CN108079311A - 用于肟键联的亲核性催化剂 - Google Patents

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H·罗滕施泰纳
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Abstract

本发明涉及用于使水溶性聚合物与治疗性蛋白质的氧化型碳水化合物部分缀合的材料和方法,所述方法包括在允许缀合的条件下使所述氧化型碳水化合物部分与活化的水溶性聚合物接触。更具体地说,本发明涉及上述材料和方法,其中所述水溶性聚合物含有活性氨氧基且其中在所述氧化型碳水化合物部分与所述水溶性聚合物上的活性氨氧基之间形成肟或腙键联,且其中所述缀合在亲核性催化剂存在下进行。

Description

用于肟键联的亲核性催化剂
本申请是中国专利申请《用于肟键联的亲核性催化剂》的分案申请,原申请的申请号为201180047635.1,申请日为2011年07月29日。
发明领域
本发明涉及用于使水溶性聚合物与蛋白质缀合的材料和方法。
发明背景
通过在水溶性聚合物与治疗性蛋白质之间形成共价键联来制备缀合物可通过多种化学方法进行。多肽药物的聚乙二醇化在循环过程中保护所述药物且改进其药效学和药物动力学特征(Harris和Chess,Nat Rev Drug Discov.2003;2:214-21)。聚乙二醇化过程使乙二醇的重复单元(聚乙二醇(PEG))连接于多肽药物。PEG分子具有大的流体动力学体积(为球状蛋白质大小的5-10倍),水溶性高且可被水合,无毒,非免疫原性并且自身体快速清除。分子的聚乙二醇化可使得药物对酶降解的抗性增加,活体内半衰期延长,给药频率降低,免疫原性降低,物理和热稳定性增加,可溶性增加,液体稳定性增加和聚集减少。在1990年代初,第一种聚乙二醇化药物由FDA批准。自此以后,FDA已批准若干种聚乙二醇化药物用于口服、注射和局部施用。
聚唾液酸(polysialic acid,PSA)也称为多聚乙酰神经胺糖酸(colominic acid,CA),为一种天然存在的多糖。其为具有α(2→8)酮苷键联(ketosidic linkage)的N-乙酰神经胺糖酸均聚物且在其非还原端含有邻二醇基团。其带负电荷且为人体的天然组分。其可以由细菌容易地大量产生且具有预定物理特征(美国专利号5,846,951)。因为细菌产生的PSA在化学和免疫学上与人体内产生的PSA一致,所以细菌PSA为非免疫原性的,即使在与蛋白质偶合时。不同于一些聚合物,PSA酸为生物可降解的。已显示多聚乙酰神经胺糖酸与催化酶和天冬酰胺酶的共价偶合可增加蛋白水解酶或血浆存在下的酶稳定性。使用聚唾液酸化和未修饰的天冬酰胺酶的活体内比较研究揭露聚唾液酸化延长所述酶的半衰期(Fernandes和Gregoriadis,Int J Pharm.2001;217:215-24)。
PEG-衍生物与肽或蛋白质的偶合由Roberts等(Adv Drug Deliv Rev2002;54:459-76)评述。一种使水溶性聚合物与治疗性蛋白质偶合的方法为经由蛋白质的碳水化合物部分缀合所述聚合物。蛋白质中碳水化合物的邻位羟基(OH)可容易地用过碘酸钠(NaIO4)氧化形成活性醛基(Rothfus et Smith,JBiol Chem 1963;238:1402-10;vanLenten et Ashwell,J Biol Chem1971;246:1889-94)。随后可通过使用含有例如活性酰肼基的试剂使聚合物与碳水化合物的醛基偶合(Wilchek M和Bayer EA,Methods Enzymol1987;138:429-42)。最新技术为使用含有氨氧基的试剂,其与醛反应形成肟键联(WO96/40662、WO2008/025856)。
描述水溶性聚合物与治疗性蛋白质的缀合的其它实例描述于以下文献中:WO 06/071801,其教导氧化冯威里氏因子(Von Willebrand factor)中的碳水化合物部分并随后使用酰肼化学反应与PEG偶合;美国公布号2009/0076237,其教导氧化rFVIII并随后使用酰肼化学反应与PEG和其它水溶性聚合物(例如PSA、HES、葡聚糖)偶合;WO 2008/025856,其教导氧化不同凝血因子(例如rFIX、FVIII和FVIIa)并随后使用氨氧基化学反应通过形成肟键联而与例如PEG偶合;和美国专利号5,621,039,其教导氧化FIX并随后使用酰肼化学反应与PEG偶合。
近来,描述了一种改进方法,其包括对唾液酸进行轻度过碘酸盐氧化以产生醛,随后在催化量的苯胺存在下与含有氨氧基的试剂反应(Dirksen A.和Dawson PE,Bioconjugate Chem.2008;19,2543-8;和Zeng Y等,Nature Methods 2009;6:207-9)。苯胺催化显著加速肟连接,从而允许使用极低浓度的试剂。亲核性催化剂的使用还描述于以下文献中:Dirksen,A.等,J Am Chem Soc.,128:15602-3(2006);Dirksen,A.等,Angewchem.Int Ed.,45:7581-4(2006);Kohler,J.J.,ChemBioChem.,10:2147-50(2009);Giuseppone,N.等,J Am Chem Soc.,127:5528-39(2005);和Thygesen,M.B.等,J OrgChem.,75:1752-5(2010)。
尽管苯胺催化可加速肟连接,从而允许短反应时间和使用低浓度的氨氧基试剂,但苯胺具有毒性,当例如缀合的治疗性蛋白质形成药物基剂时,此必须加以考虑。举例来说,已显示苯胺诱发高铁血红蛋白血症(Harrison,J.H..和Jollow,D.J.,MolecularPharmacology,32(3)423-431,1987)。已显示对大鼠进行长期膳食处理会诱发脾肿瘤(Goodman,DG.等,J Natl Cancer Inst.,73(1):265-73,1984)。活体外研究还已显示苯胺具有诱发染色体突变的可能性且具有可能的基因毒性活性(Bombhard E.M.et Herbold B,Critical Reviews in Toxicology 35,783-835,2005)。
考虑到苯胺的可能危险性质且尽管所述方法可用于缀合水溶性聚合物与治疗性蛋白质,但仍需要开发用于使水溶性聚合物与蛋白质缀合的材料和方法,其改进蛋白质的药效学和/或药物动力学性质,同时使与各种试剂相关的成本降至最小且使患者接受者的健康风险降至最小。
发明概述
本发明提供用于使聚合物与蛋白质缀合的材料和方法,其改进所述蛋白质的药效学和/或药物动力学性质,同时使与各种试剂相关的成本和当由亲核性催化剂催化缀合反应时患者接受者的健康风险降至最小。在本发明的各种实施方案中,提供取代苯胺的替代性催化剂。
在一个实施方案中,提供一种用于使水溶性聚合物与治疗性蛋白质的氧化型碳水化合物部分缀合的方法,其包括在允许缀合的条件下使所述氧化型碳水化合物部分与活化的水溶性聚合物接触;所述水溶性聚合物含有活性氨氧基且选自由以下组成的组:聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)、支链PEG、(Warwick Effect Polymers;Coventry,UK)、聚唾液酸(PSA)、淀粉、羟烷基淀粉(hydroxyalkyl starch,HAS)、羟乙基淀粉(hydroxylethyl starch,HES)、碳水化合物、多糖、普鲁兰(pullulane)、壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、淀粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚环氧烷(polyalkyleneoxide,PAO)、聚烷二醇(polyalkylene glycol,PAG)、聚丙二醇(polypropylene glycol,PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯酰基吗啉、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-马来酸酐、聚苯乙烯-共-马来酸酐、聚(1-羟甲基亚乙基羟甲基缩甲醛)(poly(1-hydroxymethylethylene hydroxymethylformal),PHF)、2-甲基丙烯酰氧基-2'-乙基三甲基磷酸铵(2-methacryloyloxy-2'-ethyltrimethylammoniumphosphate,MPC);和所述碳水化合物部分通过与包含选自由以下组成的组的氧化剂的缓冲液一起孵育而氧化:过碘酸钠(NaIO4)、四乙酸铅(Pb(OAc)4)和过钌酸钾(KRuO4);其中在所述氧化型碳水化合物部分与所述水溶性聚合物上的活性氨氧基之间形成肟键联;且其中所述肟键联形成由选自由以下组成的组的亲核性催化剂催化:邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸、对氨基苯磺酸、邻氨基苯甲酰胺、邻甲苯胺、间甲苯胺、对甲苯胺、邻茴香胺、间茴香胺和对茴香胺。
在另一实施方案中,提供一种用于使水溶性聚合物与治疗性蛋白质的氧化型碳水化合物部分缀合的方法,其包括在允许缀合的条件下使所述氧化型碳水化合物部分与活化的水溶性聚合物接触;所述治疗性蛋白质选自由以下组成的组:因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、冯威里氏因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白C、蛋白S、tPA、PAI-1、组织因子(TF)、ADAMTS 13蛋白酶、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-11、集落刺激因子-1(colony stimulatingfactor-1,CSF-1)、M-CSF、SCF、GM-CSF、粒细胞集落刺激因子(granulocyte colonystimulating factor,G-CSF)、EPO、干扰素-α(IFN-α)、复合干扰素(consensusinterferon)、IFN-β、IFN-γ、IFN-ω、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-31、IL-32α、IL-33、血小板生成素(thrombopoietin,TPO)、Ang-1、Ang-2、Ang-4、Ang-Y、促血管生成素样多肽1(angiopoietin-like polypeptide 1,ANGPTL1)、促血管生成素样多肽2(ANGPTL2)、促血管生成素样多肽3(ANGPTL3)、促血管生成素样多肽4(ANGPTL4)、促血管生成素样多肽5(ANGPTL5)、促血管生成素样多肽6(ANGPTL6)、促血管生成素样多肽7(ANGPTL7)、玻连蛋白(vitronectin)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、血管生成素、活化素A、活化素B、活化素C、骨形态发生蛋白-1、骨形态发生蛋白-2、骨形态发生蛋白-3、骨形态发生蛋白-4、骨形态发生蛋白-5、骨形态发生蛋白-6、骨形态发生蛋白-7、骨形态发生蛋白-8、骨形态发生蛋白-9、骨形态发生蛋白-10、骨形态发生蛋白-11、骨形态发生蛋白-12、骨形态发生蛋白-13、骨形态发生蛋白-14、骨形态发生蛋白-15、骨形态发生蛋白受体IA、骨形态发生蛋白受体IB、骨形态发生蛋白受体II、脑源性神经营养因子、心营养素-1(cardiotrophin-1)、纤毛神经营养因子、纤毛神经营养因子受体、畸胎瘤衍化生长因子(cripto)、隐秘因子(cryptic)、细胞因子诱导性嗜中性粒细胞趋化因子1、细胞因子诱导性嗜中性粒细胞、趋化因子2α、细胞因子诱导性嗜中性粒细胞趋化因子2β、β内皮细胞生长因子、内皮素1、表皮生长因子、促红血球生成素(epigen)、表皮调节素(epiregulin)、上皮源性嗜中性粒细胞引诱剂、成纤维细胞生长因子4、成纤维细胞生长因子5、成纤维细胞生长因子6、成纤维细胞生长因子7、成纤维细胞生长因子8、成纤维细胞生长因子8b、成纤维细胞生长因子8c、成纤维细胞生长因子9、成纤维细胞生长因子10、成纤维细胞生长因子11、成纤维细胞生长因子12、成纤维细胞生长因子13、成纤维细胞生长因子16、成纤维细胞生长因子17、成纤维细胞生长因子19、成纤维细胞生长因子20、成纤维细胞生长因子21、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、神经胶质细胞系源性神经营养因子受体α1、神经胶质细胞系源性神经营养因子受体α2、生长相关蛋白、生长相关蛋白α、生长相关蛋白β、生长相关蛋白γ、肝素结合表皮生长因子、肝细胞生长因子、肝细胞生长因子受体、肝细胞瘤源性生长因子、胰岛素样生长因子I、胰岛素样生长因子受体、胰岛素样生长因子II、胰岛素样生长因子结合蛋白、角质化细胞生长因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受体α、神经生长因子、神经生长因子受体、神经生成素、神经营养素-3、神经营养素-4、抑瘤素M(oncostatin M,OSM)、胎盘生长因子、胎盘生长因子2、血小板源性内皮细胞生长因子、血小板源性生长因子、血小板源性生长因子A链、血小板源性生长因子AA、血小板源性生长因子AB、血小板源性生长因子B链、血小板源性生长因子BB、血小板源性生长因子受体α、血小板源性生长因子受体β、前B细胞生长刺激因子、干细胞因子(stem cell factor,SCF)、干细胞因子受体、TNF、TNF0、TNF1、TNF2、转化生长因子α、转化生长因子β、转化生长因子β1、转化生长因子β1.2、转化生长因子β2、转化生长因子β3、转化生长因子β5、潜伏转化生长因子β1、转化生长因子β结合蛋白I、转化生长因子β结合蛋白II、转化生长因子β结合蛋白III、胸腺基质淋巴细胞生成素(thymic stromal lymphopoietin,TSLP)、肿瘤坏死因子受体I型、肿瘤坏死因子受体II型、尿激酶型纤溶酶原活化因子受体、磷脂酶活化蛋白(phospholipase-activating protein,PUP)、胰岛素、凝集素蓖麻毒素、泌乳素、绒毛膜促性腺素、卵泡刺激素、甲状腺刺激素、组织纤溶酶原活化因子、IgG、IgE、IgM、IgA和IgD、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、DNA酶、胎球蛋白、黄体生成激素、雌激素、胰岛素、白蛋白、脂蛋白、胎蛋白、转铁蛋白、血小板生成素、尿激酶、整合素、凝血酶、瘦素、修美乐(Humira)(阿达木单抗(adalimumab))、普罗利亚(Prolia)(地诺单抗(denosumab))、恩利(Enbrel)(依那西普(etanercept))、表1中的蛋白或其生物活性片段、衍生物或变体;所述水溶性聚合物含有活性氨氧基且选自由以下组成的组:聚乙二醇(PEG)、支链PEG、(Warwick EffectPolymers;Coventry,UK)、聚唾液酸(PSA)、淀粉、羟烷基淀粉(HAS)、羟乙基淀粉(HES)、碳水化合物、多糖、普鲁兰、壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、淀粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚环氧烷(PAO)、聚烷二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯酰基吗啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-马来酸酐、聚苯乙烯-共-马来酸酐、聚(1-羟甲基亚乙基羟甲基缩甲醛)(PHF)、2-甲基丙烯酰氧基-2'-乙基三甲基磷酸铵(MPC);和所述碳水化合物部分通过与包含选自由以下组成的组的氧化剂的缓冲液一起孵育而氧化:过碘酸钠(NaIO4)、四乙酸铅(Pb(OAc)4)和过钌酸钾(KRuO4);其中在所述氧化型碳水化合物部分与所述水溶性聚合物上的活性氨氧基之间形成肟键联;且其中所述肟键联形成由选自由以下组成的组的亲核性催化剂催化:邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸、对氨基苯磺酸、邻氨基苯甲酰胺、邻甲苯胺、间甲苯胺、对甲苯胺、邻茴香胺、间茴香胺和对茴香胺。
在又一实施方案中,提供一种上述方法,其中在与活化的水溶性聚合物接触之前,包含初始浓度介于约0.3mg/ml与约3.0mg/ml之间的治疗性蛋白质的溶液被调整至介于约5.0与约8.0之间的pH值。
如本文中所使用,术语“约(about)”意谓高于或低于规定值的值。在各种实施方案中,术语“约”包括规定值加上或减去规定值的0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10%。
在另一实施方案中,提供一种上述方法,其中治疗性蛋白质的初始浓度为约1.0mg/ml且pH为约6.0。在一个相关实施方案中,治疗性蛋白质的初始浓度为约0.75mg/ml且pH为约6.0。在又一相关实施方案中,治疗性蛋白质的初始浓度为约1.25mg/ml且pH为约6.0。
在另一实施方案中,提供一种上述方法,其中治疗性蛋白质接触期望的过量浓度的活化的水溶性聚合物,其中所述过量浓度介于约1摩尔浓度与约300摩尔浓度过量之间。在另一实施方案中,过量浓度为约50倍摩尔浓度过量。
在又一实施方案中,提供一种上述方法,其中治疗性蛋白质在包含以下的条件下与活化的水溶性聚合物一起孵育:介于约0.5小时与约24小时之间的时段;介于约2℃与约37℃之间的温度;在光存在或不存在下;和在搅拌或不搅拌下。在另一实施方案中,所述条件包含约120分钟的时段、约22℃的温度、不存在光;和在搅拌下。如本文中所使用,术语“搅拌(stirring)”欲包括由常用实验室或制造设备和产品在各种速度和强度下搅拌(例如平缓搅拌)。
在另一实施方案中,提供一种上述方法,其中亲核性催化剂在包含以下的条件下以使得亲核性催化剂的最终浓度介于约1.0mM与约50mM之间的量添加:介于约0.1分钟与约30分钟之间的时段;介于约2℃与约37℃之间的温度;在光存在或不存在下;和在搅拌或不搅拌下。在另一实施方案中,亲核性催化剂的最终浓度为约10mM,且所述条件包含至多约15分钟的时段、约22℃的温度、不存在光;和在搅拌下。
在又一实施方案中,提供一种上述方法,其中氧化剂在包含以下的条件下以使得氧化剂的最终浓度介于约50μM与约1000μM之间的量添加:介于约0.1分钟与120分钟之间的时段;介于约2℃与约37℃之间的温度;在光存在或不存在下;和在搅拌或不搅拌下。在另一实施方案中,氧化剂的最终浓度为约400μM,且所述条件包含约10分钟的时段、约22℃的温度、不存在光和在搅拌下。
在另一实施方案中,提供一种上述方法,其中水溶性聚合物与治疗性蛋白质的氧化型碳水化合物部分的缀合通过添加选自由以下组成的组的淬灭剂而终止:L-半胱氨酸、甲硫氨酸、谷胱甘肽、甘油、偏亚硫酸氢钠(Na2S2O5)、色氨酸、酪氨酸、组氨酸或其衍生物、甲酚、咪唑和其组合;其中所述淬灭剂在包含以下的条件下以使得淬灭剂的最终浓度介于约1mM与约100mM之间的量添加:介于约5分钟与约120分钟之间的时段;介于约2℃与约37℃之间的温度;在光存在或不存在下;和在搅拌或不搅拌下。在另一实施方案中,淬灭剂为L-半胱氨酸。在又一实施方案中,L-半胱氨酸添加成使得最终浓度为约10mM且所述条件包含约60分钟的时段、约22℃的温度、不存在光和在搅拌下。
在另一实施方案中,提供一种上述方法,其包括:a)第一步骤,其包括将包含治疗性蛋白质的溶液的pH值调整至介于约5.0与约8.0之间的pH值,其中治疗性蛋白质浓度介于约0.3mg/ml与约3.0mg/ml之间;b)第二步骤,其包括氧化治疗性蛋白质上的一个或多个碳水化合物,其中氧化剂在包含以下的条件下添加至所述第一步骤中的溶液中以使得最终浓度介于约50μM与约1000μM之间:介于约0.1分钟与约120分钟之间的时段;介于约2℃与约37℃之间的温度;在光存在或不存在下;和在搅拌或不搅拌下;c)第三步骤,其包括在包含以下的条件下使治疗性蛋白质与期望的过量浓度的活化的水溶性聚合物接触,其中所述过量浓度介于约1摩尔浓度过量与约300摩尔浓度过量之间:介于约0.5小时与约24小时之间的时段;介于约2℃与约37℃之间的温度;在光存在或不存在下;和在搅拌或不搅拌下;d)第四步骤,其包括将亲核性催化剂添加至所述第三步骤的溶液中,其中所述亲核性催化剂在包含以下的条件下添加成使得最终浓度介于约1mM与约50mM之间:介于约0.1分钟与约30分钟之间的时段;介于约2℃与约37℃之间的温度;在光存在或不存在下;和在搅拌或不搅拌下;e)第五步骤,其中治疗性蛋白质在允许活化的水溶性聚合物与治疗性蛋白质上的一个或多个氧化型碳水化合物缀合的条件下与活化的水溶性聚合物和亲核性催化剂一起孵育,所述条件包含介于约0.5小时与约24小时之间的时段、介于约2℃与约37℃之间的温度;在光存在或不存在下;和在搅拌或不搅拌下;和f)第六步骤,其中所述第五步骤中水溶性聚合物与治疗性蛋白质的一个或多个氧化型碳水化合物的缀合通过添加选自由以下组成的组的淬灭剂而终止:L-半胱氨酸、甲硫氨酸、谷胱甘肽、甘油、Na2S2O5(偏亚硫酸氢钠)、色氨酸、酪氨酸、组氨酸或其衍生物、甲酚、咪唑和其组合;其中所述淬灭剂在包含以下的条件下添加成使得最终浓度为约1mM和约100mM:介于约5分钟与约120分钟之间的时段;介于约2℃与约37℃之间的温度;在光存在或不存在下;和在搅拌或不搅拌下。在另一实施方案中,第一步骤中治疗性蛋白质的初始浓度为约1mg/ml且pH为约6.0;其中第二步骤中氧化剂的最终浓度为约400μM,且第五步骤中的条件包含约10分钟的时段、约22℃的温度、不存在光和在搅拌下;其中第三步骤中的过量浓度为约50摩尔浓度过量;其中第三步骤中的条件包含约15分钟的时段、约22℃的温度、不存在光和在搅拌下;其中第四步骤中亲核性催化剂的最终浓度为约10mM,且第四步骤中的条件包含约15分钟的时段、约22℃的温度、不存在光和在搅拌下;其中第五步骤中将治疗性蛋白质与活化的水溶性聚合物和亲核性催化剂一起孵育的条件包含约2小时的时段;约22℃的温度;不存在光;和在搅拌下;且其中第六步骤中的淬灭剂为L-半胱氨酸;且其中L-半胱氨酸添加成使得最终浓度为约10mM且第六步骤中的条件包含约60分钟的时段、约22℃的温度、不存在光和在搅拌下。
在另一实施方案中,提供一种上述方法,其中水溶性聚合物为PSA。在另一实施方案中,PSA由约10-300个唾液酸单元构成。在另一实施方案中,水溶性聚合物为PEG。在另一实施方案中,水溶性聚合物为HES。在又一实施方案中,水溶性聚合物为HAS。
在又一实施方案中,提供一种上述方法,其中治疗性蛋白质为FIX。在另一实施方案中,治疗性蛋白质为FVIIa。在另一实施方案中,治疗性蛋白质为FVIII。
在另一实施方案中,提供一种上述方法,其中氧化剂为过碘酸钠(NaIO4)。
在另一实施方案中,提供一种上述方法,其中治疗性蛋白质的氧化型碳水化合物部分位于凝血蛋白的活化肽中。
在一个实施方案中,提供一种上述方法,其中PSA通过使活化的氨氧基连接子与氧化型PSA反应来制备;其中所述氨氧基连接子选自由以下组成的组:
a)下式的3-氧杂-戊烷-1,5-二氧基胺连接子:
b)下式的3,6,9-三氧杂-十一烷-1,11-二氧基胺连接子:
c)下式的3,6,9,12,15-五氧杂-十七烷-1,17-二氧基胺连接子:
其中PSA通过与氧化剂一起孵育而氧化以在PSA的非还原端形成末端醛基。在一个相关实施方案中,氨氧基连接子为3-氧杂-戊烷-1,5-二氧基胺。
在又一实施方案中,提供一种上述方法,其中氧化剂为NaIO4。
在另一实施方案中,提供一种上述方法,其中亲核性催化剂以介于约1mM与约50mM之间的浓度提供。在一个实施方案中,亲核性催化剂为间甲苯胺。在又一实施方案中,间甲苯胺以约10mM的浓度存在于缀合反应中。
在另一实施方案中,提供一种上述方法,其进一步包括以下步骤:通过在包含选自由以下组成的组的还原化合物的缓冲液中孵育缀合的治疗性蛋白质来还原缀合的治疗性蛋白质中的肟键联:氰基硼氢化钠(NaCNBH3)、抗坏血酸(维生素C)和NaBH3。在一个实施方案中,所述还原化合物为氰基硼氢化钠(NaCNBH3)。
在又一实施方案中,提供一种上述方法,其进一步包括纯化缀合的治疗性蛋白质的步骤。在另一实施方案中,缀合的治疗性蛋白质通过选自由色谱、过滤和沉淀组成的组的方法来纯化。在另一实施方案中,所述色谱选自由以下组成的组:疏水性相互作用色谱(Hydrophobic Interaction Chromatography,HIC)、离子交换色谱(Ion Exchangechromatography,IEC)、尺寸排阻色谱(Size exclusion chromatography,SEC)、亲和色谱和逆相色谱。在又一实施方案中,于色谱加载步骤和色谱洗涤步骤中使用抗离液盐。在另一实施方案中,所述色谱在管柱中进行。在另一实施方案中,管柱包含选自由苯基-琼脂糖FF和丁基-琼脂糖FF组成的组的色谱树脂。在另一实施方案中,所述树脂以介于约5cm与约20cm之间的床高度存在于管柱中。在一个实施方案中,所述床高度为约10cm。
在另一实施方案中,提供一种上述方法,其包括一个或多个洗涤步骤,其中流动方向设定为向上流动且其中流速介于约0.2cm/分钟与约6.7cm/分钟之间。如本文中所使用,术语“向下流动(down-flow)”指自色谱管柱顶部至色谱管柱底部的流动方向(正常流动方向/标准模式)。如本文中所使用,术语“向上流动(up-flow)”指自管柱底部至顶部的流动方向(反向流动方向)。在一个实施方案中,流速为约2cm/分钟。
在另一实施方案中,提供一种上述方法,其包括一个或多个洗脱步骤,其中流动方向设定为向下流动且其中流速介于约0.1cm/分钟与约6.7cm/分钟之间。在一个相关实施方案中,流速为约1cm/分钟。
在又一实施方案中,提供一种上述方法,其包括通过超滤/透滤(UF/DF)浓缩缀合的治疗性蛋白质。在另一实施方案中,治疗性蛋白质的最终浓度介于约0.5mg/ml与约3mg/ml之间。
在另一实施方案中,提供一种上述方法,其中治疗性蛋白质包含约5个至约11个水溶性聚合物部分。在另一实施方案中,治疗性蛋白质包含约1个至约3个水溶性聚合物。
在又一实施方案中,提供一种上述方法,其中缀合的治疗性蛋白质使用色谱纯化;其中于加载步骤和洗涤步骤使用抗离液盐;所述方法包括一个或多个洗涤步骤,其中流动方向设定为向上流动且其中流速介于约0.2cm/分钟与约6.7cm/分钟之间;和一个或多个洗脱步骤,其中流动方向设定为向下流动且其中流速介于约0.2cm/分钟与约6.7cm/分钟之间;所述方法进一步包含通过超滤/透滤(UF/DF)浓缩缀合的治疗性蛋白质。在另一实施方案中,所述色谱为疏水性相互作用色谱(HIC);其中所述一个或多个洗涤步骤流速为约2cm/分钟;且其中所述一个或多个洗脱步骤流速为约1cm/分钟。
在另一实施方案中,提供通过任何上述方法产生的修饰的治疗性蛋白质。
在又一实施方案中,提供一种在治疗性蛋白质上的氧化型碳水化合物部分与含有活性氨氧基的活化的水溶性聚合物之间形成肟键联的方法,其包括以下步骤:a)通过将治疗性蛋白质与选自由以下组成的组的氧化剂一起孵育来氧化所述蛋白质上的碳水化合物部分:过碘酸钠(NaIO4)、四乙酸铅(Pb(OAc)4)和过钌酸钾(KRuO4);和b)在允许在所述治疗性蛋白质的氧化型碳水化合物部分与所述含有活性氨氧基的活化的水溶性聚合物之间形成肟键联的条件下在亲核性催化剂存在下形成所述肟键联;其中所述含有活性氨氧基的水溶性聚合物选自由以下组成的组:聚乙二醇(PEG)、支链PEG、(Warwick EffectPolymers;Coventry,UK)、聚唾液酸(PSA)、淀粉、羟烷基淀粉(HAS)、羟乙基淀粉(HES)、碳水化合物、多糖、普鲁兰、壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、淀粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚环氧烷(PAO)、聚烷二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯酰基吗啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-马来酸酐、聚苯乙烯-共-马来酸酐、聚(1-羟甲基亚乙基羟甲基缩甲醛)(PHF)、2-甲基丙烯酰氧基-2'-乙基三甲基磷酸铵(MPC);其中所述亲核性催化剂选自由以下组成的组:邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸、对氨基苯磺酸、邻氨基苯甲酰胺、邻甲苯胺、间甲苯胺、对甲苯胺、邻茴香胺、间茴香胺和对茴香胺。
在另一实施方案中,提供一种在治疗性蛋白质上的氧化型碳水化合物部分与含有活性氨氧基的活化的水溶性聚合物之间形成肟键联的方法,其包括以下步骤:a)通过将治疗性蛋白质与选自由以下组成的组的氧化剂一起孵育来氧化所述蛋白质上的碳水化合物部分:过碘酸钠(NaIO4)、四乙酸铅(Pb(OAc)4)和过钌酸钾(KRuO4);和b)在允许在所述治疗性蛋白质的氧化型碳水化合物部分与所述含有活性氨氧基的活化的水溶性聚合物之间形成肟键联的条件下在亲核性催化剂存在下形成所述肟键联;其中所述治疗性蛋白质选自由以下组成的组:因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、冯威里氏因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白C、蛋白S、tPA、PAI-1、组织因子(TF)、ADAMTS 13蛋白酶、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-11、集落刺激因子-1(CSF-1)、M-CSF、SCF、GM-CSF、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、EPO、干扰素-α(IFN-α)、复合干扰素、IFN-β、IFN-γ、IFN-ω、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-31、IL-32α、IL-33、血小板生成素(TPO)、Ang-1、Ang-2、Ang-4、Ang-Y、促血管生成素样多肽1(ANGPTL1)、促血管生成素样多肽2(ANGPTL2)、促血管生成素样多肽3(ANGPTL3)、促血管生成素样多肽4(ANGPTL4)、促血管生成素样多肽5(ANGPTL5)、促血管生成素样多肽6(ANGPTL6)、促血管生成素样多肽7(ANGPTL7)、玻连蛋白、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、活化素A、活化素B、活化素C、骨形态发生蛋白-1、骨形态发生蛋白-2、骨形态发生蛋白-3、骨形态发生蛋白-4、骨形态发生蛋白-5、骨形态发生蛋白-6、骨形态发生蛋白-7、骨形态发生蛋白-8、骨形态发生蛋白-9、骨形态发生蛋白-10、骨形态发生蛋白-11、骨形态发生蛋白-12、骨形态发生蛋白-13、骨形态发生蛋白-14、骨形态发生蛋白-15、骨形态发生蛋白受体IA、骨形态发生蛋白受体IB、骨形态发生蛋白受体II、脑源性神经营养因子、心营养素-1、纤毛神经营养因子、纤毛神经营养因子受体、畸胎瘤衍化生长因子、隐秘因子、细胞因子诱导性嗜中性粒细胞趋化因子1、细胞因子诱导性嗜中性粒细胞、趋化因子2α、细胞因子诱导性嗜中性粒细胞趋化因子2β、β内皮细胞生长因子、内皮素1、表皮生长因子、促红血球生成素、表皮调节素、上皮源性嗜中性粒细胞引诱剂、成纤维细胞生长因子4、成纤维细胞生长因子5、成纤维细胞生长因子6、成纤维细胞生长因子7、成纤维细胞生长因子8、成纤维细胞生长因子8b、成纤维细胞生长因子8c、成纤维细胞生长因子9、成纤维细胞生长因子10、成纤维细胞生长因子11、成纤维细胞生长因子12、成纤维细胞生长因子13、成纤维细胞生长因子16、成纤维细胞生长因子17、成纤维细胞生长因子19、成纤维细胞生长因子20、成纤维细胞生长因子21、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、神经胶质细胞系源性神经营养因子受体α1、神经胶质细胞系源性神经营养因子受体α2、生长相关蛋白、生长相关蛋白α、生长相关蛋白β、生长相关蛋白γ、肝素结合表皮生长因子、肝细胞生长因子、肝细胞生长因子受体、肝细胞瘤源性生长因子、胰岛素样生长因子I、胰岛素样生长因子受体、胰岛素样生长因子II、胰岛素样生长因子结合蛋白、角质化细胞生长因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受体α、神经生长因子、神经生长因子受体、神经生成素、神经营养素-3、神经营养素-4、抑瘤素M(OSM)、胎盘生长因子、胎盘生长因子2、血小板源性内皮细胞生长因子、血小板源性生长因子、血小板源性生长因子A链、血小板源性生长因子AA、血小板源性生长因子AB、血小板源性生长因子B链、血小板源性生长因子BB、血小板源性生长因子受体α、血小板源性生长因子受体β、前B细胞生长刺激因子、干细胞因子(SCF)、干细胞因子受体、TNF、TNF0、TNF1、TNF2、转化生长因子α、转化生长因子β、转化生长因子β1、转化生长因子β1.2、转化生长因子β2、转化生长因子β3、转化生长因子β5、潜伏转化生长因子β1、转化生长因子β结合蛋白I、转化生长因子β结合蛋白II、转化生长因子β结合蛋白III、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、肿瘤坏死因子受体I型、肿瘤坏死因子受体II型、尿激酶型纤溶酶原活化因子受体、磷脂酶活化蛋白(PUP)、胰岛素、凝集素蓖麻毒素、泌乳素、绒毛膜促性腺素、卵泡刺激素、甲状腺刺激素、组织纤溶酶原活化因子、IgG、IgE、IgM、IgA和IgD、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、DNA酶、胎球蛋白、黄体生成激素、雌激素、胰岛素、白蛋白、脂蛋白、胎蛋白、转铁蛋白、血小板生成素、尿激酶、整合素、凝血酶、瘦素、修美乐(阿达木单抗)、普罗利亚(地诺单抗)、恩利(依那西普)、来自表1的蛋白或其生物活性片段、衍生物或变体;其中所述含有活性氨氧基的水溶性聚合物选自由以下组成的组:聚乙二醇(PEG)、支链PEG、(Warwick Effect Polymers;Coventry,UK)、聚唾液酸(PSA)、淀粉、羟烷基淀粉(HAS)、羟乙基淀粉(HES)、碳水化合物、多糖、普鲁兰、壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、淀粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚环氧烷(PAO)、聚烷二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯酰基吗啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-马来酸酐、聚苯乙烯-共-马来酸酐、聚(1-羟甲基亚乙基羟甲基缩甲醛)(PHF)、2-甲基丙烯酰氧基-2'-乙基三甲基磷酸铵(MPC);其中所述亲核性催化剂选自由以下组成的组:邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸、对氨基苯磺酸、邻氨基苯甲酰胺、邻甲苯胺、间甲苯胺、对甲苯胺、邻茴香胺、间茴香胺和对茴香胺。
在另一实施方案中,提供一种在治疗性蛋白质上的氧化型碳水化合物部分与含有活性酰肼基的活化的水溶性聚合物之间形成腙键联的方法,其包括以下步骤:a)通过将治疗性蛋白质与选自由以下组成的组的氧化剂一起孵育来氧化所述蛋白质上的碳水化合物部分:过碘酸钠(NaIO4)、四乙酸铅(Pb(OAc)4)和过钌酸钾(KRuO4);和b)在允许在所述治疗性蛋白质的氧化型碳水化合物部分与所述含有活性酰肼基的活化的水溶性聚合物之间形成腙键联的条件下在亲核性催化剂存在下形成所述腙键联;其中所述含有活性酰肼基的水溶性聚合物选自由以下组成的组:聚乙二醇(PEG)、支链PEG、(Warwick EffectPolymers;Coventry,UK)、聚唾液酸(PSA)、淀粉、羟烷基淀粉(HAS)、羟乙基淀粉(HES)、碳水化合物、多糖、普鲁兰、壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、淀粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚环氧烷(PAO)、聚烷二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯酰基吗啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-马来酸酐、聚苯乙烯-共-马来酸酐、聚(1-羟甲基亚乙基羟甲基缩甲醛)(PHF)、2-甲基丙烯酰氧基-2'-乙基三甲基磷酸铵(MPC);其中所述亲核性催化剂选自由以下组成的组:邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸、对氨基苯磺酸、邻氨基苯甲酰胺、邻甲苯胺、间甲苯胺、对甲苯胺、邻茴香胺、间茴香胺和对茴香胺。
在另一实施方案中,提供一种在治疗性蛋白质上的氧化型碳水化合物部分与含有活性酰肼基的活化的水溶性聚合物之间形成腙键联的方法,其包括以下步骤:a)通过将治疗性蛋白质与选自由以下组成的组的氧化剂一起孵育来氧化所述蛋白质上的碳水化合物部分:过碘酸钠(NaIO4)、四乙酸铅(Pb(OAc)4)和过钌酸钾(KRuO4);和b)在允许在所述治疗性蛋白质的氧化型碳水化合物部分与所述含有活性酰肼基的活化的水溶性聚合物之间形成腙键联的条件下在亲核性催化剂存在下形成所述腙键联;其中所述治疗性蛋白质选自由以下组成的组:因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、冯威里氏因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白C、蛋白S、tPA、PAI-1、组织因子(TF)、ADAMTS 13蛋白酶、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-11、集落刺激因子-1(CSF-1)、M-CSF、SCF、GM-CSF、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、EPO、干扰素-α(IFN-α)、复合干扰素、IFN-β、IFN-γ、IFN-ω、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-31、IL-32α、IL-33、血小板生成素(TPO)、Ang-1、Ang-2、Ang-4、Ang-Y、促血管生成素样多肽1(ANGPTL1)、促血管生成素样多肽2(ANGPTL2)、促血管生成素样多肽3(ANGPTL3)、促血管生成素样多肽4(ANGPTL4)、促血管生成素样多肽5(ANGPTL5)、促血管生成素样多肽6(ANGPTL6)、促血管生成素样多肽7(ANGPTL7)、玻连蛋白、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、活化素A、活化素B、活化素C、骨形态发生蛋白-1、骨形态发生蛋白-2、骨形态发生蛋白-3、骨形态发生蛋白-4、骨形态发生蛋白-5、骨形态发生蛋白-6、骨形态发生蛋白-7、骨形态发生蛋白-8、骨形态发生蛋白-9、骨形态发生蛋白-10、骨形态发生蛋白-11、骨形态发生蛋白-12、骨形态发生蛋白-13、骨形态发生蛋白-14、骨形态发生蛋白-15、骨形态发生蛋白受体IA、骨形态发生蛋白受体IB、骨形态发生蛋白受体II、脑源性神经营养因子、心营养素-1、纤毛神经营养因子、纤毛神经营养因子受体、畸胎瘤衍化生长因子、隐秘因子、细胞因子诱导性嗜中性粒细胞趋化因子1、细胞因子诱导性嗜中性粒细胞、趋化因子2α、细胞因子诱导性嗜中性粒细胞趋化因子2β、β内皮细胞生长因子、内皮素1、表皮生长因子、促红血球生成素、表皮调节素、上皮源性嗜中性粒细胞引诱剂、成纤维细胞生长因子4、成纤维细胞生长因子5、成纤维细胞生长因子6、成纤维细胞生长因子7、成纤维细胞生长因子8、成纤维细胞生长因子8b、成纤维细胞生长因子8c、成纤维细胞生长因子9、成纤维细胞生长因子10、成纤维细胞生长因子11、成纤维细胞生长因子12、成纤维细胞生长因子13、成纤维细胞生长因子16、成纤维细胞生长因子17、成纤维细胞生长因子19、成纤维细胞生长因子20、成纤维细胞生长因子21、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、神经胶质细胞系源性神经营养因子受体α1、神经胶质细胞系源性神经营养因子受体α2、生长相关蛋白、生长相关蛋白α、生长相关蛋白β、生长相关蛋白γ、肝素结合表皮生长因子、肝细胞生长因子、肝细胞生长因子受体、肝细胞瘤源性生长因子、胰岛素样生长因子I、胰岛素样生长因子受体、胰岛素样生长因子II、胰岛素样生长因子结合蛋白、角质化细胞生长因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受体α、神经生长因子、神经生长因子受体、神经生成素、神经营养素-3、神经营养素-4、抑瘤素M(OSM)、胎盘生长因子、胎盘生长因子2、血小板源性内皮细胞生长因子、血小板源性生长因子、血小板源性生长因子A链、血小板源性生长因子AA、血小板源性生长因子AB、血小板源性生长因子B链、血小板源性生长因子BB、血小板源性生长因子受体α、血小板源性生长因子受体β、前B细胞生长刺激因子、干细胞因子(SCF)、干细胞因子受体、TNF、TNF0、TNF1、TNF2、转化生长因子α、转化生长因子β、转化生长因子β1、转化生长因子β1.2、转化生长因子β2、转化生长因子β3、转化生长因子β5、潜伏转化生长因子β1、转化生长因子β结合蛋白I、转化生长因子β结合蛋白II、转化生长因子β结合蛋白III、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、肿瘤坏死因子受体I型、肿瘤坏死因子受体II型、尿激酶型纤溶酶原活化因子受体、磷脂酶活化蛋白(PUP)、胰岛素、凝集素蓖麻毒素、泌乳素、绒毛膜促性腺素、卵泡刺激素、甲状腺刺激素、组织纤溶酶原活化因子、IgG、IgE、IgM、IgA和IgD、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、DNA酶、胎球蛋白、黄体生成激素、雌激素、胰岛素、白蛋白、脂蛋白、胎蛋白、转铁蛋白、血小板生成素、尿激酶、整合素、凝血酶、瘦素、修美乐(阿达木单抗)、普罗利亚(地诺单抗)、恩利(依那西普)、来自表1的蛋白或其生物活性片段、衍生物或变体;其中所述含有活性酰肼基的水溶性聚合物选自由以下组成的组:聚乙二醇(PEG)、支链PEG、(Warwick Effect Polymers;Coventry,UK)、聚唾液酸(PSA)、淀粉、羟烷基淀粉(HAS)、羟乙基淀粉(HES)、碳水化合物、多糖、普鲁兰、壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、淀粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚环氧烷(PAO)、聚烷二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯酰基吗啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-马来酸酐、聚苯乙烯-共-马来酸酐、聚(1-羟甲基亚乙基羟甲基缩甲醛)(PHF)、2-甲基丙烯酰氧基-2'-乙基三甲基磷酸铵(MPC);其中所述亲核性催化剂选自由以下组成的组:邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸、对氨基苯磺酸、邻氨基苯甲酰胺、邻甲苯胺、间甲苯胺、对甲苯胺、邻茴香胺、间茴香胺和对茴香胺。
在另一实施方案中,提供一种上述方法,其中含有活性氨氧基的水溶性聚合物通过包含以下的方法来制备:在允许在氧化型水溶性聚合物与活化的氨氧基连接子之间形成稳定肟键联的条件下将包含氧化型水溶性聚合物的溶液与包含活性氨氧基的活化的氨氧基连接子一起孵育,所述条件包含介于约1分钟与约24小时之间的时段;介于约2℃与约37℃之间的温度;在光存在或不存在下;和在搅拌或不搅拌下;从而形成含有活性氨氧基的水溶性聚合物;和b)通过选自由色谱、过滤和沉淀组成的组的方法来纯化所述含有活性氨氧基的水溶性聚合物。在一个实施方案中,术语“活化的水溶性聚合物(activated water-soluble polymer)”指含有醛基的水溶性聚合物。
在另一实施方案中,提供一种上述方法,其中含有活性氨氧基的水溶性聚合物通过包含以下的方法来制备:a)在允许在氧化型水溶性聚合物与活化的氨氧基连接子之间形成稳定肟键联的条件下将包含氧化型水溶性聚合物的溶液与包含活性氨氧基的活化的氨氧基连接子一起孵育,所述条件包含介于约1分钟与约24小时之间的时段;介于约2℃与约37℃之间的温度;在光存在或不存在下;和在搅拌或不搅拌下;从而形成含有活性氨氧基的水溶性聚合物;b)在允许在氧化型水溶性聚合物与活化的氨氧基连接子之间形成稳定烷氧胺键联的条件下将步骤a)的包含含有活性氨氧基的水溶性聚合物的溶液与还原剂一起孵育,所述条件包含介于约1分钟与约24小时之间的时段;介于约2℃与约37℃之间的温度;在光存在或不存在下;和在搅拌或不搅拌下;和c)通过选自由色谱、过滤和沉淀组成的组的方法来纯化含有活性氨氧基的水溶性聚合物。
在又一实施方案中,提供一种上述方法,其中含有活性氨氧基的水溶性聚合物通过包含以下的方法来制备:a)在允许在氧化型水溶性聚合物与活化的氨氧基连接子之间形成稳定肟键联的条件下将包含氧化型水溶性聚合物的溶液与包含活性氨氧基的活化的氨氧基连接子一起孵育,所述条件包含介于约1分钟与约24小时之间的时段;介于约2℃与约37℃之间的温度;在光存在或不存在下;和在搅拌或不搅拌下;从而形成含有活性氨氧基的水溶性聚合物;b)在包含以下的条件下将步骤a)的包含含有活性氨氧基的水溶性聚合物的溶液与亲核性催化剂一起孵育:介于1分钟与24小时之间的时段;介于2℃与37℃之间的温度;在光存在或不存在下;和在搅拌或不搅拌下;和c)通过选自由色谱、过滤和沉淀组成的组的方法来纯化含有活性氨氧基的水溶性聚合物。
在另一实施方案中,提供一种上述方法,其中含有活性氨氧基的水溶性聚合物通过包含以下的方法来制备:a)在允许在氧化型水溶性聚合物与活化的氨氧基连接子之间形成稳定肟键联的条件下将包含氧化型水溶性聚合物的溶液与包含活性氨氧基的活化的氨氧基连接子一起孵育,所述条件包含介于约1分钟与约24小时之间的时段;介于约2℃与约37℃之间的温度;在光存在或不存在下;和在搅拌或不搅拌下;从而形成含有活性氨氧基的水溶性聚合物;b)在包含以下的条件下将步骤a)的包含含有活性氨氧基的水溶性聚合物的溶液与亲核性催化剂一起孵育:介于1分钟与24小时之间的时段;介于2℃与37℃之间的温度;在光存在或不存在下;和在搅拌或不搅拌下;c)在允许在氧化型水溶性聚合物与活化的氨氧基连接子之间形成稳定烷氧胺键联的条件下将步骤b)的包含含有活性氨氧基的水溶性聚合物的溶液与还原剂一起孵育,所述条件包含介于约1分钟与约24小时之间的时段;介于约2℃与约37℃之间的温度;在光存在或不存在下;和在搅拌或不搅拌下;和d)通过选自由色谱、过滤和沉淀组成的组的方法来纯化含有活性氨氧基的水溶性聚合物。
在另一实施方案中,提供一种上述方法,其中氧化型水溶性聚合物选自由以下组成的组:聚乙二醇(PEG)、支链PEG、(Warwick EffectPolymers;Coventry,UK)、聚唾液酸(PSA)、淀粉、羟烷基淀粉(HAS)、羟乙基淀粉(HES)、碳水化合物、多糖、普鲁兰、壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、淀粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚环氧烷(PAO)、聚烷二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯酰基吗啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-马来酸酐、聚苯乙烯-共-马来酸酐、聚(1-羟甲基亚乙基羟甲基缩甲醛)(PHF)、2-甲基丙烯酰氧基-2'-乙基三甲基磷酸铵(MPC),且其中所述水溶性聚合物通过与氧化剂一起孵育而氧化以在所述水溶性聚合物的非还原端形成末端醛基。在一个实施方案中,水溶性聚合物为PSA。
在另一实施方案中,提供一种上述方法,其中氧化剂为NaIO4。
在又一实施方案中,提供一种上述方法,其中氨氧基连接子选自由以下组成的组:
a)下式的3-氧杂-戊烷-1,5-二氧基胺连接子:
b)下式的3,6,9-三氧杂-十一烷-1,11-二氧基胺连接子:
c)下式的3,6,9,12,15-五氧杂-十七烷-1,17-二氧基胺连接子:
在另一实施方案中,提供一种上述方法,其中还原剂选自由以下组成的组:氰基硼氢化钠(NaCNBH3)、抗坏血酸(维生素C)和NaBH3。在一个实施方案中,还原剂为氰基硼氢化钠(NaCNBH3)。
在另一实施方案中,提供一种上述方法,其中亲核性催化剂选自由以下组成的组:邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸、对氨基苯磺酸、邻氨基苯甲酰胺、邻甲苯胺、间甲苯胺、对甲苯胺、邻茴香胺、间茴香胺和对茴香胺。在一个实施方案中,亲核性催化剂为间甲苯胺。在另一实施方案中,亲核性催化剂以使得亲核性催化剂的最终浓度介于约1.0mM与约50mM之间的量添加。
在另一实施方案中,提供一种上述方法,其进一步包括通过超滤/透滤(UF/DF)浓缩缀合的治疗性蛋白质。
附图
图1示出凝血因子IX(SEQ ID NO:1)的一级结构。
图2示出氧化型rFIX与氨氧基-PSA的偶合。
图3示出水溶性二氨氧基连接子3-氧杂-戊烷-1,5-二氧基胺和3,6,9-三氧杂-十一烷-1,11-二氧基胺的合成。
图4示出氨氧基-PSA的制备。
图5示出通过SDS PAGE观测在不同催化剂存在下制备的PSA-FIX缀合物。a)使用不同浓度比较苯胺与间甲苯胺;b)比较苯胺与邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸、对氨基苯甲酰胺和对氨基苯磺酸;c)比较苯胺和间甲苯胺与邻茴香胺和间茴香胺。
图6示出使用各种亲核性催化剂达成的聚唾液酸化的百分比。
发明详述
治疗性蛋白质的药理学和免疫学性质可通过化学修饰和与诸如以下等聚合化合物缀合来改进:聚乙二醇(PEG)、支链PEG、聚唾液酸(PSA)、羟烷基淀粉(HAS)、羟乙基淀粉(HES)、碳水化合物、多糖、普鲁兰、壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、淀粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚环氧烷(PAO)、聚烷二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯酰基吗啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-马来酸酐、聚苯乙烯-共-马来酸酐、聚(1-羟甲基亚乙基羟甲基缩甲醛)(PHF)、2-甲基丙烯酰氧基-2'-乙基三甲基磷酸铵(MPC)。所得缀合物的性质一般高度取决于聚合物的结构和大小。因此,具有规定的狭窄大小分布的聚合物通常在所属领域中为优选的。如PEG等合成聚合物可容易地制造成具有狭窄的大小分布,而PSA可以产生具有狭窄的大小分布的最终PSA制剂的方式纯化。另外,具有规定聚合物链和狭窄的大小分布的聚乙二醇化试剂可在市场上以合理价格商购获得。
添加可溶性聚合物(诸如经由聚唾液酸化)为一种改进治疗性蛋白质的性质的方法,所述治疗性蛋白质诸如凝血蛋白FIX以及其它凝血蛋白(例如VWF、FVIIa(参见例如US2008/0221032A1,所述文献以引用的方式并入本文)和FVIII)。
治疗性蛋白质
在本发明的某些实施方案中,上述多肽和多核苷酸以如下治疗性蛋白质例示:酶、抗原、抗体、受体、凝血蛋白、生长因子、激素和配体。在某些实施方案中,治疗性蛋白质为凝血蛋白,诸如因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、冯威里氏因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白C、蛋白S、tPA、PAI-1、组织因子(TF)或ADAMTS 13蛋白酶。在一个实施方案中,本发明的治疗性蛋白质为糖蛋白,或在各种实施方案中为未在活体内天然糖基化的蛋白质(即不含天然糖基化位点的蛋白质或在纯化之前未在宿主细胞中糖基化的蛋白质)。
在某些实施方案中,治疗性蛋白质为免疫球蛋白、细胞因子(诸如IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-11)、集落刺激因子-1(CSF-1)、M-CSF、SCF、GM-CSF、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、EPO、干扰素-α(IFN-α)、复合干扰素、IFN-β、IFN-γ、IFN-ω、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-31、IL-32α、IL-33、血小板生成素(TPO)、促血管生成素(例如Ang-1、Ang-2、Ang-4、Ang-Y)、人促血管生成素样多肽ANGPTL1至7、玻连蛋白、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、活化素A、活化素B、活化素C、骨形态发生蛋白-1、骨形态发生蛋白-2、骨形态发生蛋白-3、骨形态发生蛋白-4、骨形态发生蛋白-5、骨形态发生蛋白-6、骨形态发生蛋白-7、骨形态发生蛋白-8、骨形态发生蛋白-9、骨形态发生蛋白-10、骨形态发生蛋白-11、骨形态发生蛋白-12、骨形态发生蛋白-13、骨形态发生蛋白-14、骨形态发生蛋白-15、骨形态发生蛋白受体IA、骨形态发生蛋白受体IB、骨形态发生蛋白受体II、脑源性神经营养因子、心营养素-1、纤毛神经营养因子、纤毛神经营养因子受体、畸胎瘤衍化生长因子、隐秘因子、细胞因子诱导性嗜中性粒细胞趋化因子1、细胞因子诱导性嗜中性粒细胞、趋化因子2α、细胞因子诱导性嗜中性粒细胞趋化因子2β、β内皮细胞生长因子、内皮素1、表皮生长因子、促红血球生成素、表皮调节素、上皮源性嗜中性粒细胞引诱剂、成纤维细胞生长因子4、成纤维细胞生长因子5、成纤维细胞生长因子6、成纤维细胞生长因子7、成纤维细胞生长因子8、成纤维细胞生长因子8b、成纤维细胞生长因子8c、成纤维细胞生长因子9、成纤维细胞生长因子10、成纤维细胞生长因子11、成纤维细胞生长因子12、成纤维细胞生长因子13、成纤维细胞生长因子16、成纤维细胞生长因子17、成纤维细胞生长因子19、成纤维细胞生长因子20、成纤维细胞生长因子21、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、神经胶质细胞系源性神经营养因子受体α1、神经胶质细胞系源性神经营养因子受体α2、生长相关蛋白、生长相关蛋白α、生长相关蛋白β、生长相关蛋白γ、肝素结合表皮生长因子、肝细胞生长因子、肝细胞生长因子受体、肝细胞瘤源性生长因子、胰岛素样生长因子I、胰岛素样生长因子受体、胰岛素样生长因子II、胰岛素样生长因子结合蛋白、角质化细胞生长因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受体α、神经生长因子、神经生长因子受体、神经生成素、神经营养素-3、神经营养素-4、抑瘤素M(OSM)、胎盘生长因子、胎盘生长因子2、血小板源性内皮细胞生长因子、血小板源性生长因子、血小板源性生长因子A链、血小板源性生长因子AA、血小板源性生长因子AB、血小板源性生长因子B链、血小板源性生长因子BB、血小板源性生长因子受体α、血小板源性生长因子受体β、前B细胞生长刺激因子、干细胞因子(SCF)、干细胞因子受体、TNF(包括TNF0、TNF1、TNF2)、转化生长因子α、转化生长因子β、转化生长因子β1、转化生长因子β1.2、转化生长因子β2、转化生长因子β3、转化生长因子β5、潜伏转化生长因子β1、转化生长因子β结合蛋白I、转化生长因子β结合蛋白II、转化生长因子β结合蛋白III、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、肿瘤坏死因子受体I型、肿瘤坏死因子受体II型、尿激酶型纤溶酶原活化因子受体、血管内皮生长因子和其嵌合蛋白和生物或免疫活性片段。
在某些实施方案中,治疗性蛋白质为α-干扰素、β-干扰素和γ-干扰素、集落刺激因子(包括粒细胞集落刺激因子)、成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子、磷脂酶活化蛋白(PUP)、胰岛素、植物蛋白质(诸如凝集素和蓖麻毒素)、肿瘤坏死因子和相关等位基因、可溶形式的肿瘤坏死因子受体、白介素受体和可溶形式的白介素受体、生长因子(诸如组织生长因子,诸如TGFα或TGFβ和表皮生长因子)、激素、促生长因子、色素激素、下视丘释放因子、抗利尿素、泌乳素、绒毛膜促性腺素、卵泡刺激素、甲状腺刺激素、组织纤溶酶原活化因子和免疫球蛋白(诸如IgG、IgE、IgM、IgA和IgD)、半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、DNA酶、胎球蛋白、黄体生成激素、雌激素、皮质类固醇、胰岛素、白蛋白、脂蛋白、胎蛋白、转铁蛋白、血小板生成素、尿激酶、DNA酶、整合素、凝血酶、造血生长因子、瘦素、糖苷酶、修美乐(阿达木单抗)、普罗利亚(地诺单抗)、恩利(依那西普)和其片段,或包含任何以上所述的蛋白质或其片段的任何融合蛋白。除上述蛋白质外,下表1还提供本发明所涵盖的治疗性蛋白质:
本文所提供的治疗性蛋白质不应视为排他性的。相反,如自本文所提供的公开内容显而易见,本发明的方法适用于根据本发明希望连接水溶性聚合物的任何蛋白质。举例来说,治疗性蛋白质描述于US2007/0026485中,所述文献以全文引用的方式并入本文。
凝血蛋白
在一个方面,本发明的起始材料为凝血蛋白,其可来源于人血浆,或通过重组工程改造技术产生,如专利美国专利号4,757,006、美国专利号5,733,873、美国专利号5,198,349、美国专利号5,250,421、美国专利号5,919,766和EP 306 968中所述。
诸如包括以下的凝血蛋白等治疗性多肽由蛋白水解酶快速降解且被抗体中和:因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、冯威里氏因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白C、蛋白S、tPA、PAI-1、组织因子(TF)和ADAMTS 13蛋白酶。此缩短其半衰期和循环时间,由此限制其疗效。相对较高的剂量和频繁施用为达到和维持这些凝血蛋白的期望的治疗性或预防性作用所必需的。因此,难以进行适当剂量调节且需要频繁静脉内施用使患者的生活方式受到限制。
如本文所述,本发明涵盖包括(但不限于)以下的凝血蛋白:因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、冯威里氏因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白C、蛋白S、tPA、PAI-1、组织因子(TF)和ADAMTS 13蛋白酶。如本文中所使用,术语“凝血蛋白(blood coagulation protein)”指任何因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、冯威里氏因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白C、蛋白S、tPA、PAI-1、组织因子(TF)和ADAMTS 13蛋白酶,其展现与特定天然凝血蛋白相关的生物活性。
凝血级联反应分成三个不同区段:内在、外在和共同路径(Schenone等,Curr OpinHematol.2004;11:272-7)。级联反应涉及一系列丝氨酸蛋白酶(酶原)和蛋白质辅因子。需要时,无活性酶原前体转化为活性形式,从而转化级联反应中的下一种酶。
内在路径需要凝血因子VIII、IX、X、XI和XII。当前激肽释放素(prekallikrein)、高分子量激肽原(kininogen)、因子XI(FXI)和因子XII(FXII)暴露于带负电表面时,起始内在路径。还需要自血小板分泌的钙离子和磷脂。
当血管的血管腔受损时,起始外在路径。膜糖蛋白组织因子暴露,接着结合于循环因子VII(FVII)和原有的少量其活化形式FVIIa。此结合有助于使FVII完全转化为FVIIa,且随后在钙和磷脂存在下使因子IX(FIX)转化为因子IXa(FIXa)和使因子X(FX)转化为因子Xa(FXa)。FVIIa与组织因子缔合可通过使FVII与底物(FIX和FX)的结合位点更接近和通过诱导构形变化并因此增强FVIIa的酶活性来增强蛋白水解活性。
FX的活化为两种路径的共同点。在磷脂和钙下存在,因子Va(FVa)和Xa使凝血酶原转化为凝血酶(凝血酶原酶复合物),随后裂解血纤维蛋白原以形成血纤维蛋白单体。所述单体聚合形成血纤维蛋白股束。因子XIIIa(FXIIIa)使这些股束彼此共价键结形成刚性筛网。
FVII转化为FVIIa还由许多蛋白酶催化,所述蛋白酶包括凝血酶、FIXa、FXa、因子XIa(FXIa)和因子XIIa(FXIIa)。对于抑制早期级联反应,组织因子路径抑制剂以FVIIa/组织因子/FXa产物复合物为目标。
因子VIIa
FVII(也称为稳定因子或前转化素)为维生素K依赖性丝氨酸蛋白酶糖蛋白,其在止血和凝血中具有关键作用(Eigenbrot,Curr Protein Pept Sci.2002;3:287-99)。
FVII在肝脏中合成且以48kD单链糖蛋白形式分泌。FVII与所有维生素K依赖性丝氨酸蛋白酶糖蛋白共享类似蛋白质结构域结构,其由以下组成:具有9-12个残基的氨基端γ-羧基谷氨酸(Gla)结构域,负责蛋白质与脂膜的相互作用;羧基端丝氨酸蛋白酶结构域(催化结构域);和两个表皮生长因子样结构域,其含有介导与组织因子的相互作用的钙离子结合位点。γ-谷氨酰基羧化酶催化分子氨基端部分中的Gla残基的羧化。羧化酶的作用依赖于维生素K的还原形式,其氧化为环氧化物形式。需要维生素K环氧化物还原酶使维生素K的环氧化物形式转化回还原形式。
大部分FVII在血浆中以酶原形式循环,且此形式的活化导致精氨酸152与异亮氨酸153之间的肽键裂解。所得活化的FVIIa由经由单个二硫键(Cys 135至Cys 262)连接的NH2衍生化轻链(20kD)和COOH端衍生化重链(30kD)组成。轻链含有膜结合Gla结构域,而重链含有催化结构域。
通过遗传学和环境因素测定的FVII的血浆浓度为约0.5mg/mL(Pinotti等,Blood.2000;95:3423-8)。不同FVII基因型会导致平均FVII含量相差若干倍。血浆FVII含量在健康女性怀孕期间升高且还随年龄而增加,并在女性和患有高三酸甘油酯血症的人中较高。在所有促凝血因子中,FVII具有最短半衰期(3-6小时)。FVIIa的平均血浆浓度在健康个体中为3.6ng/mL且FVIIa的循环半衰期与其它凝血因子相比相对较长(2.5小时)。
遗传性FVII缺乏为罕见常染色体隐性出血病症,其发病率估计为在一般人群中每500,000个人中有1例(Acharya等,J Thromb Haemost.2004;2248-56)。由抑制剂引起的后天性FVII缺乏也极其罕见。还已报导具有与诸如头孢菌素(cephalosporin)、青霉素(penicillin)和口服抗凝剂等药物有关发生的缺乏的病例。此外,已报导后天性FVII缺乏自发地发生或在诸如骨髓瘤、败血症、再生不良性贫血、使用白介素-2和抗胸腺细胞球蛋白疗法等其它条件下发生。
参考多核苷酸和多肽序列包括例如基因组序列的GenBank保藏编号J02933、cDNA的M13232(Hagen等PNAS 1986;83:2412-6)和多肽序列的P08709(参考文献以全文引用的方式并入本文)。已描述FVII的多种多态现象,例如参见Sabater-Lleal等(Hum Genet.2006;118:741-51)(参考文献以全文引用的方式并入本文)。
因子IX
FIX为维生素K依赖性血浆蛋白,其通过在钙离子、磷脂和FVIIIa存在下使FX转化为其活性形式而参与凝血的内在路径。FIX的主要催化能力是作为对于FX中的特定精氨酸-异亮氨酸键具有特异性的丝氨酸蛋白酶。FXIa活化FIX,使得自FIX切除活化肽以产生包含由一个或多个二硫键保持的两条链的活化FIX分子。FIX缺乏为B型隐性X连锁血友病的病因。
A型和B型血友病为遗传性疾病,其特征分别为FVIII和FIX多肽缺乏。缺乏的潜在原因常常为FVIII和FIX基因突变的结果,两个基因皆位于X染色体上。用于血友病的传统疗法通常涉及静脉内施用来自正常个体的混合血浆或半纯化凝血蛋白。这些制剂可能受病原体或病毒污染,诸如感染性朊病毒、HIV、细小病毒、A型肝炎和C型肝炎。因此,急需不需要使用人血清的治疗剂。
FIX活性的降低程度与B型血友病的严重程度成正比。B型血友病的当前治疗由用血浆源性或重组FIX替代损失的蛋白质(所谓FIX取代或替代治疗或疗法)组成。
FIX的多核苷酸和多肽序列可例如见于UniProtKB/Swiss-Prot保藏编号P00740、美国专利号6,531,298和图1(SEQ ID NO:1)中。
因子VIII
凝血因子VIII(FVIII)在血浆中以极低浓度循环且非共价结合于冯威里氏因子(VWF)。在止血期间,FVIII与VWF分离且通过在钙和磷脂或细胞膜存在下增强活化速率而充当活化因子IX(FIXa)介导性FX活化的辅因子。
FVIII合成为约270-330kD的单链前体,其具有结构域结构A1-A2-B-A3-C1-C2。当自血浆纯化(例如“血浆源性”或“血浆的”)时,FVIII由重链(A1-A2-B)和轻链(A3-C1-C2)构成。轻链的分子质量为80kD,而由于B结构域中的蛋白水解,重链在90-220kD的范围内。
FVIII还合成为重组蛋白质以用于出血病症的治疗性使用。已设计各种活体外测定来测定重组FVIII(rFVIII)作为治疗性药物的潜在功效。这些测定模拟内源性FVIII的活体内作用。FVIII的活体外凝血酶治疗导致其促凝血活性快速增加和随后降低,如通过活体外测定所测量。此活化和失活与重链和轻链中的特定限制性蛋白水解一致,其改变FVIII中的不同结合表位的可用性,例如使得FVIII自VWF解离且结合于磷脂表面或改变与某些单克隆抗体的结合能力。
FVIII的缺乏或功能异常与最常发生的出血病症A型血友病相关。选用于控制A型血友病的治疗为使用血浆源性或rFVIII浓缩物的替代疗法。FVIII水平低于1%的重度A型血友病患者一般使用预防性疗法以使在各次给药之间保持FVIII高于1%。考虑各种FVIII产物在循环过程中的平均半衰期,此结果通常可通过一周两至三次给与FVIII来达成。
参考多核苷酸和多肽序列包括例如UniProtKB/Swiss-Prot P00451(FA8_HUMAN);Gitschier J等,Characterization of the human Factor VIII gene,Nature,312(5992):326-30(1984);Vehar GH等,Structure of human Factor VIII,Nature,312(5992):337-42(1984);Thompson AR.Structure and Function of the Factor VIIIgene and protein,Semin Thromb Hemost,2003:29;11-29(2002)。
冯威里氏因子
冯威里氏因子(VWF)为在血浆中以一系列多聚体形式循环的糖蛋白,其大小范围为约500kD至20,000kD。多聚体形式的VWF由以二硫键连接在一起的250kD多肽亚基构成。VWF介导初始血小板粘着于受损血管壁的内皮下膜。仅较大多聚体展现止血活性。假设内皮细胞分泌大聚合物形式的VWF且具有低分子量的那些形式的VWF(低分子量VWF)由蛋白水解裂解而产生。具有大分子质量的多聚体储存于内皮细胞的威贝尔-帕拉地小体(Weibel-Pallade body)中且在刺激后释放。
VWF由内皮细胞和巨核细胞合成为前原VWF,所述前原VWF基本上由重复结构域组成。裂解信号肽后,原VWF在其C端区经由二硫键二聚合。二聚体用作多聚化的原聚体,多聚化受制于游离端末端之间的二硫键。组装成多聚体后蛋白水解移除原肽序列(Leyte等,Biochem.J.274(1991),257-261)。
自VWF的克隆cDNA预测的主要翻译产物为2813个残基的前体多肽(前原VWF)。前原VWF由22个氨基酸的信号肽和741个氨基酸的原肽组成,成熟VWF包含2050个氨基酸(Ruggeri Z.A.和Ware,J.,FASEB J.,308-316(1993))。
VWF缺乏导致冯威里氏病(Von Willebrand disease,VWD),其特征为不同程度的显著出血表型。3型VWD为最严重形式,其中VWF完全损失,且1型VWD与VWF的定量损失有关且其表型可为极轻的。2型VWD与VWF的定性缺乏有关且可如3型VWD般严重。2型VWD具有许多亚型,一些亚型与高分子量多聚体的损失或减少相关。2a型冯威里氏病(VWD-2A)的特征为损失中间与大型多聚体。VWD-2B的特征为损失最高分子量多聚体。其它与VWF有关的疾病和病症为所属领域中所已知。
前原VWF的多核苷酸和氨基酸序列可分别以GenBank保藏编号NM_000552和NP_000543获得。
本发明的其它凝血蛋白描述于所属领域中,例如Mann KG,Thromb Haemost,1999;82:165-74。
A.多肽
在一个方面,本发明的起始材料为蛋白质或多肽。如本文所述,术语治疗性蛋白质(therapeutic protein)指展现与治疗性蛋白质相关的生物活性的任何治疗性蛋白质分子。在本发明的一个实施方案中,治疗性蛋白质分子为全长蛋白质。
所涵盖的治疗性蛋白质分子包括全长蛋白质、全长蛋白质的前体、全长蛋白质的生物活性亚基或片段,以及任何这些形式的治疗性蛋白质的生物活性衍生物和变体。因此,治疗性蛋白质包括如下蛋白质:(1)在至少约25个、约50个、约100个、约200个、约300个、约400个或更多个氨基酸的区域中,具有与由本文所述的参考核酸或氨基酸序列编码的多肽具有大于约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%或更大氨基酸序列一致性的氨基酸序列;和/或(2)特异性结合于针对包含如本文所述的参考氨基酸序列的免疫原、其免疫原性片段和/或其保守修饰的变体产生的抗体,例如多克隆或单克隆抗体。
根据本发明,术语“重组治疗性蛋白质(recombinant therapeutic protein)”包括经由重组DNA技术获得的任何治疗性蛋白质。在某些实施方案中,所述术语涵盖如本文所述的蛋白质。
如本文中所使用,“内源性治疗性蛋白质”包括来源于意欲接受治疗的哺乳动物的治疗性蛋白质。所述术语还包括自所述哺乳动物中存在的转基因或任何其它外来DNA转录的治疗性蛋白质。如本文中所使用,“外源性治疗性蛋白质”包括并非来源于意欲接受治疗的哺乳动物的凝血蛋白。
如本文中所使用,“血浆源性凝血蛋白(plasma-derived blood coagulationprotein)”或“血浆的(plasmatic)”包括自哺乳动物获得的血液中可见的具有参与凝血路径的性质的所有形式的蛋白质。
如本文中所使用,“生物活性衍生物(biologically active derivative)”或“生物活性变体(biologically active variant)”包括分子的任何衍生物或变体,其具有所述分子的大致上相同的功能和/或生物性质(诸如结合性质)和/或相同结构基础(诸如肽主链或基础聚合单元)。
诸如“变体(variant)”或“衍生物(derivative)”等“类似物(analog)”为与天然存在的分子在结构上大致上类似且具有相同生物活性(尽管在某些情况下程度不同)的化合物。举例来说,多肽变体指与参考多肽共享大致上类似的结构且具有相同生物活性的多肽。基于涉及以下的一种或多种突变,与类似物所来源的天然存在的多肽相比,变体或类似物在其氨基酸序列的组成方面不同:(i)在多肽的一个或多个末端和/或天然存在的多肽序列的一个或多个内部区域(例如片段)缺失一个或多个氨基酸残基;(ii)在多肽的一个或多个末端(通常为“添加”或“融合”)和/或天然存在的多肽序列的一个或多个内部区域(通常为“插入”)插入或添加一个或多个氨基酸;或(iii)一个或多个氨基酸取代天然存在的多肽序列中的其它氨基酸。举例来说,“衍生物”为一种类型的类似物且指与已例如以化学方法修饰的参考多肽共享相同或大致上类似的结构的多肽。
变异多肽为一种类型的类似物多肽且包括插入变体,其中一个或多个氨基酸残基添加至本发明的治疗性蛋白质氨基酸序列中。插入可位于蛋白质的任一个或两个末端,和/或可位于治疗性蛋白质氨基酸序列的内部区域中。任一个或两个末端具有其它残基的插入变体包括例如融合蛋白和包括氨基酸标签或其它氨基酸标记的蛋白质。在一个方面,凝血蛋白分子任选地含有N端Met,尤其当分子在诸如大肠杆菌的等细菌细胞中重组表达时。
在缺失变体中,如本文所述的治疗性蛋白质多肽中的一个或多个氨基酸残基被移除。缺失可在治疗性蛋白质多肽的一个或两个末端实现,和/或通过移除治疗性蛋白质氨基酸序列中的一个或多个残基实现。因此,缺失变体包括治疗性蛋白质多肽序列的片段。
在取代变体中,移除治疗性蛋白质多肽的一个或多个氨基酸残基且置换为替代性残基。在一个方面,取代在性质上为保守性的且此类型的保守性取代为所属领域中所熟知。或者,本发明涵盖还为非保守性的取代。示例性保守性取代描述于Lehninger,[Biochemistry,第2版;Worth Publishers公司,New York(1975),第71-77页]中且接着陈述如下。
保守性取代
或者,示例性保守性取代接着陈述如下。
保守性取代II
B.多核苷酸
编码本发明的治疗性蛋白质的核酸包括例如(但不限于)基因、前mRNA、mRNA、cDNA、多态变体、等位基因、合成和天然存在的突变体。
编码本发明的治疗性蛋白质的多核苷酸还包括(但不限于)以下多核苷酸:(1)在严谨杂交条件下与编码如本文所述的参考氨基酸序列的核酸和其保守修饰的变体特异性杂交;(2)在至少约25个、约50个、约100个、约150个、约200个、约250个、约500个、约1000个或更多个核苷酸(至多成熟蛋白质的1218个核苷酸的全长序列)的区域中,具有与如本文所述的参考核酸序列具有大于约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或更高核苷酸序列一致性的核酸序列。示例性“严谨杂交”条件包括在42℃下在50%甲酰胺、5XSSC、20mM Na·PO4(pH 6.8)中杂交;和在55℃下用1XSSC洗涤30分钟。应了解,在这些示例性条件下可基于待杂交的序列的长度和GC核苷酸含量来进行变化。所属领域中的标准配方适于确定适当杂交条件。参见Sambrook等,Molecular Cloning:ALaboratory Manual(第2版,Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989)§§9.47-9.51。
“天然存在”的多核苷酸或多肽序列通常来源于哺乳动物,包括(但不限于)灵长类动物,例如人;啮齿动物,例如大鼠、小鼠、仓鼠;母牛、猪、马、绵羊或任何哺乳动物。本发明的核酸和蛋白质可为重组分子(例如异源的且编码野生型序列或其变体,或非天然存在的)。
C.治疗性蛋白质的产生
治疗性蛋白质的产生包括所属领域中已知用于以下的任何方法:(i)通过基因工程改造产生重组DNA;(ii)通过例如(但不限于)转染、电穿孔或显微注射将重组DNA引入原核或真核细胞中;(iii)培养所述转化细胞;(iv)表达治疗性蛋白质,例如组成性或诱导后表达;和(v)分离所述凝血蛋白,例如自培养基或通过收集转化细胞进行分离以获得纯化的治疗性蛋白质。
在其它方面,通过在特征为产生药理学上可接受的凝血蛋白分子的适合原核或真核生物宿主系统中表达来产生治疗性蛋白质。真核细胞的实例为哺乳动物细胞,诸如CHO、COS、HEK 293、BHK、SK-Hep和HepG2。
多种载体可用于制备治疗性蛋白质且选自真核和原核表达载体。用于原核表达的载体的实例包括质粒,诸如(但不限于)pRSET、pET和pBAD,其中原核表达载体中所用的启动子包括以下一者或多者(但不限于):lac、trc、trp、recA或araBAD。用于真核表达的载体的实例包括:(i)针对在酵母中表达,载体诸如(但不限于)pAO、pPIC、pYES或pMET,其使用诸如(但不限于)AOX1、GAP、GAL1或AUG1等启动子;(ii)针对在昆虫细胞中表达,载体诸如(但不限于)pMT、pAc5、pIB、pMIB或pBAC,其使用诸如(但不限于)PH、p10、MT、Ac5、OpIE2、gp64或polh等启动子;和(iii)针对在哺乳动物细胞中表达,载体诸如(但不限于)pSVL、pCMV、pRc/RSV、pcDNA3或pBPV,且在一个方面,载体来源于病毒系统,诸如(但不限于)痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或反转录病毒,所述载体使用诸如(但不限于)CMV、SV40、EF-1、UbC、RSV、ADV、BPV和β-肌动蛋白等启动子。
D.施用
在一个实施方案中,本发明的缀合的治疗性蛋白质可通过注射,诸如静脉内、肌肉内或腹膜内注射来施用。
在一个方面,为向人或测试动物施用包含本发明的缀合的治疗性蛋白质的组合物,组合物包含一种或多种药学上可接受的载剂。术语“药学上(pharmaceutically)”或“药理学上可接受(pharmacologically acceptable)”指分子实体和组合物为稳定的,抑制蛋白质降解(诸如聚集和裂解产物)且另外当使用如下文所述所属领域中熟知的途径施用时不产生过敏性或其它不良反应。“药学上可接受的载剂”包括任何和所有临床适用溶剂、分散介质、涂料、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂和其类似物,包括上文所公开的那些药剂。
如本文中所使用,“有效量(effective amount)”包括适合于治疗疾病或病症或改善疾病或病症的症状的剂量。在一个实施方案中,“有效量”包括适合于治疗患有如本文所述的出血病症的哺乳动物的剂量。
组合物可口服、局部、经皮、肠胃外、通过吸入喷雾、阴道、直肠或通过颅内注射来施用。如本文中所使用,术语肠胃外(parenteral)包括皮下注射、静脉内、肌肉内、脑池内注射或输注技术。还涵盖通过在特定部位静脉内、皮内、肌肉内、乳房内、腹膜内、鞘内、眼球后、肺内注射和/或手术植入来施用。一般来说,组合物基本上不含热原质,以及可能对接受者有害的其它杂质。
单次或多次施用组合物可以治疗医师所选的剂量和模式进行。对于预防或治疗疾病,适当剂量将取决于如上文所述的待治疗的疾病类型、疾病的严重程度和病程、是出于预防性目的还是治疗性目的施用药物、先前疗法、患者的临床病史和对药物的反应和主治医师的判断。
本发明还涉及一种包含有效量的如本文所定义的缀合的治疗性蛋白质的药用组合物。药用组合物可进一步包含药学上可接受的载剂、稀释剂、盐、缓冲液或赋形剂。药用组合物可用于治疗以上所定义的出血病症。本发明的药用组合物可为溶液或冻干产品。药用组合物的溶液可经受任何适合的冻干过程。
作为另一方面,本发明包括试剂盒,其包含以有助于使用其施用至个体的方式包装的本发明组合物。在一个实施方案中,所述试剂盒包括本文所述的化合物或组合物(例如包含缀合的治疗性蛋白质的组合物),其包装于诸如密封瓶子或容器等容器中,贴附于所述容器上或包括于所述包装中的标签描述化合物或组合物于实施方法时的使用。在一个实施方案中,试剂盒含有具有包含缀合的治疗性蛋白质的组合物的第一容器和具有用于所述第一容器中的组合物的生理学上可接受的复原溶液的第二容器。在一个方面,化合物或组合物以单位剂型包装。试剂盒可进一步包括适合于根据特定施用途径施用组合物的装置。优选地,试剂盒含有描述治疗性蛋白质或肽组合物的使用的标签。
水溶性聚合物
在一个方面,所提供的治疗性蛋白质衍生物(即缀合的治疗性蛋白质)分子结合于水溶性聚合物,包括(但不限于)聚乙二醇(PEG)、支链PEG、聚唾液酸(PSA)、羟烷基淀粉(HAS)、羟乙基淀粉(HES)、碳水化合物、多糖、普鲁兰、壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、淀粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚环氧烷(PAO)、聚烷二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯酰基吗啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-马来酸酐、聚苯乙烯-共-马来酸酐、聚(1-羟甲基亚乙基羟甲基缩甲醛)(PHF)、2-甲基丙烯酰氧基-2'-乙基三甲基磷酸铵(MPC)。在本发明的一个实施方案中,水溶性聚合物由具有以下分子量范围的唾液酸分子组成:350至120,000Da、500至100,000Da、1000至80,000Da、1500至60,000Da、2,000至45,000Da、3,000至35,000Da和5,000至25,000Da。水溶性聚合物的偶合可通过直接或经由连接分子与蛋白质偶合来进行。化学连接子的一个实例为含有碳水化合物选择性酰肼和氢硫基反应性马来酰亚胺基的MBPH(4-[4-N-马来酰亚胺基苯基]丁酸肼)(Chamow等,J Biol Chem 1992;267:15916-22)。下文描述其它示例性和优选连接子。
在一个实施方案中,衍生物保留天然治疗性蛋白质产物的完整功能活性,且与天然治疗性蛋白质产物相比,提供延长的活体内半衰期。在另一实施方案中,相对于天然凝血蛋白,衍生物保留至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140或150百分比(%)生物活性。在一个相关方面,通过产色活性与凝血因子抗原值的比率(凝血因子:Chr:凝血因子:Ag)来测定衍生物和天然凝血蛋白的生物活性。在本发明的又一实施方案中,相对于天然治疗性蛋白质的活体内半衰期,构建体的半衰期缩短或延长0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。
A.唾液酸和PSA
PSA由N-乙酰神经胺糖酸的聚合物(一般为均聚物)组成。仲氨基通常带有乙酰基,但其可改为带有乙醇酰基。羟基上的可能取代基包括乙酰基、乳酰基、乙基、硫酸酯基和磷酸酯基。
N-乙酰神经胺糖酸Neu5Ac
唾液酸(N-乙酰神经胺糖酸)的结构
PSA和mPSA一般包含基本上由以2,8-糖苷键联或2,9-糖苷键联或这些糖苷键联的组合(例如交替2,8-键联和2,9-键联)连接的N-乙酰神经胺糖酸部分组成的线性聚合物。在特别优选的PSA和mPSA中,糖苷键联为α-2,8。所述PSA和mPSA宜来源于多聚乙酰神经胺糖酸,且在本文中称为“CA”和“mCA”。典型PSA和mPSA包含至少2个、优选至少5个、更优选至少10个和最优选至少20个N-乙酰神经胺糖酸部分。因此,其可包含2至300个N-乙酰神经胺糖酸部分、优选5至200个N-乙酰神经胺糖酸部分或最优选10至100个N-乙酰神经胺糖酸部分。除N-乙酰神经胺糖酸外,PSA和CA优选基本上不含糖部分。因此,PSA和CA优选包含至少90%、更优选至少95%和最优选至少98%N-乙酰神经胺糖酸部分。
当PSA和CA包含除N-乙酰神经胺糖酸外的部分时(例如mPSAS和mCA中),这些部分优选位于聚合物链的一端或两端。所述“其它”部分可例如为通过氧化或还原而衍生自末端N-乙酰神经胺糖酸部分的部分。
举例来说,WO-A-0187922描述如下mPSA和mCA,其中非还原末端N-乙酰神经胺糖酸单元通过与过碘酸钠反应而转化为醛基。另外,WO 2005/016974描述如下mPSA和mCA,其中还原末端N-乙酰神经胺糖酸单元经受还原以在还原末端N-乙酰神经胺糖酸单元处还原性开环,由此形成邻二醇基团,随后氧化以使所述邻二醇基团转化为醛基。
富含唾液酸的糖蛋白结合人和其它生物体中的选择素。其在人流感感染中起重要作用。举例来说,唾液酸可掩蔽宿主细胞或细菌的表面上的甘露糖抗原以免受甘露糖结合凝集素影响。此可防止补体活化。唾液酸还掩蔽次末半乳糖残基,由此防止糖蛋白由肝实质细胞上的半乳糖受体快速清除。
多聚乙酰神经胺糖酸(N-乙酰神经胺糖酸的均聚物)的结构
多聚乙酰神经胺糖酸(PSA的亚类)为具有α(2→8)酮苷键联的N-乙酰神经胺糖酸(NANA)的均聚物,且由具有K1抗原的大肠杆菌的特定菌株产生。多聚乙酰神经胺糖酸具有许多生理功能。其作为药物和化妆品的原料很重要。
使用聚唾液酸化和未修饰的天冬酰胺酶的活体内比较研究揭露聚唾液酸化延长酶的半衰期(Fernandes和Gregoriadis,Biochimica Biophysica Acta 1341:26-34,1997)。
如本文中所使用,“唾液酸部分(sialic acid moieties)”包括唾液酸单体或聚合物(“多糖(polysaccharides)”),其可溶于水溶液或水性悬浮液中且在施用药物有效量的PSA-凝血蛋白缀合物后对哺乳动物具有极小或无负面影响,诸如副作用。在一个方面,聚合物的特征为具有1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400或500个唾液酸单元。在某些方面,不同唾液酸单元组合于一条链中。
在本发明的一个实施方案中,多糖化合物的唾液酸部分具有高亲水性,且在另一实施方案中,整个化合物具有高亲水性。亲水性主要由唾液酸单元的侧位羧基以及羟基赋予。糖单元可含有其它官能团,诸如胺、羟基或硫酸酯基或其组合。这些基团可存在于天然存在的糖化合物上,或引入衍生物多糖化合物中。
天然存在的聚合物PSA可以多分散制剂形式得到,其显示宽的大小分布(例如Sigma C-5762)和高多分散性(PD)。因为多糖通常在带有共纯化内毒素的固有风险的细菌中产生,所以长唾液酸聚合物链的纯化可能提高增加内毒素含量的可能性。具有1-4个唾液酸单元的短PSA分子还可以合成方法制备(Kang SH等,Chem Commun.2000;227-8;Ress DK和Linhardt RJ,Current Organic Synthesis.2004;1:31-46),由此使高内毒素水平的风险降至最低。然而,现可制造具有窄的大小分布和低多分散性的PSA制剂,其也不含内毒素。在一个方面,特别用于本发明的多糖化合物为细菌产生的多糖化合物。这些天然存在的多糖中的一些称为糖脂。在一个实施方案中,多糖化合物大致上不含末端半乳糖单元。
B.聚乙二醇(PEG)和聚乙二醇化
在某些方面,通过多种化学方法中的任一者使治疗性蛋白质与水溶性聚合物缀合(Roberts JM等,Advan Drug Delivery Rev2002;54:459-76)。举例来说,在一个实施方案中,通过使用N-羟基丁二酰亚胺(NHS)酯使PEG与治疗性蛋白质的游离氨基缀合来修饰所述蛋白质。在另一实施方案中,使用马来酰亚胺化学反应或在先前氧化后使PEG酰肼或PEG胺与治疗性蛋白质的碳水化合物部分偶合,使水溶性聚合物(例如PEG)与游离SH基团偶合。
在一个方面,通过经由形成稳定键使水溶性聚合物与治疗性蛋白质直接偶合(或经由连接子系统偶合)来进行缀合。另外,可降解、可释放或可水解的连接子系统用于本发明的某些方面(Tsubery等J Biol Chem 2004;279:38118-24/Greenwald等,J Med Chem1999;42:3657-67/Zhao等,Bioconj Chem 2006;17:341-51/WO2006/138572A2/US7259224B2/US7060259B2)。
在本发明的一个实施方案中,通过使用含有活性N-羟基丁二酰亚胺酯(NHS)(诸如丁二酸丁二酰亚胺酯、戊二酸丁二酰亚胺酯或丙酸丁二酰亚胺酯)的聚乙二醇衍生物,经由赖氨酸残基修饰治疗性蛋白质。这些衍生物在温和条件下通过形成稳定酰胺键而与治疗性蛋白质的赖氨酸残基反应。在本发明的一个实施方案中,PEG衍生物的链长度为5,000Da。链长度为500至2,000Da、2,000至5,000Da、大于5,000至10,000Da或大于10,000至20,000Da或大于20,000至150,000Da的其它PEG衍生物用于各种实施方案中,包括线性和支链结构。
氨基的聚乙二醇化的替代性方法为(但不限于)通过形成氨基甲酸酯键而与PEG碳酸酯化学缀合,或通过形成仲酰胺键的还原胺化而与醛或酮反应。
在本发明的一个实施方案中,治疗性蛋白质分子使用可商购获得的PEG衍生物进行化学修饰。在替代性方面,这些PEG衍生物具有线性或支链结构。下文列举含有NHS基团的PEG-衍生物的实例。
以下PEG衍生物为自Nektar Therapeutics商购获得的那些PEG衍生物的非限制性实例(Huntsville,Ala.;参见www.nektar.com/PEG试剂目录;Nektar AdvancedPEGylation,价格表2005-2006):
mPEG-丙酸丁二酰亚胺酯(mPEG-SPA)
mPEG-α-甲基丁酸丁二酰亚胺酯(mPEG-SMB)
mPEG-CM-HBA-NHS(CM=羧甲基;HBA=羟基丁酸)
支链PEG-衍生物(Nektar Therapeutics)的结构:
支链PEG N-羟基丁二酰亚胺(mPEG2-NHS)
具有支链结构的此试剂由Kozlowski等(BioDrugs 2001;5:419-29)更详细地描述。
PEG衍生物的其它非限制性实例自NOF公司商购获得(Tokyo,Japan;参见www.nof.co.jp/english:目录2005)。
线性PEG-衍生物(NOF公司)的通用结构:
X=羧甲基
X=羧戊基
x=丁二酸酯基
mPEG丁二酸丁二酰亚胺酯
x=戊二酸酯基
mPEG戊二酸丁二酰亚胺酯
支链PEG-衍生物(NOF公司)的结构:2,3-双(甲基聚氧亚乙基-氧基)-1-(1,5-二氧代-5-丁二酰亚胺基氧基,戊氧基)丙烷
2,3-双(甲基聚氧亚乙基-氧基)-1-(丁二酰亚胺基羧戊基氧基)丙烷
这些丙烷衍生物显示具有1,2取代型态的甘油主链。在本发明中,还涵盖基于具有1,3取代的甘油结构或US2003/0143596A1中所述的其它支链结构的支链PEG衍生物。
还涵盖如由Tsubery等(J Biol Chem 2004;279:38118-24)和Shechter等(WO04089280A3)所述的具有可降解(例如可水解)连接子的PEG衍生物。
令人惊讶的是,本发明的聚乙二醇化治疗性蛋白质展现功能活性与延长的活体内半衰期的组合。另外,聚乙二醇化rFVIII、FVIIa、FIX或其它凝血因子似乎针对凝血酶失活的抗性更大。
C.羟烷基淀粉(HAS)和羟乙基淀粉(HES)
在本发明的各种实施方案中,治疗性蛋白质分子使用羟烷基淀粉(HAS)或羟乙基淀粉(HES)或其衍生物进行化学修饰。
HES为天然存在的支链淀粉的衍生物且在体内由α-淀粉酶降解。HES为碳水化合物聚合物支链淀粉的取代的衍生物,其以至多95重量%的浓度存在于玉米淀粉中。HES展现有利的生物性质且用作血容量替代药剂和用于临床血稀释疗法中(Sommermeyer等,1987,Krankenhauspharmazie,8(8),271-278;和Weidler等,1991,Arzneim.-Forschung/DrugRes.g 419 494-498)。
支链淀粉由葡萄糖部分组成,其中α-1,4-糖苷键存在于主链中且α-1,6-糖苷键见于分支位点。此分子的物理化学性质主要由糖苷键的类型决定。由于切口α-1,4-糖苷键,产生每个转角具有约6个葡萄糖单体的螺旋结构。聚合物的物理化学以及生物化学性质可经由取代加以修饰。羟乙基的引入可经由碱性羟乙基化达成。关于羟乙基化,通过修改反应条件,有可能利用未取代的葡萄糖单体中各别羟基的不同反应性。由于此事实,本领域的技术人员能够在有限程度上影响取代型态。
HAS指被至少一个羟烷基取代的淀粉衍生物。因此,术语羟烷基淀粉(hydroxyalkyl starch)并不限于末端碳水化合物部分包含羟烷基R1、R2和/或R3的化合物,而且还指无论何处(末端碳水化合物部分和/或淀粉分子(HAS')的其余部分中)存在的至少一个羟基被羟烷基R1、R2或R3取代的化合物。
烷基可为可适当取代的直链或支链烷基。优选地,羟烷基含有1至10个碳原子、更优选1至6个碳原子、更优选1至4个碳原子和甚至更优选2-4个碳原子。因此,“羟烷基淀粉”优选包含羟乙基淀粉、羟丙基淀粉和羟丁基淀粉,其中羟乙基淀粉和羟丙基淀粉尤为优选。
包含两个或更多个不同羟烷基的羟烷基淀粉也包含于本发明中。HAS中所包含的至少一个羟烷基可含有两个或更多个羟基。根据一个实施方案,包含至少一个羟烷基的HAS含有一个羟基。
术语HAS还包括烷基被单取代或多取代的衍生物。在一个实施方案中,烷基被卤素、尤其氟取代,或被芳基取代,条件为HAS仍可溶于水。此外,羟烷基的末端羟基可被酯化或醚化。HAS衍生物描述于WO/2004/024776中,所述文献以全文引用的方式并入本文。
D.连接方法
治疗性蛋白质可通过本领域的技术人员已知的各种技术中的任一者与多糖化合物共价连接。在本发明的各种方面,唾液酸部分结合于治疗性蛋白质,例如FIX、FVIII、FVIIa或VWF,例如利用美国专利号4,356,170中所述的方法,所述文献以引用的方式并入本文。
用于使PSA与多肽偶合的其它技术也为已知的且由本发明涵盖。举例来说,美国公布号2007/0282096描述使例如PSA的胺或酰肼衍生物与蛋白质缀合。另外,美国公布号2007/0191597描述在还原端含有用于与底物(例如蛋白质)反应的醛基的PSA衍生物。这些参考文献以全文引用的方式并入本文。
多种方法公开于美国专利号5,846,951(以全文引用的方式并入本文)的第7栏第15行至第8栏第5行中。示例性技术包括经由凝血蛋白或多糖中的任一者上的羧基与凝血蛋白或多糖的氨基之间的肽键,或凝血蛋白或多糖的羧基与治疗性蛋白质或多糖的羟基之间的酯键联来连接。使治疗性蛋白质共价键结于多糖化合物的另一键联是经由席夫碱(Schiff base)进行,其中凝血蛋白上的游离氨基通过过碘酸盐氧化与多糖非还原端上所形成的醛基反应(Jennings HJ和Lugowski C,JImmunol.1981;127:1011-8;Fernandes AI和Gregoriadis G,Biochim Biophys Acta.1997;1341;26-34)。在一个方面,通过用NaCNBH3特异性还原形成仲胺来使所产生的席夫碱稳定。替代性方法为通过在先前氧化之后用NH4Cl还原胺化而在PSA中产生末端游离氨基。双官能试剂可用于连接两个氨基或两个羟基。举例来说,使用如BS3(辛二酸双(磺酸基丁二酰亚胺基)酯/Pierce,Rockford,IL)等试剂使含有氨基的PSA与蛋白质的氨基偶合。另外,例如使用如Sulfo-EMCS(N-ε-马来酰亚胺基己酰氧基)磺酸基丁二酰亚胺酯/Pierce)等杂双官能交联剂连接胺和硫醇基。
在另一方法中,制备PSA酰肼且在先前氧化和产生醛官能团之后使其与蛋白质的碳水化合物部分偶合。
如上文所述,治疗性蛋白质的游离氨基与唾液酸残基的1-羧基反应形成肽基键,或在1-羧酸基与凝血蛋白上的羟基或其它适合的活性基团之间形成酯键联。或者,羧基与脱乙酰化5-氨基形成肽键联,或治疗性蛋白质分子的醛基与唾液酸残基的N-脱乙酰化5-氨基形成席夫碱。
或者,多糖化合物以非共价方式与治疗性蛋白质缔合。举例来说,在一个方面,多糖化合物和药物活性化合物经由疏水性相互作用连接。其它非共价缔合包括静电相互作用,其中带相反电荷的离子彼此吸引。
在各种实施方案中,治疗性蛋白质以化学计算量(例如1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:7、1:8、1:9或1:10等)与多糖化合物连接或缔合。在各种实施方案中,1-6个、7-12个或13-20个多糖与凝血蛋白连接。在其它实施方案中,1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个多糖与凝血蛋白连接。
在各种实施方案中,治疗性蛋白质被修饰以引入糖基化位点(即除天然糖基化位点外的位点)。所述修饰可使用所属领域中已知的标准分子生物学技术来实现。另外,治疗性蛋白质在经由一个或多个碳水化合物部分与水溶性聚合物缀合之前可在活体内或活体外被糖基化。这些糖基化位点可用作蛋白质与水溶性聚合物缀合的靶标(美国专利申请号20090028822、美国专利申请号2009/0093399、美国专利申请号2009/0081188、美国专利申请号2007/0254836、美国专利申请号2006/0111279和DeFrees S.等,Glycobiology,2006,16,9,833-43)。举例来说,未在活体内发生天然糖基化的蛋白质(例如不为糖蛋白的蛋白质)可如上文所述加以修饰。
E.氨氧基键联
在本发明的一个实施方案中,羟胺或羟胺衍生物与醛(例如经过碘酸钠氧化后的碳水化合物部分上的醛)反应形成肟基可应用于制备凝血蛋白的缀合物。举例来说,糖蛋白(例如本发明的治疗性蛋白质)首先用诸如过碘酸钠(NaIO4)等氧化剂氧化(Rothfus JA etSmith EL.,JBiol Chem 1963,238,1402-10;和Van Lenten L和Ashwell G.,J Biol Chem1971,246,1889-94)。糖蛋白的过碘酸盐氧化是基于1928年所述的典型马拉普拉德反应(Malaprade reaction),即用过碘酸盐氧化邻二醇,形成活性醛基(Malaprade L.,Analytical application,Bull Soc Chim France,1928,43,683-96)。所述氧化剂的其它实例为四乙酸铅(Pb(OAc)4)、乙酸锰(MnO(Ac)3)、乙酸钴(Co(OAc)2)、乙酸亚铊(TlOAc)、硫酸铈(Ce(SO4)2)(US 4,367,309)或过钌酸钾(KRuO4)(Marko等,J Am Chem Soc 1997,119,12661-2)。“氧化剂”意谓能够在生理反应条件下氧化碳水化合物中的邻二醇,由此产生活性醛基的温和氧化化合物。
第二步骤为含有氨氧基的聚合物与氧化型碳水化合物部分偶合,形成肟键联。在本发明的一个实施方案中,此步骤可在催化量的亲核性催化剂苯胺或苯胺衍生物存在下进行(Dirksen A et Dawson PE,Bioconjugate Chem.2008;Zeng Y等,Nature Methods2009;6:207-9)。苯胺催化显著加速肟连接,从而允许使用极低浓度的试剂。在本发明的另一实施方案中,通过用NaCNBH3还原形成烷氧基胺键联来使肟键联稳定(图2)。下文描述其它催化剂。
关于氨氧基技术的其它信息可见于以下参考文献中,其中各参考文献均以全文引用的方式并入本文:EP 1681303A1(HAS化红血球生成素);WO 2005/014024(由肟连接基团连接的聚合物与蛋白质的缀合物);WO96/40662(含有氨氧基的连接子化合物和其在缀合物中的应用);WO 2008/025856(修饰的蛋白质);Peri F等,Tetrahedron 1998,54,12269-78;Kubler-Kielb J et.Pozsgay V.,J Org Chem 2005,70,6887-90;Lees A等,Vaccine2006,24(6),716-29;和Heredia KL等,Macromoecules 2007,40(14),4772-9。
在本发明的各种实施方案中,根据本文所述的氨氧基技术与治疗性蛋白质(例如FVIII、FVIIa或FIX)的氧化型碳水化合物部分连接的水溶性聚合物包括(但不限于)聚乙二醇(PEG)、支链PEG、聚唾液酸(PSA)、碳水化合物、多糖、普鲁兰、壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、淀粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚环氧烷(PAO)、聚烷二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯酰基吗啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-马来酸酐、聚苯乙烯-共-马来酸酐、聚(1-羟甲基亚乙基羟甲基缩甲醛)(PHF)、2-甲基丙烯酰氧基-2'-乙基三甲基磷酸铵(MPC)。
亲核性催化剂
如本文所述,水溶性聚合物与治疗性蛋白质的缀合可由苯胺催化。苯胺强烈催化醛和酮与胺的水性反应以形成稳定亚胺,诸如腙和肟。下图比较未催化相对于以苯胺催化的肟连接反应(Kohler JJ,ChemBioChem 2009;10:2147-50):
然而,考虑到与苯胺相关的众多健康风险,需要替代性催化剂。本发明提供苯胺衍生物作为替代性肟连接催化剂。所述苯胺衍生物包括(但不限于)邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸、对氨基苯磺酸、邻氨基苯甲酰胺、邻甲苯胺、间甲苯胺、对甲苯胺、邻茴香胺、间茴香胺和对茴香胺。
在本发明的一个实施方案中,使用间甲苯胺(也称为间甲苯胺、间甲基苯胺、3-甲基苯胺或3-氨基-1-甲基苯)催化本文所述的缀合反应。间甲苯胺和苯胺具有类似物理性质和基本上相同的pKa值(间甲苯胺:pKa 4.73,苯胺:pKa 4.63)。
本发明的亲核性催化剂适用于肟连接(例如使用氨氧基键联)或腙形成(例如使用酰肼化学反应)。在本发明的各种实施方案中,亲核性催化剂以如下浓度提供于缀合反应中:0.1、0.2、0.3、0.5、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50mM。在一个实施方案中,提供1mM至10mM之间的亲核性催化剂。在本发明的各种实施方案中,缀合反应的pH范围为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5。在一个实施方案中,pH在5.5至6.5之间。
缀合蛋白质的纯化
在各种实施方案中,希望纯化已与氧化剂一起孵育的蛋白质和/或已与本发明的水溶性聚合物缀合的治疗性蛋白质。多种纯化技术为所属领域所已知且包括(但不限于)色谱法(诸如离子交换色谱、疏水性相互作用色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱或其组合)、过滤法和沉淀法(Guide to Protein Purification,Meth.Enzymology第463卷(由Burgess RR和Deutscher MP编著),第2版,Academic Press 2009)。
以下实施例不欲限制本发明,而仅例示本发明的特定实施方案。
实施例
实施例1
制备同双官能连接子NH2[OCH2CH2]2ONH2
同双官能连接子NH2[OCH2CH2]2ONH2
根据Boturyn等(Tetrahedron 1997;53:5485-92),在使用经过修改的伯胺的加柏利合成(Gabriel-Synthesis)的两步有机反应(图3)中合成含有两个活性氨氧基的(3-氧杂-戊烷-1,5-二氧基胺)。在第一步骤中,一个2,2-氯乙醚分子与两个内-N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺分子在二甲基甲酰胺(DMF)中反应。通过肼解作用,在乙醇中由所得中间体制备期望的同双官能产物。
实施例2
制备同双官能连接子NH2[OCH2CH2]4ONH2
同双官能连接子NH2[OCH2CH2]4ONH2
根据Boturyn等(Tetrahedron 1997;53:5485-92),在使用经过修改的伯胺的加柏利合成的两步有机反应(图3)中合成含有两个活性氨氧基的(3,6,9-三氧杂-十一烷-1,11-二氧基胺)。在第一步骤中,一个双-(2-(2-氯乙氧基)-乙基)-醚分子与两个内-N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺分子在DMF中反应。通过肼解作用,在乙醇中由所得中间体制备期望的同双官能产物。
实施例3
制备同双官能连接子NH2[OCH2CH2]6ONH2
同双官能连接子NH2[OCH2CH2]6ONH2
根据Boturyn等(Tetrahedron 1997;53:5485-92),在使用经过修改的伯胺的加柏利合成的两步有机反应中合成含有两个活性氨氧基的(3,6,9,12,15-五氧杂-十七烷-1,17-二氧基胺)。在第一步骤中,一个二氯化六乙二醇分子与两个内-N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺分子在DMF中反应。通过肼解作用,在乙醇中由所得中间体制备期望的同双官能产物。
实施例4
氨氧基-PSA试剂的详细合成
根据Botyryn等(Tetrahedron 1997;53:5485-92),在如实施例1中所概述的两步有机合成中合成3-氧杂-戊烷-1,5二氧基胺。
步骤1:
向内-N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺(59.0g;1.00当量)于700ml无水N,N-二甲基甲酰胺中的溶液中添加无水K2CO3(45.51g;1.00当量)和2,2-二氯乙醚(15.84ml;0.41当量)。在50℃下搅拌反应混合物22小时。在减压下蒸发混合物至干燥。使残余物悬浮于2L二氯甲烷中且用饱和NaCl水溶液提取两次(每次1L)。二氯甲烷层用Na2SO4脱水,接着在减压下蒸发至干燥并在高度真空下干燥,得到64.5g呈白黄色固体状的3-氧杂戊烷-1,5-二氧基-内-2',3'-二甲酰亚胺降冰片烯(中间体1)。
步骤2:
向中间体1(64.25g;1.00当量)于800ml无水乙醇中的溶液中添加31.0ml水合肼(4.26当量)。接着使反应混合物回流2小时。通过在减压下蒸发溶剂将混合物浓缩至起始体积的一半。滤出产生的沉淀物。在减压下蒸发残余乙醇层至干燥。在真空中干燥含有粗产物3-氧杂-戊烷-1,5-二氧基胺的残余物,得到46.3g。进一步通过管柱色谱(硅胶60;用二氯甲烷/甲醇混合物9/1进行等度洗脱)纯化粗产物,得到11.7g纯的最终产物3-氧杂-戊烷-1,5-二氧基胺。
实施例5
制备氨氧基-PSA
将自印度血清研究所(Serum Institute of India)(Pune,India)获得的1000mg氧化型PSA(MW=20kD)溶解于16ml 50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)中。接着向反应混合物中提供170mg 3-氧杂-戊烷-1,5-二氧基胺。在室温下震荡2小时后,添加78.5mg氰基硼氢化钠且反应进行18小时过夜。接着使用由再生纤维素制成的具有5kD截断值的膜(50cm2,Millipore)对反应混合物进行超滤/透滤程序(UF/DF)。
实施例6
使用色谱纯化步骤制备氨氧基-PSA
将自印度血清研究所(Pune,India)获得的1290mg氧化型PSA(MW=20kD)溶解于25ml 50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)(缓冲液A)中。接着向反应混合物中提供209mg 3-氧杂-戊烷-1,5-二氧基胺。在室温下震荡1小时后,添加101mg氰基硼氢化钠且反应3小时。接着使用Fractogel EMD DEAE 650-M色谱凝胶(管柱尺寸:XK26/135)对混合物进行弱阴离子交换色谱步骤。用110ml缓冲液A稀释反应混合物且以1cm/分钟的流速加载于用缓冲液A预平衡的DEAE管柱上。接着以2cm/分钟的流速用20CV缓冲液B(20mM Hepes,pH 6.0)洗涤管柱以移除游离3-氧杂-戊烷-1,5-二氧基胺和氰化物。接着用由67%缓冲液B与43%缓冲液C组成的阶段梯度(20mM Hepes、1MNaCl,pH 7.5)洗脱氨氧基-PSA试剂。通过UF/DF,使用由聚醚砜制成的5kD膜(50cm2,Millipore)浓缩洗脱液。针对缓冲液D(20mMHepes、90mM NaCl,pH 7.4)进行最后透滤步骤。通过测量总PSA(间苯二酚测定)和总氨氧基(TNBS测定)以测定修饰程度而以分析法表征制剂。此外,测定多分散性以及游离3-氧杂-戊烷-1,5-二氧基胺和氰化物。
实施例7
不使用还原步骤下制备氨氧基-PSA
将自印度血清研究所(Pune,India)获得的573mg氧化型PSA(MW=20kD)溶解于11.3ml 50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)(缓冲液A)中。接着向反应混合物中提供94mg 3-氧杂-戊烷-1,5-二氧基胺。在室温下震荡5小时后,接着使用Fractogel EMD DEAE 650-M色谱凝胶(管柱尺寸:XK16/105)对混合物进行弱阴离子交换色谱步骤。用50ml缓冲液A稀释反应混合物且以1cm/分钟的流速加载于以缓冲液A预平衡的DEAE管柱上。接着以2cm/分钟的流速用20CV缓冲液B(20mM Hepes,pH 6.0)洗涤管柱以移除游离3-氧杂-戊烷-1,5-二氧基胺和氰化物。用由67%缓冲液B与43%缓冲液C组成的阶段梯度(20mMHepes、1M NaCl,pH 7.5)洗脱氨氧基-PSA试剂。通过UF/DF,使用由聚醚砜制成的5kD膜(50cm2,Millipore)浓缩洗脱液。针对缓冲液D(20mM Hepes、90mM NaCl,pH 7.4)进行最后透滤步骤。通过测量总PSA(间苯二酚测定)和总氨氧基(TNBS测定)以测定修饰程度而以分析法表征制剂。此外,测定多分散性以及游离3-氧杂-戊烷-1,5-二氧基胺。
实施例8
不使用还原步骤且在亲核性催化剂间甲苯胺存在下制备氨氧基-PSA
将自印度血清研究所(Pune,India)获得的573mg氧化型PSA(MW=20kD)溶解于9ml50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)(缓冲液A)中。接着向此溶液中提供94mg 3-氧杂-戊烷-1,5-二氧基胺。随后将2.3ml 50mM间甲苯胺储备溶液添加至此反应混合物中。在室温下震荡2小时后,接着使用Fractogel EMD DEAE 650-M色谱凝胶(管柱尺寸:XK16/105)对混合物进行弱阴离子交换色谱步骤。用50ml缓冲液A稀释反应混合物且以1cm/分钟的流速加载于以缓冲液A预平衡的DEAE管柱上。接着以2cm/分钟的流速用20CV缓冲液B(20mMHepes,pH 6.0)洗涤管柱以移除游离3-氧杂-戊烷-1,5-二氧基胺和氰化物。用由67%缓冲液B与43%缓冲液C组成的阶段梯度(20mMHepes、1M NaCl,pH 7.5)洗脱氨氧基-PSA试剂。通过UF/DF,使用由聚醚砜制成的5kD膜(50cm2,Millipore)浓缩洗脱液。针对缓冲液D(20mM Hepes、90mM NaCl,pH7.4)进行最后透滤步骤。通过测量总PSA(间苯二酚测定)和总氨氧基(TNBS测定)以测定修饰程度而以分析法表征制剂。此外,测定多分散性以及游离3-氧杂-戊烷-1,5-二氧基胺。
实施例9
制备氨氧基-PSA试剂
根据实施例4-8制备氨氧基-PSA试剂。透滤后,在-80℃下冷冻产物且冻干。冻干后,将试剂溶解于适当体积的水中且用于经由碳水化合物修饰来制备PSA-蛋白质缀合物。
实施例10
评估不同替代性亲核性催化剂的功效
在标准化条件(含1mg/ml rFIX的20mM L-组氨酸、150mMNaCl、5mM CaCl2(pH6.0),5倍摩尔浓度氨氧基-PSA试剂过量,100μM NaIO4)下,使用不同亲核性催化剂(苯胺、间甲苯胺、邻茴香胺、间茴香胺、邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸、对氨基苯甲酰胺、对氨基苯磺酸/标准浓度:10mM)将rFIX与过碘酸钠、氨氧基-PSA试剂一起孵育。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下反应2小时且在室温下通过添加最终浓度为1mM的半胱氨酸水溶液来淬灭,持续15分钟。
通过SDS-PAGE,使用Invitrogen X-cell小系统测定偶合效率。将十二烷基硫酸锂(lithium dodecyl sulfate,LDS)缓冲液搀入样品中且在70℃下变性10分钟。接着将样品施加于3-8%TRIS-乙酸盐凝胶上且在150V下电泳60分钟。随后用库马斯法(Coomassie)将凝胶染色。
另外,通过使用SEC-HPLC系统,使用装备有Shodex KW 803管柱的Agilent1200HPLC系统,在如先前所述的条件(Kolarich等,Transfusion 2006;46:1959-77)下表征样品。
注射未稀释的50μl样品且用20mM NaH2PO4、50mMNa2SO4(pH 6.1)的0.22μm滤液以0.5ml/分钟的流速等度洗脱。在280nm下记录洗脱图案。
结果总结于图5A-C和6(SDS PAGE)和表2(SEC-HPLC结果)中。说明不同制剂的催化效果。已显示,使用间甲苯胺产生与用苯胺所获得的结果相等的结果。
表2
亲核性催化剂 二聚唾液酸化rFIX 单聚唾液酸化rFIX 游离rFIX
无催化剂 4.5% 24.9% 70.6%
10mM苯胺 47.7% 33.6% 18.7%
10mM间甲苯胺 31.4% 40.8% 27.8%
10mM邻氨基苯甲酸 30.9% 38.5% 30.6%
10mM间氨基苯甲酸 27.6% 38.0% 34.4%
10mM对氨基苯甲酸 18.1% 39.3% 42.6%
10mM邻氨基苯甲酰胺 15.9% 38.4% 45.7%
10mM对氨基苯磺酸 11.8% 35.8% 52.4%
实施例11
使用氨氧基-PSA和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使rFIX聚唾液酸化
方法1:
将12.3mg rFIX溶解于6.1ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mMNaCl、5mM CaCl2)中。接着添加254μl过碘酸钠水溶液(5mM)且在4℃下在黑暗中在平缓搅拌下孵育反应混合物,在室温下通过添加6.5μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭,持续15分钟。随后使用Vivaspin 15R 10kD离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
将含有氧化型rFIX的保留物(8.8ml)与2.46ml间甲苯胺水溶液(50mM)混合且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育此混合物2.5小时。
借助于阴离子交换色谱(AEC)移除游离rFIX。用15ml缓冲液A(50mM Hepes、5mMCaCl2,pH 7.5)稀释反应混合物且加载于以缓冲液A预平衡的20ml HiPrep QFF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。接着用缓冲液B(50mM Hepes、1M NaCl、5mM CaCl2,pH7.5)洗脱管柱。游离rFIX以12-25mS/cm之间的传导率洗脱且缀合物以27-45mS/cm之间的传导率洗脱。含有缀合物的洗脱份的传导率随后使用缓冲液C(50mM Hepes、5M NaCl、5mMCaCl2,pH 6.9)升至190mS/cm且加载于以缓冲液D(50mM Hepes、3M NaCl、5mM CaCl2,pH6.9)预平衡的20ml HiPrep丁基FF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。用5CV缓冲液D洗涤出游离氨氧基-PSA试剂。随后用100%缓冲液E(50mM Hepes、5mM CaCl2,pH 7.4)洗脱缀合物。通过UF/DF,使用Vivaspin 15R 10kD离心过滤器浓缩含有缀合物的洗脱份。针对含有150mM NaCl和5mM CaCl2的组氨酸缓冲液(pH 7.2)进行最后透滤步骤。通过测量总蛋白质(布莱德法(Bradford))和FIX产色活性以分析法表征制剂。PSA-rFIX缀合物显示与天然rFIX相比,测得比活性>50%。
方法2:
将12.3mg rFIX溶解于L-组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl、5mM CaCl2)中,得到1mg rFIX/ml的最终蛋白质浓度。添加5mM过碘酸钠水溶液,得到100μM的最终浓度且在4℃下在黑暗中在平缓搅拌下在pH 6.0下孵育反应混合物1小时,在室温下通过添加1M L-半胱氨酸水溶液(或其它淬灭试剂)来淬灭,持续15分钟,得到10mM的最终浓度。随后使用Vivaspin 15R 10kD离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
将含有氧化型rFIX的所得保留物(8.8ml)与间甲苯胺水溶液(50mM)混合,得到10mM的最终浓度且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在pH 6.0下孵育此混合物2.5小时;在+4℃下在黑暗中在平缓搅拌下孵育0.5小时至18小时。
借助于阴离子交换色谱(AEC)移除游离rFIX。用适量缓冲液A(50mM Hepes、5mMCaCl2,pH 7.5)稀释反应混合物以校正溶液传导率和pH,随后加载于以缓冲液A预平衡的20ml HiPrep QFF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。接着用缓冲液B(50mMHepes、1M NaCl、5mM CaCl2,pH 7.5)洗脱管柱。通过阶段梯度,使用25%缓冲液B洗脱游离rFIX,使得所得洗脱份中的传导率在12-25mS/cm之间,且使用50%缓冲液B的阶段梯度洗脱缀合物,使得缀合物洗脱份中的传导率在27-45mS/cm之间。含有缀合物的洗脱份的传导率随后使用缓冲液C(50mM Hepes、5M NaCl、5mM CaCl2,pH 6.9,或通过使用抗离液盐,例如硫酸铵、乙酸铵等)升至190mS/cm且加载于以缓冲液D(50mM Hepes、3M NaCl、5mM CaCl2,pH6.9)预平衡的20ml HiPrep丁基FF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT或类似HIC介质)上。用5CV缓冲液D洗涤出游离氨氧基-PSA试剂。随后用100%缓冲液E(50mM Hepes、5mMCaCl2,pH 7.4)洗脱缀合物。通过UF/DF,使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2,截断值10kD,Millipore)浓缩含有缀合物的洗脱份。针对含有150mM NaCl和5mM CaCl2的L-组氨酸缓冲液(pH 7.2)进行最后透滤步骤。通过测量总蛋白质(布莱德法和BCA程序)和FIX产色和凝结活性以分析法表征制剂。对于PSA-rFIX缀合物,与天然rFIX相比,测得比活性>50%。
方法3:
将25.4mg rFIX溶解于18.7ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mMNaCl、5mM CaCl2)中。接着添加531μl过碘酸钠水溶液(5mM)和5.07ml间甲苯胺水溶液(50mM)。随后添加MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且在室温下通过添加25μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭,持续15分钟。
借助于阴离子交换色谱(AEC)移除游离rFIX。用20ml缓冲液A(50mM Hepes、5mMCaCl2,pH 7.5)稀释反应混合物且加载于以缓冲液A预平衡的20ml HiPrep QFF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。接着用缓冲液B(50mM Hepes、1M NaCl、5mM CaCl2,pH7.5)洗脱管柱。游离rFIX以12-25mS/cm之间的传导率洗脱且缀合物以27-45mS/cm之间的传导率洗脱。含有缀合物的洗脱份的传导率随后使用缓冲液C(50mM Hepes、5M NaCl、5mMCaCl2,pH 6.9)升至190mS/cm且加载于以缓冲液D(50mM Hepes、3M NaCl、5mMCaCl2,pH6.9)预平衡的20ml HiPrep丁基FF 16/10管柱(GEHealthcare,Fairfield,CT)上。用5CV缓冲液D洗涤出游离氨氧基-PSA试剂。随后用100%缓冲液E(50mM Hepes、5mM CaCl2,pH 7.4)洗脱缀合物。通过UF/DF,使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2,截断值10kD,Millipore)浓缩含有缀合物的洗脱份。针对含有150mMNaCl和5mM CaCl2的组氨酸缓冲液(pH 7.2)进行最后透滤步骤。通过测量总蛋白质(布莱德法)和FIX产色活性以分析法表征制剂。对于PSA-rFIX缀合物,与天然rFIX相比,测得比活性>50%。另外通过尺寸排阻HPLC,使用装备有Shodex KW 803管柱的Agilent 1200HPLC系统,在如先前所述的条件(Kolarich等,Transfusion2006;46:1959-77)下以分析法表征缀合物。显示制剂不含游离FIX。缀合物由57%单聚唾液酸化产物和31%二聚唾液酸化产物和12%三聚唾液酸化产物组成。
方法4:
将25.4mg rFIX溶解于L-组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl、5mM CaCl2)中,得到2mg rFIX/ml的最终蛋白质浓度。随后在15分钟内添加5mM过碘酸钠水溶液,得到100μM的最终浓度,随后在30分钟的时段内添加50mM间甲苯胺水溶液,得到10mM的最终浓度。接着添加MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),产生5倍摩尔浓度试剂过量。校正pH至6.0后,在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且通过添加1M L-半胱氨酸水溶液以得到10mM的最终浓度来淬灭,持续15分钟。
借助于离子交换色谱(IEC)移除游离rFIX。用适量缓冲液A(50mM Hepes、5mMCaCl2,pH 7.5)稀释反应混合物以校正溶液传导率和pH值,随后加载于以缓冲液A预平衡的20ml HiPrep QFF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。接着用缓冲液B(50mMHepes、1M NaCl、5mM CaCl2,pH 7.5)洗脱管柱。通过阶段梯度,使用25%缓冲液B洗脱游离rFIX,使得所得洗脱份中的传导率在12-25mS/cm之间,且使用50%缓冲液B的阶段梯度洗脱缀合物,使得缀合物洗脱份中的传导率在27-45mS/cm之间。含有缀合物的洗脱份的传导率随后使用缓冲液C(50mM Hepes、5M NaCl、5mM CaCl2,pH 6.9;通过使用抗离液盐,例如乙酸铵)升至190mS/cm且加载于以缓冲液D(50mM Hepes、3M NaCl、5mM CaCl2,pH 6.9)预平衡的20ml HiPrep丁基FF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT;或类似HIC介质)上。用5CV缓冲液D洗涤出游离氨氧基-PSA试剂。随后用100%缓冲液E(50mM Hepes、5mM CaCl2,pH7.4)洗脱缀合物。通过UF/DF,使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2,截断值10kD,Millipore)浓缩含有缀合物的洗脱份。针对含有150mM NaCl和5mM CaCl2的L-组氨酸缓冲液(pH 7.2)进行最后透滤步骤。通过测量总蛋白质(布莱德法和BCA程序)和FIX产色和凝结活性以分析法表征制剂。对于PSA-rFIX缀合物,与天然rFIX相比,测得比活性>50%。另外通过尺寸排阻HPLC,使用装备有Shodex KW 803管柱的Agilent1200HPLC系统,在如先前所述的条件(Kolarich等,Transfusion2006;46:1959-77)下以分析法表征缀合物。显示制剂不含游离FIX。缀合物由57%单聚唾液酸化产物和31%二聚唾液酸化产物和12%三聚唾液酸化产物组成。
实施例12
使用氨氧基-PSA和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使rFVIII聚唾液酸化
方法1:
将50mg rFVIII转移至反应缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4,得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行氧化反应30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度:10mM)淬灭反应,持续60分钟。使溶液通过以缓冲液A(20mM Hepes、5mM CaCl2,pH 7.0)平衡且体积为20ml的IEX管柱(Merck EMD TMAE(M))。用5CV缓冲液A平衡管柱。接着用缓冲液B(20mM Hepes、5mM CaCl2、1M NaCl,pH 7.0)洗脱氧化型rFVIII。收集含有rFVIII的洗脱份。测定蛋白质含量(库马斯法、布莱德法)且用反应缓冲液调整至1mg/ml并通过逐滴添加0.5M HCl调整至pH6.0。接着添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度:10mM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。借助于HIC移除过量氨氧基-PSA试剂。通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵,pH 6.9)使反应混合物的传导率升至130mS/cm且加载于以50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙(pH 6.9)预平衡且填充有80ml苯基琼脂糖FF的管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。随后用含有5mMCaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.5)洗脱缀合物。最后,收集含有PSA-rFVIII的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的30kD膜(88cm2,Millipore)进行UF/DF。通过测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和FVIII产色活性以分析法表征制剂。PSA-rFVIII缀合物显示与天然rFVIII相比,测得比活性>70%。
方法2:
将含来源于ADVATE过程的58mg重组因子VIII(rFVIII)的Hepes缓冲液(50mMHEPES、约350mM氯化钠、5mM氯化钙、0.1%聚山梨酸酯80,pH 7.4)溶解于反应缓冲液(50mMHepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM过碘酸钠水溶液,得到200μM的浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T=+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应,得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
进一步通过阴离子交换色谱,在EMD TMAE(M)(Merck)上纯化氧化型rFVIII。用缓冲液A(20mM Hepes、5mM CaCl2,pH 6.5)稀释混合物,得到5ms/cm的传导率。使用1.5cm/分钟的流速将此溶液加载于管柱体积为10ml的IEX管柱(床高度:5.4cm)上。随后用5CV的缓冲液A与缓冲液B(20mM Hepes、5mM CaCl2、1.0M NaCl,pH7.0)的92:8混合物(w/w)洗涤(流速:1.5cm/分钟)此管柱。接着用缓冲液A与缓冲液B的50:50(w/w)混合物洗脱氧化型rFVIII,随后用5CV缓冲液B进行后洗脱步骤。通过使用1.0cm/分钟的流速进行洗脱步骤。
随后,在最多15分钟的时段(t)内在平缓搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至含有纯化的氧化型rFVIII的洗脱液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM),得到10mM的最终浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在平缓震荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。
通过疏水性相互作用色谱(HIC),使用填充于由GE Healthcare制造的床高度为15cm且所得管柱体积(CV)为81ml的管柱中的苯基琼脂糖FF低亚树脂(GE Healthcare)来纯化所得PSA-rFVIII缀合物。
通过添加含有350mM氯化钠、8M乙酸铵、5mM氯化钙的50mM Hepes缓冲液(pH 6.9)将乙酸铵搀入反应混合物中。将2体积的反应混合物与1体积的含有乙酸铵的缓冲系统混合且通过逐滴添加0.5N NaOH水溶液将pH值校正至pH 6.9。将此混合物以1cm/分钟的流速加载于HIC管柱上,随后使用>3CV平衡缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、2.5M乙酸铵、5mM氯化钙,pH 6.9)进行洗涤步骤。
为移除反应副产物和抗离液盐,以向上流动模式以2cm/分钟的流速用>5CV洗涤缓冲液1(50mM Hepes、3M氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.9)进行第二个洗涤步骤。接着以向下流动模式以1cm/分钟的流速使用40%洗涤缓冲液2(50mM Hepes、1.5M氯化钠、5mM氯化钙,pH6.9)和60%洗脱缓冲液(20mM Hepes、5mM氯化钙,pH 7.5)的阶段梯度洗脱纯化的PSA-rFVIII缀合物。在UV 280nm下监测PSA-rFVIII缀合物的洗脱且收集<4CV的含有缀合物的洗脱液。用>3CV洗脱缓冲液在相同条件下进行后洗脱步骤以自主要产物分离次要和/或未修饰的rFVIII。
最后,通过超滤/透滤(UF/DF),使用由再生纤维素制成且分子量截断值为30kD的膜(88cm2,Millipore)浓缩纯化的缀合物。
通过测量总蛋白质、FVIII产色活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。对于所得缀合物,计算得到比活性>50%和PSA程度>5.0。
方法3:
将50mg rFVIII转移至反应缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。接着添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度:10mM)和NaIO4(最终浓度:400μM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。随后在室温下用半胱氨酸淬灭反应,持续60分钟(最终浓度:10mM)。接着通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mMHepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵,pH 6.9)使反应混合物的传导率升至130mS/cm且加载于以50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙、0.01%Tween 80(pH 6.9)预平衡且填充有80ml苯基琼脂糖FF的管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。随后用50mMHepes、5mM氯化钙(pH 7.5)洗脱缀合物。最后,收集含有PSA-rFVIII的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的30kD膜(88cm2,Millipore)进行UF/DF。通过测量总蛋白质(布莱德法)和FVIII产色活性以分析法表征制剂。对于PSA-rFVIII缀合物,与天然rFVIII相比,测得比活性≥70%。
方法4:
将含来源于ADVATE过程的50mg重组因子VIII(rFVIII)的50mM Hepes缓冲液(50mMHEPES、约350mM氯化钠、5mM氯化钙、0.1%聚山梨酸酯80,pH 7.4)溶解于反应缓冲液(50mMHepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。
随后,在最多15分钟的时段(t)内在平缓搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至此rFVIII溶液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM),得到10mM的最终浓度。最后,添加40mM过碘酸钠水溶液,得到400μM的浓度。
在T=+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在平缓震荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。接着通过添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应,得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过疏水性相互作用色谱(HIC),使用填充于由GE Healthcare制造的床高度为15cm且所得管柱体积(CV)为81ml的管柱中的苯基琼脂糖FF低亚树脂(GE Healthcare)来纯化所得PSA-rFVIII缀合物。
通过添加含有350mM氯化钠、8M乙酸铵、5mM氯化钙的50mM Hepes缓冲液(pH 6.9)将乙酸铵搀入反应混合物中。将2体积的反应混合物与1体积的含有乙酸铵的缓冲系统混合且通过逐滴添加0.5N NaOH水溶液将pH值校正至pH 6.9。将此混合物以1cm/分钟的流速加载于HIC管柱上,随后使用>3CV平衡缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、2.5M乙酸铵、5mM氯化钙,pH 6.9)进行洗涤步骤。
为移除反应副产物和抗离液盐,以向上流动模式以2cm/分钟的流速用>5CV洗涤缓冲液1(50mM Hepes、3M氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.9)进行第二个洗涤步骤。接着以向下流动模式以1cm/分钟的流速使用40%洗涤缓冲液2(50mM Hepes、1.5M氯化钠、5mM氯化钙,pH6.9)和60%洗脱缓冲液(20mM Hepes、5mM氯化钙,pH 7.5)的阶段梯度洗脱纯化的PSA-rFVIII缀合物。在UV 280nm下监测PSA-rFVIII缀合物的洗脱且收集<4CV的含有缀合物的洗脱液。用>3CV洗脱缓冲液在相同条件下进行后洗脱步骤以自主要产物分离次要和/或未修饰的rFVIII。
最后,通过超滤/透滤(UF/DF),使用由再生纤维素制成且具有分子量截断值30kD的膜(88cm2,Millipore)浓缩纯化的缀合物。
通过测量总蛋白质、FVIII产色活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
分析数据(6个连续批次的平均值):
过程产率(布莱德法):58.9%
过程产率(FVIII色谱):46.4%
比活性:(FVIII色谱/毫克蛋白质):4148IU/mg
比活性(起始材料%):79.9%
PSA程度(mol/mol):8.1
实施例13
使用氨氧基-PEG试剂和作为亲核性催化剂的间甲苯胺来使rFVIII聚乙二醇化
方法1:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使rFVIII聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将14.7mg rFVIII溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl、5mM CaCl2)中。接着添加296μl过碘酸钠水溶液(5mM)且在4℃下在黑暗中在平缓搅拌下孵育反应混合物1小时,在室温下通过添加7.5μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭,持续15分钟。随后使用Vivaspin 15R10kD离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
将含有氧化型rFVIII的保留物(10.9ml)与2.94ml间甲苯胺水溶液(50mM)混合且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂,产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后,通过离子交换色谱,在Q琼脂糖FF上纯化PEG-rFVIII缀合物。将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)预平衡的管柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物,接着使用30kD膜(50cm2,Millipore)进行UF/DF。通过测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和FVIII产色活性以分析法表征制剂。预期PEG-rFVIII缀合物将显示与天然rFVIII相比,测得比活性>70%。
方法2:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使rFVIII聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将起始重量或浓度的rFVIII溶解于或转移至反应缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM过碘酸钠水溶液,得到200μM的浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T=+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应,得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
进一步通过阴离子交换色谱,在EMD TMAE(M)(Merck)上纯化氧化型rFVIII。用缓冲液A(20mM Hepes、5mM CaCl2,pH 6.5)稀释混合物,得到5ms/cm的传导率。使用1.5cm/分钟的流速将此溶液加载于管柱体积为10ml的IEX管柱(床高度:5.4cm)上。随后用5CV的缓冲液A与缓冲液B(20mM Hepes、5mM CaCl2、1.0M NaCl,pH7.0)的92:8混合物(w/w)洗涤(流速:1.5cm/分钟)此管柱。接着用缓冲液A与缓冲液B的50:50(w/w)混合物洗脱氧化型rFVIII,随后用5CV缓冲液B进行后洗脱步骤。通过使用1.0cm/分钟的流速进行洗脱步骤。
随后,在最多15分钟的时段(t)内在平缓搅拌下将MW为20kD的氨氧基-PEG试剂以50倍摩尔浓度过量添加至含有纯化的氧化型rFVIII的洗脱液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM),得到10mM的最终浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在平缓震荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。
通过疏水性相互作用色谱(HIC),使用填充于由GE Healthcare制造的床高度为15cm且所得管柱体积(CV)为81ml的管柱中的苯基琼脂糖FF低亚树脂(GE Healthcare)来纯化所得PEG-rFVIII缀合物。
通过添加含有350mM氯化钠、8M乙酸铵、5mM氯化钙的50mM Hepes缓冲液(pH 6.9)将乙酸铵搀入反应混合物中。将2体积的反应混合物与1体积的含有乙酸铵的缓冲系统混合且通过逐滴添加0.5N NaOH水溶液将pH值校正至pH 6.9。将此混合物以1cm/分钟的流速加载于HIC管柱上,随后使用>3CV平衡缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、2.5M乙酸铵、5mM氯化钙,pH 6.9)进行洗涤步骤。
为移除反应副产物和抗离液盐,以向上流动模式以2cm/分钟的流速用>5CV洗涤缓冲液1(50mM Hepes、3M氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.9)进行第二个洗涤步骤。接着以向下流动模式以1cm/分钟的流速使用40%洗涤缓冲液2(50mM Hepes、1.5M氯化钠、5mM氯化钙,pH6.9)和60%洗脱缓冲液(20mM Hepes、5mM氯化钙,pH 7.5)的阶段梯度洗脱纯化的rFVIII缀合物。在UV 280nm下监测PEG-rFVIII缀合物的洗脱且收集<4CV的含有缀合物的洗脱液。用>3CV洗脱缓冲液在相同条件下进行后洗脱步骤以自主要产物分离次要和/或未修饰的rFVIII。
最后,通过超滤/透滤(UF/DF),使用由再生纤维素制成且具有分子量截断值30kD的膜(Millipore)浓缩纯化的缀合物。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质和生物活性以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法3:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使rFVIII聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将溶解于6mlHepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中的7.84mg rFVIII与314μl过碘酸钠水溶液(10mM)和1.57ml间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂,产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭,持续15分钟。
最后,通过离子交换色谱,在Q-琼脂糖FF上纯化PEG-rFVIII缀合物。将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)预平衡的管柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物,接着使用30kD膜(88cm2,Millipore)进行UF/DF。通过FVIII产色测定和测定总蛋白质(布莱德法)以分析法表征缀合物,显示与rFVIII起始材料相比,比活性>60%。
方法4:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使rFVIII聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将初始浓度或重量的rFVIII转移至或溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到2mg rFVIII/ml的最终蛋白质浓度。随后,在15分钟内添加5mM过碘酸钠水溶液,得到100μM的最终浓度,随后在30分钟的时段内添加50mM间甲苯胺水溶液,得到10mM的最终浓度。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂(上述),产生20倍摩尔浓度过量。校正pH至6.0后,在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且通过添加1M L-半胱氨酸水溶液以得到10mM的最终浓度来淬灭,持续15分钟。
借助于离子交换色谱(IEC)移除游离rFVIII。用适量缓冲液A(50mM Hepes、5mMCaCl2,pH 7.5)稀释反应混合物以校正溶液传导率和pH值,随后加载于以缓冲液A预平衡的20ml HiPrep QFF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。接着用缓冲液B(50mMHepes、1M NaCl、5mM CaCl2,pH 7.5)洗脱管柱。通过阶段梯度,使用25%缓冲液B洗脱游离rFVIII,使得所得洗脱份的传导率在12-25mS/cm之间,且使用50%缓冲液B的阶段梯度洗脱缀合物,使得缀合物洗脱份的传导率在27-45mS/cm之间。含有缀合物的洗脱份的传导率随后使用缓冲液C(50mM Hepes、5M NaCl、5mM CaCl2,pH 6.9;通过使用抗离液盐,例如硫酸铵、乙酸铵等)升高且加载于以缓冲液D(50mM Hepes、3M NaCl、5mM CaCl2,pH 6.9)预平衡的20ml HiPrep丁基FF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT;类似HIC介质)上。用5CV缓冲液D洗涤出游离PEG-试剂。随后用100%缓冲液E(50mMHepes、5mM CaCl2,pH 7.4)洗脱缀合物。通过UF/DF,使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2,截断值10kD,Millipore)浓缩含有缀合物的洗脱份。针对Hepes缓冲液(50mM Hepes、5mM CaCl2,pH 7.5)进行最后透滤步骤。
通过根据已知方法测量总蛋白质(布莱德法和BCA程序)和生物活性以分析法表征制剂。
实施例14
使用氨氧基-PSA和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使rFVIIa聚唾液酸化
方法1:
将起始浓度或重量的重组因子VIIa(rFVIIa)转移至或溶解于反应缓冲液(50mMHepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5NNaOH水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM过碘酸钠水溶液,得到50μM的浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T=+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应,得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
进一步通过阴离子交换色谱,在EMD TMAE(M)(Merck)上纯化氧化型rFVIIa。用缓冲液A(20mM Hepes、5mM CaCl2,pH 6.5)稀释混合物,得到5ms/cm的传导率。使用1.5cm/分钟的流速将此溶液加载于管柱体积为10ml的IEX管柱(床高度:5.4cm)上。随后用5CV的缓冲液A与缓冲液B(20mM Hepes、5mM CaCl2、1.0M NaCl,pH7.0)的92:8混合物(w/w)洗涤(流速:1.5cm/分钟)此管柱。接着用缓冲液A与缓冲液B的50:50(w/w)混合物洗脱氧化型rFVIIa,随后用5CV缓冲液B进行后洗脱步骤。通过使用1.0cm/分钟的流速进行洗脱步骤。
随后,在最多15分钟的时段(t)内在平缓搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至含有纯化的氧化型rFVIIa的洗脱液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM),得到10mM的最终浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在平缓震荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。
通过疏水性相互作用色谱(HIC),使用填充于由GE Healthcare制造的床高度为15cm且所得管柱体积(CV)为81ml的管柱中的苯基琼脂糖FF低亚树脂(GE Healthcare)来纯化所得PSA-rFVIIa缀合物。
通过添加含有350mM氯化钠、8M乙酸铵、5mM氯化钙的50mM Hepes缓冲液(pH 6.9)将乙酸铵搀入反应混合物中。将2体积的反应混合物与1体积的含有乙酸铵的缓冲系统混合且通过逐滴添加0.5N NaOH水溶液将pH值校正至pH 6.9。将此混合物以1cm/分钟的流速加载于HIC管柱上,随后使用>3CV平衡缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、2.5M乙酸铵、5mM氯化钙,pH 6.9)进行洗涤步骤。
为移除反应副产物和抗离液盐,以向上流动模式以2cm/分钟的流速用>5CV洗涤缓冲液1(50mM Hepes、3M氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.9)进行第二个洗涤步骤。接着以向下流动模式以1cm/分钟的流速使用40%洗涤缓冲液2(50mM Hepes、1.5M氯化钠、5mM氯化钙,pH6.9)和60%洗脱缓冲液(20mM Hepes、5mM氯化钙,pH 7.5)的阶段梯度洗脱纯化的rFVIIa缀合物。在UV 280nm下监测PSA-rFVIIa缀合物的洗脱且收集<4CV的含有缀合物的洗脱液。用>3CV洗脱缓冲液在相同条件下进行后洗脱步骤以自主要产物分离次要和/或未修饰的rFVIIa。
最后,通过超滤/透滤(UF/DF),使用由再生纤维素制成且具有适当分子量截断值的膜(例如10kD MWCO,88cm2,Millipore)浓缩纯化的缀合物。
通过测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法2:
将起始重量或浓度的rFVIIa溶解于或转移至反应缓冲液(50mMHepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N NaOH水溶液将溶液的pH校正至6.0。
随后,在最多15分钟的时段(t)内在平缓搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至此rFVIIa溶液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM),得到10mM的最终浓度。最后,添加40mM过碘酸钠水溶液,得到150μM的浓度。
在T=+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在平缓震荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。接着通过添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应,得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过疏水性相互作用色谱(HIC),使用填充于由GE Healthcare制造的床高度为15cm且所得管柱体积(CV)为81ml的管柱中的苯基琼脂糖FF低亚树脂(GE Healthcare)来纯化所得PSA-rFVIIa缀合物。
通过添加含有350mM氯化钠、8M乙酸铵、5mM氯化钙的50mM Hepes缓冲液(pH 6.9)将乙酸铵搀入反应混合物中。将2体积的反应混合物与1体积的含有乙酸铵的缓冲系统混合且通过逐滴添加0.5N NaOH水溶液将pH值校正至pH 6.9。将此混合物以1cm/分钟的流速加载于HIC管柱上,随后使用>3CV平衡缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、2.5M乙酸铵、5mM氯化钙,pH 6.9)进行洗涤步骤。
为移除反应副产物和抗离液盐,以向上流动模式以2cm/分钟的流速用>5CV洗涤缓冲液1(50mM Hepes、3M氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.9)进行第二个洗涤步骤。接着以向下流动模式以1cm/分钟的流速使用40%洗涤缓冲液2(50mM Hepes、1.5M氯化钠、5mM氯化钙,pH6.9)和60%洗脱缓冲液(20mM Hepes、5mM氯化钙,pH 7.5)的阶段梯度洗脱纯化的rFVIIa缀合物。在UV 280nm下监测PSA-rFVIIa缀合物的洗脱且收集<4CV的含有缀合物的洗脱液。用>3CV洗脱缓冲液在相同条件下进行后洗脱步骤以自主要产物分离次要和/或未修饰的rFVIII。
最后,通过超滤/透滤(UF/DF),使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)浓缩纯化的缀合物。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
实施例15
使用氨氧基-PEG试剂和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使rFIX聚乙二醇化
方法1:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使rFIX聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将起始重量或浓度的rFIX溶解于或转移至反应缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM过碘酸钠水溶液,得到200μM的浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T=+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应,得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
进一步通过阴离子交换色谱,在EMD TMAE(M)(Merck)上纯化氧化型rFVIII。用缓冲液A(20mM Hepes、5mM CaCl2,pH 6.5)稀释混合物,得到5mS/cm的传导率。使用1.5cm/分钟的流速将此溶液加载于管柱体积为10ml的IEX管柱(床高度:5.4cm)上。随后用5CV的缓冲液A与缓冲液B(20mM Hepes、5mM CaCl2、1.0M NaCl,pH7.0)的92:8混合物(w/w)洗涤(流速:1.5cm/分钟)此管柱。接着用缓冲液A与缓冲液B的50:50(w/w)混合物洗脱氧化型rFIX,随后用5CV缓冲液B进行后洗脱步骤。通过使用1.0cm/分钟的流速进行洗脱步骤。
随后,在最多15分钟的时段(t)内在平缓搅拌下将MW为20kD的氨氧基-PEG试剂以50倍摩尔浓度过量添加至含有纯化的氧化型rFIX的洗脱液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM),得到10mM的最终浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在平缓震荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。
通过疏水性相互作用色谱(HIC),使用填充于由GE Healthcare制造的床高度为15cm且所得管柱体积(CV)为81ml的管柱中的苯基琼脂糖FF低亚树脂(GE Healthcare)来纯化所得PEG-rFIX缀合物。
通过添加含有350mM氯化钠、8M乙酸铵、5mM氯化钙的50mM Hepes缓冲液(pH 6.9)将乙酸铵搀入反应混合物中。将2体积的反应混合物与1体积的含有乙酸铵的缓冲系统混合且通过逐滴添加0.5N NaOH水溶液将pH值校正至pH 6.9。将此混合物以1cm/分钟的流速加载于HIC管柱上,随后使用>3CV平衡缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、2.5M乙酸铵、5mM氯化钙,pH 6.9)进行洗涤步骤。
为移除反应副产物和抗离液盐,以向上流动模式以2cm/分钟的流速用>5CV洗涤缓冲液1(50mM Hepes、3M氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.9)进行第二个洗涤步骤。接着以向下流动模式以1cm/分钟的流速使用40%洗涤缓冲液2(50mM Hepes、1.5M氯化钠、5mM氯化钙,pH6.9)和60%洗脱缓冲液(20mM Hepes、5mM氯化钙,pH 7.5)的阶段梯度洗脱纯化的rFIX缀合物。在UV 280nm下监测PEG-rFIX缀合物的洗脱且收集<4CV的含有缀合物的洗脱液。用>3CV洗脱缓冲液在相同条件下进行后洗脱步骤以自主要产物分离次要和/或未修饰的rFIX。
最后,通过超滤/透滤(UF/DF),使用由再生纤维素制成且具有分子量截断值10kD的膜(88cm2,Millipore)浓缩纯化的缀合物。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质和生物活性以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法2:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使rFIX聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将初始浓度或重量的rFIX转移至或溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到2mg rFIX/ml的最终蛋白质浓度。随后,在15分钟内添加5mM过碘酸钠水溶液,得到100μM的最终浓度,随后在30分钟的时段内添加50mM间甲苯胺水溶液,得到10mM的最终浓度。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂(上述),产生20倍摩尔浓度试剂过量。校正pH至6.0后,在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且通过添加1M L-半胱氨酸水溶液以得到10mM的最终浓度来淬灭,持续15分钟。
借助于离子交换色谱(IEC)移除游离rFIX。用适量缓冲液A(50mM Hepes、5mMCaCl2,pH 7.5)稀释反应混合物以校正溶液传导率和pH值,随后加载于以缓冲液A预平衡的20ml HiPrep QFF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。接着用缓冲液B(50mMHepes、1M NaCl、5mM CaCl2,pH 7.5)洗脱管柱。通过阶段梯度,使用25%缓冲液B洗脱游离rFIX,使得所得洗脱份的传导率在12-25mS/cm之间,且使用50%缓冲液B的阶段梯度洗脱缀合物,使得缀合物洗脱份的传导率在27-45mS/cm之间。含有缀合物的洗脱份的传导率随后使用缓冲液C(50mM Hepes、5M NaCl、5mM CaCl2,pH 6.9;通过使用抗离液盐,例如乙酸铵等)升高且加载于以缓冲液D(50mMHepes、3M NaCl、5mM CaCl2,pH 6.9)预平衡的20mlHiPrep丁基FF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT;或类似HIC介质)上。用5CV缓冲液D洗涤出游离氨氧基-PEG试剂。随后用100%缓冲液E(50mM Hepes、5mM CaCl2,pH 7.4)洗脱缀合物。通过UF/DF,使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2,截断值10kD,Millipore)浓缩含有缀合物的洗脱份。针对Hepes缓冲液(50mM Hepes、5mM CaCl2,pH 7.5)进行最后透滤步骤。
通过根据已知方法测量总蛋白质(布莱德法和BCA程序)和生物活性以分析法表征制剂。
实施例16
使用氨氧基-PEG试剂和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使rFVIIa聚乙二醇化
方法1:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使rFVIIa聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将起始重量或浓度的rFVIIa溶解于或转移至反应缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N NaOH水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM过碘酸钠水溶液,得到50μM的浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T=+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应,得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
进一步通过阴离子交换色谱,在EMD TMAE(M)(Merck)上纯化氧化型rFVIIa。用缓冲液A(20mM Hepes、5mM CaCl2,pH 6.5)稀释混合物,得到5mS/cm的传导率。使用1.5cm/分钟的流速将此溶液加载于管柱体积为10ml的IEX管柱(床高度:5.4cm)上。随后用5CV的缓冲液A与缓冲液B(20mM Hepes、5mM CaCl2、1.0M NaCl,pH 7.0)的92:8混合物(w/w)洗涤(流速:1.5cm/分钟)此管柱。接着用缓冲液A与缓冲液B的50:50(w/w)混合物洗脱氧化型rFVIIa,随后用5CV缓冲液B进行后洗脱步骤。通过使用1.0cm/分钟的流速进行洗脱步骤。
随后,在最多15分钟的时段(t)内在平缓搅拌下将MW为20kD的氨氧基-PEG试剂以50倍摩尔浓度过量添加至含有纯化的氧化型rFVIIa的洗脱液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM),得到10mM的最终浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在平缓震荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。
通过疏水性相互作用色谱(HIC),使用填充于由GE Healthcare制造的床高度为15cm且所得管柱体积(CV)为81ml的管柱中的苯基琼脂糖FF低亚树脂(GE Healthcare)来纯化所得PEG-rFVIIa缀合物。
通过添加含有350mM氯化钠、8M乙酸铵、5mM氯化钙的50mM Hepes缓冲液(pH 6.9)将乙酸铵搀入反应混合物中。将2体积的反应混合物与1体积的含有乙酸铵的缓冲系统混合且通过逐滴添加0.5N NaOH水溶液将pH值校正至pH 6.9。将此混合物以1cm/分钟的流速加载于HIC管柱上,随后使用>3CV平衡缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、2.5M乙酸铵、5mM氯化钙,pH 6.9)进行洗涤步骤。
为移除反应副产物和抗离液盐,以向上流动模式以2cm/分钟的流速用>5CV洗涤缓冲液1(50mM Hepes、3M氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.9)进行第二个洗涤步骤。接着以向下流动模式以1cm/分钟的流速使用40%洗涤缓冲液2(50mM Hepes、1.5M氯化钠、5mM氯化钙,pH6.9)和60%洗脱缓冲液(20mM Hepes、5mM氯化钙,pH 7.5)的阶段梯度洗脱纯化的rFVIIa缀合物。在UV 280nm下监测PEG-rFVIIa缀合物的洗脱且收集<4CV的含有缀合物的洗脱液。用>3CV洗脱缓冲液在相同条件下进行后洗脱步骤以自主要产物分离次要和/或未修饰的rFVIIa。
最后,通过超滤/透滤(UF/DF),使用由再生纤维素制成且具有分子量截断值10kD的膜(Millipore)浓缩纯化的缀合物。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质和生物活性以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法2:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使rFVIIa聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将初始浓度或重量的rFVIIa转移至或溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到2mg rFVIIa/ml的最终蛋白质浓度。随后在15分钟内添加5mM过碘酸钠水溶液,得到100μM的最终浓度,随后在30分钟的时段内添加50mM间甲苯胺水溶液,得到10mM的最终浓度。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂(上述),产生20倍摩尔浓度试剂过量。校正pH至6.0后,在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且通过添加1M L-半胱氨酸水溶液以得到10mM的最终浓度来淬灭,持续15分钟。
借助于离子交换色谱(IEC)移除游离rFVIIa。用适量缓冲液A(50mM Hepes、5mMCaCl2,pH 7.5)稀释反应混合物以校正溶液传导率和pH值,随后加载于以缓冲液A预平衡的20ml HiPrep QFF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。接着用缓冲液B(50mMHepes、1M NaCl、5mM CaCl2,pH 7.5)洗脱管柱。通过阶段梯度,使用25%缓冲液B洗脱游离rFVIIa,使得所得洗脱份的传导率在12-25mS/cm之间,且使用50%缓冲液B的阶段梯度洗脱缀合物,使得缀合物洗脱份的传导率在27-45mS/cm之间。含有缀合物的洗脱份的传导率随后使用缓冲液C(50mM Hepes、5M NaCl、5mM CaCl2,pH 6.9;通过使用抗离液盐,例如乙酸铵)升高且加载于以缓冲液D(50mMHepes、3M NaCl、5mM CaCl2,pH 6.9)预平衡的20mlHiPrep丁基FF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT;类似HIC介质)上。用5CV缓冲液D洗涤出游离PEG-试剂。随后用100%缓冲液E(50mM Hepes、5mM CaCl2,pH 7.4)洗脱缀合物。通过UF/DF,使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2,截断值10kD,Millipore)浓缩含有缀合物的洗脱份。针对Hepes缓冲液(50mM Hepes、5mM CaCl2,pH 7.5)进行最后透滤步骤。
通过根据已知方法测量总蛋白质(布莱德法和BCA程序)和生物活性以分析法表征制剂。
实施例17
在邻氨基苯甲酸存在下使rFIX聚唾液酸化
方法1:
将8.2mg rFIX溶解于4.0ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl、5mM CaCl2)中。接着添加82μl过碘酸钠水溶液(5mM)且在4℃下在黑暗中在平缓搅拌下孵育反应混合物1小时,在室温下通过添加4μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭,持续15分钟。随后使用Vivaspin 6 10kD离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
将含有氧化型rFIX的保留物(6.5ml)与1.64ml邻氨基苯甲酸水溶液(50mM)混合且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育此混合物2.5小时。
缀合物的进一步纯化如本文所述进行。
方法2:
制备含有5倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述)的1mg rFIX于0.65ml磷酸钠缓冲液(pH 6.0)中的溶液。接着添加333μl邻氨基苯甲酸水溶液(30mM)作为亲核性催化剂,得到10mM的最终浓度。随后添加20μl NaIO4水溶液(5mM),得到100μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合过程2小时且在室温下通过添加1μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭,持续15分钟。缀合物的进一步纯化如本文所述进行。
实施例18
使用氨氧基-PSA和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使EPO聚唾液酸化
方法1:
将起始浓度的红血球生成素(EPO)转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4,得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行氧化反应30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度:10mM)淬灭反应,持续60分钟。
接着使用Vivaspin离心过滤器对溶液进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物,或在替代性情况下通过以缓冲液A(20mM Hepes、5mM CaCl2,pH 7.0)平衡且体积为20ml的IEX管柱(Merck EMD TMAE(M))。用5CV缓冲液A平衡管柱。用缓冲液B(20mM Hepes、5mM CaCl2、1M NaCl,pH 7.0)洗脱氧化型EPO。收集含有EPO的洗脱份。测定蛋白质含量(库马斯法、布莱德法)且用反应缓冲液调整至1mg/ml并通过逐滴添加0.5M HCl调整至pH 6.0。
添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度:10mM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。借助于HIC移除过量氨氧基-PSA试剂。通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵,pH 6.9)调整反应混合物的传导率且加载于以50mMHepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙(pH 6.9)预平衡且填充有80ml苯基琼脂糖FF的管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。随后用含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA-EPO的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的膜(MWCO10kD,50cm2,Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法1。
将10mg EPO溶解于5ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl)中。接着添加100μl过碘酸钠水溶液(5mM)且在4℃下在黑暗中在平缓搅拌下孵育反应混合物1小时,在室温下通过添加50μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭,持续15分钟。随后使用Vivaspin15R 10kD离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
将含有氧化型EPO的保留物(约7ml)与2ml间甲苯胺水溶液(50mM)混合且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育此混合物2.5小时。
借助于阴离子交换色谱(AEC)移除游离EPO。用20ml缓冲液A(50mM Hepes,pH 7.5)稀释反应混合物且加载于以缓冲液A预平衡的20ml HiPrep QFF 16/10管柱(GEHealthcare,Fairfield,CT)上。接着用缓冲液B(50mM Hepes、1M NaCl,pH 7.5)洗脱管柱。通过用25%缓冲液B洗涤管柱来洗脱游离EPO且用50%缓冲液B洗脱缀合物。含有缀合物的洗脱份的传导率随后使用缓冲液C(50mM Hepes、5M NaCl,pH 6.9)升至约190mS/cm且加载于以缓冲液D(50mM Hepes、3M NaCl,pH 6.9)预平衡的20ml HiPrep丁基FF 16/10管柱(GEHealthcare,Fairfield,CT)上。用5CV缓冲液D洗涤出游离PSA试剂。随后,用100%缓冲液E(50mM Hepes,pH 7.4)洗脱缀合物。通过UF/DF使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2,截断值10kD/Millipore)浓缩含有缀合物的洗脱份。针对含有150mM NaCl的组氨酸缓冲液(pH7.2)进行最后透滤步骤。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。对于PSA-EPO缀合物,与天然EPO相比,测得比活性>50%。另外通过尺寸排阻HPLC,使用装备有Shodex KW 803管柱的Agilent 1200HPLC系统,在如先前所述的条件(Kolarich等,Transfusion2006;46:1959-77)下以分析法表征缀合物。显示制剂不含游离EPO。
方法2:
将EPO转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH6.0)中,得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM过碘酸钠水溶液,得到200μM的浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T=+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应,得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型EPO。收集洗脱液中含有氧化型EPO的洗脱份且用于缀合反应。
在最多15分钟的时段(t)内在平缓搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至含有纯化的氧化型EPO的洗脱液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM),得到10mM的最终浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在平缓震荡下孵育反应混合物120+/-10分钟(蛋白质浓度:1mg/ml)。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PSA-EPO缀合物。收集含有PSA-EPO缀合物的洗脱份并通过超滤/透滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
通过测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法3:
将红血球生成素(EPO)转移至反应缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(10mM最终浓度)和NaIO4(最终浓度:400μM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。随后在室温下用半胱氨酸淬灭反应,持续60分钟(半胱氨酸浓度:10mM)。接着通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mMHepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵,pH 6.9)调整反应混合物的传导率且加载于以50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙、0.01%Tween 80(pH 6.9)预平衡且填充有苯基琼脂糖FF的管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。随后用50mMHepes、5mM氯化钙(pH 7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA-EPO的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的膜(MWCO 10kD,88cm2,Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法3。将10mg EPO溶解于8ml组氨酸缓冲液(pH6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl)中。接着添加200μl过碘酸钠水溶液(5mM)和2ml间甲苯胺水溶液(50mM)。随后添加MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且在室温下通过添加100μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭,持续15分钟。
借助于阴离子交换色谱(AEC)移除游离EPO。用20ml缓冲液A(50mM Hepes,pH 7.5)稀释反应混合物且加载于以缓冲液A预平衡的20ml HiPrep QFF 16/10管柱(GEHealthcare,Fairfield,CT)上。接着用缓冲液B(50mM Hepes、1M NaCl,pH 7.5)洗脱管柱。通过用25%缓冲液B洗涤管柱来洗脱游离EPO且用50%缓冲液B洗脱缀合物。含有缀合物的洗脱份的传导率随后使用缓冲液C(50mM Hepes、5M NaCl,pH 6.9)升至约190mS/cm且加载于以缓冲液D(50mM Hepes、3M NaCl,pH 6.9)预平衡的20ml HiPrep丁基FF 16/10管柱(GEHealthcare,Fairfield,CT)上。用5CV缓冲液D洗涤出游离PSA试剂。随后,用100%缓冲液E(50mM Hepes,pH 7.4)洗脱缀合物。通过UF/DF,使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2,截断值10kD,Millipore)浓缩含有缀合物的洗脱份。针对含有150mM NaCl的组氨酸缓冲液(pH 7.2)进行最后透滤步骤。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。对于PSA-EPO缀合物,与天然EPO相比,测得比活性>50%。另外通过尺寸排阻HPLC,使用装备有Shodex KW 803管柱的Agilent 1200HPLC系统,在如先前所述的条件(Kolarich等,Transfusion2006;46:1959-77)下以分析法表征缀合物。显示制剂不含游离EPO。方法4:
将EPO溶解于或转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH6.0)中,得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。
随后,在最多15分钟的时段(t)内在平缓搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至此EPO溶液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM),得到10mM的最终浓度。最后,添加40mM过碘酸钠水溶液,得到400μM的浓度。
在T=+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在平缓震荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。接着通过添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应,得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱纯化所得PSA-EPO缀合物。收集洗脱液中含有PSA-EPO的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的膜(MWCO 10kD,88cm2,Millipore)进行超滤/透滤(UF/DF)来浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
实施例19
使用氨氧基-PSA和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使Ang-2聚唾液酸化
方法1:
将起始浓度的促血管生成素-2(Ang-2)转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4,得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行氧化反应30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度:10mM)淬灭反应,持续60分钟。
接着使用Vivaspin离心过滤器对溶液进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物,或在替代性情况下通过以缓冲液A(20mM Hepes、5mM CaCl2,pH 7.0)平衡且体积为20ml的IEX管柱(Merck EMD TMAE(M))。用5CV缓冲液A平衡管柱。用缓冲液B(20mM Hepes、5mM CaCl2、1M NaCl,pH 7.0)洗脱氧化型Ang-2。收集含有Ang-2的洗脱份。测定蛋白质含量(库马斯法、布莱德法)且用反应缓冲液调整至1mg/ml并通过逐滴添加0.5M HCl调整至pH6.0。
添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度:10mM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。借助于HIC移除过量氨氧基试剂。通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵,pH 6.9)调整反应混合物的传导率且加载于以50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙(pH 6.9)预平衡且填充有80ml苯基琼脂糖FF的管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。随后用含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA-Ang-2的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法1。将促血管生成素-2(Ang-2)转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4,得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行氧化反应30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度:10mM)淬灭反应,持续60分钟。
接着使用Vivaspin离心过滤器对溶液进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度:10mM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。借助于离子交换色谱移除过量氨氧基试剂。收集洗脱液中含有PSA-Ang-2缀合物的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法2:
将Ang-2转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM过碘酸钠水溶液,得到200μM的浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T=+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应,得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型Ang-2。收集洗脱液中含有氧化型Ang-2的洗脱份且用于缀合反应。
在最多15分钟的时段(t)内在平缓搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至含有纯化的氧化型Ang-2的洗脱液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM),得到10mM的最终浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在平缓震荡下孵育反应混合物120+/-10分钟(蛋白质浓度:1mg/ml)。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PSA-Ang-2缀合物。
收集含有PSA-Ang-2缀合物的洗脱份并通过超滤/透滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
通过测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法3:
将促血管生成素-2(Ang-2)转移至反应缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的PSA氨氧基试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(10mM最终浓度)和NaIO4(最终浓度:400μM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。随后在室温下用半胱氨酸淬灭反应,持续60分钟(半胱氨酸浓度:10mM)。接着通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵,pH 6.9)调整反应混合物的传导率且加载于以50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙、0.01%Tween 80(pH 6.9)预平衡且填充有苯基琼脂糖FF的管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。随后用50mM Hepes、5mM氯化钙(pH 7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA Ang-2的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法3。将促血管生成素-2(Ang-2)转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的PSA氨氧基试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(10mM最终浓度)和NaIO4(最终浓度:400μM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。随后,在室温下用半胱氨酸淬灭反应,持续60分钟(半胱氨酸浓度:10mM)且通过离子交换色谱纯化缀合物。收集洗脱液中含有PSAAng-2的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法4:
将Ang-2溶解于或转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。
随后,在最多15分钟的时段(t)内在平缓搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至此Ang-2溶液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM),得到10mM的最终浓度。最后,添加40mM过碘酸钠水溶液,得到400μM的浓度。
在T=+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在平缓震荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。接着通过添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应,得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱纯化所得PSA-Ang-2缀合物。收集洗脱液中含有PSA-Ang-2的洗脱份且通过超滤/透滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
实施例20
使用氨氧基-PSA和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使VEGF聚唾液酸化
方法1:
将起始浓度的血管内皮生长因子(VEGF)转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4,得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行氧化反应30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度:10mM)淬灭反应,持续60分钟。
接着使用Vivaspin离心过滤器对溶液进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物,或在替代性情况下通过以缓冲液A(20mM Hepes、5mM CaCl2,pH 7.0)平衡且体积为20ml的IEX管柱(Merck EMD TMAE(M))。用5CV缓冲液A平衡管柱。用缓冲液B(20mM Hepes、5mM CaCl2、1M NaCl,pH 7.0)洗脱氧化型VEGF。收集含有VEGF的洗脱份。测定蛋白质含量(库马斯法、布莱德法)且用反应缓冲液调整至1mg/ml并通过逐滴添加0.5M NaOH调整至pH6.0。
添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度:10mM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。借助于HIC移除过量氨氧基试剂。通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵,pH 6.9)调整反应混合物的传导率且加载于以50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙(pH 6.9)预平衡且填充有80ml苯基琼脂糖FF的管柱(GEHealthcare,Fairfield,CT)上。随后用含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA-VEGF的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法1。将血管内皮生长因子(VEGF)转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4,得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行氧化反应30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度:10mM)淬灭反应,持续60分钟。
接着使用Vivaspin离心过滤器对溶液进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度:10mM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。借助于离子交换色谱移除过量氨氧基试剂。收集洗脱液中含有PSA-VEGF的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法2:
将VEGF转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM过碘酸钠水溶液,得到200μM的浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T=+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应,得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型VEGF。收集洗脱液中含有氧化型VEGF的洗脱份且用于缀合反应。
在最多15分钟的时段(t)内在平缓搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至含有纯化的氧化型VEGF的洗脱液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM),得到10mM的最终浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在平缓震荡下孵育反应混合物120+/-10分钟(蛋白质浓度:1mg/ml)。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PSA-VEGF缀合物。收集含有PSA-VEGF缀合物的洗脱份并通过超滤/透滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
通过测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法3:
将血管内皮生长因子(VEGF)转移至反应缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的PSA氨氧基试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(10mM最终浓度)和NaIO4(最终浓度:400μM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。随后在室温下用半胱氨酸淬灭反应,持续60分钟(半胱氨酸浓度:10mM)。接着通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵,pH 6.9)调整反应混合物的传导率且加载于以50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙、0.01%Tween 80(pH 6.9)预平衡且填充有苯基琼脂糖FF的管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。随后用50mM Hepes、5mM氯化钙(pH 7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA-VEGF的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法3。将血管内皮生长因子(VEGF)转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(10mM最终浓度)和NaIO4(最终浓度:400μM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。随后,在室温下用半胱氨酸淬灭反应,持续60分钟(半胱氨酸浓度:10mM)且通过离子交换色谱纯化缀合物。收集洗脱液中含有PSA-VEGF的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法4:
将VEGF溶解于或转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。
随后,在最多15分钟的时段(t)内在平缓搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至此VEGF溶液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM),得到10mM的最终浓度。最后,添加40mM过碘酸钠水溶液,得到400μM的浓度。
在T=+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在平缓震荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。接着通过添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应,得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱纯化所得VEGF-缀合物。收集洗脱液中含有PSA-VEGF的洗脱份且通过超滤/透滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
实施例21
使用氨氧基-PSA和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使EGF聚唾液酸化
方法1:
将起始浓度的表皮生长因子(EGF)转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4,得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行氧化反应30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度:10mM)淬灭反应,持续60分钟。
接着使用Vivaspin离心过滤器对溶液进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物,或在替代性情况下通过以缓冲液A(20mM Hepes、5mM CaCl2,pH 7.0)平衡且体积为20ml的IEX管柱(Merck EMD TMAE(M))。用5CV缓冲液A平衡管柱。用缓冲液B(20mM Hepes、5mM CaCl2、1M NaCl,pH 7.0)洗脱氧化型EGF。收集含有EGF的洗脱份。测定蛋白质含量(库马斯法、布莱德法)且用反应缓冲液调整至1mg/ml并通过逐滴添加0.5M HCl调整至pH 6.0。
添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度:10mM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。借助于HIC移除过量氨氧基试剂。通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵,pH 6.9)调整反应混合物的传导率且加载于以50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙(pH 6.9)预平衡且填充有80ml苯基琼脂糖FF的管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。随后用含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA-EGF的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法1。将表皮生长因子(EGF)转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4,得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行氧化30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度:10mM)淬灭反应,持续60分钟。
接着使用Vivaspin离心过滤器对溶液进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度:10mM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。借助于离子交换色谱移除过量氨氧基试剂。收集洗脱液中含有PSA-EGF的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法2:
将EGF转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH6.0)中,得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM过碘酸钠水溶液,得到200μM的浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T=+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应,得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型EGF。收集洗脱液中含有氧化型EGF的洗脱份且用于缀合反应。
在最多15分钟的时段(t)内在平缓搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至含有纯化的氧化型EGF的洗脱液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM),得到10mM的最终浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)和pH6.0下在黑暗中在平缓震荡下孵育反应混合物120+/-10分钟(蛋白质浓度:1mg/ml)。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PSA-EGF缀合物。收集含有PSA-EGF缀合物的洗脱份并通过超滤/透滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
通过测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。方法3:
将表皮生长因子(EGF)转移至反应缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的PSA氨氧基试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(10mM最终浓度)和NaIO4(最终浓度:400μM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。随后在室温下用半胱氨酸淬灭反应,持续60分钟(半胱氨酸浓度:10mM)。接着通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mMHepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵,pH 6.9)调整反应混合物的传导率且加载于以50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙、0.01%Tween 80(pH 6.9)预平衡且填充有苯基琼脂糖FF的管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。随后用50mM Hepes、5mM氯化钙(pH 7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA-EGF的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法3。将表皮生长因子(EGF)转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的PSA氨氧基试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(10mM最终浓度)和NaIO4(最终浓度:400μM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。随后,在室温下用半胱氨酸淬灭反应,持续60分钟(半胱氨酸浓度:10mM)且通过离子交换色谱纯化缀合物。收集洗脱液中含有缀合物的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法4:
将EGF溶解于或转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH6.0)中,得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。
随后,在最多15分钟的时段(t)内在平缓搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至此EGF溶液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM),得到10mM的最终浓度。最后,添加40mM过碘酸钠水溶液,得到400μM的浓度。
在T=+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在平缓震荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。接着通过添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应,得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱纯化所得EGF-缀合物。收集洗脱液中含有PSA-EGF的洗脱份且通过超滤/透滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
实施例22
使用氨氧基-PSA和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使NGF聚唾液酸化
方法1:
将起始浓度的神经生长因子(NGF)转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4,得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行氧化30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度:10mM)淬灭反应,持续60分钟。
接着使用Vivaspin离心过滤器对溶液进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物,或在替代性情况下通过以缓冲液A(20mM Hepes、5mM CaCl2,pH 7.0)平衡且体积为20ml的IEX管柱(Merck EMD TMAE(M))。用5CV缓冲液A平衡管柱。用缓冲液B(20mM Hepes、5mM CaCl2、1M NaCl,pH 7.0)洗脱氧化型NGF。收集含有NGF的洗脱份。测定蛋白质含量(库马斯法、布莱德法)且用反应缓冲液调整至1mg/ml并通过逐滴添加0.5M HCl调整至pH 6.0。
添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度:10mM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。借助于HIC移除过量氨氧基试剂。通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵,pH 6.9)调整反应混合物的传导率且加载于以50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙(pH 6.9)预平衡且填充有80ml苯基琼脂糖FF的管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。随后用含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA-NGF的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法1。将神经生长因子(NGF)转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4,得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行氧化反应30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度:10mM)淬灭反应,持续60分钟。
接着使用Vivaspin离心过滤器对溶液进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度:10mM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。借助于离子交换色谱移除过量氨氧基试剂。收集洗脱液中含有PSA-NGF的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法2:
将NGF转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH6.0)中,得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM过碘酸钠水溶液,得到200μM的浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T=+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应,得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型NGF。收集洗脱液中含有氧化型NGF的洗脱份且用于缀合反应。
在最多15分钟的时段(t)内在平缓搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至含有纯化的氧化型NGF的洗脱液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM),得到10mM的最终浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在平缓震荡下孵育反应混合物120+/-10分钟(蛋白质浓度:1mg/ml)。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PSA-NGF缀合物。收集含有PSA-NGF缀合物的洗脱份并通过超滤/透滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
通过测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。方法3:
将神经生长因子(NGF)转移至反应缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(10mM最终浓度)和NaIO4(最终浓度:400μM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。随后在室温下用半胱氨酸淬灭反应,持续60分钟(半胱氨酸浓度:10mM)。接着通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵,pH 6.9)调整反应混合物的传导率且加载于以50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙、0.01%Tween 80(pH 6.9)预平衡且填充有苯基琼脂糖FF的管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。随后用50mM Hepes、5mM氯化钙(pH 7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA-NGF的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法3。将神经生长因子(NGF)转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(10mM最终浓度)和NaIO4(最终浓度:400μM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。随后,在室温下用半胱氨酸淬灭反应,持续60分钟(半胱氨酸浓度:10mM)且通过离子交换色谱纯化缀合物。接着收集洗脱液中含有PSA-NGF的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法4:
将NGF溶解于或转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH6.0)中,得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。
随后,在最多15分钟的时段(t)内在平缓搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至此NGF溶液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM),得到10mM的最终浓度。最后,添加40mM过碘酸钠水溶液,得到400μM的浓度。
在T=+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在平缓震荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。接着通过添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应,得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱纯化所得NGF-缀合物。收集洗脱液中含有PSA-NGF的洗脱份且通过超滤/透滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
实施例23
使用氨氧基-PSA和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使HGH聚唾液酸化
方法1:
如本文所述,人生长激素(HGH)的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后,根据所属领域中已知的方法活体外使HGH糖基化。
将起始浓度的人生长激素(HGH)转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4,得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行氧化反应30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度:10mM)淬灭反应,持续60分钟。
接着使用Vivaspin离心过滤器对溶液进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物,或在替代性情况下通过以缓冲液A(20mM Hepes、5mM CaCl2,pH 7.0)平衡且体积为20ml的IEX管柱(Merck EMD TMAE(M))。用5CV缓冲液A平衡管柱。用缓冲液B(20mM Hepes、5mM CaCl2、1M NaCl,pH 7.0)洗脱氧化型HGH。收集含有HGH的洗脱份。测定蛋白质含量(库马斯法、布莱德法)且用反应缓冲液调整至1mg/ml并通过逐滴添加0.5M HCl调整至pH 6.0。
添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度:10mM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。借助于HIC移除过量氨氧基试剂。通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵,pH 6.9)调整反应混合物的传导率且加载于以50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙(pH 6.9)预平衡且填充有80ml苯基琼脂糖FF的管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。随后用含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA-HGH的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法1。如本文所述,人生长激素(HGH)的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后,根据所属领域中已知的方法活体外使HGH糖基化。将HGH转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4,得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行氧化反应30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度:10mM)淬灭反应,持续60分钟。
接着使用Vivaspin离心过滤器对溶液进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度:10mM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。借助于离子交换色谱移除过量氨氧基试剂。收集洗脱液中含有PSA-HGH的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法2:
如本文所述,人生长激素(HGH)的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后,根据所属领域中已知的方法活体外使HGH糖基化。
将HGH转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH6.0)中,得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM过碘酸钠水溶液,得到200μM的浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T=+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应,得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型HGH。收集洗脱液中含有氧化型HGH的洗脱份且用于缀合反应。
在最多15分钟的时段(t)内在平缓搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至含有纯化的氧化型HGH的洗脱液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM),得到10mM的最终浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在平缓震荡下孵育反应混合物120+/-10分钟(蛋白质浓度:1mg/ml)。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PSA-HGH缀合物。收集含有PSA-HGH缀合物的洗脱份并通过超滤/透滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
通过测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法3:
如本文所述,人生长激素(HGH)的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后,根据所属领域中已知的方法活体外使HGH糖基化。
将人生长激素(HGH)转移至反应缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(10mM最终浓度)和NaIO4(最终浓度:400μM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。随后在室温下用半胱氨酸淬灭反应,持续60分钟(半胱氨酸浓度:10mM)。接着通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mMHepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵,pH 6.9)调整反应混合物的传导率且加载于以50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙、0.01%Tween 80(pH 6.9)预平衡且填充有苯基琼脂糖FF的管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。随后用50mM Hepes、5mM氯化钙(pH 7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA HGH的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法3。如本文所述,人生长激素(HGH)的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后,根据所属领域中已知的方法活体外使HGH糖基化。将HGH转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(10mM最终浓度)和NaIO4(最终浓度:400μM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。随后,在室温下用半胱氨酸淬灭反应,持续60分钟(半胱氨酸浓度:10mM)且通过离子交换色谱纯化缀合物。接着收集洗脱液中含有PSA-HGH的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法4:
如本文所述,人生长激素(HGH)的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后,根据所属领域中已知的方法活体外使HGH糖基化。
将HGH溶解于或转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH6.0)中,得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。
随后,在最多15分钟的时段(t)内在平缓搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至此HGH溶液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM),得到10mM的最终浓度。最后,添加40mM过碘酸钠水溶液,得到400μM的浓度。
在T=+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在平缓震荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。接着通过添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应,得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱纯化所得HGH-缀合物。收集洗脱液中含有PSA-HGH的洗脱份且通过超滤/透滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
实施例24
使用氨氧基-PSA和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使TNF-α聚唾液酸化
将起始浓度的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4,得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行氧化反应30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度:10mM)淬灭反应,持续60分钟。
接着使用Vivaspin离心过滤器对溶液进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物,或在替代性情况下通过以缓冲液A(20mM Hepes、5mM CaCl2,pH 7.0)平衡且体积为20ml的IEX管柱(Merck EMD TMAE(M))。用5CV缓冲液A平衡管柱。用缓冲液B(20mM Hepes、5mM CaCl2、1M NaCl,pH 7.0)洗脱氧化型TNF-α。收集含有TNF-α的洗脱份。测定蛋白质含量(库马斯法、布莱德法)且用反应缓冲液调整至1mg/ml并通过逐滴添加0.5M HCl调整至pH6.0。
添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度:10mM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。借助于HIC移除过量氨氧基试剂。通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵,pH 6.9)调整反应混合物的传导率且加载于以50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙(pH 6.9)预平衡且填充有80ml苯基琼脂糖FF的管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。随后用含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA-TNF-α的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法1。将肿瘤坏死因子-α(TNF-α)转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4,得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行氧化反应30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度:10mM)淬灭反应,持续60分钟。
接着使用Vivaspin离心过滤器对溶液进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度:10mM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。借助于离子交换色谱移除过量氨氧基试剂。收集洗脱液中含有PSA-TNF-α的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法2:
将TNF-α转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM过碘酸钠水溶液,得到200μM的浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T=+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应,得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型TNF-α。收集洗脱液中含有氧化型TNF-α的洗脱份且用于缀合反应。
在最多15分钟的时段(t)内在平缓搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至含有纯化的氧化型TNF-α的洗脱液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM),得到10mM的最终浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在平缓震荡下孵育反应混合物120+/-10分钟(蛋白质浓度:1mg/ml)。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PSA-TNF-α缀合物。收集含有PSA-TNF-α缀合物的洗脱份并通过超滤/透滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
通过测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。方法3:
将肿瘤坏死因子-α(TNF-α)转移至反应缓冲液(例如50mMHepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(10mM最终浓度)和NaIO4(最终浓度:400μM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。随后在室温下用半胱氨酸淬灭反应,持续60分钟(半胱氨酸浓度:10mM)。接着通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵,pH 6.9)调整反应混合物的传导率且加载于以50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙、0.01%Tween 80(pH6.9)预平衡且填充有苯基琼脂糖FF的管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。随后用50mMHepes、5mM氯化钙(pH 7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA-TNF-α的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法3。将肿瘤坏死因子-α(TNF-α)转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(10mM最终浓度)和NaIO4(最终浓度:400μM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。随后,在室温下用半胱氨酸淬灭反应,持续60分钟(半胱氨酸浓度:10mM)且通过离子交换色谱纯化缀合物。收集洗脱液中含有PSA-TNF-α的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法4:
将TNF-α溶解于或转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。
随后,在最多15分钟的时段(t)内在平缓搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至此TNF-α溶液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM),得到10mM的最终浓度。最后,添加40mM过碘酸钠水溶液,得到400μM的浓度。
在T=+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在平缓震荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。接着通过添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应,得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱纯化所得TNF-α缀合物。收集洗脱液中含有PSA-TNF-α的洗脱份且通过超滤/透滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
实施例25
使用氨氧基-PSA和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使胰岛素聚唾液酸化
方法1:
如本文所述,胰岛素的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后,根据所属领域中已知的方法活体外使胰岛素糖基化。将起始浓度的胰岛素转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4,得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行氧化反应30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度:10mM)淬灭反应,持续60分钟。
接着使用Vivaspin离心过滤器对溶液进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物,或在替代性情况下通过以缓冲液A(20mM Hepes、5mM CaCl2,pH 7.0)平衡且体积为20ml的IEX管柱(Merck EMD TMAE(M))。用5CV缓冲液A平衡管柱。用缓冲液B(20mM Hepes、5mM CaCl2、1M NaCl,pH 7.0)洗脱氧化型胰岛素。收集含有胰岛素的洗脱份。测定蛋白质含量(库马斯法、布莱德法)且用反应缓冲液调整至1mg/ml并通过逐滴添加0.5M HCl调整至pH6.0。
添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度:10mM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。借助于HIC移除过量氨氧基试剂。通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵,pH 6.9)调整反应混合物的传导率且加载于以50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙(pH 6.9)预平衡且填充有80ml苯基琼脂糖FF的管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。随后用含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA-胰岛素的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法1。如本文所述,胰岛素的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后,根据所属领域中已知的方法活体外使胰岛素糖基化。将胰岛素转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4,得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行氧化反应30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度:10mM)淬灭反应,持续60分钟。
接着使用Vivaspin离心过滤器对溶液进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度:10mM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。借助于离子交换色谱移除过量氨氧基试剂。收集洗脱液中含有PSA-胰岛素的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法2:
如本文所述,胰岛素的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后,根据所属领域中已知的方法活体外使胰岛素糖基化。
将胰岛素转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM过碘酸钠水溶液,得到200μM的浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T=+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应,得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型胰岛素。收集洗脱液中含有氧化型胰岛素的洗脱份且用于缀合反应。
在最多15分钟的时段(t)内在平缓搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至含有纯化的氧化型胰岛素的洗脱液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM),得到10mM的最终浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在pH 6.0下在平缓震荡下孵育反应混合物120+/-10分钟(蛋白质浓度:1mg/ml)。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PSA-胰岛素缀合物。收集含有PSA-胰岛素缀合物的洗脱份并通过超滤/透滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
通过测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法3:
如本文所述,胰岛素的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后,根据所属领域中已知的方法活体外使胰岛素糖基化。
将胰岛素转移至反应缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(10mM最终浓度)和NaIO4(最终浓度:400μM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。随后在室温下用半胱氨酸淬灭反应,持续60分钟(半胱氨酸浓度:10mM)。接着通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵,pH 6.9)调整反应混合物的传导率且加载于以50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙、0.01%Tween 80(pH 6.9)预平衡且填充有苯基琼脂糖FF的管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。随后用50mM Hepes、5mM氯化钙(pH 7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA-胰岛素的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法3。如本文所述,胰岛素的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后,根据所属领域中已知的方法活体外使胰岛素糖基化。
将胰岛素转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(10mM最终浓度)和NaIO4(最终浓度:400μM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。随后,在室温下用半胱氨酸淬灭反应,持续60分钟(半胱氨酸浓度:10mM)且通过离子交换色谱纯化缀合物。收集洗脱液中含有PSA-胰岛素的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法4:
如本文所述,胰岛素的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后,根据所属领域中已知的方法活体外使胰岛素糖基化。
将胰岛素溶解于或转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。
随后,在最多15分钟的时段(t)内在平缓搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至此胰岛素溶液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM),得到10mM的最终浓度。最后,添加40mM过碘酸钠水溶液,得到400μM的浓度。
在T=+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在平缓震荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。接着通过添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应,得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱纯化所得胰岛素缀合物。收集洗脱液中含有PSA-胰岛素的洗脱份且通过超滤/透滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
实施例26
使用氨氧基-PSA和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使干扰素-α聚唾液酸化
方法1:
将起始浓度的干扰素-α转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4,得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行氧化反应30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度:10mM)淬灭反应,持续60分钟。
接着使用Vivaspin离心过滤器对溶液进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物,或在替代性情况下通过以缓冲液A(20mM Hepes、5mM CaCl2,pH 7.0)平衡且体积为20ml的IEX管柱(Merck EMD TMAE(M))。用5CV缓冲液A平衡管柱。用缓冲液B(20mM Hepes、5mM CaCl2、1M NaCl,pH 7.0)洗脱氧化型干扰素-α。收集含有干扰素-α的洗脱份。测定蛋白质含量(库马斯法、布莱德法)且用反应缓冲液调整至1mg/ml并通过逐滴添加0.5M HCl调整至pH6.0。
添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度:10mM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。借助于HIC移除过量氨氧基试剂。通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵,pH 6.9)调整反应混合物的传导率且加载于以50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙(pH 6.9)预平衡且填充有80ml苯基琼脂糖FF的管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。随后用含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA-干扰素-α的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法1。将干扰素-α转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4,得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行氧化反应30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度:10mM)淬灭反应,持续60分钟。
接着使用Vivaspin离心过滤器对溶液进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度:10mM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。借助于离子交换色谱移除过量氨氧基试剂。收集洗脱液中含有PSA-干扰素-α的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法2:
将干扰素-α转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM过碘酸钠水溶液,得到200μM的浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T=+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应,得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型干扰素-α。收集洗脱液中含有氧化型干扰素-α的洗脱份且用于缀合反应。
在最多15分钟的时段(t)内在平缓搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至含有纯化的氧化型干扰素-γ的洗脱液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM),得到10mM的最终浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)和pH6.0下在黑暗中在平缓震荡下孵育反应混合物120+/-10分钟(蛋白质浓度:1mg/ml)。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PSA-干扰素-α缀合物。收集含有PSA-干扰素-α缀合物的洗脱份并通过超滤/透滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
方法3:
将干扰素-α转移至反应缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的PSA氨氧基试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(10mM最终浓度)和NaIO4(最终浓度:400μM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。随后在室温下用半胱氨酸淬灭反应,持续60分钟(半胱氨酸浓度:10mM)。接着通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵,pH 6.9)调整反应混合物的传导率且加载于以50mMHepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙、0.01%Tween 80(pH 6.9)预平衡且填充有苯基琼脂糖FF的管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。随后用50mM Hepes、5mM氯化钙(pH7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA-干扰素-α的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法3。将干扰素-α转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(10mM最终浓度)和NaIO4(最终浓度:400μM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。随后,在室温下用半胱氨酸淬灭反应,持续60分钟(半胱氨酸浓度:10mM)且通过离子交换色谱纯化缀合物。收集洗脱液中含有PSA-干扰素-α的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法4:
将干扰素-α溶解于或转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。
随后,在最多15分钟的时段(t)内在平缓搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至此干扰素-α溶液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM),得到10mM的最终浓度。最后,添加40mM过碘酸钠水溶液,得到400μM的浓度。
在T=+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在平缓震荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。接着通过添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应,得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱纯化所得干扰素-α缀合物。收集洗脱液中含有PSA-干扰素-α的洗脱份且通过超滤/透滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
实施例27
使用氨氧基-PSA和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使干扰素-γ聚唾液酸化
方法1:
将10mg干扰素-γ溶解于5ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mMNaCl)中。接着添加100μl过碘酸钠水溶液(5mM)且在4℃下在黑暗中在平缓搅拌下孵育反应混合物1小时,在室温下通过添加50μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭,持续15分钟。随后使用Vivaspin 15R 10kD离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
将含有氧化型干扰素-γ的保留物(约7ml)与2ml间甲苯胺水溶液(50mM)混合且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育此混合物2.5小时。
借助于阳离子交换色谱(cation exchange chromatography,CEC)移除游离干扰素-γ。用20ml缓冲液A(50mM Hepes,pH 6.5)稀释反应混合物且加载于以缓冲液A预平衡的20ml HiPrep SPFF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。接着用缓冲液B(50mMHepes、1MNaCl,pH 6.5)洗脱管柱。通过用25%缓冲液B洗涤管柱来洗脱游离干扰素-γ且用50%缓冲液B洗脱缀合物。含有缀合物的洗脱份的传导率随后使用缓冲液C(50mM Hepes、5MNaCl,pH 6.9)升至约190mS/cm且加载于以缓冲液D(50mM Hepes、3M NaCl,pH 6.9)预平衡的20ml HiPrep丁基FF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。用5CV缓冲液D洗涤出游离PSA试剂。随后,用100%缓冲液E(50mM Hepes,pH 6.9)洗脱缀合物。通过UF/DF,使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2,截断值10kD,Millipore)浓缩含有缀合物的洗脱份。针对含有150mM NaCl的组氨酸缓冲液(pH 6.9)进行最后透滤步骤。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。对于PSA-干扰素-γ缀合物,与天然干扰素-γ相比,测得比活性>50%。另外通过尺寸排阻HPLC,使用装备有ShodexKW 803管柱的Agilent 1200HPLC系统,在如先前所述的条件(Kolarich等,Transfusion2006;46:1959-77)下以分析法表征缀合物。显示制剂不含游离干扰素γ。
方法2:
将10mg干扰素-γ溶解于8ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mMNaCl)中。接着添加200μl过碘酸钠水溶液(5mM)和2ml间甲苯胺水溶液(50mM)。随后添加MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且在室温下通过添加100μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭,持续15分钟。
借助于阳离子交换色谱(CEC)移除游离干扰素γ。用20ml缓冲液A(50mM Hepes,pH6.5)稀释反应混合物且加载于以缓冲液A预平衡的20ml HiPrep SPFF 16/10管柱(GEHealthcare,Fairfield,CT)上。接着用缓冲液B(50mM Hepes、1M NaCl,pH 6.5)洗脱管柱。通过用25%缓冲液B洗涤管柱来洗脱游离干扰素-γ且用50%缓冲液B洗脱缀合物。含有缀合物的洗脱份的传导率随后使用缓冲液C(50mM Hepes、5M NaCl,pH 6.9)升至约190mS/cm且加载于以缓冲液D(50mM Hepes、3M NaCl,pH 6.9)预平衡的20ml HiPrep丁基FF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。用5CV缓冲液D洗涤出游离PSA试剂。随后,用100%缓冲液E(50mM Hepes,pH 6.9)洗脱缀合物。通过UF/DF/使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2,截断值10kD/Millipore)浓缩含有缀合物的洗脱份。针对含有150mM NaCl的组氨酸缓冲液(pH 6.9)进行最后透滤步骤。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。对于PSA干扰素-γ缀合物,与天然干扰素-γ相比,测得比活性>50%。另外通过尺寸排阻HPLC,使用装备有Shodex KW 803管柱的Agilent1200HPLC系统,在如先前所述的条件(Kolarich等,Transfusion2006;46:1959-77)下以分析法表征缀合物。显示制剂不含游离干扰素-γ。
方法3:
将10mg干扰素-γ溶解于8ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mMNaCl)中。接着添加200μl过碘酸钠水溶液(5mM)和2ml间甲苯胺水溶液(50mM)。随后添加MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且在室温下通过添加100μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭,持续15分钟。
借助于阳离子交换色谱(CEC)移除游离干扰素γ。用20ml缓冲液A(50mM Hepes,pH6.5)稀释反应混合物且加载于以缓冲液A预平衡的20ml HiPrep SPFF 16/10管柱(GEHealthcare,Fairfield,CT)上。接着用缓冲液B(50mM Hepes、1M NaCl,pH 6.5)洗脱管柱。通过用25%缓冲液B洗涤管柱来洗脱游离干扰素-γ且用50%缓冲液B洗脱缀合物。含有缀合物的洗脱份的传导率随后使用缓冲液C(50mM Hepes、5M NaCl,pH 6.9)升至约190mS/cm且加载于以缓冲液D(50mM Hepes、3M NaCl,pH 6.9)预平衡的20ml HiPrep丁基FF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。用5CV缓冲液D洗涤出游离PSA试剂。随后,用100%缓冲液E(50mM Hepes,pH 6.9)洗脱缀合物。通过UF/DF/使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2,截断值10kD/Millipore)浓缩含有缀合物的洗脱份。针对含有150mM NaCl的组氨酸缓冲液(pH 6.9)进行最后透滤步骤。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。对于PSA干扰素-γ缀合物,与天然干扰素-γ相比,测得比活性>50%。另外通过尺寸排阻HPLC,使用装备有Shodex KW 803管柱的Agilent1200HPLC系统,在如先前所述的条件(Kolarich等,Transfusion2006;46:1959-77)下以分析法表征缀合物。显示制剂不含游离干扰素-γ。
方法4:
将干扰素-γ溶解于或转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。
随后,在最多15分钟的时段(t)内在平缓搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至此干扰素-γ溶液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM),得到10mM的最终浓度。最后,添加40mM过碘酸钠水溶液,得到400μM的浓度。
在T=+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在平缓震荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。接着通过添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应,得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱纯化所得干扰素-γ缀合物。收集洗脱液中含有PSA-干扰素-γ的洗脱份且通过超滤/透滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
实施例28
使用氨氧基-PSA和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使G-CSF聚唾液酸化
方法1:
将起始浓度的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4,得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行氧化反应30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度:10mM)淬灭反应,持续60分钟。
接着使用Vivaspin离心过滤器对溶液进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物,或在替代性情况下通过以缓冲液A(20mM Hepes、5mM CaCl2,pH 7.0)平衡且体积为20ml的IEX管柱(Merck EMD TMAE(M))。用5CV缓冲液A平衡管柱。用缓冲液B(20mM Hepes、5mM CaCl2、1M NaCl,pH 7.0)洗脱氧化型G-CSF。收集含有G-CSF的洗脱份。测定蛋白质含量(库马斯法、布莱德法)且用反应缓冲液调整至1mg/ml并通过逐滴添加0.5M HCl调整至pH6.0。
添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度:10mM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。借助于HIC移除过量氨氧基试剂。通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵,pH 6.9)调整反应混合物的传导率且加载于以50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙(pH 6.9)预平衡且填充有80ml苯基琼脂糖FF的管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。随后用含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA-G-CSF的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法1。将粒细胞集落刺激因子(G-CSF)转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4,得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行氧化反应30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度:10mM)淬灭反应,持续60分钟。
接着使用Vivaspin离心过滤器对溶液进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度:10mM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。借助于离子交换色谱移除过量氨氧基试剂。收集洗脱液中含有PSA-G-CSF的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法2:
将G-CSF转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM过碘酸钠水溶液,得到200μM的浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T=+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应,得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型G-CSF。收集洗脱液中含有氧化型G-CSF的洗脱份且用于缀合反应。
在最多15分钟的时段(t)内在平缓搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至含有纯化的氧化型G-CSF的洗脱液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM),得到10mM的最终浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在平缓震荡下孵育反应混合物120+/-10分钟(蛋白质浓度:1mg/ml)。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PSA-G-CSF缀合物。收集含有PSA-G-CSF缀合物的洗脱份并通过超滤/透滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
通过测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法3:
将粒细胞集落刺激因子(G-CSF)转移至反应缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(10mM最终浓度)和NaIO4(最终浓度:400μM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。随后在室温下用半胱氨酸淬灭反应,持续60分钟(半胱氨酸浓度:10mM)。接着通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵,pH 6.9)调整反应混合物的传导率且加载于以50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙、0.01%Tween 80(pH6.9)预平衡且填充有苯基琼脂糖FF的管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。随后用50mMHepes、5mM氯化钙(pH 7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA-G-CSF的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法3。将粒细胞集落刺激因子(G-CSF)转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(10mM最终浓度)和NaIO4(最终浓度:400μM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。随后,在室温下用半胱氨酸淬灭反应,持续60分钟(半胱氨酸浓度:10mM)且通过离子交换色谱纯化缀合物。收集洗脱液中含有PSA-G-CSF的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法4:
将G-CSF溶解于或转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。
随后,在最多15分钟的时段(t)内在平缓搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至此G-CSF溶液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM),得到10mM的最终浓度。最后,添加40mM过碘酸钠水溶液,得到400μM的浓度。
在T=+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在平缓震荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。接着通过添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应,得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱纯化所得G-CSF缀合物。收集洗脱液中含有PSA-G-CSF的洗脱份且通过超滤/透滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
实施例29
使用氨氧基-PSA和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使修美乐聚唾液酸化
方法1:
将起始浓度的修美乐转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4,得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行氧化反应30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度:10mM)淬灭反应,持续60分钟。
接着使用Vivaspin离心过滤器对溶液进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物,或在替代性情况下通过以缓冲液A(20mM Hepes、5mM CaCl2,pH 7.0)平衡且体积为20ml的IEX管柱(Merck EMD TMAE(M))。用5CV缓冲液A平衡管柱。用缓冲液B(20mM Hepes、5mM CaCl2、1M NaCl,pH 7.0)洗脱氧化型修美乐。收集含有修美乐的洗脱份。测定蛋白质含量(库马斯法、布莱德法)且用反应缓冲液调整至1mg/ml并通过逐滴添加0.5M HCl调整至pH6.0。
添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度:10mM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。借助于HIC移除过量氨氧基试剂。通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵,pH 6.9)调整反应混合物的传导率且加载于以50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙(pH 6.9)预平衡且填充有80ml苯基琼脂糖FF的管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。随后用含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA-修美乐的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法1。将修美乐转移至反应缓冲液(例如50mMHepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4,得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行氧化反应30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度:10mM)淬灭反应,持续60分钟。
接着使用Vivaspin离心过滤器对溶液进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度:10mM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。借助于离子交换色谱移除过量氨氧基试剂。收集洗脱液中含有PSA-修美乐的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法2:
将修美乐转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM过碘酸钠水溶液,得到200μM的浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T=+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应,得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型修美乐。收集洗脱液中含有氧化型修美乐的洗脱份且用于缀合反应。
在最多15分钟的时段(t)内在平缓搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至含有纯化的氧化型修美乐的洗脱液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM),得到10mM的最终浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在pH 6.0下在平缓震荡下孵育反应混合物120+/-10分钟(蛋白质浓度:1mg/ml)。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PSA-修美乐缀合物。收集含有PSA-修美乐缀合物的洗脱份并通过超滤/透滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
通过测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法3:
将修美乐转移至反应缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(10mM最终浓度)和NaIO4(最终浓度:400μM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。随后在室温下用半胱氨酸淬灭反应,持续60分钟(半胱氨酸浓度:10mM)。接着通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵,pH 6.9)调整反应混合物的传导率且加载于以50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙、0.01%Tween 80(pH 6.9)预平衡且填充有苯基琼脂糖FF的管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。随后用50mM Hepes、5mM氯化钙(pH 7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA-修美乐的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法3。将修美乐转移至反应缓冲液(例如50mMHepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(10mM最终浓度)和NaIO4(最终浓度:400μM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。随后,在室温下用半胱氨酸淬灭反应,持续60分钟(半胱氨酸浓度:10mM)且通过离子交换色谱纯化缀合物。收集洗脱液中含有PSA-修美乐的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法4:
将修美乐溶解于或转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。
随后,在最多15分钟的时段(t)内在平缓搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至此修美乐溶液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM),得到10mM的最终浓度。最后,添加40mM过碘酸钠水溶液,得到400μM的浓度。
在T=+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在平缓震荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。接着通过添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应,得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱纯化所得修美乐-缀合物。收集洗脱液中含有PSA-修美乐的洗脱份且通过超滤/透滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
实施例30
使用氨氧基-PSA和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使普罗利亚聚唾液酸化
方法1:
将起始浓度的普罗利亚转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。向此溶液中添加NaIO4,得到200μM的最终浓度。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行氧化反应30分钟。接着在室温下用半胱氨酸(最终浓度:10mM)淬灭反应,持续60分钟。
接着使用Vivaspin离心过滤器对溶液进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物,或在替代性情况下通过以缓冲液A(20mM Hepes、5mM CaCl2,pH 7.0)平衡且体积为20ml的IEX管柱(Merck EMD TMAE(M))。用5CV缓冲液A平衡管柱。用缓冲液B(20mM Hepes、5mM CaCl2、1M NaCl,pH 7.0)洗脱氧化型普罗利亚。收集含有普罗利亚的洗脱份。测定蛋白质含量(库马斯法、布莱德法)且用反应缓冲液调整至1mg/ml并通过逐滴添加0.5M HCl调整至pH6.0。
添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(最终浓度:10mM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。借助于HIC移除过量氨氧基试剂。通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵,pH 6.9)调整反应混合物的传导率且加载于以50mM Hepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙(pH 6.9)预平衡且填充有80ml苯基琼脂糖FF的管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。随后用含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA-普罗利亚的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法1。将10mg普罗利亚溶解于5ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl)中。接着添加100μl过碘酸钠水溶液(5mM)且在4℃下在黑暗中在平缓搅拌下孵育反应混合物1小时,在室温下通过添加50μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭,持续15分钟。随后使用Vivaspin 15R 10kD离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
将含有氧化型普罗利亚的保留物(约7ml)与2ml间甲苯胺水溶液(50mM)混合且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育此混合物2.5小时。
借助于阳离子交换色谱(CEC)移除游离普罗利亚。用20ml缓冲液A(50mM Hepes,pH6.5)稀释反应混合物且加载于以缓冲液A预平衡的20ml HiPrep SPFF 16/10管柱(GEHealthcare,Fairfield,CT)上。接着用缓冲液B(50mM Hepes、1M NaCl,pH 6.5)洗脱管柱。通过用25%缓冲液B洗涤管柱来洗脱游离普罗利亚且用50%缓冲液B洗脱缀合物。含有缀合物的洗脱份的传导率随后使用缓冲液C(50mMHepes、5M NaCl,pH 6.9)升至约190mS/cm且加载于以缓冲液D(50mM Hepes、3M NaCl,pH 6.9)预平衡的20ml HiPrep丁基FF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。用5CV缓冲液D洗涤出游离PSA试剂。随后,用100%缓冲液E(50mM Hepes,pH 6.9)洗脱缀合物。通过UF/DF,使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2,截断值10kD,Millipore)浓缩含有缀合物的洗脱份。针对含有150mM NaCl的组氨酸缓冲液(pH 6.9)进行最后透滤步骤。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。对于PSA-普罗利亚缀合物,与天然普罗利亚相比,测得比活性>50%。另外通过尺寸排阻HPLC,使用装备有Shodex KW 803管柱的Agilent1200HPLC系统,在如先前所述的条件(Kolarich等,Transfusion2006;46:1959-77)下以分析法表征缀合物。显示制剂不含游离普罗利亚。
方法2:
将普罗利亚转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM过碘酸钠水溶液,得到200μM的浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T=+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应,得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型普罗利亚。收集洗脱液中含有氧化型普罗利亚的洗脱份且用于缀合反应。
在最多15分钟的时段(t)内在平缓搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至含有纯化的氧化型普罗利亚的洗脱液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM),得到10mM的最终浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)和pH6.0下在黑暗中在平缓震荡下孵育反应混合物120+/-10分钟(蛋白质浓度:1mg/ml)。
通过离子交换色谱进一步纯化所得普罗利亚缀合物。收集含有普罗利亚缀合物的洗脱份并通过超滤/透滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
通过测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA(间苯二酚测定)含测量定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法3:
将普罗利亚转移至反应缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且稀释,获得1mg/ml的蛋白质浓度。添加50倍摩尔浓度过量的MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),随后添加作为亲核性催化剂的间甲苯胺(10mM最终浓度)和NaIO4(最终浓度:400μM)。在室温下在黑暗中在平缓震荡下进行偶合反应2小时。随后在室温下用半胱氨酸淬灭反应,持续60分钟(半胱氨酸浓度:10mM)。接着通过添加含有乙酸铵的缓冲液(50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙、8M乙酸铵,pH 6.9)调整反应混合物的传导率且加载于以50mMHepes、2.5M乙酸铵、350mM氯化钠、5mM氯化钙、0.01%Tween 80(pH 6.9)预平衡且填充有苯基琼脂糖FF的管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。随后用50mM Hepes、5mM氯化钙(pH7.5)洗脱缀合物。最后收集含有PSA普罗利亚的洗脱份且通过使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法3。将10mg普罗利亚溶解于8ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl)中。接着添加200μl过碘酸钠水溶液(5mM)和2ml间甲苯胺水溶液(50mM)。随后添加MW为20kD的氨氧基-PSA试剂(上述),产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且在室温下通过添加100μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭,持续15分钟。
借助于阳离子交换色谱(CEC)移除游离普罗利亚。用20ml缓冲液A(50mM Hepes,pH6.5)稀释反应混合物且加载于以缓冲液A预平衡的20ml HiPrep SPFF 16/10管柱(GEHealthcare,Fairfield,CT)上。接着用缓冲液B(50mM Hepes、1M NaCl,pH 6.5)洗脱管柱。通过用25%缓冲液B洗涤管柱来洗脱游离普罗利亚且用50%缓冲液B洗脱缀合物。含有缀合物的洗脱份的传导率随后使用缓冲液C(50mM Hepes、5M NaCl,pH 6.9)升至约190mS/cm且加载于以缓冲液D(50mM Hepes、3M NaCl,pH 6.9)预平衡的20ml HiPrep丁基FF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。用5CV缓冲液D洗涤出游离PSA试剂。随后,用100%缓冲液E(50mM Hepes,pH 6.9)洗脱缀合物。通过UF/DF/使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2,截断值10kD/Millipore)浓缩含有缀合物的洗脱份。针对含有150mM NaCl的组氨酸缓冲液(pH 6.9)进行最后透滤步骤。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。对于PSA-普罗利亚缀合物,与天然普罗利亚相比,测得比活性>50%。另外通过尺寸排阻HPLC,使用装备有Shodex KW 803管柱的Agilent1200HPLC系统,在如先前所述的条件(Kolarich等,Transfusion2006;46:1959-77)下以分析法表征缀合物。显示制剂不含游离普罗利亚。
方法4:
将普罗利亚溶解于或转移至反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。
随后,在最多15分钟的时段(t)内在平缓搅拌下将50倍摩尔浓度过量的氨氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)试剂添加至此普罗利亚溶液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM),得到10mM的最终浓度。最后,添加40mM过碘酸钠水溶液,得到400μM的浓度。
在T=+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在平缓震荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。接着通过添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应,得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱纯化所得普罗利亚缀合物。收集洗脱液中含有PSA-普罗利亚的洗脱份且通过超滤/透滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成的膜(Millipore)浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质、生物活性和通过测量PSA含量(间苯二酚测定)测定聚唾液酸化程度以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
实施例31
其它治疗性蛋白质的聚唾液酸化
在替代性亲核性催化剂(如本文所述的间甲苯胺或邻氨基苯甲酸)存在下进行的聚唾液酸化反应可扩展至其它治疗性蛋白质。举例来说,在本发明的各种方面,对于治疗性蛋白质(诸如本文所述的那些蛋白质)重复如本文所述的以上使用PSA氨氧基或PEG氨氧基试剂的聚唾液酸化或聚乙二醇化反应。
实施例32
使用氨氧基-PEG试剂和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使EPO聚乙二醇化
方法1:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使红血球生成素(EPO)聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将EPO溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl、5mM CaCl2)中。接着添加过碘酸钠水溶液(5mM)且在4℃下在黑暗中在平缓搅拌下孵育反应混合物1小时,在室温下通过添加7.5μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭,持续15分钟。随后使用Vivaspin离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
接着将含有氧化型EPO的保留物与间甲苯胺水溶液(50mM)混合且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂,产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后,通过离子交换色谱(例如在Q琼脂糖FF上)纯化PEG-EPO缀合物。举例来说,将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mMCaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)平衡的管柱上。用含有5mMCaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物,接着使用适当MW截断膜进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法1。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使EPO聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将10mg EPO溶解于5ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl)中。接着添加100μl过碘酸钠水溶液(5mM)且在4℃下在黑暗中在平缓搅拌下孵育反应混合物1小时,在室温下通过添加50μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭,持续15分钟。随后使用Vivaspin15R 10kD离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
将含有氧化型EPO的保留物(约7ml)与2ml间甲苯胺水溶液(50mM)混合且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂(上述),产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后,通过离子交换色谱,在Q琼脂糖FF上纯化PEG-EPO缀合物。用20ml缓冲液A(50mM Hepes,pH 7.5)稀释反应混合物且加载于以缓冲液A预平衡的20ml HiPrep QFF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。接着用缓冲液B(50mM Hepes、1M NaCl,pH 7.5)洗脱管柱。通过用25%缓冲液B洗涤管柱来洗脱游离EPO且用50%缓冲液B洗脱缀合物。通过UF/DF/使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2,截断值10kD/Millipore)浓缩含有缀合物的洗脱份。针对含有150mM NaCl的组氨酸缓冲液(pH 7.2)进行最后透滤步骤。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。对于PEG-EPO缀合物,与天然EPO相比,测得比活性>50%。另外通过尺寸排阻HPLC,使用装备有ShodexKW 803管柱的Agilent 1200HPLC系统,在如先前所述的条件(Kolarich等,Transfusion2006;46:1959-77)下以分析法表征缀合物。显示制剂不含游离EPO。
方法2:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使EPO聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。
将EPO转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH6.0)中,得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM过碘酸钠水溶液,得到200μM的浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T=+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应,得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型EPO。收集洗脱液中含有氧化型EPO的洗脱份且用于缀合反应。
随后,在最多15分钟的时段(t)内在平缓搅拌下将MW为20kD的氨氧基-PEG试剂以50倍摩尔浓度过量添加至含有纯化的氧化型EPO的洗脱液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM),得到10mM的最终浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在平缓震荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PEG-EPO缀合物。收集含有PEG-EPO缀合物的洗脱份并通过超滤/透滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质和生物活性以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法3:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使EPO聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将EPO溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且与过碘酸钠水溶液(10mM)和间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂,产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭,持续15分钟。
最后,通过离子交换色谱,在Q琼脂糖FF上纯化PEG-EPO缀合物。将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)预平衡的管柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物,接着使用膜进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法3。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使EPO聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将10mg EPO溶解于约8ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl)中。接着添加200μl过碘酸钠水溶液(5mM)和2ml间甲苯胺水溶液(50mM)。随后添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂(上述),产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且在室温下通过添加100μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭,持续15分钟。
最后,通过离子交换色谱,在Q琼脂糖FF上纯化PEG-EPO缀合物。用20ml缓冲液A(50mM Hepes,pH 7.5)稀释反应混合物且加载于以缓冲液A预平衡的20ml HiPrep QFF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。接着用缓冲液B(50mM Hepes、1M NaCl,pH 7.5)洗脱管柱。通过用25%缓冲液B洗涤管柱来洗脱游离EPO且用50%缓冲液B洗脱缀合物。通过UF/DF/使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2,截断值10kD/Millipore)浓缩含有缀合物的洗脱份。针对含有150mM NaCl的组氨酸缓冲液(pH 7.2)进行最后透滤步骤。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。对于PEG-EPO缀合物,与天然EPO相比,测得比活性>50%。另外通过尺寸排阻HPLC,使用装备有ShodexKW 803管柱的Agilent 1200HPLC系统,在如先前所述的条件(Kolarich等,Transfusion2006;46:1959-77)下以分析法表征缀合物。显示制剂不含游离EPO。
方法4:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使EPO聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将初始浓度或重量的EPO转移至或溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到2mg EPO/ml的最终蛋白质浓度。随后在15分钟内添加5mM过碘酸钠水溶液,得到100μM的最终浓度,随后在30分钟的时段内添加50mM间甲苯胺水溶液,得到10mM的最终浓度。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂(上述),产生20倍摩尔浓度试剂过量。校正pH至6.0后,在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且通过添加1M L-半胱氨酸水溶液以得到10mM的最终浓度来淬灭,持续15分钟。
借助于离子交换色谱(IEC)纯化PEG-EPO缀合物。通过UF/DF,使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2,截断值10kD/Millipore)浓缩洗脱液中含有缀合物的洗脱份。针对Hepes缓冲液(50mMHepes、5mM CaCl2,pH 7.5)进行最后透滤步骤。
通过根据已知方法测量总蛋白质(布莱德法和BCA程序)和生物活性以分析法表征制剂。
实施例33
使用氨氧基-PEG试剂和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使Ang-2聚乙二醇化
方法1:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使Ang-2聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将Ang-2溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl、5mM CaCl2)中。接着添加过碘酸钠水溶液(5mM)且在4℃下在黑暗中在平缓搅拌下孵育反应混合物1小时,在室温下通过添加7.5μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭,持续15分钟。随后使用Vivaspin离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
接着将含有氧化型Ang-2的保留物与间甲苯胺水溶液(50mM)混合且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂,产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后,通过离子交换色谱(例如在Q琼脂糖FF上)纯化PEG-Ang-2缀合物。举例来说,将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mMCaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)平衡的管柱上。用含有5mMCaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物,接着使用适当MW截断膜进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法1。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使Ang-2聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将Ang-2溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mMNaCl、5mM CaCl2)中。接着添加过碘酸钠水溶液(5mM)且在4℃下在黑暗中在平缓搅拌下孵育反应混合物1小时,在室温下通过添加7.5μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭,持续15分钟。随后使用Vivaspin离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
接着将含有氧化型Ang-2的保留物与间甲苯胺水溶液(50mM)混合且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂,产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后,通过离子交换色谱纯化PEG-Ang-2缀合物。收集洗脱液中含有缀合物的洗脱份,接着使用适当MW截断膜进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法2:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使Ang-2聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。
将Ang-2转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM过碘酸钠水溶液,得到200μM的浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T=+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应,得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型Ang-2。收集洗脱液中含有氧化型Ang-2的洗脱份且用于缀合反应。
随后,在最多15分钟的时段(t)内在平缓搅拌下将MW为20kD的氨氧基-PEG试剂以50倍摩尔浓度过量添加至含有纯化的氧化型Ang-2的洗脱液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM),得到10mM的最终浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在平缓震荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PEG-Ang-2缀合物。收集含有PEG-Ang-2缀合物的洗脱份并通过超滤/透滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质和生物活性以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法3:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使Ang-2聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将Ang-2溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且与过碘酸钠水溶液(10mM)和间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂,产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭,持续15分钟。
最后,通过离子交换色谱,在Q琼脂糖FF上纯化PEG-Ang-2缀合物。将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)预平衡的管柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物,接着使用膜进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法3。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使Ang-2聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将Ang-2溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且与过碘酸钠水溶液(10mM)和间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂,产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭,持续15分钟。
最后,通过离子交换色谱纯化PEG-Ang-2缀合物。收集洗脱液中含有缀合物的洗脱份,接着进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法4:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使Ang-2聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将初始浓度或重量的Ang-2转移至或溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到2mg Ang-2/ml的最终蛋白质浓度。随后在15分钟内添加5mM过碘酸钠水溶液,得到100μM的最终浓度,随后在30分钟的时段内添加50mM间甲苯胺水溶液,得到10mM的最终浓度。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂(上述),产生20倍摩尔浓度试剂过量。校正pH至6.0后,在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且通过添加1M L-半胱氨酸水溶液以得到10mM的最终浓度来淬灭,持续15分钟。
借助于离子交换色谱(IEC)纯化PEG-Ang-2缀合物。通过UF/DF,使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2,截断值10kD/Millipore)浓缩洗脱液中含有缀合物的洗脱份。针对Hepes缓冲液(50mMHepes、5mM CaCl2,pH 7.5)进行最后透滤步骤。
通过根据已知方法测量总蛋白质(布莱德法和BCA程序)和生物活性以分析法表征制剂。
随后,借助于离子交换色谱(IEC)移除游离Ang-2。通过UF/DF浓缩洗脱液中含有缀合物的洗脱份。
实施例34
使用氨氧基-PEG试剂和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使VEGF聚乙二醇化
方法1:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使VEGF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将VEGF溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl、5mM CaCl2)中。接着添加过碘酸钠水溶液(5mM)且在4℃下在黑暗中在平缓搅拌下孵育反应混合物1小时,在室温下通过添加7.5μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭,持续15分钟。随后使用Vivaspin离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
接着将含有氧化型VEGF的保留物与间甲苯胺水溶液(50mM)混合且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂,产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后,通过离子交换色谱(例如在Q琼脂糖FF上)纯化PEG-VEGF缀合物。举例来说,将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mMCaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)平衡的管柱上。用含有5mMCaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物,接着使用适当MW截断膜进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法1。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使VEGF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将VEGF溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mMNaCl、5mM CaCl2)中。接着添加过碘酸钠水溶液(5mM)且在4℃下在黑暗中在平缓搅拌下孵育反应混合物1小时,在室温下通过添加7.5μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭,持续15分钟。随后使用Vivaspin离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
接着将含有氧化型VEGF的保留物与间甲苯胺水溶液(50mM)混合且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂,产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后,通过离子交换色谱纯化PEG-VEGF缀合物。收集洗脱液中含有缀合物的洗脱份,接着使用适当MW截断膜进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法2:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使VEGF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将VEGF转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM过碘酸钠水溶液,得到200μM的浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T=+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应,得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型VEGF。收集洗脱液中含有氧化型VEGF的洗脱份且用于缀合反应。
随后,在最多15分钟的时段(t)内在平缓搅拌下将MW为20kD的氨氧基-PEG试剂以50倍摩尔浓度过量添加至含有纯化的氧化型VEGF的洗脱液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM),得到10mM的最终浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在平缓震荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PEG-VEGF缀合物。收集含有PEG-VEGF缀合物的洗脱份并通过超滤/透滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质和生物活性以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法3:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使VEGF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将VEGF溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且与过碘酸钠水溶液(10mM)和间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂,产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭,持续15分钟。
最后,通过离子交换色谱,在Q琼脂糖FF上纯化PEG-VEGF缀合物。将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)预平衡的管柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物,接着使用膜进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法3。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使VEGF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将VEGF溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且与过碘酸钠水溶液(10mM)和间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂,产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭,持续15分钟。
最后,通过离子交换色谱纯化PEG-VEGF缀合物。收集洗脱液中含有缀合物的洗脱份,接着进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法4:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使VEGF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将初始浓度或重量的VEGF转移至或溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到2mg VEGF/ml的最终蛋白质浓度。随后,在15分钟内添加5mM过碘酸钠水溶液,得到100μM的最终浓度,随后在30分钟的时段内添加50mM间甲苯胺水溶液,得到10mM的最终浓度。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂(上述),产生20倍摩尔浓度试剂过量。校正pH至6.0后,在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且通过添加1M L-半胱氨酸水溶液以得到10mM的最终浓度来淬灭,持续15分钟。
借助于离子交换色谱(IEC)纯化PEG-VEGF缀合物。通过UF/DF,使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2,截断值10kD/Millipore)浓缩洗脱液中含有缀合物的洗脱份。针对Hepes缓冲液(50mMHepes、5mM CaCl2,pH 7.5)进行最后透滤步骤。
通过根据已知方法测量总蛋白质(布莱德法和BCA程序)和生物活性以分析法表征制剂。
实施例35
使用氨氧基-PEG试剂和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使EGF聚乙二醇化
方法1:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使EGF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将EGF溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl、5mM CaCl2)中。接着添加过碘酸钠水溶液(5mM)且在4℃下在黑暗中在平缓搅拌下孵育反应混合物1小时,在室温下通过添加7.5μl1M半胱氨酸水溶液来淬灭,持续15分钟。随后使用Vivaspin离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
接着将含有氧化型EGF的保留物与间甲苯胺水溶液(50mM)混合且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂,产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后,通过离子交换色谱(例如在Q琼脂糖FF上)纯化PEG-EGF缀合物。举例来说,将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mMCaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)平衡的管柱上。用含有5mMCaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物,接着使用适当MW截断膜进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法1。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使EGF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将EGF溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mMNaCl、5mM CaCl2)中。接着添加过碘酸钠水溶液(5mM)且在4℃下在黑暗中在平缓搅拌下孵育反应混合物1小时,在室温下通过添加7.5μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭,持续15分钟。随后使用Vivaspin离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
接着将含有氧化型EGF的保留物与间甲苯胺水溶液(50mM)混合且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂,产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后,通过离子交换色谱纯化PEG-EGF缀合物。收集洗脱液中含有缀合物的洗脱份,接着使用适当MW截断膜进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法2:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使EGF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将EGF转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM过碘酸钠水溶液,得到200μM的浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T=+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应,得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型EGF。收集洗脱液中含有氧化型EGF的洗脱份且用于缀合反应。
随后,在最多15分钟的时段(t)内在平缓搅拌下将MW为20kD的氨氧基-PEG试剂以50倍摩尔浓度过量添加至含有纯化的氧化型NGF的洗脱液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM),得到10mM的最终浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在平缓震荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PEG-EGF缀合物。收集含有PEG-EGF缀合物的洗脱份并通过超滤/透滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质和生物活性以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法3:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使EGF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将EGF溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且与过碘酸钠水溶液(10mM)和间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂,产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭,持续15分钟。
最后,通过离子交换色谱,在Q-琼脂糖FF上纯化PEG-EGF缀合物。将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)预平衡的管柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物,接着使用膜进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法3。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使EGF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将EGF溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙,pH6.0)中且与过碘酸钠水溶液(10mM)和间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂,产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭,持续15分钟。
最后,通过离子交换色谱纯化PEG-EGF缀合物。收集洗脱液中含有缀合物的洗脱份,接着进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法4:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使EGF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将初始浓度或重量的EGF转移至或溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到2mg EGF/ml的最终蛋白质浓度。随后在15分钟内添加5mM过碘酸钠水溶液,得到100μM的最终浓度,随后在30分钟的时段内添加50mM间甲苯胺水溶液,得到10mM的最终浓度。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂(上述),产生20倍摩尔浓度试剂过量。校正pH至6.0后,在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且通过添加1M L-半胱氨酸水溶液以得到10mM的最终浓度来淬灭,持续15分钟。
借助于离子交换色谱(IEC)纯化PEG-EGF缀合物。通过UF/DF,使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2,截断值10kD/Millipore)浓缩洗脱液中含有缀合物的洗脱份。针对Hepes缓冲液(50mMHepes、5mM CaCl2,pH 7.5)进行最后透滤步骤。
通过根据已知方法测量总蛋白质(布莱德法和BCA程序)和生物活性以分析法表征制剂。
实施例36
使用氨氧基-PEG试剂和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使NGF聚乙二醇化
方法1:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使NGF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将NGF溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl、5mM CaCl2)中。接着添加过碘酸钠水溶液(5mM)且在4℃下在黑暗中在平缓搅拌下孵育反应混合物1小时,在室温下通过添加7.5μl1M半胱氨酸水溶液来淬灭,持续15分钟。随后使用Vivaspin离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
接着将含有氧化型NGF的保留物与间甲苯胺水溶液(50mM)混合且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂,产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后,通过离子交换色谱(例如在Q-琼脂糖FF上)纯化PEG-NGF缀合物。举例来说,将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)平衡的管柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物,接着使用适当MW截断膜进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法1。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使NGF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将NGF溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mMNaCl、5mM CaCl2)中。接着添加过碘酸钠水溶液(5mM)且在4℃下在黑暗中在平缓搅拌下孵育反应混合物1小时,在室温下通过添加7.5μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭,持续15分钟。随后使用Vivaspin离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
接着将含有氧化型NGF的保留物与间甲苯胺水溶液(50mM)混合且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂,产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后,通过离子交换色谱纯化PEG-NGF缀合物。收集洗脱液中含有缀合物的洗脱份,接着使用适当MW截断膜进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法2:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使NGF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将NGF转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM过碘酸钠水溶液,得到200μM的浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T=+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应,得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型NGF。收集洗脱液中含有氧化型NGF的洗脱份且用于缀合反应。
随后,在最多15分钟的时段(t)内在平缓搅拌下将MW为20kD的氨氧基-PEG试剂以50倍摩尔浓度过量添加至含有纯化的氧化型NGF的洗脱液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM),得到10mM的最终浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在平缓震荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PEG-NGF缀合物。收集含有PEG-NGF缀合物的洗脱份并通过超滤/透滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质和生物活性以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法3:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使NGF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将NGF溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且与过碘酸钠水溶液(10mM)和间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂,产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭,持续15分钟。
最后,通过离子交换色谱,在Q琼脂糖FF上纯化PEG-NGF缀合物。将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)预平衡的管柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物,接着使用膜进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法3。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使NGF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将NGF溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙,pH6.0)中且与过碘酸钠水溶液(10mM)和间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂,产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭,持续15分钟。
最后,通过离子交换色谱纯化PEG-NGF缀合物。收集含有缀合物的洗脱份,接着进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法4:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使NGF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将初始浓度或重量的NGF转移至或溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到2mg NGF/ml的最终蛋白质浓度。随后在15分钟内添加5mM过碘酸钠水溶液,得到100μM的最终浓度,随后在30分钟的时段内添加50mM间甲苯胺水溶液,得到10mM的最终浓度。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂(上述),产生20倍摩尔浓度试剂过量。校正pH至6.0后,在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且通过添加1M L-半胱氨酸水溶液以得到10mM的最终浓度来淬灭,持续15分钟。
借助于离子交换色谱(IEC)纯化PEG-NGF缀合物。通过UF/DF,使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2,截断值10kD/Millipore)浓缩洗脱液中含有缀合物的洗脱份。针对Hepes缓冲液(50mMHepes、5mM CaCl2,pH 7.5)进行最后透滤步骤。
通过根据已知方法测量总蛋白质(布莱德法和BCA程序)和生物活性以分析法表征制剂。
实施例37
使用氨氧基-PEG试剂和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使HGH聚乙二醇化
方法1:
如本文所述,人生长激素(HGH)的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后,根据所属领域中已知的方法活体外使HGH糖基化。
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使HGH聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将HGH溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl、5mM CaCl2)中。接着添加过碘酸钠水溶液(5mM)且在4℃下在黑暗中在平缓搅拌下孵育反应混合物1小时,在室温下通过添加7.5μl1M半胱氨酸水溶液来淬灭,持续15分钟。随后使用Vivaspin离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
接着将含有氧化型HGH的保留物与间甲苯胺水溶液(50mM)混合且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂,产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后,通过离子交换色谱(例如在Q琼脂糖FF上)纯化PEG-HGH缀合物。举例来说,将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)平衡的管柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物,接着使用适当MW截断膜进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在替代实施方案中,如下进行方法1。如本文所述,人生长激素(HGH)的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后,根据所属领域中已知的方法活体外使HGH糖基化。
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使HGH聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将HGH溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl、5mM CaCl2)中。接着添加过碘酸钠水溶液(5mM)且在4℃下在黑暗中在平缓搅拌下孵育反应混合物1小时,在室温下通过添加7.5μl1M半胱氨酸水溶液来淬灭,持续15分钟。随后使用Vivaspin离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
接着将含有氧化型HGH的保留物与间甲苯胺水溶液(50mM)混合且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂,产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后,通过离子交换色谱纯化PEG-HGH缀合物。收集洗脱液中含有缀合物的洗脱份,接着使用适当MW截断膜进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法2:
如本文所述,人生长激素(HGH)的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后,根据所属领域中已知的方法活体外使HGH糖基化。
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使HGH聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将HGH转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM过碘酸钠水溶液,得到200μM的浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T=+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应,得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型HGH。收集洗脱液中含有氧化型HGH的洗脱份且用于缀合反应。
随后,在最多15分钟的时段(t)内在平缓搅拌下将MW为20kD的氨氧基-PEG试剂以50倍摩尔浓度过量添加至含有纯化的氧化型HGH的洗脱液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM),得到10mM的最终浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在平缓震荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PEG-HGH缀合物。收集含有PEG-NGF缀合物的洗脱份并通过超滤/透滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质和生物活性以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法3:
如本文所述,人生长激素(HGH)的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后,根据所属领域中已知的方法活体外使HGH糖基化。
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使HGH聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将HGH溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且与过碘酸钠水溶液(10mM)和间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂,产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭,持续15分钟。
最后,通过离子交换色谱,在Q-琼脂糖FF上纯化PEG-HGH缀合物。将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)预平衡的管柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物,接着使用膜进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法3。如本文所述,人生长激素(HGH)的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后,根据所属领域中已知的方法活体外使HGH糖基化。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使HGH聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将HGH溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且与过碘酸钠水溶液(10mM)和间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂,产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭,持续15分钟。
最后,通过离子交换色谱纯化PEG-HGH缀合物。收集含有缀合物的洗脱份,接着进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法4:
如本文所述,人生长激素(HGH)的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后,根据所属领域中已知的方法活体外使HGH糖基化。
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使HGH聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将初始浓度或重量的HGH转移至或溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到2mg HGH/ml的最终蛋白质浓度。随后在15分钟内添加5mM过碘酸钠水溶液,得到100μM的最终浓度,随后在30分钟的时段内添加50mM间甲苯胺水溶液,得到10mM的最终浓度。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂(上述),产生20倍摩尔浓度试剂过量。校正pH至6.0后,在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且通过添加1M L-半胱氨酸水溶液以得到10mM的最终浓度来淬灭,持续15分钟。
借助于离子交换色谱(IEC)纯化PEG-HGH缀合物。通过UF/DF,使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2,截断值10kD/Millipore)浓缩洗脱液中含有缀合物的洗脱份。针对Hepes缓冲液(50mMHepes、5mM CaCl2,pH 7.5)进行最后透滤步骤。
通过根据已知方法测量总蛋白质(布莱德法和BCA程序)和生物活性以分析法表征制剂。
实施例38
使用氨氧基-PEG试剂和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使TNF-α聚乙二醇化
方法1:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使TNF-α聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将TNF-α溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl、5mM CaCl2)中。接着添加过碘酸钠水溶液(5mM)且在4℃下在黑暗中在平缓搅拌下孵育反应混合物1小时,在室温下通过添加7.5μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭,持续15分钟。随后使用Vivaspin离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
接着将含有氧化型TNF-α的保留物与间甲苯胺水溶液(50mM)混合且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂,产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后,通过离子交换色谱(例如在Q-琼脂糖FF上)纯化PEG-TNF-α缀合物。举例来说,将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)平衡的管柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物,接着使用适当MW截断膜进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法1。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使TNF-α聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将TNF-α溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mMNaCl、5mM CaCl2)中。接着添加过碘酸钠水溶液(5mM)且在4℃下在黑暗中在平缓搅拌下孵育反应混合物1小时,在室温下通过添加7.5μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭,持续15分钟。随后使用Vivaspin离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
接着将含有氧化型TNF-α的保留物与间甲苯胺水溶液(50mM)混合且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂,产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后,通过离子交换色谱纯化PEG-TNF-α缀合物。收集洗脱液中含有缀合物的洗脱份,接着使用适当MW截断膜进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法2:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使TNF-α聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将TNF-α转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM过碘酸钠水溶液,得到200μM的浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T=+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应,得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型TNF-α。收集洗脱液中含有氧化型TNF-α的洗脱份且用于缀合反应。
随后,在最多15分钟的时段(t)内在平缓搅拌下将MW为20kD的氨氧基-PEG试剂以50倍摩尔浓度过量添加至含有纯化的氧化型TNFα的洗脱液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM),得到10mM的最终浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在平缓震荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PEG-TNF-α缀合物。收集含有PEG-TNF-α缀合物的洗脱份并通过超滤/透滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质和生物活性以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法3:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使TNF-α聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将TNF-α溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且与过碘酸钠水溶液(10mM)和间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂,产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭,持续15分钟。
最后,通过离子交换色谱,在Q-琼脂糖FF上纯化PEG-TNF-α缀合物。将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)预平衡的管柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物,接着使用膜进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法3。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使TNF-α聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将TNF-α溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且与过碘酸钠水溶液(10mM)和间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂,产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭,持续15分钟。
最后,通过离子交换色谱纯化PEG-TNF-α缀合物。收集含有缀合物的洗脱份,接着进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法4:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使TNF-α聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将初始浓度或重量的TNF-α转移至或溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到2mg TNF-α/ml的最终蛋白质浓度。随后,在15分钟内添加5mM过碘酸钠水溶液,得到100μM的最终浓度,随后在30分钟的时段内添加50mM间甲苯胺水溶液,得到10mM的最终浓度。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂(上述),产生20倍摩尔浓度试剂过量。校正pH至6.0后,在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且通过添加1M L-半胱氨酸水溶液以得到10mM的最终浓度来淬灭,持续15分钟。
借助于离子交换色谱(IEC)纯化PEG-TNF-α缀合物。通过UF/DF,使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2,截断值10kD/Millipore)浓缩洗脱液中含有缀合物的洗脱份。针对Hepes缓冲液(50mMHepes、5mM CaCl2,pH 7.5)进行最后透滤步骤。
通过根据已知方法测量总蛋白质(布莱德法和BCA程序)和生物活性以分析法表征制剂。
实施例39
使用氨氧基-PEG试剂和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使胰岛素聚乙二醇化
方法1:
如本文所述,胰岛素的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后,根据所属领域中已知的方法活体外使胰岛素糖基化。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使胰岛素聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将胰岛素溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl、5mM CaCl2)中。接着添加过碘酸钠水溶液(5mM)且在4℃下在黑暗中在平缓搅拌下孵育反应混合物1小时,在室温下通过添加7.5μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭,持续15分钟。随后使用Vivaspin离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
接着将含有氧化型胰岛素的保留物与间甲苯胺水溶液(50mM)混合且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂,产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后,通过离子交换色谱(例如在Q-琼脂糖FF上)纯化PEG-胰岛素缀合物。举例来说,将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)平衡的管柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物,接着使用适当MW截断膜进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法1。如本文所述,胰岛素的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后,根据所属领域中已知的方法活体外使胰岛素糖基化。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使胰岛素聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将胰岛素溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl、5mM CaCl2)中。接着添加过碘酸钠水溶液(5mM)且在4℃下在黑暗中在平缓搅拌下孵育反应混合物1小时,在室温下通过添加7.5μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭,持续15分钟。随后使用Vivaspin离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
接着将含有氧化型胰岛素的保留物与间甲苯胺水溶液(50mM)混合且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂,产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后,通过离子交换色谱纯化PEG-胰岛素缀合物。收集洗脱液中含有缀合物的洗脱份,接着使用适当MW截断膜进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法2:
如本文所述,胰岛素的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后,根据所属领域中已知的方法活体外使胰岛素糖基化。
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使胰岛素聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将胰岛素转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM过碘酸钠水溶液,得到200μM的浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T=+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应,得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型胰岛素。收集洗脱液中含有氧化型胰岛素的洗脱份且用于缀合反应。
随后,在最多15分钟的时段(t)内在平缓搅拌下将MW为20kD的氨氧基-PEG试剂以50倍摩尔浓度过量添加至含有纯化的氧化型胰岛素的洗脱液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM),得到10mM的最终浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在平缓震荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PEG-胰岛素缀合物。收集含有PEG-胰岛素缀合物的洗脱份并通过超滤/透滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质和生物活性以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法3:
如本文所述,胰岛素的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后,根据所属领域中已知的方法活体外使胰岛素糖基化。
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使胰岛素聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将胰岛素溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且与过碘酸钠水溶液(10mM)和间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂,产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭,持续15分钟。
最后,通过离子交换色谱,在Q琼脂糖FF上纯化PEG-胰岛素缀合物。将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)预平衡的管柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物,接着使用膜进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法3。如本文所述,胰岛素的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后,根据所属领域中已知的方法活体外使胰岛素糖基化。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使胰岛素聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将胰岛素溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且与过碘酸钠水溶液(10mM)和间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂,产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭,持续15分钟。
最后,通过离子交换色谱纯化PEG-胰岛素缀合物。收集含有缀合物的洗脱份,接着进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法4:
如本文所述,胰岛素的氨基酸序列首先被修饰为并有至少一个糖基化位点。纯化后,根据所属领域中已知的方法活体外使胰岛素糖基化。
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使胰岛素聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将初始浓度或重量的胰岛素转移至或溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到2mg胰岛素-α/ml的最终蛋白质浓度。随后在15分钟内添加5mM过碘酸钠水溶液,得到100μM的最终浓度,随后在30分钟的时段内添加50mM间甲苯胺水溶液,得到10mM的最终浓度。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂(上述),产生20倍摩尔浓度试剂过量。校正pH至6.0后,在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且通过添加1M L-半胱氨酸水溶液以得到10mM的最终浓度来淬灭,持续15分钟。
借助于离子交换色谱(IEC)纯化PEG-胰岛素缀合物。通过UF/DF,使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2,截断值10kD/Millipore)浓缩洗脱液中含有缀合物的洗脱份。针对Hepes缓冲液(50mMHepes、5mM CaCl2,pH 7.5)进行最后透滤步骤。
通过根据已知方法测量总蛋白质(布莱德法和BCA程序)和生物活性以分析法表征制剂。
实施例40
使用氨氧基-PEG试剂和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使干扰素-α聚乙二醇化
方法1:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使干扰素-α聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将干扰素-α溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl、5mM CaCl2)中。接着添加过碘酸钠水溶液(5mM)且在4℃下在黑暗中在平缓搅拌下孵育反应混合物1小时,在室温下通过添加7.5μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭,持续15分钟。随后使用Vivaspin离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
接着将含有氧化型干扰素-α的保留物与间甲苯胺水溶液(50mM)混合且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂,产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后,通过离子交换色谱(例如在Q-琼脂糖FF上)纯化PEG-干扰素-α缀合物。举例来说,将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)平衡的管柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物,接着使用适当MW截断膜进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法1。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使干扰素-α聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将干扰素-α溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl、5mM CaCl2)中。接着添加过碘酸钠水溶液(5mM)且在4℃下在黑暗中在平缓搅拌下孵育反应混合物1小时,在室温下通过添加7.5μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭,持续15分钟。随后使用Vivaspin离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
接着将含有氧化型干扰素-α的保留物与间甲苯胺水溶液(50mM)混合且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂,产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后,通过离子交换色谱纯化PEG-干扰素-α缀合物。收集含有缀合物的洗脱份,接着使用适当MW截断膜进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法2:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使干扰素-α聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将干扰素-α转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM过碘酸钠水溶液,得到200μM的浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T=+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应,得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型干扰素-α。收集洗脱液中含有氧化型干扰素-α的洗脱份且用于缀合反应。
随后,在最多15分钟的时段(t)内在平缓搅拌下将MW为20kD的氨氧基-PEG试剂以50倍摩尔浓度过量添加至含有纯化的氧化型干扰素-α的洗脱液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM),得到10mM的最终浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在平缓震荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PEG-干扰素-α缀合物。收集含有PEG-干扰素α缀合物的洗脱份并通过超滤/透滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质和生物活性以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法3:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使干扰素-α聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将干扰素-α溶解于Hepes缓冲液(50mMHepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且与过碘酸钠水溶液(10mM)和间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂,产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭,持续15分钟。
最后,通过离子交换色谱,在Q-琼脂糖FF上纯化PEG-干扰素-α缀合物。将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)预平衡的管柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物,接着使用膜进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法3。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使干扰素-α聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将干扰素-α溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且与过碘酸钠水溶液(10mM)和间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂,产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭,持续15分钟。
最后,通过离子交换色谱纯化PEG-干扰素-α缀合物。收集含有缀合物的洗脱份,接着使用膜进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法4:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使干扰素-α聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将初始浓度或重量的干扰素-α转移至或溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙,pH6.0)中,得到2mg干扰素-α/ml的最终蛋白质浓度。随后,在15分钟内添加5mM过碘酸钠水溶液,得到100μM的最终浓度,随后在30分钟的时段内添加50mM间甲苯胺水溶液,得到10mM的最终浓度。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂(上述),产生20倍摩尔浓度试剂过量。校正pH至6.0后,在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且通过添加1M L-半胱氨酸水溶液以得到10mM的最终浓度来淬灭,持续15分钟。
借助于离子交换色谱(IEC)纯化PEG-干扰素-α缀合物。通过UF/DF,使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2,截断值10kD/Millipore)浓缩洗脱液中含有缀合物的洗脱份。针对Hepes缓冲液(50mM Hepes、5mM CaCl2,pH 7.5)进行最后透滤步骤。
通过根据已知方法测量总蛋白质(布莱德法和BCA程序)和生物活性以分析法表征制剂。
实施例41
使用氨氧基-PEG试剂和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使干扰素-γ聚乙二醇化
方法1:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使干扰素-γ聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将10mg干扰素-γ溶解于5ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl)中。接着添加100μl过碘酸钠水溶液(5mM)且在4℃下在黑暗中在平缓搅拌下孵育反应混合物1小时,在室温下通过添加50μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭,持续15分钟。随后使用Vivaspin 15R 10kD离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
将含有氧化型干扰素-γ的保留物(约7ml)与2ml间甲苯胺水溶液(50mM)混合且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂(上述),产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后,通过离子交换色谱,在SP琼脂糖FF上纯化PEG-干扰素-γ缀合物。用20ml缓冲液A(50mM Hepes,pH 6.5)稀释反应混合物且加载于以缓冲液A预平衡的20ml HiPrepSPFF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。接着用缓冲液B(50mM Hepes、1MNaCl,pH 6.5)洗脱管柱。通过用25%缓冲液B洗涤管柱来洗脱游离干扰素-γ且用50%缓冲液B洗脱缀合物。通过UF/DF/使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2,截断值10kD/Millipore)浓缩含有缀合物的洗脱份。针对含有150mM NaCl的组氨酸缓冲液(pH 6.9)进行最后透滤步骤。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。对于PEG-干扰素-γ缀合物,与天然干扰素γ相比,测得比活性>50%。另外通过尺寸排阻HPLC,使用装备有Shodex KW 803管柱的Agilent 1200HPLC系统,在如先前所述的条件(Kolarich等,Transfusion 2006;46:1959-77)下以分析法表征缀合物。显示制剂不含游离干扰素-γ。
方法2:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使干扰素-γ聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将干扰素-γ转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM过碘酸钠水溶液,得到200μM的浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T=+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应,得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型干扰素-γ。收集洗脱液中含有氧化型干扰素-γ的洗脱份且用于缀合反应。
随后,在最多15分钟的时段(t)内在平缓搅拌下将MW为20kD的氨氧基-PEG试剂以50倍摩尔浓度过量添加至含有纯化的氧化型干扰素-γ的洗脱液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM),得到10mM的最终浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在平缓震荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PEG-干扰素-γ缀合物。收集含有PEG-干扰素-γ缀合物的洗脱份并通过超滤/透滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质和生物活性以分析法表征使用此程序所制备的缀合物。
方法3:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使干扰素-γ聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将10mg干扰素-γ溶解于约8ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl)中。接着添加200μl过碘酸钠水溶液(5mM)和2ml间甲苯胺水溶液(50mM)。随后添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂(上述),产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且在室温下通过添加100μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭,持续15分钟。
最后,通过离子交换色谱,在SP-琼脂糖FF上纯化PEG-干扰素-γ缀合物。用20ml缓冲液A(50mM Hepes,pH 6.5)稀释反应混合物且加载于以缓冲液A预平衡的20ml HiPrep SPFF 16/10管柱(GEHealthcare,Fairfield,CT)上。接着用缓冲液B(50mM Hepes、1MNaCl,pH6.5)洗脱管柱。通过用25%缓冲液B洗涤管柱来洗脱游离干扰素-γ且用50%缓冲液B洗脱缀合物。通过UF/DF/使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2,截断值10kD/Millipore)浓缩含有缀合物的洗脱份。针对含有150mM NaCl的组氨酸缓冲液(pH 6.9)进行最后透滤步骤。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。对于PSA-干扰素-γ缀合物,与天然干扰素-γ相比,测得比活性>50%。另外通过尺寸排阻HPLC,使用装备有Shodex KW 803管柱的Agilent 1200HPLC系统,在如先前所述的条件(Kolarich等,Transfusion 2006;46:1959-77)下以分析法表征缀合物。显示制剂不含游离干扰素-γ。
方法4:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使干扰素-γ聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将初始浓度或重量的干扰素-γ转移至或溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙,pH6.0)中,得到2mg干扰素-γ/ml的最终蛋白质浓度。随后在15分钟内添加5mM过碘酸钠水溶液,得到100μM的最终浓度,随后在30分钟的时段内添加50mM间甲苯胺水溶液,得到10mM的最终浓度。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂(上述),产生20倍摩尔浓度试剂过量。校正pH至6.0后,在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且通过添加1M L-半胱氨酸水溶液以得到10mM的最终浓度来淬灭,持续15分钟。
借助于离子交换色谱(IEC)纯化PEG-干扰素-γ缀合物。通过UF/DF,使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2,截断值10kD/Millipore)浓缩洗脱液中含有缀合物的洗脱份。针对Hepes缓冲液(50mM Hepes、5mM CaCl2,pH 7.5)进行最后透滤步骤。
通过根据已知方法测量总蛋白质(布莱德法和BCA程序)和生物活性以分析法表征制剂。
实施例42
使用氨氧基-PEG试剂和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使G-CSF聚乙二醇化
方法1:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使G-CSF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将G-CSF溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl、5mM CaCl2)中。接着添加过碘酸钠水溶液(5mM)且在4℃下在黑暗中在平缓搅拌下孵育反应混合物1小时,在室温下通过添加7.5μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭,持续15分钟。随后使用Vivaspin离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
接着将含有氧化型G-CSF的保留物与间甲苯胺水溶液(50mM)混合且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂,产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后,通过离子交换色谱(例如在Q-琼脂糖FF上)纯化PEG-G-CSF缀合物。举例来说,将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)平衡的管柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物,接着使用适当MW截断膜进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法1。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使G-CSF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将G-CSF溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mMNaCl、5mM CaCl2)中。接着添加过碘酸钠水溶液(5mM)且在4℃下在黑暗中在平缓搅拌下孵育反应混合物1小时,在室温下通过添加7.5μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭,持续15分钟。随后使用Vivaspin离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
接着将含有氧化型G-CSF的保留物与间甲苯胺水溶液(50mM)混合且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂,产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后,通过离子交换色谱纯化PEG-G-CSF缀合物。收集洗脱液中含有缀合物的洗脱份,接着使用适当MW截断膜进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法2:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使G-CSF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将G-CSF转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM过碘酸钠水溶液,得到200μM的浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T=+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应,得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型G-CSF。收集洗脱液中含有氧化型G-CSF的洗脱份且用于缀合反应。
随后,在最多15分钟的时段(t)内在平缓搅拌下将MW为20kD的氨氧基-PEG试剂以50倍摩尔浓度过量添加至含有纯化的氧化型G-CSF的洗脱液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM),得到10mM的最终浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在平缓震荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PEG-G-CSF缀合物。收集含有PEG-G-CSF缀合物的洗脱份并通过超滤/透滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
方法3:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使G-CSF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将G-CSF溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且与过碘酸钠水溶液(10mM)和间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂,产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭,持续15分钟。
最后,通过离子交换色谱,在Q-琼脂糖FF上纯化PEG-G-CSF缀合物。将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)预平衡的管柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物,接着使用膜进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法3。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使G-CSF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将G-CSF溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且与过碘酸钠水溶液(10mM)和间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂,产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭,持续15分钟。
最后,通过离子交换色谱纯化PEG-G-CSF缀合物。收集洗脱液中含有缀合物的洗脱份,接着使用膜进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法4:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使G-CSF聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将初始浓度或重量的G-CSF转移至或溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到2mg G-CSF/ml的最终蛋白质浓度。随后,在15分钟内添加5mM过碘酸钠水溶液,得到100μM的最终浓度,随后在30分钟的时段内添加50mM间甲苯胺水溶液,得到10mM的最终浓度。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂(上述),产生20倍摩尔浓度试剂过量。校正pH至6.0后,在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且通过添加1M L-半胱氨酸水溶液以得到10mM的最终浓度来淬灭,持续15分钟。
借助于离子交换色谱(IEC)纯化G-CSF缀合物。通过UF/DF,使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2,截断值10kD/Millipore)浓缩洗脱液中含有缀合物的洗脱份。针对Hepes缓冲液(50mM Hepes、5mM CaCl2,pH 7.5)进行最后透滤步骤。
通过根据已知方法测量总蛋白质(布莱德法和BCA程序)和生物活性以分析法表征制剂。
实施例43
使用氨氧基-PEG试剂和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使修美乐聚乙二醇化
方法1:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使修美乐聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将修美乐溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl、5mM CaCl2)中。接着添加过碘酸钠水溶液(5mM)且在4℃下在黑暗中在平缓搅拌下孵育反应混合物1小时,在室温下通过添加7.5μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭,持续15分钟。随后使用Vivaspin离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
接着将含有氧化型修美乐的保留物与间甲苯胺水溶液(50mM)混合且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂,产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后,通过离子交换色谱(例如在Q-琼脂糖FF上)纯化PEG-修美乐缀合物。举例来说,将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mMCaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)平衡的管柱上。用含有5mMCaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物,接着使用适当MW截断膜进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法1。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使修美乐聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将修美乐溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl、5mM CaCl2)中。接着添加过碘酸钠水溶液(5mM)且在4℃下在黑暗中在平缓搅拌下孵育反应混合物1小时,在室温下通过添加7.5μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭,持续15分钟。随后使用Vivaspin离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
接着将含有氧化型修美乐的保留物与间甲苯胺水溶液(50mM)混合且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂,产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后,通过离子交换色谱纯化PEG-修美乐缀合物。收集洗脱液中含有缀合物的洗脱份,接着使用适当MW截断膜进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法2:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使修美乐聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将修美乐转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5N HCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM过碘酸钠水溶液,得到200μM的浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T=+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应,得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型修美乐。收集洗脱液中含有氧化型修美乐的洗脱份且用于缀合反应。
随后,在最多15分钟的时段(t)内在平缓搅拌下将MW为20kD的氨氧基-PEG试剂以50倍摩尔浓度过量添加至含有纯化的氧化型修美乐的洗脱液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM),得到10mM的最终浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在平缓震荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PEG-修美乐缀合物。收集含有PEG-修美乐缀合物的洗脱份并通过超滤/透滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
方法3:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使修美乐聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将修美乐溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且与过碘酸钠水溶液(10mM)和间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂,产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭,持续15分钟。
最后,通过离子交换色谱,在Q-琼脂糖FF上纯化PEG-修美乐缀合物。将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)预平衡的管柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物,接着使用膜进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法3。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使修美乐聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将修美乐溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且与过碘酸钠水溶液(10mM)和间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂,产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭,持续15分钟。
最后,通过离子交换色谱纯化PEG-修美乐缀合物。收集含有缀合物的洗脱份,接着使用膜进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
方法4:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使修美乐聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将初始浓度或重量的修美乐转移至或溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到2mg修美乐/ml的最终蛋白质浓度。随后在15分钟内添加5mM过碘酸钠水溶液,得到100μM的最终浓度,随后在30分钟的时段内添加50mM间甲苯胺水溶液,得到10mM的最终浓度。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂(上述),产生20倍摩尔浓度试剂过量。校正pH至6.0后,在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且通过添加1M L-半胱氨酸水溶液以得到10mM的最终浓度来淬灭,持续15分钟。
借助于离子交换色谱(IEC)纯化修美乐缀合物。通过UF/DF,使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2,截断值10kD/Millipore)浓缩洗脱液中含有缀合物的洗脱份。针对Hepes缓冲液(50mM Hepes、5mM CaCl2,pH 7.5)进行最后透滤步骤。
通过根据已知方法测量总蛋白质(布莱德法和BCA程序)和生物活性以分析法表征制剂。
实施例44
使用氨氧基-PEG试剂和作为亲核性催化剂的间甲苯胺使普罗利亚聚乙二醇化
方法1:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使普罗利亚聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将普罗利亚溶解于7.0ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl、5mM CaCl2)中。接着添加过碘酸钠水溶液(5mM)且在4℃下在黑暗中在平缓搅拌下孵育反应混合物1小时,在室温下通过添加7.5μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭,持续15分钟。随后使用Vivaspin离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
接着将含有氧化型普罗利亚的保留物与间甲苯胺水溶液(50mM)混合且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂,产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后,通过离子交换色谱(例如在Q-琼脂糖FF上)纯化PEG-普罗利亚缀合物。举例来说,将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)平衡的管柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物,接着使用适当MW截断膜进行UF/DF。接着通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(库马斯法、布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法1。通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使普罗利亚聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将10mg rFIX溶解于5ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl)中。接着添加100μl过碘酸钠水溶液(5mM)且在4℃下在黑暗中在平缓搅拌下孵育反应混合物1小时,在室温下通过添加50μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭,持续15分钟。随后使用Vivaspin15R 10kD离心过滤器对混合物进行UF/DF以移除过量过碘酸盐、淬灭剂和其副产物。
将含有氧化型普罗利亚的保留物(约7ml)与2ml间甲苯胺水溶液(50mM)混合且在室温下孵育30分钟。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂(上述),产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育此混合物2.5小时。
最后,通过离子交换色谱,在SP琼脂糖FF上纯化PEG-普罗利亚缀合物。用20ml缓冲液A(50mM Hepes,pH 6.5)稀释反应混合物且加载于以缓冲液A预平衡的20ml HiPrep SPFF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。接着用缓冲液B(50mM Hepes、1MNaCl,pH6.5)洗脱管柱。通过用25%缓冲液B洗涤管柱来洗脱游离普罗利亚且用50%缓冲液B洗脱缀合物。通过UF/DF/使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2,截断值10kD/Millipore)浓缩含有缀合物的洗脱份。针对含有150mM NaCl的组氨酸缓冲液(pH 6.9)进行最后透滤步骤。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。对于PEG-普罗利亚缀合物,与天然普罗利亚相比,测得比活性>50%。另外通过尺寸排阻HPLC,使用装备有Shodex KW 803管柱的Agilent 1200HPLC系统,在如先前所述的条件(Kolarich等,Transfusion 2006;46:1959-77)下以分析法表征缀合物。显示制剂不含游离普罗利亚。
方法2:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使普罗利亚聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将普罗利亚转移至或溶解于反应缓冲液(例如50mM Hepes、350mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到1.0+/-0.25mg/ml的最终蛋白质浓度。接着通过逐滴添加0.5NHCl水溶液将溶液的pH校正至6.0。随后在10分钟内添加40mM过碘酸钠水溶液,得到200μM的浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下进行氧化反应30+/-5分钟。接着通过在T=+22+/-2℃下在15分钟内添加L-半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭反应,得到在反应混合物中10mM的最终浓度并孵育60+/-5分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化氧化型普罗利亚。收集洗脱液中含有氧化型修美乐的洗脱份且用于缀合反应。
在最多15分钟的时段(t)内在平缓搅拌下将MW为20kD的氨氧基-PEG试剂以50倍摩尔浓度过量添加至含有纯化的氧化型普罗利亚的洗脱液中。接着在15分钟内添加间甲苯胺水溶液(50mM),得到10mM的最终浓度。在T=+22+/-2℃的温度(T)下在黑暗中在平缓震荡下孵育反应混合物120+/-10分钟。
通过离子交换色谱进一步纯化所得PEG-普罗利亚缀合物。收集含有PEG-普罗利亚缀合物的洗脱份并通过超滤/透滤(UF/DF)使用由再生纤维素制成且具有适当分子量截断值的膜(Millipore)浓缩。
方法3:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使普罗利亚聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将EPO溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中且与过碘酸钠水溶液(10mM)和间甲苯胺水溶液(50mM)混合。随后添加氨氧基试剂,产生20倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且在室温下通过添加8μl半胱氨酸水溶液(1M)来淬灭,持续15分钟。
最后,通过离子交换色谱,在Q-琼脂糖FF上纯化PEG-普罗利亚缀合物。将每毫升凝胶1.5mg蛋白质加载于以含有5mM CaCl2的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)预平衡的管柱上。用含有5mM CaCl2和500mM氯化钠的50mM Hepes缓冲液(pH 7.4)洗脱缀合物,接着使用膜进行UF/DF。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。
在一个替代实施方案中,如下进行方法3。
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使普罗利亚聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将10mg普罗利亚溶解于约8ml组氨酸缓冲液(pH 6.0)(20mM L-组氨酸、150mM NaCl)中。接着添加200μl过碘酸钠水溶液(5mM)和2ml间甲苯胺水溶液(50mM)。随后添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂(上述),产生5倍摩尔浓度试剂过量。在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且在室温下通过添加100μl 1M半胱氨酸水溶液来淬灭,持续15分钟。
最后,通过离子交换色谱,在SP-琼脂糖FF上纯化PEG-普罗利亚缀合物。用20ml缓冲液A(50mM Hepes,pH 6.5)稀释反应混合物且加载于以缓冲液A预平衡的20ml HiPrepSPFF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。接着用缓冲液B(50mM Hepes、1MNaCl,pH 6.5)洗脱管柱。通过用25%缓冲液B洗涤管柱来洗脱游离普罗利亚且用50%缓冲液B洗脱缀合物。通过UF/DF/使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2,截断值10kD/Millipore)浓缩含有缀合物的洗脱份。针对含有150mM NaCl的组氨酸缓冲液(pH 6.9)进行最后透滤步骤。通过根据所属领域中已知的方法测量总蛋白质(布莱德法)和生物活性以分析法表征制剂。对于PEG-普罗利亚缀合物,与天然普罗利亚相比,测得比活性>50%。另外通过尺寸排阻HPLC,使用装备有Shodex KW 803管柱的Agilent 1200HPLC系统,在如先前所述的条件(Kolarich等,Transfusion 2006;46:1959-77)下以分析法表征缀合物。显示制剂不含游离普罗利亚。
方法4:
通过使用含有氨氧基的线性20kD聚乙二醇化试剂使普罗利亚聚乙二醇化。此类型试剂的一个实例为来自NOF(日本东京的NOF公司)的 CA系列。将初始浓度或重量的修美乐转移至或溶解于Hepes缓冲液(50mM Hepes、150mM氯化钠、5mM氯化钙,pH 6.0)中,得到2mg普罗利亚/ml的最终蛋白质浓度。随后在15分钟内添加5mM过碘酸钠水溶液,得到100μM的最终浓度,随后在30分钟的时段内添加50mM间甲苯胺水溶液,得到10mM的最终浓度。接着添加MW为20kD的氨氧基-PEG试剂(上述),产生20倍摩尔浓度试剂过量。校正pH至6.0后,在室温下在黑暗中在平缓搅拌下孵育混合物2小时且通过添加1M L-半胱氨酸水溶液以得到10mM的最终浓度来淬灭,持续15分钟。
借助于离子交换色谱(IEC)纯化普罗利亚缀合物。通过UF/DF,使用由再生纤维素制成的10kD膜(88cm2,截断值10kD/Millipore)浓缩洗脱液中含有缀合物的洗脱份。针对Hepes缓冲液(50mM Hepes、5mM CaCl2,pH 7.5)进行最后透滤步骤。
通过根据已知方法测量总蛋白质(布莱德法和BCA程序)和生物活性以分析法表征制剂。
实施例45
使用支链PEG使治疗性蛋白质聚乙二醇化
本发明的治疗性蛋白质的聚乙二醇化可扩展至支链或线性聚乙二醇化试剂,其由醛和含有活性氨氧基的适合连接子制成。
序列表
<110> 百深有限责任公司(Baxalta GmbH)
百深公司(Baxalta Incorporated)
<120> 用于肟键联的亲核性催化剂
<130> 31315/46384
<140> 2011800476351
<141> 2011-07-29
<150> 61/369,186
<151> 2010-07-30
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 422
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Leu Asn Arg Pro Lys Arg Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val
1 5 10 15
Gln Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu
20 25 30
Glu Pro Arg Glu Val Phe Glu Asn Thr Glu Lys Thr Thr Glu Phe Trp
35 40 45
Lys Gln Tyr Val Asp Gly Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn
50 55 60
Gly Gly Ser Cys Lys Asp Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro
65 70 75 80
Phe Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile
85 90 95
Lys Asn Gly Arg Cys Glu Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys
100 105 110
Val Val Cys Ser Cys Thr Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys
115 120 125
Ser Cys Glu Pro Ala Val Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser
130 135 140
Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Ala Val Phe Pro Asp Val Asp
145 150 155 160
Tyr Val Asn Pro Thr Glu Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln
165 170 175
Gly Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp
180 185 190
Ala Lys Pro Gly Gln Phe Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val
195 200 205
Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser Ile Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr
210 215 220
Ala Ala His Cys Val Glu Thr Gly Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly
225 230 235 240
Glu His Asn Ile Glu Glu Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val
245 250 255
Ile Arg Ala Ile Ile Pro His His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys
260 265 270
Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu
275 280 285
Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile Cys Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn
290 295 300
Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly Tyr Val Ser Gly Trp Ala Arg Val
305 310 315 320
Phe His Lys Gly Arg Ser Ala Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro
325 330 335
Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Arg Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr
340 345 350
Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys
355 360 365
Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser
370 375 380
Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly
385 390 395 400
Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys
405 410 415
Glu Lys Thr Lys Leu Thr
420

Claims (7)

1.一种修饰的治疗性蛋白质,其通过包括使水溶性聚合物与所述治疗性蛋白质的氧化型碳水化合物部分缀合的方法产生,所述方法包括在允许缀合的条件下使所述氧化型碳水化合物部分与活化的水溶性聚合物接触;
所述水溶性聚合物含有活性氨氧基且选自由以下组成的组:聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)、支链PEG、聚唾液酸(polysialic acid,PSA)、碳水化合物、多糖、普鲁兰(pullulane)、壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚环氧烷(polyalkylene oxide,PAO)、聚亚烷基二醇(polyalkylene glycol,PAG)、聚丙二醇(polypropylene glycol,PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯酰基吗啉、聚乙烯醇(polyvinylalcohol,PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-马来酸酐、聚苯乙烯-共-马来酸酐、聚(1-羟甲基亚乙基羟甲基缩甲醛)(PHF)、2-甲基丙烯酰氧基-2'-乙基三甲基磷酸铵(MPC);和
所述碳水化合物部分通过与包含选自由以下组成的组的氧化剂的缓冲液一起孵育而氧化:过碘酸钠(NaIO4)、四乙酸铅(Pb(OAc)4)和过钌酸钾(KRuO4);
其中在所述氧化型碳水化合物部分与所述水溶性聚合物上的所述活性氨氧基之间形成肟键联;
且其中由亲核性催化剂间甲苯胺催化形成所述肟键联。
2.根据权利要求1所述的修饰的治疗性蛋白质,其中所述治疗性蛋白质选自由以下组成的组:FVIIa,FVIII和FIX;
其中所述水溶性聚合物选自由PEG和PSA组成的组;
其中所述氧化剂是过碘酸钠(NaI04)并且以使最终浓度介于约50μM与约1000μM之间的量添加;和
其中所述亲核性催化剂是间甲苯胺并且以介于约1mM与约50mM之间的浓度提供。
3.一种制备如权利要求1所述的修饰的治疗性蛋白质的方法,其包括:
a)第一步骤,其包括将包含所述治疗性蛋白质的溶液的pH值调整至介于约5.0与约8.0之间的pH值,其中所述治疗性蛋白质浓度介于约0.3mg/ml与约3.0mg/ml之间;
b)第二步骤,其包括氧化所述治疗性蛋白质上的一个或多个碳水化合物,其中所述氧化剂在包含以下的条件下添加至所述第一步骤中的溶液中以使得最终浓度介于约50μM与约1000μM之间:介于约0.1分钟与约120分钟之间的时段;介于约2℃与约37℃之间的温度;在光存在或不存在下;和在搅拌或不搅拌下;
c)第三步骤,其包括在包含以下的条件下使所述治疗性蛋白质与期望的过量浓度的活化的水溶性聚合物接触,其中所述过量浓度介于约1摩尔浓度过量与约300摩尔浓度过量之间:介于约0.5小时与约24小时之间的时段;介于约2℃与约37℃之间的温度;在光存在或不存在下;和在搅拌或不搅拌下;
d)第四步骤,其包括将亲核性催化剂添加至所述第三步骤的溶液中,其中所述亲核性催化剂在包含以下的条件下添加成使得最终浓度介于约1mM与约50mM之间:介于约0.1分钟与约30分钟之间的时段;介于约2℃与约37℃之间的温度;在光存在或不存在下;和在搅拌或不搅拌下;
e)第五步骤,其中所述治疗性蛋白质在允许所述活化的水溶性聚合物与所述治疗性蛋白质上的一个或多个氧化型碳水化合物缀合的条件下与所述活化的水溶性聚合物和亲核性催化剂一起孵育,所述条件包含:介于约0.5小时与约24小时之间的时段;介于约2℃与约37℃之间的温度;在光存在或不存在下;和在搅拌或不搅拌下;和
f)第六步骤,其中所述第五步骤中所述水溶性聚合物与所述治疗性蛋白质的一个或多个氧化型碳水化合物的缀合通过添加选自由以下组成的组的淬灭剂而终止:L-半胱氨酸、甲硫氨酸、谷胱甘肽、甘油、Na2S2O5(偏亚硫酸氢钠)、色氨酸、酪氨酸、组氨酸或其衍生物、甲酚、咪唑和其组合;其中所述淬灭剂在包含以下的条件下添加成使得最终浓度为约1mM和约100mM:介于约5分钟与约120分钟之间的时段;介于约2℃与约37℃之间的温度;在光存在或不存在下;和在搅拌或不搅拌下。
4.根据权利要求3所述的方法,其中步骤a)至e)发生在单个容器中。
5.根据权利要求4所述的方法,其进一步包括纯化所述缀合的治疗性蛋白质的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法,其中所述缀合的治疗性蛋白质通过选自由色谱、过滤和沉淀组成的组的方法来纯化。
7.根据权利要求6所述的方法,其中所述色谱选自由以下组成的组:疏水性相互作用色谱(Hydrophobic Interaction Chromatography,HIC)、离子交换色谱(Ion Exchangechromatography,IEC)、尺寸排阻色谱(Size exclusion chromatography,SEC)、亲和色谱和逆相色谱。
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