JP2019116500A - オキシム連結のための求核触媒 - Google Patents
オキシム連結のための求核触媒 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2019116500A JP2019116500A JP2019064337A JP2019064337A JP2019116500A JP 2019116500 A JP2019116500 A JP 2019116500A JP 2019064337 A JP2019064337 A JP 2019064337A JP 2019064337 A JP2019064337 A JP 2019064337A JP 2019116500 A JP2019116500 A JP 2019116500A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- growth factor
- protein
- factor
- therapeutic protein
- buffer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
- A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
- A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
- A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/24—Drugs for disorders of the endocrine system of the sex hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/02—Non-specific cardiovascular stimulants, e.g. drugs for syncope, antihypotensives
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Obesity (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Description
a)式:
b)式:
および
c)式:
PSAが、酸化剤とともにインキュベーションすることによって酸化され、PSAの非還元末端において末端アルデヒド基を形成する。関連した実施形態において、アミノオキシリンカーは3−オキサ−ペンタン−1,5−ジオキシアミンである。
a)式:
b)式:
c)式:
本願は特定の実施形態において例えば以下の項目を提供する:
(項目1)
水溶性ポリマーを治療用タンパク質の酸化炭水化物部分へ複合化させる方法であって、複合化を可能にする条件下で、前記酸化炭水化物部分を活性化水溶性ポリマーと接触させることを含み、
前記水溶性ポリマーが、活性アミノオキシ基を含有し、ポリエチレングリコール(PEG)、分岐PEG、PolyPEG(登録商標)(Warwick Effect Polymers、Coventry,UK)、ポリシアル酸(PSA)、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプン(HAS)、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアルキレンオキシド(PAO)、ポリアルキレングリコール(PAG)、ポリプロピレングリコール(PPG)、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレンコマレイン酸無水物、ポリ(1−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール)(PHF)、2−メタクリロイルオキシ−2’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート(MPC)からなる群から選択され、
前記炭水化物部分が、過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4)、四酢酸鉛(Pb(OAc)4)、および過ルテニウム酸カリウム(KRuO4)からなる群から選択される酸化剤を含む緩衝液とともにインキュベーションすることによって酸化され、
オキシム連結が、前記酸化炭水化物部分と前記水溶性ポリマー上の前記活性アミノオキシ基との間に形成され、
前記オキシム連結形成が、o−アミノ安息香酸、m−アミノ安息香酸、p−アミノ安息香酸、スルファニル酸、o−アミノベンズアミド、o−トルイジン、m−トルイジン、p−トルイジン、o−アニシジン、m−アニシジン、およびp−アニシジンからなる群から選択される求核触媒によって触媒される、方法。
(項目2)
水溶性ポリマーを治療用タンパク質の酸化炭水化物部分に複合化させる方法であって、複合化を可能にする条件下で、前記酸化炭水化物部分を活性化水溶性ポリマーと接触させることを含み、
前記治療用タンパク質が、第IX因子(FIX)、第VIII因子(FVIII)、第VIIa因子(FVIIa)、フォンヴィレブランド因子(VWF)、第FV因子(FV)、第X因子(FX)、第XI因子(FXI)、第XII因子(FXII)、トロンビン(FII)、プロテインC、プロテインS、tPA、PAI−1、組織因子(TF)、ADAMTS13プロテアーゼ、IL−1α、IL−1β、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−11、コロニー刺激因子−1(CSF−1)、M−CSF、SCF、GM−CSF、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、EPO、インターフェロンα(IFN−α)、コンセンサスインターフェロン、IFN−β、IFN−γ、IFN−ω、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−12、IL−13、IL−14、IL−15、IL−16、IL−17、IL−18、IL−19、IL−20、IL−21、IL−22、IL−23、IL−24、IL−31、IL−32α、IL−33、トロンボポエチン(TPO)、Ang−1、Ang−2、Ang−4、Ang−Y、アンジオポエチン様ポリペプチド1(ANGPTL1)、アンジオポエチン様ポリペプチド2(ANGPTL2)、アンジオポエチン様ポリペプチド3(ANGPTL3)、アンジオポエチン様ポリペプチド4(ANGPTL4)、アンジオポエチン様ポリペプチド5(ANGPTL5)、アンジオポエチン様ポリペプチド6(ANGPTL6)、アンジオポエチン様ポリペプチド7(ANGPTL7)、ビトロネクチン、血管内皮増殖因子(VEGF)、アンジオゲニン、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンC、骨形態形成タンパク質1、骨形態形成タンパク質2、骨形態形成タンパク質3、骨形態形成タンパク質4、骨形態形成タンパク質5、骨形態形成タンパク質6、骨形態形成タンパク質7、骨形態形成タンパク質8、骨形態形成タンパク質9、骨形態形成タンパク質10、骨形態形成タンパク質11、骨形態形成タンパク質12、骨形態形成タンパク質13、骨形態形成タンパク質14、骨形態形成タンパク質15、骨形態形成タンパク質受容体IA、骨形態形成タンパク質受容体IB、骨形態形成タンパク質受容体II、脳由来神経栄養因子、カルジオトロフィン−1、繊毛様神経栄養因子、繊毛様神経栄養因子受容体、クリプト、クリプティック、サイトカイン誘導好中球走化性因子1、サイトカイン誘導好中球走化性因子2α、サイトカイン誘導好中球走化性因子2β、β内皮細胞増殖因子、エンドセリン1、上皮増殖因子、エピゲン、エピレグリン、上皮誘導好中球誘引物質、線維芽細胞増殖因子4、線維芽細胞増殖因子5、線維芽細胞増殖因子6、線維芽細胞増殖因子7、線維芽細胞増殖因子8、線維芽細胞増殖因子8b、線維芽細胞増殖因子8c、線維芽細胞増殖因子9、線維芽細胞増殖因子10、線維芽細胞増殖因子11、線維芽細胞増殖因子12、線維芽細胞増殖因子13、線維芽細胞増殖因子16、線維芽細胞増殖因子17、線維芽細胞増殖因子19、線維芽細胞増殖因子20、線維芽細胞増殖因子21、酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、グリア細胞株誘導好中球因子受容体α1、グリア細胞株誘導好中球因子受容体α2、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質α、増殖関連タンパク質β、増殖関連タンパク質γ、ヘパリン結合上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、肝細胞癌由来増殖因子、インスリン様増殖因子I、インスリン様増殖因子受容体、インスリン様増殖因子II、インスリン様増殖因子結合タンパク質、ケラチノサイト増殖因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受容体α、神経増殖因子 神経増殖因子受容体、ニューロポエチン、ニューロトロフィン−3、ニューロトロフィン−4、オンコスタチンM(OSM)、胎盤増殖因子、胎盤増殖因子2、血小板由来内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子A鎖、血小板由来増殖因子AA、血小板由来増殖因子AB、血小板由来増殖因子B鎖、血小板由来増殖因子BB、血小板由来増殖因子受容体α、血小板由来増殖因子受容体β、プレB細胞増殖刺激因子、幹細胞因子(SCF)、幹細胞因子受容体、TNF、TNF0、TNF1、TNF2、形質転換増殖因子α、形質転換増殖因子β、形質転換増殖因子β1、形質転換増殖因子β1.2、形質転換増殖因子β2、形質転換増殖因子β3、形質転換増殖因子β5、潜伏形質転換増殖因子β1、形質転換増殖因子β結合タンパク質I、形質転換増殖因子β結合タンパク質II、形質転換増殖因子β結合タンパク質III、胸腺間質性リンパ球新生因子(TSLP)、I型腫瘍壊死因子受容体、II型腫瘍壊死因子受容体、ウロキナーゼタイププラスミノーゲン活性剤受容体、ホスホリパーゼ活性化タンパク質(PUP)、インスリン、レクチン リシン、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノゲン活性化因子、IgG、IgE、IgM、IgA、およびIgD、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、DNAse、フェチュイン、黄体形成ホルモン、エストロゲン、インスリン、アルブミン、リポタンパク質、フェトプロテイン、トランスフェリン、トロンボポエチン、ウロキナーゼ、インテグリン、トロンビン、レプチン、ヒュミラ(アダリムマブ)、Prolia(デノスマブ)、Enbrel(エタネルセプト)、表1中のタンパク質、またはその生物学的に活性なフラグメント、誘導体、もしくは変異体からなる群から選択され、
前記水溶性ポリマーが活性アミノオキシ基を含有し、ポリエチレングリコール(PEG)、分岐PEG、PolyPEG(登録商標)(Warwick Effect Polymers、Coventry,UK)、ポリシアル酸(PSA)、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプン(HAS)、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアルキレンオキシド(PAO)、ポリアルキレングリコール(PAG)、ポリプロピレングリコール(PPG)、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレンコマレイン酸無水物、ポリ(1−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール)(PHF)、2−メタクリロイルオキシ−2’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート(MPC)からなる群から選択され、
前記炭水化物部分が、過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4)、四酢酸鉛(Pb(OAc)4)、および過ルテニウム酸カリウム(KRuO4)からなる群から選択される酸化剤を含む緩衝液とともにインキュベーションすることによって酸化され、
オキシム連結が、前記酸化炭水化物部分と前記水溶性ポリマー上の前記活性アミノオキシ基との間に形成され、前記オキシム連結中、o−アミノ安息香酸、m−アミノ安息香酸、p−アミノ安息香酸、スルファニル酸、o−アミノベンズアミド、o−トルイジン、m−トルイジン、p−トルイジン、o−アニシジン、m−アニシジン、およびp−アニシジンからなる群から選択される求核触媒によって形成が触媒される、方法。
(項目3)
約0.3mg/mL〜約3.0mg/mLの初期濃度の前記治療用タンパク質を含む溶液が、前記活性化水溶性ポリマーと接触させる前に、pH値が約5.0〜約8.0になるように調整される、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記治療用タンパク質の前記初期濃度が、約1.0mg/mLであり、前記pHが、約6.0である、項目3に記載の方法。
(項目5)
前記治療用タンパク質が、所望の過剰濃度の活性化水溶性ポリマーによって接触され、前記過剰濃度が、約1モル〜約300モル過剰である、項目2に記載の方法。
(項目6)
前記過剰濃度が、約50倍のモル過剰である、項目5に記載の方法。
(項目7)
前記治療用タンパク質が、約0.5時間〜約24時間の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、前記活性化水溶性ポリマーとともにインキュベートされる、項目5に記載の方法。
(項目8)
前記条件が、約120分の期間、約22℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含む、項目7に記載の方法。
(項目9)
前記求核触媒が、約0.1分〜約30分の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、約1.0mM〜約50mMの求核触媒の最終濃度をもたらす量で添加される、項目2に記載の方法。
(項目10)
前記求核触媒の前記最終濃度が、約10mMであり、前記条件が、最大約15分の期間、約22℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含む、項目9に記載の方法。
(項目11)
前記酸化剤が、約0.1分〜120分の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、約50μM〜約1000μMの酸化剤の最終濃度をもたらす量で添加される、項目2に記載の方法。
(項目12)
前記酸化剤の最終濃度が、約400μMであり、前記条件が、約10分の期間、約22℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含む、項目11に記載の方法。
(項目13)
前記治療用タンパク質の前記酸化炭水化物部分への前記水溶性ポリマーの前記複合化が、L−システイン、メチオニン、グルタチオン、グリセロール、メタ重亜硫酸ナトリウム(Na2S2O5)、トリプトファン、チロシン、ヒスチジン、またはそれらの誘導体、クレゾール、イミダゾール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される反応停止剤の添加によって停止され、
前記反応停止剤が、約5分〜約120分の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、約1mM〜約100mMの反応停止剤の最終濃度をもたらす量で添加される、項目2に記載の方法。
(項目14)
前記反応停止剤が、L−システインである、項目13に記載の方法。
(項目15)
前記L−システインが、約10mMの最終濃度をもたらすように添加され、前記条件が、約60分の期間、約22℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含む、項目14に記載の方法。
(項目16)
a)pH値が約5.0〜約8.0になるように、前記治療用タンパク質を含む溶液の前記pH値を調整させることを含み、前記治療用タンパク質濃度が、約0.3mg/mL〜約3.0mg/mLである、第1のステップと、
b)前記治療用タンパク質において、1つ以上の炭水化物を酸化させることを含み、前記酸化剤が、約0.1分〜約120分の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、約50μM〜約1000μMの最終濃度をもたらすように、前記第1のステップ中の前記溶液に添加される、第2のステップと、
c)所望の過剰濃度の活性化水溶性ポリマーと前記治療用タンパク質を接触させることを含み、前記過剰濃度が、約1モル過剰〜約300モル過剰であり、約0.5時間〜約24時間の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下である、第3のステップと、
d)前記第3のステップの前記溶液に、求核触媒を添加することを含み、前記求核触媒が、約0.1分〜約30分の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、約1mM〜約50mMの最終濃度をもたらすように添加される、第4のステップと、
e)前記治療用タンパク質が、前記治療用タンパク質の1つ以上の酸化炭水化物への前記活性化水溶性ポリマーの前記複合化を可能にする条件下で、前記活性化水溶性ポリマーおよび求核触媒とともにインキュベートされ、前記条件が、約0.5時間〜約24時間の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む、第5のステップと、
f)第5のステップ中の前記治療用タンパク質の前記1つ以上の酸化炭水化物への前記水溶性ポリマーの前記共役が、L−システイン、メチオニン、グルタチオン、グリセロール、Na2S2O5(メタ重亜硫酸ナトリウム)、トリプトファン、チロシン、ヒスチジン、またはそれらの誘導体、クレゾール、イミダゾール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される反応停止剤の添加によって停止され、前記反応停止剤が、約5分〜約120分の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、約1mM〜約100mMの最終濃度をもたらすように添加される、第6のステップと、を含む、項目2に記載の方法。
(項目17)
前記第1のステップ中の前記治療用タンパク質の前記初期濃度が、約1mg/mLであり、前記pHが、約6.0であり、
前記第2のステップ中の前記酸化剤の最終濃度が、約400μMであり、前記第5のステップ中の前記条件が、約10分の期間、約22℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含み、
前記第3のステップ中の前記過剰濃度が、約50モル過剰であり、前記第3のステップ中の前記条件が、約15分の期間、約22℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含み、
前記第4のステップ中の前記求核触媒の前記最終濃度が、約10mMであり、前記第4のステップ中の前記条件が、約15分の期間、約22℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含み、
前記第5のステップ中の前記活性化水溶性ポリマーおよび求核触媒とともに前記治療用タンパク質をインキュベートする条件が、約2時間の期間、約22℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含み、
前記第6のステップ中の前記反応停止剤が、L−システインであり、前記L−システインが、約10mMの最終濃度をもたらすように添加され、前記第6のステップ中の前記条件が、約60分の期間、約22℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含む、項目16に記載の方法。
(項目18)
前記水溶性ポリマーがPSAである、項目2に記載の方法。
(項目19)
前記水溶性ポリマーがPEGである、項目2に記載の方法。
(項目20)
前記水溶性ポリマーがHESである、項目2に記載の方法。
(項目21)
前記水溶性ポリマーが、HASである、項目2に記載の方法。
(項目22)
前記PSAが約10〜300個のシアル酸単位からなる、項目18に記載の方法。
(項目23)
前記治療用タンパク質がFIXである、項目2〜22のいずれか1項に記載の方法。
(項目24)
前記治療用タンパク質がFVIIaである、項目2〜22のいずれか1項に記載の方法。
(項目25)
前記治療用タンパク質がFVIIIである、項目2〜22のいずれか1項に記載の方法。
(項目26)
前記酸化剤が過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4)である、項目2〜25のいずれか1項に記載の方法。
(項目27)
前記治療用タンパク質の前記酸化炭水化物部分が、前記血液凝固タンパク質の活性化ペプチド内に位置する、項目23〜25のいずれか1項に記載の方法。
(項目28)
前記PSAが、活性化アミノオキシリンカーを、酸化PSAと反応させることによって、調製され、
前記アミノオキシリンカーが、
a)式:
b)式:
c)式:
前記PSAが、酸化剤とともにインキュベーションすることによって酸化され、前記PSAの非還元末端において、末端アルデヒド基を形成する、項目18に記載の方法。
(項目29)
前記アミノオキシリンカーが、3−オキサ−ペンタン−1,5−ジオキシアミンである、項目28に記載の方法。
(項目30)
前記酸化剤が、NaIO4である、項目1〜29のいずれか1項に記載の方法。
(項目31)
前記求核触媒が、約1mM〜約50mMの濃度で提供される、項目1〜30のいずれか1項に記載の方法。
(項目32)
前記求核触媒が、m−トルイジンである、項目31に記載の方法。
(項目33)
前記m−トルイジンが、約10mMの濃度で、複合化反応において存在する、項目32に記載の方法。
(項目34)
シアノホウ化水素ナトリウム(NaCNBH3)、アスコルビン酸(ビタミンC)、およびNaBH3からなる群から選択される還元化合物を含む緩衝液中で前記複合化された治療用タンパク質をインキュベートすることによって、前記複合化された治療用タンパク質中のオキシム連結を還元するステップを更に含む、項目1〜33のいずれか1項に記載の方法。
(項目35)
前記還元化合物が、シアノホウ化水素ナトリウム(NaCNBH3)である、項目34に記載の方法。
(項目36)
前記複合化された治療用タンパク質を精製するステップを更に含む、項目1〜35のいずれか1項に記載の方法。
(項目37)
前記複合化された治療用タンパク質が、クロマトグラフィ、濾過、および沈殿からなる群から選択される方法によって精製される、項目36に記載の方法。
(項目38)
前記クロマトグラフィが、疎水性相互作用クロマトグラフィ(HIC)、イオン交換クロマトグラフィ(IEC)、サイズ排除クロマトグラフィ(SEC)、親和性クロマトグラフィ、および逆相クロマトグラフィからなる群から選択される、項目37に記載の方法。
(項目39)
抗カオトロピック塩が、クロマトグラフィの負荷ステップおよびクロマトグラフィの洗浄ステップにおいて使用される、項目38に記載の方法。
(項目40)
前記クロマトグラフィが、カラムにおいて行われる、項目38に記載の方法。
(項目41)
前記カラムが、フェニル−セファロースFFおよびブチル−セファロースFFからなる群から選択されるクロマトグラフィ樹脂を含む、項目40に記載の方法。
(項目42)
前記樹脂が、約5cm〜約20cmの床高さでカラム中に存在する、項目41に記載の方法。
(項目43)
前記床高さが、約10cmである、項目42に記載の方法。
(項目44)
流れ方向が、上向流に設定され、前記流速が、約0.2cm/分〜約6.7cm/分である、1つ以上の洗浄ステップを含む、項目40に記載の方法。
(項目45)
前記流速が、約2cm/分である、項目44に記載の方法。
(項目46)
流れ方向が、下向流に設定され、前記流速が、約0.1cm/分〜約6.7cm/分である、1つ以上の溶出ステップを含む、項目40〜45のいずれか1項に記載の方法。
(項目47)
前記流速が、約1cm/分である、項目46に記載の方法。
(項目48)
限外濾過/透析濾過(UF/DF)によって、前記複合化された治療用タンパク質を濃縮させることを更に含む、項目36〜47のいずれか1項に記載の方法。
(項目49)
前記治療用タンパク質の前記最終濃度が、約0.5〜約3mg/mLである、項目36〜48のいずれか1項に記載の方法。
(項目50)
前記治療用タンパク質が、約5〜約11個の水溶性ポリマー部分を含む、項目36〜49のいずれか1項に記載の方法。
(項目51)
前記複合化された治療用タンパク質が、クロマトグラフィを用いて精製され、抗カオトロピック塩が、負荷ステップおよび洗浄ステップにおいて使用され、前記方法が、流れ方向が、上向流に設定され、前記流速が、約0.2cm/分〜約6.7cm/分である、1つ以上の洗浄ステップと、流れ方向が、下向流に設定され、前記流速が、約0.2cm/分〜約6.7cm/分である、1つ以上の溶出ステップと、を含み、限外濾過/透析濾過(UF/DF)によって、前記複合化された治療用タンパク質を濃縮させることを更に含む、項目2に記載の方法。
(項目52)
前記クロマトグラフィが、疎水性相互作用クロマトグラフィ(HIC)であり、前記1つ以上の洗浄ステップの流速が、約2cm/分であり、前記1つ以上の溶出ステップの流速が、約1cm/分である、項目51に記載の方法。
(項目53)
項目1〜52のいずれか1項に記載の方法によって産生される、修飾された治療用タンパク質。
(項目54)
治療用タンパク質の酸化炭水化物部分と活性アミノオキシ基を含有する活性化水溶性ポリマーとの間のオキシム連結の形成方法であって、
a)過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4)、四酢酸鉛(Pb(OAc)4)、および過ルテニウム酸カリウム(KRuO4)からなる群から選択される酸化剤とともに前記タンパク質をインキュベートすることによって、治療用タンパク質の炭水化物成分を酸化させるステップと、
b)前記オキシム連結の形成を可能にする条件下で、求核触媒の存在下で、前記治療用タンパク質の前記酸化炭水化物部分と活性アミノオキシ基を含有する活性化水溶性ポリマーとの間のオキシム連結を形成するステップであって、
活性アミノオキシ基を含有する前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール(PEG)、分岐PEG、PolyPEG(登録商標)(Warwick Effect Polymers、Coventry,UK)、ポリシアル酸(PSA)、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプン(HAS)、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアルキレンオキシド(PAO)、ポリアルキレングリコール(PAG)、ポリプロピレングリコール(PPG)、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレンコマレイン酸無水物、ポリ(1−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール)(PHF)、2−メタクリロイルオキシ−2’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート(MPC)からなる群から選択され、
前記求核触媒が、o−アミノ安息香酸、m−アミノ安息香酸、p−アミノ安息香酸、スルファニル酸、o−アミノベンズアミド、o−トルイジン、m−トルイジン、p−トルイジン、o−アニシジン、m−アニシジン、およびp−アニシジンからなる群から選択される、オキシム連結を形成するステップと、を含む、方法。
(項目55)
治療用タンパク質の酸化炭水化物部分と活性アミノオキシ基を含有する活性化水溶性ポリマーとの間のオキシム連結の形成方法であって、
a)過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4)、四酢酸鉛(Pb(OAc)4)、および過ルテニウム酸カリウム(KRuO4)からなる群から選択される酸化剤とともに前記タンパク質をインキュベートすることによって、治療用タンパク質の炭水化物成分を酸化させるステップと、
b)前記オキシム連結の形成を可能にする条件下で、求核触媒の存在下で、前記治療用タンパク質の前記酸化炭水化物部分と、活性アミノオキシ基を含有する活性化水溶性ポリマーとの間のオキシム連結を形成するステップであって、
前記治療用タンパク質が、第IX因子(FIX)、第VIII因子(FVIII)、第VIIa因子(FVIIa)、フォンヴィレブランド因子(VWF)、第FV因子(FV)、第X因子(FX)、第XI因子(FXI)、第XII因子(FXII)、トロンビン(FII)、プロテインC、プロテインS、tPA、PAI−1、組織因子(TF)、ADAMTS13プロテアーゼ、IL−1α、IL−1β、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−11、コロニー刺激因子−1(CSF−1)、M−CSF、SCF、GM−CSF、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、EPO、インターフェロンα(IFN−α)、コンセンサスインターフェロン、IFN−β、IFN−γ、IFN−ω、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−12、IL−13、IL−14、IL−15、IL−16、IL−17、IL−18、IL−19、IL−20、IL−21、IL−22、IL−23、IL−24、IL−31、IL−32α、IL−33、トロンボポエチン(TPO)、Ang−1、Ang−2、Ang−4、Ang−Y、アンジオポエチン様ポリペプチド1(ANGPTL1)、アンジオポエチン様ポリペプチド2(ANGPTL2)、アンジオポエチン様ポリペプチド3(ANGPTL3)、アンジオポエチン様ポリペプチド4(ANGPTL4)、アンジオポエチン様ポリペプチド5(ANGPTL5)、アンジオポエチン様ポリペプチド6(ANGPTL6)、アンジオポエチン様ポリペプチド7(ANGPTL7)、ビトロネクチン、血管内皮増殖因子(VEGF)、アンジオゲニン、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンC、骨形態形成タンパク質1、骨形態形成タンパク質2、骨形態形成タンパク質3、骨形態形成タンパク質4、骨形態形成タンパク質5、骨形態形成タンパク質6、骨形態形成タンパク質7、骨形態形成タンパク質8、骨形態形成タンパク質9、骨形態形成タンパク質10、骨形態形成タンパク質11、骨形態形成タンパク質12、骨形態形成タンパク質13、骨形態形成タンパク質14、骨形態形成タンパク質15、骨形態形成タンパク質受容体IA、骨形態形成タンパク質受容体IB、骨形態形成タンパク質受容体II、脳由来神経栄養因子、カルジオトロフィン−1、繊毛様神経栄養因子、繊毛様神経栄養因子受容体、クリプト、クリプティック、サイトカイン誘導好中球走化性因子1、サイトカイン誘導好中球走化性因子2α、サイトカイン誘導好中球走化性因子2β、β内皮細胞増殖因子、エンドセリン1、上皮増殖因子、エピゲン、エピレグリン、上皮誘導好中球誘引物質、線維芽細胞増殖因子4、線維芽細胞増殖因子5、線維芽細胞増殖因子6、線維芽細胞増殖因子7、線維芽細胞増殖因子8、線維芽細胞増殖因子8b、線維芽細胞増殖因子8c、線維芽細胞増殖因子9、線維芽細胞増殖因子10、線維芽細胞増殖因子11、線維芽細胞増殖因子12、線維芽細胞増殖因子13、線維芽細胞増殖因子16、線維芽細胞増殖因子17、線維芽細胞増殖因子19、線維芽細胞増殖因子20、線維芽細胞増殖因子21、酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、グリア細胞株誘導好中球因子受容体α1、グリア細胞株誘導好中球因子受容体α2、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質α、増殖関連タンパク質β、増殖関連タンパク質γ、ヘパリン結合上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、肝細胞癌由来増殖因子、インスリン様増殖因子I、インスリン様増殖因子受容体、インスリン様増殖因子II、インスリン様増殖因子結合タンパク質、ケラチノサイト増殖因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受容体α、神経増殖因子 神経増殖因子受容体、ニューロポエチン、ニューロトロフィン−3、ニューロトロフィン−4、オンコスタチンM(OSM)、胎盤増殖因子、胎盤増殖因子2、血小板由来内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子A鎖、血小板由来増殖因子AA、血小板由来増殖因子AB、血小板由来増殖因子B鎖、血小板由来増殖因子BB、血小板由来増殖因子受容体α、血小板由来増殖因子受容体β、プレB細胞増殖刺激因子、幹細胞因子(SCF)、幹細胞因子受容体、TNF、TNF0、TNF1、TNF2、形質転換増殖因子α、形質転換増殖因子β、形質転換増殖因子β1、形質転換増殖因子β1.2、形質転換増殖因子β2、形質転換増殖因子β3、形質転換増殖因子β5、潜伏形質転換増殖因子β1、形質転換増殖因子β結合タンパク質I、形質転換増殖因子β結合タンパク質II、形質転換増殖因子β結合タンパク質III、胸腺間質性リンパ球新生因子(TSLP)、I型腫瘍壊死因子受容体、II型腫瘍壊死因子受容体、ウロキナーゼタイププラスミノーゲン活性剤受容体、ホスホリパーゼ活性化タンパク質(PUP)、インスリン、レクチン リシン、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノゲン活性化因子、IgG、IgE、IgM、IgA、およびIgD、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、DNAse、フェチュイン、黄体形成ホルモン、エストロゲン、インスリン、アルブミン、リポタンパク質、フェトプロテイン、トランスフェリン、トロンボポエチン、ウロキナーゼ、インテグリン、トロンビン、レプチン、ヒュミラ(アダリムマブ)、Prolia(デノスマブ)、Enbrel(エタネルセプト)、表1中のタンパク質、またはその生物学的に活性なフラグメント、誘導体、もしくは変異体からなる群から選択され、
活性アミノオキシ基を含有する前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール(PEG)、分岐PEG、PolyPEG(登録商標)(Warwick Effect Polymers、Coventry,UK)、ポリシアル酸(PSA)、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプン(HAS)、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアルキレンオキシド(PAO)、ポリアルキレングリコール(PAG)、ポリプロピレングリコール(PPG)、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレンコマレイン酸無水物、ポリ(1−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール)(PHF)、2−メタクリロイルオキシ−2’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート(MPC)からなる群から選択され、
前記求核触媒が、o−アミノ安息香酸、m−アミノ安息香酸、p−アミノ安息香酸、スルファニル酸、o−アミノベンズアミド、o−トルイジン、m−トルイジン、p−トルイジン、o−アニシジン、m−アニシジン、およびp−アニシジンからなる群から選択される、オキシム連結を形成するステップと、を含む、方法。
(項目56)
治療用タンパク質の酸化炭水化物部分と活性ヒドラジド基を含有する活性化水溶性ポリマーとの間のヒドラゾン連結の形成方法であって、
a)過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4)、四酢酸鉛(Pb(OAc)4)、および過ルテニウム酸カリウム(KRuO4)からなる群から選択される酸化剤とともに前記タンパク質をインキュベートすることによって、治療用タンパク質の炭水化物成分を酸化させるステップと、
b)前記ヒドラゾン連結の形成を可能にする条件下で、求核触媒の存在下で、前記治療用タンパク質の前記酸化炭水化物部分と活性ヒドラジド基を含有する前記活性化水溶性ポリマーとの間のヒドラゾン連結を形成するステップであって、
活性ヒドラジド基を含有する前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール(PEG)、分岐PEG、PolyPEG(登録商標)(Warwick Effect Polymers、Coventry,UK)、ポリシアル酸(PSA)、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプン(HAS)、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアルキレンオキシド(PAO)、ポリアルキレングリコール(PAG)、ポリプロピレングリコール(PPG)、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレンコマレイン酸無水物、ポリ(1−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール)(PHF)、2−メタクリロイルオキシ−2’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート(MPC)からなる群から選択され、
前記求核触媒が、o−アミノ安息香酸、m−アミノ安息香酸、p−アミノ安息香酸、スルファニル酸、o−アミノベンズアミド、o−トルイジン、m−トルイジン、p−トルイジン、o−アニシジン、m−アニシジン、およびp−アニシジンからなる群から選択される、ヒドラゾン連結を形成するステップと、を含む、方法。
(項目57)
治療用タンパク質の酸化炭水化物部分と活性ヒドラジド基を含有する活性化水溶性ポリマーとの間のヒドラゾン連結の形成方法であって、
a)過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4)、四酢酸鉛(Pb(OAc)4)、および過ルテニウム酸カリウム(KRuO4)からなる群から選択される酸化剤とともに前記タンパク質をインキュベートすることによって、治療用タンパク質の炭水化物成分を酸化させるステップと、
b)前記ヒドラゾン連結の形成を可能にする条件下で、求核触媒の存在下で、前記治療用タンパク質の前記酸化炭水化物部分と活性ヒドラジド基を含有する前記活性化水溶性ポリマーとの間のヒドラゾン連結を形成するステップであって、
前記治療用タンパク質が、第IX因子(FIX)、第VIII因子(FVIII)、第VIIa因子(FVIIa)、フォンヴィレブランド因子(VWF)、第FV因子(FV)、第X因子(FX)、第XI因子(FXI)、第XII因子(FXII)、トロンビン(FII)、プロテインC、プロテインS、tPA、PAI−1、組織因子(TF)、ADAMTS13プロテアーゼ、IL−1α、IL−1β、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−11、コロニー刺激因子−1(CSF−1)、M−CSF、SCF、GM−CSF、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、EPO、インターフェロンα(IFN−α)、コンセンサスインターフェロン、IFN−β、IFN−γ、IFN−ω、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−12、IL−13、IL−14、IL−15、IL−16、IL−17、IL−18、IL−19、IL−20、IL−21、IL−22、IL−23、IL−24、IL−31、IL−32α、IL−33、トロンボポエチン(TPO)、Ang−1、Ang−2、Ang−4、Ang−Y、アンジオポエチン様ポリペプチド1(ANGPTL1)、アンジオポエチン様ポリペプチド2(ANGPTL2)、アンジオポエチン様ポリペプチド3(ANGPTL3)、アンジオポエチン様ポリペプチド4(ANGPTL4)、アンジオポエチン様ポリペプチド5(ANGPTL5)、アンジオポエチン様ポリペプチド6(ANGPTL6)、アンジオポエチン様ポリペプチド7(ANGPTL7)、ビトロネクチン、血管内皮増殖因子(VEGF)、アンジオゲニン、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンC、骨形態形成タンパク質1、骨形態形成タンパク質2、骨形態形成タンパク質3、骨形態形成タンパク質4、骨形態形成タンパク質5、骨形態形成タンパク質6、骨形態形成タンパク質7、骨形態形成タンパク質8、骨形態形成タンパク質9、骨形態形成タンパク質10、骨形態形成タンパク質11、骨形態形成タンパク質12、骨形態形成タンパク質13、骨形態形成タンパク質14、骨形態形成タンパク質15、骨形態形成タンパク質受容体IA、骨形態形成タンパク質受容体IB、骨形態形成タンパク質受容体II、脳由来神経栄養因子、カルジオトロフィン−1、繊毛様神経栄養因子、繊毛様神経栄養因子受容体、クリプト、クリプティック、サイトカイン誘導好中球走化性因子1、サイトカイン誘導好中球走化性因子2α、サイトカイン誘導好中球走化性因子2β、β内皮細胞増殖因子、エンドセリン1、上皮増殖因子、エピゲン、エピレグリン、上皮誘導好中球誘引物質、線維芽細胞増殖因子4、線維芽細胞増殖因子5、線維芽細胞増殖因子6、線維芽細胞増殖因子7、線維芽細胞増殖因子8、線維芽細胞増殖因子8b、線維芽細胞増殖因子8c、線維芽細胞増殖因子9、線維芽細胞増殖因子10、線維芽細胞増殖因子11、線維芽細胞増殖因子12、線維芽細胞増殖因子13、線維芽細胞増殖因子16、線維芽細胞増殖因子17、線維芽細胞増殖因子19、線維芽細胞増殖因子20、線維芽細胞増殖因子21、酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、グリア細胞株誘導好中球因子受容体α1、グリア細胞株誘導好中球因子受容体α2、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質α、増殖関連タンパク質β、増殖関連タンパク質γ、ヘパリン結合上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、肝細胞癌由来増殖因子、インスリン様増殖因子I、インスリン様増殖因子受容体、インスリン様増殖因子II、インスリン様増殖因子結合タンパク質、ケラチノサイト増殖因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受容体α、神経増殖因子 神経増殖因子受容体、ニューロポエチン、ニューロトロフィン−3、ニューロトロフィン−4、オンコスタチンM(OSM)、胎盤増殖因子、胎盤増殖因子2、血小板由来内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子A鎖、血小板由来増殖因子AA、血小板由来増殖因子AB、血小板由来増殖因子B鎖、血小板由来増殖因子BB、血小板由来増殖因子受容体α、血小板由来増殖因子受容体β、プレB細胞増殖刺激因子、幹細胞因子(SCF)、幹細胞因子受容体、TNF、TNF0、TNF1、TNF2、形質転換増殖因子α、形質転換増殖因子β、形質転換増殖因子β1、形質転換増殖因子β1.2、形質転換増殖因子β2、形質転換増殖因子β3、形質転換増殖因子β5、潜伏形質転換増殖因子β1、形質転換増殖因子β結合タンパク質I、形質転換増殖因子β結合タンパク質II、形質転換増殖因子β結合タンパク質III、胸腺間質性リンパ球新生因子(TSLP)、I型腫瘍壊死因子受容体、II型腫瘍壊死因子受容体、ウロキナーゼタイププラスミノーゲン活性剤受容体、ホスホリパーゼ活性化タンパク質(PUP)、インスリン、レクチン リシン、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノゲン活性化因子、IgG、IgE、IgM、IgA、およびIgD、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、DNAse、フェチュイン、黄体形成ホルモン、エストロゲン、インスリン、アルブミン、リポタンパク質、フェトプロテイン、トランスフェリン、トロンボポエチン、ウロキナーゼ、インテグリン、トロンビン、レプチン、ヒュミラ(アダリムマブ)、Prolia(デノスマブ)、Enbrel(エタネルセプト)、表1中のタンパク質、またはその生物学的に活性なフラグメント、誘導体、もしくは変異体からなる群から選択され、
活性ヒドラジド基を含有する前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール(PEG)、分岐PEG、PolyPEG(登録商標)(Warwick Effect Polymers、Coventry,UK)、ポリシアル酸(PSA)、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプン(HAS)、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアルキレンオキシド(PAO)、ポリアルキレングリコール(PAG)、ポリプロピレングリコール(PPG)、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレンコマレイン酸無水物、ポリ(1−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール)(PHF)、2−メタクリロイルオキシ−2’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート(MPC)からなる群から選択され、
前記求核触媒が、o−アミノ安息香酸、m−アミノ安息香酸、p−アミノ安息香酸、スルファニル酸、o−アミノベンズアミド、o−トルイジン、m−トルイジン、p−トルイジン、o−アニシジン、m−アニシジン、およびp−アニシジンからなる群から選択される、ヒドラゾン連結を形成するステップと、を含む、方法。
(項目58)
活性アミノオキシ基を含有する前記水溶性ポリマーが、
a)約1分間〜約24時間の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む、酸化水溶性ポリマーと活性化アミノオキシリンカーとの間の安定したオキシム連結の形成を可能にする条件下で、活性アミノオキシ基を含む前記活性化アミノオキシリンカーとともに、前記酸化水溶性ポリマーを含む溶液をインキュベートし、それによって、活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーを形成することと、
b)クロマトグラフィ、濾過、および沈殿からなる群から選択される方法によって、活性アミノオキシ基を含有する前記水溶性ポリマーを精製することと、を含む、方法によって調製される、項目1〜52のいずれか1項に記載の方法。
(項目59)
活性アミノオキシ基を含有する前記水溶性ポリマーが、
a)約1分間〜約24時間の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む、酸化水溶性ポリマーと活性化アミノオキシリンカーとの間の安定したオキシム連結の形成を可能にする条件下で、活性アミノオキシ基を含む前記活性化アミノオキシリンカーとともに、前記酸化水溶性ポリマーを含む溶液をインキュベートし、それによって、活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーを形成することと、
b)約1分間〜約24時間の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む、酸化水溶性ポリマーと活性化アミノオキシリンカーとの間の安定したアルコキサミン(alkoxamine)連結の形成を可能にする条件下で、還元剤とともに、ステップa)の活性アミノオキシ基を含有する前記水溶性ポリマーを含む溶液をインキュベートすることと、
c)クロマトグラフィ、濾過、および沈殿からなる群から選択される方法によって、活性アミノオキシ基を含有する前記水溶性ポリマーを精製することと、を含む、方法によって調製される、項目1〜52のいずれか1項に記載の方法。
(項目60)
活性アミノオキシ基を含有する前記水溶性ポリマーが、
a)約1分間〜約24時間の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む、酸化水溶性ポリマーと活性化アミノオキシリンカーとの間の安定したオキシム連結の形成を可能にする条件下で、活性アミノオキシ基を含む前記活性化アミノオキシリンカーとともに、前記酸化水溶性ポリマーを含む溶液をインキュベートし、それによって、活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーを形成することと、
b)約1分間〜約24時間の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、求核触媒とともに、ステップa)の活性アミノオキシ基を含有する前記水溶性ポリマーを含む溶液をインキュベートすることと、
c)クロマトグラフィ、濾過、および沈殿からなる群から選択される方法によって、活性アミノオキシ基を含有する前記水溶性ポリマーを精製することと、を含む、方法によって調製される、項目1〜52のいずれか1項に記載の方法。
(項目61)
活性アミノオキシ基を含有する前記水溶性ポリマーが、
a)約1分間〜約24時間の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む、酸化水溶性ポリマーと活性化アミノオキシリンカーとの間の安定したオキシム連結の形成を可能にする条件下で、活性アミノオキシ基を含む前記活性化アミノオキシリンカーとともに、前記酸化水溶性ポリマーを含む溶液をインキュベートし、それによって、活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーを形成することと、
b)約1分間〜約24時間の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、求核触媒とともに、ステップa)の活性アミノオキシ基を含有する前記水溶性ポリマーを含む溶液をインキュベートすることと、
c)約1分間〜約24時間の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む、前記酸化水溶性ポリマーと前記活性化アミノオキシリンカーとの間の安定したアルコキサミン(alkoxamine)連結の形成を可能にする条件下で、還元剤とともに、ステップb)の活性アミノオキシ基を含有する前記水溶性ポリマーを含む溶液をインキュベートすることと、
d)クロマトグラフィ、濾過、および沈殿からなる群から選択される方法によって、活性アミノオキシ基を含有する前記水溶性ポリマーを精製することと、を含む、方法によって調製される、項目1〜52のいずれか1項に記載の方法。
(項目62)
前記酸化水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール(PEG)、分岐PEG、PolyPEG(登録商標)(Warwick Effect Polymers、Coventry,UK)、ポリシアル酸(PSA)、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプン(HAS)、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアルキレンオキシド(PAO)、ポリアルキレングリコール(PAG)、ポリプロピレングリコール(PPG)、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレンコマレイン酸無水物、ポリ(1−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール)(PHF)、2−メタクリロイルオキシ−2’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート(MPC)からなる群から選択され、前記水溶性ポリマーが、酸化剤とともにインキュベーションすることによって酸化され、前記水溶性ポリマーの非還元末端において、末端アルデヒド基を形成する、項目58〜61のいずれか1項に記載の方法。
(項目63)
前記水溶性ポリマーが、PSAである、項目62に記載の方法。
(項目64)
前記酸化剤が、NaIO4である、項目62に記載の方法。
(項目65)
前記アミノオキシリンカーが、
a)式:
b)式:
c)式:
(項目66)
前記還元剤が、シアノホウ化水素ナトリウム(NaCNBH3)、アスコルビン酸(ビタミンC)、およびNaBH3からなる群から選択される、項目59および61のいずれか1項に記載の方法。
(項目67)
前記還元剤が、シアノホウ化水素ナトリウム(NaCNBH3)である、項目66に記載の方法。
(項目68)
前記求核触媒が、o−アミノ安息香酸、m−アミノ安息香酸、p−アミノ安息香酸、スルファニル酸、o−アミノベンズアミド、o−トルイジン、m−トルイジン、p−トルイジン、o−アニシジン、m−アニシジン、およびp−アニシジンからなる群から選択される、項目60および61のいずれか1項に記載の方法。
(項目69)
前記求核触媒が、m−トルイジンである、項目68に記載の方法。
(項目70)
前記求核触媒が、約1.0mM〜約50mMの求核触媒の最終濃度をもたらす量で添加される、項目68〜69のいずれか1項に記載の方法。
(項目71)
限外濾過/透析濾過(UF/DF)によって、前記複合化された治療用タンパク質を濃縮させることを更に含む、項目58〜70のいずれか1項に記載の方法。
治療用タンパク質
本発明のある実施形態において、上述のポリペプチドおよびポリヌクレオチドの典型的なものは以下の治療用タンパク質である:酵素、抗原、抗体、受容体、血液凝固タンパク質、増殖因子、ホルモン、およびリガンド。ある実施形態において、治療用タンパク質は、第IX因子(FIX)、第VIII因子(FVIII)、第VIIa因子(FVIIa)、フォンヴィレブランド因子(VWF)、第FV因子(FV)、第X因子(FX)、第XI因子(FXI)、第XII因子(FXII)、トロンビン(FII)、プロテインC、プロテインS、tPA、PAI−1、組織因子(TF)、およびADAMTS13プロテアーゼ等の血液凝固タンパク質である。一実施形態において、本発明による治療用タンパク質は糖タンパク質であるか、または様々な実施形態において、インビボで自然にグリコシル化されないタンパク質(即ち、天然にグリコシル化部位を含有しないタンパク質か、または精製前に宿主細胞中においてグリコシル化されないタンパク質)である。
血液凝固タンパク質
一態様では、本発明の出発物質は、血液凝固タンパク質であり、これは、米国特許第4,757,006号、米国特許第5,733,873号、米国特許第5,198,349号、米国特許第5,250,421号、米国特許第5,919,766号、欧州特許第306 968号に説明されるように、ヒト血漿に由来され得るか、または組換え体操作技術によって産生され得る。
第VIIa因子
FVII(安定因子またはプロコンベルチンとしても公知である)は、止血および凝固で中枢的役割を有する、ビタミンK依存性セリンプロテアーゼ糖タンパク質である(Eigenbrot,Curr Protein Pept Sci.2002;3:287−99)。
第IX因子
FIXは、カルシウム鉄、リン脂質、およびFVIIIaの存在下で、FXをその活性型に変換することによって、血液凝固の内因性経路に関与するビタミンK依存性血漿タンパク質である。FIXの主な触媒能は、FX内の特定のアルギニン−イソロイシン結合に対して特異性を有するセリンプロテアーゼとしての触媒能である。FIXの活性化は、FIXからの活性化ペプチドの除去をもたらし、1つまたは複数のジスルフィド結合によって保持される2つの鎖を含む活性化したFIX分子を産生する、FXIaによって生じる。FIXの欠損は、劣性X連鎖血友病Bの原因である。
第VIII因子
凝固第VIII因子(FVIII)は、非常に低い濃度で血漿中を循環し、フォンヴィレブランド因子(VWF)に非共有結合する。止血中、FVIIIは、VWFから分離され、カルシウムおよびリン脂質、または細胞膜の存在下で、活性化の速度を強化させることによって、活性化第IX因子(FIXa)媒介のFX活性化のための補因子として機能する。
A.ポリペプチド
一態様では、本発明の出発物質は、タンパク質またはポリペプチドである。本明細書に説明するとき、治療用タンパク質という用語は、治療用タンパク質に関連する生物学的活性を呈する、任意の治療用タンパク質分子を指す。本発明の一実施形態において、治療用タンパク質分子は、完全長のタンパク質である。
本発明の治療用タンパク質をコードする核酸としては、例えば、遺伝子、pre−mRNA、mRNA、cDNA、多形変異体、対立遺伝子、合成、および天然変異体が挙げられるが、これらに限定されない。
C.治療用タンパク質の産生
治療用タンパク質の産生には、(i)遺伝子操作による組換えDNAの産生、(ii)例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、またはマイクロインジェクションによる(これらに限定されない)原核細胞または真核細胞への組換えDNAの導入、(iii)該形質転換細胞の培養、(iv)例えば構造的または誘発時の治療用タンパク質の発現、(v)精製した治療用タンパク質を得るために、例えば培養培地から、または形質転換細胞を収集することによる該血液凝固タンパク質の単離、に関して当該技術分野で公知の任意の方法が含まれる。
D.投与
一実施形態において、本発明の複合化された治療用タンパク質は、静脈内、筋肉内、または腹腔内注入等の注入によって投与されてもよい。
水溶性ポリマー
一態様では、提供される治療用タンパク質誘導体(即ち、複合化された治療用タンパク質)分子は、ポリエチレングリコール(PEG)、分岐PEG、ポリシアル酸(PSA)、ヒドロキシアルキルデンプン(HAS)、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレンオキシド(PAO)、ポリアルキレングリコール(PAG)、ポリプロピレングリコール(PPG)、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレン−コマレイン酸無水物、ポリ(1−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール)(PHF)、2−メタクリロイルオキシ−2’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート(MPC)が挙げられるが、これらに限定されない、水溶性ポリマーに結合される。本発明の一実施形態において、水溶性ポリマーは、350〜120,000、500〜100,000、1000〜80,000、1500〜60,000、2,000〜45,000Da、3,000〜35,000Da、および5,000〜25,000Daの範囲の分子量を有する、シアル酸分子からなる。水溶性ポリマーの結合は、タンパク質への直接結合によって、またはリンカー分子を介して実行することができる。化学的リンカーの一例は、炭水化物−選択的ヒドラジドおよびスルフヒドリル反応マレイミド基を含有する、MBPH(4−[4−N−マイレインイミドフェニル]酪酸ヒドラジド)である(Chamow et al.,J Biol Chem 1992;267:15916−22)。他の例示的および好ましいリンカーは、下に説明される。
A.シアル酸およびPSA
PSAは、N−アセチルノイラミン酸のポリマー(通常、ホモポリマー)からなる。二級アミノ基は、一般に、アセチル基を保有するが、その代わりにグリコシル基を保有してもよい。ヒドロキシル基における可能な置換基としては、アセチル基、ラクチル基、エチル基、硫酸基、およびリン酸基が挙げられる。
PSAおよびmPSAは、一般的には、2,8−または2,9−グリコシド連結、あるいはこれらの組み合わせ(例えば、2,8−および2,9−で交互に連結したもの)によって連結されたN−アセチルノイラミン酸部分から本質的になる直鎖状ポリマーを含む。特に好ましいPSAおよびmPSAでは、グリコシド連結はa−2,8である。そのようなPSAおよびmPSAは、好都合には、コロミン酸に由来し、本明細書中では「CA」および「mCA」と称される。典型的なPSAおよびmPSAは、少なくとも2個、好ましくは少なくとも5個、より好ましくは少なくとも10個、および最も好ましくは少なくとも20個のN−アセチルノイラミン酸部分を含む。したがって、それらは、2〜300個のN−アセチルノイラミン酸部分、好ましくは5〜200個のN−アセチルノイラミン酸部分、または最も好ましくは10〜100個のN−アセチルノイラミン酸部分を含み得る。PSAおよびCAは、好ましくは、N−アセチルノイラミン酸以外の糖部分を本質的に含まない。したがって、PSAおよびCAは、好ましくは、少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、および最も好ましくは少なくとも98%のN−アセチルノイラミン酸部分を含む。
コロミン酸(PSAの部分集合)は、α(2→8)ケトーシス連結によるN−アセチルノイラミン酸(NANA)のホモポリマーであり、とりわけ、K1抗原を有する大腸菌の特定の株によって産生される。コロミン酸は、多くの生理学的機能を有する。それらは、薬物および化粧品の原材料として重要である。
B.ポリエチレングリコール(PEG)およびPEG化
ある特定の態様では、治療用タンパク質は、種々の化学的方法のいずれかによって、水溶性ポリマーに複合化される(Roberts JM et al.,Advan Drug Delivery Rev 2002;54:459−76)。例えば、一実施形態において、治療用タンパク質は、PEGの複合化によって、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステルを使用して、タンパク質の遊離アミノ基に修飾される。別の実施形態において、水溶性ポリマー、例えば、PEGは、マレインイミド化学、または前酸化後に、治療用タンパク質の炭水化物部分へのPEGヒドラジドもしくはPEGアミンの結合を使用して、遊離SH基に結合される。
mPEG−プロピオン酸スクシンイミジル(mPEG−SPA)
分岐PEG N−ヒドロキシスクシンイミド(mPEG2−NHS)
直鎖PEG誘導体(NOF Corp.)の一般構造:
C.ヒドロキシアルキルデンプン(HAS)およびヒドロキシエチルデンプン(HES)
本発明の種々の実施形態において、治療用タンパク質分子は、ヒドロキシアルキルデンプン(HAS)もしくはホドロキシエチルデンプン(HES)、またはそれらの誘導体を使用して化学的に修飾される。
D.付着方法
治療用タンパク質は、当業者に公知の種々の技術のいずれかによって、多糖類化合物に共有連結され得る。本発明の種々の態様では、シアル酸部分は、例えば、米国特許第4,356,170号に説明される方法(参照により、本明細書に組み込まれる)によって、治療用タンパク質、例えば、FIX、FVIII、FVIIa、またはVWFに結合される。
E.アミノオキシ連結
本発明の一実施形態において、オキシム基を形成するための、アルデヒド(例えば過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化後の炭水化物部分上)とのヒドロキシルアミンまたはヒドロキシルアミン誘導体の反応が、血液凝固タンパク質の複合体の調製に適用される。例えば、糖タンパク質(例えば本発明に従う治療用タンパク質)は、まず、過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4)等の酸化剤で酸化される(Rothfus JA et Smith EL.,J Biol Chem 1963,238,1402−10、およびVan Lenten L and Ashwell G.,J Biol Chem 1971,246,1889−94)。糖タンパク質の過ヨウ素酸塩酸化は、1928年の過ヨウ素酸塩との隣接ジオールの酸化に説明された古典的マラプラード反応に基づいて、活性アルデヒド基を形成する(Malaprade L.,Analytical application,Bull Soc Chim France,1928,43,683−96)。かかる酸化剤のさらなる例は、四酢酸鉛(Pb(OAc)4)、酢酸マンガン(MnO(Ac)3)、酢酸コバルト(Co(OAc)2)、酢酸タリウム(TlOAc)、硫酸セリウム(Ce(SO4)2)(米国特許第4,367,309号)、または過ルテニウム酸カリウム(KRuO4)(Marko et al.,J Am Chem Soc 1997,119,12661−2)である。「酸化剤」とは、炭水化物中の隣接ジオールを酸化し、それによって、生理学的反応条件下で、活性アルデヒド基を生成することが可能な温和な酸化化合物を意味する。
求核触媒
本明細書に説明される通り、治療用タンパク質への水溶性ポリマーの複合化は、アニリンによって触媒され得る。アニリンは、アルデヒドおよびケトンの水性反応を強く触媒し、ヒドラゾンおよびオキシム等の安定したイミンを形成する。以下の略図は、無触媒反応とアニリン触媒オキシムライゲーション反応を比較する(Kohler JJ,ChemBioChem 2009;10:2147−50):
共役タンパク質の精製
種々の実施形態において、酸化剤でインキュベートされているタンパク質および/または本開示に従って水溶性ポリマーで複合化されている治療用タンパク質の精製が望ましい。多くの精製技術が、当該技術分野で知られており、これには、イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、および親和性クロマトグラフィ、またはそれらの組み合わせ等のクロマトグラフ法、濾過法、ならびに沈殿法(Guide to Protein Purification,Meth.Enzymology Vol 463(edited by Burgess RR and Deutscher MP),2nd edition,Academic Press 2009)が挙げられるが、これらに限定されない。
ホモ二官能性リンカーNH2[OCH2CH2]2ONH2の調製
ホモ二官能性リンカーNH2[OCH2CH2]2ONH2
ホモ二官性リンカーNH2[OCH2CH2]4ONH2の調製
ホモ二官能性リンカーNH2[OCH2CH2]4ONH2
ホモ二官性リンカーNH2[OCH2CH2]6ONH2の調製
ホモ二官能性リンカーNH2[OCH2CH2]6ONH2
アミノオキシ−PSA試薬の詳細な合成
3−オキサ−ペンタン−1,5ジオキシアミンを、実施例1に概説される2ステップ有機合成で、Botyrynら(Tetrahedron 1997;53:5485−92)に従って合成した。
ステップ1:
700mLの無水N,N−ジメチルホルムアミド中のエンド−N−ヒドロキシ−5−ノルボルネン−2,3−ジカルボキシイミド(59.0g、1.00当量)の溶液に、無水K2CO3(45.51g、1.00当量)および2,2−ジクロロジエチルエーテル(15.84mL、0.41当量)を添加した。反応混合物を50℃で22時間撹拌した。混合物を減圧下で乾燥するまで蒸発させた。残渣を、2Lのジクロロメタン中で懸濁し、NaCl飽和水溶液(各1L)で2回、抽出した。ジクロロメタン層を、Na2SO4で乾燥させ、次いで、減圧下で乾燥するまで蒸発させ、高真空内で乾燥して、白黄色の固体(中間体1)として64.5gの3−オキサペンタン−1,5−ジオキシ−エンド−2’,3’−ジカルボキシジイミドノルボルネンを得た。
ステップ2:
800mLの無水エタノール中の中間体1(64.25g、1.00当量)の溶液に、31.0mLのヒドラジン水和物(4.26当量)を添加した。次いで、反応混合物を2時間還流させた。混合物を、減圧下で溶媒を蒸発させることによって、出発体積の半分まで濃縮した。生じた沈殿物を濾去した。残りのエタノール層を、減圧下で乾燥するまで蒸発させた。粗生成物3−オキサ−ペンタン−1,5−ジオキシアミンを含有する残渣を、真空内で乾燥させ、46.3gを得た。粗生成物を更にに、カラムクロマトグラフィ(シリカゲル60、ジクロロメタン/メタノール混合物での定組成溶離、9/1)によって精製して、11.7gの純最終生成物3−オキサ−ペンタン−1,5−ジオキシアミンを得た。
アミノオキシ−PSAの調製
Serum Institute of India(Pune,India)から得た1000mgの酸化PSA(分子量=20kD)を、16mLの50mMのリン酸緩衝液、pH6.0中に溶解した。次いで、170mgの3−オキサ−ペンタン−1,5−ジオキシアミンを反応混合物に添加した。室温で2時間振とうした後、78.5mgのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、反応を、一晩かけて18時間行った。次いで、反応混合物を、再生成されたセルロース(50cm2、Millipore)から作製された5kDのカットオフを有する膜を使用する限外濾過/透析濾過の手順(UF/DF)に供した。
クロマトグラフィ精製ステップを採用するアミノオキシ−PSAの調製
Serum Institute of India(Pune,India)から得た1290mgの酸化PSA(分子量=20kD)を、25mLの50mMのリン酸緩衝液(緩衝液A)、pH6.0中に溶解した。次いで、209mgの3−オキサ−ペンタン−1,5−ジオキシアミンを反応混合物に添加した。室温で1時間振とうした後、101mgのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、反応を、3時間行った。次いで、混合物を、Fractogel EMD DEAE 650−Mクロマトグラフィゲル(カラム寸法:XK26/135)を採用する穏やかな陰イオン交換クロマトグラフィに供した。反応混合物を110mLの緩衝液Aで希釈し、1cm/分の流速で、緩衝液Aで事前に平衡化したDEAEカラム上に負荷した。次いで、カラムを20CVの緩衝液B(20mMのHepes、pH6.0)で洗浄し、2cm/分の流速で、遊離3−オキサ−ペンタン−1,5−ジオキシアミンおよびシアン化物を除去した。次いで、アミノオキシ−PSA試薬を、67%の緩衝液Bおよび43%の緩衝液C(20mMのHepes、1MのNaCl、pH7.5)からなるステップ勾配で溶出した。溶出液を、ポリエーテルスルホン(50cm2、Millipore)から作製された5kDの膜を使用する限外濾過/透析濾過によって濃縮した。最終透析濾過ステップを緩衝液D(20mMのHepes、90mMのNaCl、pH7.4)に対して行った。調製物を、全PSA(レゾルシノールアッセイ)および全アミノオキシ基(TNBSアッセイ)を測定し、修飾の度合いを決定することによって分析的に特徴付けた。更に、多分散性、ならびに遊離3−オキサ−ペンタン−1,5−ジオキシアミンおよびシアン化物を決定した。
還元ステップを行わないアミノオキシ−PSAの調製
Serum Institute of India(Pune,India)から得た573mgの酸化PSA(分子量=20kD)を、11,3mLの50mMのリン酸緩衝液(緩衝液A)、pH6.0中に溶解した。次いで、94mgの3−オキサ−ペンタン−1,5−ジオキシアミンを反応混合物に添加した。次いで、室温で5時間振とうした後、混合物を、Fractogel EMD DEAE 650−Mクロマトグラフィゲル(カラム寸法:XK16/105)を採用する穏やかな陰イオン交換クロマトグラフィに供した。反応混合物を50mLの緩衝液Aで希釈し、1cm/分の流速で、緩衝液Aで事前に平衡化したDEAEカラム上に負荷した。次いで、カラムを20CVの緩衝液B(20mMのHepes、pH6.0)で洗浄し、2cm/分の流速で、遊離3−オキサ−ペンタン−1,5−ジオキシアミンおよびシアン化物を除去した。次いで、アミノオキシ−PSA試薬を、67%の緩衝液Bおよび43%の緩衝液C(20mMのHepes、1MのNaCl、pH7.5)からなるステップ勾配で溶出した。溶出液を、ポリエーテルスルホン(50cm2、Millipore)から作製された5kDの膜を使用する限外濾過/透析濾過によって濃縮した。最終透析濾過ステップを緩衝液D(20mMのHepes、90mMのNaCl、pH7.4)に対して行った。調製物を、全PSA(レゾルシノールアッセイ)および全アミノオキシ基(TNBSアッセイ)を測定し、修飾の度合いを決定することによって分析的に特徴付けた。更に、多分散性、ならびに遊離3−オキサ−ペンタン−1,5−ジオキシアミンを決定した。
求核触媒m−トルイジンの存在下で、還元ステップを行わないアミノオキシ−PSAの調製
Serum Institute of India(Pune,India)から得た573mgの酸化PSA(分子量=20kD)を、9mLの50mMのリン酸緩衝液(緩衝液A)、pH6.0中に溶解する。次いで、94mgの3−オキサ−ペンタン−1,5−ジオキシアミンを溶液に添加する。続いて、2.3mLの50mMのm−トルイジン原液をこの反応混合物に添加する。次いで、室温で2時間振とうした後、Fractogel EMD DEAE 650−Mクロマトグラフィゲル(カラム寸法:XK16/105)を採用する穏やかな陰イオン交換クロマトグラフィステップに供する。反応混合物を50mLの緩衝液Aで希釈し、1cm/分の流速で、緩衝液Aで事前に平衡化したDEAEカラム上に負荷する。次いで、カラムを20CVの緩衝液B(20mMのHepes、pH6.0)で洗浄し、2cm/分の流速で、遊離3−オキサ−ペンタン−1,5−ジオキシアミンおよびシアン化物を除去する。アミノオキシ−PSA試薬を、67%の緩衝液Bおよび43%の緩衝液C(20mMのHepes、1MのNaCl、pH7.5)からなるステップ勾配で溶出する。溶出液を、ポリエーテルスルホン(50cm2、Millipore)から作製された5kDの膜を使用する限外濾過/透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップを緩衝液D(20mMのHepes、90mMのNaCl、pH7.4)に対して行う。調製物を、全PSA(レゾルシノールアッセイ)および全アミノオキシ基(TNBSアッセイ)を測定し、修飾の度合いを決定することによって分析的に特徴付ける。更に、多分散性、ならびに遊離3−オキサ−ペンタン−1,5−ジオキシアミンを決定する。
アミノオキシ−PSA試薬の調製
アミノオキシ−PSA試薬を実施例4〜8に従い調製した。透析濾過後、生成物を−80℃で凍結し、凍結乾燥した。凍結乾燥後、試薬を適切な体積の水中で溶解し、炭水化物修飾を介するPSA−タンパク質複合体の調製のために使用した。
異なる代替の求核触媒の有効性の評価
rFIXを、異なる求核触媒(アニリン、m−トルイジン、o−アニシジン、m−アニシジン、o−アミノ安息香酸、m−アミノ安息香酸、p−アミノ安息香酸、p−アミノベンゾアミド、スルファニル酸/標準濃度:10mM)を使用して、標準条件(20mMのL−ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2中の1mg/mLのrFIX、pH6.0、5倍のモル過剰のアミノオキシ−PSA試薬、100μMのNaIO4)下で、過ヨウ素酸ナトリウム、アミノオキシ−PSA試薬でインキュベートした。反応を、穏やかな撹拌下で、暗室で、室温で2時間行い、1mMの最終濃度によるシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行った。
アミノオキシ−PSAおよび求核触媒としてm−トルイジンを使用するrFIXのポリシアル化
方法1:
12.3mgのrFIXを、6.1mLのヒスチジン緩衝液、pH6.0(20mMのL−ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2)中に溶解した。次いで、254μLの水性過ヨウ素酸ナトリウム溶液(5mM)を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4℃で1時間インキュベートし、6.5μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって室温で15分間反応停止処理を行った。続いて、その混合物をVivaspin 15R 10kDの遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去した。
方法2:
12.3mgのrFIXを、L−ヒスチジン緩衝液、pH6.0(20mMのL−ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2)中に溶解し、rFIXの1mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。5mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を添加し、100μMの最終濃度を得、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、pH6.0で、4℃で1時間インキュベートし、1MのL−システイン水溶液(または他の反応停止試薬)の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行い、10mMの最終濃度を得る。続いて、その混合物をVivaspin 15R 10kDの遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
方法3:
25.4mgのrFIXを、18.7mLのヒスチジン緩衝液、pH6.0(20mMのL−ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2)中に溶解した。次いで、531μLの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液(5mM)および5.07mLのm−トルイジン水溶液(50mM)を添加した。続いて、20kDの分子量を有するアミノオキシ−PSA試薬(上述)を添加し、5倍モル過剰の試薬を得た。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、25μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行った。
方法4:
25.4mgのrFIXを、L−ヒスチジン緩衝液、pH6.0(20mMのL−ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2)中に溶解し、rFIXの2mg/mLの最終タンパク質濃度を得た。続いて、5mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を15分間以内で添加し、100μMの最終濃度を得、続いて、50mMのm−トルイジン水溶液の添加によって、30分以内に10mMの最終濃度を得た。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ−PSA試薬(上述)を添加し、5倍モル過剰の試薬を得た。pHを6.0に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、1MのL−システイン水溶液の添加によって15分間反応停止処理を行い、10mMの最終濃度を得た。
アミノオキシ−PSAおよび求核触媒としてm−トルイジンを使用するrFVIIIのポリシアル化
方法1:
50mgのrFVIIIを、反応緩衝液(50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移し、希釈して、1mg/mLのタンパク質濃度を得た。この溶液に、NaIO4を添加して、200μMの最終濃度を得た。酸化を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で30分間行った。次いで、反応物は、システイン(最終濃度:10mM)を使用して、室温で60分間反応停止処理を行った。溶液を、緩衝液A(20mMのHepes、5mMのCaCl2、pH7.0)で平衡化した20mLの体積を有するIEXカラム(Merck EMD TMAE(M))に供した。カラムを、5CVの緩衝液Aで平衡化した。次いで、酸化rFVIIIを、緩衝液B(20mMのHepes、5mMのCaCl2、1MのNaCl、pH7.0)を使用して溶出した。rFVIIIを含有する画分を収集した。タンパク質含有量を決定し(クマシー,Bradford)、反応緩衝液を使用して1mg/mLに調整し、0.5MのHClの滴加によってpH6.0に調整した。次いで、50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ−PSA試薬(上述)を添加し、続いて、求核触媒(最終濃度:10mM)として、m−トルイジンを添加した。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行った。過剰のアミノオキシ−PSA試薬をHICによって除去した。反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム(50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、8Mの酢酸アンモニウム、pH6.9)を含有する緩衝液を添加することによって130mS/cmに引き上げ、50mMのHepes、2.5Mの酢酸アンモニウム、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.9で事前に平衡化した80mLのフェニルセファロースFF(GE Healthcare,Fairfield,CT)で充填したカラム上に負荷した。続いて、その複合体を、5mMのCaCl2を含有する50mMのHepes緩衝液pH7.5で溶出した。最後に、PSA−rFVIIIを含有する画分を収集し、再生成されたセルロース(88cm2、Millipore)から作製された30kDの膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供した。調製物を、総タンパク質(クマシー、Bradford)およびFVIII色原体活性の測定によって分析的に特徴付けた。PSA−rFVIII複合体は、天然rFVIIIと比較して70%超の特異的活性を決定することを示した。
方法2:
Hepes緩衝液(50mMのHEPES、約350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、0.1%のポリソルベート80、pH7.4)中のADVATEプロセス由来の58mgの組換え因子VIII(rFVIII)を、反応緩衝液(50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)中に溶解し、1.0+/−0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=+22+/−2℃の温度(T)で30+/−5分間行う。次いで、T=+22+/−2℃で、15分以内のL−システイン水溶液(1M)の添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60+/−5分間インキュベートする。
方法3:
50mgのrFVIIIを、反応緩衝液(50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移し、希釈して、1mg/mLのタンパク質濃度を得た。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ−PSA試薬(上述)を添加し、続いて、求核触媒としてm−トルイジン(最終濃度:10mM)およびNaIO4(最終濃度:400μM)を添加した。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行った。続いて、反応物を、システイン(最終濃度:10mM)を使用して、室温で60分間反応停止処理を行った。次いで、反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウムを含有する緩衝液(50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、8Mの酢酸アンモニウム、pH6.9)を添加することによって、130mS/cmに引き上げ、50mMのHepes、2.5Mの酢酸アンモニウム、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、0.01%のTween80、pH6.9で事前に平衡化した80mLのフェニルセファロースFF(GE Healthcare,Fairfield,CT)で充填したカラム上に負荷した。続いて、その複合体を50mMのHepes、5mMの塩化カルシウム、pH7.5で溶出した。最後に、PSA−rFVIIIを含有する画分を収集し、再生成されたセルロース(88cm2、Millipore)から作製された30kDの膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供した。調製物を、総タンパク質(Bradford)およびFVIII色原体活性の測定によって分析的に特徴付けた。PSA−rFVIII複合体に対して、天然のrFVIIIと比較して70%超の特異的活性を決定した。
方法4:
50mMのHepes緩衝液(50mMのHEPES、約350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、0.1%のポリソルベート80、pH7.4)中のADVATEプロセス由来の50mgの組換え因子VIII(rFVIII)を、反応緩衝液(50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)中に溶解し、1.0+/−0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得た。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正した。
分析データ(6つの連続するバッチの平均):
プロセス収率(Bradford):58.9%
プロセス収率(FVIII色原体活性):46.4%
特異的活性:(FVIII色原体活性/mgタンパク質):4148IU/mg
特異的活性(出発物質の割合(%)):79.9%
PSAの度合い(mol/mol):8.1
実施例13
アミノオキシ−PEG試薬および求核触媒としてm−トルイジンを使用するrFVIIIのPEG化
方法1:
rFVIIIを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によって、PEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。14.7mgのrFVIIIを、7.0mLのヒスチジン緩衝液、pH6.0(20mMのL−ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2)中に溶解する。次いで、296μLの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液(5mM)を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4℃で1時間インキュベートし、7.5μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物をVivaspin 15R 10kDの遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去した。
方法2:
rFVIIIを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によって、PEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。出発重量または濃度のrFVIIIを、反応緩衝液(50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)中に溶解するか、またはそれに移して、1.0+/−0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応を、T=+22+/−2℃の温度(T)で30+/−5分間で行う。次いで、T=+22+/−2℃で、15分以内のL−システイン水溶液(1M)の添加により反応を停止し、反応混合物中での10mM最終濃度を得て、60+/−5分間インキュベートする。
方法3:
rFVIIIを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によって、PEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。6mLのHepes緩衝液(50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)中に溶解される7.84mgのrFVIIIを、314μLの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液(10mM)、および1.57mLのm−トルイジン水溶液(50mM)と混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、8μLのシステイン水溶液(1M)の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。
方法4:
rFVIIIを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によって、PEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。初期濃度または重量のrFVIIIを、Hepes緩衝液(50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移すか、またはその中に溶解して、rFVIIIの2mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。続いて、5mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を15分以内で添加し、100μMの最終濃度を得、続いて、50mMのm−トルイジン水溶液の添加によって、30分の期間以内に10mMの最終濃度を得る。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ−PEG試薬(上述)を添加し、20倍モル過剰を得る。pHを6.0に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、1MのL−システイン水溶液の添加によって室温で15分間反応停止処理を行い、10mMの最終濃度を得る。
アミノオキシ−PSAおよび求核触媒としてm−トルイジンを使用するrFVIIaのポリシアル化
方法1:
出発濃度または重量の組換え因子VIIa(rFVIIa)を、反応緩衝液(50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移すか、またはその中に溶解して、1.0+/−0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのNaOH水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、50μMの濃度を得る。酸化反応をT=+22+/−2℃の温度(T)で30+/−5分間行う。次いで、T=+22+/−2℃で、15分以内のL−システイン水溶液(1M)の添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60+/−5分間インキュベートする。
方法2:
出発重量または濃度のrFVIIaを、反応緩衝液(50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)中に溶解するか、またはそれに移して、1.0+/−0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのNaOH水溶液の滴加によって6.0に修正する。
アミノオキシ−PEG試薬および求核触媒としてm−トルイジンを使用するrFIXのPEG化
方法1:
rFIXを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によって、PEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。出発重量または濃度のrFIXを、反応緩衝液(50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)中に溶解するか、またはそれに移して、1.0+/−0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=+22+/−2℃の温度(T)で30+/−5分間行う。次いで、T=+22+/−2℃で、15分以内のL−システイン水溶液(1M)の添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60+/−5分間インキュベートする。
方法2:
rFIXを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によって、PEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。初期濃度または重量のrFIXを、Hepes緩衝液(50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移すか、またはその中に溶解して、rFIXの2mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。続いて、5mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を15分以内で添加し、100μMの最終濃度を得、続いて、50mMのm−トルイジン水溶液の添加によって、30分の期間以内に10mMの最終濃度を得る。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ−PEG試薬(上述)を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。pHを6.0に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、1MのL−システイン水溶液の添加によって室温で15分間反応停止処理を行い、10mMの最終濃度を得る。
アミノオキシ−PEG試薬および求核触媒としてm−トルイジンを使用するrFVIIaのPEG化
方法1:
rFVIIaを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によって、PEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。出発重量または濃度のrFVIIaを、反応緩衝液(50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)中に溶解するか、またはそれに移して、1.0+/−0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのNaOH水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、50μMの濃度を得る。酸化反応をT=+22+/−2℃の温度(T)で30+/−5分間行う。次いで、T=+22+/−2℃で、15分以内のL−システイン水溶液(1M)の添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60+/−5分間インキュベートする。
方法2:
rFVIIaを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によって、PEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。初期濃度または重量のrFVIIaを、Hepes緩衝液(50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移すか、またはその中に溶解して、rFVIIaの2mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。続いて、5mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を15分以内で添加し、100μMの最終濃度を得、続いて、50mMのm−トルイジン水溶液の添加によって、30分の期間以内に10mMの最終濃度を得る。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ−PEG試薬(上述)を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。pHを6.0に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、1MのL−システイン水溶液の添加によって室温で15分間反応停止処理を行い、10mMの最終濃度を得る。
o−アミノ安息香酸の存在下でのrFIXのポリシアル化
方法1:
8.2mgのrFIXを、4.0mLのヒスチジン緩衝液、pH6.0(20mMのL−ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2)中に溶解する。次いで、82μLの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液(5mM)を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4℃で1時間インキュベートし、4μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物をVivaspin 6 10kDの遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
方法2:
5倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ−PSA試薬(上述)を含有する0.65mLのリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.0中の1mgのrFIXの溶液を調製した。333μLのo−アミノ安息香酸溶液(30mM)を求核触媒として添加し、10mMの最終濃度を得た。続いて、20μLのNaIO4水溶液(5mM)を添加し、100μMの最終濃度を産出した。カップリングプロセスを、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行い、1μLのシステイン水溶液(1M)の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行った。本明細書に説明される通りに複合体のさらなる精製を行う。
アミノオキシ−PSAおよび求核触媒としてm−トルイジンを使用するEPOのポリシアル化
方法1:
出発濃度のエリスロポエチン(EPO)を、反応緩衝液(例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移し、希釈し、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。この溶液に、NaIO4を添加して、200μMの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で30分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン(最終濃度:10mM)を使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。
方法2:
EPOを、反応緩衝液(例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移すか、またはその中に溶解して、1.0+/−0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=+22+/−2℃の温度(T)で30+/−5分間行う。次いで、T=+22+/−2℃で、15分以内のL−システイン水溶液(1M)の添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60+/−5分間インキュベートする。
方法3:
エリスロポエチン(EPO)を、反応緩衝液(50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移し、希釈して、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ−PSA試薬(上述)を添加し、続いて、求核触媒としてm−トルイジン(10mMの最終濃度)およびNaIO4(最終濃度:400μM)を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。続いて、反応物を、システイン(システイン濃度:10mM)を使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。次いで、反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム(50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、8Mの酢酸アンモニウム、pH6.9)を含有する緩衝液を添加することによって調整し、50mMのHepes、2.5Mの酢酸アンモニウム、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、0.01%のTween80、pH6.9で事前に平衡化したフェニルセファロースFF(GE Healthcare,Fairfield,CT)で充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、50mMのHepes、5mMの塩化カルシウム、pH7.5で溶出する。最後に、PSA−EPOを含有する画分を収集し、再生成されたセルロース(MWCO 10kD、88cm2、Millipore)から作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質(Bradford)および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法4:
EPOを、反応緩衝液(例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)中に溶解するか、またはそれに移して、1.0+/−0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。
アミノオキシ−PSAおよび求核触媒としてm−トルイジンを使用するAng−2のポリシアル化
方法1:
出発濃度のアンジオポエチン−2(Ang−2)を、反応緩衝液(例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移し、希釈し、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。この溶液に、NaIO4を添加して、200μMの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で30分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン(最終濃度:10mM)を使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。
方法2:
Ang−2を、反応緩衝液(例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移すか、またはその中に溶解して、1.0+/−0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=+22+/−2℃の温度(T)で30+/−5分間行う。次いで、T=+22+/−2℃で、15分以内のL−システイン水溶液(1M)の添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60+/−5分間インキュベートする。
方法3:
アンジオポエチン−2(Ang−2)を、反応緩衝液(50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移し、希釈し、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するPSAアミノオキシ試薬(上述)を添加し、続いて、求核触媒としてm−トルイジン(10mMの最終濃度)およびNaIO4(最終濃度:400μM)を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。続いて、反応物を、システイン(システイン濃度:10mM)を使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。次いで、反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム(50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、8Mの酢酸アンモニウム、pH6.9)を含有する緩衝液を添加することによって調整し、50mMのHepes、2.5Mの酢酸アンモニウム、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、0.01%のTween80、pH6.9で事前に平衡化したフェニルセファロースFF(GE Healthcare,Fairfield,CT)で充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、50mMのHepes、5mMの塩化カルシウム、pH7.5で溶出する。最後に、PSA−Ang−2−を含有する画分を収集し、再生成されたセルロース(Millipore)から作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質(Bradford)および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法4:
Ang−2を、反応緩衝液(例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)中に溶解するか、またはそれに移して、1.0+/−0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。
アミノオキシ−PSAおよび求核触媒としてm−トルイジンを使用するVEGFのポリシアル化
方法1:
出発濃度の血管内皮増殖因子(VEGF)を、反応緩衝液(例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移し、希釈し、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。この溶液に、NaIO4を添加して、200μMの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で30分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン(最終濃度:10mM)を使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。
方法2:
VEGFを、反応緩衝液(例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移すか、またはその中に溶解して、1.0+/−0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=+22+/−2℃の温度(T)で30+/−5分間行う。次いで、T=+22+/−2℃で、15分以内のL−システイン水溶液(1M)の添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60+/−5分間インキュベートする。
方法3:
血管内皮増殖因子(VEGF)を、反応緩衝液(50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移し、希釈し、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するPSAアミノオキシ試薬(上述)を添加し、続いて、求核触媒としてm−トルイジン(10mMの最終濃度)およびNaIO4(最終濃度:400μM)を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。続いて、反応物を、システイン(システイン濃度:10mM)を使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。次いで、反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム(50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、8Mの酢酸アンモニウム、pH6.9)を含有する緩衝液を添加することによって調整し、50mMのHepes、2.5Mの酢酸アンモニウム、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、0.01%のTween80、pH6.9で事前に平衡化したフェニルセファロースFF(GE Healthcare,Fairfield,CT)で充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、50mMのHepes、5mMの塩化カルシウム、pH7.5で溶出する。最後に、PSA−VEGF−を含有する画分を収集し、再生成されたセルロース(Millipore)から作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質(Bradford)および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法4:
VEGFを、反応緩衝液(例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)中に溶解するか、またはそれに移して、1.0+/−0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。
アミノオキシ−PSAおよび求核触媒としてm−トルイジンを使用するEGFのポリシアル化
方法1:
出発濃度の上皮増殖因子(EGF)を、反応緩衝液(例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移し、希釈し、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。この溶液に、NaIO4を添加して、200μMの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で30分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン(最終濃度:10mM)を使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。
方法2:
EGFを、反応緩衝液(例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移すか、またはその中に溶解して、1.0+/−0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=+22+/−2℃の温度(T)で30+/−5分間行う。次いで、T=+22+/−2℃で、15分以内のL−システイン水溶液(1M)の添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60+/−5分間インキュベートする。
方法3:
上皮増殖因子(EGF)を、反応緩衝液(50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移し、希釈し、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するPSAアミノオキシ試薬(上述)を添加し、続いて、求核触媒としてm−トルイジン(10mMの最終濃度)およびNaIO4(最終濃度:400μM)を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。続いて、反応物を、システイン(システイン濃度:10mM)を使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。次いで、反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム(50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、8Mの酢酸アンモニウム、pH6.9)を含有する緩衝液を添加することによって調整し、50mMのHepes、2.5Mの酢酸アンモニウム、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、0.01%のTween80、pH6.9で事前に平衡化したフェニルセファロースFF(GE Healthcare,Fairfield,CT)で充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、50mMのHepes、5mMの塩化カルシウム、pH7.5で溶出する。最後に、PSA−EGF−を含有する画分を収集し、再生成されたセルロース(Millipore)から作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質(Bradford)および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法4:
EGFを、反応緩衝液(例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)中に溶解するか、またはそれに移して、1.0+/−0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。
アミノオキシ−PSAおよび求核触媒としてm−トルイジンを使用するNGFのポリシアル化
方法1:
出発濃度の神経増殖因子(NGF)を、反応緩衝液(例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移し、希釈し、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。この溶液に、NaIO4を添加して、200μMの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で30分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン(最終濃度:10mM)を使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。
方法2:
NGFを、反応緩衝液(例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移すか、またはその中に溶解して、1.0+/−0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=+22+/−2℃の温度(T)で30+/−5分間行う。次いで、T=+22+/−2℃で、15分以内のL−システイン水溶液(1M)の添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60+/−5分間インキュベートする。
方法3:
神経増殖因子(NGF)を、反応緩衝液(50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移し、希釈し、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ−PSA試薬(上述)を添加し、続いて、求核触媒としてm−トルイジン(10mMの最終濃度)およびNaIO4(最終濃度:400μM)を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。続いて、反応物を、システイン(システイン濃度:10mM)を使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。次いで、反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム(50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、8Mの酢酸アンモニウム、pH6.9)を含有する緩衝液を添加することによって調整し、50mMのHepes、2.5Mの酢酸アンモニウム、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、0.01%のTween80、pH6.9で事前に平衡化したフェニルセファロースFF(GE Healthcare,Fairfield,CT)で充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、50mMのHepes、5mMの塩化カルシウム、pH7.5で溶出する。最後に、PSA−NGFを含有する画分を収集し、再生成されたセルロース(Millipore)から作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質(Bradford)および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法4:
NGFを、反応緩衝液(例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)中に溶解するか、それに移して、1.0+/−0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。
アミノオキシ−PSAおよび求核触媒としてm−トルイジンを使用するHGHのポリシアル化
方法1:
本明細書に説明されるように、ヒト成長ホルモン(HGH)のアミノ酸配列は、まず、少なくとも1つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、HGHは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。
方法2:
本明細書に説明されるように、ヒト成長ホルモン(HGH)のアミノ酸配列は、まず、少なくとも1つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、HGHは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。
方法3:
本明細書に説明されるように、ヒト成長ホルモン(HGH)のアミノ酸配列は、まず、少なくとも1つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、HGHは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。
方法4:
本明細書に説明されるように、ヒト成長ホルモン(HGH)のアミノ酸配列は、まず、少なくとも1つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、HGHは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。
アミノオキシ−PSAおよび求核触媒としてm−トルイジンを使用するTNF−αのポリシアル化
出発濃度の腫瘍壊死因子−α(TNF−α)を、反応緩衝液(例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移し、希釈し、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。この溶液に、NaIO4を添加して、200μMの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で30分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン(最終濃度:10mM)を使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。
方法2:
TNF−αを、反応緩衝液(例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移すか、またはその中に溶解して、1.0+/−0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=+22+/−2℃の温度(T)で30+/−5分間行う。次いで、T=+22+/−2℃で、15分以内のL−システイン水溶液(1M)の添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60+/−5分間インキュベートする。
方法3:
腫瘍壊死因子−α(TNF−α)を、反応緩衝液(例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移し、希釈し、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ−PSA試薬(上述)を添加し、続いて、求核触媒としてm−トルイジン(10mMの最終濃度)およびNaIO4(最終濃度:400μM)を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。続いて、反応物を、システイン(システイン濃度:10mM)を使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。次いで、反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム(50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、8Mの酢酸アンモニウム、pH6.9)を含有する緩衝液を添加することによって調整し、50mMのHepes、2.5Mの酢酸アンモニウム、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、0.01%のTween80、pH6.9で事前に平衡化したフェニルセファロースFF(GE Healthcare,Fairfield,CT)で充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、50mMのHepes、5mMの塩化カルシウム、pH7.5で溶出する。最後に、PSA−TNF−αを含有する画分を収集し、再生成されたセルロース(Millipore)から作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質(Bradford)および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法4:
TNF−αを、反応緩衝液(例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)中に溶解するか、またはそれに移して、1.0+/−0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。
アミノオキシ−PSAおよび求核触媒としてm−トルイジンを使用するインスリンのポリシアル化
方法1:
本明細書に説明されるように、インスリンのアミノ酸配列は、まず、少なくとも1つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、インスリンは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。出発濃度のインスリンを、反応緩衝液(例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移し、希釈して、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。この溶液に、NaIO4を添加して、200μMの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で30分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン(最終濃度:10mM)を使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。
方法2:
本明細書に説明されるように、インスリンのアミノ酸配列は、まず、少なくとも1つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、インスリンは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。
方法3:
本明細書に説明されるように、インスリンのアミノ酸配列は、まず、少なくとも1つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、インスリンは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。
方法4:
本明細書に説明されるように、インスリンのアミノ酸配列は、まず、少なくとも1つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、インスリンは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。
アミノオキシ−PSAおよび求核触媒としてm−トルイジンを使用するインターフェロンαのポリシアル化
方法1:
出発濃度のインターフェロンαを、反応緩衝液(例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移し、希釈して、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。この溶液に、NaIO4を添加して、200μMの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で30分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン(最終濃度:10mM)を使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。
方法2:
インターフェロンαを、反応緩衝液(例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移すか、またはその中に溶解して、1.0+/−0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=+22+/−2℃の温度(T)で30+/−5分間行う。次いで、T=+22+/−2℃で、15分以内のL−システイン水溶液(1M)の添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60+/−5分間インキュベートする。
方法3:
インターフェロンαを、反応緩衝液(50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移し、希釈して、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するPSAアミノオキシ試薬(上述)を添加し、続いて、求核触媒としてm−トルイジン(10mMの最終濃度)およびNaIO4(最終濃度:400μM)を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。続いて、反応物を、システイン(システイン濃度:10mM)を使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。次いで、反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム(50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、8Mの酢酸アンモニウム、pH6.9)を含有する緩衝液を添加することによって調整し、50mMのHepes、2.5Mの酢酸アンモニウム、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、0.01%のTween80、pH6.9で事前に平衡化したフェニルセファロースFF(GE Healthcare,Fairfield,CT)で充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、50mMのHepes、5mMの塩化カルシウム、pH7.5で溶出する。最後に、PSA−インターフェロンαを含有する画分を収集し、再生成されたセルロース(Millipore)から作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質(Bradford)および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法4:
インターフェロンαを、反応緩衝液(例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)中に溶解するか、またはそれに移して、1.0+/−0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。
アミノオキシ−PSAおよび求核触媒としてm−トルイジンを使用するインターフェロンγのポリシアル化
方法1:
10mgのインターフェロンγを、5mLのヒスチジン緩衝液、pH6.0(20mMのL−ヒスチジン、150mMのNaCl)中に溶解する。次いで、100μLの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液(5mM)を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4℃で1時間インキュベートし、50μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物をVivaspin 15R 10kDの遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
1200 HPLCシステムを使用するサイズ排除HPLCによって分析的に特徴付ける(Kolarich et al,Transfusion 2006;46:1959−77)。調製物が遊離インターフェロンγを含有しないことを示す。
方法2:
10mgのインターフェロンγを、8mLのヒスチジン緩衝液、pH6.0(20mMのL−ヒスチジン、150mMのNaCl)中に溶解する。次いで、200μLの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液(5mM)および2mLのm−トルイジン水溶液(50mM)を添加する。続いて、20kDの分子量を有するアミノオキシ−PSA試薬(上述)を添加し、5倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、100μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって室温で15分間反応停止処理を行う。
1200 HPLCシステムを使用するサイズ排除HPLCによって分析的に特徴付ける(Kolarich et al,Transfusion 2006;46:1959−77)。調製物が遊離インターフェロンγを含有しないことを示す。
方法3:
10mgのインターフェロンγを、8mLのヒスチジン緩衝液、pH6.0(20mMのL−ヒスチジン、150mMのNaCl)中に溶解する。次いで、200μLの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液(5mM)および2mLのm−トルイジン水溶液(50mM)を添加する。続いて、20kDの分子量を有するアミノオキシ−PSA試薬(上述)を添加し、5倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、100μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって室温で15分間反応停止処理を行う。
1200 HPLCシステムを使用するサイズ排除HPLCによって分析的に特徴付ける(Kolarich et al,Transfusion 2006;46:1959−77)。調製物が遊離インターフェロンγを含有しないことを示す。
方法4:
インターフェロンγを、反応緩衝液(例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)中に溶解するか、またはそれに移して、1.0+/−0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。
アミノオキシ−PSAおよび求核触媒としてm−トルイジンを使用するG−CSFのポリシアル化
方法1:
出発濃度の顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)を、反応緩衝液(例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移し、希釈して、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。この溶液に、NaIO4を添加して、200μMの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で30分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン(最終濃度:10mM)を使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。
方法2:
G−CSFを、反応緩衝液(例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移すか、またはその中に溶解して、1.0+/−0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=+22+/−2℃の温度(T)で30+/−5分間行う。次いで、T=+22+/−2℃で、15分以内のL−システイン水溶液(1M)の添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60+/−5分間インキュベートする。
方法3:
顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)を、反応緩衝液(50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移し、希釈して、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ−PSA試薬(上述)を添加し、続いて、求核触媒としてm−トルイジン(10mMの最終濃度)およびNaIO4(最終濃度:400μM)を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。続いて、反応物を、システイン(システイン濃度:10mM)を使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。次いで、反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム(50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、8Mの酢酸アンモニウム、pH6.9)を含有する緩衝液を添加することによって調整し、50mMのHepes、2.5Mの酢酸アンモニウム、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、0.01%のTween80、pH6.9で事前に平衡化したフェニルセファロースFF(GE Healthcare,Fairfield,CT)で充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、50mMのHepes、5mMの塩化カルシウム、pH7.5で溶出する。最後に、PSA−G−CSFを含有する画分を収集し、再生成されたセルロース(Millipore)から作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質(Bradford)および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法4:
G−CSFを、反応緩衝液(例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)中に溶解するか、またはそれに移して、1.0+/−0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。
アミノオキシ−PSAおよび求核触媒としてm−トルイジンを使用するヒュミラ(Humira)のポリシアル化
方法1:
出発濃度のヒュミラを、反応緩衝液(例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移し、希釈して、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。この溶液に、NaIO4を添加して、200μMの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で30分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン(最終濃度:10mM)を使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。
方法2:
ヒュミラを、反応緩衝液(例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移すか、またはその中に溶解して、1.0+/−0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=+22+/−2℃の温度(T)で30+/−5分間行う。次いで、T=+22+/−2℃で、15分以内のL−システイン水溶液(1M)の添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60+/−5分間インキュベートする。
方法3:
ヒュミラを、反応緩衝液(50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移し、希釈して、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ−PSA試薬(上述)を添加し、続いて、求核触媒としてm−トルイジン(10mMの最終濃度)およびNaIO4(最終濃度:400μM)を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。続いて、反応物を、システイン(システイン濃度:10mM)を使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。次いで、反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム(50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、8Mの酢酸アンモニウム、pH6.9)を含有する緩衝液を添加することによって調整し、50mMのHepes、2.5Mの酢酸アンモニウム、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、0.01%のTween80、pH6.9で事前に平衡化したフェニルセファロースFF(GE Healthcare,Fairfield,CT)で充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、50mMのHepes、5mMの塩化カルシウム、pH7.5で溶出する。最後に、PSA−ヒュミラを含有す+る画分を収集し、再生成されたセルロース(Millipore)から作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質(Bradford)および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法4:
ヒュミラを、反応緩衝液(例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)中に溶解するか、またはそれに移して、1.0+/−0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。
アミノオキシ−PSAおよび求核触媒としてm−トルイジンを使用するProliaのポリシアル化
方法1:
出発濃度のProliaを、反応緩衝液(例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移し、希釈して、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。この溶液に、NaIO4を添加して、200μMの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で30分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン(最終濃度:10mM)を使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。
方法2:
Proliaを、反応緩衝液(例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移すか、またはその中に溶解して、1.0+/−0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=+22+/−2℃の温度(T)で30+/−5分間行う。次いで、T=+22+/−2℃で、15分以内のL−システイン水溶液(1M)の添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60+/−5分間インキュベートする。
方法3:
Proliaを、反応緩衝液(50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移し、希釈して、1mg/mLのタンパク質濃度を得る。50倍モル過剰の20kDの分子量を有するアミノオキシ−PSA試薬(上述)を添加し、続いて、求核触媒としてm−トルイジン(10mMの最終濃度)およびNaIO4(最終濃度:400μM)を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で2時間行う。続いて、反応物を、システイン(システイン濃度:10mM)を使用して、室温で60分間反応停止処理を行う。次いで、反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム(50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、8Mの酢酸アンモニウム、pH6.9)を含有する緩衝液を添加することによって調整し、50mMのHepes、2.5Mの酢酸アンモニウム、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、0.01%のTween80、pH6.9で事前に平衡化したフェニルセファロースFF(GE Healthcare,Fairfield,CT)で充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、50mMのHepes、5mMの塩化カルシウム、pH7.5で溶出する。最後に、PSA Proliaを含有する画分を収集し、再生成されたセルロース(Millipore)から作製された膜の使用によって限外濾過/透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質(Bradford)および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法4:
Proliaを、反応緩衝液(例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)中に溶解するか、またはそれに移して、1.0+/−0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。
他の治療用タンパク質のポリシアル化
本明細書に説明される、m−トルイジンまたはo−アミノ安息香酸のような代替的な求核触媒の存在下で行われるポリシアル化反応は、他の治療用タンパク質まで拡大され得る。例えば、本発明の種々の態様において、本明細書に説明される上述のポリシアル化またはPSAアミノオキシまたはPEGアミノオキシ試薬によるPEG化反応を、本明細書に説明されるこれらのタンパク質等の治療用タンパク質で繰り返す。
アミノオキシ−PEG試薬および求核触媒としてm−トルイジンを使用するEPOのPEG化
方法1:
エリスロポエチン(EPO)を、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によって、PEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。EPOを、7.0mLのヒスチジン緩衝液、pH6.0(20mMのL−ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2)中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液(5mM)を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4℃で1時間インキュベートし、7.5μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
方法2:
EPOを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によって、PEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。
方法3:
EPOを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によって、PEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。EPOを、Hepes緩衝液(50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液(10mM)およびm−トルイジン水溶液(50mM)と混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、8μLのシステイン水溶液(1M)の添加によって、室温で15分間反応停止処理をする。
方法4:
EPOを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によって、PEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。初期濃度または重量のEPOを、Hepes緩衝液(50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移すか、またはその中に溶解して、EPOの2mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。続いて、5mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を15分以内で添加し、100μMの最終濃度を得、続いて、50mMのm−トルイジン水溶液の添加によって、30分の期間以内に10mMの最終濃度を得る。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ−PEG試薬(上述)を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。pHを6.0に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、1MのL−システイン水溶液の添加によって室温で15分間反応停止処理を行い、10mMの最終濃度を得る。
アミノオキシ−PEG試薬および求核触媒としてm−トルイジンを使用するAng−2のPEG化
方法1:
Ang−2を、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。Ang−2を、7.0mLのヒスチジン緩衝液、pH6.0(20mMのL−ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2)中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液(5mM)を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4℃で1時間インキュベートし、7.5μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
方法2:
Ang−2を、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。
方法3:
Ang−2を、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。Ang−2を、Hepes緩衝液(50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液(10mM)およびm−トルイジン水溶液(50mM)と混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、8μLのシステイン水溶液(1M)の添加によって、室温で15分間反応停止処理をする。
方法4:
Ang−2を、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。初期濃度または重量のAng−2を、Hepes緩衝液(50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移すか、またはその中に溶解して、Ang−2の2mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。続いて、5mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を15分以内で添加し、100μMの最終濃度を得、続いて、50mMのm−トルイジン水溶液の添加によって、30分の期間以内に10mMの最終濃度を得る。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ−PEG試薬(上述)を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。pHを6.0に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、1MのL−システイン水溶液の添加によって室温で15分間反応停止処理を行い、10mMの最終濃度を得る。
アミノオキシ−PEG試薬および求核触媒としてm−トルイジンを使用するVEGFのPEG化
方法1:
VEGFを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。VEGFを、7.0mLのヒスチジン緩衝液、pH6.0(20mMのL−ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2)中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液(5mM)を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4℃で1時間インキュベートし、7.5μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
方法2:
VEGFを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。VEGFを、反応緩衝液(例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移すか、またはその中に溶解して、1.0+/−0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=+22+/−2℃の温度(T)で30+/−5分間行う。次いで、T=+22+/−2℃で、15分以内のL−システイン水溶液(1M)の添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60+/−5分間インキュベートする。
方法3:
VEGFを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。VEGFを、Hepes緩衝液(50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液(10mM)およびm−トルイジン水溶液(50mM)と混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、8μLのシステイン水溶液(1M)の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。
方法4:
VEGFを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。初期濃度または重量のVEGFを、Hepes緩衝液(50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移すか、またはその中に溶解して、VEGFの2mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。続いて、5mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を15分以内で添加し、100μMの最終濃度を得、続いて、50mMのm−トルイジン水溶液の添加によって、30分の期間以内に10mMの最終濃度を得る。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ−PEG試薬(上述)を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。pHを6.0に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、1MのL−システイン水溶液の添加によって室温で15分間反応停止処理を行い、10mMの最終濃度を得る。
アミノオキシ−PEG試薬および求核触媒としてm−トルイジンを使用するEGFのPEG化
方法1:
EGFを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。EGFを、7.0mLのヒスチジン緩衝液、pH6.0(20mMのL−ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2)中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液(5mM)を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4℃で1時間インキュベートし、7.5μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
方法2:
EGFを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。EGFを、反応緩衝液(例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移すか、またはその中に溶解して、1.0+/−0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=+22+/−2℃の温度(T)で30+/−5分間行う。次いで、T=+22+/−2℃で、15分以内のL−システイン水溶液(1M)の添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60+/−5分間インキュベートする。
方法3:
EGFを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。EGFを、Hepes緩衝液(50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液(10mM)およびm−トルイジン水溶液(50mM)と混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、8μLのシステイン水溶液(1M)の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。
方法4:
EGFを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。初期濃度または重量のEGFを、Hepes緩衝液(50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移すか、またはその中に溶解して、EGFの2mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。続いて、5mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を15分以内で添加し、100μMの最終濃度を得、続いて、50mMのm−トルイジン水溶液の添加によって、30分の期間以内に10mMの最終濃度を得る。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ−PEG試薬(上述)を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。pHを6.0に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、1MのL−システイン水溶液の添加によって室温で15分間反応停止処理を行い、10mMの最終濃度を得る。
アミノオキシ−PEG試薬および求核触媒としてm−トルイジンを使用するNGFのPEG化
方法1:
NGFを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。NGFを、7.0mLのヒスチジン緩衝液、pH6.0(20mMのL−ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2)中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液(5mM)を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4℃で1時間インキュベートし、7.5μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
方法2:
NGFを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。NGFを、反応緩衝液(例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移すか、またはその中に溶解して、1.0+/−0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=+22+/−2℃の温度(T)で30+/−5分間行う。次いで、T=+22+/−2℃で、15分以内のL−システイン水溶液(1M)の添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60+/−5分間インキュベートする。
方法3:
NGFを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。NGFを、Hepes緩衝液(50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液(10mM)およびm−トルイジン水溶液(50mM)と混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、8μLのシステイン水溶液(1M)の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。
方法4:
NGFを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。初期濃度または重量のNGFを、Hepes緩衝液(50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移すか、またはその中に溶解して、NGFの2mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。続いて、5mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を15分以内で添加し、100μMの最終濃度を得、続いて、50mMのm−トルイジン水溶液の添加によって、30分の期間以内に10mMの最終濃度を得る。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ−PEG試薬(上述)を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。pHを6.0に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、1MのL−システイン水溶液の添加によって室温で15分間反応停止処理を行い、10mMの最終濃度を得る。
アミノオキシ−PEG試薬および求核触媒としてm−トルイジンを使用するHGHのPEG化
方法1:
本明細書に説明されるように、ヒト成長ホルモン(HGH)のアミノ酸配列は、まず、少なくとも1つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、HGHは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。
方法2:
本明細書に説明されるように、ヒト成長ホルモン(HGH)のアミノ酸配列は、まず、少なくとも1つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、HGHは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。
方法3:
本明細書に説明されるように、ヒト成長ホルモン(HGH)のアミノ酸配列は、まず、少なくとも1つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、HGHは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。
方法4:
本明細書に説明されるように、ヒト成長ホルモン(HGH)のアミノ酸配列は、まず、少なくとも1つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、HGHは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。
アミノオキシ−PEG試薬および求核触媒としてm−トルイジンを使用するTNF−αのPEG化
方法1:
TNF−αを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。TNF−αを、7.0mLのヒスチジン緩衝液、pH6.0(20mMのL−ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2)中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液(5mM)を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4℃で1時間インキュベートし、7.5μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
方法2:
TNF−αを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。TNF−αを、反応緩衝液(例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移すか、またはその中に溶解して、1.0+/−0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=+22+/−2℃の温度(T)で30+/−5分間行う。次いで、T=+22+/−2℃で、15分以内のL−システイン水溶液(1M)の添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60+/−5分間インキュベートする。
方法3:
TNF−αを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。TNF−αを、Hepes緩衝液(50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液(10mM)およびm−トルイジン水溶液(50mM)と混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、8μLのシステイン水溶液(1M)の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。
方法4:
TNF−αを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。初期濃度または重量のTNF−αを、Hepes緩衝液(50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移すか、またはその中に溶解して、TNF−αの2mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。続いて、5mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を15分以内で添加し、100μMの最終濃度を得、続いて、50mMのm−トルイジン水溶液の添加によって、30分の期間以内に10mMの最終濃度を得る。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ−PEG試薬(上述)を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。pHを6.0に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、1MのL−システイン水溶液の添加によって室温で15分間反応停止処理を行い、10mMの最終濃度を得る。
アミノオキシ−PEG試薬および求核触媒としてm−トルイジンを使用するインスリンのPEG化
方法1:
本明細書に説明されるように、インスリンのアミノ酸配列は、まず、少なくとも1つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、インスリンは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。インスリンを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。インスリンを、7.0mLのヒスチジン緩衝液、pH6.0(20mMのL−ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2)中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液(5mM)を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4℃で1時間インキュベートし、7.5μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
方法2:
本明細書に説明されるように、インスリンのアミノ酸配列は、まず、少なくとも1つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、インスリンは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。
方法3:
本明細書に説明されるように、インスリンのアミノ酸配列は、まず、少なくとも1つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、インスリンは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。
方法4:
本明細書に説明されるように、インスリンのアミノ酸配列は、まず、少なくとも1つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、インスリンは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。
アミノオキシ−PEG試薬および求核触媒としてm−トルイジンを使用するインターフェロンαのPEG化
方法1:
インターフェロンαを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。インターフェロンαを、7.0mLのヒスチジン緩衝液、pH6.0(20mMのL−ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2)中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液(5mM)を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4℃で1時間インキュベートし、7.5μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
方法2:
インターフェロンαを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。インターフェロンαを、反応緩衝液(例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移すか、またはその中に溶解して、1.0+/−0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=+22+/−2℃の温度(T)で30+/−5分間行う。次いで、T=+22+/−2℃で、15分以内のL−システイン水溶液(1M)の添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60+/−5分間インキュベートする。
方法3:
インターフェロンαを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。インターフェロンαを、Hepes緩衝液(50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液(10mM)およびm−トルイジン水溶液(50mM)と混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、8μLのシステイン水溶液(1M)の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。
方法4:
インターフェロンαを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。初期濃度または重量のインターフェロンαを、Hepes緩衝液(50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移すか、またはその中に溶解して、インターフェロンαの2mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。続いて、5mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を15分以内で添加し、100μMの最終濃度を得、続いて、50mMのm−トルイジン水溶液の添加によって、30分の期間以内に10mMの最終濃度を得る。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ−PEG試薬(上述)を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。pHを6.0に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、1MのL−システイン水溶液の添加によって室温で15分間反応停止処理を行い、10mMの最終濃度を得る。
アミノオキシ−PEG試薬および求核触媒としてm−トルイジンを使用するインターフェロンγのPEG化
方法1:
インターフェロンγを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。10mgのインターフェロンγを、5mLのヒスチジン緩衝液、pH6.0(20mMのL−ヒスチジン、150mMのNaCl)中に溶解する。次いで、100μLの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液(5mM)を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4℃で1時間インキュベートし、50μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物をVivaspin 15R 10kDの遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
方法2:
インターフェロンγを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。インターフェロンγを、反応緩衝液(例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移すか、またはその中に溶解して、1.0+/−0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=+22+/−2℃の温度(T)で30+/−5分間行う。次いで、T=+22+/−2℃で、15分以内のL−システイン水溶液(1M)の添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60+/−5分間インキュベートする。
方法3:
インターフェロンγを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。10mgのインターフェロンγを、約8mLのヒスチジン緩衝液、pH6.0(20mMのL−ヒスチジン、150mMのNaCl)中に溶解する。次いで、200μLの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液(5mM)および2mLのm−トルイジン水溶液(50mM)を添加する。続いて、20kDの分子量を有するアミノオキシ−PEG試薬(上述)を添加し、5倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、100μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって室温で15分間反応停止処理を行う。
SP FF16/10カラム(GE Healthcare,Fairfield,CT)上に負荷する。次いで、カラムを、緩衝液B(50mMのHepes、1MのNaCl、pH6.5)で溶出する。遊離インターフェロンγを、25%の緩衝液Bを使用してカラムを洗浄することによって溶出し、その複合体を、50%の緩衝液Bで溶出する。複合体を含有する画分を、再生成されたセルロース(88cm2、カットオフ10kD/Millipore)から作製された10kDの膜を使用する限外濾過/透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップを、150mMのNaClを含有するヒスチジン緩衝液、pH6.9に対して行う。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質(Bradford)および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。PEG−インターフェロンγ複合体に対して、天然のインターフェロンγと比較して50%超の特異的活性を決定する。更に、その複合体を、以前に説明されている条件下で、Shodex KW 803カラムを搭載したAgilent 1200 HPLCシステムを使用するサイズ排除HPLCによって分析的に特徴付ける(Kolarich et al,Transfusion 2006;46:1959−77)。調製物が遊離インターフェロンγを含有しないことを示す。
方法4:
インターフェロンγを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。初期濃度または重量のインターフェロンγを、Hepes緩衝液(50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移すか、またはその中に溶解して、インターフェロンγの2mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。続いて、5mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を15分以内で添加し、100μMの最終濃度を得、続いて、50mMのm−トルイジン水溶液の添加によって、30分の期間以内に10mMの最終濃度を得る。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ−PEG試薬(上述)を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。pHを6.0に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、1MのL−システイン水溶液の添加によって室温で15分間反応停止処理を行い、10mMの最終濃度を得る。
アミノオキシ−PEG試薬および求核触媒としてm−トルイジンを使用するG−CSFのPEG化
方法1:
G−CSFを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。G−CSFを、7.0mLのヒスチジン緩衝液、pH6.0(20mMのL−ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2)中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液(5mM)を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4℃で1時間インキュベートし、7.5μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
方法2:
G−CSFを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。G−CSFを、反応緩衝液(例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移すか、またはその中に溶解して、1.0+/−0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=+22+/−2℃の温度(T)で30+/−5分間行う。次いで、T=+22+/−2℃で、15分以内のL−システイン水溶液(1M)の添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60+/−5分間インキュベートする。
方法3:
G−CSFを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。G−CSFを、Hepes緩衝液(50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液(10mM)およびm−トルイジン水溶液(50mM)と混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、8μLのシステイン水溶液(1M)の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。
方法4:
G−CSFを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。初期濃度または重量のG−CSFを、Hepes緩衝液(50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移すか、またはその中に溶解して、G−CSFの2mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。続いて、5mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を15分以内で添加し、100μMの最終濃度を得、続いて、50mMのm−トルイジン水溶液の添加によって、30分の期間以内に10mMの最終濃度を得る。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ−PEG試薬(上述)を添加して、20倍のモル過剰の試薬を得る。pHを6.0に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、1MのL−システイン水溶液の添加によって室温で15分間反応停止処理を行い、10mMの最終濃度を得る。
アミノオキシ−PEG試薬および求核触媒としてm−トルイジンを使用するヒュミラのPEG化
方法1:
ヒュミラを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。ヒュミラを、7.0mLのヒスチジン緩衝液、pH6.0(20mMのL−ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2)中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液(5mM)を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4℃で1時間インキュベートし、7.5μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
方法2:
ヒュミラを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。ヒュミラを、反応緩衝液(例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移すか、またはその中に溶解して、1.0+/−0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=+22+/−2℃の温度(T)で30+/−5分間行う。次いで、T=+22+/−2℃で、15分以内のL−システイン水溶液(1M)の添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60+/−5分間インキュベートする。
方法3:
ヒュミラを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。ヒュミラを、Hepes緩衝液(50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液(10mM)およびm−トルイジン水溶液(50mM)と混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、8μLのシステイン水溶液(1M)の添加によって室温で15分間反応停止処理を行う。
方法4:
ヒュミラを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。初期濃度または重量のヒュミラを、Hepes緩衝液(50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移すか、またはその中に溶解して、ヒュミラの2mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。続いて、5mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を15分以内で添加し、100μMの最終濃度を得、続いて、50mMのm−トルイジン水溶液の添加によって、30分の期間以内に10mMの最終濃度を得る。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ−PEG試薬(上述)を添加して、20倍のモル過剰の試薬を得る。pHを6.0に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、1MのL−システイン水溶液の添加によって室温で15分間反応停止処理を行い、10mMの最終濃度を得る。
アミノオキシ−PEG試薬および求核触媒としてm−トルイジンを使用するProliaのPEG化
方法1:
Proliaを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。Proliaを、7.0mLのヒスチジン緩衝液、pH6.0(20mMのL−ヒスチジン、150mMのNaCl、5mMのCaCl2)中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液(5mM)を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、4℃で1時間インキュベートし、7.5μLの1Mのシステイン水溶液の添加によって、室温で15分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Vivaspin遠心分離濾過機を採用する限外濾過/透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
FF16/10カラム(GE Healthcare,Fairfield,CT)上に負荷する。次いで、カラムを、緩衝液B(50mMのHepes、1MのNaCl、pH6.5)で溶出する。遊離Proliaを、25%の緩衝液Bを使用してカラムを洗浄することによって溶出し、その複合体を、50%の緩衝液Bで溶出する。複合体を含有する画分を、再生成されたセルロース(88cm2、カットオフ10kD/Millipore)から作製された10kDの膜を使用する限外濾過/透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップを、150mMのNaClを含有するヒスチジン緩衝液、pH6.9に対して行う。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質(Bradford)および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。PEG−Prolia複合体に対して、天然のProliaと比較して50%超の特異的活性を決定する。更に、その複合体を、以前に説明されている条件下で、Shodex KW 803カラムを搭載したAgilent 1200 HPLCシステムを使用するサイズ排除HPLCによって分析的に特徴付ける(Kolarich et al,Transfusion 2006;46:1959−77)。調製物が遊離Proliaを含有しないことを示す。
方法2:
Proliaを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。Proliaを、反応緩衝液(例えば50mMのHepes、350mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移すか、またはその中に溶解して、1.0+/−0.25mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のpHを、0.5NのHCl水溶液の滴加によって6.0に修正する。続いて、40mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、10分以内で添加し、200μMの濃度を得る。酸化反応をT=+22+/−2℃の温度(T)で30+/−5分間行う。次いで、T=+22+/−2℃で、15分以内のL−システイン水溶液(1M)の添加により反応を停止し、反応混合物中で10mMの最終濃度を得て、60+/−5分間インキュベートする。
方法3:
Proliaを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。EPOを、Hepes緩衝液(50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液(10mM)およびm−トルイジン水溶液(50mM)と混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、20倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、8μLのシステイン水溶液(1M)のの添加によって室温で15分間反応停止処理を行う。
方法4:
Proliaを、アミノオキシ基を含有する直鎖20kDのPEG化試薬の使用によってPEG化する。このタイプの試薬の例は、NOF(NOF Corp.,Tokyo,Japan)のSunbright(登録商標)CAシリーズである。初期濃度または重量のヒュミラを、Hepes緩衝液(50mMのHepes、150mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カルシウム、pH6.0)に移すか、またはその中に溶解して、Proliaの2mg/mLの最終タンパク質濃度を得る。続いて、5mMの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を15分以内で添加し、100μMの最終濃度を得、続いて、50mMのm−トルイジン水溶液の添加によって、30分の期間以内に10mMの最終濃度を得る。次いで、20kDの分子量を有するアミノオキシ−PEG試薬(上述)を添加して、20倍のモル過剰の試薬を得る。pHを6.0に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で2時間インキュベートし、1MのL−システイン水溶液の添加によって室温で15分間反応停止処理を行い、10mMの最終濃度を得る。
分岐鎖PEGを使用する治療用タンパク質のPEG化
本発明の治療用タンパク質のPEG化は、アルデヒドおよび活性アミノオキシ基を含有する適切なリンカーから作製される分岐鎖または直鎖PEG化試薬まで拡大され得る。
Claims (18)
- 出血性障害を治療するための修飾された治療用タンパク質を含む組成物であって、活性化水溶性ポリマーが、オキシム連結を介して前記治療用タンパク質の酸化炭水化物部分へと複合化され、
前記活性化水溶性ポリマーは、活性アミノオキシ基を含有し、炭水化物、ポリアルキレングリコール(PAG)、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレンコマレイン酸無水物、およびポリ(1−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール)(PHF)からなる群から選択され;
オキシム連結が、前記酸化炭水化物部分と前記水溶性ポリマー上の前記活性アミノオキシ基との間に形成され、前記オキシム連結の形成が、m−トルイジンによって触媒される、
組成物。 - 前記ポリアルキレングリコール(PAG)が、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリ(メトキシPEG)メタクリレート、またはポリプロピレングリコール(PPG)を含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記炭水化物部分が多糖類を含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記多糖類が、ポリシアル酸(PSA)、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デキストラン、またはカルボキシメチルデキストランを含む、請求項3に記載の組成物。
- 前記治療用タンパク質が、第IX因子(FIX)、第VIII因子(FVIII)、第VIIa因子(FVIIa)、フォンヴィレブランド因子(VWF)、第FV因子(FV)、第X因子(FX)、第XI因子(FXI)、第XII因子(FXII)、トロンビン(FII)、プロテインC、プロテインS、tPA、PAI−1、組織因子(TF)、ADAMTS13プロテアーゼ、IL−1α、IL−1β、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−11、コロニー刺激因子−1(CSF−1)、M−CSF、SCF、GM−CSF、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、EPO、インターフェロンα(IFN−α)、コンセンサスインターフェロン、IFN−β、IFN−γ、IFN−ω、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−12、IL−13、IL−14、IL−15、IL−16、IL−17、IL−18、IL−19、IL−20、IL−21、IL−22、IL−23、IL−24、IL−31、IL−32α、IL−33、トロンボポエチン(TPO)、Ang−1、Ang−2、Ang−4、Ang−Y、アンジオポエチン様ポリペプチド1(ANGPTL1)、アンジオポエチン様ポリペプチド2(ANGPTL2)、アンジオポエチン様ポリペプチド3(ANGPTL3)、アンジオポエチン様ポリペプチド4(ANGPTL4)、アンジオポエチン様ポリペプチド5(ANGPTL5)、アンジオポエチン様ポリペプチド6(ANGPTL6)、アンジオポエチン様ポリペプチド7(ANGPTL7)、ビトロネクチン、血管内皮増殖因子(VEGF)、アンジオゲニン、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンC、骨形態形成タンパク質1、骨形態形成タンパク質2、骨形態形成タンパク質3、骨形態形成タンパク質4、骨形態形成タンパク質5、骨形態形成タンパク質6、骨形態形成タンパク質7、骨形態形成タンパク質8、骨形態形成タンパク質9、骨形態形成タンパク質10、骨形態形成タンパク質11、骨形態形成タンパク質12、骨形態形成タンパク質13、骨形態形成タンパク質14、骨形態形成タンパク質15、骨形態形成タンパク質受容体IA、骨形態形成タンパク質受容体IB、骨形態形成タンパク質受容体II、脳由来神経栄養因子、カルジオトロフィン−1、繊毛様神経栄養因子、繊毛様神経栄養因子受容体、クリプト、クリプティック、サイトカイン誘導好中球走化性因子1、サイトカイン誘導好中球走化性因子2α、サイトカイン誘導好中球走化性因子2β、β内皮細胞増殖因子、エンドセリン1、上皮増殖因子、エピゲン、エピレグリン、上皮誘導好中球誘引物質、線維芽細胞増殖因子4、線維芽細胞増殖因子5、線維芽細胞増殖因子6、線維芽細胞増殖因子7、線維芽細胞増殖因子8、線維芽細胞増殖因子8b、線維芽細胞増殖因子8c、線維芽細胞増殖因子9、線維芽細胞増殖因子10、線維芽細胞増殖因子11、線維芽細胞増殖因子12、線維芽細胞増殖因子13、線維芽細胞増殖因子16、線維芽細胞増殖因子17、線維芽細胞増殖因子19、線維芽細胞増殖因子20、線維芽細胞増殖因子21、酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、グリア細胞株誘導好中球因子受容体α1、グリア細胞株誘導好中球因子受容体α2、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質α、増殖関連タンパク質β、増殖関連タンパク質γ、ヘパリン結合上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、肝細胞癌由来増殖因子、インスリン様増殖因子I、インスリン様増殖因子受容体、インスリン様増殖因子II、インスリン様増殖因子結合タンパク質、ケラチノサイト増殖因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受容体α、神経増殖因子、神経増殖因子受容体、ニューロポエチン、ニューロトロフィン−3、ニューロトロフィン−4、オンコスタチンM(OSM)、胎盤増殖因子、胎盤増殖因子2、血小板由来内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子A鎖、血小板由来増殖因子AA、血小板由来増殖因子AB、血小板由来増殖因子B鎖、血小板由来増殖因子BB、血小板由来増殖因子受容体α、血小板由来増殖因子受容体β、プレB細胞増殖刺激因子、幹細胞因子(SCF)、幹細胞因子受容体、TNF、TNF0、TNF1、TNF2、形質転換増殖因子α、形質転換増殖因子β、形質転換増殖因子β1、形質転換増殖因子β1.2、形質転換増殖因子β2、形質転換増殖因子β3、形質転換増殖因子β5、潜伏形質転換増殖因子β1、形質転換増殖因子β結合タンパク質I、形質転換増殖因子β結合タンパク質II、形質転換増殖因子β結合タンパク質III、胸腺間質性リンパ球新生因子(TSLP)、I型腫瘍壊死因子受容体、II型腫瘍壊死因子受容体、ウロキナーゼタイププラスミノーゲン活性剤受容体、ホスホリパーゼ活性化タンパク質(PUP)、レクチン、リシン、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノゲン活性化因子、IgG、IgE、IgM、IgA、およびIgD、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、DNAse、フェチュイン、黄体形成ホルモン、エストロゲン、インスリン、アルブミン、リポタンパク質、フェトプロテイン、トランスフェリン、トロンボポエチン、ウロキナーゼ、インテグリン、トロンビン、レプチン、ヒュミラ(アダリムマブ)、Prolia(デノスマブ)、Enbrel(エタネルセプト)、表1中のタンパク質、またはその生物学的に活性なフラグメント、誘導体、もしくは変異体からなる群から選択される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記治療用タンパク質が血液凝固タンパク質である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記治療用タンパク質が、FVIIa、FVIII、FIXおよびVWFからなる群から選択される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記水溶性ポリマーがPEGまたはPSAである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記m−トルイジンが、1mM〜50mMの濃度で提供される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の組成物。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載の組成物であって、
前記治療用タンパク質が、FVIIa、FVIIIおよびFIXからなる群から選択され;
前記水溶性ポリマーがPEGまたはPSAであり;
m−トルイジンが、10mMの濃度で提供される、
組成物。 - 請求項1に記載の修飾された治療用タンパク質を調製する方法であって、
a)pH値が5.0〜8.0になるように、前記治療用タンパク質を含む溶液のpH値を調整させることを含み、前記治療用タンパク質濃度が0.3mg/ml〜3.0mg/mlである、第1のステップと;
b)前記治療用タンパク質において、1つ以上の炭水化物を酸化させることを含み、前記酸化剤が、0.1分〜120分の期間;2℃〜37℃の温度;光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、50μM〜1000μMの最終濃度をもたらすように、前記第1のステップ中の前記溶液に添加される、第2のステップと;
c)0.5時間〜24時間の期間、2℃〜37℃の温度;光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、前記治療用タンパク質を所望の過剰濃度の活性化水溶性ポリマーと接触させることを含み、前記過剰濃度が1倍モル過剰〜300倍モル過剰である、第3のステップと;
d)前記第3のステップの前記溶液に、m−トルイジンを添加することを含み、前記m−トルイジンが、0.1分〜30分の期間;2℃〜37℃の温度;光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、1mM〜50mMの最終濃度をもたらすように添加される、第4のステップと;
e)前記治療用タンパク質の1つ以上の酸化炭水化物への前記活性化水溶性ポリマーの複合化を可能にする条件下で、前記治療用タンパク質が、前記活性化水溶性ポリマーおよびm−トルイジンとともにインキュベートされ、前記条件が、0.5時間〜24時間の期間、2℃〜37℃の温度;光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む、第5のステップと;
f)前記第5のステップ中の前記治療用タンパク質の1つ以上の酸化炭水化物への前記水溶性ポリマーの複合化が、L−システイン、メチオニン、グルタチオン、グリセロール、Na 2 S 2 O 5 (メタ重亜硫酸ナトリウム)、トリプトファン、チロシン、ヒスチジン、またはそれらの誘導体、クレゾール、イミダゾール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される反応停止剤の添加によって停止され;前記反応停止剤が、5分〜120分の期間;2℃〜37℃の温度;光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、1mM〜100mMの最終濃度をもたらすように添加される、第6のステップと、
を含み、ステップa)〜e)が単一の容器で起こる、方法。 - 請求項1に記載の修飾された治療用タンパク質を調製する方法であって、
a)pH値が6.0になるように、前記治療用タンパク質を含む溶液のpH値を調整させることを含み、前記治療用タンパク質濃度の初期濃度が1mg/mlである、第1のステップと;
b)前記治療用タンパク質において、1つ以上の炭水化物を酸化させることを含み、前記酸化剤が、10分の期間、22℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含む条件下で、400μMの最終濃度をもたらすように、前記第1のステップ中の前記溶液に添加される、第2のステップと;
c)15分の期間、22℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含む条件下で、前記治療用タンパク質を所望の過剰濃度の活性化水溶性ポリマーと接触させることを含み、前記過剰濃度が50倍モル過剰である、第3のステップと;
d)前記第3のステップの前記溶液に、m−トルイジンを添加することを含み、前記m−トルイジンが、15分の期間、22℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含む条件下で、10mMの最終濃度をもたらすように添加される、第4のステップと;
e)前記治療用タンパク質の1つ以上の酸化炭水化物への前記活性化水溶性ポリマーの複合化を可能にする条件下で、前記治療用タンパク質が、前記活性化水溶性ポリマーおよびm−トルイジンとともにインキュベートされ、前記条件が、2時間の期間;22℃の温度;光の非存在下;および撹拌しながらを含む、第5のステップと;
f)前記第5のステップ中の前記治療用タンパク質の1つ以上の酸化炭水化物への前記水溶性ポリマーの複合化が、L−システインの添加によって停止され;前記L−システインが、60分の期間、22℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含む条件下で、10mMの最終濃度をもたらすように添加される、第6のステップと、
を含み、ステップa)〜e)が単一の容器で起こる、方法。 - 前記酸化剤が過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO 4 )であり、10分の期間;22℃の温度;光の非存在下;および撹拌しながらを含む条件下で、400μM酸化剤の最終濃度をもたらす量で添加される、請求項11または請求項12に記載の方法。
- m−トルイジンが、10mMの濃度で提供される、請求項11または請求項13に記載の方法。
- シアノホウ化水素ナトリウム(NaCNBH 3 )、アスコルビン酸(ビタミンC)、およびNaBH 3 からなる群から選択される還元化合物を含む緩衝液中で前記修飾された治療用タンパク質をインキュベートすることによって、前記修飾された治療用タンパク質中のオキシム連結を還元するステップをさらに含む、請求項11〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記修飾された治療用タンパク質を精製するステップをさらに含む、請求項11〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記修飾された治療用タンパク質が、クロマトグラフィ、濾過、および沈殿からなる群から選択される方法によって精製される、請求項16に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィが、疎水性相互作用クロマトグラフィ(HIC)、イオン交換クロマトグラフィ(IEC)、サイズ排除クロマトグラフィ(SEC)、親和性クロマトグラフィ、および逆相クロマトグラフィからなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US36918610P | 2010-07-30 | 2010-07-30 | |
US61/369,186 | 2010-07-30 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017099807A Division JP2017137358A (ja) | 2010-07-30 | 2017-05-19 | オキシム連結のための求核触媒 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2019116500A true JP2019116500A (ja) | 2019-07-18 |
JP2019116500A5 JP2019116500A5 (ja) | 2020-06-25 |
JP6757823B2 JP6757823B2 (ja) | 2020-09-23 |
Family
ID=44629987
Family Applications (7)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013521998A Active JP6325818B2 (ja) | 2010-07-30 | 2011-07-29 | オキシム連結のための求核触媒 |
JP2015118007A Withdrawn JP2015164958A (ja) | 2010-07-30 | 2015-06-11 | オキシム連結のための求核触媒 |
JP2017099807A Withdrawn JP2017137358A (ja) | 2010-07-30 | 2017-05-19 | オキシム連結のための求核触媒 |
JP2019064338A Withdrawn JP2019116501A (ja) | 2010-07-30 | 2019-03-28 | オキシム連結のための求核触媒 |
JP2019064337A Active JP6757823B2 (ja) | 2010-07-30 | 2019-03-28 | オキシム連結のための求核触媒 |
JP2020196260A Active JP7054407B2 (ja) | 2010-07-30 | 2020-11-26 | オキシム連結のための求核触媒 |
JP2021212106A Active JP7258999B2 (ja) | 2010-07-30 | 2021-12-27 | オキシム連結のための求核触媒 |
Family Applications Before (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013521998A Active JP6325818B2 (ja) | 2010-07-30 | 2011-07-29 | オキシム連結のための求核触媒 |
JP2015118007A Withdrawn JP2015164958A (ja) | 2010-07-30 | 2015-06-11 | オキシム連結のための求核触媒 |
JP2017099807A Withdrawn JP2017137358A (ja) | 2010-07-30 | 2017-05-19 | オキシム連結のための求核触媒 |
JP2019064338A Withdrawn JP2019116501A (ja) | 2010-07-30 | 2019-03-28 | オキシム連結のための求核触媒 |
Family Applications After (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020196260A Active JP7054407B2 (ja) | 2010-07-30 | 2020-11-26 | オキシム連結のための求核触媒 |
JP2021212106A Active JP7258999B2 (ja) | 2010-07-30 | 2021-12-27 | オキシム連結のための求核触媒 |
Country Status (25)
Country | Link |
---|---|
EP (3) | EP2598172B1 (ja) |
JP (7) | JP6325818B2 (ja) |
KR (6) | KR102229967B1 (ja) |
CN (3) | CN103370082A (ja) |
AR (1) | AR082941A1 (ja) |
AU (1) | AU2011282571C1 (ja) |
BR (1) | BR112013001611B1 (ja) |
CA (1) | CA2806684C (ja) |
CY (1) | CY1121943T1 (ja) |
DK (1) | DK2598172T3 (ja) |
EA (2) | EA025738B9 (ja) |
ES (1) | ES2731626T3 (ja) |
HR (1) | HRP20190990T1 (ja) |
HU (1) | HUE043790T2 (ja) |
LT (1) | LT2598172T (ja) |
MX (1) | MX346271B (ja) |
NZ (1) | NZ605972A (ja) |
PL (1) | PL2598172T3 (ja) |
PT (1) | PT2598172T (ja) |
RS (1) | RS58900B1 (ja) |
SG (2) | SG187171A1 (ja) |
SI (1) | SI2598172T1 (ja) |
TR (1) | TR201908836T4 (ja) |
TW (1) | TWI534152B (ja) |
WO (1) | WO2012016131A1 (ja) |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8642737B2 (en) | 2010-07-26 | 2014-02-04 | Baxter International Inc. | Nucleophilic catalysts for oxime linkage |
US8809501B2 (en) | 2009-07-27 | 2014-08-19 | Baxter International Inc. | Nucleophilic catalysts for oxime linkage |
DK2598172T3 (da) * | 2010-07-30 | 2019-07-01 | Baxalta GmbH | Nukleofile katalysatorer til oximforbindelse |
MX345608B (es) | 2010-12-22 | 2017-02-07 | Baxalta Inc | Materiales y metodos para conjugar un derivado de acido graso soluble en agua a una proteina. |
SG11201406492YA (en) * | 2012-04-16 | 2014-11-27 | Cantab Biopharmaceuticals Patents Ltd | Optimised subcutaneous therapeutic agents |
AU2013204754C1 (en) * | 2012-05-16 | 2018-10-11 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Nucleophilic Catalysts for Oxime Linkage |
MA39711A (fr) * | 2014-04-03 | 2015-10-08 | Nektar Therapeutics | Conjugués d'une fraction d'il-15 et d'un polymère |
JP2019510022A (ja) * | 2015-12-03 | 2019-04-11 | バクスアルタ インコーポレイテッド | 半減期が延長されリガンド結合性が低下した第viii因子 |
WO2018017923A1 (en) * | 2016-07-22 | 2018-01-25 | Nektar Therapeutics | Conjugates of a factor viii moiety having an oxime-containing linkage |
CA3126476A1 (en) | 2019-01-23 | 2020-07-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of ophthalmic conditions with angiopoietin-like 7 (angptl7) inhibitors |
US11845989B2 (en) | 2019-01-23 | 2023-12-19 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of ophthalmic conditions with angiopoietin-like 7 (ANGPTL7) inhibitors |
EP4298219A1 (en) | 2021-02-26 | 2024-01-03 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of inflammation with glucocorticoids and angiopoietin-like 7 (angptl7) inhibitors |
Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5574187A (en) * | 1994-10-06 | 1996-11-12 | Uniroyal Chemical Company, Inc. | Process of preparing para substituted phenylamines |
WO2005014024A2 (en) * | 2003-08-08 | 2005-02-17 | Fresenius Kabi Deutschland Gmbh | Conjugates of a polymer and a protein linked by an oxime linking group |
JP2007527891A (ja) * | 2004-03-11 | 2007-10-04 | フレゼニウス・カビ・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | ヒドロキシアルキルデンプンとタンパク質とのコンジュゲート |
WO2009028573A1 (ja) * | 2007-08-27 | 2009-03-05 | National University Corporation Nagoya University | 血液凝固障害におけるリバビリンの利用 |
JP2010501638A (ja) * | 2006-09-01 | 2010-01-21 | ノボ ノルディスク ヘルス ケア アーゲー | 修飾タンパク質 |
WO2010014708A2 (en) * | 2008-08-01 | 2010-02-04 | Baxter International Inc. | Factor viii polymer conjugates |
WO2011012850A2 (en) * | 2009-07-27 | 2011-02-03 | Lipoxen Technologies Limited | Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins |
WO2011014890A1 (en) * | 2009-07-31 | 2011-02-03 | Bayer Healthcare Llc | Modified factor ix polypeptides and uses thereof |
JP2013536180A (ja) * | 2010-07-30 | 2013-09-19 | バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド | オキシム連結のための求核触媒 |
Family Cites Families (34)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS54113492A (en) | 1978-02-24 | 1979-09-05 | Sanyo Chem Ind Ltd | Preparation of glucoprotein derivative |
US4356170A (en) | 1981-05-27 | 1982-10-26 | Canadian Patents & Development Ltd. | Immunogenic polysaccharide-protein conjugates |
US4757006A (en) | 1983-10-28 | 1988-07-12 | Genetics Institute, Inc. | Human factor VIII:C gene and recombinant methods for production |
US5198349A (en) | 1986-01-03 | 1993-03-30 | Genetics Institute, Inc. | Method for producing factor VIII:C and analogs |
US5250421A (en) | 1986-01-03 | 1993-10-05 | Genetics Institute, Inc. | Method for producing factor VIII:C-type proteins |
JPH0387173A (ja) | 1987-09-10 | 1991-04-11 | Teijin Ltd | ヒト活性化天然型ファクター8cの製造方法及びそれに用いる形質転換体 |
US5846951A (en) | 1991-06-06 | 1998-12-08 | The School Of Pharmacy, University Of London | Pharmaceutical compositions |
CA2124690C (en) | 1992-10-02 | 2007-09-11 | Thomas Osterberg | Composition comprising coagulation factor viii formulation, process for its preparation and use of a surfactant as stabilizer |
WO1994028024A1 (en) * | 1993-06-01 | 1994-12-08 | Enzon, Inc. | Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity |
US5621039A (en) | 1993-06-08 | 1997-04-15 | Hallahan; Terrence W. | Factor IX- polymeric conjugates |
WO1996040662A2 (en) | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Cellpro, Incorporated | Aminooxy-containing linker compounds and their application in conjugates |
US6531298B2 (en) | 1997-07-21 | 2003-03-11 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Factor IX antihemophilic factor with increased clotting activity |
US7074878B1 (en) | 1999-12-10 | 2006-07-11 | Harris J Milton | Hydrolytically degradable polymers and hydrogels made therefrom |
US6413507B1 (en) | 1999-12-23 | 2002-07-02 | Shearwater Corporation | Hydrolytically degradable carbamate derivatives of poly (ethylene glycol) |
DE60116137T2 (de) | 2000-05-16 | 2006-08-24 | Lipoxen Technologies Ltd. | Derivatisierung von proteinen in wässrigem lösungsmittel |
US7265084B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-09-04 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods |
US7026440B2 (en) | 2001-11-07 | 2006-04-11 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Branched polymers and their conjugates |
AU2003253399B2 (en) | 2002-09-11 | 2010-10-14 | Fresenius Kabi Deutschland Gmbh | Hasylated polypeptides, especially hasylated erythropoietin |
EP1681303B1 (en) | 2002-09-11 | 2013-09-04 | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | HASylated polypeptides, especially HASylated erythropoietin |
WO2004089280A2 (en) | 2003-04-08 | 2004-10-21 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Reversible pegylated drugs |
MXPA05010773A (es) | 2003-04-09 | 2005-12-12 | Neose Technologies Inc | Metodos de glicopegilacion y proteinas/peptidos producidos por los metodos. |
CN1832762B (zh) * | 2003-08-08 | 2012-09-05 | 弗雷泽纽斯卡比德国有限公司 | 羟烷基淀粉与g-csf的偶联物 |
WO2005016949A2 (en) | 2003-08-12 | 2005-02-24 | Lipoxen Technologies Limited | Sialic acid derivatives |
US8633157B2 (en) | 2003-11-24 | 2014-01-21 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated erythropoietin |
US20060040856A1 (en) | 2003-12-03 | 2006-02-23 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated factor IX |
KR101237884B1 (ko) | 2003-12-03 | 2013-02-27 | 바이오제너릭스 에이지 | 글리코 peg화 과립구 콜로니 자극인자 |
EP1776389B1 (en) | 2004-08-12 | 2016-06-29 | Lipoxen Technologies Limited | Sialic acid derivatives |
US8268967B2 (en) | 2004-09-10 | 2012-09-18 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated interferon α |
PT1835938E (pt) | 2004-12-27 | 2013-11-06 | Baxter Int | Conjugados de polímero-factor de von willebrand |
MX2007016314A (es) | 2005-06-16 | 2008-03-10 | Nektar Therapeutics Al Corp | Conjugados que tienen un enlace degradable y reactivos polimericos utiles en la preparacion de tales conjugados. |
CN101535339B (zh) * | 2006-09-01 | 2014-11-12 | 诺沃-诺迪斯克保健股份有限公司 | 改性糖蛋白 |
ES2521490T3 (es) | 2006-12-15 | 2014-11-12 | Baxter International Inc. | Conjugado de factor VIIa - ácido (poli)siálico con una vida media in vivo prolongada. |
GB0908393D0 (en) * | 2009-05-15 | 2009-06-24 | Almac Sciences Scotland Ltd | Labelling method |
WO2011017055A2 (en) * | 2009-07-27 | 2011-02-10 | Baxter International Inc. | Blood coagulation protein conjugates |
-
2011
- 2011-07-29 DK DK11741727.9T patent/DK2598172T3/da active
- 2011-07-29 KR KR1020207030594A patent/KR102229967B1/ko active IP Right Grant
- 2011-07-29 KR KR1020217007514A patent/KR102269494B1/ko active IP Right Grant
- 2011-07-29 ES ES11741727T patent/ES2731626T3/es active Active
- 2011-07-29 WO PCT/US2011/045873 patent/WO2012016131A1/en active Application Filing
- 2011-07-29 PL PL11741727T patent/PL2598172T3/pl unknown
- 2011-07-29 CN CN2011800476351A patent/CN103370082A/zh active Pending
- 2011-07-29 SI SI201131742T patent/SI2598172T1/sl unknown
- 2011-07-29 PT PT11741727T patent/PT2598172T/pt unknown
- 2011-07-29 SG SG2013005160A patent/SG187171A1/en unknown
- 2011-07-29 TW TW100126974A patent/TWI534152B/zh active
- 2011-07-29 KR KR1020197010071A patent/KR102088852B1/ko active IP Right Grant
- 2011-07-29 JP JP2013521998A patent/JP6325818B2/ja active Active
- 2011-07-29 MX MX2013001261A patent/MX346271B/es active IP Right Grant
- 2011-07-29 SG SG10201913078SA patent/SG10201913078SA/en unknown
- 2011-07-29 AR ARP110102758A patent/AR082941A1/es active IP Right Grant
- 2011-07-29 CN CN201810090885.7A patent/CN108079312A/zh active Pending
- 2011-07-29 EA EA201300190A patent/EA025738B9/ru not_active IP Right Cessation
- 2011-07-29 KR KR1020207006813A patent/KR102172133B1/ko active IP Right Grant
- 2011-07-29 RS RS20190779A patent/RS58900B1/sr unknown
- 2011-07-29 KR KR1020217018874A patent/KR102325780B1/ko active IP Right Grant
- 2011-07-29 NZ NZ60597211A patent/NZ605972A/en unknown
- 2011-07-29 BR BR112013001611-6A patent/BR112013001611B1/pt active IP Right Grant
- 2011-07-29 KR KR1020137004971A patent/KR101969601B1/ko active IP Right Grant
- 2011-07-29 HU HUE11741727A patent/HUE043790T2/hu unknown
- 2011-07-29 CA CA2806684A patent/CA2806684C/en active Active
- 2011-07-29 EP EP11741727.9A patent/EP2598172B1/en active Active
- 2011-07-29 AU AU2011282571A patent/AU2011282571C1/en active Active
- 2011-07-29 EA EA201691292A patent/EA201691292A1/ru unknown
- 2011-07-29 LT LTEP11741727.9T patent/LT2598172T/lt unknown
- 2011-07-29 CN CN201810089901.0A patent/CN108079311A/zh active Pending
- 2011-07-29 EP EP21207146.8A patent/EP4023247A1/en active Pending
- 2011-07-29 TR TR2019/08836T patent/TR201908836T4/tr unknown
- 2011-07-29 EP EP18208032.5A patent/EP3505186B1/en active Active
-
2015
- 2015-06-11 JP JP2015118007A patent/JP2015164958A/ja not_active Withdrawn
-
2017
- 2017-05-19 JP JP2017099807A patent/JP2017137358A/ja not_active Withdrawn
-
2019
- 2019-03-28 JP JP2019064338A patent/JP2019116501A/ja not_active Withdrawn
- 2019-03-28 JP JP2019064337A patent/JP6757823B2/ja active Active
- 2019-05-31 HR HRP20190990TT patent/HRP20190990T1/hr unknown
- 2019-06-19 CY CY20191100632T patent/CY1121943T1/el unknown
-
2020
- 2020-11-26 JP JP2020196260A patent/JP7054407B2/ja active Active
-
2021
- 2021-12-27 JP JP2021212106A patent/JP7258999B2/ja active Active
Patent Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5574187A (en) * | 1994-10-06 | 1996-11-12 | Uniroyal Chemical Company, Inc. | Process of preparing para substituted phenylamines |
WO2005014024A2 (en) * | 2003-08-08 | 2005-02-17 | Fresenius Kabi Deutschland Gmbh | Conjugates of a polymer and a protein linked by an oxime linking group |
JP2007527891A (ja) * | 2004-03-11 | 2007-10-04 | フレゼニウス・カビ・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | ヒドロキシアルキルデンプンとタンパク質とのコンジュゲート |
JP2010501638A (ja) * | 2006-09-01 | 2010-01-21 | ノボ ノルディスク ヘルス ケア アーゲー | 修飾タンパク質 |
WO2009028573A1 (ja) * | 2007-08-27 | 2009-03-05 | National University Corporation Nagoya University | 血液凝固障害におけるリバビリンの利用 |
WO2010014708A2 (en) * | 2008-08-01 | 2010-02-04 | Baxter International Inc. | Factor viii polymer conjugates |
WO2011012850A2 (en) * | 2009-07-27 | 2011-02-03 | Lipoxen Technologies Limited | Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins |
WO2011014890A1 (en) * | 2009-07-31 | 2011-02-03 | Bayer Healthcare Llc | Modified factor ix polypeptides and uses thereof |
JP2013536180A (ja) * | 2010-07-30 | 2013-09-19 | バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド | オキシム連結のための求核触媒 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
DIRKSEN A: "NUCLEOPHILIC CATALYSIS OF OXIME LIGATION", ANGEWANDTE CHEMIE. INTERNATIONAL EDITION, vol. V45 N45, JPN5013011052, 20 November 2006 (2006-11-20), pages 7581 - 7584, ISSN: 0004213164 * |
MIKKEL B THYGESEN: "NUCLEOPHILIC CATALYSIS OF CARBOHYDRATE OXIME FORMATION BY ANILINES", THE JOURNAL OF ORGANIC CHEMISTRY, vol. V75 N5, JPN5013011054, 5 March 2010 (2010-03-05), pages 1752 - 1755, ISSN: 0004213165 * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7258999B2 (ja) | オキシム連結のための求核触媒 | |
JP7304402B2 (ja) | オキシム連結のための求核触媒 | |
AU2015275284B2 (en) | Nucleophilic Catalysts for Oxime Linkage |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20190328 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200214 |
|
A524 | Written submission of copy of amendment under article 19 pct |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A524 Effective date: 20200513 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20200826 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20200831 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6757823 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |