JP2010518814A - デンプン脱分岐活性を有するポリペプチド - Google Patents

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Abstract

触媒デンプン脱分岐ドメイン及びデンプン結合ドメインを含むポリペプチドを開示する。デンプン結合ドメインポリペプチドは、デンプン結合ドメインを伴わない、同じ量の同じ触媒ユニットと比較して、生デンプン分解において改善された機能を有する。

Description

本発明は、デンプン脱分岐活性を有するポリペプチド、及びデンプン加水分解、特に生デンプン加水分解におけるこれらの使用に関する。
デンプンは多種多様な植物中で見られる天然の貯蔵炭水化物である。デンプン含有作物は世界中のほとんどの場所において重要な農作物である。デンプンを含む最も重要な作物としては、トウモロコシ、小麦、稲、大麦及びジャガイモが挙げられる。
デンプンの酵素分解は、醸造、グルコース又は高果糖シロップの生産、及び飲料用又は燃料用エタノールの生産といった多くの工業処理の一部である。
その天然状態において、デンプンは多くの酵素による分解に対して極めて耐性であり、このためデンプンの工業的な酵素分解は、伝統的に、デンプンをゼラチン化する加熱工程により開始され、これにより多くの酵素に対してより感受性を与える。ゼラチン化は高度な分解を満足するために一般的に必要とされるが、粘度を極めて増加させ、これは技術的な困難性を与える恐れにつながる。
エンド型酵素、例えばα−アミラーゼ;エキソ型酵素、例えばβ−アミラーゼ及びグルコアミラーゼ;ならびに脱分岐酵素、例えばプルラナーゼ及びイソアミラーゼの組み合わせはデンプンの酵素分解のために使用される。
WO 98/16633は、デンプン分解酵素、炭水化物結合ドメイン(CBD)及びリンカーを含むハイブリッドを記載する。プルラナーゼは、デンプン分解酵素の一例として言及されている。唯一例示されているハイブリッドは、α−アミラーゼ、CBD及びリンカーから成る。
EP 1200552 B1は、デンプン結合ドメイン(SBD)を有するハイブリッドとして、デンプン変換タンパク質、例えばプルラナーゼの植物中の発現を開示する。該ハイブリッドは、これらが植物中でデンプン粒に限局し、これにより変換されたデンプンが産生されるという利点を有する。
Van Bueren et al. Biochemistry 2004, 43: 15633-15642 は、超好熱真正細菌サーモトガ・マリチマ(Thermotoga maritima)から単離されたプルラナーゼ活性を有する4つのモジュールタンパク質を記載する。この4つのモジュールの1つは、α−(1−4)結合グルカンに最も高い親和性を有する、新しい種類の炭水化物結合ドメインとして同定された。
N. Sauvonnet et al. 1995. J. Bact. 177 (18): 5238-5246 には、細菌プルラナーゼに関する研究が開示されており、ここでより小さい挿入は許容されるが、より大きなタンパク質のN−又はC−末端に対する融合は、一般に有効に分泌できないことが発見されている。
WO 2005/096804 には、植物における発現のためのポリヌクレオチドが開示されている。該ポリヌクレオチドは、第1のポリペプチドと第2のペプチドを含む融合ポリペプチドをコードできる。第1のポリペプチドはプルラナーゼ活性を有しており、そして第2のペプチドはデンプン結合ドメイン由来のN−末端シグナル配列であってよい。
本発明者らは、デンプン結合ドメイン(SBD)をデンプン脱分岐ドメインに加えることにより、より優れた生デンプン加水分解を得ることが可能となることを見出した。
したがって、本発明は、触媒デンプン脱分岐ドメイン、デンプン結合ドメイン(SBD)、及び任意に、これらのドメインを連結するリンカーを含む融合ポリペプチド(ハイブリッドポリペプチド)を供する。該触媒デンプン脱分岐ドメインは、好ましくはプルラナーゼである。
本発明はまた、本発明の融合ポリペプチドの調製を供する。本発明はさらに、デンプン分解、特に生デンプン分解における触媒デンプン脱分岐ドメイン及びデンプン結合ドメインを含むポリペプチドの使用を供する。
図1は、プラスミドpKK223−3を示す。詳細は実施例に供される。 図2は、プラスミドpNBT51を示す。 図3は、プラスミドpNBT52を示す。 図4は、プラスミドpNBT53を示す。 図5は、プラスミドpNBT54を示す。 図6は、プラスミドpNBT35を示す。 図7は、プラスミドpNBT30を示す。 図8は、プラスミドpNBT31を示す。 図9は、プラスミドpNBT36を示す。 図10は、プラスミドpRB165を示す。 図11は、プラスミドpMRT135を示す。 図12は、プラスミドpWWi006を示す。 図13は、プラスミドpMDT105を示す。 図14は、プラスミドpMDT114を示す。 図15は、プラスミドpMBin115を示す。 図16は、プラスミドpRB212を示す。
定義
本発明において、ポリペプチドのドメインは、ポリペプチドのリマインダーの構造的及び/又は機能的な相違であるポリペプチドの一部を意味することを意図する。例えば、ポリペプチドはポリペプチドの触媒特性の原因である触媒ドメインを有することが知られており、その一方で第2ドメインは特定の構造成分に結合するための原因となりうる。天然のポリペプチドは1つだけのドメインから成るか、あるいは2つ以上のドメインを含みうる。典型的には、各々のドメインは、独立にポリペプチドのリマインダーの折りたたみ及び機能化を可能にする。
触媒ドメインは酵素の一部であってよく、あるいは完全な酵素であってもよい。
デンプン脱分岐酵素は、デンプンの脱分岐を触媒することができる酵素を意味する。
デンプンは、α−1,4結合を介して連結されるグルコシル残基から構成されるポリマーである。一般に、デンプンは、アミロース、α−1,4結合を介して連結されるグルコシル残基から成るポリマー、及びα−1,6−結合を介してほかのα−1,4結合グルコシル鎖に連結するα−1,4結合グルコシル鎖の分岐とのα−1,4結合を介して連結されるグルコシル残基から成るアミロペクチンから構成される。アミロペクチンを攻撃することができる脱分岐酵素は、イソアミラーゼ(E.C.3.2.1.68)及びプルラナーゼ(E.C.3.2.1.41)を含む。
イソアミラーゼは、アミロペクチンとβ−限界デキストリンにおけるα−1,6−D−グルコシド分岐結合を加水分解し、そしてプルランを攻撃するためのイソアミラーゼの不能力により、及びα−限界デキストリンにおける制限された作用により、プルラナーゼと区別することができる。アミロペクチンに対するアミラーゼの割合、該アミロペクチンにおける分岐の頻度、及び該分岐の平均の鎖長は、デンプン源に有意に依存して変化するが、これは本発明において考慮するほど重要ではない。したがって、デンプン脱分岐酵素は、アミロペクチンのα−1,6結合の分解を触媒し、これによりアミロペクチン構造から分岐を除去することができるポリペプチドである。
本発明において、「デンプン脱分岐酵素」の用語又は文法的に同等の表現は、2つのグルコース単位を接続するα−1,6−グルコース結合を分解することができる触媒活性を有する酵素又はタンパク質ドメインを意味することが意図される。したがって、該用語はプルラナーゼ又はイソアミラーゼとして記載される酵素に制限されない。
デンプン脱分岐酵素は、天然に見られるタンパク質、天然において見られるタンパク質の断片であってよく、あるいはこのようなタンパク質の変異体であってもよい。
変異体の用語は、少なくとも1つの改変、例えば置換、挿入又は欠失による天然タンパク質に直接又は間接的に由来するタンパク質であると理解される。タンパク質の変異体は、分子生物学における当業者に周知の技術を使用して調製することができ、確立されたハンドブック、例えば J. Sambrook, E. F. Fritsch, 及び T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York に記載されている。
触媒デンプン脱分岐ドメインは、デンプン脱分岐酵素の一部を意味することが意図され、この部分は完全な酵素の触媒活性に関与する。したがって、触媒デンプン脱分岐ドメインは、デンプン脱分岐酵素の全部又は一部であってよい。
炭水化物結合ドメインは、通常、非共有結合により、炭水化物と結合することができるタンパク質構造である。炭水化物結合ドメインは、多糖類、セルロース、キシラン又はデンプンを結合するドメインを含む。いくつかの炭水化物結合ドメインは文献中に記載されており、ファミリーに分類されている。CBMファミリーの分類については Boraston et al. (2004) Biochem. J. 382: 769-781 及び http://afrnb.cnrs- mrs.fr/CAZY/inclex.html を参照のこと。
デンプン結合ドメインは、デンプン、特に生デンプンに対する特異性を有する炭水化物結合ドメインである。デンプン結合ドメインは、CBM−20、CBM−21、CBM−25、CBM−26、CBM−34、CBM−41及びCBM−45の少なくとも1つの炭水化物結合ドメインファミリーに見られる。
リンカーは、2つのドメインの活性を阻害することなく、触媒デンプン脱分岐ドメインを炭水化物結合ドメインから分離するタンパク質部分である。
本明細書において、デンプン分解は、デンプン形成デキストリンとグルコースの酵素的な脱重合として理解される。デンプン分解は、通常、α−1,4及びα1,6グルコシド結合を加水分解することができる酵素、例えばα−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ及びCGTアーゼの組み合わせを使用して行われる。通常、デンプン分解は、少なくとも1つのエンド型アミラーゼ、例えばα−アミラーゼと、少なくとも1つのエキソ型アミラーゼ、例えばβ−アミラーゼ又はグルコアミラーゼ、ならびに任意的な脱分岐酵素、例えばプルラナーゼの組み合わせを使用して行われる。伝統的には、デンプン分解は、デンプン含有物質と水の混合物を加熱し、その後酵素を添加し、そして分解が完了するか、所望の程度に達するまで該混合物を適当な温度に保つことにより行われる。デンプン含有物質と水の混合物の最初の加熱により、デンプンはゼラチン化し、混合物の粘度を有意に増加させる。
本明細書において、生デンプンは、非ゼラチン化デンプンとして理解される。生デンプン分解は、デンプンのゼラチン化及びその後の実質的な粘度の増加を伴わずに行われるデンプン分解プロセスである。
発明の詳細な説明
本発明は、デンプン脱分岐触媒ドメイン及びデンプン結合ドメイン、ならびに任意的にこれらのドメインを接続するリンカー配列を含む融合ポリペプチドを供する。
デンプン脱分岐触媒ドメイン
デンプン脱分岐触媒ドメインは、原則として、デンプンの脱分岐を触媒することが可能ないずれかのドメインであってよい。デンプン脱分岐触媒ドメインは、好ましくはプルラナーゼに由来する。
脱分岐酵素は、主には細菌であるが、多様な生物、例えばバチルス属及びパイロコッカス属;ならびに植物、例えば大麦及び稲に由来することが記載されている。本発明においては、脱分岐酵素は細菌に由来し、例えばバチルス・アシドプルリチカス(Bacillus acidopullulyticus)、バチルス・デラミフィカンス(B. deramificans)、クレブシエラ・ニューモニア(Klebsiella pneumonia)、クレブシエラ・アエロゲネス(K. aerogenes)又はパイロコッカス属(Pyrococcus sp.)に由来するプルラナーゼ;あるいはロドサームス・マリヌス(Rhodothermus marinus)、シュードモナス・アミロデラモサ(Pseudomonas amyloderamosa)、シュードモナス属SMP1(Pseudomonas sp. SMP1)、フラボバクテリウム・オドラツム(Flavobacterium odoratum)、スルフォロブス・アシドカルダリウス(Sulfolobus acidocaldarius)又はスルフォロブス・ソルファタリクス(S. solfataricus)に由来するイソアミラーゼが好ましい。
好ましくは、本発明の脱分岐酵素は、細菌、好ましくはバチルス属に由来するプルラナーゼである。
好ましい実施形態において、脱分岐酵素は、B・アシドプルリチカス(B. acidopullulyticus)に由来するプルラナーゼ、特には配列番号14の11〜837残基から成るpulB/Cハイブリッド(融合)である。これは、コード領域内のBam HI部位のpulB遺伝子上流部分 (Kelly et al., 1994 FEMS Microbiol. Letters, 1 15: 97-106を参照のこと;参考として組み込まれている)及びコード領域内のBam HI部位のB・アシドプルリチカス(B. acidopullulyticus)のpulC遺伝子下流部分から成る。
脱分岐酵素は、天然の酵素であってよく、あるいは脱分岐活性を依然として有する天然の酵素の変異体であってもよい。これに関して、変異体は、天然のポリペプチドと少なくとも1つのアミノ酸残基が異なるポリペプチドとして理解される。少なくとも1つが異なるアミノ酸は、1又は複数のアミノ酸残基の置換、挿入又は欠失、あるいはこれらの組み合わせの中から選択されてよい。このような変異体を調製するための方法は当業者に周知である。
ある実施形態において、脱分岐酵素は、WO 00/01796 又はWO 01/51620 に開示されるような変異体であり、これらは共に参考として本明細書に組み込まれている。
デンプン結合ドメイン(SBD)
デンプン結合ドメイン(SBD)は、原則としてデンプンと結合することができるいずれかのタンパク質ドメインであってよい。本明細書において、SBDは、好ましくは非ゼラチン化デンプンとして理解される生デンプンに結合することが可能である。
SBDは、炭水化物結合モジュールの認識されたグループに属してよく、あるいはほかの既知の炭水化物結合モジュールに類似しない独特の構造を有してもよい。いくつかの炭水化物結合モジュール(CBM)は、文献において記載されており、また配列的及び構造的な類似性に基づくファミリーに分類されている。デンプン結合ドメインは、CBM−20、CBM−21、CBM−25、CBM−26、CBM−34、CBM−41及びCBM−45の炭水化物結合ドメインファミリーに見られる。好ましくは、本発明のSBDは、CBM−20ファミリーに属する。
CBM−20ファミリーに属するSBDは、古細菌(archaebacteria)に由来する酵素中、例えばパイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)DSM 3638(Uniprot ace. No. Q8U1 U7)に由来するPF1108タンパク質中、;真正細菌(eubacteria)に由来する酵素中、例えばアノキシバチルス・コンタミナンス(Anoxybacillus contaminans)(バチルス・フラボサーマス(Bacillus flavothermus)として従来知られていた)に由来するα−アミラーゼタンパク質、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)に由来するα−アミラーゼ、及びバチルス・サーキュランスAM7(Bacillus circulans AM7)に由来するα−アミラーゼ中;並びに真核生物(eukaryotes)に由来する酵素、例えばアスペルギルス・ニゲル(Aspergillus niger)に由来するグルコアミラーゼ中に見られる。
本発明のCBM−20ファミリーに属するSBDは、好ましくはバチルス(Bacillus)、ゲオバチルス(Geobacillus)、アノキシバチルス(Anoxybacillus)、パイロコッカス(Pyrococcus)又はアスペルギルス(Aspergillus)属に属する微生物に由来する。
CBM−20ファミリーに属するSBDは、配列番号15、及び配列番号14の838〜936残基として示されている。前者は、サーモアナエロバクター属(Thermoanaerobacter sp)のCGTアーゼに由来し(Joergensen et al (1997), Biotechnol. Lett. 19:1027-1031)、そして後者は、アノキシバチルス・コンタミナンス(Anoxybacillus contaminans)のα−アミラーゼに由来する (WO 2006/066596)。
SBDは、天然のSBDであってよく、あるいはデンプン結合活性を有する天然のSBDの変異体であってもよい。これに関して、変異体は、天然のポリペプチドと少なくとも1つのアミノ酸残基が異なるポリペプチドとして理解される。少なくとも1つが異なるアミノ酸は、1又は複数のアミノ酸残基の置換、挿入又は欠失、あるいはこれらの組み合わせの中から選択されてよい。タンパク質、例えばSBDの変異体を調製するための方法は、当業者に周知である。
リンカー
リンカーの重要な目的は、融合体のほかの部分によって融合体の1つのドメインの機能のいずれかの立体障害を防止するために、SBDから触媒ドメインを分離することである。リンカーは融合体の構築ストラテジーをもたらす1又は数個のアミノ酸から成ってよく、あるいはリンカーはより長いペプチドであってもよい。原則として、リンカーの長さに上限はないが、実質的な理由により、リンカーは約100アミノ酸残基よりも長くないことが好ましい。したがって、本発明の好ましいリンカーは1〜100のアミノ酸、好ましくは2〜50のアミノ酸、より好ましくは2〜25のアミノ酸、そして最も好ましくは5〜20のアミノ酸である。
リンカーの正確な配列は重要ではないが、リンカーの配列は、リンカーがいずれかの剛構造(rigid structure)を導入しないように選択することが好ましい。リンカーのアミノ酸組成は、好ましくは、親水性残基リッチであるように選択される。また、プロリン残基は、リンカーのいずれかの二次構造を分裂させる能力を有することから有利となりうる。
好ましい実施形態において、リンカーはプロリンリッチリンカーである。プロリンリッチリンカーは、少なくとも20%の残基、好ましくは25〜25%の残基がプロリン残基であるリンカーを意味することを意図する。
本発明のプロリンリッチリンカーの好ましい例は、−PEPTPEPN−(配列番号1)である。
特に好ましい実施形態において、本発明の融合体は配列番号14の成熟部分から成る。これは、コード領域内のBamHI部位のpulB遺伝子上流部分(Kelly et al., 上記を参照のこと)及びコード領域内のBamHI部位のB・アシドプルリチカス(B. acidopullulyticus)のpulC遺伝子下流の部分から成るpulB/C遺伝子ハイブリッド(融合)の発現により作成されるpulB/Cハイブリッド(融合)、A・コンタミナンス(A. contaminans)α−アミラーゼ、又はサーモアナエロバクター属(Thermoanaerobacter sp.)CGTアーゼ由来のSBD、及びリンカー−PEPTPEPN−(配列番号1)を含む。
本発明の融合体は、本発明の融合体をコードする核酸を提供し、該核酸を、特に選択された宿主細胞に適合する適当なプロモーター及び適当な制御配列を有する適当な発現ベクターに挿入し、宿主細胞を該発現ベクターで形質転換し、該形質転換した宿主細胞を、融合体の発現を促進する適当な成長培地中で培養し、その後、該融合体を回収することにより慣習的に産生される。組み換えポリペプチド、例えば本発明の融合体を発現するための技術、発現ベクター、宿主細胞等は、当業界において簡単に入手できるものであり、そして例えば Sambrook et al. op. cit に記載される周知の方法を使用して本発明の融合体を産生するための適当な条件を選択することは、平均的な当業者の範疇にある。
組み換え発現ベクター
ほかの観点において、本発明は本発明の融合体をコードする核酸を含む組み換え発現ベクターに関する。
本発明の組み換え発現ベクターは、組み換えDNA手順において慣習的行うことができるいずれかの発現ベクターであってよく、ベクターの選択は、導入される宿主細胞にしばしば依存する。したがって、ベクターは、自発的に複製ベクター、すなわち、染色体外部として存在し、染色体複製と独立する複製、例えばプラスミドとして存在するベクターであってよい。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入される場合、宿主細胞ゲノムと、部分的又は全体的に一体化し、そして一体化された染色体と一緒に複製されるものあってよい。発現ベクターはプラスミド又はウイルスDNAであってよく、あるいはその両方の要素を含有してもよい。
本発明の発現ベクターにおいて、融合をコードするDNA配列は、好ましくはDNAの転写に必要な追加的なセグメント、特に1又は複数のプロモーター及びターミネーター領域と作動可能的に連結される。「作動可能的に連結される」の用語は、該セグメントが、これらの意図される目的に合わせて機能するように配置されたセグメントを意味する。例えば転写は、プロモーターにおいて開始され、酵素をコードするDNA配列を介して進行する。
プロモーターは、選択された宿主細胞において転写活性を示すいずれかのDNA配列であってよく、そして該宿主細胞と同種又は異種のタンパク質をコードする遺伝子に由来してよい。
細菌宿主細胞において使用するための適当なプロモーターの例は、バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)α−アミラーゼ遺伝子、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)α−アミラーゼ遺伝子、バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)アルカリプロテアーゼ遺伝子、又はバチルス・プミルス(Bacillus pumilus)キシロシダーゼ遺伝子のプロモーター、あるいはファージラムダPR又はPLプロモーター、あるいは大腸菌(E. coli)lac、trp、もしくはtacプロモーターを含む。
また、本発明の酵素をコードするDNA配列は、必要な場合には、適当なターミネーターと任意に連結することができる。
本発明の組み換え発現ベクターは、さらに問題の宿主細胞中でベクターを複製することを可能にするDNA配列を含んでよい。
本発明の発現ベクターはまた、選択マーカー、例えば宿主細胞における欠陥を補完する遺伝子、又は例えばカナマイシン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、テトラサイクリン、スペクチノマイシンなどの抗生物質に対する耐性、あるいは重金属又は除草剤に対する耐性をコードする遺伝子含んでよい。
該酵素を宿主細胞の分泌経路に向けるために、分泌シグナル配列(リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られる)を組み替えベクター中に供することができる。分泌シグナル配列は正しいリーディング・フレームにおいて酵素をコードするDNA配列に連結される。分泌シグナル配列は、一般に該酵素をコードするDNA配列に対して5’に位置している。該分泌シグナル配列は該酵素に通常関連してよく、あるいは、ほかの分泌されたタンパク質をコードする遺伝子に由来してよい。
本発明の酵素をコードするDNA配列、プロモーター、及び任意的なターミネーター及び/又は分泌シグナル配列をそれぞれ連結するため、又は適当なPCR増幅スキームによりこれらの配列を構築するため、そしてこれらを複製や一体化に必要な情報を含有する適当なベクターに導入するために使用される手順は、当業界に周知である(例えばSambrook et al., op.cit.を参照のこと)。
生デンプン分解
さらなる観点において、本発明は、触媒デンプン脱分岐ドメイン及びデンプン結合ドメインを含むポリペプチドを使用する、生デンプンを分解するための方法に関する。本発明者らは、驚くべきことに、デンプン結合ドメインを伴わずに同じ触媒デンプン脱分岐ドメインを含むポリペプチドを使用する場合と比較して、触媒デンプン脱分岐ドメイン及びデンプン結合ドメインを含むポリペプチドを使用することによって、より有効な生デンプン分解を達成できることを見出した。
触媒デンプン脱分岐ドメイン及びデンプン結合ドメインを含むポリペプチドは、天然の酵素であってよく、あるいは本発明の融合体であってもよい。好ましくは、触媒デンプン脱分岐ドメイン及びデンプン結合ドメインを含むポリペプチドは、本発明の融合体であり、よりさらに好ましくは、触媒プルラナーゼドメイン及びデンプン結合ドメインを含む融合ポリペプチドである。
典型的には、生デンプンを分解するための方法は以下の工程を含む:
a)生デンプンと水の混合物を提供するステップ;
b)触媒デンプン脱分岐ドメインとデンプン結合ドメインを含む少なくとも1つのポリペプチド、少なくとも1つのエンド型アミラーゼ、及び少なくとも1つのエキソ型アミラーゼを添加するステップ;
c)該混合物を、所望の程度の分解を得るために適当な温度及び十分な時間においてインキュベートするステップ。
工程a)において、上記混合物は、PH調節化合物、無機塩等をさらに含んでよい。生デンプンは、いずれかの生デンプンであってもよいが、好ましくは該デンプンは、穀類デンプン、例えばトウモロコシ、小麦、大麦、ソルガム等に由来するデンプンである。
触媒デンプン脱分岐ドメイン及びデンプン結合ドメインを含むポリペプチドは、天然のポリペプチドであってよく、あるいは本発明の融合体であってもよい。
エンド型アミラーゼは、好ましくは微生物源、特には糸状菌又は酵母菌、又は細菌に由来するα−アミラーゼから選択される。多数のα−アミラーゼが当業界において知られており、そして本発明の生デンプンを分解する方法に適当なα−アミラーゼを選択することは当業者の能力の範囲内である。適当なα−アミラーゼの例としては、アクレモニウム(Acremonium)、アルカリゲネス(Alcaligenes)種、特にアルカリゲネス・レイタス(Alcaligenes latus)、アスペルギルス(Aspergillus)種、特にアルペルギルス・カワチイ(Aspergillus kawachii)及びアスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)、バチルス(Bacillus)種、特にバチルスバチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス・ポリミクサ(Bacillus polymyxa)、バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)及びバチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)、デスルフロコッカス(Desulfurococcus)種、特にデスルフロコッカス・ムコサス(Desulfurococcus mucosus)、フェルビドバクテリウム(Fervidobacterium)種、ラクトバチルス(Lactobacillus)種、ミクロコッカス(Micrococcus)種、シュードモナス(Pseudomonas)種、特にシュードモナス・アミロデラモサ(Pseudomonas amyloderamosa)、パイロコッカス(Pyrococcus)種、特にパイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)及びパイロコッカス・ウォエセイ(Pyrococcus woesei)、ピロジクチウム(Pyrodictium)種、スルホロブス(Sulfolobus)種、スタフィロサーマス(Staphylothermus)種、又はサーモコッカス属(Thermococcus sp.)種に由来するα−アミラーゼを挙げることができる。
エキソ型アミラーゼは、好ましくはグルコアミラーゼ、例えばアスペルギルス・ニゲル(Aspergillus niger)、アスペルギルス・アワモリ(A. awamori)、アスペルギルス・カワチイ(A. kawachii)、タラロマイセス・エメルソニイ(Talaromyces emersonii)、トラメテス・シングラタ(Trametes cingulata)又はアセリア・ロフシイ(Athelia rolfsii)に由来するグルコアミラーゼである。
α−アミラーゼ及び/又はグルコアミラーゼは(a)天然の酵素であってよく、あるいは周知の組み替えDNA技術方法を使用して改変した変異酵素であってもよい。
好ましい実施形態において、生デンプン分解は、燃料エタノールを調製するための過程の一部である。
本発明者により意図されるほかの使用は、洗剤組成物、デンプン液化もしくは糖化、又は織物湯通し(textile desizing)における本発明の融合体の使用を含む。
本発明は、実証的な目的のために供される以下の例によりさらに説明されるが、制限することを意図するものではない。
実験
培地
バチルス株をTBABプレート(Difco Tryptose Blood Agar Base (BD Diagnostics, Franklin Lakes, NJ, USA)又はLB寒天プレート(10g/lのトリプトン、5g/lの酵母抽出物、5g/lのNaCl、15g/lのバクト寒天)において、あるいはVY液体培地(25g/lの仔牛抽出液(veal infusion)(BD Diagnostics, Franklin Lakes, NJ, USA)、5g/lの酵母抽出物)中で成長させた。必要な場合には、濾過滅菌抗生物質を、120μg/mlのスペクチノマイシン;6μg/mlのネオマイシン;5μg/mlのクロラムフェニコールの濃度において、オートクレーブ後培地に添加した。
大腸菌(E. coli)株を、100μg/mlのアンピシリン(濾過滅菌、オートクレーブ後添加)を補完したLB液体培地(10g/lのトリプトン、5g/lの酵母抽出物、5g/lのNaCl)又はLB寒天(LB培地及び15g/lのバクト寒天)又は2X YT寒天(16g/lのトリプトン、10g/lの酵母抽出物、5g/lのNaCl、15g/lのバクト寒天)において成長させた。
バチルス宿主株
バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)168Δ4は、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)型株168(BGSC 1A1 , Bacillus Genetic Stock Center, Columbus, OH)に由来し、spollAC、aprE、nprE、及びamyE遺伝子における欠失を有する。これらの4遺伝子の欠失は、基本的にバチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)A164Δ5について記載されるとおりに行い、これは米国特許第5,891,701号に詳しく記載される。
バチルス・サブチリス(B. subtilis)A164Δ10は、小さな細胞外プロテアーゼ遺伝子wprA、bpr、vpr、mpr、及びeprにおける欠失を伴うA164Δ5株である(Connelly et al., 2004, J. Bacteriol. 186: 4159- 4167)。
プラスミド及びゲノムDNA単離
プラスミドDNAは、QIAprep 8 Miniprep Kit(QIAGEN, Valencia, CA, USA)を使用して、あるいはBioRobot 9600(QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA)を使用して、あるいはQIAGEN Plasmid Midi Kit(QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA)を使用して、各々の製造業者によって提供された手順に従い、大腸菌(E. coli)形質転換細胞から単離した。
ゲノムDNAは、Pitcher et al., 1989, Lett. Appl. Microbiol. 8: 151-156の手順に従い、バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)宿主から単離した。
大腸菌(E. coli)及びB・スブチリス(B. subtilis)のための形質転換方法
B・スブチリス株は、AnagnostopolousとSpizizen の手順(J. Bacteriol. 81 : 741-746)に従い形質転換した。大腸菌SURE細胞(Stratagene Corporation, La JoIIa, CA, USA)、DH5α細胞(GibcoBRL, Gaithersburg, MD, USA)、及びOne Shot(登録商標)TOP10細胞(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)、XL1−Blue細胞(Stratagene Corporation, La JoIIa, CA, USA)は、各々の製造業者により提供された手順に従い形質転換した。
PCR
PCRは、上述した製造業者の取扱説明書に従い行った。増幅反応物(50μl)は、1×PCRバッファーII(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)、3.0mMのMgCl2、200μMの各々のdNTP、0.5μMの各々のプライマー、0.25ユニットのTaq DNAポリメラーゼ、及び約50〜100ngのプラスミドDNA又は約200ngのゲノムDNAから構成された。反応は、95℃において2分間を1サイクル;95℃、55℃及び72℃において各々2分間を30サイクル;そして72℃において3分間を1サイクルでプログラムされた RoboCycler(登録商標)40 Temperature Cycler(Stratagene, La JoIIa, CA, USA)において行った。
DNA配列決定
DNA配列決定は、Applied Biosystems Model 3130X Genetic Analyzer(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を使用して、染色ターミネーター・ケミストリー(Giesecke et al., 1992, Journal of Virol. Methods 38: 47-60)を用いて行った。
プルラン・アズール (pullulan-azure) 及びAZCL−プルランオーバーレイ
寒天プレート上のバチルス株のプルラナーゼ活性を、プルラン・アズール(Sigma, St. Louis, MO, USA)又はAZCL−プルラン(Megazymes International Ireland Ltd., Bray, Ireland)を含有する寒天オーバーレイを使用して検出した。0.5%プルラン・アズール又は0.1%AZCL−プルランを含有する100mMの酢酸ナトリウム(pH5.0)中の1%寒天の層を、寒天プレート上のコロニー上に注ぎ、その後50℃でインキュベートした。プルラナーゼ活性は、コロニーを取り囲むプルラン・アズールにおける透明帯の形成により検出した。
酵素活性:
グルコアミラーゼ活性(AGU)
ノボ・グルコアミラーゼユニット(Novo Glucoamylase Unit)(AGU)は、37℃、pH4.3において1分あたり1マイクロモルのマルトースを加水分解する酵素の量として定義した。
該活性は、Boehringer Mannheim, 124036からのGlucose GOD-Perid キットの使用後に改変した方法(AEL-SM-0131, Novozymesからの要求により入手できる)によりAGU/mlとして測定する。標準:AMG標準、バッチ7−1195、195AGU/ml。375μlの基質(50mMの酢酸ナトリウム中1%マルトース、pH4.3)を37℃で5分間インキュベートする。酢酸ナトリウム中に希釈した25μlの酵素を添加する。反応は、100μlの0.25M NaOHを添加することにより10分後に終了する。20μlを96ウェルマイクロタイタープレートに移し、そして200μlのGODペリド溶液(124036, Boehringer Mannheim)を添加する。室温で30分後、650nmにおいて吸光度を測定し、そして活性をAMG標準からAGU/mlにおいて計算する。この分析方法をより詳細に説明するフォルダ(AEL−SM−0131)は、Novozymes A/S, Denmarkからの要求により入手でき、これは参考により本明細書に組み込まれている。
プルラナーゼ活性(ニュー・プルラナーゼ・ユニット・ノボ(New Pullulanase Unit Novo)、NPUN)
プルラナーゼ活性は、プルラン基質に対して測定することができる。プルランは、1,6−α−結合により結合されるマルトトリオシル単位(maltotriosyl unit)から本質的に成る直線状のD−グルコースポリマーである。エンド型プルラナーゼは、任意に1,6−α−結合を加水分解し、マルトトリオース、63−α−マルトトリオシル−マルトトリオース、63−α−(63−α−マルトトリオシル−マルトトリオシル)−マルトトリオースを遊離する。
1ニュー・プルラナーゼ・ユニット・ノボ(NPUN)は、エンド型プルラナーゼ活性の単位であり、Novozymes A/S Promozyme D 標準に対して測定される。標準条件は40℃、pH4.5で30分間の反応時間であり、基質として0.7%レッド・プルラン(Red-pullulan)を伴う。赤色の基質の分解生成物の量は、510nmにおいて写真分光学的に測定され、これは試料中のエンド型プルラナーゼ活性に比例する。この分析方法をより詳細に説明するフォルダ(EB−SM.0420.02/01)は、Novozymes A/S, Denmarkからの要求により入手でき、これは参考により本明細書に組み込まれている。
標準条件下において、1NPUNは、1分あたりに2.86マイクロモルのグルコースに相当する還元力を伴う還元炭水化物を遊離させる酵素の量と同等である。
媒体
Figure 2010518814
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J6:ツベルミン(Tubermine)ジャガイモタンパク質加水分解物
10Lにするために、12Lの発酵槽に5Lの水道水、0.75kgのツベルミンを添加する。
水を添加して8Lにし、完全に懸濁するように攪拌する(500rpm)。
55℃まで加熱を開始する。
55℃になったら、4N NaOHを添加し、pH7.00にする。
pH=6.20において、粘度が増加する。
pH=7.00において、72.9gのアルカラーゼ(Alcalase)2.4を添加する。
4 HR加水分解
水で9Lまで満たす。
5HRの合計において、300rpmまで攪拌を下げる。
滴定を止める。
10Lまで水を添加する。
例1:pNBT36の構築
pNBT36は、クロラムフェニコール選択を用いて2つのamy E断片を介する二重相同組み換えにより、バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)染色体のamy E座位において発現カセットの挿入を許容する、バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)のamy E遺伝子の断片を有するpDG268MCSΔPamyQ(sc)/PcryIIIA/cryIIIAstab/SAVである。pNBT36の構築を以下に説明する。
プラスミドpNBT51。プラスミドpNBT10(pDG268MCS−PrcryIIIA/cryIIIAstab/SAV;米国特許第6,255,076号)を製造業者の取扱説明書に従い大腸菌宿主DH5αから単離し、そしてCla I及びSca Iで消化した。Cla I末端は、クレノウ断片(Klenow fragment)(New England Biolabs, Inc., Beverly, MA, USA)及びdNTPを使用して、製造業者の取扱説明書に従い平滑末端化した。消化したプラスミドを、TBE(50mM Trisベース−50mM ホウ酸−1mM EDTA二ナトリウム)緩衝液を用いて0.8%アガロース電気泳動により分析し、そして約6615bpのベクター断片を、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA)を使用して精製した。プラスミドpOS4301(Bacillus Genetic Stock Center, Ohio State University, Columbus, OH, USA)をSal I及びSca Iで消化し、そして上述のとおり、クレノウ断片及びdNTPを使用して、Sal I末端を平滑末端化した。消化したプラスミドをTBE緩衝液を用いて0.8%アガロース電気泳動により分析し、そして大腸菌rrnB転写ターミネーターを有する約840bpの断片をQIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製した。同じ840bpのSal I/Sca I断片は、ベクターpKK223−3(GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)から単離することができた(図1)。pNBT10ベクター断片とターミネーターを有する断片を、製造業者の取扱説明書に従い、T4DNAリガーゼ(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)により結合させ、そして大腸菌DH5αを製造業者の取扱説明書に従い、該連結物で形質転換し、37℃における2X YTアンピシリンプレート上でアンピシリン耐性を選択する。生じたプラスミドをpNBT51(pDG268−PcryiiiA/cryIIIAstab/SAVΔ)と命名した(図2)。
プラスミドpNBT52。プラスミドpNBT51(pDG268−PcryiiiA/cryIIIAstab/SAVΔ)をSfi Iで消化し、そしてその末端を、T4 ポリメラーゼ(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)及び25μMの各々のdNTPと共に11℃で20分間インキュベートすることにより平滑末端化し、その後、75℃で10分間インキュベートすることにより該ポリメラーゼを熱不活性化した。その後平滑末端化プラスミドをDra IIIで消化し、そしてTBE緩衝液を用いて0.8%アガロース電気泳動により分析し、そして約5920bpのベクター断片をQIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製した。プラスミドpNBT20(pDG268MCS−PamyQ(sc)/SAV;米国特許第6,255,076号)をDra III及びEcl 136IIで消化し、そしてショートコンセンサスamyQプロモーター(PamyQ(sc))を有する約1641bpの断片をQIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製した。上述のとおり、pNBT51ベクター断片とPamyQ(sc)断片を結合させ、そして上述のとおり、大腸菌DH5αを該連結物で形質転換し、37℃における2X YTアンピシリンプレート上でアンピシリン耐性を選択する。プラスミドDNAをいくつかの形質転換体から単離し、Sph Iで消化し、そしてTBE緩衝液を用いて0.8%アガロース電気泳動により分析した。約4873bp及び2688bpの期待された制限酵素断片を有する1つのプラスミドをpNBT52(pDG268−PamyQ(sc)/PcryIIIA/cryIIIAstab/SAVΔ)と命名した(図3)。
プラスミドpNBT53。プラスミドpNBT6(pHP13amp−SAV;米国特許第6,255,076号)をSfi I及びSac Iで消化し、そしてTBE緩衝液を用いて0.8%アガロース電気泳動により分析し、そして約6438bpのベクター断片をQIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製した。プラスミドpNBT52(pDG268−PamyQ(sc)/PcryIIIA/cryIIIAstab/SAVΔ)をSfi I及びSac Iで消化し、そしてTBE緩衝液を用いて0.8%アガロース電気泳動により分析し、そしてPamyQ(sc)/PcryIIIA/cryIIIAstabタンデムプロモーターを有する約727bpの断片をQIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製した。上述のとおり、pNBT6ベクター断片とPamyQ(sc)/PcryIIIA/cryIIIAstab断片を結合し、そして上述のとおり、大腸菌DH5α細胞を該連結物で形質転換し、37℃における2X YTアンピシリンプレート上でアンピシリン耐性を選択する。いくつかの形質転換体からDNAプラスミドを単離し、Pvu IIで消化し、そしてTBE緩衝液を用いて0.8%アガロース電気泳動により分析した。約4903bp、1320bp、及び942bpの期待された制限酵素断片を有する1つのプラスミドを、pNBT53(pHP13amp−PamyQ(sc)/PcryIIIAstab/SAV)と命名した(図4)。
プラスミドpNBT54。プラスミドpNBT1(pDG268MCS;米国特許第6,255,076号)をSfi I及びBam HIで消化し、そしてTBE緩衝液を用いて0.8%アガロース電気泳動により分析し、そして約6040bpのベクター断片をQIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製した。プラスミドpNBT53(pHP13amp−PamyQ(sc)/cryIIIA/cryIIIAstab/SAV)をSfi I及びBam HIで消化し、そしてTBE緩衝液を用いて0.8%アガロース電気泳動により分析し、そしてPamyQ(sc)/cryIIIA/cryIIIAstab/SAVカセットを有する約1953bpの断片をQIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製した。上述のとおり、pNBT1ベクター断片とPamyQ(sc)/PcryIIIA/cryIIIAstab/SAV断片を結合させ、そして上述のとおり、大腸菌DH5α細胞を該連結物で形質転換し、37℃における2X YTアンピシリンプレート上でアンピシリン耐性を選択する。いくつかの形質転換体からプラスミドDNAを単離し、Sfi I及びBam HIで同時に消化し、その後TBE緩衝液を用いて0.8%アガロース電気泳動を使用して分析した。約6040bp及び1953bpの期待された制限酵素断片を有する1つのプラスミドを、pNBT54(pDG268MCS−PamyQ(sc)/PcryIIIA/cryIIIAstab/SAV)と命名した(図5)。
プラスミドpNBT35。プラスミドpNBT2(pDG268MCSΔ−PrcryIIIA/cryIIIAstab/SAV;米国特許第6,255,076号)をSfi I及びBam HIで消化し、そしてTBE緩衝液を用いて0.8%アガロース電気泳動により分析し、そして約5394bpのベクター断片をQIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製した。プラスミドpNBT54(pDG268MCS−PamyQ(sc)/PcryIIIA/cryIIIAstab/SAV)をSfi I及びBam HIで消化し、そしてTBE緩衝液を用いて0.8%アガロース電気泳動により分析し、そしてPamyQ(sc)/PcryIIIA/cryIIIAstab/SAVカセットを有する約1953bpの断片をQIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製した。上述のとおり、pNBT2ベクター断片とPamyQ(sc)/PcryIIIA/cryIIIAstab/SAV断片を結合させ、そして上述のとおり、大腸菌DH5α細胞を該連結物で形質転換し、37℃における2X YTアンピシリンプレート上でアンピシリン耐性を選択する。いくつかの形質転換体からプラスミドDNAを単離し、Nco Iで消化し、そしてTBE緩衝液を用いて0.8%アガロース電気泳動を使用して分析した。約5492bp及び1855bpの期待された制限酵素断片を有する1つのプラスミドをpNBT35(pDG268MCSΔ−PamyQ(sc)/PcryIIIA/cryIIIAstab/SAV)と命名した(図6)。
プラスミドpNBT30。プラスミドpNBT30は、amyL遺伝子プロモーターのamyL4199変異体のPCRクローンを含有するように構築した(米国特許第6,100,063号)。バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)SJ1904ゲノムDNAを単離した。amyL4199プロモーター(Pamyl4199)遺伝子を、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)SJ1904ゲノムDNAから、プライマー950872及び991151(配列番号2及び3)を使用して、PCRにより増幅した。プライマー950872は、Sfi I制限部位を含み、そしてプライマー99115は、Sac I制限部位及びPamyl4199の変異ヌクレオチドを含んでいる。
このPCRは上記の製造業者の推奨に従い行った。これにより生じた約625bpのPCR産物は、TOPO TA Cloning (登録商標) Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を使用してベクターpCR2.1中でクローニングし、そして製造業者の取扱説明書に従い、One Shot (登録商標) TOP10 Chemically Competent 大腸菌細胞に形質転換した。プラスミドDNAをいくつかの形質転換体から単離し、そしてEco RIによる消化、その後のTBE緩衝液を用いた0.8%アガロース電気泳動により、クローン化PCR断片の存在を分析した。約3913bp及び640bpの期待された制限酵素断片を有する1つのプラスミドを、pNBT30(pCR2.1−amyL4199)と命名した(図7)。クローン化PCR断片のDNA配列はDNA配列決定により確認した。
プラスミドpNBT31。プラスミドpNBT3(pDG268MCSΔneo−PrcryIIIA/cryIIIAstab/SAV;米国特許第6,255,076号)をSfi I及びSac Iで消化し、そしてTBE緩衝液を用いて0.8%アガロース電気泳動により分析し、そして約7931bpのベクター断片をQIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製した。プラスミドpNBT30(pCR2.1−amyL4199)をSfi I及びSac Iで消化し、TBE緩衝液を用いて0.8%アガロース電気泳動により分析し、そしてPamyl4199を有する約612bpの断片をQIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製した。上述のとおり、pNBT3断片とPamyl4199断片を結合させ、そして製造業者の取扱説明書に従い、大腸菌XL1−Blue細胞を該連結物で形質転換し、37℃における2X YTアンピシリンプレート上でアンピシリン耐性を選択する。いくつかの形質転換体からプラスミドDNAを単離し、Nco Iで消化し、そしてTBE緩衝液を用いて0.8%アガロース電気泳動を使用して分析した。約6802bp及び1741bpの期待された制限酵素断片を有する1つのプラスミドをpNBT31(pDG268MCSΔneo−PamyL4199/PrcryIIIA/cryIIIAstab/SAV)と命名した(図8)。
プラスミドpNBT36。プラスミドpNBT35(pDG268MCSΔ−PamyQ(sc)/PcryIIIA/cryIIIAstab/SAV)をSfi Iで消化し、そして上述のとおり、T4 DNAポリメラーゼ及びdNTPを使用して、その末端を平滑末端化した。その後、この平滑末端化プラスミドをDra IIIで消化し、そしてTBE緩衝液を用いて0.8%アガロース電気泳動により分析した。約5808bpのベクター断片をQIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製した。プラスミドpNBT31(pDG268MCSΔneo−PamyL4199/PrcryIIIA/cryIIIAstab/SAV)をDra III及びEcl 136IIで消化し、TBE緩衝液を用いて0.8%アガロース電気泳動により分析し、そしてPamyL4199を有する約2150bpの断片をQIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製した。上述のとおり、pNBT35ベクター断片とPamyL4199断片を結合させ、そして製造業者の取扱説明書に従い、大腸菌SURE細胞を該連結物で形質転換し、37℃における2X YTアンピシリンプレート上でアンピシリン耐性を選択する。いくつかの形質転換体からプラスミドDNAを単離し、Nco Iで消化し、そしてTBE緩衝液を用いて0.8%アガロース電気泳動を使用して分析した。約5492bp及び2466bpの期待された制限酵素断片を有する1つのプラスミドを、pNBT36(pDG268MCSΔ−PamyL4199/PamyQ(sc)/PcryIIIA/cryIIIAstab/SAV)と命名した(図9)。以下において、プロモーターPamyL4199/PamyQ(sc)/PcryIIIA/cryIIIAstabはトリプル・タンデムプロモーターと称する。
例2:pRB165の構築
プラスミドpRB165は、上述のとり、スペクチノマイシン耐性遺伝子のPCRクローンを含有するように構築された、pRB162(2つのpel断片を介する二重相同組換えによりバチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)染色体のpel座位において発現カセットの挿入を許容するバチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)ペクチン酸リアーゼ(pel)遺伝子の断片を有するプラスミド(pDG268MCS−PamyQ(sc)、米国出願公報第20030175902号)である。
プラスミドpCR2.1−spc。スペクチノマイシン耐性遺伝子を、プラスミドpSJ5218(米国特許第6,808,896号)DNAから、プライマー994079及び994103(配列番号4及び5)を使用して、PCRにより増幅した。プライマー994079はSal I制限部位を含み、そしてプライマー994103はSfi I制限部位を含む。
上記PCRは上述のとおり製造業者の推奨に従い行った。PCRは、上述のとおり、RoboCycler (登録商標) 40 Temperature Cycler において行った。
生じた約1165bpのPCR産物は、TOPO TA Cloning (登録商標) Kitを使用してベクターpCR2.1中でクローニングし、そして製造業者の取扱説明書に従い、One Shot (登録商標) TOP10 Chemically Competent 大腸菌細胞に形質転換した。プラスミドDNAをいくつかの形質転換体から単離し、そしてEco RIによる消化、その後のTBE緩衝液を用いた0.8%アガロース電気泳動により、クローン化PCR断片の存在を分析した。約3913bp及び1183bpの期待された制限酵素断片を有する1つのプラスミドをpCR2.1−spcと命名した。スペクチノマイシン遺伝子のDNA配列はDNA配列決定により確認した。
プラスミドpRB165。プラスミドpRB162(pel3’及びpel5’を有するpDG268MCS−PamyQ(sc))をSfi I及びSal Iで消化し、TBE緩衝液を用いて0.8%アガロース電気泳動により分析し、そして約4541bpのベクター断片をQIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製した。プラスミドpCR2.1/spcをSfi I及びSal Iで消化し、そしてspc遺伝子を有する約1153bpの断片をQIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製した。上述のとおり、pRB162断片とspc遺伝子断片を結合させ、そして製造業者の取扱説明書に従い、大腸菌SURE細胞を該連結物で形質転換し、37℃における2X YTアンピシリンプレート上でアンピシリン耐性を選択する。いくつかの形質転換体からプラスミドDNAを単離し、Bam HIで消化し、そしてTBE緩衝液を用いて0.8%アガロース電気泳動を使用して分析した。約1329bp及び4365bpの期待された制限酵素断片を有する1つのプラスミドを、pRB165(pel3’及びpel5’を有するpDG268MCS−PamyQ(sc))と命名した(図10)。
例3:pMRT135の構築
プラスミドpMRT135。プラスミドpNBT36(pDG268Δ−PamyL4199/PamyQ(sc)/PcryIIIA/cryIIIAstab/SAV)をSfi I及びSac Iで消化し、そしてトリプル・タンデムプロモーターを有する約1337bpの断片をQIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製した。プラスミドpRB165(pel3’、pel5’及びspcを有するpDG268Δneo−PamyQ(sc))をSfi I及びSac Iで消化し、TBE緩衝液を用いて0.8%アガロース電気泳動により分析し、そして約5591bpのベクター断片をQIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製した。上述のとおり、pRB165ベクター断片とトリプル・タンデムプロモーター断片を結合させ、そして製造業者の取扱説明書に従い、大腸菌SURE細胞を該連結物で形質転換し、37℃における2X YTアンピシリンプレート上でアンピシリン耐性を選択する。いくつかの形質転換体からプラスミドDNAを単離し、Sfi I及びSac Iで消化し、そしてTBE緩衝液を用いて0.8%アガロース電気泳動を使用して分析した。約5591bp及び1337bpの期待された制限酵素断片を有する1つのプラスミドをpMRT135(pel3’、pel5’、及びspcを有するpDG268Δneo−トリプル・タンデムプロモーター)と命名した(図11)。
例4:pMDT105の構築
プラスミドpMDT114。プラスミドpMDT114(図14)は、pMRT075の約5358bpのSac I/Not Iベクター断片(米国特許出願公報第20050221446号)、pMDT105約2622bpのSac I/Mlu I断片(aprHリボソーム結合部位及びpulB/Cコード領域を有する)、及びpWWi006の約70bpのMluI/NotI断片(aprH転写ターミネーターを有する)から成る。プラスミドspMDT105及びpWWi006の構築を以下に説明する。
プラスミドpWWi006。pWWi006は、pNBT18(pDG268MCSΔneo−cryIIIAstab/SAV;米国特許第5,955,310号)のBam HI部位を消去することにより構築した。プラスミドpNBT18をBam HIで消化し、そして製造業者の取扱説明書に従いT4 DNAポリメラーゼを使用して平滑末端化した。その後pNBT18ベクター断片を、製造業者の取扱説明書に従い、T4 DNAリガーゼを使用して自己結合させ、そして製造業者の取扱説明書に従い、大腸菌DH5αを該連結物で形質転換し、37℃における2X YTアンピシリンプレート上でアンピシリン耐性を選択する。生じたプラスミドをpWWi006と命名した(図12)。
プラスミドpMDT105。プラスミドpMDT105は、pCR2.1ベクター中に挿入されたaprHリボソーム結合部位及びpulB/Cコード領域を含み、そして以下のとおり構築された。
バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)PL2545は、染色体的に組み込まれたpulB/C遺伝子ハイブリド(融合体)のコピーを含有する。pulB/C遺伝子は、コード領域内のBam HI部位のバチルス・アシドプルリチカス(Bacillus acidopullulyticus)294−16(Kellyら、上記)の上流のpulB遺伝子の部分、及びコード領域内のBam HI部位のバチルス・アシドプルリチカス(Bacillus acidopullulyticus)246−49下流のpulC遺伝子の部分を含む。
pulB/Cリボソーム結合部位及びコード領域を含む約2624bpの断片は、プライマー998542及び998543(配列番号6及び7)を使用して、バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)PL2545のゲノムDNAからPCRにより増幅した。プライマー998542はSac I制限部位及びバチルス・クラウジイ(Bacillus clausii)アルカリ性プロテアーゼ遺伝子aprHのリボソーム結合部位を含み、そしてpulBの天然GTG開始コドンをATGコドンに変換する。プライマー998543はMlu I制限部位を含む。
これにより生じた約2624bpのPCR産物は、TOPO TA Cloning (登録商標) KitpCR2.1中でクローニングし、そして製造業者の取扱説明書に従い、One Shot (登録商標) TOP10 Chemically Competent 大腸菌細胞に形質転換した。いくつかの形質転換体由来のプラスミドDNAを精製し、そしてクローン化したPCR断片のDNA配列をDNA配列決定により決定した。Taq DNAポリメラーゼによる組み込みエラーのために、配列決定した各々のプラスミドはpulB/Cについて期待された配列に対して少なくとも1つの配列相違(sequence discrepancy)を有した。pulB/C内に1つのヌクレオチド相違を有するプラスミドをpMDT103と命名した。この相違はpulB遺伝子の断片を使用して以下のとおり修正した。
pulBリボソーム結合部位及びコード領域を含む約2624bpの断片を、上述のプライマー998542及び998543を使用して、バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)DN1400(Kellyら、上記)のゲノムDNAからPCRにより増幅した。
上記PCRは、上述のとおり、製造業者の取扱説明書に従い行った。
これにより生じた約2624bpのPCR産物は、TOPO TA Cloning (登録商標) KitpCR2.1中でクローニングし、そして製造業者の取扱説明書に従い、One Shot (登録商標) TOP10 Chemically Competent 大腸菌細胞に形質転換した。いくつかの形質転換体由来のプラスミドDNAを精製し、そしてEco RIで消化し、その後TBE緩衝液を用いる0.8%アガロース電気泳動により、クローン化したPCR断片の存在について試験した。約3913bp及び2642bpのEco RI断片を有する1つのプラスミドをpMDT102と命名した。
プラスミドpMDT102をBbr PI及びNsi Iで消化し、そしてTBE緩衝液を用いて0.8%アガロース電気泳動により分析し、そして約4915bpのベクター断片を QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGENInc., Valencia, CA, USA)を使用して精製した。プラスミドpMDT103をBbr PI及びNsi Iで消化し、そしてTBE緩衝液を用いて0.8%アガロース電気泳動により分析し、そしてpulB/Cコード領域の下流部分を有する約1640bpbの断片を、QIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製した。上述のとおり、pMDT102ベクター断片とpulB/C断片を結合させ、そして製造業者の取扱説明書に従い、大腸菌XL1−Blue細胞を該連結物で形質転換し、37℃における2X YTアンピシリンプレート上でアンピシリン耐性を選択する。いくつかの形質転換体からプラスミドDNAを単離し、BbrPI及びNsiIで消化し、そしてTBE緩衝液を用いて0.8%アガロース電気泳動を使用して分析した。約4915bp及び1640bpの期待された制限酵素断片を有する1つのプラスミドをpMDT105と命名した(図13)。
例5:pMBin115の構築
プラスミドpMBin115。プラスミドpMDT114をSac I及びNot Iで消化し、TBE緩衝液を用いて0.8%アガロース電気泳動により分析し、そしてpulB/C遺伝子を有する約2684bpの断片をQIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製した。プラスミドpMRT135(pel3’、pel5’及びspcpを有するDG268Δneo−トリプル・タンデムプロモーター)をSac I及びNot Iで消化し、TBE緩衝液を用いて0.8%アガロース電気泳動により分析し、そして約6909bpのベクター断片をQIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製した。pMRT135ベクター断片とpulB/C断片を上述のとおり結合させ、そして製造業者の取扱説明書に従い、大腸菌SURE細胞を該連結物で形質転換し、37℃における2X YTアンピシリンプレート上でアンピシリン耐性を選択する。いくつかの形質転換体からプラスミドDNAを単離し、TBE緩衝液を用いて0.8%アガロース電気泳動によりpulB/C挿入の存在を分析した。1つのプラスミドをpMBin115(pel3’、pel5’及びspcpを有するpDG268Δneo−トリプル・タンデムプロモーター/pulB/C)と命名した(図15)。
例6:B・スブチリス(B. subtilis)におけるpulB/C−リンカー−AMY 1048 CBMのクローニング及び発現のためのpRB212の構築
プラスミドpRB212は、トリプル・タンデムプロモーター、aprHリボソーム結合部位、バチルス・アシドプルリチカス(Bacillus acidopullulyticus)プルラナーゼ(pulB/C)コード領域、プロリンリッチリンカー(−PEPTPEPN−)、アノキシバチルス・コンタミナンス(A. contaminans)α−アミラーゼCBM(AMY1048 CBM)(CBM20ファミリー)及びaprHターミネーターを含む発現カセットを含有する大腸菌レプリコンである。バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)ペクチン酸リアーゼ(pel)の両側には遺伝子発現カセット及びspc遺伝子が配置されており、2つのpel断片を介する二重騒動組み換えにより、バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)染色体のpel座位において発現カセット及びspc遺伝子の挿入を許容する。pRB212の構築を以下に説明する。
プラスミドpRB210。プロリンリッチリンカー(−PEPTPEPN−)及びpulB/CのAMY 1048 CBM下流を導入するためにA SOE(重複伸展によるスプライシング)ストラテジーを考案した。このA SOEストラテジーは、pulB/Cの停止コドンを除去し、そしてpulB/Cの3’末端において該リンカーとAMY 1048 CBMの挿入を許容する。
上流断片:
上流断片(pulB/Cの3’末端)を、下流断片の5’末端に相同的なオーバーハングを含むプライマーを使用して、MBin115からPCR増幅した。プライマー999448及び060179(配列番号8及び9)を、571bpの上流断片のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅のために合成した。下流断片を増幅するために使用される060180プライマーの5’末端を補完するために、060179のヌクレオチド1〜10を添加した。これらのプライマーは、pulB/Cの停止コドンを含むことなく、pulB/Cの3’末端のPCR増幅を許容する。
上記PCRは、上述の条件下において行った。
下流断片:
下流断片(アノキシバチルス・コンタミナンス(A. contaminans)AMY 1048 CBM(CBM20ファミリー))を、−PEPTPEPTN−(配列番号1)リンカー及びpulB/Cの3’末端に相同的なオーバーハングを含むプライマーを使用して、AMY 1048(WO 2006/066596 A2 の配列番号1)のクローン遺伝子からPCR増幅した。542bpの下流断片のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅のためにプライマー060180及び999451(配列番号10及び11)を合成した。リンカー−PEPTPEPN−(配列番号1)及び上流断片を増幅するために使用した060179の5’末端の相補配列を導入するために、060180のヌクレオチド1〜24を添加した。060180のヌクレオチド1〜10は、上流断片と下流断片の重複領域を表す。
上記PCRは、上述の条件下において行った。
上記の上流断片と下流断片の鋳型として使用し、全長断片をPCR増幅した。該PCRは、上述の条件下において、プライマーペア999448/999451を使用して行った。
このSOEは、561bpの3’−pulB/C、24bpのリンカー、及び518bpのAMY1048CBMと下流配列を含む配列を含有する1103bpの断片を提供した。
これにより生じた約1103bpのPCR産物をゲル精製し、そして配列決定のためのTOPO (登録商標) TA PCR Cloning Kit を使用してベクターpCR2.1中でクローニングし、そして製造業者の取扱説明書に従い、One Shot (登録商標) TOP10 Chemically Competent 大腸菌細胞に形質転換した。1つの形質転換体からプラスミドDNAを単離し、そしてEco RIで消化し、そしてTBE緩衝液を用いて0.8%アガロース電気泳動を行い、約3931bp及び1121bpの期待した断片を産生した。クローンPCR断片のDNA配列は、DNA配列決定により確認した。このプラスミドはpRB210と命名した。pCR2.1においてクローニングした完全DNA配列である3’−pulB/C−リンカー−AMY 1048 CBMは配列番号12に示される。
プラスミドRB212.プラスミドpRB210(pCR2.1−3’−pulB/C−リンカー−AMY 1048 CBM)をBstxXII及びMIuIで消化し、TBE緩衝液を用いて0.8%アガロース電気泳動により分析し、そして3’−pulB/C−リンカー−AMY 1048 CBMを有する約402bpの断片を QIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製した。プラスミドpMBin115(pel3’、pel5’及びspcを有するpDG268Δneo−トリプル・タンデムプロモーター/pulB/C)をBstxX II及びMlu Iで消化し、TBE緩衝液を用いて0.8%アガロース電気泳動により分析し、そして約9442bpのベクター断片をQIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製した。pMBin115ベクター断片と3’−pulB/C−リンカー−AMY1048 CBM断片を上述のとおり結合させ、そして大腸菌SURE細胞を該連結物で上述のとおり形質転換し、37℃における2X YTアンピシリンプレート上でアンピシリン耐性を選択する。製造業者の取扱説明書に従いQIAGENロボットを使用していくつかの形質転換体からプラスミドDNAを精製し、そして0.5X TBE緩衝液を用いて0.8%アガロースゲルにおいてBam HI消化により分析した。所望の断片(4638bp、2954bp、及び2322bp)を含有することが同定されたプラスミドをpRB212と命名した(図16)。このクローニングストラテジーは、pulB/CとaprHターミネーターに続く停止コドンの間に該リンカーとAMY 1048 CBMを置いた。このプラスミドにおけるpulB/C−リンカー−AMY1048 CBMコード領域は、DNA配列決定によりエラーがないことが確認された。
例7:B.スブチリス(B. subtilis)におけるpulB/C−リンカー−AMY 1048 CBMのクローニング及び発現
株RB272。上述のとおり、プラスミドpRB212を用いてB.スブチルス168Δ4をスペクチノマイシン耐性に変換した。組み込み体をネオマイシン感受性についてスクリーニングし、pel座位においてダブル・クロスオーバー統合(double-crossover integration)を示した。上述のとおり、プルラン・アズールオーバーレイ(及びAZCL−プルランオーバーレイ)における透明帯の形成により、pulB/C発現カセットの存在を確認した。このような組み込み体の1つをRB268と命名した。ゲノムDNAをバチルス・スブチリス(B. subtilis)RB268から単離した。
細胞外タンパク質(例えば、pulC−リンカー−CBM)のプロセッシング及び分解を最小とするために、pulB/C−リンカー−AMY 1048 CBMの発現はプロテアーゼ欠損宿主中で生じさせた。その後、宿主をRB268ゲノムDNAで形質転換することによりトリプル・タンデムプロモーターpulB/C−リンカー−AMY 1048 CBM発現カセットをB.スブチルス産生宿主A164Δ10に移植し、スペクチノマイシン耐性にした。上述のとおり、pulB/C発現カセットの存在はプルラン・アズールオーバーレイ(及びAZCL−プルランオーバーレイ)における透明帯の形成により確認した。このような組み込み体の1つをRB272と命名し、これは、A164Δ10のpel座位において挿入されたトリプル・タンデムプロモーターpulB/C−リンカー−AMY 1048 CBM発現カセットを含有する。
対照株RB265
対照株RB265は、pel染色体座位において1つのコピー中に統合されたトリプル・タンデムプロモーター、aprHリボソーム結合部位、プルラナーゼ(pulB/C)コード領域、及びaprHターミネーターを含有するA164Δ10バチルス・スブチリス(B. subtilis)宿主である。
B.スブチルスをスペクチノマイシン耐性に変換するために、pMBin115を使用した。組み換え体を、ネオマイシン感受性についてスクリーニングし、pel座位においてダブル・クロスオーバー統合を示した。上述のとおり、プルラン・アズールオーバーレイ(及びAZCL−プルランオーバーレイ)における透明帯の形成により、pulB/C発現カセットの存在を確認した。このような組み込み体の1つを168Δ4::トリプル・タンデムプロモーター/pulB/Cと命名した。
その後、宿主を168Δ4::トリプル・タンデムプロモーター/pulB/CゲノムDNAで形質転換することにより、トリプル・タンデムプロモーター−pulB/C発現カセットをB.スブチルス産生宿主A164Δ10に移植し、スペクチノマイシン耐性にした(Connellyら、上記)。上述のとおり、pulB/C発現カセットの存在はプルラン・アズールオーバーレイ(及びAZCL−プルランオーバーレイ)における透明帯の形成により確認した。PB272により産生された透明帯は、AMY 1048 CBMを伴わずにpulB/Cを内部に有する対照株RB265により産生された透明帯よりも僅かに小さかった。
このような組み込み体の1つをRB265と命名し、これは、A164Δ10のpel座位において挿入されたトリプル・タンデムプロモーター/pulB/C発現カセットを含有する。
例8:B.スブチルスA164Δ10におけるpulB/C−リンカー−AMY 1048 CBMの発現のための発酵
実験室規模において、RB265及びRB2272を以下のとおり試験した。
種子繁殖
固体培地において種子を繁殖させ、そして振とうフラスコに移し、最終接種菌液(final inocula)を作成した。SSB−4プレート上において、−80℃の冷蔵ストックから株を筋付けした(streaked)。
この後、プレートを37℃で20時間インキュベートし、その後さらに20時間インキュベートするために他のSSB−4プレートに移した。その後、これらを5mlのM9緩衝液と共に回収し、細菌懸濁液を作成した。その後、該M9懸濁液を650nmで読取り、そして100mlのPRK50調節振とうフラスコ中の接種体積を、式v=0.1/Abs650を用いて測定した。振とうフラスコを37℃、250rpmで20時間インキュベートした。
全ワーキング・ボリュームが1.0Lになるように100mlの適当な振とうフラスコ培養液をタンクに添加し、DKプルラナーゼ培地を含有するタンクを接種した。プロセスコントロールは、手動及びFermWorks対照とデータ記録ソフトウェアを介して達成した(Jova Solutions, San Francisco, CA, USA)。
タンクを、スクロース・フィードを伴うプロフィールに従い補い、そして4N NH4OH/5M H3PO4でpHを調整した。電子質量流装置を用いて、制御された速度においてタンクを圧縮空気でスパージした。発酵の間、手動で調節した目盛り付モーターコントローラーを介して攪拌を標準化した。10℃のコールド・フィンガー及び電子ヒータープローブを使用して温度を制御した。
発酵の間、FermWorksソフトウェアパッケージにおけるデータ・ロギング特性を使用してプロセスコントロールをモニターした。これらのデータは5分毎に転送した。
pHは、0時間において6.8であり、20−24−48時間において6.2であった。pHは、0−20−24−48時間において5.9であった。空気プロフィールについての設定ポイントは2.25L/mを保ち、そして温度プロフィールの設定ポイントは37℃を保った。PRMプロフィールの設定ポイントは、0時間において700、そして1−3−48時間において1500とした。フィードプロフィールの設定ポイントは、0時間において4.5g/mであり、15時間において22.5g/mであり、30時間において22.58g/mであり、そしてa<t60時間で10.8g/mであった。
サンプリング
発酵の間の各時間におけるオンラインpHの検証のために、少量の試料を採取した。貯蔵/分析のための試料を約3、24及び48時間においてタンクから引き出した。アッセイ分析のために、200μlの全ブロスを96ウェルプレートに満たし、そして−20℃で凍結させた。後学のため、そして再アッセイの必要がある場合にそなえて、1mlの全ブロスを各々2つの1.7mlエッペンドルフ・チューブにピペッティングした。これらは、全ブロスライブラリーにおいて、−20℃で保存した。タンパク質ゲル電気泳動のために更なるチューブのセットを用意した。
例9:自動化プルラナーゼアッセイ
この方法は、Beckman Coulter Biomek NX (Beckman Coulter, Fullerton CA)と連動して使用する。培養液の上澄み液を約0.1Mの酢酸ナトリウム緩衝液pH5.0(試料緩衝液)中に希釈した。試料緩衝液において2NPUN/ml濃度で出発し、そして0.031 NPUN/ml濃度で終了する2ホールド・ステップを使用してプルラナーゼ標準を希釈した。標準を含む全部で75μlの各希釈液を96ウェルの平底プレート(アッセイプレート)中に移した。試料緩衝液中40μlの2.5%Red−プルラン基質(Megazymes International Ireland Ltd., Wicklow, Ireland)を各ウェルに添加した。その後アッセイプレートを40℃で10分間インキュベートした。インキュベーションの完了において、190μlのエタノール(95%v/v)を各ウェルに添加し、その後周囲温度で10分間インキュベートした。その後アッセイを3,000rpmで10分間遠心分離した。150μlの上澄み液を除去し、そして新しい96ウェルの平底プレートに置いた。その後、510nmの吸光度を測定した。作成した標準曲線からの外挿により試料濃度を測定した。
RB272とRB265のおおまかなプルラナーゼ価は、1リットルあたり数グラムの範囲にあると推定された。
例10:RB272及びRB265発酵試料のSDS−PAGE分析
融合体の安定性を試験するために、製造業者の取扱説明書に従い、RB272とRB265の発酵試料を7.5%Tris−HCl SDS−PAGE(Bio-Rad Laboratories, CA, USA)上を走らせた。かかる分析は、主なタンパク質生成物が、成熟したPulB/C(〜91.7kDA)及び融合PulB/C−リンカー−AMY1048CBM(〜103kDA)について予想されたサイズのものであることを示した。かかる分析は、株PB272が安定な融合体を産生することを確認するだけでなく、このような融合体の24hにおける高い収率を確認するものである。
例11:粒状小麦デンプンのグルコースへの変換
本実施例は、グルコアミラーゼとの併用における、CBM20を伴う又は伴わないプルラナーゼを使用する粒状デンプンのグルコースへの変換を実証する。
まず、継続的に攪拌しながら10gの小麦デンプンを90mlの0.2M 酢酸ナトリウム pH5.5に添加することにより、10%小麦デンプンを伴うスラリーを作成した。
以下の酵素を0時間において投与した(表1)。
Figure 2010518814
上記酵素の添加後、デンプンスラリーを60℃でインキュベートした。25及び50時間において、アリコートを除去し、溶液中のグルコースの量を測定した。グルコース含有量は、グルコース標準曲線に対する還元末端(reducing ends)を測定することにより決定した。
その結果を以下の表2に示す。
Figure 2010518814
例12:粒状トウモロコシデンプンのグルコースへの変換
本実施例は、グルコアミラーゼとの併用における、CBM20を伴う又は伴わないプルラナーゼを使用する粒状デンプンのグルコースへの変換を実証する。
まず、継続的に攪拌しながら3.6gのトウモロコシデンプンを112mlの50mM 酢酸ナトリウム、1mM CaCl2に添加することにより3.2%トウモロコシデンプンを伴うスラリーを作成した。pHは酢酸で4.0に調節した。
以下の酵素を0時間において投与した(表3)。
Figure 2010518814
上記酵素の添加後、デンプンスラリーを32℃の水浴中においた。21及び45時間において、アリコートを除去し、上述のとおり溶液中のグルコースの量を測定した。
得られた結果を以下の表4に示す。
Figure 2010518814

Claims (20)

  1. デンプン脱分岐活性を有し、かつ触媒デンプン脱分岐ドメイン及びデンプン結合ドメインを含むアミノ酸配列を有するポリペプチド。
  2. 前記触媒デンプン脱分岐ドメインとデンプン結合ドメインとを連結するリンカーをさらに含む、請求項1に記載のポリペプチド。
  3. 前記触媒デンプン脱分岐ドメインが、プルラナーゼ又はイソアミラーゼに由来する、請求項1又は2に記載のポリペプチド。
  4. 前記触媒デンプン脱分岐ドメインが、バチルス・アシドプルリチカス(Bacillus acidopullulyticus)、バチルス・デラミフィカンス(B. deramificans)、クレブシエラ・ニューモニア(Klebsiella pneumonia)、クレブシエラ・アエロゲネス(K. aerogenes)又はパイロコッカス属(Pyrococcus sp.)から得られるプルラナーゼ;あるいはロドサームス・マリヌス(Rhodothermus marinus)、シュードモナス・アミロデラモサ(Pseudomonas amyloderamosa)、シュードモナス属SMP1(Pseudomonas sp. SMP1)、フラボバクテリウム・オドラツム(Flavobacterium odoratum)、スルフォロブス・アシドカルダリウス(Sulfolobus acidocaldarius)又はスルフォロブス・ソルファタリクス(S. solfataricus)から得られるイソアミラーゼに由来する、請求項3に記載のポリペプチド。
  5. 前記プルラナーゼが、バチルス属の細菌に由来する、請求項1〜4のいずれか1項に記載のポリペプチド。
  6. 前記プルラナーゼが、バチルス・アシドプルリチカス(B. acidopullulyticus)pulBもしくはpulC、又はこれらの変異体である、請求項5に記載のポリペプチド。
  7. 前記プルラナーゼがpulBとpulCのハイブリッドである、請求項6に記載のポリペプチド。
  8. 前記デンプン結合ドメインが、炭水化物結合モジュールファミリーのCBM−20、CBM−21、CBM−25、CBM−26、CBM−34、CBM−41及びCBM−45に属する、請求項1又は2に記載のポリペプチド。
  9. 前記デンプン結合ドメインが、CBM−20ファミリーに属する、請求項8に記載のポリペプチド。
  10. 前記デンプン結合ドメインが、アノキシバチルス・コンタミナンス(Anoxybacillus contaminans)α−アミラーゼのデンプン結合ドメイン、又はサーモアナエロバクター属(Thermoanaerobacter sp.)CGTアーゼのデンプン結合ドメインである、請求項8に記載のポリペプチド。
  11. 前記リンカーが、100以下のアミノ酸、好ましくは2〜50のアミノ酸、より好ましくは2〜25のアミノ酸、そして最も好ましくは5〜20のアミノ酸から成る、請求項2に記載のポリペプチド。
  12. 前記リンカーがプロリンリッチである、請求項11に記載のポリペプチド。
  13. 前記リンカーが−PEPTPEPN−である、請求項12に記載のポリペプチド。
  14. 請求項1〜13のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
  15. 請求項14に記載の核酸を含む組み換えベクター。
  16. pRB212である、請求項15に記載の組み換えベクター。
  17. 請求項14に記載の核酸又は請求項15もしくは16に記載のベクターを含む、組み換え宿主細胞。
  18. 非ゼラチン化デンプン及び水を請求項1〜13のいずれか1項に記載のポリペプチドと共にインキュベートすることを含む、生デンプン分解のための方法。
  19. 以下のステップ:
    a)生デンプンと水の混合物を提供するステップ;
    b)エンド型アミラーゼ又はエキソ型アミラーゼと一緒に、デンプン脱分岐活性を有するポリペプチドを添加するステップ;
    c)デンプンが分解するために有効な温度及び時間において、上記混合物をインキュベートするステップ、
    を含む、請求項18に記載の方法。
  20. 前記エキソ型アミラーゼがグルコアミラーゼを含む、請求項19に記載の方法。
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