JP2011092215A

JP2011092215A - Ｖ様ドメイン結合分子

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Publication number: JP2011092215A
Application number: JP2011028861A
Authority: JP
Inventors: Gregory Coia; グレゴリー・コイア; Maria Galanis; マリア・ガラニス; Peter John Hudson; ピーター・ジョン・ハドソン; Robert Alexander Irving; ロバート・アレクサンダー・イアヴィング; Stewart Douglas Nuttall; スチュワート・ダグラス・ナットール
Original assignee: Cephalon Australia Pty Ltd
Current assignee: Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd
Priority date: 1998-03-06
Filing date: 2011-02-14
Publication date: 2011-05-12
Anticipated expiration: 2019-03-05
Also published as: EP1058728A4; US20070065431A1; JP4813656B2; EP1058728A1; DE69938622D1; US7166697B1; DE69938622T2; JP5272257B2; EP1058728B1; CA2322621A1; US7405288B2; WO1999045110A1; ES2306507T3; JP2002505103A; DK1058728T3; US20080305988A1; ATE393824T1; AUPP221098A0

Abstract

【課題】本発明は、非抗体リガンド由来の少なくとも一つの単量体Ｖ様ドメイン（ＶＬＤ）を含み、該少なくとも一つの単量体Ｖ様ドメインが、未改変ＶＬＤと比較した場合に、改変ＶＬＤの可溶性が改善しているように、少なくとも一つのＣＤＲループ構造またはその一部が改変または置換されている点に特徴付けられる、新規な結合部分に関する。
【解決手段】本発明は、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２８およびＩＣＯＳなどの非抗体リガンドのＶ様ドメイン（ＶＬＤ）から得られた新規な結合分子を開発した。ＶＬＤ内のＣＤＲループ構造の置換によって、結合特異性が変化して可溶性が改善された、単量体で正確に折り畳まれた分子を、予期せずに産生した。
【選択図】なし

Description

本発明は、標的分子に対するアフィニティーを有するＶ様ドメイン結合分子に関する。また、本発明は、これらのＶ様ドメイン結合分子を含む組成物に関し、これらの分子の使用を含む診断または処置方法に関する。また、本発明は、新規な結合アフィニティーおよび／または特異性を有するＶ様ドメイン結合分子を選択する方法に関する。

イムノグロブリン・スーパーファミリー−抗体可変（Ｖ）ドメイン
抗体は、特異的な高アフィニティー結合剤の実例であり、イムノグロブリンドメインの可変重鎖（Ｖ_H）と可変軽鎖（Ｖ_L）との相互作用による抗原結合部分を提供する。結合界面は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される六つの表面ポリペプチドループによって形成され、高頻度に可変で、結合している、各可変ドメインのうちの三つが、抗原との相互作用に対して、十分に広い表面積を提供する。特異的結合剤は、Ｖ_HおよびＶ_Lドメインのみの結合によってＦｖモジュールを形成することができる。Ｖドメインをリンカーポリペプチドと結合させて、単一鎖ｓｃＦｖモジュールにすることによって、細菌の発現が、増強される。齧歯類のＣＤＲループ構造を、ヒトＦｖ枠組み上にグラフト化することによる、組み換え抗体の「ヒト化」が、Winterら、EP-239400によって開示されている。

単一鎖Ｆｖモジュールの発現および折畳特性を改善する方法が、Niebaら(1997)によって記載されていた。天然の哺乳動物の抗体から得られた単一Ｖドメインの特性は、Gussowら、WO/90/05144とEP0368684B1、およびDavisら、WO/91/08482によって、記載されている。単一ラクダ科動物のＶドメインが、Hamersら、WO/96/34103とWO/94/25591によって、記載されている。ヒトアミノ酸配列を、ラクダ科動物のアミノ酸配列と置換することにより、ヒトＶ_Hドメインの表面の疎水性を低減させる方法は、DaviesとRiechmann(1994)によって記載される。ＣＤＲループにおけるシステイン残基の挿入を含み、タンパク質の安定性をさらに増強するために、ヒトＶ_H配列の他の領域を、ラクダの配列と置換する方法は、DaviesとRiechmann(1996)によって記載される。

Ｖ_HまたはＶ_Lドメインのどちらか一方を用いて、高いアフィニティーの単一ドメイン結合剤を設計するいくつかの試みは、結合特異性の欠如と、Ｖ_HとＶ_Lドメインが相互作用する疎水性表面の不在下における単一ドメイン固有の不溶性により、成功していない（Ｋｏｒｔｔら、１９９５）。

Ｔ細胞受容体可変（Ｖ）ドメイン
Ｔ細胞受容体は、Ｖ_HとＶ_Lドメインの結合により生じる抗体のＦｖモジュールに類似する構造に、結合してなる二つのＶドメインを有する。Novotnyら(1991)により、いかにして、Ｔ細胞受容体の二つのＶドメイン（αおよびβと称する）が、単一鎖ポリペプチドとして融合して発現できるのか、およびさらに、いかにして、疎水性を低減するために、直接的に抗体ｓｃＦｖに類似する表面残基を変化させるのかについて、記載された。他の文献には、二つのＶαとＶβドメインを含む、単一鎖Ｔ細胞受容体の発現特性について、記載されている(WulfingとPluckthun、1994;Ward、1991)。

非抗体リガンド−ＣＴＬＡ−４とＣＤ２８様ドメイン
また、Ｖ様ドメインを含む特異的結合対に結合する非抗体リガンドの種類がある。これらのＶ様ドメインは、共に結合してＦｖ型分子にならない傾向にあるため、抗体もしくはＴ細胞受容体のＶ様ドメインから識別される。これらの非抗体リガンドは、標的分子に対する高いアフィニティーを有する新規な結合部分を開発するための代替枠組みを提供する。従って、可溶性であるこれらの非抗体リガンドから得られた単一ドメインＶ様結合分子が、望ましい。適した非抗体リガンドの実施例は、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２８およびＩＣＯＳである(Hutloffら、1999)。

細胞毒性Ｔリンパ球付随抗原４(Cytotoxic T-lymphocyte associated antigen4)（ＣＴＬＡ−４）と該相同体の細胞表面タンパク質ＣＤ２８とＩＣＯＳは、免疫応答時におけるＴ細胞制御に関連している。ＣＴＬＡ−４は、活性化Ｔ細胞表面上に、初期かつ一過性に発現する４４ｋＤａホモ二量体であり、免疫応答の制御に作用する抗原提示細胞上のＣＤ８０とＣＤ８６表面抗原と相互作用する(Waterhouseら、1996、van der Merweら、1997)。ＣＤ２８は、Ｔ細胞上に主に発現する４４ｋＤａホモ二量体であり、ＣＴＬＡ−４と同様に、免疫応答の制御に作用する抗原提示細胞上のＣＤ８０とＣＤ８６表面抗原と相互作用する。最近の学説では、例えば、ノックアウトマウスにおけるＣＴＬＡ−４の遺伝子欠損により、広範囲における活性化Ｔ細胞の過増殖が認められる(Waterhouseら、1995)など、利用できるリガンドに対する、ＣＴＬＡ−４とＣＤ２８との競合が、免疫応答のレベルを制御することがディスプレイされている。

各ＣＴＬＡ−４単量体サブユニットは、Ｎ末端細胞外ドメイン、膜貫通領域、およびＣ末端細胞内ドメインからなる。細胞外ドメインは、Ｎ末端Ｖ様ドメイン（ＶＬＤ；イムノグロブリン・スーパーファミリーに対する相同性より、約１４ｋＤａの推定分子量である）と、免疫応答の制御に作用する抗原提示細胞上のＣＤ８０とＣＤ８６表面抗原と相互作用する、ＶＬＤを膜貫通領域に連結する約１０残基の軸を含む。ＶＬＤは、抗体ＶドメインのＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２およびＣＤＲ−３に相当する表面ループを含む(Metzler、1997)。ＣＴＬＡ−４における最近の構造および変異研究により、ＣＤ８０とＣＤ８６への結合が、Ａ’ＧＦＣＣ’Ｖ様β鎖から、およびＣＤＲ３様表面ループにおける高度に保存されたＭＹＰＰＰＹ配列から、形成されたＶＬＤ表面を介して生じることが示されている(Peachら、1994;Mortonら、1996;Metzlerら、1997)。ＣＴＬＡ−４単量体間の二量体化は、二軸におけるシステイン残基（Ｃｙｓ¹²⁰）間のジスルフィド結合を介して生じ、これにより、二つの細胞外ドメインが連結されるが、Ｖ様ドメイン間での直接的な会合は認められない(Metzlerら、1997)。二量体化は、リガンドに対する親和性の増強にのみ、寄与すると思われる。

イン・ビトロにおけるＣＴＬＡ−４の可溶型の発現
おそらく発現タンパク質の凝集により、ヒトＣＴＬＡ−４分子の細胞外ドメインとＶ様ドメイン（ＶＬＤ）のどちらも、細菌細胞において、可溶性単量体として十分に発現されていない(Linsleyら、1995)。大腸菌において、細胞外Ｎ末端ドメイン（Ｃｙｓ¹²⁰を含む、Ｍｅｔ¹からＡｓｐ¹²⁴）を発現させると、二つのＣＴＬＡ−４Ｖ様ドメインがＣｙｓ¹²⁰におけるジスルフィド結合により連結された、二量体の分子量２８ｋＤａのタンパク質が生成される。Ｖａｌ¹¹⁴における先端除去により、これらシステインを除去し、可溶性単量体型での１４ｋＤａＶＬＤの発現を可能にすることが企図された。しかしながら、生成物は凝集し、通常はグリコシル化によってマスクされていた疎水性部位が、露出し、凝集を引き起こしたことが結論づけられた（Linsleyら、1995）。

真核細胞発現系（すなわち、ＣＨＯ細胞と酵母Pichia pastoris;Linsleyら、1995;Metzlerら、1997;Gerstmayerら、1997）において、単量体のグリコシル化ＣＴＬＡ−４細胞外ドメインを発現させることができたとのいくつかの報告がある。これらの真核細胞発現系におけるグリコシル化は、ＶＬＤにおける二つのＮ−連結グリコシル化部位（Ａｓｎ７６とＡｓｎ１０８）で生じることが推定される。しかしながら、Ｉｇ−ＣＨ２／ＣＨ３ドメインに融合したＣＴＬＡ−４ＶＬＤをコードする遺伝子を発現させた場合、高い収率で、Ｆｃサブユニットに連結された２つのＣＴＬＡ−４ＶＬＤを有する二量体組み換えタンパク質が生成されることが報告されているのみである(WO95/01994とAU16458/95)。AU60590/96には、天然のＣＤ８０とＣＤ８６リガンドに対するアフィニティーを保持して改変するＭＹＰＰＰＹ表面ループにおいて、最初のチロシン（Ｙ）が単一アミノ酸置換されたＣＴＬＡ−４ＶＬＤの変異型が、記載されている。AU60590/96には、真核細胞において発現させた組み換えＣＴＬＡ−４／Ｉｇ融合タンパク質として、好ましいＣＴＬＡ−４ＶＬＤの可溶型が記載されているが、真核細胞発現系における凝集の問題点は解決されていない。EP0757099A2には、ＣＴＬＡ−４変異分子の使用、例えばＣＤＲ３様ループにおける変異体のリガンド結合における変化の作用が記載されている。

EP-239400 WO/90/05144 EP0368684B1 WO/91/08482 WO/96/34103 WO/94/25591 WO95/01994 AU16458/95 AU60590/96 EP0757099A2

Niebaら(1997) DaviesとRiechmann(1994) DaviesとRiechmann(1996) Novotnyら(1991) WulfingとPluckthun、1994 Ward、1991 Hutloffら、1999 Waterhouseら、1996 van der Merweら、1997 Waterhouseら、1995 Metzler、1997 Peachら、1994 Mortonら、1996 Metzlerら、1997 Linsleyら、1995 Gerstmayerら、1997

本発明は、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２８およびＩＣＯＳなどの非抗体リガンドのＶ様ドメイン（ＶＬＤ）から得られた新規な結合分子を開発した。ＶＬＤ内のＣＤＲループ構造の置換によって、結合特異性が変化して可溶性が改善された、単量体で正確に折り畳まれた分子を、予期せずに産生した。

従って、本発明の第一の態様において、非抗体リガンドから得られた少なくとも一つの単量体Ｖ様ドメイン（ＶＬＤ）を含み、該少なくとも一つの単量体Ｖ様ドメインが、未改変ＶＬＤと比較した場合に、改変ＶＬＤの可溶性が改善されるように、少なくとも一つのＣＤＲループ構造もしくはその一部を改変もしくは置換されていることを特徴とする結合部分を提供する。

本発明の範囲内で、改変または置換は、少なくとも一つのＣＤＲループ構造の一以上の物理特性（例えば、サイズ、形状、電荷、疎水性など）に対するあらゆる変化を含むことができる。改変または置換により、少なくとも一つのＣＤＲループ構造のサイズを低減させることができる。しかしながら、好ましい実施態様において、少なくとも一つのＣＤＲループ構造またはその一部が、
（ｉ）未改変ＶＬＤにおいて相当するＣＤＲループ構造と比較した場合に、ＣＤＲループ構造のサイズが増大している；および／または、
（ｉｉ）改変または置換により、一以上のＣＤＲループ構造内もしくは間のジスルフィド結合が形成される、ように改変または置換される。

第二の態様において、本発明は、非抗体リガンドから得られた少なくとも一つの単量体Ｖ様ドメイン（ＶＬＤ）を含み、該少なくとも一つの単量体Ｖ様ドメインは、少なくとも一つのＣＤＲループ構造またはその一部が、
（ｉ）未改変ＶＬＤにおいて相当するＣＤＲループ構造と比較した場合に、ＣＤＲループ構造のサイズが変化している；および／または、
（ｉｉ）改変または置換により、一以上のＣＤＲループ構造内もしくは間のジスルフィド結合が形成される、ように改変または置換されていることを特徴とする結合部分を提供する。

第二の態様の好ましい実施態様において、ＣＤＲループ構造のサイズは、少なくとも二つ、より好ましくは少なくとも三つ、さらに好ましくは少なくとも六つ、よりさらに好ましくは少なくとも九つのアミノ酸残基によって増加している。

また、より好ましい実施態様において、本発明の第一または第二の態様の改変された結合部分は、未改変の結合部分と比較した場合に、変化した結合アフィニティーまたは特異性を示す。好ましくは、ＣＤＲループ構造を置換または改変することによる効果は、未改変ＶＬＤの一以上の天然のリガンドに対するＶＬＤのアフィニティーを低減させるまたは消失させることである。好ましくは、ＣＤＲループ構造を置換または改変することによる効果は、ＶＬＤの結合特異性も変化することである。従って、改変ＶＬＤが、未改変ＶＬＤの結合対と異なる特異的結合対に、結合することが好ましい。

「Ｖ様ドメイン」または「ＶＬＤ」という言葉は、可変重鎖（Ｖ_H）または可変軽鎖（Ｖ_L）抗体に類似する構造上の特徴を有するドメインを表すことが企図される。これらの類似する構造上の特徴は、ＣＤＲループ構造を含む。「ＣＤＲループ構造」によって、我々は、抗体Ｖドメインにおける相補性決定領域のような、表面ポリペプチドループ構造または領域を意味する。

「非抗体リガンド」という言葉は、抗体またはＴ細胞受容体でない、特異的結合対に結合するあらゆるリガンドを表すことが企図される。適切な非抗体リガンドの実施例は、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２８およびＩＣＯＳなどのＴ細胞表面タンパク質である。本発明に適したＶ様ドメインを提供できる他の非抗体リガンドが、他のＴ細胞表面タンパク質、例えば、ＣＤ２、ＣＤ４，ＣＤ７およびＣＤ１６；Ｂ細胞表面タンパク質、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ７９ａ、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ８０およびＣＤ８６；接着分子、例えば、ＣＤ４８、ＣＤ５４ＩＣＡＭおよびＣＤ５８、であることが、当業者によって認識されるであろう。表１に列挙するこれらの分子は、本発明の単一ドメイン結合分子の基を形成する構造の、一部の一覧を提供する。

「非抗体リガンドから得られたＶ様ドメイン」という言葉は、非抗体リガンドから得られたＶ様ドメインの少なくとも一部を含むキメラＶ様ドメインを包括することが企図される。

これらの分子は、（１）The Leucocyte Antigen Facts Book, 1993,Eds Barclay et al.Academic Press, London；および（２）CD Antigen 1996(1997) Immunology Today 18,100-101において記載されており、これらの全ての内容が、ここに参照として取り込まれる。

本発明の改変された結合部分の「可溶性」は、正確に折り畳まれた、単量体ドメインの産物と相関する。従って、改変ＶＬＤの可溶性は、ＨＰＬＣによってアッセイすることができる。例えば、可溶性（単量体）ＶＬＤは、ＨＰＬＣクロマトグラフ上で単一ピークを生じるであろうし、一方不溶性（例えば、多重結合で凝集している）ＶＬＤは、複数のピークを生じるであろう。従って、当業者であれば、通常のＨＰＬＣ技術を用いて、改変ＶＬＤの可溶性の増加を検出することができるであろう。

本発明の結合部分が、共に結合し、化学的または遺伝学的に、多価または多機能の試薬となることが、認識されるであろう。例えば、Ｃｙｓ¹²⁰を含む天然ＣＴＬＡ−４において、Ｃ末端の付加により、二量となる。

また、本発明の結合部分は、様々な診断用製剤のための他の分子に結合させることができる。例えば、ＶＬＤは、ポリペプチドＣ末端を含むことができ、または多イン・ビトロアッセイにおいて、多部位で、ストレプトアビジンまたはビオチンに結合させることができる。また、ＶＬＤは、放射性同位元素、染料マーカー、または腫瘍、凝血塊などのイン・ビボ検出および／または局在のためのその他のイメージング剤に結合させることができる。また、ＶＬＤは、診断およびバイオセンサー装置のための不溶性装置および台上に結合させることによって、固定化することができる。

本発明の第一の態様の最も好ましい実施態様において、Ｖ様ドメインは、ＣＴＬＡ−４分子またはＣＤ２８分子の細胞外ドメインから得られる。さらなる好ましい実施態様において、ＣＴＬＡ−４Ｖ様ドメインの一以上の表面ループ、好ましくはＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２もしくはＣＤＲ−３ループ構造が、興味のある標的分子に対する結合アフィニティーを有するポリペプチドと置換される。興味のある標的分子は、限定されないが、薬剤、ステロイド、殺虫剤、抗原、成長因子、腫瘍マーカー、細胞表面タンパク質、またはウィルスコートタンパク質を含む。これらのＶＬＤは、多特異的であり、天然の表面および改変されたポリペプチドの両方によってもたらされたアフィニティーを有することができると認識されるであろう。

さらなる好ましい実施態様において、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２８およびＩＣＯＳのＶ様ドメイン表面ループを置換または改変することによる効果は、ＣＤ８０とＣＤ８６に対する天然のアフィニティーを消失させることである。

好ましい一実施態様において、ＶＬＤの一以上のＣＤＲループ構造は、抗体から得られた一以上のＣＤＲループ構造と置換される。抗体は、あらゆる種から得ることができる。好ましい実施態様において、抗体は、ヒト、ラット、マウス、ラクダ、ラマまたはサメから得られる。抗体は、ラクダ抗体ｃＡＢ−Ｌｙｓ３とヒト抗メラノーマ抗体Ｖ８６から選択されることができる。

さらなる好ましい実施態様において、一以上のＣＤＲループ構造が、非抗体ポリペプチド由来の結合決定基で置換される。例えば、一以上のＣＤＲループ構造が、ポリペプチドホルモン、例えば、ジスルフィド結合化ポリペプチド内の１４残基が腫瘍細胞の認識に重要であるソマトスタチン、またはウィルスタンパク質、例えばヒトインフルエンザウィルス・ヘマグルチニンタンパク質などで置換されることができる。

さらに好ましい実施態様において、結合部分のＶ様ドメインは、ラクダ科動物もしくはラマの抗体において見出されるＣＤＲループ構造に一致するＣＤＲループ構造を含む。例えば、ＣＤＲループ構造は、一以上の通常でない置換体（例えば、本来の極性に対して疎水性である）を含む。他の好ましい実施態様において、ＣＤＲ−１とＣＤＲ−３ループ構造は、長さが非常に不均一である一般的でないコンホメーションを採ることができる。また、Ｖ様ドメインは、ＣＤＲ−１とＣＤＲ−３ループ構造（幾つかのラクダＶ_HＨ抗体において見出されている）もしくはＣＤＲ−２とＣＤＲ−３ループ構造（幾つかのラマＶ_HＨ抗体において見出されている）を相互に結ぶジスルフィド結合を有することができる。

第三の態様において、本発明は、本発明の第一または第二の態様の結合部分をコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、プラスミドまたは発現ベクターに組み込むことができる。

第四の態様において、本発明は、本発明の第三の態様によるポリヌクレオチドで形質転換した原核もしくは真核宿主細胞を提供する。

第五の態様において、本発明は、本発明の第四の態様による宿主細胞を、結合部分の発現を可能にする条件下で培養することと、任意で結合部分を回収することを含む、結合部分を生成する方法を提供する。

本発明の好ましい実施態様において、結合部分は、細菌宿主において発現させることによって、産生させることができる。好ましくは、結合部分は、グリコシル化されていない。

第六の態様において、本発明は、本発明の第一もしくは第二の態様の結合部分と薬学的に受容できる担体もしくは希釈剤を含む薬学的組成物を提供する。

第七の態様において、本発明は、患者の病状を治療する方法であって、患者に本発明の第一または第二の態様による結合部分を投与することを含む方法を提供する。

イン・ビボで適用する場合、ＶＬＤは治療または診断する患者に一致し、あらゆる可能性の外来抗原が除去されていることが好ましい。従って、臨床に適用して使用するＶＬＤ分子は、天然のヒトのイムノグロブリン・スーパーファミリーメンバーに十分に一致していることが好ましい。

第八の態様において、本発明は、標的分子に対するアフィニティーを有する結合部分を選択する方法であって、一以上の非抗体リガンドから得られたＶＬＤをコードするポリヌクレオチドのライブラリーを、標的分子に対するアフィニティーを有する結合部分の発現でスクリーニングすることを含み、該ポリヌクレオチドは、少なくとも一つのＶＬＤにおける少なくとも一つのＣＤＲループにおける改変または置換を生じる突然変異を受けており、単離された改変ＶＬＤの可溶性が、単離された未改変ＶＬＤと比較した場合に改善されている方法を提供する。

本発明の第八の態様の範囲内で、あらゆるランダムまたは標的突然変異生成方法が、Ｖ様ドメインに改変を導入するために用いられることは、当業者によって、認識されるであろう。好ましい実施態様において、突然変異生成は、標的突然変異生成である。標的突然変異生成は、好ましくは、スプライスオーバーラップＰＣＲ法を用いた、少なくとも一つのＣＤＲループ構造内での少なくとも一つの配列の置換を含む。

また、ポリヌクレオチドライブラリーは、非天然のＣＤＲループ構造を含むＶＬＤをコードする配列だけでなく、天然のイムノグロブリンにおいて見出されたＣＤＲループ構造と十分に同一であるＣＤＲループ構造を含むＶＬＤをコードする配列を含むことが、当業者によって認識されるであろう。

本発明の第八の態様の好ましい実施態様において、スクリーニング方法は、改変されたＶ様ドメインを、バクテリオファージ粒子の表面上の遺伝子IIIタンパク質融合体としてディスプレイすることを含む。該ライブラリーは、Ｖ様ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む、ｐＨＦＡ、ｆｄ−ｔｅｔ−ｄｏｇまたはｐＦＡＢ．５ｃなどのバクテリオファージを含むことができる。

第八の態様のさらに好ましい実施態様において、スクリーニング方法は、リボソームディスプレイ選択系において、改変Ｖ様ドメインをディスプレイすることを含む。

この明細書を通して、「含む」または「含んでいる」などの言葉は、記載された要素、全過程、または要素群の包含を含意すると解されるであろうが、あらゆる他の要素、全過程、もしくは要素群の排除を含意しないと解されるであろう。

ＣＴＬＡ−４ＶＬＤ特異的オリゴヌクレオチド。ＣＴＬＡ−４ＶＬＤ特異的オリゴヌクレオチド。ＣＴＬＡ−４ＶＬＤ特異的オリゴヌクレオチド。ＣＴＬＡ−４ＶＬＤ特異的オリゴヌクレオチド。ヒトＣＴＬＡ−４をコードする全長ｃＤＮＡポリヌクレオチド配列と、ヒトＣＴＬＡ−４のＶＬＤのポリヌクレオチド配列。ファージまたはファージミド表面における遺伝子３融合体としてのＣＴＬＡ−４ＶＬＤＳＴＭを示す。ＣＴＬＡ−４ＶＬＤＳＴＭは、黒楕円として表し；遺伝子３タンパク質は、白楕円として表し；ＦＬＡＧポリペプチドは、灰色で表し；遺伝子は、類似色の記号でマークし、楕円形のファージ（ミド）ベクターの中に表す。ソマトスタチンポリペプチドの概念図。ソマトスタチン（ソマトトロピン遊離阻害因子ＳＲＩＦ）は、環状１４アミノ酸ポリペプチドである。環状形状は、位置３と１４におけるシステイン残基間のジスルフィド結合によって得られる。ループの先端を構成する四つの残基（Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ）は、ソマトスタチン受容体ファミリーのメンバーに対する結合に密接に関係している。アフィニティー精製したＣＴＬＡ−４ＶＬＤとＣＴＬＡ−４Ｓｏｍ３ＳＴＭのサイズ排除ＨＰＬＣの推移。組み換えヒトＣＴＬＡ−４タンパク質を、ベクターｐＧＣから宿主大腸菌ＴＧ１において発現させ、抗ＦＬＡＧアフィニティークロマトグラフィーによるペリプラズム抽出から精製し、調整したＳｕｐｅｒｏｓｅ１２ＨＲカラム上のサイズ排除クロマトグラフィーにかけた。精製したＣＴＬＡ−４ＶＬＤとＣＴＬＡ−４−Ｓｏｍ３ＳＴＭの溶出推移を、このグラフに重ねる。ＣＴＬＡ−４ＶＬＤは、三量体（２１．８６分）、二量体（２６．８３分）および単量体（２９．３５分）を含む。ＣＴＬＡ−４−Ｓｏｍ３ＳＴＭは、二量体（２６．３４分）と単量体（２９．２８分）を含む。トレースは、２１４ｎｍでの吸光度を表し、任意単位で与えられる。ＣＴＬＡ−４ループ置換の概念図。構造物Ａ（ＣＴＬＡ−４ＶＬＤ：Ｓ２）は、１−１１５残基にわたる野生型ＣＴＬＡ−４の細胞外Ｖドメインを表す。構造物Ｂは、（ＣＴＬＡ−４Ｓｏｍ１：ＰＰ２）およびＣ（ＣＴＬＡ−４Ｓｏｍ１−Ｃｙｓ１２０：ＰＰ５）は共に、ＣＤＲ１において、１４残基のソマトスタチンポリペプチドを含む。また、ＰＰ５は、Ｃｙｓ１２０を含むＣ末端の伸長を担持する。構造物Ｄ（ＣＴＬＡ−４−Ｓｏｍ３：ＰＰ８）は、ＣＤＲ３の位置に１４残基ソマトスタチンポリペプチドを含む。構造物Ｅ（ＣＴＬＡ−４−ＨＡ２：ＸＸ４）において、ＣＤＲ２はヘマグルチニン標識で置換されている。構造物Ｆ（ＣＴＬＡ−４−Ｓｏｍ１−Ｓｏｍ３：ＶＶ３）において、ＣＤＲ１とＣＤＲ３の両方が、ソマトスタチンポリペプチドで置換されている。構造物Ｇ（ＣＴＬＡ−４−Ｓｏｍ−ＨＡ２−Ｓｏｍ３：ＺＺ３）において、ＣＤＲ１とＣＤＲ３が、ソマトスタチンポリペプチドで置換されており、ＣＤＲ２がヘマグルチニン標識で置換されている。構造物Ｈ（ＣＴＬＡ−４−抗ｌｙｓ：２Ｖ８）において、三つ全てのＣＤＲループ構造が、ラクダ抗リゾチームＶ_HＨ分子からのＣＤＲループで置換されている。構造物Ｉ（ＣＴＬＡ−４−抗ｍｅｌ：３Ｅ４）は、三つ全てのＣＤＲが抗メラノーマ抗体Ｖ８６からのＶＨＣＤＲループで置換されているＣＴＬＡ−４ＶＬＤを表す（ＣａｉとＧａｒｅｎ、１９９７）。ＰｅｌＢ、切断可能なペクチン酸溶解遊離配列（２２ａ）；ｆｌａｇ、二重ｆｌａｇ標識（ＡＡＡＤＹＫＤＤＤＤＫＡＡＤＹＫＤＤＤＤＫ）。精製した組み換えヒトＣＴＬＡ−４ＳＴＭのＨＰＬＣ推移。組み換えＣＴＬＡ−４ＶＬＤは、ベクターｐＧＣから宿主大腸菌ＴＧ１に発現させ、ペリプラズム抽出から抗ＦＬＡＧアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、調整したＳｕｐｅｒｏｓｅ１２ＨＲカラムのサイズ排除クロマトグラフィーにかけた。精製したタンパク質の溶出推移を示す。パネルＡ、ＣＴＬＡ−４二量体（ＰＰ５）；パネルＢ、ＣＴＬＡ−４Ｒ（Ｓ２）；パネルＣ、ＣＴＬＡ−４−ＨＡ２（ＸＸ４）；パネルＤ、ＣＴＬＡ−４−Ｓｏｍ３（ＰＰ８）；パネルＥ、ＣＴＬＡ−４−Ｓｏｍ１（ＰＰ２）；パネルＦ、ＣＴＬＡ−４−Ｓｏｍ１−Ｓｏｍ３（ＶＶ３）；パネルＧ、ＣＴＬＡ−４−Ｓｏｍ−ＨＡ２−Ｓｏｍ３（ＺＺ３）；パネルＨ、ＣＴＬＡ−４−抗ｌｙｓ（２Ｖ８）；パネルＩ、ＣＴＬＡ−４−抗ｍｅｌ（３Ｅ４）。トレースは、２１４ｎｍでの吸光度を表し、任意単位で与えられる。細菌発現ベクターｐＧＣまたはｐＰＯＷを用いて合成し、アフィニティー精製したＣＴＬＡ−４構造物の、サイズ排除ＦＰＬＣ分析による比較。組み換えヒトＣＴＬＡ−４Ｒまたはそのループ変異体を、宿主大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’において発現させ、抗ＦＬＡＧアフィニティークロマトグラフィーにより、ペリプラズム溶出液から精製し、調整したＳｕｐｅｒｏｓｅ１２ＨＲカラムのサイズ排除クロマトグラフィーにかけた。ベクターｐＧＣから発現させたタンパク質の溶出推移を左に示し、ベクターｐＰＯＷから発現させたタンパク質を右に示す。パネルＡ、野生型ＣＴＬＡ−４ＶＬＤ（Ｓ２）；Ｂ、ＣＴＬＡ−４−Ｓｏｍ１（ＰＰ２）；Ｃ、ＣＴＬＡ−４−Ｓｏｍ３（ＰＰ８）；Ｄ、ＣＴＬＡ−４−抗ｌｙｓ（２Ｖ８）；Ｅ、ＣＴＬＡ−４−Ｓｏｍ１−ＨＡ２−Ｓｏｍ３（ＺＺ３）。タンパク質の安定性分析。ＣＴＬＡ−４ＶＬＤとループ変異構造物の単量体の調製の安定性を、複数回凍結／融解を繰り返した後、予め調整しておいたｓｕｐｅｒｏｓｅ１２ｈｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムのサイズ排除ｆｐｌｃクロマトグラフィーにより、分析した。各タンパク質のアリコートを、ピーク精製し、二回凍結／融解した後、直ちに試験した。Ａ、ＣＴＬＡ−４ＶＬＤ（Ｓ２）；Ｂ、ＣＴＬＡ−４Ｓｏｍ１（ＰＰ２）；Ｃ、ＣＴＬＡ−４−Ｓｏｍ３（ＰＰ８）；Ｄ、ＣＴＬＡ−４−抗ｌｙｓ（２Ｖ８）；Ｅ、ＣＴＬＡ−４−Ｓｏｍ−ＨＡ２−Ｓｏｍ３（ＺＺ３）。ＣＴＬＡ−４−抗ｌｙｓ構造２Ｖ８のリゾチーム結合特性。固定化Ｓｈブレオマイシン上のＣＴＬＡ−４ＶＬＤファージミドライブラリーのスクリーニング。溶液中のＣＴＬＡ−４ＶＬＤライブラリーのスクリーニング。

本発明は、例えば、ヒトＣＴＬＡ−４分子などの、イムノグロブリン・スーパーファミリーメンバーのＶ様ドメインから得られた新規な可溶性ＶＬＤ結合分子の設計に関する。本発明の好ましい結合分子は、以下の利点：（ｉ）天然ヒトタンパク質の使用により、ヒトの治療に用いる場合に、免疫系応答に対する保護をしばしば必要とする工程である、組み換え分子の連続したヒト化が不要となる；（ｉｉ）ドメインが、上記のように（Ｃ末端部におけるＣｙｓ１２０残基の組み込みにより、二量体分子を生成する）、天然の単量体である；および（ｉｉｉ）構造上の改変により大腸菌発現レベルが向上する、をもたらす。

最初のＣＴＬＡ−４構造決定の公表前に、この分子とＣＤ２８の両方の利用できる配列データおよび変異分析が分析された。これにより、抗体ＣＤＲ１、２および３領域に相当する領域のモデリングまたは推測が許容された。そのような領域が、分子の枠組みに十分な作用をもたらすことなく、変異または置換されやすく、従って正確に折り畳まれた分子の発現を許容すると推測されていた。続いて公表された構造（Ｍｅｔｚｌｅｒら、１９９７）により、リガンド結合部分からのＣＤＲ１の予期しなかった分離と、リガンド結合表面と接触する平らな表面を形成するＣＤＲ３の広範囲な曲がりにもかかわらず、これらの推測が正確であることが示された。

実験の最初の設定において、ヒトＣＴＬＡ−４分子のＶ様ドメインは、ＣＤＲループ構造を、二つの定義したポリペプチドのどちらかと置換して、改変した。二つのポリペプチドは、ヒトソマトスタチン（Ｓｏｍ）とヒトインフルエンザウィルスヘマグルチニンタンパク質（Ｈａ−標識）であった。ソマトスタチン（ＳＲＩＦ：ソマトスタチン遊離阻害因子）は、ループ中の中央１０残基に面したジスルフィド結合を含む１４残基ポリペプチドである。ヒトソマトスタチンは、生体内で生物学的に広範囲に存在し、成長ホルモン分泌の制御などの多くの異なる生理機能を媒介する（Reisne、1995）。ヒトソマトスタチンは、異なる組織特異性とアフィニティーを有する多くの特異的受容体に、結合する（少なくとも五つのサブタイプが存在する）（Schonbrunnら、1995）。これらの結合と活性の態様は、まだ理解に乏しいが、一つの顕著な特徴は、多くのガン細胞株、例えば神経−内分泌系のガンと小肺ガンなどに、ソマトスタチン受容体が高密度に存在することである（Reubi、1997）。非常に不安定なソマスタチンポリペプチドと比較して、分解に耐性であるソマトスタチンの人工アナログが、そのような腫瘍のイメージング用に作製されている。

ヘマグルチニンエピトープ配列は、９残基ＹＰＹＤＶＰＤＹＡからなる。この配列を特異的に認識する、商業的に製造された抗体が、利用できる。エピトープ標識は、タンパク質の構造内に、ランダムに、または方向性に取り込まれた場合、検出できる（Canfieldら、1996）。

ＣＴＬＡ−４Ｖ様ドメインにおける一以上のＣＤＲループ構造を、ソマトスタチンまたはＨＡ−標識で置換することにより、異なる細菌発現系を用い、可溶性単量体未グリコシル化結合分子が生成される。この驚異的な発見により、Ｖ様ドメインが、可溶性単一ドメイン分子の構築用の基の枠組みを提供し、これにより分子の結合特異性が、ＣＤＲループ構造の改変により設計されることができることが示された。

Ｖ様ドメインの基本の枠組み残基は、ラクダ類動物抗体に存在する構造上の特徴に従って、改変することができる。ラクダ重鎖イムノグロブリンは、単一のＶＨドメインのみからなることより、「従来の」抗体構造とは異なる（Hamers-Castermanら、1993）。いくつかの特徴により、これらの抗体は、可溶性と、十分に広い抗原結合表面をディスプレイできないこととの、二つの問題を克服することができる。

最初に、曝された枠組み残基における複数の非従来的な置換（本来の極性に対して、顕著に疎水性）により、疎水性表面が低減する一方で、内部のβシート枠組み構造が維持される（Desmyterら、1996）。さらに、三つのＣＤＲループ内で、いくつかの構造上の特徴が、通常、ＶＬドメインによって提供される抗原結合表面の欠失を補う。ＣＤＲ２ループが、他のＶＨドメインと大きく異ならない一方で、ＣＤＲ−１と−３ループは、長さが非常に不均一である一般的でない構造を採る。例えば、Ｉｇ分子では通常５残基にであるのに対して、Ｈ１ループは２−８残基の範囲で含むことができる。しかしながら、ＣＤＲ３ループは、より大きな変化を示す：報告された１７ラクダ抗体配列において、この領域の長さは、７から２１残基まで変化する（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら、１９９４）。第三に、多くのラクダ科動物のＶＨドメインが、ラクダの場合はＣＤＲ−１と−３を、ラマの場合はＣＤＲ−１と−２を相互に連結するジスルフィド結合を有する（Ｖｕら、１９９７）。この構造上の特徴の機能は、ループ安定性の保持であり、抗原内のポケットへの結合を許容し、表面積を増大する、平らにならないようにより制御されたループ構造を提供する。しかしながら、全てのラクダ科動物抗体が、このジスルフィド結合を有するわけではないことから、これが構造上絶対的に必要なものではないことが示唆される。

これらの前記特徴は、ラクダ科動物のＶドメインが、可溶性分子としてイン・ビボで、様々な標的抗原に対して有効な免疫応答を形成するのに十分に高いアフィニティーで存在できる。これに対して、Ｉｇスーパーファミリーの細胞表面受容体（ＣＤ４およびＣＤ２など）は、Ｖ様結合ドメインを含み、ＣＤＲループ以外の表面特徴を有する同種の受容体に結合するようである。これらＶ様ドメインは、同種の受容体に、非常に低いアフィニティーで結合する。二つの細胞表面が連結し、各々が複数の受容体を含む時に、二つの細胞間の生理的シグナリングは、複数部位の結合親和力によって媒介される。ＣＤ２は、十分に特徴づけられた例である：ＣＤ５８への結合は、ＧＦＣＣ’Ｃ”面（抗体型ＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２またはＣＤＲ−３ループではない）に局在する荷電された極性残基によって生じた小さな静電気相互作用が強く圧縮された形状によってもたらされる。これにより、低アフィニティーであるが、非常に特異的な相互作用を生じる（Bodianら、1994）。

また、本発明は、標的分子に対する新規な結合アフィニティーを有する単一ＶＬＤ分子を生成し、選択する方法に関する。この方法は、イムノグロブリン・スーパーファミリーのメンバーから得られたＶ様ドメインの公知の分子進化法の適用を含む。該方法は、多数の変異したＶ様ドメインをスクリーニングするための、ファージまたはリボソームディスプレイライブラリーの生成を含む。

ファージ内に含まれるＤＮＡによってコードされるＩｇ様タンパク質（ｓｃＦｖ、Ｆａｂ）などのタンパク質をファージが表面上にディスプレイするように、フィラメント状のｆｄ−バクテリオファージ染色体が設計される（Smith、1985;Huseら、1989;McCaffertyら、1990;Hoogenboomら、1991）。タンパク質分子は、Ｆｄバクテリオファージの表面上に、遺伝子III、もしくはあまり一般的でない遺伝子VIIIによってコードされたファージコートタンパク質に共有結合して、ディスプレイされることができる。遺伝子IIIコートタンパク質への抗体遺伝子の挿入により、ファージ毎に３−５組み換えタンパク質分子が、末端に位置して発現する。これに対して、遺伝子VIIIへの抗体遺伝子の挿入により、ファージ粒子毎に約２０００コピーの組み換えタンパク質がディスプレイされる可能性を有するが、これは、単一にディスプレイされたタンパク質のアフィニティーを覆うことができる多価系である。また、Ｆｄバクテリオファージの表面上の機能的Ｉｇ様フラグメントのディスプレイから、大腸菌における可溶性Ｉｇ様フラグメントの分泌に容易に変換できるため、Ｆｄファージミドベクターが用いられる。ファージディスプレイされた遺伝子IIIコートタンパク質のＮ末端との融合組み換えタンパク質が、二つのタンパク質遺伝子間に戦略的に位置する終止コドンによって作製され得る。大腸菌のアンバー抑制遺伝子株において、得られたＩｇドメイン−遺伝子III融合体は、ファージコートにおいてアンカーとなる。

タンパク質のアフィニティーに基づく選択方法は、あらゆる高アフィニティー結合剤、例えば抗体、抗原、受容体およびリガンドなどに適用することができる（例えば、全内容をここに参照として取り込むWinterとMilstein、1991参照）。このように、バクテリオファージ上にディスプレイされる最も高いアフィニティーの結合タンパク質の選択は、タンパク質をコードする遺伝子の回復に結びつけることができる。Ｉｇディスプレイファージは、ビーズに共有結合させた同種の結合対への結合、またはＥＬＩＳＡもしくは固相ラジオイムノアッセイに類似する様式でのプラスチック表面への吸着によって、アフィニティー選択されることができる。あらゆるプラスチック表面のほとんどが、タンパク質抗原を吸着するであろうが、Nunc Immunotubeなどの幾つか商品が、特にこの目的のために考案されている。

リボソームディスプレイ細胞は、細胞不含翻訳系で新規合成され、選択するためにリボソーム表面上にディスプレイさせたポリペプチドを含む（HanesとPluckthun、1997;HeとTaussig、1997）。「細胞不含翻訳系」は、リボソーム、タンパク質の合成に要する可溶性酵素（通常、リボソームと同じ細胞由来）、転移ＲＮＡ、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、リボヌクレオチド三リン酸再生系（例えば、ホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼ）、および外因性ｍＲＮＡによってコードされたタンパク質の合成に要する緩衝塩を含む。ポリペプチドの翻訳は、無傷のポリソーム（すなわち、リボソーム、ｍＲＮＡ分子および翻訳されたポリペプチドが単一の複合体で会合している）を維持する条件下で、行わせることができる。この有効性は、翻訳されたポリペプチドの「リボソームディスプレイ」をもたらす。

選択のために、相当するリボソーム複合体と会合している、翻訳されたポリペプチドは、マトリックス（例えば、Dynabead）に結合している標的分子と混合する。標的分子は、興味のあるあらゆる化合物（またはその一部）、例えばＤＮＡ分子、タンパク質、受容体、細胞表面分子、代謝産物、抗体、ホルモンまたはウィルスであることができる。翻訳されたポリペプチドをディスプレイしているリボソームは、標的分子に結合するであろうし、これらの複合体は選択され、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、該ｍＲＮＡを再度増幅させることができる。

結合分子を改変する幾つかの代替方法が存在するものの、全てのディスプレイ化タンパク質のための一般的な方法は、各結合剤を同種の受容体に対するアフィニティーによってディスプレイライブラリーから選択する様式に従う。これらの剤をコードする遺伝子は、様々なイン・ビボおよびイン・ビトロ変異生成手段のいずれか一つまたは組み合わせによって、改変され、最も高いアフィニティーの結合分子をディスプレイし選択するための新規な遺伝子プールとして構築される。

本発明の性質をより明確に理解されことができるように、それらの好ましい形式を、以下の実施例を参照して説明する。

実施例１
遺伝子の構築とクローニング
ＣＴＬＡ−４ＳＴＭ（ＳＴＭ：ＣＴＬＡ−４の可溶性切断変異体、ＣＴＬＡ−４キメラＶ様ドメインタンパク質を記載するために、ここに用いられる）遺伝子の構築とクローニングを、標準的で、十分に記載された方法（特異的に設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応、スプライスオーバーラップ伸長、制限酵素消化など）によって行った。用いたオリゴヌクレオチドプライマーを、図１−４に示す。

野性型ＳＴＭ構造を、SfiIとNotI制限酵素部位を各々５’と３’末端に組み込んだオリゴヌクレオチドプライマー＃３５５３と＃４３１６を用いて、クローン化ヒトＣＴＬＡ−４ＤＮＡ（図５）から増幅（逆転写されたヒトｃＤＮＡから当業者によって容易に増幅できる）した。これらの末端プライマーは、（ｉ）＃４８５１または＃５４４３を、５’末端にＡｐａＬ１部位を組み込むために用いた；（ｉｉ）＃４４８６を、Ｃｙｓ１２０残基を含むＣ末端を付加するために用いた；（ｉｉｉ）＃５４６７を、５’末端にＥｃｏＲ１部位を組み込むために用いた；および（ｉｖ）特定のセットの伸長プライマーをリボソームディスプレイのために用いた、ことを除く、全てのさらなる構築において用いた。

図１−４に列挙したオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせを用いたスプライスオーバーラップＰＣＲ法を用い、様々なＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２および／またはＣＤＲ−３ループ構造置換体を生成した。以下の実施例においてより詳細に記載する変異体を、表２に列挙する。

ＣＤＲループ構造の無作為抽出した断片を生成するために、同様のスプライスオーバーラップ法を、記述のトリプレットが配列ＮＮｇ／Ｔ（式中、Ｎは、あらゆる四つの可能なヌクレオチド塩基を表す）によってコードされたオリゴヌクレオチドを用いて行った。この組み合わせは、あらゆる可能なアミノ酸残基を網羅する。あるいは、無作為抽出は、アミノ酸のある部分集合に対して偏らせた（例えば、芳香族残基、図３、#5452）。

いくつかの事例において、ＳＴＭ遺伝子の構築のために様々な方法を用い、無作為抽出したオリゴヌクレオチドプライマーを、同様に（相補的制限酵素部位で）改変したＣＴＬＡ−４ＶＬＤの枠組み（例えば、図２、#4254）中に直接クローニングするために、制限酵素部位を組み込むように設計した。

完全な構造を、適切な制限酵素の組み合わせ（例えば、Sfi1、Not1、ApaL1、EcoR1）で切断し、適切な発現ベクターにおける同様の部位にクローニングした。これらのベクターは、以下を含む：（ｉ）可溶性タンパク質を生成するための発現ベクターｐＧＣ（Coiaら、1996）とｐＰＯＷ（Powerら、1992;Korttら、1995）、（ｉｉ）バクテリオファージとファージミドディスプレイのため、完全ＳＴＭ構造を制限酵素SfiIとNotIまたはApaLIとNotIで切断し、ベクターpHFAとpFAB.5c（ファージミド）またはpfd-Tet-DOG（ファージ）にクローニングした。これらのベクターは、バクテリオファージ一粒子当たり、１−２（ファージミド）または３−５（ファージ）コピーで、バクテリオファージの表面において遺伝子３タンパク質融合体として、ＳＴＭをディスプレイすることを許容する（図６）。

全てのＤＮＡ構造物は、制限酵素分析とＤＮＡ配列決定によって確認し、標準的によく理解された方法（ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ウェスタンブロットなど）によって、組み換えタンパク質の発現を試験した。

実施例２
組み換えＳＴＭタンパク質の生成と単離
組み換えタンパク質を、ペリプラズム発現系に対して異なる方法を示すベクターを用いて産生した。これらのベクターは、以下であった；（ｉ）ｐＧＣ：このベクターは、化学的（ＩＰＴＧ）誘導によって、不均一なタンパク質の高レベルでの発現を許容し、リーダー配列によって、ペリプラズムへ標的とされる。続いて、このリーダー配列は、切断されて、成熟タンパク質を生成する。さらに、このベクターは、組み換えタンパク質のアフィニティー精製を許容する二つの枠内８残基の標識配列（ＦＬＡＧ標識）を含む。（ｉｉ）ｐＧＣと同様に、切断可能なリーダー配列と二つの枠内８残基の標識配列（ＦＬＡＧ標識）によって、ペリプラズムへ標的とされるタンパク質の発現を、高レベルで熱誘導できるｐＰＯＷ。

組み換えタンパク質は、十分に確立された方法の二つの変型である以下の方法によって精製した。（ｉ）ベクターｐＧＣにおける細菌クローンを、２ＹＴ培地／３７℃／２００ｒｐｍ／１００ｍｇ／ｍｌアンピシリン、１％グルコース（最終）中で、一晩培養した。１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンと０．１％グルコース（最終）で補充した２ＹＴ培地０．５または２ｌ中に、細菌を、１／１００希釈し、２８℃／２００ｒｐｍで培養した。これらの培養物を、光学密度が０．２−０．４の範囲になるまで培養し、この段階で、それらを１ｍＭのＩＰＴＧ（最終）で誘導した。培養物を、１６時間（一晩）培養し、回収した。細菌は、遠心分離（BeckmanJA-14ローターまたは相当物／６Ｋ／１０分／４℃）で回収し、ペリプラズム画分を、標準的な方法で回収した。簡単には、細菌ペレットを、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ／０．５Ｍショ糖／０．５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）からなるスフェロプラスト形成用緩衝液１／２５倍容量中に再度懸濁し、１／５００倍容量のニワトリ卵白リゾチーム（水中２ｍｇ／ｍｌ）を添加し、１０分間インキュベーションした。上記スフェロプラスト用緩衝液の０．５ｘ溶液を、次いで、元の培養物の１／５倍最終容量になるまで添加し、さらに２０分間インキュベーションを続けた。次いで細胞破片を、遠心分離（BeckmanJA-14ローターまたは相当物／９Ｋ／１５分／４℃）によってペレットとし、ペリプラズム画分を含む上清を回収した。上記全ての操作を４℃で行った。試料を、すみやかに音波処理し、０．４５μニトロセルロース膜で濾過し、速やかに処理、またはアジ化ナトリウム（０．０５％）の存在において４℃で保存した。凍結が必要である場合は、凍結融解を一回のみ許容した。（ｉｉ）ｐＰＯＷにおける細菌クローンを、１００μｇ／ｍｌ（ｗ／ｎ）アンピシリンを含む２ｘＹＴ培地１００ｍｌ中、３０℃で一晩培養した。翌日、培養物を用い、ＯＤ６００ｎｍ＝０．２−０．５になるまで、１００μｇ／ｍｌ（ｗ／ｖ）アンピシリンを含む新鮮な２ｘＹＴ培地９００ｍｌ中に播種し、ＯＤ６００ｎｍ＝４、すなわち後対数期になるまで、３０℃で振盪培養した。組み換えタンパク質の発現を誘導するために、温度を、４２℃まで１時間上昇させ、次いでさらに２０℃まで１時間下降させた。細胞を、遠心分離（BeckmanJA-14／６Ｋｒｐｍ／５分／４℃）によって回収し、細胞ペレットを、１００ｍｌの抽出用緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓｐＨ８．０／０．２ｍｇ／ｍｌ（ｗ／ｖ）リゾチーム／０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０）中に再度懸濁し、４℃で一晩インキュベーションした。試料を、３０秒間音波処理し、細胞破片を、遠心分離（BeckmanJA-14／１４Ｋｒｐｍ／１０分／４℃）によって回収した。「リゾチーム」洗浄液を含む水相を、保持した。次いで、細胞ペレットを、氷冷した水で二回洗浄し、この「浸透性衝撃」洗浄液を保持した。氷冷した水１００ｍｌ中でペレットを再度懸濁させた後、一回目の洗浄を１０分間、二回目の洗浄を一時間、氷上でインキュベーションしながら行った。遠心分離（BeckmanJA-14／１４Ｋｒｐｍ／１０分／４℃）後、水相のｐＨを、１０ｍｌの１０ｘＴＢＳ、ｐＨ８を添加して調整した。「リゾチーム」と「浸透性衝撃」洗浄液は、プールし、可溶性または「ペリプラズム」タンパク質画分とする。ペリプラズム画分は、音波処理し、０．４５μニトロセルロース膜で濾過し、速やかに処理し、またはアジ化ナトリウム（０．０５％）、ＰＭＳＦ（２３μｇ／ｍｌ）およびＥＤＴＡ（５０ｍＭ）の存在において４℃で保存した。

組み換えタンパク質を、スルホン酸ジビニル活性化アガロース(Mini-Leak)−結合化抗ＦＬＡＧ抗体カラムを介したアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。ペリプラズム抽出物を、０．０５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含むＴＢＳ（ｐＨ８）で予め平衡化した１０ｍｌの抗ＦＬＡＧカラムに、直接負荷した。結合タンパク質を、Immunopure Gentle Ag/Ab Elution Buffer(Pierce)で溶出した。次いで、試料を、ＴＢＳ／０．０５％（ｗ／ｖ）アジ化物（ｐＨ８）に対して透析し、限外濾過により３ｋＤａカットオフ膜（ＹＭ３、Ｄｉａｆｌｏ）上に濃縮し、予め調整したSuperose12HRまたはSuperdex200HRカラム（Pharmacia Biotech）を用いたＨＰＬＣにより、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで分析した。単量体、二量体、および三量体に相当する画分を回収し、上記のように濃縮し、分析するまで４℃で保存した。タンパク質濃度は、分光光度計で、Ａ２８０における消光係数を用い、ＣＴＬＡ−４Ｒ細胞外ドメインが１．２７、ＣＴＬＡ−４−Ｓｏｍ１が０．９２、ＣＴＬＡ−４−Ｓｏｍ３が１．１３、ＣＴＬＡ−４−抗Ｌｙｓが１．０５であることを測定した。上記タンパク質の化学的方法の全ては、当該分野における標準的な方法である。精製したタンパク質は、標準的な方法、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動、ウェスタンブロット、ドットブロットなどによって分析した。

バクテリオファージ発現ベクターpHFA、pFAB.5cおよびfd-tet dogにおけるクローニングと発現、および続く組み換えバクテリオファージの精製は、標準的に十分に確率された方法で行った。無作為抽出したＣＴＬＡ−４ＳＴＭのライブラリーのスクリーニングは、標準的に十分に確率された方法で行った（Galanisら、1997）。

実施例３
ソマトスタチンとヘマグルチニンペプチドを組み込んだＣＴＬＡ−４ＳＴＭ
最初に、ＣＴＬＡ−４ＳＴＭのＣＤＲ１またはＣＤＲ３ループ構造を、ソマトスタチンポリペプチドで置換した。この１４残基ポリペプチドは、Ｃｙｓ３とＣｙｓ１４の間の内部ジスルフィド結合によって、構造的に拘束されている（図７）。これにより、抗体において見出されたＣＤＲループに類似した、特にジスルフィド結合によって安定化されているラクダ化動物の抗体において見出された長いＣＤＲに類似した、別個のタンパク質ループが形成された。また、Ｃｙｓ１２０の存在または不在におけるＣＤＲ１の置換の効果、すなわち二量体が生成されるかどうかについて、試験した。これらの実験により、予期しない、驚異的な結果が得られた。ＣＤＲ−１もしくは−３のどちらかを、ソマトスタチンで置換することにより、単量体タンパク質の生成が、有意に増大した。これは、図８において、ＣＤＲ−３ループ構造をソマトスタチンで置換することにより、二量体／三量体タンパク質種に対する単量体の割合が有意に増大したことを示す。

さらなる実験において、ＣＤＲ−１と−３ループ構造の両方を、ソマトスタチンで同時に置換することによって、高レベルでの単量体タンパク質の生成がもたらされた。これにより、広範囲のループ構造の置換が、ＣＴＬＡ−４骨格に適合し得ることが示された。ソマトスタチンループの一つが、構造的に、ＣＴＬＡ−４ＶＬＤのＣＤＲ−３ループ構造に類似した様式で、分子面に対して水平に位置できる。

ＣＤＲループ構造−置換戦略のさらなる拡大において、ＣＤＲ−２に相当する領域を、８残基ヘマグルチニン（ＨＡ）標識配列で置換した。この領域は、一部、分子の長さに亘るＣ”β鎖を包囲するため、この部位において構造的に拘束されたソマトスタチンループの使用は、不適切であると見なされた。抗ＨＡ抗体を用いることによって、ＨＡ標識は、このＣＴＬＡ−４ＳＴＭ上に検出することができる。ゲル濾過実験により、単量体からＣＤＲ−２単一置換体が安定でなかったことを示す凝集した種までの範囲のタンパク質種の存在が示された（図９、１０）。

三つ全てのＣＤＲループ構造を二つのソマトスタチンと一つのＨＡエピトープでそれぞれ同時に置換することによって、ＣＴＬＡ−４ＣＤＲループ構造を、他のポリペプチドと置換することができ、単量体、可溶性ＳＴＭを生成できる決定的な原則が、証明された。このＳＴＭは、正確に折り畳まれた単量体タンパク質をゲル濾過クロマトグラフィーで生成した（図９、１０）。

様々なＳＴＭのＣＴＬＡ−４ＶＬＤ内のＣＤＲループ構造置換の位置を、図９に示す。アフィニティー精製したＳＴＭタンパク質のＨＰＬＣ推移を、図１０に示す。同一の結果が、二つの異なるタンパク質発現系：タンパク質の発現が化学的に誘導されるｐＧＣと、タンパク質の発現が温度で誘導されるｐＰＯＷ（実施例２参照）、において生成したタンパク質で得られた（図１１）。

ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ウェスタンブロット分析により、ＣＴＬＡ−４ＳＴＭが、低減し、予期した分子量まで泳動され、グリコシル化されていないことが示された。単離した単量体ＳＴＭタンパク質の試験により、凍結融解０，１または２回後に、それらが単量体型を維持していることが示された（図１２）。

構造特異的抗ＣＴＬＡ−４抗体により、ＣＤＲ１と−３ループ構造の両方が置換されたＳＴＭが認識されたことから、ＣＴＬＡ−４ＳＴＭは、正しい構造を維持していた。興味深いことに、この抗体は、改変されたタンパク質種に観察された強い反応に対して、野性型単量体と、（ＣＤＲ１置換された）二量体をほとんど認識しなかった。これにより、野性型ＳＴＭにおいて、ある種の局部的な相互作用により、抗体結合部分が吸蔵され、この相互作用が、二つのＣＴＬＡ−４分子が互いに連結される時の結果に類似することが示される（推測的には、抗体に対しての接近が阻害される）。

実施例４
ラクダ抗リゾチーム抗体に基づくＣＴＬＡ−４ＳＴＭ
免疫したラクダから単離したラクダＶ_HＨ抗体ｃＡｂ−Ｌｙｓ３は、ニワトリ卵白リゾチームの活性部位のへこみ内に特異的に結合する。同様に機能するＣＴＬＡ−４ＳＴＭの性能を例示するために、ＣＴＬＡ−４ＶＬＤＳＴＭの三つのＣＤＲループ構造を、ｃＡｂ−Ｌｙｓ３からの三つのＣＤＲループ構造で置換した。置換体の位置と配列を、図９に示す。ｐＧＣまたはｐＰＯＷに基づく発現系のどちらかにおけるこのＳＴＭ（２Ｖ８）の発現により、単量体可溶性タンパク質を顕著に生成した（図１０、１１）。このＣＴＬＡ−４ＳＴＭのタンパク質可溶性は、天然のＣＴＬＡ−４ＶＬＤよりも優れている。ＥＬＩＳＡ分析により、（ｐＧＣ生成）精製単量体タンパク質が、非特異的抗原と比較して、およびＣＤＲ１ループ構造（ＰＰ２）内がソマトスタチンで置換されたＣＴＬＡ−４ＳＴＭと比較して、雌鶏リゾチームに特異的に結合することが示された（図１３Ａ）。ＢＩＡコアによるリアルタイム結合分析により、リゾチームが、固定化抗リゾチームＳＴＭに特異的に結合することが示された（図１３Ｂ）。このように、ＣＴＬＡ−４ＳＴＭ枠組みが、正確に折り畳まれ、リゾチーム抗原を結合できる様式で、ＣＤＲループ構造を呈している。ＣＴＬＡ−４ＶＬＤ抗リゾチームの発現をさらに増強するために、コード化配列を、スプライスオーバーラップＰＣＲによって、大腸菌の発現に優先的なコドンを含むように、調節した。

実施例５
ヒト抗メラノーマ抗体に基づくＣＴＬＡ−４ＳＴＭ
ヒト由来抗メラノーマ抗体Ｖ８６は、特異的にヒトメラノーマ細胞に結合する。この抗体は、結合アフィニティーが、完全にＶ_H領域内にあり、同種のＶ_Lの付加により結合効率が低下し、ＶＬドメインの小断片と共に発現させたＶＨドメインが、高い可溶性を有する点において独特である（ＣａｉとＧａｒｅｎ、１９９７）。ＣＴＬＡ−４ＶＬＤＣＤＲループ構造の置換により、可溶性が増強し、得られたＳＴＭを細菌発現系において生成させることができることを、さらに例示するために、ＣＴＬＡ−４の三つのＣＤＲループ構造を、Ｖ８６からの三つのＣＤＲループ領域で置換した。置換の位置と配列を、図９に示す。ｐＧＣにおけるこのＳＴＭ（３Ｅ４）の再度の発現により、ＣＴＬＡ−４ＶＬＤと比較して、可溶性が増強された単量体可溶性タンパク質が顕著に生成された（図１０）。

実施例６
結合分子ライブラリーとしてのＣＴＬＡ−４の構築
新規な結合特異性を有するＣＴＬＡ−４ＳＴＭを選択するために、ＶＬＤライブラリーを、無作為抽出したＣＤＲ１とＣＤＲ３ループ構造を含むように作製した。ライブラリーを構築するために用いたオリゴヌクレオチドプライマーを、表１に列挙する。ライブラリー構築のために用いたオリゴヌクレオチドの組み合わせを、表３に示す。

得られたライブラリーをコードするＤＮＡ構造物を、ｆｄ−ファージミドに基づくライブラリーを作製するためのベクターpHFAまたはpFAB.5cにクローニングし、ｆｄ−ファージに基づくライブラリーを作製するためのpfd-Tet-Dogにクローニングした（実施例１と２参照）。ライブラリー１は、ベクターｐＨＦＡにクローニングし、２．１ｘ１０⁷個の独立したクローンからなる。ライブラリー３は、ベクターpHFA（５．７ｘ１０⁵個の独立したクローン）とpfd-Tet-Dog（２．２ｘ１０⁴個の独立したクローン）にクローニングした。ライブラリー２は、ベクターｐＦＡＢ．５ｃ（１．７ｘ１０⁷個の独立したクローン）と、pfd-Tet-Dog（１．６ｘ１０⁵個の独立したクローン）にクローニングした。ライブラリーを構築する形質転換コロニーの総数を計数し、ＣＴＬＡ−４ＳＴＭ特異的ＤＮＡの存在と割合をアッセイすることによって、多くの独立したクローンを測定した。

ライブラリー２の場合、全ライブラリーの多様性を、代表的なクローンの配列決定によって試験した。これらの結果を表４に示す。予期された挿入サイズと配列の多様性が、観察された。高い割合のＵＡＧ終止コドンが、オリゴヌクレオチド無作為抽出法と一致して、観察された。これらのコドンにより、ＣＴＬＡ−４ＳＴＭ遺伝子３タンパク質融合体の未成熟の終止が生じることを防ぐために、この終止コドンをグルタミン酸残基の挿入によって抑制する、大腸菌株Ｔｇ−１とＪＭ１０９に、ライブラリを形質転換した。システイン残基は、オリゴヌクレオチドの設計から予想されたように多数存在し、ＣＤＲループ構造内および中のジルフィド結合を形成できる位置に存在した。

遺伝子３タンパク質融合体としてＣＴＬＡ−４ＳＴＭをディスプレイするバクテリオファージ粒子を、大腸菌細胞から、標準的な方法でレスキューし、以下の実施例において記載された多くの抗原に対して作動させた。

実施例７
ＣＴＬＡ−４ＳＴＭライブラリー：固型支持物上の抗原に対する選択
構造内にへこみまたはすき間を有するタンパク質に分類される四つの異なった抗原を、スクリーニング用に選択した。抗体より小さなサイズで、伸長されたＣＤＲループ構造（特にＣＤＲ−３）を有するＣＴＬＡ−４ＶＬＤＳＴＭは、これらのへこみ領域に接近できると予想された。選択された抗原は、（ｉ）ニワトリ卵白リゾチーム（EC3.2.1.17）；（ｉｉ）ウシカルボニックアンヒドラーゼ（EC4.2.1.1）；（ｉｉｉ）真菌類のａ−アミラーゼ（EC3.2.1.1）；および（ｉｖ）ストレプトアロテイチウス・ヒンドゥスタニス（Streptoalloteichus hindustanis）耐性タンパク質ＳｈＢｌｅ（Gatignolら、1988）、であった。プレートに結合させる場合、コート用緩衝液中の抗原（０．１ＭＮａＨＣＯ₃ｐＨ８．５中１ｍｇ／ｍｌ）を、CostarELISAプレートに標準的な方法で結合させた。レスキューしたファージとファージミド由来ライブラリーを、選択されるべきファージの低親和結合を許容するために、標準の洗浄回数よりも低い洗浄回数を用いた以外は、標準的に良く知られた方法によって、作動させた。図１４に、ＳｈＢｌｅに対して選択したライブラリーの力価を示す。四巡後、回復したバクテリオファージ力価は、対照よりも高かった。当業者にとって、これは、特定の結合部分の選択を表し、これら選択されたＣＴＬＡ−４ＶＬＤＳＴＭを、ｐＧＣまたはｐＰＯＷなどの発現ベクターを用いて生成させること（実施例２に記載されたように）は、通常の方法である。

実施例８
ＣＴＬＡ−４ＳＴＭライブラリー：溶液中の抗原に対する選択
溶液中で選択する場合、抗原ウシカルボニックアンヒドラーゼと真菌類のａ−アミラ−ゼを、ビオチン化し、ストレプトアビジンでコートした磁性ビーズによる捕捉を用いて、溶液中で選択した。これらの実験を通して、洗浄は、一定した、毎巡、２または５回行った。回収したバクテリオファージの溶出後の力価を、図１５に示す。四巡後、回収されたバクテリオファージの力価は、対照よりも高かった。当業者にとって、これは特異的結合部分の選択を表し、次いで、（実施例２に記載したように）ｐＧＣまたはｐＰＯＷなどの発現ベクターを用い、これらの選択されたＣＴＬＡ−４ＶＬＤＳＴＭを生成することが、通常の方法である。

実施例９
ＣＴＬＡ−４ライブラリー：代替ディスプレイおよび選択系における選択
抗原結合ＳＴＭのさらなる成熟と選択を許容するために、ＣＴＬＡ−４ＳＴＭライブラリーを、プラスミドに結紮し、下流Ｃ末端スペーサーポリペプチド（重鎖定常ドメイン）を付加した。上流の転写および翻訳開始配列は、特異的オリゴヌクレオチド（図１−４）を用いたＰＣＲ増幅によって付加した。このＰＣＲＤＮＡは、ＲＮＡを生成するための鋳型として用い、HeとTaussig(1997)に記載されたように、結合化細胞不含翻訳系におけるリボソーム上にライブラリーを翻訳させてディスプレイさせた。結合を証明するために、ＣＴＬＡ−４ＳＴＭリボソーム複合体を、肝臓Ｂ表面抗原（ｈｂｓａ）、グリコホリン（ｇｌｙＡ）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）被覆化ダイナビーズ（ｄｙｎａｂｅａｄｓ）上に、作動させた。ｈｂｓａ、ｇｌｙＡおよびＢＳＡに結合したリボソーム複合体からのＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲによって回収した。次いで、これらのＲＴ−ＰＣＲ産物を、（実施例２において記載したように）ＣＴＬＡ−４ＳＴＭの生成を許容するｐＧＣまたはｐＰＯＷなどの発現ベクターにクローニングすることは、通常の方法である。（この実施例におけるように）リボソーム複合体としてのＣＴＬＡ−４ＳＴＭのライブラリーをディスプレイし、生細胞（真核細胞または原核細胞のバックグラウンドから得られ、細菌、酵母、哺乳動物もしくは昆虫細胞を含むことができる）の表面上にディスプレイすることを許容する本発明に、多くの変型および／または改変がなされることができることは、当業者によって、認識されるであろう。

実施例１０
ＣＴＬＡ−４ＳＴＭ：アフィニティー成熟とＣＤＲ２変異
抗原結合ＳＴＭのさらなる成熟と選択と、無作為抽出されたＣＤＲ−１、−２および−３ライブラリーの構築を許容するために、ＣＤＲ−２無作為抽出オリゴヌクレオチドプライマーを作製した（図１−４）。これらのプライマーの変異は、ラマ単一ドメイン抗体において見出されたものに類似したＣＤＲ−２−ＣＤＲ−３ジスルフィド結合を有するＳＴＭの構築を許容する保存されたシステイン残基を含む。スプライスオーバーラップＰＣＲは、無作為抽出した三つ全てのＣＤＲループ構造を含むライブラリーの作製を許容した。

広く記載された本発明の精神または範囲を逸脱することなく、特定の実施態様において示された本発明に、多くの変型および／または改変がなされることができることは、当業者によって認識されるであろう。従って、本実施態様は、全ての点では、制限ではなく例示としてみなされるべきである。
［参考文献］

Claims

少なくとも一つの単量体非抗体リガンドＶ様ドメイン（ＶＬＤ）を含む、標的分子に対するアフィニティーを有する結合部分であって、前記少なくとも一つの単量体非抗体ＶＬＤが、
（ｉ）ＣＤＲループ構造のサイズが、未改変ＶＬＤ中の相当するループ構造と比較したときに、変化している；および／または
（ｉｉ）改変または置換により、一以上のＣＤＲループ構造内もしくは間に、ジスルフィド結合の形成を生じる
ように、ＶＬＤの少なくとも一つのＣＤＲループ構造またはその一部が改変または置換されていることを特徴とする、結合部分。
ＣＤＲループ構造のサイズが増大している、請求項１に記載の結合部分。
ＣＤＲループ構造のサイズが、少なくとも二つのアミノ酸残基によって増大する、請求項２に記載の結合部分。
ＣＤＲループ構造のサイズが、少なくとも六つのアミノ酸残基によって増大する、請求項２に記載の結合部分。
ＣＤＲループ構造のサイズが、少なくとも九つのアミノ酸残基によって増大する、請求項２に記載の結合部分。
ＣＤＲループ構造のサイズが減少している、請求項１に記載の結合部分。
単量体非抗体リガンドが、Ｔ細胞受容体ではない、請求項１から６のいずれか一項に記載の結合部分。
単量体非抗体リガンドが、Ｔ細胞表面タンパク質である、請求項１から６のいずれか一項に記載の結合部分。
単量体非抗体リガンドが、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ７９ａ、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４８、ＣＤ５４ＩＣＡＭ、ＣＤ５８、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２８およびＩＣＯＳからなる群より選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載の結合部分。
改変ＶＬＤの結合アフィニティーが、未改変ＶＬＤと比較した場合に変化している、請求項１から９のいずれか一項に記載の結合部分。
一以上のＣＤＲループ構造が、非抗体ポリペプチド由来の結合決定基で置換されている、請求項１から１０のいずれか一項に記載の結合部分。
結合決定基が、ソマトスタチンまたはヘマグルチニン由来である、請求項１１に記載の結合部分。
一以上のＣＤＲループ構造が、抗体由来の一以上のＣＤＲループ構造で置換されている、請求項１から１０のいずれか一項に記載の結合部分。
抗体が、ラット、マウス、ヒト、ラクダ、ラマまたはサメ由来である、請求項１３に記載の結合部分。
診断剤に結合した、請求項１から１４のいずれか一項に記載の結合部分。
請求項１から１５のいずれか一項に記載の結合部分または多価試薬をコードするポリヌクレオチド。
請求項１６に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
請求項１７に記載のベクターで形質転換されている宿主細胞。