and the sample 14.
- the path of the light beams is illustrated by the illumination system according to the invention.
- the light source 9 generates a light signal in the form of a plane wave 22.
- This plane wave is diffracted by means of beam generation 21 for generating only three diffraction orders lo, IN and IN.
- These beam generation means correspond to the spatial light modulator 10 described with reference to FIG. 2.
- the diffracted beams I 0 , IN and LN are still plane waves.
- the focusing means 19, for example corresponding to a lens or achromatic doublet 19 described above converge these beams towards the back focal plane PFA of the objective 12 of microscope 13. In this way, the beams lo, IN and N L interfere in the PMP focusing plane in the form of plane waves and measurements relating to a sample 14 positioned in the PMP focusing plane can be realized.
- Beam generating means for generating three coherent beams that interfere at the objective focus plane have been described above.
- the effect of improving the axial resolution is then optimal for beams IN, IN and lo, the orders N and -N being chosen as before so that
- the effect of improving the axial resolution is obtained when the diffracted beams are such that at least two coherent beams that are not symmetrical with respect to the axis lens optics interfere at the focus plane PMP of the objective 12. Indeed, in this case, the axial symmetry of the beams is broken and it is possible, by moving the sample 14 with respect to the 12 or by simulating this displacement as mentioned above, to obtain information on the axial position of the sample 14.
- the system 8 described above can also easily fit on an existing microscope 13, in parallel with the existing illumination system.
- the microscope 13 may be an existing microscope with an existing objective 12, and the illumination system is adapted so that the beams IN, IN and Io are focused in the PFA rear focal plane of the objective 12.
- a new microscope having a improved resolution allowing full field observation.
Abstract
L'invention se rapporte à un système d'illumination structurée (8) pour la microscopie tridimensionnelle d'un échantillon ( 14) comprenant : - des moyens de génération de faisceaux (9, 10) agencés pour générer des faisceaux lumineux cohérents ( I N, I-N, I O); - un objectif (12) ayant un plan focal arrière (PFA), l'objectif étant agencé de sorte que l'échantillon (14) soit susceptible d'être positionné dans le plan de mise au point (PMP) de l'objectif; - des moyens de focalisation (19) agencés pour focaliser les faisceaux lumineux dans le plan focal arrière (PFA) de sorte que les faisceaux interfèrent de façon collimatée dans le plan de mise au point (PMP) de l'objectif (12), caractérisé en ce que les moyens de génération de faisceaux (9, 10) comprennent un modulateur spatial de lumière (10) programmé pour diffracter un signal lumineux (22) de sorte à générer au moins deux faisceaux diffractés cohérents (( I N, I O), ( I-N, IO)) non symétriques par rapport à l'axe optique de l'objectif, le modulateur spatial de lumière comprenant un calculateur agencé pour appliquer un terme de phase constant à chacun desdits au moins deux faisceaux cohérents.
Description
SYSTÈME D'ILLUMINATION STRUCTURÉE D'UN ÉCHANTILLON
L'invention se rapporte à système d'illumination structurée pour la microscopie tridimensionnelle d'un échantillon.
La publication de Wilson et al. « confocal microscopy by aperture corrélation », 1996, décrit un tel système d'illumination structurée pour la microscopie tridimensionnelle d'un échantillon.
Dans cette publication, l'illumination de l'échantillon est structurée par une grille mobile. Une telle structuration permet une amélioration de la résolution axiale du système par rapport à un microscope dit classique mais elle ne permet pas d'améliorer la résolution latérale.
L'invention se rapporte plus particulièrement à un système d'illumination structurée pour la microscopie tridimensionnelle d'un échantillon comprenant :
- des moyens de génération de faisceaux agencés pour générer des faisceaux lumineux cohérents ;
- un objectif ayant un plan focal arrière, l'objectif étant agencé de sorte que l'échantillon soit susceptible d'être positionné dans le plan de mise au point de l'objectif ;
- des moyens de focalisation agencés pour focaliser les faisceaux lumineux dans le plan focal arrière de sorte que les faisceaux interfèrent de façon collimatée dans le plan de mise au point de l'objectif.
Un tel système d'illumination structurée d'un échantillon est notamment connu de la publication de Gustaffson et al. « Extended resolution fluorescence microscopy », 1999.
Dans ce document, comme illustré figure 1 , le système d'illumination 1 comprend une source lumineuse 2, un réseau de diffraction 3
formant les moyens de génération de faisceaux, le réseau de diffraction 3 étant couplé à un filtre 7 de sorte à générer seulement deux faisceaux lumineux diffractés cohérents 4a et 4b à partir de la source lumineuse 2, une lentille 5 agencée pour focaliser les faisceaux cohérents 4a et 4b dans le plan focal arrière PFA d'un objectif 6 de microscope, un échantillon 18 étant positionné dans le plan de mise au point PMP de l'objectif 6. Les faisceaux cohérents 4a et 4b sont des faisceaux diffractés ayant des ordres symétriques p et
-P-
Un tel système d'illumination structurée pour la microscopie tridimensionnelle d'un échantillon a notamment l'avantage d'avoir une résolution latérale améliorée et de permettre des mesures en plein champ.
Toutefois, il a l'inconvénient d'avoir une résolution axiale identique à celle d'un microscope dit classique, c'est-à-dire de l'ordre de 0,4 micromètre.
Un but de l'invention est d'améliorer la résolution axiale dans un tel système d'illumination structurée pour la microscopie tridimensionnelle d'un échantillon.
La demande US 2007/0171519 vise à atteindre ce but et décrit un système d'illumination structurée pour la microscopie tridimensionnelle d'un échantillon tel que décrit ci-dessus dans lequel les faisceaux cohérents sont tels que deux des faisceaux cohérents sont non symétriques par rapport à l'axe optique de l'objectif. En particulier, la demande 2007/0171519 utilise des faisceaux d'ordres de diffraction 1 , 0 et -1 pour améliorer la résolution axiale du système d'illumination.
Toutefois, ce document utilise une simple grille pour générer les
faisceaux diffractés, et il ne décrit pas comment est réalisée le déplacement axial de l'échantillon pour procéder aux mesures axiales.
Or, classiquement, les déplacements sont réalisés par des systèmes mécaniques, par exemple piezo-électriques, qui provoquent d'importantes pertes de précision qui diminuent la résolution du système.
Un but de l'invention est de fournir un système d'illumination structurée pour la microscopie tridimensionnelle d'un échantillon permettant d'améliorer la résolution axiale par rapport à un système d'illumination classique.
L'approche originale à la base de l'invention est de simuler le déplacement axial de l'échantillon sans déplacement mécanique.
Un autre but de l'invention est de fournir un système d'illumination structurée pour la microscopie tridimensionnelle d'un échantillon permettant d'améliorer à la fois la résolution axiale et la résolution latérale par rapport à un système d'illumination classique, c'est-à- dire d'atteindre des résolutions axiales de l'ordre de 0,3 micromètres, et des résolutions latérales de l'ordre de 0, 1 micromètres.
Un autre but de l'invention est de permettre d'atteindre de telles performances tout en conservant une cadence d'acquisition compatible avec l'étude de phénomènes dynamiques, c'est-à-dire supérieure ou égale à 1 Hertz.
Au moins un de ces buts est atteint grâce à un système d'illumination structurée pour la microscopie tridimensionnelle tel que décrit ci- dessus, dans lequel les moyens de génération de faisceaux comprennent un modulateur spatial de lumière programmé pour
diffracter un signal lumineux de sorte à générer au moins deux faisceaux diffractés cohérents non symétriques par rapport à l'axe optique de l'objectif, le modulateur spatial de lumière comprenant un calculateur agencé pour appliquer un terme de phase constant à chacun desdits au moins deux faisceaux cohérents non symétriques par rapport à l'axe optique.
Grâce à l'invention, et notamment au fait que les faisceaux cohérents générés par les moyens de génération comprennent au moins deux faisceaux non symétriques par rapport à l'axe optique de l'objectif, l'échantillon est éclairé par des faisceaux cohérents mais non symétriques dans la direction axiale. Dès lors, il est possible, par une modification de la distance entre l'objectif et l'échantillon ou un déplacement axial de l'illumination dans l'échantillon, d'utiliser cette non symétrie à partir notamment de la différence d'illumination entre deux positions axiales de l'échantillon. Ceci permet ainsi d'améliorer la résolution axiale par rapport au système de Gustaffson et al. mentionné ci-dessus, et d'obtenir notamment une résolution axiale inférieure à 0,3 micromètres. Selon l'invention, ce déplacement axial est simulé grâce au modulateur spatial de lumière par application d'un terme de phase à chacun des faisceaux cohérents. Ainsi, la mesure ne nécessite aucun déplacement mécanique et les pertes mécaniques sont donc diminuées.
Les deux faisceaux non symétriques par rapport à l'axe optique de l'objectif sont notamment des faisceaux diffractés d'ordre de diffraction n et p avec n+p différent de 0.
En outre, grâce à l'invention, la résolution latérale maintenue autour de 0, 1 micromètres, comme dans le système de Gustaffson et al. susmentionné.
Enfin, puisque le système selon l'invention est un système d'imagerie
plein champ, une cadence supérieure à 1 Hz peut être obtenue.
Selon l'invention, on a donc réalisé une structuration tridimensionnelle de l'illumination qui permet de réaliser un codage axial de l'illumination en plus du codage latéral connu en soi.
On décrit maintenant des modes de réalisation avantageux de l'invention.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les moyens de génération de faisceaux peuvent comprendre une source lumineuse apte à générer un signal lumineux.
De préférence, les moyens de génération de faisceaux peuvent être agencés pour générer trois faisceaux cohérents, au moins deux faisceaux cohérents parmi les trois faisceaux cohérents étant non symétriques par rapport à l'axe optique de l'objectif. Dans le cadre de l'invention, la génération de ces trois faisceaux cohérents permet d'obtenir une structuration du champ symétrique par rapport à l'axe optique de l'objectif et un gain d'un facteur deux en résolution axiale par rapport à un éclairage avec uniquement deux faisceaux cohérents non symétriques.
De préférence, les moyens de génération de faisceaux sont agencés pour que les trois faisceaux cohérents générés par diffraction correspondent à deux faisceaux diffractés d'ordres de diffraction symétriques et à un faisceau d'ordre de diffraction zéro. Dans ce cas, les faisceaux d'ordre symétriques N et -N forment, avec le faisceau d'ordre de diffraction zéro, deux couples de faisceaux non symétriques par rapport à l'axe optique utilisables dans le cadre de l'invention.
En particulier, les deux faisceaux diffractés d'ordre de diffraction
symétrique peuvent être d'intensité égale, et les deux ordres de diffraction symétriques peuvent être choisis de sorte que l'intensité du faisceau d'ordre de diffraction zéro soit égale à quatre fois l'intensité d'un des faisceaux diffractés d'ordre de diffraction symétriques. On démontre en effet que l'amélioration de la résolution axiale est la meilleure dans ce cas.
Afin de permettre des mesures latérales dans un plan xOy perpendiculaire à l'axe optique z de l'objectif, le calculateur peut être programmé de sorte à déphaser l'un desdits au moins deux faisceaux cohérents non symétriques par rapport à l'autre. Ce mode de réalisation a l'avantage de permettre un déplacement latéral du motif d'interférence dans l'échantillon et simule donc le déplacement latéral d'un réseau de diffraction par programmation du modulateur spatial de lumière. Il permet donc de réaliser des mesures latérales sans déplacement physique des composants du système.
On décrit maintenant un mode de réalisation de l'invention en référence aux figures annexées dans lesquelles :
- la figure 2 représente un système d'illumination structurée pour la microscopie tridimensionnelle d'un échantillon selon un mode de réalisation de l'invention ;
- la figure 3 représente les trajets de faisceaux lumineux dans un système tel qu'illustré en référence à la FIG. 2.
Sur les figures, des références identiques se rapportent, sauf indication contraire, à des caractéristiques techniques similaires.
Comme illustré sur la figure 2, selon un premier mode de réalisation de l'invention, un système 8 d'illumination structurée pour la microscopie tridimensionnelle d'un échantillon comprend une source lumineuse 9 apte à générer un signal lumineux cohérent et polarisé
linéairement. La source lumineuse 9 est par exemple un laser. Il comprend également un modulateur spatial de lumière 10 en transmission ou en réflexion programmé pour générer, à partir du signal lumineux reçu de la source 9, trois faisceaux diffractés d'intensité respectives IN, I-N et lo- Les faisceaux diffractés IN et LN sont des faisceaux d'ordre symétriques N, et le faisceau Io correspond à un faisceau d'ordre zéro.
Les faisceaux Io et IN sont non symétriques par rapport à l'axe optique de l'objectif. De même, les faisceaux I0 et LN sont non symétriques par rapport à l'axe optique de l'objectif.
L'ordre N des faisceaux diffractés IN et LN est choisi de sorte que l'intensité du faisceau d'ordre zéro soit égal à quatre fois l'intensité de ces faisceaux, soit I0=4IN=4LN. On démontre en effet que l'amélioration de la résolution axiale est la meilleure dans ce cas.
Afin que le signal lumineux reçu de la source 9 s'adapte à la taille du modulateur spatial de lumière 10, il est possible de positionner un dispositif afocal non représenté entre la source 9 et le modulateur spatial de lumière 10 de sorte à élargir le signal lumineux, par exemple de cinq à dix fois.
En sortie du modulateur spatial de lumière 10, les faisceaux diffractés passent par un nouveau dispositif afocal 1 1 et sont focalisés dans le plan focal arrière PFA d'un objectif 12 de microscope 13 par un doublet achromatique 19. Le facteur de grandissement du dispositif afocal 1 1 est choisi pour que les angles de diffraction soit adaptés au diamètre de l'objectif 12 du microscope 1 3.
Un échantillon 14 par exemple sous la forme d'un objet ponctuel fluorescent est positionné dans le plan de mise au point PMP de
l'objectif 12 du microscope 13 au niveau duquel les trois faisceaux diffractés I N, I-N et Io interfèrent.
Le système 8 décrit ci-dessus permet une structuration tridimensionnelle de l'illumination vers l'échantillon 14. En effet, l'utilisation de trois ordres de diffraction fait apparaître un effet Talbot dans le champ transmis par l'objectif.
En fonctionnement, pour réaliser des mesures dans le plan latéral xOy, on programme le modulateur spatial de lumière 10 de sorte à déplacer latéralement le motif d'interférence généré par les trois faisceaux diffractés dans le plan de mise au point de l'objectif. Cette programmation permet de simuler un déplacement latéral d'un réseau de diffraction générant les trois faisceaux diffractés sans que le modulateur ne se déplace physiquement. Suite à ce déplacement latéral simulé, on mesure la position de l'objet ponctuel fluorescent de façon connue en soi en combinant plusieurs images ou leur transformée de Fourier pour différentes positions réelles ou simulées du réseau de diffraction, par exemple par différence entre l'intensité de la fluorescence reçue pour deux positions réelles ou simulées du réseau de diffraction.
En outre, en fonctionnement, pour réaliser des mesures selon la direction axiale z, on modifie la distance optique entre l'échantillon 14 et l'objectif 12. Pour ce faire, on peut utiliser une platine piézoélectrique 15 positionnée au niveau de l'échantillon 14 ou déplacer axialement l'objectif 12. Selon l'invention, il est également possible de simuler ce déplacement en programmant le modulateur spatial de lumière 10 pour appliquer un terme de phase constant à tous les pixels du modulateur 10, ce qui en conséquence applique un terme de phase constant aux faisceaux diffractés.
Comme précédemment, et grâce à l'effet Talbot bien connu, on
mesure la position axiale de l'objet ponctuel fluorescent par exemple par différence entre l'intensité de la fluorescence reçue pour deux distances réelles ou simulées entre l'objectif 12 et l'échantillon 14.
Sur la figure 3, on a illustré le trajet des faisceaux lumineux grâce au système d'illumination selon l'invention. Selon l'invention, la source lumineuse 9 génère un signal lumineux sous la forme d'une onde plane 22. Cette onde plane est diffractée par des moyens de génération de faisceaux 21 permettant de générer uniquement trois ordres de diffraction lo, IN et I-N. Ces moyens de génération de faisceaux correspondent au modulateur spatial de lumière 10 décrit en référence à la figure 2. Les faisceaux diffractés I0, I N et LN sont encore des ondes planes. Les moyens de focalisation 19 correspondant par exemple à une lentille ou au doublet achromatique 19 décrit précédemment font converger ces faisceaux vers le plan focal arrière PFA de l'objectif 12 du microscope 13. De la sorte, les faisceaux lo, I N et LN interfèrent dans le plan de mise au point PMP sous la forme d'ondes planes et les mesures relatives à un échantillon 14 positionné dans le plan de mise au point PMP peuvent être réalisées.
On décrit maintenant des variantes de l'invention.
On a décrit ci-dessus des moyens de génération de faisceaux permettant de générer trois faisceaux cohérents qui interfèrent au niveau du plan de mise au point de l'objectif. L'effet d'amélioration de la résolution axiale est alors optimal pour des faisceaux IN, I-N et lo, les ordres N et -N étant choisis comme précédemment de sorte que
Toutefois, on comprend que l'effet d'amélioration de la résolution axiale est obtenu dès lors que les faisceaux diffractés sont tels qu'au moins deux faisceaux cohérents non symétriques par rapport à l'axe
optique de l'objectif interfèrent au niveau du plan de mise au point PMP de l'objectif 12. En effet, dans ce cas, la symétrie axiale des faisceaux est rompue et il est possible, en déplaçant l'échantillon 14 par rapport à l'objectif 12 ou en simulant ce déplacement comme mentionné précédemment, d'obtenir une information sur la position axiale de l'échantillon 14.
Au contraire, on peut noter, en référence à la figure 1 , qu'un déplacement de l'échantillon 18 par rapport à l'objectif 6 n'aurait aucun effet dans le cadre du système 1 décrit dans la publication de Gustafsson et al. puisque les deux faisceaux 4a et 4b sont symétriques par rapport à l'axe optique de l'objectif. Un tel déplacement axial ne permet donc pas de réaliser des mesures axiales précises.
II a été démontré que l'invention décrite précédemment permettait d'améliorer la résolution axiale d'un facteur de l'ordre de 10 par rapport à la microscopie dite classique.
En outre, l'utilisation d'un modulateur spatial de lumière comme décrit en référence à la figure 2 a l'avantage d'éviter les déplacements mécaniques du système et donc d'améliorer la précision des mesures.
Le système 8 décrit précédemment peut également facilement s'adapter sur un microscope 13 existant, en parallèle du système d'illumination existant.
Dans ce cas, dans les modes de réalisation décrits ci-dessus, le microscope 13 peut être un microscope existant avec un objectif existant 12, et on adapte le système d'illumination de sorte que les faisceaux IN, I-N et Io soient focalisés dans le plan focal arrière PFA de l'objectif 12. On forme alors un nouveau microscope ayant une
résolution améliorée permettant une observation plein champ.
Claims
1 . Système d'illumination structurée (8) pour la microscopie tridimensionnelle d'un échantillon (14) comprenant : - des moyens de génération de faisceaux (9, 10) agencés pour générer des faisceaux lumineux cohérents (IN, I-N, IO) ;
- un objectif (12) ayant un plan focal arrière (PFA), l'objectif étant agencé de sorte que l'échantillon (14) soit susceptible d'être positionné dans le plan de mise au point (PMP) de l'objectif ;
- des moyens de focalisation (19) agencés pour focaliser les faisceaux lumineux dans le plan focal arrière (PFA) de sorte que les faisceaux interfèrent de façon collimatée dans le plan de mise au point (PMP) de l'objectif (12), caractérisé en ce que les moyens de génération de faisceaux (9, 10) comprennent un modulateur spatial de lumière (10) programmé pour diffracter un signal lumineux (22) de sorte à générer au moins deux faisceaux diffractés cohérents ((IN, IO) , (I-N, IO)) non symétriques par rapport à l'axe optique de l'objectif, le modulateur spatial de lumière comprenant un calculateur agencé pour appliquer un terme de phase constant à chacun desdits au moins deux faisceaux cohérents.
2. Système selon la revendication 1 , dans lequel les moyens de génération de faisceaux comprennent une source lumineuse (9) apte à générer le signal lumineux (22).
3. Système selon la revendication 1 ou 2 dans lequel lesdits au moins deux faisceaux cohérents non symétriques sont des faisceaux diffractés d'ordre de diffraction respectif n et p avec n + p différent de zéro.
4. Système selon l'une des revendications précédentes, dans lequel les moyens de génération de faisceaux (10, 9) sont agencés pour générer trois faisceaux cohérents (IN , I-N> IO) , au moins deux faisceaux cohérents (IN , I-N , IO) parmi les trois faisceaux cohérents étant non symétriques par rapport à l'axe optique de l'objectif.
5. Système selon la revendication précédente, dans lequel les moyens de génération de faisceaux (10, 9) sont agencés pour que les trois faisceaux cohérents générés par diffraction correspondent à deux faisceaux diffractés d'ordres de diffraction symétriques et à un faisceau d'ordre de diffraction zéro.
6. Système selon la revendication précédente, dans lequel les deux faisceaux diffractés d'ordre de diffraction symétrique sont d'intensité égale, et les deux ordres de diffraction symétriques sont choisis de sorte que l'intensité du faisceau d'ordre de diffraction zéro soit égale à quatre fois l'intensité d'un des faisceaux diffractés d'ordre de diffraction symétrique.
7. Système selon l'une des revendications précédentes, dans lequel le calculateur est en outre agencé pour déphaser l'un des deux faisceaux cohérents non symétriques par rapport à l'autre.
8. Microscope comprenant un système d'illumination structurée (8) selon l'une des revendications précédentes.
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