JP2011184311A - 新規二次胆汁酸低減剤 - Google Patents

Abstract

【課題】 新規の二次胆汁酸低減剤、より詳細には、二次胆汁酸のうち一次胆汁酸の還元的代謝により生成する７位水酸基の脱水酸化物を低減する新規の剤を提供する。
【解決手段】 二次胆汁酸のうち一次胆汁酸の還元的代謝により生成する７位水酸基の脱水酸化物を低減する剤であって、電子受容体を有効成分として含有する。本発明によれば、腸内細菌の胆汁酸代謝に直接介入することができ、従来の間接的な作用によるものと比較して、腸内の発がん性を有する二次胆汁酸の生成をより効果的に抑制し、発がん性を有する二次胆汁酸を低減することができる。
【選択図】 図１

Description

本発明は、新規の二次胆汁酸低減剤、より詳細には、二次胆汁酸のうち一次胆汁酸の還元的代謝により生成する７位水酸基の脱水酸化物を低減する新規の剤に関する。

胆汁酸は胆汁に含まれるステロイド化合物であり、コレステロールの異化代謝物である。肝臓でコレステロールから生成されたコール酸、ケノデオキシコール酸などの一次胆汁酸は、胆汁に含有された状態で小腸上部に分泌され、食事に含まれる脂肪の乳化、分解、吸収を補助する。一次胆汁酸は小腸下部から吸収されて再利用されるが、一部は大腸に流れ込み、そこで腸内細菌により種々の二次胆汁酸に変換される。ヒトの大腸における胆汁酸の６０％は、一次胆汁酸の還元的代謝により生成する７位水酸基の脱水酸化物である、デオキシコール酸およびリトコール酸で占められており、これらは発がん性を有する二次胆汁酸として知られている（非特許文献１）。

これら発がん性を有する二次胆汁酸は、大腸内のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属細菌による７α−脱水酸化反応により生成される。例えばコール酸の７α−脱水酸化によりデオキシコール酸が、ケノデオキシコール酸の７α−脱水酸化によりリトコール酸が生成される。

ヒト以外の動物の腸においても、一次胆汁酸の還元的代謝により７位水酸基が脱離され、二次胆汁酸が生成されることが知られている。例えばブタでは、ヒオコール酸の７α−脱水酸化によりヒオデオキシコール酸が生成される（非特許文献２）。また、ラットでは、腸内細菌の働きにより、一次胆汁酸であるβ−ミュリコール酸の７位の水酸基が脱離、６位の水酸基が異性化され、二次胆汁酸であるヒオデオキシコール酸が生成されることが報告されている（非特許文献３）。

デオキシコール酸およびリトコール酸といった発がん性を有する二次胆汁酸は、発がん物質そのものであり、かつ大腸がんのプロモーターであることが知られている（非特許文献１）。また、発がん性を有する二次胆汁酸は、腸管細胞への細胞毒性を示すことから、炎症性腸疾患の他、酸化ストレスやＮＦκＢ依存性の炎症性分子応答の増大への関与が報告されている（例えば、非特許文献４〜６など）。従って、これら発がん性を有する二次胆汁酸を低減することにより、大腸がんの予防効果のみならず、炎症性腸疾患の予防ないし治療、酸化ストレスやＮＦκＢ依存性の炎症分子応答の抑制などを期待することができることから、発がん性を有する二次胆汁酸低減のための様々な試みがなされている。

例えば、コレスチラミンなどのイオン交換樹脂に発がん性（毒性）を有する二次胆汁酸を吸着させ、大腸内の発がん性（毒性）を有する二次胆汁酸を低減させる方法が提案されている（特許文献１）。しかしながら、これらの吸着剤は、腸管内で二次胆汁酸以外の栄養成分を非特異的に吸着してしまうため、当該栄養成分の欠乏症を引き起こすなどの副作用がある。

発がん性を有する二次胆汁酸を低減する別のアプローチとして、ビフィズス菌などのプロバイオティクスやオリゴ糖などのプレバイオティクスを摂取することによる、一次胆汁酸からの発がん性を有する二次胆汁酸の生成を抑制する方法が提案されている（例えば、特許文献２および３など）。これらの方法は特許文献１に開示されている吸着剤の欠点を解消するものであり、プロバイオティクスやプレバイオティクスの摂取により、ビフィズス菌の大腸内増殖を促し、その結果として７α−脱水酸化反応に関与するＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属細菌の活動を相対的に抑制することで、発がん性を有する二次胆汁酸の生成を抑制するものである。

特表２００１−５１４６６７号公報 特開２００１−０９７８７０号公報 特開２００４−２４４３６５号公報

Ｈ．Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．、第５８９巻、第４７〜６５頁、２００５年 穂下剛彦、生化学、４２巻、第７０３〜７１７頁、１９７０年 Ｈ．Ｊ．Ｅｙｓｓｅｎら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第６５巻、第７号、第３１５８〜３１６３頁、１９９９年 Ｙ．Ａｒａｋｉら、Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．、第１０巻、第６号、第１９３１〜１９３６頁、２００３年 Ｓ．Ｌｅｃｈｎｅｒら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、第２３巻、第１２８１〜１２８８頁、２００２年 Ｃ．Ｍ．Ｐａｙｎｅら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、第２８巻、第２１５〜２２２頁、２００７年

特許文献２および３に開示された、発がん性を有する二次胆汁酸の生成を抑制する方法は、腸管内の発がん性を有する二次胆汁酸を低減することができる有効な技術であるが、発がん性を有する二次胆汁酸を生成する腸内細菌に対し、作用は間接的であることから、発がん性を有する二次胆汁酸の生成を直接的かつ根本的に抑制することができるとは言い難く、発がん性を有する二次胆汁酸を直接的かつ根本的に低減する剤が求められていた。したがって本発明は、新規の二次胆汁酸低減剤、より詳細には、二次胆汁酸のうち一次胆汁酸の還元的代謝により生成する７位水酸基の脱水酸化物を低減する新規の剤を提供することを目的とする。

本発明者らは、腸内細菌による胆汁酸代謝の特性に着目して、二次胆汁酸生成反応を制御する技術について鋭意研究した結果、驚くべきことに、腸内細菌の嫌気呼吸の促進、すなわちエネルギー代謝制御により、発がん性を有する二次胆汁酸の生成が抑制されることを見出した。具体的には、電子受容体が一次胆汁酸の酸化的代謝を促進することにより、発がん性を有する二次胆汁酸を生成する腸内細菌によって行われる一次胆汁酸の還元的代謝を抑制でき、その結果、腸内の発がん性を有する二次胆汁酸が低減することを見出し、下記の各発明を完成した。

（１）二次胆汁酸のうち一次胆汁酸の還元的代謝により生成する７位水酸基の脱水酸化物を低減する剤であって、電子受容体を有効成分として含有する前記剤。

（２）７位水酸基の脱水酸化物がデオキシコール酸、リトコール酸およびヒオデオキシコール酸からなる群より選ばれる１または２以上である、（１）に記載の剤。

（３）電子受容体がフマル酸またはその塩である、（１）または（２）に記載の剤。

本発明に係る新規二次胆汁酸低減剤は、腸内細菌の胆汁酸代謝に直接介入することができ、従来の間接的な作用によるものと比較して、腸内の発がん性を有する二次胆汁酸の生成をより効果的に抑制し、発がん性を有する二次胆汁酸を低減することができる。

ヒトの腸内細菌による主要な二次胆汁酸生成反応を示す図である。 フマル酸摂取ラットの盲腸内容物中の有機酸組成を示す図である。縦軸は濃度を、横軸は有機酸の種類を示す。 フマル酸摂取ラットの糞便中胆汁酸組成を示す図である。縦軸は濃度を、横軸は胆汁酸の種類を示す。

「一次胆汁酸」とは、生体の肝臓においてコレステロールを原料として生合成される胆汁酸である。一次胆汁酸の例としては、ヒトにおいてはコール酸（ＣＡ）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）などを、げっ歯類においては上記のヒトの一次胆汁酸に加えてαミュリコール酸（αＭＣＡ）やβミュリコール酸（βＭＣＡ）などを、ブタでは上記のヒトの一次胆汁酸に加えてヒオコール酸（ＨＣＡ）などを挙げることができる。

一方、「二次胆汁酸」とは、一次胆汁酸が腸内細菌の代謝を受けた結果として生成する胆汁酸である。二次胆汁酸の例としては、ヒトにおいてはデオキシコール酸（ＤＣＡ）、リトコール酸（ＬＣＡ）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、７−ケトデオキシコール酸（７−ＫＤＣＡ）、７−ケトリトコール酸（７−ＫＬＣＡ）などを、げっ歯類においては上記のヒトの二次胆汁酸に加えてヒオデオキシコール酸（ＨＤＣＡ）およびωミュリコール酸（ωＭＣＡ）などを、ブタでは上記のヒトの二次胆汁酸に加えてＨＤＣＡなどを挙げることができる。

本明細書でいう「二次胆汁酸のうち一次胆汁酸の還元的代謝により生成する７位水酸基の脱水酸化物」としては、例えば、ＤＣＡ、ＬＣＡ、ＨＤＣＡなどを挙げることができ、ＤＣＡおよびＬＣＡは、対応する一次胆汁酸であるＣＡおよびＣＤＣＡの７位の水酸基が脱離した構造を有し、ＨＤＣＡは対応する一次胆汁酸であるβＭＣＡの７位の水酸基が脱離、６位の水酸基が異性化された構造を有している。本明細書において、「二次胆汁酸のうち一次胆汁酸の還元的代謝により生成する７位水酸基の脱水酸化物」は、「発がん性を有する二次胆汁酸」と交換可能に用いられる場合がある。例えば、前記ＤＣＡ、ＬＣＡ、ＨＤＣＡなどは、変異原性または発がんプロモーター活性を有し、発がん性を有する二次胆汁酸である。

表１に各種胆汁酸における水酸基の位置を示す。表１中、例えばＣＡは３α、７α、１２αの水酸基を有することを表し、また７−ＫＤＣＡは３αの水酸基および７位のオキソ基を有することを表す。

一次胆汁酸は、腸内細菌により代謝を受け、様々な二次胆汁酸となる。例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属菌などの腸内細菌（発がん性を有する二次胆汁酸生成菌）は、一次胆汁酸を基質とした還元的代謝（例えば、７α−脱水酸化反応）により、ＤＣＡ、ＬＣＡ、ＨＤＣＡなどの発がん性を有する二次胆汁酸を生成する。

また、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属菌などの腸内細菌（発がん性を有さない二次胆汁酸生成菌）は一次胆汁酸を基質とした酸化的代謝（例えば、７α−脱水素反応）により、７−ＫＤＣＡ、７−ＫＬＣＡなどの発がん性の弱い、もしくは発がん性を有さない二次胆汁酸を生成する。

図１にヒトの主要な二次胆汁酸代謝を示す。図１に示すとおり、発がん性を有する二次胆汁酸生成菌の還元的代謝により、一次胆汁酸であるＣＡはＤＣＡとなり、ＣＤＣＡはＬＣＡとなる。一方、発がん性を有さない二次胆汁酸生成菌の酸化的代謝により、ＣＡは７−ＫＤＣＡとなり、ＣＤＣＡは７−ＫＬＣＡとなる。発がん性を有する二次胆汁酸生成菌の還元的代謝と、発がん性を有さない二次胆汁酸生成菌の酸化的代謝とは、一次胆汁酸を基質とする点で競合する。

本発明においては、腸内への電子受容体の導入により、発がん性を有さない二次胆汁酸生成菌の嫌気呼吸が促進される結果、一次胆汁酸の酸化的代謝が促進され、競合する一次胆汁酸の還元的代謝が抑制される。このように、本発明によると、一次胆汁酸の還元的代謝産物である発がん性を有する二次胆汁酸の生成を抑制することができる。

本発明に係る電子受容体としては、二次胆汁酸のうち一次胆汁酸の還元的代謝により生成する７位水酸基の脱水酸化物を低減する電子受容体であれば特に限定されず、例えば、フマル酸、硝酸塩、硫酸塩（タウリンなどを含む）、トリメチルアミン−Ｎ−オキサイド、ジメチルスルホキシド、３価の鉄イオンなど、また例えば植物由来のポリフェノール性化合物に代表されるような二重結合を多く含む食品素材（例えばカフェイン酸、カテキン、ルチン、ケルセチンなど）やリグニンなどを用いることができる。

特に好適な電子受容体としては、電子受容体自身および電子受容により生成される還元化合物のいずれもが安全性に問題がない物質、例えばフマル酸およびその塩を挙げることができる。フマル酸、および嫌気呼吸によりフマル酸から生成されるコハク酸は大部分の生物の基本的代謝経路であるクエン酸回路を構成する有機酸であり、共に食品添加物として安全性が確認されている化合物である。

フマル酸の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、フマル酸第一鉄などの金属塩などを用いることができる。

発がん性を有する二次胆汁酸生成菌としては、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属菌などを挙げることができ、特にＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃｉｎｄｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｒａｎｏｎｉｓなどを挙げることができる。また、発がん性を有さない二次胆汁酸生成菌としては、例えば、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属菌、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属菌などを挙げることができる。

本発明において、「二次胆汁酸のうち一次胆汁酸の還元的代謝により生成する７位水酸基の脱水酸化物を低減する」とは、腸管内または糞便における、二次胆汁酸のうち一次胆汁酸の還元的代謝により生成する７位の水酸基の脱水酸化物の量、濃度、総胆汁酸量に占める二次胆汁酸のうち一次胆汁酸の還元的代謝により生成する７位の水酸基の脱水酸化物の割合のいずれかを、健常な生物個体が通常有するレベルと比較して、または本発明に係る剤を摂取する前の状態と比較して、低下もしくは減少させること、または増加させないことを意味する。

発がん性を有する二次胆汁酸は、いくつかの疾患との関連が指摘されている。例えば大腸がんとの関連性について、ラットにリトコール酸などの二次胆汁酸を投与した場合に発がん剤による大腸発がん頻度を増悪すること（Ｎａｒｉｓａｗａ Ｔ．ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．、第１７巻、第１０９３〜１０９７頁、１９７４年）、大腸がん自然発症ラットでは発症していない同系統のラットに比べてその糞便中のデオキシコール酸が増加すること（Ｈａｙａｓｈｉ Ｅ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、第３７巻、第６２９〜６３２頁、１９８６年）が報告されている。

また、発がん性を有する二次胆汁酸は、上皮細胞の細胞死を引き起こす（Ｊｅｋｉｎｓ Ｇ．ら、Ｂｉｌｅ Ａｃｉｄｓ；Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ、Ｉｓｓｕｅｓ ｉｎ Ｔｏｘｏｃｏｌｏｇｙ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００８）ことから、大腸での炎症の惹起に関わる可能性が示されている。

したがって、本発明に係る剤によると、摂取した動物の腸管内または糞便内の発がん性を有する二次胆汁酸を効果的に低減させることから、上述のような発がん性を有する二次胆汁酸の関与が指摘されている疾患である大腸がんおよび炎症性腸疾患の予防や治療の効果を期待することができる。

本発明に係る剤は、電子受容体をそのまま用いてもよいし、一般的な賦形剤と組み合わせることで組成物とし、さらに皮膚外用剤、内服剤、注射剤その他の一般的な剤型に製剤化して利用することもできる。製剤化において使用される賦形剤は、例えば、錠剤やカプセルなどの経口固形剤、水性液剤や懸濁液剤などの内服液剤、座剤その他の、剤型毎に当業者に広く知られ、また用いられている成分を適宜組み合わせて使用することができる。

上記組成物あるいは各種の剤型は、電子受容体に加えて、他の発がん性を有する二次胆汁酸低減剤その他の成分を必要に応じて配合し、医薬品、医薬部外品、農薬の形態としても差し支えなく、安全な食品添加物として飲食品に添加してもよい。

上記組成物あるいは剤型における電子受容体の配合量は特に規定されるものではなく、剤形の種類、品質、期待される効果の程度によって若干異なるが、組成物或いは製剤全量中、乾燥固形分として１％〜９９重量％、好ましくは１０〜９９重量％、更に好ましくは５０〜９９重量％配合させるのがよい。

本発明に係る剤は、そのまま、あるいは適当な飲食品成分と組み合わせることで、乳飲料やジュースなどの飲料、ヨーグルト、アイスクリーム、スープ、ゼリー、ジャム、菓子、パン類などの食品の形態としてもよく、さらに健康食品またはサプリメントの形態としてもよい。

さらに本発明に係る剤は、そのまま、あるいは適当な飼料成分と組み合わせることで、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ヤギ、ニワトリなどの家畜用飼料、魚類などの養殖用飼料、イヌ、ネコなどのペット用飼料の形態としてもよい。

本発明に係る剤を上記の飲食品や飼料などの形態で摂取する場合の量に特段の制限はないが、人間に対しては、一般に食品として使用される範囲の量を摂取することが望ましく、具体的には１回につき０．５〜１０００ｇ、好ましくは１〜５００ｇであり、１日当たりの総摂取量は０．５〜２０００ｇ、好ましくは１〜１０００ｇである。

以下、実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は係る実施例に限定的に解釈されるものではない。

＜実施例１＞フマル酸摂取がラット腸内の胆汁酸組成に与える影響の評価
フマル酸摂取がラット腸内の胆汁酸組成に与える影響を評価した。５週齢のＷＫＡＨ／Ｈｋｍ ｓｌｃ雄ラットに基本飼料（ＡＩＮ−９３Ｇ準拠、２０％カゼイン食）を摂取させ、３−６日間の予備飼育を行った。予備飼育後、ラットを３群に分け、コントロール群（ｎ＝６）は引き続き同様の基本飼料を、５％フマル酸群（ｎ＝６）は基本飼料にフマル酸２ナトリウム（東京化成工業株式会社）を５％量添加した飼料を、１０％フマル酸群（ｎ＝３）は基本飼料にフマル酸２ナトリウムを１０％量添加した飼料を摂取させ、１４日間の試験飼育を行った。試験期間最終日に解剖を行い、盲腸内容物を採取した。試験に用いた飼料の組成を表２に示す。

盲腸内容物重量に対して、４倍量の水を加えてホモジナイズして遠心後、上清のｐＨを簡易型ｐＨ測定器（ＫＳ７０１；新電元工業）で測定した。また盲腸内容物の有機酸は以下の方法により測定した。上記盲腸内容物ホモジネート１ｍＬに、内部標準物質として２５ｍＭのクロトン酸を含む５０ｍＭ水酸化ナトリウム溶液２００μＬを加え撹拌して遠心後、０．７５ｍＬの上清に０．７ｍＬのクロロホルムを添加して混合した。クロロホルム層が分離した後、上清に含まれる有機酸濃度をイオン交換カラム（Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ ＳＣＲ−１０２Ｈ、８ｘ３０ｍｍ；島津製作所）を用いた有機酸分析用ＨＰＬＣシステム（ＳＣＬ−１０ＡＶＰ；島津製作所）で定量した（Ｈｏｓｈｉ Ｓ．ら、Ｊ．Ｎｕｔｒ．、第２４巻、第５２〜６０頁、１９９４年）。

糞便中の胆汁酸分析については以下の方法を用いた。凍結乾燥後に粉砕した糞便１００ｍｇに、１ｍＬのメタノールを加え混合した。これに内部標準として５００μＭのノルデオキシコール酸を含むメタノールを５０μＬ加えた後に、超音波破砕機／超音波式ホモジナイザー（Ｕｌｔｒａ Ｓ．Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ ＶＰ−１５Ｓ；タイテック社）を用いて混合した。ウォーターバスを用いて６０℃で３０分間サンプルを加熱後、さらに１００℃で３分間加熱した。室温になるまで放置後、撹拌し遠心分離して上清を回収した。残査に１ｍＬのエタノールを加えて撹拌遠心後、再度上清を回収した。エタノールを用いた抽出操作を再度行いすべての抽出液を混合した。回収した抽出液からエタノールを除いた後、メタノールに溶解したものの胆汁酸組成をＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステムを用いたＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳにより定量した（Ｈａｇｉｏ Ｍ．ら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、第５０巻、第１７３〜１８０頁、２００９年）。統計処理は一元配置分散分析により行った。

盲腸内容物のｐＨを表３に示す。表３より、フマル酸摂取によるｐＨの変動は認められなかった。

盲腸内容物に含まれる有機酸を分析した結果を図２に示す。図２より、フマル酸摂取により盲腸内のコハク酸濃度の増大が認められた。コハク酸は、フマル酸を電子受容体とした嫌気呼吸により生成する有機酸であることから、フマル酸摂取によりラット腸内細菌の嫌気呼吸が促進されることが示された。

糞便に含まれる胆汁酸を分析した結果を図３に示す。図３より、発がん性を有する二次胆汁酸であるデオキシコール酸およびリトコール酸の濃度は、フマル酸摂取量に依存して統計的に有意に減少することが示された。また、ヒオデオキシコール酸は減少傾向となることが示された。

以上の結果から、飼料から摂取したフマル酸がラットの腸内で電子受容体として機能し、発がん性を有する二次胆汁酸生成菌が一次胆汁酸の還元的代謝を抑制することにより、糞便中の発がん性を有する二次胆汁酸の濃度を低下させることが示された。

Claims (3)

1. 二次胆汁酸のうち一次胆汁酸の還元的代謝により生成する７位水酸基の脱水酸化物を低減する剤であって、電子受容体を有効成分として含有する前記剤。
2. ７位水酸基の脱水酸化物がデオキシコール酸、リトコール酸およびヒオデオキシコール酸からなる群より選ばれる１または２以上である、請求項１に記載の剤。
3. 電子受容体がフマル酸またはその塩である、請求項１または請求項２に記載の剤。

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