o - — “MÉTODOS PARA CONJUGAR UM POLÍMERO SOLÚVEL EM ÁGUA : A UMA FRAÇÃO DE CARBOIDRATO OXIDADO DE UMA PROTEÍNA TERAPÊUTICA, PARA FORMAR UMA LIGAÇÃO OXIMA ENTRE
UMA FRAÇÃO DE CARBOIDRATO OXIDADO EM UMA PROTEÍNA — TERAPÊUTICA E UM POLÍMERO SOLÚVEL EM ÁGUA ATIVADO, E
PARA FORMÁR UMA LIGAÇÃO HIDRAZONA ENTRE UMA FRAÇÃO
DE CARBOIDRATO OXIDADO EM UMA PROTEÍNA TERAPÊUTICA E UM POLÍMERO SOLÚVEL EM ÁGUA ATIVADO, E, PROTEÍNA TERAPÊUTICA MODIFICADA” CAMPO DA INVENÇÃO ; A presente invenção refere-se aos materiais e métodos para s conjugação de um polímero solúvel em água a uma proteína. h FUNDAMENTO DA INVENÇÃO . “ A preparação de conjugados por formação de uma ligação covalente entre polímero solúvel em água e a proteína terapêutica pode ser - realizada por uma variedade de métodos químicos. Peguilação de polipeptídeos drogas protege os mesmos na circulação e melhora seus perfis Ú farmacodinâmicos e farmacocinéticos (Harris and Chess, Nat Ver Drug Discov. 2003;2:214-21). O processo de peguilação liga unidades repetidas de | etilenoglicol (polietilenoglicol (PEG)) a uma droga de polipeptídeo. Moléculas PEG têm um grande volume hidrodinâmico (5 - 10 vezes o tamanho de proteínas globulares), são altamente solúveis e hidratados, não tóxicas, não imunogênicas e rapidamente são excluídas do corpo. Peguilação ' de moléculas pode levar a aumento da resistência das drogas à degradação 225 enzimática, maior meia-vida in vivo, frequência de dosagem reduzida, imunogenicidade reduzida, estabilidade física e térmica aumentada, solubilidade aumentada, estabilidade aumentada de líquido e reduziu da agregação. As primeiras drogas peguiladas foram aprovadas pelo FDA no | início de 1990. Desde então, o FDA aprovou várias drogas peguiladas para
MN ” RM Lo 2 . administração oral, injetável e tópica.
Ácido Polisiálico (PSA), também conhecido como ácido colomínico (CA), é um polissacarídeo que ocorre naturalmente. É um homopolimero — de ácido N-acetilneuramínico com ligação de a(2—>8)cetosídicae contém grupos vicinais de diol em sua extremidade não redutora. É negativamente carregado e um constituinte natural do corpo humano. Facilmente pode ser produzido a partir de bactérias em grandes quantidades e com características físicas predeterminadas (Patente US
5.846.951). Devido ao fato de que o PSA bacteriano produzido é — quimicamente e imunologicamente idêntico ao PSA produzido no corpo humano, PSA bacteriano é não imunogênico, mesmo quando ligado a proteínas.
Ao contrário de alguns polímeros, ácido PSA é biodegradável. Acoplamento , covalente de ácido colomínico a catalase e asparaginase demonstrou aumentar a .. estabilidade da enzima na presença de enzimas proteolíticas ou plasma sanguíneo.
i 15 Estudos comparativos in vivo com asparaginase polisialiladas e sem modificações : revelaram que polisialilação aumentou a meia-vida da enzima (Fernandes e Gregoriadis, Int J] Pharm. 2001;217:215-24).
' Acoplamento de derivados de PEG a peptídeos ou proteínas é | revisto por Roberts et al. (Adv Drug Deliv Rev 2002;54:459-76). Uma abordagem para acoplamento de polímeros solúveis em água a proteínas terapêuticas é a conjugação de polímeros através de frações de carboidrato da proteína. Grupos hidroxil vicinais (OH) de carboidratos em proteínas podem ser facilmente oxidados com periodato de sódio (NaIO4) para formar grupos " aldeídos ativos (Rothfus et Smith, J Biol Chem 1963; 238:1402-10; van — 25 Lentenet Ashwell, J Biol Chem 1971;246:1889-94). Subsequentemente o polímero pode ser acoplado aos grupos aldeídos do carboidrato pelo uso de reagentes contendo, por exemplo, um grupo hidrazida ativo (Wilchek M and Bayer EA, Methods Enzymol 1987;138:429-42). Uma tecnologia mais recente é o uso de reagentes contendo grupos amino-oxi que reagem com
| o Le 3 . aldeídospara forma ligações oxima (WO 96/40662, WO2008/025856). Exemplos adicionais que descrevem a conjugação de um polímero solúvel em água a uma proteína terapêutica são descritos na WO 06/071801 que ensina a oxidação de frações de carboidratos no fato de Von S —Willebrande acoplamento subsequente a PEG usando química da hidrazida; Publicação US 2009/0076237, que ensina a oxidação de rF VIII e acoplamento subsequente a PEG e outros polímeros solúveis em água (por exemplo, PSA, HES, dextrano) usando química de hidrazida; WO 2008/025856 que ensina a oxidação dos diferentes fatores de coagulação, por exemplo, rFIX, FVIII e FVIla e acoplamento subsequente a PEG, usando química de amino-oxi, formando uma ligação oxima; e Patente US 5.621.039 que ensina a oxidação de FIX e subsequente acoplamento a PEG usando química de hidrazida.
A Recentemente, um método melhorado foi descrito ; compreendendo oxidação leve de periodato de ácidos siálicos para gerar | —aldeídos seguidos pela reação com um grupo amino-oxi contendo o reagente | - na presença de quantidades catalíticas de anilina (Dirksen A. é Dawson PE, | Bioconjugate Chem. 2008;19,2543-8; e Zeng Y et al., Nature Methods | 2009;6:207-9). A catálise de anilina dramaticamente acelera a ligação de | oxima, permitindo o uso de concentrações muito baixas de reagente. O uso de — catalisadores de nucelofílicos também é descrito em Dirksen, A., et al., J Am | Chem. Soc., 128:15602-3 (2006); Dirksen, A., et al., Angew Chem. Int Ed., | | 45:7581-4/ (2006); Kohler, J.J, ChemBioChem., 10:2147-50 (2009); | Giuseppone, N., et al., J Am Chem Soc., 127:5528-39 (2005); e Thygesen, oo M.B,., et al., J Org Chem., 75:1752-5 (2010).
225 Embora a catálise de anilina possa acelerar a ligação oxima i permitindo tempos de reação curtos e o uso de concentrações baixas do | reagente amino-oxi, anilina tem propriedades tóxicas que devem ser consideradas quando, por exemplo, a proteína terapêutica conjugada forma a base de um produto farmacêutico. Por exemplo, anilina demonstrou introduzir
| e o 4 us metemoglobinemia — (Harrison, JH., and Jollow, D.J, Molecular Pharmacology, 32(3) 423-431, 1987). O tratamento dietético de longo prazo de ratos demonstrou induzir tumores no baço (Goodman, DG., et al., J Natl Cancer Inst., 73(1):265-73, 1984). Estudos in vitro demonstraram também que anilina tem o potencial para induzir mutações cromossomais e tem atividade potencialmente genotóxico (Bombhard É M. et Herbold B, Critical Reviews in Toxicology 35,783-835, 2005). Considerando as propriedades potencialmente perigosas de anilina e não obstante os métodos disponíveis de polímeros solúveis em água a proteínas terapêuticas, permanece uma necessidade para desenvolver materiais e métodos para conjugar polímeros solúveis em água a proteínas que melhoram as propriedades farmacodinâmicas e/ou farmacocinéticas a enquanto minimizando os custos associados com os vários reagentes e minimizando os riscos de saúde do receptor paciente.
AS SUMÁRIO DA INVENÇÃO - A presente invenção fornece materiais e métodos para conjugar polímeros a proteínas que melhoram as propriedades ] farmacodinâmicas e/ou farmacocinéticas enquanto minimizando os custos l associados com os vários reagentes e os riscos a saúde do paciente receptor quando a reação de conjugação é catalisada por um catalisador nucleofílico. Em várias modalidades da invenção, catalisadores alternativos para substituir i anilina são fornecidos. Em uma modalidade, um método de conjugação de um - polímero solúvel em água a uma fração de carboidrato oxidado de uma — 25 proteina terapêutica é fornecido compreendendo contatar a fração de carboidrato oxidado com um polímero solúvel em água ativado em condições que permite a conjugação; dito polímero solúvel em água contendo um grupo amino-oxi ativo é selecionado do grupo que consiste de polietilenoglicol (PEG), PEG ramificado, PoliPEGE& (Warwick Effect Polimers; Coventry,
| . 5 . UM), ácido polisiálico (PSA), amido, hidroxialquil amido (HAS), hidroxiletil amido (HES), carboidrato, polissacarídeos, pululano, quitosana, ácido hialurônico, sulfato de condroitina, sulfato de dermatano, amido, dextrano, carboximetil-dextrano, óxido polialquileno (PAO), polialquíleno glicol (PAG), polipropileno glicol (PPG), polioxazolina, poliacriloilmorfolina, polivinil álcool (PVA), policarboxilato, polivinilpirrolidoná, polifosfazeno, polioxazolina, polietileno-co-ácido maleico anidrido, poliestireno-co-ácido maleico anidrido, poli(1-hidroximetiletileno hidroximetilformal) (PHF), 2- metacriloiloxi-2'-etiltrimetilamôniofosfato (MPC); e dita fração de carboidrato oxidada por incubação com um tampão compreendendo um agente oxidante selecionado do grupo que consiste de periodato de sódio (NalIO4), tetraacetato de chumbo (PL(OAc)4) e perrutenato de potássio a. (KRuO4); em que uma ligação oxima é formada entre a fração de carboidrato oxidado e o grupo amino-oxi ativo do polímero solúvel em água; e em que dita formação de ligação oxima é catalisada por um catalisador nucleofílico - selecionado do grupo que consiste de ácido o-amino benzoico, ácido m-amino | benzoico, ácido p-amino benzoico, ácido sulfanílico, o-aminobenzamida, o- Ú toluidina, m-toluidina, p-toluidina, o-anisidina, m-anisidina, e p-anisidina.
Em outra modalidade, um método de conjugação a polímero | solúvel em água a uma fração de carboidrato oxidado de uma proteína terapêutica é fornecida compreendendo contatar a fração de carboidrato oxidado com um polímero solúvel em água ativado em condições que permitem conjugação; dita proteina terapêutica selecionada do grupo que - consiste de Fator IX (FIX), Fator VIII (FVIII), Fator VIIa (FVIa), Fator de Von Willebrand(VWF), Fator FV (FEV), Fator X (FX), Fator XI (FXI), Fator i XII (FXID), trombina (FII), proteína C, proteína S, tPA, PAI-1, fator tecidual (TF), ADAMTS 13 protease, IL-1 alfa, IL-1 beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, fator estimulante de colônia-1 (CSF-1), M-CSF, SCF, GM-CSF, fator estimulante de colônia de granulócito (G-CSF), EPO, interferon-alfa (IFN-
“% 6 " alfa), interferon consenso, IFN-beta, IFN-gama, IFN-ômega, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, 11-22, 11-23, I1L-24, IL-31, IL-32 alfa, IL-33, trombopoietina (TPO), Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y, polipeptídeo tipo angiopoietina 1 (ANGPTLI),
—polipeptideo tipo angiopoietina 2 (ANGPTL2), polipeptídeo tipo | angiopoietina 3 (ANGPTL3), polipeptídeo tipo angiopoietina 4 (ANGPITA), | polipeptídeo tipo angiopoietina 5 (ANGPTLS), polipeptídeo tipo | angiopoietina 6 (ANGPTLO6), polipeptídeo tipo angiopoietina 7 (ANGPTL7), vitronectina, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), angiogenina,
—activina A, activina B, activina C, proteína morfogênica óssea-l, proteína morfogênica óssea-2, proteína morfogênica óssea-3, proteína morfogênica
Óóssea-4, proteína morfogênica óssea-5, proteina morfogênica óÓssea-6,
A“. proteína morfogênica óssea-7, proteína morfogênica óssea-8, proteína morfogênica óssea-9, proteína morfogênica óssea-10, proteína morfogênica
5 óssea-11, proteína morfogênica óssea-12, proteína morfogênica óssea-13, - proteína morfogênica óssea-l14, proteína morfogênica óssea-l15, receptor de proteína morfogênica óssea IA, receptor de proteína morfogênica óssea IB,
' receptor de proteína morfogênica óssea II, fator neurotrófico derivado de cérebro, cardiotrofina-1, fator neutrófico ciliar, receptor de fator neutrófico ciliar, cripto, críptico, fator quimiotáxico de neutrófilo induzido por citocina
1, neutrófilo induzido por citocina, fator quimiotáxico 2a, fator quimiotáxico de neutrófilo induzido por citocina 28, fº fator de crescimento de célula endotelial, endotelina 1, fator de crescimento epidérmico, epigen, epiregulina,
- atrativo de neutrófilo derivado de epitélio, fator de crescimento de fibroblasto 4, fatorde crescimento de fibroblasto 5, fator de crescimento de fibroblasto 6, fator de crescimento de fibroblasto 7, fator de crescimento de fibroblasto 8, fator de crescimento de fibroblasto &b, fator de crescimento de fibroblasto &c,
fator de crescimento de fibroblasto 9, fator de crescimento de fibroblasto 10,
fator de crescimento de fibroblasto 11, fator de crescimento de fibroblasto 12,
fator de crescimento de fibroblasto 13, fator de crescimento de fibroblasto 16, fator de crescimento de fibroblasto 17, fator de crescimento de fibroblasto 19, fator de crescimento de fibroblasto 20, fator de crescimento de fibroblasto 21, fator de crescimento de fibroblasto ácido, fator de crescimento de fibroblasto — básico, receptor de fator neurotrófico derivado de linhagem de célula da glia al, receptor de fator neurotrófico derivado de linhagem de célula da glia a2, O proteína relacionada a crescimento, proteína relacionada a crescimento a, proteína relacionada a crescimento B, proteína relacionada a crescimento 7, fator de crescimento epidérmico de ligação a heparina, fator de crescimento de hepatócito, fator receptor de crescimento de hepatócito, fator de crescimento derivado de hepatoma, fator de crescimento tipo insulina 1, fator de crescimento tipo insulina receptor, fator de crescimento tipo insulina II, - proteína de ligação a fator de crescimento tipo insulina, fator de crescimento | de queratinócito, fator inibitório de leucemia, receptor de fator inibitório de leucemiaa, fator de crescimento de nervo, receptor de fator de crescimento de . nervo, neuropoietina, neurotrofina-3, neurotrofina-4, oncostatina M (OSM), fator de crescimento de placenta, fator de crescimento de placenta 2, fator de Ú crescimento de célula endotelial derivado de plaqueta, fator de crescimento | derivado de plaqueta, cadeia A de fator de crescimento derivado de plaqueta, | 20 fator AA de crescimento derivado de plaqueta, fator AB de crescimento derivado de plaqueta, cadeia B de fator de crescimento derivado de plaqueta, fator BB de crescimento derivado de plaqueta, receptor a de fator de crescimento derivado de plaqueta, receptor (3 de fator de crescimento derivado . de plaqueta, fator estimulante de crescimento de pré-célula B, fator de célula- — tronco (SCF), receptor de fator de célula-tronco, TNF, TNFO, TNF1, TNF2, fator a de crescimento transformador, fator À de crescimento transformador,fator Bl de crescimento transformador, fator Bl.2 de crescimento transformador, fator 82 de crescimento transformador, fator B3 de crescimento transformador, fator 5 de crescimento transformador, fator
| B1 latente de crescimento transformador, proteína I de ligação fator Bº de crescimento transformador, proteína II de ligação a fator B de crescimento transformador, proteína III de ligação a fator Bº de crescimento transformador, linfopoietina estromal tímica (TSLP), receptor de fator de necrose tumoral tipo, receptor de fator de necrose tumoral tipo II, receptor ativador de plasminogênio tipo uroquinase, proteína ativadora de fosfolipase (PUP), insulina, lectina, ricina, prolactina, gonadotropina coriônica, hormônio estimulador de folículo, hormônio estimulador de tireoide, ativador de plasminogênio tecidual, IgG, IgE, IgM, IgA, e IgD, a-galactosidase, B- —galactosidase, DNAse, fetuina, hormônio luteinizante, estrogênio, insulina, albumina, lipoproteínas, fetoproteína, transferrina, trombopoietina, uroquinase, integrina, trombina, leptina, Humira (adalimumab), Prolia ” (denosumab), Enbrel (etanercept), uma proteína na tabela 1, ou um fragmento biologicamente ativo, derivado ou variante do mesmo; dito polímero solúvel “15 em água contendo um grupo amino-oxi ativo e é selecionada do grupo que . consiste de polietilenoglicol (PEG), PEG ramificado, PoliPEGÊ& (Warwick Effect Polimers; Coventry, UK), ácido polisiálico (PSA), amido, hidroxialquil ' amido (HAS), hidroxiletil amido (HES), carboidrato, polissacarídeos, ' pululano, quitosana, ácido hialurônico, sulfato de condroitina, sulfato de —dermatano, amido, dextrano, carboximetil-dextrano, óxido de polialquileno (PAO), polialquileno glicol (PAG), polipropileno glicol (PPG), polioxazolina, poliacriloilmorfolina, polivinil álcool (PVA), policarboxilato, polivinilpirrolidona, —polifosfazeno, polioxazolina, polietileno-co-ácido - maleico — anidrido, — poliestireno-co-ácido — maleico — anidrido, — poli(1- —hidroximetiletileno — hidroximetilformal) (PHF), 2-metacriloiloxi-2- etiltrimetilamôniofosfato (MPC); e dita fração de carboidrato oxidada por incubação com um tampão compreendendo um agente oxidante selecionado do grupo que consiste de periodato de sódio (NaIO4), tetracetato de chumbo (PLb(OAc)4) e perrutenato de potássio (KRuO4); em que uma libação oxima é | | o o 4 9 formada entre a fração de carboidrato oxidado e o grupo amino-oxi ativo no polímero solúvel em água; e em que dita formação de ligação de oxima é catalisada por um catalisador nucleofílico selecionado do grupo que consiste de ácido o-amino benzoico, ácido m-amino benzoico, ácido p-amino — benzoico, ácido sulfanílico, o-aminobenzamida, o-toluidina, m-toluidina, p- toluidina, o-anisidina, m-anisidina, e p-anisidina.
Ainda em outra modalidade, um método acima mencionado é | fornecido em que uma solução compreendendo uma concentração inicial da | proteína terapêutica entre cerca de 0,3 mg/ml e cerca de 3,0 mg/ml é ajustado aum valor de pH entre cerca de 5,0 e cerca de 8,0 antes de contatar com o polímero solúvel em água ativado.
Conforme usado aqui, o termo “cerca de” significa um valor | - acima ou abaixo de um valor declarado.
Em várias modalidades, o termo “cerca de” inclui o valor declarado mais ou menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, | : 15 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2,3, 4,5, 6,7, 8, 9 ou 10% do valor declarado. . Ainda em outra modalidade, um método acima mencionado é fornecido em que a concentração inicial da proteína terapêutica é cerca de 1,0 ' mg/ml e o pH é cerca de 6,0. Em uma modalidade relacionada, a concentração inicial da proteína terapêutica é cerca de 0,75 mg/ml e o pH é cerca de 6,0. | Ainda em outra modalidade relacionada, a concentração inicial da proteina | terapêutica é cerca de 1,25 mg/ml e o pH é cerca de 6,0. Em outra modalidade, um método acima mencionado é fornecido em que a proteína terapêutica é contatada por uma concentração em - excesso desejada de polímero solúvel em água ativado, em que a — concentração em excesso é entre cerca de l-molar e cerca de 300-molar excesso.
Em outra modalidade, a concentração em excesso é cerca de 50 vezes excesso molar.
Ainda em outra modalidade, um método acima mencionado é fornecido em que a proteína terapêutica é incubada com o polímero solúvel
| ativado em água em condições compreendendo um período de tempo entre cerca de 0,5 hora e cerca de 24 horas; uma temperatura entre cerca de 2ºC e cerca de 37ºC; na presença ou ausência de luz; e com ou sem agitação.
Em | outra modalidade, as condições compreendem um período de tempo de cerca l 5 —del1l20minutos, uma temperatura de cerca de 22 ºC, a ausência de luz; e com agitação.
Conforme usado aqui, o termo “agitação” pretende incluir agitação | em várias velocidades e intensidades (por exemplo, agitação suave) comumente usadas por equipamentos e produtos de laboratório ou fabricação.
Em outra modalidade, um método acima mencionado é 10 fornecido em que o catalisador nucleofílico é adicionado em uma quantidade para resultar em uma concentração final entre cerca de 1,0 mM e cerca de 50 mM de catalisador nucleofílico, em condições compreendendo um período de - tempo entre cerca de 0,1 minuto e cerca de 30 minutos; uma temperatura entre cerca de 2ºC e cerca de 37ºC; na presença ou ausência de luz; e com ou sem | 15 agitação.
Em outra modalidade, a concentração final do catalisador . nucleofílico é cerca de 10 mM, e as condições compreendem um período de tempo de até cerca de 15 minutos, uma temperatura de cerca de 22 ºC, a ' ausência de luz; e com agitação.
Ainda em outra modalidade, um método acima mencionado é | fornecido em que o agente oxidante é adicionado em uma quantidade para resultar em uma concentração final entre cerca de 50 uM e cerca de 1000 uM do agente oxidante, em condições compreendendo um período de tempo entre cerca de 0,1 minuto e 120 minutos; uma temperatura entre cerca de 2ºC e . cerca de 37ºC; na presença ou ausência de luz; e com ou sem agitação.
Em : 25 —outramodalidade,a concentração final de agente oxidante é cerca de 400 uM, e as condições compreendem um período de tempo de cerca de 10 minutos, uma temperatura de cerca de 22ºC, a ausência de luz e com agitação.
Ainda em outra modalidade, um método acima mencionado é fornecido em que a conjugação do polímero solúvel em água à fração de
| 11 carboidrato oxidado da proteína terapêutica é interrompida pela adição de um agente de extinção selecionado do grupo que consiste de L-cisteína, metionina, glutationa, glicerol, metabissulfito de sódio (Na2S8205), triptofano, tirosina, histidina ou derivados dos mesmos, cresol, imidazol, e combinações | S —dosmesmos;em que o agente de extinção é adicionado em uma quantidade para resultar em uma concentração final entre cerca de 1 mM e cerca de 100 mM do agente de extinção, em condições compreendendo um período de l tempo entre cerca de 5 minutos e cerca de 120 minutos; uma temperatura entre cerca de 2ºC e cerca de 37ºC; na presença ou ausência de luz; e com ou | sem agitação. Em outra modalidade, o agente de extinção é L-cisteína. Ainda | em outra modalidade, a L-cisteíina é adicionado para resultar em uma concentração final de cerca de 10 mM e as condições compreendem um ; “ período de tempo de cerca de 60 minutos, uma temperatura de cerca de 220C, a ausência de luz e com agitação.
| ' 15 Em outra modalidade, um método acima mencionado é . fornecido compreendendo: a) uma primeira etapa compreendendo ajustar o | valor de pH de uma solução compreendendo a proteína terapêutica a um valor o de pH entre cerca de 5,0 e cerca de 8,0, em que a concentração da proteína | terapêutica é entre cerca de 0,3 mg/ml e cerca de 3,0 mg/ml; b) uma segunda | | 20 etapa compreendendo oxidar um ou mais carboidratos na proteína terapêutica, em que o agente oxidante é adicionado à solução na primeira etapa para | resultar em uma concentração final entre cerca de 50uM e cerca de 1000uM, | em condições compreendendo um período de tempo entre cerca de 0,1 minuto . e cerca de 120 minutos; uma temperatura entre cerca de 2ºC e cerca de 37ºC; — na presença ou ausência de luz, e com ou sem agitação; c) uma terceira etapa | i compreendendo contatar a proteína terapêutica com uma concentração em excesso desejado de polímero solúvel em água ativado, em que a concentração em excesso é entre cerca de 1-excesso molar e cerca de 300- excesso molar, em condições compreendendo um período de tempo entre
À 12 cerca de 0,5 hora e cerca de 24 horas, uma temperatura entre cerca de 2ºC e cerca de 37ºC; na presença ou ausência de luz; e com ou sem agitação; d) uma quarta etapa compreendendo adicionar um catalisador nucleofílico à solução da terceira etapa, em que o catalisador nucleofílico é adicionado para resultar em uma concentração final entre cerca de 1 mM e cerca de 50 mM, ” em condições compreendendo um período de tempo entre cerca de 0,1 minuto e cerca de 30 minutos; uma temperatura entre cerca de 2ºC e cerca de 37ºC; na presença ou ausência de luz, e com ou sem agitação; e) uma quinta etapa em que a proteína terapêutica é incubada com o polimero solúvel ativado em Ááguaeo catalisador nucleofílico em condições que permitem conjugação do polímero solúvel em água ativado a um ou mais carboidratos oxidados na proteína terapêutica, tais condições compreendendo um período de tempo | " entre cerca de 0,5 hora e cerca de 24 horas, uma temperatura entre cerca de 2ºC e cerca de 37ºC; na presença ou ausência de luz, e com ou sem agitação; ef uma sexta etapa em que a conjugação do polímero solúvel em água a um . ou mais carboidratos oxidados da proteína terapêutica na quinta etapa é interrompida pela adição de um agente de extinção selecionada do grupo que ' consiste de L-cisteinay metionina, glutationay glicerol, Na2S205 (metabissulfito de sódio), triptofano, tirosina, histidina ou derivados dos mesmos, cresol, imidazol, e combinações dos mesmos; em que o agente de extinção é adicionado para resultar em uma concentração final de cerca de 1 mM e cerca de 100 mM, em condições compreendendo um período de tempo entre cerca de 5 minutos e cerca de 120 minutos; uma temperatura entre cerca . de 2ºC e cerca de 37ºC; na presença ou ausência de luz, e com ou sem agitação.
Em outra modalidade, a concentração inicial da proteína terapêutica na primeira etapa é cerca de 1 mg/ml e o pH é cerca de 6,0; em que a concentração final de agente oxidante na segunda etapa é cerca de 400 uM, e as condições na quinta etapa compreendem um período de tempo de cerca de 10 minutos, uma temperatura de cerca de 220C, a ausência de luz e com
Ú AN 13 agitação; em que a concentração em excesso na terceira etapa é cerca de 50 excesso molar; em que as condições na terceira etapa compreendem um período de tempo de cerca de 15 minutos, uma temperatura de cerca de 22 ºC, a ausência de luz e com agitação; em que a concentração final do catalisador —nucleofílicona quarta etapa é cerca de 10 mM, e as condições na quarta etapa - compreendem um período de tempo de cerca de 15 minutos, uma temperatura de cerca de 22 ºC, a ausência de luz e com agitação; em que as condições de incubação da proteína terapêutica com o polímero solúvel ativado em água e o catalisador nucleofílico na quinta etapa compreendem um período de tempo de cerca de 2 horas; uma temperatura de cerca de 22ºC; a ausência de luz; e com agitação; e em que o agente de extinção na sexta etapa é L-cisteína; e em que a L-cisteína é adicionada para resultar em uma concentração final de | * cerca de 10 mM e as condições na sexta etapa compreendem um período de tempo de cerca de 60 minutos, uma temperatura de cerca de 22ºC, a ausência ' 15 deluzecom agitação. ' Em outra modalidade, um método acima mencionado é fornecido em que o polímero solúvel em água é PSA.
Em outra modalidade o : PSA é compreendido de cerca de 10 — 300 unidades de ácido siálico.
Em outra modalidade, o polímero solúvel em água é PEG.
Em outra modalidade, o polímero solúvel em água é HES.
Ainda em outra modalidade, o polímero solúvel em água é HAS.
Ainda em outra modalidade, um método acima mencionado é fornecido em que a proteína terapêutica é FIX.
Em outra modalidade, a - proteína terapêutica é FVIJa.
Em outra modalidade, a proteína terapêutica é FVIM.
Ainda em outra modalidade, um método acima mencionado é fornecido em que o agente oxidante é periodato de sódio (NaIO4). Em outra modalidade, um método acima mencionado é fornecido em que a fração de carboidrato oxidado da proteína terapêutica está localizado no peptídeo de ativação da proteína de coagulação do sangue.
Em uma modalidade, um método acima mencionado é fornecido em que PSA é preparado reagindo um ligante amino-oxi ativado com PSA oxidado; em que o ligante amino-oxi é selecionado do grupo que consistede: Ó a) um ligante 3-0xa-pentano-1,5-dioxiamina da fórmula: HAN, A A A NHAR b) um ligante 3,6,9-trioxa-undecano-1,1 I1-dioxiamina da fórmula: HAN, or O A ga O A a NHAz : . c) um ligante 3,6,9,12,15-penatoxa-heptadecano-1,17- —dioxiamina da fórmula: i HINOS DONA ADM SA NANDA NH, ' em que o PSA é oxidado por incubação com um agente . oxidante para formar um grupo aldeído terminal na extremidade não redutora do PSA. Em uma modalidade relacionada, o ligante amino-oxi é 3-oxa- pentano-1,5-dioxiamina. Ainda em outra modalidade, um método acima mencionado é fornecido em que o agente oxidante é NaIO4.
Em outra modalidade, um método acima mencionado é fornecido em que o catalisador nucleofílico é fornecido em uma concentração | entre cerca de | mM e cerca de 50 mM. Em uma modalidade, o catalisador - 20 nucleofílicoé m-toluidina. Ainda em outra modalidade, o m-toluidina está presente na reação de conjugação em uma concentração de cerca de 10 MM.
Ainda em outra modalidade, um método acima mencionado é fornecido ainda compreendendo a etapa para reduzir uma ligação oxima na proteína terapêutica conjugada incubando a proteína terapêutica conjugada em um tampão compreendendo um composto redutor selecionado do grupo que consiste de cianoborohidreto de sódio (NaACNBH3), ácido ascórbico (vitamina C) e NaBH3. Em uma modalidade, o composto redutor é cianoborohidreto de sódio (NaCNBH3).
Ainda em outra modalidade, um método acima mencionado é fornecido ainda cofpreendendo a etapa de purificar a proteína terapêutica conjugada. Em outra modalidade, a proteína terapêutica conjugada é purificada por um método selecionado do grupo que consiste de cromatografia, filtração e precipitação. Em outra modalidade, a cromatografia é selecionada do grupo que consiste de Cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), Cromatografia de troca iônica (IEC), Cromatografia por exclusão de tamanho (SEC), Cromatografia por afinidade, e Cromatografia de « fase reversa. Ainda em outra modalidade, um sal anti-caotrópico é usado em uma etapa de carregamento de cromatografia e em uma etapa de lavagem de ' 15 cromatografia. Ainda em outra modalidade, a cromatografia ocorre em uma o coluna. Em outra modalidade, a coluna compreende uma resina de | cromatografia selecionada do grupo que consiste de Fenil-Sepharose FF e DD o* Butil-Sepharose FF. Em outra modalidade, a resina está presente na coluna em uma altura de leito de entre cerca de 5 cm e cerca de 20 cm. Em uma modalidade, a altura de leito é cerca de 10 em. Em outra modalidade, um método acima mencionado é fornecido compreendendo uma ou mais etapas de lavagem em que a direção - de fluxo é ajustada para fluxo ascendente e em que a vazão é entre cerca de - 0,2 cm/min e cerca de 6,7 cm/min. Conforme usado aqui, o termo “fluxo — descendente” refere-se a uma direção de fluxo da partes superior da coluna cromatográfica para a parte inferior da coluna cromatográfica (direção de fluxo normal / modo padrão). Conforme usado aqui, o termo “fluxo ascendente” refere-se a uma direção de fluxo a partir da parte inferior para a parte superior da coluna (direção de fluxo reverso). Em uma modalidade, a
* = 16 * vazão é cerca de 2 cm/min.
Em outra modalidade, um método acima mencionado é fornecido compreendendo uma ou mais etapas de eluição em que a direção de fluxo é ajustada para fluxo descendente e em que a vazão é entre cerca de 0,1 cm/mine cerca de 6,7 cem/min.
Em uma modalidade relacionada, a vazão é cerca de 1 cm/min.
Ó Ainda em outra modalidade, um método acima mencionado é | fornecido compreendendo concentrar uma proteína terapêutica conjugada por ultra-/diafiltração (UF/DF). Em outra modalidade, a concentração final de — proteína terapêutica é entre cerca de 0,5 e cerca de 3 mg/ml.
Em outra modalidade, um método acima mencionado é fornecido em que a proteína terapêutica compreende entre cerca de 5 e cerca de 11 frações . de polímero solúveis em água.
Em outra modalidade, a proteína terapêutica compreende entre cerca de 1 e cerca de 3 polímero solúveis em água. “AS Ainda em outra modalidade, um método acima mencionado é : fornecido em que a proteína terapêutica conjugada é purificada usando cromatografia; em que um sal anti-caotrópico é usado para uma etapa de | 7 carregamento e para uma etapa de lavagem; o método compreendendo uma | ou mais etapas de lavagem em que a direção de fluxo é ajustada para fluxo | 20 —ascendenteeem que a vazão é entre cerca de 0,2 cm/min e cerca de 6,7 cm/min e | uma ou mais etapas de eluição em que a direção de fluxo é ajustada para fluxo ' descendente e em que a vazão é entre cerca de 0,2 cm/min e cerca de 6,7 cm/min; | ainda compreendendo concentrar uma proteina terapêutica conjugada por ultra- - /diafiltração (UF/DF). Em outra modalidade, a cromatografia é Cromatografia de interação hidrofóbica (HIC); em que a uma ou mais etapas de vazão de lavagem é ' cerca de 2 cm/min; e em que a uma ou mais etapas de vazão de eluição é cerca de | 1 em/min.
Em outra modalidade, uma proteína terapêutica modificada produzida por qualquer um dos métodos acima mencionados é fornecido. |
' Ainda em outra modalidade, um método para formar uma ligação oxima entre uma fração de carboidrato oxidada em uma proteína terapêutica e um polímero solúvel em água ativado contendo um grupo amino-oxi ativo é fornecido compreendendo as etapas de: a) oxidar uma — fração de carboidrato em uma proteína terapêutica incubando dita proteína com um agente oxidante selecionado do gíupo que consiste de periodato de sódio (NaIO4), tetracetato de chumbo (PLb(OAc)4) e perrutenato de potássio (KRuO4); e b) formar uma ligação oxima entre a fração de carboidrato oxidado da proteína terapêutica e o polímero solúvel ativado em água | 10 contendo um grupo amino-oxi ativo na presença de um catalisador nucleofílico em condições que permitem a formação de dita ligação de oxima; | em que dito polímero solúvel em água contendo um grupo amino-oxi ativo é - selecionado do grupo que consiste de polietilenoglicol (PEG), PEG ramificado, PoliPEGE& (Warwick Effect Polimers; Coventry, UK), ácido AS polisiálico (PSA), amido, hidroxialquil amido (HAS), hidroxiletil amido . (HES), carboidrato, polissacarídeos, pululano, quitosana, ácido hialurônico, sulfato de condroitina, sulfato de dermatano, amido, dextrano, carboximetil- ' dextrano, óxido de polialquileno (PAO), polialquileno glicol (PAG), polipropileno glicol (PPG), polioxazolina, poliacriloilmorfolina, polivinil álcool (PVA), policarboxilato, polivinilpirrolidonay polifosfazeno, polioxazolina, polietileno-co-ácido maleico anidrido, poliestireno-co-ácido maleico anidrido, poli(1-hidroximetiletileno hidroximetilformal) (PHF), 2- metacriloiloxi-2' -etiltrimetilamôniofosfato (MPC); em que o catalisador - nucleofílico é selecionado do grupo que consiste de ácido o-amino benzoico, . 25 ácido m-amino benzoico, ácido p-amino benzoico, ácido sulfanílico, o- aminobenzamida, o-toluidinay m-toluidina, p-toluidina, o-anisidina, m- anisidina, e p-anisidina.
Ainda em outra modalidade, um método para formar uma ligação oxima entre uma fração de carboidrato oxidada em uma proteína o terapêutica e um polímero solúvel em água ativado contendo um grupo amino-oxi ativo é fornecido compreendendo as etapas de: a) oxidar uma fração de carboidrato em uma proteína terapêutica incubando dita proteína com um agente oxidante selecionado do grupo que consiste de periodato de sódio (NaIO4), tetracetato de chumbo (Pb(OAc)4) e perrutenato de potássio (KRuO4); e b) formar uma ligação oxima entre a fração de carboidrato oxidado da proteína terapêutica e o polímero solúvel ativado em água contendo um grupo amino-oxi ativo na presença de um catalisador nucleofílico em condições que permitem a formação de dita ligação de oxima; emquea proteína terapêutica é selecionada do grupo que consiste de Fator TX (FIX), Fator VIII (EVIID), Fator Vila (FVIIa), Fator de Von Willebrand (VWF), Fator FV (EV), Fator X (FX), Fator XI (FXD), Fator XII (EXID), . trombina (FID), proteína C, proteina S, tPA, PAI-I, fator tecidual (TF), ADAMTS 13 protease, IL-1 alfa, IL-1 beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, ' 15 IL-11, fator estimulante de colônia-1 (CSF-1), M-CSF, SCF, GM-CSF, fator : estimulante de colônia de granulócito (G-CSF), EPO, interferon-alfa (IFN- | alfa), interferon consenso, IFN-beta, IFN-gama, IFN-ômega, IL-7, IL-8, IL-9, | ' IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, | 11-22, IL-23, IL-24, IL-31, 11-32 alfa, IL-33, trombopoietina (TPO), Ang-1, Ang2, Ang4, Ang-Y, polipeptídeo tipo angiopoietina 1 (ANGPTLI), | polipeptídeo tipo angiopoietina 2 (ANGPTL2), polipeptídeo tipo | angiopoietina 3 (ANGPTL3), polipeptídeo tipo angiopoietina 4 (ANGPTLA), | polipeptídeo tipo angiopoietina 5 (ANGPTLS), polipeptídeo tipo ! . angiopoietina 6 (ANGPTL6), polipeptídeo tipo angiopoietina 7 (ANGPTL7),
— vitronectina, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), angiogenina, ! activina A, activina B, activina C, proteína morfogênica óssea-l, proteina | morfogênica óssea-2, proteína morfogênica óssea-3, proteína morfogênica óssea-4, proteína morfogênica óÓssea-5, proteína morfogênica óssea-6, proteína morfogênica óssea-7, proteína morfogênica óssea-8, proteína í MM | 19 | ' morfogênica óssea-9, proteína morfogênica óssea-10, proteína morfogênica óssea-l11, proteína morfogênica óssea-l12, proteína morfogênica óssea-13, proteína morfogênica óssea-l14, proteína morfogênica óssea-15, receptor de proteína morfogênica óssea IA, receptor de proteína morfogênica óssea IB, receptor de proteína morfogênica óssea II, fator neurotrófico derivado de cérebro, cardiotrofina-1, fator neutrófico ciliar, receptor de fator neutrófico ciliar, cripto, eríptico, fator quimiotáxico de neutrófilo induzido por citocina 1, neutrófilo induzido por citocina, fator quimiotáxico 2a, fator quimiotáxico de neutrófilo induzido por citocina 28, à fator de crescimento de célula —endotelial, endotelina 1, fator de crescimento epidérmico, epigen, epiregulina, atrativo de neutrófilo derivado de epitélio, fator de crescimento de fibroblasto 4, fator de crescimento de fibroblasto 5, fator de crescimento de fibroblasto 6, - fator de crescimento de fibroblasto 7, fator de crescimento de fibroblasto 8, fator de crescimento de fibroblasto &8b, fator de crescimento de fibroblasto &c, ' 15 fator de crescimento de fibroblasto 9, fator de crescimento de fibroblasto 10, : fator de crescimento de fibroblasto 11, fator de crescimento de fibroblasto 12, fator de crescimento de fibroblasto 13, fator de crescimento de fibroblasto 16, ' fator de crescimento de fibroblasto 17, fator de crescimento de fibroblasto 19, fator de crescimento de fibroblasto 20, fator de crescimento de fibroblasto 21, fatorde crescimento de fibroblasto ácido, fator de crescimento de fibroblasto básico, receptor de fator neurotrófico derivado de linhagem de célula da glia al, receptor de fator neurotrófico derivado de linhagem de célula da glia a2, proteína relacionada a crescimento, proteína relacionada a crescimento a, - proteína relacionada a crescimento B, proteína relacionada a crescimento 7, — fator de crescimento epidérmico de ligação a heparina, fator de crescimento i de hepatócito, fator receptor de crescimento de hepatócito, fator de crescimento derivado de hepatoma, fator de crescimento tipo insulina 1, fator de crescimento tipo insulina receptor, fator de crescimento tipo insulina II, proteína de ligação a fator de crescimento tipo insulina, fator de crescimento i 20
' de queratinócito, fator inibitório de leucemia, receptor de fator inibitório de leucemia a, fator de crescimento de nervo, receptor de fator de crescimento de nervo, neuropoietina, neurotrofina-3, neurotrofina-4, oncostatina M (OSM),
fator de crescimento de placenta, fator de crescimento de placenta 2, fator de crescimento de célula endotelial derivado de plaqueta, fator de crescimento derivado de plaqueta, cadeia A de fator de crescimento derivado de plaqueta/
fator AA de crescimento derivado de plaqueta, fator AB de crescimento derivado de plaqueta, cadeia B de fator de crescimento derivado de plaqueta,
fator BB de crescimento derivado de plaqueta, receptor a de fator de
— crescimento derivado de plaqueta, receptor à de fator de crescimento derivado de plaqueta, fator estimulante de crescimento de pré-célula B, fator de célula-
| tronco (SCF), receptor de fator de célula-tronco, TNF, TNFO, TNF1, TNFE2,
. fator a de crescimento transformador, fator B de crescimento transformador,fator Bl de crescimento transformador, fator Bl,2 de
' 15 * crescimento transformador, fator B2 de crescimento transformador, fator 83
. de crescimento transformador, fator B5 de crescimento transformador, fator
B1 latente de crescimento transformador, proteína I de ligação fator B de
' crescimento transformador, proteína II de ligação a fator fº de crescimento transformador, proteína III de ligação a fator À de crescimento transformador,
—linfopoietina estromal tímica (TSLP), receptor de fator de necrose tumoral tipo 1, receptor de fator de necrose tumoral tipo II, receptor ativador de plasminogênio tipo uroquinase, proteína ativadora de fosfolipase (PUP),
insulina, lectina, ricina, prolactina, gonadotropina coriônica, hormônio
- estimulador de folículo, hormônio estimulador de tireoide, ativador de
—plasminogênio tecidual, IBGG, IgE, IgM, IgA, e IgD, a-galactosidase, pP-
galactosidase, DNAse, fetuina, hormônio luteinizante, estrogênio, insulina,
albumina, — lipoproteínas, fetoproteina, transferrina, trombopoietina,
uroquinase, integrina, trombina, leptina, Humira (adalimumab), Prolia
(denosumab), Enbrel (etanercept), a proteína da Tabela 1, ou um fragmento
' biologicamente ativo, derivado ou variante do mesmo; em que dito polímero solúvel em água contendo um grupo amino-oxi ativo is selecionada do grupo | que consiste de polietilenoglicol (PEG), PEG ramificado, PoliPEGÊ (Warwick Effect Polimers; Coventry, UK), ácido polisiálico (PSA), amido, —hidroxialquil amido (HAS), hidroxiletil amido (HES), carboidrato, polissacarídeos, pululano, quitosana, ácido hialurônico, sulfato de condroitina, Cá sulfato de dermatano, amido, dextrano, carboximetil-dextrano, óxido de polialquileno (PAO), polialquileno glicol (PAG), polipropileno glicol (PPG), | polioxXazolina, poliacriloilmorfolina, polivinil álcool (PVA), policarboxilato, —polivinilpirrolidona, polifosfazeno, polioxazolina,y polietileno-co-ácido maleico — anidrido, —poliestireno-co-ácido —“maleico anidrido, poli(l- hidroximetiletileno — hidroximetilformal)º (PHF), —2-metacriloiloxi-2*- . etiltrimetilamôniofosfato (MPC); em que o catalisador nucleofílico é selecionado do grupo que consiste de ácido o-amino benzoico, ácido m-amino | ' 15 —Dbenzoico, ácido p-amino benzoico, ácido sulfanílico, o-aminobenzamida, o- : toluidina, m-toluídina, p-toluidina, o-anisidina, m-anisidina, e p-anisidina.
Ainda em outra modalidade, um método para formar uma ' ligação hidrazona entre uma fração de carboidrato oxidada em uma proteína terapêutica e um polímero solúvel em água ativado contendo um grupo hidrazida ativo é fornecido compreendendo as etapas de: a) oxidar uma fração de carboidrato em uma proteína terapêutica incubando dita proteína com um agente oxidante selecionado do grupo que consiste de periodato de sódio (NalO4), tetracetato de chumbo (Pb(OAc)4) e perrutenato de potássio : (KRuO4); e b) formar uma ligação hidrazona entre a fração de carboidrato oxidado da proteína terapêutica e o polímero solúvel ativado em água contendo um grupo hidrazida ativo na presença de um catalisador nucleofílico em condições que permitem a formação de dita ligação hidrazona; em que dito polímero solúvel em água contendo um grupo hidrazida ativo is selecionada do grupo que consiste de polietilenoglicol (PEG), PEG
' 22 ' ramificado, PoliPEGE& (Warwick Effect Polimers; Coventry, UK), ácido polisiálico (PSA), amido, hidroxialquil amido (HAS), hidroxiletil amido (HES), carboidrato, polissacarídeos, pululano, quitosana, ácido hialurônico, sulfato de condroitina, sulfato de dermatano, amido, dextrano, carboximetil- | 5 —dextranoy óxido de polialquileino (PAO), polialquileno glicol (PAG), polipropileno glicol (PPG), polioxazolina, poliacriloilmorfolina, polivinil ! álcool (PVA), policarboxilato, polivinilpirrolidonay polifosfazeno, polioxazolina, polietileno-co-ácido maleico anidrido, poliestireno-co-ácido maleico anidrido, poli(1-hidroximetiletileno hidroximetilformal) (PHF), 2- 10 —metacriloiloxi-2'-etiltrimetilamôniofosfato (MPC); em que o catalisador nucleofílico é selecionado do grupo que consiste de ácido o-amino benzoico, ácido m-amino benzoico, ácido p-amino benzoico, ácido sulfanílico, o- . aminobenzamida, o-toluidina,y m-toluidina, p-toluidina, o-anisidina, m- anisidina, e p-anisidina.
Em outra modalidade, um método para formar uma ligação | : hidrazona entre uma fração de carboidrato oxidada em uma proteína terapêutica e um polímero solúvel em água ativado contendo um grupo ' hidrazida ativo compreendendo as etapas de: a) oxidar uma fração de carboidrato em uma proteína terapêutica incubando dita proteína com um agente oxidante selecionado do grupo que consiste de periodato de sódio (NalO4), tetracetato de chumbo (PLb(OAc)4) e perrutenato de potássio (KRuO4); e b) formar uma ligação hidrazona entre a fração de carboidrato oxidado da proteína terapêutica e o polímero solúvel ativado em água - contendo um grupo hidrazida ativo na presença de um catalisador nucleofílico em condições que permitem a formação de dita ligação hidrazona; em que a proteína terapêutica é selecionada do grupo que consiste de Fator IX (FIX), Fator VIII (FVIII), Fator VIla (EVIIa), Fator de Von Willebrand (VWF), Fator FV (EV), Fator X (FX), Fator XI (FX), Fator XII (FXID), trombina (FID), proteína C, proteína S, tPA, PAI-1, fator tecidual (TE) ADAMTS 13
Ns 23 | ' protease, IL-1 alfa, IL-1 beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, fator estimulante de colônia-1 (CSF-1), M-CSF, SCF, GM-CSF, fator estimulante | de colônia de granulócito (G-CSF), EPO, interferon-alfa (IFN-alfa), interferon consenso, IFN-beta, IFN-gama, IFN-ômega, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13,IL-14,1IL-15,IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, 11-20, IL-21, 11-22, 11-23, | 11-24, IL-31, I1-32 alfa, IL-33, trombopoietina (TPO), Ang-1, Ang-2, Ang, Ang-Y, polipeptídeo tipo angiopoietina 1 (ANGPTLI), polipeptídeo tipo angiopoietina 2 (ANGPTL?2), polipeptídeo tipo angiopoietina 3 (ANGPTL3), polipeptídeo tipo angiopoietina 4 (ANGPTIA4), polipeptídeo tipo —angiopoietina 5 (ANGPTLS), polipeptídeo tipo angiopoietina 6 (ANGPTL6), polipeptídeo tipo angiopoietina 7 (ANGPTL7), vitronectina, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), angiogenina, activina A, activina B, . activina C, proteína morfogênica óssea-l, proteína morfogênica óssea-2, | proteína morfogênica óssea-3, proteína morfogênica óssea-4, proteína | ' 15 —morfogênica óssea-5, proteína morfogênica óssea-6, proteína morfogênica o óssea-7, proteína morfogênica óssea-8, proteína morfogênica óssea-9, proteína morfogênica óssea-l10, proteína morfogênica óssea-l1, proteína ' morfogênica óssea-12, proteína morfogênica óssea-13, proteína morfogênica óssea-14, proteína morfogênica óssea-l15, receptor de proteína morfogênica óssealA, receptor de proteína morfogênica óssea IB, receptor de proteína morfogênica óssea II, fator neurotrófico derivado de cérebro, cardiotrofina-1, fator neutrófico ciliar, receptor de fator neutrófico ciliar, cripto, críptico, fator quimiotáxico de neutrófilo induzido por citocina 1, neutrófilo induzido por . citocina, fator quimiotáxico 2a, fator quimiotáxico de neutrófilo induzido por — citocina 23, fator de crescimento de célula endotelial B, endotelina 1, fator de i crescimento epidérmico, epigen, epiregulina, atrativo de neutrófilo derivado de epitélio, fator de crescimento de fibroblasto 4, fator de crescimento de fibroblasto 5, fator de crescimento de fibroblasto 6, fator de crescimento de fibroblasto 7, fator de crescimento de fibroblasto 8, fator de crescimento de
| 24 : fibroblasto 8b, fator de crescimento de fibroblasto 8c, fator de crescimento de fibroblasto 9, fator de crescimento de fibroblasto 10, fator de crescimento de fibroblasto 11, fator de crescimento de fibroblasto 12, fator de crescimento de fibroblasto 13, fator de crescimento de fibroblasto 16, fator de crescimento de fibroblasto 17, fator de crescimento de fibroblasto 19, fator de crescimento de fibroblasto 20, fator de crescimento de fibroblasto 21, fator de crescimento de fibroblasto ácido, fator de crescimento de fibroblasto básico, receptor de fator neurotrófico derivado de linhagem de célula da glia al, receptor de fator neurotrófico derivado de linhagem de célula da glia a2, proteína relacionada a crescimento, proteína relacionada a crescimento a, proteína relacionada a crescimento B, proteína relacionada a crescimento 7, fator de crescimento epidérmico de ligação a heparina, fator de crescimento de hepatócito, fator . receptor de crescimento de hepatócito, fator de crescimento derivado de | hepatoma, fator de crescimento tipo insulina 1, fator de crescimento tipo ' 15 insulina receptor, fator de crescimento tipo insulina II, proteína de ligação a : fator de crescimento tipo insulina, fator de crescimento de queratinócito, fator inibitório de leucemia, receptor de fator inibitório de leucemia a, fator de ' crescimento de nervo, receptor de fator de crescimento de nervo, neuropoietina, neurotrofina-3, neurotrofina-4, oncostatina M (OSM), fator de crescimento de placenta, fator de crescimento de placenta 2, fator de | crescimento de célula endotelial derivado de plaqueta, fator de crescimento i derivado de plaqueta, cadeia A de fator de crescimento derivado de plaqueta, fator AA de crescimento derivado de plaqueta, fator AB de crescimento - derivado de plaqueta, cadeia B de fator de crescimento derivado de plaqueta, fator BB de crescimento derivado de plaqueta, receptor a de fator de crescimento derivado de plaqueta, receptor B de fator de crescimento derivado ' de plaqueta, fator estimulante de crescimento de pré-célula B, fator de célula- tronco (SCF), receptor de fator de célula-tronco, TNF, TNFO0, TNF1, TNF2, fator a de crescimento transformador, fator RB de crescimento
' 25 '
] transformador,fator Bl de crescimento transformador, fator 91,2 de crescimento transformador, fator B2 de crescimento transformador, fator B3
| de crescimento transformador, fator B5 de crescimento transformador, fator B1 latente de crescimento transformador, proteína I de ligação fator B de crescimento transformador, proteína II de ligação a fator À de crescimento l transformador, proteína III de ligação a fator 8 de crescimento transformador, | linfopoietina estromal tímica (TSLP), receptor de fator de necrose tumoral tipo 1, receptor de fator de necrose tumoral tipo II, receptor ativador de plasminogênio tipo uroquinase, proteína ativadora de fosfolipase (PUP),
insulina, lectina, ricina, prolactina, gonadotropina coriônica, hormônio estimulador de folículo, hormônio estimulador de tireoide, ativador de plasminogênio tecidual, IgG, IgE, IgM, IgA, e IgD, a-galactosidase, B-
. galactosidase, DNAse, fetuina, hormônio luteinizante, estrogênio, insulina, albumina, — lipoproteínas, fetoproteínay transferrinay trombopoietina,
' 15 uroquinase, integrina, trombina, leptina, Humira (adalimumab), Prolia
. (denosumab), Enbrel (etanercept), a proteína da Tabela 1, ou um fragmento biologicamente ativo, derivado ou variante do mesmo; em que dito polímero
Ú solúvel em água contendo um grupo hidrazida ativo is selecionada do grupo que consiste de polietilenoglicol (PEG), PEG ramificado, PoliPEGÊ
(Warwick Effect Polimers; Coventry, UK), ácido polisiálico (PSA), amido, hidroxialquil amido (HAS), hidroxiletil amido (HES), carboidrato, polissacarídeos, pululano, quitosana, ácido hialurônico, sulfato de condroitina,
sulfato de dermatano, amido, dextrano, carboximetil-dextrano, óxido de
. polialquileno (PAO), polialquileno glicol (PAG), polipropileno glicol (PPG),
—polioxazolina, poliacriloilmorfolina, polivinil álcool (PVA), policarboxilato, polivinilpirrolidona, — polifosfazeno, polioxazolina,y polietileno-co-ácido maleico — anidrido, —poliestireno-co-ácido —maleico anidrido, poli(l- hidroximetiletileno — hidroximetilformal) (PHF), — 2-metacriloiloxi-2*- etiltrimetilamôniofosfato (MPC); em que o catalisador nucleofílico é
' selecionado do grupo que consiste de ácido o-amino benzoico, ácido m-amino benzoico, ácido p-amino benzoico, ácido sulfanílico, o-aminobenzamida, o- toluidina, m-toluidina, p-toluidina, o-anisidina, m-anisidina, e p-anisidina.
Em outra modalidade, um método acima mencionado é — fornecido em que o polímero solúvel em água contendo um grupo amino-oxi PÁ ativo é preparado por um método compreendendo: incubar uma solução compreendendo um polímero solúvel em água oxidado com um ligante amino-oxi ativado compreendendo um grupo amino-oxi ativo em condições que permitem a formação de uma ligação oxima estável entre o polímero solúvel em água oxidado e o ligante amino-oxi ativado, tais condições compreendendo um período de tempo entre cerca de 1 minute e cerca de 24 horas; uma temperatura entre cerca de 2ºC e cerca de 37ºC; na presença ou - ausência de luz, e com ou sem agitação; assim formando um polímero solúvel em água contendo um grupo amino-oxi ativado; e b) purificar o polímero “15 solóvel em água contendo um grupo amino-oxi ativo por um método . selecionado do grupo que consiste de cromatografia, filtração e precipitação.
O termo “polímero solúvel em água ativado” refere-se, em uma modalidade, a ' um polímero solúvel em água contendo um grupo aldeído.
Ainda em outra modalidade, um método acima mencionado é fornecido em que o polímero solúvel em água contendo um grupo amino-oxi ativo é preparado por um método compreendendo: a) incubar uma solução compreendendo um polímero solúvel em água oxidado com um ligante amino-oxi ativado compreendendo um grupo amino-oxi ativo em condições | - que permitem a formação de uma ligação oxima estável entre o polímero | solúvel em água oxidado e o ligante amino-oxi ativado, tais condições | compreendendo um período de tempo entre cerca de 1 minute e cerca de 24 | horas; uma temperatura entre cerca de 2ºC e cerca de 37ºC; na presença ou | ausência de luz, e com ou sem agitação; assim formando um polímero solúvel êm água contendo um grupo amino-oxi ativado; b) incubar uma solução
] compreendendo o polímero solúvel em água contendo um grupo amino-oxi ativo da etapa a) com um agente redutor em condições que permitem a formação de uma ligação alcoxamina estável entre o polímero solúvel em i água oxidado e o ligante amino-oxi ativado., tais condições compreendendo ! um período de tempo entre cerca de 1 minute e cerca de 24 horas; uma ! teffiporatura entre cerca de 2ºC e cerca de 37ºC; na presença ou ausência de luz; e com ou sem agitação; e c) purificar o polímero solúvel em água | contendo um grupo amino-oxi ativo por um método selecionado do grupo que | consiste de cromatografia, filtração e precipitação.
Ainda em outra modalidade, um método acima mencionado é fornecido em que o polímero solúvel em água contendo um grupo amino-oxi | ativo é preparado por um método compreendendo: a) incubar uma solução ; " compreendendo um polímero solúvel em água oxidado com um ligante amino-oxi ativado compreendendo um grupo amino-oxi ativo em condições que permitem a formação de uma ligação oxima estável entre o polímero : solúvel em água oxidado e o ligante amino-oxi atívado, tais condições compreendendo um período de tempo entre cerca de 1 minute e cerca de 24 ' horas; uma temperatura entre cerca de 2ºC e cerca de 37ºC; na presença ou ausência de luz, e com ou sem agitação; assim formando um polímero solúvel em água contendo um grupo amino-oxi ativado; b) incubar uma solução compreendendo o polímero solúvel em água contendo um grupo amino-oxi ! ativo da etapa a) com um catalisador nucleofilio em condições compreendendo um período de tempo entre 1 minuto e 24 horas; uma - temperatura entre 2ºC e 37ºC; na presença ou ausência de luz; e com ou sem agitação; e oc) purificar o polímero solúvel em água contendo um grupo amino-oxi ativo por um método selecionado do grupo que consiste de cromatografia, filtração e precipitação.
Ainda em outra modalidade, um método acima mencionado é fornecido em que o polímero solúvel em água contendo um grupo amino-oxi
] ativo é preparado por um método compreendendo: a) incubar uma solução compreendendo um polímero solúvel em água oxidado com um ligante ! amino-oxi ativado compreendendo um grupo amino-oxi ativo em condições que permitem a formação de uma ligação oxima estável entre o polímero solúvel em água oxidado e o ligante amino-oxi ativado, tais condições compreendendo um período de tempo entre cerca de 1 minuto e cerca de 24 horas; uma temperatura entre cerca de 2ºC e cerca de 37ºC; na presença ou | ausência de luz, e com ou sem agitação; assim formando um polímero solúvel em água contendo um grupo amino-oxi ativado; b) incubar uma solução — compreendendo o polímero solúvel em água contendo um grupo amino-oxi ativo da etapa a) com um catalisador nucleofílio em condições compreendendo um período de tempo entre 1 minuto and 24 horas; uma . temperatura entre 2ºC and 37ºC; na presença ou ausência de luz; e com ou sem agitação; c) incubar uma solução compreendendo o polímero solúvel em ' 15 água contendo um grupo amino-oxi ativo da etapa b) com um agente redutor o. em condições que permitem a formação de uma ligação alcoxamina estável entre o polímero solúvel em água oxidado e o ligante amino-oxi ativado, tais o? condições compreendendo um período de tempo entre cerca de 1 minuto e cerca de 24 horas; uma temperatura entre cerca de 2ºC e cerca de 37ºC; na presença ou ausência de luz; e com ou sem agitação; e d) purificar o polímero solúvel em água contendo um grupo amino-oxi ativo por um método selecionado do grupo que consiste de cromatografia, filtração e precipitação.
Em outra modalidade, um método acima mencionado é : fornecido em que o polímero solúvel oxidado em água é selecionada do grupo que consiste de polietilenoglicol (PEG), PEG ramificado, PoliPEGÊO (Warwick Effect Polimers; Coventry, UK), ácido polisiálico (PSA), amido, hidroxialquil amido (HAS), hidroxiletil amido (HES), carboidrato, polissacarídeos, pululano, quitosana, ácido hialurônico, sulfato de condroitina, : sulfato de dermatano, amido, dextrano, carboximetil-dextrano, óxido de
' polialquileno (PAO), polialquileno glicol (PAG), polipropileno glicol (PPG), polioxazolina, poliacriloilmorfolina, polivinil álcool (PVA), policarboxilato, polivinilpirrolidona, —polifosfazeno, polioxazolina, polietileno-co-ácido maleico — anidrido, —poliestireno-co-ácido “maleico anidrido, poli(l- —Rhidroximetiletileno hidroximetilformal) (PHF), —2-metacriloiloxi-2- etiltrimetilamôniofosfato ( (MPC), e em que dito polímero solúvel em água é oxidado por incubação com um agente oxidante para formar um grupo aldeído terminal na extremidade não redutora do polímero solúvel em água.
Em uma modalidade, o polímero solúvel em água é PSA.
Em outra modalidade, um método acima mencionado é | fornecido em que o agente oxidante é NaIO4. Ainda em outra modalidade, um método acima mencionado é - fornecido em que o ligante amino-oxi é selecionado do grupo que consiste de: um ligante 3-oxa-pentano-1,5-dioxiamina da fórmula: ANSA O A a NHa b) um ligante 3,6,9-trioxa-undecano-1,11-dioxiamina da fórmula: HAN O gr O Na : c) um ligante 3,6,9,12,15-penatoxa-heptadecano-1,17- dioxiamina da fórmula: pa ADAM APNANoM NANA NDA SN, | Ainda em outra modalidade, um método acima mencionado é * 20 fornecidoem que o agente redutor é selecionado do grupo que consiste de cianoborohidreto de sódio (NaCNBH3), ácido ascórbico (vitamina C) e NaBH3. Em uma modalidade, o agente redutor é cianoborohidreto de sódio (NaCNBH3). Em outra modalidade, um método acima mencionado é
' fornecido em que o catalisador nucleofílico é selecionado do grupo que consiste de ácido o-amino benzoico, ácido m-amino benzoico, ácido p-amino benzoico, ácido sulfanílico, o-aminobenzamida, o-toluidina, m-toluidina, p- toluidina, o-anisidina, m-anisidina, e p-anisidina. Em uma modalidade, o catalisador nucleofílico é m-toluidina. Em outra modalidade, o catalisador nucleofilico é adicionado em uma quantidade para resultar em uma concentração final entre cerca de 1,0 mM e cerca de 50 mM de catalisador | nucleofílico. Em outra modalidade, um método acima mencionado é —fomecido ainda compreendendo concentrar uma proteína terapêutica conjugada por ultra/diafiltração (UF/DF). | i FIGURAS . A Figura 1 mostra a estrutura primária de Fator de coagulação IX (SEQ ID NO: 1). 5 A Figura 2 mostra o acoplamento de rFIX oxidado a amino- . oxi-PSA. A Figura 3 mostra a síntese de ligantes di-aminoxi solúveis em ] água 3-oxa-pentano-1,5-dioxiamina e 3,6,9-trioxa-undecano-1,11-dioxiamina. A Figura 4 mostra a preparação de amino-oxi-PSA.
A Figura 5 mostra à visualização de conjugados PSA-FIX preparados na presença de diferentes catalisadores por SDS PAGE. a) Comparação de anilina com m-toluidina usando diferentes concentrações; b) Comparação de anilina com ácido o-aminobenzoico, ácido m-aminobenzoico, - ácido “p-aminobenzoico, p-aminobenzamida e ácido sulfanílico; c) — Comparação de anilina e m-toluidina com o-anisidina e m-anisidina. ' A Figura 6 mostra percentual de polisialilação com vários catalisadores nucleofílicos.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO As propriedades farmacológicas e imunológicas das proteínas
' terapêuticas podem ser melhoradas por modificação e conjugação química com compostos poliméricos como polietilenoglicol (PEG), PEG ramificado, | ácido polisiálico (PSA), hidroxialquil amido (HAS), hidroxiletil amido (HES), carboidrato, polissacarídeos, pululano, quitosana, ácido hialurônico, sulfato de condroitina, sulfato de dermatano, amido, dextrano, carboximetil- dextrano, óxido de polialquileno (PAO), pólialquileno glicol (PAG), polipropileno glicol (PPG), polioxazolina, poliacriloilmorfolina, polivinil l álcool (PVA), policarboxilato, polivinilpirrolidona, polifosfazeno, polioxazolina, polietileno-co-ácido maleico anidrido, poliestireno-co-ácido —maleico anidrido, poli(I-hidroximetiletileno hidroximetilformal) (PHF), 2- metacriloiloxi-2' -etiltrimetilamôniofosfato (MPC). As propriedades dos conjugados resultantes geralmente fortemente dependem da estrutura e o a tamanho do polímero.
Assim, polímeros com uma distribuição de estreita e definida são geralmente preferenciais na técnica.
Polímeros sintéticos como ' 15 PEG podem ser fabricados facilmente com uma distribuição de tamanho . estreita, enquanto PSA pode ser purificado de modo que os resultados em uma preparação de PSA final com uma distribuição estreita de tamanho.
Além : disso, reagentes de peguilação com cadeias de polímero definidos e distribuição estreita de tamanho estão no mercado e comercialmente —disponíveispor um preço razoável.
A adição de um polímero solúvel, como por polisialilação, é uma abordagem para melhorar as propriedades de proteínas terapêuticas como a proteína FIX da coagulação sanguínea, bem como outras proteínas de . coagulação (por exemplo, VWF, FVIla (ver, por exemplo, US —2008/0221032AI, incorporado aqui por referência) e FVIII). ' PROTEÍNAS TERAPÊUTICAS Em certas modalidades da invenção, os polipeptídeos acima mencionados e polinucleotídeos são exemplificados pelas seguintes proteínas terapêuticas: enzimas, antígenos, anticorpos, receptores, proteínas de
' coagulação sanguínea, fatores de crescimento, hormônios, e ligantes.
Em certas modalidades, a proteína terapêutica é uma proteína de coagulação sanguínea como Fator IX (FIX), Fator VITI (FVIII), Fator Vila (FVIIa), Fator de Von Willebrand (VWF), Fator FV (EV), Fator X (FX), Fator XI (FXI), S Fator XII (FXII), trombina (FIN), proteina C, proteína S, tPA, PAI-1, fator tecidual (TF) ou ADAMTS 13 protease.
Em uma modalidade, a proteína terapêutica de acordo com a invenção é uma glicoproteína ou, em várias modalidades, a proteína que não é naturalmente glicosilada in vivo (ou seja, a proteína que não contém um sítio de glicosilação natural ou uma a proteína
—quenãoé glicosilada em uma célula hospedeira antes da purificação). Em certas modalidades, a proteina terapêutica é imunoglobulinas, citocinas como IL-1 alfa, IL-1 beta, IL-2, IL-3, IL-A4, IL-5, . 1IL-6, IL-11, fator estimulante de colônia-1 (CSF-1), M-CSF, SCF, GM-CSF, fator estimulante de colônia de granulócito (G-CSF), EPO, interferon-alfa ] 15 (IFN-alfa), interferon consenso, IFN-beta, IFN-gama, IFN-ômega, IL -7, IL-8, . 11-9, 11-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, 11-20, IL- 21, IL-22, 11-23, 11-24, IL-31, 11-32 alfa, IL-33, trombopoietina (TPO), . angiopoietinas, por exemplo, Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y, polipeptídeos tipo angiopoietina humana ANGPTLI1 a 7, vitronectina, fator de crescimento —endotelial vascular (VEGF), angiogenina, activina A, activina B, activina C, proteina morfogênica óssea-l, proteína morfogênica óssea-2, proteína morfogênica óssea-3, proteína morfogênica óssea-4, proteína morfogênica óssea-5, proteína morfogênica óÓssea-6, proteina morfogênica óÓssea-7, - proteína morfogênica óssea-8, proteína morfogênica óssea-9, proteina —morfogênica óssea-10, proteína morfogênica óssea-l1, proteína morfogênica óssea-12, proteína morfogênica óssea-13, proteína morfogênica óssea-l4, proteína morfogênica óssea-15, receptor de proteína morfogênica óssea IA, receptor de proteína morfogênica óssea IB, receptor de proteína morfogênica óssea II, fator neurotrófico derivado de cérebro, cardiotrofina-l1, fator
: neutrófico ciliar, receptor de fator neutrófico ciliar, cripto, críptico, fator
! quimiotáxico de neutrófilo induzido por citocina 1, neutrófilo induzido por citocina, fator quimiotáxico 2a, fator quimiotáxico de neutrófilo induzido por citocina 263, fator de crescimento de célula endotelial B, endotelina 1, fator de crescimento epidérmico, epigen, epiregulina, atrativo de neutrófilo derivado | de epitélio, fator de crescimento de fibroblasto 4, fator de crescimerifo de fibroblasto 5, fator de crescimento de fibroblasto 6, fator de crescimento de fibroblasto 7, fator de crescimento de fibroblasto 8, fator de crescimento de fibroblasto 8b, fator de crescimento de fibroblasto 8c, fator de crescimento de fibroblasto 9, fator de crescimento de fibroblasto 10, fator de crescimento de fibroblasto 11, fator de crescimento de fibroblasto 12, fator de crescimento de fibroblasto 13, fator de crescimento de fibroblasto 16, fator de crescimento de
. fibroblasto 17, fator de crescimento de fibroblasto 19, fator de crescimento de
| fibroblasto 20, fator de crescimento de fibroblasto 21, fator de crescimento de S 15 fibroblasto ácido, fator de crescimento de fibroblasto básico, receptor de fator | | neurotrófico derivado de linhagem de célula da glia al, receptor de fator ! | neurotrófico derivado de linhagem de célula da glia 02, proteína relacionada a ; , crescimento, proteína relacionada a crescimento a, proteína relacionada a | crescimento B, proteína relacionada a crescimento y, fator de crescimento !
—epidérmico de ligação a heparina, fator de crescimento de hepatócito, fator receptor de crescimento de hepatócito, fator de crescimento derivado de hepatoma, fator de crescimento tipo insulina 1, fator de crescimento tipo insulina receptor, fator de crescimento tipo insulina II, proteína de ligação a
- fator de crescimento tipo insulina, fator de crescimento de queratinócito, fator
—inibitório de leucemia, receptor de fator inibitório de leucemia a, fator de crescimento de nervo, receptor de fator de crescimento de nervo,
neuropoietina, neurotrofina-3, neurotrofina-4, oncostatina M (OSM), fator de crescimento de placenta, fator de crescimento de placenta 2, fator de crescimento de célula endotelial derivado de plaqueta, fator de crescimento o 34 ] derivado de plaqueta, cadeia A de fator de crescimento derivado de plaqueta, | | fator AA de crescimento derivado de plaqueta, fator AB de crescimento derivado de plaqueta, cadeia B de fator de crescimento derivado de plaqueta, fator BB de crescimento derivado de plaqueta, receptor a de fator de — crescimento derivado de plaqueta, receptor B de fator de crescimento derivado de plaqueta, fator estimulante de crescimento de pré-célula B, fator de célula- PÓ tronco (SCF), receptor de fator de célula-tronco, TNF, incluindo TNFO, TNF1, TNF2, fator a de crescimento transformador, fator À de crescimento transformador,fator B1Il de crescimento transformador, fator Bl,2 de crescimento transformador, fator B2 de crescimento transformador, fator B3 de crescimento transformador, fator B5 de crescimento transformador, fator B1 latente de crescimento transformador, proteína I de ligação fator Bº de . crescimento transformador, proteína II de ligação a fator B de crescimento transformador, proteína III de ligação a fator f; de crescimento transformador, “15 linfopoietina estromal tímica (TSLP), receptor de fator de necrose tumoral . tipo 1, receptor de fator de necrose tumoral tipo II, receptor ativador de plasminogênio tipo uroquinase, fator de crescimento endotelial vascular, e oo proteínas quiméricas e fragmentos biologicamente ou imunologicamente ativos dos mesmos.
Em certas modalidades, a proteína terapêutica é alfa-, beta-, e gama-interferons, fator estimulante de colônias incluindo fator estimulante de Ú colônias de granulócitos, fatores de crescimento de fibroblasto, fator de crescimento derivado de plaquetas, proteína ativadora de fosfolipase (PUP), - insulina, proteínas de planta como lectinas e ricinas, fatores de necrose tumoral e alelos relacionados, formas solúveis de receptores de fator de ' necrose tumoral, receptores de interleucina e formas solúveis de receptores de interleucina, fatores de crescimento como fatores de crescimento tecidual, como TGFas ou TGFBfs e fatores de crescimento epidérmicos, hormônios, somatomedinas, hormônios pigmentares, fatores de liberação hipotalâmicos,
3s ' hormônios antidiuréticos, prolactina, gonadotropina coriônica, hormônio estimulador de folículo, hormônio estimulador de tireoide, ativador de plasminogênio tecidual, e imunoglobulinas como IgG, IgE, IgM, IgA, e IgD, a galactosidase, a-galactosidase, B-galactosidase, DNAse, fetuina, hormônio —luteinizante, estrogênio, corticosteroides, insulina, albumina, lipoproteínas, fetoproteina, transferrina, trombopoietina, uroquinase, DNase, integrinas, | trombina, fatores de crescimento hematopoietico, leptina, glicosidases, Humira (adalimumab), Prolia (denosumab), Enbrel (etanercept), e fragmentos dos mesmos, ou qualquer proteína de fusão compreendendo qualquer uma das | proteínas acima mencionadas ou fragmentos dos mesmos.
Além das proteínas | acima mencionadas, a seguinte tabela 1 fornece proteínas terapêuticas contempladas pela presente invenção: |
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| ' 54 o As proteínas terapêuticas fornecidas aqui não devem ser consideradas como exclusivas. Em vez disso, como é aparente a partir da revelação fornecida aqui, os métodos da invenção são aplicáveis a qualquer proteína em que a ligação do polímero solúvel em água é desejado de acordo coma invenção. Por exemplo, proteínas terapêuticas são descritas em US 2007/0026485, incorporado aqui por referência em sua totalidade. | Proteínas de coagulação sanguínea Em um aspecto, o material de partida da presente invenção é uma proteína da coagulação sanguínea, que pode ser derivada de plasma humano, ou produzida por técnicas de engenharia recombinantes, como descrito na Patente US 4.757.006; Patente US 5.733.873; Patente US
5.198.349; Patente US 5.250.421; Patente US 5.919.766; e EP 306 968. o Polipeptídeos terapêuticos como proteínas de coagulação Vê sanguínea incluindo Fator IX (FIX), Fator VIII (FVIID), Fator VIla (FVIIa), Fator de Von Willebrand (VWF), Fator FV (FV), Fator X (FX), Fator XI (FXD, Fator XII (FXID), trombina (FII), proteína C, proteina S, tPA, PAI-1, ] fator tecidual (TF) e ADAMTS 13 protease são rapidamente degradados por enzimas proteolíticas e neutralizadas por anticorpos. Isto reduz sua meia-vida e tempo de circulação, assim limitando sua efetividade terapêutica. Doses relativamente altas e administração frequente são necessárias para atingir e manter o efeito terapêutico ou profilático desejado destas proteínas de coagulação. Como uma consequência, regulação de dose adequada é difícil de obter e a necessidade de administrações intravenosas frequentes impõe restrições no modo de vida do paciente. - 25 Como descrito aqui, proteínas de coagulação sanguínea incluindo, entre outras, Fator IX (FIX), Fator VIII (FVIID), Fator Vila (FVIa), Fator de Von Willebrand (VWF), Fator FV (FV), Fator X (EX), Fator XI, Fator XII (FXII), trombina (FIJI), proteína C, proteína S, tPA, PAI-1, fator tecidual (TF) e ADAMTS 13 protease são contemplados pela invenção.
" 55 ' Conforme usado aqui, o termo “proteína de coagulação sanguínea” refere-se a qualquer Fator IX (FIX), Fator VIII (FVIII), Fator VIla (FVIIa), Fator de Von Willebrand (VWF), Fator FV (FEV), Fator X (FX), Fator XII (FXII), trombina (FID), proteína C, proteína S, tPA, PAI-1, fator tecidual (TF) e ADAMTS 13 — proteaseque apresenta atividade biológica que é associada com a proteína de coagulação sáúguínea nativa.
A cascata de coagulação sanguínea é dividida em três segmentos distintos: as vias intrínseca, extrínseca e comum (Schenone et al., Curr Opin Hematol. 2004;11:272-7). A cascata envolve uma série de enzimas —serina protease (zimogênios) e cofatores de proteína.
Quando requerido, um precursor zimogênio inativo é convertido na forma ativay que consequentemente converte a enzima seguinte na cascata.
Í A via intrínseca requer os fatores de coagulação VIII, IX, X, VU XI, e XII.
O início da via intrínseca ocorre quando pré-calicreína, —quininogênio de alto peso molecular, fator XI (FXTI) e fator XII (FXII) estão expostos a uma superfície negativamente carregada.
Também são requeridos íons de cálcio e fosfolipídeos secretados de plaquetas.
A via extrínseca é iniciada quando o lúmen vascular de vasos sanguíneos é danificado.
O fator tecidual de glicoproteína de membrana é exposto e então se liga ao fator VII circulante (FVII) e às quantidades pré- existentes pequenas de sua forma FVIIa ativada.
Esta ligação facilita a conversão total de FVII a FVIJa e subsequentemente, na presença de cálcio e fosfolipídeos, à conversão do fator IX (FIX) ao fator IXa (FIXa) e fator X (FX) ao fator Xa (FXa). À associação de FVIIa com fator tecidual melhora a — atividade proteolítica ao trazer os sítios de ligação de FVII para o substrato (FIX e FX) em maior proximidade e induzindo uma mudança conformacional, que aumenta a atividade enzimática de FVIJa.
A ativação de FX é o ponto comum das duas vias.
Junto com fosfolipídeo e cálcio, fatores Va (FVa) e Xa convertem protrombina a ,
' 56 ] trombina (complexo protrombinase), que então cliva fibrionogênio para formar monômeros de fibrina.
Os monômeros polimerizam para formar as fitas de fibrina.
Fator XIIIa (FXIIla) covalentemente liga estas fitas a outra para formar uma malha rígida.
A conversão de FVII a FVIla é ainda catalisada por um número de proteases, inefúindo trombina, FIXa, FXa, fator XIa (FXIa), e fator XIla (FXIla). Para inibição de fase precoce da cascata, inibidor de via de fator tecidual direciona para FVIIa/fator tecidual/Complexo de produto FXa.
Fator Vila FVIL (também conhecido como fator estável ou pró- convertina) é uma glicoproteína serina protease dependente de vitamina K. com um papel principal em hemostasia e coagulação (Eigenbrot, Curr ' Proteína Pept Sci. 2002;3:287-99). . FVI é sintetizado no fígado e secretado como uma glicoproteína de cadeia simples de 48 kKD.
FVII compartilha com todas as glicoproteínas serina protease dependentes de vitamina K uma estrutura de domínio de proteína semelhante que consiste de domínio de um ácido gama- carboxiglutâmico amino-terminal (Gla) com 9-12 resíduos responsáveis para a interação da proteína com membranas de lipídeo, um domínio de serina —protease carboxi-terminal (domínio catalítico), e dois domínios tipo fator de crescimento epidérmico contendo um sítio de ligação ao íon de cálcio que medeia interação com fator tecidual.
Gama-glutamil carboxilase catalisa carboxilação de resíduos Gla na porção amino-terminal da molécula.
À carboxilase é dependente de uma forma reduzida de vitamina K para sua ação, —queé oxidado à forma epóxido.
Vitamina K epóxido redutase é requerida para converter a forma epóxido de vitamina K de volta a forma reduzida.
A principal proporção de FVII circula no plasma na forma de zimogênio, e ativação desta forma resulta em clivagem de estrutura de peptídeo entre arginina 152 e isoleucina 153. A FVIIa ativada resultante
' 57 , consiste de uma cadeia leve derivada de NH2 (20 kD) e uma cadeia pesada derivada de COOH (30 kD) ligado através de ligação dissulfeto simples (Cys 135 a Cys 262). A cadeia leve contém o domínio Gla de ligação a membrana, enquanto a cadeia pesada contém o domínio catalítico.
A concentração plasmática de FVII determinada por fatores genéticos e ambientais é cerca dé 05 mg/mL (Pinotti et al., Blood. 2000;95:3423-8). Diferentes genótipos FVII podem resultar em várias vezes nas diferenças em níveis médios de FVII. Níveis plasmáticos de FVII são elevados durante a gravidez em mulheres saudáveis e ainda aumenta com —idadeesão maiores em mulheres e em pessoas com hipertrigliceridemia. FVII tem uma meia-vida mais curta de todos os fatores pró-coagulantes (3-6 h). À concentração plasmática média de FVIla é 3,6 ng/ml em indivíduos Ns saudáveis e a meia-vida circulante de FVIla é relativamente longa (2,5 h) - comparado com outros fatores de coagulação. Deficiência hereditária de FVII é um distúrbio de sangramento recessivo autossomal raro com uma prevalência estimada de 1 caso por
500.000 pessoas na população em geral (Acharya et al., J] Thromb Haemost. 2004; 2248-56). Deficiência de FVII adquirida de inibidores também é muito rara. Casos também foram relatados com a deficiência ocorrendo em associação com drogas como cefalosporinas, penicilinas, e anticoagulantes orais. Além disso, a deficiência adquirida de FVII foi relatada por ocorrer espontaneamente ou com outras condições, como mieloma, sepsis, anemia aplástica, com interleucina-2 e terapia de globulina antitimócito. Sequências de polinucleotídeo e polipeptídeo de referência incluem, por exemplo, GenBank N.ºs de acessão J02933 para a sequência genômica, M13232 para o cDNA (Hagen et al. PNAS 1986, 83: 2412-6), e PO08709 para a sequência de polipeptídeo (referências aqui incorporadas em sua totalidade). Uma variedade de polimorfismos de FVII foi descrita, por ] exemplo, ver Sabater-Lleal et al. (Hum Genet. 2006; 118:741-51) (aqui
' 58 7 incorporado como referência na sua totalidade). Fator IX FIX é uma proteína do plasma dependente de vitamina K que participa na via intrínseca da coagulação sanguínea convertendo FX a sua forma ativa na presença de íons de cálcio, fosfolipídeos e FVIIla.
À capacidade predominante catalítica de FIX é ceofão x uma protease serina, com especificidade para uma determinada ligação arginina-isoleucina dentro de FX.
Ativação de FIX ocorre por FXIa que faz com que a excisão do peptídeo de ativação de FIX produza uma molécula FIX ativada compreendendo duas — cadeias mantidas por uma ou mais ligações dissulfeto.
Defeitos em FIX são a causa de recessiva hemofilia B ligada ao X.
A hemofilia A e B são doenças herdadas caracterizadas por : deficiências em polipeptídeos FVIII e FIX, respectivamente.
À causa - subjacente das deficiências é frequentemente o resultado de mutações em —genesde FVIII e FIX, sendo que ambos estão localizados no cromossomo X.
À terapia tradicional para hemofilias muitas vezes envolve a administração intravenosa de um pool de plasma ou proteínas semi-purificados de coagulação a partir de indivíduos normais.
Estas preparações podem ser contaminadas por agentes patogênicos ou vírus, como príons infecciosos, HIV, parvovírus, hepatite A, e hepatite C.
Deste modo, existe uma necessidade urgente de agentes terapêuticos que não requerem o uso de soro humano.
O nível da redução na atividade de FIX é diretamente proporcional à gravidade da hemofilia B.
O tratamento atual da hemofilia B consiste na substituição da proteína ausente por FIX derivado de plasma ou — recombinante (o chamado terapia ou tratamento de substituição ou reposição de FD). Sequências de polinucleotídeo e polipeptídeo de FIX podem ser encontradas, por exemplo, em UniProtKB/Swiss-Prot N.º de acessão P00740, Patente US 6.531.298 e na Figura 1 (SEQ ID NO: 1).
' 59 : Fator VII Fator de coagulação VIII (FVIII) circula no plasma com uma concentração muito baixa e está ligado de forma não covalente a Fator de von Willebrand (VWF). Durante a hemostasia, o FVIII é separado do VWF e atua como um cofator para ativação de FX mediada por Fator IX ativado (FIXa) através do aumento da taxa de ativação na presença de cáléio e fosfolipídeos ou membranas celulares. FVII é sintetizado como um precursor de cadeia simples de aproximadamente 270-330 kD, com a estrutura do domínio A1-A2-B-A3-C1-C2.
— Quando purificada a partir de plasma (por exemplo, “derivada de plasma” ou “plasmática”), FVIII é composto de uma cadeia pesada (A1-A2-B) e uma cadeia leve (A3-C1-C2). A massa molecular da cadeia leve é 80 kD enquanto que, Ú devido à proteólise dentre do domínio B, a cadeia pesada está na faixa de 90-220 : kD.
FVIII também é sintetizado como uma proteína recombinante para utilização terapêutica em doenças hemorrágicas. Vários ensaios in vitro foram concebidos para determinar a eficácia potencial de FVIII recombinante (TFVIII) como um medicamento terapêutico. Estes ensaios imitam os efeitos in vivo de FVIII endógeno. Tratamento de trombina in vitro de FVIII resulta em um aumento rápido e subsequente diminuição na sua atividade pró- coagulante, tal como medido por testes in vitro. Esta ativação e desativação coincide com proteólise limitada específica ambos nas cadeias pesada e leve, que pode altera a disponibilidade de diferentes epítopos de ligação em FVIII, por exemplo permitindo que FVIII se dissocie de VWF e se ligue a uma superfície de fosfolipídeo ou alterando à capacidade de ligação a certos anticorpos monoclonais.
A ausência ou disfunção de FVIII é associada com a doença hemorrágica mais comum, a hemofilia A. O tratamento de escolha para a gestão da hemofilia A é a terapia de substituição com derivados de plasma ou
60 | | 7 concentrados de rFVIII.
Os pacientes com hemofilia A grave com níveis de | FVIII abaixo de 1%, são geralmente em terapia profilática com o objetivo de manter o FVIII acima de 1%, entre doses.
Tomando em consideração as meias-vidas médias dos vários produtos de F VIII na circulação, este resultado — pode ser conseguido administrando F VIII duas a três vezes por semana, Sequências de polinucleotídeo e polipeptídeo de refifância incluem, por exemplo, UniProtKB/Swiss-Prot PO0451 (FA8 HUMAN); Gitschier J et al., Characterization of the human Factor VIII gene, Nature, 312(5992): 326-30 (1984); Vehar GH et al., Structure of human Fator VIII, Nature, 312(5992):337-42 (1984); Thompson AR.
Structure and Function of the Factor VIII gene and proteína, Semin Thromb Hemost, 2003:29;11-29 (2002). Ú Fator de Von Willebrand . Fator de von Willebrand (VWF) é uma glicoproteína circulante no plasma como uma série de multímeros que variam em tamanho de cerca de 500 a 20.000 kD.
Formas multiméricas de VWF são compostas de | 250 kD subunidades de polipeptídeo ligadas por pontes dissulfeto.
VWF medeia a adesão inicial de plaquetas ao sub-endotélio da parede do vaso ; danificado.
Apenas os multímeros maiores apresentam uma atividade | hemostática É assumido que as células endoteliais secretam formas poliméricas grandes de VWF e aquelas formas de VWF que têm um peso molecular baixo (VWF de baixo peso molecular) surgida de clivagem proteolítica.
Os multímeros contendo grandes massas moleculares são | armazenados nos corpos de Weibel-Pallade de células endoteliais e liberados apósestimulação. ] VWF é sintetizado pelas células endoteliais e megacariócitos como prepro-V WF, que consiste em grande parte de domínios repetidos.
Com a clivagem do peptídeo sinal, pró-VWF dimeriza através de ligações ! dissulfeto em sua região C-terminal.
Os dímeros servem como protômeros É |
Í 61 : para multimerização, que é regulado por ligações dissulfeto entre as extremidades terminais livres.
A montagem de multímeros é seguida pela remoção proteolítica da sequência propeptídeo (Leyte et al., Biochem.
J. 274 (1991), 257-261). O produto de tradução primária prevista a partir do cDNA clonado do VWF é um polipeptídeo precursor de 2.813 resíduos (prepro- o VWF). A prepro-VWF consiste de um peptídeo sinal de 22 aminoácidos e um propeptídeo de 741 aminoácidos, com FVW maduro compreendendo 2050 aminoácidos (Ruggeri Z.A., e Ware, J., FASEB J., 308-316 (1993). Defeitos em VWF são causa de doença de von Willebrand | (VWD), que é caracterizada por um fenótipo de sangramento mais ou menos pronunciado.
VWD tipo 3 é a forma mais grave, em que VWF é Ú completamente ausente, e VWD tipo 1 refere-se a uma perda quantitativa de - VWF e seu fenótipo pode ser muito leve.
VWD tipo 2 relaciona-se com defeitos qualitativos de VWF e pode ser tão grave quanto VWD tipo 3. VWD tipo 2 tem muitas subformas, algumas sendo associadas com a perda ou a diminuição de multímeros de alto peso molecular.
Doença de von Willebrand do tipo 2a (VWD-2A) é caracterizada por uma perda de ambos os multímeros intermediários e grandes.
VWD-2B é caracterizada por uma perda de —multímeros de mais alto peso molecular.
Outras doenças e distúrbios relacionados com VWF são conhecidos na técnica.
As sequências de polinucleotídeos e aminoácidos de prepro- VWF estão disponíveis em GenBank N.ºs de acessão NM 000552 e NP 000543, respectivamente.
Outras proteínas de coagulação sanguínea de acordo com a presente invenção são descritas na técnica, por exemplo, Mann KG, Thromb Haemost, 1999;82:165-74. Polipeptídeos Em um aspecto, o material de partida da presênte invenção é
' 62 " uma proteína ou polipeptídeo. Como descrito aqui, o termo proteína terapêutica refere-se a qualquer molécula de proteína terapêutica que apresenta atividade biológica que é associada com a proteína terapêutica. Em uma modalidade da invenção, a molécula de proteína terapêutica é uma —proteínade comprimento completo.
Moléculas de proteína terapêutica contempladas incluem as proteínas de comprimento total, precursores de proteínas de comprimento completo, subunidades biologicamente ativas ou fragmentos de proteínas de | comprimento completo, bem como os derivados biologicamente ativos e variantes de qualquer uma destas formas de proteínas terapêuticas. Assim, proteínas terapêuticas incluem aquelas que (1) têm uma sequência de aminoácido que tem mais do que cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, S cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, - cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99% ou maior de identidade de sequência de aminoácido, sobre uma região de pelo menos cerca de 25, cerca de 50, cerca de 100, cerca de 200, cerca de 300, cerca de 400, ou mais aminoácidos, a um polipeptídeo codificado por um ácido nucleico referenciado ou uma sequência de aminoácido descrita aqui; e/ou (2) especificamente se liga a anticorpos, por exemplo, anticorpos policlonais ou monoclonais, geradas contra um imunogênio compreendendo uma sequência de aminoácido referenciada como descrita aqui, um fragmento imunogênico do mesmo, e/ou uma variante conservativamente modificada do mesmo.
De acordo com a presente invenção, o termo "proteína — terapêutica recombinante" inclui qualquer proteína terapêutica obtida através de tecnologia de DNA recombinante. Em certas modalidades, o termo inclui proteínas como descrito aqui.
Conforme usado aqui, "proteína terapêutica endógena" inclui uma proteína terapêutica que se origina a partir de um mamífero destinado a
: 63 7 receber o tratamento. O termo também inclui proteína terapêutica transcrita a partir de um transgene ou qualquer outro DNA estrangeiro presente em dito mamífero. Conforme usado aqui, "proteína terapêutica exógena" inclui uma proteína de coagulação sanguínea que não se origina de mamífero pretendido para receber o tratamento.
Conforme usado aqui, "proteína de coagulação de sangue derivada de plasma" ou "plasmática" inclui todas as formas de proteína encontradas no sangue obtidas de um mamífero contendo a propriedade participante na via de coagulação.
Conforme usado aqui "derivado biologicamente ativo" ou "variante biologicamente ativa" inclui qualquer derivado ou variante de uma molécula contendo substancialmenet as mesmas propriedades funcionais e/ou ' biológicas de dita molécula, como propriedades de ligação, e/ou a mesma . base estrutural, como uma estrutura peptídica ou uma unidade polimérica básica Um "análogo," como uma "variante" ou um "derivado", é um composto substancialmente semelhante em estrutura e contendo a mesma atividade biológica, embora em certos casos, em um grau diferente, a uma molécula de ocorrência natural. Por exemplo, um variante de polipeptídeo referese a uma estrutura substancialmente semelhante que compartilha polipeptídeo e contendo a mesma atividade biológica como um polipeptídeo de referência. Variantes ou análogos diferem na composição de suas sequências de aminoácido comparado a polipeptídeo de ocorrência natural a partir do qual o análogo é derivado, baseado em uma ou mais mutações que envolvem (i) deleção de um ou mais resíduos de aminoácidos em um ou mais terminais do polipeptídeo e/ou uma ou mais regiões internas da sequência de polipeptídeo de ocorrência natural (por exemplo, fragmentos), (ii) inserção ou adição de um ou mais aminoácidos em um ou mais terminais (tipicamente uma “adição” ou “fusão”) do polipeptídeo e/ou uma ou mais regiões internas
" (tipicamente uma “inserção”) da sequência de polipeptídeo de ocorrência natural ou (iii) substituição de um ou mais aminoácidos para outros aminoácidos na sequência de polipeptídeo de ocorrência natural. À título de exemplo, um "derivado" é um tipo de análogo e refere-se a um polipeptídeo que compartilha a mesma estrutura, ou substancialmente semelhante a um polipeptídeo de referência que tenha sido modificado, por exemplo, quimicamente. Um polipeptídeo variante é um tipo de polipeptídeo análogo e inclui variantes de inserção, em que um ou mais resíduos de aminoácidos são adicionados a uma proteína terapêutica da sequência de aminoácidos da invenção. As inserções podem estar localizadas em um ou em ambos os terminais da proteína, e/ou podem ser posicionadas nas regiões internas da FS sequência de aminoácidos de proteína terapêutica. Variantes de inserção, com | “ resíduos adicionais em qualquer um ou em ambos os terminais, incluem por exemplo, proteínas de fusão e proteínas incluindo tags de aminoácidos ou outros marcadores de aminoácidos. Em um aspecto, a molécula de proteína de coagulação do sangue, opcionalmente, contém um Met N-terminal, especialmente quando a molécula é expressa de forma recombinante em uma célula bacteriana como E. coli.
Em variantes de deleção, um ou mais resíduos de aminoácidos em um polipeptídeo de proteína terapêutica como aqui descrito são removidos. As deleções podem ser efetuadas em um ou em ambos os terminais de polipeptídeo da proteína terapêutica, e/ou com a remoção de um ou mais resíduos dentro de uma sequência de aminoácido de proteína terapêutica. Variantes de deleção, portanto, podem incluir fragmentos de uma sequência de polipeptídeo de proteína terapêutica.
Em variantes de substituição, um ou mais resíduos de aminoácidos de um polipeptídeo de proteína terapêutica são removidos e substituídos com resíduos alternativos. Em um aspecto, as substituições são
' 65 " conservadoras na natureza e substituições conservadoras deste tipo são bem conhecidas na técnica. Alternativamente, a presente invenção engloba também as substituições que são não-conservadoras. Exemplos de substituições conservadoras são descritas em Lehninger, [Biochemistry, 2º edição, Worth Publishers, Inc., Nova Iorque (1975), pp,71-77] e são descritos imediatamente a seguir.
SUBSTITUIÇÕES CONSERVADORAS
CARACTERÍSTICAS DA AMINOÁCIDO
CADEIA LATERAL Não polar (hidrofóbico): A. Alifático ALIVP | B. Aromático FW C. Contendo enxofre M D. Borderline G Polar não carregado: A. Hidroxil STY ' B. Amidas NQ | C. Sulfidril Cc - D. Linha limite G Positivamente carregado (básico) KRH Negativamente carregado (acídico) “DE Alternativamente, substituições conservadoras exemplares são definidas imediatamente abaixo.
SUBSTITUIÇÕES CONSERVADORAS II
RESÍDUO ORIGINAL SUBSTITUIÇÃO
EXEMPLAR Ala (A) Val, Leu, Hle Arg (R) Lys, Gln, Asn Asn (N) Gln, His, Lys, Arg Asp (D) Glu Cys (C) Ser Gln (Q) Asn Glu (E) Asp His (H) Asn, Gln, Lys, Arg Ile (D) Leu, Val, Met, Ala, Phe, Leu (L) He, Val, Met, Ala, Phe Lys (K) Arg, Gln, Asn Met (M) Leu, Phe, Ile Phe (F) Leu, Val, Ile, Ala Pro (P) Gly Ser (S) Thr Thr (T) Ser Trp (W) Tyr - Tyr (Y) Trp, Phe, Thr, Ser
' 66 . Val (V) Tle, Leu, Met, Phe, Ala B. Polinucleotídeos Ácidos nucleicos que codificam a proteína terapêutica da invenção incluem, por exemplo, entre outros, genes, pré-mRNAs, mRNAs, cDNAs, variantes polimórficas, alelos, mutantes sintéticos e de ocorrência natural.
Polinucleotídeos que codificam a proteína terapêutica da invenção ainda incluem, entre outros, aqueles que (1) especificamente hibridizam em condições de hibridização restritas a um ácido nucleico que | codifica uma sequência de aminoácido referenciada como descrito aqui, e variantes conservadoramente modificadas dos mesmos; (2) têm uma sequência de ácido nucleico que tem mais do que cerca de 95%, cerca de - 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou superior identidade de | sequência de nucleotídeo, sobre uma região de pelo menos cerca de 25, cerca NE de 50, cerca de 100, cerca de 150, cerca de 200, cerca de 250, cerca de 500, cerca de 1000, ou mais nucleotídeos (até a sequência de comprimento completo de 1218 nucleotídeos da proteína madura), a uma sequência de ácido nucleico de referência como descrito aqui. Condições exmplares “rígidas de hibridização” incluem hibridização a 420C em 50% formamida, 5X SSC, 20 mM Na-PO4, pH 6,8; e lavando em 1X SSC a 550C por 30 minutos. É entendido que a variação das condições exemplares pode ser | preparada baseada no comprimento e teor de nucleotídeo GC das sequências a serem hibridizadas. Fórmulas padrões na técnica são apropriadas para determinar condições apropriadas de hibridização. Ver Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Second ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 88 9.47-9.51.
Uma sequência de polipeptídeo ou polinucleotideo de "ocorrência natural" é tipicamente derivada de um mamífero incluindo, entre outros, primata, por exemplo, humano; roedor, por exemplo, rato, camundongo, hamster; vaca, porco, cavalo, ovelha, ou qualquer mamífero. Os
' 67 ' ácidos nucleicos e proteínas da invenção podem ser moléculas recombinantes (por exemplo, heterólogos e que codificam a sequência de tipo selvagem ou uma variante do mesmo ou de ocorrência natural). C.
Produção de proteínas terapêuticas A produção de uma proteína terapêutica inclui qualquer ÓÕ método conhecido na técnica para (1) a produção de DNA recombinante por engenharia genética, (ii) introduzir DNA recombinante em células procarióticas ou eucarióticas por, por exemplo, entre outros, transfecção, | eletroporação ou microinjeção, (iii) cultivar ditas células transformadas, (iv) expressar proteína terapêutica, por exemplo constitutivamente na indução, e (v) isolar dita proteína de coagulação sanguínea, por exemplo a partir do meio de cultura ou colhendo as células transformadas, para obter proteína ' terapêutica purificada. - Em outros aspectos, a proteína terapêutica é produzida por expressão em um sistema hospedeiro procariótico ou eucariótico apropriado caracterizado pela produção de uma molécula de proteína de coagulação sanguínea farmacologicamente aceitável.
Exemplos de células eucarióticas são células mamíferas, como CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep, e HepG2. Uma ampla variedade de vetores são usados para preparação da proteína terapêutica e são selecionados a partir de vetores de expressão eucarióticos e procarióticos.
Exemplos de vetores para expressão procariótica incluem plasmídeos como, entre outros, pRSET, pET, e pBAD, em que os promotores usados nos vetores de expressão procarióticos incluem um ou mais de, entre outros, lac, tre, trp, recA, ou araBAD.
Exemplos de vetores — para expressão eucariótica incluem: (1) para expressão em levedura, vetores como, entre outros, pÃO, pPIC, pYES, ou pMET, usando promotores como, entre outros, AOX1, GAP, GAL1, ou AUGI; (ii) para expressão em células de inseto, vetores como entre outros, pMT, pAc5, pIB, pMIB, ou pBAC, usando promotores como entre outros PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, ou
: 68 ' polh, e (iii) para expressão em células de mamíferos, vetores como entre outros pSVL, pCMV, pRe/RSV, pcDNA3, ou pBPV, e vetores derivados de, em um aspecto, sistemas virais como entre outros vírus vaccinia, vírus adeno- associados, vírus herpes, ou retrovírus, usando promotores como entre outros CMV,SVA40,EF-1, ULC, RSV, ADV, BPV, e B-actina. PÓ D. Administração Em uma modalidade uma proteína terapêutica conjugada da presente invenção pode ser administrada por injeção, como injeção intravenosa, intramuscular, ou intraperitoneal.
Para administrar composições compreendendo uma proteína terapêutica conjugada da presente invenção aos humanos ou animais de teste, em um aspecto, as composições compreendem um ou mais carreadores ' farmaceuticamente * aceitáveis. Os termos "farmaceuticamente" ou - "farmacologicamente aceitável" referem-se a entidades moleculares e composições que são estáveis, inibem degradação da proteína como produtos de agregação e clivagem, e além disso não produzem reações alérgicas ou outras reações adversas quando administrados usando vias bem conhecidas na técnica, como descrito abaixo. "Carreadores farmaceuticamente aceitáveis" incluem qualquer e todos os solventes clinicamente úteis, meio de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e que retardam a absorção e semelhantes, incluindo aqueles agentes revelados acima.
Conforme usado aqui, "quantidade eficaz" inclui uma dose apropriada para tratar uma doença ou distúrbio que ameniza um sintoma de uma doença ou distúrbio. Em uma modalidade, "quantidade eficaz" inclui uma dose apropriada para tratar um mamífero contendo um distúrbio de sangramento como descrito aqui.
As composições podem ser administradas por via oral, tópica, transdérmica, parenteral, por spray de inalação via vaginal, retal ou injeção intracranial. O termo parenteral conforme usado aqui inclui injeções
' 69 " subcutâneas, intravenosas, intramusculares, intracisternais, ou técnicas de infusão. A administração por injeção intravenosa, intradérmica, intramuscular, —intramamária, —intraperitoneal, intratecal, retrobulbar, intrapulmonar e/ou implante cirúrgico em um sítio particular é contemplado | comotal. Geralmente, composições são essencialmente livres de pirogênios, | bem como outras ifipurezas que podem ser danosos ao recipiente.
Administrações simples ou múltiplas das composições podem | ser conduzidas com os níveis de dose e padrões sendo selecionados pelo | médico assistente. Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem apropriada irá depender do tipo de doença a ser tratada, como descrito acima, a gravidade e curso da doença, se a droga é administrada para fins de | prevenção ou terapêutico, terapia anterior, histórico clínico do paciente e o resposta á droga, e o critério do médico assistente. | . A presente invenção ainda refere-se a uma composição | farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de uma proteína | terapêutica conjugada como definido aqui. A composição farmacêutica pode | ainda compreender um carreador, diluente, sal, tampão ou excipiente farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode ser usada para tratar os distúrbios de sangramento definidos acima. A composição farmacêutica da invenção pode ser uma solução ou um produto liofilizado. Soluções da composição farmacêutica podem ser submetidas a qualquer processo de liofilização apropriado.
Como um aspecto adicional, a invenção inclui kits que I compreendem uma composição da invenção embalada de modo que facilita | —seuuso para administração aos sujeitos. Em uma modalidade, tal kit inclui um | composto ou composição descritos aqui (por exemplo, uma composição compreendendo uma proteína terapêutica conjugada), embalada em um recipiente como um frasco ou vaso vedado, com um rótulo afixado ao recipiente ou incluindo na embalagem que descreve o uso de composto ou
Y 70 ' composição na prática do método. Em uma modalidade, o kit contém um primeiro recipiente contendo uma composição compreendendo uma proteína terapêutica conjugada e um segundo recipiente contendo uma solução de reconstituição fisiologicamente aceitável para a composição no primeiro recipiente. Em um aspecto, o composto ou composição é embalado em uma forma de dosagem unitária” o kit pode ainda incluir um dispositivo apropriado para administrar a composição de acordo com a via específica de | administração. Preferencialmente, o kit contém um rótulo que descreve uso da proteína terapêutica ou composição peptídica.
POLÍMEROS SOLÚVEIS EM ÁGUA Em um aspecto, uma molécula derivada de proteína terapêutica (ou seja, uma proteína terapêutica conjugada) fornecida é ligada a ' um polímero solúvel em água incluindo, entre outras, polietilenoglicol (PEG), . PEG ramificado, ácido polisiálico (PSA), hidroxialquil amido (HAS), hidroxiletil amido (HES), carboidrato, polissacarídeos, pululano, quitosana, ácido hialurônico, sulfato de condroitina, sulfato de dermatano, amido, dextrano, carboximetil-dextrano, óxido de polialquileno (PÃO), polialquileno glicol (PAG), polipropileno glicol (PPG) polioxazolina, polí acriloilmorfolina, polivinil álcool (PVA), policarboxilato, polivinilpirrolidona, polifosfazeno, —polioxazolina, polietileno-co-ácido maleico anidrido, poliestireno-co-ácido maleico anidrido, poli(1-hidroximetiletileno hidroximetilformal) (PHF), 2- metacriloiloxi-2 -etiltrimetilamôniofosfato (MPC). Em uma modalidade da invenção, o polímero solúvel em água consiste de molécula de ácido siálico contendo uma faixa de peso molecular de 350 a 120.000, 500 a 100.000, 1000 —a&80.000,1500 a 60.000, 2.000 a 45.000 Da, 3.000 a 35.000 Da, e 5.000 a
25.000 Da. O acoplamento do polímero solúvel em água pode ser realizado por acoplamento direto à proteína ou através de moléculas ligantes. Um exemplo de um ligante químico é MBPH (ácido 4[4-N- Maleimidofênil]butírico hidrazida) contendo uma hidrazida seletiva para
' 71 ' carboidrato um grupo maleimida reativo a sulfidrila (Chamow et al., J Biol Chem 1992;267:15916-22). Outros ligantes preferenciais e exemplares são descritos abaixo.
Em uma modalidade, o derivado retém a atividade funcional —completade produtos de proteína terapêutica nativa, e fornece uma meia-vida estendida in vivo, em comparação a prodítos de proteína terapêutica nativa.
Em outra modalidade, o derivado retém pelo menos 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27,28, 29, 30, 31, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43,44. 45, 46,47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56,57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,71,72,73,74,75,76,77,78,79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, ou 150 por cento (%) de atividade biológica em relação a proteína de coagulação sanguínea ] nativa.
Em um aspecto relacionado, as atividades biológicas da proteína de - coagulação derivada e nativa são determinadas pelas razões de atividade —cromogênica pelo valor de antígeno de coagulação sanguínea (fator de coagulação sanguínea:Chr: fator de coagulação sanguínea:Ag). Ainda em outra modalidade da invenção, a meia-vida do constructo é reduzido ou aumentado 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 2, 3, 4,5, 6,7,8, 9, ou 10 vezes em relação a meia-vida in vivo de proteína terapêutica nativa.
À.
Ácido siálico e PSA PSAs consiste de polímeros (geralmente homopolímeros) de ácido N-acetilneuramínico.
O grupo amino secundário normalmente contém um grupo acetil, mas este pode, por outro lado, conter um grupo glicolil.
Possíveis substituintes nos grupos hidroxil incluem grupos acetil, lactil, etil, sulfato,e fosfato.
' 72 ACHN LOS “on
HO OH Ácido N-Acetilneuramínico NeuSAc O Estrutura de ácido siálico (ácido N-acetilneuramínico) PSAs e mPSAs geralmente compreendem polímeros lineares que consistem essencialmente de frações de ácido N-acetilneuramínico ligados por ligações 2,8- ou 2,9- glicosídicas ou combinações destes (por exemplo alternando ligações 2,8- e 2,9-). Em PSAs e mPSAs particularmente . preferenciais, as ligações glicosídicas são a-2,8. Tais PSAs e mPSAs são convenientemente derivados de ácidos colomínicos, e são referenciados aqui como “CAs” e “mCAs”. Típicos PSAs e mPSAs compreendem pelo menos 2, preferencialmente pelo menos 5, mais preferencialmente pelo menos 10 e mais preferencialmente pelo menos 20 frações de ácido N-acetilneuramínico. Assim, podem compreender de 2 a 300 frações de ácido N-acetilneuramínico, preferencialmente de 5 a 200 frações de ácido N-acetilneuramínico, ou mais preferencialmente de 10 a 100 frações de ácido N-acetilneuramínico. PSAs e CAs preferencialmente são essencialmente livres de frações de açúcar além de ácido N- —acetilneuramínico. Assim, PSAs e CAs preferencialmente compreendem pelo menos 90 %, mais preferencialmente pelo menos 95 % e mais preferencialmente pelo menos 98 % frações de ácido N-acetilneuramínico. Onde PSAs e CAs compreendem frações além de ácido N- acetilneuramínico (como, por exemplo, em mPSAS e mCAs) estas são —preferencialmente localizadas em uma ou ambas as extremidades da cadeia de polímero. Tais “outras” frações podem, por exemplo, ser frações derivadas de frações terminais de ácido N-acetilneuramínico por oxidação ou redução. Por exemplo, WO-A-0187922 descreve ditos MPSAs e mCAs
' 7 Í em que a unidade terminal não redutora de ácido N-acetilneuramínico é convertido a um grupo aldeído por reação com periodato de sódio. Além disso, WO 2005/016974 descreve ditos MPSAs e mCAs em que a unidade terminal redutora de ácido N-acetilneuramínico é submetida a redução para —redutivamente abrir o anel no terminal redutor da unidade de ácido N- acetilneuramínico, por meio da qual um grupo diol vicinal é formádo, seguido por oxidação para converter o grupo diol vicinal a um grupo aldeído. | Glicoproteínas ricas em ácido siálico se ligam a selectina em | | humanos e outros organismos. Elas desempenham um papel importante em infecções de influenza humana. Por exemplo, ácido siálico pode esconder antígenos de manose na superfície de células hospedeiras ou bactérias a partir de ligação a manose. Isto previne a ativação de complemento. Ácidos siálicos ' ainda escondem o penúltimo resíduo de galactose assim prevenindo o . clearance rápido da the glicoproteína através do receptor de galactose nas células parenquimais hepáticas. o Ho COONa | o o o COONa no AR, o ho, o IA
HIT OH
ROD HN a | A estrutura de ácido colomínico (homopolímero de ácido N- acetilneuramínico) Ácidos —colomínicos (uma subclasse de PSAs) são homopolímeros de ácido N-acetilneuramínico (NANA) com uma ligação cetosídicaa (28), e são produzidos, entre outros, por cepas particulares de Escherichia coli possuindo antígeno K1. Ácidos colomínicos têm muitas funções fisiológicas. São importantes como uma matéria-prima para drogas e cosméticos.
º 74 , Estudos comparativos in vivo com polisialilada e asparaginase não modificada revelaram que a polisialilação aumento a meia-vida da enzima (Fernandes and Gregoriadis, Biochimica Biophysica Acta 1341: 26-34, 1997).
Conforme usado aqui, "frações de ácido siálico" incluem monômeros ou polímeros de ácido siálico (“polissacarídeos”) que são solúveis em uma solução ou suspensão aquosa e têm pouco ou nenhum impacto negativo, como efeitos colaterais, aos mamíferos na administração de conjugado de proteína de coagulação do sangue-PSA em uma quantidade farmaceuticamente aceitável. Os polímeros são caracterizados, em um | 10 aspecto, como contendo 1, 2,3,4,5, 10,20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, ou 500 unidades de ácido siálico. Em certos aspectos, unidades diferentes de ácido siálico são combinadas em uma cadeia.
' Em uma modalidade da invenção, a porção de ácido siálico do : composto polissacarídeo é altamente hidrofílico, e em outra modalidade o composto inteiro é altamente hidrofílico. Hidrofilicidade é conferida principalmente pelos grupos carboxil pingentes das unidades de ácido siálico, bem como os grupos hidroxil. A unidade de sacarídeo podem conter outros grupos funcionais como grupos amina, hidroxil ou sulfato, ou combinações dos mesmos. Estes grupos podem estar presentes em compostos de sacarídeo de ocorrência natural, ou introduzidos em compostos polisscarídeos derivados.
O polímero PSA de ocorrência natural está disponível como preparação polidispersa mostrando uma ampla distribuição de tamanho (por exemplo Sigma C-5762) e alta polidispersidade (PD). Devido ao fato de — polissacarídeos serem geralmente produzidos em bactérias contendo o risco inerente de copurificação, a purificação das cadeias de polímero de ácido siálico longo pode surgir da probabilidade de teor de endotoxina aumentada. Moléculas curtas de PSA com 1-4 unidades de ácido siálico podem ainda ser sinteticamente preparadas (Kang SH et al., Chem Commun. 2000;227-8; Ress
' 75 ' DK and Linhardt RJ, Current Organic Synthesis. 2004;1:31-46), assim, minimizando o risco de níveis altos de endotoxina. No entanto, preparações de PSA com uma distribuição estreita de tamanho e baixa polidispersidade, que são ainda livres de endotoxina,y podem agora ser fabricadas. Compostos — polissacarídeos de uso particular para a invenção são, em um aspecto, aqueles produzidos por bactérias. Alguns dos polissacarídeos de ocorrência natural são Ó conhecidos como glicolipídeos. Em uma modalidade, os compostos polissacarídeos são substancialmente livres de unidades terminais de galactose.
B. Polietilenoglicol (PEG) e Peguilação Em certos aspectos, as proteínas terapêuticas são conjugados a um polímero solúvel em água por qualquer um de uma variedade de métodos químicos (Roberts JM et al., Advan Drug Delivery Rev 2002;54:459-76). Por ' exemplo, em uma modalidade a proteína terapêutica é modificada pela . conjugação de PEG a grupos amino livres da proteína usando ésteres de N- hidroxisuccinimida (NHS). Em outra modalidade o polímero solúvel em água, por exemplo, PEG, é acoplado a grupos SH livres usando química de maleimida ou o acoplamento de PEG hidrazidas ou PEG aminas a frações de carboidrato da proteína terapêutica após oxidação anterior.
A conjugação é em um aspecto realizada por acoplamento direto — (ou acoplamentro através de sistemas de ligantes) do polímero solúvel em água à proteína terapêutica em formação de ligações estáveis. Além disso, sistemas de ligantes degradáveis, liberáveis ou hidrolizáveis são usados em certos aspectos da presente invenção (Tsubery et al. J Biol Chem 2004;279:38118-24 / Greenwald et al., ] Med Chem 1999;42:3657-67 / Zhao et al., Bioconj Chem 2006;17:341-51 / —WO2006/138572A2/US7259224B2/US7060259B2).
Em uma modalidade da invenção, a proteína terapêutica é modificada por resíduos de lisina pelo uso de derivados de polietilenoglicol contendo um éster ativo N-hidroxisuccinimida (NHS) como succinimidil succinato, succinimidil glutarato ou succinimidil propionato. Estes derivados
"oo 76 7 reagente com os resíduos de lisina da proteína terapêutica em condições leves pela formação de uma ligação amida estável. Em uma modalidade da invenção, o comprimento da cadeia de derivado de PEG é 5.000 Da. Outros derivados de PEG com comprimentos de cadeia de 500 a 2.000 Da, 2.000 a — 5.000 Da,maisdo que 5.000 até 10.000 Da ou mais do que 10.000 até 20.000 Da, ou mais do que 20.000 até 150.000 Da são usados em várias modalidades, incluindo estruturas lineares e ramificadas.
Métodos alternativos para a peguilação de grupos amino são, entre outros, a conjugação química com PEG carbonatos formando ligações de uretano, ou a reação com aldeídos ou cetonas por aminação redutora ' formando ligações de amida secundária. Em uma modalidade da presente invenção em uma molécula oo de proteína terapêutica é quimicamente modificada usando derivados PEG ' que são comercialmente disponíveis. Estes derivados de PEG em aspectos alternativos têm estruturas lineares ou ramificadas. Exemplos de derivados de PEG contendo grupos NHS são listados abaixo.
Os derivados PEG seguintes são exemplos não limitantes destes comercialmente disponíveis de Nektar Therapeutics (Huntsville, Ala.; ver www.nektar.com/PEG reagent catalog; Nektar Advanced Peguilação, —pricelist2005-2006): mPEG-Succinimidil propionato (mPEG-SPA) o mPEG-CH,CH,— C— O—N o mPEG-Succinimidil a-metilbutanoato (nPEG-SMB)
' 77 bw O,
Ú mPEG-CHCH,CH—C— O— N Es o mMPEG-CM-HBA-NHS (CM=carboximetil; HBA=ácido Hidroxi butírico) o O o meo cb o— guest mo | | CH; | o Estrutura de um derivado de PEG ramificado (Nektar . Therapeutics): PEG ramificado N-Hidroxisuccinimida (mPEG2-NHS)
Q mPEG do mPEG o Este reagente com estrutura ramificada é descrito em mais detalhes por Kozlowski et al. (BioDrugs 2001;5:419-29). Outros exemplos não limitantes de derivados de PEG são | comercialmente disponíveis de NOF Corporation (Tóquio, Japan; ver | www.nof.co.jp/english: Catálogo 2005) Estrutural geral de derivados lineares de PEG (NOF Corp.): O, | CH;O(CH;CHO) —X— N | | o
X=carboximetil O,
Í CHZO(CHICH/O) — CH; C—O—N o X=carboxipentil
O
Í CH;O(CH;CHO) (CH); —C— O—N o | x=suceinato l O, i 1 CH;O(CHCHZO)/—C— CH;OH—C—O— N = O, o o Y o 1 À svceinato CH;O(CHCHZO) — C— (CH) C—C Y o MPEG Succinimidyl glutarato Estruturas de derivados de PEG ramificado (NOF Corp.): 2,3- Bis(metilpolioxietileno-oxi)-1-(1,5-dioxo-S-succinimidiloxi, pentiloxi)propano HC (OCHz CHA) O CHa a H;C(OCHZTCHAN TO CE Q q CH O-C—CHCH,CH,-C-O-N o 2,3-Bis(metilpolioxietileno-oxi)-1-(succinimidil —carboxipentiloxi)propano
| - 79 NS O NA o. | seta " sã : º CH O— CH;CH;CH;CH;CH;— C—O0—N ó Estes derivados de propano mostram uma estrutura glicerol com um padrão de substituição 1,2. Na presente invenção derivados de PEG ramificados baseado em estruturas de glicerol com substituição 1,3 ou outras estruturas ramificadas descritas em US2003/0143596Al são ainda contemplados.
Derivados PEG com ligantes degradáveis (por exemplo, hidrolizáveis) como descrito por Tsubery et al. (J Biol Chem 2004;279:38118-24) e Shechter et al. (WO04089280A3) são ainda . contemplados.
De modo surpreendente, a proteína terapêutica peguilada desta ' invenção apresenta atividade funcional, combinado com uma meia-vida estendida in vivo.
Além disso, os fatores rF VIII, FVIJa, FIX, ou outros fatores | de coagulação sanguíneos peguilados parecem ser mais resistentes a contra | inativação por trombina.
C.
Hidroxialquil amido (HAS) e hidroxiletil amido (HES) Em várias modalidades da presente invenção, uma molécula de | proteína terapêutica é quimicamente modificada usando hidroxialquil amido (HAS) ou hidroxiletil amido (HES) ou derivados dos mesmos.
HES é um derivado de amilopectina de ocorrência natural e é degradado por alfa-amilase no corpo.
HES é um derivado substituído de amilopectina de polímero de carboidrato, que está presente em amido de milho em uma concentração de até 95 % em peso.
HES apresenta propriedades biológicas vantajosas e é usada como um agente de reposição de volume sanguíneo e em terapia de hemodiluição na clínica (Sommermeyer et al, 1987, Krankenhauspharmazie, 8 (8), 271-278; e Weidler et al., 1991, Arzneim.-Forschung/Drug Res. g 419 494-498).
Amilopectina consiste de frações de glicose, em que a cadeia principal de ligações alfa-1,4- glicosídicas estão presentes e nos sítios de ramificação de ligações alfa-l, 6-glicosídicas são encontrados. As propriedades físico-químicas desta molécula são principalmente determinadas pelo tipo de ligações glicosídicas. Devido a ligações niqueladas alfa-1,4- Ê S glicosídicas, estruturas helicais através de seis monômeros de glicose por vez são produzidos. As propriedades físico-químicas bem como as bioquímicas do polímero podem ser modificadas através de substituição. A introdução de um grupo hidroxietil pode ser conseguida por hidroxietilação alcalina. Pela adaptação das condições de reações é possível explorar a reatividade diferente do grupo hidroxi respectivo no monômero de glicose não substituído com relação a hidroxietilação. Devido a este fato, especialistas são capazes de ' influenciar o padrão de substituição a uma extensão limitada. - HAS refere-se a um derivado amido que foi substituído em pelomenos um grupo hidroxialquil. Portanto, o termo hidroxialquil amido não é limitado aos compostos onde a fração terminal de carboidrato compreende grupos hidroxialquil R1, R2, e/ou R3, mas ainda refere-se aos compostos em que pelo menos um grupo hidroxi presente em qualquer lugar, na fração terminal carboidrato e/ou na parte restante da molécula de amido, HAS, é substituído por um grupo hidroxialquil RI, R2, ou R3.
un A mass NA o RO: ou " º *% O grupo alquil pode ser um grupo alquil linear ou ramificado que pode ser apropriadamente substituído. Preferencialmente, o grupo hidroxialquil contém 1 a 10 átomos de carbono, mais preferencialmente de 1 a 6 átomos de carbono, mais preferencialmente de 1 a 4 átomos de carbono, e ainda mais preferencialmente 2-4 átomos de carbono. "Hidroxialquil amido" portanto, preferencialmente compreende hidroxietil amido, hidroxipropil
| 81 amido e hidroxibutil amido, em que o hidroxietil amido e hidroxipropil amido são particularmente preferenciais.
Hidroxialquil amido compreendendo dois ou mais grupos diferentes hidroxialquil é ainda compreendido na presente invenção. O pelo —menosum grupo hidroxialquil compreendido em HAS pode conter dois ou .— grupos hidroxi. De acordo com uma modalidade, o pelo menos um grupo hidroxialquil compreendia HAS contém um grupo hidroxi.
O termo HAS ainda inclui derivados em que o grupo alquil é mono ou polisubstituído. Em uma modalidade, o grupo alquil é substituído com um halogênio, especialmente flúor, ou com um grupo aril, desde que o HAS permaneça solúvel em água. Além disso, o grupo hidroxi terminal de um grupo hidroxialquil pode ser esterificado ou eterificado. Deerivados de HAS são ' descritos em W0O/2004/024776, que é incorporado por referência em sua - totalidade.
D. Métodos de ligação A proteína terapêutica pode ser covalentemente ligado aos compostos polissacarídeos por qualquer uma das várias técnicas conhecidas aos especialistas na técnica. Em vários aspectos da invenção, frações de ácido siálico são ligados a uma proteína terapêutica, por exemplo, FIX, FVIL, FVIlaouWVWF, por exemplo, pelo método descrito na Patente US 4.356.170, que é aqui incorporado por referência.
Outras técnicas para acoplamento de PSA a polipeptídeos são ainda conhecidos e contemplados pela invenção. Por exemplo, publicação US 2007/0282096 descreve conjugação de um derivado de amina ou hidrazida de, — por exemplo, PSA, às proteínas. Além disso, publicação US 2007/0191597 descreve derivados de PSA contendo um grupo aldeído para reação com substratos (por exemplo, próteinas) em uma extremidade redutora. Estas referências são incorporadas por referência em suas totalidades.
Vários métodos são revelados na coluna 7, linha 15, até a
| 82 coluna 8, linha 5 de patente US 5.846.951 (incorporado por referência em sua totalidade). Técnicas exemplares incluem ligação a uma ligação peptídica entre um grupo carboxil em um de proteína de coagulação sanguínea ou polissacarídeo e um grupo amina da proteína de coagulação sanguínea ou — polissacarídeo, ou uma ligação éster entre um grupo carboxil da proteína de cougulação-Sfliguínca ou polissacarídeo e um grupo hidroxil da proteína terapêutica ou polissacarídeo. Outra ligação pela qual a proteína terapêutica é covalentemente ligada ao composto polissacarídeo é através de uma base de Schiff, entre um grupo amino livre na proteína de coagulação sanguínea sendo —reagida com um grupo aldeído formado na extremidade não redutora do polissacarídeo por oxidação por periodato (Jennings HJ and Lugowski C, J Immunol. 1981;127:1011-8; Fernandes AI and Gregoriadis G, Biochim ' Biophys Acta. 1997;1341;26-34). A base de Schiff gerada é em um aspecto - estabilizada por redução específica com NaCNBH3 para formar uma amina secundária. Uma abordagem alternativa é a geração de grupos amino terminais livres no PSA por aminação redutora com NHA4CI após oxidação anterior. Reagentes bifuncionais podem ser usados para ligação de dois grupos amino ou dois hidroxil. Por exemplo, PSA contendo um grupo amino é acoplado aos grupos amino da proteína com reagentes como BS3 (Bis(sulfosuccinimidil)suberato / Pierce, Rockford, IL). Além disso reagentes de ligação cruzada heterobifuncionais como Sulfo-EMCS (N-e- Maleimidocaproiloxi) sulfosuccinimida éster/ Pierce) é usado, por exemplo, para ligar grupos amina e tiol. Em outra abordagem, uma hidrazida PSA é preparada e — acoplada à fração de carboidrato da proteína após oxidação anterior e geração de funções de aldeído.
Como descrito acima, um grupo amina livre da proteina terapêutica reage com o grupo l-carboxil do resíduo de ácido siálico para formar uma ligação peptidil ou uma ligação éster é formada entre o grupo de ácido 1-carboxílico e um hidroxil ou outro grupo ativo apropriado na proteína | de coagulação sanguínea.
Alternativamente, um grupo carboxil forma uma | ligação peptídica com grupo 5-amino desacetilado, ou um grupo aldeído de uma molécula de uma proteína terapêutica que forma uma base de Schiff com ogrupo N-desacetilado 5-amino de um resíduo de ácido siálico.
Alternativámente, o composto polissacarídeo é associado em um modo não covalente com uma proteína terapêutica.
Por exemplo, o composto polissacarídeo e o composto farmaceuticamente ativo são em um | aspecto ligados por interações hidrofóbicas.
Outras associações não —covalentes incluem interações eletrostáticas, com íons carregados de modo oposto atraindo cada outro.
Em várias modalidades, a proteína terapêutica é ligada ou ' associada com o composto polissacarídeo em quantidades estequiométricas | - (por exemplo, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:7, 1:8, 1:9, ou 1:10, etc.). Em | várias modalidades, 1-6, 7-12 ou 13-20 polissacarídeos são ligados à proteína de coagulação sanguínea.
Ainda em outras modalidades, 1, 2, 3,4,5,6,7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais polissacarídeos são ligados à proteína de coagulação sanguínea.
Em várias modalidades, a proteína terapêutica é modificada para introduzir sítios de glicosilação (ou seja, sítios que não sítios de glicosilação nativos). Tal modificação pode ser conseguida usando técnicas padrões de biologia molecular conhecidas na técnica.
Além disso, a proteína terapêutica, antes da conjugação a um polímero solúvel em água através de uma ou mais frações de carboidrato, podem ser glicosliados in vivo ou in vitro.
Estes sítios glicosliados podem servir como alvos para conjugação das proteínas com polímeros solúveis em água (Pedido de Patente US | 20090028822, Pedido de Patente US 2009/0093399, Pedido de Patente US | 2009/0081188, Pedido de Patente US 2007/0254836, Pedido de Patente US 2006/0111279, e DeFrees S. et al., Glicobiology, 2006, 16, 9, 833-43). Por exemplo, a proteína que não é naturalmente glicosilada in vivo (por exemplo, uma proteína que não é uma glicoproteína) pode ser modificada como descrito acima. E. Ligação Amino-oxi Em uma modalidade da invenção, a reação de hidroxilamina ou derivados de hidroxilamina corirfídeídos (por exemplo, em uma fração de carboidrato seguido por oxidação em periodato de sódio) para formar um grupo oxima é aplicado à preparação de conjugados de proteína de coagulação sanguínea. Por exemplo, uma glicoproteína (por exemplo, a proteína terapêutica de acordo com a presente invenção) é primeiro oxidada com um agente oxidante como periodato de sódio (NaIO4) (Rothfus JA et Smith EL., J Biol Chem 1963, 238, 1402-10; e Van Lenten L and Ashwell G., Ú J Biol Chem 1971, 246, 1889-94). A oxidação de periodato de glicoproteínas . é baseado em reação clássica de Malaprade descrita em 1928, a oxidação de —diois vicinais com periodato para formar um grupo aldeído ativo (Malaprade L., Analytical application, Bull Soc Chim France, 1928, 43, 683-96). Exemplos adicionais para dito um agente oxidante são tetracetato de chumbo (PLD(OAc)4 ), acetato de manganês (MnO(Ac)3), acetato de cobalto (Co(OAc)2), acetato de tálio (TIOAc), sulfato de cério (Ce(SO4)2) (US
4.367.309) ou perrutenato de potássio (KRuO4) (Marko et al., J Am Chem Soc 1997,119, 12661-2). Por “agente oxidante” um composto oxidante leve que é capaz de oxidar diois vicinais em carboidratos, assim, gerando grupos aldeídos ativos em condições fisiológicas de reação é pretendido. A segunda etapa é o acoplamento do polímero contendo um grupo amino-oxi à uma fração de carboidrato oxidado para formar uma ligação oxima. Em uma modalidade da invenção, esta etapa pode ser realizada na presença de quantidades catalíticas do catalisador nucleofílico anilina ou derivados de anilina (Dirksen A et Dawson PE, Bioconjugate Chem. 2008; Zeng Y et al, Nature Methods 2009;6:207-9). A catálise por anilina | dramaticamente acelera a ligação de oxima permitindo o uso de concentrações muito baixas de reagentes. Em outra modalidade da invenção a ligação oxima é estabilizada por redução com NaCNBH3 para formar uma ligação alcoxiamina (Figura 2). Catalisadores adicionais são descritos abaixo. Informações adicionais em tecnologia de amino-oxi podem ser encontradas nas seguintes referências, cada umá das quais é incorporada em suas totalidades: EP 1681303A1 (eritropoietina HASilada); WO 2005/014024 (conjugados de um polímero e uma proteína ligados por um grupo de ligação oxima); WO96/40662 (compostos ligantes contendo amino-oxi e suas — aplicações em conjugados); WO 2008/025856 (proteínas modificadas); Peri F et al., Tetrahedron 1998, 54, 12269-78; Kubler-Kielb J et. Pozsgay V., J Org Chem 2005, 70, 6887-90; Lees A et al., Vacceine 2006, 24(6), 716-29; e ' Heredia KL et al., Macromoecules 2007, 40(14), 4772-9. . Em várias modalidades da invenção, o polímero solúvel em água que é ligado de acordo com a tecnologia de amino-oxi descrita aqui a uma fração de carboidrato oxidado de uma proteína terapêutica (por exemplo, FVIII, FVIla, ou FIX) inclui, entre outros, polietilenoglicol (PEG), PEG ramificado, ácido polisiálico (PSA), carboidrato, polissacarídeos, pululano, quitosana, ácido hialurônico, sulfato de condroitina, sulfato de dermatano, amido, dextrano, carboximetil-dextrano, óxido de polialquileno (PAO), polialquileno glicol (PAG), polipropileno glicol (PPG) polioxazolina, poli acriloilmorfolina, polivinil álcool (PVA), policarboxilato, polivinilpirrolidona, —polifosfazeno, polioxazolina, polietileno-co-ácido maleico — anidrido, —poliestireno-co-ácido —maleico anidrido, poli(l- —hidroximetiletileno —hidroximetilformal) (PHF), 2-metacriloiloxi-2º- etiltrimetilamôniofosfato (MPC).
CATALISADORES NUCLEOFÍLICOS Como descrito aqui, a conjugação de polímeros solúveis em água às proteínas terapêuticas pode ser catalisada por anilina. Anilina fortemente catalisa reações aquosas de aldeídos e cetonas com aminas para formar iminas estáveis como hidrazonas e oximas. O seguinte diagrama compara uma reação de ligação de oxima catalisada por anilina (Kohler JJ, ChemBioChem 2009;10:2147-50): o reação catalisada 2" Rr poranilina É i E " Reação não ; i o 1 PxCesso . catalisada i ”" j OA, Po AT HE e ' i HR HOR > r A = : É; K Rd Pa]! x
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RO O CA À neo NR AAg mó” ij ER astra : 1 produto de ligação a extra No entanto, considerando os vários riscos de saúde associados com anilina, catalisadores alternativos são desejáveis. A presente invenção fornece derivados de anilina como catalisadores alternativos de ligação a oxima. Tais derivados de anilina incluem, entre outros, ácido o-amino benzoico, ácido m-amino benzoico, ácido p-amino benzoico, ácido sulfanílico, o-aminobenzamida, o-toluidina, m-toluidina, p-toluidina, o- anisidina, m-anisidina, e p-anisidina.
Em uma modalidade da invenção, m-toluidina (também chamado de meta-toluidina, m-metilanilina, 3-metilanilina, ou 3-amino-l- metilbenzene) é usada para catalisar as reações de conjugação descritas aqui.
M-toluidina e anilina têm propriedades físicas semelhantes e essencialmente '
os mesmos valores de pKa (m-toluidina: pKa 4,73, anilina: pKa 4,63).
Os catalisadores nucleofílicos da invenção são úteis para ligação a oxima (por exemplo, usando ligação amino-oxi) ou formação de hidrazona (por exemplo, usando química da hidrazida)) Em várias —modalidades da invenção, o catalisador nucleofílico é fornecido na reação de conjugação em uma concentração de 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,5, 0,6, 0,7, 0.0.9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ou 50 MM. Em uma modalidade, o catalisador nucleofílico é fornecido entre 1 a 10 MM. Em várias modalidades da invenção, a faixa de pH de reação de conjugação é 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 e 7,5. Em uma modalidade, o pH é entre 5,5 a 6,5.
PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS CONJUGADAS ' Em várias modalidades, a purificação da proteína que foi ' incubada com um agente oxidante e/ou proteína terapêutica que foi conjugada com um polímero solúvel em água de acordo com a presente revelação, é desejado. Várias técnicas de purificação são conhecidas na técnica e incluem, entre outros, métodos cromatográficos cromatografia de troca iônica, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia por exclusão de tamanho e cromatografia por afinidade ou combinações dos mesmos, métodos de filtração, e métodos de precipitação (Guide to Protein Purification, Meth. Enzymology Vol 463 (edited by Burgess RR and Deutscher MP), 2º edição, Academic Press 2009)..
Os seguintes exemplos não pretendem ser limitantes, mas somente exemplares das modalidades específicas da invenção.
EXEMPLOS Exemplo 1 Preparação do ligante homobifuncional NEL[OCH,CHLONH, O ligante homobifuncional NEJOCH;CH,;);-ONH,; |
| 88 HaN-xo, AO A NAa (3-oxa-pentano-1,5-dioxiamina) contendo dois grupos ativos amino-oxi foi sintetizado de acordo com Boturyn et al. (Tetrahedron 1997;53:5485-92) em uma reação orgânica de duas etapas empregando uma síntese modificada de Gabriel de aminas primárias (Figura 3). Na primeira Ó ' etapa, uma molécula de 2,2-clorodietiléter foi reagido com duas moléculas de Endo-N-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboximida em dimetilformamida (DMF). O produto homobifuncional foi preparado a partir do intermediário resultante por hidrazinólise em etanol.
Exemplo 2 Preparação do ligante homobifuncional NH;[OCH,CH,ONH, . O ligante homobifuncional NHE[OCH;CH;]),.ONH, HAN AVIS o AMO, eo (3,6,9-trioxa-undecano-1,11-dioxiamina) contendo dois grupos ativos amino-oxi foi sintetizado de acordo com Boturyn et al. (Tetrahedron 1997;53:5485-92) em uma reação orgânica de duas etapas empregando uma síntese modificada de Gabriel de aminas primárias (Figura 3). Na primeira etapa uma molécula de Bis-(2-(2-cloretoxi)-etil)-éter foi rêagido com duas moléculas de Endo-N-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboximida em DMF.
O produto homobifuncional desejado foi preparado a partir do intermediário resultante por hidrazinólise em etanol.
Exemplo 3 Preparação do ligante homobifuncional NEC[OCH,CE,);ONH) O ligante homobifuncional NHE[OCH;CH;];sONH; NA DON ADM A NANDO NH,
(3,6,9,12,15-penatoxa-heptadecano-1,17-dioxiamina) contendo dois grupos ativos amino-oxi foi sintetizado de acordo com Boturyn et al. (Tetrahedron 1997;53:5485-92) em uma reação orgânica de duas etapas empregando uma síntese modificada de Gabriel de aminas primárias.
Na primeira etapa uma molécula de hexaetileno glicol dicloridrato foi reagido com duas moléculas de Endo-N-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboximida em DMF.
O produto homobifuncional desejado foi preparado a partir do | intermediário resultante por hidrazinólise em etanol.
Exemplo 4 Síntese detalhada de reagente amino-oxi-PSA 3-oxa-pentano-1,5 dioxiamina foi sintetizado de acordo com Botyryn et al (Tetrahedron 1997; 53:5485-92) em uma síntese orgânica de ' duas etapas como delineado no Exemplo 1. m Etapa 1: | 15 A uma solução de Endo-N-hidroxi-S-norbonene-2,3- dicarboxiimida (59,0 g; 1,00 eq) em 700 ml anidro N,N-dimetylformamida K2CO; anidro (45,51 g; 1,00 eq) e 2,2-diclorodietiléter (15,84 ml; 0,41 eq) foram adicionados.
A mistura de reação foi agitada por 22 h a 50ºC.
À mistura foi evaporada até secagem em pressão reduzida.
O resíduo foi suspenso em 2 L diclorometano e extraído duas vezes com solução aquosa saturada de NaCl (cada 1 L). A camada de diclorometano foi seca em over Na7SO, e então evaporada até secagem em pressão reduzida e seca em alto vácuo para gerar 64,5 g de 3-oxapentano-1,5-dioxi-endo-2',3"- dicarboxidiimidanorborneno como um sólido branco-amarelo (intermediário 1). Etapa 2: A uma solução de intermediário 1 (64,25 g; 1,00 eq) em 800 ml Etanol anidro, 31,0 ml Hidrazina hidratada (4,26 eq) foram adicionados.
À mistura de reação foi então refluxada por 2 hrs.
À mistura foi concentrada até metade do volume inicial evaporando o solvente em pressão reduzida.
O ÍÀ precipitado que ocorre foi filtrado.
A camada restante de etanol foi evaporada até secagem em pressão reduzida.
O resíduo contendo o produto bruto 3-0xa- pentano -1,5-dioxiamina foi seco em vácuo para gerar 46,3 g.
O produto bruto foi ainda purificado por cromatografia em coluna (Sílica gel 60; eluição —isocrática com mistura de Diclorometano/Metanol, 9/1) para gerar 11,7 g do produto final puro 3-oxa-pentano -1,5-dioxiamina.
Exemplo 5 Preparação de amino-oxi-PSA 1000 mg de PSA oxidado (MW = 20 kD) obtido de Serum Institute of India (Pune, Índia) foi dissolvido em 16 ml de tampão fosfato 50 mM pH 6,0. Então 170 mg 3-oxa-pentano-1,5-dioxiamina foi posto na mistura de reação.
Após agitação por 2 hrs em RT 78,5 mg cianoborohidreto : ] de sódio foi adicionado e a reação foi realizada por 18 horas durante a noite. ' A mistura de reação foi então submetida a um procedimento de ultrafiltração/diafiltração (UF/DF) usando uma membrana com um corte de 5 kD feita de celulose regenerada (50 cm”, Millipore). Exemplo 6 Preparação de amino-oxi-PSA empregando uma etapa de purificação cromatográfica 1290 mg de PSA oxidado (MW = 20 kD) obtido de Serum Institute of India (Pune, Índia) foi dissolvido em 25 ml de tampão fosfato 50 mM pH 6,0 (tampão A). Então 209 mg 3-oxa-pentano-1,5-dioxiamina foi colocado na mistura de reação.
Após agitação por 1 h em RT 101 mg de cianoborohidreto de sódio foi colocado e a reação foi realizada por 3 horas. —Entãoa mistura foi submetida a uma etapa fraca de cromatografia de troca aniônica empregando um Fractogel EMD DEAE 650-M cromatografia gel (dimensão da coluna: XK26/135). A mistura de reação foi diluída com 110 ml Tampão A e carregada em uma coluna DEAE pré-equilibrada com Tampão À em uma vazão de 1 cm/min.
Então a coluna foi lavada com 20 CV Tampão B | l (20 mM Hepes, pH 6,0) para remover livre 3-oxa-pentano-1,5-dioxiamina e cianeto em uma vazão de 2 cm/min.
O reagente amino-oxi-PSA foi então eluído com uma etapa gradiente que consiste de 67% Tampão B e 43% Tampão C (20 mM Hepes, IM NaCl, pH 7,5). O eluato foi concentrado por —UF/DF usando uma membrana de 5 kD feita de poliéter sulfona (50 em?, Millipore). A etapa final de diafiltração foi realizada contra Tampão D (20OmM Hepes, 90mM NaCl, pH 7,4). À preparação foi analiticamente caracterizada medindo PSA total (ensaio Resorcinol) e grupos amino-oxi totais (ensaio TNBS) para determinar o grau de modificação.
Além disso, a —polidispersidade bem como 3-oxa-pentano-1,5-dioxiamina livre e cianeto foi determinado.
Exemplo 7 ' Preparação de amino-oxi-PSA sem uma etapa de redução . 573 mg de PSA oxidado (MW = 20 kD) obtido de Serum Institute of India (Pune, Índia) foi dissolvido em 11,3 ml fosfato tampão S50mM pH 6,0 (tampão A). Então 94 mg 3-oxa-pentano-1,5-dioxiamina foi colocado na mistura de reação.
Após agitação por 5 h em RT a mistura foi então submetida a uma etapa fraca de cromatografia de troca aniônica empregando uma Fractogel EMD DEAE 650-M cromatografia gel (dimensão — da coluna: XK16/105). A mistura de reação foi diluída com 50 ml Tampão A e carregada na coluna DEAE pré-equilibrada com Tampão À em uma vazão de 1 cm/min.
Então a coluna foi lavada com 20 CV Tampão B (20 mM Hepes, pH 6,0) para remover 3-oxa-pentano-1,5-dioxiamina livre e cianeto em uma vazão de 2 cm/min.
O reagente amino-oxi-PSA foi o eluído com uma — etapa gradiente que consiste de 67 % Tampão B e 43 % Tampão C (20 mM Hepes, 1 M NaCl, pH 7,5). O eluato foi concentrado por UF/DF usando uma membrana 5 kD feita de poliéter sulfona (50 cm”, Millipore). A etapa final de | diafiltração foi realizada contra Tampão D (20 mM Hepes, 90 mM NaCl, pH | ] 7,4). A preparação foi analiticamente caracterizada medindo PSA total |
(ensaio Resorcinol) e grupos amino-oxi totais (Ensaio TNBS) para determinar o grau de modificação.
Além disso, a polidispersidade bem como 3-oxa- pentano-1,5-dioxiamina livre foi determinada.
Exemplo 8 Preparação de amino-oxi-PSA sem uma etapa de redução na presença do catalisador nucleofílico m-toluidina 573 mg de PSA oxidado (MW = 20 kD) obtido de Serum Institute of India (Pune, Índia) é dissolvido em 9 ml 50 mM fosfato tampão pH 6,0 (tampão A). Então 94 mg 3-oxa-pentano-1,5-dioxiamina é colocado nesta solução.
Subsequentemente 2,3 ml de uma solução estoque 50 mM de m-toluidina são adicionados à esta mistura de reação.
Após agitação por 2 h em RT a mistura é então submetida a uma etapa fraca de cromatografia de ' troca aniônica empregando uma Fractogel EMD DEAE 650-M cromatografia . gel (dimensão da coluna: XK16/105). A mistura de reação é diluída com 50 ml Tampão A e carregada na coluna DEAE pré-equilibrada com Tampão À em uma vazão de | cm/min.
Então a coluna é lavada com 20CV Tampão B (20 mM Hepes, pH 6,0) para remover 3-oxa-pentano-1 ,5-dioxiamina livre e cianeto em uma vazão de 2 cm/min.
O reagente amino-oxi-PSA é eluído com uma etapa gradiente que consiste de 67 % Tampão B e 43 % Tampão C (20 mM Hepes, 1 M NaCl, pH 7,5). O eluato é concentrado por UF/DF usando uma | membrana 5 kD feita de poliéter sulfona (50 em”, Millipore). À etapa final de diafiltração é realizada contra Tampão D (20mM Hepes, 90mM NaCl, pH 7,4). À preparação é analiticamente caracterizada medindo PSA total (ensaio Resorcinol) e grupos amino-oxi totais (Ensaio TNBS) para determinar o grau de modificação. — Além disso, a polidispersidade bem como 3-oxa-pentano-1,5-dioxiamina livre é determinada.
Exemplo 9 | Preparação de reagente amino-oxi-PSA 1 Um reagente Amino-oxi - PSA foi preparado de acordo com é Es os exemplos 4 - 8. Após diafiltração, o produto foi congelado a -80ºC e e liofilizado. Após liofilização o reagente foi dissolvido no volume apropriado de água e usado para preparação de conjugados de PSA-proteína através de modificação de carboidrato. BR 5 Exemplo 10 Avaliação da eficácia de diferentes catalisadores alternativos nucleofilicos rFIX foi incubado com periodato de sódio, reagente amino- OxXi-PSA em condições padronizadas (1 mg/ml rFIX em 20 mM L-histidina, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl,, pH 6,0, 5 vezes excesso molar de reagente amino-oxi-PSA, 100 uM NalO;) usando diferentes catalisadores nucleofílicos (anilina, m-toluidina, o-anisidina, m-anisidina, ácido o-aminobenzoico, ácido ' m-aminobenzoico, ácido p-aminobenzoico, p-aminobenzamida, ácido . sulfanílico / concentração padrão: 10 mM) A reação foi conduzida por 2 horas
15. no escuro em temperatura ambiente em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de solução aquosa de cisteina com uma concentração final de 1 MM. A eficiência de acoplamento foi determinada por SDS-PAGE usando um mini sistema Invitrogen X-cell. As amostras foram concentradas com dodecil sulfato de sódio (LDS) tampão e desnaturadas por 10 a 70ºC. Então as amostras foram aplicadas em géis 3-8 % TRIS-acetato e correram em 150 V por 60 min. Subsequentemente os géis foram corados com Coomassie. . Além disso, as amostras foram caracterizadas pelo uso de um sistema SEC-HPLC usando um sistema Agilent 1200 HPLC equipado com uma coluna Shodex KW 803 em condições como anteriormente descrita (Kolarich et al, Transfusion 2006;46:1959-77). 50 ul das amostras foram injetadas não diluídas e eluídas isocraticamente com uma solução filtrada em 0,22 um de 20 mM NaH2PO4, |
« ' 50 mM Na2S0OA4, pH 6,1 em uma vazão de 0,5 ml/min. O padrão de eluição at * foi registrado a 280 nm. Os resultados são sumarizados nas Figuras 5A-C e 6 (SDS PAGE) e tabela 2 (resultados SEC- HPLC). O efeito catalítico das diferentes — preparações é demonstrado. É demonstrado que o uso de m-toluidina leva a
FO 7 resultados equivalentes como obtidos com anilina. Tabela 2 . s mono- catalisadores nucleofílicos di-PSAilado PSAilado rFIX livre : rFIX rFIX 24,9% 10mM anilina 33,6% 18,7% 10mM m-toluidina 40,8% | 10mM ácido o-aminobenzoico 10mM ácido m-aminobenzoico 34,4% . 10mM ácido p-aminobenzoico 18,1% 39,3% 42,6% 10mM o-aminobenzamida 15,9% 10mM ácido sulfanílico ' Exemplo 11 Polisialilação de 1TFIX usando amino-oxi-PSA e m-toluidina —comoum catalisador nucleofilico Método 1: 12,3 mg de 1FIX foram dissolvidos em 6,1 ml de tampão histidina, pH 6,0 (20 mM L-histidina, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2). 254 ul de uma solução aquosa de periodato de sódio (5 mM) foram, então, adicionados e a mistura de reação é incubada por 1 h no escuro a 4ºC em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de 6,5 ul de uma solução aquosa 1 M de cisteina, A mistura foi subsequentemente submetida a UF/DF empregando Vivaspin 15R 10 kD filtradores por centrífuga para remover periodato em excesso, extintores e os — subprodutos dos mesmos.
O retentado (8,8 ml), contendo 1FIX oxidado foi misturado com 2,46 ml de uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM) e incubado por 30 min em temperatura ambiente. Então reagente amino-oxi-PSA com a MW de 20 kD
' (descrito acima) foi adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 5 ” vezes.
Esta mistura foi incubada por 2,5 h em RT no escuro em agitação suave.
O rFIX livre foi removido por meio de cromatografia de troca aniônica (AEC). A mistura de reação foi diluída com 15 ml de Tampão A (50 mM Hepes,5mM CaCl2, pH 7,5) e carregada em uma coluna 20 ml HiPrep QFF ro (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré-equilibrada com Tampão A.
À coluna foi então eluída com Tampão B (50 mM Hepes, 1 M NaCl, 5 mM CaCl2, pH 7,5). RFIX livre elui em uma condutividade entre 12-25 mS/cm e o conjugado entre 27-45 mS/cm.
A condutividade das frações contendo — conjugado foi subsequentemente elevada para 190 mS/em com Tampão C (50 mM Hepes, SM NaCl, 5 mM CaCl2, pH 6,9) e carregada em uma coluna 20 ml HiPrep Butil FF 16/10 (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré-equilibrada com Í Tampão D (50 mM Hepes, 3 M NaCl, 5 mM CaCl2, pH 6,9). O reagente livre . amino-oxi-PSA foi lavado com 5 CV Tampão D.
Subsequentemente o conjugado é eluído com 100 % Tampão E (50 mM Hepes, 5 MM CaCl2, pH 7,4). As frações contendo conjugado foram concentrados por UF/DF usando Vivaspin 15R 10 kD filtrador por centrífuga.
A etapa final de diafiltração foi realizada contra tampão histidina, pH 7,2 contendo 150 mM NaCl e 5 mM CaCl2. A preparação foi analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade cromogênica de FIX.
O conjugado PSA-rFIX apresentou uma atividade específica de > 50% em comparação ao rFIX nativo é determinada.
Método 2: 12,3 mg de rFIX são dissolvidos em Tampão L-histidina, pH 6,0 (20 mM L-histidinay 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2) para obter concentração de proteína final de 1 mg de rFIX / ml.
Uma solução aquosa 5 mM de periodato de sódio é adicionada para obter uma concentração final de 100 uM e a mistura de reação é incubada por 1 hora no escuro a 4ºC em agitação suave em pH 6,0 e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela
9% adição de uma solução aquosa 1 M de L-cisteína (ou outros reagentes de EMA extinção) para obter uma concentração final de 10 mM. A mistura é subsequentemente submetida a UF/DF empregando Vivaspin 15R 10 kD filtradores por centrífuga para remover periodato em excesso, extintores e os — subprodutos dosmesmos.
O fétentado obtido (8,8 ml), contendo rFIX oxidado, é misturado com uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM) para gerar uma concentração final de 10 mM e incubado por 30 min em temperatura ambiente. Então reagente amino-oxi-PSA com a MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 5 vezes. Esta mistura foi incubada em pH 6,0 por 2,5 horas em temperatura ambiente; 0,5 hora a 18 horas em +4ºC) no escuro em agitação suave.
' O rFIX livre é removido por meio de cromatografia de troca . aniônica (AEC). A mistura de reação é diluída com quantidades apropriadas de Tampão A (50 mM Hepes, 5 mM CaCl2, pH 7,5) para corrigir a condutividade das soluções e pH antes de carregar em uma coluna 20 ml HiPrep QFF 16/10 (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré-equilibrada com . tampão A. Então a coluna é eluída com Tampão B (50 mM Hepes, 1 M NaCl, 5 mM CaCl2, pH 7,5). RFIX livre é eluído por uma etapa gradiente usando 25 %de Tampão B, que resulta em uma condutividade entre 12-25 mS/cm na fração obtida e o conjugado usando uma etapa gradiente de 50 % Tampão B, que resulta em uma condutividade entre 27-45 mS/cm na fração do conjugado. A condutividadê do conjugado contendo fração é subsequentemente elevada para 190 mS/em com Tampão C (50 mM Hepes, 5 M NaCl,5 mM CaCl2, pH 6,9 ou pelo uso de sais anti-caotrópicos por exemplo sulfato de amônio, acetato amônio etc.) e carregada em uma coluna 20 ml HiPrep Butil FF 16/10 (GE Healthcare, Fairfield, CT ou meio comparável HIC) pré-equilibrada com Tampão D (50 mM Hepes, 3 M NaCl, ' 5 mM CaCl2, pH 6,9). O reagente livre amino-oxi-PSA é lavádo com 5 CV
Tampão D.
Subsequentemente, o conjugado é eluído com 100 % Tampão E x (50 mM Hepes, 5 mM CaCl2, pH 7,4). Os conjugados contendo frações são concentrados por UF/DF usando uma membrana de 10 kD feita de celulose regenerada (88 cm2, corte 10 kD, Millipore). A etapa final de diafiltração é — realizada contra Tampão L-histidina, pH 7,2 contendo 150 mM NaCl e 5 mM CaCl2. A preparação é analificamente caracterizada medindo proteína total (procedimento Bradford e BCA) e atividade de coagulação e cromogênica de FIX.
Para o conjugado PSA-rFIX uma atividade específica de > 50 % em comparação ao rFIX nativo é determinada.
Método 3:
25,4 mg de rFIX foram dissolvidos em 18,7 ml tampão | histidina, pH 6,0 (20 mM L-histidina, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2). 531 ul o de uma solução aquosa de periodato de sódio (5 mM) e 5,07 ml de uma
. solução aquosa de m-toluidina (50 mM) foram então adicionados.
Subsequentemente, o reagente amino-oxi-PSA com um MW de 20 kD (descrito acima) foi adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 5 vezes.
A mistura foi incubada por 2 h no escuro em temperatura ambiente em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de
25 ul de solução aquosa 1 M de cisteína.
O rFIX livre foi removido por meio de cromatografia de troca aniônica (AEC). A mistura de reação foi diluída com 20 ml Tampão A (50 mM Hepes, 5 mM CaCl2, pH 7,5) e carregada em uma coluna 20 ml HiPrep QFF 16/10 (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré-equilibrada com Tampão A.
Então a coluna foi eluída com Tampão B (50 mM Hepes, 1 M NaCl, 5 mM —CaCl2, pH7,5).rFIX livre eluiu em uma condutividade entre 12-25 mS/em e o conjugado entre 27-45 mS/cm.
A condutividade das frações contendo conjugado foi subsequentemente elevada para 190 mS/cm com Tampão C (50 mM Hepes, 5 M NaCl, 5 mM CaCl2, pH 6,9) e carregada em uma coluna 20 ml HiPrep Butil FF 16/10 (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré-equilibrada com
Tampão D (50 mM Hepes, 3 M NaCl, 5 mM CaCl2, pH 6,9). O reagente livre * amino-oxi-PSA foi lavado com 5 CV Tampão D. Subsequentemente, o conjugado foi eluído com 100 % Tampão E (50 mM Hepes, 5 mM CaCI2, pH 7,4). As frações contendo conjugado foram concentrados por UF/DF usando uma membrana de 10 kD feita de celulose regenerada (88 cm2, corte 10 kD, Millipore). A etapa final de diafiltração fóí realizada contra tampão histidina, pH 7,2 contendo 150 mM NaCl e 5 mM CaCl2. A preparação foi analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade cromogênica de FIX. Para o conjugado PSA-rFIX uma atividade específica de >50% em comparação ao 1FIX nativo foi determinada. O conjugado foi adicionalmente analiticamente caracterizado por HPLC por exclusão de tamanho usando um sistema Agilent 1200 HPLC equipado com uma coluna ' Shodex KW 803 em condições como anteriormente descrito (Kolarich et al, - Transfusion 2006;46:1959-77), Foi demonstrada que a preparação não contém FIXlivre. O conjugado consistiu de produtos 57 % mono-polisialilada e 31 % di-polisialilada e 12 % tri-polisialilada.
Método 4: 25,4 mg de rFIX foram dissolvidos em Tampão L-histidina, pH 6,0 (20 mM L-histidina, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2) para obter concentração de proteína final de 2 mg de rFIX / ml. Subsequentemente uma solução aquosa 5 mM de periodato de sódio foi adicionada em 15 minutos para gerar uma concentração final de 100 uM, seguido pela adição de uma solução aquosa 50 mM de m-toluidina para obter uma concentração final de 10 mM dentro de um período de tempo de 30 minutos. Então o reagente —amino-oxi-PSA comum MW de 20 kD (descrito acima) foi adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 5 vezes. Após correção do pH to 6,0 a mistura foi incubada por 2 h no escuro em temperatura ambiente em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de uma solução aquosa 1 M de L-cisteína para gerar uma concentração final de 10 | mM. ? O rFIX livre foi removido por meio de cromatografia de troca iônica (TEC). A mistura de reação foi diluída com quantidades apropriadas de Tampão A (50 mM Hepes, 5 mM CaCl2, pH 7,5) para corrigir a — condutividade das soluções e valores de pH antes de carregar em uma coluna 20 ml HiPrep QFF 16/10 (GE Healthcare, Fairfield, OT ) pré-equilibrada com Tampão A.
Então a coluna foi eluída com Tampão B (50 mM Hepes, 1 M NaCl, 5 MM CaCl2, pH 7,5). RFIX livre foi eluído por uma etapa gradiente usando 25 % de Tampão B, que resulta em uma condutividade entre 12-25 mS/cm na fração obtida e o conjugado usando uma etapa gradiente de 50 % | Tampão B, que resulta em uma condutividade entre 27-45 mS/cm na fração do conjugado.
A condutividade do conjugado contendo fração foi ' subsequentemente elevada para 190 mS/cm com Tampão C (50 mM Hepes, 5 . M NaCl, 5 mM CaCl2, pH 6,9; pelo uso de sais anti-caotrópicos por exemplo amônio acetato) e carregada em uma coluna 20 ml HiPrep Butil FF 16/10 (GE Healthcare, Fairfield, CT; ou meio HIC comparável) pré-equilibrada com Tampão D (50 mM Hepes, 3 M NaCl, 5 mM CaCl2, pH 6,9). O reagente livre amino-oxi-PSA foi lavado com 5 CV Tampão D.
Subsequentemente o conjugado foi eluído com 100 % Tampão E (50 mM Hepes, 5 mM CaCl2, pH 7,4). As frações contendo conjugado foram concentrados por UF/DF usando uma membrana de 10 kD feita de celulose regenerada (88 cm2, corte 10 kD, Millipore). A etapa final de diafiltração foi realizada contra Tampão L- histidina, pH 7,2 contendo 150 mM NaCl e 5 mM CaCl2. A preparação foi analiticamente caracterizada medindo proteína total (procedimento Bradford e —BCA) e atividade cromogênica e de coagulação de FIX.
Para o conjugado PSA-rFIX uma atividade específica de > 50 % em comparação ao rFIX nativo foi determinada.
O conjugado foi adicionalmente analiticamente caracterizado por HPLC por exclusão de tamanho usando um sistema Agilent 1200 HPLC equipado com uma coluna Shodex KW 803 em condições como anteriormente descrito (Kolarich et al, Transfusion 2006;46:1959-77). Foi * demonstrado que a preparação não contém FIX livre.
O conjugado consistiu de produto 57 % mono-polisialilada e 31 % di-polisialilada e 12 % tri- polisialilada.
Exemplo 12 Polisialilação de rFEVIII usando amino-md-PRALS mntolaidina como um catalisador nucleofílico Método 1: 50 mg rFVIII foi transferido em tampão de reação (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e diluído para obter uma concentração de proteína de 1 mg/ml.
À esta solução, NalIO, foi adicionado para gerar uma concentração final de 200 uM.
A oxidação foi ' realizada em RT por 30 min no escuro sob agitação suave.
Então a reação foi - extinta com cisteína (concentração final: 10 mM) por 60 min em RT.
À solução foi submetida a uma coluna IEX com um volume de 20 ml (Merck EMD TMAE (M)) que foi equilibrada com Tampão A (20 mM Hepes, 5 MM CaCl,, pH 7,0). A coluna foi equilibrada com 5 CV Tampão A.
Então o rFVIII oxidado foi eluído com Tampão B (20 mM Hepes, 5 mM CaCl,, IM NaCl, pH 7,0). As frações contendo rFVIII foram coletadas.
O teor de proteína foi determinado (Coomassie, Bradford) e ajustado para 1 mg/ml com tampão de reação e ajustado para pH 6,0 por adição sob gotej amento de 0,5 M HCl.
Então um excesso molar de 50 vezes de um reagente amino-oxi-PSA com um MW de 20 kD (descrito acima) foi adicionado seguido por m- toluidina como um catalisador nucleofílico (concentração final: 10 mM). À — reação de acoplamento foi realizada por 2 horas no escuro sob agitação suave em temperatura ambiente.
O excesso de reagente amino-oxi-PSA foi removido por meio de HIC.
A condutividade da mistura de reação foi elevada para 130 mS/cm adicionando um tampão contendo acetato de amônio (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, 8 M amônio acetato, pH 6,9) e carregada em uma coluna preenchida com 80 ml Fenil * Sepharose FF (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré-equilibrada com 50 mM Hepes, 2,5 M amônio acetato, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de | cálcio, pH 6,9. Subsequentemente, o conjugado foi eluído com 50 mM Hepes tampãopH7,5 contendo 5 mM CaCl,. Finalmente, as frações contendo PSA- rF VIII foram coletados e submetidos a UF/DF pelo uso de uma membrana a | 30 kD feita de celulose regenerada (88cm”, Millipore). A preparação foi analiticamente caracterizada medindo proteína total (Coomassie, Bradford) e atividade cromogênica de FVIII.
O conjugado PSA-rFVIII apresentou uma atividade específica de > 70% em comparação ao rFVIII nativo foi determinado.
Método 2: ' 58 mg de fator VIII recombinante (TFVIII) derivado de N processo ADVATE em tampão Hepes (50 mM HEPES, —-350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, 0,1 % Polissorbato 80, pH 7,4) são dissolvidos em tampão de reação (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 1,0 +/- 0,25 mg/ml.
Então o pH da solução é corrigido para 6,0 por adição sob gotejamento de uma solução aquosa 0,5 N de HCl.
Subsequentemente, uma | 20 solução aquosa 40 mM de periodato de sódio é adicionado dentro de 10 minutos para gerar uma concentração de 200 uM.
A reação de oxidação é | conduzida por 30 +/- 5 min em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC.
Então a reação é interrompida por adição de uma solução aquosa de L-cisteína (1 M) dentro de 15 minutos em T= +22 +/- 2ºC para gerar uma concentração —finalldel/OmMina mistura de reação e incubação por 60 +/- 5 min.
O rFVIII oxidado é ainda purificado por cromatografia de troca aniônica em EMD TMAE (M) (Merck). A mistura é diluída com Tampão A (20 mM Hepes, 5 mM CaCbhb, pH 6,5) para gerar uma condutividade de 5 ms/cm.
Esta solução é carregada na coluna TEX (altura de |
| 102 leito: 5,4 cm) com um volume de coluna de 10 ml usando uma vazão de 1,5 ' em/min.
Esta coluna é subsequentemente lavada (vazão: 1,5 cm/min) com 5 : CV de uma mistura 92:8 (p/p) de Tampão A e Tampão B (20 mM Hepes, 5 mM CaCl,, 1,0 M NaCl, pH 7,0). Então o rFVIII oxidado é eluído com uma mistura50:50(p/p)de Tampão A e Tampão B seguido por uma etapa de pós- eluição com 5 CV de Tampão B.
As etapas de eluição são conduzidas pelo Á uso de uma vazão de 1,0 cm/min.
Subsequentemente, o reagente amino-oxi-ácido polisiálico (PSA-ONH;) é adicionado em um excesso molar de 50 vezes ao eluato contendo o rFVIII oxidado purificado dentro de um período de tempo máximo (t) de 15 minutos em agitação suave.
Então uma solução aquosa de m-toluidina (50 MM) é adicionada dentro de 15 minutos para obter uma NS concentração final de 10 mM.
À mistura de reação é incubada por 120 +/- 10 . min. no escuro em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC sob agitação suave.
O conjugado PSA-rFVIII obtido é purificado por Cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) usando uma subresina baixa de Fenil Sepharose FF (GE Healthcare) empacotada em uma coluna fabricada pela GE Healthcare com uma altura de leito (h) de 15 cm e um volume de — coluna resultante (CV) de 81 ml.
A mistura de reação é concentrada com acetato amônio por adição de 50 mM Tampão Hepes, contendo 350 mM cloreto de sódio, 8 M acetato de amônio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,9. Dois volumes da mistura de reação são misturados com 1 volume de acetato de amônio contendo sistema tampão e o valor pH é corrigido para pH 6,9 por adição sob gotejamento de uma 0,5 N solução aquosa de NaOH.
Esta mistura é carregada na coluna HIC em vazão de 1 cm/min seguido por uma etapa de lavagem usando > 3 CV tampão de equilíbrio (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 2,5 M acetato de amônio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,9).
Para remoção de subprodutos de reação e sal anti-caotrópico ? uma segunda etapa de lavagem é realizada com > SCV tampão de lavagem 1 (50 mM Hepes, 3 M cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,9) em modo ascendente em uma vazão de 2 cm/min.
Então eluição de conjugado —PSA+FVII purificado é realizada em modo de fluxo descendente usando uma etapa gradiente de 40 % tampão de lavagem 2 (50 mM Hepes, 1,5 M cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,9) e 60% tampão de eluição (20mM Hepes, SmM cloreto de cálcio, pH 7,5) em uma vazão de 1 em/min.
À eluição do conjugado PSA-rFVIII é monitorado em UV 280 nm e o eluato — contendo o conjugado é coletado dentro de < 4 CV.
A etapa pós eluição é realizada com > 3 CV tampão de eluição nas mesmas condições para separar TF VIII menor e/ou não modificado do produto principal. ' Finalmente o conjugado purificado é concentrado por ultra- ó /diafiltração (UF/DF) usando uma membrana feita de celulose regenerada comum corte de peso molecular 30kD (88cm?, Millipore). Os conjugados preparados pelo uso deste procedimento são analiticamente — caracterizados —medindo proteína total, atividade e determinação cromogênica de FVIII do grau de polisialiação medindo o teor de PSA (ensaio Resorcinol). Para o conjugado obter uma atividade específica de>50%eumgraudePSA> 5,0 é calculado.
Método 3: 50 mg rF VIII foram transferidos em tampão de reação (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e diluído para obter uma concentração de proteína de 1 mg/ml.
Um excesso molar de reagente de 50 vezes de amino-oxi-PSA com um MW de 20 kD (descrito | acima) foi adicionado seguido por m-toluidina como um catalisador | nucleofílico (concentração final: 10 mM) e NalIO, (concentração final: 400 UM). A reação de acoplamento foi realizada por 2 horas no escuro sob agitação suave em temperatura ambiente.
Subsequentemente, a reação foi
| 104 extinta com cisteína por 60 min em RT (concentração final: 10 MM). Então a ? condutividade da mistura de reação foi elevada para 130 mS/cm adicionando um tampão contendo acetato de amônio (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, 8 M acetato de amônio, pH 6,9) e carregada em uma coluna preenchida com 80 ml Fenil Sepharose FF (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré-equilibrada com 50 mM Hepes, 2,5 M acetato de amônio, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, 0,01 % Tween 80, pH 6,9. ] Subsequentemente, o conjugado foi eluído com 50 mM Hepes, 5 mM de cloreto de cálcio, pH 7,5. Finalmente, as frações contendo PSA-rF VIII foram | 10 — coletados e submetidos a UF/DF pelo uso de uma membrana de 30 kD feita de celulose regenerada (88cm?, Millipore). A preparação foi analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade cromogênica de FVIII.
Para o conjugado PSA-tFVIII uma atividade específica de > 70% em “ comparação ao rF VIII nativo foi determinado.
Método 4: 50 mg fator VIII recombinante (rF VIII) derivado de processo ADVATE em 50 mM Tampão Hepes (50 mM HEPES, —-350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, 0,1 % Polissorbato 80, pH 7,4) foram dissolvidos em tampão de reação (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 “mM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 1,0 +/- 0,25 mg/ml.
Então o pH da solução foi corrigido para 6,0 por adição sob gotejamento de uma solução aquosa 0,5 N de HCl.
Subsequentemente, o reagente amino-oxi-ácido polisiálico (PSA-ONHD2) foi adicionado em um excesso molar de 50 vezes a esta solução —derFVIM dentro de um período de tempo máximo (t) de 15 minutos em agitação suave.
Então uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM) foi adicionada em 15 minutos para obter uma concentração final de 10 mM.
Finalmente, uma solução aquosa 40 mM de periodato de sódio foi adicionada para gerar uma concentração de 400 uM. |
A mistura de reação foi incubada por 120 +/- 10 min. no . escuro em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC sob agitação suave. Então a reação foi interrompida pela adição de uma solução aquosa de L-cisteína (1 M) para gerar uma concentração final de 10 mM na mistura de reação e —incubaçãopor60+/-5 min.
O conjugado PSA-«FVIII obtido foi purificado por Cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) usando uma subresina baixa de Fenil Sepharose FF (GE Healthcare) empacotada em uma coluna fabricada pela GE Healthcare com uma altura de leito (h) de 15 cm e um volume de — coluna resultante (CV) de 81 ml. A mistura de reação foi concentrada com acetato de amônio por adição de 50 mM Tampão Hepes, contendo 350 mM cloreto de sódio, 8 S M acetato de amônio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,9. Dois volumes da - mistura de reação foi misturado com 1 volume de acetato de amônio contendo sistema tampão e o valor de pH foi corrigido para pH 6,9 por adição em gotejamento de uma solução aquosa de 0,5 N de NaOH. Esta mistura foi carregada na coluna HIC usando uma vazão de 1 cm/min seguido por uma etapa de lavagem usando > 3CV tampão de equilíbrio (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 2,5 M acetato de amônio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,59.
Para remoção de subprodutos de reação e sal anti-caotrópico uma segunda etapa de lavagem foi realizada com > SCV tampão de lavagem 1 (50 mM Hepes, 3 M cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,9) em modo ascendente em uma vazão de 2 cm/min. Então eluição de conjugado de —rFVIM purificado foi realizada em modo de fluxo descendente usando uma etapa gradiente de 40 % tampão de lavagem 2 (50 mM Hepes, 1,5 M cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,9) e 60 % tampão de eluição (20 mM Hepes, 5 mM cloreto de cálcio, pH 7,5) em uma vazão de 1 ecm/min. À eluição do conjugado PSA-rFVIII foi monitorada em UV 280 nm e o eluato
| 106 contendo o conjugado foi coletado dentro de <4 CV, A etapa pós eluição foi " realizada com > 3 CV tampão de eluição nas mesmas condições para separar rF VIII menor modificado e/ou não modificado a partir do produto principal.
Finalmente, o conjugado purificado foi concentrado por ultra- /diafiltração (UF/DF) usando uma membrana feita de celulose regenerada com um corte de peso molecular 30kD (88cm2, Millipore). Os conjugados preparados pelo uso deste procedimento foram | | analiticamente — caracterizados “medindo proteína total, atividade e | determinação cromogênica de FVIII do grau de polisialiação medindo o teor —dePSA (ensaio Resorcinol). Dados analíticos (média de 6 lotes consecutivos): Rendimento do processo (Bradford): 58,9% Rendimento do processo (FVIII chrom.): 46,4% - Atividade específica: (FVIII chrom. / mg proteína): 4148 IU/mg Atividade específica (% de material de partida): 79,9 % Grau de PSA (mol/mol): 8,1. Exemplo 13 Peguilação de r FVIII usando um reagente amino-oxi-PEG e —m-toluidinacomo um catalisador nucleofilico Método 1: TFVIII é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é o Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). 14,7 mg rFVIII —édissolvidoem 7,0 ml tampão histidina, pH 6,0 (20 mM L-histidina, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2). Então 296 ul de uma solução aquosa de periodato de sódio (5 mM) é adicionado e a mistura de reação é incubada por 1 h no escuro a 4ºC em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição dé 7,5 ul de uma solução aquosa de 1 M de cisteína.
A mistura foi
| 107 subsequentemente submetida a UF/DF empregando Vivaspin 15R 10 kD " filtradores por centrífuga para remover periodato em excesso, extintores e os subprodutos dos mesmos.
O retentado (10,9 ml), contendo rFVIII oxidado, é misturado com2,94mlde uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM) e incubado por A ” 30 min em temperatura ambiente.
Então reagente amino-oxi-PEG com um MW de 20 kD é adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 5 vezes.
Esta mistura foi incubada por 2,5 h em temperatura ambiente no escuro em agitação suave. | Finalmente, o conjugado PEG-rFVIII é purificado por cromatografia de troca iônica em Q Sepharose FF. 1,5 mg proteína/ml gel é | carregada em uma coluna equilibrada com 50 mM Tampão Hepes, pH 7,4 | ] contendo 5 mM CaCl2. O conjugado é eluído com 50 mM Tampão Hepes | - contendo 5 mM CaCl2 and 500 mM cloreto de sódio, pH 7,4 e é então submetido a UF/DF usando uma membrana 30 kD (50cm2, Millipore). À preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (Coomassie, Bradford) e atividade cromogênica de FVIII.
É esperado que o conjugato PEG+FVIII irá demonstrar uma atividade específica de >70% em | comparação ao rF VIII nativo foi determinado. | Método 2: rFVIII é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). Um peso ou concentração inicial de rF VIII é dissolvido em ou transferido a um tampão de —reação(50mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 MM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 1,0 +/- 0,25 mg/ml.
Então o pH da solução é corrigido para 6,0 por adição sob gotejamento de uma solução aquosa 0,5 N de HCl.
Subsequentemente uma solução aquosa 40 mM de periodato de sódio é adicionado dentro de 10 minutos para gerar uma
| concentração de 200 uM. A reação de oxidação é conduzida por 30 +/-5 min ' em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC. Então a reação é interrompida por adição de uma solução aquosa de L-cisteína (1 M) dentro de 15 minutos em T= +22 +/- 2ºC para gerar uma concentração final de 10 mM em uma —misturade reação e incubação por 60 +/- 5 min. Ó O rFVIII oxidado é ainda purificado por cromatografia de troca aniônica em EMD TMAE (M) (Merck). A mistura é diluída com Tampão A (20 mM Hepes, 5 mM CaCl2, pH6,5) para gerar uma condutividade de 5 ms/cm. Esta solução é carregada na coluna IEX (altura de leito: 5,4 cm) com um volume de coluna de 10 ml usando uma vazão de 1,5 cem/min. Esta coluna é subsequentemente lavada (vazão: 1,5 cm/min) com 5 CV de uma mistura 92:8 (p/p) de Tampão A e Tampão B (20 mM Hepes, 5 ' mM CaCl2, 1,0 M NaCl, pH 7,0). Então o rFVIII oxidado é eluído com uma - mistura 50:50 (p/p) de Tampão A e Tampão B seguido por uma etapa de pós- —eluiçãocom 5 CV de Tampão B. As etapas de eluição são conduzidas pelo uso de uma vazão de 1,0 cm/min.
Subsequentemente, o reagente amino-oxi-PEG com um MW de reagente de 20 kD é adicionado em um excesso molar de 50 vezes ao eluato contendo o rFVIII oxidado purificado dentro de um período de tempo máximo (t)de1l5 minutos em agitação suave. Então uma solução aquosa de m-toluidina (S0 MM) é adicionada dentro de 15 minutos para obter uma concentração final de 10 mM. A mistura de reação é incubada por 120 +/- 10 min. no escuro em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC sob agitação suave.
O conjugado PEG-rFVIII obtido é purificado por Cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) usando uma subresina baixa de Fenil Sepharose FF (GE Healthcare) empacotada em uma coluna fabricada pela GE Healtheare com uma altura de leito (h) de 15 em e um volume de coluna resultante (CV) de 81 ml.
A mistura de reação é concentrada com acetato de amônio por ] adição de 50 mM Tampão Hepes, contendo 350 mM cloreto de sódio, 8 M acetato de amônio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,9. Dois volumes da mistura de reação são misturados com | volume de acetato de amônio contendo sistema tampão e o valor de pH é corrigido para pH 6,9 por adição sob gotejamento de uma solução aquosa de 0,5 N de NaOH. Esta mistura é carregada na coluna HIC usando uma vazão de 1 cm/min seguido por uma etapa de lavagem usando > 3 CV tampão de equilíbrio (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 2,5 M acetato de amônio, 5 mM cloreto de cálcio, pH
69. | Para remoção de subprodutos de reação e sal anti-caotrópico uma segunda etapa de lavagem é realizada com > SCV tampão de lavagem 1 i (50 mM Hepes, 3 M cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,9) em . modo ascendente em uma vazão de 2 cm/min. Então eluição de conjugado de rFVII purificado é realizada em modo de fluxo descendente usando uma etapa gradiente de 40 % tampão de lavagem 2 (50 mM Hepes, 1,5 M cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,9) e 60 % tampão de eluição (20OmM Hepes, 5SmM cloreto de cálcio, pH 7,5) em uma vazão de 1em/min. A eluição do de conjugado PEG-rTFVIII é monitorado em UV 280 nm e o eluato contendo o conjugado é coletado dentro de < 4 CV. A etapa pós eluição é realizada com > 3 CV tampão de eluição nas mesmas condições para separar rF VII modificado menor e/ou não modificado do produto principal.
Finalmente, o conjugado purificado é concentrado por ultra- /diafiltração (UF/DF) usando uma membrana feita de celulose regenerada comum corte de peso molecular 30kD (Millipore).
Os conjugados preparados pelo uso deste procedimento são analiticamente caracterizados medindo proteína total e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Método 3:
TF VIII é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de : 20 kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). 7,84 mg rFVIII, dissolvido em 6 ml Tampão Hepes (50 mM Hepes, 150 mM cloreto de sódio, 5mM cloreto de cálcio, PH 6,0) são misturados com 314 ul de uma solução aquosa de periodato de sódio (10 mM), e 1,57 ml de uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM). Subsequentemente o reagente amino-oxi é adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 20 vezes.
A mistura é incubada por 2 h no escuro em temperatura ambiente em agitação suave e extinta por min em temperatura ambiente pela adição de 8 ul de solução aquosa de | cisteina (1 M). : Finalmente o conjugato PEG-FVIII é purificado por ' cromatografia de troca iônica em Q-Sepharose FF. 1,5 mg proteína/ml gel é . carregada em uma coluna pré equilibrada com 50 mM Tampão Hepes, pH 7,4 15 contendo 5 mM CaCbhb7. O conjugado é eluído com 50 mM Tampão Hepes contendo 5 mM CaCl, and 500 mM cloreto de sódio, pH 7,4 e é então submetido a UF/DF usando uma membrana 30 kD (88em, Millipore). À caracterização analítica do conjugado por ensaio cromogênico FVIII e | determinação de proteína total (Bradford) mostra uma atividade específica de >60% comparado ao material de partida rF VIII.
Método 4: rFVIII é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). Uma — concentração inicial ou peso de rFVIII is é transferida ou dissolvida em | Tampão Hepes (50 mM Hepes, 150 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de | cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 2 mg rFVIII / ml.
Subsequentemente, uma solução aquosa 5 mM de periodato de sódio é adicionada dentro de 15 minutos para gerar uma concentração final de
| mm 100 uM, seguido pela adição de uma solução aquosa 50 mM de m-toluidina ' para obter uma concentração final de 10 mM dentro de um período de tempo de 30 minutos. Então o reagente amino-oxi-PEG com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado para gerar um excesso molar de 20 vezes. Após —correçãodopHa6,0a mistura é incubada por 2 h no escuro em temperatura ambiente em agitação suave e extifta | por 15 min em temperatura ambiente pela adição de uma solução aquosa | M de L-cisteína para gerar uma concentração final de 10 MM.
O rFVIII livre é removido por meio de cromatografia de troca iônica(IEC). A mistura de reação foi diluída com quantidades apropriadas de Tampão A (50 mM Hepes, 5 mM CaCl2, pH 7,5) para corrigir a | condutividade das soluções e valor de pH antes de carregar em uma coluna 20 ml HiPrep QFF 16/10 (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré-equilibrada com . Tampão A. Então a coluna foi eluída com Tampão B (50 mM Hepes, 1 M NaCl,5mM CaCl2, pH 7,5). RFVIII livre foi eluído por uma etapa gradiente usando 25 % de Tampão B, que resulta em uma condutividade entre 12-25 mS/cm na fração obtida e o conjugado usando uma etapa gradiente de 50 % Tampão B, que resulta em uma condutividade entre 27-45 mS/cm na fração do conjugado. A condutividade do conjugado contendo fração é — subsequentemente elevada com Tampão C (50 mM Hepes, SM NaCl, 5 mM CaCl2, pH 6,9; pelo uso de sais anti-caotrópicos por exemplo acetato de amônio, sulfato de amônio etc.) e carregada em uma coluna 20 ml HiPrep Butil FF 16/10 (GE Healthcare, Fairfield, CT; ou meio HIC comparável) pré- equilibrada com Tampão D (50 mM Hepes, 3 M NaCl, 5 mM CaCl2, pH 6,9). — Reagente livre de PEG foi lavado com 5 CV Tampão D. Subsequentemente, o conjugado foi eluído com 100 % Tampão E (50 mM Hepes, 5 mM CaCl2, pH 7,4). As frações contendo conjugado são concentradas por UF/DF usando uma membrana de 10 kD feita de celulose regenerada (88 cm2, corte 10 kD, Millipore). A etapa final de diafiltração é realizada contra tampão Hepes
(50 mM Hepes, 5 mM CaCl2, pH 7,5). | A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (procedimento Bradford e BCA) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos.
Exemplo 14 Polisialilação de rFVIIa usando ammino-oxt-PSA, e m-toluíidina como um catalisador nucleofílico Método 1: Uma concentração inicial ou peso de fator VIIa recombinante (TFVIIa) é transferida ou dissolvida em tampão de reação (50 mM Hepes, 350 | mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 1,0 +/- 0,25 mg/ml.
Então o pH da solução é corrigido para 6,0 por adição sob gotejamento de uma solução aquosa 0,5 N - de NaOH.
Subsequentemente, uma solução aquosa 40 mM de periodato de sódio é adicionado dentro de 10 minutos para gerar uma concentração de 50 uM.
A reação de oxidação é conduzida por 30 +/- 5 min em uma temperatura (D) de T= +22 +/- 2ºC.
Então a reação é interrompida por adição de uma solução aquosa de L-cisteína (1 M) dentro de 15 minutos em T= +22 +/- 2ºC para gerar uma concentração final de 10 mM em uma mistura de reação e incubação por 60 +/-5 min.
O r1FVIla oxidado é ainda purificado por cromatografia de troca aniônica em EMD TMAE (M) (Merck). A mistura é diluída com Tampão A (20 mM Hepes, 5 mM CaCl,, pH6,5) para gerar uma condutividade de 5 ms/cm.
Esta solução é carregada na coluna IEX (altura de leito: 5,4 cm) com um volume de coluna de 10 ml usando uma vazão de 1,5 cm/min.
Esta coluna é subsequentemente lavada (vazão: 1,5 em/min) com 5 CV de uma mistura 92:8 (p/p) de Tampão A e Tampão B (20 mM Hepes, 5 mM CaCl,, 1,0 M NaCl, pH 7,0). Então o rFVITa oxidado é eluído com uma mistura 50:50 (p/p) de Tampão A e Tampão B seguido por uma etapa de pós-
eluição com 5 CV de Tampão B.
As etapas de eluição são conduzidas pelo uso de uma vazão de 1,0 cm/min.
Subsequentemente, o reagente amino-oxi-ácido polisiálico (PSA-ONH) é adicionado em um excesso molar de 50 vezes ao eluato | 5 contendo o 1IFVIla oxidado purificado dentro de um período de tempo máximo (t) de 15 minutos em agitação suave.
Então uma Solução aquosa de m-toluidina (50 mM) é adicionada dentro de 15 minutos para obter uma concentração final de 10 mM.
A mistura de reação é incubada por 120 +/- 10 | min. no escuro em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC sob agitação suave.
O conjugado PSA-FVIla obtido é purificado por Cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) usando uma subresina baixa de Fenil Sepharose FF (GE Healthcare) empacotada em uma coluna fabricada “ pela GE Healthcare com uma altura de leito (h) de 15 em e um volume de coluna resultante(CV) de 81 ml. | A mistura de reação é concentrada com acetato de amônio por adição de 50 mM Tampão Hepes, contendo 350 mM cloreto de sódio, 8 M acetato de amônio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,9. Dois volumes da mistura | de reação são misturados com 1 volume de acetato de amônio contendo | sistema tampão e o valor de pH é corrigido para pH 6,9 por adição sob | gotejamento de uma solução aquosa de 0,5 N de NaOH.
Esta mistura é | carregada na coluna HIC usando uma vazão de 1 cm/min seguido por uma etapa de lavagem usando > 3 CV tampão de equilíbrio (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 2,5 M acetato de amônio, 5 mM cloreto de cálcio, pH | 69). | Para remoção de subprodutos de reação e sal anti-caotrópico uma segunda etapa de lavagem é realizada com > 5SCV tampão de lavagem 1 (50 mM Hepes, 3 M cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,9) em modo ascendente em uma vazão de 2 cm/min.
Então eluição de conjugado rFVITa purificado é realizada em modo de fluxo descendente usando uma ' etapa gradiente de 40 % tampão de lavagem 2 (50 mM Hepes, 1,5 M cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,9) e 60 % tampão de eluição (20OmM Hepes, 5SmM cloreto de cálcio, pH 7,5) em uma vazão de 1 cm/min.
A eluição — do conjugadoPSA-rFVIIa é monitorado em UV 280 nm e o eluato contendo o conjugado é coletado dentro de < 4 CV.
A etapa pós eluição é realizada com > 3 CV tampão de eluição nas mesmas condições para separar rFVIJa menor e/ou não modificado do produto principal.
Finalmente, o conjugado purificado é concentrado por ultra- /diafiliração (UF/DF) usando uma membrana feita de celulose regenerada com um corte de peso molecular apropriado (por exemplo, 10 kD MWCO, 88em”, Millipore). : O conjugado preparado pelo uso deste procedimento é . analiticamente caracterizada medindo proteína total, atividade biológica, e determinação de grau de polisialiação medindo o teor de PSA (ensaio resorcinol). Método 2: Um peso ou concentração inicial de rFVIIa é dissolvido em ou transferido a um tampão de reação (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5mM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 1,0 +/- 0,25 mg/ml.
Então, o pH da solução é corrigido para 6,0 por adição sob gotejamento de uma solução aquosa 0,5 N de NaOH.
Subsequentemente, o reagente amino-oxi-ácido polisiálico (PSA-ONH;) é adicionado em um excesso molar de 50 vezes a esta solução —rFVIladentrode um período de tempo máximo (t) de 15 minutos em agitação suave.
Então uma solução aquosa de m-toluidina (SOMM) é adicionada dentro de 15 minutos para obter uma concentração final de 10 mM.
Finalmente uma solução aquosa 40 mM de periodato de sódio é adicionado para gerar uma concentração de 150 uM.
A mistura de reação é incubada por 120 +/- 10 min. no escuro em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC sob agitação suave. Então a reação é interrompida pela adição de uma solução aquosa de L-cisteina (1 M) para gerar uma concentração final de 10 mM em uma mistura de reação e incubação por60+/-5min. O conjugado PSA-rFVIla obtido é purificado por é o Cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) usando uma subresina baixa de Fenil Sepharose FF (GE Healthcare) empacotada em uma coluna fabricada pela GE Healthcare com uma altura de leito (h) de 15 cm e um volume de — coluna resultante (CV) de 81 ml. A mistura de reação é concentrada com acetato de amônio por | adição de 50 mM Tampão Hepes, contendo 350 mM cloreto de sódio, 8 M ' acetato de amônio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,9. Dois volumes da mistura . de reação são misturados com 1 volume de acetato de amônio contendo sistema tampão e o valor de pH é corrigido para pH 6,9 por adição em gotejamento de uma solução aquosa de 0,5 N de NaOH. Esta mistura é carregada na coluna HIC usando uma vazão de 1 cm/min seguido por uma etapa de lavagem usando > 3CV tampão de equilíbrio (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 2,5 M acetato de amônio, 5 mM cloreto de cálcio, pH
69. Para remoção de subprodutos de reação e sal anti-caotrópico uma segunda etapa de lavagem é realizada com > SCV tampão de lavagem 1 (50 mM Hepes, 3 M cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,9) em modo ascendente em uma vazão de 2 cm/min. Então eluição de conjugado —1FVIla purificado é realizada em modo de fluxo descendente usando uma etapa gradiente de 40 % tampão de lavagem 2 (50 mM Hepes, 1,5 M cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,9) e 60 % tampão de eluição (2OmM Hepes, SmM cloreto de cálcio, pH 7,5) em uma vazão de 1 cm/min. A eluição do conjugado PSA-rFVIIa é monitorado em UV 280 nm e o eluato contendo o conjugado foi coletado dentro de <4 CV.
A etapa pós eluição é realizada com ] > 3 CV tampão de eluição nas mesmas condições para separar rFVIII modificado menor e/ou não modificado do produto principal.
Finalmente, o conjugado purificado é concentrado por ultra- /diafiltração (UF/DF) usando uma membrana feita de celulose regenerada (Millipore). Os conjugados preparados pelo uso deste procedimento são analiticamente caracterizados medindo proteína total, atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica, e determinação de grau de —polisialiação medindo o teor de PSA (ensaio Resorcinol). Exemplo 15 Peguilação de rFIX usando um reagente amino-oxi-PEG e m- ' toluidina como um catalisador nucleofilico - Método 1: rFIX é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). Um peso ou concentração inicial de rFIX é dissolvido em ou transferido à um tampão de reação (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 MM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 1,0 +/- 0,25 mg/ml.
Então o pH da solução é corrigido para 6,0 por adição sob gotejamento de uma solução aquosa 0,5 N de HCI.
Subsequentemente, uma solução aquosa 40 mM de periodato de sódio é adicionado dentro de 10 minutos para gerar uma concentração de 200 uM.
A reação de oxidação é conduzida por 30 +/- 5 min em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC.
Então a reação é interrompida por adição de uma solução aquosa de L-cisteína (1 M) dentro de 15 minutos em T= +22 +/- 2ºC para gerar uma concentração final de 10 mM em uma mistura de reação e incubação por 60 +/- 5 min.
O rFVIII oxidado é ainda purificado por cromatografia de
117 | troca aniônica em EMD TMAE (M) (Merck). A mistura é diluída com ' Tampão A (20 mM Hepes, 5 mM CaCl2, pH6,5) para gerar uma condutividade de 5 mS/cm.
Esta solução é carregada na coluna IEX (altura de | leito: 5,4 cm) com um volume de coluna de 10 ml usando uma vazão de 1,5 cm/min Esta coluna é subsequentemente lavada (vazão: 1,5 cm/min) com 5 | CV de uma mistura 92:8 (p/p) de Tampão A e Tampão B (20 mM Hepes, 5 MM CaCl2, 1,0 M NaCl, pH 7,0). Então o rFIX oxidado é eluído com uma Í mistura 50:50 (p/p) de Tampão A e Tampão B seguido por uma etapa de pós- ' eluição com 5 CV de Tampão B.
As etapas de eluição são conduzidas pelo —usode uma vazão de 1,0 cm/min.
Subsequentemente, o reagente amino-oxi-PEG com um MW de 20 kD é adicionado em um excesso molar de 50 vezes ao eluato contendo " o rFIX oxidado purificado dentro de um período de tempo máximo (t) de 15 - minutos em agitação suave.
Então uma solução aquosa de m-toluidina (50mM) é adicionada dentro de 15 minutos para obter uma concentração final de 10 mM.
A mistura de reação é incubada por 120 +/- 10 min. no escuro em uma temperatura (T) de T=+22 +/- 2ºC sob agitação suave.
O conjugado PEG-rFIX obtido é purificado por Cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) usando uma subresina baixa de Fenil —SepharoseFF (GE Healthcare) empacotada em uma coluna fabricada pela GE Healthcare com uma altura de leito (h) de 15 cm e um volume de coluna resultante (CV) de 81 ml.
A mistura de reação é concentrada com acetato de amônio por adição de 50 mM Tampão Hepes, contendo 350 mM cloreto de sódio, 8 M | — acetato de amônio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,9. Dois volumes da mistura de reação são misturados com 1 volume de acetato de amônio contendo ] sistema tampão e o valor de pH é corrigido para pH 6,9 por adição sob gotejamento de uma solução aquosa de 0,5 N de NaOH.
Esta mistura é carregada na coluna HIC usando uma vazão de 1 cm/min seguido por uma etapa de lavagem usando > 3 CV tampão de equilíbrio (50 mM Hepes, 350 ' mM cloreto de sódio, 2,5 M acetato de amônio, 5 mM cloreto de cálcio, pH | 6,9). Para remoção de subprodutos de reação e sal anti-caotrópico uma segunda etapa de lavagem é realizada com > SCV tampão de lavagem 1 (50 mM Hepes, 3 M cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,9) em modo ascendente em uma vazão de 2 cm/min.
Então eluição de conjugado 1FIX purificado é realizada em modo de fluxo descendente usando uma etapa | gradiente de 40 % tampão de lavagem 2 (50 mM Hepes, 1,5 M cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,9) e 60 % tampão de eluição (20 mM Hepes, 5 mM cloreto de cálcio, pH 7,5) em uma vazão de 1 cm/min.
À eluição do conjugado PEG-rFIX é monitorado em UV 280 nm e o eluato : contendo o conjugado é coletado dentro de < 4 CV.
A etapa pós eluição é - realizada com > 3 CV tampão de eluição nas mesmas condições para separar —rFIX menor e/ou não modificado do produto principal.
Finalmente, o conjugado purificado é concentrado por ultra- /diafiltração (UF/DF) usando uma membrana feita de celulose regenerada com um corte de peso molecular 10kD (88cm2, Millipore). Os conjugados preparados pelo uso deste procedimento são —analiticamente caracterizados medindo proteína total e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Método 2: TFIX é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é —Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). Uma concentração inicial ou peso de rFIX é transferida ou dissolvida em Tampão Hepes (50 mM Hepes, 150 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 2 mg de rFIX / ml.
Subsequentemente, uma solução aquosa 5 mM de periodato de sódio é adicionada dentro de 15 minutos para gerar uma concentração final de ' 100 uM, seguido pela adição de uma solução aquosa 50 mM de m-toluidina para obter uma concentração final de 10 mM dentro de um período de tempo de 30 minutos.
Então o reagente amino-oxi-PEG com um MW de 20 kD — (descrito acima) é adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 20 vezes.
Após correção do pH a 6,0 a mistura é incubada por 2 h no escuro em temperatura ambiente em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de uma solução aquosa 1 M de L-cisteína para gerar uma concentração final de 10 mM.
O rFIX livre é removido por meio de cromatografia de troca iônica (TEC). A mistura de reação foi diluída com quantidades apropriadas de Tampão A (50 mM Hepes, 5 mM CaCl2, pH 7,5) para corrigir a condutividade das soluções e valor de pH antes de carregar em uma coluna 20 í ml HiPrep QFF 16/10 (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré-equilibrada com Tampão A.
Então a coluna foi eluída com Tampão B (50 mM Hepes, | M NaCl, 5 mM CaCl2, pH 7,5). RFIX livre foi eluído by uma etapa gradiente usando 25 % de Tampão B, que resulta em uma condutividade entre 12- 25 mS/cm na fração obtida e o conjugado usando uma etapa gradiente de 50 % Tampão B, que resulta em uma condutividade entre 27-45 mS/cm na fração do conjugado.
A condutividade do conjugado contendo fração é subsequentemente elevado com Tampão C (50 mM Hepes, 5 M NaCl, 5 mM CaCl2, pH 6,9; pelo uso de sais anti-caotrópicos por exemplo acetato de amônio, etc) e carregada em uma coluna 20 ml HiPrep Butil FF 16/10 (GE Healthcare, Fairfield, CT; ou meio HIC comparável) pré-equilibrada com | —Tampão D (50mM Hepes, 3 M NaCl, 5 mM CaCl2, pH 6,9). O reagente | amino-oxi-PEG livre foi lavado com 5 CV Tampão D.
Subsequentemente, o | conjugado foi eluído com 100 % Tampão E (50 mM Hepes, 5 mM CaCl2, pH 7,4). As frações contendo conjugado são concentradas por UF/DF usando uma membrana de 10 kD feita de celulose regenerada (88 cm2, corte 10 kD,
| DM 120 Millipore). A etapa final de diafiltração é realizada contra tampão Hepes ' (50 mM Hepes, 5 mM CaCl2, pH 7,5). A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (procedimento Bradford e BCA) e atividade biológica de acordo com
1. 5 — métodos conhecidos. Exemplo 16 Peguilação de rFVIla usando um reagente amino-oxi-PEG e | m-toluidina como um catalisador nucleofílico | Método 1: rFVIIa é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de | 20 kD contendo um grupo amino-oxi. Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). Um peso ou concentração inicial de rFVIJa é dissolvido em ou transferido a um tampão de | reação (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH | 6,0) para obter concentração de proteína final de 1,0 +/- 0,25 mg/ml. Então o pH da solução é corrigido para 6,0 por adição sob gotejamento de uma solução aquosa 0,5 N de NaOH. Subsequentemente, uma solução aquosa 40 mM de periodato de sódio é adicionado dentro de 10 minutos para gerar uma concentração de 50 uM. A reação de oxidação é conduzida por 30 +/- 5 min em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC. Então a reação é interrompida por adição de uma solução aquosa de L-cisteína (1 M) dentro de 15 minutos em T= +22 +/- 2ºC para gerar uma concentração final de 10 MM em uma mistura de reação e incubação por 60 +/- 5 min. O rFVIla oxidado é ainda purificado por cromatografia de — troca aniônica em EMD TMAE (M) (Merck). A mistura é diluída com Tampão A (20 mM Hepes, 5 mM CaCl2, pH6,5) para gerar uma condutividade de 5 mS/cm. Esta solução é carregada na coluna IEX (altura de leito: 5,4 cm) com um volume de coluna de 10 ml usando uma vazão de 1,5 em/min. Esta coluna é subsequentemente lavada (vazão: 1,5 cm/min) com 5
CV de uma mistura 92:8 (p/p) de Tampão A e Tampão B (20 mM Hepes, 5 ' mM CaCl2, 1,0 M NaCl, pH 7,0). Então o rFVIIa oxidado é eluída com uma mistura 50:50 (p/p) de Tampão A e Tampão B seguido por uma etapa de pós- eluição com 5 CV de Tampão B.
As etapas de eluição são conduzidas pelo usodeuma vazão de 1,0 cm/min. s Subsequentemente, o reagente amino-oxi-PEG com um MW de 20 kD reagent é adicionado em um excesso molar de 50 vezes ao eluato contendo o rFVIla oxidado purificado dentro de um período de tempo | máximo (t) de 15 minutos em agitação suave.
Então uma solução aquosa de m-toluidina (SOmMM) é adicionada dentro de 15 minutos para obter uma concentração final de 10 mM.
A mistura de reação é incubada por 120 +/- 10 min. no escuro em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC sob agitação suave. | O conjugado PEG-rFVIla obtido é purificado por Cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) usando uma subresina baixa de Fenil Sepharose FF (GE Healthcare) empacotada em uma coluna fabricada pela GE Healthcare com uma altura de leito (h) de 15 cm e um volume de coluna resultante (CV) de 81 ml.
A mistura de reação é concentrada com acetato de amônio por adiçãode50mM Tampão Hepes, contendo 350 mM cloreto de sódio, 8 M acetato de amônio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,9. Dois volumes da mistura de reação são misturados com | volume de acetato de amônio contendo sistema tampão e o valor de pH é corrigido para pH 6,9 por adição sob gotejamento de uma solução aquosa de 0,5 N de NaOH.
Esta mistura é — carregada na coluna HIC usando uma vazão de 1 cm/min seguido por uma etapa de lavagem usando > 3 CV tampão de equilíbrio (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 2,5 M acetato de amônio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,9). Para remoção de subprodutos de reação e sal anti-caotrópico ]
uma segunda etapa de lavagem é realizada com > SCV tampão de lavagem 1 ' (50 mM Hepes, 3 M cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,9) em modo ascendente em uma vazão de 2 cm/min. Então eluição de conjugado rFVIla purificado é realizada em modo de fluxo descendente usando uma etapa gradiente de 40% tampão de lavagem 2 (50 mM Hepes, 1,5 M cloreto de sódio, : 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,9) e 60 % tampão de eluição (20 mM Hepes, 5 mM cloreto de cálcio, pH 7,5) em uma vazão de 1 ecm/min. À eluição de o conjugado PEG-rFVIIa é monitorado em UV 280 nm e o eluato contendo o conjugado é coletado dentro de < 4 CV. A etapa pós eluição é realizada com > 3 CV tampão de eluição nas mesmas condições para separar rFVIIa menor e/ou não modificado do produto principal.
Finalmente, o conjugado purificado é concentrado por ultra- /diafiltração (UF/DF) usando uma membrana feita de celulose regenerada com um corte de peso molecular 10kD (Millipore).
Os conjugados preparados pelo uso deste procedimento são analiticamente caracterizados medindo proteína total e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Método 2: rFVIJa é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20kD contendo um grupo amino-oxi. Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). Uma concentração inicial ou peso de rF VIIa é transferida ou dissolvida em Tampão Hepes (50 mM Hepes, 150 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 2 mg rFVIla / ml.
—Subsequentemente uma solução aquosa 5 mM de periodato de sódio é adicionado dentro de 15 minutos para gerar uma concentração final de 100 uM, seguido pela adição de uma solução aquosa 50 mM de m-toluídina para obter uma concentração final de 10 mM dentro de um período de tempo de 30 minutos. Então o reagente amino-oxi-PEG com um MW de 20 kD i (descrito acima) é adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 20 ' vezes. Após correção do pH a 6,0 a mistura é incubada por 2 h no escuro em temperatura ambiente em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de uma solução aquosa 1 M de Lr-cisteína para gerar umaconcentração final de 10 MM.
ova livre é removido por meio de cromatografia de troca iônica (TEC). A mistura de reação foi diluída com quantidades apropriadas de Tampão A (50 mM Hepes, 5 mM CaCl2, pH 7,5) para corrigir a condutividade das soluções e valor de pH antes de carregar em uma coluna 20 ml HiPrep QFF 16/10 (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré-equilibrada com Tampão A. Então a coluna foi eluída com Tampão B (50 mM Hepes, 1 M NaCl, 5 mM CaCL2, pH 7,5). rFVIJa livre foi eluído por uma etapa gradiente usando 25 % de Tampão B, que resulta em uma condutividade entre 12-25 mS/cm na fração obtida e o conjugado usando uma etapa gradiente de 50 % 15º Tampão B, que resulta em uma condutividade entre 27-45 mS/cm na fração do conjugado. À condutividade do conjugado contendo fração é subsequentemente elevado com Tampão C (50 mM Hepes, 5 M NaCl, 5 mM CaCl2, pH 6,9; pelo uso de sais anti-caotrópicos por exemplo acetato de amônio) e carregada em uma coluna 20 ml HiPrep Butil FF 16/10 (GE Healthcare, Fairfield, CT; ou meio HIC comparável) pré-equilibrada com Tampão D (50 mM Hepes, 3 M NaCl, 5 mM CaCl2, pH 6,9). Reagente livre de PEG foi lavado com 5 CV Tampão D. Subsequentemente o conjugado foi eluído com 100% Tampão E (50 mM Hepes, 5 mM CaCl2, pH 7,4). Às frações contendo conjugado são concentradas por UF/DF usando uma —membrana de 10 kD feita de celulose regenerada (88 cm2, corte 10 kD, Millipore). À etapa final de diafiltração é realizada contra tampão Hepes (50 mM Hepes, 5 mM CaCl2, pH 7,5). A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (procedimento Bradford e BCA) e atividade biológica de acordo com
| | 124 | métodos conhecidos. l . Exemplo 17 Polisialilação de rFIX na presença de ácido o-amino benzoico Método 1: 8,2 mg de rFIX é dissolvido em 4,0 ml tampão histidina, pH 6,0 (20 mM L-histidina, 1597 EM NaCl, 5 mM CaCl,). Então 82 ul de uma solução aquosa de periodato de sódio (5 mM) é adicionado e a mistura de reação é incubada por 1 h no escuro a 4ºC em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de 4 ul de uma solução aquosa de 1 M de cisteénma.
A mistura é subsequentemente submetido a UF/DF empregando Vivaspin 6 10 kD filtradores por centrífuga para remover periodato em excesso, extintores e os subprodutos dos mesmos. | a? O retentado (6,5 ml), contendo rFIX oxidado, é misturado com a. 1,64 ml de um ácido o-amino benzoico aquoso (50 mM) e incubado por 30 minem temperatura ambiente.
Então reagente amino-oxi-PSA com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 5 vezes.
Esta mistura foi incubada por 2,5 h em temperatura ambiente no escuro em agitação suave. | Outra purificação do conjugado é conduzido como descrito aqui | Método 2: Uma solução de 1 mg de rFIX em 0,65 ml de tampão fosfato | de sódio, pH 6,0 contendo um excesso molar de 5 vezes de reagente amino- | oxi-PSA com um MW de 20 kD (descrito acima) foi preparada.
Então 333 ul i —de uma solução aquosa de ácido o-amino benzoico (30 mM) foi adicionado como catalisador nucleofílico para gerar uma concentração final de 10 mM.
Í Subsequentemente 20 ul de uma solução aquosa de NalO, (5 mM) foi | adicionada gerando uma concentração final de 100 uM.
O processo de acoplamento foi realizado por 2 horas no escuro sob agitação suave em temperatura ambiente e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela : adição de 1 ul de solução aquosa de cisteíina (1 M). Outra purificação do conjugado é conduzida como descrito aqui. Exemplo 18 Polisialilação de EPO usando amino-oxi-PSA e m-toluidina como um catalisador nucleofílico Êo Método 1: Uma concentração inicial de eritropoietina (EPO) é transferida em um tampão de reação (por exemplo 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e diluído para obter uma concentração de proteína de 1 mg/ml. À esta solução, NaIO, é adicionado para gerar uma concentração final de 200 UM. A oxidação é realizada em RT for 30 min. no ' escuro sob agitação suave. À reação é então extinta com cisteína o (concentração final: 10 MM) por 60 min em RT.
A solução é seguida é submetida a UF/DF empregando filtradores Vivaspin por centrífuga para remover periodato em excesso, extintores e os subprodutos dos mesmos ou, em alternativa, a uma coluna IEX com um volume de 20 ml (Merck EMD TMAE (M)) que é equilibrada com Tampão A (20 mM Hepes, 5 mM CaCl,; pH 7,0). A coluna é equilibrada com 5CV TampãoA.A EPO oxidada é eluída com Tampão B (20 mM Hepes, 5 mM CaCLk,, 1M NaCl, pH 7,0). A EPO contendo frações é coletada. O teor de proteína é determinado (Coomassie, Bradford) e ajustado para 1 mg/ml com tampão de reação e ajustado para pH 6,0 por adição sob gotejamento de 0,5SM HCl.
Um excesso molar de 50 vezes de um reagente amino-oxi-PSA com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado seguido por m-toluidina como um catalisador nucleofílico (concentração final: 10 mM). A reação de acoplamento foi realizada por 2 horas no escuro sob agitação suave em temperatura ambiente. O excesso de reagente amino-oxi-PSA foi removido por meio de HIC.
A condutividade da mistura de reação é ajustada ' adicionando um tampão contendo acetato de amônio (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, 8 M acetato de amônio, pH 6,9) e carregada em uma coluna preenchida com 80 ml Fenil Sepharose FF (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré-equilibrada com 50 mM Hepes, 2,5 M acetato de amônio, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM clofeto de cálcio, pH 6,9. Subsequentemente, o conjugado é eluído com 50 mM Tampão Hepes pH 7,5 contendo 5 mM CaCl,. Finalmente as frações contendo PSA-EPO são coletadas e submetidas a UF/DF pelo uso de uma membrana feita de celulose regenerada (MWCO 10kD, 50cm”, Millipore). A preparação é em seguida analiticamente caracterizada medindo proteína total (Coomassie, Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica. | Em uma modalidade alternativa, o Método | é conduzido - como a seguir. 10 mg de EPO é dissolvido em 5 ml tampão histidina, pH 6,0 (20 mM L-histidina, 150 mM NaCl). 100 ul de uma solução aquosa de periodato de sódio (5 mM) é então adicionada e a mistura de reação é incubada por 1 h no escuro a 4ºC em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de 50 ul de uma solução aquosa de 1 M de cisteina A mistura é subsequentemente submetido a UF/DF empregando Vivaspin 15R 10 kD filtradores por centrífuga para remover periodato em excesso, extintores e os subprodutos dos mesmos.
BR O retentado (aprox. 7 ml), contendo EPO oxidado, é misturado com 2 ml de uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM) e incubado por 30 minem temperatura ambiente.
Então reagente amino-oxi-PSA com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 5 vezes.
Esta mistura é incubada por 2,5 h em RT no escuro em agitação suave.
A EPO livre é removida por meio de cromatografia de troca aniônica (AEC). A mistura de reação é diluída com 20 ml Tampão A (50 mM : Hepes, pH 7,5) e carregada em uma coluna 20 ml HiPrep QFF 16/10 (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré-equilibrada com Tampão A.
Então a coluna é eluída com Tampão B (50 mM Hepes, 1 M NaCl, pH 7,5). EPO livre é eluída —lavandoacolunacom 25% Tampão B e o conjugado em 50 % Tampão B.
À condutividade das frações contendo conjugado é subsequententária elevada para —190 mS/cm com Tampão C (50 mM Hepes, 5 M NaCl, pH 6,9) e carregada em uma coluna 20 ml HiPrep Butil FF 16/10 (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré-equilibrada com Tampão D (50 mM Hepes, 3 M NaCl, pH | 6,9) Reagente PSA livre é lavado dentro de 5 CV Tampão D.
Subsequentemente, o conjugado é eluído com 100 % Tampão E (50 mM Hepes, pH 7,4). As frações contendo conjugado são concentradas por UF/DF ' usando uma membrana de 10 kD feita de celulose regenerada (88 cm2, corte « 10 kD / Millipore). A etapa final de diafiltração é realizada contra tampão histidina, pH 7,2 contendo 150 mM NaCl.
A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Para o conjugado PSA-EPO uma atividade específica de > 50 % em comparação ao EPO nativo é determinada.
O conjugado é adicionalmente analiticamente caracterizado por HPLC por exclusão de tamanho usando um sistema Agilent 1200 HPLC equipado com uma coluna Shodex KW 803 em condições como anteriormente descrito (Kolarich et al, Transfusion 2006;46:1959-77). É mostrado que a preparação | não contém EPO livre. | Método 2: EPO é transferida ou dissolvida em tampão de reação (por exemplo SOmM Hepes, 350mM cloreto de sódio, SMM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 1,0 +/- 0,25 mg/ml.
Então o pH da solução é corrigido para 6,0 por adição sob gotejamento de uma solução aquosa 0,5 N de HCl.
Subsequentemente, uma solução aquosa 40 mM de periodato de sódio é adicionado dentro de 10 minutos para gerar uma ' concentração de 200 uM. A reação de oxidação é conduzida por 30 +/- 5 min em uma temperatura (T) de T = +22 +/- 2ºC. Então a reação é interrompida por adição de uma solução aquosa de L-cisteína (1 M) dentro de 15 minutos emT=+22+/-2ºC para gerar uma concentração final de 10 mM em uma mistura de reação e incubação por 60 +/- 5 min. ÓÕ " A EPO oxidada é ainda purificada por cromatografia de troca iônica. A EPO oxidada contendo frações de eluato é coletada e usada para reação de conjugação.
O reagente amino-oxi-ácido polisiálio (PSA-ONH2) é adicionado em um excesso molar de 50 vezes ao eluato contendo a EPO oxidada purificada dentro de um período de tempo máximo (t) de 15 minutos DM em agitação suave. Então uma solução aquosa de m-toluíidina (SO MM) é s adicionada dentro de 15 minutos para obter uma concentração final de 10 mM. A mistura de reação é incubada por 120 +/- 10 min. em pH 6,0 no escuro em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC sob agitação suave (concentração de proteína: 1 mg/ml).
O conjugado PSA-EPO obtido é ainda purificado por cromatografia de troca iônica. O conjugado PSA-EPO contendo frações são coletados e concentrados por ultra-/diafiltração (UF/DF) usando uma membrana feita de celulose regenerada com um corte de peso molecular apropriado (Millipore).
O conjugado preparado pelo uso deste procedimento é analiticamente caracterizado medindo proteína total, atividade biológica, e — determinação de grau de polisialiação medindo o teor de PSA (ensaio resorcinol).
Método 3: Eritropoietina (EPO) é transferida em tampão de reação (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e mm RM ' 129 diluída para obter uma concentração de proteína de 1 mg/ml.
Um excesso nm molar de 50 vezes de um reagente amino-oxi-PSA com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado seguido por m-toluidina como um catalisador nucleofilico (10 mM concentração final) e NaIO4 (concentração final: 400 uM) A reação de acoplamento foi realizada por 2 horas no escuro sob agitação suave em temperatura ambiente.
Subsequentemente, a reação é É extinta com cisteíina por 60 min em RT (concentração de cisteina: 10 mM). Então, a condutividade da mistura de reação é ajustada adicionando um tampão contendo acetato de amônio (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de | 10 sódio, 5 mM cloreto de cálcio, 8 M acetato de amônio, pH 6,9) e carregada | em uma coluna preenchida com Fenil Sepharose FF (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré-equilibrada com 50 mM Hepes, 2,5 M acetato de amônio, º 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, 0,01% Tween 80, pH 6,9. . Subsequentemente, o conjugado é eluído com 50 mM Hepes, 5 mM cloreto de cálcio, pH 7,5. Finalmente, as frações contendo PSA-EPO são coletadas e submetidas a UF/DF pelo uso de uma membrana feita de celulose regenerada (MWCO 10 kD, 88&m2, Millipore). À preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Em uma modalidade alternativa, o Método 3 é conduzido como a seguir. 10 mg de EPO é dissolvido em 8 ml tampão histidina, pH 6,0 i (20 mM L-histidina, 150 mM NaCl). 200 ul de uma solução aquosa de periodato de sódio (5 mM) e 2 ml de uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM) são então adicionados.
Subsequentemente, o reagente amino-oxi-PSA comum MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 5 vezes.
A mistura é incubada por 2 h no escuro em temperatura ambiente em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de 100 ul de solução aquosa | M de cisteína.
A EPO livre é removida por meio de cromatografia de troca aniônica (AEC). A mistura de reação é diluída com 20 ml Tampão A (50 mM ' Hepes, pH 7,5) e carregada em uma coluna 20 ml HiPrep QFF 16/10 (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré-equilibrada com Tampão A. Então a coluna é eluída com Tampão B (50 mM Hepes, 1 M NaCl, pH 7,5). EPO livre é eluída —lavandoa colunacom 725% Tampão B e o conjugado a 50 % Tampão B. À condutividade das frações contendo conjugado é subsequentemente elevada para —-190 mS/cm com Tampão C (50 mM Hepes, 5 M NaCl, pH 6,9) e carregada em uma coluna 20 ml HiPrep Butil FF 16/10 (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré-equilibrada com Tampão D (50 mM Hepes, 3 M NaCl, pH 6,9). Reagente livre de PSA é lavado dentro de 5 CV Tampão D. Subsequentemente, o conjugado é eluído com 100% Tampão E (50 mM Hepes, pH 7,4). As frações contendo conjugado são concentradas por UF/DF ' usando uma membrana de 10 kD feita de celulose regenerada (88 cm2, corte - 10 kD, Millipore). A etapa final de diafiltração é realizada contra tampão histidina, pH 7,2 contendo 150 mM NaCl. A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica. Para o conjugado PSA-EPO uma atividade específica de > 50 % em comparação ao EPO nativo é determinada. O conjugado é adicionalmente analiticamente caracterizado por HPLC por exclusão de tamanho usando um sistema Agilent 1200 HPLC equipado com Í uma coluna Shodex KW 803 em condições como anteriormente descrito (Kolarich et al, Transfusion 2006;46:1959-77). É mostrado que a preparação não contém EPO livre.
Método 4: EPO é dissolvida em ou transferido a um tampão de reação (por exemplo, SOmM Hepes, 350mM cloreto de sódio, SMM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 1,0 +/- 0,25 mg/ml. Então o pH da solução é corrigido para 6,0 por adição sob gotejamento de uma solução aquosa 0,5 N de HCl.
| 131 Subsequentemente, o reagente amino-oxi-ácido polisiálico 7 (PSA-ONH2) é adicionado em um excesso molar de 50 vezes a esta solução EPO dentro de um período de tempo máximo (t) de 15 minutos em agitação suave. Então uma solução aquosa de m-toluidina (SOmMM) é adicionada dentro de 15 minutos para obter uma concentração final de 10 mM, Finalmente uma solução aquosa 40 mM de periodato de sódio é adicionada para gerar uma concentração de 400 uM.
À mistura de reação é incubada por 120 +/- 10 min. no escuro em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC sob agitação suave. Então a reação é interrompida pela adição de uma solução aquosa de L-cisteína (1 M) para gerar uma concentração final de 10 mM em uma mistura de reação e incubação por 60 +/- 5 min. : * O conjugado PSA-EPO obtido é purificado por cromatografia - de troca iônica. As frações contendo PSA-EPO do eluato são coletadas e concentradas por ultra-/diafiltração (UF/DF) usando uma membrana feita de celulose regenerada (MWCO 10 kD, 88cm2, Millipore).
Os conjugados preparados pelo uso deste procedimento são analiticamente caracterizados medindo proteína total, atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica, e determinação de grau de
20. polisialiação medindo o teor de PSA (ensaio Resorcinol).
Exemplo 19 Polisialilação de Ang-2 usando amino-oxi-PSA e m-toluidina como um catalisador nucleofílico Método 1: Uma concentração inicial of angiopoietina-2 (Ang-2) é transferida em um tampão de reação (por exemplo, 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e diluído para obter uma concentração de proteína de 1 mg/ml. À esta solução, NalO4 é adicionado para gerar uma concentração final de 200 uM. A oxidação é realizada em RT for 30 min no escuro sob agitação suave.
À reação é então extinta com " cisteína (concentração final: 10 mM) por 60 min em RT.
A solução é em seguida submetida a UF/DF empregando filtradores Vivaspin por centrífuga para remover periodato em excesso, extintoreseos subprodutos, ou, em alternativa, submetido a uma coluna IEX com um volume de 20 ml (Mérck EMD TMAE (M)) que é equilibrada com Tampão A (20 mM Hepes, 5 mM CaCl2, pH 7,0). A coluna é equilibrada com 5 CV Tampão A.
A Ang-2 oxidada é eluída com Tampão B (20 mM Hepes, 5 mM CaCl2, 1 M NaCl, pH 7,0). As frações contendo Ang-2 são coletadas.
O teor de proteína é determinada (Coomassie, Bradford) e ajustado para | mg/ml com tampão de reação e ajustado para pH 6,0 por adição sob gotejamento de 0,5 M HCI.
Ú Um excesso molar de reagente de 50 vezes amino-oxi-PSA - com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado seguido por m-toluidina como um catalisador nucleofílico (concentração final: 10 mM). A reação de acoplamento foi realizada por 2 horas no escuro sob agitação suave em temperatura ambiente.
O excesso de reagente amino-oxi é removido por meio de HIC.
A condutividade da mistura de reação é ajustada adicionando um tampão contendo acetato de amônio (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, 8 M acetato de amônio, pH 6,9) e carregada em uma coluna preenchida com 80 ml Fenil Sepharose FF (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré-equilibrada com 50 mM Hepes, 2,5 M acetato de amônio, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,9. Subsequentemente, o conjugado é eluído com 50 mM Tampão Hepes pH 7,5 contendo 5 mM —CaCl2. Finalmente, as frações contendo PSA - Ang-2 são coletadas e submetidas a UF/DF pelo uso de uma membrana feita de celulose regenerada (Millipore). A preparação é em seguida analiticamente caracterizada medindo proteína total (Coomassie, Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Em uma modalidade alternativa, o Método 1 é conduzido ' como a seguir.
Angiopoietina-2 (Ang-2) é transferida em um tampão de reação (por exemplo, 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e diluído para obter uma concentração de proteína de 1 mg/ml.
À esta solução, NaIO4 é adicionado para gerar uma concentração final de 200 uM.
A oxidação é realizada em RT for 30 min no escuro sob agitação suave.
A reação é então extinta com cisteína (concentração final: 10 mM) por 60 min em R.T. | A solução é em seguida submetida a UF/DF empregando | filtradores Vivaspin por centrífuga para remover periodato em excesso, extintores e os subprodutos dos mesmos.
Um excesso molar de reagente de 50 vezes amino-oxi-PSA | Ú com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado seguido por m-toluidina - como um catalisador nucleofílico (concentração final: 10 mM). A reação de ! acoplamento foi realizada por 2 horas no escuro sob agitação suave em temperatura ambiente.
O excesso de reagente amino-oxi é removido por meio de cromatografia de troca iônica.
As frações contendo PSA-Ang-2 conjugado do eluato são coletadas e submetidas a UF/DF pelo uso de uma membrana feita de celulose regenerada (Millipore). A preparação é em seguida —analiticamente caracterizada medindo proteína total (Coomassie, Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Método 2: Ang-2 é transferida ou dissolvida em tampão de reação (por | exemplo, 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, | 25 pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 1,0 +/- 0,25 mg/ml.
Então o pH da solução é corrigido para 6,0 por adição sob gotejamento de uma solução aquosa 0,5 N de HCl.
Subsequentemente, uma solução aquosa 40 mM de periodato de sódio é adicionado dentro de 10 minutos para gerar uma concentração de 200 uM.
A reação de oxidação é conduzida por 30 +/-
| 134 5min em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC.
Então a reação é ' interrompida por adição de uma solução aquosa de L-cisteína (1 M) dentro de 15 minutos em T= +22 +/- 2ºC para gerar uma concentração final de 10 MM em uma mistura de reação e incubação por 60 +/- 5 min. o A Ang-2 oxidada é ainda purificado por cromatografia de troca Ó - iônica.
As frações contendo Ang-2 oxidada de eluato são coletadas e usadas para a reação de conjugação.
O reagente amino-oxi-ácido polisiálio (PSA-ONH2) é adicionado em um excesso molar de 50 vezes ao eluato contendo a Ang-2 —oxidada purificada dentro de um período de tempo máximo (t) de 15 minutos em agitação suave.
Então uma solução aquosa de m-toluidina (SOMM) é adicionada dentro de 15 minutos para obter uma concentração final de 10 Ú mM.
A mistura de reação é incubada por 120 +/- 10 min. em pH 6,0 no escuro | - em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC sob agitação suave (concentração —deproteina:1 mg/ml). | O conjugado PSA- Ang-2 obtido é ainda purificado por cromatografia de troca iônica.
As frações contendo conjugado PSA-Ang-2 são coletadas e ; concentradas por ultra- / diafiltração (UF/DF) usando uma membrana feita de — celulose regenerada com um corte de peso molecular apropriado (Millipore). | O conjugado preparado pelo uso deste procedimento é analiticamente caracterizado medindo proteína total, atividade biológica, e ; determinação de grau de polisialiação medindo o teor de PSA (ensaio resorcinol). : Método 3: Angiopoietina-2 (Ang-2) é transferida em tampão de reação (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e diluído para obter uma concentração de proteína de 1 mg/ml.
Um excesso molar de 50 vezes de um reagente PSA amino-oxi com um MW de 20 kD
| 135 (descrito acima) é adicionado seguido por m-toluidina como um catalisador ' nucleofílico (10 mM concentração final) e NaIO4 (concentração final: 400 uM). A reação de acoplamento foi realizada por 2 horas no escuro sob agitação suave em temperatura ambiente. Subsequentemente, a reação é extintacom Ccisteína por 60 min em RT (concentração de cisteína: 10 mM). Antão a condutividade da mistura de reação é ajustada adicionando um tampão contendo acetato de amônio (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, 8 M acetato de amônio, pH 6,9) e carregada em uma coluna preenchida com Fenil Sepharose FF (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré-equilibrada com 50 mM Hepes, 2,5 M acetato de amônio, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, 0,01% Tween 80, pH 6,9. Subsequentemente, o conjugado é eluído com 50 mM Hepes, 5 mM cloreto de Ú cálcio, pH 7,5. Finalmente, as frações contendo PSA Ang-2 são coletadas e - submetidas a UF/DF pelo uso de uma membrana feita de celulose regenerada (Millipore). A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na | técnica.
| Em uma modalidade alternativa, o Método 3 é conduzido | como a seguir. Angiopoietina-2 (Ang-2) é transferida em tampão de reação (por exemplo, 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e diluída para obter uma concentração de proteina de 1 mg/ml. Um excesso molar de 50 vezes de um reagente PSA amino-oxi com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado seguido por m-toluidina como um catalisador nucleofílico (10 mM concentração final) e NalO4 (concentração final: 400uM). A reação de acoplamento foi realizada por 2 horas no escuro sob agitação suave em temperatura ambiente. Subsequentemente, a reação é extinta com cisteína por 60 min em RT (concentração de cisteína: 10 mM) e o conjugado é purificado por cromatografia de troca iônica. As frações contendo PSA Ang-2 o eluato são coletadas e submetidas a UF/DF pelo uso de uma membrana feita de celulose regenerada (Millipore). A preparação é ' analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Método 4: Ang-2 é dissolvida em ou transferida a um tampão de reação (por exemplo, 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 1,0 +/- 0,25 mg/ml. Então o pH da solução é corrigido para 6,0 por adição sob gotejamento de uma solução aquosa 0,5 N de HCI, Subsequentemente, o reagente amino-oxi-ácido polisiálico (PSA-ONH2) é adicionado em um excesso molar de 50 vezes a esta solução | Ang-2 dentro de um período de tempo máximo (t) de 15 minutos em agitação Ú suave. Então uma solução aquosa de m-toluídina (SO0mM) é adicionada % dentro de 15 minutos para obter uma concentração final de 10 mM. Finalmente uma solução aquosa 40 mM de periodato de sódio é adicionada | para gerar uma concentração de 400 uM, A mistura de reação é incubada por 120 +/- 10 min. no escuro em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC sob agitação suave. Então a reação é interrompida pela adição de uma solução aquosa de L-cisteina (1 M) para gerar uma concentração final de 10 mM em uma mistura de reação e incubação por 60 +/- 5 min. | O conjugado PSA-Ang-2 obtido é purificado por cromatografia de troca iônica. As frações contendo PSA-Ang-2 de eluato são coletadas e concentradas por ultra-/diafiltração (UF/DF) usando uma —membrana feitade celulose regenerada (Millipore).
Os conjugados preparados pelo uso deste procedimento são analiticamente caracterizados medindo proteína total, atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica, e determinação de grau de polisialiação medindo o teor de PSA (ensaio Resorcinol).
Exemplo 20 ' Polisialilação de VEGF usando amino-oxi-PSA e m-toluidina como um catalisador nucleofílico Método 1: Uma concentração inicial de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) é transferida em um tampão de reação (por exemplo, 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e diluída para obter uma concentração de proteína de 1 mg/ml. À esta solução, NaIO4 é adicionado para gerar uma concentração final de 200 uM. A oxidação é realizada em RT for 30 min no escuro sob agitação suave. A reação é então extinta com cisteína (concentração final: 10 mM) por 60 min em RT.
A solução é em seguida submetida a UF/DF empregando | ] filtradores Vivaspin por centrífuga para remover periodato em excesso, - extintores e os subprodutos dos mesmos ou, em alternativa, a uma coluna IEX comum volume de 20 ml (Merck EMD TMAE (M)) que é equilibrada com Tampão A (20 mM Hepes, 5 mM CaCl2, pH 7,0). A coluna é equilibrada com 5 CV Tampão A. O VEGF oxidado é eluído com Tampão B (20 mM Hepes, 5 mM CaCl2, 1 M NaCl, pH 7,0). As frações contendo VEGF são coletadas. O teor de proteína é determinado (Coomassie, Bradford) e ajustado para 1 mg/ml com tampão de reação e ajustado para pH 6,0 por adição sob gotejamento de 0,5M NaOH.
Um excesso molar de reagente de 50 vezes amino-oxi-PSA com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado seguido por m-toluidina como um catalisador nucleofílico (concentração final: 10 mM). A reação de acoplamento foi realizada por 2 horas no escuro sob agitação suave em temperatura ambiente. O excesso de reagente amino-oxi é removido por meio de HIC. A condutividade da mistura de reação é ajustada adicionando um tampão contendo acetato de amônio (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, S mM cloreto de cálcio, 8 M acetato de amônio, pH 6,9) e carregada
| ' em uma coluna preenchida com 80 ml Fenil Sepharose FF (GE Healthcare, * Fairfield, CT) pré-equilibrada com 50 mM Hepes, 2,5 M acetato de amônio, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,9. Subsequentemente, o conjugado é eluído com 50 mM Tampão Hepes pH 7,5 contendo 5 mM CaCll. Finalmente as frações contendo PSA-VEGF são coletadas e submetidas a UF/DF pelo uso de uífa x membrana feita de celulose regenerada (Millipore). A preparação é em seguida analiticamente caracterizada medindo proteína total (Coomassie, Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica. | 10 Em uma modalidade alternativa, o Método 1 é conduzido como a seguir. Fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) é transferido em um tampão de reação (por exemplo, 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de ] sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e diluído para obter uma concentração : de proteína de 1 mg/ml. À esta solução, NaIO4 é adicionado para gerar uma concentração final de 200 uM. A oxidação é realizada em RT for 30 min no escuro sob agitação suave. A reação é então extinta com cisteína (concentração final: 10 mM) por 60 min em RT.
A solução é em seguida submetida a UF/DF empregando filtradores Vivaspin por centrífuga para remover periodato em excesso, — extintores e os subprodutos dos mesmos.
Um excesso molar de reagente de 50 vezes amino-oxi-PSA com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado seguido por m-toluidina como um catalisador nucleofílico (concentração final: 10 mM). A reação de acoplamento foi realizada por 2 horas no escuro sob agitação suave em temperatura ambiente. O excesso de reagente amino-oxi é removido por meio de cromatografia de troca iônica. As frações contendo PSA-VEGF do eluato são coletadas e submetidas a UF/DF pelo uso de uma membrana feita de celulose regenerada (Millipore). A preparação é em seguida analiticamente caracterizada medindo proteína total (Coomassie, Bradford) e atividade
' biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica. 7 Método 2: VEGF é transferida ou dissolvida em tampão de reação (por exemplo 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 1,0 +/- 0,25 mg/ml. Então o pH da solução é corrigido para 6,0 J6t adição sob gotejamento de uma solução aquosa 0,5 N de HCl. Subsequentemente uma solução aquosa 40 | mM de periodato de sódio é adicionado dentro de 10 minutos para gerar uma concentração de 200 uM. A reação de oxidação é conduzida por 30 +/- 5 min em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC. Então a reação é interrompida por adição de uma solução aquosa de L-cisteína (1 M) dentro de 15 minutos em T= +22 +/- 2ºC para gerar uma concentração final de 10 mM em uma , mistura de reação e incubação por 60 +/- 5 min. - O VEGF oxidado é ainda purificado por cromatografia de troca iônica. As frações contendo VEGF oxidado de eluato são coletadas e | usadas para a reação de conjugação.
O reagente amino-oxi-ácido polisiálio (PSA-ONH2) é adicionado em um excesso molar de 50 vezes ao eluato contendo o VEGF oxidado purificado dentro de um período de tempo máximo (t) de 15 minutos | 20 em agitação suave. Então uma solução aquosa de m-toluidina (SOMM) é adicionada dentro de 15 minutos para obter uma concentração final de 10 | mM. A mistura de reação é incubada por 120 +/- 10 min. em pH 6,0 no escuro em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC sob agitação suave (concentração de proteína: 1 mg/ml).
O conjugado PSA-VEGF obtido é ainda purificado por cromatografia de troca iônica. As frações contendo conjugado PSA-VEGF são coletadas e concentradas por ultra-/diafiltração (UF/DF) usando uma membrana feita de celulose regenerada com um corte de peso molecular apropriado (Millipore).
* | O conjugado preparado pelo uso deste procedimento Í analiticamente caracterizada medindo proteína total, atividade biológica, e determinação de grau de polisialiação medindo o teor de PSA (ensaio Resorcinol). Método 3: Fator de crescimento endotelial vascular VÉGF) é transferido em tampão de reação (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 MM cloreto de cálcio, pH 6,0) e diluído para obter uma concentração de proteína de 1 mg/ml.
Um excesso molar de 50 vezes de um reagente PSA amino-oxi com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado seguido por m-toluidina como um catalisador nucleofílico (10 mM concentração final) e NalO4 (concentração final: 400 uM). A reação de acoplamento foi realizada por 2 ' horas no escuro sob agitação suave em temperatura ambiente. . Subsequentemente, a reação é extinta com cisteína por 60 min em RT (concentração de cisteína: 10 mM). Então a condutividade da mistura de | reação é ajustada adicionando um tampão contendo acetato de amônio (50 | mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, 8 M acetato de amônio, pH 6,9) e carregada em uma coluna preenchida com Fenil Sepharose FF (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré-equilibrada com 50 mM Hepes, 2,5 M —acetatode amônio, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, 0,01% Tween 80, pH 6,9. Subsequentemente o conjugado é eluído com 50 mM Hepes, 5 mM cloreto de cálcio, pH 7,5. Finalmente, as frações contendo PSA- VEGF são coletadas e submetidas a UF/DF pelo uso de uma membrana feita de celulose regenerada (Millipore) A preparação é analiticamente — caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Em uma modalidade alternativa, o Método 3 é conduzido como a seguir.
Fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) é transferido em tampão de reação (por exemplo 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio,
mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e diluído para obter uma concentração de proteína de 1 mg/ml.
Um excesso molar de reagente de 50 vezes amino-oxi- PSA com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado seguido por m- toluídina como um catalisador nucleofílico (10 mM concentração final) e 5 — NalO4 (concentração final: 400 uM). A reação de acoplamento foi realizada por 2 horas no escuro sob agitação suave em temperatura aríbiente. | Subsequentemente, a reação é extinta com cisteína por 60 min em RT | (concentração de cisteina: 10 mM) e o conjugado é purificado por | cromatografia de troca iônica.
As frações contendo PSA-VEGF do eluato são — coletadas e submetidas a UF/DF pelo uso de uma membrana feita de celulose regenerada (Millipore). A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos ' conhecidos na técnica. - Método 4: VEGF é dissolvido em ou transferido à um tampão de reação (por exemplo 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 1,0 +/- 0,25 mg/ml.
Então o pH da solução é corrigido para 6,0 por adição sob gotejamento de uma solução aquosa 0,5 N de HCI.
Subsequentemente, o reagente amino-oxi-ácido polisiálico | (PSA-ONH2) é adicionado em um excesso molar de 50 vezes a esta solução | VEGF dentro de um período de tempo máximo (t) de 15 minutos em agitação suave.
Então uma solução aquosa de m-toluidina (SOmMM) é adicionada dentro de 15 minutos para obter uma concentração final de 10 mM. — Finalmente uma solução aquosa 40 mM de periodato de sódio é adicionado para gerar uma concentração de 400 uM.
A mistura de reação é incubada por 120 +/- 10 min. no escuro em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC sob agitação suave.
Então a reação é interrompida pela adição de uma solução aquosa de L-cisteína (1 M) | para gerar uma concentração final de 10 mM em uma mistura de reação e incubação por 60 +/- 5 min.
O conjugado VEGF obtido é purificado por cromatografia de troca iônica.
As frações contendo PSA-VEGF de eluato são coletadas e — concentradas por ultra-/diafiltração (UF/DF) usando uma membrana feita de celulose regenerada (Millipore). E o Os conjugados preparados pelo uso deste procedimento são analiticamente caracterizados medindo proteína total, atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica, e determinação de grau de —polisialiação medindo o teor de PSA (ensaio Resorcinol). Exemplo 21 Polisialilação de EGF usando amino-oxi-PSA e m-toluidina ] como um catalisador nucleofílico - Método 1: Uma concentração inicial de fator de crescimento epidérmico (EGF) é transferida em um tampão de reação (por exemplo, 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e diluído para obter uma concentração de proteína de 1 mg/ml.
À esta solução, NalO4 é adicionado para gerar uma concentração final de 200 uM.
A oxidação é realizada em RT for 30 min no escuro sob agitação suave.
À reação é então extinta com cisteína (concentração final: 10 mM) por 60 min em R.T. | A solução é em seguida submetida a UF/DF empregando filtradores Vivaspin por centrífuga para remover periodato em excesso, extintores e os subprodutos dos mesmos ou, em alternativa, a uma coluna IEX comum volume de 20 ml (Merck EMD TMAE (M)) que é equilibrada com Tampão A (20 mM Hepes, 5 mM CaCl2, pH 7,0). A coluna é equilibrada com 5 CV Tampão A.
O EGF oxidado é eluído com Tampão B (20 mM Hepes, 5 mM CaCl2, IM NaCl, pH 7,0). As frações contendo EGF são coletadas.
O teor de proteína é determinado (Coomassie, Bradford) e ajustado para 1 mg/ml com tampão de reação e ajustado para pH 6,0 por adição sob gotejamento de 0,5SM HCI.
Um excesso molar de reagente de 50 vezes amino-oxi-PSA com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado seguido por m-toluidina como um catalisador nucleofílico (concentração final: 10 MM). À reação de acoplamento foi realizada por 2 horas no escuro sob agitação suave em temperatura ambiente.
O excesso de reagente amino-oxi é removido por meio | de HIC.
A condutividade da mistura de reação é ajustada adicionando um tampão contendo acetato de amônio (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de — sódio, 5 mM cloreto de cálcio, 8 M acetato de amônio, pH 6,9) e carregada em uma coluna preenchida com 80 ml Fenil Sepharose FF (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré-equilibrada com 50 mM Hepes, 2,5 M acetato de amônio, ' 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,9. Subsequentemente, . o conjugado é eluído com 50 mM Tampão Hepes pH 7,5 contendo 5 mM CaCl2. Finalmente, as frações contendo PSA-EGF frações são coletadas e submetidas a UF/DF pelo uso de uma membrana feita de celulose regenerada (Millipore). A preparação é em seguida analiticamente caracterizada medindo proteína total (Coomassie, Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Em uma modalidade alternativa, o Método 1 é conduzido como a seguir.
Fator de crescimento epidérmico (EGF) é transferido em um tampão de reação (por exemplo, 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e diluído para obter uma concentração de proteína de 1 mg/ml.
À esta solução, NalO4 é adicionado para gerar uma concentração final de 200 uM.
A oxidação é realizada em RT for 30 min no escuro sob agitação suave.
A reação é então extinta com cisteína | (concentração final: 10 mM) por 60 min em R.T. | A solução é em seguida submetida a UF/DF empregando filtradores Vivaspin por centrífuga para remover periódato em excesso, | extintores e os subprodutos dos mesmos.
Um excesso molar de reagente de 50 vezes amino-oxi-PSA com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado seguido por m-toluidina como um catalisador nucleofílico (concentração final: 10 mM). A reação de acoplamento foi realizada por 2 horas no escuro sob agitação suave em temperatura ambiente. O excesso de reagente amino-oxi é removido por meio de cromatografia de troca iônica. As frações contendo PSA-EGF do eluato são coletadas e submetidas a UF/DF pelo uso de uma membrana feita de celulose regenerada (Millipore). A preparação é em seguida analiticamente caracterizada medindo proteína total (Coomassie, Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Método 2: ' EGF é transferida ou dissolvida em tampão de reação (por - exemplo 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 1,0 +/- 0,25 mg/ml. Então o pH da solução é corrigido para 6,0 por adição sob gotejamento de uma solução aquosa 0,5 N de HCl. Subsequentemente, uma solução aquosa 40 mM de periodato de sódio é adicionado dentro de 10 minutos para gerar uma concentração de 200 uM. A reação de oxidação é conduzida por 30 +/- S5min em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC. Então a reação é interrompida por adição de uma solução aquosa de L-cisteina (1 M) dentro de 15 minutos em T= +22 +/- 2ºC para gerar uma concentração final de 10 mM em uma mistura de reação e incubação por 60 +/- 5 min.
O EGF oxidado é ainda purificado por cromatografia de troca — iônica. Frações contendo EGF oxidado do eluato são coletadas e usadas para a reação de conjugação.
O reagente amino-oxi-ácido polisiálio (PSA-ONH2) é adicionado em um excesso molar de 50 vezes ao eluato contendo o EGF oxidado purificado dentro de um período de tempo máximo (t) de 15 minutos em agitação suave. Então uma solução aquosa de m-toluidina (SO MM) é adicionada dentro de 15 minutos para obter uma concentração final de 10 mM. A mistura de reação é incubada por 120 +/- 10 min. em pH 6,0 no escuro em uma temperatura (T) de T=+22 +/- 2ºC sob agitação suave (concentração —deproteína:lme/ml).
O conjugado PSA-EGF obtido é ainda purificado por cromatografia de troca iônica. As frações contendo conjugado PSA-EGF são coletadas e concentradas por ultra-/diafiltração (UF/DF) usando uma membrana feita de celulose regenerada com um corte de peso molecular — apropriado (Millipore). O conjugado preparado pelo uso deste procedimento analiticamente caracterizada medindo proteína total, atividade biológica, e ] determinação de grau de polisialiação medindo o teor de PSA (ensaio - resorcinol). Método 3: Fator de crescimento epidérmico (EGF) é transferida em tampão de reação (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e diluído para obter uma concentração de proteína de 1 mg/ml. Um excesso molar de 50 vezes de um reagente PSA amino-oxi com um MW de20kD (descrito acima) é adicionado seguido por m-toluidina como um catalisador nucleofílico (10 mM concentração final) e NalO4 (concentração final: 400 uM). A reação de acoplamento foi realizada por 2 horas no escuro sob agitação suave em temperatura ambiente. Subsequentemente, a reação é extinta com cisteína por 60 min em RT (concentração de cisteína: 10 mM).
—Entãoa condutividade da mistura de reação é ajustada adicionando um tampão contendo acetato de amônio (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, 8 M acetato de amônio, pH 6,9) e carregada em uma coluna preenchida com Fenil Sepharose FF (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré-equilibrada com 50 mM Hepes, 2,5 M acetato de amônio,
350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, 0,01% Tween 80, pH 6,9. Subsequentemente o conjugado é eluído com 50 mM Hepes, 5 mM cloreto de cálcio, pH 7,5. Finalmente as frações contendo PSA-EGF são coletadas e submetidas a UF/DF pelo uso de uma membrana feita de celulose regenerada —(Millipore): À preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na | técnica.
Em uma modalidade alternativa, o Método 3 é conduzido | como a seguir.
Fator de crescimento epidérmico (EGF) é transferido em tampão de reação (por exemplo 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 | mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e diluído para obter uma concentração de proteína de 1 mg/ml.
Um excesso molar de 50 vezes de um reagente PSA amino-oxi com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado seguido por - m-toluidina como um catalisador nucleofílico (10 mM concentração final) e NalO4 (concentração final: 400 uM). A reação de acoplamento foi realizada por 2 horas no escuro sob agitação suave em temperatura ambiente.
Subsequentemente, a reação é extinta com cisteína por 60 min em RT (concentração de cisteína: 10 mM) e o conjugado é purificado por cromatografia de troca iônica.
As frações contendo conjugado do eluato são — coletadas e submetidas a UF/DF pelo uso de uma membrana feita de celulose regenerada (Millipore). A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Método 4: EGF é dissolvido em ou transferido a um tampão de reação (por exemplo 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 1,0 +/- 0,25 mg/ml.
Então o pH da solução é corrigido para 6,0 por adição sob gotejamento de uma solução aquosa 0,5 N de HCI. |
Subsequentemente, o reagente amino-oxi-ácido polisiálico (PSA-ONHD) é adicionado em um excesso molar de 50 vezes a esta solução | EGF dentro de um período de tempo máximo (t) de 15 minutos em agitação | suave. Então uma solução aquosa de m-toluidina (SOmMM) é adicionada — dentro de 15 minutos para obter uma concentração final de 10 mM. ' Finalmente uma solução aquosa 40 mM de periodato de sódio é adicionado para gerar uma concentração de 400 uM. | A mistura de reação é incubada por 120 +/- 10 min. no escuro em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC sob agitação suave. Então a reação é interrompida pela adição de uma solução aquosa de L-cisteína (1 M) para gerar uma concentração final de 10 mM em uma mistura de reação e | incubação por 60 +/- 5 min. O conjugado EGF obtido é purificado por cromatografia de - troca iônica. As frações contendo PSA-EGF de eluato são coletadas e concentradas por ultra-/diafiltração (UF/DF) usando uma membrana feita de celulose regenerada (Millipore).
Os conjugados preparados pelo uso deste procedimento são analiticamente caracterizados medindo proteína total, atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica, e determinação de grau de —polisialiação medindo o teor de PSA (ensaio Resorcinol). : Exemplo 22 Polisialilação de NGF usando amino-oxi-PSA e m-toluidina como um catalisador nucleofiílico Método 1: Uma concentração inicial de fator de crescimento de nervo (NGF) é transferida em um tampão de reação (por exemplo, SO mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e diluído para obter uma concentração de proteína de 1 mg/ml. À esta solução, NalO4 é adicionado para gerar uma concentração final de 200 uM. À oxidação é realizada em RT for 30 min no escuro sob agitação suave.
A reação é então extinta com cisteína (concentração final: 10 mM) por 60 min em RT, A solução é em seguida submetida a UF/DF empregando | filtradores Vivaspin por centrífuga para remover periodato em excesso, extintoreseos subprodutos dos mesmos ou, em alternativa, a uma coluna IEX Êo com um volume de 20 ml (Merck EMD TMAE (M)) que é equilibrada com ; | Tampão A (20 mM Hepes, 5 mM CaCl2, pH 7,0). A coluna é equilibrada com ' 5 CV Tampão A.
O NGF oxidado é eluído com Tampão B (20 mM Hepes, 5 mM CaCl2, IM NaCl, pH 7,0). As frações contendo NGF são coletadas.
O teor de proteína é determinado (Coomassie, Bradford) e ajustado para 1 mg/ml com tampão de reação e ajustado para pH 6,0 por adição sob gotejamento de 0,5M HCl. | ' Um excesso molar de reagente de 50 vezes amino-oxi-PSA ' com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado seguido por m-toluidina como um catalisador nucleofílico (concentração final: 10 mM). A reação de | acoplamento foi realizada por 2 horas no escuro sob agitação suave em temperatura ambiente.
O excesso de reagente amino-oxi é removido por meio de HIC.
A condutividade da mistura de reação é ajustada adicionando um tampão contendo acetato de amônio (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de — sódio, 5 mM cloreto de cálcio, 8 M acetato de amônio, pH 6,9) e carregada em uma coluna preenchida com 80 ml Fenil Sepharose FF (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré-equilibrada com 50 mM Hepes, 2,5 M acetato de amônio, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,9. Subsequentemente, o conjugado é eluído com 50 mM Tampão Hepes pH 7,5 contendo 5 mM —CaCl2. Finalmente, as frações contendo PSA-NGF são coletadas e submetidas | a UF/DF pelo uso de uma membrana feita de celulose regenerada (Millipore). A preparação é em seguida analiticamente caracterizada medindo proteína total (Coomassie, Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica. |
| 1 149 Em uma modalidade alternativa, o Método 1 é conduzido | | como a seguir.
Fator de crescimento de nervo (NGF) é transferida em um tampão de reação (por exemplo, 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e diluído para obter uma concentração de proteína del mg/ml.
À esta solução, NalIO4 é adicionado para gerar uma conceliíração final de 200 uM.
A oxidação é realizada em RT for 30 min no | escuro sob agitação suave.
À reação é então extinta com cisteina | (concentração final: 10 mM) por 60 min em RT.
A solução é em seguida submetida a UF/DF empregando | 10 filtradores Vivaspin por centrífuga para remover periodato em excesso, extintores e os subprodutos dos mesmos.
Um excesso molar de reagente de 50 vezes amino-oxi-PSA : com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado seguido por m-toluidina . como um catalisador nucleofílico (concentração final: 10 mM). A reação de acoplamento foi realizada por 2 horas no escuro sob agitação suave em temperatura ambiente.
O excesso de reagente amino-oxi é removido por meio | de cromatografia de troca iônica.
As frações contendo PSA-NGF do eluato | são coletadas e submetidas a UF/DF pelo uso de uma membrana feita de celulose regenerada (Millipore). A preparação é em seguida analiticamente caracterizada medindo proteína total (Coomassie, Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Método 2: NGF é transferido ou dissolvido em tampão de reação (por exemplo 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 1,0 +/- 0,25 mg/ml.
Então o pH da solução é corrigido para 6,0 por adição sob gotejamento de uma solução aquosa 0,5 N de HCl.
Subsequentemente, uma solução aquosa 40 mM de periodato de sódio é adicionado dentro de 10 minutos para gerar uma concentração de 200 uM.
A reação de oxidação é conduzida por 30 +/-
min em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC.
Então a reação é | | interrompida por adição de uma solução aquosa de L-cisteína (1 M) dentro de 15 minutos em T=+22 +/- 2ºC para gerar uma concentração final de 10 mM | em uma mistura de reação e incubação por 60 +/- 5 min. 5 Oo NGF oxidado é ainda purificado por cromatografia de troca iônica.
As frações contendo NGF oxidado do eluato coletadas e usadas para a | reação de conjugação.
O reagente amino-oxi-ácido polisiálio (PSA-ONH2) é | adicionado em um excesso molar de 50 vezes ao eluato contendo o NGF oxidado purificado dentro de um período de tempo máximo (t) de 15 mínutos em agitação suave.
Então uma solução aquosa de m-toluidina (SO MM) é i adicionada dentro de 15 minutos para obter uma concentração final de 10 ; mM.
A mistura de reação é incubada por 120 +/- 10 min. em pH 6,0 no escuro | - em uma temperatura (T) de T=+22 +/- 2ºC sob agitação suave (concentração | deproteína:1 mg/ml). | O conjugado PSA-NGF obtido é ainda purificado por ! cromatografia de troca iônica.
As frações contendo conjugado PSA-NGF são ! coletadas e concentradas por ultra-/diafiltração (UF/DF) usando uma membrana feita de celulose regenerada com um corte de peso molecular apropriado (Millipore). O conjugado preparado pelo uso deste procedimento analiticamente caracterizada medindo proteína total, atividade biológica, e determinação de grau de polisialiação medindo o teor de PSA (ensaio Resorcinol). Método 3: Fator de crescimento de nervo (NGF) é transferido em um tampão de reação (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e diluído para obter uma concentração de proteína de 1 mg/ml.
Um excesso molar de reagente de 50 vezes amino-oxi-PSA com um MW de
20 kD (descrito acima) é adicionado seguido por m-toluidina como um catalisador nucleofílico (10 mM concentração final) e NalO4 (concentração final: 400 uM). À reação de acoplamento foi realizada por 2 horas no escuro sob agitação suave em temperatura ambiente.
Subsequentemente, a reação é extintacom cisteína por 60 min em RT (concentração de cisteína: 10 mM). Então a condutividade da Ailstura de reação é ajustada adicionando um | tampão contendo acetato de amônio (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, 8 M acetato de amônio, pH 6,9) e carregada em uma coluna preenchida com Fenil Sepharose FF (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré-equilibrada com 50 mM Hepes, 2,5 M acetato de amônio, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, 0,01 % Tween 80, pH 6,9. Subsequentemente o conjugado é eluído com 50 mM Hepes, 5 mM cloreto de ' cálcio, pH 7,5. Finalmente, as frações contendo PSA NGF são coletadas e - submetidas a UF/DF pelo uso de uma membrana feita de celulose regenerada (Millipore). A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína | total (Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Em uma modalidade alternativa, o Método 3 é conduzido como a seguir.
Fator de crescimento de nervo (NGF) é transferido em um tampão de reação (por exemplo, 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e diluído para obter uma concentração de proteína de | mg/ml.
Um excesso molar de reagente de 50 vezes amino-oxi- PSA com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado seguido por m- toluidina como um catalisador nucleofílico (10 mM concentração final) e — NalO4 (concentração final: 400 uM). A reação de acoplamento foi realizada por 2 horas no escuro sob agitação suave em temperatura ambiente.
Subsequentemente, a reação é extinta com cisteína por 60 min em RT (concentração de cisteína: 10 mM) e o conjugado é purificado por cromatografia de troca iônica.
Então as frações contendo PSA-NGF do eluato
| são coletadas e submetidas a UF/DF pelo uso de uma membrana feita de celulose regenerada (Millipore). A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Método 4: NGF é dissolvido em ou transferido a um tampão de reação | (por exemplo 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 1,0 +/- 0,25 mg/ml.
Então o pH da solução é corrigido para 6,0 por adição sob gotejamento de uma solução aquosa 0,5 N de HCI.
Subsequentemente, o reagente amino-oxi-ácido polisiálico (PSA-ONH2) é adicionado em um excesso molar de 50 vezes a esta solução Ú NGF dentro de um período de tempo máximo (t) de 15 minutos em agitação * suave.
Então uma solução aquosa de m-toluidina (SOmMM) é adicionada dentro de 15 minutos para obter uma concentração final de 10 MM.
Finalmente uma solução aquosa 40 mM de periodato de sódio é adicionado para gerar uma concentração de 400 uM.
A mistura de reação é incubada por 120 +/- 10 min. no escuro em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC sob agitação suave.
Então a reação é interrompida pela adição de uma solução aquosa de L-cisteína (1 M) para gerar uma concentração final de 10 mM em uma mistura de reação e incubação por 60 +/- 5 min.
O conjugado NGF obtido é purificado por cromatografia de troca iônica.
As frações contendo PSA-NGF de eluato são coletadas e — concentradas por ultra-/diafiltração (UF/DF) usando uma membrana feita de celulose regenerada (Millipore). Os conjugados preparados pelo uso deste procedimento são analiticamente caracterizados medindo proteína total, atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica, e determinação de grau de
| 153 polisialiação medindo o teor de PSA (ensaio Resorcinol).
Exemplo 23 Polisialilação de HGH usando amino-oxi-PSA e m-toluidina como um catalisador nucleofílico Método 1: Como descrito aqui, a sequência de áminoácido de hormônio | de crescimento humano (HGH) é primeiro modificado para incorporar pelo menos um sítio de glicosilação. Após a purificação, HGH é glicosilado in | vitro de acordo com métodos conhecidos na técnica. Uma concentração inicial de hormônio de crescimento humano (HGH) é transferida em um tampão de reação (por exemplo, 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e diluído para ' obter uma concentração de proteína de 1 mg/ml. À esta solução, NalIO4 é . adicionado para gerar uma concentração final de 200 uM. À oxidação é ! realizada em RT for 30 min no escuro sob agitação suave. A reação é então ! extinta com cisteína (concentração final: 10 mM) por 60 min em RT.
A solução é em seguida submetida a UF/DF empregando filtradores Vivaspin por centrífuga para remover periodato em excesso, extintores e os subprodutos dos mesmos ou, em alternativa, a uma coluna IEX comum volume de 20 ml (Merck EMD TMAE (M)) que é equilibrada com Tampão A (20 mM Hepes, 5 mM CaCl2, pH 7,0). A coluna é equilibrada com 5 CV Tampão A. O HGH oxidado é eluído com Tampão B (20 mM Hepes, 5 mM CaCl2, 1 M NaCl, pH 7,0). The HGH contendo frações são coletadas. O teor de proteína é determinada (Coomassie, Bradford) e ajustado para 1 mg/ml com tampão de reação e ajustado para pH 6,0 por adição sob gotejamento de 0,5 M HCI.
Um excesso molar de reagente de 50 vezes amino-oxi-PSA com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado seguido por m-toluidina como um catalisador nucleofílico (concentração final: 10 mM). A reação de acoplamento foi realizada por 2 horas no escuro sob agitação suave em temperatura ambiente. O excesso de reagente amino-oxi é removido por meio de HIC. À condutividade da mistura de reação é ajustada adicionando um tampão contendo acetato de amônio (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de —sódio,5mM cloreto de cálcio, 8 M acetato de amônio, pH 6,9) e carregada em uma coluna preenchida com 80 ml Fenil Sepharose FF (GÉ1 Healthcare, | Fairfield, CT) pré-equilibrada com 50 mM Hepes, 2,5 M acetato de amônio, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,9. Subsequentemente o conjugado é eluído com 50 mM Tampão Hepes pH 7,5 contendo 5 mM CaCl2. Finalmente, as frações contendo PSA-HGH são coletadas e submetidas a UF/DF pelo uso de uma membrana feita de celulose regenerada (Millipore). A preparação é em seguida analiticamente caracterizada medindo ' proteína total (Coomassie, Bradford) e atividade biológica de acordo com . métodos conhecidos na técnica.
Em uma modalidade alternativa, o Método 1 é conduzido como a seguir. Como descrito aqui, a sequência de aminoácido de hormônio de crescimento humano (HGH) é primeiro modificada para incorporar pelo ! menos um sítio de glicosilação. Após a purificação, HGH é glicosilado in | vitro de acordo com métodos conhecidos na técnica. HGH é transferida em umtampão de reação (por exemplo, 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e diluído para obter uma concentração de proteína de 1 mg/ml. À esta solução, NaIO4 é adicionado para gerar uma concentração final de 200 uM. A oxidação é realizada em RT for 30 min no escuro sob agitação suave. A reação é então extinta com cisteína (concentração final: 10 MM) por 60 min em RT.
A solução é em seguida submetida a UF/DF empregando filtradores Vivaspin por centrífuga para remover periodato em excesso, extintores e os subprodutos dos mesmos.
Um excesso molar de reagente de 50 vezes amino-oxi-PSA.
)
com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado seguido por m-toluidina como um catalisador nucleofílico (concentração final: 10 mM). A reação de acoplamento foi realizada por 2 horas no escuro sob agitação suave em temperatura ambiente. O excesso de reagente amino-oxi é removido por meio — de cromatografia de troca iônica. As frações contendo PSA-HGH do eluato são coletadas e submetidas a UF/DF pelo uso de uma membrana feita-de celulose regenerada (Millipore). À preparação é em seguida analiticamente caracterizada medindo proteína total (Coomassie, Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Método 2: Como descrito aqui, a sequência de aminoácido de hormônio de crescimento humano (HGH) é primeiro modificada para incorporar pelo ' menos um sítio de glicosilação. Após a purificação, HGH é glicosilado in - vitro de acordo com métodos conhecidos na técnica.
HGH é transferido ou dissolvido em tampão de reação (por exemplo 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 1,0 +/- 0,25 mg/ml. Então o pH da solução é corrigido para 6,0 por adição sob gotejamento de uma solução aquosa 0,5 N de HCl. Subsequentemente, uma solução aquosa 40 mM de periodato de sódio é adicionado dentro de 10 minutos para gerar uma concentração de 200 uM. A reação de oxidação é conduzida por 30 +/- 5min em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC. Então a reação é interrompida por adição de uma solução aquosa de L-cisteína (1 M) dentro de 15 minutos em T= +22 +/- 2ºC para gerar uma concentração final de 10 mM emuma mistura de reação e incubação por 60 +/- 5 min.
O HGH oxidado é ainda purificado por cromatografia de troca iônica. As frações contendo HGH oxidado do eluato coletadas e usadas para a reação de conjugação.
O reagente amino-oxi-ácido polisiálio (PSA-ONH2) é adicionado em um excesso molar de 50 vezes ao eluato contendo o HGH oxidado purificado dentro de um período de tempo máximo (t) de 15 minutos em agitação suave.
Então uma solução aquosa de m-toluidina (SO MM) é adicionada dentro de 15 minutos para obter uma concentração final de 10 mM.Amisturade reação é incubada por 120 +/- 10 min. em pH 6,0 no escuro em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC sob agitação suave (concentração PÓ de proteína: 1 mg/ml). | O conjugado PSA-HGH obtido é ainda purificado por cromatografia de troca iônica.
As frações contendo conjugado PSA-HGH são coletadas e concentradas por ultra-/diafiltração (UF/DF) usando uma membrana feita de celulose regenerada com um corte de peso molecular apropriado (Millipore). | ' O conjugado preparado pelo uso deste procedimento x analiticamente caracterizada medindo proteína total, atividade biológica, e determinação de grau de polisialiação medindo o teor de PSA (ensaio resorcinol). Método 3: Como descrito aqui, a sequência de aminoácido de hormônio de crescimento humano (HGH) é primeiro modificada para incorporar pelo menos um sítio de glicosilação.
Após a purificação, HGH é glicosilado in vitro de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Hormônio de crescimento humano (HGH) é transferido em tampão de reação (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e diluído para obter uma concentração de proteína de 1 mg/ml. ; Um excessomolar de 50 vezes de um reagente PSA amino-oxi com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado seguido por m-toluídina como um catalisador nucleofílico (10 mM concentração final) e NaIO4 (concentração final: 400 uM). A reação de acoplamento foi realizada por 2 horas no escuro sob agitação suave em temperatura ambiente.
Subsequentemente, a reação é extinta com cisteína por 60 min em RT (concentração de cisteína: 10 mM). Então a condutividade da mistura de reação é ajustada adicionando um tampão contendo acetato de amônio (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, 8 M acetato de amônio, pH 6,9) e carregada em uma coluna preenchida com Fenil Sepharose FF (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré-equilibrada com 50 mM Hepes, 2,5 M acetato de amônio, | 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, 0,01% Tween 80, pH 6,9. Subsequentemente o conjugado é eluído com 50 mM Hepes, 5 mM cloreto de cálcio, pH 7,5. Finalmente, as frações contendo PSA-HGH são coletadas e submetidas a UF/DF pelo uso de uma membrana feita de celulose regenerada (Millipore). A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na ' técnica.
Em uma modalidade alternativa, o Método 3 é conduzido —comoa seguir. Como descrito aqui, a sequência de aminoácido de hormônio de crescimento humano (HGH) é primeiro modificada para incorporar pelo menos um sítio de glicosilação. Após a purificação, HGH é glicosilado in vitro de acordo com métodos conhecidos na técnica. HGH é transferida em um tampão de reação (por exemplo, 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e diluído para obter uma concentração de proteína de 1 mg/ml. Um excesso molar de 50 vezes de um reagente PSA amino-oxi com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado seguido por m-toluídina como um catalisador nucleofílico (10 mM concentração final) e NalIO4 (concentração final: 400 uM). A reação de acoplamento foi realizada por 2 horas no escuro sob agitação suave em temperatura ambiente. Subsequentemente, a reação é extinta com cisteína por 60 min em RT (concentração de cisteíina: 10 mM) e o conjugado é purificado por cromatografia de troca iônica. Então as frações contendo PSA-HGH do eluato são coletadas e submetidas a UF/DF pelo uso de uma membrana feita de
| 158 celulose regenerada (Millipore). A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica. Método 4: Como descrito aqui, a sequência de aminoácido de hormônio de crescimento humano (HGH) é primeiro modificada para incorporar pelo menos um sítio de glicosilação. Após a purificação, HGH é glicosilado in vitro de acordo com métodos conhecidos na técnica.
HGH é dissolvido em ou transferido a um tampão de reação (por exemplo 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 1,0 +/- 0,25 mg/ml. Então o pH da solução é corrigido para 6,0 por adição sob ] gotejamento de uma solução aquosa 0,5 N de HCl. . Subsequentemente, o reagente amino-oxi-ácido polisiálico (PSA-ONH2) é adicionado em um excesso molar de 50 vezes a esta solução HGH dentro de um período de tempo máximo (t) de 15 minutos em agitação suave. Então uma solução aquosa de m-toluidina (SO0mM) é adicionada dentro de 15 minutos para obter uma concentração final de 10 mM. Finalmente uma solução aquosa 40 mM de periodato de sódio é adicionado —paragerar uma concentração de 400 UM. A mistura de reação é incubada por 120 +/- 10 min. no escuro em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC sob agitação suave. Então a reação é interrompida pela adição de uma solução aquosa de L-cisteína (1 M) para gerar uma concentração final de 10 mM em uma mistura de reação e —incubaçãopor60+/-5 min. O conjugado HGH obtido é purificado por cromatografia de troca iônica. As frações contendo PSA-HGH de eluato são coletadas e concentradas por ultra-/diafiltração (UF/DF) usando uma membrana feita de celulose regenerada (Millipore).
Os conjugados preparados pelo uso deste procedimento são analiticamente caracterizados medindo proteína total, atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica, e determinação de grau de i polisialiação medindo o teor de PSA (ensaio resorcinol). Exemplo 24 | Polisialilação de TNF-alfa usando amino-oxi-PSA e m- l toluidina como um catalisador nucleofílico | Uma concentração inicial de Fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa) é transferida em um tampão de reação (por exemplo, 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e diluído para obter uma concentração de proteína de 1 mg/ml. À esta solução, NaIO4 é adicionado para gerar uma concentração final de 200 uM. A oxidação é ' realizada em RT for 30 min no escuro sob agitação suave. A reação é então - extinta com cisteína (concentração final: 10 mM) por 60 min em RT. A solução é em seguida submetida a UF/DF empregando filtradores Vivaspin por centrífuga para remover periodato em excesso, extintores e os subprodutos dos mesmos ou, em alternativa, a uma coluna IEX com um volume de 20 ml (Merck EMD TMAE (M)) que é equilibrada com Tampão A (20 mM Hepes, 5 mM CaCl2, pH 7,0). A coluna é equilibrada com 5 CV Tampão A. O TNF-alfa oxidado é eluído com Tampão B (20 mM Hepes, 5 mM CaClI2, IM M NaCl, pH 7,0). As frações contendo TNF-alfa são coletadas. O teor de proteína é determinado (Coomassie, Bradford) e ajustado para 1 mg/ml com tampão de reação e ajustado para pH 6,0 por adição sob gotejamento de 0,5SM HCI.
Um excesso molar de reagente de 50 vezes amino-oxi-PSA com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado seguido por m-toluidina como um catalisador nucleofílico (concentração final: 10 MM). A reação de acoplamento foi realizada por 2 horas no escuro sob agitação suave em temperatura ambiente. O excesso de reagente amino-oxi é removido por meio | de HIC. A condutividade da mistura de reação é ajustada adicionando um tampão contendo acetato de amônio (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, 8 M acetato de amônio, pH 6,9) e carregada em uma coluna preenchida com 80 ml Fenil Sepharose FF (GE Healthcare, — Fairfield, CT) pré-equilibrada com 50 mM Hepes, 2,5 M acetato de amônio, | 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,9. Subsequentemente, o conjugado é eluído com 50 mM Tampão Hepes pH 7,5 contendo 5 mM CaCl2. Finalmente as frações contendo PSA- TNF-alfa são coletadas e submetidas a UF/DF pelo uso de uma membrana feita de celulose regenerada (Millipore). À preparação é em seguida analiticamente caracterizada medindo proteína total (Coomassie, Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
' Em uma modalidade alternativa, o Método | é conduzido * como a seguir. Fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa) é transferido em um tampão de reação (por exemplo 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e diluído para obter uma concentração de proteína de 1 mg/ml. À esta solução, NaIO4 é adicionado para gerar uma concentração final de 200 uM. A oxidação é realizada em RT for 30 min no escuro sob agitação suave. A reação é então extinta com cisteína (concentração final: 10 MM) por 60 min em RT. A solução é em seguida submetida a UF/DF empregando filtradores Vivaspin por centrífuga para remover periodato em excesso, extintores e os subprodutos dos mesmos. Um excesso molar de reagente de 50 vezes amino-oxi-PSA com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado seguido por m-toluidina como um catalisador nucleofílico (concentração final: 10 MM). A reação de acoplamento foi realizada por 2 horas no escuro sob agitação suave em temperatura ambiente. O excesso de reagente amino- | oxi é removido por meio de cromatografia de troca iônica. As frações contendo PSA-TNF-alfa do eluato são coletadas e submetidas a UF/DF pelo a Y 161 uso de uma membrana feita de celulose regenerada (Millipore). A preparação | ; é em seguida analiticamente caracterizada medindo proteína total (Coomassie, | Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na | técnica.
Método 2: Êo TNF -alfa é transferida ou dissolvida em tampão de reação (por exemplo 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, PH 6,0) para obter concentração de proteína final de 1,0 +/- 0,25 mg/ml.
Então o pH da solução é corrigido para 6,0 por adição sob gotejamento de | uma solução aquosa 0,5 N de HCl.
Subsequentemente, uma solução aquosa | 40 mM de periodato de sódio é adicionado dentro de 10 minutos para gerar uma concentração de 200 uM.
A reação de oxidação é conduzida por 30 +/- | ] Smin em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC.
Então a reação é - interrompida por adição de uma solução aquosa de L-cisteína (1 M) dentro de | 15 minutos em T= +22 +/- 2ºC para gerar uma concentração final de 10 MM em uma mistura de reação e incubação por 60 +/- 5 min.
O TNF-alfa oxidado é ainda purificado por cromatografia de troca iônica.
As frações contendo TNF-alfa de eluato são coletadas e usadas para a reação de conjugação. | O reagente amino-oxi-ácido polisiálico (PSA-ONID) é | adicionado em um excesso molar de 50 vezes ao eluato contendo o TNF-alfa oxidado purificado dentro de um período de tempo máximo (t) de 15 minutos em agitação suave.
Então uma solução aquosa de m-toluidina (SO MM) é adicionada dentro de 15 minutos para obter uma concentração final de 10 | : 25 mM.A mistura de reação é incubada por 120 +/- 10 min. em pH 6,0 no escuro | em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC sob agitação suave (concentração l de proteína: 1 mg/ml). O conjugado PSA-TNF-alfa obtido é ainda purificado por ' cromatografia de troca iônica.
As frações contendo conjugado PSA-TNF-alfa
TF 162 são coletadas e concentradas por ultra-/diafiltração (UF/DF) usando uma membrana feita de celulose regenerada com um corte de peso molecular apropriado (Millipore). O conjugado preparado pelo uso deste procedimento —analiticamente caracterizada medindo proteína total, atividade biológica, e AMeterminação de grau de polisialiação medindo o teor de PSA (ensaio | resorcinol). Método 3: Fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa) é transferido em um tampão de reação (por exemplo 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e diluído para obter uma concentração de proteína de 1 mg/ml.
Um excesso molar de reagente de 50 vezes amino-oxi- ] PSA com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado seguido por m- - toluidina como um catalisador nucleofílico (10 mM concentração final) e —NalO4 (concentração final: 400 uM). A reação de acoplamento foi realizada por 2 horas no escuro sob agitação suave em temperatura ambiente, | Subsequentemente, a reação é extinta com cisteína por 60 min em RT (concentração de cisteína: 10 mM). Então a condutividade da mistura de reação é ajustada adicionando um tampão contendo acetato de amônio (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, 8 M acetato de amônio, pH 6,9) e carregada em uma coluna preenchida com Fenil Sepharose FF (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré-equilibrada com 50 mM Hepes, 2,5 M acetato de amônio, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, 0,01 % Tween 80, pH 6,9. Subsequentemente o conjugado é eluído com 50 mM —Hepes,5mM cloreto de cálcio, pH 7,5. Finalmente as frações contendo PSA- TNF-alfa são coletadas e submetidas a UF/DF pelo uso de uma membrana feita de celulose regenerada (Millipore). A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
ê 163 | Em uma modalidade alternativa, o Método 3 é conduzido como a seguir.
Fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa) é transferido em um tampão de reação (por exemplo 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e diluído para obter uma concentração de — proteína del mg/ml.
Um excesso molar de reagente de 50 vezes amino-oxi- PSA com 4a MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado seguido por m- toluidina como um catalisador nucleofílico (10 mM concentração final) e NalO4 (concentração final: 400 uM). A reação de acoplamento foi realizada por 2 horas no escuro sob agitação suave em temperatura ambiente. —Subsequentemente, a reação é extinta com cisteína por 60 min em RT (concentração de cisteíina: 10 mM) e o conjugado é purificado por ' cromatografia de troca iônica.
As frações contendo PSA-TNF-alfa do eluato ' são coletadas e submetidas a UF/DF pelo uso de uma membrana feita de . celulose regenerada (Millipore). A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Método 4: TNG-alfa é dissolvido em ou transferido a um tampão de reação (por exemplo 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 1,0 +/- 0,25 mg/ml.
Então o pH da solução é corrigido para 6,0 por adição sob gotejamento de uma solução aquosa 0,5 N de HCI. | Subsequentemente o reagente amino-oxi-ácido polisiálico (PSA-ONH2) é adicionado em um excesso molar de 50 vezes a esta solução TNF-alfa dentro de um período de tempo máximo (t) de 15 minutos em agitação suave.
Então uma solução aquosa de m-toluidina (SOMM) é adicionada dentro de 15 minutos para obter uma concentração final de 10 mM.
Finalmente uma solução aquosa 40 mM de periodato de sódio é adicionado para gerar uma concentração de 400 uM.
» 164 A mistura de reação é incubada por 120 +/- 10 min. no escuro em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC sob agitação suave. Então, a reação é interrompida pela adição de uma solução aquosa de L-cisteína (1 M) para gerar uma concentração final de 10 mM em uma mistura de reação e —incubaçãopor60+/-5S min. | O conjugado TNF-alfa obtido é purificado por cromatografia de troca iônica. As frações contendo PSA-TNF-alfa de eluato são coletadas e concentradas por ultra-/diafiltração (UF/DF) usando uma membrana feita de celulose regenerada (Millipore).
Os conjugados preparados pelo uso deste procedimento são analiticamente caracterizados medindo proteína total, atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica, e determinação de grau de ] polisialiação medindo o teor de PSA (ensaio resorcinol). - Exemplo 25 Polisialilação de insulina usando amino-oxi-PSA e m-toluidina como um catalisador nucleofiílico Método 1: Como descrito aqui, a sequência de aminoácido de insulina é primeiro modificada para incorporar pelo menos um sítio de glicosilação.
Após a purificação, insulina é glicosilada in vitro de acordo com métodos conhecidos na técnica. Uma concentração inicial de insulina é transferida em um tampão de reação (por exemplo 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e diluído para obter uma concentração de proteína de 1 mg/ml. À esta solução, NalO4 é adicionado para gerar uma — concentração final de 200 uM. A oxidação é realizada em RT for 30 min no escuro sob agitação suave. À reação é então extinta com cisteína (concentração final: 10 MM) por 60 min em RT.
A solução é em seguida submetida a UF/DF empregando filtradores Vivaspin por centrífuga para remover periodato em excesso,
” 165 extintores e os subprodutos dos mesmos ou, em alternativa, a uma coluna IEX. com um volume de 20 ml (Merck EMD TMAE (M)) que é equilibrada com Tampão A (20 mM Hepes, 5 MM CaClI2, pH 7,0). A coluna é equilibrada com CV Tampão A. A insulina oxidada é eluída com Tampão B (20 mM Hepes, 5 5 mM CaCl2, 1 M NaCl, pH 7,0). As frações contendo insulina são coletadas. O teor de proteína é determinada (Coomassie, Bradford) e ajustado para 1 mg/ml com tampão de reação e ajustado para pH 6,0 por adição sob gotejamento de 0,5 M HCI. ' Um excesso molar de. reagente de 50 vezes amino-oxi-PSA comum MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado seguido por m-toluidina como um catalisador nucleofílico (concentração final: 10 mM). A reação de acoplamento foi realizada por 2 horas no escuro sob agitação suave em ' temperatura ambiente. O excesso de reagente amino-oxi é removido por meio - de HIC. A condutividade da mistura de reação é ajustada adicionando um tampão contendo acetato de amônio (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, 8 M acetato de amônio, pH 6,9) e carregada | em uma coluna preenchida com 80 ml Fenil Sepharose FF (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré-equilibrada com 50 mM Hepes, 2,5 M acetato de amônio, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,9. Subsequentemente o conjugado é eluído com 50 mM Tampão Hepes pH 7,5 contendo 5 mM CaCl2. Finalmente as frações contendo PSA-insulina são coletadas e submetidas a UF/DF pelo uso de uma membrana feita de celulose regenerada (Millipore). A preparação é em seguida analiticamente caracterizada medindo proteína total (Coomassie, Bradford) e atividade biológica de acordo com — métodos conhecidos na técnica.
Em uma modalidade alternativa, o Método 1 é conduzido como a seguir. Como descrito aqui, a sequência de aminoácido de insulina é primeiro modificada para incorporar pelo menos um sítio de glicosilação. Após a purificação, insulina é glicosilada in vitro de acordo com métodos r 166 conhecidos na técnica.
Insulina é transferida em um tampão de reação (por exemplo, 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e diluído para obter uma concentração de proteína de 1 mg/ml.
À esta solução, NaIO4 é adicionado para gerar uma concentração final de 200 uM.
À oxidação é realizada em RT for 30 min no escuro sob agitação suave.
À reação é então extinta com cisteína (concentráção final: 10 MM) por 60 min | em RT.
A solução é em seguida submetida a UF/DF empregando filtradores Vivaspin por centrífuga para remover periodato em excesso, extintores e os subprodutos dos mesmos.
Um excesso molar de reagente de 50 vezes amino-oxi-PSA com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado seguido por m-toluídina ' como um catalisador nucleofílico (concentração final: 10 mM). A reação de - acoplamento foi realizada por 2 horas no escuro sob agitação suave em temperatura ambiente.
O excesso de reagente amino-oxi é removido por meio de cromatografia de troca iônica.
As frações contendo PSA-insulina do eluato são coletadas e submetidas a UF/DF pelo uso de uma membrana feita de celulose regenerada (Millipore). A preparação é em seguida analiticamente caracterizada medindo proteína total (Coomassie, Bradford) e atividade | 20 —biológicade acordocom métodos conhecidos na técnica.
Método 2: Como descrito aqui, a sequência de aminoácido de insulina é primeiro modificada para incorporar pelo menos um sítio de glicosilação.
Após a purificação, insulina é glicosilada in vitro de acordo com métodos — conhecidos na técnica.
Insulina é transferida ou dissolvida em tampão de reação (por exemplo 50mM Hepes, 350mM cloreto de sódio, SmMM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteina final de 1,0 +/- 0,25 mg/ml.
Então o pH da solução é corrigido para 6,0 por adição sob gotejamento de uma solução aquosa 0,5 N de HCl.
Subsequentemente, uma solução aquosa 40 mM de periodato de sódio é adicionado dentro de 10 minutos para gerar uma concentração de 200 uM.
A reação de oxidação é conduzida por 30 +/- S min em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC.
Então a reação é interrompida —poradiçãode uma solução aquosa de L-cisteína (1 M) dentro de 15 minutos em T= +22 +/- 2ºC para gerar uma concentração final-dé 10 mM em uma mistura de reação e incubação por 60 +/- 5 min.
A insulina oxidada é ainda purificada por cromatografia de troca iônica.
As frações contendo insulina oxidada de eluato são coletadas e usadas para a reação de conjugação.
O reagente amino-oxi-ácido polisiálio (PSA-ONH2) é adicionado em um excesso molar de 50 vezes ao eluato contendo a insulina : oxidada purificada dentro de um período de tempo máximo (t) de 15 minutos Ns em agitação suave.
Então uma solução aquosa de m-toluidina (SOMM) é | 15 adicionada dentro de 15 minutos para obter uma concentração final de 10 mM.
A mistura de reação é incubada por 120 +/- 10 min. em pH 6,0 no escuro em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC sob agitação suave (concentração de proteína: 1 mg/ml). O conjugado PSA-insulina obtido é ainda purificado por cromatografia de troca iônica.
As frações contendo conjugado PSA-insulina são coletadas e concentradas por ultra-/diafiltração (UF/DF) usando uma membrana feita de celulose regenerada com um corte de peso molecular apropriado (Millipore). O conjugado preparado pelo uso deste procedimento —analiticamente caracterizada medindo proteína total, atividade biológica, e determinação de grau de polisialiação medindo o teor de PSA (ensaio Resorcinol). Método 3: Como descrito aqui, a sequência de aminoácido de insulina é
" 168 primeiro modificada para incorporar pelo menos um sítio de glicosilação.
Após a purificação, insulina é glicosilada in vitro de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Insulina é transferida em tampão de reação (50 mM Hepes, —350mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e diluída para obter uma concentração de proteína de 1 mg/ml.
Um excesso molar de reagênte de 50 vezes amino-oxi-PSA com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado seguido por m-toluídina como um catalisador nucleofílico (10 mM concentração final) e NalIO4 (concentração final: 400 uM). A reação de acoplamento foi realizada por 2 horas no escuro sob agitação suave em temperatura ambiente.
Subsequentemente, a reação é extinta com cisteína por 60 min em RT (concentração de cisteína: 10 mM). Então, a condutividade da mistura de reação é ajustada adicionando um tampão contendo acetato de - amônio (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, 8 M acetato de amônio, pH 6,9) e carregada em uma coluna preenchida com Fenil Sepharose FF (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré-equilibrada com 50 mM Hepes, 2,5 M acetato de amônio, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, 0,01 % Tween 80, pH 6,9. Subsequentemente o conjugado é eluído com 50 mM Hepes, 5 mM cloreto de cálcio, pH 7,5. Finalmente, as frações contendo PSA-insulina são coletadas e submetidas a UF/DF pelo uso de uma membrana feita de celulose regenerada (Millipore). À preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Em uma modalidade alternativa, o Método 3 é conduzido como a seguir.
Como descrito aqui, a sequência de aminoácido de insulina é primeiro modificada para incorporar pelo menos um sítio de glicosilação.
Após a purificação, insulina é glicosilada in vitro de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Insulina é transferida em tampão de reação (por exemplo 50 | |
- 169 | mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e diluída para obter uma concentração de proteína de 1 mg/ml.
Um excesso | molar de reagente de 50 vezes amino-oxi-PSA com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado seguido por m-toluidina como um catalisador —nucleofilio(10mM concentração final) e NalO4 (concentração final: 400 uM). A reação de acoplamento foi realizada por 2 horas no escuro sob É ” agitação suave em temperatura ambiente.
Subsequentemente, a reação é extinta com cisteína por 60 min em RT (concentração de cisteína: 10 MM) e o conjugado é purificado por cromatografia de troca iônica.
As frações — contendo PSA-insulina do eluato são coletadas e submetidas a UF/DF pelo uso de uma membrana feita de celulose regenerada (Millipore). A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade ' biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica. - Método 4: Como descrito aqui, a sequência de aminoácido de insulina é primeiro modificada para incorporar pelo menos um sítio de glicosilação.
Após a purificação, insulina é glicosilada in vitro de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Insulina é dissolvida em ou transferida a um tampão de reação (por exemplo 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 1,0 +/- 0,25 mg/ml.
Então o pH da solução é corrigido para 6,0 por adição sob gotejamento de uma solução aquosa 0,5 N de HCI.
Subsequentemente, o reagente amino-oxi-ácido polisiálico —(PSA-ONH2) é adicionado em um excesso molar de 50 vezes a esta solução de insulina dentro de um período de tempo máximo (t) de 15 minutos em agitação suave.
Então uma solução aquosa de m-toluidina (SOMM) é adicionada dentro de 15 minutos para obter uma concentração final de 10 mM.
Finalmente uma solução aquosa 40 mM de periodato de sódio é
« 170 adicionado para gerar uma concentração de 400 uM. A mistura de reação é incubada por 120 +/- 10 min. no escuro em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC sob agitação suave. Então a reação é interrompida pela adição de uma solução aquosa de L-cisteína (1 M) para gerar uma concentração final de 10 mM em uma mistura de reação e incubação por 60 +/- 5 min.
O conjugado insulina obtido é purificado por cromatografia de troca iônica. As frações contendo PSA-insulina de eluato são coletadas e concentradas por ultra-/diafiltração (UF/DF) usando uma membrana feita de — celulose regenerada (Millipore). Os conjugados preparados pelo uso deste procedimento são analiticamente caracterizados medindo proteína total, atividade biológica de ' acordo com métodos conhecidos na técnica, e determinação de grau de - polisialiação medindo o teor de PSA (ensaio resorcinol). | 15 Exemplo 26 Polisialilação de interferon-alfa usando amino-oxi-PSA e m- toluidina como um catalisador nucleofílico Método 1: Uma concentração inicial de interferon-alfa é transferida em —umtampão de reação (por exemplo, 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e diluída para obter uma concentração de proteína de 1 mg/ml. À esta solução, NaIO4 é adicionado para gerar uma concentração final de 200 uM. A oxidação é realizada em RT for 30 min no escuro sob agitação suave. À reação é então extinta com cisteína — (concentração final: IO mM) por 60 min em RT.
A solução é em seguida submetida a UF/DF empregando filtradores Vivaspin por centrífuga para remover periodato em excesso, extintores e os subprodutos dos mesmos ou, em alternativa, a uma coluna IEX com um volume de 20 ml (Merck EMD TMAE (M)) que é equilibrada com
| . 171 Tampão A (20 mM Hepes, 5 mM CaCl2, pH 7,0). A coluna é equilibrada com CV Tampão A.
O interferon-alfa oxidado é eluído com Tampão B (20 mM Hepes, 5 mM CaCl2, 1IM NaCl, pH 7,0). As frações contendo interferon-alfa são coletadas.
O teor de proteína é determinada (Coomassie, Bradford) e 5 ajustado para 1 mg/ml com tampão de reação e ajustado para pH 6,0 por | adição sob gotejamento de 0,5 M HCI.
Um excesso molar de reagente de 50 vezes amino-oxi-PSA com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado seguido por m-toluidina como um catalisador nucleofílico (concentração final: 10 mM). A reação de acoplamento foi realizada por 2 horas no escuro sob agitação suave em temperatura ambiente.
O excesso de reagente amino-oxi é removido por meio de HIC.
A condutividade da mistura de reação é ajustada adicionando um ' tampão contendo acetato de amônio (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de . sódio, 5 mM cloreto de cálcio, 8 M acetato de amônio, pH 6,9) e carregada em uma coluna preenchida com 80 ml Fenil Sepharose FF (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré-equilibrada com 50 mM Hepes, 2,5 M acetato de amônio, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,9. Subsequentemente, o conjugado é eluído com 50 mM Tampão Hepes pH 7,5 contendo 5 mM | CaCl2. Finalmente as frações contendo PSA-interferon-alfa são coletadas e —submetidasa UF/DF pelo uso de uma membrana feita de celulose regenerada (Millipore). A preparação é em seguida analiticamente caracterizada medindo proteína total (Coomassie, Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Em uma modalidade alternativa, o Método 1 é conduzido como a seguir.
Interferon-alfa é transferida em um tampão de reação (por exemplo 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e diluído para obter uma concentração de proteína de 1 mg/ml.
À esta solução, NaIO4 é adicionado para gerar uma concentração final de 200 uM.
À oxidação é realizada em RT for 30 min no escuro sob agitação suave.
A reação é
| . 172 então extinta com cisteína (concentração final: 10 mM) por 60 min em RT.
A solução é em seguida submetida a UF/DF empregando filtradores Vivaspin por centrífuga para remover periodato em excesso, extintores e os subprodutos dos mesmos.
Um excesso molar de reagente de 50 vezes amino-oxi-PSA | com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado seguido por m-toluidina | como um catalisador nucleofílico (concentração final: 10 mM). A reação de acoplamento foi realizada por 2 horas no escuro sob agitação suave em temperatura ambiente. O excesso de reagente amino-oxi é removido por meio de cromatografia de troca iônica. As frações contendo PSA-interferon-alfa do eluato são coletadas e submetidas a UF/DF pelo uso de uma membrana feita de celulose regenerada (Millipore). A preparação é em seguida analiticamente Í caracterizada medindo proteína total (Coomassie, Bradford) e atividade : biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Método 2: Interferon-alfa é transferida ou dissolvida em tampão de | reação (por exemplo 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 1,0 +/- 0,25 mg/ml. Então o pH da solução é corrigido para 6,0 por adição sob gotejamento de uma solução aquosa 0,5 N de HCl. Subsequentemente, uma solução aquosa 40 mM de periodato de sódio é adicionado dentro de 10 minutos para gerar uma concentração de 200 uM. A reação de oxidação é conduzida por 30 +/- 5 min em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC. Então a reação é interrompida por adição de uma solução aquosa de L-cisteína —(1M)dentrode 15 minutos em T=+22 +/- 2ºC para gerar uma concentração final de 10 MM em uma mistura de reação e incubação por 60 +/- 5 min.
O interferon-alfa oxidado é ainda purificado por cromatografia de troca iônica. Às frações contendo interferon-alfa oxidado de eluato são coletadas e usadas para a reação de conjugação.
* 173 O reagente amino-oxi-ácido polisiálio (PSA-ONHFD) é adicionado em um excesso molar de 50 vezes ao eluato contendo o interferon- gama oxidado purificado dentro de um período de tempo máximo (t) de 15 minutos em agitação suave. Então uma solução aquosa de m-toluíidina (50mM) é adicionada dentro de 15 minutos para obter uma concentração final de 10 MM. A mistura de reação é incubada por 120 +/- 10 min. em pH | 6,0 no escuro em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC sob agitação suave (concentração de proteína: 1 mg/ml).
O conjugado PSA-interferon-alfa é ainda purificado por ! cromatografia de troca iônica. As frações contendo conjugado PSA- interferon-alfa são coletadas e concentradas por ultra-/diafiltração (UF/DF) usando uma membrana feita de celulose regenerada com um corte de peso ' molecular apropriado (Millipore). . Método 3: Interferon-alfa é transferida em tampão de reação (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e diluído | para obter uma concentração de proteína de 1 mg/ml. Um excesso molar de | 50 vezes de um reagente PSA amino-oxi com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado seguido por m-toluidina como um catalisador | 20 —nucleofílio(10mM concentração final) e NalIO4 (concentração final: 400 uM). A reação de acoplamento foi realizada por 2 horas no escuro sob agitação suave em temperatura ambiente. Subsequentemente, a reação é extinta com cisteina por 60 min em RT (concentração de cisteína: 10 mM). Então a condutividade da mistura de reação é ajustada adicionando um tampão contendo acetato de amônio (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, 8 M acetato de amônio, pH 6,9) e carregada em uma coluna preenchida com Fenil Sepharose FF (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré-equilibrada com 50 mM Hepes, 2,5 M acetato de amônio, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, 0,01 % Tween 80, pH 6,9.
| . 174 Subsequentemente o conjugado é eluído com 50 mM Hepes, 5 mM cloreto de cálcio, pH 7,5. Finalmente, as frações contendo PSA-interferon-alfa são coletadas e submetidas a UF/DF pelo uso de uma membrana feita de celulose regenerada (Millipore). A preparação é analiticamente caracterizada medindo ' 5 proteína total (Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos ' conhecidos na técnica.
Em uma modalidade alternativa, o Método 3 é conduzido | como a seguir. Interferon-alfa é transferida em tampão de reação (por exemplo 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH6,0)e diluído para obter uma concentração de proteína de 1 mg/ml. Um excesso molar de reagente de 50 vezes amino-oxi-PSA com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado seguido por m-toluidina como um ' catalisador nucleofílico (10 mM concentração final) e NaIO4 (concentração . final: 400 uM). A reação de acoplamento foi realizada por 2 horas no escuro sob agitação suave em temperatura ambiente. Subsequentemente, a reação é extinta com cisteína por 60 min em RT (concentração de cisteina: l0 mM) e o conjugado é purificado por cromatografia de troca iônica. As frações contendo PSA-interferon-alfa do eluato são coletadas e submetidas a UF/DF pelo uso de uma membrana feita de celulose regenerada (Millipore). À preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Método 4: Interferon-alfa é dissolvido em ou transferido a um tampão de reação (por exemplo 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto — de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 1,0 +/- 0,25 mg/ml. Então o pH da solução é corrigido para 6,0 por adição sob gotejamento de uma solução aquosa 0,5 N de HCI.
Subsequentemente, o reagente amino-oxi-ácido polisiálico (PSA-ONH2) é adicionado em um excesso molar de 50 vezes a esta solução
. 175 interferon-alfa dentro de um período de tempo máximo (t) de 15 minutos em | agitação suave. Então uma solução aquosa de m-toluidina (SOMM) é adicionada dentro de 15 minutos para obter uma concentração final de 10 mM. Finalmente, uma solução aquosa 40 mM de periodato de sódio é — adicionado para gerar uma concentração de 400 uM. Ê A mistura de reação é incubada por 120 +/- 10 min, no escuro em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC sob agitação suave. Então a reação é interrompida pela adição de uma solução aquosa de L-cisteína (1 M) para gerar uma concentração final de 10 mM em uma mistura de reação e incubação por 60 +/- 5 min.
| O conjugado interferon-alfa é purificado por cromatografia de troca iônica. As frações contendo PSA-interferon-alfa de eluato são coletadas º e concentradas por ultra-/diafiltração (UF/DF) usando uma membrana feita de . celulose regenerada (Millipore).
Os conjugados preparados pelo uso deste procedimento são analiticamente caracterizados medindo proteína total, atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica, e determinação de grau de polisialiação medindo o teor de PSA (ensaio resorcinol).
Exemplo 27 Polisialilação de Interferon-gama usando amino-oxi-PSA e m- toluidina como um catalisador nucleofílico Método 1: 10 mg de interferon-gama é dissolvido em 5 ml tampão histidina, pH 6,0 (20 mM L-histidina, 150 mM NaCl). 100 pl de uma solução — aquosade periodato de sódio (5 mM) é então adicionada e a mistura de reação é incubada por 1 h no escuro a 4ºC em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de 50 ul de uma solução aquosa de 1 M de cisteína. À mistura é subsequentemente submetido a UF/DF empregando Vivaspin 15R 10 kD filtradores por centrífuga para remover periodato em é 176 excesso, extintores e os subprodutos dos mesmos.
O retentado (aprox. 7 ml), contendo interferon-gama oxidado, é misturado com 2 ml de uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM) e incubado por 30 min em temperatura ambiente. Então reagente amino-oxi- —PSA comum MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 5 vezes. Esta mistura é incubada por 2,5 h em RT no escuro em agitação suave. | O Interferon-gama livre é removido por meio de cromatografia de troca catiônica (CEC). A mistura de reação é diluída com 20 ml Tampão À (SOmM Hepes, pH 6,5) e carregada em uma coluna 20 ml HiPrep SPFF 16/10 (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré-equilibrada com Tampão A. Então a coluna é eluída com Tampão B (50 mM Hepes, 1 M NaCl, pH 6,5). : Interferon-gama livre é eluída lavando a coluna com 25 % Tampão B e o - conjugado a 50 % Tampão B. À condutividade do frações contendo conjugado é subsequentemente elevada para -190 mS/cm com Tampão C (50 mM Hepes, 5 M NaCl, pH 6,9) e carregada em uma coluna 20 ml HiPrep Butil FF 16/10 (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré-equilibrada com Tampão D (50 mM Hepes, 3 M NaCl, pH 6,9). Reagente livre de PSA é lavado dentro de 5 CV Tampão D. Subsequentemente, o conjugado é eluído com 100 % Tampão E (50 mM Hepes, pH 6,9). As frações contendo conjugado são concentradas por UF/DF usando uma membrana de 10 kD feita de celulose regenerada (88 cm2, corte 10 kD, Millipore). A etapa final de diafiltração é realizada contra tampão histidina, pH 6,9 contendo 150 mM NaCl. A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e — atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica. Para o conjugado PSA-Interferon-gama uma atividade específica de > 50 % em comparação ao Interferon-gama nativo é determinada. O conjugado é adicionalmente analiticamente caracterizado por HPLC por exclusão de “ — tamanho usando um sistema Agilent 1200 HPLC equipado com uma coluna
« 177 Shodex KW 803 em condições como anteriormente descrito (Kolarich et al, Transfusion 2006;46:1959-77). É demonstrado que a preparação não contém interferon gama livre. Método 2: mg de interferon-gama é dissolvido em 8 ml tampão histidina, pH 6,00. mM L-histidina, 150 mM NaCl). 200 ul de uma solução aquosa de periodato de sódio (5 mM) e 2 ml de uma solução aquosa de m- toluidina (50 mM) são então adicionados. Subsequentemente, o reagente amino-oxi-PSA com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado para 10 gerar um excesso molar de reagente de 5 vezes. A mistura é incubada por 2 h no escuro em temperatura ambiente em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de 100 ul de solução aquosa 1 M de ' cisteína.
O Interferon-gama livre é removido por meio de cromatografia | 15 —detrocacatiônica (CEC). A mistura de reação é diluída com 20 ml Tampão À (50 mM Hepes, pH 6,5) e carregada em uma coluna 20 ml HiPrep SPFF 16/10 (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré-equilibrada com Tampão A. Então a coluna é eluída com Tampão B (50 mM Hepes, 1 M NaCl, pH 6,5). Interferon-gama livre é eluída lavando a coluna com 25 % Tampão B e o conjugado a 50% Tampão B. A condutividade das frações contendo conjugado é subsequentemente elevada para -190 mS/cm com Tampão C (50 mM Hepes, 5 M NaCl, pH 6,9) e carregada em uma coluna 20 ml HiPrep Butil FF 16/10 (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré-equilibrada com Tampão D (50 mM Hepes, 3 M NaCl, pH 6,9). Reagente PSA livre é lavado dentro de 5 CV TampãoD. Subsequentemente, o conjugado é eluído com 100 % Tampão E (50 mM Hepes, pH 6,9). As frações contendo conjugado são concentradas por UF/DF usando uma membrana de 10 kD feita de celulose regenerada (88 em2, corte 10 kD / Millipore). A etapa final de diafiltração é realizada contra tampão histidina, pH 6,9 contendo 150 mM NaCl. A preparação é
. 178 analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Para o conjugado PSAinterferon-gama uma atividade específica de > 50 % em comparação ao interferon-gama nativo é determinada.
O conjugado é adicionalmente analiticamente caracterizada por HPLC por exclusão de tamanho usando um sistema Agilent 1200 HPLC Sauipado com uma coluna Shodex KW 803 em condições como anteriormente descrito (Kolarich et al, Transfusion 2006;46:1959-77). É demonstrado que a preparação não contém interferon- gama livre.
Método 3: 10 mg de interferon-gama é dissolvido em 8 ml tampão histidina, pH 6,0 (20 mM L-histidina, 150 mM NaCl). 200 ul de uma solução ' aquosa de periodato de sódio (5 MM) e 2 ml de uma solução aquosa de m- - toluidina (50 mM) são então adicionados.
Subsequentemente, o reagente —amino-oxi-PSA com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 5 vezes.
A mistura é incubada por 2 h | no escuro em temperatura ambiente em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de 100 ul de solução aquosa 1 M de cisteína.
O interferon gama livre é removido por meio de cromatografia | de troca catiônica (CEC). A mistura de reação é diluída com 20 ml Tampão À (50 mM Hepes, pH 6,5) e carregada em uma coluna 20 ml HiPrep SPFF 16/10 (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré-equilibrada com Tampão A.
Então a coluna é eluída com Tampão B (50 mM Hepes, 1 M NaCl, pH 6,5). —Interferon-gama livre é eluída lavando a coluna com 25 % Tampão B e o conjugado a 50% Tampão B.
A condutividade das frações contendo conjugado é subsequentemente elevada para -190 mS/cm com Tampão C (50 mM Hepes, 5 M NaCl, pH 6,9) e carregada em uma coluna 20 ml HiPrep Butil FF 16/10 (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré-equilibrada com Tampão D
- 179 (50 mM Hepes, 3 M NaCl, pH 6,9). Reagente PSA livre é lavado dentro de 5 CV Tampão D.
Subsequentemente o conjugado é eluído com 100% Tampão E (50 mM Hepes, pH 6,9). As frações contendo conjugado são concentradas por UF/DF usando uma membrana de 10 kD feita de celulose regenerada (88 em2,cortelo0kD/Millipore). À etapa final de diafiltração é realizada contra tampão histidina, pH 6,9 contendo-"150 mM NaCl.
A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade | biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Para o conjugado PSA-interferon-gama uma atividade específica de > 50 % em comparação ao interferon-gama nativo é determinada.
O conjugado é adicionalmente analiticamente caracterizada por HPLC por exclusão de tamanho usando um sistema Agilent 1200 HPLC equipado com uma coluna Shodex KW 803 em ' condições como anteriormente descrito (Kolarich et al, Transfusion - 2006;46:1959-77). É demonstrado que a preparação não contém interferon- gamalivre.
Método 4: Interferon-gama é dissolvido em ou transferido a um tampão de reação (por exemplo 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 1,0 +/- 0,25 mg/ml.
Então o pH da solução é corrigido para 6,0 por adição sob gotejamento de uma solução aquosa 0,5 N de HCI.
Subsequentemente, o reagente amino-oxi-ácido polisiálico (PSA-ONHD2) é adicionado em um excesso molar de 50 vezes a esta solução de interferon-gama dentro de um período de tempo máximo (t) de 15 minutos em agitação suave.
Então uma solução aquosa de m-toluidina (S0 mM) é adicionada dentro de 15 minutos para obter uma concentração final de 10 mM.
Finalmente, uma solução aquosa 40 mM de periodato de sódio é adicionado para gerar uma concentração de 400 uM.
A mistura de reação é incubada por 120 +/- 10 min. no escuro
. 180 em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC sob agitação suave. Então a reação é interrompida pela adição de uma solução aquosa de L-cisteina (1 M) para gerar uma concentração final de 10 mM em uma mistura de reação e incubação por 60 +/- 5 min.
O conjugado interferon-gama obtido é purificado por cromatografia de troca iônica. As frações contendo PSA-interferon-gama de eluato são coletadas e concentradas por ultra-/diafiltração (UF/DF) usando uma membrana feita de celulose regenerada (Millipore).
Os conjugados preparados pelo uso deste procedimento são —analiticamente caracterizados medindo proteína total, atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica, e determinação de grau de polisialiação medindo o teor de PSA (ensaio resorcinol).
' Exemplo 28 - Polisialilação de G-CSF usando amino-oxi-PSA e m-toluidina comoum catalisador nucleofílico Método 1: Uma concentração inicial de fator estimulante de colônia de granulócito (G-CSF) é transferida em um tampão de reação (por exemplo, 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e — diluído para obter uma concentração de proteína de 1 mg/ml. À esta solução, NalO4 é adicionado para gerar uma concentração final de 200 uM. A oxidação é realizada em RT for 30 min no escuro sob agitação suave. À reação é então extinta com cisteína (concentração final: 10 mM) por 60 min em RT.
A solução é em seguida submetida a UF/DF empregando filtradores Vivaspin por centrífuga para remover periodato em excesso, extintores e os subprodutos dos mesmos ou, em alternativa, a uma coluna IEX com um volume de 20 ml (Merck EMD TMAE (M)) que é equilibrada com Tampão A (20 mM Hepes, 5 mM CaCl2, pH 7,0). A coluna é equilibrada com
: 181 CV Tampão A. O G-CSF oxidado é eluída com Tampão B (20 mM Hepes, | 5 mM CaCl2, 1 M NaCl, pH 7,0). As frações contendo G-CSF são coletadas. l O teor de proteína é determinada (Coomassie, Bradford) e ajustado para 1 mg/ml com tampão de reação e ajustado para pH 6,0 por adição sob 5 gotejamentode0,5M HCI.
Um excesso molar de reagente de 50 vezes afúino-oxi-PSA com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado seguido por m-toluidina | como um catalisador nucleofílico (concentração final: 10 mM). A reação de acoplamento foi realizada por 2 horas no escuro sob agitação suave em temperatura ambiente. O excesso de reagente amino-oxi é removido por meio de HIC. A condutividade da mistura de reação é ajustada adicionando um tampão contendo acetato de amônio (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de ' sódio, 5 mM cloreto de cálcio, 8 M acetato de amônio, pH 6,9) e carregada - em uma coluna preenchida com 80 ml Fenil Sepharose FF (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré-equilibrada com 50 mM Hepes, 2,5 M acetato de amônio, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,9. Subsequentemente, o conjugado é eluído com 50 mM Tampão Hepes pH 7,5 contendo 5 mM | CaCl2. Finalmente as frações contendo PSA-G-CSF são coletadas e | submetidas a UF/DF pelo uso de uma membrana feita de celulose regenerada —(Millipore). A preparação é em seguida analiticamente caracterizada medindo proteína total (Coomassie, Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Em uma modalidade alternativa, o Método 1 é conduzido como a seguir. Fator estimulante de colônia de granulócito (G-CSF) é transferida em um tampão de reação (por exemplo, 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e diluído para obter uma concentração de proteína de 1 mg/ml. À esta solução, NalO4 é adicionado para gerar uma concentração final de 200 uM. A oxidação é realizada em RT for 30 min no escuro sob agitação suave, A reação é então extinta com |
: 182 cisteína (concentração final: 10 mM) por 60 min em RT.
A solução é em seguida submetida a UF/DF empregando filtradores Vivaspin por centrífuga para remover periodato em excesso, extintores e os subprodutos dos mesmos. Um excesso molar de reagente de 50 —vezesamino-oxi-PSA com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado seguido por m-toluidina como um catalisador nucleofílico (concentração | final: 10 mM). À reação de acoplamento foi realizada por 2 horas no escuro sob agitação suave em temperatura ambiente. O excesso de reagente amino- oxi é removido por meio de cromatografia de troca iônica. As frações — contendo PSA-G-CSF do eluato são coletadas e submetidas a UF/DF pelo uso de uma membrana feita de celulose regenerada (Millipore). A preparação é em seguida analiticamente caracterizada medindo proteína total (Coomassie, ' Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na - técnica. Método 2: G-CSF é transferida ou dissolvida em tampão de reação (por exemplo 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 1,0 +/- 0,25 mg/ml. Então o pH da solução é corrigido para 6,0 por adição sob gotejamento de uma solução aquosa 0,5 N de HCl. Subsequentemente, uma solução aquosa 40 mM de periodato de sódio é adicionado dentro de 10 minutos para gerar uma concentração de 200 uM. A reação de oxidação é conduzida por 30 +/- Smin em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC. Então a reação é interrompida por adição de uma solução aquosa de L-cisteína (1 M) dentro de 15 minutosem T=+22 +/-2ºC para gerar uma concentração final de 10 MM em uma mistura de reação e incubação por 60 +/- 5 min.
O G-CSF oxidado é ainda purificado por cromatografia de troca iônica. As frações contendo G-CSF oxidado de eluato são coletadas e usadas para a reação de conjugação.
O reagente amino-oxi-ácido polisiálio (PSA-ONH2) é adicionado em um excesso molar de 50 vezes ao eluato contendo to G-CSF oxidado purificado dentro de um período de tempo máximo (t) de 15 minutos em agitação suave.
Então uma solução aquosa de m-toluidina (SOMM) é — adicionada dentro de 15 minutos para obter uma concentração final de 10 : MM.
A mistura de reação é incubada por 120 +/- 10 min. em pH 6,0 no escuro Ps em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC sob agitação suave (concentração de proteína: 1 mg/ml). O conjugado PSA-G-CSF obtido é ainda purificado por cromatografia de troca iônica.
As frações contendo conjugado PSA-G-CSF são coletadas e concentradas por ultra-/diafiltração (UF/DF) usando uma membrana feita de celulose regenerada com um corte de peso molecular . apropriado (Millipore). . O conjugado preparado pelo uso deste procedimento analiticamente caracterizada medindo proteína total, atividade biológica, e determinação de grau de polisialiação medindo o teor de PSA (ensaio resorcinol). | Método 3: | Fator estimulante de colônia de granulócito (G-CSF) é transferida em tampão de reação (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e diluído para obter uma concentração de proteína de 1 mg/ml.
Um excesso molar de reagente de 50 vezes amino-oxi- | PSA com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado seguido por m- toluidina como um catalisador nucleofílico (10 mM concentração final) e — NalO4 (concentração final: 400 uM). A reação de acoplamento foi realizada por 2 horas no escuro sob agitação suave em temperatura ambiente.
Subsequentemente, a reação é extinta com cisteína por 60 min em RT (concentração de cisteína: 10 mM). Então a condutividade da mistura de | reação é ajustada adicionando um tampão contendo acetato de amônio (50
: 184 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, 8 M acetato de amônio, pH 6,9) e carregada em uma coluna preenchida com Fenil Sepharose FF (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré-equilibrada com 50 mM Hepes, 2,5 M acetato de amônio, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, 0,01 % Tween 80, pH 6,9. Subsequentemente o conjugado é eluído com 50 mM Hepes, 5 mM cloreto de cálcio, pH 7,5. Finalmente, as frações contendo PSA- G-CSF são coletadas e submetidas a UF/DF pelo uso de uma membrana feita de celulose regenerada (Millipore) A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de : 10 — acordo com métodos conhecidos na técnica.
Em uma modalidade alternativa, o Método 3 é conduzido como a seguir.
Fator estimulante de colônia de granulócito (G-CSF) é ' transferida em tampão de reação (por exemplo 50 mM Hepes, 350 mM - cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e diluído para obter uma — concentração de proteína de 1 mg/ml.
Um excesso molar de reagente de 50 | vezes amino-oxi-PSA com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado | seguido por m-toluidina como um catalisador nucleofílio (10 mM concentração final) e NalIO4 (concentração final: 400 uM). A reação de acoplamento foi realizada por 2 horas no escuro sob agitação suave em temperatura ambiente.
Subsequentemente, a reação é extinta com cisteína por 60 min em RT (concentração de cisteína: 10 mM) e o conjugado é purificado por cromatografia de troca iônica.
As frações contendo PSA-G-CSF do eluato são coletadas e submetidas a UF/DF pelo uso de uma membrana feita de celulose regenerada (Millipore). A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Método 4: G-CSF é dissolvido em ou transferido a um tampão de reação (por exemplo 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 1,0 +/- 0,25 mg/ml. Então o pH da solução é corrigido para 6,0 por adição sob gotejamento de uma solução aquosa 0,5 N de HCI. Subsequentemente, o reagente amino-oxi-ácido polisiálico —(PSA-ONH2) é adicionado em um excesso molar de 50 vezes a esta solução G-CSF dentro de um período de tempo máximo (t) de 15 minutos em agitação suave. Então uma solução aquosa de m-toluidina (S0mMM) é adicionada dentro de 15 minutos para obter uma concentração final de 10 mM. Finalmente, uma solução aquosa 40 mM de periodato de sódio é adicionado — para gerar uma concentração de 400 uM.
A mistura de reação é incubada por 120 +/- 10 min. no escuro em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC sob agitação suave. Então a * reação é interrompida pela adição de uma solução aquosa de L-cisteína (1 M) R para gerar uma concentração final de 10 mM em uma mistura de reação e incubação por 60+/-5 min.
O conjugado obtido G-CSF é purificado por cromatografia de troca iônica. As frações contendo PSA-G-CSF de eluato são coletadas e concentradas por ultra-/diafiltração (UF/DF) usando uma membrana feita de celulose regenerada (Millipore).
Os conjugados preparados pelo uso deste procedimento são analiticamente caracterizados medindo proteína total, atividade biológica de | acordo com métodos conhecidos na técnica, e determinação de grau de | polisialiação medindo o teor de PSA (ensaio resorcinol).
Exemplo 29 Polisialilação de Humira usando amino-oxi-PSA e m-toluídina como um catalisador nucleofilico Método 1: Uma concentração inicial de Humira é transferida em um tampão de reação (por exemplo 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5
. 186 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e diluído para obter uma concentração de proteína de 1 mg/ml. À esta solução, NalIO4 é adicionado para gerar uma concentração final de 200 uM. A oxidação é realizada em RT for 30 min no escuro sob agitação suave. A reação é então extinta com cisteína — (concentração final: IO mM) por 60 min em RT.
A solução é em seguida submetida a UF/DF empregando filtradores Vivaspin por centrífuga para remover periodato em excesso, extintores e os subprodutos dos mesmos ou, em alternativa, a uma coluna IEX com um volume de 20 ml (Merck EMD TMAE (M)) que é equilibrada com TampãoA (20 mM Hepes, 5 MM CaCl2, pH 7,0). A coluna é equilibrada com 5 CV Tampão A. A Humira oxidada é eluída com Tampão B (20 mM Hepes, 5 mM CaCl2, IM NaCl, pH 7,0). As frações contendo Humira são coletadas.
" O teor de proteína é determinado (Coomassie, Bradford) e ajustado para 1 - mg/ml com tampão de reação e ajustado para pH 6,0 por adição sob gotejamento de 0,5M HCl.
Um excesso molar de reagente de 50 vezes amino-oxi-PSA com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado seguido por m-toluidina como um catalisador nucleofílico (concentração final: LO mM). A reação de acoplamento foi realizada por 2 horas no escuro sob agitação suave em temperatura ambiente. O excesso de reagente amino-oxi é removido por meio de HIC. A condutividade da mistura de reação é ajustada adicionando um tampão contendo acetato de amônio (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, 8 M acetato de amônio, pH 6,9) e carregada em uma coluna preenchida com 80 ml Fenil Sepharose FF (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré-equilibrada com 50 mM Hepes, 2,5 M acetato de amônio, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,9. Subsequentemente o conjugado é eluído com 50 mM Tampão Hepes pH 7,5 contendo 5 mM CaCl2. Finalmente, as frações contendo PSA-Humira são coletadas e submetidas a UF/DF pelo uso de uma membrana feita de célulose regenerada
. 187 (Millipore). À preparação é em seguida analiticamente caracterizada medindo proteína total (Coomassie, Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Em uma modalidade alternativa, o Método 1 é conduzido comoa seguir. Humira é transferida em um tampão de reação (por exemplo 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e diluída para obter uma concentração de proteína de 1 mg/ml. À esta solução, NalO4 é adicionado para gerar uma concentração final de 200 uM. A oxidação é realizada em RT for 30 min no escuro sob agitação suave. A reação é então extinta com cisteína (concentração final: 10 mM) por 60 min em RT.
A solução é em seguida submetida a UF/DF empregando ' filtradores Vivaspin por centrífuga para remover periodato em excesso, - extintores e os subprodutos dos mesmos. Um excesso molar de reagente de 50 vezes amino-oxi-PSA com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado seguido por m-toluidina como um catalisador nucleofílico (concentração final: 10 mM). A reação de acoplamento foi realizada por 2 horas no escuro sob agitação suave em temperatura ambiente. O excesso de reagente amino- 2 oxi é removido por meio de cromatografia de troca iônica. As frações contendo PSA-Humira de eluato são coletadas e submetidas a UF/DF pelo uso de uma membrana feita de celulose regenerada (Millipore). A preparação é em seguida analiticamente caracterizada medindo proteína total (Coomassie, Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Método 2: Hurmira é transferida ou dissolvida em tampão de reação (por exemplo 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 1,0 +/- 0,25 mg/ml. Então o pH da solução é corrigido para 6,0 por adição sob gotejamento de
: 188 uma solução aquosa 0,5 N de HCl.
Subsequentemente, uma solução aquosa 40 mM de periodato de sódio é adicionado dentro de 10 minutos para gerar uma concentração de 200 uM.
A reação de oxidação é conduzida por 30 +/- Smin em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC.
Então a reação é interrompida por adição de uma solução aquosa de L-cisteína (1 M) dentro de PÁ 15 minutos em T= +22 +/- 2ºC para gerar uma concentração final de 10 mM em uma mistura de reação e incubação por 60 +/- 5 min.
Humira oxidada é ainda purificada por cromatografia de troca | iônica.
As frações contendo Humira oxidada de eluato são coletadas e usadas —paraareação de conjugação.
O reagente amino-oxi-ácido polisiálio (PSA-ONH2) é adicionado em um excesso molar de 50 vezes ao eluato contendo a Humira ' oxidada purificada dentro de um período de tempo máximo (t) de 15 minutos . em agitação suave.
Então uma solução aquosa de m-toluidina (SOMM) é adicionada dentro de 15 minutos para obter uma concentração final de 10 mM.
A mistura de reação é incubada por 120 +/- 10 min. em pH 6,0 no escuro | em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC sob agitação suave (concentração de proteína: 1 mg/ml). O conjugado PSA-Humira obtido é ainda purificado por | 20 cromatografia de troca iônica.
As frações contendo PSA-Humira são coletadas e concentradas por ultra-/diafiltração (UF/DF) usando uma membrana feita de celulose regenerada com um corte de peso molecular apropriado (Millipore). O conjugado preparado pelo uso deste procedimento —analiticamente caracterizada medindo proteína total, atividade biológica, e determinação de grau de polisialiação medindo o teor de PSA (ensaio resorcinol). Método 3: Humira é transferida em tampão de reação (50 mM Hepes, 350
| : 189
MM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e diluído para obter uma concentração de proteína de 1 mg/ml.
Um excesso molar de reagente de 50 vezes amino-oxi-PSA com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado seguido por m-toluídina como um catalisador nucleofílico (10 mM concentração final) e NalO4 (concentração final: 400 uM). A reação de acoplamento foi realizada por 2 horas no escuro sob agitação suave em temperatura ambiente.
Subsequentemente, a reação é extinta com cisteína por 60 min em RT (concentração de cisteína: 10 mM). Então a condutividade da | mistura de reação é ajustada adicionando um tampão contendo acetato de amônio (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, 8 M acetato de amônio, pH 6,9) e carregada em uma coluna preenchida com Fenil Sepharose FF (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré-equilibrada com 50 * mM Hepes, 2,5 M acetato de amônio, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto . de cálcio, 0,01 % Tween 80, pH 6,9. Subsequentemente o conjugado é eluído | 15 com 50mM Hepes, 5 mM cloreto de cálcio, pH 7,5. Finalmente as frações contendo PSA-Humira são coletadas e submetidas a UF/DF pelo uso de uma membrana feita de celulose regenerada (Millipore). A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica. | 20 Em uma modalidade alternativa, o Método 3 é conduzido como a seguir.
Humira é transferida em tampão de reação (por exemplo 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e diluído para obter uma concentração de proteína de 1 mg/ml.
Um excesso molar de reagente de 50 vezes amino-oxi-PSA com um MW de 20 kD — (descrito acima) é adicionado seguido por m-toluidina como um catalisador nucleofílico (10 mM concentração final) e NaIO4 (concentração final: 400 UM). A reação de acoplamento foi realizada por 2 horas no escuro sob agitação suave em temperatura ambiente.
Subsequentemente, a reação é extinta com cisteína por 60 min em RT (concentração de cisteína: 10 mM) e o conjugado é purificado por cromatografia de troca iônica.
As frações contendo PSA-Humira do eluato são coletadas e submetidas a UF/DF pelo uso de uma membrana feita de celulose regenerada (Millipore). A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade — biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica. o Método 4: Humira é dissolvida em ou transferida a um tampão de reação (por exemplo 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de | cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 1,0 +/- 0,25mg/ml.
Então o pH da solução é corrigido para 6,0 por adição sob gotejamento de uma solução aquosa 0,5 N de HCI.
Subsequentemente, o reagente amino-oxi-ácido polisiálico | ' (PSA-ONHD) é adicionado em um excesso molar de 50 vezes a esta solução . de Humira dentro de um período de tempo máximo (t) de 15 minutos em agitação suave.
Então uma solução aquosa de m-toluidina (SOMM) é adicionada dentro de 15 minutos para obter uma concentração final de 10 mM.
Finalmente uma solução aquosa 40 mM de periodato de sódio é adicionado para gerar uma concentração de 400 uM.
A mistura de reação é incubada por 120 +/- 10 min. no escuro em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC sob agitação suave.
Então a reação é interrompida pela adição de uma solução aquosa de L-cisteína (1 M) para gerar uma concentração final de 10 mM em uma mistura de reação e incubação por 60 +/- 5 min.
O conjugado Humira obtido é purificado por cromatografia de — troca iônica.
As frações contendo PSA-Humira de eluato são coletadas e concentradas por ultra-/diafiltração (UF/DF) usando uma membrana feita de celulose regenerada (Millipore). Os conjugados preparados pelo uso deste procedimento são analiticamente caracterizados medindo proteína total, atividade biológica de
: 191 acordo com métodos conhecidos na técnica, e determinação de grau de polisialiação medindo o teor de PSA (ensaio resorcinol). Exemplo 30 Polisialilação de Prolia usando amino-oxi-PSA e m-toluidina —comoum catalisador nucleofilico Métodó1: Uma concentração inicial de Prolia é transferida em um tampão de reação (por exemplo 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e diluído para obter uma concentração de proteína de 1 mg/ml.
À esta solução, NalO4 é adicionado para gerar uma concentração final de 200 uM.
A oxidação é realizada em RT for 30 min no escuro sob agitação suave.
A reação é então extinta com cisteína * (concentração final: 10 mM) por 60 min em RT. . A solução é em seguida submetida a UF/DF empregando Tiltradores Vivaspin por centrífuga para remover periodato em excesso, extintores e os subprodutos dos mesmos ou, em alternativa, a uma coluna IEX com um volume de 20 ml (Merck EMD TMAE (M)) que é equilibrada com Tampão A (20 mM Hepes, 5 mM CaCl2, pH 7,0). A coluna é equilibrada com 5 CV Tampão A.
A Prolia oxidada é eluída com Tampão B (20 mM Hepes, 5 mM CaCl2, IM NaCl, pH 7,0). As frações contendo Prolia são coletadas.
O teor de proteína é determinada (Coomassie, Bradford) e ajustado para 1 mg/ml com tampão de reação e ajustado para pH 6,0 por adição sob gotejamento de 0,5 M HCI.
Um excesso molar de reagente de 50 vezes amino-oxi-PSA comum MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado seguido por m-toluidina como um catalisador nucleofílico (concentração final: 10 mM). A reação de acoplamento foi realizada por 2 horas no escuro sob agitação suave em temperatura ambiente.
O excesso de reagente amino-oxi é removido por meio de HIC.
A condutividade da mistura de reação é ajustada adicionando um
: 192 tampão contendo acetato de amônio (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, 8 M acetato de amônio, pH 6,9) e carregada em uma coluna preenchida com 80 ml Fenil Sepharose FF (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré-equilibrada com 50 mM Hepes, 2,5 M acetato de amônio, 350mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,9. Subsequentemente o conjugado é eluído com 50 mé Tampão Hepes pH 7,5 contendo 5 mM CaCl2. Finalmente, as frações contendo PSA-Prolia são coletadas e submetidas a UF/DF pelo uso de uma membrana feita de celulose regenerada (Millipore). A preparação é em seguida analiticamente caracterizada medindo proteína total (Coomassie, Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Em uma modalidade alternativa, o Método | é conduzido * como a seguir. 10 mg Prolia é dissolvido em 5 ml tampão histidina, pH 6,0 - (20 mM L-histidina, 150 mM NaCl). 100 ul de uma solução aquosa de —periodato de sódio (5 mM) é então adicionada e a mistura de reação é incubada por 1 h no escuro a 4ºC em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de 50 ul de uma solução aquosa de 1 M de cisteína. A mistura é subsequentemente submetido a UF/DF empregando Vivaspin 15R 10 kD filtradores por centrífuga para remover periodato em — excesso, extintores e os subprodutos dos mesmos.
O retentado (aprox. 7 ml), contendo Prolia oxidado, é misturado com 2 ml de uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM) e incubado por 30 min em temperatura ambiente. Então reagente amino-oxi- PSA com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado para gerar um — excesso molar de reagente de 5 vezes. Esta mistura é incubada por 2,5 h em RT no escuro em agitação suave.
O Prolia livre é removido por meio de cromatografia de troca catiônica (CEC). A mistura de reação é diluída com 20 ml Tampão A (50 mM Hepes, pH 6,5) e carregada em uma coluna 20 ml HiPrep SPFF 16/10 (GE
: 193 Healthcare, Fairfield, CT) pré-equilibrada com Tampão A. Então a coluna é eluída com Tampão B (50 mM Hepes, 1 M NaCl, pH 6,5). Prolia livre é eluída lavando a coluna com 25 % Tampão B e o conjugado a 50 % Tampão B. A condutividade das frações contendo conjugado é subsequentemente — elevadapara-190mS/cm com Tampão C (50 mM Hepes, 5 M NaCl, pH 6,9) e carregada em uma coluna 20 ml HiPrep Búotl FF 16/10 (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré-equilibrada com Tampão D (50 mM Hepes, 3 M NaCl, pH 6,9). Reagente livre de PSA é lavado dentro de 5 CV Tampão D. Subsequentemente, o conjugado é eluído com 100 % Tampão E (50 mM —Hepes, pH 6,9). As frações contendo conjugado são concentradas por UF/DF usando uma membrana de 10 kD feita de celulose regenerada (88 cm2, corte 10 kD, Millipore). A etapa final de diafiltração é realizada contra tampão * histidina, pH 6,9 contendo 150 mM NaCl. A preparação é analiticamente . caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica. Para o conjugado PSA-Prolia uma atividade específica de > 50 % em comparação ao Prolia nativo é determinada. O conjugado é adicionalmente analiticamente caracterizada por HPLC por exclusão de tamanho usando um sistema Agilent 1200 HPLC equipado com uma coluna Shodex KW 803 em condições como anteriormente descrito (Kolarich et al, Transfusion 2006;46:1959-77). É demonstrado que a preparação não contém Prolia livre.
Método 2: .
Prolia é transferida ou dissolvida em tampão de reação (por exemplo 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 1,0 +/- 0,25 mg/ml. Então o pH da solução é corrigido para 6,0 por adição sob gotejamento de uma solução aquosa 0,5 N de HCl. Subsequentemente, uma solução aquosa 40 mM de periodato de sódio é adicionado dentro de 10 minutos para gerar uma concentração de 200 uM. A reação de oxidação é conduzida por 30 +/-
| 194 5min em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC. Então a reação é interrompida por adição de uma solução aquosa de L-cisteína (1 M) dentro de 15 minutos em T= +22 +/- 2ºC para gerar uma concentração final de 10 mM em uma mistura de reação e incubação por 60 +/- 5 min. Prolia oxidada é ainda purificado por cromatografia de troca iônica. As frações contendo Prolia oxidada de eluato são coletadas e usadas para a reação de conjugação. O reagente amino-oxi-ácido polisiálio (PSA-ONH2) é | adicionado em um excesso molar de 50 vezes ao eluato contendo a Prolia —oxidada purificada dentro de um período de tempo máximo (t) de 15 minutos em agitação suave. Então uma solução aquosa de m-toluidina (SO0MM) é adicionada dentro de 15 minutos para obter uma concentração final de 10 > mM. A mistura de reação é incubada por 120 +/- 10 min. em pH 6,0 no escuro O em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC sob agitação suave (concentração col de proteína: 1 mg/ml).
o O conjugado Prolia obtido é ainda purificado por cromatografia de troca iônica. As frações contendo conjugado Prolia são coletadas e concentradas por ultra-/diafiltração (UF/DF) usando uma membrana feita de celulose regenerada com um corte de peso molecular apropriado (Millipore). O conjugado preparado pelo uso deste procedimento analiticamente caracterizada medindo proteína total, atividade biológica, e determinação de grau de polisialiação medindo o teor de PSA (ensaio resorcinol). Método 3: Prolia é transferida em tampão de reação (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e diluído para obter uma concentração de proteína de 1 mg/ml. Um excesso molar de reagente de 50 vezes amino-oxi-PSA com um MW de 20 kD (descrito acima) é
| 195 adicionado seguido por m-toluidina como um catalisador nucleofílico (10 mM | concentração final) e NaIO, (concentração final: 400 uM). A reação de acoplamento foi realizada por 2 horas no escuro sob agitação suave em temperatura ambiente.
Subsequentemente, a reação é extinta com cisteína por 60minem RT (concentração de cisteína: 10 mM). Então a condutividade da mistura de reação é ajustada adicionando um tampão contendo acetato de amônio (50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, 8 M acetato de amônio, pH 6,9) e carregada em uma coluna preenchida com Fenil Sepharose FF (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré-equilibrada com 50 mM Hepes,2,5M acetato de amônio, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto | de cálcio, 0,01 % Tween 80, pH 6,9. Subsequentemente o conjugado é eluído com 50 mM Hepes, 5 mM cloreto de cálcio, pH 7,5. Finalmente as frações . contendo PSA Prolia são coletadas e submetidas a UF/DF pelo uso de uma | a membrana feita de celulose regenerada (Millipore). A preparação é -— 15 analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade ' biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Em uma modalidade alternativa, o Método 3 é conduzido como a seguir. 10 mg Prolia é dissolvido em 8 ml tampão histídina, pH 6,0 (20 mM L-histidina, 150 mM NaCl). 200 ul de uma solução aquosa de — periodato de sódio (5 mM) e 2 ml de uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM) são então adicionados.
Subsequentemente o reagente amino-oxi-PSA com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 5 vezes.
A mistura é incubada por 2 h no escuro em temperatura ambiente em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura —ambientepela adição de 100 ul de solução aquosa 1 M de cisteína.
Prolia livre é removido por meio de cromatografia de troca catiônica (CEC). A mistura de reação é diluída com 20 ml Tampão A (50 mM Hepes, pH 6,5) e carregada em uma coluna 20 ml HiPrep SPFF 16/10 (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré-equilibrada com Tampão A.
Então a coluna é eluída com Tampão B (50 mM Hepes, 1 M NaCl, pH 6,5). Prolia livre é eluída lavando a coluna com 25 % Tampão B e o conjugado a 5 0% Tampão B.
A condutividade das frações contendo conjugado é subsequentemente elevada para -190 mS/cm com Tampão C (50 mM Hepes, 5 M NaCl, pH 6,9) e carregada em uma coluna 20 ml HiPrep Butil FF 16/10 (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré-equilibrada com Tampão D (50 mM Hepes, 3 M NaCl, pH PÓ 6,9). Reagente livre de PSA é lavado dentro de 5 CV Tampão D.
Subsequentemente o conjugado é eluído com 100% Tampão E (50 mM Hepes, pH 6,9). As frações contendo conjugado são concentradas por UF/DF —usandouma membrana de 10 kD feita de celulose regenerada (88 cm”, corte 10 kD / Millipore). A etapa final de diafiltração é realizada contra tampão histidina, pH 6,9 contendo 150 mM NaCl.
A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de a acordo com métodos conhecidos na técnica.
Para o conjugado PSA-Prolia uma atividade específica de > 50 % em comparação ao Prolia nativo é ' determinada.
O conjugado é adicionalmente analiticamente caracterizada por HPLC por exclusão de tamanho usando um sistema Agilent 1200 HPLC equipado com uma coluna Shodex KW 803 em condições como anteriormente descrito (Kolarich et al, Transfusion 2006;46:1959-77). É demonstrado que a preparação não contém Prolia livre.
Método 4: Prolia é dissolvida em ou transferida a um tampão de reação (por exemplo 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 1,0 +/- 0,25mg/ml.
Então o pH da solução é corrigido para 6,0 por adição sob gotejamento de uma solução aquosa 0,5 N de HCI.
Subsequentemente o reagente amino-oxi-ácido polisiálico (PSA-ONH;>) é adicionado em um excesso molar de 50 vezes a esta solução de Prolia dentro de um período de tempo máximo (t) de 15 minutos em agitação suave.
Então uma solução aquosa de m-toluidina (SOMM) é adicionada dentro de 15 minutos para obter uma concentração final de 10 mM.
Finalmente uma solução aquosa 40 mM de periodato de sódio é adicionado para gerar uma concentração de 400 uM.
A mistura de reação é incubada por 120 +/- 10 min. no escuro em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC sob agitação suave.
Então a reação é interrompida pela adição de uma solução aquosa de L-cisteína (1 M) para gerar uma concentração final de 10 mM em uma mistura de reação e incubação por 60 +/- 5 min.
O conjugado de Prolia obtido é purificado por cromatografia de troca iônica.
As frações contendo PSA-Prolia de eluato são coletadas e concentradas por ultra- / diafiltração (UF/DF) usando uma membrana feita de celulose regenerada (Millipore). . Os conjugados preparados pelo uso deste procedimento são —analiticamente caracterizados medindo proteína total, atividade biológica de ' acordo com métodos conhecidos na técnica, e determinação de grau de polisialiação medindo o teor de PSA (ensaio resorcinol). Exemplo 31 Polisialilação de outras proteínas terapêuticas Reações de polisialilação realizadas na presença de catalisadores nucleofílicos alternativos como m-toluidina ou ácido o- aminobenzoico como descrito aqui podem ser realizadas a outras proteínas terapêuticas.
Por exemplo, em vários aspectos da invenção, as reações acima de polisialilação ou peguilação como descrito aqui com reagentes PSA amino- —oxiouPEG amino-oxisão repetidas com proteínas terapêuticas como aquelas proteínas descritas aqui.
Exemplo 32 Peguilação de EPO usando um reagente amino-oxi-PEG e m- . toluidina como um catalisador nucleofilico
| 198 | Método 1: Eritropoietina (EPO) é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi. Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão).
—EPO é dissolvido em 7,0 ml tampão histidina, pH 6,0 (20 mM L-histidina, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2). Uma solução aquosa de periodato de sódio (5. mM) é então adicionada e a mistura de reação é incubada por 1 h no escuro a 4ºC em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de 7,5 ul de uma solução aquosa de 1 M de cisteína. A mistura é — 10 subsequentemente submetida a UF/DF empregando filtradores Vivaspin por centrífuga para remover periodato em excesso, extintores e os subprodutos dos mesmos.
O retentado contendo EPO oxidado é em seguida misturado 2 com uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM) e incubado por 30 min em temperatura ambiente. Reagente amino-oxi-PEG com um MW de 20 kD é ' então adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 5 vezes. Esta mistura é incubada por 2,5 h em temperatura ambiente no escuro em agitação suave.
Finalmente, o conjugado PEG-EPO é purificado por 20 . cromatografia de troca iônica (por exemplo em Q Sepharose FF). Por exemplo, 1,5 mg proteina/ml gel é carregada em uma coluna equilibrada com 50 mM Tampão Hepes, pH 7,4 contendo 5 mM CaCl;. O conjugado é eluído | com 50 mM Tampão Hepes contendo 5 mM CaCl; and 500 mM cloreto de sódio, pH 7,4 e é então submetido a UF/DF usando uma membrana de MW de corte apropriado. A preparação é em seguida analiticamente caracterizada medindo proteína total (Coomassie, Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Em uma modalidade alternativa, o Método 1 é conduzido | como a seguir. EPO é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 |
| 199 kD contendo um grupo amino-oxi. Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). 10 mg de EPO é dissolvido em 5 ml tampão histidina, pH 6,0 (20 mM L-histidina, 150 mM NaCl). 100 ul de uma solução aquosa de periodato de sódio (5 mM) é então —adicionadae a mistura de reação é incubada por 1 h no escuro a 4ºC em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de 50 ul de uma solução aquosa de 1 M de cisteína, A mistura é subsequentemente submetido a UF/DF empregando Vivaspin 15R 10 kD | filtradores por centrífuga para remover periodato em excesso, extintores e os subprodutos dos mesmos.
O retentado (aprox. 7 ml), contendo EPO oxidado, é misturado com 2 ml de uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM) e incubado por 30 min em temperatura ambiente. Então reagente amino-oxi-PEG com um MW - de 20 kD (descrito acima) é adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 5 vezes. Esta mistura é incubada por 2,5 h em RT no escuro em ' agitação suave. Finalmente, o conjugado PEG-EPO é purificado por cromatografia de troca iônica em Q Sepharose FF. A mistura de reação é | diluída com 20 ml Tampão A (50 mM Hepes, pH 7,5) e carregada em uma | 20 coluna 20 ml HiPrep QFF 16/10 (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré- | equilibrada com Tampão A. Então a coluna é eluída com Tampão B (50 mM Hepes, 1 M NaCl, pH 7,5). EPO livre é eluída lavando a coluna com 25 % Tampão B e o conjugado a 50 % Tampão B. As frações contendo conjugado são concentradas por UF/DF usando uma membrana de 10 kD feita de celulose regenerada (88 cm2, corte 10 kD / Millipore). A etapa final de diafiltração é realizada contra tampão histidina, pH 7,2 contendo 150 mM NaCl. A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.. Para o conjugado PEG-EPO uma atividade específica
| 200 de > 50 % em comparação ao EPO nativo é determinada. O conjugado é adicionalmente analiticamente caracterizada por HPLC por exclusão de tamanho usando um sistema Agilent 1200 HPLC equipado com uma coluna Shodex KW 803 em condições como anteriormente descrito (Kolarich et al, S —Transfusion 2006;46:1959-77). É demonstrado que a preparação não contém EPO livre. Método 2: EPO é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 | kD contendo um grupo amino-oxi. Um exemplo deste tipo de reagente é | 10 Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). EPO é transferida ou dissolvida em tampão de reação (por exemplo 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, PH 6,0) para obter concentração de proteína final de 1,0 +/- 0,25 mg/ml. . Então o pH da solução é corrigido para 6,0 por adição sob gotejamento de uma solução aquosa 0,5 N de HCI. Subsequentemente uma solução aquosa 40 ' mM de periodato de sódio é adicionado dentro de 10 minutos para gerar uma concentração de 200 uM. A reação de oxidação é conduzida por 30 +/- 5 min em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC. Então a reação é interrompida por adição de uma solução aquosa de L-cisteína (1 M) dentro de 15 minutos em T=+22+/-2ºC para gerar uma concentração final de 10 MM em uma mistura de reação e incubação por 60 +/- 5 min.
O EPO oxidado é ainda purificado por cromatografia de troca iônica. Frações contendo EPO oxidado de eluato são coletadas e usadas para a reação de conjugação.
O reagente amino-oxi-PEG com um MW de reagente 20 kD é adicionado em um excesso molar de 50 vezes ao eluato contendo a EPO oxidada purificada dentro de um período de tempo máximo (t) de 15 minutos | em agitação suave. Então uma solução aquosa de m-toluidina (SOMM) é adicionada dentro de 15 minutos para obter uma concentração final de 10
. 201 mM.
A mistura de reação é incubada por 120 +/- 10 min. no escuro em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC sob agitação suave.
O conjugado PEG- EPO obtido é ainda purificado por cromatografia de troca iônica.
As frações contendo PEG-EPO são coletadas e . 5 concentradas por ultra-/diafiltração (UF/DF) usando uma membrana feita de celulose regenerada com um corte de peso molecular apropriado (Millipore). Os conjugados preparados pelo uso deste procedimento são analiticamente caracterizados medindo proteína total e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Método 3: EPO é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). EPO é NS dissolvido em Tampão Hepes (50 mM Hepes, 150 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e misturado com uma solução aquosa de periodato de sódio (10 mM), e uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM). Subsequentemente, o reagente amino-oxi é adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 20 vezes.
A mistura é incubada por 2 h no escuro em temperatura ambiente em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de 8 ul de solução aquosa de cisteína (1 M). | Finalmente, o conjugado PEG-EPO é purificado por | cromatografia de troca iônica em Q Sepharose FF. 1,5 mg proteína/ml gel é carregada em uma coluna pré-equilibrada com 50 mM Tampão Hepes, pH 7,4 contendo 5 mM CaCl2. O conjugado é eluído com 50 mM Tampão Hepes —contendo5 mM CaCl2 and 500 mM cloreto de sódio, pH 7,4 e é então submetido a UF/DF usando uma membrana.
A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Em uma modalidade alternativa, o Método 3 é conduzido
: 202 | como a seguir.
EPO é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). 10 mg EPO é dissolvido em —8 ml tampão histidina, pH 6,0 (20 mM L-histidina, 150 mM — NaCl) 200 ulde uma solução aquosa de periodato de sódio (5 mM) e 2 ml de ÕÓ uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM) são então adicionados.
Subsequentemente, o reagente amino-oxi-PEG com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 5 vezes.
A mistura é incubada por 2 h no escuro em temperatura ambiente em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de | 100 ul de solução aquosa 1 M de cisteína. | Finalmente, o conjugado PEG-EPO é purificado por cromatografia de troca iônica em Q Sepharose FF.
À mistura de reação é - diluída com 20 ml Tampão A (50 mM Hepes, pH 7,5) e carregada em uma coluna 20 ml HiPrep QFF 16/10 (GE Healtheare, Fairfield, CT) pré- equilibrada com Tampão A.
Então a coluna é eluída com Tampão B (50 mM Hepes, 1 M NaCl, pH 7,5). EPO livre é eluída lavando a coluna com 25 % | Tampão B e o conjugado a 50 % Tampão B.
As frações contendo conjugado são concentradas por UF/DF usando uma membrana de 10 kD feita de celulose regenerada (88 cm2, corte 10 kD / Millipore). A etapa final de diafiltração é realizada contra tampão histidina, pH 7,2 contendo 150 mM NaCl.
A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Para o conjugado PEG-EPO uma atividade específica de > 50 % em comparação ao EPO nativo é determinada.
O conjugado é adicionalmente analiticamente caracterizada por HPLC por exclusão de tamanho usando um sistema Agilent 1200 HPLC equipado com uma coluna Shodex KW 803 em condições como anteriormente descrito (Kolarich et al, Transfusion 2006;46:1959-77). É demonstrado que a preparação não contém EPO livre.
| | « : 203 Método 4: EPO é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp.
Tóquio, Japão). Uma concentração inicial ou peso de EPO é transferida ou dissolvida em Tampão Hepés (50 mM Hepes, 150 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH | 6,0) para obter concentração de proteína final de 2 mg EPO / ml. | Subsequentemente uma solução aquosa 5 mM de periodato de sódio é | adicionado dentro de 15 minutos para gerar uma concentração final de 100 uM, seguido pela adição de uma solução aquosa 50 mM de m-toluidina para obter uma concentração final de 10 mM dentro de um período de tempo de 30 minutos.
Então o reagente amino-oxi-PEG com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 20 - vezes.
Após correção do pH a 6,0 a mistura é incubada por 2 h no escuro em temperatura ambiente em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de uma solução aquosa 1 M de L-cisteína para gerar uma concentração final de 10 mM.
O conjugado PEG-EPO é purificado por meios de cromatografia de troca iônica (IEC). As frações de eluato contendo conjugado são concentradas por UF/DF usando uma membrana de 10 kD feita de celulose regenerada (88 cm”, corte 10 kD / Millipore). A etapa final de diafiltração é realizada contra Tampão Hepes (50 mM Hepes, 5 mM CaCl,, PH 7,5). A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína — total (procedimento Bradford e BCA) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos.
Exemplo 33 Peguilação de Ang-2 usando um reagente amino-oxi-PEG e m- toluidina como um catalisador nucleofílico
' 204 Método 1: Ang-2 é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). Ang-2 é — dissolvido em 7,0 ml tampão histidina, pH 6,0 (20mM L-histidina, 150 mM NaCl, 5 mM Ca). Uma solução aquosa de periodato de sódio (5 mM) é então adicionada e a mistura de reação é incubada por 1 h no escuro a 4ºC em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de | 7,5 ul de uma solução aquosa de 1 M de cisteina.
À mistura é — subsequentemente submetida a UF/DF empregando filtradores Vivaspin por centrífuga para remover periodato em excesso, extintores e os subprodutos dos mesmos.
O retentado contendo Ang-2 oxidado é, em seguida, misturado - com uma solução aquosa de m-toluídina (50 mM) e incubado por 30 min em temperatura ambiente.
Reagente amino-oxi-PEG com um MW de 20 kD é então adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 5 vezes.
Esta | mistura é incubada por 2,5 h em temperatura ambiente no escuro em agitação suave, Finalmente, o conjugado PEG-Ang-2 é purificado por cromatografia de troca iônica (por exemplo em Q Sepharose FF). Por exemplo, 1,5 mg proteína/ml gel é carregada em uma coluna equilibrada com 50 mM Tampão Hepes, pH 7,4 contendo 5 mM CaCl2. O conjugado é eluído com 50 mM Tampão Hepes contendo 5 mM CaCl2 and 500 mM cloreto de | sódio, pH 7,4 e é então submetido a UF/DF usando uma membrana de MW de corte apropriado.
A preparação é em seguida analiticamente caracterizada medindo proteína total (Coomassie, Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Em uma modalidade alternativa, o Método 1 é conduzido como a seguir.
Ang-2 é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de |
: Ai | 205 20 kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é | Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). Ang-2 é dissolvido em 7,0 ml tampão histidina, pH 6,0 (20mM L-histidina, 150 mM | ' NaCl, 5 mM CaCl2). Uma solução aquosa de periodato de sódio (5 mM) é —entãoadicionadaea mistura de reação é incubada por 1 h no escuro a 4ºC em | agitação suave e extinta por TS min em temperatura ambiente pela adição de 7,5 ul de uma solução aquosa de 1 M de cisteina.
À mistura é | subsequentemente submetida a UF/DF empregando filtradores Vivaspin por centrífuga para remover periodato em excesso, extintores e os subprodutos —dosmesmos.
O retentado contendo Ang-2 oxidado é, em seguida, misturado com uma solução aquosa de m-toluidina (S0 mM) e incubado por 30 min em temperatura ambiente.
Reagente amino-oxi-PEG com um MW de 20 kD é - então adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 5 vezes.
Esta —misturaé incubada por 2,5 h em temperatura ambiente no escuro em agitação : suave.
Finalmente, o conjugado PEG-Ang-2 é purificado por | cromatografia de troca iônica.
As frações contendo conjugados de eluato são coletadas e então submetidas a UF/DF usando uma membrana de MW de corte apropriado.
A preparação é em seguida analiticamente caracterizada | medindo proteína total (Coomassie, Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Método 2: Ang-2 é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de —20kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). Ang-2 é transferida ou dissolvida em tampão de reação (por exemplo 50mM Hepes, 350mM cloreto de sódio, SMM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 1,0 +/- 0,25 mg/ml.
Então o
: 206 pH da solução é corrigido para 6,0 por adição sob gotejamento de uma | solução aquosa 0,5 N de HCl. Subsequentemente uma solução aquosa 40 mM | de periodato de sódio é adicionado dentro de 10 mínutos para gerar uma concentração de 200 uM. A reação de oxidação é conduzida por 30 +/- 5 min em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC. Então a reação é interrompida por adição de uma solução aquosa de A cistelna (1 M) dentro de 15 minutos em T= +22 +/- 2ºC para gerar uma concentração final de 10 mM em uma mistura de reação e incubação por 60 +/- 5 min.
A Ang-2 oxidada é ainda purificado por cromatografia de troca iônica. Frações contendo Ang-2 oxidada de eluato são coletadas e usadas para a reação de conjugação.
; : O reagente amino-oxi-PEG com um MW de reagente 20 kD é adicionado em um excesso molar de 50 vezes ao eluato contendo Ang-2 - oxidado purificado dentro de um período de tempo máximo (t) de 15 minutos em agitação suave. Então uma solução aquosa de m-toluidina (SO MM) é adicionada dentro de 15 minutos para obter uma concentração final de 10 mM. A mistura de reação é incubada por 120 +/- 10 min. no escuro em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC sob agitação suave.
O conjugado PEG- Ang-2 obtido é ainda purificado por | 20 cromatografia de troca iônica. Frações contendo conjugado PEG-Ang-2 são | coletadas e concentradas por ultra- / diafiltração (UF/DF) usando uma membrana feita de celulose regenerada com um corte de peso molecular apropriado (Millipore).
Os conjugados preparados pelo uso deste procedimento são 25 —analiticamente caracterizados medindo proteína total e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Método 3: Ang-2 é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de kD contendo um grupo amino-oxi. Um exemplo deste tipo de reagente é
' 207 Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). Ang-2 é | dissolvido em Tampão Hepes (50 mM Hepes, 150 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e misturado com uma solução aquosa de periodato de sódio (10 mM), e uma solução aquosa de m-toluidina (50 MM). — Subsequentemente 6 reagente amino-oxi é adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 20 vezes. A mistura é incubáda por 2 h no escuro em temperatura ambiente em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de 8 ul de solução aquosa de cisteína (1 M). Finalmente, o conjugado PEG-Ang-2 é purificado por cromatografia de troca iônica em Q Sepharose FF. 1,5 mg proteína/ml gel é carregada em uma coluna pré-equilibrada com 50 mM Tampão Hepes, pH 7,4 contendo 5 mM CaCl2. O conjugado é eluído com 50 mM Tampão Hepes contendo 5 mM CaCl2 e 500 mM cloreto de sódio, pH 7,4 e é então - submetido a UF/DF usando uma membrana. A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de i acordo com métodos conhecidos na técnica.
| Em uma modalidade alternativa, o Método 3 é conduzido | como a seguir. Ang-2 é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de kD contendo um grupo amino-oxi. Um exemplo deste tipo de reagente é 20 —Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). Ang-2 é dissolvido em Tampão Hepes (50 mM Hepes, 150 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e misturado com uma solução aquosa de periodato de sódio (10 mM), e uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM). Subsequentemente o reagente amino-oxi é adicionado para gerar um excesso — molar de reagente de 20 vezes. À mistura é incubada por 2 h no escuro em temperatura ambiente em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de 8 ul de solução aquosa de cisteína (1 M). Finalmente o conjugado PEG-Ang-2 é purificado por cromatografia de troca iônica. As frações de eluato contendo conjugado são
| 208 coletadas e então submetidas a UF/DF.. A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Método 4: Ang-2 é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi. Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright&ê CA series de NOF (NOF Corp. Tóquio, Japão) Uma concentração inicial ou peso de Ang-2 é transferida ou dissolvida em Tampão Hepes (50 mM Hepes, 150 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 2 mg Ang-2 / ml. Subsequentemente uma solução aquosa 5 mM de periodato de sódio é | adicionado dentro de 15 minutos para gerar uma concentração final de 100 uM, seguido pela adição de uma solução aquosa 50 mM de m-toluidina ' para obter uma concentração final de 10 mM dentro de um período de tempo de 30 minutos. Então o reagente amino-oxi-PEG com um MW de 20 kD : (descrito acima) é adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 20 | vezes. Após correção do pH a 6,0 a mistura é incubada por 2 h no escuro em temperatura ambiente em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de uma solução aquosa 1M de L-cisteína para gerar uma — concentração final de 10 MM.
O conjugado PEG-Ang-2 é purificado por meios de cromatografia de troca iônica (TEC). As frações de eluato contendo conjugado são concentradas por UF/DF usando uma membrana de 10 kD feita de celulose regenerada (88 cm2, corte 10 kD / Millipore). A etapa final de —diafiltração é realizada contra Tampão Hepes (50 mM Hepes, 5 mM CaCl2, PH 7,5).
A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (procedimento Bradford e BCA) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos..
. 209 Subsequentemente, o Ang-2 livre é removido por meio de cromatografia de troca iônica (IEC). Frações de eluato contendo conjugado são concentradas por UF/DF. Exemplo 34 Peguilação de VEGF usando um reagente amino-oxi-PEG e m-toluidina como um catalisador nucleofilico PÓ Método 1: VEGF é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi. Um exemplo deste tipo de reagente é —Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). VEGF é dissolvido em 7,0 ml! tampão histidina, pH 6,0 (20OmM L-histidina, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2). Uma solução aquosa de periodato de sódio (5 mM) é então adicionada e a mistura de reação é incubada por 1 h no escuro a 4ºC em - agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de 7,5 nl de uma solução aquosa de 1] M de cisteina, A mistura é subsequentemente submetida a UF/DF empregando filtradores Vivaspin por centrífuga para remover periodato em excesso, extintores e os subprodutos dos mesmos. O retentado contendo VEGF oxidado é, em seguida, misturado —comuma solução aquosa de m-toluidina (50 mM) e incubado por 30 min em temperatura ambiente. Reagente amino-oxi-PEG com um MW de 20 kD é então adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 5 vezes. Esta mistura é incubada por 2,5 h em temperatura ambiente no escuro em agitação suave.
Finalmente, o conjugado PEG- VEGF é purificado por cromatografia de troca iônica (por exemplo, em Q Sepharose FF). Por | exemplo, 1,5 mg proteína/ml gel é carregada em uma coluna equilibrada com | 50 mM Tampão Hepes, pH 7,4 contendo 5 mM CaCl2. O conjugado é eluído com 50 mM Tampão Hepes contendo 5 mM CaCl2 e 500 mM cloreto de
. 210 sódio, pH 7,4 e é então submetido a UF/DF usando uma membrana de MW de corte apropriado.
A preparação é em seguida analiticamente caracterizada medindo proteína total (Coomassie, Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Em uma modalidade alternativa, o Método 1 é conduzido r como a seguir.
VEGF é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de a | 20 kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é | Sunbright& CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). VEGF é dissolvido em 7,0 ml tampão histidina, pH 6,0 (20mM L-histidina, 150 mM | | 10 NaCl, 5 mM CaCl2). Uma solução aquosa de periodato de sódio (5 mM) é então adicionada e a mistura de reação é incubada por 1 h no escuro a 4ºC em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de 7,5 pl de uma solução aquosa de 1 M de cisteína, A mistura é o subsequentemente submetida a UF/DF empregando filtradores Vivaspin por centrífuga para remover periodato em excesso, extintores e os subprodutos dos mesmos.
O retentado contendo VEGF oxidado é, em seguida, misturado com uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM) e incubado por 30 min em temperatura ambiente.
Reagente amino-oxi-PEG com um MW de 20 kD é então adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 5 vezes.
Esta | mistura é incubada por 2,5 h em temperatura ambiente no escuro em agitação suave.
Finalmente, o conjugado PEG- VEGF é purificado por cromatografia de troca iônica.
Frações de eluato contendo conjugado são — coletadas e então submetidas a UF/DF usando uma membrana de MW de corte apropriado.
A preparação é em seguida analiticamente caracterizada | medindo proteína total (Coomassie, Bradford) e atividade biológica de acordo | com métodos conhecidos na técnica. | Método 2:
| a . 211 VEGF é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de | 20 kD contendo um grupo amino-oxi. Um exemplo deste tipo de reagente é | Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão).VEGF é transferida ou dissolvida em tampão de reação (por exemplo 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 1,0 +/- 0,25 mg/ml. Então o pH da solução é corrigido para 6,0 por adição sob gotejamento de uma solução aquosa 0,5 N | de HCl. Subsequentemente, uma solução aquosa 40 mM de periodato de sódio é adicionado dentro de 10 minutos para gerar uma concentração de 200 uUM.A reação de oxidação é conduzida por 30 +/- 5 min em uma temperatura (TD) de T= +22 +/- 2ºC. Então a reação é interrompida por adição de uma solução aquosa de L-cisteína (1 M) dentro de 15 minutos em T= +22 +- 2ºC para gerar uma concentração final de 10 mM em uma mistura de reação e - incubação por 60 +/- 5 min. O VEGF oxidado é ainda purificado por cromatografia de : troca iônica. Frações contendo VEGF oxidado de eluato são coletadas e usadas para a reação de conjugação. O reagente amino-oxi-PEG com um MW de reagente 20 kD é adicionado em um excesso molar de 50 vezes ao eluato contendo VEGF oxidado purificado dentro de um período de tempo máximo (t) de 15 minutos em agitação suave. Então uma solução aquosa de m-toluidina (SO MM) é adicionada dentro de 15 minutos para obter uma concentração final de 10 mM. A mistura de reação é incubada por 120 +/- 10 min. no escuro em uma temperatura (T) de T=+22 +/- 2ºC sob agitação suave.
O conjugado PEG-VEGF obtido é ainda purificado por cromatografia de troca iônica. As frações contendo conjugado PEG-VEGF são coletadas e concentradas por ultra-/diafiltração (UF/DF) usando uma membrana feita de celulose regenerada com um corte de peso molecular | apropriado (Millipore).
| a - 212 Os conjugados preparados pelo uso deste procedimento são analiticamente caracterizados medindo proteína total e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica. | Método 3: | 5 VEGF é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de | 20 kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright& CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). VEGF é dissolvido em Tampão Hepes (50 mM Hepes, 150 mM cloreto de sódio, 5 | mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e misturado com uma solução aquosa de —periodato de sódio (10 mM), e uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM). Subsequentemente, o reagente amino-oxi é adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 20 vezes.
A mistura é incubada por 2 h no escuro em temperatura ambiente em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura - ambiente pela adição de 8 ul de solução aquosa de cisteína (1 M). Finalmente, o conjugado PEG- VEGF é purificado por cromatografia de troca iônica em Q Sepharose FF. 1,5 mg proteína/ml gel é carregada em uma coluna pré-equilibrada com SO mM Tampão Hepes, pH 7,4 contendo 5 mM CaCl2. O conjugado é eluído com 50 mM Tampão Hepes contendo 5 mM CaCl2 e 500 mM cloreto de sódio, pH 7,4 e é então —submetidoa UF/DF usando uma membrana.
A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Em uma modalidade alternativa, o Método 3 é conduzido como a seguir.
VEGF é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de —20KkD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é | Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). VEGF é dissolvido em Tampão Hepes (50 mM Hepes, 150 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e misturado com uma solução aquosa de periodato de sódio (10 mM), e uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM).
Subsequentemente, o reagente amino-oxi é adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 20 vezes. A mistura é incubada por 2 h no escuro em temperatura ambiente em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de 8 ul de solução aquosa de cisteína (1 M).
Finalmente, o conjugado PEG-VEGF é purificado por cromatografia de troca iônica. As frações de eluato contendo conjugado são coletadas e então submetidas a UF/DF. A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Método 4: VEGF é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de kD contendo um grupo amino-oxi. Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbrightê CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). Uma - concentração inicial ou peso de VEGF é transferida ou dissolvida em Tampão 15º Hepes (50 mM Hepes, 150 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH i 6,0) para obter concentração de proteína final de 2 mg VEGF / ml. Subsequentemente, uma solução aquosa 5 mM de periodato de sódio é adicionada dentro de 15 minutos para gerar uma concentração final de 100 uM, seguido pela adição de uma solução aquosa 50 mM de m-toluidina 20 para obter uma concentração final de 10 mM dentro de um período de tempo de 30 minutos. Então o reagente amino-oxi-PEG com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 20 vezes. Após correção do pH a 6,0 a mistura é incubada por 2 h no escuro em temperatura ambiente em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de uma solução aquosa 1M de L-cisteína para gerar uma concentração final de 10 mM. O conjugado PEG-VEGF é purificado por meios de cromatografia de troca iônica (IEC). Frações de eluato contendo conjugado são concentradas por UF/DF usando uma membrana de 10 kD feita de celulose regenerada (88 cem2, corte 10 kD / Millipore). A etapa final de diafiltração é realizada contra Tampão Hepes (50 mM Hepes, 5 mM CaCl2, pH 7,5). A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (procedimento Bradford e BCA) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos.
Exemplo 35 Peguilação de EGF usando um reagente amino-oxi-PEG e m- toluidina como um catalisador nucleofílico Método 1: EGF é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi. Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). EGF é ' dissolvido em 7,0 ml tampão histidina, pH 6,0 (2OmM L-histidina, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2). Uma solução aquosa de periodato de sódio (5 mM) é ' então adicionada e a mistura de reação é incubada por 1 h no escuro a 4ºC em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de 7,5 ul de uma solução aquosa de 1 M de cisteíina, À mistura é subsequentemente submetida a UF/DF empregando filtradores Vivaspin por centrífuga para remover periodato em excesso, extintores e os subprodutos dos mesmos.
O retentado contendo EGF oxidado é, em seguida, misturado com uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM) e incubado por 30 min em temperatura ambiente. Reagente amino-oxi-PEG com um MW de 20 kD é então adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 5 vezes. Esta mistura é incubada por 2,5 h em temperatura ambiente no escuro em agitação suave.
Finalmente, o conjugado PEG-EGF é purificado por cromatografia de troca iônica (por exemplo em Q Sepharose FF). Por exemplo, 1,5 mg proteína/ml gel é carregada em uma coluna equilibrada com 50 mM Tampão Hepes, pH 7,4 contendo 5 mM CaCl2. O conjugado é eluído com 50 mM Tampão Hepes contendo 5 mM CaCl2 e 500 mM cloreto de sódio, pH 7,4 e é então submetidas a UF/DF usando uma membrana de MW — de corte apropriado.
A preparação é em seguida analiticamente caracterizada É o medindo proteína total (Coomassie, Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Em uma modalidade alternativa, o Método | é conduzido como a seguir.
EGF é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 KkD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). EGF é dissolvido em 7,0 ml tampão histidina, pH 6,0 (20mM L-histidina, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2). Uma solução aquosa de periodato de sódio (5 MM) é . então adicionada e a mistura de reação é incubada por 1 h no escuro a 4ºC em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de 7,5 pl de uma solução aquosa de 1 M de cisteína, A mistura é subsequentemente submetida a UF/DF empregando filtradores Vivaspin por centrífuga para remover periodato em excesso, extintores e os subprodutos dos mesmos.
O retentado contendo EGF oxidado é, em seguida, misturado com uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM) e incubado por 30 min em temperatura ambiente.
Reagente amino-oxi-PEG com um MW de 20 kD é então adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 5 vezes.
Esta mistura é incubada por 2,5 h em temperatura ambiente no escuro em agitação suave Finalmente, o conjugado PEG-EGF é purificado por cromatografia de troca iônica.
As frações contendo conjugados de eluato são coletadas e então submetidas a UF/DF usando uma membrana de MW de corte apropriado.
A preparação é em seguida analiticamente caracterizada medindo proteína total (Coomassie, Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Método 2: EGF é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 —kD contendo um grupo amino-oxi. Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbrighto CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). EGF é transferida ou dissolvida em tampão de reação (por exemplo 50 mM Hepes, | 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 1,0 +/- 0,25 mg/ml. Então o pH da solução é — corrigido para 6,0 por adição sob gotejamento de uma solução aquosa 0,5 N de HCl, Subsequentemente, uma solução aquosa 40 mM de periodato de sódio é adicionado dentro de 10 minutos para gerar uma concentração de 200 ' UM. A reação de oxidação é conduzida por 30 +/- 5 min em uma temperatura . (TD) de T= +22 +/- 2ºC. Então a reação é interrompida por adição de uma solução aquosa de L-cisteína (1 M) dentro de 15 minutos em T=+22 +/- 2ºC para gerar uma concentração final de 10 mM em uma mistura de reação e incubação por 60 +/- 5 min.
O EGF oxidado é ainda purificado por cromatografia de troca iônica. As frações contendo EGF oxidado de eluato são coletadas e usadas —paraareação de conjugação.
O reagente amino-oxi-PEG com um MW de reagente 20 kD é adicionado em um excesso molar de 50 vezes ao eluato contendo o NGF oxidado purificado dentro de um período de tempo máximo (t) de 15 minutos em agitação suave. Então uma solução aquosa de m-toluidina (SOMM) é adicionada dentro de 15 minutos para obter uma concentração final de 10 mM. A mistura de reação é incubada por 120 +/- 10 min. no escuro em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC sob agitação suave.
O conjugado PEG- EGF obtido é ainda purificado por cromatografia de troca iônica. As frações contendo PEG-EGF são coletadas e
MM A 217 concentradas por ultra- / diafiltração (UF/DF) usando uma membrana feita de celulose regenerada com um corte de peso molecular apropriado (Millipore). Os conjugados preparados pelo uso deste procedimento são analiticamente caracterizados medindo proteína total e atividade biológica de — acordocom métodos conhecidos na técnica. Ps Método 3: EGF é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi. Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). EGF é — dissolvido em Tampão Hepes (50 mM Hepes, 150 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e misturado com uma solução aquosa de periodato de sódio (10 mM), e uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM). Subsequentemente o reagente amino-oxi é adicionado para gerar um excesso . molar de reagente de 20 vezes. A mistura é incubada por 2 h no escuro em temperatura ambiente em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ' ambiente pela adição de 8 ul de solução aquosa de cisteína (1 M). Finalmente, o conjugado PEG-EGF é purificado por cromatografia de troca iônica em Q Sepharose FF. 1,5 mg proteína/ml gel é carregada em uma coluna pré-equilibrada com 50 mM Tampão Hepes, pH 7,4 — contendo 5 mM CaCl2. O conjugado é eluído com 50 mM Tampão Hepes contendo 5 mM CaCl2 e 500 mM cloreto de sódio, pH 7,4 e é então submetidas a UF/DF usando uma membrana. A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Em uma modalidade alternativa, o Método 3 é conduzido como a seguir. EGF é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 KkD contendo um grupo amino-oxi. Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). EGF é dissolvido em Tampão Hepes (50 mM Hepes, 150 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e misturado com uma solução aquosa de periodato de sódio (10 mM), e uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM). Subsequentemente o reagente amino-oxi é adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 20 vezes.
À mistura é incubada por 2 h no escuro em — temperatura ambiente em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição-de 8 ul de solução aquosa de cisteína (1 M). Finalmente, o conjugado PEG-EGF é purificado por cromatografia de troca iônica.
As frações de eluato contendo conjugado são coletadas e então submetidas a UF/DF.
A preparação é analiticamente — caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Método 4: EGF é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 . kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp.
Tóquio, Japão). Uma concentração inicial ou peso de EGF é transferida ou dissolvida em Tampão Hepes (50 mM Hepes, 150 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 2 mg EGF / ml. | Subsequentemente uma solução aquosa 5 mM de periodato de sódio é | adicionado dentro de 15 minutos para gerar uma concentração final de | | 100 uM, seguido pela adição de uma solução aquosa 50 mM de m-toluidina para obter uma concentração final de 10 mM dentro de um período de tempo de 30 minutos.
Então o reagente amino-oxi-PEG com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 20 vezes.
Após correção do pH a 6,0 a mistura é incubada por 2 h no escuro em | temperatura ambiente em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura | | ambiente pela adição de uma solução aquosa 1M de Lr-cisteina para gerar uma | concentração final de 10 mM. | O conjugado PEG-EGF é purificado por meios de | cromatografia de troca iônica (IEC). Frações de eluato contendo conjugado são concentradas por UF/DF usando uma membrana de 10 kD feita de celulose regenerada (88 cm2, corte 10 kD / Millipore). A etapa final de diafiltração é realizada contra Tampão Hepes (50 mM Hepes, 5 mM CaCl2, | 5 pH7,5). A preparação é anáfiticamente caracterizada medindo proteína total (procedimento Bradford e BCA) e atividade biológica de acordo com | métodos conhecidos.
Exemplo 36 Peguilação de NGF usando um reagente amino-oxi-PEG e m- toluidina como um catalisador nucleofílico Método 1: NGF é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 - kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright O CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). NGF é dissolvido em 7,0 ml tampão histidina, pH 6,0 (20OmM L-histidina, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2). Uma solução aquosa de periodato de sódio (5 mM) é então adicionada e a mistura de reação é incubada por 1 h no escuro a 4ºC em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de 7,5 ul de uma solução aquosa del M de cisteina A mistura é subsequentemente submetida a UF/DF empregando filtradores Vivaspin por centrífuga para remover periodato em excesso, extintores e os subprodutos dos mesmos.
O retentado contendo NGF oxidado é, em seguida, misturado com uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM) e incubado por 30 min em l 25 temperatura ambiente.
Reagente amino-oxi-PEG com um MW de 20 kD é então adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 5 vezes.
Esta | mistura é incubada por 2,5 h em temperatura ambiente no escuro em agitação suave, | Finalmente, o conjugado PEG-NGF é purificado por | cromatografia de troca iônica (por exemplo, em Q-Sepharose FF). Por exemplo, 1,5 mg proteína/ml gel é carregada em uma coluna equilibrada com 50 mM Tampão Hepes, pH 7,4 contendo 5 mM CaCl2. O conjugado é eluído com 50 mM Tampão Hepes contendo 5 mM CaCl2 e 500 mM cloreto de —sódio,pH7,Ae é então submetidas a UF/DF usando uma membrana de MW de corte apropriado.
A preparação é em seguída analiticamente caracterizada medindo proteína total (Coomassie, Bradford) e atividade biológica de acordo | com métodos conhecidos na técnica.
Em uma modalidade alternativa, o Método 1 é conduzido como a seguir.
NGF é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbrightê CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). NGF é dissolvido em 7,0 ml tampão histidina, pH 6,0 (20OmM L-histidina, 150 mM - NaCl, 5 mM CaCl2). Uma solução aquosa de periodato de sódio (5 mM) é então adicionada e a mistura de reação é incubada por 1 h no escuro a 4ºC em i agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de 7,5 ul de uma solução aquosa de 1 M de cisteína.
À mistura é subsequentemente submetida a UF/DF empregando filtradores Vivaspin por centrífuga para remover periodato em excesso, extintores e os subprodutos —dosmesmos.
O retentado contendo NGF oxidado é, em seguida, misturado com uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM) e incubado por 30 min em temperatura ambiente.
Reagente amino-oxi-PEG com um MW de 20 kD é então adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 5 vezes.
Esta —misturaé incubada por 2,5 h em temperatura ambiente no escuro em agitação suave.
Finalmente, o conjugado PEG-NGF é purificado por cromatografia de troca iônica.
As frações de eluato contendo conjugado são coletadas e então submetidas a UF/DF usando uma membrana de MW de corte apropriado. À preparação é em seguida analiticamente caracterizada medindo proteína total (Coomassie, Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica. Método 2: NGF é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi. Um exemplo desté tipo de reagente é Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). NGF é | transferido ou dissolvido em tampão de reação (por exemplo 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter — concentração de proteína final de 1,0 +/- 0,25 mg/ml. Então o pH da solução é corrigido para 6,0 por adição sob gotejamento de uma solução aquosa 0,5 N de HCl. Subsequentemente uma solução aquosa 40 mM de periodato de sódio é adicionado dentro de 10 minutos para gerar uma concentração de 200 uM. . A reação de oxidação é conduzida por 30 +/- 5 min em uma temperatura (T) de T=+22+/-2ºC. Então a reação é interrompida por adição de uma solução aquosa de L-cisteína (1 M) dentro de 15 minutos em T= +22 +/- 2ºC para gerar uma concentração final de 10 mM em uma mistura de reação e incubação por 60 +/- 5 min.
O NGF oxidado é ainda purificado por cromatografia de troca iônica. As frações contendo NGF oxidado de eluato são coletadas e usadas para a reação de conjugação.
O reagente amino-oxi-PEG com um MW de reagente 20 kD é adicionado em um excesso molar de 50 vezes ao eluato contendo o NGF oxidado purificado dentro de um período de tempo máximo (t) de 15 minutos em agitação suave. Então uma solução aquosa de m-toluidina (SOMM) é adicionada dentro de 15 minutos para obter uma concentração final de 10 mM. A mistura de reação é incubada por 120 +/- 10 min. no escuro em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC sob agitação suave.
O conjugado PEG- NGF obtido é ainda purificado por | cromatografia de troca iônica.
As frações contendo conjugado PEG-NGF são coletadas e concentradas por ultra-/diafiltração (UF/DF) usando uma | membrana feita de celulose regenerada com um corte de peso molecular apropriado (Millipore). Os conjugados preparados pelo uso deste procedimento são analiticamente caracterizados medindo proteína total e atividade biológica de | acordo com métodos conhecidos na técnica. | Método 3: NGF é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 KkD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). NGF é | dissolvido em Tampão Hepes (50 mM Hepes, 150 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e misturado com uma solução aquosa de . periodato de sódio (10 mM), e uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM). Subsequentemente o reagente amino-oxi é adicionado para gerar um excesso Ú molar de reagente de 20 vezes.
A mistura é incubada por 2 h no escuro em temperatura ambiente em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de 8 ul de solução aquosa de cisteina (1 M). Finalmente, o conjugado PEG-NGF é purificado por cromatografia de troca iônica em Q Sepharose FF. 1,5 mg proteína/ml gel é carregada em uma coluna pré-equilibrada com 50 mM Tampão Hepes, pH 7,4 contendo 5 mM CaCl2. O conjugado é eluído com 50 mM Tampão Hepes contendo 5 mM CaCl2 e 500 mM cloreto de sódio, pH 7,4 e é então submetidas a UF/DF usando uma membrana.
A preparação é analiticamente — caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Em uma modalidade alternativa, o Método 3 é conduzido como a seguir.
NGF é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é | |
Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). NGF é dissolvido em Tampão Hepes (50 mM Hepes, 150 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e misturado com uma solução aquosa de periodato de sódio (10 mM), e uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM). —Subsequentemente o reagente amino-oxi é adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 20 vezes.
A mistura é incubada por 2 h no escuro em É temperatura ambiente em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura | ambiente pela adição de 8 ul de solução aquosa de cisteína (1 M). Finalmente, o conjugado PEG-NGF é purificado por cromatografia de troca iônica.
As frações contendo conjugado são coletados e | então submetidas a UF/DF.
A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de acordo com | métodos conhecidos na técnica. . Método 4: NGF é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 i kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). Uma concentração inicial ou peso de NGF é transferida ou dissolvida em Tampão Hepes (50 mM Hepes, 150 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 2 mg NGF / ml.
Subsequentemente uma solução aquosa 5 mM de periodato de sódio é adicionado dentro de 15 minutos para gerar uma concentração final de 100 uM, seguido pela adição de uma solução aquosa 50 mM de m-toluidina para obter uma concentração final de 10 mM dentro de um período de tempo —de30 minutos.
Então o reagente amino-oxi-PEG com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 20 vezes.
Após correção do pH a 6,0 a mistura é incubada por 2 h no escuro em temperatura ambiente em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de uma solução aquosa 1M de L-cisteina para gerar uma concentração final de 10 mM. | O conjugado PEG- NGF é purificado por meios de cromatografia de troca iônica (IEC). Frações de eluato contendo conjugado | são concentradas por UF/DF usando uma membrana de 10 kD feita de | S — celulose regenerada (88 cem2, corte 10 kD / Millipore). A etapa final de diafiltração é realizada contra Tampão Hepes (50 mM Hepes, 5 mM CaCl2, | pH 7,5). A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (procedimento Bradford e BCA) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos. ] Exemplo 37 Peguilação de HGH usando um reagente amino-oxi-PEG e m- toluidina como um catalisador nucleofílico . Método 1: Como descrito aqui, a sequência de aminoácido de hormônio ' de crescimento humano (HGH) é primeiro modificada para incorporar pelo menos um sítio de glicosilação.
Após a purificação, HGH é glicosilado in vitro de acordo com métodos conhecidos na técnica.
HGH é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). HGH é dissolvido em 7,0 ml tampão histidina, pH 6,0 (20OmM L-histidina, 150 mM | NaCl, 5 mM CaCl2). Uma solução aquosa de periodato de sódio (5 mM) é então adicionada e a mistura de reação é incubada por 1 h no escuro a 4ºC em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de 7,5 nl de uma solução aquosa de 1 M de cisteína, À mistura é | subsequentemente submetida a UF/DF empregando filtradores Vivaspin por centrífuga para remover periodato em excesso, extintores e os subprodutos dos mesmos.
O retentado contendo HGH oxidado é, em seguida, misturado com uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM) e incubado por 30 min em temperatura ambiente.
Reagente amino-oxi-PEG com um MW de 20 kD é então adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 5 vezes.
Esta misturaéincubada por 2,5 hem temperatura ambiente no escuro em agitação suave.
Finalmente, o conjugado PEG- HGH é purificado por | | cromatografia de troca iônica (por exemplo, em Q Sepharose FF). Por exemplo, 1,5 mg proteína/ml gel é carregada em uma coluna equilibrada com 50mM Tampão Hepes, pH 7,4 contendo 5 mM CaCl2. O conjugado é eluído com 50 mM Tampão Hepes contendo 5 mM CaCl2 e 500 mM cloreto de | sódio, pH 7,4 e é então submetidas a UF/DF usando uma membrana de MW de corte apropriado.
A preparação é em seguida analiticamente caracterizada - medindo proteína total (Coomassie, Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Em uma modalidade alternativa,o Método 1 é realizado como a seguir.
Como descrito aqui, a sequência de aminoácido de hormônio de crescimento humano (HGH) é primeiro modificada para incorporar pelo menos um sítio de glicosilação.
Após a purificação, HGH é glicosilado in — vitrode acordo com métodos conhecidos na técnica.
HGH é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). HGH é dissolvido em 7,0 ml tampão histidina, pH 6,0 (2OmM L-histidina, 150 mM —NaCl,5mM CaCl2). Uma solução aquosa de periodato de sódio (5 mM) é então adicionada e a mistura de reação é incubada por 1 h no escuro a 4ºC em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de | 7,5 pl de uma solução aquosa de 1 M de cisteina.
A mistura é subsequentemente submetida a UF/DF empregando filtradores Vivaspin por centrífuga para remover periodato em excesso, extintores e os subprodutos dos mesmos. | O retentado contendo HGH oxidado é, em seguida, misturado com uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM) e incubado por 30 min em temperatura ambiente. Reagente amino-oxi-PEG com um MW de 20 kD é então adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 5 vezes. Esta mistura é incubada por 2,5 h em temperatura ambiente no escuro em agitação Suave.
Finalmente, o conjugado PEG-HGH é purificado por cromatografia de troca iônica. As frações de eluato contendo conjugado são coletadas e então submetidas a UF/DF usando uma membrana de MW de corte apropriado. À preparação é em seguida analiticamente caracterizada medindo proteína total (Coomassie, Bradford) e atividade biológica de acordo . com métodos conhecidos na técnica.
Método 2: : Como descrito aqui, a sequência de aminoácido de hormônio de crescimento humano (HGH) é primeiro modificada para incorporar pelo menos um sítio de glicosilação. Após a purificação, HGH é glicosilado in vitro de acordo com métodos conhecidos na técnica.
HGH é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi. Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). HGH é transferida ou dissolvida em tampão de reação (por exemplo SOMM Hepes, 350mM cloreto de sódio, SMM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter — concentração de proteína final de 1,0 +/- 0,25 mg/ml. Então o pH da solução é corrigido para 6,0 por adição sob gotejamento de uma solução aquosa 0,5 N de HCl. Subsequentemente, uma solução aquosa 40 mM de periodato de sódio é adicionado dentro de 10 minutos para gerar uma concentração de 200 UM. A reação de oxidação é conduzida por 30 +/- 5 min em uma temperatura | |
(TD) de T= +22 +/- 2ºC.
Então a reação é interrompida por adição de uma solução aquosa de L-cisteína (1 M) dentro de 15 minutos em T=+22 +/- 2ºC para gerar uma concentração final de 10 mM em uma mistura de reação e incubação por 60 +/- 5 min.
O HGH oxidado é ainda purificado por cromatografia de troca iônica.
As frações de eluato contendo HGH oxidado são coletadas e usadas para a reação de conjugação. ! O reagente amino-oxi-PEG com um MW de reagente 20 kD é adicionado em um excesso molar de 50 vezes ao eluato contendo o HGH — oxidado purificado dentro de um período de tempo máximo (t) de 15 minutos em agitação suave.
Então uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM) é adicionada dentro de 15 minutos para obter uma concentração final de 10 MM.
A mistura de reação é incubada por 120 +/- 10 min. no escuro em uma . temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC sob agitação suave.
O conjugado PEG- HGH obtido é ainda purificado por | | cromatografia de troca iônica.
As frações contendo conjugado PEG-NGF são coletadas e concentradas por ultra- / diafiltração (UF/DF) usando uma membrana feita de celulose regenerada com um corte de peso molecular apropriado (Millipore). Os conjugados preparados pelo uso deste procedimento são | analiticamente caracterizados medindo proteína total e atividade biológica de | acordo com métodos conhecidos na técnica.
Método 3: Como descrito aqui, a sequência de aminoácido de hormônio — de crescimento humano (HGH) é primeiro modificada para incorporar pelo | menos um sítio de glicosilação.
Após a purificação, HGH é glicosilado in vitro de acordo com métodos conhecidos na técnica. | HGH é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é
| Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). HGH é dissolvido em Tampão Hepes (50 mM Hepes, 150 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e misturado com uma solução aquosa de periodato de sódio (10 mM), e uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM). — Subsequentemente o reagente amino-oxi é adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 20 vezes. A mistura é incubada por 2 h no escuro em temperatura ambiente em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de 8 ul de solução aquosa de cisteína (1 M). Finalmente, o conjugado PEG-HGH é purificado por cromatografia de troca iônica em Q-Sepharose FF. 1,5 mg proteína/ml gel é carregada em uma coluna pré-equilibrada com 50 mM Tampão Hepes, pH 7,4 | contendo 5 mM CaCl2. O conjugado é eluído com 50 mM Tampão Hepes contendo 5 mM CaCl2 e 500 mM cloreto de sódio, pH 7,4 e é então . submetidas a UF/DF usando uma membrana. A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
| Em uma modalidade alternativa, o Método 3 é conduzido como a seguir. Como descrito aqui, a sequência de aminoácido de hormônio de crescimento humano (HGH) é primeiro modificada para incorporar pelo menos um sítio de glicosilação. Após a purificação, HGH é glicosilado in vitro de acordo com métodos conhecidos na técnica. HGH é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi. Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). HGH é dissolvido em Tampão Hepes (50 mM Hepes, 150 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e misturado com uma solução aquosa de periodato de sódio (10 mM), e uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM). Subsequentemente o reagente amino-oxi é adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 20 vezes. A mistura é incubada por 2 h no escuro em temperatura ambiente em agitação suave e extinta por
15 min em temperatura ambiente pela adição de 8 ul de solução aquosa de cisteína (1 M). Finalmente, o conjugado PEG-HGH é purificado por cromatografia de troca iônica.
As frações contendo conjugado são coletados e então submetidas a UF/DF.
A preparação é analiticamente caracterizada Ps medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica. | Método 4: | Como descrito aqui, a sequência de aminoácido de hormônio de crescimento humano (HGH) é primeiro modificada para incorporar pelo menos um sítio de glicosilação.
Após a purificação, HGH é glicosilado in vitro de acordo com métodos conhecidos na técnica.
HGH é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 - kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é . 15 Sunbrigit& CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). Uma ] concentração inicial ou peso de HGH é transferida ou dissolvida em Tampão Hepes (50 mM Hepes, 150 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 2 mg HGH / ml.
Subsequentemente uma solução aquosa 5 mM de periodato de sódio é adicionado dentro de 15 minutos para gerar uma concentração final de 100 uM, seguido pela adição de uma solução aquosa 50 mM de m-toluidina para obter uma concentração final de 10 mM dentro de um período de tempo de 30 minutos.
Então o reagente amino-oxi-PEG com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 20 vezes.
Após correção do pH a 6,0 a mistura é incubada por 2 h no escuro em ) temperatura ambiente em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de uma solução aquosa | M de L-cisteína para gerar uma concentração final de 10 mM.
O conjugado PEG - HGH é purificado por meios de cromatografia de troca iônica (IEC). Frações de eluato contendo conjugado são concentradas por UF/DF usando uma membrana de 10 kD feita de | celulose regenerada (88 cm2, corte 10 kD / Millipore). À etapa final de diafiltração é realizada contra Tampão Hepes (50 mM Hepes, 5 mM CaCl2, pH7,5).
PÓ A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (procedimento Bradford e BCA) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos.
Exemplo 38 Peguilação de TNF-alfa usando um reagente amino-oxi-PEG e m-toluídina como um catalisador nucleofílico Método 1: TNF-alfa é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação ' de 20 kD contendo um grupo amino-oxi. Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). TNF-alfa é ' dissolvido em 7,0 ml tampão histidina, pH 6,0 (20mM L-histidina, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2). Uma solução aquosa de periodato de sódio (5 mM) é então adicionada e a mistura de reação é incubada por 1 h no escuro a 4ºC em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de 7,55 ul de uma solução aquosa de 1 M de cisteina. A mistura é subsequentemente submetida a UF/DF empregando filtradores Vivaspin por centrífuga para remover periodato em excesso, extintores e os subprodutos dos mesmos. | O retentado contendo TNF-alfa oxidado é, em seguida, | 25 — misturado com uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM) e incubado por min em temperatura ambiente. Reagente amino-oxi-PEG com um MW de 20 kD é então adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 5 vezes. Esta mistura é incubada por 2,5 h em temperatura ambiente no escuro em agitação suave. |
| 231 Finalmente, o conjugado PEG-TNF-alfa é purificado por cromatografia de troca iônica (por exemplo, em Q-Sepharose FF). Por exemplo, 1,5 mg proteína/ml gel é carregada em uma coluna equilibrada com 50 mM Tampão Hepes, pH 7,4 contendo 5 mM CaCl2. O conjugado é eluído com 50mM Tampão Hepes contendo 5 mM CaCl2 e 500 mM cloreto de sódio, pH 7,4 ef É então submetidas a UF/DF usando uma membrana de MW de corte apropriado.
A preparação é em seguida analiticamente caracterizada | medindo proteína total (Coomassie, Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Em uma modalidade alternativa, o Método | é conduzido como a seguir.
TNF-alfa é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright& CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). TNF-alfa é . dissolvido em 7,0 ml tampão histidina, pH 6,0 (20OmM L-histidina, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2). Uma solução aquosa de periodato de sódio (5 mM) é ' então adicionada e a mistura de reação é incubada por 1 h no escuro a 4ºC em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de 7,5 ul de uma solução aquosa de 1 M de cisteína, A mistura é subsequentemente submetida a UF/DF empregando filtradores Vivaspin por centrífuga para remover periodato em excesso, extintores e os subprodutos dos mesmos.
O retentado contendo TNF-alfa oxidado é, em seguida, misturado com uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM) e incubado por 30 min em temperatura ambiente.
Reagente amino-oxi-PEG com um MW de 20kD é então adicionado para gerar um exceêsso molar de reagente de 5 vezes.
Esta mistura é incubada por 2,5 h em temperatura ambiente no escuro em agitação suave.
Finalmente, o conjugado PEG-TNF-alfa é purificado por cromatografia de troca iônica.
As frações contendo conjugados de eluato são coletadas e então submetidas a UF/DF usando uma membrana de MW de corte apropriado. A preparação é em seguida analiticamente caracterizada medindo proteína total (Coomassie, Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Método 2: TNF-alfa éféguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi. Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright& CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). TNF-alfa é transferida ou dissolvida em tampão de reação (por exemplo S0OmM Hepes, 350mM cloreto de sódio, SMM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter | concentração de proteína final de 1,0 +/- 0,25 mg/ml. Então o pH da solução é corrigido para 6,0 por adição sob gotejamento de uma solução aquosa 0,5 N de HCl. Subsequentemente uma solução aquosa 40 mM de periodato de sódio , é adicionado dentro de 10 minutos para gerar uma concentração de 200 uM. A reação de oxidação é conduzida por 30 +/- 5 min em uma temperatura (T) ] de T=+22 +/- 2ºC. Então a reação é interrompida por adição de uma solução aquosa de L-cisteína (1 M) dentro de 15 minutos em T= +22 +/- 2ºC para gerar uma concentração final de 10 mM em uma mistura de reação e incubação por 60 +/- 5 min.
O TNF-alfa oxidado é ainda purificado por cromatografia de troca iônica. As frações contendo TNF-alfa de eluato são coletadas e usadas para a reação de conjugação.
O reagente amino-oxi-PEG com um MW de reagente 20 kD é adicionado em um excesso molar de 50 vezes ao eluato contendo o TNF alfa — oxidado purificado dentro de um período de tempo máximo (t) de 15 minutos em agitação suave. Então uma solução aquosa de m-toluidina (SOMM) é adicionada dentro de 15 minutos para obter uma concentração final de 10 MM. A mistura de reação é incubada por 120 +/- 10 min. no escuro em uma | temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC sob agitação suave.
B 233 as. : e O conjugado PEG- TNF-alfa obtido é ainda purificado por cromatografia de troca iônica. As frações contendo conjugado PEG- TNF-alfa são coletadas e concentradas por ultra-/diafiltração (UF/DF) usando uma * membrana feita de celulose regenerada com um corte de peso molecular apropriado (Millipore).
Os conjugados preparados pelo uso deste procedimento são analiticamente caracterizados medindo proteína total e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Método 3: | 10 TNF-alfa é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi. Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). TNF-alfa é dissolvido em Tampão Hepes (50 mM Hepes, 150 mM cloreto de sódio, 5 R mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e misturado com uma solução aquosa de periodato de sódio (10 mM), e uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM). " Subsequentemente o reagente amino-oxi é adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 20 vezes. A mistura é incubada por 2 h no escuro em temperatura ambiente em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de 8 ul de solução aquosa de cisteína (1 M). Finalmente, o conjugado PEG-TNF-alfa é purificado por cromatografia de troca iônica em Q-Sepharose FF. 1,5 mg proteína/ml gel é carregada em uma coluna pré-equilibrada com 50 mM Tampão Hepes, pH 7,4 contendo 5 mM CaCl2. O conjugado é eluído com 50 mM Tampão Hepes contendo 5 mM CaCl2 e 500 mM cloreto de sódio, pH 7,4 e é então —submetidasa UF/DF usando uma membrana. A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Em uma modalidade alternativa, o Método 3 é conduzido | como a seguir. TNF-alfa é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação l 234 + % de 20 kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). TNF-alfa é dissolvido em Tampão Hepes (50 mM Hepes, 150 mM cloreto de sódio, 5 | mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e misturado com uma solução aquosa de — periodato de sódio (10 mM), e uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM). Subsequentemente, o reagente amino-oxi é adicioríádo para gerar um excesso molar de reagente de 20 vezes.
A mistura é incubada por 2 h no escuro em temperatura ambiente em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura | ambiente pela adição de 8 ul de solução aquosa de cisteína (1 M). | 10 Finalmente, o conjugado PEG- TNF-alfa é purificado por cromatografia de troca iônica.
As frações contendo conjugado são coletados e então submetidas a UF/DF.
A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de acordo com . métodos conhecidos na técnica.
Método 4: í TNF-alfa é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbrightê CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). Uma concentração inicial ou peso de TNF-alfa é transferida ou dissolvida em Tampão Hepes (50 MM Hepes, 150 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 2 mg TNF-alfa / ml.
Subsequentemente, uma solução aquosa 5 mM de periodato de sódio é adicionada dentro de 15 minutos para gerar uma concentração final de 100 uM, seguido pela adição de uma solução aquosa 50 mM de m-toluidina — para obter uma concentração final de 10 mM dentro de um período de tempo | de 30 minutos.
Então o reagente amino-oxi-PEG com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 20 vezes.
Após correção do pH a 6,0 a mistura é incubada por 2 h no escuro em temperatura ambiente em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura
| . 235 | % ambiente pela adição de uma solução aquosa 1M de L-cisteína para gerar uma ) concentração final de 10 mM.
O conjugado PEG- TNF-alfa é purificado por meios de cromatografia de troca iônica (IEC). Frações de eluato contendo conjugado são concentradas por UF/DF usando uma membrana de 10 kD feita de celulose regenerada (88 cm2, corte 10 kD / Millipore). A /Gapa final de diafiltração é realizada contra Tampão Hepes (50 mM Hepes, 5 mM CaCl2, PH 7,5). A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (procedimento Bradford e BCA) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos.
Exemplo 39 Peguilação de insulina usando um reagente amino-oxi-PEG e o m-toluidina como um catalisador nucleofílico | 15 Método 1: ! ' Como descrito aqui, a sequência de aminoácido de insulina é primeiro modificada para incorporar pelo menos um sítio de glicosilação.
Após a purificação, insulina é glicosilada in vitro de acordo com métodos | conhecidos na técnica.
Insulina é peguilado pelo uso de um reagente de —peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright& CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). Insulina é dissolvido em 7,0 ml tampão histidina, pH 6,0 (20OmM L-histidina, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2). Uma solução aquosa de periodato de sódio (5 mM) é então adicionada e a mistura de reação é incubada por 1 h no escuro a | | 25 4ºCem agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de 7,5 ul de uma solução aquosa de 1 M de cisteína.
À mistura é subsequentemente submetida a UF/DF empregando filtradores Vivaspin por centrífuga para remover periodato em excesso, extintores e os subprodutos dos mesmos.
| . 236 . O retentado contendo insulina oxidada é, em seguida, misturado com uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM) e incubado por 30 min em temperatura ambiente.
Reagente amino-oxi-PEG com um MW de 20 kD é então adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 5 vezes.
Esta mistura é incubada por 2,5 h em temperatura ambiente no escuro em agitação suave.
PP Finalmente, o conjugado PEG-insulina é purificado por ! cromatografia de troca iônica (por exemplo, em Q-Sepharose FF). Por | exemplo, 1,5 mg proteína/ml gel é carregada em uma coluna equilibrada com 50mM Tampão Hepes, pH 7,4 contendo 5 MM CaCl2. O conjugado é eluído com 50 mM Tampão Hepes contendo 5 mM CaCl2 e 500 mM cloreto de sódio, pH 7,4 e é então submetidas a UF/DF usando uma membrana de MW de corte apropriado.
A preparação é em seguida analiticamente caracterizada JN medindo proteína total (Coomassie, Bradford) e atividade biológica de acordo | 15 commétodos conhecidos na técnica. : Em uma modalidade alternativa, o Método 1 é conduzido | como a seguir.
Como descrito aqui, a sequência de aminoácido de insulina é primeiro modificada para incorporar pelo menos um sítio de glicosilação.
Após a purificação, insulina é glicosilada in vitro de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Insulina é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). Insulina é dissolvido em 7,0 ml tampão histidina, pH 6,0 (20mM L-histidina, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2). Uma solução aquosa de periodato de sódio (5 mM)éentão adicionada e a mistura de reação é incubada por 1 h no escuro a 4ºC em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de 7,5 ul de uma solução aquosa de 1 M de cisteína.
A mistura é subsequentemente submetida a UF/DF empregando filtradores Vivaspin por centrífuga para remover periodato em excesso, extintores e os subprodutos
- 237 z dos mesmos.
O retentado contendo insulina oxidada é, em seguida, misturado com uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM) e incubado por 30 min em temperatura ambiente.
Reagente amino-oxi-PEG com um MW de | 5 20KkD é então adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 5 vezes.
Esta mistura é incubada por 2,5 h em temperatura ambiente no escuro ÓÕ " em agitação suave.
Finalmente, o conjugado PEG-insulina é purificado por cromatografia de troca iônica.
As frações contendo conjugados de eluato são — coletadas e então submetidas a UF/DF usando uma membrana de MW de corte apropriado.
À preparação é em seguida analiticamente caracterizada medindo proteína total (Coomassie, Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica. : Método 2: Como descrito aqui, a sequência de aminoácido de insulina é Í primeiro modificada para incorporar pelo menos um sítio de glicosilação.
Após a purificação, insulina é glicosilada in vitro de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Insulina é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20KkD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). Insulina é transferida ou dissolvida em tampão de reação (por exemplo SOMM Hepes, 350mM cloreto de sódio, SMM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 1,0 +/- 0,25 mg/ml.
Então o pH da solução é corrigido para 6,0 por adição sob gotejamento de uma solução aquosa 0,5 N de HCl.
Subsequentemente, uma solução aquosa 40 mM de periodato de | sódio é adicionado dentro de 10 minutos para gerar uma concentração de 200 | UM.
A reação de oxidação é conduzida por 30 +/- 5 min em uma temperatura ' (T) de T= +22 +/- 2ºC.
Então a reação é interrompida por adição de uma
| . 238 + solução aquosa de L-cisteína (1 M) dentro de 15 minutos em T= +22 +/- 2ºC | para gerar uma concentração final de 10 mM em uma mistura de reação e : incubação por 60 +/- 5 min. ! A insulina oxidada é ainda purificada por cromatografia de S — troca iônica.
As frações contendo insulina oxidada de eluato são coletadas e ] usadas para a reação de conjugação. | O reagente amino-oxi-PEG com um MW de reagente 20 kD é adicionado em um excesso molar de 50 vezes ao eluato contendo insulina oxidada purificada dentro de um período de tempo máximo (t) de 15 minutos em agitação suave.
Então uma solução aquosa de m-toluidina (SOMM) é adicionada dentro de 15 minutos para obter uma concentração final de 10 mM.
A mistura de reação é incubada por 120 +/- 10 min. no escuro em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC sob agitação suave. . O conjugado PEG - insulina obtido é ainda purificado por : cromatografia de troca iônica.
As frações contendo conjugado PEG - insulina Ú são coletadas e concentradas por ultra- / diafiltração (UF/DF) usando uma membrana feita de celulose regenerada com um corte de peso molecular apropriado (Millipore). Os conjugados preparados pelo uso deste procedimento são analiticamente caracterizados medindo proteína total e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Método 3: Como descrito aqui, a sequência de aminoácido de insulina é primeiro modificada para incorporar pelo menos um sítio de glicosilação.
Após a purificação, insulina é glicosilada in vitro de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Insulina é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é : Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). Insulina é
. dissolvido em Tampão Hepes (50 mM Hepes, 150 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e misturado com uma solução aquosa de periodato de sódio (10 mM), e uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM). Subsequentemente, o reagente amino-oxi é adicionado para gerar um excesso | —molarde reagente de 20 vezes.
A mistura é incubada por 2 h no escuro em | temperatura ambiente em agitação suave e extínta por 15 min em temperatura | ambiente pela adição de 8 ul de solução aquosa de cisteína (1 M). | Finalmente, o conjugado PEG-insulina é purificado por | cromatografia de troca iônica em Q Sepharose FF. 1,5 mg proteína/ml gel é — carregada em uma coluna pré-equilibrada com 50 mM Tampão Hepes, pH 7,4 | contendo 5 mM CaCl2. O conjugado é eluído com 50 mM Tampão Hepes contendo 5 mM CaCl2 e 500 mM cloreto de sódio, pH 7,4 e é então submetidas a UF/DF usando uma membrana.
À preparação é analiticamente ' caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de —acordocom métodos conhecidos na técnica. : Em uma modalidade alternativa, o Método 3 é conduzido como a seguir.
Como descrito aqui, a sequência de aminoácido de insulina é primeiro modificada para incorporar pelo menos um sítio de glicosilação.
Após a purificação, insulina é glicosilada in vitro de acordo com métodos — conhecidos na técnica.
Insulina é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). Insulina é dissolvido em Tampão Hepes (50 mM Hepes, 150 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e misturado com uma solução aquosa — de periodato de sódio (10 mM), e uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM). Subsequentemente o reagente amino-oxi é adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 20 vezes.
A mistura é incubada por 2 h no escuro em temperatura ambiente em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de 8 ul de solução aquosa de cisteína (1 M). |
. 240 . Finalmente, o conjugado de insulina é purificado por cromatografia de troca iônica.
As frações contendo conjugado são coletados e então submetidas a UF/DF.
A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de acordo com —métodosconhecidos na técnica.
Método 4: Como descrito aqui, a sequência de aminoácido de insulina é primeiro modificada para incorporar pelo menos um sítio de glicosilação. | Após a purificação, insulina é glicosilada in vitro de acordo com métodos | 10 — conhecidos na técnica.
Insulina é peguilada pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). Uma . concentração inicial ou peso de insulina é transferida ou dissolvida em Tampão Hepes (50 mM Hepes, 150 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de ' cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 2 mg insulina / ml.
Subsequentemente uma solução aquosa 5 mM de periodato de sódio é adicionado dentro de 15 minutos para gerar uma concentração final de 100 uM, seguido pela adição de uma solução aquosa 50 mM de m-toluidina para obter uma concentração final de 10 mM dentro de um período de tempo | de 30 minutos.
Então o reagente amino-oxi-PEG com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 20 ' vezes.
Após correção do pH a 6,0 a mistura é incubada por 2 h no escuro em temperatura ambiente em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de uma solução aquosa 1 M de L-cisteína para gerar uma concentração final de 10 mM.
O conjugado PEG - insulina é purificado por meios de cromatografia de troca iônica (IEC). Frações de eluato contendo conjugado são concentradas por UF/DF usando uma membrana de 10 kD feita de
. 242 . exemplo, 1,5 mg proteína/ml gel é carregada em uma coluna equilibrada com 50 mM Tampão Hepes, pH 7,4 contendo 5 mM CaCl2. O conjugado é eluído com 50 mM Tampão Hepes contendo 5 mM CaCl2 e 500 mM cloreto de sódio, pH 7,4 e é então submetidas a UF/DF usando uma membrana de MW de corte apropriado.
A preparação é em seguida analiticamente caracterizada ÓÕ " medindo proteína total (Coomassie, Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica. , Em uma modalidade alternativa, o Método | é conduzido como a seguir.
Interferon-alfa é peguilado pelo uso de um reagente de l 10 —peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo | de reagente é Sunbright& CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). Interferon-alfa é dissolvido Em 7,0 ml tampão histidina, pH 6,0 (2OmM L- histidina, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2). Uma solução aquosa de periodato de | . sódio (5 mM) é então adicionada e a mistura de reação é incubada por 1 h no escuro a 4ºC em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura | Ú ambiente pela adição de 7,5 ul de uma solução aquosa de 1 M de cisteína.
À | mistura é subsequentemente submetida a UF/DF empregando filtradores Vivaspin por centrífuga para remover periodato em excesso, extintores e os subprodutos dos mesmos.
O retentado contendo interferon-alfa oxidado é, em seguida, misturado com uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM) e incubado por 30 min em temperatura ambiente.
Reagente amino-oxi-PEG com um MW de 20 kD é então adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 5 vezes.
Esta mistura é incubada por 2,5 h em temperatura ambiente no escuro —emagitação suave.
Finalmente, o conjugado PEG-interferon-alfa é purificado por cromatografia de troca iônica O conjugado contendo frações são coletadas e então submetidas a UF/DF usando uma membrana de MW de corte apropriado.
A preparação é em seguida analiticamente caracterizada medindo
- 243 . proteína total (Coomassie, Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Método 2: Interferon-alfa é peguilado pelo uso de um reagente de — peguilaçãode20 kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo Me reagente é Sunbright& CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). Interferon-alfa é transferida ou dissolvida em tampão de reação (por exemplo ! 50 mM Hepes, 350 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 1,0 +/- 0,25 mg/ml.
Então o pH | 10 da solução é corrigido para 6,0 por adição sob gotejamento de uma solução aquosa 0,5 N de HCl.
Subsequentemente, uma solução aquosa 40 mM de periodato de sódio é adicionado dentro de 10 minutos para gerar uma | concentração de 200 uM.
A reação de oxidação é conduzida por 30 +/- 5 min | . em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC.
Então a reação é interrompida ! por adição de uma solução aquosa de L-cisteína (1 M) dentro de 15 minutos ' em T= +22 +/- 2ºC para gerar uma concentração final de 10 MM em uma i mistura de reação e incubação por 60 +/- 5 min.
O interferon-alfa oxidado é ainda purificado por cromatografia de troca iônica.
As frações contendo interferon-alfa oxidado de eluato são coletadas e usadas para a reação de conjugação.
O reagente amino-oxi-PEG com um MW de reagente 20 kD é adicionado em um excesso molar de 50 vezes ao eluato contendo o interferon- alfa oxidado purificado dentro de um período de tempo máximo (t) de 15 minutos em agitação suave.
Então uma solução aquosa de m-toluídina (50mM) é adicionada dentro de 15 minutos para obter uma concentração final de 10 mM.
A mistura de reação é incubada por 120 +/- 10 min. no escuro em uma temperatura (T) de T=+22 +/- 2ºC sob agitação suave.
O conjugado PEG- interferon-alfa obtido é ainda purificado por cromatografia de troca iônica.
As frações contendo conjugado PEG-
| - 244 + interferon alfa são coletadas e concentradas por ultra- / diafiltração (UF/DF) usando uma membrana feita de celulose regenerada com um corte de peso molecular apropriado (Millipore).
Os conjugados preparados pelo uso deste procedimento são | 5 —analiticamente caracterizados medindo proteína total e atividade biológica de acordo cof métodos conhecidos na técnica.
Método 3: Interferon-alfa é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi. Um exemplo deste tipo | 10 — de reagente é Sunbright& CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão).
Interferon-alfa é dissolvido em Tampão Hepes (50 mM Hepes, 150 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e misturado com uma solução aquosa de periodato de sódio (10 mM), e uma solução aquosa de m- . toluídina (50 mM). Subsequentemente o reagente amino-oxi é adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 20 vezes. À mistura é incubada ' por 2 h no escuro em temperatura ambiente em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de 8 ul de solução aquosa de cisteína (1 M). Finalmente, o conjugado PEG-interferon-alfa é purificado por cromatografia de troca iônica em Q-Sepharose FF. 1,5 mg proteína/ml gel é carregada em uma coluna pré-equilibrada com 50 mM Tampão Hepes, pH 7,4 contendo 5 mM CaCl2. O conjugado é eluído com 50 mM Tampão Hepes contendo 5 mM CaCl2 e 500 mM cloreto de sódio, pH 7,4 e é então submetidas a UF/DF usando uma membrana. A preparação é analiticamente — caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica. Em uma modalidade alternativa, o Método 3 é conduzido | como a seguir. Interferon-alfa é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi. Um exemplo deste tipo |
| - 245 . de reagente é Sunbright& CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). Interferon-alfa é dissolvido em Tampão Hepes (50 mM Hepes, 150 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e misturado com uma solução aquosa de períodato de sódio (10 mM), e uma solução aquosa de m- —toluidina (50 MM). Subsequentemente o reagente amino-oxi é adicionado para gerar um excessó molar de reagente de 20 vezes. A mistura é incubada por 2 h no escuro em temperatura ambiente em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de 8 ul de solução aquosa de | cisteina (1 M).
Finalmente, o conjugado PEG-interferon-alfa é purificado por cromatografia de troca iônica. As frações contendo conjugado são coletados e então submetidas a UF/DF usando uma membrana. A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade . biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Método 4: Interferon-alfa é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi. Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright& CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). Uma concentração inicial ou peso de interferon-alfa é transferida ou dissolvida em Tampão Hepes (50 mM Hepes, 150 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 2 meg interferon -alfa / ml. Subsequentemente, uma solução aquosa 5 mM de periodato de sódio é adicionada dentro de 15 minutos para gerar uma | concentração final de 100 uM, seguido pela adição de uma solução aquosa 50 mM de m-toluidina para obter uma concentração final de 10 mM dentro de um período de tempo de 30 minutos. Então o reagente amino-oxi-PEG com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 20 vezes. Após correção do pH a 6,0 a mistura é incubada por 2 h no escuro em temperatura ambiente em agitação suave e extinta por 15
. 246 " min em temperatura ambiente pela adição de uma solução aquosa 1M de L- cisteína para gerar uma concentração final de 10 mM.
O conjugado PEG- interferon -alfa é purificado por meios de cromatografia de troca iônica (TEC). Frações de eluato contendo conjugado são concentradas por UF/DF usando uma membrana de 10 kD feita de celulose regenerada (88 cm2, corte 10 kD / Millipore). A etapa final de diafiltração é realizada contra Tampão Hepes (50 mM Hepes, 5 mM CaCl2, PH 7,5). A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (procedimento Bradford e BCA) e atividade biológica de acordo com ! métodos conhecidos. | l Exemplo 41 Peguilação de interferon-gama usando um reagente amino-oxi- . PEG e m-toluídina como um catalisador nucleofílico Método 1: ] Interferon-gama é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). 10 mg de interferon-gama é dissolvido em 5 ml tampão histidina, pH 6,0 (20 mM —L-histidina, 150 mM NaCl). 100 ul de uma solução aquosa de periodato de sódio (5 mM) é então adicionada e a mistura de reação é incubada por 1 h no ; escuro a 4ºC em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura | ambiente pela adição de 50 ul de uma solução aquosa de 1 M de cisteína.
À mistura é subsequentemente submetido a UF/DF empregando Vivaspin 15R 10 kD filtradores por centrífuga para remover periodato em excesso, extintores e os subprodutos dos mesmos.
O retentado (aprox. 7 ml), contendo interferon-gama oxidado, é misturado com 2 ml de uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM) e incubado por 30 min em temperatura ambiente.
Então reagente amino-oxi-
Pp RR IZ 0. 0 “o iT ? . P . A sssMl o rnvncrPw>iáéa é6aas nm+mõ NS . 247 . PEG com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 5 vezes.
Esta mistura é incubada por 2,5 h em RT no escuro em agitação suave.
Finalmente, o conjugado PEG-interferon-gama é purificado porcromatografia de troca iônica em SP Sepharose FF.
A mistura de reação é diluída com 20 ml Tampão A (50 mM Hepés, pH 6,5) e carregada em uma coluna 20 ml HiPrep SPFF 16/10 (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré- equilibrada com Tampão A.
Então a coluna é eluída com Tampão B (50 mM Hepes, 1 M NaCl, pH 6,5). Interferon-gama livre é eluída lavando a coluna com25% Tampão Be o conjugado a 50 % Tampão B.
As frações contendo conjugado são concentradas por UF/DF usando uma membrana de 10 kD feita de celulose regenerada (88 cm2, corte 10 kD / Millipore). A etapa final de diafiltração é realizada contra tampão histidina, pH 6,9 contendo 150 mM NaCl.
A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na 7 técnica.
Para o conjugado PEG-interferon-gama uma atividade específica de > 50 % em comparação ao Interferon gama nativo é determinada.
O conjugado é adicionalmente analiticamente caracterizada por HPLC por exclusão de tamanho usando um sistema Agilent 1200 HPLC equipado com uma coluna ShodexKW 803 em condições como anteriormente descrito (Kolarich et al, Transfusion 2006;46:1959-77). É demonstrado que a preparação não contém interferon-gama livre.
Método 2: Interferon-gama é peguilado pelo uso de um reagente de —peguilaçãode20kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). Interferon-gama é transferida ou dissolvida em tampão de reação (por exemplo S0OMM Hepes, 350mM cloreto de sódio, SMM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 1,0 +/- 0,25 mg/ml.
Então o
- 248 = pH da solução é corrigido para 6,0 por adição sob gotejamento de uma solução aquosa 0,5 N de HCl.
Subsequentemente uma solução aquosa 40 mM de periodato de sódio é adicionado dentro de 10 minutos para gerar uma concentração de 200 uM.
A reação de oxidação é conduzida por 30 +/- 5 min emuma temperatura (T) de T= +22 +/-2ºC.
Então a reação é interrompida por adição de uma solução aquosa de L-cisteína (1 M) déntro de 15 minutos em T= +22 +/- 2ºC para gerar uma concentração final de 10 MM em uma mistura de reação e incubação por 60 +/- 5 min. | O interferon-gama oxidado é ainda purificado por cromatografia de troca iônica.
As frações contendo interferon-gama oxidado de eluato são coletadas e usadas para a reação de conjugação.
O reagente amino-oxi-PEG com um MW de reagente 20 kD é adicionado em um excesso molar de 50 vezes ao eluato contendo o interferon- « gama oxidado purificado dentro de um período de tempo máximo (t) de 15 minutos em agitação suave.
Então uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM) é adicionada dentro de 15 minutos para obter uma concentração final de 10 mM.
A mistura de reação é incubada por 120 +/- 10 min. no escuro em uma temperatura (T) de T=+22 +/- 2ºC sob agitação suave.
O conjugado PEG-interferon-gama obtido é ainda purificado por cromatografia de troca iônica.
As frações contendo PEG-interferon-gama são coletadas e concentradas por ultra-/diafiltração (UF/DF) usando uma membrana feita de celulose regenerada com um corte de peso molecular apropriado (Millipore). Os conjugados preparados pelo uso deste procedimento são —analiticamente caracterizados medindo proteína total e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Método 3: Interferon-gama é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo
' de reagente é Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). 10 mpg interferon-gama é dissolvido em —8 ml histidina - tampão, pH 6,0 (20 mM L-histidina, 150 mM NaCl). 200 ul de uma solução aquosa de periodato de | sódio (5 mM) e 2 ml de uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM) são | | 5 então adicionados.
Subsequentemente o reagente amino-oxi-PEG com um | MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 5 vezes.
A mistura é incubada por 2 h no escuro em temperatura ambiente em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de 100 ul de solução aquosa 1 M de cisteína.
Finalmente o conjugado PEG-interferon-gama é purificado por cromatografia de troca iônica em SP-Sepharose FF.
A mistura de reação é diluída com 20 ml Tampão A (50 mM Hepes, pH 6,5) e carregada em uma ! coluna 20 ml HiPrep SP FF 16/10 (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré- equilibrada com Tampão A.
Então a coluna é eluída com Tampão B (50 mM 15º Hepes, 1 M NaCl, pH 6,5). Interferon-gama livre é eluída lavando a coluna com 25 % Tampão B e o conjugado a 50 % Tampão B.
As frações contendo | conjugado são concentradas por UF/DF usando uma membrana de 10 kD feita | | de celulose regenerada (88 cm2, corte 10 kD / Millipore). A etapa final de | | diafiltração é realizada contra tampão histidina, pH 6,9 contendo 150 mM NaCl.
A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Para o conjugado PEG-interferon-gama uma atividade específica de > 50 % em comparação ao interferon-gama nativo é determinada.
O conjugado é adicionalmente analiticamente caracterizada por HPLC por exclusão de tamanho usando um sistema Agilent 1200 HPLC equipado com uma coluna Shodex KW 803 em condições como anteriormente descrito (Kolarich et al, | Transfusion 2006;46:1959-77). É demonstrado que a preparação não contém interferon-gama livre.
Método 4:
' 250 i Interferon-gama é peguilado pelo uso de um reagente de | peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi. Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). Uma concentração inicial ou peso de interferon-gama é transferida ou — dissolvida em Tampão Hepes (50 mM Hepes, 150 mM cloreto de sódio, 5 MM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 2 É o mpg interferon-gama / ml. Subsequentemente uma solução aquosa 5 mM de periodato de sódio é adicionado dentro de 15 minutos para gerar uma concentração final de 100 uM, seguido pela adição de uma solução aquosa 50 “mM de m-toluidina para obter uma concentração final de 10 mM dentro de um período de tempo de 30 minutos. Então o reagente amino-oxi-PEG com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 20 vezes. Após correção do pH a 6,0 a mistura é incubada por 2 h no escuro em temperatura ambiente em agitação suave e extinta por 15 minem temperatura ambiente pela adição de uma solução aquosa 1M de L- cisteina para gerar uma concentração final de 10 mM.
O conjugado PEG-interferon-gama é purificado por meios de cromatografia de troca iônica (IEC). Frações de eluato contendo conjugado são concentradas por UF/DF usando uma membrana de 10 kD feita de — celulose regenerada (88 cm2, corte 10 kD / Millipore). A etapa final de diafiltração é realizada contra Tampão Hepes (50 mM Hepes, 5 mM CaCl2, PH 7,5). A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína | total (procedimento Bradford e BCA) e atividade biológica de acordo com — métodos conhecidos.
Exemplo 42 Peguilação de G-CSF usando um reagente amino-oxi-PEG e m-toluidina como um catalisador nucleofilico Método 1:
G-CSF é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). G-CSF é dissolvido em 7,0 ml tampão histidina, pH 6,0 (20mM L-histidina, 150 mM — NaCl 5 mM CaCl2). Uma solução aquosa de periodato de sódio (5 mM) é então adicionada e a mistura de reação é incubada por 1 h no escuro a 4ºC em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de 7,5 ul de uma solução aquosa de 1 M de cisteina.
A mistura é subsequentemente submetida a UF/DF empregando filtradores Vivaspin por | centrífuga para remover periodato em excesso, extintores e os subprodutos ' dos mesmos.
O retentado contendo G-CSF oxidado é, em seguida, misturado com uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM) e incubado por 30 min em temperatura ambiente.
Reagente amino-oxi-PEG com um MW de kD é então adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 5 vezes.
Esta mistura é incubada por 2,5 h em temperatura ambiente no escuro em agitação suave.
Finalmente, o conjugado PEG- G-CSF é purificado por cromatografia de troca iônica (por exemplo, em Q-Sepharose FF). Por 20 exemplo, 1l,5mg proteína/ml gel é carregada em uma coluna equilibrada com 50 mM Tampão Hepes, pH 7,4 contendo 5 mM CaCl2. O conjugado é eluído com 50 mM Tampão Hepes contendo 5 mM CaCl2 e 500 mM cloreto de sódio, pH 7,4 e é então submetidas a UF/DF usando uma membrana de MW de corte apropriado.
À preparação é em seguida analiticamente caracterizada — medindo proteína total (Coomassie, Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica. | Em uma modalidade alternativa, o Método 1 é conduzido como a seguir.
G-CSF é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de ! 20 kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é | i 252 Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). G-CSF é dissolvido em 7,0 ml tampão histidina, pH 6,0 (2OmM L-histidina, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2). Uma solução aquosa de periodato de sódio (5 mM) é então adicionada e à mistura de reação é incubada por 1 h no escuro a 4ºC em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de 7,5 nl de uma solução aquosa de 1 M de cisteéina. À mistura é subsequentemente submetida a UF/DF empregando filtradores Vivaspin por | centrífuga para remover periodato em excesso, extintores e os subprodutos dos mesmos. O retentado contendo G-CSF oxidado é, em seguida, misturado com uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM) e incubado por 30 min em temperatura ambiente. Reagente amino-oxi-PEG com um MW de 20 kD é então adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 5 vezes. Esta mistura é incubada por 2,5 h em temperatura ambiente no escuro emagitação suave.
Finalmente, o conjugado PEG- G-CSF é purificado por cromatografia de troca iônica. As frações contendo conjugado de eluato são coletadas e então submetidas a UF/DF usando uma membrana de MW de corte apropriado. À preparação é em seguida analiticamente caracterizada — medindo proteína total (Coomassie, Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Método 2: G-CSF é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi. Um exêmplo deste tipo de reagente é — Sunbright O CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). G-CSF é transferida ou dissolvida em tampão de reação (por exemplo SOmM Hepes, 350mM cloreto de sódio, SmMM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 1,0 +/- 0,25 mg/ml. Então o pH da solução é corrigido para 6,0 por adição sob gotejamento de uma solução aquosa 0,5 N de HCl.
Subsequentemente uma solução aquosa 40 mM de periodato de sódio é adicionado dentro de 10 minutos para gerar uma concentração de 200 uM.
A reação de oxidação é conduzida por 30 +/- 5 min em uma temperatura (T) de T=+22 +/- 2ºC.
Então a reação é interrompida por adição de uma solução aquosa de L-cisteína (l M) dentro de 15 minutos em T= +22 +/- 2ºC para gerar uma concentração final de 10 mM em uma mistura de reação e incubação por 60 +/- 5 min.
O G-CSF oxidado é ainda purificado por cromatografia de | troca iônica.
As frações contendo G-CSF oxidado de eluato são coletadas e usadas para a reação de conjugação.
O reagente amino-oxi-PEG com um MW de reagente 20 kD é | adicionado em um excesso molar de 50 vezes ao eluato contendo o G-CSF oxidado purificado dentro de um período de tempo máximo (t) de 15 minutos em agitação suave.
Então uma solução aquosa de m-toluidina (SO MM) é adicionada dentro de 15 minutos para obter uma concentração final de 10 mM.
A mistura de reação é incubada por 120 +/- 10 min. no escuro em uma temperatura (T) de T=+22 +/- 2ºC sob agitação suave.
O conjugado PEG- G-CSF obtido é ainda purificado por cromatografia de troca iônica.
As frações contendo conjugado PEG-G-CSF são coletadas e concentradas por ultra-/diafiltração (UF/DF) usando uma membrana feita de celulose regenerada com um corte de peso molecular apropriado (Millipore). | Método 3: G-CSF é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de —20KkD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright&O CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). G-CSF é dissolvido em Tampão Hepes (50 mM Hepes, 150 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e misturado com uma solução aquosa de periodato de sódio (10 mM), e uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM).
Ns i 254 Subsequentemente, o reagente amino-oxi é adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 20 vezes.
A mistura é incubada por 2 h no escuro em Ú temperatura ambiente em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura | ambiente pela adição de 8 ul de solução aquosa de cisteína (1 M). | Finalmente, o conjugado PEG- G-CSF é purificado por | cromatografia de troca iônica em Q-Sepharose FF. 1,5 mg proteína/ml gel é carregada em uma coluna pré-equilibrada com 50 mM Tampão Hepes, pH 7,4 | | contendo 5 mM CaCl2. O conjugado é eluído com 50 mM Tampão Hepes contendo 5 mM CaCl2 e 500 mM cloreto de sódio, pH 7,4 e é então — submetidas a UF/DF usando uma membrana.
À preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica. | Em uma modalidade alternativa, o Método 3 é conduzido como a seguir.
G-CSF é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20KkD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright& CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). G-CSF é dissolvido em Tampão Hepes (50 mM Hepes, 150 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e misturado com uma solução aquosa de periodato de sódio (10 mM), e uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM). | —Subsequentemente, o reagente amino-oxi é adicionado para gerar um excesso | molar de reagente de 20 vezes.
A mistura é incubada por 2 h no escuro em temperatura ambiente em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de 8 ul de solução aquosa de cisteina (1 M). Finalmente, o conjugado PEG- G-CSF é purificado por | 25 cromatografia de troca iônica.
As frações de eluato contendo conjugado são coletadas e então submetidas a UF/DF usando uma membrana.
A preparação | é analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica. | Método 4:
' 255 ' G-CSF é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi. Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright&ê CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). Uma concentração inicial ou peso de G-CSF é transferida ou dissolvida em Tampão Hepes(50mM Hepes, 150 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 2 mg G-CSF / ml. Subsequentemente, uma solução aquosa 5 mM de periodato de sódio é | adicionada dentro de 15 minutos para gerar uma concentração final de 100 uM, seguido pela adição de uma solução aquosa 50 mM de m-toluidina — para obter uma concentração final de 10 mM dentro de um período de tempo de 30 minutos. Então o reagente amino-oxi-PEG com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 20 vezes. Após correção do pH a 6,0 a mistura é incubada por 2 h no escuro em temperatura ambiente em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de uma solução aquosa 1M de L-cisteína para gerar uma concentração final de 10 mM.
O conjugado G-CSF é purificado por meios de cromatografia de troca iônica (IEC). Frações de eluato contendo conjugado são concentradas por UF/DF usando uma membrana de 10 kD feita de celulose regenerada (88 —ecm2,corte10kD/Millipore). A etapa final de diafiltração é realizada contra Tampão Hepes (50 mM Hepes, 5 MM CaCl2, pH 7,5).
A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (procedimento Bradford e BCA) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos.
Exemplo 43 Peguilação de Humira usando um reagente amino-oxi-PEG e m-toluidina como um catalisador nucleofílico Método 1: Humira é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de
20 kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). Humira é dissolvido em 7,0 ml tampão histidina, pH 6,0 (20mM L-histidina, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2). Uma solução aquosa de periodato de sódio (5 mM) é entãoadicionadae a mistura de reação é incubada por 1 h no escuro a 4ºC em É agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de 7,5 ul de uma solução aquosa de 1 M de cisteina, A mistura é subsequentemente submetida a UF/DF empregando filtradores Vivaspin por | centrífuga para remover periodato em excesso, extintores e os subprodutos —dosmesmos.
O retentado contendo Humira oxidado é, em seguida, misturado com uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM) e incubado por 30 min em temperatura ambiente.
Reagente amino-oxi-PEG com um MW de 20 kD é então adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 5 vezes.
Esta mistura é incubada por 2,5 h em temperatura ambiente no escuro em agitação suave. | Finalmente, o conjugado PEG-Humira é purificado por cromatografia de troca iônica (por exemplo, em Q-Sepharose FF). Por exemplo, 1,5 mg proteína/ml gel é carregada em uma coluna equilibrada com 50mM Tampão Hepes, pH 7,4 contendo 5 mM CaCl2. O conjugado é eluído com 50 mM Tampão Hepes contendo 5 mM CaCl2 e 500 mM cloreto de sódio, pH 7,4 e é então submetidas a UF/DF usando uma membrana de MW de corte apropriado.
A preparação é em seguida analiticamente caracterizada medindo proteína total (Coomassie, Bradford) e atividade biológica de acordo —commétodos conhecidos na técnica. | Em uma modalidade alternativa, o Método | é conduzido como à seguir.
Humira é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). Humira é i 257 Ú dissolvido em 7,0 ml! tampão histidina, pH 6,0 (20OmM Lr-histidina, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2). Uma solução aquosa de periodato de sódio (S MM) é então adicionada e a mistura de reação é incubada por 1 h no escuro a 4ºC em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de 7,5 pl de uma solução aquosa de 1 M de cisteina.
À mistura é subsóquentemente submetida a UF/DF empregando filtradores Vivaspin por centrífuga para remover periodato em excesso, extintores e os subprodutos dos mesmos. | O retentado contendo Humira oxidado é, em seguida, | misturado com uma solução aquosa de m-toluídina (50 mM) e incubado por 30 min em temperatura ambiente.
Reagente amino-oxi-PEG com um MW de 20 kD é então adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 5 vezes.
Esta mistura é incubada por 2,5 h em temperatura ambiente no escuro em agitação suave.
Finalmente, o conjugado PEG- Humira é purificado por cromatografia de troca iônica.
As frações contendo conjugados de eluato são coletadas e então submetidas a UF/DF usando uma membrana de MW de | corte apropriado.
À preparação é em seguida analiticamente caracterizada medindo proteína total (Coomassie, Bradford) e atividade biológica de acordo — com meétodos conhecidos na técnica.
Método 2: Humira é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). Humira é | transferida ou dissolvida em tampão de reação (por exemplo 50mM Hepes, ! 350mM cloreto de sódio, SMM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 1,0 +/- 0,25 mg/ml.
Então o pH da solução é | corrigido para 6,0 por adição sob gotejamento de uma solução aquosa 0,5 N de HCl.
Subsequentemente uma solução aquosa 40 mM de periodato de sódio i 258 é adicionado dentro de 10 minutos para gerar uma concentração de 200 uM. A reação de oxidação é conduzida por 30 +/- 5 min em uma temperatura (T) de T=+22 +/- 2ºC. Então a reação é interrompida por adição de uma solução aquosa de L-cisteína (1 M) dentro de 15 minutos em T= +22 +/- 2ºC para gerar uma concentração final de 10 mM em uma mistura de reação e incubação por 66 +/- 5 min. Humira oxidada é ainda purificada por cromatografia de troca | iônica. As frações contendo Humira oxidada de eluato são coletadas e usadas para a reação de conjugação.
O reagente amino-oxi-PEG com um MW de reagente 20 kD é adicionado em um excesso molar de 50 vezes ao eluato contendo o Humira oxidado purificado dentro de um período de tempo máximo (t) de 15 minutos em agitação suave. Então uma solução aquosa de m-toluidina (SO MM) é adicionada dentro de 15 minutos para obter uma concentração final de 10 mM. A mistura de reação é incubada por 120 +/- 10 min. no escuro em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC sob agitação suave.
O conjugado PEG-Humira obtido é ainda purificado por cromatografia de troca iônica. As frações contendo conjugado PEG-Humira são coletadas e concentradas por ultra- / diafiltração (UF/DF) usando uma membrana feita de celulose regenerada com um corte de peso molecular apropriado (Millipore).
Método 3: Humira é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi. Um exemplo deste tipo de reagente é —Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). Humira é dissolvido em Tampão Hepes (50 mM Hepes, 150 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e misturado com uma solução aquosa de periodato de sódio (10 mM), e uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM). Subsequentemente, o reagente amino-oxi é adicionado para gerar um excesso
| ' 259 ' molar de reagente de 20 vezes.
A mistura é incubada por 2 h no escuro em temperatura ambiente em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de 8 ul de solução aquosa de cisteina (1 M). Finalmente, o conjugado PEG- Humira é purificado por cromatografia de troca iônica em Q-Sepharose FF. 1,5 mg proteína/ml gel é carregada em uma coluna píé-equilibrada com 50 mM Tampão Hepes, pH 7,4 contendo 5 mM CaCl2. O conjugado é eluído com 50 mM Tampão Hepes contendo 5 mM CaCl2 e 500 mM cloreto de sódio, pH 7,4 e é então submetidas a UF/DF usando uma membrana.
A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Em uma modalidade alternativa, o Método 3 é conduzido como a seguir.
Humira é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). Humira é dissolvido em Tampão Hepes (50 mM Hepes, 150 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e misturado com uma solução aquosa de periodato de sódio (10 mM), e uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM). Subsequentemente o reagente amino-oxi é adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 20 vezes.
À mistura é incubada por 2 h no escuro em temperatura ambiente em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de 8 ul de solução aquosa de cisteína (1 M). Finalmente, o conjugado PEG-Humira é purificado por cromatografia de troca iônica.
As frações contendo conjugado são coletados e então submetidas a UF/DF usando uma membrana.
À preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Método 4: Humira é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de
] 20 kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). Uma concentração inicial ou peso de Humira é transferida ou dissolvida em Tampão Hepes (50 mM Hepes, 150 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de — cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 2 mg Humira / ml.
Subsequentemente uma solução atfoosa 5 mM de periodato de sódio é | adicionado dentro de 15 minutos para gerar uma concentração final de 100 uM, seguido pela adição de uma solução aquosa 50 mM de m-toluidina para obter uma concentração final de 10 mM dentro de um período de tempo de 30 minutos.
Então o reagente amino-oxi-PEG com um MW de 20 kD | (descrito acima) é adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 20 vezes.
Após correção do pH a 6,0 a mistura é incubada por 2 h no escuro em temperatura ambiente em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de uma solução aquosa 1 M de L-cisteína para gerar uma concentração final de 10 mM.
O conjugado Humira é purificado por meios de cromatografia de troca iônica (IEC). Frações de eluato contendo conjugado são concentradas por UF/DF usando uma membrana de 10 kD feita de celulose regenerada (88 : cem2, corte 10 kD / Millipore). A etapa final de diafiltração é realizada contra Tampão Hepes(50mM Hepes, 5 mM CaCl2, pH 7,5). A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (procedimento Bradford e BCA) e atividade biológica de acordo com | métodos conhecidos.
Exemplo 44 Peguilação de Prolia usando um reagente amino-oxi-PEG e m- | toluidina como um catalisador nucleofílico | Método 1: Prolia é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é
DM: 261 Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). Prolia é dissolvido em 7,0 ml tampão histidina, pH 6,0 (2OmM L-histidina, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2). Uma solução aquosa de periodato de sódio (5 mM) é então adicionada e a mistura de reação é incubada por 1 h no escuro a 4ºC em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de 7,5 ul de uma solução aquosa de 1 M dé cisteina. A mistura é subsequentemente submetida a UF/DF empregando filtradores Vivaspin por centrífuga para remover periodato em excesso, extintores e os subprodutos dos mesmos. , O retentado contendo Prolia oxidado é, em seguida, misturado com uma solução aquosa de m-toluidina (50 MM) e incubado por 30 min em temperatura ambiente. Reagente amino-oxi-PEG com um MW de 20 kD é então adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 5 vezes. Esta mistura é incubada por 2,5 h em temperatura ambiente no escuro em agitação suave.
Finalmente, o conjugado PEG- Prolia é purificado por cromatografia de troca iônica (por exemplo, em Q-Sepharose FF). Por exemplo, 1,5 mg proteína/ml gel é carregada em uma coluna equilibrada com 50 mM Tampão Hepes, pH 7,4 contendo 5 mM CaCl2. O conjugado é eluído com 50mM Tampão Hepes contendo 5 mM CaCl2 e 500 mM cloreto de sódio, pH 7,4 e é então submetidas a UF/DF usando uma membrana de MW de corte apropriado. A preparação é em seguida analiticamente caracterizada medindo proteína total (Coomassie, Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Em uma modalidade alternativa, o Método 1 é conduzido como a seguir. Prolia é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi. Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). 10 mg de rFIX é dissolvido em 5 ml histidina - tampão, pH 6,0 (20 mM L-histidina, 150 mM
| i 262 O NaCl). 100 ul de uma solução aquosa de periodato de sódio (5 mM) é então | adicionada e a mistura de reação é incubada por 1 h no escuro a 4ºC em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de 50 ul de uma solução aquosa de 1 M de cisteina A mistura é — subsequentemente submetido a UF/DF empregando Vivaspin 15R 10 kD filtradores por centrífuga para remover periodato em excessos extintores eos subprodutos dos mesmos.
O retentado (aprox. 7 ml), contendo Prolia oxidado, é misturado com 2 ml de uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM) e —incubado por 30 min em temperatura ambiente.
Então reagente amino-oxi- PEG com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 5 vezes.
Esta mistura é incubada por 2,5 h em RT no escuro em agitação suave.
Finalmente o conjugado PEG-Prolia é purificado por cromatografia de troca iônica em SP Sepharose FF.
A mistura de reação é diluída com 20 ml Tampão A (50 mM Hepes, pH 6,5) e carregada em uma coluna 20 ml HiPrep SP FF 16/10 (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré- equilibrada com Tampão A.
Então a coluna é eluída com Tampão B (50 mM Hepes, 1 M NaCl, pH 6,5). Prolia livre é eluída lavando a coluna com 25 % TampãoBeo conjugado a 50% Tampão B.
As frações contendo conjugado são concentradas por UF/DF usando uma membrana de 10 kD feita de celulose regenerada (88 cm2, corte 10 kD / Millipore). A etapa final de diafiltração é realizada contra tampão histidina, pH 6,9 contendo 150 mM NaCl.
A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Para o conjugado PEG-Prolia uma atividade específica de > 50 % em comparação ao Prolia nativo é determinada.
O conjugado é adicionalmente analiticamente caracterizada por HPLC por exclusão de tamanho usando um sistema Agilent 1200 HPLC equipado com uma coluna Shodex KW 803 em
| o Ol%ooaÕD"EB e sa ua nnnnnn nn N-'22!S52!.j ;2.) 2 529 i 263 i condições como anteriormente descrito (Kolarich et al, Transfusion 2006;46:1959-77). É demonstrado que a preparação não contém Prolia livre.
Método 2: Prolia é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de —20KkD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). Protiá é transferida ou dissolvida em tampão de reação (por exemplo S0OmM Hepes, 350mM cloreto de sódio, SMM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter | concentração de proteína final de 1,0 +/- 0,25 mg/ml.
Então o pH da solução é ! corrigido para 6,0 por adição sob gotejamento de uma solução aquosa 0,5 N de HCl.
Subsequentemente, uma solução aquosa 40 mM de periodato de sódio é adicionado dentro de 10 minutos para gerar uma concentração de 200 UM.
A reação de oxidação é conduzida por 30 +/- 5 min em uma temperatura (T) de T= +22 +/- 2ºC.
Então a reação é interrompida por adição de uma solução aquosa de L-cisteína (1 M) dentro de 15 minutos em T= +22 +/- 2ºC para gerar uma concentração final de 10 mM em uma mistura de reação e incubação por 60 +/- 5 min.
Prolia oxidada é ainda purificado por cromatografia de troca iônica.
As frações contendo Humira oxidada de eluato são coletadas e usadas —paraareação de conjugação. | O reagente amino-oxi-PEG com um MW de reagente 20 kD é adicionado em um excesso molar de 50 vezes ao eluato contendo Prolia | oxidada purificada dentro de um período de tempo máximo (t) de 15 minutos em agitação suave.
Então uma solução aquosa de m-toluidina (SO mM) é | 25 — adicionada dentro de 15 minutos para obter uma concentração final de 10 mM.
A mistura de reação é incubada por 120 +/- 10 min. no escuro em uma temperatura (T) de T=+22 +/- 2ºC sob agitação suave.
O conjugado PEG- Prolia obtido é ainda purificado por cromatografia de troca iônica.
As frações contendo conjugado PEG- Prolia
' 264 ' são coletadas e concentradas por ultra- / diafiltração (UF/DF) usando uma membrana feita de celulose regenerada com um corte de peso molecular apropriado (Millipore). Método 3: Prolia é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é CA Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). EPO é dissolvido em Tampão Hepes (50 mM Hepes, 150 mM cloreto de sódio, 5 | mM cloreto de cálcio, pH 6,0) e misturado com uma solução aquosa de — periodato de sódio (10 mM), e uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM). Subsequentemente o reagente amino-oxi é adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 20 vezes.
A mistura é incubada por 2 h no escuro em | temperatura ambiente em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de 8 ul de solução aquosa de cisteína (1 M). Finalmente, o conjugado PEG- Prolia é purificado por cromatografia de troca iônica em Q-Sepharose FF. 1,5 mg proteína/ml gel é carregada em uma coluna pré-equilibrada com 50 mM Tampão Hepes, pH 7,4 contendo 5 mM CaCl2. O conjugado é eluído com 50 mM Tampão Hepes contendo 5 mM CaCl2 e 500 mM cloreto de sódio, pH 7,4 e é então —submetidasa UF/DF usando uma membrana.
A preparação é analiticamente ( caracterizada medindo proteína total (Bradford) e atividade biológica de | acordo com métodos conhecidos na técnica. | Em uma modalidade alternativa, o Método 3 é conduzido como a seguir.
Prolia é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). 10 mg Prolia é dissolvido em —8 ml tampão histidina, pH 6,0 (20 mM L-histidina, 150 mM NaCl). 200 ul de uma solução aquosa de periodato de sódio (5 mM) e 2 ml de
' uma solução aquosa de m-toluidina (50 mM) são então adicionados. | Subsequentemente, o reagente amino-oxi-PEG com um MW de 20 kD | (descrito acima) é adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 5 vezes.
À mistura é incubada por 2 h no escuro em temperatura ambiente em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura ambiente pela adição de 100 ul de solução aquosa 1 M de cisteína.
Finalmente o conjugado PEG-Prolia é purificado por cromatografia de troca iônica em SP-Sepharose FF.
A mistura de reação é diluída com 20 ml Tampão A (50 mM Hepes, pH 6,5) e carregada em uma coluna 20 ml HiPrep SPFF 16/10 (GE Healthcare, Fairfield, CT) pré- equilibrada com Tampão A.
Então a coluna é eluída com Tampão B (50 mM Hepes, 1 M NaCl, pH 6,5). Prolia livre é eluída lavando a coluna com 25% Tampão B e o conjugado a 50% Tampão B.
As frações contendo conjugado são concentradas por UF/DF usando uma membrana de 10 kD feita de — celulose regenerada (88 cm2, corte 10 kD / Millipore). A etapa final de diafiltração é realizada contra tampão histidina, pH 6,9 contendo 150 mM NaCl.
A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total | (Bradford) e atividade biológica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Para o conjugado PEG-Prolia uma atividade específica de > 50 % em comparação ao Prolia nativo é determinada.
O conjugado é adicionalmente analiticamente caracterizada por HPLC por exclusão de tamanho usando um ! sistema Agilent 1200 HPLC equipado com uma coluna Shodex KW 803 em | condições como anteriormente descrito (Kolarich et al, Transfusion 2006;46:1959-77). É demonstrado que a preparação não contém Prolia livre.
Método 4: Prolia é peguilado pelo uso de um reagente de peguilação de 20 kD contendo um grupo amino-oxi.
Um exemplo deste tipo de reagente é | Sunbright & CA series de NOF (NOF Corp., Tóquio, Japão). Uma concentração inicial ou peso de Humira é transferida ou dissolvida em
| 266 ' Tampão Hepes (50 mM Hepes, 150 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de cálcio, pH 6,0) para obter concentração de proteína final de 2 mg Prolia / ml.
Subsequentemente uma solução aquosa 5 mM de periodato de sódio é adicionado dentro de 15 minutos para gerar uma concentração final de —100uM, seguido pela adição de uma solução aquosa 50 mM de m-toluidina para obter uma concentração final de 10 mM dentro de um período de tempo | de 30 minutos.
Então o reagente amino-oxi-PEG com um MW de 20 kD (descrito acima) é adicionado para gerar um excesso molar de reagente de 20 vezes.
Após correção do pH a 6,0 a mistura é incubada por 2 h no escuro em | temperatura ambiente em agitação suave e extinta por 15 min em temperatura | ambiente pela adição de uma solução aquosa 1M de L-cisteina para gerar uma concentração final de 10 mM. | O conjugado Prolia é purificado por meios de cromatografia de troca iônica (IEC). Frações de eluato contendo conjugado são concentradas ; por UF/DF usando uma membrana de 10 kD feita de celulose regenerada (88 em2, corte 10 kD / Millipore). A etapa final de diafiltração é realizada contra Tampão Hepes (50 mM Hepes, 5 mM CaCl2, pH 7,5). | A preparação é analiticamente caracterizada medindo proteína total (procedimento Bradford e BCA) e atividade biológica de acordo com | — métodos conhecidos.
Exemplo 45 | Peguilação de uma proteína terapêutica usando PEG | ramificado Peguilação de uma proteína terapêutica da invenção pode ser — estendida a um reagente de peguilação ramificado ou linear, que é preparado por um aldeído e um ligante apropriado contendo um grupo amino-oxi ativado.