JP2010501638A - 修飾タンパク質 - Google Patents
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Abstract
Description
(M-L-O-N=CH)n-P-(CH=N-O-L'-M')m (式I)
[上式中、M及び場合によってはM'は、独立して、修飾された糖タンパク質の分子量を増加させるためのポリマー部分であり、L及びL'は、独立して二価リンカーを表し、Pは該糖タンパク質の一又は複数の酸化グルカン末端を有する糖タンパク質を表し、O、N、C及びHは、それぞれ酸素、窒素、炭素及び水素原子を表し、nは1−10であり、mは0−50である]
を有する修飾された糖タンパク質の調製方法に関し、該方法は、
a)糖タンパク質P*に存在する少なくとも一のグリカン末端を過ヨウ素酸イオンで酸化させ、ここでP*は、一又は複数のアルデヒド基を含む糖タンパク質P-(CHO)n+mを得るための複数のグリコフォームを表し、
b)P-(CHO)n+mをM-L-O-NH2と反応させて、構造(M-L-O-N=CH)n-P-(CHO)mの修飾糖タンパク質を得、
c)場合によっては、構造(M-L-O-N=CH)n-P-(CHO)mの糖タンパク質中の任意の未反応アルデヒド基をM'-L'-O-NH2と反応させて、構造(M-L-O-N=CH)n-P-(CH=N-O-L'=M')mの修飾糖タンパク質を得る;
工程を含み、ここで前記過ヨウ素酸イオンは、糖タンパク質に存在する非還元グリカン末端の数に対して、50当量未満の量で存在しており、該修飾糖タンパク質は、出発糖タンパク質P*と比較して改善された薬理学的性質を有し、その機能活性は維持している。
また、P-及び-P-とは、糖タンパク質が、前記糖タンパク質の一又は複数の酸化グルカン末端を有し、化学結合が該一又は複数のグルカン末端でなされていることが理解される。
よって、本発明は、一般構造
(M-L-O-N=CH)n-P-(CH=N-O-L'-M')m (式I)
[上式中、M及び場合によってはM'は、独立して、修飾された糖タンパク質の分子量を増加させるためのポリマー部分であり、L及びL'は、独立して二価リンカーを表し、Pは該糖タンパク質の一又は複数の酸化グルカン末端を有する糖タンパク質を表し、O、N、C及びHは、それぞれ酸素、窒素、炭素及び水素原子を表し、nは1−10であり、mは0−50である]
を有する修飾された糖タンパク質に関し、該修飾された糖タンパク質は、出発糖タンパク質P*と比較して改善された薬理学的性質を有し、その機能活性は維持されている。
また本発明は、一般構造
(M-L-O-N=CH)n-P-(CH=N-O-L'-M')m (式I)
[上式中、M及び場合によってはM'は、独立して、修飾された糖タンパク質の分子量を増加させるためのポリマー部分であり、L及びL'は、独立して二価のリンカーを表し、Pは該糖タンパク質の一又は複数の酸化グルカン末端を有する糖タンパク質を表し、O、N、C及びHは、それぞれ酸素、窒素、炭素及び水素原子を表し、nは1−10であり、mは0−50である]
を有する複数の修飾された糖タンパク質を含む調製物に関し、該修飾された糖タンパク質は、出発糖タンパク質P*と比較して改善された薬理学的性質を有し、その機能活性は維持されている。
一実施態様では、免疫原性の低下は、M及び/又はM'を免疫原性部位に結合する抗体をブロックする基にすることにより得られる。
一実施態様では、アルブミンに対する親和性の改善は、M及び/又はM'をアルブミンに対して高い親和性を有する基にすることにより得られる。
一実施態様では、レセプターに対する親和性の改善は、M及び/又はM'を標的細胞における表面レセプターに特異的に結合する基にすることにより得られる。
(M-L-O-N=CH)n-P-(CH=N-O-L'-M')m (式I)
[上式中、M及び/又はM'は、一又は複数のカルボン酸、アミン類、スルホン酸、ホスホン酸又はその組合せを含有してよい低分子量の有機荷電基;低分子量の中性親水性分子、例えばシクロデキストリン、又は場合によっては分枝状のポリエチレン鎖;低分子量の疎水性分子、例えば脂肪酸又はコール酸又はその誘導体;2−40kDaの平均分子量を有するポリエチレングリコール;十分に定義された精密ポリマー、例えば700Da〜20kDaの範囲の正確な分子量を有するデンドリマー;実質的に非免疫原性のポリペプチド、例えばアルブミン、抗体又はFcドメインを含んでいてもよい抗体の一部;及び高分子量の有機ポリマーからなる群から選択される]
を有する修飾された糖タンパク質を調製する方法に関する。
(M-L-O-N=CH)n-P-(CH=N-O-L'-M')m (式I)
[上式中、M及び/又はM'は、デンドリマー、ポリアルキレングリコール(PAG)を含むポリアルキレンオキシド(PAO)、例えばポリエチレングリコール(PEG)及びポリプロピレングリコール(PPG)、分枝状PEG、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン・無水マレイン酸コポリマー、ポリスチレン・無水マレイン酸コポリマー、デキストラン、カルボキシメチル-デキストランからなる群から選択される]
を有する修飾された糖タンパク質を調製する方法に関する。
さらなる実施態様では、M及び/又はM'は、ポリ(1-ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール)(PHF)又は類似の分解デキストラン類、例えば出典明示によりここに含まれるWO2006094810A2に記載されているものであり、そこでは、ポリマーの適切に活性化された形態が開示されている。
さらなる実施態様では、M及び/又はM'は、双性イオン性ポリマー、例えば出典明示によりここに含まれるWO03062290A1に開示されているものから選択される。特定の実施態様では、ポリマーは2-メタクリロイルオキシ-2'-エチルトリメチルアンモニウムホスフェート内塩(MPC)である。
(M-L-O-N=CH)n-P-(CH=N-O-L'-M')m (式I)
[上式中、M及び/又はM'は、血清タンパク質結合リガンド、及び生理学条件下にて帯電特性を変化させる部分を有する小有機分子、グリカンのレセプターへの結合を阻害する構造、及びグリカン特異的認識を防止する中性置換基からなる群から選択される]
を有する修飾された糖タンパク質を調製する方法に関する。
(M-L-O-N=CH)n-P-(CH=N-O-L'-M')m (式I)
[上式中、Pは、FVII、FVIII、FIX、FX、FII、FV、プロテインC、プロテインS、tPA、PAI-1、組織因子、FXI、FXII、FXIII、並びにその配列変異体;免疫グロブリン、サイトカイン、例えばインターロイキン、α-、β-、及びγ-インターフェロン、コロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、ホスホリパーゼ活性化タンパク質(PUP)、インスリン、植物タンパク質、例えばレクチン及びリシン、腫瘍壊死因子及び関連する対立遺伝子、腫瘍壊死因子レセプターの可溶型、インターロイキンレセプター及びインターロイキンレセプターの可溶型、増殖因子、例えば組織増殖因子、例えばTGFa’s又はTGFps、及び表皮増殖因子、ホルモン、ソマトメジン、エリスロポエチン、色素性ホルモン、視床下部放出因子、抗利尿ホルモン類、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノーゲンアクチベータ、及び免疫グロブリン、例えばIgG、IgE、IgM、IgA、及びIgD、及びその断片、又は上述のタンパク質又はその断片の任意のものを含む任意の融合タンパク質から選択される]
を有する修飾された糖タンパク質を調製する方法に関する。
(M-L-O-N=CH)n-P-(CH=N-O-L'-M')m (式I)
[上式中、糖タンパク質は第VII因子ポリペプチドである]
を有する修飾された糖タンパク質を調製する方法に関する。
さらなる実施態様では、本発明は、一般構造
(M-L-O-N=CH)n-P-(CH=N-O-L'-M')m (式I)
[上式中、糖タンパク質は野生型ヒト第VII因子のアミノ酸配列を有する]
を有する修飾された糖タンパク質を調製する方法に関する。
さらなる実施態様では、本発明は、一般構造
(M-L-O-N=CH)n-P-(CH=N-O-L'-M')m (式I)
[上式中、糖タンパク質は第VIII因子ポリペプチドである]
を有する修飾された糖タンパク質を調製する方法に関する。
ここで使用される場合、「第VIII因子」又は「FVIIIポリペプチド」には、FVIII:FVIIIのC、B-ドメイン欠失型、アミノ酸変異体及びその組合せが含まれる。
(M-L-O-N=CH)n-P-(CH=N-O-L'-M')m (式I)
を有する修飾された糖タンパク質を調製する方法に関し、ここで修飾された糖タンパク質は、本明細書に記載されるような凝固アッセイ、タンパク質分解アッセイ、又はTF結合アッセイの一又は複数で試験された場合、未修飾の第VII因子ポリペプチドの特定の活性の、少なくとも約10%、例えば少なくとも約20%、例えば少なくとも約40%、例えば少なくとも約60%、少なくとも約80%、例えば少なくとも約100%を示す。
(M-L-O-N=CH)n-P-(CH=N-O-L'-M')m (式I)
を有する修飾された糖タンパク質を調製する方法に関し、ここで修飾された糖タンパク質は、未修飾の糖タンパク質の生物学的利用能の少なくとも約110%、例えば少なくとも約120%、約130%、又は未修飾の糖タンパク質の生物学的利用能の少なくとも約140%の生物学的利用能を示す。
(M-L-O-N=CH)n-P-(CH=N-O-L'-M')m (式I)
を有する修飾された糖タンパク質を調製する方法に関し、ここで修飾された糖タンパク質は、未修飾の糖タンパク質の半減期の少なくとも約125%、例えば約150%、約200%、又は未修飾の糖タンパク質の半減期の少なくとも約250%の血清半減期を示す。
(M-L-O-N=CH)n-P-(CH=N-O-L'-M')m (式I)
を有する修飾された糖タンパク質を調製する方法に関し、ここで過ヨウ素酸イオンは、糖タンパク質に存在する非還元グリカン末端の数に対して、20当量未満、例えば10当量未満、例えば5当量未満、例えば1当量未満、例えば糖タンパク質に存在する非還元グリカン末端の数に対して、0.1−20当量の範囲、例えば0.1−10当量の範囲、例えば0.1-5当量の範囲、例えば0.1−1当量の範囲の量で存在している。
本明細書及び特許請求の範囲において、「ポリペプチド」なる用語は、ペプチド結合アミノ酸残基からなる直鎖状の単鎖分子である。よって、本用語は、ペプチド(2−10のアミノ酸残基)、オリゴペプチド(11−100のアミノ酸残基)及び本来のポリペプチド(100を越えるアミノ酸残基)を包含する。よって、ポリペプチドは、生物学的に活性な構造単位であるが、機能を欠いている場合もある。本明細書において「タンパク質」は、少なくとも一のポリペプチドを含む機能的又は非機能的分子又は複合体であり、モノマーとは別に、該用語には、ポリマー分子、例えばホモ-及びヘテロ多量体が含まれる。タンパク質は補欠分子族(接合団)を含んでいてよく、様々なグリコシル化及び脂質化パターンを含みうる。ここで使用される「糖タンパク質」とは、何らかの方法でグリコシル化されたタンパク質のことである。本発明のいくつかの実施態様では、糖タンパク質は、N-グリコシル化及び/又はO-グリコシル化され、及び/又はシアル酸部分で修飾される。
典型的には、改善された薬理学的性質は、生物学的利用能の増加、機能的インビボ半減期の増加、インビボ血漿半減期の増加、免疫原性の低下、プロテアーゼ耐性の増加、アルブミンに対する親和性の増加、レセプターに対する親和性の改善、保存安定性の増加からなる群から選択される。
糖タンパク質の保存安定性は、(a)乾燥粉末として25℃で保存した場合、調製物の生物学的利用能の20%が崩壊するのに必要な時間、及び/又は(b)調製物において、凝集物等、予め決められた分解産物の割合が倍になるのに必要な時間を測定することにより評価されうる。
以下において、置換基M及びM'を考察する。
本発明の一実施態様では、半減期の増加は、M及び/又はM'を、腎クリアランスが低減され又は消失されるように分子量を増加させる基にするか、及び/又はM及び/又はM'を肝臓レセプターに対する結合パートナーをマスクする基にすることにより得られる。他の実施態様では、免疫原性の低下は、M及び/又はM'を免疫原性部位に結合する抗体をブロックする基にすることにより得られる。さらに他の実施態様では、アルブミンに対する親和性の改善は、M及び/又はM'をアルブミンに対して高い親和性を有する基にすることにより得られる。さらに他の実施態様では、レセプターに対する親和性の改善は、M及び/又はM'を標的細胞における表面レセプターに特異的に結合する基にすることにより得られる。
置換基M及び/又はM'は、任意の官能性改善基、例えば「延長(プロトラクター(protractor))基」とすることができる。ここで使用される場合、これは、未修飾のタンパク質又はペプチドと比較した場合、タンパク質又はペプチドにコンジュゲートした際に、該タンパク質又はペプチドの循環半減期を増加させる基を意味する。延長効果の背後にある特定の原理は、サイズの増加、ペプチダーゼ又は抗体により認識可能なペプチド配列の保護、例えば肝臓又はマクロファージ中に存在するグリカン特異性レセプターにより認識されない形でのグリカンのマスキング、クリアランスの防止又は低減に起因している。また延長基の延長効果は、例えば、アルブミン等の血中成分への結合、又は血管組織への特異的又は非特異的結合に起因する場合もある。コンジュゲートした糖タンパク質は、未修飾の糖タンパク質の生物学的活性を実質的に維持しているべきである。
− 一又は複数のカルボン酸、アミン、スルホン酸、ホスホン酸、又はその組合せを含みうる低分子量の有機荷電基(15−1000Da)、
− 低分子量(15−1000Da)の中性親水性分子、例えばシクロデキストリン、又は場合によっては分枝していてもよいポリエチレン鎖、
− 低分子量(15−1000Da)の疎水性分子、例えば脂肪酸又はコール酸又はその誘導体、
− 2−40kDaの平均分子量のポリエチレングリコール、
− 十分に定義された精密ポリマー、例えば700Da〜20000Da、より好ましくは700−10000Daの範囲の正確な分子量を有するデンドリマー、
− 実質的に非免疫原性の糖タンパク質、例えばアルブミン、又は抗体もしくは場合によってはFcドメインを含んでいてもよい抗体の一部、及び
− 高分子量の有機ポリマー、例えばデキストラン、
からなる群から選択される。
− 直鎖状、分枝状及び/又は環状のC1-30アルキル、C2-30アルケニル、C2-30アルキニル、C1-30ヘテロアルキル、C2-30ヘテロアルケニル、C2-30ヘテロアルキニルで、一又は複数の同素環芳香族化合物のビラジカル、又は複素環化合物のビラジカルが挿入されていてもよく、該C1-30又はC2-30基は、-CO2H、-SO3H、-PO2OH、-SO2NH2、-NH2、-OH、-SH、ハロゲン、又はアリールから選択される一又は複数の置換基で置換されていてもよく、該アリールは-CO2H、-SO3H、-PO2OH、-SO2NH2、-NH2、-OH、-SH、又はハロゲンで置換されていてもよいもの;ステロイド基;脂質基;
− 多糖類基、例えばデキストラン類;α-、β-、又はγ-シクロデキストリン、ポリアミド基、例えばポリアミノ酸基;PVP基;PVA基;ポリ(1-3-ジオキサラン);ポリ(1,3,6-トリオキサン);エチレン/無水マレイン酸ポリマー;
− チバクロン染料、例えばチバクロンブルー3GA、及び出典明示によりここに援用されるWO 00/12587に開示されている特定長さのポリアミド鎖;
− 実質的に非免疫原性のタンパク質残基、例えばアルブミニル誘導体のような血液成分、又は抗体又はそのドメイン、例えばヒト正常IgG1由来のFcドメインで、Kan, SKら, The Journal of Immunology 2001, 166(2), 1320-1326、又はStevenson, GT, The Journal of Immunology 1997, 158, 2242-2250に記載されているようなもの;
− ポリエチレングリコール(PEG)又はメトキシポリエチレングリコール(mPEG)基、及びそのアミノ誘導体で、平均分子量が500〜100000Da、例えば500〜60000Da、例えば1000〜40000Da、例えば5000〜40000Daであってよいもの;
− アルブミン等の血漿タンパク質に結合することが知られている部分で、アルブミン結合特性が、出典明示によりここに援用されるJ.Med.Chem, 43, 2000, 1986-1992に記載されているようにして測定されてよいもの、又はアルブミン結合部分、例えば40未満のアミノ酸残基を有するペプチド、例えば出典明示によりここに援用されるJ. Biol Chem. 277, 38(2002)35035-35043に開示されている部分;
の一つから選択される有機基でありうる。
特定の実施態様では、M'はMとは異なる。特定の実施態様では、M'は、Mよりも実質的に低い分子量を有する。特定の一実施態様では、M'はメトキシルアミン(MeONH2)である。
以下、置換基P*を考察する。
糖タンパク質P*は、過ヨウ素酸塩により酸化反応する、グリカン末端を有する。
よって、P*の反応性基は、炭水化物の一部であるか、又はグリコシル化された糖タンパク質のN-又はO-グリカン類に見出されるもの等の、炭水化物残基から誘導される。また糖タンパク質P*の反応性基は、シアル酸残基であってもよい。
一実施態様では、糖タンパク質はFVIIポリペプチドである。一実施態様では、ポリペプチドは野生型第VIIa因子である。
「第VII因子」なる用語は、それらの未切断(チモーゲン)型の第VII因子ポリペプチド、並びにタンパク分解的にプロセシングされて第VIIa因子と命名されうるそれぞれの生物活性型を生じるものを含むものである。典型的には、第VII因子は残基152と153の間が切断されて第VIIa因子を生じる。第VII因子のこのような変異体は、安定性、リン脂質結合性、特定の活性の改変等を含む、ヒト第VII因子とは異なる特性を示しうる。
ここで使用される場合、「野生型ヒトFVIIa」とは、米国特許第4,784,950号に開示されているアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
II、F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII、F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII、F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII、S52A-VII因子、S60A-VII因子;R152E-VII因子、S344A-VII因子、T106N-FVII、K143N/N145T-FVII、V253N-FVII、R290N/A292T-FVII、G291N-FVII、R315N/V317T-FVII、K143N/N145T/R315N/V317T-FVII;及び233Thrから240Asnのアミノ酸配列に、置換、付加又は欠失を有するFVII;304Argから329Cysのアミノ酸配列に、置換、付加又は欠失を有するFVII;153Ileから223Argのアミノ酸配列に、置換、付加又は欠失を有するFVIIが含まれる。
一実施態様では、糖タンパク質はFVIIIポリペプチドである。一実施態様では、糖タンパク質はFIXポリペプチドである。
また本発明は、一般構造
(M-L-O-N=CH)n-P-(CH=N-O-L'-M')m (式I)
[上式中、M及び場合によってはM'は独立して、修飾された糖タンパク質の分子量を増加させるためのポリマー部分であり、L及びL'は、独立して二価のリンカーを表し、Pは糖タンパク質の一又は複数の酸化グルカン末端を有する糖タンパク質を表し、O、N、C及びHは、それぞれ酸素、窒素、炭素及び水素原子を表し、nは1−10であり、mは0−50である]
を有する新規の修飾された糖タンパク質に関し、該修飾された糖タンパク質は、出発糖タンパク質P*と比較して改善された薬理学的性質を有し、その機能活性は維持されている。
本発明の一実施態様では、修飾された糖タンパク質はN-グリコシル化及び/又はO-グリコシル化されており、及び/又はシアル酸部分を含む。
一実施態様では、本発明の修飾された糖タンパク質は、糖タンパク質が、野生型ヒト第VII因子のアミノ酸配列を有しているものである。
一実施態様では、修飾されたグリコシル化分子を生成する方法は、医薬組成物として、該グリコシル化分子を処方するさらなる工程を含む。
一般構造(M-L-O-N=CH)n-P-(CH=N-O-L'-M')mを有する修飾された糖タンパク質において、nは、特定の糖タンパク質の非還元グリカン末端の数により制限される。よって、本発明の一実施態様では、一般構造(M-L-O-N=CH)n-P-(CH=N-O-L'-M')mを有する修飾された糖タンパク質におけるnは、糖タンパク質に存在する非還元グリカン末端の数に等しい。本発明の他の実施態様では、一般構造(M-L-O-N=CH)n-P-(CH=N-O-L'-M')mを有する修飾された糖タンパク質におけるnは、1−10、例えば1−5、例えば1−3、例えば1−2、例えば1、例えば2、例えば3の範囲にある。
本発明の他の目的は、10−12mg/ml〜200mg/ml、例えば10−10mg/ml〜5mg/mlの濃度で存在する修飾された糖タンパク質を含有する医薬組成物を提供することであり、ここで、該組成物は2.0〜10.0のpHを有する。該組成物はバッファー系、保存料、等張化剤、キレート剤、安定剤及び界面活性剤をさらに含有しうる。本発明の一実施態様では、医薬組成物は水性組成物、すなわち水を含有する組成物である。このような組成物は、典型的には溶液又は懸濁液である。本発明のさらなる実施態様では、医薬組成物は水溶液である。「水性組成物」なる用語は、少なくとも50%w/wの水分を含有する組成物と定義される。同様に「水溶液」なる用語も、少なくとも50%w/wの水分を含有する溶液と定義され、「水性懸濁液」なる用語は、少なくとも50%w/wの水分を含有する懸濁液と定義される。
医薬組成物中における界面活性剤の使用は当業者によく知られている。簡便には、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20版, 2000が参照される。
非経口投与は、シリンジ、場合によってはペン状シリンジによる皮下、筋肉内、腹膜内又は静脈内注射によって実施することができる。あるいは、非経口投与は輸液ポンプにより実施することができる。さらなる選択肢は、鼻用又は肺用スプレーの形態で修飾された糖タンパク質を投与するための溶液又は懸濁液であってもよい組成物にある。さらなる選択肢としては、本発明の修飾された糖タンパク質を含む医薬組成物を、例えば針のない注射、又はイオン導入パッチであってよいパッチによる経皮投与、又は頬等の経粘膜投与用に適合させることもできる。
ここで使用されるタンパク質組成物の「物理的安定性」という用語は、熱機械的ストレスへのタンパク質の暴露及び/又は疎水性表面及び界面のような不安定化している界面及び表面との相互作用の結果としてのタンパク質の生物学的に不活性な及び/又は不溶性の凝集体を形成するタンパク質の傾向を意味する。タンパク質水性組成物の物理的安定性は、適切な容器(例えばカートリッジ又はバイアル)中に満たした組成物を機械的/物理的ストレス(例えば攪拌)に様々な時間の間、異なった温度で暴露した後に視覚検査及び/又は濁度測定によって評価される。組成物の視覚検査は暗い背景中において鋭く集光された光下で実施される。組成物の濁りは例えば濁度を0から3の尺度(濁りを示さない組成物が視覚スコア0に相当し、昼光で可視できる濁りを示す組成物は視覚スコア3に相当する)でランク付けすることにより特徴付けされる。組成物は、昼光下で可視できる濁りを示す場合にタンパク質凝集に対して物理的に不安定であると分類される。あるいは、組成物の濁りは当業者によく知られている簡単な濁度測定によって評価することができる。タンパク質水性組成物の物理的安定性はタンパク質の立体構造状態の分光学的薬剤又はプローブを使用してまた評価することができる。プローブは好ましくはタンパク質の非天然配座異性体に優先的に結合する小分子である。タンパク質構造の小分子分光学的プローブの一例はチオフラビンTである。チオフラビンTはアミロイド線維の検出に広く使用されている蛍光染料である。線維と、おそらくは他のタンパク質立体配置もまた存在すると、チオフラビンTが約450nmで新たな励起極大を引き起こし、線維タンパク質形態に結合したとき約482nmで増強した発光を生じる。未結合のチオフラビンTは本質的にはその波長で非蛍光である。
本発明の一実施態様では、修飾された糖タンパク質を含有する医薬組成物は、6週間を越える使用の間、また3年を越える貯蔵の間、安定している。
本発明の他の実施態様では、修飾された糖タンパク質を含有する医薬組成物は、4週間を越える使用の間、また3年を越える貯蔵の間、安定している。
本発明のさらなる実施態様では、修飾された糖タンパク質を含有する医薬組成物は、4週間を越える使用の間、また2年を越える貯蔵の間、安定している。
本発明のさらなる実施態様では、修飾された糖タンパク質を含有する医薬組成物は、2週間を越える使用の間、また2年を越える貯蔵の間、安定している。
本発明で記述する場合における「a」及び「an」及び「the」及び類似の指示対象の使用は、ここに特段の定義が示されたり、明瞭に内容に矛盾が生じていない限り、単数形と複数形の双方をカバーしていると解釈される。
要素又は要素群に関して「含有する」、「持つ」、「有する」、又は「含む」のような用語を使用する任意の態様又は本発明の態様のここに記載した説明は、特段の定義が示されないか又は明瞭に内容が矛盾しない限り、その特定の要素又は要素群「からなる」、「から本質的になる」、「含む」又は「含める」態様又は本発明の態様に対して裏付けを提供するものである(例えば、特定の成分を含有するここに記載の組成物は、特段の定義が示されないか又は明瞭に内容が矛盾しない限り、その成分からなる組成物を記述するものと理解されなければならない)。
本明細書における任意のかつ全ての例、又は例を示す表現(例えば「等」)の使用は、発明をより良好に例証するためだけのものであり、特段示されていない限り、本発明の範囲に対する限定をもたらすものではない。明細書中の如何なる表現も、請求項に記載していない要素が発明の実施に必須であることを示していると解釈してはいけない。
ここでの特許文献の引用及び援用は便宜のためにのみなすもので、そのような特許文献の有効性、特許性及び/又は権利行使可能性についての見解を何ら反映するものではない。
SDS-PAGE:ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動
EDTA:エチレンジアミン四酢酸
FVIIa:第VIIa因子
FVIII:第VIII因子
FIX:第IX因子
精製:
イオン交換カラム(HiTrap Q HP, Amersham Bioscience)又はサイズ排除カラム(XK26/60 HiLoad Superdex 200, Amersham Bioscience)でのタンパク質精製を、FC-950フラクション収集器を具備するAkta FPLCを使用して実施した。溶出用バッファー、カラム及びフラクション収集器を5℃で温度調節した。
SDS-PAGE:
Invitrogenの標準的なプロトコルに従い、プレキャストされた4−12%のビス-トリスゲル、NuPAGE MES SDSランニングバッファー、 Mark 12 標準体、及びNUPAGE LDSサンプルバッファーと共にInvitrogenTMのXcell SurelockTMMinI-Cellシステムを使用して、SDS-PAGEを実施した。Invitrogenの標準的なプロトコルに従い、ゲルをSimpleBlueTMで染色した。
バッファー溶液
GlyGlyバッファー:25mMのGly-Gly、50mMのNaCl、25mMのCaCl2、pH6.0
CaCl2フリーのGlyGlyバッファー:25mMのGly-Gly、50mMのNaCl、pH6.0
Hepesバッファー:50mMのHepes、100mMのNaCl、5mMのCaCl2、0,01%のトゥイーン80、pH=7.4
FVIIaのNaIO4処理及びS2288活性
NaIO4と残留ペプチド分解(peptiodlytical activity)活性との相関研究→非自明な関係
FVIIaに対するペプチド分解活性の測定:
ペプチド分解活性を、Chromogenix, Molndal, Swedenからの発色基質S-2288(H-D-Ile-Pro-Arg-P-ニトロアニリン)を使用して測定した。次のプロトコルを適用した:Hepesバッファーに入った10mMのS2288保存液を調製した。同様に、Hepesバッファーに入った200nMの組織因子保存液を調製した。試験体と参照化合物(例えば野生型FVIIa)の200nM保存液を、Hepesバッファーにて調製した。化合物を、ELISAウェルで3回試験した。典型的な実験では、10ulの200nM試験体溶液、50ulの200nM組織因子保存液、及び135μlのHepesバッファーを、ウェルに添加した。5ulの200nM S2288保存液を添加することにより、反応を開始させた。室温で15分間、ELISA-リーダー(405nmでの吸光度)でウェルを連続的に分析した。開始速度から相対的活性を算出し、野生型FVIIaの速度と比較した。修飾されたFVIIaアナログに対する活性を、野生型FVIIaの活性のパーセントとして報告した。
1H-NMR(CDCl3;選択ピーク):δ1.25ppm(d,3H);1.50−1.75(m,6H);1.82(m,1H);3.38(s,3H);3,45−3,90(m,ca.900H)。
10mlの25mM Gly-Gly、50mMのNaCl、25mMのCaCl2、pH6.0(GlyGlyバッファー)に溶解させた第VIIa因子(14mg、0.28umol)を、CaCl2フリーのGlyGlyバッファーに20mMのNaIO4を溶解させた100ulの溶液及びGlyGlyバッファーに10K-PEG-ONH2(実施例1、42mg;4.2umol;第VIIa因子に対して15当量)を溶解させた1000ulの溶液に添加した。時折振揺させつつ、混合物を2時間氷上に配した。ついで、GlyGlyバッファーにMeONH2・HCl(17mg;0.21mmol)を溶解させた溶液500ul(1MのNaOHでpHを6.0に調節)を反応混合物に添加した。氷上にさらに10分混合物を放置した。ついで、反応混合物を、pH9.0以下に維持しつつ、100mMの二塩基EDTA(4.5ml)の冷溶液に添加した。ついで、1NのHCl水100ulでpHを8.0に調節した。
過剰のPEG-ONH2をイオン交換クロマトグラフィーにより除去した。冷却した反応混合物を、25mMのGlyGly、50mMのNaCl、pH8.0で予め平衡にした5mlのHiTrap Qイオン交換カラム(Amersham Bioscience)に充填した。一定の流量(1ml/分)及び温度(5℃)にて、25mMのGlyGly、50mMのNaCl、pH8.0(バッファーA)、10cvで、ついで25mMのGlyGly、50mMのNaCl、25mMのCaCl2、pH8.0(バッファーB)、15cvで、カラムを溶出させた。280nmの吸光度により溶出物をモニターした。
5℃で操作されるFrac-950を具備するAKTA FPLC(Amersham Bioscience)を使用し、Superdex 200でのサイズ排除クロマトグラフィーにより、HiTrap Qからプール化フラクションとして回収されたグリコペグ化FVIIa変異体から非ペグ化FVIIaを除去した。XK26/60 HiLoad Superdex 200カラム(320ml cv)を予め平衡にしておき(10cv)、充填後、25mMのGlyGly、50mMのNaCl、25mMのCaCl2、pH6.0を用い、流量2.5ml/分で溶出させた。280nmの吸光度により溶出物をモニターした。10mlのフラクションを収集した。Invitrogenにより記載されたようにし、Simple Blueで染色されたSDS-PAGE(4-12%のビス-トリスNuPAGEゲル)でフラクションを分析した。純粋なモノペグ化FVIIaを含むフラクションをプール化し、4000rpm、10℃で、13.5分、Amicon UltraTM-15(10K MWCO)遠心分離フィルターを介して濾過することにより濃縮して、最終容量4.1mlが得られた。
10mlの25mM Gly-Gly、50mMのNaCl、25mMのCaCl2、pH6.0(GlyGlyバッファー)に溶解させた第VIIa因子(14mg、0.28umol)を、CaCl2フリーのGlyGlyバッファーに20mMのNaIO4を溶解させた100ulの溶液、及びGlyGlyバッファーに10K-PEG-ONH2(実施例1、42mg;4.2umol;第VIIa因子に対して15当量)を溶解させた1000ulの溶液に添加した。時折振揺させつつ、混合物を24時間4℃に配した。ついで、GlyGlyバッファーにMeONH2.HCl(17mg;0.21mmol)を溶解させた溶液500ul(1MのNaOHでpHを6.0に調節)を反応混合物に添加した。氷上にさらに10分混合物を放置した。ついで、反応混合物をpH9.0以下に維持しつつ、100mMの二塩基EDTA(4.5ml)の冷溶液に添加した。ついで、1NのHCl水60ulでpHを8.0に調節した。
過剰のPEG-ONH2をイオン交換クロマトグラフィーにより除去した。冷却した反応混合物を、25mMのGlyGly、50mMのNaCl、pH8.0で予め平衡にされた5mlのHiTrap Qイオン交換カラム(Amersham Bioscience)に充填した。一定の流量(1ml/分)及び温度(5℃)にて、25mMのGlyGly、50mMのNaCl、pH8.0(バッファーA)、10cvで、ついで25mMのGlyGly、50mMのNaCl、25mMのCaCl2、pH8.0(バッファーB)、15cvで、カラムを溶出させた。280nmの吸光度により溶出物をモニターした。
5℃で操作されるFrac-950を具備するAKTA FPLC(Amersham Bioscience)を使用し、Superdex 200でのサイズ排除クロマトグラフィーにより、HiTrap Qからプール化フラクションとして回収されたグリコペグ化FVIIa変異体から非ペグ化FVIIaを除去した。XK26/60 HiLoad Superdex 200カラム(320ml cv)を予め平衡にしておき(10cv)、充填後、25mMのGlyGly、50mMのNaCl、25mMのCaCl2、pH6.0を用い、流量2.5ml/分で溶出させた。280nmの吸光度により溶出物をモニターした。10mlのフラクションを収集した。Invitrogenにより記載されたようにし、Simple Blueで染色されたSDS-PAGE(4-12%のビス-トリスNuPAGEゲル)でフラクションを分析した。PEG置換レベルに従ってフラクションをプール化し、4000rpm、10℃、Amicon UltraTM-15(10K MWCO)遠心分離フィルターを介して濾過することにより濃縮した。
HS(トリ/テトラ10K PEG)FVIIa:0.92mgのタンパク質(UV280nm)/ml、全量=1.6ml。
HS(ジ/トリ10K PEG)FVIIa:0.63mgのタンパク質(UV280nm)/ml、全量=1.4ml。
LS(モノ/ジ10K PEG)FVIIa:1.2mgのタンパク質(UV280nm)/ml、全量=1.4ml。
モノ10K PEG FVIIa:0.7mgのタンパク質(UV280nm)/ml、全量=2.3ml。
15mlの25mM Gly-Gly、50mMのNaCl、25mMのCaCl2、pH6.0(GlyGlyバッファー)に溶解させた第VIIa因子(14mg、0.28umol)を、CaCl2フリーのGlyGlyバッファーに20mMのNaIO4を溶解させた溶液50ul、及びGlyGlyバッファーに40K-PEG-ONH2((20K PEG)OCH2(20K PEG)OCHCH2OC(=O)O-CH2CH2ONH2;WO 2006042847、112mg;2.8umol;第VIIa因子に対して10当量)を溶解させた溶液1500ulに添加した。時折振揺させつつ、混合物を48時間4℃に配した。ついで、GlyGlyバッファーにMeONH2.HCl(17mg;0.21mmol)を溶解させた500ulの溶液を反応混合物に添加し、続いて1NのNaOHを用い、pHを6.0に調節した。氷上に10分混合物を放置した。ついで、反応混合物を、pH9.0以下に維持しつつ、100mMの二塩基EDTA(4.5ml)の冷溶液に添加した。ついで、1NのHCl水60ulでpHを8.0に調節した。
過剰のPEG-ONH2をイオン交換クロマトグラフィーにより除去した。冷却した反応混合物を、25mMのGlyGly、50mMのNaCl、pH8.0で予め平衡にされた、5mlのHiTrap Qイオン交換カラム(Amersham Bioscience)に充填した。一定の流量(1ml/分)及び温度(5℃)にて、25mMのGlyGly、50mMのNaCl、pH8.0(バッファーA)、10cvで、ついで25mMのGlyGly、50mMのNaCl、25mMのCaCl2、pH8.0(バッファーB)、15cvで、カラムを溶出させた。280nmの吸光度により溶出物をモニターした。フラクションをプール化し、1NのHClでpHを6.0に調節した。
5℃で操作されるFrac-950を具備するAKTA FPLC(Amersham Bioscience)を使用し、Superdex 200でのサイズ排除クロマトグラフィーにより、HiTrap Qからプール化フラクションとして回収されたグリコペグ化FVIIa変異体から非ペグ化FVIIaを除去した。XK26/60 HiLoad Superdex 200カラム(320ml cv)を予め平衡にしておき(10cv)、充填後、25mMのGlyGly、50mMのNaCl、25mMのCaCl2、pH6.0を用い、流量2.5ml/分で溶出させた。280nmの吸光度により溶出物をモニターした。10mlのフラクションを収集した。Invitrogenにより記載されたようにし、Simple Blueで染色されたSDS-PAGE(4-12%のビス-トリスNuPAGEゲル)で、UV活性(280nm)を含むフラクションを分析した。PEG置換レベルに従ってフラクションをプール化し、4000rpm、10℃、Amicon UltraTM-15(10K MWCO)遠心分離フィルターを介して濾過することにより濃縮した。
HS(ジ/トリ40K PEG)FVIIa:0.46mgのタンパク質(UV280nm)/ml、全量=3.0ml。
LS(モノ/ジ40K PEG)FVIIa:0.75mgのタンパク質(UV280nm)/ml、全量=3.7ml。
モノ40K PEG FVIIa:0.53mgのタンパク質(UV280nm)/ml、全量=4.5ml。
−過ヨウ素酸塩濃度及び最終の化合物のペプチド分解活性に対する影響
次の保存液を調製した:
2.8mMのPEG保存液:5K-PEG-ONH2(4.03mg;0.8umol、実施例1に記載したようにして、5K-PEG-NHSエステルから調製)を、CaCl2フリーのGlyGlyバッファー(25mMのGly-Gly、50mMのNaCl、pH6.0)281ulに溶解。20mMのNaIO4保存液:NaIO4(426mg;2mmol)を、CaCl2フリーのGlyGlyバッファー(25mMのGly-Gly、50mMのNaCl、pH6.0)100mlに入れたもの。100mMのEDTA溶液:10mlの水にEDTA-二ナトリウム塩(292mg)を入れたもの。1MのCaCl2溶液:10mlの水にCaCl2(1.12g)を入れたもの(0.45umのフィルターで濾過)。12.8uMの第VIIa因子溶液:1.0mlの25mM Gly-Gly、50mMのNaCl、25mMのCaCl2、pH6.0(GlyGlyバッファー)に(1.4mg、0.028umol)を溶解させたものを、100mMのEDTA溶液95ul、続いてCaCl2フリーのGlyGlyバッファー1.095mlに添加したもの(最終的なFVIIa濃度=0.64mg/ml)。保存液を以下のスキームに従い混合した。
これらの物質は、実施例3に記載したプロトコルを使用して調製する。
第IX因子(BeneFix)を、次の手順に従って賦形剤から精製した:凍結乾燥した材料(1000IU)を、滅菌水(4ml)で再構築させ、EDTA(200ul、0.25Mの水溶液、pH6)に添加した。5℃で10分後、サンプルを、25mMのGlyGly、100mMのNaCl、pH6.0で予め平衡にされた1mlのResource Qカラム(Amersham Bioscience)に充填した。カラムを1ml/分の流量で操作した。一定の流量(1ml/分)及び温度(5℃)にて、25mMのGlyGly、100mMのNaCl、pH6.0(バッファーA)、30cvで、ついで25mMのGlyGly、100mMのNaCl、10mMのCaCl2、pH6.0(バッファーB)、15cvで、カラムを溶出させた。280nmの吸光度により溶出物をモニターした。4.2mlのフラクションを収集し、タンパク質濃度を吸光度により測定し(1.32/mg/ml)、0.52mg/mlであった。
25mMのGlyGly、100mMのNaCl、pH6.0(2ml;1.04mg;18.54mmol)に精製したBenefixが入ったものを、80ul(1mMのNaIO4、80nmol、BeneFixにおけるシアル酸含有量に対して1当量)添加した。室温で2時間、混合物を攪拌し、ついで、25mMのGlyGly、100mMのNaCl、pH6.0に40K-PEG-ONH2((20K PEG)OCH2(20K PEG)OCHCH2OC(=O)O-CH2CH2ONH2; WO 2006042847;926ul;500uM;25×)が溶解した溶液を添加した。混合物を、室温で48時間放置した。メチオニン(100ul、25mMのGlyGly、100mMのNaCl、pH6.0に5mM)、続いてMeONH2(100ul、25mMのGlyGly、100mMのNaCl、pH6.0に5mM)を添加した。混合物を室温で30分放置し、ついで、さらに精製するまで、−80℃で凍結した。
過剰のPEG-ONH2試薬と非ペグ化FIXを、Frac-950を具備するAKTA FPLCにおいて操作される1mlのResource Qカラム(全てAmersham Bioscience)を使用するイオン交換クロマトグラフィーにより、グリコペグ化FIXから除去した。280nmの吸光度により溶出物をモニターした。1000ulのフラクションを収集し、プロセス中、流量を1ml/分に維持した。凍結された反応混合物をゆっくりと解凍し、EDTA(400ul、0.25Mの水溶液、pH6)に添加した。水を添加することにより、混合物の伝導率を9.3mSに調節した。ついで、混合物を、20cvの10mM ヒスチジン、50mMのNaCl、10mMのEDTA、0.01%のトゥイーン80、pH6.0で予め平衡にされたResource Qカラムに適用した。カラムを、15cvの10mM ヒスチジン、50mMのNaCl、10mMのEDTA、0.01%のトゥイーン80、pH6.0、続いて15cvの10mM ヒスチジン、50mMのNaCl、0.01%のトゥイーン80、pH6.0(バッファーA)で洗浄した。ついで、10mMのヒスチジン、50mMのMgCl2、0.01%のトゥイーン80、pH6.0(バッファーB)、15cvで、続いて100%のバッファーBで20cvで増加する勾配(0-80%)を用いて、カラムを溶出させた。Invitrogenにより記載されたようにして、Simple Blueで染色されたSDS-PAGE(4-12%のビス-トリスNuPAGEゲル)でフラクションを分析した。PEG置換レベルに従ってフラクションをプール化した。
LS(モノ/ジ40K PEG)FIX:34.3ugのタンパク質(UV280nm)/ml、全量=3ml。
モノ40K-PEG-FIX:70.7ugのタンパク質(UV280nm)/ml、全量=3ml。
WO 2005014035 A2に記載されたようにして、Molecular Probes Inc.(29851 Willow Creek Road, Eugene, OR 97402)からのAmplex Red Neuraminidase(Sialidase)アッセイキット(A-22178)を使用し、シアル酸含有量を測定した。
NaCl(36mg/ml);サッカロース(12mg/ml);L-ヒスチジン(6mg/ml);KCl(1mg/ml);ポリソルベート80(0.4mg/ml)を含有する1mlの分散バッファーに、第VIII因子(Refacto; WyetH、2000 IE)を溶解させた。ついで、400IE(200ulの構成バッファー中)を、Amiconultra 15,10K MWCOを使用するスピンフィルター(3x12分、13.000rpm)により、20mMのGlyGly、0.15MのNaCl;10mMのCaCl2;0.02%のトゥイーン80、pH7.3においてバッファー交換した。このFVIII溶液が30ulになるまで、20mMのGlyGly、0.15MのNaCl;10mMのCaCl2;0.02%のトゥイーン80、pH7.3に500uMの40K-PEG-ONH2(SunBrightgL2-400CA;20mg/ml)が入ったものを10ul、続いて3ulの100uM NaIO4水、及び12ulの20mM GlyGly、0.15MのNaCl;10mMのCaCl2;0.02%のトゥイーン80、pH7.3溶液を添加した。反応物を4℃で16時間インキュベートし、ついでSDS-ゲル(7%のトリスアセタートゲル150V/70分)で分析し、Invitrogenに記載されたようにして、SilverQuestで銀染色した。
ここに記載された本発明をよりよく例証するために、本発明の例示的な実施態様及び特徴のいくつかの非限定的列挙をここに提供する:
1.一般構造
(M-L-O-N=CH)n-P-(CH=N-O-L'-M')m (式I)
[上式中、M及び場合によってはM'は、独立して修飾された糖タンパク質の分子量を増加させるためのポリマー部分であり、L及びL'は、独立して二価リンカーを表し、Pは糖タンパク質の一又は複数の酸化グルカン末端を有する糖タンパク質を表し、O、N、C及びHは、それぞれ酸素、窒素、炭素及び水素原子を表し、nは1−10であり、mは0−50である]
を有する修飾された糖タンパク質を調製する方法であって、
a)糖タンパク質P*に存在する少なくとも一のグリカン末端を過ヨウ素酸イオンで酸化させ、ここで、P*は一又は複数のアルデヒド基を含む糖タンパク質P-(CHO)n+mを得るための複数のグリコフォームを表し、
b)P-(CHO)n+mをM-L-O-NH2と反応させて構造(M-L-O-N=CH)n-P-(CHO)mの修飾された糖タンパク質を得、
c)場合によっては、構造(M-L-O-N=CH)n-P-(CHO)mの糖タンパク質中の任意の未反応アルデヒド基をM'-L'-O-NH2と反応させて構造(M-L-O-N=CH)n-P-(CH=N-O-L'=M')mの修飾された糖タンパク質を得る
工程を含み、ここで、該過ヨウ素酸イオンは、糖タンパク質に存在する非還元グリカン末端の数に対して50当量未満の量で存在しており、該修飾された糖タンパク質は、出発糖タンパク質P*と比較して改善された薬理学的性質を有し、その機能活性は維持されている方法。
3.修飾された糖タンパク質が出発糖タンパク質と比較して改善された薬理学的性質を有していることを確認するさらなる工程を含む先の実施態様のいずれか一つの方法。
4.改善された薬理学的性質が、生物学的利用能の増加、機能的インビボ半減期の増加、インビボ血漿半減期の増加、免疫原性の低下、プロテアーゼ耐性の増加、アルブミンに対する親和性の増加、レセプターに対する親和性の改善、保存安定性の増加、機能的インビボ半減期の低減、インビボ血漿半減期の低減からなる群から選択される、先の実施態様のいずれか一つの方法。
6.免疫原性の低下が、M及び/又はM'を免疫原性部位に結合する抗体をブロックする基にすることにより得られる実施態様4の方法。
7.アルブミンに対する親和性の改善が、M及び/又はM'をアルブミンに対して高い親和性を有する基にすることにより得られる実施態様4の方法。
8.レセプターに対する親和性の改善が、M及び/又はM'を標的細胞上の表面レセプターに特異的に結合する基にすることにより得られる実施態様4の方法。
11.M及び/又はM'が、血清タンパク質結合リガンド、生理的条件下で荷電特性を変化させる部分を含む低有機分子、グリカンのレセプターへの結合を阻害する構造、及びグリカン特異的認識を防止する中性置換基からなる群から選択される先の実施態様のいずれか一つの方法。
14.糖タンパク質が、野生型ヒト第VII因子のアミノ酸配列を有している実施態様1−12のいずれか一つの方法。
16.修飾された糖タンパク質が、未修飾の糖タンパク質の生物学的利用能の少なくとも約110%、例えば少なくとも約120%、約130%、又は未修飾の糖タンパク質の生物学的利用能の少なくとも約140%の生物学的利用能を示す実施態様1−15のいずれか一つの方法。
17.修飾された糖タンパク質が、未修飾の糖タンパク質の半減期の少なくとも約125%、例えば約150%、約200%、又は未修飾の糖タンパク質の半減期の少なくとも約250%の血清半減期を示す実施態様1−15のいずれか一つの方法。
(M-L-O-N=CH)n-P-(CH=N-O-L'-M')m (式I)
[上式中、M及び場合によってはM'は、独立して、修飾された糖タンパク質の分子量を増加させるためのポリマー部分であり、L及びL'は、独立して二価リンカーを表し、Pは糖タンパク質の一又は複数の酸化グルカン末端を有する糖タンパク質を表し、O、N、C及びHは、それぞれ酸素、窒素、炭素及び水素原子を表し、nは1−10であり、mは0−50である]
を有する修飾された糖タンパク質であって、出発糖タンパク質P*と比較して改善された薬理学的性質を有し、その機能活性が維持されている修飾された糖タンパク質。
21.改善された薬理学的性質が、生物学的利用能の増加、機能的インビボ半減期の増加、インビボ血漿半減期の増加、免疫原性の低下、プロテアーゼ耐性の増加、アルブミンに対する親和性の増加、レセプターに対する親和性の改善、保存安定性の増加、機能的インビボ半減期の低減、インビボ血漿半減期の低減からなる群から選択される、実施態様19−20のいずれか一つの修飾された糖タンパク質。
23.免疫原性の低下が、M及び/又はM'を免疫原性部位に結合する抗体をブロックする基にすることにより得られる実施態様21の修飾された糖タンパク質。
24.アルブミンに対する親和性の改善が、M及び/又はM'をアルブミンに対して高い親和性を有する基にすることにより得られる実施態様21の修飾された糖タンパク質。
25.レセプターに対する親和性の改善が、M及び/又はM'を標的細胞における表面レセプターに特異的に結合する基にすることにより得られる実施態様21の修飾された糖タンパク質。
28.M及び/又はM'が、血清タンパク質結合リガンド、生理条件下で帯電特性を変化させる部分を有する低有機分子、グリカンのレセプターへの結合を阻害する構造、及びグリカン特異性認識を防止する中性置換基からなる群から選択される実施態様19−26のいずれか一つの修飾された糖タンパク質。
31.糖タンパク質が、野生型ヒト第VII因子のアミノ酸配列を有している実施態様19−29のいずれか一つの修飾された糖タンパク質。
33.修飾された糖タンパク質が、未修飾の糖タンパク質の生物学的利用能の少なくとも約110%、例えば少なくとも約120%、約130%、又は未修飾の糖タンパク質の生物学的利用能の少なくとも約140%の生物学的利用能を示す実施態様19−32のいずれか一つの修飾された糖タンパク質。
34.修飾された糖タンパク質が、未修飾の糖タンパク質の半減期の少なくとも約125%、例えば約150%、約200%、又は未修飾の糖タンパク質の半減期の少なくとも約250%の血清半減期を示す実施態様19−33のいずれか一つの方法。
(M-L-O-N=CH)n-P-(CH=N-O-L'-M')m (式I)
[上式中、M及び場合によってはM'は、独立して、修飾された糖タンパク質の分子量を増加させるためのポリマー部分であり、L及びL'は、独立して二価のリンカーを表し、Pは糖タンパク質の一又は複数の酸化グルカン末端を有する糖タンパク質を表し、O、N、C及びHは、それぞれ酸素、窒素、炭素及び水素原子を表し、nは1−10であり、mは0−50である]
を有する修飾された糖タンパク質であって、出発糖タンパク質P*と比較して改善された薬理学的性質を有し、その機能活性が維持され、実施態様1−12のいずれか一つの方法で得られる修飾された糖タンパク質。
37.製薬的に許容可能な担体、希釈剤、ビヒクル又は賦形剤と混合して、実施態様19−36のいずれか一つの修飾された糖タンパク質を含有する医薬組成物。
38.治療における使用のための実施態様19−36のいずれか一つの修飾された糖タンパク質。
Claims (15)
- 一般構造
(M-L-O-N=CH)n-P-(CH=N-O-L'-M')m (式I)
[上式中、M及び場合によってはM'は、独立して、修飾された糖タンパク質の分子量を増加させるためのポリマー部分であり、L及びL'は、独立して二価リンカーを表し、Pは糖タンパク質の一又は複数の酸化グルカン末端を有する糖タンパク質を表し、O、N、C及びHは、それぞれ酸素、窒素、炭素及び水素原子を表し、nは1−10であり、mは0−50である]
を有する修飾された糖タンパク質を調製する方法であって、
a)糖タンパク質P*に存在する少なくとも一のグリカン末端を過ヨウ素酸イオンで酸化させ、ここでP*は一又は複数のアルデヒド基を含む糖タンパク質P-(CHO)n+mを得るための複数のグリコフォームを表し、
b)P-(CHO)n+mをM-L-O-NH2と反応させて構造(M-L-O-N=CH)n-P-(CHO)mの修飾された糖タンパク質を得、
c)場合によっては、構造(M-L-O-N=CH)n-P-(CHO)mを有する糖タンパク質中の任意の未反応アルデヒド基をM'-L'-O-NH2と反応させて構造(M-L-O-N=CH)n-P-(CH=N-O-L'=M')mの修飾された糖タンパク質を得る
工程を含み、ここで、該過ヨウ素酸イオンは、糖タンパク質に存在する非還元グリカン末端の数に対して50当量未満の量で存在しており、該修飾された糖タンパク質は、出発糖タンパク質P*と比較して改善された薬理学的性質を有し、その機能活性は維持されている方法。 - M及び/又はM'が、一又は複数のカルボン酸、アミン、スルホン酸、ホスホン酸、又はその組合せを含みうる低分子量の有機荷電基;低分子量の中性親水性分子、例えばシクロデキストリン、又は分枝していてもよいポリエチレン鎖;低分子量の疎水性分子、例えば脂肪酸又はコール酸又はその誘導体;2−40kDaの平均分子量を有するポリエチレングリコール;詳細が明らかな精密ポリマー、例えば700Da〜20kDaの範囲の正確な分子量のデンドリマー;実質的に非免疫原性のポリペプチド、例えばアルブミン、抗体又は場合によってはFcドメインを含んでいる抗体の一部;及び高分子量の有機ポリマーからなる群から選択される請求項1に記載の方法。
- M及び/又はM'が、デンドリマー、ポリアルキレングリコール(PAG)を含むポリアルキレンオキシド(PAO)、例えばポリエチレングリコール(PEG)及びポリプロピレングリコール(PPG)、分枝状PEG、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン・無水マレイン酸コポリマー、ポリスチレン・無水マレイン酸コポリマー、デキストラン、カルボキシメチル-デキストラン、HES、MPC、及びPHFからなる群から選択される請求項1又は2に記載の方法。
- Pが、FVII、FVIII、FIX、FX、FII、FV、プロテインC、プロテインS、tPA、PAI-1、組織因子、FXI、FXII、FXIII、並びにその配列変異体;免疫グロブリン、サイトカイン、例えばインターロイキン、α-、β-、及びγ-インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子を含むコロニー刺激因子、線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、ホスホリパーゼ活性化タンパク質(PUP)、インスリン、植物タンパク質、例えばレクチン及びリシン、腫瘍壊死因子及び関連する対立遺伝子、腫瘍壊死因子レセプターの可溶型、インターロイキンレセプター及びインターロイキンレセプターの可溶型、増殖因子、例えば組織増殖因子、例えばTGFa’s又はTGFps、及び表皮増殖因子、ホルモン、ソマトメジン、エリスロポエチン、色素性ホルモン、視床下部放出因子、抗利尿ホルモン、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノーゲンアクチベータ、及び免疫グロブリン、例えばIgG、IgE、IgM、IgA、及びIgD、及びその断片、又は上述のタンパク質又はその断片の任意のものを含む任意の融合タンパク質から選択される請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 糖タンパク質が第VII因子ポリペプチドである請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 修飾された糖タンパク質が、未修飾の糖タンパク質の生物学的利用能の少なくとも約110%、例えば少なくとも約120%、約130%、又は未修飾の糖タンパク質の生物学的利用能の少なくとも約140%の生物学的利用能を示す請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 過ヨウ素酸イオンが、糖タンパク質に存在する非還元グリカン末端の数に対して、20当量未満、例えば10当量未満、例えば5当量未満、例えば1当量未満、例えば糖タンパク質に存在する非還元グリカン末端の数に対して、0.1−20当量の範囲、例えば0.1−10当量の範囲、例えば0.1−5当量の範囲、例えば0.1−1当量の範囲の量で存在する請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 一般構造
(M-L-O-N=CH)n-P-(CH=N-O-L'-M')m (式I)
[上式中、M及び場合によってはM'は、独立して、修飾された糖タンパク質の分子量を増加させるためのポリマー部分であり、L及びL'は、独立して二価リンカーを表し、Pは糖タンパク質の一又は複数の酸化グルカン末端を有する糖タンパク質を表し、O、N、C及びHは、それぞれ酸素、窒素、炭素及び水素原子を表し、nは1−10であり、mは0−50である]
を有する修飾された糖タンパク質であって、出発糖タンパク質P*と比較して改善された薬理学的性質を有し、その機能活性が維持されている修飾された糖タンパク質。 - M及び/又はM'が、一又は複数のカルボン酸、アミン類、スルホン酸、ホスホン酸、又はその組合せを含有してよい低分子量の有機荷電基;低分子量の中性親水性分子、例えばシクロデキストリン、又は場合によっては分枝状のポリエチレン鎖;低分子量の疎水性分子、例えば脂肪酸又はコール酸又はその誘導体;2−40kDaの平均分子量を有するポリエチレングリコール;詳細が明らかな精密ポリマー、例えば700Da〜20kDaの範囲の正確な分子量を有するデンドリマー;実質的に非免疫原性のポリペプチド、例えばアルブミン、抗体又は場合によってはFcドメインを含んでいる抗体の一部;及び高分子量の有機ポリマーからなる群から選択される請求項8に記載の修飾された糖タンパク質。
- M及び/又はM'が、デンドリマー、ポリアルキレングリコール(PAG)を含むポリアルキレンオキシド(PAO)、例えばポリエチレングリコール(PEG)及びポリプロピレングリコール(PPG)、分枝状PEG、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン・無水マレイン酸コポリマー、ポリスチレン・無水マレイン酸コポリマー、デキストラン、カルボキシメチル-デキストラン、HES、MPC及びPHFからなる群から選択される請求項8又は9に記載の修飾された糖タンパク質。
- Pが、FVII、FVIII、FIX、FX、FII、FV、プロテインC、プロテインS、tPA、PAI-1、組織因子、FXI、FXII、FXIII、並びにその配列変異体;免疫グロブリン、サイトカイン類、例えばインターロイキン、α-、β-、及びγ-インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子を含むコロニー刺激因子、線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、ホスホリパーゼ活性化タンパク質(PUP)、インスリン、植物タンパク質、例えばレクチン類及びリシン類、腫瘍壊死因子及び関連する対立遺伝子、腫瘍壊死因子レセプターの可溶型、インターロイキンレセプター及びインターロイキンレセプターの可溶型、増殖因子、例えば組織増殖因子、例えばTGFa’s又はTGFps、及び表皮増殖因子、ホルモン、ソマトメジン、エリスロポエチン、色素性ホルモン、視床下部放出因子、抗利尿ホルモン、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノーゲンアクチベータ、及び免疫グロブリン、例えばIgG、IgE、IgM、IgA、及びIgD、及びその断片、又は上述のタンパク質又はその断片の任意のものを含む任意の融合タンパク質から選択される請求項8から10のいずれか一項に記載の修飾された糖タンパク質。
- 糖タンパク質が第VII因子ポリペプチドである請求項8から11のいずれか一項に記載の修飾された糖タンパク質。
- 修飾された糖タンパク質が、未修飾の糖タンパク質の生物学的利用能の少なくとも約110%、例えば少なくとも約120%、約130%、又は未修飾の糖タンパク質の生物学的利用能の少なくとも約140%の生物学的利用能を示す、請求項8から12のいずれか一項に記載の修飾された糖タンパク質。
- 一般構造
(M-L-O-N=CH)n-P-(CH=N-O-L'-M')m (式I)
[上式中、M及び場合によってはM'は、独立して、修飾された糖タンパク質の分子量を増加させるためのポリマー部分であり、L及びL'は、独立して二価リンカーを表し、Pは糖タンパク質の一又は複数の酸化グルカン末端を有する糖タンパク質を表し、O、N、C及びHは、それぞれ酸素、窒素、炭素及び水素原子を表し、nは1−10であり、mは0−50である]
を有する修飾された糖タンパク質であって、出発糖タンパク質P*と比較して改善された薬理学的性質を有し、その機能活性が維持され、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法で得ることができる修飾された糖タンパク質。 - 製薬的に許容可能な担体、希釈剤、ビヒクル又は賦形剤と混合して、請求項8から14のいずれか一項に記載の修飾された糖タンパク質を含有する医薬組成物。
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