EA025738B1 - Способ конъюгирования водорастворимого полимера с терапевтическим белком (варианты) и полученный модифицированный белок (варианты) - Google Patents

Способ конъюгирования водорастворимого полимера с терапевтическим белком (варианты) и полученный модифицированный белок (варианты) Download PDF

Info

Publication number
EA025738B1
EA025738B1 EA201300190A EA201300190A EA025738B1 EA 025738 B1 EA025738 B1 EA 025738B1 EA 201300190 A EA201300190 A EA 201300190A EA 201300190 A EA201300190 A EA 201300190A EA 025738 B1 EA025738 B1 EA 025738B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
protein
soluble polymer
factor
water
group
Prior art date
Application number
EA201300190A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201300190A1 (ru
EA025738B9 (ru
Inventor
Юрген Зикманн
Штефан Хайдер
Ханспетер Роттенштайнер
Андреас Ивенс
Петер Турецек
Оливер Цехлинг
Original Assignee
Баксалта Инкорпорейтид
Баксалта Гмбх
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Баксалта Инкорпорейтид, Баксалта Гмбх filed Critical Баксалта Инкорпорейтид
Publication of EA201300190A1 publication Critical patent/EA201300190A1/ru
Publication of EA025738B1 publication Critical patent/EA025738B1/ru
Publication of EA025738B9 publication Critical patent/EA025738B9/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/24—Drugs for disorders of the endocrine system of the sex hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/02—Non-specific cardiovascular stimulants, e.g. drugs for syncope, antihypotensives

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Изобретение относится к материалам и способам конъюгации водорастворимого полимера с окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка, включающей контактирование окисленного углеводного фрагмента с активированным водорастворимым полимером в условиях, позволяющих конъюгацию. В частности, данное изобретение относится к вышеупомянутым материалам и способам, где водорастворимый полимер содержит активную аминооксигруппу, где оксимная или гидразоновая связь формируется между окисленным углеводным фрагментом и активной аминооксигруппой на водорастворимом полимере и где конъюгация проводится в присутствии нуклеофильного катализатора.

Description

Данное изобретение относится к материалам и способам для конъюгирования водорастворимых полимеров с белками.
Уровень техники
Приготовление конъюгатов путем ковалентного связывания водорастворимого полимера с терапевтическим протеином может осуществляться различными химическими способами. Пегилирование полипептидных препаратов защищает их при циркуляции и улучшает их фармакодинамические и фармакокинетические профили (Натз апб Сйезз, Ыа1 Кеу Эгид Όίδοον. 2003; 2:214-21). Во время процесса пегилирования происходит присоединение повторяющихся единиц этиленгликоля (полиэтиленгликоля - ПЭГ) к полипептидному препарату. Молекулы ПЭГ обладают большим гидродинамическим объемом (в 5-10 раз превышающим размер глобулярных белков), хорошо растворимы в воде и гидратированы, нетоксичны, неиммуногенны и быстро выводятся из организма. Пегилирование молекул может способствовать повышению устойчивости препаратов к ферментативному расщеплению, увеличивать период полужизни ίη νίνο, уменьшать частоту введения доз, понижать иммуногенность, повышать физическую и термическую стабильность, растворимость, стабильность в жидком виде и уменьшать агрегацию. Первые пегилированные препараты были утверждены Управлением США по надзору за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств (ΡΌΑ) в начале 1990-х гг. С тех пор ΡΌΑ утвердило ряд пегилированных препаратов для приема внутрь, парентерального введения и местного применения.
Полисиаловая кислота (ПСК), также называемая коломиновой кислотой (КК), является природным полисахаридом. Это гомополимер Ν-ацетилнейраминовой клслоты с а(2^8)-кетозидными связями, содержащий вицинальные диольные группы на своем невосстанавливающем конце. Она несет отрицательный заряд и встречается в организме человека. Она может быть легко получена с помощью бактерий в больших количествах и с предопределенными физическими характеристиками (патент И8 № 5846951). Поскольку бактериальная ПСК химически и иммунологически идентична человеческой ПСК, бактериальная ПСК неиммуногенна, даже при соединении с протеинами. В отличие от некоторых полимеров, ПСК подвергается биоразложению. При ковалентном соединении коломиновой кислоты с каталазой и аспарагиназой было выявлено увеличение стабильности этих ферментов в присутствии протеолитических энзимов плазмы крови. Сравнительные исследования ίη νίνο с полисиалированной и немодифицированной аспарагиназой показали, что полисиалирование увеличивало время полужизни фермента (Регпапбез апб Огедопаб18, 1п! 1. Рйагт. 2001; 217:215-24).
Связывание ПЭГ-производных с пептидами или белками описано в работе Койейз е! а1. (Α6ν Эгид ЭеПу Кеу 2002; 54:459-76). Один подход к связыванию водорастворимых полимеров с терапевтическими протеинами заключается в конъюгации полимеров с углеводными фрагментами молекул протеинов. Вицинальные гидроксильные (ОН) углеводные группы протеинов могут быть легко окислены периодатом натрия ЩаЮ4) с образованием активных альдегидных групп (Ко1й1и8 е! 8тИй, 1. ΒίοΙ Сйет 1963; 238:1402-10; νаη Ьеп!еп е! АзйтееП, 1. ΒίοΙ Сйет 1971; 246:1889-94). Потом полимер можно соединить с альдегидными группами углеводов, используя реагенты, содержащие, например, активные гидразидные группы (ЛУПсйек М. апб Вауег Е.А., Мебюбз Εηζутο1 1987; 138:429-42). Более современная технология заключается в использовании реагентов, содержащих аминооксигруппы, которые реагируют с альдегидными, формируя оксимные связи (\УО 96/40662, \УО 2008/025856).
Дополнительные примеры конъюгации водорастворимого полимера с терапевтическим протеином представлены в \УО 06/071801, в котором описывается окисление углеводных фрагментов фактора Фон Виллебранда и последующее связывание с ПЭГ гидразидным способом; публикации И8 2009/0076237, в которой описывается окисление рф-УШ и последующее связывание с ПЭГ и иными водорастворимыми полимерами (например, ПСК, ГЭК (НЕ§), декстран) гидразидным способом; \УО 2008/025856, в котором описывается окисление различных факторов свертывания, в том числе рф-ΙΧ, Ф-УШ и Ф-УНа и их, например, с ПЭГ, способом аминооксигрупп с формированием оксимных связей; и в патенте И8 № 5621039, в котором описывается окисление Ф-ΙΧ и последующее связывание с ПЭГ гидразидным способом.
Недавно был предложен улучшенный способ, заключающийся в мягком периодатном окислении сиаловых кислот с формированием альдегидных групп и последующем их взаимодействии с реагентом, содержащим аминооксигруппы в присутствии каталитических количеств анилина Щикзеп А., апб Эа\\8οη Р.Е., Β^οсοη^ида!е Сйет. 2008; 19,2543-8; и 2епд Υ е! а1., №Циге Мебюбз 2009; 6:207-9). Катализ анилином значительно ускоряет образование оксимных связей, что позволяет использовать очень низкие концентрации реагента. Применение нуклеофильных катализаторов также описано в работах Э|гк8еп. А., е! а1., 1. Ат Сйет. δοα, 128:15602-3 (2006); Эикзеп, А., е! а1., Апдете сйет. 1п! Еб., 45:7581-4 (2006); ΚοΗ1ег, П, СйетВюСйет., 10:2147-50 (2009); Οΐ^ρρο^, Ν., е! а1., 1. Ат Сйет. δοα, 127:5528-39 (2005); и Тйудезеп, М.В., е! а1., 1. Огд. Сйет., 75:1752-5 (2010).
Хотя катализ анилином может ускорять образование оксимных связей, позволяя быстрое протекание реакции и использование низких концентраций аминоокси-реагента, анилин характеризуется токсичностью, с которой приходится считаться, к примеру, при конъюгировании терапевтического белка с целью получения лекарственного средства. К примеру, было показано, что анилин может вызывать мет- 1 025738 гемоглобинемию (Наткоп, ΙΗ., апб 1о11о№, Ό.Ι, Мо1еси1аг Рйаттасо1о§у, 32(3) 423-431, 1987). Долгосрочное его введение крысам с едой, как показано, приводило к образованию опухолей селезенки (Сообтап. Ό.Ο., е! а1., 1. Νηΐΐ. Сапсег Ιηκΐ., 73 (1):265-73, 1984). Исследования ίη уйго также показали, что анилин способен вызывать хромосомные мутации и обладает потенциально генотоксической активностью (ВотЬЬатб Е.М. е! НетЬо1б В., Стй1са1 Ве\ае\У5 ίη Тох1со1о§у 35,783-835, 2005).
Учитывая потенциально опасные свойства анилина и несмотря на то, что способы конъюгирования водорастворимых полимеров с терапевтическими протеинами известны, остается необходимость в разработке материалов и способов для конъюгирования водорастворимых полимеров с протеинами, которые улучшали бы фармакокинетические и/или фармакодинамические свойства белка с минимизацией затрат на различные реагенты, а также минимизировали бы риски для здоровья пациента-реципиента.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение предлагает материалы и способы для конъюгации полимеров и белков, что улучшает фармакодинамические и/или фармакокинетические свойства белков, минимизирующие затраты, связанные с различными реагентами и риски для здоровья пациентов-реципиентов при катализе реакции конъюгации нуклеофильным катализатором. В различных воплощениях изобретения предлагаются альтернативные анилину катализаторы.
В одном воплощении изобретения предлагается способ конъюгирования водорастворимого полимера с окисленным углеводным фрагментом белка свертывания крови, который включает контактирование окисленного углеводного фрагмента с активированным водорастворимым полимером в условиях, позволяющих конъюгацию; упомянутый водорастворимый полимер содержит активную аминооксигруппу и выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, Ро1уРЕС® (\Уаг\\зск ЕШес! Ро1утетк; Ковентри, Соединенное Королевство), полисиаловой кислоты (ПСК), крахмала, гидроксиалкилкрахмала (ГАК), гидроксиэтилкрахмала (ГЭК), углевода, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дераматансульфата, крахмала, декстрана, карбоксиметил-декстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полипропиленгликоля (ППГ), полиоксазолина, полиакрилоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, полиэтилен-комалеиновой кислоты ангидрида, полистирол-комалеиновой кислоты ангидрида, поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилтриметиламмонийфосфата (МФС); а упомянутый углеводный фрагмент окисляется путем инкубирования в буфере, содержащем окислитель, выбранный из группы, состоящей из периодата натрия (Ν;ιΙΟ(), тетраацетата свинца (РЬ(ОАс)4) и перрутената калия (ККиО4); причем оксимная связь формируется между окисленным углеводным фрагментом и активной аминооксигруппой водорастворимого полимера; и причем упомянутое образование оксимной связи катализируется нуклеофильным катализатором, выбранным из группы, состоящей из о-аминобензойной кислоты, м-аминобензойной кислоты, п-аминобензойной кислоты, сульфаниловой кислоты, о-аминобензамида, о-толуидина, мтолуидина, п-толуидина, о-анизидина, м-анизидина и п-анизидина.
В другом воплощении изобретения предлагается способ конъюгирования водорастворимого полимера с окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка, который включает контактирование окисленного углеводного фрагмента с активированным водорастворимым полимером в условиях, позволяющих конъюгацию; упомянутый терапевтический белок выбирается из группы, состоящей из фактора IX (Ф-ΙΧ), фактора VIII (Ф-УШ), фактора УПа (Ф-УПа), фактора Фон Виллебранда (ФВф), фактора РУ (Ф-У), фактора X (фХ), фактора XI (Ф-ХЦ, фактора XII (Ф-ΧΠ), тромбина (Ф-П), протеина С, протеина 8, !РА, РАН, тканевого фактора (Тф), протеазы АИАМТЗ 13, [И-1 альфа, !И-1 бета, [И-2, [И-3, Ш-4, [И-5, [И-6, Ш-11, колониестимулирующего фактора-1 (С8Р-1), М-С8Р, 8СР, СМ-С8Р, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (С-С8Р), ЕРО, интерферона-альфа (ΣΡΝ-альфа), консенсусного интерферона, ΣΡΝ-бета, ШИ-гамма, ШИ-омега, Ш-7, Ш-8, [И-9, Ш-К), [И-12, Ш-13, Ш-14, Ш-15, Ш-Ш Ш-17,Ш-18,Ш-19, Ш-20, Ш-21, Ш-22, Ш-23, Ш-24, Ш-31, Ш-32 альфа, Ш-33, тромбопоэтина (ТРО), АпдI, Апд-2, Апд-4, Апд-Υ, ангиопоэтин-подобного полипептида 1 (АИСРТЫ), ангиопоэтин-подобного полипептида 2 (АИСРТЬ2), ангиопоэтин-подобного полипептида 3 (АИСРТЬ3), ангиопоэтин-подобного полипептида 4 (АИСРТЬ4), ангиопоэтин-подобного полипептида 5 (АИСРТЬ5), ангиопоэтин-подобного полипептида 6 (АИСРТЬб), ангиопоэтин-подобного полипептида 7 (АИСРТЬ7), витронектина, фактора роста сосудистого эндотелия (УЕСР), ангиогенина, активина А, активина В, активина С, костного морфогенного белка-1, костного морфогенного белка-2, костного морфогенного белка-3, костного морфогенного белка-4, костного морфогенного белка-5, костного морфогенного белка-6, костного морфогенного белка-7, костного морфогенного белка-8, костного морфогенного белка-9, костного морфогенного белка-10, костного морфогенного белка-11, костного морфогенного белка-12, костного морфогенного белка-13, костного морфогенного белка-14, костного морфогенного белка-15, костного морфогенного белка рецептора костного морфогенного белка рецептора ГВ, костного морфогенного белка рецептора
II, мозгового нейротрофического фактора, кардиотрофина-1, цилиарного нейротрофического фактора, цилиарного нейротрофического фактора рецептора, крипто, криптического, цитокин-индуцированного хемотаксического фактора нейтрофилов 1, цитокин-индуцированного хемотаксического фактора ней- 2 025738 трофилов 2α, цитокин-индуцированного хемотаксического фактора нейтрофилов 2β, β-эндотелиального фактора роста клеток, эндотелина 1, фактора роста эпидермиса, эпигена, эпирегулина, эпителиального аттрактанта нейтрофилов, фактора роста фибробластов 4, фактора роста фибробластов 5, фактора роста фибробластов 6, фактора роста фибробластов 7, фактора роста фибробластов 8, фактора роста фибробластов 8Ь, фактора роста фибробластов 8с, фактора роста фибробластов 9, фактора роста фибробластов 10, фактора роста фибробластов 11, фактора роста фибробластов 12, фактора роста фибробластов 13, фактора роста фибробластов 16, фактора роста фибробластов 17, фактора роста фибробластов 19, фактора роста фибробластов 20, фактора роста фибробластов 21, кислотного фактора роста фибробластов, основного фактора роста фибробластов, линии глиальных клеток нейтрофического фактора рецептора αί, линии глиальных клеток нейтрофического фактора рецептора α2, рост-связанного белка, рост-связанного белка α, рост-связанного белка β, рост-связанного белка γ, гепарин-связывающего фактора роста эпидермиса, фактора роста гепатоцитов, рецептора фактора роста гепатоцитов, гепатомного фактора роста, инсулинподобного фактора роста I, инсулин-подобного фактора роста рецептора, инсулин-подобного фактора роста II, инсулин-подобного фактора роста связывающего белка, фактора роста кератиноцитов, фактора ингибирования лейкоза, фактора ингибирования лейкоза рецептора α, фактора роста нервов, рецептора фактора роста нервов, нейропоэтина, нейтрофина-3, нейтрофина-4, онкостатина М (О8М), фактора роста плаценты, фактора роста плаценты 2, тромбоцитного фактора роста клеток эндотелия, тромбоцитного фактора роста, тромбоцитного фактора роста А цепи, тромбоцитного фактора роста АА, тромбоцитного фактора роста АВ, тромбоцитного фактора роста В цепи, тромбоцитного фактора роста ВВ, тромбоцитного фактора роста рецептора α, тромбоцитного фактора роста рецептора β, пре-В клеток роста фактора стимуляции, фактора стволовых клеток (§СР), рецептора фактора стволовых клеток, ΤΝΕ. включая ΤΝΕ0. ΤΝΕ1, ΤΝΕ2, фактора трансформирования роста α, фактора трансформирования роста β, фактора трансформирования роста β1, фактора трансформирования роста β 1.2, фактора трансформирования роста β2, фактора трансформирования роста β3, фактора трансформирования роста β5, латентного фактора трансформирования роста β1, фактора трансформирования роста β связывающего белка I, фактора трансформирования роста β связывающего белка II, фактора трансформирования роста β связывающего белка III, тимуса стромального лимфопоэтина (ΤδΕΡ), фактора некроза опухолей рецептора типа I, фактора некроза опухолей рецептора типа II, урокиназного типа плазминогена активатора рецептора, фосфолипаза-активирующего белка (ΡϋΡ), инсулина, лектина, рицина, пролактина, хорионического гонадотропина, фолликул-стимулирующего гормона, тирео-стимулирующего гормона, тканевого активатора плазминогена, ЦС, !дЕ, ЦМ, !дА и ЦО, α-галактозидазы, β-галактозидазы, ДНКазы, фетуина, лютеинизирующего гормона, эстрогена, инсулина, альбумина, липопротеинов, фетопротеинов, трансферрина, тромбопоэтина, урокиназы, интегрина, тромбина, лептина, Нитка (адалимумаба), Ртойа (денозумаба), ЕпЬге1 (этанерцепта), белка из табл. 1 или их биологически активных фрагментов, производных или вариантов; упомянутый водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу выбирается из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, Ро1уРЕС® (ХУагИек ЕГГее! Ро1утет8; Ковентри, Соединенное Королевство), полисиаловой кислоты (ПСК), крахмала, гидроксиалкилкрахмала (ГАК), гидроксилэтилкрахмала (ГЭК), углеводов, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дерматансульфата, крахмала, декстрана, карбоксиметилдекстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полипропиленгликоля (III11'), полиоксазолина, полиакрилоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, сополимера полиэтилена с малеиновым ангидридом, сополимера полистирола с малеиновым ангидридом, поли(1-гидроксиметилэтилен гидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилтриметиламмонийфосфата (МФС); а упомянутый углеводный фрагмент окисляется путем инкубирования в буфере, содержащем окислитель, выбранный из группы, состоящей из периодата натрия (АаЮ/ тетраацетата свинца (РЬ(ОАс)4) и перрутената калия (ККиО4); причем оксимная связь формируется между окисленным углеводным фрагментом и активной аминооксигруппой водорастворимого полимера; и причем упомянутое образование оксимной связи катализируется нуклеофильным катализатором, который выбран из группы, состоящей из о-аминобензойной кислоты, м-аминобензойной кислоты, п-аминобензойной кислоты, сульфаниловой кислоты, оаминобензамида, о-толуидина, м-толуидина, п-толуидина, о-анизидина, м-анизидина и п-анизидина.
В еще одном воплощении предлагается вышеупомянутый способ, отличающийся тем, что величина рН раствора, содержащего исходную концентрацию терапевтического белка от приблизительно 0,3 мг/мл до приблизительно 3,0 мг/мл, доводится до величины от приблизительно 5,0 до приблизительно 8,0 до контактирования с активированным водорастворимым полимером.
При использовании здесь, термин приблизительно обозначает величину выше или ниже указанной величины. В различных воплощениях термин приблизительно включает указанную величину и интервал в пределах выше или ниже на 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10% от указанной величины.
В еще одном воплощении предлагается вышеупомянутый способ, отличающийся тем, что исходная концентрация терапевтического белка равна приблизительно 1,0 мг/мл, а рН равен приблизительно 6,0. В
- 3 025738 родственном воплощении исходная концентрация терапевтического белка равна приблизительно 0,75 мг/мл, а рН равен приблизительно 6,0. В еще одном родственном воплощении исходная концентрация терапевтического белка равна приблизительно 1,25 мг/мл, а рН равен приблизительно 6,0.
В другом воплощении предлагается вышеупомянутый способ, в котором терапевтический белок контактирует с желаемой избыточной концентрацией активированного водорастворимого полимера, причем избыточная концентрация составляет от приблизительно 1-молярного до приблизительно 300молярного избытка. В другом воплощении избыточная концентрация равна приблизительно 50-кратному молярному избытку.
В другом воплощении предлагается вышеупомянутый способ, отличающийся тем, что терапевтический белок инкубируется с активированным водорастворимым полимером в условиях, которые включают период времени от приблизительно 0,5 до приблизительно 24 ч; температуру от приблизительно 2 до приблизительно 37°С; при наличии или в отсутствие света, при перемешивании или без него. В другом воплощении условия включают период времени приблизительно в 120 мин, температуру приблизительно 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания. При использовании здесь, подразумевается, что термин перемешивание включает перемешивание на различных скоростях и интенсивностях (например, осторожное перемешивание) при помощи используемого обычно лабораторного или производственного оборудования и продуктов.
В другом воплощении предлагается вышеупомянутый способ, отличающийся тем, что нуклеофильный катализатор добавляется в таком количестве, чтобы итоговая концентрация составила от приблизительно 1,0 до приблизительно 50 мМ нуклеофильного катализатора, в условиях, которые включают период времени от приблизительно 0,1 до приблизительно 30 мин; температуру от приблизительно 2 до приблизительно 37°С; при наличии или в отсутствие света, при перемешивании или без него. В другом воплощении итоговая концентрация нуклеофильного катализатора равна приблизительно 10 мМ, а условия включают период времени приблизительно в 15 мин, температуру приблизительно 22°С, отсутствие света; и наличие перемешивания.
В еще одном воплощении предлагается вышеупомянутый способ, отличающийся тем, что окислитель добавляется в таком количестве, чтобы итоговая концентрация составила от приблизительно 50 до приблизительно 1000 мкМ окислителя, в условиях, которые включают период времени от приблизительно 0,1 до 120 мин; температуру от приблизительно 2 до приблизительно 37°С; при наличии или в отсутствие света, при перемешивании или без него. В другом воплощении итоговая концентрация окислителя равна приблизительно 400 мкМ, а условия включают период времени приблизительно в 10 мин, температуру приблизительно 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания.
В еще одном воплощении предлагается вышеупомянутый способ, отличающийся тем, что конъюгация водорастворимого полимера с окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка останавливается путем добавления гасителя, выбранного из группы, состоящей из Ь-цистеина, метионина, глутатиона, глицерина, натрия метабисульфита (Ыа282О5), триптофана, тирозина, гистидина или их производных, крезола, имидазола и их комбинаций; причем гаситель добавляется в таком количестве, чтобы итоговая концентрация составила от приблизительно 1 до приблизительно 100 мМ гасителя, в условиях, которые включают период времени от приблизительно 5 до приблизительно 120 мин; температуру от приблизительно 2 до приблизительно 37°С; при наличии или в отсутствие света, при перемешивании или без него. В ином воплощении гасителем является Ь-цистеин. В еще одном воплощении Ь-цистеин добавляют до итоговой концентрации приблизительно в 10 мМ, а условия включают период времени приблизительно в 60 мин, температуру приблизительно 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания.
В другом воплощении предлагается вышеописанный способ, включающий: а) первый этап, включающий корректировку величины рН раствора, содержащего терапевтический белок, до уровня рН от приблизительно 5,0 до приблизительно 8,0, причем концентрация терапевтического белка составляет от приблизительно 0,3 мг/мл до приблизительно 3,0 мг/мл; б) второй этап, включающий окисление одного и более углеводов в терапевтическом белке, причем окислитель добавляется к раствору, полученному на первом этапе до итоговой концентрации от приблизительно 50 до приблизительно 1000 мкМ, в условиях, которые включают период времени от приблизительно 0,1 до 120 мин; температуру от приблизительно 2 до приблизительно 37°С; при наличии или в отсутствие света, при перемешивании или без него; в) третий этап, включающий контактирование терапевтического белка с желаемой избыточной концентрацией активированного водорастворимого полимера, причем избыточная концентрация составляет от приблизительно 1-молярного избытка до приблизительно 300-молярного избытка, в условиях, включающих период времени от приблизительно 0,5 до приблизительно 24 ч, температуру от приблизительно 2 до приблизительно 37°С; при наличии или в отсутствие света, при перемешивании или без него; г) четвертый этап, включающий добавление нуклеофильного катализатора к раствору, полученному на третьем этапе, причем нуклеофильный катализатор добавляется в таком количестве, чтобы итоговая концентрация составила от приблизительно 1,0 мМ до приблизительно 50 мМ нуклеофильного катализатора, в условиях, которые включают период времени от приблизительно 0,1 до приблизительно 30 мин; температуру от приблизительно 2 до приблизительно 37°С; при наличии или в отсутствие света, при перемешивании или без него; д) пятый этап, на котором терапевтический белок инкубируют с активированным водораство- 4 025738 римым полимером и нуклеофильным катализатором в условиях, позволяющих конъюгацию активированного водорастворимого полимера с одним или более окисленных углеводов терапевтического белка, в упомянутых условиях, которые включают период времени от приблизительно 0,5 до приблизительно 24 ч; температуру от приблизительно 2 до приблизительно 37°С; при наличии или в отсутствие света, при перемешивании или без него; и е) шестой этап, на котором конъюгация водорастворимого полимера с одним или более окисленных углеводных фрагментов терапевтического белка, начатая на пятом этапе, останавливается путем добавления гасителя, выбранного из группы, состоящей из Ь-цистеина, метионина, глутатиона, глицерина, Ыа282О5 (натрия метабисульфита), триптофана, тирозина, гистидина или их производных, крезола, имидазола и их комбинаций; причем гаситель добавляется в таком количестве, чтобы итоговая концентрация составила от приблизительно 1 мМ до приблизительно 100 мМ гасителя, в условиях, которые включают период времени от приблизительно 5 мин до приблизительно 120 мин; температуру от приблизительно 2 до приблизительно 37°С; при наличии или в отсутствие света, при перемешивании или без него. В ином воплощении исходная концентрация терапевтического белка на первом этапе равна приблизительно 1 мг/мл, а рН равен приблизительно 6,0; причем итоговая концентрация окислителя на втором этапе равна приблизительно 400 мкМ, а условия на пятом этапе включают период времени приблизительно 10 мин, температуру приблизительно 22°С, отсутствие света и перемешивание; причем избыточная концентрация на третьем этапе составляет приблизительно 50 молярных избытков; причем условия на третьем этапе включают период времени приблизительно 15 мин, температуру приблизительно 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания; причем итоговая концентрация нуклеофильного катализатора на четвертом этапе равна приблизительно 10 мМ, а условия на четвертом этапе включают период времени приблизительно 15 мин, температуру приблизительно 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания; причем условия инкубирования терапевтического белка с активированным водорастворимым полимером и нуклеофильным катализатором на пятом этапе включают период времени приблизительно 2 ч; температуру приблизительно 22°С; отсутствие света и наличие перемешивания; и причем гасителем на шестом этапе выступает Ь-цистеин; и причем Ь-цистеин добавляется до итоговой концентрации приблизительно в 10 мМ, а условия на шестом этапе включают период времени приблизительно 60 мин, температуру приблизительно 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания.
В другом воплощении предлагается вышеупомянутый способ, отличающийся тем, что водорастворимым полимером является ПСК. В ином воплощении ПСК состоит из приблизительно 10-300 единиц сиаловой кислоты. В другом воплощении водорастворимым полимером является ПЭГ. В другом воплощении водорастворимым полимером является ГЭК. В другом воплощении водорастворимым полимером является Г АК.
В еще одном воплощении предлагается вышеупомянутый способ, отличающийся тем, что терапевтическим белком является Φ-ΙΧ. В еще одном воплощении терапевтическим белком является Ф-У11а. В еще одном воплощении терапевтическим белком является Ф-УШ.
В еще одном воплощении предлагается вышеупомянутый способ, отличающийся тем, что окислителем выступает периодат натрия (ЫаЮ4).
В еще одном воплощении изобретения предлагается способ, отличающийся тем, что окисленные углеводные фрагменты терапевтического белка расположены на участке активационного пептида белка свертывания крови.
В одном воплощении предлагается вышеупомянутый способ, отличающийся тем, что он осуществляется с ПСК, приготовленной путем взаимодействия активированного аминооксисшивающего агента с окисленной ПСК; причем аминооксисшивающий агент выбран из группы, состоящей из:
а) сшивающего агента 3-оксопентан-1,5-диоксиамина, имеющего следующую формулу:
б) сшивающего агента 3,6,9-триоксоундекан -1,11-диоксиамина, имеющего следующую формулу:
в) сшивающего агента 3,6,9,12,15-пентаокса-гептадекан-1,17-диоксиамина, имеющего следующую формулу:
причем ПСК окислена путем инкубирования с окислителем, чтобы образовать терминальные альдегидные группы на невосстанавливающем конце ПСК. В связанном воплощении аминооксисшивающим агентом является 3-оксопентан-1,5-диоксиамин.
В еще одном воплощении вышеуказанный способ выполняется с использованием в качестве окислителя ЫаЮ4.
В ином воплощении вышеуказанный способ выполняется с использованием нуклеофильного катализатора в концентрации от приблизительно 1 до приблизительно 50 мМ. В одном воплощении в качестве нуклеофильного катализатора выступает м-толуидин. В еще одном воплощении при реакции конъю- 5 025738 гации м-толуидин находится в концентрации приблизительно 10 мМ.
В ином воплощении изобретения вышеупомянутый способ дополнительно содержит этап восстановления оксимной связи конъюгированного терапевтического белка, выполняемый путем инкубирования конъюгированного терапевтического белка в буфере, содержащем восстановитель, выбранный из группы, состоящей из цианоборогидрида натрия (Ναί'.'ΝΒΗ3). аскорбиновой кислоты (витамин С) и ΝαΒΗ3. В одном воплощении в качестве восстановителя используется цианоборогидрид натрия (ΝαΟΝΒΗ3).
В еще одном воплощении предлагается упомянутый выше способ, который дополнительно содержит этап очистки конъюгированного терапевтического белка. В другом воплощении конъюгированный терапевтический белок очищается по способу, выбранному из группы, состоящей из хроматографии, фильтрации и осаждения. В ином воплощении хроматография выбрана из группы, состоящей из хроматографии гидрофобного взаимодействия (Н1С), ионообменной хроматографии (1ЕС), эксклюзионной хроматографии (8ЕС), аффинной хроматографии и обратно-фазовой хроматографии. В еще одном воплощении на хроматографическом этапе загрузки и хроматографическом этапе промывания используется антихаотропическая соль. В еще одном воплощении хроматография производится в колонке. В ином воплощении в колонке содержится хроматографическая смола, выбранная из группы, состоящей из фенил-сефарозы РР и бутил-сефарозы РР. В ином воплощении в колонке находится слой смолы высотой от приблизительно 5 до приблизительно 20 см. В одном воплощении высота слоя равна приблизительно 10 см.
В другом воплощении предлагается вышеупомянутый способ, который содержит один или более этапов промывания, при которых поток направляется вверх и при которых скорость потока составляет от приблизительно 0,2 до приблизительно 6,7 см/мин. При использовании здесь термин направление потока вниз обозначает направление потока из верхней части хроматографической колонки в нижнюю часть хроматографической колонки (нормальное направление потока/стандартный режим). При использовании здесь термин направление потока вверх обозначает направление потока из нижней части в верхнюю часть колонки (обратное направление потока). В одном воплощении скорость потока равна приблизительно 2 см/мин.
В другом воплощении предлагается вышеупомянутый способ, который содержит один или более этапов элюирования, при которых поток направляется вниз и при которых скорость потока составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 6,7 см/мин. В родственном воплощении скорость потока равна приблизительно 1 см/мин.
В еще одном воплощении предлагается упомянутый выше способ, который дополнительно содержит концентрирование конъюгированного терапевтического белка ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ). В другом воплощении итоговая концентрация терапевтического белка составляет от приблизительно 0,5 до приблизительно 3 мг/мл.
В другом воплощении предлагается вышеупомянутый способ, в котором терапевтический белок содержит от приблизительно 5 до приблизительно 11 фрагментов водорастворимого полимера. В другом воплощении терапевтический белок содержит от приблизительно 1 до приблизительно 3 фрагментов водорастворимых полимеров.
В еще одном воплощении предлагается вышеупомянутый способ, в котором конъюгированный терапевтический белок очищается при помощи хроматографии; причем на этапе загрузки и на этапе промывки используется антихаотропическая соль; способ, который содержит один или более этапов промывания, при которых поток направляется вверх и при которых скорость потока составляет от приблизительно 0,2 до приблизительно 6,7 см/мин и один или более этапов элюирования, при которых поток направляется вниз и при которых скорость потока составляет от приблизительно 0,2 до приблизительно 6,7 см/мин; дополнительно содержащий концентрирование конъюгированного терапевтического белка ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ). В другом воплощении хроматография является хроматографией гидрофобного взаимодействия (Н1С); при которой скорость потока на одном или более этапов промывки равна приблизительно 2 см/мин; и при которой скорость потока на одном или более этапов элюирования равна приблизительно 1 см/мин.
В другом воплощении предлагается модифицированный терапевтический белок, который производится по любому из вышеупомянутых способов.
В еще одном воплощении предлагается способ формирования оксимной связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную аминооксигруппу, включающий этапы: а) окисления углеводного фрагмента терапевтического белка путем инкубирования указанного белка с окисляющим агентом, выбранным из группы, состоящей из натрия периодата (Ν;·ιΙΟ4), свинца тетраацетата (РЬ(ОАс)4) и калия перрутената (ККиО4); и б) образования оксимной связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную аминооксигруппу в присутствии нуклеофильного катализатора в условиях, позволяющих образование упомянутой оксимной связи; причем упомянутый водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, Ро1уРЕО® (ХУагмюк ЕГГсс1 Ро1- 6 025738 утег8; Ковентри, Соединенное Королевство), полисиаловой кислоты (ПСК), крахмала, гидроксиалкилкрахмала (ГАК), гидроксиэтилкрахмала (ГЭК), углевода, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дераматансульфата, крахмала, декстрана, карбоксиметилдекстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полипропиленгликоля (ППГ), полиоксазолина, полиакрилоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, полиэтилен-комалеиновой кислоты ангидрида, полистиролкомалеиновой кислоты ангидрида, поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаля) (ПГФ), 2метакрилоилокси-2'-этилтриметиламмонийфосфата (МФС); причем нуклеофильный катализатор выбран из группы, состоящей из о-аминобензойной кислоты, м-аминобензойной кислоты, п-аминобензойной кислоты, сульфаниловой кислоты, о-аминобензамида, о-толуидина, м-толуидина, п-толуидина, оанизидина, м-анизидина и п-анизидина.
В еще одном воплощении предлагается способ формирования оксимной связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную аминооксигруппу, включающий этапы: а) окисления углеводного фрагмента терапевтического белка путем инкубирования указанного белка с окисляющим агентом, выбранным из группы, состоящей из натрия периодата (ЫаЮ4), свинца тетраацетата (РЬ(ОАс)4) и калия перрутената (ККиО4); и б) образования оксимной связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную аминооксигруппу в присутствии нуклеофильного катализатора в условиях, позволяющих образование упомянутой оксимной связи; причем терапевтический белок выбран из группы, состоящей из фактора IX (Ф-ΙΧ), фактора VIII (Ф-УШ), фактора УИа (Ф-УПа), фактора Фон Виллебранда (ФВф), фактора РУ (Ф-У), фактора X (Ф-Х), фактора XI (Ф-ХЦ, фактора XII (Ф-ΧΠ), тромбина (РП), белка С, белка 8, ίΡΑ, РАМ, тканевого фактора (ТР), протеазы ΑΌΑΜΤ8 13, [Ш-1 альфа, [Ш-1 бета, !К-2, [Ш-З, !К-4, [Ш-З, !С-6, Ш-11, колониестимулирующего фактора-1 (С8Р-1), М-С8Р, 8СР, СМ-С8Р, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (С-С8Р), ЕРО, интерферона-альфа (ШЫ-альфа), консенсусного интерферона, ШЫ-бета, ШЫ-гамма, ΣΡΝомега, Ш-7, Ш-8, Ш-9, Ш-10, Ш-12, Ш-13, Ш-14, Ш-15, Ш-16, Ш-17, Ш-18, Ш-19, Ш-20, Ш-21, Ш-22, Ш23, Ш-24, Ш-31, !К-32 альфа, !К-33, тромбопоэтина (ТРО), Аид-1, Апд-2, Апд-4, Апд-Υ, ангиопоэтинподобного полипептида 1 (АЫСРТЬ1), ангиопоэтин-подобного полипептида 2 (АЫСРТЬ2), ангиопоэтинподобного полипептида 3 (АЫСРТЬ3), ангиопоэтин-подобного полипептида 4 (АЫСРТЬ4), ангиопоэтинподобного полипептида 5 (АЫСРТЬ5), ангиопоэтин-подобного полипептида 6 (АЫСРТЬб), ангиопоэтинподобного полипептида 7 (АЫСРТЬ7), витронектина, фактора роста сосудистого эндотелия (УЕСР), ангиогенина, активина А, активина В, активина С, костного морфогенного белка-1, костного морфогенного белка-2, костного морфогенного белка-3, костного морфогенного белка-4, костного морфогенного белка5, костного морфогенного белка-6, костного морфогенного белка-7, костного морфогенного белка-8, костного морфогенного белка-9, костного морфогенного белка-10, костного морфогенного белка-11, костного морфогенного белка-12, костного морфогенного белка-13, костного морфогенного белка-14, костного морфогенного белка-15, костного морфогенного белка рецептора М, костного морфогенного белка рецептора ΣΒ, костного морфогенного белка рецептора II, мозгового нейротрофического фактора, кардиотрофина-1, цилиарного нейротрофического фактора, цилиарного нейротрофического фактора рецептора, крипто, криптического, цитокин-индуцированного хемотаксического фактора нейтрофилов 1, цитокин-индуцированного хемотаксического фактора нейтрофилов 2α, цитокин-индуцированного хемотаксического фактора нейтрофилов 2β, β-эндотелиального фактора роста клеток, эндотелина 1, фактора роста эпидермиса, эпигена, эпирегулина, эпителиального аттрактанта нейтрофилов, фактора роста фибробластов 4, фактора роста фибробластов 5, фактора роста фибробластов 6, фактора роста фибробластов 7, фактора роста фибробластов 8, фактора роста фибробластов 8Ь, фактора роста фибробластов 8с, фактора роста фибробластов 9, фактора роста фибробластов 10, фактора роста фибробластов 11, фактора роста фибробластов 12, фактора роста фибробластов 13, фактора роста фибробластов 16, фактора роста фибробластов 17, фактора роста фибробластов 19, фактора роста фибробластов 20, фактора роста фибробластов 21, кислотного фактора роста фибробластов, основного фактора роста фибробластов, линии глиальных клеток нейтрофического фактора рецептора αΐ, линии глиальных клеток нейтрофического фактора рецептора α2, рост-связанного белка, рост-связанного белка α, рост-связанного белка β, ростсвязанного белка γ, гепарин-связывающего фактора роста эпидермиса, фактора роста гепатоцитов, рецептора фактора роста гепатоцитов, гепатомного фактора роста, инсулин-подобного фактора роста I, инсулин-подобного фактора роста рецептора, инсулин-подобного фактора роста II, инсулин-подобного фактора роста связывающего белка, фактора роста кератиноцитов, фактора ингибирования лейкоза, фактора ингибирования лейкоза рецептора α, фактора роста нервов, рецептора фактора роста нервов, нейропоэтина, нейротрофина-3, нейротрофина-4, онкостатина М (Ο8Μ), фактора роста плаценты, фактора роста плаценты 2, тромбоцитного фактора роста клеток эндотелия, тромбоцитного фактора роста, тромбоцитного фактора роста А цепи, тромбоцитного фактора роста АА, тромбоцитного фактора роста АВ, тромбоцитного фактора роста В цепи, тромбоцитного фактора роста ВВ, тромбоцитного фактора роста рецептора α, тромбоцитного фактора роста рецептора β, пре-В клеток роста фактора стимуляции, факто- 7 025738 ра стволовых клеток (8СЕ), рецептора фактора стволовых клеток, ΤΝΡ, ΤΝΡ0, ΤΝΕ1. ΤΝΡ2, фактора трансформирования роста α, фактора трансформирования роста β, фактора трансформирования роста β1, фактора трансформирования роста β1.2, фактора трансформирования роста β2, фактора трансформирования роста β3, фактора трансформирования роста β5, латентного фактора трансформирования роста β1, фактора трансформирования роста β связывающего белка I, фактора трансформирования роста β связывающего белка II, фактора трансформирования роста β связывающего белка III, тимуса стромального лимфопоэтина (Τ8ΡΡ), фактора некроза опухолей рецептора типа I, фактора некроза опухолей рецептора типа II, урокиназного типа плазминогена активатора рецептора, фосфолипаза-активирующего белка (ΡυΡ), инсулина, лектина, рицина, пролактина, хорионического гонадотропина, фолликулстимулирующего гормона, тирео-стимулирующего гормона, тканевого активатора плазминогена, [дС, ^Е, ЦМ, ЦЛ и ЦЭ, α-галактозидазы, β-галактозидазы, ДНКазы, фетуина, лютеинизирующего гормона, эстрогена, инсулина, альбумина, липопротеинов, фетопротеинов, трансферрина, тромбопоэтина, урокиназы, интегрина, тромбина, лептина, Нитка (адалимумаба), РгоИа (денозумаба), ЕиЬге1 (этанерцепта), белка из табл. 1 или их биологически активным фрагментом, производным или вариантом; причем упомянутый водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, Ро1уРЕС® (Уаггоск ЕГГес! Ро1утег§; Ковентри, Соединенное Королевство), полисиаловой кислоты (ПСК), крахмала, гидроксиалкилкрахмала (ГАК), гидроксиэтилкрахмала (ГЭК), углевода, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой-кислоты, хондроитинсульфата, дераматансульфата, крахмала, декстрана, карбоксиметил-декстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полипропиленгликоля (ППГ), полиоксазолина, полиакролоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, полиэтилен-комалеиновой кислоты ангидрида, полистирол-комалеиновой кислоты ангидрида, поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'этилтриметиламмонийфосфата (МФС); причем нуклеофильный катализатор выбран из группы, состоящей из о-аминобензойной кислоты, м-аминобензойной кислоты, п-аминобензойной кислоты, сульфаниловой кислоты, о-аминобензамида, о-толуидина, м-толуидина, п-толуидина, о-анизидина, м-анизидина и п-анизидина.
В еще одном воплощении предлагается способ формирования гидразоновой связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную гидразидную группу, включающий этапы: а) окисления углеводного фрагмента терапевтического белка путем инкубирования указанного белка с окисляющим агентом, выбранным из группы, состоящей из натрия периодата АаЮ..), свинца тетраацетата (РЬ(ОАс)4) и калия перрутената (ККиО4); и б) образования гидразоновой связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную гидразидную группу в присутствии нуклеофильного катализатора в условиях, позволяющих образование упомянутой гидразоновой связи; причем упомянутый водорастворимый полимер, содержащий активную гидразидную группу, выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, Ро1уРЕС® (Уатеюк ЕГГес! Ро1утег§; Ковентри, Соединенное Королевство), полисиаловой кислоты (ПСК), крахмала, гидроксиалкилкрахмала (ГАК), гидроксиэтилкрахмала (ГЭК), углевода, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дераматансульфата, крахмала, декстрана, карбоксиметил-декстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полипропиленгликоля (ППГ), полиоксазолина, полиакролоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, полиэтилен-комалеиновой кислоты ангидрида, полистирол-комалеиновой кислоты ангидрида, поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилтриметиламмонийфосфата (МФС); причем нуклеофильный катализатор выбран из группы, состоящей из о-аминобензойной кислоты, м-аминобензойной кислоты, паминобензойной кислоты, сульфаниловой кислоты, о-аминобензамида, о-толуидина, м-толуидина, птолуидина, о-анизидина, м-анизидина и п-анизидина.
В еще одном воплощении предлагается способ формирования гидразоновой связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную гидразидную группу, включающий этапы: а) окисления углеводного фрагмента терапевтического белка путем инкубирования указанного белка с окисляющим агентом, выбранным из группы, состоящей из натрия периодата (КаЮ4), свинца тетраацетата (РЬ(ОАс)4) и калия перрутената (ККиО4); и б) образования гидразоновой связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную гидразидную группу, в присутствии нуклеофильного катализатора в условиях, позволяющих образование упомянутой гидразоновой связи; причем, терапевтический белок выбран из группы, состоящей из фактора IX (Ф-К), фактора VIII (Ф-УШ), фактора УПа (Ф-УПа), фактора фон Виллебранда (ФВф), фактора Εν (Ф-У), фактора X (фХ), фактора XI (Ф-ХЦ, фактора XII (Ф-ХП), тромбина (Ф-П), белка С, белка 8, !РА, РАЫ, тканевого фактора (Тф), протеазы ΑΌΑΜΤ8 13, !П-1 альфа, !П-1 бета, !П-2, !П-3, !П-4, ^-5, !П-6, ГЬ-П, колониестимулирующего фактора-1 (С8Е-1), М-С8Е, 8СЕ, СМ-С8Е, гранулоцитарного колониестимули- 8 025738 рующего фактора (С-С8Р), ЕРО, интерферона-альфа (ΙΡΝ-альфа), консенсусного интерферона, ΙΡΝ-бета, ΙΡΝ-гамма, ΙΡΝ-омега, 1Ь-7, 1Ь-8, 1Ь-9, 1Ь-10, 1Ь-12, 1Ь-13, 1Ь-14, 1Ь-15, 1Ь-16, 1Ь-17, 1Ь-18, 1Ь-19, 1Ь-20, ГО-21, ГО-22, ГО-23, 1Ь-24, 1Ь-31, 1Ь-32 альфа, 1Ь-33, тромбопоэтина (ТРО), Аид-1, Апд-2, Апд-4, Апд-Υ, ангиопоэтин-подобного полипептида 1 (ΛΝΟΡΤΡ1). ангиопоэтин-подобного полипептида 2 (ΛΝΟΡΤΡ2). ангиопоэтин-подобного полипептида 3 (АКСРТЬ^), ангиопоэтин-подобного полипептида 4 (АКСРТЬ!), ангиопоэтин-подобного полипептида 5 (АНСР^л), ангиопоэтин-подобного полипептида 6 (АКСРТЬ-б), ангиопоэтин-подобного полипептида 7 (АЫСРТЕ7), витронектина, фактора роста сосудистого эндотелия (УЕСР), ангиогенина, активина А, активина В, активина С, костного морфогенного белка-1, костного морфогенного белка-2, костного морфогенного белка-3, костного морфогенного белка-4, костного морфогенного белка-5, костного морфогенного белка-6, костного морфогенного белка-7, костного морфогенного белка-8, костного морфогенного белка-9, костного морфогенного белка-10, костного морфогенного белка-11, костного морфогенного белка-12, костного морфогенного белка-13, костного морфогенного белка-14, костного морфогенного белка-15, костного морфогенного белка рецептора 1А, костного морфогенного белка рецептора ΙΒ, костного морфогенного белка рецептора II, мозгового нейротрофического фактора, кардиотрофина-1, цилиарного нейротрофического фактора, цилиарного нейротрофического фактора рецептора, крипто, криптического, цитокин-индуцированного хемотаксического фактора нейтрофилов 1, цитокин-индуцированного хемотаксического фактора нейтрофилов 2α, цитокининдуцированного хемотаксического фактора нейтрофилов 2β, β-эндотелиального фактора роста клеток, эндотелина 1, фактора роста эпидермиса, эпигена, эпирегулина, эпителиального аттрактанта нейтрофилов, фактора роста фибробластов 4, фактора роста фибробластов 5, фактора роста фибробластов 6, фактора роста фибробластов 7, фактора роста фибробластов 8, фактора роста фибробластов 8Ь, фактора роста фибробластов 8с, фактора роста фибробластов 9, фактора роста фибробластов 10, фактора роста фибробластов 11, фактора роста фибробластов 12, фактора роста фибробластов 13, фактора роста фибробластов 16, фактора роста фибробластов 17, фактора роста фибробластов 19, фактора роста фибробластов 20, фактора роста фибробластов 21, фактора роста фибробластов кислотного, фактора роста фибробластов основного, линии глиальных клеток нейтрофического фактора рецептора α1, линии глиальных клеток нейтрофического фактора рецептора α2, рост-связанного белка, рост-связанного белка α, ростсвязанного белка β, рост-связанного белка ццц, гепарин-связывающего фактора роста эпидермиса, фактора роста гепатоцитов, рецептора фактора роста гепатоцитов, гепатомного фактора роста, инсулинподобного фактора роста Ι, инсулин-подобного фактора роста рецептора, инсулин-подобного фактора роста ΙΙ, инсулин-подобного фактора роста связывающего белка, фактора роста кератиноцитов, фактора ингибирования лейкоза, фактора ингибирования лейкоза рецептора α, фактора роста нервов, рецептора фактора роста нервов, нейропоэтина, нейтрофина-3, нейтрофина-4, онкостатина М (ΘδΜ), фактора роста плаценты, фактора роста плаценты 2, тромбоцитного фактора роста клеток эндотелия, тромбоцитного фактора роста, тромбоцитного фактора роста А цепи, тромбоцитного фактора роста АА, тромбоцитного фактора роста АВ, тромбоцитного фактора роста В цепи, тромбоцитного фактора роста ВВ, тромбоцитного фактора роста рецептора α, тромбоцитного фактора роста рецептора β, пре-В клеток роста фактора стимуляции, фактора стволовых клеток (8СР), рецептора фактора стволовых клеток, ΤΝΕ, включая ΤΝΕ0, ΤΝΕ1, ΤΝΕ2, фактора трансформирования роста α, фактора трансформирования роста β, фактора трансформирования роста β1, фактора трансформирования роста β 1.2, фактора трансформирования роста β2, фактора трансформирования роста β3, фактора трансформирования роста β5, латентного фактора трансформирования роста β1, фактора трансформирования роста β связывающего белка Ι, фактора трансформирования роста β связывающего белка ΙΙ, фактора трансформирования роста β связывающего белка ΙΙΙ, тимуса стромальный лимфопоэтин (ΤδΕΡ), фактора некроза опухолей рецептора типа Ι, фактора некроза опухолей рецептора типа ΙΙ, урокиназного типа плазминогена активатора рецептора, фосфолипаза-активирующего белка (РИР), инсулина, лектина, рицина, пролактина, хорионического гонадотропина, фолликул-стимулирующего гормона, тирео-стимулирующего гормона, тканевого активатора плазминогена, ЦС, ЦЕ, ЦМ, ЦА и [дЭ, α-галактозидазы, β-галактозидазы, ДНКазы, фетуина, лютеинизирующего гормона, эстрогена, инсулина, альбумина, липопротеинов, фетопротеина, трансферрина, тромбопоэтина, урокиназы, интегрина, тромбина, лептина, Нитка (адалимумаба), Ртойа (денозумаба), ЕпЬге1 (этанерцепта), белка из табл. 1 или их биологически активным фрагментом, производным или вариантом; причем упомянутый водорастворимый полимер, содержащий активную гидразидную группу, выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, Ро1уРЕС® (ХУагМск ЕГГес! Ро1утегк; Ковентри, Соединенное Королевство), полисиаловой кислоты (ПСК), крахмала, гидроксиалкилкрахмала (ГАК), гидроксиэтилкрахмала (ГЭК), углевода, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дераматансульфата, крахмала, декстрана, карбоксиметилдекстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полипропиленгликоля (ППГ), полиоксазолина, полиакролоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, полиэтилен-комалеиновой кислоты ангидрида, полистиролкомалеиновой кислоты ангидрида, поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаля) (ПГФ), 2метакрилоилокси-2'-этилтриметиламмонийфосфата (МФС); причем нуклеофильный катализатор выбран
- 9 025738 из группы, состоящей из о-аминобензойной кислоты, м-аминобензойной кислоты, п-аминобензойной кислоты, сульфаниловой кислоты, о-аминобензамида, о-толуидина, м-толуидина, п-толуидина, оанизидина, м-анизидина и п-анизидина.
В другом воплощении предлагается вышеупомянутый способ, отличающийся тем, что водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу готовится по способу, включающему: инкубирование раствора, содержащего окисленный водорастворимый полимер с активированным аминооксилинкером, включающим активную аминооксигруппу в условиях, позволяющих образование стабильной оксимной связи между окисленным водорастворимым полимером и активированным аминооксилинкером, упомянутые условия включают период времени от приблизительно 1 мин до приблизительно 24 ч; температуру от приблизительно 2 до приблизительно 37°С; при наличии или в отсутствие света, при перемешивании или без него; с формированием водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу; и б) очистку водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу по способу, выбранному из группы, состоящей из хроматографии, фильтрации и осаждения. Термин активированный водорастворимый полимер обозначает, в одном воплощении, водорастворимый полимер, содержащий альдегидную группу.
В еще одном воплощении предлагается вышеупомянутый способ, отличающийся тем, что водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу готовится по способу, включающему: а) инкубирование раствора, содержащего окисленный водорастворимый полимер с активированным аминооксилинкером, включающим активную аминооксигруппу в условиях, позволяющих образование стабильной оксимной связи между окисленным водорастворимым полимером и активированным аминооксилинкером, упомянутые условия включают период времени от приблизительно 1 мин до приблизительно 24 ч; температуру от приблизительно 2 до приблизительно 37°С; при наличии или в отсутствие света, при перемешивании или без него; с формированием водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу; б) инкубирование раствора, содержащего водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, введенную на этапе а) с восстанавливающим агентом, в условиях, позволяющих образование стабильной алкоксаминной связи между окисленным водорастворимым полимером и активированным аминооксилинкером, упомянутые условия включают период времени от приблизительно 1 мин до приблизительно 24 ч; температуру от приблизительно 2 до приблизительно 37°С; при наличии или в отсутствие света, при перемешивании или без него; и с) очистку водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу по способу, выбранному из группы, состоящей из хроматографии, фильтрации и осаждения.
В еще одном воплощении предлагается вышеупомянутый способ, отличающийся тем, что водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, готовится по способу, включающему: а) инкубирование раствора, содержащего окисленный водорастворимый полимер с активированным аминооксилинкером, включающим активную аминооксигруппу в условиях, позволяющих образование стабильной оксимной связи между окисленным водорастворимым полимером и активированным аминооксилинкером, упомянутые условия включают период времени от приблизительно 1 мин до приблизительно 24 ч; температуру от приблизительно 2 до приблизительно 37°С; при наличии или в отсутствие света, при перемешивании или без него; с формированием водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу; б) инкубирование раствора, содержащего водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, введенную на этапе а) с нуклеофильным катализатором в условиях, которые включают период времени от 1 мин до 24 ч; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света, при перемешивании или без него; и в) очистку водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу по способу, выбранному из группы, состоящей из хроматографии, фильтрации и осаждения.
В еще одном воплощении предлагается вышеупомянутый способ, отличающийся тем, что водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу готовится по способу, включающему: а) инкубирование раствора, содержащего окисленный водорастворимый полимер с активированным аминооксилинкером, включающим активную аминооксигруппу в условиях, позволяющих образование стабильной оксимной связи между окисленным водорастворимым полимером и активированным аминооксилинкером, упомянутые условия включают период времени от приблизительно 1 мин до приблизительно 24 ч; температуру от приблизительно 2 до приблизительно 37°С; при наличии или в отсутствие света, при перемешивании или без него; с формированием водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу; б) инкубирование раствора, содержащего водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, введенную на этапе а) с нуклеофильным катализатором в условиях, которые включают период времени от 1 мин до 24 ч; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света, при перемешивании или без него; в) инкубирование раствора, содержащего водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу после этапа б) с восстанавливающим агентом, в условиях, позволяющих образование стабильной алкоксаминной связи между окисленным водорастворимым полимером и активированным аминооксилинкером, упомянутые условия включают период времени от приблизительно 1 мин до приблизительно 24 ч; температуру от приблизительно 2 до приблизительно 37°С; при наличии или в отсутствие света, при перемешивании или без него; и г) очистку водораствори- 10 025738 мого полимера, содержащего активную аминооксигруппу по способу, выбранному из группы, состоящей из хроматографии, фильтрации и осаждения.
В ином воплощении вышеупомянутый способ выполняется с окисленным водорастворимым полимером, выбранным из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, Ро1уРЕС® (\Уаг\\)ск ЕГГес! Ро1ушет8; Ковентри, Соединенное Королевство), полисиаловой кислоты (ПСК), крахмала, гидроксиалкилкрахмала (ГАК), гидроксиэтилкрахмала (ГЭК), углевода, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дераматансульфата, крахмала, декстрана, карбоксиметил-декстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полипропиленгликоля (ППГ), полиоксазолина, полиакролоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, полиэтилен-комалеиновой кислоты ангидрида, полистирол-комалеиновой кислоты ангидрида, поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилтриметиламмонийфосфата (МФС); причем упомянутый водорастворимый полимер окисляется путем инкубирования с окислителем с образованием терминальной альдегидной группы на невосстанавливающем конце водорастворимого полимера. В одном воплощении водорастворимый полимер является ПСК.
В другом воплощении предлагается вышеупомянутый способ, отличающийся тем, что окислителем является ΝαΙ04.
В еще одном воплощении предлагается вышеупомянутый способ, отличающийся тем, что аминооксилинкер выбран из группы, состоящей из:
а) сшивающего агента 3-оксопентан-1,5-диоксиамина, имеющего формулу
б) сшивающего агента 3,6,9-триоксоундекан-1,11-диоксиамина, имеющего формулу
в) сшивающего агента 3,6,9,12,15-пентаокса-гептадекан-1, 17-диоксиамина, имеющего следующую формулу:
В еще одном воплощении предлагается вышеупомянутый способ, отличающийся тем, что восстановитель выбран из группы, состоящей из натрия цианоборогидрида (ΝαϋΝΒΗ3), аскорбиновой кислоты (витамин С) и ΝαΒΗ3. В одном воплощении восстанавливающим агентом является натрия цианоборогидрид (Ν;ΟΒΗ3|.
В еще одном воплощении предлагается вышеупомянутый способ, отличающийся тем, что нуклеофильный катализатор выбран из группы, состоящей из о-аминобензойной кислоты, м-аминобензойной кислоты, п-аминобензойной кислоты, сульфаниловой кислоты, о-аминобензамида, о-толуидина, мтолуидина, п-толуидина, о-анизидина, м-анизидина и п-анизидина. В одном воплощении нуклеофильный катализатор является м-толуидином. В ином воплощении нуклеофильный катализатор добавляется в таком количестве, чтобы дать итоговую концентрацию от приблизительно 1,0 до приблизительно 50 мМ нуклеофильного катализатора.
В ином воплощении предлагается упомянутый выше способ, который дополнительно содержит концентрирование конъюгированного терапевтического белка ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ).
Фигуры
На фиг. 1 показана первичная структура фактора свертывания крови IX (8ЕС ГО N0: 1).
На фиг. 2 показано связывание окисленного рф-ΙΧ с аминоокси-ПСК.
На фиг. 3 показан синтез водорастворимых диаминооксисшивающих агентов 3-оксопентан-1,5диоксиамина и 3,6,9-триоксоундекан-1,11-диоксиамина.
На фиг. 4 показано приготовление аминоокси-ПСК.
На фиг. 5 представлена визуализация способом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (δΌδ-РАСЕ) конъюгатов ПСК-ф-ΙΧ, приготовленных в присутствии различных катализаторов, а) сравнение анилина с м-толуидином в различных концентрациях; б) сравнение анилина с о-аминобензойной кислотой, м-аминобензойной кислотой, п-аминобензойной кислотой, паминобензамидом и сульфаниловой кислотой; в) сравнение анилина и м-толуидина с о-анизидином и манизидином.
На фиг. 6 показаны процентные уровни полисиалирования с различными нуклеофильными катализаторами.
- 11 025738
Детальное описание изобретения
Фармакологические и иммунологические свойства терапевтических протеинов могут быть улучшены путем химического модифицирования и конъюгации с полимерными соединениями, например полиэтиленгликолем (ПЭГ), разветвленным ПЭГ, полисиаловой кислотой (ПСК), гидроксиалкилкрахмалом (ГАК), гидроксилэтилкрахмалом (ГЭК), углеводами, полисахаридами, пуллуланом, хитозаном, гиалуроновой кислотой, хондроитинсульфатом, дерматансульфатом, крахмалом, декстраном, карбоксиметилдекстраном, полиалкиленоксидом (ПАО), полиалкиленгликолем (ПАГ), полипропиленгликолем (ППГ), полиоксазолином, полиакрилоилморфолином, поливиниловым спиртом (ПВС), поликарбоксилатом, поливинилпирролидоном, полифосфазеном, полиоксазолином, сополимером полиэтилена с малеиновым ангидридом, сополимером полистирола с малеиновым ангидридом, поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформалем) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилтриметиламмонийфосфатом (МФС). Свойства получаемых конъюгатов обычно сильно зависят от структуры и размера полимера. Как правило, в данной отрасли предпочтительно использовать полимеры определенного размера или имеющие узкий интервал размеров. Синтетические полимеры типа ПЭГ легко могут быть синтезированы в узком интервале размеров, в то время, как ПСК может быть подвергнута очистке с получением. полимерных молекул в узком интервале размеров. Также, реактивы для пегилирования с конкретными полимерными цепями и узким интервалом распределения размеров, присутствуют на рынке и имеются в продаже по доступным ценам.
Добавление растворимого полимера, например, полисиалирование - подход к улучшению свойств терапевтических белков, таких как белки системы свертывания крови, например, Ф-К, а также иных белков свертывания (например, ФВф, Ф-УПа (см., к примеру, υδ 2008/0221032А1, включенный в настоящую заявку посредством ссылки) и Ф-УШ).
Терапевтические белки
В определенных воплощениях изобретения вышеупомянутые полипептиды и полинуклеотиды представлены следующими терапевтическими белками: ферментами, антигенами, антителами, рецепторами, белками свертывания крови, факторами роста, гормонами и лигандами. В определенных воплощениях терапевтический белок является белком свертывания крови, таким как Фактор IX (Ф-ΙΧ), фактор VIII (Ф-УШ), фактор УПа (Ф-УПа), фактор фон Виллебранда (ФВф), фактор РУ (Ф-У), фактор X (фХ), фактор XI (Ф-ХЦ фактор XII (Ф-ΧΠ), тромбин (Ф-П), белок С, белок δ, ΙΡΆ, РАН, тканевой фактор (Тф) или протеаза ΆΌΑΜΤδ 13. В одном воплощении терапевтический белок по изобретению является гликопротеином или, в различных воплощениях, белком, который не является природно гликозилированным ίη νίνο (т.е. белком, который не содержит природного сайта гликозилирования или белком, который не гликозилирован в клетке-хозяине до очистки).
В определенных воплощениях терапевтический белок является иммуноглобулинами, цитокинами, такими как ГО-1 альфа, (Б-1 бета, (Б-2, (Б-3, (Б-4, ГО-5, (Б-6. ГО-11, колониестимулирующий фактор-1 (ΟδΡ-1), Μ-ΟδΡ, δΟΡ, ΟΜ-ΟδΡ, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Ο-ΟδΡ), ЕРО, интерферон-альфа (ШЛ-альфа), консенсусный интерферон, ШЛ-бета, ШЛ-гамма, ШЛ-омега, (Б-7, (Б-8, (Б-У, ГО-10, ГО-12, ГО-13, ГО-14, ГО-15, ГО-16, ГО-17, ГО-18, ГО-19, ГО-20, ГО-21, ГО-22, ГО-23, ГО-24, ГО-31, ГО-32 альфа, ГО-33, тромбопоэтин (ТРО), ангиопоэтины, к примеру, Апд-1, Апд-2, Апд-4, Апд-Υ, человеческие ангиопоэтин-подобные полипептиды ΑΝΟΡΤΠ-7, витронектин, фактор роста сосудистого эндотелия (УЕОР), ангиогенин, активин А, активин В, активин С, костный морфогенный белок-1, костный морфогенный белок-2, костный морфогенный белок-3, костный морфогенный белок-4, костный морфогенный белок-5, костный морфогенный белок-6, костный морфогенный белок-7, костный морфогенный белок-8, костный морфогенный белок-9, костный морфогенный белок-10, костный морфогенный белок-11, костный морфогенный белок-12, костный морфогенный белок-13, костный морфогенный белок-14, костный морфогенный белок-15, костного морфогенного белка рецептор И, костного морфогенного белка рецептор ГО, костного морфогенного белка рецептор II, мозговой нейротрофический фактор, кардиотрофин-1, цилиарный нейротрофический фактор, цилиарного нейротрофического фактора рецептор, крипто, криптический, цитокин-индуцированный хемотактический фактор нейтрофилов 1, цитокин-индуцированный хемотактический фактор нейтрофилов 2α, цитокин-индуцированный хемотактический фактор нейтрофилов 2β, β-эндотелиальный фактор роста клеток, эндотелии 1, фактор роста эпидермиса, эпиген, эпирегулин, эпителиальный аттрактант нейтрофилов, фактор роста фибробластов 4, фактор роста фибробластов 5, фактор роста фибробластов 6, фактор роста фибробластов 7, фактор роста фибробластов 8, фактор роста фибробластов 8Ь, фактор роста фибробластов 8с, фактор роста фибробластов 9, фактор роста фибробластов 10, фактор роста фибробластов 11, фактор роста фибробластов 12, фактор роста фибробластов 13, фактор роста фибробластов 16, фактор роста фибробластов 17, фактор роста фибробластов 19, фактор роста фибробластов 20, фактор роста фибробластов 21, фактор роста фибробластов кислотный, фактор роста фибробластов основный, линии глиальных клеток нейтрофического фактора рецептор α1, линии глиальных клеток нейтрофического фактора рецептор α2, рост-связанный белок, рост-связанный белок α, рост-связанный белок β, рост-связанный белок γ, гепарин-связывающий фактор роста эпидермиса, фактор роста гепатоцитов, рецептор фактора роста гепатоцитов, гепатомный фактор роста, инсу- 12 025738 лин-подобный фактор роста I, инсулин-подобного фактора роста рецептор, инсулин-подобный фактор роста II, инсулин-подобного фактора роста связывающий белок, фактор роста кератиноцитов, фактор ингибирования лейкоза, фактора ингибирования лейкоза рецептор α, фактор роста нервов, рецептор фактора роста нервов, нейропоэтин, нейтрофин-3, нейтрофин-4, онкостатин М (ΘδΜ), фактор роста плаценты, фактор роста плаценты 2, тромбоцитный фактор роста клеток эндотелия, тромбоцитный фактор роста, тромбоцитного фактора роста А цепь, тромбоцитный фактор роста АА, тромбоцитный фактор роста АВ, тромбоцитного фактора роста В цепь, тромбоцитный фактор роста ВВ, тромбоцитного фактора роста рецептор α, тромбоцитного фактора роста рецептор β, пре-В клеток роста фактор стимуляции, фактор стволовых клеток (8СР), рецептор фактора стволовых клеток, ΤΝΡ, включая ΤΝΡ0, ΤΝΡ1, ΤΝΡ2, фактор трансформирования роста α, фактор трансформирования роста β, фактор трансформирования роста β1, фактор трансформирования роста β 1.2, фактор трансформирования роста β2, фактор трансформирования роста β3, фактор трансформирования роста β5, латентный фактор трансформирования роста β1, фактора трансформирования роста β связывающий белок I, фактора трансформирования роста β связывающий белок II, фактора трансформирования роста β связывающий белок III, тимуса стромальный лимфопоэтин (ΤδΡΡ), фактора некроза опухолей рецептор типа I, фактора некроза опухолей рецептор типа II, урокиназного типа плазминогена активатора рецептор, фактор роста сосудистого эндотелия и химерные белки, а также их биологически или иммунологически активные фрагменты.
В определенных воплощениях терапевтический белок является альфа-, бета- и гаммаинтерферонами, колониестимулирующими факторами, включая гранулоцитные колониестимулирующие факторы, факторами роста фибробластов, тромбоцитарными факторами роста, фосфолипазаактивирующим белком (ΡϋΡ), инсулином, растительными белками, например, лектинами и рицинами, факторами некроза опухолей и родственными аллелями, растворимыми формами рецепторов фактора некроза опухолей, рецепторами интерлейкина и растворимыми формами рецепторов интерлейкина, факторами роста, например, тканевыми факторами роста, такими как ΤΟΡα или ΤΟΡβ и факторами роста эпидермиса, гормонами, соматомединами, пигментарными гормаонами, рилизинг-факторами гипоталамуса, антидиуретическими гормонами, пролактином, хорионическим гонадотропином, фолликулстимулирующим гормоном, тиреоид-стимулирующим гормоном, тканевым активатором плазминогена и иммуноглобулинами, такими как ЦО, !дЕ, !дМ, !дА и [дЭ, галактозидазой, α-галактозидазой, βгалактозидазой, ДНКазой, фетуином, лютеинизирующим гормоном, эстрогеном, кортикостероидами, инсулином, альбумином, липопротеинами, фетопротеином, трансферрином, тромбопоэтином, урокиназой, ДНКазой, интегринами, тромбином, гемопоэтическими факторами роста, лептином, гликозидазами, Нит1га (адалимумабом), РгоНа (денозумабом), ЕиЬге1 (этанерцептом) и их фрагментами, либо любыми слитыми белками, включающими любой из указанных выше белков или их фрагментов. В дополнение к упомянутым белкам, в табл. 1 ниже представлены терапевтические белки, охватываемые настоящим изобретением.
Таблица 1
Фолликулярный пептид, секретируемый дендритными клетками Ангиотензин- конвертирующий фермент Член 6 семейства Интерлейкина-1 Герстатин
Дермокин Антитромбин-Ш Белок 2, экспрессируемый простатой и яичками Лейцин-богатый повторсодержащий белок 28
Секретируемый связанный с ожогом белок 1 Аполипопротеин В-100 Секреторная фосфолипаза А2 Группы XIΙΑ ΙιΚΚΝ4 С-терминально- подобный белок
Эктодисплазин-А· Аполипопротеин ϋ Коллаген альфа-3(V) цепь Ъуб/РЬАОК доменсодержащий белок 2
Секретируемый связанный с ожогом белок 2 Аполипопротеин Е Альфа-2-макроглобулин- подобный белок 1 Трансмембранный белок 81
Резистин Бета-1,4- галактозилтрансфераза 1 Дерматопонтин Миелиновый белок нуль- подобный белок 3
Остеопонтин Костный морфогенный белок 7 Белок, связанный с хрящами Гомолог белка поЪигп
Секретируемый связанный с ожогом белок 5 Субъединица субкомпонента В комплемента Οίς Эфиопский еж-белок иор- глюкуронозилтрансфераза ЗА2
Секретируемый связанный с ожогом белок 4 альфа цепь С4Ь- Связывающего белка Внеклеточный матричный белок 2 Протокадгерин альфа-1
- 13 025738
Се кр е тируемый фосфопротеин 24 Кальретикулин Желудочный внутренний фактор Фосфолипаза 04
Глипикан-б Кортикостероидов я зыв а ющий гло Оули н Интерлейкин-33 Ретинолдегидрогеназа 10
Секретируемый связанный с ожогом белок 3 Карбоксипептидаза А1 Костный морфогенный белок 2 Сиаловая кислота- связывающий 1д-подобный лектин 14
С-С мотив хемокина 4 Карбоксипептидаза А2 Костный морфогенный белок 6 Трансмембранный белок 161А
Меланоцитный белок Рте1 17 Эотаксин Неохарактеризованный белок ΚΙΑΑ0564 Трансмембранный белок 161В
Секретируемый Ьу-6/иРАЕ- родственный белок 1 С-С мотив хемокина 13 СегЬегиз Трансмембранный белок 182
Бета-микросеминопротеин С-С мотив хемокина 18 Карбогидратсульфотрансфе раза 8 Белок БАМ24В
Глипикан-4 С-С мотив хемокина 20 Контактин-связанный белок-подобный 3 Трансмембранный белок 52
Член 15 суперсемейства Триггерный рецептор/ Секреторная фосфолипаза Домен-содержащий белок 4
лигандов фактора некроза экспрессируемый на А2-подобный белок группы суперсемейства основного
опухолей миелоидных клетках 2 ΧΙΙΒ фасилитатора
Резистин-подобный бета С-С мотив хемокина 2 Кортиколиберин 1ЮР- глюкуронозилтрансфераза 2АЗ
Член 12 суперсемейства Трансформирующего Дизинтегрин и Одонтогенный амелобласт-
лигандов фактора некроза опухолей фактора роста-бета- индуцированный белок 1д-КЗ металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина 19 связанный белок
ЗРАЕС СБ40 лиганд иРР0556 белок 019οχί10 Нейросекреторный белок УСГ
Глипикан-5 Корнеодесмозин С-Х-С мотив хемокина 3 Се кре тируемый фосфопротеин 2, 24кДа
Антериорного градиентного белка 2 гомолог Фактор комплемента ϋ Цистатин-М Белок ГАМ150В
Белка сапору гомолог 2 Хромогранин-А Дефенсин-5 Фактор роста/дифференциации 9
Глипикан-1 Коллаген альфа-1(I) цепь Дефенсин-6 Кластерин-подобный белок 1
фон Виллебранда фактора Дизинтегрина и Дизинтегрин и Трансмембранный и
А домен-содержащий металлопротеиназы металлопротеиназа с иммуноглобулиновый
белок 2 домен-содержащий белок 18 мотивами тромбоспондина 18 домен-содержащий белок 2
- 14 025738
ΗΝΤ1-индуцируемого- сигнального пути белок 1 Цистеин-богатый секреторный белок ЬССЬ домен-содержащий 1 , Дизинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина 3 С-типа лектина доменсодержащий белок иЫ058Ю/РК019б27
С-С мотив хемокина 1 Коллаген альфа-4(IV) цель Э1сккор£-родственный белок 4 Эпидидимальноспецифический липокалин- 10
3РАИС-связанный Кератиноцит Дизинтегрин и Дизинтегрин и
модулярный кальций- дифференциация- металлопротеиназа с металлопротеиназа с
связывающий белок 2 связанный белок мотивами тромбоспондина 5 мотивами тромбоспондина 8
С-типа лектинового домена семейства 11 член А Комплемент С4-В Эпендимин-связанный белок 1 млекопитающих Эпидидимальноспецифический липокалин- 8
Секретируемый Ьу-6/иРАК- родственный белок 2 Коллаген альфа-2(V) цепь Фибриллин-3 Основной пролин-богатый пептид Р-Е
Глипикан-3 Комплемент С5 Фетуин-В Мнимый неохарактеризованный белок С10ог£Э9
Секретируемый и Коллаген альфа-1(VII) Фактор роста Неохарактеризованный
трансмембранный белок 1 цепь фибробластов б белок С17ог£77
Белок экспрессируемой в яичках последовательности 264 Компонент комплемента С7 Фактор роста кератиноцитов Арилацетамид деациталаза-подобная 2
Глипикан-2 Компонент комплемента С8 бета цепь Фактор роста/дифференциации 8 Эпидидимальноспецифический липокалин- 12
Сериновая протеаза 23 Компонент комплемента С8 гамма цепь Желудочный ингибиторный полипептид В меланомы антиген 2
395 рибосомальный белок Ь55, митохондриальный Коллаген альфа-1(XV) цепь Гликопротеиновый гормон бета-5 В меланомы антиген 3
Гомолог ЗА белка МтрЗпар Коллаген альфа-1(XVI) цепь Гранзим М Бычьего зародышевого плазменного белка гомолог 1
Фибронектин Коллаген альфа- 1(XVIII) цепь Гастрин-рилизинг пептид Комплемент СХс^подобный белок 3
Нейдезин Коллаген альфа-1(XIX) цепь Сериновая протеаза НТКА1 иРГ05б5 белок С2ог£69
Фактора роста фибробластов рецептор 2 Хрящевой олигомерный матричный протеин Интерферон альфа-4 иРГ0669 белок Сбог£120
Карбоновая ангидраза 6 С-реактивный белок Интерферон альфа-5 Колипаза-подобный белок Сбог£127
- 15 025738
Белок, отсутствующий в злокачественных опухолях мозга 1 Гранулоцит- ко л они е с тимулирукнций фактор Интерферон альфа-7 Неохарактеризованыый белок С7от£б9
ЗРАКС-связанный модулярный кальций- связывающий белок 1 Гранулоцит- макрофагоколониестиму лирующий фактор Дизинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина 7 Тромобоцитарного фактора роста рецептор-подобный белок
Амилоид бета А4 белок Белок СУК61 Член 10 суперсемейства иммуноглобулинов Хондроадгерин-подобный белок
Член б суперсемейства рецептора фактора некроза опухолей Комплемента компонента рецептора 1-подобныи белок Протеаза-связанный домен-содержащий белок 21 кДа Мнимый неохарактеризованный белок ϋΝΏ6490/ΡΚΟ21339
Гамма-аминомасляной кислоты типа В рецептора субъединица 1 Фактор роста стволовых клеток; лимфоцит- секретируемый лектин С-типа Абгидролазы доменсодержащий белок ГАМ108А1 Мнимый неохарактеризованный белок ПМ0б493/РКО21345
Про-нейрегулин-1, мембранно-связанная изоформа СМР-Ν- ацетилнейраминат- бета-галактозамид- альфа-2,3- сиалилтранофераза Дизинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина 9 Мнимый неохарактеризованный белок иМ05815/РПО19632
Гликопротеиновый гормон альфа-2 Дипептидиллептидаза 4 Интерлейкина-9 рецептор Цистатин-А
Мембранная металло- эндопептидаза-подобный 1 Дентин сиалофосфопротеин Интерлейкин-9 Ингибитор пептидазы КЗИРМЬ
Гс рецептор-подобный А Эндотелин-1 Ингибина бета В цепь Цистатин-9
С-С мотив хемокина 4- подобный Зфрин--В1 Сериновой протеазы ингибитор Кага1-типа 2 Член 5 семейства домена ЭАМ
Эпителиального дискоидина доменсодержащий рецептор 1 Эпидермис- специфической сериновой протеазы- подобный белок ВМР-связывающий эндотелиальный регуляторный белок Инсулин-подобного фактора роста- связывающий белок- подобный 1
Муцин-1 ΕΜΙΣΙΝ-1 Кератиноцит-связанный белок 2 Эпидидимально сперма- связывающий белок 1
Фактор роста сосудистого эндотелия А Эндоплазмин Ламинина субъединица альфа-1 Элафин
Фибулин-1 Эфрина типа-А рецептор 3 Лейкоцитарный клеточный хемотаксин-2 Белок БАМ55А
Рецептор пролактина Эфрина типа-В рецептор б Желудочная триацилглицеринлипаза Фактор роста/дифференциации б
Пропротеин конвертаза субтилизин/кексин типа 6 Гликозилтрансферазы 1 домен-содержащий белок 1 Лейцин-богатый повторами и гомолога калпонина домен-содержащий белок 3 Глюкозы-фруктозы Оксидоредуктазы доменсодержащий белок 1
- 16 025738
СЭ209 антиген Фактор коагуляции X Панкреатический липаза- связанный белок 2 Эритропоэтин
Коллаген альфа-2(XI) цепь Фактор коагуляции VIII Эпидидимис-специфическая альфа-маннозидаза Глутатионпероксидаза 6
Гранулоцит- Комплемента 01ς Фибронектина типа III Неохарактеризованный
макрофагоколоннестимулир ующий фактора рецептора субъединица альфа фактор некроза опухолей-родственный белок 7 домен-содержащий белок 7 белок Ц№511/РКО1026
Эластин Фибриллин-2 Микрофибриллы-связанный белок 5 Бета-дефенсин 128
Интерлейкина-15 рецептора субъединица альфа Альфа-2-Н5- гликопротеин Мюллер-ингибирующий фактор Интерлейкин-31
Мидкин Фактор роста фибробластов 10 Металлопротеиназа матрикса-21 Интерлейкин-34
Интегрин альфа-7 Фибриноген альфа цепь Металлопротеиназа матрикса-17 Плазменный калликреин- подобный белок 4
Муцин-4 Фибриноген бета цепь Матричная металлопротеиназа-20 Эпидидимальноспецифический липокалин- 9
Пептидил-глицин альфа- амидирующая монооксигеназа Белок, связанный с карциномой эпителия длинного неба, легкого и носа 1 И-ацетилглюкозамин-1- фосфотрансферазы субъединица гамма кДНК ГБЛ60957, высоко аналогичная С е кр е тируемому связанному с ожогом белку 4
Аполипопротеин Α-Ι Гастрин Мультимерин-2 Липазы член М
Протеогликан 4 Гликопротеинового гормона альфа-цепь Промотилин СБЕС5Г12
Член 25 суперсемейства рецептора фактора некроза опухолей П-ацетилглюкозамин-1- фосфотрансферазы субъединица альфа/бета ГНА51-родственный белок внеклеточного матрикса 3 Мнимая неактивная секреторная фосфолипаза А2 группы НС
Аттрактин Гранзим А Протеинкиназы С- связывающий белок МЕЬЬ1 Сериновая протеаза ΜΡΝ2
Простата-ассоциированный микросеминопротеин Фактора роста гепатоцитов-подобный белок Протеинкиназы С- связывающий белок ΝΕϋ2 Нетрин-5
Альфа-амилаза 1 Инсулин-подобного фактора роста- связывающий белок 1 Нейротрипсин ΝΗΣ повтор-содержащий белок 3
- 17 025738
Мозговой нейротрофический фактор Инсулин-подобного фактора роста- связывающий белок 2 Нейросерпин Офлактомедин-подобный белок 2В
С-типа лектинового домена семейства 4 член М Инсулин-подобного фактора роста- связывающий белок 4 Нидоген-2 Овохимаза-2
Гранулоцит- Член 10ϋ Абгидролазы домен- Мнимый
колониестимулирующего суперсемейства содержащий белок неохарактеризованный
фактора рецептор рецептора фактора некроза опухолей РАМ108В1 белок σΝζ)3029/ΡΚΟ9830
Инсулин-лодобный фактор роста II Интерферон альфа-1/13 Нейротрофин-4 Овохимаза-1
Карциноэмбриногенная Интерферон- Эпидидимальна я Мнимый беременность-
антиген-родственная индуцированной секреторная специфический бета-1-
молекула клеточной адгезии 1 геликазы С доменсодержащий белок 1 глутатионпероксидаза гликопротеин 7
С-типа лектинового домена семейства Ί член А Интерферон альфа-2 Группы 10 секреторная фосфолипаза А2 Овостатина гомолог 2
СМЕЕ35-подобная молекула 1 Интерферон бета Группы IIб секреторная фосфолипаза А2 Орексигенный нейропептид ОЕЕР
Холина транспортера- подобный белок 4 Интерферон гамма Лактопероксидаза Лимфоцитарный антиген 6К
Легочный сурфактант- Инсулин-подобный р53 апоптоза эффектор, Белок, экспрессируемый
ассоциированный белок А1 фактор роста ΙΒ родственный РМР-22 простатой и яичками 1
Сперминоксидаза Индийский еж-белок Плацента-слецифический белок 1 Мнимая фосфолипаза В- подобный 1
СМР-14-ацетилнейраминат- Нервных клеток Тубероинфундибулярный Мнимый
бета-1,4-галактозид адгезивная молекула пептид неохарактеризованный
альфа-2,3- сиалилтрансфераза Ы-подобный белок с 39 остатками белок Р1.Л4 2147
Калликреин-8 Интерлейкин-13 Проларгин Отогелин
Тканевого типа плазминогена активатор Интерлейкин-2 Секретогранин-2 Рибонуклеаза 8
Пероксисомальная N(1)- Химотрипсин-подобной Эндонуклеазы домен- Ядерной поры комплекса-
ацетил-спермин/ слермидиноксидаза эластазы семейства член 2А содержащий 1 белок взаимодействующий бедок- подобный 2
Вероятная пальмитоилтрансфераза 2ОННС4 Ингибина бета А цепь Семафорин-ЗВ Проактиватора полипептида-подобный 1
Холестерилового сложного эфира транпортировочный белок Панкреатический секреторный трипсина ингибитор Соматостатин Белка зргпзРег гомолог 2
- 18 025738
НЬА класса I гистосовместимости антиген, А-2 альфа цепь Член 21 суперсемейства рецептора фактора некроза опухолей Дегидрогеназы/редуктазы ЗБЕ член семейства 4- подобный 2 фон Виллебранда фактора С домен-содержащий белок 2-подобный
Коллаген альфа-1(II) цепь Интер-альфа-трипсин ингибитора тяжелая цепь Н1 Транскобаламин-1 Уротензин-2В
Про-интерлейкин-16 йнтер-альфа-трипсин ингибитора тяжелая цепь Н2 Клеверный фактор 2 Тетраспанин-18
Рецептор лептина Интер-альфа-трипсин ингибитора тяжелая цепь НЗ Тестикан-1 БРБ0514 мембранный белок ГАМ159А
Декорин Простатаспецифический антиген Сывороточная параоксоназа/лактоназа 3 Латерин
Стромальных клеток фактор 1 Калликреин-4 Толлоид-подобный белок 2 Метилтрансфераза- подобный белок 7В
Тенасцин Плазменный калликреин Трипсин-2 Белок ТЕХ261
Дизинтегрина и металлопротеиназы доменсодержащий белок 12 Кальций- активированный хлоридного канала регулятор 4 ΚΪΝΟ пальцевый и 3ΡΚΥ домен-содержащий белок 1 Алкилированной ДНК восстанавливающего белка а!кВ гомолог 7
Дизинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина 13 Бактерицидный/проница емость-повышающий белок-подобный 1 Кальций-связывающий и суперспиральный доменсодержащий белок 1 Трансмембранный етпр24 домен-содержащий белок 6
Т-клеток поверхностного гликопротеина СБ8 альфа цепь Лептин Белок Ипб-2 ХК-родственный белок 5
ЕСГК-коамплифицируемый и переэкспрессируемый белок Дизинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина 4 Эктонуклеазид трифосфат дифосфогидролаза 8 Мнимый ν-набора и иммуноглобулиновый домен-содержащий белок 7
Аутофагия-родственный белок 16-1 Печеночная триацилглицеринлипаза Белок ИпР-8Ь Инсулинового фактора роста-подобный член семейства 3
Рака молочной железы анти-эстроген- резистентного белок 3 Лимфоцитного антигена 6 комплексного локуса протеин Обе ΟΟΡ-ΟΙοΝΑο:бетаСа! бета- 1,3-Ν- а це тилглюко з амин ил тр а н сф ераза 4 Ядерной поры комплекса- взаимодействукхций белок- подобный 1
Кадгерин-23 Эозинофиллизофосфолип аза ΕΜΙ домен-содержащий белок 1 Секретируемый фосфопротеин 1
- 19 025738
Макрофаговый колониестимулирующий фактор 1 Лютропина субъединица бета Неохарактеризованный белок Сбог£15 Коллаген альфа-5(VI) цепь
Фолатный рецептор альфа Микрофибриллярносвязанный белок 1 Коллектин-10 В меланомы антиген 5
Низкой плотности липопротеинов рецептор- родственный белок 8 Мезенцефалический астроцитарный нейротрофический фактор Длинноцепочечных жирных кислот--КоА лигаза АС5ВС2 МАР четырехдисульфидный ядерный доменный белок 10А
ЕЗ убиквитинпротеинлигаза ЬКЗАМ1 Матрикса С1а белок Онколротеин- индуцированный транскриптный белок 3 БРЕ0369 белок С6ог£57
Нервных клеток адгезивная молекула 1 72 кДа типа IV коллагеназа Ингибитор пептидазы 15 Мнимый неохарактеризованный белок С10ог£31
Невролигин-4, X- связанный Стромелизин-1 Пролин-богатый кислотный белок 1 Мнимый неохарактеризованный белок С11ог£45
Нетрин-СХ Нейтрофилколлагеназа Урокортин Неохарактеризованный белок С12ог£28
СР1 трансамидазы компонент РТС-Т Мезотелии Трипсин-ХЗ (ЕС 3.4.21.4) Неохарактеризованный белок С17ог£67
КЛИ лиганд Муцин-5АС ННГР-подобный белок 2 Бета-дефенсин 121
Зедгиге 6-подобный белок Муцин-6 Фракталкин Бета-дефенсин 130
51,АМ семейства член 7 Норрин Белок Мп£-11 Гистидиновой триады нуклеотид-связывающий белок 2
Фактор некроза опухолей Окситоцин-нейрофизин 1 Белок Мп£-7а Апелин
Уромодулин Бета-фактор роста нервов ГСН и двойных доменов 5НЗ белок 1 Плацента-специфический белок 9
Член 13 суперсемейства лигандов фактора некроза опухолей Член 18 суперсемейства лигандов фактора некроза опухолей Гепатомный фактор роста- родственный белок 2 Гепатоклеточный карциномы-связанный белок Τϋ26
Белок СКЕС1 Нейротрофин-3 Интерлейкина-12 субъединица альфа Персефин
ЕСГ-подобный доменсодержащий белок 8 Тромобоцитарного фактора роста субъединица А иРЕО577 белок ΚΙΑΑ1324 Регулированный эндокринспецифический белок 18
- 20 025738
Аминоацил тРНК синтетаза комплекс- в за им о де йс т вукмций многофункциональный белок 1 Фосфопантотеноилцисте индекарбоксилаза Комплемента <31ς фактор некроза опухолей- родственный белок 9 Комплемента 01ς фактор некроза опухолей- родственный белок 8
АОАМТЗ-подобный белок 4 Ингибитор активатора плазминогена 1 Муцин-17 Костный морфогенньтй белок 8А
фактор коагуляции XI Ингибитор активатора плазминогена 2 Лизосомный белок МС0-С1 Белок ИГБС13
Интерлейкина-22 рецептора субъединица альфа-2 Проколлаген С- эндопептидазы усилитель 1 Пролил 4-гидроксилазы субъединица альфа-3 белок Мпб-8а
Деформированного эпидермиса ауторегуляторного фактора 1 гомолог Трансмембранный и убиквитин-подобный домен-содержащий белок 2 Пептидил-пролил цис- транс изомераза 2БССАС10 1д-подобный домен- содержащий белок ΕΝ3Ρ00000270642
Простагландин-Н2 0- изомераза Протеин дисульфид- изомераза Ингибитор пептидазы 16 Абгидролазы доменсодержащий белок 15
Альфа-1-антитрипсин Пигментного эпителия- производный фактор Полиовирус рецептор- родственный белок 4 Рибонуклеаза-подобный белок 9
Альфа-1-антихимотрипсин Пепсин А Носителей растворенных веществ семейства 22 член 15 Неохарактеризованный белок С2ог£66
Ацил-КоА-связывающий белок Гастриксин СР1 инозитол-деацилаза Неохарактеризованный белок С17ог£99
Фактор комплемента В Зоп1С еж-белок Трансмембранный белок 43 Белок ΕΆΜ150Α
Хориогонадотропина Распознавания Ангиопозтин-родственный Плацента-специфический
субъединица бета пептидогликана белок 1-альфа белок 2 1-подобный белок
Уегзьсап ядерный белок Бигликан Ангиопоэтик-родствекньгй белок б Неохарактеризованный белок С18ог£20
Рецептор фактора роста эпидермиса Пролактин- индуцируемый белок Арилсульфатаза К Бета-дефенсин 110
Экто-ΝΟΧ дисульфид-тиол обменник 2 Фактор тромбоцитов 4 Авгурин Невритин-подобный белок
Гиалуронидаза-1 Плазминоген Мозг-специфическая сериновая протеаза 4 Гистидин-богатый белок карбоксильного конца 1
Интерлейкина-1 рецептора Сывороточная БВН-подобный С-типа лектинового
антагонистический белок параоксоназа/арилэсте раза 1 монооксигеназный белок 1 домена семейства 2 член А
Интерлейкина-б рецептора Щелочная фосфатаза, Неохарактеризованный Лейцин-богатый повтор-
субъединица бета плацентарного типа белок С1ог£5б содержащий белок 70
- 21 025738
Интерлейкина-1 рецептор- подобный 1 Пептидил-пролил цис- транс изомераза В Церебеллин-3 Серпин А13
Инсулин Костномозговой протеогликан Церебеллин-4 ΒΤΒ/ΡΟΖ домен-содержащий белок 17
Гликоделин Основной слюнный пролин-богатый белок 1 Колипаза-подобный белок Сбог£12Ё Неохарактеризованный белок С12ог£53
Паратгормон-родственный белок Легочный сурфактант- ассоциированный белок С Неохарактеризованный белок С11ог£83 С-типа лектинового домена семейства 9 член А
Нурим Паратгормон Неохарактеризованный белок С16ог£89 Комплемент С1 ς - под обный белок 4
Пролил 4-гидрокилазы субъединица альфа-2 Сывороточный амилоид Р-комлонент Карбоксипептидаза- подобный белок Х2 СМВЕ35-подобная молекула 4
С6276 антиген Секретогранин-1 Цистатин-9-подобный Белок ЕАМ151В
Цистеин-богатый с ЕСЕ- подобным доменом белок 1 Сердцевинный белок базальной мембраны- специфического гепарансульфат протеогликана Дегидрогеназы/редуктазы 5ΌΒ член семейства 13 Абгидролазы доменсодержащий белок ГАМ108А2/АЗ
Сив и зизЫ доменсодержащий белок 1 Антилейкопротеиназа Бета-дефенсин 123 Остеокрин
Фиколин-2 Стабилин-1 Бета-дефенсин 132 Трансмембранная протеаза, сериновая 11Е2
Ес рецептор-подобный белок 5 Внеклеточная супероксиддиемутаза [Си-Ζη] Цитокин-подобный белок 1 Трансмембранный белок 14Е
Белок СРК89 Соматотропин сккор£-родственный белок 2 Трансмембранный белок 207
Соединительная адгезивная молекула А Серпин В5 О1сккор£-подобный белок 1 ТОММ20-подобный белок 1
Лейцин-богатый повтор- содержащий белок 8А Спондин-1 Эпидидимальный секреторный белок ЕЗ- бета Неохарактеризованный белок С3ог£41
Множественная инозитолполифосфатфосфат аза 1 Белок обеспечения структур хромосом 3 ЕСЕ-подбный повторный и дискоидин 1-подобный домен-содержащий белок 3 Подчелюстной железы андроген-регулируемый белок ЗА
Нейропилин-1 Синтаксин-1А Белок ЕАМ556 В меланомы антиген 1
Плексин-А4 Тетранектин Фактор роста фибробластов 17 Неактивная карбоксилэстераза 4
Плексин-В1 Тр а нс ф ормирующий фактор роста бета-1 Фактор роста фибробластов 22 Четырехсочлененный коробочный белок 1
- 22 025738
Периостин Тироглобулин Фибробластов фактор роста-связывающий белок 2 Белок Η5Ν2
Белок К1С-3 Ингибитор металлопротеиназы 1 Фактор роста/дифференциации 3 Гуманин
ЗИТ и НТНК-подобный белок 2 Ингибитор металлопротеиназы 2 СЫРК1-подобный белок 1 Килин/хордин-подобный белок
Сульфатаза- модифицирующий фактор 1 Ингибитор металлопротеиназы 3 Сериновой протеазы ингибитор Кага1-типа 6 0РГ0624 белок СбогПЗб
Сульфатаза- модифицирующий фактор 2 Урокиназного типа активатор плазминогена Интерлейкин-17В Мнимый нейрофибромин 1- подобный белок 4/6
Траимембранная протеаза, сериновая 6 Лактотрансферрин Интерлейкин-17С Пероксидазин-подобный белок
Лимфотоксин-альфа Трипсин-1 Интерлейкин-17 Б ЗСО-спондин
Член 10В суперсемейства Подчелюстной железы Гиалуронана и Мнимый
рецептора фактора андроген-регулируемый протеогликана сшивки неохарактеризованный
некроза опухолей белок ЗВ белок 3 белок υΝ<29165/ΡΚΟ28630
Урокиназы плазминогена Член 1А Вителлин-мембранного Кальций-активированный
активаторный суперсемейства белка 1 внешнего слоя хлоридного канала
поверхностный рецептор рецептора фактора некроза опухолей гомолог регулятора член семейства 3
ν-набора домен- Фактора роста Хориогонадотропина Вероятная сериновая
содержащий Т-клеток сосудистого эндотелия субъединицы бета протеаза
активации ингибитор 1 рецептор 1 вариант 1 иВД9391/РКО34284
Глюкагон Витамин Б-связывающий белок Лизоцим-подобный белок 1 Неохарактеризованный белок С4ог£26
М-ацетилмурамоил-Ь- Витронектин Металлопротеиназа Неохарактеризованный
аланинамидаза матрикса-28 белок С4ог£40
Сульфгидрилоксидаза 1 фон Виллебранда фактор Нефронектин Неохарактеризованный белок С5ог£55
Дегидрогеназы/редуктазы Лимфоцитного антигена ΝΆΡ че тырехдисул ь фидный Мнимый макрофаг-
ЗОН член семейства 4 б комплексного локуса протеин С5с ядерный доменный белок 12 стимулирующий белок ΜΞΤΡ9
Интерлейкин-18- Цинк-альфа-2- Ольфактомедин-подобный Неохарактеризованный
связывающий белок гликопротеин белок 1 белок С15ог£61
Κίη ΙΚΒΕ-подобный белок 2 Неохарактеризованный белок С14ог£93 Офлактомедин-подобный белок 2А Химотрипсиноген В2
Миелоид-ассоциированный маркер дифференциации Ретиношизин Сериновая протеаза 27 Бета-дефенсин 108А
Хордин Альфа-1,3- маннозилтрансфераза АЬС2 Секретоглобина семейства ЗА член 2 Бета-дефенсин 111
- 23 025738
1-ацил-зп-глицерин-З- фосфат ацилтрансфераза гамма С-типа лектинового домена семейства 11 член А изоформа СКА Ь Дизинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина 2 Мнимый ν-набора и иммуноглобулиновый домен-содержащий белок б
Ведущего конца гликозилирования продукт-специфический рецептор Домен-содержащий белок 7 суперсемейства основного фасилитатора Дизинтегрина и металлопротеиназы доменсодержащий белок 26 Сериновой протеазы ингибитор КагаЗ-типа 5-подобный 3
ΝΙ.Β семейства САКО домен-содержащий белок 4 Лейцин-богатый повторяющийся трансмембранный нейрональный белок 1 Бактерицидный/проницаемо сть-повышающий белок- подобный 2 Мнимый сериновой протеазы ингибитор Кага1-типа 5-подобный 2
Про-нейрегулин-2, мембрана-связанная изоформа ПАБН дегидрогеназы [убихинон] 1 бета субкомплекса субъединица 11, митохондриальная Кислой сфингомиелинаэы- подобная фосфодиэстераза ЗЬ Дегидрогеназы/редуктазы ЗБК член семейства 7С
Сперма-ассоциированный антиген НА БРГ054б мембранный белок С1ог£91 Сериновой протеазы ингибитор Кага1-типа 7 Бета-дефенсин 131
Ооцит-секретируемого белка 1 гомолог Карбоновая ангидраза- родственный белок 10 Нейрексофилин-4 Бета-дефенсин 134
Сывороточный альбумин Холецистокинин Белок ИпЬ-9Ь Бета-дефенсин 136
Кохлин Коданин-1 Зимогенового гранулярного белка 16 гомолог В Бета-дефенсин 116
Плазменной протеазы С1 ингибитор ^охарактеризованный белок С6ог£89 Семафорин-ЗБ Белок ЕАМ132А
Интерлейкина-7 рецептора субъединица альфа Хондроитинсульфатглюк уронилтрансфераза Аполипопротеин Ъ4 Белок ЕАМ132В
Интер-альфа-трипсин ингибитора тяжелая цепь Н5 Хитиназа доменсодержащий белок 1 Транмембранная протеаза, сериновая 110 Бета-дефенсин 115
Тромобоцитарный фактор роста Б Трансмембранный белок С9ог£7 ЗсгарЬе-чувствительный белок 1 Бета-дефенсин 114
Белок Ξ100-Α7 СМКГ35-подобная молекула 9 Мнимый аннексии А2- подобный белок Сериновой протеазы ингибитор Кага1-типа 9
Сиаловая кислота- связывающий 1д-подобный лектин 10 Цитохром Р450 251 Костный морфогенный белок 10 Липазы член N
Тубулоинтерстициального нефрита антиген-подобный СгитЬз белка гомолог 3 Секретогранин-3 Панкреатический липаза- связанный белок 3
- 24 025738
Член 13В суперсемейства лигандов фактора некроза опухолей Дегидрогеназы/редукта зы ЗОВ член семейства 7 Комплемента С1ч фактор некроза опухолей- родственный белок 4 Белок, экспрессируемый в яичках, простате и плаценте
Длинноцепочечных жирных кислот--КоА лигаза 5 Белок ЕМЕБ Неохарактеризованный белок С1ог£54 Нейромедин-5
Клаудин-14 Комплемента фактора Н-родственный белок 4 Карбоксипептидаза Аб Нейропептид 5
Лейцин-богатый повторсодержащий белок 20 Лейцин-богатый повторяющийся ЬС1 семейства член 3 С-С мотив хемокина 19 Нейрональный пентраксин- подобный белок С16ог£38
Член Ί семейства Интерлейкина-1 Глиомедин С-С мотив хемокина 25 Отолин-1
Лимфоцитного антигена б Глицерофосфодиэфирфос Химотрилсин-лодобной Железо/цинк пурпуровая
комплексного локуса фодиэстеразы домен- эластазы семейства член кислая фосфатаза-
протеин С5Ь содержащий белок 5 2В подобный белок
Ацетилхолинастераза Вероятный С-белок сцепленный рецептор 113 Белок СЕ1 Овостатина гомолог 1
Амелогенин, X изоформа Вероятный С-белок сцепленный рецептор 114 Неохарактеризованный белок С6ог£1 Плазминоген-родственный белок А
Ангиогенин Глицерин-3- фосфатацилтрансфераза 4 Неохарактеризованный белок С7ог£34 Полисераза-3
сибиреязвенного токсина рецептор 2 Гремлин-1 Кератиноцит-связанный белок 3 Мнимый пептид ΥΥ-2
Аннексии А2 Калийного канала подсемейства К член 17 Неохарактеризованный белок С9огГ47 Мнимый пептид ΥΥ-3
Аполипопротеин С-1Х1 КОББ мотив-содержащий белок 2 Коллаген альфа-1(VIII) цепь Рибонуклеаза-подобный белок 10
Аполипопротеин Ъ1 Лайилин Неохарактеризованный белок С18ог£54 Рибонуклеаза-подобный белок 12
Субъединица субкомпонента А комплемента С1ч Лейцин-богатый повтор-содержащий белок 8В Цистатин-подобный 1 Рибонуклеаза-подобный белок 13
Субъединица субкомпонента С комплемента С1д Лейцин-богатый повтор-содержащий белок 8ϋ С2 домен-содержащий белок 2 Серпин АН
Кальцитонин Сиаловая кислота- связывающий 1д- подобный лектин 6 БОНСК домен-содержащий белок 1 КипИг-типа протеазы ингибитор 4
- 25 025738
Растворимая кальций- активируемая нуклеотидаза 1 Мнимый беременность- специфический бета-1- гликопротеин 2 Белок ГАМ55С Метеорин-подобный белок
С-С мотив хемокина 15 Ъуб/РЬАСВ домек- содержащий белок 1 Коллаген альфа-1(XXVI) цепь Мнимая яичковая сериновая протеаза 2
СО97 антиген( Ьуб/РЬАин доменсодержащий белок 5 Белок РАМ19А2 Бета-дефенсин 112
Контактин-4 ΜΕιΝ64 Ν-терминального домена гомолог Белок РАМ5В Неохарактеризованный белок Р1Л37543
Комплемент С2 Фактор, ингибирующий миграцию макрофагов Фактор роста фибробластов 5 Белок РАМ24А
Коллаген альфа-6(IV) цепь 2-ацилглицернл 0- ацилтрансфераза 3 Вероятная сериновая протеаза НТКАЗ Секретируемый связанный с ожогом белок 4
Коллаген альфа-2 (VI) цепь Митохондриального носителя гомолог 1 Член 8 семейства Интерлейкина-1 Комплемент С1д-подобный белок 2
Коллаген альфа-1(XI) цепь Аполипопротеин Ьб Сериновой протеазы ингибитор Кага1-типа 4 Мнимый неохарактеризованный белок С17ог£69
СгшпЪз гомолог 1 Протокадгерин альфа-б Отоспиралин Мнимый цистатин-13
Цистатин-С Протокадгерин гамма- А12 Экспрессируемый в печени антимикробный пептид 2 Бета-дефенсин 109
Нейтрофильный дефенсин 1 Вольтаж-открываемый водородный канал 1 Лизилоксидазы гомолог 1 Бета-дефенсин 113
Эндотелин-3 АН-транс-ретинол 13,14-редуктаза Лизилоксидазы гомолог 2 Бета-дефенсин 135
Низкоаффиный иммун о гл обули н о вый эпсилон Гс-рецептор Динамики микротубул регуляторный белок 2 Белок, связанный с карциномой эпителия длинного неба, легкого и носа 4 Пептидаза 51 доменсодержащий белок БОС136242
Рецептор фактора роста фибробластов 3 Н-Спондин-4 Лизоцим д-подобный белок 2 Фактор роста/дифференциации 7
Рецептор фактора роста фибробластов 4 Длинноцепочечных жирных кислот транспортный белок 3 Эндомуцин 1дА-индуцирующего белка гомолог
Роста остановкаспецифический белок 6 Пузырек- транслортирующий белок 5ЕС22с Нейропептид В Мнимый липокалин 1- подобный белок 1
Рецептор гормона роста Клаудин-1 Кинезин-подобный белок ΚΙΕ7 Мнимая сериновая протеаза 29
- 26 025738
Бифункциональный УДФ-Ν- ацетилглюкозамино 2- зпимераза/Ν- ацетилманнозаминокиназа Лейцин-богатый повторами и иммуноглобулин- подобный домен- . содержащий белок 3 Лейкоцит-асссциировавный иммуноглобулин-подобный рецептор 2 Мнимый рецептора Зсауепдег цистеин- богатый домен-содержащий белок ЬОСб19207
Член 8 суперсемейства иммуноглобулинов ЗЬАМ семейства член 9 Кальций-зависимая фосфолипаза А2 Секретоглобин-подобный белок
Интерлейкина-4 рецептора альфа-цепь Транстиретин Проапоптозный каспазный адаптерный белок Мнимый стереоцилин- подобный белок
Калликреин-14 Сериновой/ треониновой-киназы белок 32В Интегрин бета-подобный белок 1 Инсулинового фактора роста-подобный член семейства 2
Калликреин-6 Тромобоцитарного фактора роста субъединица В Толлоид-подобный белок 1 К1В2ОЬ4
Ламинина субъединица бета-3 Ноггин КипЦг-типа протеазы ингибитор 3 Мнимый цинк-альфа-2- гликопротеиы-подобный 1
Лейцил-цистинил аминопептидаза Триптаза альфа-1 Белок ТМЕМ155 Инсулинового фактора роста-подобный член семейства 4
Маннан-связывающая лектиновая сериновая протеаза 1 Тетратрикопептидповто рный белок 14 Просалюзин Неохарактеризованный белок С2ог£72
Маннан-связываюгцая лектиновая сериновая протеаза 2 ХТРЗ- трансактивированного гена В белок Белок безамнионный Начала репликации- подобкый белок
Нейтрофилжелатиназы- связанный липокалин Пальмитоилтрансфераза 2ВННС15 Белок ИГ1ЭС10В Белок, экспрессируемый простатой и яичками 3
Нейропептид Υ Вителлинового слоя сперма-связывающий белок 3 МАР четырехдисульфидный ядерный доменный белок 8 В меланомы антиген 4
Аддгесап ядерный белок Лейцин-богатый повтор-содержащий белок 39 Белок Мп1:-5Ь Мнимый неохарактеризованный белок С1ог£191
Легочный сурфактант- ассоциированный белок В Панкреатическая триацилглицеринлипаза Белок МпР-7Ь Бета-дефенсин 108В- подобный
Полиовирус рецептор- родственный белок 1 Трансмембранный белок 139 Вителлинового слоя сперма-связывающий белок 2 Неохарактеризованный белок ЕЬЛ90б87
Ренин Лейкемии ингибирующий фактор ЗНЗ домен-связывающий белок 5-подобный Секретируемый связанный с ожогом белок 2
- 27 025738
Рибонуклеаза панкреатическая Галектин-1 Адипоцитов адгезивная молекула Основной пролин-богатый пептид ΙΒ-1
Семеногелин-1 С-С мотив хемокина 21 Неохарактеризованный белок С12ог£59 Фактор роста фибробластов 16
Сигнальная молекула СБ5 антиген-подобный Аполипопротеин Α-Ϊ- Сериновой протеазы
активации лимфоцитов связывающий белок ингибитор Кага1-типа 8
Ингибитор пути тканевого фактора Карбогидратсульфотран сфераза 9 Клаудин-17 Неохарактеризованный белок ΚΙΑΑ0495
Ушерин Липополисахарид- связывающий белок Неактивная каспаза-12 Тромбоцитов основный белок-подобный 2
Фактор роста фибробластов 23 Цистеин-богатый моторных нейронов 1 белок Неохарактеризованный белок С7ог£58 Серпин ЕЗ
Интерлейкина-23 субъединица альфа Фактор роста соединительной ткани Коллаген альфа-1(XXVIII) цепь СК1-рецептор
Эпидидимальный секреторный белок Е1 Гомолог белка еуез зЬп£ Белок матрикса дентина 4 Секретируемый фосфопротеин 1
ΑϋΑΜΤΞ-подоСный белок 1 Муцин-подобный белок 1 Неохарактеризованный белок С16ог£48 Белок, секретируемый при стрессе 1
Хемокин-подобный фактор Фактор роста фибробластов 19 Карбоксилэстераза 3 Белок Ип£
ЕСГ-подобный домен- содержащий белок 7 Фоллистатин- родственный белок 3 Белок ГАМ20В Белок №п£ (Фрагмент)
Тектоник-1 Еж-взаимодействующий белок СРМ-петля ГТФазы 3 Мнимая сериновая протеаза ЬОС138652
Трансмембранный белок 25 Интерлейкина-17 рецептор В СНАМ домен-содержащий белок 1В ТОМ1
УДФ-Са1ЫАс:бета-1,3-Ν- ΕΧΥΟ домен-содержащий Фосфатидилинозитолгликан Мнимый
ацетилгалактозаминилтран регулятор якорного биосинтеза неохарактеризованный
сфераза 1 транспортировки ионов 5 класса и белок белок Г1Л46089
Интерлейкин-15 (1Ь-15) Эндотелиальная липаза Интерлейкина-27 субъединица альфа Мнимый неохарактеризованный белок С1ог£134
Множественные домены, ЭГФ-содержащий Про-нейрегулин-4, ϋϋΡ-ΟΙοΝΑο:бетаСа1 бета-
подобные фактору роста фибулин-подобный мембрана-связаная 1,3-Ν-
эпидермиса 11 белок внеклеточного матрикса 2 изоформа ацетилглюкозаминилтрансф ераза 9
Муцин и кадгерин- подобный белок Отораплин Лейцин-богатый повторами нейрональный белок 3 Неохарактеризованный белок С11ог£44
Рибонуклеаза 4 Группы 3 секреторная фосфолипаза А2 ММЭА рецептор- регулируемый белок 2 Неохарактеризованный белок С12ог£73
- 28 025738
2Н2 домен-содержащий белок ЗС Группы XV Фосфолипаза А2 ΝΑΌΗ-цитохром Ь5 редуктаза 1 Мнимый цистатин-9- подобный 2
СМР-Ы-ацетилнейраминат- бета-галактозамид-альфа- 2,3-сиалилтрансфераза Член 14 суперсемейства лигандов фактора некроза опухолей Болезни. Паркинсона 7 домен-содержащий белок 1 Мнимой абгидролазы домен-содержащий белок ГАМ106А5
Трансмембранный белок 9 Плексин-А2 ГК506-связывающий белок 11 Бета-дефенсин 133
МАР четырехдисульфидный ядерный доменный белок 2 Папилин С-типа лектинового домена семейства 12 член В Фиброзин-1
Аденозиновый АЗ рецептор Прокинетицин-1 Носителей растворенных веществ семейства 35 член Г5 Вероятный фолатный рецептор дельта
Гамма-секретазы субъединица АРН-1А Рибонуклеаза 7 Сиаловая кислота- связывающий 1д-подобный лектин 12 КРЕ-спондин
Базигин Кипхбг-типа протеазы ингибитор 1 Белок РАМ19АЗ ΝΡΙΡ-подобный белок ΕΝ5Ρ00000346774
Бакуловирусный ΙΑΡ повтор-содержащий белок 7 Спондин-2 ИБ повтор-содержащий белок 82 Мнимый яичкоспецифический прионный белок
Калуменин Тестикан-2 Адипоцитарный энхансер- связывающий белок 1 Пролин-богатый белок 1
Альфа-51-казеин Неактивная сериновая протеаза РАМЕ1 АБАМТЗ-подобный белок 3 Мнимый неохарактеризованный белок ГР248
Ци клин—1.1 Торсин~2А Суперспиральный доменсодержащий белок 80 иРГО670 белок С8ог£55
Фактор комплемента Н Вазогибин-1 Экто-ΝΟΧ дисульфид-тиол обменник 1 Мнимый цинк-альфа-2- гликопротеин-подобный 2
Хорионический соматомаммотропиновый гормон Вазорин Нейрональный регулятор роста 1 Белок 5РАКС
Рецептор вируса Коксаки и аденовируса Ксилозилтрансфераза 1 Интерфоторецептора матрикса протеогликан 1 Отопетрин-1
Эктонуклеотидных Эктонуклеотидных кДНК ГЬДЗббОЗ £15, клон кДНК ГБЛ55667, высоко
пирофосфатазы/фосфодиэст пирофосфатазы/фосфоди ТЕАСН2015180, высоко аналогичная
еразы семейства член 2 эстеразы семейства член 6 аналогичная Секретируемому связанному с ожогом белку 2 Секретируемому кислотному и цистеин- богатому белку
ЕЕО1-подобный белок альфа Онкостатин-М Липазы член Н Липазы член К
- 29 025738
Фактор коагуляции IX Дерлин-1 Муцин-19 (мие-19) С-типа лектинового домена семейства 18 член С
Низкоаффинный НЕЕУ-ГЕб_6р24.1 Чувствительности к Мнимый
иммуноглобулина гамма Гс провирусный псориазу 1 кандидатного неохарактеризованный
региона рецептор ΙΙΙ-Β наследственный полипротеин Εην гена 2 белок белок иВД6125/РК020090
Фиколин-3 Простасин Интегральный мембранный белок 2А Комплемент СЗ
Гс рецептор-подобный Трансмембранная Транспорта пузырьков Коллаген альфа-2(IV)
белок 2 протеаза, сериновая НЕ белок 5ГТ2В цепь
Лейцин-богатый НЬА класса I фон Виллебранда фактора Неохарактеризованный
повторяющийся трансмембранный белок гьктз гистосовместимости антиген, См-16 альфа цепь А домен-содержащий белок ЗА белок га06126/РК020091
Гелсолин Ипб ингибиторный фактор 1 Белка зЫ5а-2 гомолог Серпин-подобный белок нмзэ
Гранулизин С-типа натрийуретический пептид Сигнальной пептидазы комплексная субъединица 3 Белок, экспрессируемый простатой и яичками 4
Трансмембранный гликопротеин ΝΜΒ Ангиопоэтин-2 СВ164 сиаломуцин- подобный 2 белок Коллаген альфа-1(XXII) цепь
Гранулины Дезоксирибонуклеаза гамма Кадгерин-16 Мнимый неохарактеризованный белок С13ог£28
Гепараназа Карбоксипептидаза А5 Кадгерин-19 Цистатин-5
1д мю цепи С регион С-С мотив хемокина 14 Церебеллин-2 Е-Спондин-1
Интерлейкин-1 альфа Интерлейкин-5 Трансмембранный белок С3ог£1 С8ог£2
Интерлейкина-31 рецептор А Интерлейкин-10 Спермальныи экваториального сегмента белок 1 Одорант-связывающий белок 2а
Соединительная адгезивная молекула В С-Х-С мотив хемокина 2 Неохарактеризованный белок Сбог£72 Опиорфин
Липокалин-1 С-Х-С мотив хемокина 5 Неохарактеризованный белок С11ог£24 Почек андроген- регулируемый белок
Лейцин-богатый повтор- Дизинтегрин и Асу1-СоА синтетазы Мнимый
содержащий С-белок металлопротеиназа с семейства член 2, Неохарактеризованный
спаренный рецептор б мотивами тромбоспондина 6 митохондриальный белок υΝ<25830/ΡΡΟ19650/ РКО19816
- 30 025738
Латентный трансформирующий фактор роста бета-связывающий белок 1 Полипептид Ν- ацетилгалактозаминилт рансфераза 1 Вероятный УДФ-сахар- транспортирующий белок ЗБС35А5 Мнимый неохарактеризованный белок ПЫО6975/РИО21958
Матрилин-3 Фибулин-2 С-типа лектинового домена семейства 1 член А Трахикинин-3
Миелиновый белок нуль- подобный белок 1 Фиколин-1 С-типа лектинового домена семейства 3 член А Секретируемый фосфопротеин 1
Нейробеахин-подобный белок 2 ЗЬ цитокин С-типа лектинового домена семейства 4 член Е Склеростин
Никастрин Фоллистатин С-типа лектинового домена семейства 4 член С АБАМТЗ-лодобный белок 2
АДФ-рибоза пирофосфатаза, митохондриальная ЕКА51-связанный внеклеточного матрикса белок 1 Вероятная катион- транспортирующая АТФаза 13А4 Рецептора Зсачепдег цистеин-богатый доменсодержащий белок БОС284297
Протокадгерин-15 Энамелин НРГ0480 белок С15ог£24 Триптаза бета-1
Фактор роста плаценты Гиалуронана и протеогликана сшивки белок 1 Вителлинового слоя сперма-связывающий белок 4 Триптаза дельта
Белок 0-связанная- манноза бета-1,2-Ν- ацетилглюкозаминилтрансф ераза 1 Лейкоцитарного иммуноглобулинподобного рецептора подсемейства А член 3 Резидентный белок эндоплазматической сети ЕВр27 Мнимый белок критического региона синдрома кошачьего глаза 9
Вероятная гидролаза ΡΝΚΒ Интерлейкин-17Г Трансмембранный белок С1бог£54 Плексин домен-содержащий белок 1
Плейотрофин Интерлейкина-1 рецептора белок доступа Цитохром Р450 4Е12 МС51Ь-53Ъ-54Ь гомолог (Фрагмент)
Рецептор полиовируса Сериновой протеазы ингибитор Каза1-типа 5 Цитохром Р450 4X1 СОВЮ-подобный плацентарный белок (фрагмент)
Ретикулон-4 рецептор Калликреин-15 Цитохром Р450 4Ζ1 Цитокинового рецептора- подобный фактор 2
Сывороточный амилоидный А белок Интерферон альфа-14 Белок СЕЕС2 Вета-дефенсин 103
Половых гормонов- связывающий глобулин Беременностьспецифический бета-1- гликопротеин 4 БпаИ гомолога подсемейства В член 9 Вета-дефенсин 106
- 31 025738
5ЬАМ семейства член 6 Коллагеназа 3 Дипептидаза 3 Гиалуронидаза-3
Сарколеммной мембраны- связанный белок Металлопротеиназа матрикса-16 Мембранный белок ΓΆΜ174Ά Интерлейкина-28 рецептора альфа-цепь
БизН, Фон Виллебранда Питуитарной Тиоредоксин домен- Гликозидтрансфераза 54
фактора типа А, ЭГФ и пентраксин доменсодержащий белок 1 аденилатциклаза- а кт и в ирующий полипептид содержащий белок 15 домен-содержащий белок
Тироксин-связывающий глобулин Прокинетицин-2 Белок РАМ19А4 Хордин-подобный белок 1
Трансмембранный и Латентный Аденозин монофосфат- Мнимый
суперспиральный доменсодержащий белок 1 трансформирующий фактор роста бета- связывающий белок 3 белок трансфераза ПСБ неохарактеризованный белок иЫ09370/РКО34162
Транмембранная протеаза, сериновая 3 Соматолиберин Пренилцистеиноксидаза- подобный Нетрина рецептор иыс5В
Член ЮС суперсемейства Тромбоспондина типа-1 Фитаноил-КоА Рецептор фактора роста
рецептора фактора домен-содержащий гидроксилаза- фибробластов РСГК-1
некроза опухолей белок 1 взаимодействующий белок- подобный секретируемая форма белка (Фрагмент)
Член 11В суперсемейства Ангиогенный фактор с БХУБ домен-содержащий Неохарактеризованный
рецептора фактора некроза опухолей С вставкой и БНА доменами 1 регулятор транспортировки ионов 4 белок ΕΝ3Ρ00000244321
Серотрансферрин ТСБ-бета рецептор типа III Фактор роста/дифференциации 11 ЕСЕ2
Триптаза бета-2 Тиротропина субъединица бета Церебральный допамин нейротрофический фактор ЕРА6
Белок ΎΙΡΓ5 Неохарактеризованный белок С19ог£36 СРМ-петля ГТФазы 2 Мнимый растворимый интерлейкина 18 рецептор 1
Везикула-ассоциированной Комплемента 01ς Гормон роста- Мнимой абгидролазы
мембраны белок- фактор некроза индуцируемый домен-содержащий белок
ассоциированный белок В/С опухолей-родственный белок 2 трансмембранный белок ЕАМ108А6
кДНК ГЬ396669, высоко Эктонуклеотидных Глицерофосфодиэфирфосфод Мнимый ν-набора и
аналогичная пирофосфатазы/фосфоди иэстеразы домен- иммуноглобулиновый
Секретируемому кислотному цистеин- богатому белку Ношо зартепз (остеонектин) (ЗРАНС), мРНК эстеразы семейства член 5 содержащий белок 2 домен-содержащий- подобный белок ΕΝ3Ρ00000303034
- 32 025738
кДНК ГДД77519, высоко Полипептид Ν- ЮАР, кага1, В-клеток созревания
аналогичная ацетилгадактозаминилт иммуноглобулин, кипзЛг и антигена транскриптный
секретируемому рансфераза-подобный ΝΤΚ домен-содержащий вариант 4 (Член 17
связанному с ожогом белку Ното еаргепз мРНК белок 2 белок 1 суперсемейства рецептора фактора некроза опухолей)
Т-клеток дифференциации антиген Сйб 51ΪΙ гомологичный 1 белок КЭЕЬ мотив-содержащий белок 1 ΌΡΓ0672 белок С3ог£58
Пикачурин Вариант гормона роста Адипофилин Метилрибоза-1- фосфатизомераза
Фибриноген-подобный белок 1 Ангиопоэтин- родственный белок 3 Пактаза-подобный белок 17-бета гидроксистероид дегидрогеназа 13
Интерлейкин-32 Ангиопоэтин- родственный белок 7 Хондромодулин-1 Аминопептидаза В
Матрилин-4 Экто-АДФ- рибозилтрансфераза 5 Коллаген альфа-6(VI) цепь - Дермцидин
Сперма-ассоциированный антиген 11В Карбоновая ангидраза- родственный белок 11 Лейцин-богатый повторсодержащий белок 33 Метеорин
Фактор коагуляции XII Вероятная рибонуклеаза 11 МАЫЗС домен-содержащий белок 1 Метилтрансфераза- подобный белок 7А
Гепцидин Вероятная карбоксипептидаза XI Липокалин-15 иъз
К1о£Ьо Белок ГАМЗБ Арилсульфатаза I Ν-ацетилтрансфераза 15
Серглицин С-Х-С мотив хемокина 14 Мезодермы развития кандидат 2 Эфрин-А4
Томорегулин-2 Бета-дефенсин 127 01сккор£-родственный белок 1 Белок Р1ипс
Хордин-подобный белок 2 Бета-дефенсин 129 Подокан Калликреин-11
Член 6В суперсемейства Цистеин-богатый Фибронектина типа III ЮКТ1 индуцированный
рецептора фактора секреторный белок домен-содержащий белок 1 секретируемый белок 1
некроза опухолей ЬССЬ домен-содержащий 2 вариант разрезания х (Фрагмент)
иРЕ0414 трансмембранный Фактор роста Нейротримин Член 10 семейства
белок С20ол£30 фибробластов 21 Интерлейкина-1
С-типа лектинового Плазменная альфа-Б- Обонятельный рецептор РБА2С2О
домена семейства 4 член С фукозидаза 10И1
ИРГ0317 белок С14ог£159, митохондриальный Гастрокин-1 Белок РАРМ-1 Протеогликан 3
Нетрин-С2 Гастрокин-2 ΡΒΖ домен-содержащий белок 2 Инсулин-лодобный пептид ΙΝ5Ι,5
Металлоредуктаза 5ТЕАР2 Глутатионпероксидаза 7 Проэлирегулин Ольфактомедин-подобный белок 3
- 33 025738
ЗизЫ домен-содержащий белок 4 ΗΗΙΡ-подобный белок 1 Болезни лоликистоза почек белок 1-подобный 1 Внеклеточный гликопротеин лакритин
Белок ΥΙΓ1Β Интерферон каппа ИЬРЪ514 Ретинолдегидрогеназа 13
Аполипопротеин М Аполипопротеин С-1 Металлопротеиназа матрикса-2б Нейтрофильный дефенсин 3
С4Ь-связывающего белка бета-цепь Проколлаген С- эндопептидазы усилитель 2 РЕЪТ-подобный белок 2 6Σ&25807
Т-клеток поверхностного гликопротеина СБ8 бета цепь Фактор определения лево-право 1 Носителей растворенных веществ семейства 35 член ЕЗ τυττι
С-С мотив хемокина 3- подобный 1 Лейцин-богатый повторяющийся ЬС1 семейства член 4 Транспортер цинка ΖΙΡ9 ϋΚΤν8200
Фактор роста фибробластов 8 ВКСА1-А комплексная субединица АЬгахаз Ноэлин-2 ЮЬИ5808
Сиаломуциновый ядерный белок 24 Лейцин зипперный белок 2 5е12иге 6-подобный белок 2 0ВАР2
Программированной клеточной смерти 1 лиганд 2 Нейрексофилин-3 Семафорин-ЗА С1д/ТПГ-родственный белок 8
Секретируемый и трансмембранный 1 Остеомодулин Семафорин-4С К1Н2РЬ4 (Фрагмент)
Комплемента 01ς фактор некроза опухолей- родственный белок 6 Сериновой протеазы ингибитор Кага1-типа домен-содержащий белок 1 Абгидролазы доменсодержащий белок 14А Хемокин-подобного фактора суперсемейства 2 транскриптный вариант 2
ЕСГ-подобньтй модульсодержащий муцин- подобный рецептор- подобный 3 Спермы акросомы мембрана- ассоциированный белок 3 Анкирина повтор доменсодержащий белок 36 Кератиноциты- ассоциированный Трансмембранный белок 1
Ноэлин-3 Секретоглобина семейства ЗА член 1 Белка зЫза-4 ΟΚΘΜ353
Одорант-связывающий белок 2Ь Тсукушин Нейромедин-Н МАТ12963
Уротензин-2 Клаудин-2 (5Р82) Мос1а1 гомолог ΝΪΝΡ6167
Витрин Комплемента фактора Н-родственный белок 2 Синаптогирин-2 РОМ121-подобный
ΝΚΤ1-индуцируемого- сигнального пути белок 3 Иммуноглобулина суперсемейства содержащий лейцин- богатый повторами белок Мозг-специфического ангиогенеза ингибитор 1- ассоциированный белок 2- подобный белок 2 ΚΤΓν9368 (ЗЬЕ-зависимое повышение 1}
- 34 025738
οϋΝΑ ГЫ75759, высокоаналогичный Нолта зарьепз фоллистатин- подобному 3 (секретируемому гликопротеину) (ГЗТБЗ), мРНК Лейцин-богатый повторами и иммуноглобулин- подобный доменсодержащий подо- рецептор- взаимодействующий белок 1 Суперспиральный доменсодержащий белок 104 Лейцин-богатый повторами и иммуноглобулин- подобный доменсодержащий подо- рецептор- взаимодействующий белок 4
Ангиотензин- конвертирующий фермент 2 Κίη ΙΡΡΕ-подобного белка 3 Трансмембранный 4 Σ6 член семейства 20 КСМ02
Адипонектин Гематопоэтических клеток трансдюсер сигнала Трансмембранный белок 107 ЕЪОТ5929
Ангиопозтин-родственный белок 4 Фоллитропина субъединица бета Трансмембранный белок 143 КУУМЗЮб
Аполипопротеин Α-ν Белок, ингибирующий активность меланомы 3 Трансмембранный белок 178 Ι8ΡΓ6484
Аспорин Лейцин-богатый повтор-содержащий белок 4 Трансмембранный белок 205 Ы4НР9428
Бактерицидный белок, повышающий проницаемость Транспортер цинка 5 Трансмембранный белок 41А νΝΕΤ9373
СОВ домен-содержащий белок 1 Лейцин-богатый повторами нейрональный белок 1 Трансмембранный белок 50А АСАН3104
Хрящего промежуточного слоя белок 1 Апикальный эндосомальный гликопротеин Трансмембранный белок 50В Κνΐ.Α1944
Бета-А1а-Н1з дипептидаза Сывороточный амилоидный белок А-4 Интерлейкин-28В Крер3002
Коллаген альфа-1(V) цепь Пробетацеллюлин Нейрональный пентраксин- 2 ΖΒΗΗΟΙΙ
Коллаген альфа-1(XXV) цепь Бета-1,4- галактозилтрансфераза 7 Коллектрин АСБИ2560
Эстрадиол 17-бета- дегидрогеназа 11 3- гидроксибутиратдегидр огеназа типа 2 Трансмембранный белок 92 Τ5ΞΡ3028
ЭпаЭ гомолога субсемейства С член 10 С1СА1/Г1 -специфический шаперон 1 Трансмембранный белок 95 НГУС5814
ЕСГ-подобный доменсодержащий белок 6 Бета-казеин Трансмембранный белок 9В ΞΗ553124
Фактора свертывания крови XIII А цепь Каппа-казеин Вероятная карбоксипептидаза РМ20Б1 ММР19
- 35 025738
Глюкоза-6- фосфатизомераза Трансмембранный белок С2ог£18 Тетраспанин-12 Ο52Ξ6193
Аппетит-регулирующий гормон Карбоксипептидаза N каталитическая цепь Тетраспанин-13 7СРИ2523
Интерлейкина-12 субъединица бета СС320 антиген Тетраспанин-15 Ι.ΜΝΕ6487
Интерлейкин-22 Хондроитинсульфатсинт аза 1 БРГ0513 трансмембранный белок АЬЬА2487
Интелектин-1 Хондроитинсульфатсинт аза 2 Митохондриальный распаривающий белок 4 САЫ1870
Лейцин-богатый глиома- деактивирующий белок 1 СМЕБ35-подобная молекула 7 Полисераза-2 ГР531829
Лимфоцитарный антиген 96 Белка сапору гомолог 3 Вероятная пальмитоилтрансфераза 2БННС24 МК336228
Матрилизин Короткоцепочечная дегидрогеназа/редукта за 3 Вителлинового слоя сперма-связывающий белок 1 СКРЕ5311
Муцин-20 Дельта-подобный белок 4 Вителлинового слоя сперма-связывающий белок 2 АУЬЬ5809
Пропротеин конвертаза субтилизин/кексин типа 9 Эе1Ъа и МобсЬ- подобный фактора роста эпидермиса - родственный рецептор Консервативная олигомерная субъединица комплекса Гольджи 7 СН1 СЗЬ/С4Ь рецептор 5СЕ9 (или 16) С-терм. экзон 5СР = короткий консенсусный повтор
Распознавания пептидогликана белок Долихолкиназа Адипонектина рецептора белок 2 ΡΙΚΚ2786
Интерферон- индуцированный белок 17 кДа Эндотелин- конвертирующий фермент-подобныи 1 Ингибина бета С цепь 3100 кальцийсвязывающий белок А7-подобный 3
Белок Ип1-4 Интегральный мембранный белок 2В Брорин СТНИ5826 (ЬР5085 белок)
Аллографта воспалительный фактор 1- подобный Инсулин-подобного фактора роста- связывающий белок 5 Семафорин-ЗС ΚΤΙ58219 (НСС2020043)
АгтасНИо повторсодержащий X-связанный белок 3 Эндотелиальных клеток-селективная адгезивная молекула Гепарансульфатглюкозамин З-О-сульфотрансфераза 2 Гиалуронана и протеогликана сшивки белок 4
Хондроитинсульфат Ν- ацетилгалактозаминилтран сфераза 1 Сигнальный пептид, Сив и ЕЕЕ-лодобный домен-содержащий белок 1 Рецептора лептина пере крыв а ющий с я транскрипт-подобный 1 Мгсгопоуе!
- 36 025738
Хитотриозидаза-1 Комплемента фактора Н-родственный белок 3 ЗРАКС-подобный белок 1 ЗАМК3000
С1аиб1П домен-содержащий белок 1 Прорелаксин Н1 Фибулин-7 ' УГЫ.ЗО57
Эрлин-2 Фоллистатин- родственный белок 1 Белка НЕС гомолог 1 СТИЕ5837
Гликозилтрансферазы 8 домен-содержащий белок 1 Глобозид альфа-1,3-Ν- ацетилгалактозаминилт рансфераза 1 Фибриноген С доменсодержащий белок 1 УСЗА5840
Гольджи мембранный белок 1 Гамма- глутамилгидролаза Фосфолипаза А1 член А СН.Р33125
Вероятный С-белок сцепленный рецептор 125 Кадгерин-24 Основной слюнный пролин- богатый белок 2 СРТК3118
Интерлейкина-20 рецептора альфа-цепь Глицерин-3- фосфатацилтрансфераза 3 Сперматогенез- ассоциированный белок 6 РАМР6501
Галектин-7 С-белок сцепленный рецептор 56 ЗизЫ повтор-содержащий белок ЗКРХ2 ЬТЬЪ9335
ЫКС2О лиганд 4 Гиалуронан- связывающий белок 2 Белка скручивания при гаструляции гомолог 1 ν0ΕΗ9374
1>-аминокислог оксидаза Прогепаринсвязывающий ЭГФ- подобный фактор роста Торсин-1В АНРА9419
Пролил 3-гидрокилаза 1 Гистидин-богатый гликопротеин Белок Юп£-5а ΜΟΗνΐ887
6ΡΙ этаноламин фосфаттрансфераза 2 Карбогидратсульфотран сфераза 14 Акрозин-связывающий белок НЗАБ5836
СР1 этаноламин фосфаттрансфераза 3 Интерлейкина-20 рецептора бета цепь С-типа лектинового домена семейства 18 член Б БНБС1946
Кальций-связывающий митохондриальный белок- носитель ЗСаМС-2 (Малый кальций-связывающий митохондриальный белок- носитель 2) Эктонуклеотидной пирофосфатазы/фосфоди эстеразы член семейства 3 Лизосомно- ассоциированкый трансмембранный белок 4А Белок, связанный с карциномой эпителия длинного неба, легкого и носа 3 (лигандсвязывающий белок ΗΥΑ3)
Легочный сурфактант- ассоциированный белок А2 Инсулин-подобного фактора роста- связывающий белок 7 Семафорин-ЗЕ БРРА601
Фактор расщепления, аргинин/серин-богатый 16 Каллистатин Амелобластин ΡΙΚΚ1
- 37 025738
Альфа-Ν- ацетилгалактозаминид альфа-2,6- сиалилтрансфераза 6 Фибронектина типа III домен-содержащий белок ЗВ Домен-содержащий белок 5 суперсемейства основного фасилитатора 5ЕКН2790
Одиночный 1д 11,-1- связанный рецептор Лейкемии ингибирующего фактора рецептор Ангиопоэтин-1 ЕЬЕЕ93б4
Тектоник-3 Ιιίη-7 гомолог В Ангиопоэтин-4 АПЕЛ14Н
Член 11 суперсемейства лигандов фактора некроза опухолей Тиоредоксин- родственный трансмембранный белок 1 Множественные домены, подобные фактору роста эпидермиса 9 СЪ8Н6409
Член 19 суперсемейства рецептора фактора некроза опухолей Дизинтегрина и металлопротеиназы домен-содержащий белок 32 Кислой сфингомиелиназы- подобная фосфодиэстераза За 5ЕУР2550
Пальмитоилтрансфераза ΖϋΗΗΟ9 Ьуб/РЬАиК доменсодержащий белок 3 АБАМТЗ-подобный белок 5 ККБЕ9220
Фибулин-5 С-типа лектинового домена семейства 14 член А Спексин РТМБ5838
Белок 2-зависимой протеазы ингибитор Белка согпхсЪоп гомолог Мнимый трипсин-6 УЬСЫ1945
Ал ьфа-2-ма кро глобулин Белок ЕАМ151А Прото-Онкогенный белок Ипб-1 АУРС1948
АдоиЫ-родственный белок ЕК506-связывающий белок 14 Костный морфогенньгй белок ЗЬ АИСС2491
Панкреатическая альфа- амилаза Нейропилин и толлоид- подобный белок 2 Костный морфогенный белок 5 РЗУЪ6168
Натрийуретические пептиды В Протокадгерин бета-13 Костный морфогенный белок 8В ьспзозэ
Предсердный натрийуретический фактор Пренилцистеиноксидаза 1 Белок ЕАМ26Б РРЕК6495
Нейтральная церамидаза Пефлин С1д-связанный фактор КЬ5С6348
Бета-2-микроглобулин Пептидил-пролил цис- транс изомераза- подобный 1 ИАР четырехдисульфидный ядерный доменный белок 1 СЗЕР2ВР
Костный морфогенный белок 4 Стволовых клеток простаты антиген Церебеллин-1 6ЫУ3061
Биотинидаза Белок лоскутный гомолог 2 Карбоксипептидаза 0 6Η5Ι6489
- 38 025738
Рецептора Зсачепдег цистеин-богатый типа 1 белок М130 Хитобиосилдифосфодоли хол бета- манно зилтрансфера за Миелиновый белок нуль- подобный белок 2 (Эпителиальный V- подобный антиген 1) кДНК ΕΣ353955, высоко аналогичная Секретируемому связанному с ожогом белку 4
Карбоксипептидаза В2 Белка зе1-1 гомолог 1 Сериновая протеаза 1- подобный белок 1 ΡΡΙΕ
Карбоксипептидаза Ζ РгоЗААЗ Суперспиральный доменсодержащий белок 70 УЗЗИ1971
С-С мотив хемокина 5 Сиаловая кислота- связывающий 1д- подобный лектин 9 С-С мотив хемокина 28 КЫА6249
С-С мотив хемокина 7 ЗБ1Т и МТКК-подобный белок 1 Неохарактеризованный белок С4ог£29 АЫ.Ю1950
С-С мотив хемокина 8 Статерин Сив домен-содержащий белок 2 ενεΐ466
СБ59 гликопротеин Тестизин Тгет-подобный транскрилтный белок 4 Ε3ΓΙ5812
Фактор комплемента I Трансмембранный канал-подобный белок 5 Неохарактеризованный белок С6ог£58 СЫМС2999
Кластерин Транмембранная протеаза, сериновая 4 Хондроадгерин ААСС6488
Коллаген альфа-2 (I) цепь Метастазов-суппрессор ΚΪ35-1 Хрящего промежуточного слоя белок 2 ННЗБ751
Коллаген альфа-1(III) цепь Островковый амилоидный полипептид Неохарактеризованный белок С10ог£25 Бета-дефенсин 108В
Коллаген альфа-1(IV) цепь Тгет-подобный транскрилтный белок 2 Истмин-1 Бета-дефенсин 118
Коллаген альфа-3(IV) цепь Тиоредоксин доменсодержащий белок 12 Цистатин-8 Бета-дефенсин 124
Коллаген альфа-5(IV) цепь Фактор роста сосудистого эндотелия В Кардиотропин-1 (СТ-1) Бета-дефенсин 125
Коллаген альфа-3(VI) цепь Фактора роста сосудистого эндотелия С Химотрипсиноген В Бета-дефенсин 126
Компонент комплемента С6 Ретикулокальбин-3 С-Х-С мотив хемокина 9 Дезоксирибонуклеаза-1- подобный 2
Коллаген альфа-1(IX) цепь Фибриллин-1 С-Х-С мотив хемокина 13 Станниокальцин-2
Коллаген альфа-1(X) цепь Белок ЕАМЗА ΕΜΙΣΙΝ-3 Эндотелиальная клеточноспецифическая молекула 1
- 39 025738
Коллаген альфа-1(XVII) цепь Белок С7с Секретагогин Карбоксилэстераза 7
Коллаген альфа-1(XXI) цепь Еейропилин и толлоид- подобный белок 1 Эпидидимальный секреторный белок ЕЗ- альфа Белка ΝΟν гомолог
Коатомер субъединица альфа Беременность- специфический бета-1- гликопротеин 11 Эпификан иРГ0528 белок ΓΑΜ172Α
Комплемента рецептор типа 1 Серпин В4 Белок ГАМ5С Интерлейкина-27 субъединица бета
Цистатин-ЗЫ АОАМ БЕС1 Фактор роста фибробластов 20 Белок ГАМЗС
Дезоксирибонуклеаза-1 АДФ-зависимая глюкокиназа Фибробластов роста- связывающий белок 3 Стромальных клеток фактор 2-подобный белок 1
Внеклеточный матричный белок 1 Альфа-амилаза 2В Трансмембранный белок 204 Бутирофилина подсемейства 1 член А1
Низкоаффиный иммуноглобулиновый гамма Гс регион рецептора III- А иэРС1сМАс;бета6а1 бета-1,3-Ν- ацетилглюкозаминилтра нсфераза 3 Фосфатидилэтаноламин- связывающий белок 4 Кератиноцит- ассоциированный трансмембранный белок 2
Альфа-фетопротеин Кальцитонин генсвязанный пептид 2 Фактор коагуляции V Иммуноглобулина альфа Гс-рецептор
Гепарин-связывающий фактор роста 2 Карбоксипептидаза Е Фактор коагуляции VII ΕΜΙΜΝ-2
Фибриноген гамма цепь Кардиотрофин-подобный цитокиновый фактор 1 Рго-МСН Эфрина типа-А рецептор 10
Фактор роста/дифференциации 5 Коллаген альфа- 2(VIII) цепь Фолатный рецептор гамма Экзостозин-подобный 2
Глиальной клеточной линии-производный нейротрофический фактор СгитЬз гомолог 2 Муцин-7 Фоллистатин-родственный белок 4
Инсулин-подобного фактора роста- связывающий белок 3 Дентинового матрикса кислотный фосфопротеин 1 Галанин-подобный пептид Фоллистатин-родственный белок 5
Инсулин-подобный фактор роста ΙΑ Синдрома Дауна клеток адгезивная молекула Гемицентин-1 Трансмембранный белок бб
1д гамма-1 цепи С регион Член 1 суперсемейства иммуноглобулинов Интерлейкин-6 Фактор роста/дифференциации 2
1д гамма-2 цепи С регион Интерлейкин-4 Эмбриональный фактор роста/дифференциации 1 СБЫГ семейства рецептор альфа-4
- 40 025738
1д гамма-3 цепи С регион Интерлейкина-б рецептора субъединица альфа Интерлейкин-8 1д гамма-4 цепи С регион
Инсулин-полобный 3 Интерлейкин-24 Гремлин-2 Лимфоцитарный антиген 86
Интер-альфа-трипсин ингибитора тяжелая цепь Ладинин-1 Стромелизин-2 Ингибина бета Е цепь
ϋΡΓ0378 белок ΚΙΑΑ0100 Липазы член I Вероятный С-белок сцепленный рецептор 171 СРАМ домен-содержащий белок 1С
Кининоген-1 Панкреатический липаза-связанный белок 1 Паппализин-2 Интерферон альфа-10
Ламинина субъединица альфа-2 Лейцин-богатый альфа- 2-гликопротеин Микрофибриллярносвязанный гликопротеин 4 Интерферон альфа-16
Ламинина субъединица альфа-4 Матрикса- ремоделирования- связанный белок 5 Нейромедин-В Интерферон альфа-б
Ламинина субъединица бета-1 Нетрин-4 Мимекан Член 21 суперсемейства иммуноглобулинов
Протеин-лизин б-оксидаза Рецептор фактора роста гепатоцитов Металлопротеиназа матрикса-19 Агрин
Мультимерин-1 С-С мотив хемокина 22 Интерлейкин-11 Пролактин
Вазолрессин-нейрофизин 2-колептин Никталопии Интерлейкин-17А Ке1сЬ-подобный белок 11
Нидоген-1 Остеокальцин Интерлейкин-18 Белок Ипр-16
Фосфолипаза А2 Основной слюнный пролин-богатый белок 3 Интерлейкин-26 Пропердин
Перфорин-1 Беременностьспецифический бета-1- гликопротеин 10 Интерлейкин-28А Калликреин-13
Фосфатидилинозитол- гликан-специфическая фосфолипаза ϋ Лейцин-богатый повторяющийся трансмембранный белок ГЬНТ2 Трансмембранный етр24 домен-содержащий белок 3 1-ацил-зп-глицерин-З- фосфат ацилтрансфераза дельта
Фиброцистин К-Спондин-3 Ин те рл ей кин -2 9 Калликреин-9
Фосфолипидов транспортировочный белок Сиалоадгезин Инсулин-подобный пептид ΙΝ5Β6 Витамин К-зависимый белок 5
Кислая фосфатаза простаты Трипсин-3 Белок Ип£-2Ъ Бутирофилин-лодобный белок 8
Ви т амин К-за в и с имый белок Ζ Дипептидаза 2 Беременность- специфический бета-1- гликопротеин 1 Ламинина субъединица бета-4
- 41 025738
Слюнный кислотный пролин-богатый фосфопротеин 1/2 Коллаген и кальций- связывающий ЭГФ домен-содержащий белок 1 Спермы акросомы мембрана-ассоциированный белок 4 Лимфатических сосудов эндотелиальный рецептор гиалуроновой кислоты 1
Белок зоны беременности Зародышевых клеток- специфический ген 1- подобный белок Ламинина субъединица гамма-3 Цистатин-5А
Прорелаксин Н2 Лейцин-богатый повтор-содержащий белок 31 Лизилоксидазы гомолог 3 Трансмембранный белок 59
Семафорин-4Б Аполипопротеин 0 Нейротензин/нейромедин N Аполипопротеин(а) - подобный белок 2
3111 гомологичный 2 белок Дистрогликан МАМ домен-содержащий белок 2 Лизоцим-подобный белок 2
Альфа-текторин Нейтрофильный дефенсин 4 Микрофибриллярносвязанный белок 2 Лизоцим-подобный белок 4
Тенасцин-Х Амфотерин- индуцированный белок 3 Белок, ингибирующий активность меланомы 2 Рилин
Клеверный фактор 3 Гамма-секретазы субъединица АРН-1В Металлопротеиназа матрикса-24 Ретинол-связывающий белок 4
Трансферрина рецептора белок 1 Аполипопротеин С-ΐν Металлопротеиназа матрикса-25 Карбоновая ангидраза 14
Протрансформирующий фактор роста альфа Арилсульфатаза С Нетрин-1 Тубулоинтерстициального нефрита антиген
Трансформирующий фактор роста бета-2 Глия-активирующий фактор Нетрин-3 Нейропептид И
Член 6 суперсемейства Рекрутинга каспазы Альфа-М- Альфа-1,3-маннозил-
лиганда фактора некроза домен-содержащий ацетилгалактозаминид гликопротеин 4-бета-И-
опухолей белок 18 альфа-2,б- сиалилтрансфераза 1 ацетилглюкозаминилтрансф ераза В
Член 1В суперсемейства Гепарансульфатглюкоза Альфа-Ν- Трансмембранный ешр24
рецептора фактора мин 3-0- ацетилгалактозаминид домен-содержащий белок 5
некроза опухолей сульфотрансфераза ЗА1 альфа-2,б- сиалилтрансфераза 3
Член 5 суперсемейства Тиротропин-рилизинг Меланома-происходящий Комплемента С1я фактор
рецептора фактора гормона-деградирующий белок регуляции роста некроза опухолей-
некроза опухолей эктоэнзим родственный белок 3
Тромбопоэтин Гуанилин ЕМЕЕамид-родственные пептиды Подокан-подобный белок 1
νΐΡ пептиды Холина транспортера- подобный белок 3 Отоконин-90 Беременность- специфический бета-1- гликопротеин 5
- 42 025738
Кислая хитиназа млекопитающих 17-бета- гидроксистероид дегидрогеназа 14 Нейртурин Кератскан
Цистеин-богатый секреторный белок 2 Иммуноглобулин лямбда-подобный полипептид 1 Нейрексофилин-1 Группы НЕ секреторная фосфолипаза А2
Гаптоглобин-родственный белок ^ηа^ гомолога подсемейства В член 14 Нейрексофилин-2 Фактор определения левоправо 2
С-С мотив хемокина 26 Г-Ьох оп1у белок 8 Вариантный фактор тромбоцитов 4 ΝΚ52ϋ лиганд 2
Коллектин-11 Фибролейкин Ноцицептин Макрофаговая металлоэластаза
Цистеин-богатый с ЕСГ- подобным доменом белок 2 Метионин-К- сульфоксидредуктаза ВЗ, митохондриальная ν-набора и трансмембранный доменсодержащий белок 1 Триггерный рецептор, экспрессируемый на миелоидных клетках 1
С-Х-С мотив хемокина 16 Лейцин-богатый повторяющийся ΙΛ3Ι семейства член 2 Пролин-богатый белок 4 Цитокинового рецептора- подобный фактор 1
Фибробластов фактор роста-связывающий белок 1 Транспорта пузырьков белок СОТ1В Пролактин-рилизинг пептид Секретин
Член 5 семейства Интерлейкина-1 Интегральный мембранный белок СРИ177 Сериновая протеаза 33 Стромальных клеток фактор 2
Член 9 семейства Интерлейкина-1 Вероятный С-белок сцепленный рецептор 78 Беременность- специфический бета-1- гликолротеин 8 - Лизоцим-подобный белок б
Калликреин-5 НЕРАСАМ член семейства 2 Ретбиндин Серпин А9
Матрилин-2 Интерлейкина-27 рецептора субъединица альфа ГМКГамид-родственные пептиды Склеростин доменсодержащий белок 1
Клеточного поверхностного гликопротеина СО20О рецептор 1 Прознкефалин -А Рибонуклеаза Кб Лизокардиолипин ацилтрансфераза 1
Лизофосфатидной кислоты фосфатаза типа б Интегрин альфа-10 Рибонуклеаза Т2 Глутамат карбоксипептидаза плазмы
Фактор обмена нуклеотидов 51Ь1 КТЕЪ мотив-содержащий белок 1 Репетин 51ίΡ гомологичный 3 белок
- 43 025738
Тромбоспондина типа-1 домен-содержащий белок 4 Лейкоцитарного иммуноглобулин- подобного рецептора подсемейства А член 5 Комплемента С1г субкомпонент-подобный белок СЗ и ΡΖΡ-подобный альфа- 2-макроглобулин доменсодержащий белок 8
ΜΝΤ1-индуцируемого- сигнального пути белок 2 Лейцин-богатый повторами и фибронектина типа III домен-содержащий белок 3 Неохарактеризованная гликозилтрансфераза АЕН61 Ретиноевой кислоты рецептора респондерный белок 2
Бромодомен-содержащий белок 9 Утероглобин Семафорин-ЗС Хрящевой кислотный белок 1
СП99 антиген-подобный белок 2 Нетрин-С1 лиганд Секретоглобина семейства 1С член 1 Станниокальцин-1
Неохарактеризованный белок С1ог£159 Паннексин-1 Секретоглобина семейства Ю член 1 Бета-текторин
Карбогидратсульфотранефе раза 12 Протокадгерин-12 Секретоглобина семейства 10 член 2 Пост-СР1 присоединения к белкам фактор 3
Вероятная сериновая карбоксипептидаза СРУЬ Протокадгерин альфа- 10 Серпин А12 Зародышевых клеток- специфический ген 1 белок
Муцин-ЗА Протокадгерин бета-10 Серпин 12 Интерлейкина-21 рецептор
СОВ и вителлиновая зона- подобный доменсодержащий белок 1 Остеопетроз- ассоциированный трансмембранный белок 1 фон Виллебранда фактора С и ЕСГ домен-содержащий белок ν-набор и иммуноглобулиновый домен-содержащий белок 4
Полипептид Ν- Бета-галактозид Дизинтегрин и Рецептора Зсауепдег
ацетилгалактозаминилтран альфа-2,6- металлопротеиназа с цистеин-богатый домен-
сфераза 14 сиалилтрансфераза 1 мотивами тромбоспондина 15 содержащий группы В белок
Галектин-9 СР1 трансамидазы компонент Р1С-5 Натриевого канала субъединица бета-2 Протиролиберин
Лейцин-богатый повтор- Пролин-богатый Ингибитор Семафорин-4А
содержащий белок 17 трансмембранный белок 3 металлопротеиназы 4
Лейцин-богатый повторами нейрональный белок 2 Сульфгидрилоксидаза 2 Т-клеток иммуномодуляторный белок
Бифункциональная Дизинтегрин и Дизинтегрин и Член 27 сулерсемейства
гепарансульфат Ν- металлопротеиназа с металлопротеиназа с рецептора фактора
деацетилаза/М- мотивами мотивами тромбоспондина некроза опухолей
сульфотрансфераза 3 тромбоспондина 16 10
Туфтелин 5Н2 домен-содержащий белок ЗА Тимусный стромальный лимфопоэтин То11-подобный рецептор 7
- 44 025738
Мозговой митохондриальный белок- носитель 5НС-трансформирующий белок 4 Трансмембранный белок 130
Сигнальный пептид, СБВ и ЕСГ-лодобный доменсодержащий белок 3 Дизинтегрина и металлопротеиназы домен-содержащий белок 23 Уникальный хрящевой матрикс-ассоциированный белок Тиоредоксин доменсодержащий белок 16
14-3-3 белок сигма Трансдуцин бета- подобный белок 2 Урокортин-2 Альфа-2-антиплазмин
Альфа-1-кислый гликопротеин 1 Тийог доменсодержащий белок 10 Урокортин-3( ИАР четырехдисульфидный ядерный доменный белок 3
Альфа-1-кислый гликопротеин 2 Трансмембранный 9 член суперсемейства 3 Белок АМВР Белок ИРБС9
фон Виллебранда фактора А домен-содержащий белок 1 Фон Виллебранда фактора Б и ЕСР домен-содержащий белок Комплемента 01ς фактор некроза опухолей- родственный белок 9- подобный Дизинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина 14
Дизинтегрина и металлопротеиназы доменсодержащий белок 9 Дизинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина 17 Фактор ингибирования и дифференциации- родственный белок 88 Адипоцитов плазматическая мембрана- ассоциированный белок
Ангиотензиноген Трансмембранный канал-подобный белок 2 Белок Йпб-Юа Пероксидазина гомолог
Аполипопротеин Α-ΙΙ (Αρο-ΑΙΙ) (АроА-11} Беременность- специфический бета-1- гликопротеин 3 Белок ЫпЬ-Зэ Прогрессирующего анкилоза белка гомолог
Аполипопротеин Α-ΐν (Αρο-Αίν) (ΑροΑ-ΐν) Теномодулин Прото-онкогенный белок Ип£-3 Хитиназа-3-подобный белок 1
Аполипопротеин С-II (Аро-С11) (АроС-11) Тетраспанин-6 Белок Нп£-6 □РГ0672 белок СХог£36
Бета-2-гликопротеин 1 Тиоредоксин доменсодержащий белок 5 Белок Нпб-9а Арилсульфатаза Л
Апоптоз-родственный белок 3 Фактора роста сосудистого эндотелия Б Цитокин ЗСМ-1 бета Кортистатин
Бета-секретаза 2 Беременностьспецифический бета-1- гликопротеин 9 Зимогеновый гранулярной мембраны белок 16 Церулоплазмин
Трансфераза гистосовместимости АВО системы крови Семафорин-ЗР Вителлинового слоя- связывающий белок 1 Ангиопоэтин-родственный белок 5
- 45 025738
Катепсин Ь2 Кислая фосфатаза- подобный белок 2 Антериорного градиентного белка 3 гомолог Суперспиральный доменсодержащий белок 126
С-С мотив хемокина 3 Аполипопротеин 0- подобный Амелотин СБ177 антиген
С-типа лектинового домена семейства 1 член В Бета-дефенсин 119 Неохарактеризованный белок С5ог£4б Белка сапору гомолог 4
Кальций-активированный хлоридного канала регулятор 1 Дизинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина 12 Неохарактеризованная аагГ домен-содержащая протеинкиназа 1 Фибронектина типа-1II домен-содержащий белок С4ох£31
Химаза Белок ГАМ131А Драксин Белок ГАМ180А
Коллаген альфа-1(VI) цепь Белок ГАМЗВ Фактор роста фибробластов 18 Тромбоцитов основный белок
Компонент комплемента С8 альфа-цепь Бета-галактозидаза-1- подобный белок С-Х-С мотив хемокина 11 Интерферон эпсилон
Компонент комплемента С9 Лизоцим д-подобный белок 1 Буб/РЬАиВ доменсодержащий белок 6 Интелектин-2
Глюкозы-фруктозы оксидоредуктазы доменсодержащий белок 2 Интер-альфа-трипсин ингибитора тяжелая цепь Н5-подобного белка Химотрипсин-подобной эластазы семейства член 1 Альфа-1,3-маннозил- гликопротеин 4-бета-И- ацетилглюкозаминилтрансф ераза А
^ηа^ гомолога подсемейства В член 11 Акросомы сперматозоидной- ассоциированный белок 5 Рецептор эритропоэтина Фосфогликопротеин внеклеточного матрикса
Эктонуклеотидных пирофосфатазы/фосфодиэст еразы семейства член 7 Лейцин-богатый повторами и иммуноглобулин- подобный доменсодержащий подо- рецептор- взаимодействующий белок 2 МАМ домен-содержащий гликозилфосфатидилинозит ол-якорный белок 2 кДНК ГЬ377863, высоко аналогичная секретируемому и трансмембранному 1 (5ЕСТМ1) белку Ното зарьепз мРНК
Аминопептидаза эндоплазматической сети 1 Сурфактант- ассоциированный белок 2 Металлопротеиназа матрикса-27 Эпидидимальноспецифический липокалин- 6
Рецепторная тирозинбелок киназа егЬВ-3 Адипонектина рецептора белок 1 Неактивная сериновая протеаза 35 Афамин
- 46 025738
Резидентный бедок эндоплазматической сети ЕЕр4 4 Множественные домены, подобные фактору роста эпидермиса 6 Суперспиральный доменсодержащий белок 134 Вероятная катион- транспортирующая АТФаза 13А5
1дСГс-связывающий белок Нейроэндокринный белок 7В2 Супрабазин Глутатионпероксидаза 3
Комплемента фактора Н- родственный белок 1 Альфа-1В-гликопротеин Секретоглобина семейства 10 член 4 Клаудин-18
Полипептид Ν- ацетилгалактозаминилтран сфераза 2 МАР, каха1, иммуноглобулин, кип!£2 и ΝΤΚ доменсодержащий белок 2 ν-набора и трансмембранный доменсодержащий белок 2А Мнимый клеток-киллеров иммуноглобулин-подобный рецептор подобный белок К1ЕЗБР1
Гемопексин Арилацетамид деациталаза-подобная 1 АОМ Секреторной фосфолипазы А2 рецептор
Активатор фактора роста гепатоцитов Гистатин-3 Неохарактеризованный белок С2ог£82 Гаптотлобин
Главного комплекса гистосовмести класса I- родственный генный белок Про-нейрегулин-3, мембрана-связанная изоформа Инсулинового фактора роста-подобный семейства член 1 Карциноэмбрионогенная антиген-родственная молекула клеточной адгезии 20
Инсулин-подобного фактора роста- связывающий белок 6 Адои£1- сигнализирующий белок Кадгерин-подобный белок 29 Костный морфогенный бедок 3
1д дельта цепи С регион Клаудин-8 Костный морфогенный белок 15 Костномозговой стромальный антиген 2
Интерлейкин-1 бета ПРЕ0454 белок С12ог£49 Плазменной сериновой протеазы ингибитор Цитохром Р450 20А1
Низкой плотности липопротеинов рецептор- родственный белок 10 фон Виллебранда фактора А доменсодержащий белок 5В1 Карциноэмбриногенная антиген-родственная молекула клеточной адгезии 21 Бактерицидный/проницаемо сть-повышающий белок- подобный 3
Соединительная адгезивная молекула С Кадгерин-6 . Альфа-лактальбумин Белка άργ-19 гомолог 2
Неохарактеризованный белок ΚΙΑΑ0319 Кателицидин антимикробный пептид Сестринский белок когезии хроматид БСС1 Группы ΙΙΓ секреторная фосфолипаза А2
Ламинина субъединица альфа-5 Ламинина субъединица гамма-1 Галектин-3-связывающий белок Карбоксипептидаза В
Фибронектина типа III домен-содержащий белок 4 Дегидрогеназы/редукта зы БОЕ член семейства 7В Динеина тяжелой цепи домен-содержащий белок 1 Гликозилтрансферазы 8 домен-содержащий белок 2
Липопротеин липаза С-С мотив хемокина 16 С-С мотив хемокина 17 Белок ЕАМ19А1
- 47 025738
Интерстициальная коллагеназа С-С мотив хемокина 24 Жирнокислая ацил-КоА редуктаза 1 □ΩΝΕ семейства рецептор альфа-подобный
Металлопротеиназа матрикса-9 НЕАТ повторсодержащий белок С7огГ27 Еьп Ъис1 гомолог фактора инициации Вероятная глутатионпероксидаза 8
Муцин-16 Коллаген альфа-2(IX) цепь Полимерный иммуноглобулиновый рецептор Цистатин-Б
Муцин-2 Коллаген альфа-3(IX) цепь Прион-подобный белок όορρβΐ Цистатин-Г
Муцин-5В Колипаза С-Х-С мотив хемокина 6 Тромбоцит-активирующий фактор ацетилгидролаза
Миоцилин Коллаген альфа- 1(XXVII) цепь С-Х-С мотив хемокина 10 Паппализин-1
Рецептор окисленных липопротеинов низкой плотности 1 Карбоксипептидазы N субъединица 2 Бета-дефенсин 1 Носителей растворенных веществ семейства 22 член 12
Избыточно экспрессируемого гена 1 белок опухоли простаты Лейцин-богатый повторяющийся трансмембранный нейрональный белок 4 Гиалуронана и протеогликана сшивки белок 2 Хорионический соматомаммотропиновый гормон-подобный 1
Рецептор- взаимодействующая сериново/треониновая- протеинкиназа 2 Коллагена тройной спирали повторсодержащий белок 1 Дизинтегрина и металлопротеиназы доменсодержащий белок 30 Динамики микротубул регуляторный белок 3
Эквилибративный транспортер нуклеозидов 3 Эндотелин-2 Суппрессор слитого гомолога Ретинолдегидрогеназа 14
Селенопротеин Р Фибромодулин Фолатный рецептор бета Галанин
Легочный сурфактант- ассоциированньгй белок ϋ Гс-рецептор-подобный В Внеклеточная сульфатаза 5и1£-2 Транскобаламин-2
Стимулируемого ретиноевой кислотой гена 6 белка гомолог Цинк-лальцевый ΚΑϋ18 домен-содержащий белок С1ог£124 Член 14 суперсемейства рецептора фактора некроза опухолей Катехол-О- метилтрансферазы доменсодержащий белок 1
Клеверный фактор 1 Фактор роста/дифференциации 15 Артемин Трипептидилпептидаза 1
Ингибитор пути тканевого фактора 2 Глия-производный нексин Коллаген альфа-1(XII) цепь Тгет-подобный транскрилтный белок 1
Протромбин Прогонадолиберин-1 Коллаген альфа-1(XIV) цепь Гуанилатциклазы активатор 2В
То11-подобный рецептор 9 Гранзим К Бета-дефенсин 2 Индуцируемый Т-клеточный ко-стимулятор
- 48 025738
Межклеточных клеток адгезивная молекула 4 Интерферон альфа-17 Интерлейкин-21
Интерлейкин-19 Интерферон альфа-21 Интерлейкин-3
Истмин-2 Интерферон альфа-8 Интерлейкин-7 ИобсЬ гомолог 2 14- термина льно-подобного белка
Κίη ΙΚΚΕ-подобного белка 1 Интерферон омега-1 Ингибина альфа цепь Ламинина субъединица бета-2
Калликреин-10 Ранний плацентарный инсулин-подобный пептид Ламинина субъединица альфа-3 Нейропилин-2
Латентный ЕСЕ, латрофилин и Дегидрогеназы/редуктазы ЭГФ-содержащий фибулин-
трансформирующий фактор семь трансмембранных ЗЭК член семейства на подобный белок
роста б^та-связывающий белок 4 доменов-содержащий белок 1 хромосоме X внеклеточного матрикса 1
Спаренный Фибронектин типа 3 и ΓΧΥϋ домен-содержащий Рецепторного типа
иммуноглобулин-подобного анкирина регулятор тирозин-протеин
типа 2 рецептор альфа повторяющиеся домены белок 1 транспортировки ионов 6 фосфатаза каппа
Регенерирующих островков-происходящий белок 3 альфа Лизилоксидазы гомолог 4 Инкорпоратор серина 2 Регенерирующих островков-происходящий белок 4
ЕЗ убиквитинпротеинлигаза ΡΝΓ5 Люмикан Стромелизин-3 Тахикинин-4
Протахикинин-1 Адропин Секретируемый фосфопротеин 1 Металлопротеиназа матрикса-23
Секретируемый связанный Лейцин-богатый Сериновая бета- Комплемента фактор
с ожогом белок 1, повторяющийся лактамаза-подобный белок некроза опухолей-
изоформа СКА а трансмембранный белок ГБКТ1 БАСТВ, митохоыдриаль ный родственный белок 5
Плазминоген-родственный белок В Нуклеобиндин-2 Галектин-3 Оптицин
Вероятная пальмитоилтрансфераза 2ОННС1б Фосфолипаза А2 Панкреатический прогормон Пре-малый/секретируемый гликопротеин
Ангиопозтин-родственный белок 1 Проэнкефалин -В Беременность- специфический бета-1- гликопротеин 6 Лентраксин-родственный белок РТХЗ
иРГОЫО белок С19ог£бЗ Распознавания пептидогликана белок Т-бета □ί сккор£-родственный белок 3 Карбоксилэстераза 8
- 49 025738
Рецептора Зса^епдег цистеин-богатый типа 1 белок М2 60 Иммуноглобулина суперсемейства содержащий лейцин- богатый повторами белок 2 Дегидрогеназы/редуктазы ЗБЕ член семейства 11 Тиоредоксин-родственный трансмембранный белок 4
ЕР деградации-усиления альфа-маннозидаза- подобный 2 ν-набор и имму н о гл о булиновый доме н-содержа щи й белок 2 Регенерирующих островков-происходящий белок 3 гамма Домен-содержащий белок 2 суперсемейства основного фасилитатора
Бета-галактозидаза-1- подобный белок 2 Пептид ΥΥ Е1ЫС пальцевый белок 43 Калликреин-12
Интерлейкина-17 рецептор Е Ретинол-связывающий белок 3 Семеногелин-2 Вгеуьсап ядерный белок
Интерлейкин-20 Атерин Муцин-15 Поримин
Интерлейкин-25 Белка транслокации 5ЕС63 гомолог Костный сиалопротеин 2 Торсин-1А
ΡΟΖ домен-содержащий белок 11 Трансформирующий фактор роста бета-3 Лимфотактин С-С мотив хемокина 23
Релаксин-3 Белок Ип£-10Ь Рост-регулируемый белок альфа Тестикан-3
Ретиноид-индуцируемая сериновая карбоксипептидаза Реналаза Е-Спондин-2 Основной слюнный пролин- богатый белок 4
Белок, связанный с карциномой эпителия короткого неба, легкого и носа 2 Пропротеин конвертаза субтилизин/кексин типа 4 Трансмембранный и суперспиральный доменсодержащий белок 3 Член 18 суперсемейства рецептора фактора некроза опухолей
ΝΑΡ четырехдисульфидный ядерный доменный белок 5 Карбоксипептидаза А4 νΕ6Ε ко-регулируемый хемокин 1 Братский белок ОБО
Тромобоцитарный фактор роста С Ольфактомедин-4 ΑϋΜ2 Бета-1,4- галактозилтрансфераза 4
Дизинтегрина и металлопротеиназы доменсодержащий белок 33 Инсулин-подобного фактора роста- связываюгций белок комплексная кислая лабильная цепь Гидроксистероид 11-бета- дегидрогеназа 1-подобный белок Дегидрогеназы/редуктазы ЗОЕ член семейства 9
ВЗБ домен-содержащий белок 1 Амелогенин, Υ изоформа Дельта-подобный белок 1 Элпин
Клеток адгезивная молекула 3 Арилсульфатаза Г Эфрин-А1 Отоанкорин
- 50 025738
СЭС 4 5-родственный белок Хориогонадотропина субъединицы бета вариант 2 Фактора роста фибробластов рецептор- подобный 1 Тенасцин-К
Хондролектин Бета-дефенсин 104 СОИ? семейства рецептор альфа-3 Фактор роста
Диацилглицерин 0- ацилтрансфераза 2 Бета-дефенсин 105 Рецептор тромбоцитов С124 Белок Т2РЕАЕ
3-кето-стероидредуктаза Бета-дефенсин 107 Прогонадолиберин-2 Гефестин
Интерлейкина-17 рецептор С Белок МБ0С11 Калликреин-7 Вутирофиллин-подобный белок 3
Интерлейкина-17 рецептор ϋ НАР четырехдисульфидный ядерный доменный белок 6 Аполипопротеин Г Бутирофиллин-подобный белок 9
Интегратора комплексная субъединица 1 Эпиген Белок СА5С4 Ламинина субъединица гамма-2
Соединительная адгезивная молекула- подобная Белок ЕАМ19А5 У1Р36-лодобный протеин Белок ЬМВР1Ь
ЕЗ убиквитин-белок лигаза ЬЫХ Клаудин-6 Магния транспортерный белок 1 Муцин-21
Лейцин-богатый повторяющийся трансмембранный нейрональный белок 3 Карциноэмбриногенная антиген-родственная молекула клеточной адгезии 19 Амилорид-чувствительная аминооксидаза ί медь-содержащая] Эдоплазматической сети маннозил-олигосахарид 1,2-альфа-маннозидаза
Метионинаденозилтрансфер азы 2 субъединица бета Дизинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина 1 ДНК повреждение- регулируемый аутофагии модуляторный белок 2 Панкреатической секреторной гранулярной мембраны главный гликопротеин СР2
Подокаликсин-подобный белок 2 Белок СООЮ, митохондриальный Трансмембранный белок С17огГ87 Семафорин-4В
Проминин-2 ^охарактеризованный белок С19огГ41 Комплемента фактора Н- родственный белок 5 Семафорин-5В
Плексин домен-содержащий белок 2 Неохарактеризованный белок С21ог13б ЕК5Об-связывающий белок 7 ' Эпсилон-саркогликан
Еоцп0аЬои1 гомолог 4 Белка бе1ба гомолог 2 Инкорпоратор серина 1 Гуанилат-связывающий белок 5
Лактозилцерамид альфа- 2, 3-сиалилтрансфераза Кокаин- и амфетамин- регулируемый транскриптный белок Трансмембранный и . убиквитин-подобный домен-содержащий белок 1 Эктонуклеозид трифосфат дифосфогидролаза б
5101 трансмембранный член семейства 2 Липомы НМС1С слитый партнер-подобный 1 белок Белок ЕЕС1С-53-подобный Серпин ВЗ
- 51 025738
Зиз^т домен-содержащий белок 1 Лейцин-богатый повтор-содержащий белок 18 То11-подобный рецептор 10 Белка КМЭ5 гомолог В
Сериновая/треониновая- киназа ТАО2 Лейцин-богатый повтор-содержащий белок 25 То11-ггодобный рецептор 8 2са\'епдег рецептора класса А член 5
Трансмембранная протеаза, сериновая 2 Лейцин-богатый повтор-содержащий белок Зв Селенопротеин Т Семафорин-бВ
УДФ-глюкуроновой кислоты декарбоксилаза 1 Лейцин-богатый повтор-содержащий белок 3 Сиаловая кислота- связывающий 1д-подобный лектин 11 Трансмембранный белок 108
Неохарактеризованный белок С10огТ58 Ъуб/РЬАЦН доменсодержащий белок 4 Сортирующий нексин-24 ЗизЫ домен-содержащий белок 3
Тиоредоксин-родственный трансмембранный белок 2 Витамин К эпоксидредуктазы комплексная субъединица 1 Комплемента С1ц фактор некроза олухолей- родственный белок 1 Латентный трансформирующий фактор роста бета-связывающий белок 2
СМР-Ы-ацетилнейраминат- бета-галактозамид-альфа- 2,3-сиалилтрансфераза Дизинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина 20 Мнимый неохарактеризованный белок иЫОЙ494/РРО2134б Мнимый неохарактеризованный белок иы£)6190/РКО20217
Мнимый неохарактеризованный белок ΕΝΞΡ00000380674 Мнимый неохарактеризованный белок ΕΝ3Ρ00000381830 Секретируемый и трансмембранный 1 прекурсорный вариант Секретируемый и тра нсмембра нный 1 прекурсорный вариант
Трансмембранный белок 119 Белок критического региона синдрома кошачьего глаза 1 С-типа лектинового домена семейства 18 член А Коллаген альфа-1(XX) цепь
Трансмембранный белок 98 Белок экспрессируемой в яичках 101 Цистеин-богатый секреторный белок 3 Нетрина рецептор ПМС5О
Пре-В лифоцитарный белок 3 Ксилозилтрансфераза 2 Комплемент С4-А Муцин-13
Мнимый неохарактеризованный белок С14ог1144 Белок БАМ20А Мнимый неохарактеризованный белок РКО2829 АТР-зависимая металлопротеаза УМЕ1Ы
Мембрана-связанный фактор транскрипции сайта-1 протеаза Трансмембранный и иммуноглобулиновый домен-содержащий белок 1 Кальций-активированный хлоридного канала регулятор 2 Пропротеин конвертаза субтилизин/кексин типа 5
Фиколин (Коллаген/фибриноген доменсодержащий) 3 (Наказа антиген) (ЫЬЗ) (Фиколин {Коллаген/фибриноген доменсодержащий} 3 (Накаба антиген), изоформа СНА Ь) Мнимый клеток- киллеров иммуноглобулин- подобный рецептор- подобный белок ΚΙΡ3ΟΧ1 (Лейкоцитарного рецептора кластерный член 12) Нейробластомы суппрессор онкогенности 1
Терапевтические белки, предложенные здесь, не должны расцениваться как исключительные. Напротив, как следует из раскрытия, представленного здесь, способы изобретения применимы к любому белку, для которого желательно присоединение водорастворимого полимера в соответствии с изобрением. К примеру, терапевтические белки, описанные в И8 2007/0026485, включены в данное изобретение во всей полноте посредством ссылки.
- 52 025738
Белки системы свертывания крови
Одна из особенностей настоящего изобретения - то, что в качестве исходного материала используется белок системы свертывания крови, который может быть получен из человеческой плазмы, либо произведен способами рекомбинантной инженерии, согласно патентам υδ № 4757006; υδ № 5733873; И8 № 5198349; υδ № 5250421; υδ № 5919766; а также ЕР 306968.
Терапевтические полипептиды, в частности, белки, отвечающие за систему свертывания крови, включая фактор IX (Ф-ΙΧ), фактор VIII (Ф-У111), фактор У11а (Ф-УНа), фактор Фон Виллебранда (ФВф), фактор РУ (Ф-У), фактор X (фХ), фактор XI (Ф-ΧΙ), фактор XII (Ф-ΧΙΙ), тромбин (Ф-ΙΙ), протеин С, протеин δ, !РА, ΡΛΙ-1, тканевой фактор (Тф) и протеазу ΛΩΛΜΤδ 13 быстро разрушаются протеолитическими ферментами и нейтрализуются антителами. Это способствует уменьшению их периода полужизни и времени циркуляции, что ограничивает их терапевтическую эффективность. Для достижения и поддержания желаемых терапевтических и профилактических эффектов этих белков системы свертывания требуется частое их введение в относительно высоких дозах. Как следствие, сложно достигнуть адекватного регулирования дозы, а необходимость частых внутривенных инъекций накладывает ограничения на образ жизни пациента.
Как указывалось здесь, изобретение охватывает белки свертывания крови, включая фактор IX (ФIX), фактор УШ (Ф-УШ), фактор УНа (Ф-УНа), фактор Фон Виллебранда (ФВф), фактор РУ (Ф-У), фактор X (фХ), фактор XI, фактор XII (Ф-ΧΙΙ), тромбин (Ф-ΙΙ), протеин С, протеин δ, !РА, РАЫ, тканевой фактор (Тф) и протеазу Λ^ΛМΤδ 13, но не ограничиваясь ими. Термин белок свертывания крови, используемый в этом документе, относится к любому белку из фактора IX (Ф-ΙΧ), фактора УШ (Ф-УШ), фактора УНа (Ф-УНа), фактора Фон Виллебранда (ФВф), фактора РУ (Ф-У), фактора X (фХ), фактора XI (Ф-ΧΙ), фактора XII (Ф-ΧΙΙ), тромбина (Ф-ΙΙ), протеина С, протеина δ, !РА, РАЫ, тканевого фактора (Тф) и протеазы Α^ΑМΤδ 13, проявляющему биологическую активность, аналогичную активности нативного белка свертывания крови.
Каскад свертывания крови разделен на три отдельных сегмента: внутренний, внешний, а также общий пути (БсЬегопе е! а1., Сигг Орш НетаЮ1. 2004; 11:272-7). Каскад включает ряд ферментов (проферментов) сериновых протеаз и белковые кофакторы. При необходимости неактивный проферментпредшественник превращается в активную форму, которая, в свою очередь, преобразует следующий фермент каскада.
Внутренний путь включает в себя факторы свертывания УШ, IX, X, XI и XII. Инициация внутреннего пути происходит тогда, когда прекалликреин, высокомолекулярный кининоген, фактор XI (Ф-ΧΙ) и фактор XII (Ф-ΧΙΙ) вступают в контакт с отрицательно заряженной поверхностью. Также требуются ионы кальция и фосфолипиды, секретируемые из тромбоцитов.
Внешний путь запускается при повреждении внутренних стенок кровеносных сосудов. Обнажается мембранный гликопротеин тканевой фактор, который связывается с циркулирующим фактором УН (ФУП) и с малыми присутствующими количествами его активированной формы Ф-УНа. Это связывание приводит к полной конверсии Ф-УН в Ф-УНа и, последовательно, в присутствии кальция и фосфолипидов, конверсию фактора IX (Ф-ΙΧ) в фактор Ка (Ф-Ка) и фактора X (фХ) в фактор Ха (фХа). Ассоциирование Ф-УНа с тканевым фактором усиливает протеолитическую активность путем перемещения сайтов связывания Ф-УН с субстратами (Ф-ΙΧ и фХ) в более доступное положение и путем индукции изменения конформации, усиливающей ферментативную активность Ф-УНа.
Активация фХ - общая точка обоих путей. Вместе с фосфолипидами и кальцием, факторы Уа (ФУа) и Ха преобразуют протромбин в тромбин (комплекс протромбиназы), который затем разрезает фибриноген с образованием мономеров фибрина. Мономеры полимеризуются, формируя волокна из фибрина. Фактор ΧΙΙΙη (ФКШа) ковалентно связывает эти волокна друг с другом, формируя жесткую сеть.
Превращение Ф-УН в Ф-УНа также катализируется рядом протеаз, включая тромбин, Ф-Ка, Ф-Ха, фактор ΧΙη (ФК1а), фактор ΧΙΙη (ФКПа). Для ингибирования ранних стадий каскада, ингибитор пути тканевого фактора воздействует на комплекс Ф-УНа/тканевой фактор/фХа.
Фактор УНа.
Ф-УН (также известный как стабильный фактор или проконвертин) является гликопротеином, относящимся к группе витамин К-зависимых сериновых протеаз, обладающим ключевой ролью в гемостазе и свертывании крови (Е1депЪго!, Сигг Рго!еш Рер! δα. 2002; 3:287-99).
Ф-УН синтезируется в печени и секретируется в виде одноцепочечного гликопротеина с массой 48 кДа. Ф-УН, как и все гликопротеины, относящиеся к группе витамин К-зависимых сериновых протеаз, имеет доменную структуру, содержащую аминотерминальный домен гамма-карбоксиглутаминовой кислоты (О1а) с 9-12 остатками, ответственными за взаимодействие белка с липидными мембранами, карбокситерминальный домен сериновой протеазы (каталитический домен), а также два домена, аналогичных доменам фактора роста эпидермиса, содержащие ион кальция, отвечающие за взаимодействие с тканевым фактором. Гамма-глутамилкарбоксилаза катализирует карбоксилирование остатков О1а на аминотерминальном участке молекулы. Действие карбоксилазы зависит от восстановленной формы витамина К, который при этом окисляется до эпоксидной формы. Обратное превращение эпоксида витамина К в восстановленную форму происходит под действием витаминК-эпоксид-редуктазы.
- 53 025738
Основная часть Ф-УП циркулирует в плазме крови в виде профермента, и активация этой формы происходит при разрезании пептидной связи между 152-м остатком аргинина и 153-м остатком изолейцина. Результирующий активированный Ф-УПа состоит из ИН2-конечной легкой цепи (20 кДа) и СООНконечной тяжелой цепи (30 кДа), связанных единственной дисульфидной цепью (Цис 135 с Цис 262). Легкая цепь содержит мембран-связывающий С1а-домен, в то время как тяжелая цепь содержит каталитический домен.
Концентрация Ф-УП в плазме обусловлена генетическими факторами и факторами окружающей среды и составляет около 0,5 мг/мл (Ртой1 е! а1., В1ооб. 2000; 95:3423-8). Различные Ф-УП генотипы могут привести к средним уровням Ф-УП, отличающимся в несколько раз. Уровень Ф-УП в плазме повышается у здоровых женщин во время беременности, кроме того, он повышается с возрастом, выше у женщин и у лиц с гипертриглицеридемией. Ф-УП имеет самый короткий период полужизни из всех факторов-прокоагулянтов (3-6 ч). У здоровых людей средняя концентрация Ф-УПа в плазме равна 3,6 нг/мл, период полужизни циркулирующего Ф-УПа относительно велик (2,5 ч) в сравнении с остальными факторами свертывания крови.
Наследственная недостаточность Ф-УП - редкое аутосомное рецессивное нарушение системы свертывания крови, распространенность которого в популяции оценивается в 1 случай на 500000 людей (АсЬагуа е! а1., 1. ТЬготЬ Наеток!. 2004; 2248-56). Приобретенная недостаточность Ф-УП из-за применения ингибиторов также очень редка. Описаны случаи недостаточности после применения таких препаратов, как цефалоспорины, пенициллины, антикоагулянты для приема внутрь. Кроме того, приобретенная недостаточность Ф-УП отмечалась при иных состояниях: миеломе, сепсисе, апластической анемии, при терапии интерлейкином-2 и антитимоцитарным глобулином.
К эталонным полинуклеотидным и полипептидным последовательностям относятся, например, последовательности с номерами доступа СепВапк 102933 для геномной последовательности, М13232 для кДНК (Надеп е! а1. РИА8 1986; 83: 2412-6), и Р08709 для полипептидной последовательности (ссылки включены в настоящую заявку во всей полноте). Описано множество полиморфизмов Ф-УП, например, см. 8аЬа!ег-Ь1еа1 е! а1. (Нит Сепе!. 2006; 118:741-51) (ссылка включена в настоящую заявку во всей полноте).
Фактор IX.
Ф-К - витамин-И-зависимый протеин плазмы, участвующий во внутреннем пути коагуляции крови путем превращения фХ в его активную форму в присутствии ионов кальция, фосфолипидов и Ф-УШа. Предоминантная каталитическая способность Ф-К аналогична сериновым протеазам со специфичностью к связи аргинин-изолейцин в Ф-Х. Активация Ф-К происходит под действием Ф^Ь), который отрезает активационный пептид от Ф-К, формируя активированную молекулу Ф-К, содержащую две цепи, связываемые одной или большим количеством дисульфидных связей. Дефекты Ф-К - причина рецессивной гемофилии В, сцепленной с Х-хромосомой.
Гемофилия А и В - наследственные заболевания, которые характеризуются дефицитом полипептидов Ф-УШ и Ф-К соответственно. Первопричина дефицита зачастую лежит в мутациях в генах Ф-УШ и Ф-К, которые расположены в Х-хромосоме. Традиционная терапия гемофилии часто заключается во внутривенном введении смешанной плазмы или полуочищенных белков системы свертывания, полученных от людей с нормальной функцией. Эти препараты могут быть загрязнены патогенными агентами или вирусами, например инфекционными прионами, ВИЧ, парвовирусом, гепатитом А, гепатитом С. Вследствие этого, имеется острая потребность в лекарственных средствах, при производстве которых не используется человеческая сыворотка.
Уровень понижения активности Ф-К прямо пропорционален тяжести гемофилии В. Текущая терапия гемофилии В заключается в замене недостающего белка полученным из плазмы или рекомбинантным Ф-К (так называемая заместительная терапия или лечение Ф-К).
Полинуклеотидные и полипептидные последовательности Ф-К приведены, к примеру, в базе ИтРго1КВ/§№155-Рго!, номер доступа Р00740, базе И8 Ра!. номер 6531298, а также на фиг. 1 (8ЕЦ Ш ΝΟ: 1).
Фактор УШ.
Фактор свертываемости УШ (Ф-УШ) циркулирует в плазме при очень низкой концентрации, он связан нековалентно с фактором Фон Виллебранда (ФВф). Во время гемостаза, Ф-УШ отделяется от ФВф и действует как кофактор при активации фХ, медиируемой фактором IX (Ф-Ка) посредством увеличения скорости активации в присутствии кальция и фосфолипидов или клеточных мембран.
Ф-УШ синтезируется в виде одноцепочечного предшественника с массой примерно 270-330 кДа и с доменной структурой А1-А2-В-А3-С1-С2. При очищении из плазмы (так называемый полученный из плазмы или плазматический), Ф-УШ состоит из тяжелой цепи (А1-А2-В) и легкой (А3-С1-С2). Молекулярная масса легкой цепи равна 80 кДа, в то время как, вследствие протеолиза В-домена, вес тяжелой цепи варьируется в интервале 90-220 кДа.
Ф-УШ также синтезируется как рекомбинантный белок для терапии нарушений свертываемости крови. Для определения потенциальной эффективности рекомбинантного Ф-УШ (рф-УШ) как терапевтического средства были разработаны различные анализы ш уйго. Эти анализы имитируют эффекты эндогенного Ф-УШ ш у1уо. Обработка тромбина Ф-УШ ш уйго приводит к быстрому подъему и после- 54 025738 дующему спаду его прокоагулянтной активности, по данным анализов ш νίίτο. Эта активация и деактивация согласуется со специфическим ограниченным протеолизом тяжелой и легкой цепей, что видоизменяет доступность различных связывающих эпитопов Ф-УШ, например, позволяя Ф-УШ отсоединяться от ФВф и связываться с фосфолипидной поверхностью или изменять способность к связыванию с определенными моноклональными антителами.
Нехватка или дисфункция Ф-УШ ассоциированы с наиболее частым нарушением свертываемости крови - гемофилией А.
Способ выбора для лечения гемофилии А - заместительная терапия плазмой или концентратами рфУШ. Пациенты с тяжелой гемофилией А с уровнем Ф-УШ ниже 1%, как правило, проходят профилактическую терапию, предназначенную для поддержания уровня Ф-УШ выше 1% между его введениям. Принимая во внимание среднее время полужизни различных препаратов Ф-УШ при циркуляции, как правило, этот уровень достижим при введениях Ф-УШ два-три раза в неделю.
Эталонные полинуклеотидные и полипептидные последовательности включают, например, ИшРго(КВ/§№155-Рго( Р00451 (РА8_НυΜАN); СкзсЫег ί. е( а1., СНагасЮп/айоп оГ (Не Нитап Рас(ог УШ депе, №1иге, 312(5992): 326-30 (1984); УеНаг СН е( а1., 8(гис(иге оГ Нитап Рас(ог УШ, ИаШге, 312(5992):337-42 (1984); таотркоп АК. §(гис(иге апй РипсНоп оГ (Не Рас(ог УШ депе апй рго1ст, §етш ЛиотЬ Нето5( 2003:29; 11-29 (2002).
Фактор Фон Виллебранда.
Фактор Фон Виллебранда (ФВф) - гликопротеин, циркулирующий в плазме в виде нескольких мультимеров, варьирующихся в размере от 500 до 20000 кДа. Мультимерные формы ФВф составлены из полипептидных субъединиц массой 250 кДа, связанных друг с другом дисульфидными связями. ФВф вызывает первичную адгезию тромбоцитов к субэндотелию поврежденной сосудистой стенки. Только большие мультимеры проявляют гемостатическую активность. Предполагается, что эндотелиальные клетки секретируют большие полимерные формы ФВф, а молекулы ФВф, имеющие низкий молекулярный вес (низкомолекулярные формы ФВф) появляются вследствие протеолитического разрезания. Мультимеры, имеющие большие молекулярные массы, накапливаются в тельцах Вейбеля-Паладе клеток эндотелия и высвобождаются после стимуляции.
ФВф синтезируется эндотелиальными клетками и мегакариоцитами в виде препро-ФВф, состоящего из большого количества повторяющихся доменов. После отрезания сигнального пептида, про-ФВф димеризуется посредством образования дисульфидных связей на С-терминальном участке. Димеры служат протомерами мультимеризации, которая управляется путем образования дисульфидных связей на свободных концах. За объединением в мультимеры следует протеолитическое удаление пропептидной последовательности (Ьеу(е е( а1., ВюсНет. ί. 274 (1991), 257-261).
Первичный продукт трансляции, считываемый с клонированной кДНК ФВф является полипептидом-предшественником, содержащим 2813 остатков (препро-ФВф). Препро-ФВф состоит из 22 аминокислотных остатков сигнального пептида и 741 аминокислотных остатков пропептида, таким образом, зрелый ФВф содержит 2050 аминокислот (Киддеп ΖΑ., апй \Уаге, ί., РА8ЕВ ί., 308-316 (1993)).
Дефекты ФВф вызывают болезнь Фон Виллебранда (ФВБ), которая характеризуется более или менее выраженной кровоточивостью. ФВБ 3 типа - наиболее тяжелая форма, при которой ФВф полностью отсутствует, ФВБ 1 типа обусловлена количественной потерей ФВф и ее проявления могут быть весьма мягкими, а ФВБ 2 типа характеризуется качественными дефектами ФВф, ее проявления могут быть такими же тяжелыми, как и при 3 типе. ФВБ 2 типа имеет много подтипов, некоторые из которых ассоциированы с отсутствием или уменьшением количества мультимеров с высоким молекулярным весом. Болезнь Фон Виллебранда типа 2а (ФВБ-2А) характеризуется утратой мультимеров и промежуточных размеров, и больших размеров. ФВБ-2В характеризуется утратой мультимеров с самым большим молекулярным весом. Специалистам в данной области техники известны и иные болезни и нарушения, связанные с ФВф.
Полинуклеотидная и аминокислотная последовательности препро-ФВф представлены в базе СепВапк, номера доступа ΝΜ_000552 и ИР_000543 соответственно.
Иные белки свертывания крови согласно изобретению описаны в области техники, например, Мапп КС, ΤΙιι-отЬ Наеток(, 1999; 82:165-74.
А. Полипептиды
Одна из особенностей настоящего изобретения - то, что в качестве исходного материала используется белок или полипептид. Как здесь описано, термин терапевтический белок относится к любой молекуле терапевтического белка, проявляющей биологическую активность, связанную с активностью терапевтического белка. В одном из воплощений изобретения молекула терапевтического белка представляет собой белок полной длины.
Подразумеваемые молекулы терапевтических белков включают протеины, имеющие полную длину, предшественники протеинов полной длины, биологически активные субъединицы или фрагменты протеинов полной длины, а также биологически активные производные или варианты какой-либо из этих форм терапевтических белков. Итак, к терапевтическим белкам относят те, которые (1) имеют аминокислотную последовательность, более чем на примерно 60, примерно 65, примерно 70, примерно 75, при- 55 025738 мерно 80, примерно 85, примерно 90, примерно 91, примерно 92, примерно 93, примерно 94, примерно 95, примерно 96, примерно 97, примерно 98 или примерно 99% или более идентичную с участком из по меньшей мере около 25, около 50, около 100, около 200, около 300, около 400 и более аминокислот полипептида, закодированного эталонной нуклеиновой кислотой или аминокислотной последовательностью, приведенной здесь; и/или (2) специфически связываются с антителами, например поликлональными или моноклональными антителами, сформированными против иммуногена, содержащего эталонную аминокислотную кислотную последовательность, описанную здесь, ее иммуногенный фрагмент и/или консервативно модифицированный вариант.
Согласно данному изобретению термин рекомбинантный терапевтический белок включает любой терапевтический белок, полученный по технологии рекомбинантной ДНК. В некоторых воплощениях термин включает описанные здесь белки.
Термин эндогенный терапевтический белок, используемый в этом документе, включает терапевтические белки, полученные от млекопитающих, предназначенные для терапии. В это понятие также включаются терапевтические белки, транскрибируемые из трансгенной или иной чужеродной ДНК, присутствующей в указанном млекопитающем. Термин экзогенный терапевтический белок, используемый здесь, включает белки свертывания крови, полученные не от млекопитающих, предназначенные для терапии.
Термины полученный из плазмы белок свертывания крови или плазматический, используемые в этом документе, включают все формы белков, обнаруживаемые в крови млекопитающих, которые способны участвовать в каскаде коагуляции.
Термины биологически активное производное или биологически активный вариант, используемые в этом документе, включают любые производные или варианты молекулы, имеющие аналогичные с упомянутой молекулой функциональные и/или биологические свойства, например, связывающие свойства, и/либо аналогичную с ней структуру, например, пептидный скелет или основную полимерную единицу.
Аналог, такой как вариант или производное - соединение, в значительной степени сходное по структуре и имеющее такую же биологическую активность, что и природное, хотя и имеющее отличия. К примеру, вариант полипептида - полипептид, в значительной степени сходный по структуре и имеющий такую же биологическую активность, что и эталонный полипептид. Варианты или аналоги отличаются по составу аминокислотных последовательностей в сравнении с природными полипептидами, из которых был получен аналог, основываясь на одной и более мутациях, включая (ί) делецию одного и большего количества аминокислотных остатков на одном и более концах полипептида и/или на одном и более внутренних участках последовательности природного полипептида (например, фрагменты), (ίί) вставку или добавку одной и большего количества аминокислот на одном и более концах полипептида (как правило, добавление или слияние) и/или на одном и более внутренних участках (как правило, вставка) последовательности природного полипептида или (ίίί) замещение одной и большего количества аминокислот в последовательности природного полипептида на другие аминокислоты. В качестве примера, производное является типом аналога и относится к полипептиду, имеющему аналогичную или в значительной степени сходную структуру с эталонным полипептидом, который был модифицирован, например, химически.
Вариант полипептида является типом аналога полипептида и включает инсерционные варианты, при которых один и большее количество аминокислотных остатков добавлены к аминокислотной последовательности терапевтического белка согласно изобретению. Вставки могут быть расположены на одном или обоих концах протеина, и/или могут располагаться во внутренних участках аминокислотной последовательности терапевтического белка. Инсерционные варианты с дополнительными остатками на одном или обоих концах включают, например, слитые белки и белки, включающие аминокислоты с группами-метками или иные меченые аминокислоты. В одном случае, молекул белка свертывания крови необязательно содержит Ν-терминальный остаток Мет, особенно, если молекула экспрессируется рекомбинантно в бактериальных клетках, например, Е.соН.
Делеционные варианты отличаются тем, что из полипептидной последовательности терапевтического белка, описанного здесь, удалены один или более аминокислотных остатков. Делеции могут быть расположены на одном или обоих концах полипептида терапевтического белка, и/или могут быть обусловлены удалением одного и большего количества остатков из аминокислотной последовательности терапевтического белка. Делеционные варианты, таким образом, включают фрагменты полипептидной последовательности терапевтического белка.
Заместительные варианты характеризуются тем, что один или более аминокислотных остатков в полипептиде терапевтического белка удалены и замещены другими остатками. В одном случае замены могут быть консервативными по природе, консервативные замены этого типа хорошо известны в области техники. Альтернативно, изобретение охватывает замены, которые также являются неконсервативными. Примеры консервативных замещений описаны в ЬеНшидег [ВюсНет181гу, 2'1 ЕНйюп; УойН РиЬНкНета, Шс., Νον Уогк (1975), р. 71-77] и представлены ниже.
- 56 025738
Консервативные замещения
ХАРАКТЕРИСТИКА РАДИКАЛА
Неполярные (гидрофобные)
A. Алифатические
B. Ароматические
C. Серосодержащие б. Граничные Незаряженные полярные:
A. Гидроксильные
B. Амидные
C. Сульфгидрильные б. Граничные
Положительно заряженные (основные)
Отрицательно заряженные (кислотные)
Альтернативный примерный перечень консервативных вариантов замен приведен ниже.
Консервативные замены II
ИСХОДНЫЙ ОСТАТОК ПРИМЕРЫ ЗАМЕНЫ
Ала (А) Вал, Лей, Иле
Арг (К) Лиз, Глн, Аск
Асн (Ν) Глн, Гис, Лиз, Арг
АОП (б) Глу
Цис (С) Сер
Глн (0) Асн
Глу (Е) Асп
Гис (Н) Асн, Глн, Лиз, Арг
Иле (I) Лей, Вал, Мет, Ала, Фен
Лей (Ь) Иле, Вал, Мет, Ала, Фен
Лиз (К) Арг, Глн, Асн
Мет (М) Лей, Фен, Иле
Фен (Г) Лей, Вал, Иле, Ала
Про (Р) Гли
Сер (5) Тре
Тре (Т) Сер
Три (И) ' Тир
Тир < Υ) Три, Фен, Тре, Сер
Вал (V) Иле, Лей, Мет, Фен, Ала
В. Полинуклеотиды
Нуклеиновые кислоты, кодирующие терапевтические белки по изобретению, включают в рамках изобретения, к примеру, гены, пре-мРНК, мРНК, кДНК, полиморфные варианты, аллели, искусственные и природные мутанты, но не ограничиваясь ими.
Полинуклеотиды, кодирующие терапевтические белки, также включают в рамках изобретения, к примеру, но не ограничиваясь ими, те, которые (1) специфически гибридизированы в жестких гибридизационных условиях с нуклеиновой кислотой, кодирующей аминокислотную последовательность, описанную здесь, а также их консервативно модифицированные варианты; (2) имеют нуклеотидную последовательность с более чем 95, около 96, около 97, около 98, около 99, и большей идентичностью нуклеотидной последовательности на участке с по меньшей мере около 25, около 50, около 100, около 150, около 200, около 250, около 500, около 1000 и более нуклеотидов (вплоть до полной длины последователь- 57 025738 ности из 1218 нуклеотидов зрелого белка), с эталонной последовательностью нуклеиновой кислоты, описанной здесь. Примером жестких гибридизационных условий служит гибридизация при 42°С в 50% формамиде, 5Х 88С (цитрат и хлорид натрия), 20 мМ Ыа-РО4, рН 6,8; и отмывка в IX 88С при 55°С в течение 30 мин. Следует понимать, что в зависимости от длины и содержания ГЦ-нуклеотидов гибридизируемых последовательностей, эти примерные условия могут быть изменены. Для определения приемлемых условий гибридизации приемлемы стандартные в данной области техники формулы. См. 8атЬгоок с1 а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬота1оту Мапиа1 (8есопй ей., Со1й 8ргтд НагЬог ЬаЬота1оту Рте88, 1989) § 9.47-9.51.
Природные полинуклеотидные или полипептидные последовательности, как правило, происходят от млекопитающих, включая, но не ограничиваясь ими, приматов, к примеру, человека; грызунов, к примеру, крыс, мышей, хомяков; от коров, свиней, лошадей, овец или иных млекопитающих. Нуклеиновые кислоты и белки в рамках изобретения могут быть рекомбинантными молекулами (к примеру, гетерологическими, кодирующими последовательность дикого типа или ее варианты, или не встречающимися в природе).
С. Получение терапевтических белков
Получение терапевтических белков включает любые способы, известные в области техники, предназначенные для (ί) получения рекомбинантной ДНК способами генной инженерии, (ίί) внедрения рекомбинантной ДНК в прокариотические или эукариотические клетки посредством, к примеру, но не ограничиваясь ими, трансфекции, электропорации или микроинъекции, (ίίί) культивирования указанных трансформированных клеток, (ίν) экспрессирования терапевтических белков, например, конститутивно или по индукции, а также (ν) выделения указанных белков свертывания крови, например, из культуральной среды или путем сбора трансформированных клеток для получения очищенного терапевтического белка.
В иных случаях, терапевтический белок получают путем экспрессии в подходящей прокариотической или эукариотической клеточной системе, характеризующейся способностью к синтезу фармакологически приемлемой молекулы белка свертывания крови. Примерами эукариотических клеток являются клетки млекопитающих, например, СНО, СО8, НЕК 293, ВНК, 8К-Нер, а также НерО2.
Для получения терапевтических белков используется множество векторов, выбранных из эукариотических и прокариотических векторов экспрессии. Примерами векторов прокариотической экспрессии служат плазмиды, например, но не ограничиваясь ими, рК8ЕТ, рЕТ, и рВАЭ, а промоторы, используемые для прокариотических векторов экспрессии, включают один или более из 1ас, 1гс, 1гр. гесА, или агаВАЭ, но не ограничиваясь перечисленными. Примеры векторов для эукариотической экспрессии включают: (ί) для экспрессии в дрожжах - такие векторы, как рАО, рР1С, рУЕ8, или рМЕТ, но не ограничиваясь ими, с использованием таких промоторов, как АОХ1, ОАР, ОАЕ1, или АИО1, но не ограничиваясь ими; (ίί) для экспрессии в клетках насекомых - такие векторы, как рМТ, рАс5, р1В, рМ1В, или рВАС, но не ограничиваясь ими, с использованием таких промоторов, как РН, р10, МТ, Ас5, Ор1Е2, др64, или ро1Ь, но не ограничиваясь ими, и (ίίί) для экспрессии в клетках млекопитающих - такие векторы, как р8УЪ, рСМУ, рКс/К8У, рсПЫАЗ, или рВРУ, но не ограничиваясь ими, а также векторы, в одном случае, полученные из таких вирусных систем, как вирус осповакцины, аденосателлитные вирусы, вирусы герпеса, или ретровирусы, с использованием таких промоторов, как СМУ, 8У40, ЕР-1, ИЬС, К8У, АЭУ, ВРУ, и βактин, но не ограничиваясь ими.
ϋ. Введение препарата
В одном из воплощений конъюгированный терапевтический белок согласно настоящему изобретению может вводиться путем инъекции, например, внутривенно, внутримышечно, либо интраперитонеально.
Для введения композиций человеку или подопытным животным, содержащих конъюгированный терапевтический белок согласно данному изобретению, в их состав могут быть включены один и большее количество фармацевтически приемлемых носителей. Термины фармацевтически или фармакологически приемлемые относятся к молекулярным структурам и композициям, которые стабильны, ингибируют деградацию белка, например, агрегацию и разрезание, а также не вызывают аллергических реакций и иных нежелательных реакций при введении путями, известными в области техники, как описано ниже. К фармацевтически приемлемым носителям относятся все клинически пригодные растворители, диспергенты, пленки, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические растворы и средства для замедления абсорбции и т.д., включая средства, перечисленные выше.
Термин эффективное количество при использовании в этом документе обозначает дозу, пригодную для лечения заболевания или нарушения или ослабления симптома заболевания или нарушения. В одном воплощении термин эффективное количество обозначает дозу, пригодную для лечения млекопитающего, имеющего описанное здесь расстройство свертывания крови.
Композиции могут вводиться перорально, местно, чрескожно, парентерально, ингаляционным спреем, вагинально, ректально, либо интракраниальной инъекцией. Термин парентерально включает здесь подкожные инъекции, внутривенные, внутримышечные, интрацистернальное введение, а также
- 58 025738 инфузии. Введение может осуществляться способами внутривенных, внутрикожных, внутримышечных, интрамаммарных, интраперитонеальных, интратекальных, ретробульбарных, интрапульмонарных инъекций, а также способом хирургической имплантации в конкретный участок тела. Как правило, композиции не содержат пирогенов, а также иных примесей, которые могут быть опасны для реципиента.
Одно- и многократные введения композиций могут проводиться с уровнями дозировок и по схеме, выбранными лечащим врачом. Для профилактики или лечения болезни, приемлемый уровень дозировки будет зависеть от типа болезни, подлежащей лечению, как описано выше, тяжести и течения болезни, целей применения препарата: профилактических или терапевтических, предшествующей терапии, анамнеза больного и реакции на препарат, а также от индивидуальных суждений лечащего врача.
Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество конъюгированного терапевтического белка, как описано здесь. Фармацевтическая композиция может содержать фармацевтически приемлемый носитель, растворитель, соли, буферы или вспомогательные добавки. Фармацевтическая композиция может использоваться для лечения указанных выше расстройств свертывания крови. Фармацевтическая композиция согласно изобретению может являться раствором или лиофилизатом. Растворы фармацевтической композиции могут подвергаться любым подходящим лиофилизационным процессам.
Дополнительно, изобретение включает наборы, содержащие композицию согласно изобретению, упакованную таким способом, чтобы облегчить ее введение субъектам. В одном воплощении в такой набор включено соединение или композиция, описанная здесь (например, композиция, содержащая конъюгированный терапевтический белок), упакованные в контейнер, например запечатанный флакон или бутыль, с этикеткой, прикрепленной к контейнеру или прилагаемой к упаковке, в которой описано практическое использование соединения или композиции. В одном воплощении набор содержит два контейнера, в первом из которых находится композиция, содержащая конъюгированный терапевтический белок, а во втором - физиологически приемлемый раствор для восстановления раствора композиции в первом флаконе. В одном случае соединение или композиция могут быть упакованы в форму, позволяющую дозирование. Набор может дополнительно включать приспособление, предназначенное для введения композиции согласно специфическому способу введения. Предпочтительно, чтобы набор содержал этикетку, в которой описано использование терапевтического белка или пептидной композиции.
Водорастворимые полимеры
В одном случае, молекула производного терапевтического белка (т.е. конъюгированный терапевтический белок) связана с водорастворимым полимером, включая полиэтиленгликоль (ПЭГ), разветвленный ПЭГ, полисиаловую кислоту (ПСК), гидроксиалкилкрахмал (ГАК), гидроксилэтилкрахмал (ГЭК), углеводы, полисахариды, пуллулан, хитозан, гиалуроновую кислоту, хондроитинсульфат, дерматансульфат, крахмал, декстран, карбоксиметил-декстран, полиалкиленоксид (ПАО), полиалкиленгликоль (ПАГ), полипропиленгликоль (ППГ), полиоксазолин, полиакрилоилморфолин, поливиниловый спирт (ПВС), поликарбоксилат, поливинилпирролидон, полифосфазен, полиоксазолин, сополимер полиэтилена с малеиновым ангидридом, сополимер полистирола с малеиновым ангидридом, поли(1-гидроксиметилэтилен гидроксиметилформаль) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилтриметиламмонийфосфат (МФС), но не ограничиваясь ими. В одном воплощении изобретения водорастворимый полимер состоит из молекулы сиаловой кислоты, имеющей молекулярный вес, находящийся в пределах 350-120000, 500-100000, 100080000, 1500-60000, 2000-45000, 3000-35000 и 5000-25000 Да. Связывание водорастворимого полимера может выполняться путем прямого связывания с белком либо через молекулы сшивающих агентов. Один пример химического сшивающего агента - МВРН (4-[4-^малеимидофенил]масляной кислоты гидразид), содержащий карбогидрат-селективную гидразидную и сульфгидрил-реактивную малеимидную группы (СЬатоте е1 а1., ί. ΒίοΙ. СЬет. 1992; 267:15916-22). Иные примерные и предпочтительные сшивающие агенты приведены ниже.
В одном воплощении производное сохраняет полную функциональную активность нативного терапевтического продукта белка, а также обеспечивает увеличенный период полужизни ίη νίνο в сравнении с нативными терапевтическими продуктами белков. В другом воплощении производное сохраняет по меньшей мере 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, или 150 % от биологической активности нативного белка свертывания крови. В связанном случае, биологическая активность производного и нативного белков свертывания крови определяется отношениями хромогенной активности антигенов к факторам свертывания крови (фактор свертывания крови: СЬг: фактор свертывания крови:Ад). В ином воплощении изобретения период полужизни конструкции уменьшен или увеличен в 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз в сравнении с периодом полужизни нативного терапевтического белка ίη νίνο.
А. Сиаловая кислота и ПСК
ПСК состоят из полимеров (обычно, гомополимеров) Ν-ацетилнейраминовой кислоты. Вторичная аминогруппа, как правило, несет ацетильную группу, но может, вместо нее, нести гликолильную группу. Возможные заместители гидроксильных групп включают ацетильную, лактильную, этильную, сульфат- 59 025738 ную и фосфатную группы.
ΗΩ 2Н
Н сооΑΟΗΝ^^ΛΟΗ но он
Ν-Ацетилнейраминовая кислота №и5Ас
Структура сиаловой кислоты (Ν-ацетилнейраминовой кислоты).
ПСК и мПСК, как правило, включают линейные полимеры, состоящие, в основном, из фрагментов Ν- ацетилнейраминовой кислоты, соединенных 2,8- или 2,9- гликозидными связями или их комбинациями (например, чередующимися 2,8- и 2,9-связями). Особенно предпочтительны ПСК и мПСК с α-2,8 гликозидными связями. Подобные ПСК и мПСК, как правило, получаются из коломиновых кислот и обозначаются здесь как КК и мКК. Типичные ПСК и мПСК включают по меньшей мере 2, предпочтительно по меньшей мере 5, более предпочтительно по меньшей мере 10 и наиболее предпочтительно по меньшей мере 20 фрагментов Ν-ацетилнейраминовой кислоты. Таким образом, в них может содержаться от 2 до 300 фрагментов Ν-ацетилнейраминовой кислоты, предпочтительно от 5 до 200 фрагментов Ν-ацетилнейраминовой кислоты или наиболее предпочтительно от 10 до100 фрагментов Νацетилнейраминовой кислоты. Предпочтительно, чтобы ПСК и КК существенным образом не содержали иных углеводных остатков, кроме как остатков Ν-ацетилнейраминовой кислоты. Таким образом, ПСК и КК предпочтительно содержат по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 98% фрагментов Ν-ацетилнейраминовой кислоты.
Если ПСК и КК содержат фрагменты, отличные от Ν-ацетилнейраминовой кислоты (как, например, в мПСК и мКК), то предпочтительно, чтобы они располагались на одном или обоих концах полимерной цепи. Подобные отличные фрагменты, к примеру, могут быть фрагментами, полученными из терминальных фрагментов Ν-ацетилнейраминовой кислоты окислением или восстановлением.
К примеру, в ΑΌ -А-0187922 описаны подобные мПСК и мКК, у которых невосстанавливающая терминальная единица Ν-ацетилнейраминовой кислоты превращена в ацетильную группу взаимодействием с натрия периодатом. Помимо этого, в ΑΌ 2005/016974 описаны ПСК и КК, в которых восстанавливающая терминальная единица Ν-ацетилнейраминовой кислоты подвергается восстановлению с восстановительным разрывом кольца восстановительной терминальной единицы Ν-ацетилнейраминовой кислоты с образованием вицинальной диольной группы, после чего ее окисляют с превращением вицинальной диольной группы в альдегидную группу.
Гликопротеины, богатые сиаловой кислотой, связывают селектин у человека и других организмов. Они играют важную роль при инфекциях гриппа у человека. Так, например, сиаловая кислота может скрывать от маннозасвязывающего лектина маннозные антигены на поверхности клеток-хозяев или бактерий. Вследствие этого не происходит активации комплемента. Сиаловые кислоты также скрывают предпоследние остатки галактозы, предотвращая быстрый клиренс гликопротеина галактозным рецептором клеток паренхимы печени.
Структура коломиновой кислоты (гомополимера Ν-ацетилнейраминовой кислоты).
Коломиновые кислоты (подкласс ПСК) являются гомополимерами Ν-ацетилнейраминовой кислоты (ΝΑΝΑ) с α (2^8) кетозидной связью и производятся, среди прочего, определенным штаммами ЕзсйепсЫа сой, несущими антиген К1. Коломиновые кислоты выполняют множество физиологических функций. Они - важное сырье для лекарственных и косметических препаратов.
Сравнительные исследования т νίνο с полисиалированной и немодифицированной аспарагиназой показали, что полисиалирование повышает период полужизни фермента (Ретапйез апй Огецопасйз. БюсЫш1са Вюрйузюа Ас1а 1341: 26-34, 1997).
Термин фрагменты сиаловых кислот, используемый в этом документе, включает мономеры или полимеры сиаловой кислоты (полисахариды), которые растворимы в водном растворе или суспензии и не имеют отрицательных эффектов (либо имеют незначительные), например, побочных эффектов, у млекопитающих при введении конъюгатов ПСК с белками системы свертывания крови в фармацевтически эффективных количествах. Полимеры могут состоять, в одном случае, из 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 или 500 единиц сиаловой кислоты. В ряде случаев различные единицы
- 60 025738 сиаловой кислоты объединяются в цепочки.
В одном из воплощений изобретения фрагмент полисахаридного соединения, состоящий из сиаловой кислоты, очень гидрофилен, в ином воплощении все соединение очень гидрофильно. Гидрофильность в первую очередь обусловлена боковыми карбоксильными группами сиаловой кислоты, а также гидроксильными группами. Сахаридная единица может содержать и иные функциональные группы, например, аминогруппу, гидроксильную или сульфатную группу, а также их комбинации. Эти группы могут присутствовать в природных сахаридных соединениях, либо могут быть введены в получаемые полисахаридные соединения.
Природный полимер ПСК доступен в виде полидисперсного препарата с большим разбросом размеров (например, 81дта С-5762) и высокой полидисперсностью (ПД). Поскольку полисахариды, как правило, получают из бактерий, имеется риск попадания эндотоксинов в продукт при его очистке, а при выделении длинноцепочечных полимеров сиаловой кислоты вероятность повышения содержания эндотоксинов повышается. Короткие молекулы ПСК, содержащие 1-4 остатка сиаловой кислоты также могут быть приготовлены синтетически (Капд δ.Η. е! а1., СЬет Соттип. 2000; 227-8; Ке88 Ό.Κ. апй ЫпЬагй! КТ, СиггеШ ОгдаШс §уп1Ье818. 2004; 1:31-46), что минимизирует риск высокого содержания эндотоксинов. Тем не менее, препараты ПСК с узким распределением размеров и низкой полидисперсностью, а также свободные от эндотоксинов, могут быть приготовлены в настоящее время. В одном случае в изобретении могут использоваться полисахаридные компоненты, полученные из бактерий. Некоторые из этих природных полисахаридов известны под видом гликолипидов. В одном из воплощений изобретения полисахаридные соединения практически полностью освобождены от терминальных единиц галактозы.
В. Полиэтиленгликоль (ПЭГ) и пегилирование
В качестве особенности изобретения, терапевтические белки конъюгированы с водорастворимым полимером каким-либо из множества химических способов (КоЪей8 ТМ. е! а1., Айуап Эгид ЭеЬуегу Кеу 2002; 54:459-76). К примеру, в одном воплощении терапевтический белок модифицирован конъюгацией ПЭГ со свободными аминогруппами белка с использованием Ν-гидроксисукцинимидных (ΝΗδ) сложных эфиров. В ином воплощении водорастворимый полимер, к примеру, ПЭГ, соединен со свободными δΗ-группами малеимидным способом или связыванием гидразидов ПЭГ или аминов ПЭГ с углеводными фрагментами терапевтического белка после предварительного окисления.
В качестве особенности изобретения, конъюгация осуществляется путем прямого связывания (или связывания посредством сшивающих агентов) водорастворимого полимера с терапевтическим белком с образованием стабильных связей. В определенных случаях изобретения могут использоваться разрушаемые, легкоразрываемые или гидролизуемые системы сшивания (Т8иЪегу е! а1. I. Вю1 СЬет 2004; 279:38118-24/Сгееп№а1й е! а1., I. Мей СЬет 1999; 42:3657-67/2Ьао е! а1., Вюсот СЬет 2006; 17:34151/Ψ0 2006/138572Α2/υδ7259224Β2/ϋδ7060259Β2).
В одном воплощении изобретения терапевтический белок модифицирован в остатках лизина производными полиэтиленгликоля, содержащими активный Ν-гидроксисукцинимидный сложный эфир (ΝΗδ), например, сукцинат сукцинимидила, глутарат сукцинимидила или пропионат сукцинимидила. Эти производные реагируют с остатками лизина терапевтического белка в мягких условиях, образуя стабильную амидную связь. В одном воплощении изобретения длина цепи производного ПЭГ равна 5000 Да. В иных воплощениях могут использоваться другие производные ПЭГ с длиной цепи от 500 до 2000 Да, от 2000 до 5000 Да, более 5000 вплоть до 10000 Да или более 10000 вплоть до 20000 Да, более 20000 вплоть до 150000 Да, включая линейные и разветвленные структуры.
Среди альтернативных способов пегилирования аминогрупп, но не ограничиваясь перечисленными, можно назвать химическое конъюгирование с карбонатами ПЭГ с образованием уретановых связей, или взаимодействие с альдегидами или кетонами при восстановительном аминировании с образованием вторичных амидных связей.
В одном воплощении данного изобретения молекула терапевтического белка химически модифицирована производными ПЭГ, доступными в продаже. Эти производные ПЭГ в альтернативных вариантах могут иметь линейные или разветвленные структуры. Примеры производных ПЭГ, содержащих группы ΝΗδ, приведены ниже.
Следующие производные ПЭГ - неисчерпывающий перечень продуктов, коммерчески доступных у №к!аг ТЬегареШгс8 (Хантсвиль, Алабама; см. №№№.пек!аг.сот/каталог реагентов ПЭГ; №к!аг Айуапсей РЕОу1а!юп, прайс-лист 2005-2006):
мПЭГ -сукцинимидилпропионат (тРЕО^РА)
мПЭГ -сукцинимидил-а-метилбутаноат (тРЕО-δΜΒ)
- 61 025738
тРЕС-СМ-ΗΒΑ-ΝΗδ (СМ=карбоксиметил; НВА=гидроксимасляная кислота)
Структура разветвленных производных ПЭГ (№к!ат ТйегареиЕск). Разветвленный Ν-гидроксисукцинимид ПЭГ (тРЕО2-№Н§)
Этот реагент с разветвленной структурой описан более подробно в работе Κοζ1ο\ν5ΐ<ί е1 а1. (ВюЭгидх 2001; 5:419-29).
Еще один неисчерпывающий перечень производных ПЭГ, доступных в продаже у ΝΘΡ Согрогайоп (Токио, Япония; см. \у\у\у.поГ.со.)р/епдП511: каталог 2005).
Общая структура линейных производных ПЭГ (ΝΘΡ Согр.):
- 62 025738
Структуры разветвленных производных ПЭГ (ΝΟΕ Согр.):
2,3-бис-(метилполиоксиэтилен-окси)-1 -(1,5-диоксо-5 -сукцинимидилокси, пентилокси)пропан
2,3-бис-(метилполиоксиэтилен-окси)-1 -(сукцинимидил карбоксипентилокси)пропан
Данные производные пропана обладают скелетом глицерина с 1,2-замещением. В данном изобретении также могут применяться разветвленные производные ПЭГ на основе структуры глицерина с 1,3замещением или иные разветвленные структуры, описанные в и82003/0143596А1.
Также могут использоваться производные ПЭГ с легко разрываемыми связями (например, с гидролизуемыми сшивками), как описано ПиЬегу е! а1. (I. Вю1 СНет 2004; 279:38118-24) и 8НесН!ег е! а1. (УО 04089280 А3).
Как ни удивительно, пегилированный терапевтический белок согласно данному изобретению, обладает функциональной активностью в комбинации с продленным периодом полужизни ίη У1уо. Вдобавок, пегилированные рф-УШ, Ф-УНа, Ф-К и иные факторы свертывания крови, видимо, более резистентны к инактивации тромбином.
С. Гидроксиалкилкрахмал (ГАК) и гидроксилэтилкрахмал (ГЭК)
В различных воплощениях настоящего изобретения молекула терапевтического белка химически модеифицирована с использованием гидроксиалкилкрахмала (ГАК) или гидроксилэтилкрахмала (ГЭК) или их производных.
ГЭК является производным природного амилопектина и расщепляется в организме альфа-амилазой. ГЭК является замещенным производным углеводного полимера амилопектина, который присутствует в кукурузном крахмале в концентрации вплоть до 95% по массе. ГЭК обладает выгодными биологическими характеристиками и используется в качестве средства для возмещения объема циркулирующей крови и в гемодилюционной терапии в клиниках (8оттегтеуег е! а1., 1987, КгапкепЬаи5рНагта71е, 8 (8), 271278; и УеИ1ег е! а1., 1991, Аг/пеип.-РогксНнпд/Огид Кек. д. 419 494-498).
Амилопектин состоит из фрагментов глюкозы, причем в главной цепи присутствуют альфа-1,4гликозидные связи, а в местах разветвления присутствуют альфа-1,6-гликозидные связи. Физикохимические свойства этой молекулы, в основном, определяются типом гликозидных связей. Благодаря альфа-1,4-гликозидной связи, получаются спиральные структуры, содержащие приблизительно шесть мономеров глюкозы на оборот. Физико-химические, а также биохимические свойства полимера могут быть модифицированы замещением. Гидроксиэтильная группа может быть внедрена щелочным гидроксиэтилированием. При адаптировании условий реакции возможно добиться различной реакционной способности соответствующей гидроксигруппы незамещенного мономера глюкозы в сравнении с гидроксиэтилированием. Благодаря этому факту, специалист может осуществить замещение в желаемой степени.
ГАК обозначает производное крахмала, в котором замещена по меньшей мере одна гидроксиалкильная группа. Таким образом, термин гидроксиалкилкрахмал не ограничивается соединениями, в которых терминальный углеводный фрагмент содержит гидроксиалкильные группы К1, К2 и/или К3, но, также, относится к соединениям, у которых где-либо присутствует по меньшей мере одна гидроксигруппа в терминальном углеводном фрагменте и/или в оставшейся части молекулы крахмала, ГАК', замещена гидроксиалкильной группой К1, К2 или К3.
- 63 025738
Алкильная группа может быть линейной или разветвленной алкильной группой, которая тоже может быть замещена нужным образом. Предпочтительно, чтобы в гидроксиалкильной группе содержалось 1-10 атомов углерода, более предпочтительно 1-6 атомов углерода, более предпочтительно 1-4 атомов углерода, еще более предпочтительно 2-4 атомов углерода.
Гидроксиалкилкрахмал, таким образом, предпочтительно включает гидроксиэтилкрахмал, гидроксипропилкрахмал и гидроксибутилкрахмал, причем особенно предпочтительны гидроксиэтилкрахмал и гидроксипропилкрахмал.
Гидроксиалкилкрахмал, который содержит две или более различные гидроксиалкильные группы, также охватывается настоящим изобретением. По меньшей мере одна из гидроксиалкильных групп, содержащихся в ГАК, может содержать две или более гидроксильные группы. В соответствии с одним воплощением по меньшей мере одна из гидроксиалкильных групп, находящихся в ГАК, содержит одну гидроксигруппу.
Термин ГАК также включает производные, в которых алкильная группа моно- или полизамещена. В одном воплощении алкильная группа замещена галогеном, в частности фтором, либо арильной группой, так, чтобы ГАК оставался растворимым в воде. Помимо этого, терминальная гидроксигруппа гидроксиалкильной группы может входить в состав сложного или простого эфира. Производные ГАК описаны в \νϋ /2004/024776, который включен в это изобретение во всей полноте посредством ссылки.
ϋ. Способы присоединения
Терапевтический белок может быть ковалентно связан с полисахаридными соединениями различными способами, известными специалистам в этой области техники. В качестве особенности изобретения, фрагменты сиаловой кислоты связаны с терапевтическим белком, например, Ф-IX, Ф-УШ, Ф-УПа или ФВф, например, по способу, описанному в патенте υδ № 4356170, который включен в данную заявку по ссылке.
В рамках изобретения также предполагается возможность использования иных известных способов связывания ПСК с полипептидами. К примеру, в публикации υδ № 2007/0282096 описано конъюгирование амино- или гидразидных производных, например, ПСК, с белками. Помимо этого, в публикации υδ № 2007/0191597 описаны производные ПСК, содержащие альдегидную группу, взаимодействующую с субстратами (например, белками) на их восстанавливающем конце. Эти публикации включены по ссылке во всей полноте.
Различные способы приведены в колонке 7, строке 15, -колонке 8, строке 5 патента υ.δ. № 5846951 (включен по ссылке во всей полноте). Среди примеров способов можно назвать связывание посредством образования пептидной связи между карбоксильной группой того или иного белка свертывания крови или полисахарида и аминогруппой белка свертывания крови или полисахарида, либо сложноэфирной связи между карбоксильной группой белка свертывания крови или полисахарида и гидроксильной группой терапевтического белка или полисахарида. Другой пример ковалентного связывания терапевтического белка с полисахаридным соединением - через основание Шиффа, т.е. путем взаимодействия свободной аминогруппы белка свертывания крови с альдегидной группой, формируемой на невосстанавливающем конце полисахарида при периодатном окислении (.Гептпдк Н.В апй Ьидо№8к1 С., I. Iттиηο1. 1981; 127:1011-8; Ретапйез А.Г апй ОгедопаЙ18 Ο., ВюсЫт Βίορίινδ Ас1а. 1997; 1341; 26-34). В одном случае образовавшееся основание Шиффа стабилизируется путем специфического восстановления при помощи ЛаСЛВН3 с образованием вторичного амина. Альтернативный подход - формирование терминальных свободных аминогрупп в ПСК путем восстановительного аминирования с ЛН4С1 после предварительного окисления. Для связывания двух амино- или двух гидроксильных групп могут быть использованы бифункциональные реагенты. Например, ПСК, содержащая аминогруппу может быть связана с аминогруппой белка при помощи реагентов типа Βδ3 (бис-(сульфосукцинимидил)суберат/Р1егсе, Рокфорд, Иллинойс). Помимо этого, к примеру, для связывания амино- и тиоловых групп могут использоваться гетеробифункциональные перекрестно-сшивающие реагенты по типу δи1£ο-ЕΜСδ (Ν-εмалеимидокапроилокси)сульфосукцинимидный сложный эфир/Р1егсе).
По иному способу, готовят гидразид ПСК и связывают его с углеводными фрагментами белка после предварительного окисления с формированием альдегидных групп.
Как описано выше, свободная аминогруппа терапевтического протеина реагирует с 1карбоксильной группой остатка сиаловой кислоты с образованием пептидильной связи или сложноэфирная связь образуется между 1-карбоксильной группой кислоты и гидроксильной или иной подходящей активной группой белка свертывания крови. В качестве варианта, карбоксильная группа может образовывать пептидную связь с деацетилированной 5-аминогруппой или альдегидная группа молекулы тера- 64 025738 певтического белка может образовывать основание Шиффа с Ν-деацетилированной 5-аминогруппой остатка сиаловой кислоты.
Альтернативно, полисахаридное соединение связано нековалентно с терапевтическим белком. К примеру, полисахаридное соединение и фармацевтически активное соединение в одном случае соединяются в одно целое посредством гидрофобных взаимодействий. Иные нековалентные способы связи включают электростатические взаимодействия, при которых противоположно заряженные ионы притягиваются друг к другу.
В различных воплощениях, терапевтический белок связан или ассоциирован с полисахаридным соединением в стехиометрических отношениях (например, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:7, 1:8, 1:9 или 1:10 и т.д.). В различных воплощениях, 1-6, 7-12 или 13-20 полисахаридов связаны с белком свертывания крови. В иных воплощениях, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 и более полисахаридов связаны с белком свертывания крови.
В различных воплощениях, терапевтический белок модифицирован, т.е. в него внедрены сайты гликозилирования (т.е. сайты, отличные от нативных сайтов гликозилирования). Такая модификация может быть выполнена стандартными способами молекулярной биологии, известными в данной области техники. Более того, терапевтический белок перед конъюгированием с водорастворимым полимером может быть гликозилирован ίη νίνο или ίη νίίΓΟ. Эти гликозилированные сайты могут служить мишенями для конъюгации белков с водорастворимыми полимерами (заявка на патент И8 № 20090028822, заявка на патент И8 № 2009/0093399, заявка на патент И8 № 2009/0081188, заявка на патент И8 № 2007/0254836, заявка на патент И8 № 2006/0111279, а также ИеРгеек 8. βί а1., С1усоЬю1о§у, 2006, 16, 9, 833-43). К примеру, белок, который не гликозилирован в природе ίη νί\Ό (например, белок, который не является гликопротеином), может быть модифицирован так, как описано выше.
Е. Аминоокси-связывание
В одном воплощении изобретения для приготовления конъюгатов белков системы свертывания крови используется взаимодействие гидроксиламина или гидроксиламиновых производных с альдегидами (например, с углеводными фрагментами, окисленными периодатом натрия) с образованием оксимной группы. К примеру, гликопротеин (например, терапевтический белок согласно данному изобретению) вначале окисляется окислителем типа периодата натрия (ЫаЮ4) (КЫЬГик ίΑ е1 8тЬЬ ЕЬ., ί. Вю1 СЬет 1963, 238, 1402-10; и Уап Ьейеп Ь апЬ АкЬгеЬ С., ί. Вю1 СЬет 1971, 246, 1889-94). Периодатное окисление гликопротеинов основывается на классической реакции Малапрада, описанной в 1928 г., а именно на окислении вицинальных диолов периодатом с образованием активной альдегидной группы (Ма1аргайе Ь., Апа1уЬса1 аррЬсайоп, Ви11 8ос СИт Ргапсе, 1928, 43, 683-96). Окислителями также могут дополнительно выступать тетраацетат свинца (РЬ(ОАс)4 ), ацетат марганца (МпО(Ас)3), ацетат кобальта (Со(ОАс)2), ацетат таллия (Т1ОАс), сульфат церия (Се(8О4)2) (И8 4367309) или перрутенат калия (ККиО4) (Магко еί а1., ί. Ат СЬет 8ос 1997,119, 12661-2). Под окислителем подразумевается соединение, обладающее мягкими окислительными свойствами, позволяющими произвести окисление вицинальных диолов в углеводы и сформировать активные альдегидные группы при протекании реакции в физиологических условиях.
Второй этап - связывание полимера, содержащего аминооксигруппы, с окисленными углеводными фрагментами с образованием оксимной связи. В одном воплощении изобретения этот этап может проводиться в присутствии каталитических количеств нуклеофильного катализатора анилина или его производных (Ииккеп А. еί Эа\У5оп Р.Е., ВюсопщдаЮ СЬет. 2008; 2еп§ Υ еί а1., №Ниге МеНюЬк 2009; 6:207-9). Анилиновый катализ существенно ускоряет образование оксимных связей, что позволяет использовать очень малые концентрации реагентов. В другом воплощении данного изобретения оксимная связь стабилизируется восстановлением №ιί''ΝΒΗ3 с образованием алкоксиаминовой связи (фиг. 2). Дополнительные катализаторы описаны ниже.
Дополнительные сведения по технологии аминоокси-связывания приведены в следующих источниках, каждый из которых включен в своей полноте: ЕР 1681303А1 (эритропоэтин, связанный с гидроксиалкилкрахмалом); \УО 2005/014024 (конъюгаты полимера и белка, связанные оксимной группой); \УО 96/40662 (сшивающие агенты, содержащие аминооксигруппы и их применение для изготовления конъюгатов); \УО 2008/025856 (модифицированные протеины); Реп Р. еί а1., ТеЦаЬеЬгоп 1998, 54, 12269-78; КиЬ1ег-К1е1Ь ί. еί Ро/5дау V., ί. Огд СЬет 2005, 70, 6887-90; Ьеек А. еί а1., Уассше 2006, 24(6), 716-29; и НегеЛа К.Ь. еί а1., Масготоеси1е8 2007, 40(14), 4772-9.
В различных воплощениях изобретения водорастворимый полимер, соединенный согласно аминоокси-технологии, описанной здесь, с окисленными углеводными фрагментами терапевтического белка (например, Ф-УШ, Ф-У11а или Ф-ΙΧ), включает, к примеру, но не ограничиваясь перечисленными примерами, полиэтиленгликолем (ПЭГ), разветвленным ПЭГ, полисиаловой кислота (ПСК), углеводами, полисахаридами, пуллуланом, хитозаном, гиалуроновой кислотой, хондроитинсульфатом, дерматансульфатом, крахмалом, декстраном, карбоксиметил-декстраном, полиалкиленоксидом (ПАО), полиалкиленгликолем (ПАГ), полипропиленгликолем (ППГ), полиоксазолином, полиакрилоилморфолином, поливиниловым спиртом (ПВС), поликарбоксилатом, поливинилпирролидоном, полифосфазеном, полиоксазолином, сополимером полиэтилена с малеиновым ангидридом, сополимером полистирола с малеиновым ангидридом, поли(1-гидроксиметилэтилен гидроксиметилформалем) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'- 65 025738 этилтриметиламмонийфосфатом (МФС).
Нуклеофильные катализаторы
Как описано здесь, конъюгирование водорастворимых полимеров с терапевтическими белками может быть катализировано анилином. Анилин выраженно катализирует реакции в воде альдегидов и кетонов с аминами с образованием стабильных иминов, таких как гидразоны и оксимы. На диаграмме ниже сравниваются некатализированная и анилин-катализированная реакция оксимного связывания (КоЫег Ц, СЬетВюСЬет. 2009; 10:2147-50):
Однако, в связи с тем, что анилин вреден для здоровья, желательны другие катализаторы. В настоящем изобретении в качестве альтернативных катализаторов оксимного связывания предлагаются анилиновые производные. Подобные анилиновые производные включают, но не ограничиваясь перечисленным, о-аминобензойную кислоту, м-аминобензойную кислоту, п-аминобензойную кислоту, сульфаниловую кислоту, о-аминобензамид, о-толуидин, м-толуидин, п-толуидин, о-анизидин, м-анизидин и панизидин.
В одном воплощении изобретения для катализа реакций конъюгации, описанных здесь, используется м-толуидин (также называемый мета- толуидином, м-метиланилином, 3-метиланилином или 3-амино1-метилбензолом). М-толуидин и анилин обладают сходными физическими свойствами и практически одинаковой величиной рКа (м-толуидин: рКа 4,73, анилин: рКа 4,63).
Нуклеофильные катализаторы по изобретению пригодны для оксимного связывания (например, с использование аминоокси-связывания) или образования гидразонов (например, по гидразидной химии). В различных воплощениях изобретения нуклеофильный катализатор вводится в реакцию конъюгации в концентрации 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 мМ. В одном воплощении нуклеофильный катализатор вводится в концентрации 1-10 мМ. В различных воплощениях изобретения интервал рН реакции конъюгации равен 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 и 7,5. В одном воплощении рН лежит в пределах 5,5-6,5.
Очистка конъюгированных белков
В различных воплощениях желательна очистка белка, который был инкубирован с окислителем и/или терапевтического белка, который был конъюгирован с водорастворимым полимером согласно данному раскрытию. В области техники известно множество способов очистки, включая, без ограничений, хроматографические способы, такие как ионообменная хроматография, хроматография гидрофобного взаимодействия, эксклюзионная хроматография и аффинная хроматография или их комбинации, способы фильтрования и способы осаждения (Ошйе ΐο Рго1еш РштйсаЬоп, Ме1Ь. Еп/уто1оду. Уо1. 463 (еШ1еО Ьу Вигде88 КК апй Эеи18сЬег МР), 2'1 еШПоп, ЛсаЬетю Рге88 2 0 09).
Следующие примеры не исчерпывающи, но приведены лишь в качестве приблизительных способов воплощения изобретения.
- 66 025738
Примеры
Пример 1.
Приготовление гомобифункционального сшивающего агента ΝΗ2[ΟΟΗ2ΟΗ2]2ΟΝΗ2. Гомобифункциональный сшивающий агент ΝΗ2[ΟΟΗ2ΟΗ2]2ΟΝΗ2
(3-оксопентан-1,5-диоксиамин), содержащий две активные аминооксигруппы, был синтезирован согласно ВоШгуп е( а1. (Τеΐ^аНей^οп 1997; 53:5485-92) по двухэтапной органической реакции, включающей модифицированную реакцию Габриэля для синтеза первичных аминов (фиг. 3). На первом этапе одна молекула 2,2-хлордиэтилового эфира взаимодействовала с двумя молекулами эндо-Ы-гидрокси-5норборнен-2,3-дикарбоксимида в диметилформамиде (ДМФ). Целевой гомобифункциональный продукт приготавливали из полученного интермедиата путем гидразинолиза к этаноле.
Пример 2.
Приготовление гомобифункционального сшивающего агента ΝΗ2[ΟΟΗ2ΟΗ2]4ΟΝΗ2.
Гомобифункциональный сшивающий агент ΝΗ2[ΟΟΗ2ΟΗ2]4ΟΝΗ2
(3,6,9-триоксоундекан-1,11-диоксиамин), содержащий две активные аминооксигруппы, был синтезирован согласно ВоШгуп е( а1. (Τеί^аНей^οп 1997; 53:5485-92) по двухэтапной органической реакции, включающей модифицированную реакцию Габриэля для синтеза первичных аминов (фиг. 3). На первом этапе одна молекула бис-(2-(2-хлорэтокси)-этилового) эфира взаимодействовала с двумя молекулами эндо-Ы-гидрокси-5-норборнен-2,3-дикарбоксимида в диметилформамиде (ДМФ). Целевой гомобифункциональный продукт приготавливали из полученного интермедиата путем гидразинолиза в этаноле.
Пример 3.
Приготовление гомобифункционального сшивающего агента ΝΗ2[ΟΟΗ2ΟΗ2]6ΟΝΗ2.
Гомобифункциональный сшивающий агент ΝΗ2[ΟΟΗ2ΟΗ2]6ΟΝΗ2
(3,6,9,12,15-пентаоксогептадекан-1,17-диоксиамин), содержащий две активные аминооксигруппы, был синтезирован согласно ВоШгуп е( а1. (ГекаНейгоп 1997; 53:5485-92) по двухэтапной органической реакции, включающей модифицированную реакцию Габриэля для синтеза первичных аминов. На первом этапе одна молекула гексаэтиленгликоля дихлорида взаимодействовала с двумя молекулами эндо-Νгидрокси-5-норборнен-2,3-дикарбоксимида в диметилформамиде (ДМФ). Целевой гомобифункциональный продукт приготавливали из полученного интермедиата путем гидразинолиза в этаноле.
Пример 4.
Детальный синтез реактива аминоокси-ПСК.
3-оксопентан-1,5-диоксиамин был синтезирован согласно ВоЦгуп е( а1. ^екаНейгоп 1997; 53:548592) двухэтапным способом органического синтеза, описанным в примере 1.
Этап 1.
К раствору эндо-Ы-гидрокси-5-норборнен-2, 3-дикарбоксиимида (59,0 г; 1,00 экв.) в 700 мл безводного Ν,Ν-диметилформамида добавили безводный Κ2ί'Ό3, (45,51 г; 1,00 экв.) и 2,2-дихлордиэтиловый эфир (15,84 мл; 0,41 экв.). Реакционную смесь перемешивали 22 ч при 50°С. Смесь была выпарена досуха под пониженным давлением. Остаток был суспендирован в 2 л дихлорметана и экстрагирован дважды насыщенным раствором №С1 в воде (каждый раз по 1 л). Дихлорметановый слой был высушен над №2δΟ4 и выпарен досуха под пониженным давлением, высушен под высоким вакуумом. Было получено 64,5 г желтоватого порошка 3-оксопентан-1,5-диокси-эндо-2',3'-дикарбоксиддимиднорборнена (промежуточный продукт 1).
Этап 2.
К раствору промежуточного продукта 1 (64,25 г; 1,00 экв.) в 800 мл безводного этанола, добавили 31,0 мл гидразингидрата (4,26 экв.). Реакционную смесь кипятили с обратным холодильником 2 ч. Концентрация смеси была увеличена путем упаривания раствора до половины исходного объема под пониженным давлением. Выпавший осадок был отфильтрован. Оставшийся этаноловый слой был выпарен досуха под пониженным давлением. Остаток, содержащий сырой продукт 3-оксопентан-1,5-диоксиамина был высушен в вакууме, было получено 46,3 г продукта. Сырой продукт был далее очищен хроматографией на колонке (силикагель 60; изократическое элюирование смесью дихлорметан-метанол, 9/1), было получено 11,7г чистого конечного продукта 3-оксапентан-1,5-диоксиамина.
Пример 5.
Приготовление аминоокси-ПСК.
1000 мг окисленной ПСК (молекулярный вес 20 кДа), полученной из Института сывороток Индии (Пуна, Индия), были растворены в 16 мл 50 мМ фосфатного буфера с рН 6,0. Затем к реакционной смеси добавили 170 мг 3-оксопентан-1,5-диоксиамина. После встряхивания в течение 2 ч при комнатной температуре, добавили 78,5 мг цианоборогидрида натрия, реакцию оставили на ночь на 18 ч. Затем реакци- 67 025738 онная смесь была подвергнута процедуре ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране из регенерированной целлюлозы (МПИроге) с порогом фильтрации 5 кДа (50 см2, МПИроге).
Пример 6.
Приготовление аминоокси-ПСК с использованием этапа хроматографической очистки.
1290 мг окисленной ПСК (ММ=20 кДа), полученной от Института сывороток Индии (Пуна, Индия), растворили в 25 мл 50 мМ фосфатного буфера с рН 6,0 (Буфер А). Затем к реакционной смеси добавили 209 мг 3-оксопентан-1,5-диоксиамина. После встряхивания в течение 1 ч при комнатной температуре добавили 101 мг натрия цианоборогидрида, реакцию выдержали 3 ч. Затем смесь подвергли этапу слабой анионообменной хроматографии на хроматографическом геле Ргас(оде1 ΕΜΌ ИЕАЕ 650-М (измерения колонки: ХК26/135). Реакционную смесь разбавили 110 мл буфера А и загрузили в колонку ΌΕΑΕ, предварительно уравновешенную буфером А на скорости потока 1 см/мин. Затем колонку промывали 20 ОК буфера В (20 мМ Нерек, рН 6,0) для удаления свободного 3-оксопентан-1,5-диоксиамина и цианида на скорости потока 2 см/мин. Реагент аминоокси-ПСК затем элюировали ступенчатым градиентом, состоящим из 67% буфера В и 43% буфера С (20 мМ Нерек, 1 М №С1, рН 7,5). Элюат концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны 5 кДа из полиэфирсульфона (50 см2, МПИроге). Финальный этап диафильтрации проводили против буфера Ό (20 мМ Нерек, 90 мМ №С1, рН 7,4). Препарат исследовали аналитически путем измерения общей ПСК (анализ с резорцином) и общего содержания аминооксигрупп (анализ ΤΝΒδ) для определения степени модифицирования. Помимо этого, определяли полидисперсность и содержание свободных 3-оксопентан-1,5-диоксиамина и цианида.
Пример 7.
Приготовление аминоокси-ПСК без этапа восстановления.
573 мг окисленной ПСК (ММ=20 кДа), полученной от Института сывороток Индии (Пуна, Индия), растворили в 11,3 мл 50 мМ фосфатного буфера с рН 6,0 (Буфер А). Затем к реакционной смеси добавили 94 мг 3-оксопентан-1,5-диоксиамина. После встряхивания в течение 5 ч при комнатной температуре смесь подвергли этапу слабой анионообменной хроматографии на хроматографическом геле Ргас(оде1 ЕМИ ΌΕΑΕ 650-М (измерения колонки: ХК16/105). Реакционную смесь разбавили 50 мл буфера А и загрузили в колонку ИЕАЕ, предварительно уравновешенную буфером А на скорости потока 1 см/мин. Затем колонку промывали 20 ОК буфера В (20 мМ Нерек, рН 6,0) для удаления свободного 3-оксопентан1.5- диоксиамина и цианида на скорости потока 2 см/мин. Реагент аминоокси-ПСК затем элюировали ступенчатым градиентом, состоящим из 67% буфера В и 43% буфера С (20 мМ Нерек, 1 М №С1, рН 7,5). Элюат концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны 5 кДа из полиэфирсульфона (50 см2, МПИроге). Финальный этап диафильтрации проводили против буфера Ό (20 мМ Нерек, 90 мМ №С1, рН 7,4). Препарат исследовали аналитически путем измерения общей ПСК (анализ с резорцином) и общего содержания аминооксигрупп (анализ ΤΝΒδ) для определения степени модифицирования. Помимо этого, определяли полидисперсность и содержание свободных 3-оксопентан1.5- диоксиамина.
Пример 8.
Приготовление аминоокси-ПСК без этапа восстановления в присутствии нуклеофильного катализатора м-толуидина.
573 мг окисленной ПСК (ММ=20 кДа), полученной от Института сывороток Индии (Пуна, Индия), растворяют в 9 мл 50 мМ фосфатного буфера с рН 6,0 (Буфер А). Затем к этому раствору добавляют 94 мг 3-оксопентан-1,5-диоксиамина. После этого к этой реакционной смеси добавляют 2,3 мл 50 мМ базового раствора м-толуидина. После встряхивания в течение 2 ч при комнатной температуре смесь подвергают этапу слабой анионообменной хроматографии на хроматографическом геле Ргас(оде1 ЕМИ ИЕАЕ 650-М (измерения колонки: ХК16/105). Реакционную смесь разбавляют 50 мл буфера А и загрузили в колонку ИЕАЕ, предварительно уравновешенную буфером А на скорости потока 1 см/мин. Затем колонку промывают 20 ОК буфера В (20 мМ Нерек, рН 6,0) для удаления свободного 3-оксопентан-1,5диоксиамина и цианида на скорости потока 2 см/мин. Реагент аминоокси-ПСК затем элюируют ступенчатым градиентом, состоящим из 67% буфера В и 43% буфера С (20 мМ Нерек, 1 М ИаС1, рН 7,5). Элюат концентрируют ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны 5 кДа из полиэфирсульфона (50 см2, МПИроге). Финальный этап диафильтрации проводят против буфера Ό (20 мМ Нерек, 90 мМ ИаС1, рН 7,4). Препарат исследуют аналитически путем измерения общей ПСК (анализ с резорцином) и общего содержания аминооксигрупп (анализ ΤΝΒδ) для определения степени модифицирования. Помимо этого, определяют полидисперсность и содержание свободного 3-оксопентан-1,5диоксиамина.
Пример 9.
Приготовление реагента аминоокси-ПСК.
Реагент аминоокси-ПСК изготавливался в соответствии с примерами 4-8. После диафильтрации продукт замораживали при -80°С и лиофилизировали. После лиофилизации реагент растворяли в нужном объеме воды и использовали для изготовления конъюгатов ПСК-белок посредством углеводного модифицирования.
- 68 025738
Пример 10.
Оценивание эффективности различных альтернативных нуклеофильных катализаторов.
рф-ΙΧ был инкубирован с натрия периодатом, реагентом аминоокси-ПСК в стандартных условиях (1 мг/мл рф-ΙΧ в 20 мМ Ь-гистидине, 150 мМ №С1, 5 мМ СаС12, рН 6,0, 5-кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК, 100 мкМ №Ю4) с использованием различных нуклеофильных катализаторов (анилина, м-толуидина, о-анизидина, м-анизидина, о-аминобензойной кислоты, м-аминобензойной кислоты, п-аминобензойной кислоты, п-аминобензамида, сульфаниловой кислоты/стандартная концентрация: 10 мМ). Реакцию проводили в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию останавливали в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением водного раствора цистеина с конечной концентрацией 1 мМ.
Эффективность спаривания оценивалась способом δΌδ-РАОЕ с использованием системы Iην^ί^οдеη Χ-сеИ тт. Образцы метились буфером лития додецилсульфата (ΌΌδ) и денатурировались 10 мин при 70°С. Затем образцы наносили на 3-8% гель ΤΚΙδ-ацетат и снимали при 150 В в течение 60 мин. После этого гель прокрашивали Сοοта88^е.
Образцы дополнительно характеризуют аналитически.
Эксклюзионной ВЭЖХ с использованием ВЭЖХ-системы АдЛеп! 1200, оснащенной колонкой δΐιοбех Κ\ν 803 в описанных ранее условиях (ΚοΕιγΚΙι е! а1., ТгапзГизюп 2006; 46:1959-77).
мкл образцов инжектировали неразведенными и элюировали изократически 0,22 мкм фильтрованным раствором 20 мМ NаН2РО4, 50 мМ №ЫО+ рН 6,1 со скоростью потока 0,5 мл/мин. Схему элюирования снимали при 280 нм.
Результаты отражены на фиг. 5А-С и 6 (δΌδ РАОЕ) и в табл. 2 (результаты δΗΟ-ΗΓΕΟ). Продемонстрирован каталитический эффект различных препаратов. Показано, что при использовании м-толуидина достигаются такие же результаты, как и с анилином.
Таблица 2
нуклеофильные катализаторы ди-ПСК- лированный ρφΙΧ моно-ПСК- лированный ρφΙΧ свободный ρφΙΧ
без катализаторов 4,5% 24,9% 70,6%
10 мМ анилин 47,7% 33, 6% 18,7%
10 мМ м-толуидин 31,4% 40,8% 27,8%
10 мМ о-аминобензойная кислота 30,9% 38,5% 30,6%
10 мМ м-аминобензойная кислота 27, 6% 38,0% 34,4%
10 мМ п-аминобензойная кислота 18, 1% 39,3% 42,6%
10 мМ о-аминобензамид 15, 9% 38,4% 45,7%
10 мМ сульфаниловая кислота 11,8% 35, 8% 52,4%
Пример 11.
Полисиалирование рф-ΙΧ с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора.
Способ 1.
12,3 мг рф-ΙΧ растворяли в 6,1 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ №С1, 5 мМ СаС12). Затем добавили 254 мкл водного раствора периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию останавливают в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 6,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов УКазрш 15К 10 кДА для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат (8,8 мл), содержащий окисленный рф-ΙΧ, смешивают с 2,46 мл водного раствора мтолуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавили реактив аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубировали 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
Свободный рф-ΙΧ удаляли при помощи анионообменной хроматографии (АЕС). Реакционную смесь разбавили 15 мл буфера А (50 мМ Нерез, 5 мМ СаС12, рН 7,5) и загружают в 20 мл колонку Н1Ргер ЭРЕ 16/10 (ОЕ Неа1!йсаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером А. Затем колонку элюировали буфером В (50 мМ Нерез, 1 М №С1, 5 мМ СаС12, рН 7,5). Свободный рф-ΙΧ элюируется при проводимости 12-25 мСм/см, а конъюгат - при 27-45 мСм/см. Проводимость конъюгат- 69 025738 содержащих фракций затем поднимали до 190 мСм/см буфером С (50 мМ Нерек, 5 М №С1, 5 мМ СаС12, рН 6,9; и загружали в 20 мл колонку ШРгер Ви1у1 РР 16/10 (ОЕ НеаНЬсате, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером Ό (50 мМ Нерек, 3 М №С1, 5 мМ СаС12, рН 6,9). Свободный аминоокси-ПСК реагент вымывали 5 ОК буфера Ό. Затем конъюгат элюировали 100% буфера Е (50 мМ Нерек, 5 мМ СаС12, рН 7,4). Конъюгат-содержащие фракции концентрировались способом ультрафильтрации/диафильтрации на центрифужном фильтраторе Ущакрш 15К 10 кДа. Конечный этап диафильтрации проводили против гистидинового буфера, рН 7,2, содержащего 150 мМ Ν;·ιΟ и 5 мМ СаС12. Препарат был аналитически исследован измерением общего содержания белка (Брэдфорд) и хромогенной активности Φ-ΙΧ. Конъюгат ПСК-рф-ΙΧ проявлял удельную активность > 50% в сравнении с нативным рф-1Х.
Способ 2.
12.3 мг рф-ΙΧ растворяют в Ь-гистидиновом буфере, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ №С1, 5 мМ СаС12) до конечной концентрации белка в 1 мг рф-1Х/мл. Добавляют 5 мМ водный раствор периодата натрия до конечной концентрации 100 мкМ и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании при рН 6,0, затем реакцию останавливают в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора Ь-цистеина (или иного гасителя) до конечной концентрации 10 мМ. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов УКакрш 15К 10 кДА для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Полученный ретентат (8,8 мл), содержащий окисленный рф-ΙΧ, смешивают с водным раствором мтолуидина (50 мМ) до конечной концентрации 10 мМ и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют при рН 6,0 в течение 2,5 ч при комнатной температуре; от 0,5 до 18 ч при +4°С) в темноте при осторожном перемешивании.
Свободный рф-ΙΧ удаляют при помощи анионообменной хроматографии (АЕС). Реакционную смесь разбавляют достаточными количествами буфера А (50 мМ Нерек, 5 мМ СаС12, рН 7,5) для корректировки проводимости растворов и величины рН перед загрузкой в 20 мл колонку ШРгер ОРР 16/10 (ОЕ НеаЙЬсате, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером А. Затем колонку элюируют буфером В (50 мМ Нерек, 1 М №С1, 5 мМ СаС12, рН 7,5). Свободный рф-ΙΧ элюировали ступенчатым градиентом с использованием 25% буфера В, что дало проводимость в пределах 12-25 мСм/см в полученной фракции, и конъюгат с использованием ступенчатого градиента 50% буфера В, что дало проводимость в пределах 27-45 мСм/см в конъюгатной фракции. Проводимость конъюгат-содержащей фракции затем поднимали до 190 мСм/см буфером С (50 мМ Нерек, 5 М №С1, 5 мМ СаС12, рН 6,9; или с использованием антихаотропических солей, таких, как аммония сульфат, аммония ацетат и т.д.) и загружали в 20 мл колонку ШРгер Ви1у1 РР 16/10 (ОЕ НеаИЬсате, Фэйрфилд, Коннектикут; или в аналогичную среду для гидрофобной хроматографии), предварительно уравновешенную буфером Ό (50 мМ Нерек, 3 М №С1, 5 мМ СаС12, рН 6,9). Свободный аминоокси-ПСК реагент вымывают 5 ОК буфера Ό. Затем конъюгат элюировали 100% буфера Е (50 мМ Нерек, 5 мМ СаС12, рН 7,4). Конъюгат-содержащие фракции концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа, МЛйроте). Конечный этап диафильтрации проводят против Ь-гистидинового буфера, рН 7,2, содержащего 150 мМ Ν;·ιΟ и 5 мМ СаС12. Препарат аналитически исследуют измерением общего содержания белка (процедура Брэдфорд и ВСА) и хромогенной и коагулирующей активностей Ф-ΙΧ. Конъюгат ПСК-рф-ΙΧ проявлял удельную активность > 50% в сравнении с нативным рф-ΙΧ.
Способ 3.
25.4 мг рф-ΙΧ растворяли в 18,7 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ №С1, 5 мМ СаС12). Затем добавили 531 мкл водного раствора периодата натрия (5 мМ) и 5,07 мл водного раствора м-толуидина (50 мМ). Затем добавили реактив аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубировали в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию останавливают в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 25 мкл 1 М водного раствора цистеина.
Свободный рф-ΙΧ удаляли при помощи анионообменной хроматографии (АЕС). Реакционную смесь разбавили 20 мл буфера А (50 мМ Нерек, 5 мМ СаС12, рН 7,5) и загружают в 20 мл колонку ШРгер ОРР 16/10 (ОЕ НеаИЬсате, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером А. Затем колонку элюировали буфером В (50 мМ Нерек, 1 М №С1, 5 мМ СаС12, рН 7,5). Свободный рф-ΙΧ элюировали при проводимости 12-25 мСм/см, а конъюгат - при 27-45 мСм/см. Проводимость конъюгатсодержащих фракций затем поднимали до 190 мСм/см буфером С (50 мМ Нерек, 5 М №С1, 5 мМ СаС12, рН 6,9) и загружали в 20 мл колонку ШРгер Ви1у1 РР 16/10 (ОЕ НеаНЬсате, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером Ό (50 мМ Нерек, 3 М №С1, 5 мМ СаС12, рН 6,9). Свободный аминоокси-ПСК реагент вымывали 5 ОК буфера Ό. Затем конъюгат элюировали 100% буфера Е (50 мМ Нерек, 5 мМ СаС12, рН 7,4). Конъюгат-содержащие фракции концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа, МЛйроте). Конечный этап диафильтрации проводили против
- 70 025738 гистидинового буфера, рН 7,2, содержащего 150 мМ ИаС1 и 5 мМ СаС12. Препарат был аналитически исследован измерением общего содержания белка (Брэдфорд) и хромогенной активности Ф-К. Конъюгат ПСК-рф-К проявлял удельную активность >50% в сравнении с нативным рф-К. Конъюгат дополнительно характеризовали аналитически эксклюзионной ВЭЖХ с использованием ВЭЖХ-системы АдЛеп! 1200, оснащенной колонкой 81юбех К\У 803 в описанных ранее условиях (Ко1аг1сН е! а1., ТгапкГикюп 2006; 46:1959-77). Было показано, что в препарате не содержится свободного Ф-К. Конъюгат состоял из 57% монополисиалированного и 31% ди-полисиалированного и 12% три-полисиалированного продукта.
Способ 4.
25,4 мг рф-К растворяли в Ь-гистидиновом буфере, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ ИаС1, 5 мМ СаС12) до конечной концентрации белка в 2 мг рф-К/мл. После этого в течение 15 мин добавляли 5 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 100 мкМ, затем добавляют 50 мМ водного раствора м-толуидина до получения конечной концентрации в 10 мМ в течение периода времени в 30 мин. Затем добавили реактив аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. После доведения рН до 6,0, смесь инкубировали в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию останавливают в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора Ь-цистеина до конечной концентрации 10 мМ.
Свободный рф-К удаляли при помощи ионообменной хроматографии ЦЕС). Реакционную смесь разбавили достаточными количествами буфера А (50 мМ Нерек, 5 мМ СаС12, рН 7,5) для корректировки проводимости растворов и величины рН перед загрузкой в 20 мл колонку Н!Ргер ОРР 16/10 (СЕ Неа1!1саге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером А. Затем колонку элюировали буфером В (50 мМ Нерек, 1 М ИаС1, 5 мМ СаС12, рН 7,5). Свободный рф-К элюировали ступенчатым градиентом с использованием 25% буфера В, что дало проводимость в пределах 12-25 мСм/см в полученной фракции, и конъюгат с использованием ступенчатого градиента 50% буфера В, что дало проводимость в пределах 27-45 мСм/см в конъюгатной фракции. Проводимость конъюгат-содержащей фракции затем поднимали до 190 мСм/см буфером С (50 мМ Нерек, 5 М ИаС1, 5 мМ СаС12, рН 6,9; с использованием антихаотропических солей, таких, как аммония ацетат) и загружали в 20 мл колонку ШРгер Ви1у1 РР 16/10 (СЕ НеаЛЬсаге, Фэйрфилд, Коннектикут; или в аналогичную среду для гидрофобной хроматографии), предварительно уравновешенную буфером Ό (50 мМ Нерек, 3 М ИаС1, 5 мМ СаС12, рН 6,9). Свободный аминоокси-ПСК реагент вымывали 5 ОК буфера Ό. Затем конъюгат элюировали 100% буфера Е (50 мМ Нерек, 5 мМ СаС12, рН 7,4). Конъюгат-содержащие фракции концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа, МЛЛроге). Конечный этап диафильтрации проводили против Ь-гистидинового буфера, рН 7,2, содержащего 150 мМ ИаС1 и 5 мМ СаС12. Препарат аналитически исследовали измерением общего содержания белка (процедура Брэдфорд и ВСА) и хромогенной и коагулирующей активностей Ф-К. Конъюгат ПСК-рф-К проявлял удельную активность >50% в сравнении с нативным рф-К. Конъюгат дополнительно характеризовали аналитически эксклюзионной ВЭЖХ с использованием ВЭЖХ-системы АдЛеп! 1200, оснащенной колонкой 81юбех К\У 803 в описанных ранее условиях (Ко1аг1сН е! а1., ТгапкГикюп 2006; 46:1959-77). Было показано, что в препарате не содержится свободного Ф-К. Конъюгат состоял из 57% монополисиалированного и 31% диполисиалированного и 12% три-полисиалированного продукта.
Пример 12.
Полисиалирование рф-УШ с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора.
Способ 1.
мг рф-УШ перенесли в реакционный буфер (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавили до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавили ИаЮ4 до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводили при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию остановили цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре. Раствор пропустили через ионообменную колонку с объемом 20 мл (Мегск ЕМО ТМАЕ (М)), которая была уравновешена буфером А (20 мМ Нерек, 5 мМ СаС12, рН 7,0). Колонка была уравновешена 5 ОК буфера А. Затем окисленный рф-УШ был элюирован буфером В (20 мМ Нерек, 5 мМ СаС12, 1 М ИаС1, рН 7,0). Были собраны фракции, содержащие рф-УШ. Было определено содержание белка (Соотакые, Брэдфорд), затем оно было доведено до 1 мг/мл реакционным буфером и доведено до рН 6,0 капельным добавлением 0,5 М НС1. Затем был добавлен 50кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описана выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакция спаривания проводилась в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток реактива аминоокси-ПСК удаляли при помощи гидрофобной хроматографии. Проводимость реакционной смеси поднимали до 130 мСм/см добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9) и загружали в колонку, заполненную 80 мл Р1епу1 ЗерЬагоке РР (СЕ НеаЫсаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предвари- 71 025738 тельно уравновешенную 50 мМ Нерек, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9. Затем конъюгат элюировали 50 мМ буфером Нерек с рН 7,5, содержащего 5 мМ СаС12. Наконец, собирали фракции, содержащие ПСК-рф-УШ и подвергали ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) на 30 кДа мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, МПНроге). Препарат был аналитически исследован измерением общего содержания белка (Соотакые, Брэдфорд) и хромогенной активности Ф-УШ. Конъюгат ПСК-рф-УШ проявлял удельную активность >70% в сравнении с нативным рф-УШ.
Способ 2.
мг рекомбинантного фактора УШ (рф-УШ), полученного при процессе АЭУАТЕ в буфере Нерек (50 мМ НЕРЕ8, ~350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 0,1% Полисорбата 80, рН 7,4) растворяют в реакционном буфере (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректировали до 6,0 капельным добавлением 0,5н. водного раствора НС1. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30±5 мин при температуре (Т) Т=+22±2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора Ь-цистеина (1 М) в течение 15 мин при Т=+22±2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60±5 мин.
Окисленный рф-УШ далее очищают анионообменной хроматографией на ЕМЭ ТМАЕ (М) (Мегск). Смесь разбавляют буфером А (20 мМ Нерек, 5 мМ СаС12, рН 6,5) до получения проводимости 5 мсм/см. Полученный раствор загружают в ионообменную колонку (высота слоя: 5,4 см) с объемом колонки 10 мл с использованием скорости потока 1,5 см/мин. Колонку впоследствии промывают (скорость потока: 1,5 см/мин) 5 ОК смеси 92:8 (м/м) буфера А и буфера В (20 мМ Нерек, 5 мМ СаС12, 1,0 М ЫаС1, рН 7,0). Затем окисленный рф-УШ элюируют смесью 50:50 (м/м) буфера А и буфера В с постэлюировочным этапом в 5 ОК буфера В. Этапы элюирования проводят со скоростью потока 1,0 см/мин.
После этого реактив аминооксиполисиаловой кислоты (ПСК-ОЫН2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный рф-УШ в течение максимального периода времени (ΐ) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120±10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПСК-рф-УШ очищают гидрофобной хроматографией (Н1С) с использованием смолы Ркепу1 8еркагоке РР 1о\у киЬ гекш (ОЕ НеаНксаге), заполненной в колонку производства ОЕ НеаНксаге с высотой слоя (к) 15 см и итоговым объемом колонки (ОК) 81 мл.
В реакционную смесь добавляют аммония ацетат добавлением 50 мМ буфера Нерек, содержащего 350 мМ натрия хлорида, 8 М аммония ацетата, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9. Два объема реакционной смеси смешивают с 1 объемом аммония ацетата, содержащего буферную систему, величину рН доводят до рН 6,9 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора ЫаОН. Данную смесь загружают в Н1С колонку со скоростью потока 1 см/мин, после чего выполняют этап отмывания с использованием >3 ОК уравновешивающего буфера (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 2,5 М аммония ацетата, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9).
Для удаления побочных продуктов реакции и антихаотропической соли выполняют второй этап отмывания с > 5 ОК отмывочного буфера 1 (50 мМ Нерек, 3 М натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН
6,9) в режиме восходящего потока со скоростью потока 2 см/мин. Затем выполняют элюирование очищенного конъюгата ПСК-рф-УШ в нисходящем режиме со ступенчатым градиентом 40% отмывочного буфера 2 (50 мМ Нерек, 1,5 М натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9) и 60% элюирующего буфера. (20 мМ Нерек, 5 мМ кальция хлорида, рН 7,5) со скоростью потока 1 см/мин. Элюирование конъюгата ПСК-рф-УШ отслеживают на УФ 280 нм и элюат, содержащий конъюгат, собирают в пределах < 4 ОК. Пост-элюировочный этап проводят с > 3 ОК элюирующего буфера в тех же условиях для отделения мало прореагировавшего и/или ^модифицированного рф-УШ от основного продукта.
Наконец, очищенный конъюгат концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с отсечением молекулярной массы в 30 кДа (88 см2, МПНроге).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывали путем измерения общего содержания белка, хромогенной активности Ф-УШ и определяли степени полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином). Для полученного конъюгата были определены удельная активность > 50% и степень ПСК > 5,0.
Способ 3.
мг рф-УШ перенесли в реакционный буфер (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавили до получения концентрации белка 1 мг/мл. Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описана выше), после чего был добавлен мтолуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и ЫаЮ4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакция спаривания проводилась в течение 2 ч в темноте при комнатной тем- 72 025738 пературе и при осторожном встряхивании. Затем реакцию остановили цистеином в течение 60 мин при комнатной температуре (конечная концентрация: 10 мМ). Затем проводимость реакционной смеси поднимали до 130 мСм/см добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9) и загружали в колонку, заполненную 80 мл Ркепу1 8еркагоке РР (СЕ Неакксаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Нерек, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 0,01% Твин-80, рН 6,9. Затем конъюгат элюировали 50 мМ Нерек, 5 мМ кальция хлорида, рН 7,5. Наконец, собирали фракции, содержащие ПСК-рф-νΐΙΙ и подвергали ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) на 30 кДа мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, МПНроге). Препарат был аналитически исследован измерением общего содержания белка (Брэдфорд) и хромогенной активности Ф-νΐΙΙ. Конъюгат ПСК-рф-νΐΙΙ проявлял удельную активность >70% в сравнении с нативным рф-νΐΙΙ.
Способ 4.
мг рекомбинантного фактора νΙΙΙ (рф-νΙΙΙ), полученного при процессе АЭУЛТЕ в 50 мМ буфере Нерек (50 мМ НЕРЕ8, ~350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 0,1% Полисорбата 80, рН 7,4) растворяли в реакционном буфере (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректировали до 6,0 капельным добавлением 0,5н. водного раствора НС1.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ОМН2) в 50-кратном молярном избытке добавляли к этому раствору рф-νΙΙΙ в течение максимального периода времени (ΐ) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляли водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Наконец добавляли 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 400 мкМ.
Реакционную смесь инкубировали 120±10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С при осторожном встряхивании.
Затем реакцию останавливали добавлением водного раствора Ь-цистеина (1 М) до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубировали 60±5 мин.
Полученный конъюгат ПСК-рф-УШ очищали гидрофобной хроматографией (ШС) с использованием смолы Ркепу1 8еркагоке РР 1о\у киЬ гекш (СЕ Неакксаге), заполненной в колонку производства СЕ Неакксаге с высотой слоя (к) 15 см и итоговым объемом колонки (ОК) 81 мл.
В реакционную смесь вносили аммония ацетат добавлением 50 мМ буфера Нерек, содержащего 350 мМ натрия хлорида, 8 М аммония ацетата, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9. Два объема реакционной смеси смешивали с 1 объемом аммония ацетата, содержащего буферную систему, величину рН доводили до рН
6,9 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора ЫаОН. Данную смесь загружали в ШС колонку со скоростью потока 1 см/мин, после чего выполняли этап отмывания с использованием >3 ОК уравновешивающего буфера (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 2,5 М аммония ацетата, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9).
Для удаления побочных продуктов реакции и антихаотропической соли выполняли второй этап отмывания с >5 ОК отмывочного буфера 1 (50 мМ Нерек, 3 М натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН
6,9) в режиме восходящего потока со скоростью потока 2 см/мин. Затем выполняли элюирование очищенного конъюгата рф-νΙΙΙ в нисходящем режиме со ступенчатым градиентом 40% отмывочного буфера 2 (50 мМ Нерек, 1,5 М натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9) и 60% элюирующего буфера (20 мМ Нерек, 5 мМ кальция хлорида, рН 7,5) со скоростью потока 1 см/мин. Элюирование конъюгата ПСКрф-νΙΙΙ отслеживали на УФ 280 нм и элюат, содержащий конъюгат, собирали в пределах < 4 ОК. Постэлюировочный этап проводили с >3 ОК элюирующего буфера в тех же условиях для отделения мало прореагировавшего и/или немодифицированного рф-νΙΙΙ от основного продукта.
Наконец, очищенный конъюгат концентрировали ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с отсечением молекулярной массы в 30 кДа (88 см2, МПНроге).
Конъюгаты, приготовленные по этой процедуре, аналитически охарактеризовывали путем измерения общего содержания белка, хромогенной активности Ф-νΙΙΙ и определяли степени полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Аналитические данные (среднее 6 последовательных серий):
Выход процесса (ВгаПТогб): 58,9%;
Выход процесса (хром. Ф-νΙΙΙ): 46,4%;
Удельная активность (хром. Ф-УШ/мг белка): 4148 МЕ/мг;
Удельная активность (% исходного материала): 79,9%;
Степень ПСК (моль/моль): 8,1.
- 73 025738
Пример 13.
Пегилирование рф-УШ с использованием реактива аминоокси-ПЭГ и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора.
Способ 1.
рф-УШ пегилируют с использованием линейного 20. кДа реактива для пегилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит 8ипЬп§Ы® СА серий от ΝΟΡ (ΝΟΡ Согр., Токио, Япония). 14,7 мг рф-УШ растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ ЫаС1, 5 мМ СаС12). Затем добавляют 296 мкл водного раствора периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию останавливают в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Ущакрш 15К 10 кДА для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат (10,9 мл), содержащий окисленный рф-УШ смешивают с 2,94 мл водного раствора мтолуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-рф-УШ очищают ионообменной хроматографией на О 8еркагоке РР. 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, уравновешенную 50 мМ буфером Нерек, рН 7,4 содержащим 5 мМ СаС12. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Нерек, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны 30 кДа (50 см2, МИБроге). Препарат аналитически исследуют измерением общего содержания белка (Соотак81е, Брэдфорд) и хромогенной активности Ф-УШ, ожидается, что конъюгат ПЭГ -рф-УШ будет обладать удельной активностью >70% относительно нативного рф-УШ.
Способ 2.
рф-УШ пегилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для пегилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит 8ипЬп§Ы® СА серий от ΝΟΡ (ΝΟΡ Согр., Токио, Япония). Начальную массу или концентрацию рф-УШ растворяют или переносят в реакционный буфер (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректировали до 6,0 капельным добавлением 0,5н. водного раствора НС1. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30±5 мин при температуре (Т) Т=+22±2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора Ь-цистеина (1 М) в течение 15 мин при Т=+22±2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60±5 мин.
Окисленный рф-УШ далее очищают анионообменной хроматографией на ΕΜΌ ТМАЕ (М) (Мегск). Смесь разбавляют буфером А (20 мМ Нерек, 5 мМ СаС12, рН 6,5) до получения проводимости 5 мсм/см. Полученный раствор загружают в ионообменную колонку (высота слоя: 5,4 см) с объемом колонки 10 мл с использованием скорости потока 1,5 см/мин. Колонку впоследствии промывают (скорость потока: 1,5 см/мин) 5 ОК смеси 92:8 (м/м) буфера А и буфера В (20 мМ Нерек, 5 мМ СаС12, 1,0 М №С1, рН 7,0). Затем окисленный рф-УШ элюируют смесью 50:50 (м/м) буфера А и буфера В с постэлюировочным этапом в 5 ОК буфера В. Этапы элюирования проводят со скоростью потока 1,0 см/мин.
После этого реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный рф-УШ в течение максимального периода времени (ΐ) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120±10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПЭГ -рф-УШ очищают гидрофобной хроматографией (ШС) с использованием смолы РНепу1 8еркагоке РР 1о\у киЬ гекш (ОЕ НеаИНсаге), заполненной в колонку производства ОЕ НеаНЪсаге с высотой слоя (к) 15 см и итоговым объемом колонки (ОК) 81 мл.
В реакционную смесь вносят аммония ацетат добавлением 50 мМ буфера Нерек, содержащего 350 мМ натрия хлорида, 8 М аммония ацетата, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9. Два объема реакционной смеси смешивают с 1 объемом аммония ацетата, содержащего буферную систему, величину рН доводят до рН
6,9 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора №ЮН. Данную смесь загружают в ШС колонку со скоростью потока 1 см/мин, после чего выполняют этап отмывания с использованием >3 ОК уравновешивающего буфера (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 2,5 М аммония ацетата, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9).
Для удаления побочных продуктов реакции и антихаотропической соли выполняют второй этап отмывания с >5 ОК отмывочного буфера 1 (50 мМ Нерек, 3 М натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН
6,9) в режиме восходящего потока со скоростью потока 2 см/мин. Затем выполняют элюирование очищенного конъюгата рф-УШ в нисходящем режиме со ступенчатым градиентом 40% отмывочного буфера 2 (50 мМ Нерек, 1,5 М натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9) и 60% элюирующего буфера (20
- 74 025738 мМ Нере8, 5 мМ кальция хлорида, рН 7,5) со скоростью потока 1 см/мин. Элюирование конъюгата ПЭГ рф-УШ отслеживают на УФ 280 нм и элюат, содержащий конъюгат, собирают в пределах < 4 ОК. Постэлюировочный этап проводят с >3 ОК элюирующего буфера в тех же условиях для отделения мало прореагировавшего и/или немодифицированного рф-УШ от основного продукта.
Наконец, очищенный конъюгат концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с отсечением молекулярной массы в 30 кДа (Мййроге).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
Способ 3.
рф-УШ пегилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для пегилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит БипЬйдЫ® СА серий от ΝΟΡ (ΝΟΡ Согр., Токио, Япония). 7,84 мг рф-УШ, растворенного в б мл буфера Нере8 (50 мМ Нере8, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) смешивают с 314 мкл водного раствора периодата натрия (10 мМ) и 1,57 мл водного раствора м-толуидина (50 мМ). Затем добавляют аминоокси-реактив до достижения 20кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию останавливают в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл 1 М водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-рф-УШ очищают ионообменной хроматографией на 0-§ерЬаго8е ΡΡ. 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, предварительно уравновешенную 50 мМ буфером Нере8, рН 7,4 содержащим 5 мМ СаС12. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Нере8, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны 30 кДа (88 см2, Мййроге). Аналитическая характеризация конъюгата путем определения хромогенной активности Ф-УШ и определения общего содержания белка (Брэдфорд) показала удельную активность в >60% в сравнении с исходным материалом рф-УШ.
Способ 4.
рф-УШ пегилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для пегилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит БипЬйдЫ® СА серий от ΝΟΡ (ΝΟΡ Согр., Токио, Япония). Начальную концентрацию или массу рф-У111 переносят или растворяют в буфере Нере8 (50 мМ Нере8, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 2 мг рф-УШ/мл. После этого в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор натрия периодата до конечной концентрации 100 мкМ, затем добавляют 50 мМ водного раствора м-толуидина до получения конечной концентрации в 10 мМ в течение периода времени в 30 мин. Затем добавляют реактив аминооксиПЭГ с ММ 20 кДа (описанный выше) до достижения 20-кратного молярного избытка. После доведения рН до 6,0, смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию останавливают в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора Ь-цистеина до конечной концентрации 10 мМ.
Свободный рф-УШ удаляют при помощи ионообменной хроматографии (1ЕС). Реакционную смесь разбавили достаточными количествами буфера А (50 мМ Нере8, 5 мМ СаС12, рН 7,5) для корректировки проводимости растворов и величины рН перед загрузкой в 20 мл колонку ШРгер ΟΡΡ 16/10 (ОЕ НеаЙЬсаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером А. Затем колонку элюировали буфером В (50 мМ Нере8, 1 М №С1, 5 мМ СаС12, рН 7,5). Свободный рф-УШ элюировали ступенчатым градиентом с использованием 25% буфера В, что дало проводимость в пределах 12-25 мСм/см в полученной фракции, и конъюгат с использованием ступенчатого градиента 50% буфера В, что дало проводимость в пределах 27-45 мСм/см в конъюгатной фракции. Проводимость конъюгат-содержащей фракции затем поднимали буфером С (50 мМ Нере8, 5 М №С1, 5 мМ СаС12, рН 6,9; с использованием антихаотропических солей, таких, как аммония ацетат, аммония сульфат и т.д.) и загружали в 20 мл колонку ШРгер Ви1у1 ΡΡ 16/10 (ОЕ НеаЙЬсаге, Фэйрфилд, Коннектикут; или в аналогичную среду для гидрофобной хроматографии), предварительно уравновешенную буфером Ό (50 мМ Нере8, 3 М №С1, 5 мМ СаС12, рН 6,9). Свободный ПЭГ-реагент вымывали 5 ОК буфера Ό. Затем конъюгат элюировали 100% буфера Е (50 мМ Нере8, 5 мМ СаС12, рН 7,4). Конъюгат-содержащие фракции концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа, Мййроге). Конечный этап диафильтрации проводили против буфера Нере8 (50 мМ Нере8, 5 мМ СаС12, рН 7,5).
Препарат аналитически исследуют измерением общего содержания белка (процедура Брэдфорд и ВСА) и биологической активности по известным способам.
- 75 025738
Пример 14.
Полисиалирование рф-УНа с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора.
Способ 1.
Начальную концентрацию или массу рекомбинантного фактора У11а (рф-У11а) переносят или растворяют в реакционном буфере (50 мМ Иерее, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора Ν;·ιΟΗ. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 50 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30±5 мин при температуре (Т) Т=+22±2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора Ь-цистеина (I М) в течение 15 мин при Т=+22±2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60±5 мин.
Окисленный рф-У11а далее очищают анионообменной хроматографией на ЕМИ ТМАЕ (М) (Мегск). Смесь разбавляют буфером А (20 мМ Иерее, 5 мМ СаС12, рН 6,5) до получения проводимости 5 мсм/см. Полученный раствор загружают в ионообменную колонку (высота слоя: 5,4 см) с объемом колонки 10 мл с использованием скорости потока 1,5 см/мин. Колонку впоследствии промывают (скорость потока: 1,5 см/мин) 5 ОК смеси 92:8 (м/м) буфера А и буфера В (20 мМ Нерее, 5 мМ СаС12, 1,0 М №С1, рН 7,0). Затем окисленный рф-У11а элюируют смесью 50:50 (м/м) буфера А и буфера В с постэлюировочным этапом в 5 ОК буфера В. Этапы элюирования проводят со скоростью потока 1,0 см/мин.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ОИН2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный рф-У11а в течение максимального периода времени (1) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор мтолуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120±10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПСК-рф-У11а очищают гидрофобной хроматографией (Н1С) с использованием смолы Рйепу1 Зерйагоее РР 1ο\ν еиЬ гееш (СЕ НеаИйсаге), заполненной в колонку производства СЕ Неа11йсаге с высотой слоя (й) 15 см и итоговым объемом колонки (ОК) 81 мл.
В реакционную смесь добавляют аммония ацетат добавлением 50 мМ буфера Нерее, содержащего 350 мМ натрия хлорида, 8 М аммония ацетата, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9. Два объема реакционной смеси смешивают с 1 объемом аммония ацетата, содержащего буферную систему, величину рН доводят до рН 6,9 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора №ЮН. Данную смесь загружают в Н1С колонку со скоростью потока 1 см/мин, после чего выполняют этап отмывания с использованием >3 ОК уравновешивающего буфера (50 мМ Нерее, 350 мМ натрия хлорида, 2,5 М аммония ацетата, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9).
Для удаления побочных продуктов реакции и антихаотропической соли выполняют второй этап отмывания с >5 ОК отмывочного буфера 1 (50 мМ Нерее, 3 М натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН
6,9) в режиме восходящего потока со скоростью потока 2 см/мин. Затем выполняют элюирование очищенного конъюгата рф-У11а в нисходящем режиме со ступенчатым градиентом 40% отмывочного буфера 2 (50 мМ Нерее, 1,5 М натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9) и 60% элюирующего буфера (20 мМ Нерее, 5 мМ кальция хлорида, рН 7,5) со скоростью потока 1 см/мин. Элюирование конъюгата ПСКрф-У11а отслеживают на УФ 280 нм и элюат, содержащий конъюгат, собирают в пределах < 4 ОК. Постэлюировочный этап проводят с >3 ОК элюирующего буфера в тех же условиях для отделения мало прореагировавшего и/или ^модифицированного рф-У11а от основного продукта.
Наконец, очищенный конъюгат концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы (например, 10 кДа МХУС’О. 88 см2, Мййроге).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Способ 2.
Начальную массу или концентрацию рф-У11а растворяют или переносят в реакционный буфер (50 мМ Нерее, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора №ЮН.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ОИН2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к этому раствору рф-У11а в течение максимального периода времени (1) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Наконец добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 150 мкМ.
Реакционную смесь инкубируют 120±10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С при осторожном встряхивании. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора Ь-цистеина (1 М)
- 76 025738 до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубировали 60±5 мин.
Полученный конъюгат ПСК-рф-УНа очищают гидрофобной хроматографией (ШС) с использованием смолы РЬепу1 8ерЬагоке ΕΕ 1о\у киЬ гекш (СЕ НеаЪЬсаге), заполненной в колонку производства СЕ НеаИЬсаге с высотой слоя (Н) 15 см и итоговым объемом колонки (ОК) 81 мл.
В реакционную смесь вносят аммония ацетат добавлением 50 мМ буфера Нерек, содержащего 350 мМ натрия хлорида, 8 М аммония ацетата, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9. Два объема реакционной смеси смешивают с 1 объемом аммония ацетата, содержащего буферную систему, величину рН доводят до рН
6,9 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора №ОН. Данную смесь загружают в ШС колонку со скоростью потока 1 см/мин, после чего выполняют этап отмывания с использованием >3 ОК уравновешивающего буфера (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 2,5 М аммония ацетата, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9).
Для удаления побочных продуктов реакции и антихаотропической соли выполняют второй этап отмывания с >5 ОК отмывочного буфера 1 (50 мМ Нерек, 3 М натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН
6,9) в режиме восходящего потока со скоростью потока 2 см/мин. Затем выполняют элюирование очищенного конъюгата рф-УНа в нисходящем режиме со ступенчатым градиентом 40% отмывочного буфера 2 (50 мМ Нерек, 1,5 М натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9) и 60% элюирующего буфера (20 мМ Нерек, 5 мМ кальция хлорида, рН 7,5) со скоростью потока 1 см/мин. Элюирование конъюгата ПСКрф-УНа отслеживают на УФ 280 нм и элюат, содержащий конъюгат собирали в пределах < 4 ОК. Постэлюировочный этап проводят с > 3 ОК элюирующего буфера в тех же условиях для отделения мало прореагировавшего и/или немодифицированного рф-УШ от основного продукта.
Наконец, очищенный конъюгат концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы (МЬЬроге).
Конъюгаты, приготовленные по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Пример 15.
Пегилирование рф-К с использованием реактива аминоокси-ПЭГ и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора.
Способ 1.
рф-К пегилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для пегилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит 8ипЬг1§Ь!® СА серий от NΟΕ ^ОР Согр., Токио, Япония). Начальную массу или концентрацию рф-К растворяют или переносят в реакционный буфер (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректировали до 6,0 капельным добавлением 0,5н. водного раствора НС1. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30±5 мин при температуре (Т) Т=+22±2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора Ь-цистеина (1 М) в течение 15 мин при Т=+22±2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60±5 мин.
Окисленный рф-УШ далее очищают анионообменной хроматографией на ЕМЭ ΤΜАЕ (М) (Мегск). Смесь разбавляют буфером А (20 мМ Нерек, 5 мМ СаС12, рН 6,5) до получения проводимости 5 мСм/см. Полученный раствор загружают в ионообменную колонку (высота слоя: 5,4 см) с объемом колонки 10 мл с использованием скорости потока 1,5 см/мин. Колонку впоследствии промывают (скорость потока: 1,5 см/мин) 5 ОК смеси 92:8 (м/м) буфера А и буфера В (20 мМ Нерек, 5 мМ СаС12, 1,0 М №С1, рН 7,0). Затем окисленный рф-К элюируют смесью 50:50 (м/м) буфера А и буфера В с постэлюировочным этапом в 5 ОК буфера В. Этапы элюирования проводят со скоростью потока 1,0 см/мин.
После этого реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный рф-К в течение максимального периода времени (!) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120±10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПЭГ -рф-К очищают гидрофобной хроматографией (ШС) с использованием смолы РЬепу1 8ерЬагоке ΕΕ 1о\у киЬ гекш (СЕ НеаИЬсаге), заполненной в колонку производства СЕ Неа1!Ьсаге с высотой слоя (Ь) 15 см и итоговым объемом колонки (ОК) 81 мл.
В реакционную смесь вносят аммония ацетат добавлением 50 мМ буфера Нерек, содержащего 350 мМ натрия хлорида, 8 М аммония ацетата, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9. Два объема реакционной смеси смешивают с 1 объемом аммония ацетата, содержащего буферную систему, величину рН доводят до рН
6,9 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора №ЮН. Данную смесь загружают в ШС колонку со скоростью потока 1 см/мин, после чего выполняют этап отмывания с использованием >3 ОК уравновешивающего буфера (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 2,5 М аммония ацетата, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9).
- 77 025738
Для удаления побочных продуктов реакции и антихаотропической соли выполняют второй этап отмывания с >5 ОК отмывочного буфера 1 (50 мМ Нерек, 3 М натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН
6,9) в режиме восходящего потока со скоростью потока 2 см/мин. Затем выполняют элюирование очищенного конъюгата рф-БХ в нисходящем режиме со ступенчатым градиентом 40% отмывочного буфера 2 (50 мМ Нерек, 1,5 М натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9) и 60% элюирующего буфера (20 мМ Нерек, 5 мМ кальция хлорида, рН 7,5) со скоростью потока 1 см/мин. Элюирование конъюгата ПЭГ -рфIX отслеживают на УФ 280 нм и элюат, содержащий конъюгат собирают в пределах < 4 ОК. Постэлюировочный этап проводят с >3 ОК элюирующего буфера в тех же условиях для отделения мало прореагировавшего и/или немодифицированного рф-БХ от основного продукта.
Наконец, очищенный конъюгат концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с отсечением молекулярной массы в 10 кДа (88 см2, МПНроге).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
Способ 2.
рф-БХ пегилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для пегилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит §ипЬП§Ы® СА серий от ΝΟΡ (ΝΟΡ Согр., Токио, Япония). Начальную концентрацию или массу рфЯХ переносят или растворяют в буфере Нерек (50 мМ Нерек, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 2 мг рф-БХ/мл. После этого в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор натрия периодата до конечной концентрации 100 мкМ, затем добавляют 50 мМ водного раствора м-толуидина до получения конечной концентрации в 10 мМ в течение периода времени в 30 мин. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описанный выше) до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. После доведения рН до 6,0, смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию останавливают в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора Ь-цистеина до конечной концентрации 10 мМ.
Свободный рф-БХ удаляют при помощи ионообменной хроматографии (!ЕС). Реакционную смесь разбавили достаточными количествами буфера А (50 мМ Нерек, 5 мМ СаС12, рН 7,5) для корректировки проводимости растворов и величины рН перед загрузкой в 20 мл колонку Н1Ргер ΟΡΡ 16/10 (ОЕ НеаИЬсаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером А. Затем колонку элюировали буфером В (50 мМ Нерек, 1 М №С1, 5 мМ СаС12, рН 7,5). Свободный рф-РХ элюировали ступенчатым градиентом с использованием 25% буфера В, что дало проводимость в пределах 12-25 мСм/см в полученной фракции, и конъюгат с использованием ступенчатого градиента 50% буфера В, что дало проводимость в пределах 27-45 мСм/см в конъюгатной фракции. Проводимость конъюгат-содержащей фракции затем поднимали буфером С (50 мМ Нерек, 5 М №С1, 5 мМ СаС12, рН 6,9; с использованием антихаотропических солей, таких, как аммония ацетат и т.д.) и загружали в 20 мл колонку ШРгер Ви1у1 ΡΡ 16/10 (ОЕ НеаНЬсаге, Фэйрфилд, Коннектикут; или в аналогичную среду для гидрофобной хроматографии), предварительно уравновешенную буфером Ό (50 мМ Нерек, 3 М №С1, 5 мМ СаС12, рН 6,9). Свободный аминоокси-ПЭГ реагент вымывали 5 ОК буфера Ό. Затем конъюгат элюировали 100% буфера Е (50 мМ Нерек, 5 мМ СаС12, рН 7,4). Конъюгат-содержащие фракции концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа, МБШроге). Конечный этап диафильтрации проводили против буфера Нерек (50 мМ Нерек, 5 мМ СаС12, рН 7,5).
Препарат аналитически исследуют измерением общего содержания белка (процедура Брэдфорд и ВСА) и биологической активности по известным способам.
Пример 16.
Пегилирование рф-УПа с использованием реактива аминоокси-ПЭГ и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора.
Способ 1.
рф-УПа пегилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для пегилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит §ипЬП§Ы® СА серий от ΝΟΡ (ΝΟΡ Согр., Токио, Япония). Начальную массу или концентрацию рф-УПа растворяют или переносят в реакционный буфер (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора №ЮН. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 50 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30±5 мин при температуре (Т) Т=+22±2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора Ь-цистеина (1 М) в течение 15 мин при Т=+22±2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60±5 мин.
Окисленный рф-УПа далее очищают анионообменной хроматографией на ΕΜΌ ΤΜΑΕ (М) (Мегск). Смесь разбавляют буфером А (20 мМ Нерек, 5 мМ СаС12, рН 6,5) до получения проводимости 5 мСм/см.
- 78 025738
Полученный раствор загружают в ионообменную колонку (высота слоя: 5,4 см) с объемом колонки 10 мл с использованием скорости потока 1,5 см/мин. Колонку впоследствии промывают (скорость: 1,5 см/мин) 5 ОК смеси 92:8 (м/м) буфера А и буфера В (20 мМ Нерек, 5 мМ СаС12, 1,0 М ЛаС1, рН 7,0). Затем окисленный рф-УПа элюируют смесью 50:50 (м/м) буфера А и буфера В с постэлюировочным этапом в 5 ОК буфера В. Этапы элюирования проводят со скоростью потока 1,0 см/мин.
После этого реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный рф-УПа в течение максимального периода времени (ΐ) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120±10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПЭГ -рф-УПа очищают гидрофобной хроматографией (НЮ) с использованием смолы РНепу1 δеρЬа^οке РР 1ο\ν киЬ гекш (ОЕ НеаННсаге), заполненной в колонку производства ОЕ НеаННсаге с высотой слоя (И) 15 см и итоговым объемом колонки (ОК) 81 мл.
В реакционную смесь вносят аммония ацетат добавлением 50 мМ буфера Нерек, содержащего 350 мМ натрия хлорида, 8 М аммония ацетата, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9. Два объема реакционной смеси смешивают с 1 объемом аммония ацетата, содержащего буферную систему, величину рН доводят до рН
6,9 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора ЛаОН. Данную смесь загружают в НЮ колонку со скоростью потока 1 см/мин, после чего выполняют этап отмывания с использованием > 3 ОК уравновешивающего буфера (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 2,5 М аммония ацетата, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9).
Для удаления побочных продуктов реакции и антихаотропической соли выполняют второй этап отмывания с > 5 ОК отмывочного буфера 1 (50 мМ Нерек, 3 М натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН
6,9) в режиме восходящего потока со скоростью потока 2 см/мин. Затем выполняют элюирование очищенного конъюгата рф-УПа в нисходящем режиме со ступенчатым градиентом 40% отмывочного буфера 2 (50 мМ Нерек, 1,5 М натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9) и 60% элюирующего буфера (20 мМ Нерек, 5 мМ кальция хлорида, рН 7,5) со скоростью потока 1 см/мин. Элюирование конъюгата ПЭГ рф-УПа отслеживают на УФ 280 нм и элюат, содержащий конъюгат, собирают в пределах < 4 ОК. Постэлюировочный этап проводят с > 3 ОК элюирующего буфера в тех же условиях для отделения мало прореагировавшего и/или ^модифицированного рф-УПа от основного продукта.
Наконец, очищенный конъюгат концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с отсечением молекулярной массы в 10 кДа (МйНроге).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
Способ 2.
рф-УПа пегилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для пегилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит δικΛπ^Ηΐ® СА серий от ЛОР (ЛОР Согр., Токио, Япония). Начальную концентрацию или массу рф-УПа переносят или растворяют в буфере Нерек (50 мМ Нерек, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 2 мг рф-УПа/мл. После этого в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 100 мкМ, затем добавляют 50 мМ водного раствора м-толуидина до получения конечной концентрации в 10 мМ в течение периода времени в 30 мин. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описанный выше) до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. После доведения рН до 6,0, смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию останавливают в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора Ь-цистеина до конечной концентрации 10 мМ.
Свободный рф-УПа удаляют при помощи ионообменной хроматографии ПЕС). Реакционную смесь разбавили достаточными количествами буфера А (50 мМ Нерек, 5 мМ СаС12, рН 7,5) для корректировки проводимости растворов и величины рН перед загрузкой в 20 мл колонку Н1Ргер ОРР 16/10 (ОЕ НеаННсаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером А. Затем колонку элюировали буфером В (50 мМ Нерек, 1 М ЛаС1, 5 мМ СаС12, рН 7,5). Свободный рф-УПа элюировали ступенчатым градиентом с использованием 25% буфера В, что дало проводимость в пределах 12-25 мСм/см в полученной фракции, и конъюгат с использованием ступенчатого градиента 50% буфера В, что дало проводимость в пределах 27-45 мСм/см в конъюгатной фракции. Проводимость конъюгат-содержащей фракции затем поднимали буфером С (50 мМ Нерек, 5 М ЛаС1, 5 мМ СаС12, рН 6,9; с использованием антихаотропических солей, таких, как аммония ацетат) и загружали в 20 мл колонку ШРгер ВШу1 РР 16/10 (ОЕ НеаННсаге, Фэйрфилд, Коннектикут; или в аналогичную среду для гидрофобной хроматографии), предварительно уравновешенную буфером Ό (50 мМ Нерек, 3 М ЛаС1, 5 мМ СаС12, рН 6,9). Свободный ПЭГ-реагент вымывали 5 ОК буфера Ό. Затем конъюгат элюировали 100% буфера Е (50 мМ Нерек, 5 мМ СаС12, рН 7,4). Конъюгат-содержащие фракции концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией
- 79 025738 (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа, МЛНроге). Конечный этап диафильтрации проводили против буфера №ре8 (50 мМ Шре8, 5 мМ СаС12, рН 7, 5).
Препарат аналитически исследуют измерением общего содержания белка (процедура Брэдфорд и ВСА) и биологической активности по известным способам.
Пример 17.
Полисиалирование рф-ΙΧ в присутствии о-аминобензойной кислоты.
Способ 1.
8,2 мг рф-ΙΧ растворяют в 4,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ №С1, 5 мМ СаС12). Затем добавляют 82 мкл водного раствора периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию останавливают в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 4 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов У1уа8рш 6 10 кДа для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат (6,5 мл), содержащий окисленный рф-ΙΧ, смешивают с 1,-64 мл водного раствора оаминобензойной кислоты (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
Дальнейшую очистку конъюгата производят так, как описано здесь.
Способ 2.
Был приготовлен раствор 1 мг рф-ΙΧ в 0,65 мл натрийфосфатного буфера, рН 6,0, содержащего 5кратный молярный избыток аминоокси-ПСК реактива с ММ 20 кДа (описан выше). Затем добавляли 333 мкл водного раствора о-аминобензойной кислоты (30 мМ) в качестве нуклеофильного катализатора до конечной концентрации 10 мМ. Последовательно добавляли 20 мкл водного раствора NаIО4 (5 мМ) до конечной концентрации 100 мкМ. Процесс связывания производили в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном встряхивании, затем реакцию останавливают в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 мкл 1 М водного раствора цистеина (1 М). Дальнейшую очистку конъюгата производят так, как описано здесь.
Пример 18.
Полисиалирование ЭПО с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора.
Способ 1.
Начальную концентрацию эритропоэтина (ЭПО) переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ №ре8, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавили до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют Ν;·ιΙ04 до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводят при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию останавливают цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре.
Затем раствор подвергли ультрафильтрации/диафильтрации на центрифужных фильтраторах VIуа8рш для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов, или, альтернативно, пропустили через ионообменную колонку с объемом 20 мл (Мегск ΕΜΌ ТМАЕ (М)), которая была уравновешена буфером А (20 мМ Шре8, 5 мМ СаС12, рН 7,0). Колонку уравновешивают 5 ОК буфера А. Затем окисленный ЭПО элюируют буфером В (20 мМ Шре8, 5 мМ СаС12, 1 М №С1, рН 7,0). Далее собирают ЭПОсодержащие фракции. Было определено содержание белка (Соота881е, Брэдфорд), затем оно было доведено до 1 мг/мл реакционным буфером и доведено до рН 6,0 капельным добавлением 0,5 М ΗΟ.
Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описана выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток реактива аминоокси-ПСК удаляют при помощи гидрофобной хроматографии. Проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Шре8, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9) и загружают в колонку, заполненную 80 мл РЬепу1 δерЬа^о8е РР (ОЕ ^а^Ьсите, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Шре8, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ буфером Шре8 с рН 7,5, содержащего 5 мМ СаС12. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСК-ЭПО и подвергали ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Номинальный порог отсечения 10 кДа, 50 см2, МЛНроге). Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Соота881е, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном воплощении способ 1 производят следующим образом.
мг ЭПО растворяют в 5 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ №С1). За- 80 025738 тем добавляют 100 мкл водного раствора периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию останавливают в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 50 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Укакрш 15К 10 кДА для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат (приблизительно 7 мл), содержащий окисленный ЭПО, смешивают с 2 мл водного раствора м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
Свободный ЭПО удаляют при помощи анионообменной хроматографии (АЕС). Реакционную смесь разбавляют 20 мл буфера А (50 мМ Нерек, рН 7,5) и загружают в 20 мл колонку ШРгер ОРР 16/10 (СЕ НеаННсаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером А. Затем колонку элюируют буфером В (50 мМ Нерек, 1 М №С1, рН 7,5). Свободный ЭПО элюируют, промывая колонку 25% буфером В, конъюгат - 50% буфером В. Проводимость конъюгат-содержащих фракций затем поднимают до ~190 мСм/см буфером С (50 мМ Нерек, 5 М №С1, рН 6,9) и загружают в 20 мл колонку ШРгер Ви1у1 РР 16/10 (СЕ НеаННсаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером Ό (50 мМ Нерек, 3 М №С1, рН 6,9). Свободный ПСК-реагент вымывали 5 ОК буфера Ό. Затем конъюгат элюируют 100% буфера Е (50 мМ Нерек, рН 7,4). Конъюгат-содержащие фракции концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/Мййроге). Конечный этап диафильтрации проводили против гистидинового буфера, рН 7,2, содержащего 150 мМ №С1. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники. Конъюгат ПСК-ЭПО проявлял удельную активность > 50% в сравнении с нативным ЭПО. Конъюгат дополнительно характеризуют аналитически эксклюзионной ВЭЖХ с использованием ВЭЖХ-системы АдЛей 1200, оснащенной колонкой ЗНойех К\У 803 в описанных ранее условиях (Ко1апсН е( а1., Τ^аηкГик^οη 2006; 46:1959-77). Показано, что в препарате не содержится свободного ЭПО.
Способ 2.
ЭПО переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректировали до 6,0 капельным добавлением 0,5н. водного раствора НС1. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30±5 мин при температуре (Т) Т=+22±2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора Ь-цистеина (1 М) в течение 15 мин при Т=+22±2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60±5 мин.
Окисленный ЭПО далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный ЭПО, собирают и используют для реакции конъюгации.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ΟNН2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный ЭПО в течение максимального периода времени (ί) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120±10 мин при рН 6,0 в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С при осторожном встряхивании (концентрация белка: 1 мг/мл).
Полученный конъюгат ПСК-ЭПО далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат ПСК-ЭПО, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы (МЛЛроге).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Способ 3.
Эритропоэтин (ЭПО) переносят в реакционный буфер (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описана выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и ΝηΙΟ.·ι (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Затем реакцию останавливают цистеином в течение 60 мин при комнатной температуре (концентрация цистеина: 10 мМ). Затем проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9) и загружают в колонку, заполненную РНепу1 ЗерНагоке РР (СЕ Неаййсаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ
- 81 025738
Нерек, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 0,01% Твин-80, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ Нерек, 5 мМ кальция хлорида, рН 7,5. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСК-ЭПО и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Номинальный порог отсечения 10 кДа, 88 см2, МПИроге). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном воплощении способ 3 производят следующим образом. 10 мг ЭПО растворяют в 8 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ №С1). Затем добавляют 200 мкл водного раствора периодата натрия (5 мМ) и 2 мл водного раствора м-толуидина (50 мМ). После этого добавляют реактив аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию останавливают в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 100 мкл 1 М водного раствора цистеина.
Свободный ЭПО удаляют при помощи анионообменной хроматографии (АЕС). Реакционную смесь разбавляют 20 мл буфера А (50 мМ Нерек, рН 7,5) и загружают в 20 мл колонку ШРгер ОРР 16/10 (СЕ НеаНИсаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером А. Затем колонку элюируют буфером В (50 мМ Нерек, 1 М №С1, рН 7,5). Свободный ЭПО элюируют, промывая колонку 25% буфером В, конъюгат - 50% буфером В. Проводимость конъюгат-содержащих фракций затем поднимают до -190 мСм/см буфером С (50 мМ Нерек, 5 М №С1, рН 6,9) и загружают в 20 мл колонку ШРгер Ви1у1 РР 16/10 (СЕ НеаНИсаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером Ό (50 мМ Нерек, 3 М №С1, рН 6,9). Свободный ПСК-реагент вымывали 5 ОК буфера Ό. Затем конъюгат элюируют 100% буфера Е (50 мМ Нерек, рН 7,4). Конъюгат-содержащие фракции концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа, МПИроге). Конечный этап диафильтрации проводили против гистидинового буфера, рН 7,2, содержащего 150 мМ №С1. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники. Конъюгат ПСК-ЭПО проявлял удельную активность > 50% в сравнении с нативным ЭПО.
Конъюгат дополнительно характеризуют аналитически эксклюзионной ВЭЖХ с использованием ВЭЖХ-системы АдИей 1200, оснащенной колонкой 8ИоПех К\У 803 в описанных ранее условиях (Ко1апсИ е1 а1., ^ап^коп 2006; 46:1959-77). Показано, что в препарате не содержится свободного ЭПО.
Способ 4.
ЭПО переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора НС1.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ОИН2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к этому раствору ЭПО в течение максимального периода времени (ΐ) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Наконец, добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 400 мкМ.
Реакционную смесь инкубируют 120±10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С при осторожном встряхивании. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора Ь-цистеина (1 М) до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубировали 60±5 мин.
Полученный конъюгат ПСК-ЭПО очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции, содержащие ПСК-ЭПО и концентрируют способом ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Номинальный порог отсечения 10 кДа, 88 см2, МПИроге).
Конъюгаты, приготовленные по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Пример 19.
Полисиалирование Апц-2 с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора.
Способ 1.
Начальную концентрацию ангиопоэтина-2 (Апд-2) переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют ΝηΣΟ4 до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводят при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию останавливают цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре.
- 82 025738
Затем раствор подвергают ультрафильтрации/диафильтрации на центрифужных фильтраторах VIуакрт для удаления избытка периодата, гасителя и побочных продуктов, или, альтернативно, пропускают через ионообменную колонку с объемом 20 мл (Мегск ЕМО ТМАЕ (М)), которая была уравновешена буфером А (20 мМ Нерек, 5 мМ СаС12, рН 7,0). Колонку уравновешивают 5 ОК буфера А. Затем окисленный Апд-2 элюируют буфером В (20 мМ Нерек, 5 мМ СаС12, 1 М ЫаС1, рН 7,0). Далее собирают Апд-2содержащие фракции. Определяют содержание белка (Соотакяе, Брэдфорд), затем его доводят до 1 мг/мл реакционным буфером и доводят до рН 6,0 добавлением 0,5 М НС1 по каплям.
Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описана выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток аминоокси-реагента удаляют при помощи гидрофобной хроматографии. Проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9) и загружают в колонку, заполненную 80 мл РЬепу1 8ерЬагоке РР (СЕ НеаИЬсаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Нерек, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ буфером Нерек с рН 7,5, содержащего 5 мМ СаС12. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСК-Апд-2 и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (МППроге). Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Соотакк1е, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном воплощении способ 1 производят следующим образом. Ангиопоэтин-2 (Апд-2) переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют ЫаЮ4 до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводят при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию останавливают цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре.
Потом раствор подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов УАакрш для удаления избытка периодата, гасителя и побочных продуктов.
Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описана выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток аминоокси-реагента удаляют при помощи ионообменной хроматографии. Наконец, собирают фракции элюата, содержащие конъюгат ПСК-Апд-2 и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (МПЬроге). Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Соотакяе, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
Способ 2.
Апд-2 переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора НС1. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30±5 мин при температуре (Т) Т=+22±2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора Ь-цистеина (1 М) в течение 15 мин при Т=+22±2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60±5 мин.
Окисленный Апд-2 далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный Апд-2, собирают и используют для реакции конъюгации.
После этого реактив аминоокси-полисйаловой кислоты (ПСК-ОМН2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный Апд-2 в течение максимального периода времени (ί) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор мтолуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120±10 мин при рН 6,0 в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С при осторожном встряхивании (концентрация белка: 1 мг/мл).
Полученный конъюгат ПСК-Апд-2 далее очищают ионообменной хроматографией.
Фракции, содержащие конъюгат ПСК-Апд-2, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы (МППроге).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
- 83 025738
Способ 3.
Ангиопоэтин-2 (Апд-2) переносят в реакционный буфер (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описана выше), после чего добавляют м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и ЫаЮ4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Затем реакцию останавливают цистеином в течение 60 мин при комнатной температуре (концентрация цистеина: 10 мМ). Затем проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9) и загружают в колонку, заполненную Ркепу1 8еркагоке РР (ОЕ НеаНксаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Нерек, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 0,01% Твин-80, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ Нерек, 5 мМ кальция хлорида, рН 7,5. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСК-Апд-2 и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (МПНроге). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном воплощении способ 3 производят следующим образом. Ангиопоэтин-2 (Аид-2) переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описана выше), после чего добавляют м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и ЫаЮ4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Затем реакцию останавливают цистеином в течение 60 мин при комнатной температуре (концентрация цистеина: 10 мМ) и конъюгат далее очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат ПСК-Апд-2 и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (МПНроге).
Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
Способ 4.
Апд-2 растворяют или переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора НС1.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ОМН2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к этому раствору Апд-2 в течение максимального периода времени (ΐ) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Наконец, добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 400 мкМ.
Реакционную смесь инкубируют 120±10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С при осторожном встряхивании. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора Ь-цистеина (1 М) до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубировали 60±5 мин.
Полученный конъюгат ПСК-Апд-2 очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции, содержащие ПСК-Апд-2, и концентрируют способом ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (МПНроге).
Конъюгаты, приготовленные по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Пример 20.
Полисиалирование УЕОР с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора.
Способ 1.
Начальную концентрацию фактора роста сосудистого эндотелия (УЕОР) переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют ЫаЮ4 до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводят при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию останавливают цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре.
Затем раствор подвергли ультрафильтрации/диафильтрации на центрифужных фильтраторах У1уакрт для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов, или, альтернативно, пропустили через ионообменную колонку с объемом 20 мл (Мегск ЕМО ТМАЕ (М)), которая была уравновеше- 84 025738 на буфером А (20 мМ Нерез, 5 мМ СаС12, рН 7,0). Колонку уравновешивают 5 ОК буфера А. Затем окисленный УЕОР элюируют буфером В (20 мМ Нерез, 5 мМ СаС12, 1 М №С1, рН 7,0). Далее собирают УЕОР-содержащие фракции. Было определено содержание белка (Сοοтазз^е, Брэдфорд), затем оно было доведено до 1 мг/мл реакционным буфером и доведено до рН 6,0 добавлением по каплям 0,5 М №ЫН.
Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описана выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток аминоокси-реагента удаляют при помощи гидрофобной хроматографии. Проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Нерез, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9) и загружают в колонку, заполненную 80 мл Рйепу1 δеρЬа^οзе РР (ОЕ Неа1!йсаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Нерез, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ буфером Нерез с рН 7,5, содержащего 5 мМ СаС12. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСК-УЕОР и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы ^Π^οΐΐ). Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Сοοтазз1е, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном воплощении способ 1 производят следующим образом. Фактор роста сосудистого эндотелия (УЕОР) переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Нерез, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют NаIО4 до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводят при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию останавливают цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре.
Потом раствор подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов УКазрш для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описана выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток аминоокси-реагента удаляют при помощи ионообменной хроматографии. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат ПСК-УЕОР и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы ^Π^οΐΐ). Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Сοοтазз1е, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
Способ 2.
УЕОР переносят или растворяют. в реакционном буфере (например, 50 мМ Нерез, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора НС1. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30±5 мин при температуре (Т) Т=+22±2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора Ь-цистеина (1 М) в течение 15 мин при Т=+22±2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60±5 мин.
Окисленный УЕОР далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный УЕОР, собирают и используют для реакции конъюгации.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ОNН2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный УЕОР в течение максимального периода времени (!) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор мтолуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120±10 мин при рН 6,0 в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С при осторожном встряхивании (концентрация белка: 1 мг/мл).
Полученный конъюгат ПСК-УЕОР далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат ПСК-УЕОР, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы ^Π^οΐΐ).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Способ 3.
Фактор роста сосудистого эндотелия (УЕОР) переносят в реакционный буфер (50 мМ Нерез, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описана выше), после чего добавляют м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентра- 85 025738 ция: 10 мМ) и NаIΟ4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Затем реакцию останавливают цистеином в течение 60 мин при комнатной температуре (концентрация цистеина: 10 мМ). Затем проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9) и загружают в колонку, заполненную РЬепу1 БерЬагоке РР (ОЕ НеаНЬсаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Нерек, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 0,01% Твин-80, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ Нерек, 5 мМ кальция хлорида, рН 7,5. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСК-УЕОР и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (МПНроге). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном воплощении способ 3 производят следующим образом. Фактор роста сосудистого эндотелия (УЕОР) переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описана выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и Ν;ιΙΟ( (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Затем реакцию останавливают цистеином в течение 60 мин при комнатной температуре (концентрация цистеина: 10 мМ) и конъюгат далее очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат ПСК-УЕОР и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (МЛНроге).
Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
Способ 4.
УЕОР растворяют или переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора НС1.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ОИН2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к этому раствору УЕОР в течение максимального периода времени (ΐ) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Наконец, добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 400 мкМ.
Реакционную смесь инкубируют 120±10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С при осторожном встряхивании. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора Ь-цистеина (1 М) до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубировали 60±5 мин.
Полученный конъюгат УЕОР очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции, содержащие ПСК-УЕОР и концентрируют способом ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (МПРроге).
Конъюгаты, приготовленные по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Пример 21.
Полисиалирование ФРЭ с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора.
Способ 1.
Начальную концентрацию фактора роста эпидермиса (ФРЭ) переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавили до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют №ιΙΟ( до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводят при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию останавливают цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре.
Затем раствор подвергли ультрафильтрации/диафильтрации на центрифужных фильтраторах У1уакрш для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов, или, альтернативно, пропустили через ионообменную колонку с объемом 20 мл (Мегск ЕМО ТМАЕ (М)), которая была уравновешена буфером А (20 мМ Нерек, 5 мМ СаС12/рН 7,0). Колонку уравновешивают 5 ОК буфера А. Затем окисленный ФРЭ элюируют буфером В (20 мМ Нерек, 5 мМ СаС12, 1 М №С1, рН 7,0). Далее собирают ФРЭсодержащие фракции. Было определено содержание белка (Соошакые, Брэдфорд), затем оно было доведено до 1 мг/мл реакционным буфером и доведено до рН 6,0 капельным добавлением 0,5 М НС1.
- 86 025738
Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описана выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток аминоокси-реагента удаляют при помощи гидрофобной хроматографии. Проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Нере8, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9) и загружают в колонку, заполненную 80 мл РЬепу1 §ерйаго8е ΡΡ (ОЕ НеаЙЬсаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Нере8, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ буфером Нере8 с рН 7,5, содержащего 5 мМ СаС12. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСК-ФРЭ и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Мййроге). Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Соота881е, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном воплощении способ 1 производят следующим образом. Фактора роста эпидермиса (ФРЭ) переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Нере8, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют №ιΙΟ( до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводят при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию останавливают цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре.
Потом раствор подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Угуа8рш для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описана выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток аминоокси-реагента удаляют при помощи ионообменной хроматографии. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат ПСК-ФРЭ и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Мййроге). Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Соота881е, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
Способ 2.
ФРЭ переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Нере8, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют, до. 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора НС1. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30±5 мин при температуре (Т) Т=+22±2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора Ь-цистеина (1 М) в течение 15 мин при Т=+22±2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60±5 мин.
Окисленный ФРЭ далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный ФРЭ, собирают и используют для реакции конъюгации.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ΟNН2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный ФРЭ в течение максимального периода времени (1) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120±10 мин при рН 6,0 в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С при осторожном встряхивании (концентрация белка: 1 мг/мл).
Полученный конъюгат ПСК-ФРЭ далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат ПСК-ФРЭ, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы (Мййроге).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Способ 3.
Фактор роста эпидермиса (ФРЭ) переносят в реакционный буфер (50 мМ Нере8, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описана выше), после чего добавляют м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и №ιΙΟ( (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Затем реакцию останавливают цистеином в течение 60 мин при комнатной температуре (концентрация цистеина: 10 мМ). Затем проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Нере8, 350 мМ
- 87 025738 натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9) и загружают в колонку, заполненную РНепу1 8ерНагоке РР (СЕ НеаННсаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Нерек, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 0,01% Твин-80, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ Нерек, 5 мМ кальция хлорида, рН 7,5. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСК-ФРЭ и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (МПНроге). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном воплощении способ 3 производят следующим образом. Фактор роста эпидермиса (ФРЭ) переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описана выше), после чего добавляют м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и ЫаЮ4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Затем реакцию останавливают цистеином в течение 60 мин при комнатной температуре (концентрация цистеина: 10 мМ) и конъюгат далее очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (МПНроге). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
Способ 4.
ФРЭ растворяют или переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора НС1.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ОИН2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к этому раствору ФРЭ в течение максимального периода времени (ΐ) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Наконец, добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 400 мкМ.
Реакционную смесь инкубируют 120±10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С при осторожном встряхивании. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора Ь-цистеина (1 М) до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубировали 60±5 мин.
Полученный конъюгат ФРЭ очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции, содержащие ПСК-ФРЭ и концентрируют способом ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (МПНроге).
Конъюгаты, приготовленные по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Пример 22.
Полисиалирование ФРН с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора
Способ 1.
Начальную концентрацию фактора роста нервов (ФРН) переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавили до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют ЫаЮ4 до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводят при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию останавливают цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре.
Затем раствор подвергли ультрафильтрации/диафильтрации на центрифужных фильтраторах νΐуакрш для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов, или, альтернативно, пропустили через ионообменную колонку с объемом 20 мл (Мегск ЕМИ ТМАЕ (М)), которая была уравновешена буфером А (20 мМ Нерек, 5 мМ СаС12, рН 7,0). Колонку уравновешивают 5 ОК буфера А. Затем окисленный ФРН элюируют буфером В (20 мМ Нерек, 5 мМ СаС12, 1 М ЫаС1, рН 7,0). Далее собирают ФРНсодержащие фракции. Было определено содержание белка (Соошакяе, Брэдфорд), затем оно было доведено до 1 мг/мл реакционным буфером и доведено до рН 6,0 капельным добавлением 0,5 М НС1.
Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описана выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток аминоокси-реагента удаляют при помощи гидрофобной хроматографии. Проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония
- 88 025738 ацетат (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9) и загружают в колонку, заполненную 80 мл РЬепу1 ЗерЛагоке РР (СЕ НеаЛЛсаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Нерек, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ буфером Нерек с рН 7,5, содержащего 5 мМ СаС12. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСК-ФРН и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (МЛЛроге). Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Соотакк1е, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном воплощении способ 1 производят следующим образом. Фактор роста нервов (ФРН) переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавили до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют ИаЮ4 до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводят при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию останавливают цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре.
Потом раствор подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов УКакрш для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описана выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток аминоокси-реагента удаляют при помощи ионообменной хроматографии. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат ПСК-ФРН и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (МЛЛроге). Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Соотакк1е, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
Способ 2.
ФРН переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора НС1. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30±5 мин при температуре (Т) Т=+22±2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора Ь-цистеина (1 М) в течение 15 мин при Т=+22±2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60±5 мин.
Окисленный ФРН далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный ФРН, собирают и используют для реакции конъюгации.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ОИН2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный ФРН в течение максимального периода времени (!) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120±10 мин при рН 6,0 в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С при осторожном встряхивании (концентрация белка: 1 мг/мл).
Полученный конъюгат ПСК-ФРН далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат ПСК-ФРН, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы (МЛЛроге).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Способ 3.
Фактор роста нервов (ФРН) переносят в реакционный буфер (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавили до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описана выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и ИаЮ4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Затем реакцию останавливают цистеином в течение 60 мин при комнатной температуре (концентрация цистеина: 10 мМ). Затем проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9) и загружают в колонку, заполненную Р1епу1 ЗерЬагоке РР (СЕ НеаЛЛсаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Нерек, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 0,01% Твин-80, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ Нерек, 5 мМ кальция хлорида, рН 7,5. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСК-ФРН и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготов- 89 025738 ленной из регенерированной целлюлозы (МПНроге). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном воплощении способ 3 производят следующим образом. Фактор роста нервов (ФРН) переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Нерее, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавили до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описана выше), после чего был добавлен мтолуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и NаIΟ4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Затем реакцию останавливают цистеином в течение 60 мин при комнатной температуре (концентрация цистеина: 10 мМ) и конъюгат далее очищают ионообменной хроматографией. Затем собирают фракции элюата, содержащие конъюгат ПСК-ФРН и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (МПНроге). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
Способ 4.
ФРН растворяют или переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Нерее, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора НС1.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ОИН2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к этому раствору ФРН в течение максимального периода времени (1) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Наконец, добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 400 мкМ.
Реакционную смесь инкубируют 120±10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С при осторожном встряхивании. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора Ь-цистеина (1 М) до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубировали 60±5 мин.
Полученный конъюгат ФРН очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции, содержащие ПСК-ФРН и концентрируют способом ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (МПНроге).
Конъюгаты, приготовленные по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Пример 23.
Полисиалирование ГРЧ с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора.
Способ 1.
Как описано здесь, аминокислотную последовательность гормона роста человека (ГРЧ) сначала модифицируют, чтобы внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки ГРЧ гликозилируют ίη νίΠΌ способами, известными в данной области техники.
Начальную концентрацию гормона роста человека (ГРЧ) переносят в реакционный буфер (50 мМ Нерее, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют NаIΟ4 до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводят при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию гасят цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре.
Затем раствор подвергается ультрафильтрации/диафильтрации на центрифужных фильтраторах VIуаерт для удаления избытка периодата, замедлителя и их побочных продуктов или, альтернативно, пропускают через ионообменную колонку с объемом 20 мл (Мегск ЕМИ ТМАЕ (М)), которая была уравновешена буфером А (20 мМ Нерее, 5 мМ СаС12, рН 7,0). Колонку уравновешивают 5 ОК буфера А. Окисленный ГРЧ элюируют буфером В (20 мМ Нерее, 5 мМ СаС12, 1 М №С1, рН 7,0). Собирают ГРЧсодержащие фракции. Определяют содержание белка (Соотаее1е, Брэдфорд) и доводят его до 1 мг/мл реакционным буфером, и доводят до рН 6,0 добавлением 0,5 М НС1 по каплям.
Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток аминоокси-реагента удаляют при помощи гидрофобной хроматографии. Проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Нерее, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9) и загружают в колонку, заполненную 80 мл Рйепу1 Зерйагоее РР (СЕ НеаЛйсаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Нерее, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция
- 90 025738 хлорида, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ буфером Нерек с рН 7,5, содержащим 5 мМ СаС12. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСК-ГРЧ, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с исользованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (МДЦроге). Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Соотакяе, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 1 выполняют следующим образом. Как описано здесь, аминокислотную последовательность гормона роста человека (ГРЧ) сначала модифицируют, чтобы внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки ГРЧ гликозилируют ш νίΙΐΌ способами, известными в данной области техники. ГРЧ переносят в реакционный буфер (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют NаIΟ4 до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводят при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию гасят цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре.
Потом раствор подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Ущакрш для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток аминоокси-реагента удаляют при помощи ионообменной хроматографии. Собирают фракции элюата, содержащие ПСК-ГРЧ, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (МПНроге). Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Соотакк1е, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 2.
Как описано здесь, аминокислотную последовательность гормона роста человека (ГРЧ) сначала модифицируют, чтобы внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки ГРЧ гликозилируют ш νίΙΐΌ способами, известными в области техники.
ГРЧ переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6.0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора НС1. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30±5 мин при температуре (Т) Т=+22±2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора Ь-цистеина (1 М) в течение 15 мин при Т=+22±2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60±5 мин.
Окисленный ГРЧ далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный ГРЧ, собирают и используют для реакции конъюгации.
Реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ΟNН2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный ГРЧ в течение максимального периода времени (ΐ) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120±10 мин при рН 6,0 в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С при осторожном встряхивании (концентрация белка: 1 мг/мл).
Полученный конъюгат ПСК-ГРЧ далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат ПСК-ГРЧ, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы (МППроге).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Способ 3.
Как описано здесь, аминокислотную последовательность гормона роста человека (ГРЧ) сначала модифицируют, чтобы внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки ГРЧ гликозилируют ш νίΙΐΌ способами, известными в области техники.
Гормон роста человека (ГРЧ) переносят в реакционный буфер (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и №Ю4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Затем реакцию гасят цистеином в течение 60 мин при комнатной температуре (концентрация цистеина: 10 мМ). Затем проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5
- 91 025738 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9) и загружают в колонку, заполненную РЬепу1 8ерЬагоке ΕΕ (СЕ НеаИЬсаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Нерек, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 0,01% Твин-80, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ Нерек, 5 мМ кальция хлорида, рН 7.5. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСКГРЧ, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (МИНроге). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 3 выполняют следующим образом. Как описано здесь, аминокислотную последовательность гормона роста человека (ГРЧ) сначала модифицируют, чтобы внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки ГРЧ гликозилируют ш уИго способами, известными в области техники. ГРЧ переносят в реакционный буфер (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и NаIΟ4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Затем реакцию гасят цистеином в течение 60 мин при комнатной температуре (концентрация цистеина: 10 мМ) и конъюгат далее очищают ионообменной хроматографией. Затем собирают фракции элюата, содержащие конъюгат ПСК-ГРЧ, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (МИНроге). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
Способ 4.
Как описано здесь, аминокислотную последовательность гормона роста человека (ГРЧ) сначала модифицируют, чтобы внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки ГРЧ гликозилируют ш уИго способами, известными в области техники.
ГРЧ растворяют или переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6.0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора НС1.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ОИН2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к этому раствору ГРЧ в течение максимального периода времени (!) 15 мин при осторожном встряхивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Наконец, добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 400 мкМ.
Реакционную смесь инкубируют 120±10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С при осторожном встряхивании. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора Ь-цистеина (1 М) до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубирюют 60±5 мин.
Полученный конъюгат ГРЧ очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции, содержащие ПСК-ГРЧ, и концентрируют способом ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (МИНроге).
Конъюгаты, приготовленные по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности, в соответствии со способами, известными в области техники, и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Пример 24.
Полисиалирование ФНО-альфа с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора.
Начальную концентрацию фактора некроза опухолей-альфа (ФНО-альфа) переносят в реакционный буфер (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют №Ю4 до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводят при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию гасят цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре.
Затем раствор подвергли ультрафильтрации/диафильтрации на центрифужных фильтраторах У1уакрш для удаления избытка периодата, замедлителя и их побочных продуктов или, альтернативно, пропустили через ионообменную колонку с объемом 20 мл (Мегск ЕМЭ ТМАЕ (М)), которая была уравновешена буфером А (20 мМ Нерек, 5 мМ СаС12, рН 7,0). Колонку уравновешивают 5 ОК буфером А. Затем окисленный ФНО-альфа элюируют буфером В (20 мМ Нерек, 5 мМ СаС12, 1 М №С1, рН 7,0). Собирают ФНО-альфа-содержащие фракции. Было определено содержание белка (Соотакяе, Брэдфорд) и оно было доведено до 1 мг/мл реакционным буфером, и доведено до рН 6,0 добавлением по каплям 0,5 М НС1.
- 92 025738
Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток аминоокси-реагента удаляют при помощи гидрофобной хроматографии. Проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9), и загружают в колонку, заполненную 80 мл РЬепу1 ЗерНагоке ΡΡ (ОЕ НеаИЬсаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Нерек, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ буфером Нерек с рН 7,5, содержащим 5 мМ СаС1.2 Наконец, собирают фракции, содержащие ПСК-ФНО-альфа, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (МПНроге). Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Соотакк1е, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 1 выполняют следующим образом. Фактор некроза опухолей-альфа (ФНО-альфа) перенесли в реакционный буфер (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавили до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют ΝηΣΟ4 до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводят при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию гасят цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре.
Потом раствор подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Ущакрш для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов. Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток аминоокси-реагента удаляют при помощи ионообменной хроматографии. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат ПСК-ФНО-альфа, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (МПНроге). Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Соотакк1е, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
Способ 2.
ФНО-альфа переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6.0), чтобы получить конечную концентрацию белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора НС1. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30±5 мин при температуре (Т) Т=+22±2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора Ь-цистеина (1 М) в течение 15 мин при Т=+22±2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60±5 мин.
Окисленный ФНО-альфа далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный ФНО-альфа, собирают и используют для реакции конъюгации.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ΟNН2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный ФНО-альфа, в течение максимального периода времени (ΐ) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор мтолуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120±10 мин при рН 6,0 в темноте, при температуре (Т) Т=+22±2°С, при осторожном встряхивании (концентрация белка: 1 мг/мл).
Полученный конъюгат ПСК-ФНО-альфа далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат ПСК-ФНО-альфа, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы (МПНроге).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Способ 3.
Фактор некроза опухолей-альфа (ФНО-альфа) перенесли в реакционный буфер (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавили до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и №Ю4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Затем реакцию гасят цистеином
- 93 025738 в течение 60 мин при комнатной температуре (концентрация цистеина: 10 мМ). Затем проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ №ре8, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9), и загружают в колонку, заполненную РЬепу1 δерЬа^о8е РР (ОЕ ΗеаЙЬса^е, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ №ре8, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 0,01% Твин80, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ Шре8, 5 мМ кальция хлорида, рН 7.5. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСК-ФНО-альфа, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Мййроге). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 3 выполняют следующим образом. Фактор некроза опухолей-альфа (ФНО-альфа) перенесли в реакционный буфер (50 мМ Шре8, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавили до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и №Н04 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Затем реакцию гасят цистеином в течение 60 мин при комнатной температуре (концентрация цистеина: 10 мМ) и конъюгат далее очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат ПСК-ФНО-альфа, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) на с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Мййроге). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
Способ 4.
ФНО-альфа растворяют или переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Шре8, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6.0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора ΗΟ.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ОNΗ2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к этому раствору ФНО-альфа в течение максимального периода времени (!) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Наконец, добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата, чтобы получить концентрацию 400 мкМ.
Реакционную смесь инкубируют 120±10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С при осторожном встряхивании. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора Ь-цистеина (1 М) до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60±5 мин.
Полученный конъюгат ФНО-альфа очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции, содержащие ПСК-ФНО-альфа, и концентрируют способом ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Мййроге).
Конъюгаты, приготовленные по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники, и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Пример 25.
Полисиалирование инсулина с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора
Способ 1.
Как описано здесь, аминокислотную последовательность инсулина сначала модифицируют, чтобы внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки инсулин гликозилируют ш уйго способами, известными в области техники. Начальную концентрацию инсулина перенесли в реакционный буфер (50 мМ Шре8, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавили до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют №ιΙ04 до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводят при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию гасят цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре.
Затем раствор подвергли ультрафильтрации/диафильтрации на центрифужных фильтраторах VIуа8рш для удаления избытка периодата, замедлителя и их побочных продуктов или, альтернативно, пропустили через ионообменную колонку с объемом 20 мл (Мегск ЕМЭ ТМАЕ (М)), которая была уравновешена буфером А (20 мМ Шре8, 5 мМ СаС12, рН 7,0). Колонку уравновешивают 5 ОК буфером А. Затем окисленный инсулин элюируют буфером В (20 мМ Шре8, 5 мМ СаС12, 1 М №С1, рН 7,0). Далее собирают инсулин-содержащие фракции. Определяют содержание белка (Соота881е, Брэдфорд) и доводят его до 1 мг/мл реакционным буфером, и доводят до рН 6,0 добавлением 0,5 М ΗΟ по каплям.
- 94 025738
Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток аминоокси-реагента удаляют при помощи гидрофобной хроматографии. Проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9), и загружают в колонку, заполненную 80 мл РНепу1 δеρНа^οке РР (ОЕ НеаННсаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Нерек, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ буфером Нерек с рН 7,5, содержащего 5 мМ СаС12. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСК-инсулин и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (МйНроге). Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (СоотакПе, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 1 выполняют следующим образом. Как описано здесь, аминокислотную последовательность инсулина сначала модифицируют, чтобы внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки инсулин гликозилируют ш уйго способами, известными в области техники. Инсулин переносят в реакционный буфер (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют ЛаЮ4 до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводят при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию гасят цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре.
Потом раствор подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Угуакрш для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток аминоокси-реагента удаляют при помощи ионообменной хроматографии. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат ПСК-инсулин, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (МгШроге). Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (СоотакПе, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
Способ 2.
Как описано здесь, аминокислотную последовательность инсулина сначала модифицируют, чтобы внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки инсулин гликозилируют ш уйго способами, известными в области техники.
Инсулин переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6.0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора НС1. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30±5 мин при температуре (Т) Т=+22±2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора Ь-цистеина (1 М) в течение 15 мин при Т=+22±2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60±5 мин.
Окисленный инсулин далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный инсулин, собирают и используют для реакции конъюгации.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ОЛН2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный инсулин, в течение максимального периода времени (ΐ) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор мтолуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120±10 мин при рН 6,0 в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С при осторожном встряхивании (концентрация белка: 1 мг/мл).
Полученный конъюгат ПСК-инсулин далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат ПСК-инсулин, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы (МйНроге).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Способ 3.
Как описано здесь, аминокислотную последовательность инсулина сначала модифицируют, чтобы
- 95 025738 внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки инсулин гликозилируют ίη уйго способами, известными в области техники.
Инсулин переносят в реакционный буфер (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ -20 кДа (описано выше), после чего был добавлен мтолуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и ΝηΣΟ4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Затем реакцию гасят цистеином в течение 60 мин при комнатной температуре (концентрация цистеина: 10 мМ). Затем проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9), и загружают в колонку, заполненную РИепу1 δерИа^оке РР (СЕ НеаНИсаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Нерек, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 0,01% Твин-80, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ Нерек, 5 мМ кальция хлорида, рН 7.5. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСКинсулин, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (МПИроге). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 3 выполняют следующим образом. Как описано здесь, аминокислотную последовательность инсулина сначала модифицируют, чтобы внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки инсулин гликозилируют ίη уйго способами, известными в области техники.
Инсулин переносят в реакционный буфер (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен мтолуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и УПСи (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Затем реакцию гасят цистеином в течение 60 мин при комнатной температуре (концентрация цистеина: 10 мМ) и конъюгат далее очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат ПСК-инсулин, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (МПИроге). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
Способ 4.
Как описано здесь, аминокислотную последовательность инсулина сначала модифицируют, чтобы внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки инсулин гликозилируют ίη уИго способами, известными в области техники.
Инсулин растворяют или переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6.0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора НС1.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ОИН2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к этому раствору инсулина в течение максимального периода времени (ΐ) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Наконец, добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 400 мкМ.
Реакционную смесь инкубируют 120±10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С при осторожном встряхивании. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора Ь-цистеина (1 М) до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60±5 мин.
Полученный конъюгат инсулина очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции, содержащие ПСК-инсулин, и концентрируют способом ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (МПИроге).
Конъюгаты, приготовленные по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности, в соответствии со способами, известными в области техники, и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Пример 26.
Полисиалирование интерферона-альфа с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора.
Способ 1.
Начальную концентрацию интерферона-альфа перенесли в реакционный буфер (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавили до получения концентрации белка 1
- 96 025738 мг/мл. К этому раствору добавляют ΝηΙΟ.4 до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводят при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию гасят цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре.
Затем раствор подвергли ультрафильтрации/диафильтрации на центрифужных фильтраторах У1\'акрт для удаления избытка периодата, замедлителя и их побочных продуктов или, альтернативно, пропустили через ионообменную колонку с объемом 20 мл (Мегск ЕМО ТМАЕ (М)), которая была уравновешена буфером А (20 мМ Нерек, 5 мМ СаС12, рН 7,0). Колонку уравновешивают 5 ОК буфером А. Затем окисленный интерферон-альфа элюируют буфером В (20 мМ Нерек, 5 мМ СаС12, 1 М ЫаС1, рН 7,0). Далее собирают интерферон-альфа-содержащие фракции. Определяют содержание белка (Соотакяе, Брэдфорд), затем его доводят до 1 мг/мл реакционным буфером и доводят до рН 6,0 добавлением 0,5 М НС1 по каплям.
Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток аминоокси-реагента удаляют при помощи гидрофобной хроматографии. Проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9), и загружают в колонку, заполненную 80 мл РНепу1 Зерйагоке РР (СЕ НеаННсаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Нерек, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ буфером Нерек с рН 7,5, содержащего 5 мМ СаС12. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСК-интерферон-альфа и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (МЛНроге). Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Соотакйе, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 1 выполняют следующим образом. Интерферональфа переносят в реакционный буфер (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют ЫаЮ4 до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводят при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию гасят цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре.
Потом раствор подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Уйакрш для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток аминоокси-реагента удаляют при помощи ионообменной хроматографии. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат ПСК-интерферон-альфа, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Мййроге). Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Соотакяе, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
Способ 2.
Интерферон-альфа перенесли или растворили в реакционном буфере (например, 50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6.0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректировали до 6,0 капельным добавлением 0,5н. водного раствора НС1. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30±5 мин при температуре (Т) Т=+22±2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора Ь-цистеина (1 М) в течение 15 мин при Т=+22±2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60±5 мин.
Окисленный интерферон-альфа далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный интерферон-альфа, собирают и используют для реакции конъюгации.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ΟNН2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный интерферон-гамма, в течение максимального периода времени (ί) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120±10 мин при рН 6,0 в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С при осторожном встряхивании (концентрация белка: 1 мг/мл).
Полученный конъюгат ПСК-интерферон-альфа далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат ПСК-интерферон-альфа, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ). с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы
- 97 025738 с подходящим отсечением молекулярной массы (МПНроге).
Способ 3.
Интерферон-альфа переносят в реакционный буфер (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего добавляют м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и ИаЮ4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Затем реакцию гасят цистеином в течение 60 мин при комнатной температуре (концентрация цистеина: 10 мМ). Затем проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9), и загружают в колонку, заполненную Ркепу1 8еркагоке РР (ОЕ НеаНксаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Нерек, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 0,01% Твин-80, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ Нерек, 5 мМ кальция хлорида, рН 7.5. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСКинтерферон-альфа, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (МПНроге). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 3 выполняют следующим образом. Интерферональфа переносят в реакционный буфер (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и ИаЮ4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Затем реакцию гасят цистеином в течение 60 мин при комнатной температуре (концентрация цистеина: 10 мМ) и конъюгат далее очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат ПСК-интерферон-альфа, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (МПНроге). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
Способ 4.
Интерферон-альфа растворяют или переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6.0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректировали до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора НС1.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ОИН2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к этому раствору интерферона-альфа в течение максимального периода времени (ΐ) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Наконец, добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 400 мкМ.
Реакционную смесь инкубируют 120±10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С при осторожном встряхивании. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора Ь-цистеина (1 М) до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60±5 мин.
Полученный конъюгат интерферона-альфа очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции, содержащие ПСК-интерферон-альфа, и концентрируют способом ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (МПНроге).
Конъюгаты, приготовленные по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности, в соответствии со способами, известными в области техники, и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Пример 27.
Полисиалирование интерферона-гамма с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора.
Способ 1.
мг интерферона-гамма растворяют в 5 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ ИаС1). Затем добавляют 100 мкл водного раствора периодата натрия (5 мМ) и кнкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 50 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Ущакрш 15К 10 кДА для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат (приблизительно 7 мл), содержащий окисленный интерферон-гамма, смешивают с 2 мл
- 98 025738 водного раствора м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
Свободный интерферон-гамма удаляют при помощи катионообменной хроматографии (СЕС). Реакционную смесь разбавляют 20 мл буфера А (50 мМ Нере8, рН 6,5) и загружают в 20 мл колонку ШРгер 8РРР 16/10 (ОЕ НеаЙЬсаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером А. Затем колонку элюируют буфером В (50 мМ Нере8, 1 М №С1, рН 6,5). Свободный интерферон-гамма элюируют, промывая колонку 25% буфером В, конъюгат - 50% буфером В. Проводимость конъюгатсодержащих фракций затем поднимают до ~190 мСм/см буфером С (50 мМ Нере8, 5 М №С1, рН 6,9) и загружают в 20 мл колонку ШРгер Ви1у1 ΡΡ 16/10 (ОЕ НеаЙЬсаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером Ό (50 мМ Нере8, 3 М №С1, рН 6,9). Свободный ПСК-реагент вымывали 5 ОК буфером Ό. Затем конъюгат элюируют 100% буфером Е (50 мМ Нере8, рН 6,9). Конъюгатсодержащие фракции концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа, Мййроге). Конечный этап диафильтрации проводили против гистидинового буфера, рН 6,9, содержащего 150 мМ №С1. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники. Конъюгат ПСК-интерферон-гамма проявлял удельную активность > 50% в сравнении с нативным интерфероном-гамма. Конъюгат дополнительно характеризуют аналитически эксклюзионной ВЭЖХ с использованием ВЭЖХ-системы А§йеп1 1200, оснащенной колонкой 8Ьойех К\У 803, в описанных ранее условиях (Ко1апсЬ е1 а1., Тгап8£и8юп 2006; 46:1959-77). Показано, что в препарате не содержится свободный интерферон-гамма.
Способ 2.
мг интерферона-гамма растворяют в 8 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ №С1). Затем добавляют 200 мкл водного раствора периодата натрия (5 мМ) и 2 мл водного раствора м-толуидина (50 мМ). После этого добавляют реактив аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 100 мкл 1 М водного раствора цистеина.
Свободный интерферон-гамма удаляют при помощи катионообменной хроматографии (СЕС). Реакционную смесь разбавляют 20 мл буфера А (50 мМ Нере8, рН 6,5) и загружают в 20 мл колонку ШРгер 8РРР 16/10 (ОЕ НеаЙЬсаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером А. Затем колонку элюируют буфером В (50 мМ Нере8, 1 М №С1, рН 6,5). Свободный интерферон-гамма элюируют, промывая колонку 25% буфером В, конъюгат - 50% буфером В. Проводимость конъюгатсодержащих фракций затем поднимают до ~190 мСм/см буфером С (50 мМ Нере8, 5 М №С1, рН 6,9) и загружают в 20 мл колонку ШРгер Ви1у1 ΡΡ 16/10. (ОЕ НеаЙЬсаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером Ό (50 мМ Нере8, 3 М №С1, рН 6,9). Свободный ПСК-реагент вымывали в 5 ОК буфера Ό. Затем конъюгат элюируют 100% буфером Е (50 мМ Нере8, рН 6,9). Конъюгатсодержащие фракции концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/Мййроге). Конечный этап диафильтрации проводили против гистидинового буфера, рН 6,9, содержащего 150 мМ №С1. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники. Для конъюгата ПСК-интерферон-гамма определили характерную активность >50% в сравнении с нативным интерфероном-гамма. Конъюгат дополнительно характеризуют аналитически эксклюзионной ВЭЖХ с использованием ВЭЖХ-системы А§йеп1 1200, оснащенной колонкой 8Ьойех К\У 803, в описанных ранее условиях (Ко1агюЬ е1 а1., Тгап8£и8юп 2006; 46:1959-77). Показано, что в препарате не содержится свободный интерферон-гамма.
Способ 3.
мг интерферона-гамма растворяют в 8 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ №С1). Затем добавляют 200 мкл водного раствора периодата натрия (5 мМ) и 2 мл водного раствора м-толуидина (50 мМ). После этого добавляют реактив аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 100 мкл 1 М водного раствора цистеина.
Свободный интерферон-гамма удаляют при помощи катионообменной хроматографии (СЕС). Реакционную смесь разбавляют 20 мл буфера А (50 мМ Нере8, рН 6,5) и загружают в 20 мл колонку ШРгер 8РРР 16/10 (ОЕ НеаЙЬсаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером А. Затем колонку элюируют буфером В (50 мМ Нере8, 1 М №С1, рН 6,5). Свободный интерферон-гамма элюируют, промывая колонку 25% буфером В, конъюгат - 50% буфером В. Проводимость конъюгатсодержащих фракций затем поднимают до ~190 мСм/см буфером С (50 мМ Нере8, 5 М №С1, рН 6,9) и
- 99 025738 загружают в 20 мл колонку ШРгер Ви1у1 РР 16/10 (СЕ НеаИЬсаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером Ό (50 мМ Нерек, 3 М ЫаС1, рН 6,9). Свободный ПСК-реагент вымывали в 5 ОК буфера Ό. Затем конъюгат элюируют 100% буфером Е (50 мМ Нерек, рН 6,9). Конъюгатсодержащие фракции концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/МППроге). Конечный этап диафильтрации проводили против гистидинового буфера, рН 6,9, содержащего 150 мМ ЫаС1. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники. Конъюгат ПСК-интерферон-гамма проявлял удельную активность >50% в сравнении -с нативным интерфероном-гамма. Конъюгат дополнительно характеризуют аналитически эксклюзионной ВЭЖХ с использованием ВЭЖХ-системы АдЛей 1200, оснащенной колонкой 8ЬоПех К\У 803, в описанных ранее условиях (Ко1апсЬ еί а1., ТгапкГикюп 2006; 46:1959-77). Показано, что в препарате не содержится свободный интерферон-гамма
Способ 4.
Интерферон-гамма растворяют или переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6.0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректировали до 6,0 добавлением по каплях 0,5н. водного раствора НС1.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ОМН2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к этому раствору интерферона-гамма в течение максимального периода времени (ί) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Наконец, добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 400 мкМ.
Реакционную смесь инкубируют 120±10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С при осторожном перемешивании. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора Ь-цистеина (1 М) до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубировали 60±5 мин.
Полученный конъюгат интерферона-гамма очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции, содержащие ПСК-интерферон-гамма, и концентрируют способом ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (МППроге).
Конъюгаты, приготовленные по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности, в соответствии со способами, известными в области техники, и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Пример 28.
Полисиалирование Г-КСФ с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора.
Способ 1.
Начальную концентрацию гранулоцит-колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) перенесли в реакционный буфер (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавили до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют ЫаЮ4 до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводят при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию гасят цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре.
Затем раствор подвергли ультрафильтрации/диафильтрации на центрифужных фильтраторах VIуакрт для удаления избытка периодата, замедлителя и их побочных продуктов или, альтернативно, пропустили через ионообменную колонку с объемом 20 мл (Мегск ЕМО ТМАЕ (М)), которая была уравновешена буфером А (20 мМ Нерек, 5 мМ СаС12, рН 7,0). Колонку уравновешивают 5 ОК буфером А. Затем окисленный Г-КСФ элюируют буфером В (20 мМ Нерек, 5 мМ СаС12, 1 М ЫаС1, рН 7,0). Далее собирают Г-КСФ-содержащие фракции. Определяют содержание белка (Соотакяе, Брэдфорд), затем его доводят до 1 мг/мл реакционным буфером и доводят до рН 6,0 добавлением 0,5 М НС1 по каплям.
Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток аминоокси-реагента удаляют при помощи гидрофобной хроматографии. Проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9), и загружают в колонку, заполненную 80 мл РЬепу1 8ерПагоке РР (СЕ НеаИЬсаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Нерек, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ буфером Нерек с рН 7,5, содержащим 5 мМ СаС12. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСК-Г-КСФ, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлю- 100 025738 лозы (МПНроге). Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Соотаее1е, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 1 выполняют следующим образом. Гранулоцитколониестимулирующий фактор (Г-КСФ) перенесли в реакционный буфер (50 мМ Нерее, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавили до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют КаЮ( до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводят при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию гасят цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре.
Потом раствор подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных, фильтраторов Угуаерш для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов. Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток аминоокси-реагента удаляют при помощи ионообменной хроматографии. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат ПСК-Г-КСФ, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (МПНроге). Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Соотаее1е, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
Способ 2.
Г-КСФ переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Нерее, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6.0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора НС1. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30±5 мин при температуре (Т) Т=+22±2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора Ь-цистеина (1 М) в течение 15 мин при Т=+22±2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60±5 мин.
Окисленный Г-КСФ далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный Г-КСФ, собирают и используют для реакции конъюгации.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ОИН2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный Г-КСФ, в течение максимального периода времени (1) 15 мин при осторожном перемешивании.
Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120±10 мин при рН 6,0 в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С, при осторожном встряхивании (концентрация белка: 1 мг/мл).
Полученный конъюгат ПСК-Г-КСФ далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат ПСК-Г-КСФ, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы (МПНроге).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности и определения степени полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Способ 3.
Гранулоцит-колониестимулирующий фактор (Г-КСФ) переносят в реакционный буфер (50 мМ Нерее, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и NаIΟ4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Затем реакцию гасят цистеином в течение 60 мин при комнатной температуре (концентрация цистеина: 10 мМ). Затем проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Нерее, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9), и загружают в колонку, заполненную Рйепу1 ЗерНагоее РР (СЕ НеаЛНсаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Нерее, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 0,01% Твин80, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ Нерее, 5 мМ кальция хлорида, рН 7.5. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСК-Г-КСФ, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (МПНроге). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 3 выполняют следующим образом. Гранулоцит- 101 025738 колониестимулирующий фактор (Г-КСФ) перенесли в реакционный буфер (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавили до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и ЫаЮ4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Затем реакцию гасят цистеином в течение 60 мин при комнатной температуре (концентрация цистеина: 10 мМ) и конъюгат далее очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат ПСК-Г-КСФ, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (МПНроге). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
Способ 4.
Г-КСФ растворяют или переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6.0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора НС1.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ОИН2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к этому раствору Г-КСФ в течение максимального периода времени (ΐ) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Наконец, добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 400 мкМ.
Реакционную смесь инкубируют 120±10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С при осторожном встряхивании. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора Ь-цистеина (1 М) до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60±5 мин.
Полученный конъюгат Г-КСФ очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции, содержащие ПСК-Г-КСФ, и концентрируют способом ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (МПНроге).
Конъюгаты, приготовленные по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности, в соответствии со способами, известными в области техники, и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Пример 29.
Полисиалирование Нитка с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора.
Способ 1.
Начальную концентрацию Нитка перенесли в реакционный буфер (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавили до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют ЫаЮ4 до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводят при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию гасят цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре.
Затем раствор подвергли ультрафильтрации/диафильтрации на центрифужных фильтраторах νΐуакрш для удаления избытка периодата, замедлителя и их побочных продуктов или, альтернативно, пропустили через ионообменную колонку с объемом 20 мл (Мегск ЕМО ТМАЕ (М)), которая была уравновешена буфером А (20 мМ Нерек, 5 мМ СаС12, рН 7,0). Колонку уравновешивают 5 ОК буфером А. Затем окисленный Нитка элюируют буфером В (20 мМ Нерек, 5 мМ СаС12, 1 М ЫаС1, рН 7,0). Далее собирают Ниш1га -содержащие фракции. Было определено содержание белка (Соотакяе, Брэдфорд), затем оно было доведено до 1 мг/мл реакционным буфером и доведено до рН 6,0 добавлением по каплям 0,5 М НС1.
Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток аминоокси-реагента удаляют при помощи гидрофобной хроматографии. Проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9), и загружают в колонку, заполненную 80 мл РНепу1 8ерНагоке РР (СЕ Неакксаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Нерек, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ буфером Нерек с рН 7,5, содержащим 5 мМ СаС12. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСК-Нитка, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (МПНроге). Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Соотакк1е, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
- 102 025738
В альтернативном варианте воплощения способ 1 выполняют следующим образом. Нитка переносят в реакционный буфер (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют NаIΟ4 до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводят при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию гасят цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре.
Потом раствор подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Утакрщ для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов. Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток аминоокси-реагента удаляют при помощи ионообменной хроматографии. Собирают фракции, содержащие ПСК-Нитка, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (МППроге). Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Соотакые, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
Способ 2.
Нитка переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6.0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора НС1. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30±5 мин при температуре (Т) Т=+22±2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора Ь-цистеина (1 М) в течение 15 мин при Т=+22±2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60±5 мин.
Окисленный Нитка далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный Нитка, собирают и используют для реакции конъюгации.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ОИН2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный Нитка, в течение максимального периода времени (ΐ) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор мтолуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120±10 мин при рН 6,0 в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С, при осторожном встряхивании (концентрация белка: 1 мг/мл).
Полученный конъюгат ПСК-Нитка далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат ПСК-Нитка, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы (МПНроге).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Способ 3.
Нитка переносят в реакционный буфер (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и NаIΟ4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Затем реакцию гасят цистеином в течение 60 мин при комнатной температуре (концентрация цистеина: 10 мМ). Затем проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9), и загружают в колонку, заполненную РЬепу1 БерЬагоке РР (ОЕ НеаНЬсаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Нерек, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 0,01% Твин-80, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ Нерек, 5 мМ кальция хлорида, рН 7.5. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСК-Нитка, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Мккроге). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 3 выполняют следующим образом. Нитка переносят в реакционный буфер (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и №·ιΙΟ4 (конечная концентрация: 400 мкМ).
- 103 025738
Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной, температуре и при осторожном встряхивании. Затем реакцию гасят цистеиномв течение 60 мин при комнатной температуре (концентрация цистеина: 10 мМ) и конъюгат далее очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат ПСК-НитЛа, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы ^Π^οΐΐ). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
Способ 4.
НитЛа растворяют или переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Нерез, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6.0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора НС1.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ОNН2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к этому раствору НитПа в течение максимального периода времени (!) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Наконец, добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 400 мкМ.
Реакционную смесь инкубируют 120±10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С при осторожном встряхивании. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора Ь-цистеина (1 М) до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60±5 мин.
Полученный конъюгат НцтЛа очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции, содержащие ПСК-НцтЛа, и концентрируют способом ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (М^11^ρο^е).
Конъюгаты, приготовленные по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности, в соответствии со способами, известными в области техники, и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Пример 30.
Полисиалирование РгоЛа с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора
Способ 1.
Начальную концентрацию РгоЛа перенесли в реакционный буфер (50 мМ Нерез, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавили до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют №Ю4 до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводят при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию гасят цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре.
Затем раствор подвергли ультрафильтрации/диафильтрации на центрифужных фильтраторах У1уазрт для удаления избытка периодата, замедлителя и их побочных продуктов или, альтернативно, пропустили через ионообменную колонку с объемом 20 мл (Мегск ЕМЭ ТМАЕ (М)), которая была уравновешена буфером А (20 мМ Нерез, 5 мМ СаС12, рН 7,0). Колонку уравновешивают 5 ОК буфером А. Затем окисленный РгоЛа элюируют буфером В (20 мМ Нерез, 5 мМ СаС12, 1 М №С1, рН 7,0). Далее собирают РгоПа -содержащие фракции. Определяют содержание белка (Сοοтазз^е. Брэдфорд), затем его доводят до 1 мг/мл реакционным буфером и доводят до рН 6,0 добавлением 0,5 М НС1 по каплям.
Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток аминоокси-реагента удаляют при помощи гидрофобной хроматографии. Проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Нерез, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9), и загружают в колонку, заполненную 80 мл Рйепу1 δеρЬагозе РР (ОЕ Неа1!йсаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Нерез, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ буфером Нерез с рН 7,5, содержащим 5 мМ СаС12. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСК-РгоЛа, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (М^Шρο^е). Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Сοοтазз^е, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 1 выполняют следующим образом. 10 мг РгоЛа растворяют в 5 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ №С1). Затем добавляют 100 мкл водного раствора периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 50 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтра- 104 025738 ции/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов УКакрш 15К 10 кДА для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат (приблизительно 7 мл), содержащий окисленный РгоЛа, смешивают с 2 мл водного раствора м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше) до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте, при осторожном перемешивании.
Свободный РгоЛа удаляют при помощи катионообменной хроматографии (СЕС). Реакционную смесь разбавляют 20 мл буфера А (50 мМ Нерек, рН 6,5) и загружают в 20 мл колонку ШРгер 8РРР 16/10 (СЕ НеаЛЬсаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером А. Затем колонку элюируют буфером В (50 мМ Нерек, 1 М ИаС1, рН 6,5). Свободный Ргойа элюируют, промывая колонку 25% буфером В, конъюгат - 50% буфером В. Проводимость конъюгат-содержащих фракций затем поднимают до ~190 мСм/см буфером С (50 мМ Нерек, 5 М ИаС1, рН 6,9) и загружают в 20 мл колонку ШРгер ВЩу1 РР 16/10 (СЕ Неа1!Ьсаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером Ό (50 мМ Нерек, 3 М ИаС1, рН 6,9). Свободный ПСК-реагент вымывали в 5 ОК буфера Ό. Затем конъюгат элюируют 100% буфера Е (50 мМ Нерек, рН 6,9). Конъюгат-содержащие фракции концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа, МЛЛроге). Конечный этап диафильтрации проводили против гистидинового буфера, рН 6,9, содержащего 150 мМ ИаС1. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники. Для конъюгата ПСК-РгоЛа определили характерную активность >50% в сравнении с нативным РгоЛа. Конъюгат дополнительно характеризуют аналитически эксклюзионной ВЭЖХ с использованием ВЭЖХ-системы АдЛеп! 1200, оснащенной колонкой 81юбех Κ\ν 803, в описанных ранее условиях (Ко1апсЬ е! а1., ТгапкГикюп 2006; 46:1959-77).
Показано, что в препарате не содержится свободный РгоЛа.
Способ 2.
РгоЛа переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6.0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора НС1. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30±5 мин при температуре (Т) Т=+22±2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора Ь-цистеина (1 М) в течение 15 мин при Т=+22±2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60±5 мин.
Окисленный РгоЛа далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный Ргойа, собирают и используют для реакции конъюгации.
Реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ОИН2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный РгоЛа в течение максимального периода времени (!) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120±10 мин при рН 6,0 в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С, при осторожном встряхивании (концентрация белка: 1 мг/мл).
Полученный конъюгат РгоЛа далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат Ргойа, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы (МЛЛроге).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Способ 3.
РгоЛа переносят в реакционный буфер (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и ИаЮ4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Затем реакцию гасят цистеином в течение 60 мин при комнатной температуре (концентрация цистеина: 10 мМ). Затем проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9), и загружают в колонку, заполненную РЬепу1 Зерйагоке РР (СЕ НеаЛЬсаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Нерек, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 0,01% Твин-80, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ Нерек, 5 мМ кальция хлорида, рН 7.5. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСК-РгоЛа, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (МЛЛроге). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содер- 105 025738 жания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 3 выполняют следующим образом. 10 мг Ргока растворяют в 8 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ №С1). Затем добавляют 200 мкл водного раствора периодата натрия (5 мМ) и 2 мл водного раствора м-толуидина (50 мМ). После этого добавляют реактив аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше) до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 100 мкл 1 М водного раствора цистеина.
Свободный Ргока удаляют при помощи катионообменной хроматографии (СЕС). Реакционную смесь разбавляют 20 мл буфера А (50 мМ Нерек, рН 6,5) и загружают в 20 мл колонку ШРгер 8РРР 16/10 (ОЕ Неакксаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером А. Затем колонку элюируют буфером В (50 мМ Нерек, 1 М №С1, рН 6,5). Свободный Ргока элюируют, промывая колонку 25% буфером В, конъюгат - 50% буфером В. Проводимость конъюгат-содержащих фракций затем поднимают до ~190 мСм/см буфером С (50 мМ Нерек, 5 М №С1, рН 6,9) и загружают в 20 мл колонку ШРгер Ви1у1 РР 16/10 (ОЕ Неакксаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером Ό (50 мМ Нерек, 3 М №С1, рН 6,9). Свободный ПСК-реагент вымывали в 5 ОК буфера Ό. Затем конъюгат элюируют 100% буфером Е (50 мМ Нерек, рН 6,9). Конъюгат-содержащие фракции концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/МПИроге). Конечный этап диафильтрации проводили против гистидинового буфера, рН 6,9, содержащего 150 мМ №С1. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники. Для конъюгата ПСК-РгоИа определили характерную активность >50% в сравнении с нативным Ргока. Конъюгат дополнительно характеризуют аналитически эксклюзионной ВЭЖХ с использованием ВЭЖХ-системы АдйеШ 1200, оснащенной колонкой 8койех Κ\ν 803, в описанных ранее условиях (Ко1апск е1 а1., ТгапкГикюп 2006; 46:1959-77).
Показано, что в препарате не содержится свободный Ргока.
Способ 4.
Ргока растворяют или переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6.0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректировали до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора НС1.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ΟNН2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к этому раствору Ргока в течение максимального периода времени (ΐ) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Наконец, добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 400 мкМ.
Реакционную смесь инкубируют 120±10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С, при осторожном встряхивании. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора Ь-цистеина (1 М) до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60±5 мин.
Полученный конъюгат Ргока очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции, содержащие ПСК-Ргока, и концентрируют способом ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Мйкроге).
Конъюгаты, приготовленные по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности, в соответствии со способами, известными в области техники, и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Пример 31.
Полисиалирование других терапевтических белков.
Реакции полисиалирования, которые проводятся в присутствии альтернативных нуклеофильных катализаторов типа м-толуидина или о-аминобензойной кислоты, как описано здесь, могут быть распространены на другие терапевтические белки. К примеру, в различных аспектах изобретения описанные выше реакции полисиалирования или ПЭГилирования с ПСК-аминоокси или ПЭГ-аминоокси реагентами повторяются с терапевтическими белками, такими, как те белки, которые описаны здесь.
Пример 32.
ПЭГилирование ЭПО с использованием реактива аминоокси-ПЭГ и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора.
Способ 1.
Эритропоэтин (ЭПО) ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит 8ипЬпдк1® С А серий от NΟΡ (NΟΡ Согр., Токио, Япония). ЭПО растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ Ьгистидина, 150 мМ №С1, 5 мМ СаС12). Затем добавляют водный раствор периодата натрия (5 мМ) и ин- 106 025738 кубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов УАакрт для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат, содержащий окисленный ЭПО, затем смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-ЭПО очищают ионообменной хроматографией (например, О 8ерЬагоке ΕΕ). К примеру, 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, уравновешенную 50 мМ буфером Нерек, рН 7,4 содержащим 5 мМ СаС12. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Нерек, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны с подходящим порогом отсечения по молекулярной массе. Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Соотакяе, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 1 выполняют следующим образом. ЭПО ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит 8ипЬг1§Ь!® СА серий от ЫОР (ЫОР Согр., Токио, Япония). 10 мг ЭПО растворяют в 5 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ ЫаС1). Затем добавляют 100 мкл водного раствора периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 50 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов УАакрт 15К 10 кДА для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат (приблизительно 7 мл), содержащий окисленный ЭПО, смешивают с 2 мл водного раствора м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описано выше) до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-ЭПО очищают ионообменной хроматографией на О 8ерЬагоке РР. Реакционную смесь разбавляют 20 мл буфера А (50 мМ Нерек, рН 7,5) и загружают в 20 мл колонку ШРгер ОРР 16/10 (СЕ НеаИЬсаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером А. Затем колонку элюируют буфером В (50 мМ Нерек, 1 М ЫаС1, рН 7,5). Свободный ЭПО элюируют, промывая колонку 25% буфером В, конъюгат - 50% буфером В. Конъюгат-содержащие фракции концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/МИНроге). Конечный этап диафильтрации проводили против гистидинового буфера, рН 7,2, содержащего 150 мМ ЫаС1. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники. Для конъюгата ПЭГ-ЭПО определили характерную активность >50% в сравнении с нативным ЭПО. Конъюгат дополнительно характеризуют аналитически эксклюзионной ВЭЖХ с использованием ВЭЖХ-системы АдПеШ 1200, оснащенной колонкой 8ЬоИех КУ 803, в описанных ранее условиях (Ко1апсЬ е! а1., ТгапкГикюп 2006; 46:1959-77). Показано, что в препарате не содержится свободный ЭПО.
Способ 2.
ЭПО ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит 8ипЬг1§Ь!® СА серий от ЫОР (ЫОР Согр., Токио, Япония).
ЭПО переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6.0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора НС1. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30±5 мин при температуре (Т) Т=+22±2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора Ь-цистеина (1 М) в течение 15 мин при Т=+22±2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60±5 мин.
Окисленный ЭПО далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный ЭПО, собирают и используют для реакции конъюгации.
Реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный ЭПО в течение максимального периода времени (!) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120±10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С, при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПЭГ-ЭПО далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содер- 107 025738 жащие конъюгат ПЭГ-ЭПО, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы (МПНроге).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
Способ 3.
ЭПО ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит §ипЬп§Ы® СА серий от ΝΟΡ (ΝΟΡ Согр., Токио, Япония). ЭПО растворяют в буфере Нерек (50 мМ Нерек, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и с водным раствором мтолуидина (50 мМ). Затем добавляют аминоокси-реактив до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-ЭПО очищают ионообменной хроматографией на О 8ерЬагоке ΡΡ. 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, предварительно уравновешенную 50 мМ буфером Нерек, рН 7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Нерек, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 3 выполняют следующим образом. ЭПО ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит ЗипЬпдЫ® СА серий от ΝΟΡ (ΝΟΡ Согр., Токио, Япония). 10 мг ЭПО растворяют в ~8 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ №С1). Затем добавляют 200 мкл водного раствора периодата натрия (5 мМ) и 2 мл водного раствора м-толуидина (50 мМ). После этого добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описано выше) до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 100 мкл 1 М водного раствора цистеина.
Наконец, конъюгат ПЭГ-ЭПО очищают ионообменной хроматографией на О 8ерЬагоке ΡΡ. Реакционную смесь разбавляют 20 мл буфера А (50 мМ Нерек, рН 7,5) и загружают в 20 мл колонку ШРгер ΟΡΡ 16/10 (ОЕ НеаИЬсаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером А. Затем колонку элюируют буфером В (50 мМ Нерек, 1 М №С1, рН 7,5). Свободный ЭПО элюируют, промывая колонку 25% буфером В, конъюгат - 50% буфером В. Конъюгат-содержащие фракции концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/МПНроге). Конечный этап диафильтрации проводили против гистидинового буфера, рН 7,2, содержащего 150 мМ №С1. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники. Для конъюгата ПЭГ-ЭПО определили характерную активность >50% в сравнении с нативным ЭПО. Конъюгат дополнительно характеризуют аналитически эксклюзионной ВЭЖХ с использованием ВЭЖХ-системы АдПеШ 1200, оснащенной колонкой §ЬоПех Κν 803, в описанных ранее условиях (Ко1апсЬ е1 а1., ^^8^8^ 2006; 46:1959-77). Показано, что в препарате не содержится свободный ЭПО.
Способ 4.
ЭПО ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит §ипЬп§Ы® СА серий от ΝΟΡ (ΝΟΡ Согр., Токио, Япония). Начальную концентрацию или массу ЭПО переносят или растворяют в буфере Нерек (50 мМ Нерек, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6.0) до конечной концентрации белка 2 мг ЭПО/мл. После этого в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 100 мкМ, затем добавляют 50 мМ водного раствора м-толуидина до получения конечной концентрации в 10 мМ в течение периода времени в 30 мин. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описано выше) до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. После доведения рН до 6,0 смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора Ьцистеина до конечной концентрации 10 мМ.
Конъюгат ПЭГ-ЭПО очищают при помощи ионообменной хроматографии (БЕС). Конъюгатсодержащие фракции элюата концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ.) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/МПНроге). Конечный этап диафильтрации проводили против буфера Нерек (50 мМ Нерек, 5 мМ
- 108 025738
СаС12, рН 7,5).
Препарат аналитически исследуют измерением общего содержания белка (процедура Брэдфорд и ВСА) и биологической активности согласно известным способам.
Пример 33.
ПЭГилирование Апд-2 с использованием реактива аминоокси-ПЭГ и м-толуидина в качестве нукле.офильного катализатора.
Способ 1.
Апд-2 ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит διιιΛπβΙιΙ® СА серий от ЛОР (ЛОР Согр., Токио, Япония). Апд-2 растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ ЛаС1, 5 мМ СаС12). Затем добавляют водный раствор периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов УЮакрш для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат, содержащий окисленный Апд-2, затем смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте, при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-Апд-2 очищают ионообменной хроматографией (например, на б δеρНа^οке РР). К примеру, 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, уравновешенную 50 мМ буфером Нерек, рН
7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Нерек, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны с подходящим порогом отсечения по молекулярной массе. Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Соотакяе, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 1 выполняют следующим образом. Апд-2 ПЭГ илируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит διιιΛπβΙιΙ® СА серий от ЛОР (ЛОР Согр., Токио, Япония). Апд-2 растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ ЛаС1, 5 мМ СаС12). Затем добавляют водный раствор периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Ущакрш для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат, содержащий, окисленный Апд-2, затем смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-Апд-2 очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны с подходящим порогом отсечения по молекулярной массе. Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (СоотакПе, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 2.
Апд-2 ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит διιιΛπβΙιΙ®® СА серий от ЛОР (ЛОР Согр., Токио, Япония).
Апд-2 переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6.0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора НС1. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30±5 мин при температуре (Т) Т=+22±2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора Ь-цистеина (1 М) в течение 15 мин при Т=+22±2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60±5 мин.
Окисленный Апд-2 далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный Апд-2, собирают и используют для реакции конъюгации.
Реактив аминоокси-ПЭГ с ММ- 20 кДа в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный Апд-2, в течение максимального периода времени (ΐ) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120±10 мин в темноте при температуре
- 109 025738 (Т) Т=+22±2°С, при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПЭГ-Апд-2 далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат ПЭГ-Апд-2, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы (Мййроге).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 3.
Апд-2 ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит διιιΛπβΗΐ® СА серий от Ν0Ρ (Ν0Ρ Согр., Токио, Япония). Апд-2 растворяют в буфере Шре8 (50 мМ Шре8, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и с водным раствором мтолуидина (50 мМ). Затем добавляют аминоокси-реактив до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-Апд-2 очищают ионообменной хроматографией на О δерЬа^о8е РР. 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, предварительно уравновешенную 50 мМ буфером Шре8, рН 7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Шре8, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 3 выполняют следующим образом. Апд-2 ПЭГ илируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит διιιΛπβΗΐ® СА серий от NОР (Ν0Ε Согр., Токио, Япония). Апд-2 растворяют в буфере Шре8 (50 мМ Шре8, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и с водным раствором м-толуидина (50 мМ). Затем добавляют аминоокси-реактив до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-Апд-2 очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 4.
Апд-2 ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит δΐΗΛπβΙιΙ® СА серий от NОР (Ν0Ε Согр., Токио, Япония). Начальную концентрацию или массу Апд-2 переносят или растворяют в буфере Шре8 (50 мМ Шре8, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6.0) до конечной концентрации белка 2 мг Апд-2/мл. После этого в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 100 мкМ, затем добавляют 50 мМ водного раствора м-толуидина до получения конечной концентрации в 10 мМ в течение периода времени в 30 мин. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описано выше) до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. После доведения рН до 6,0 смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора Ь-цистеина до конечной концентрации 10 мМ,
Конъюгат ПЭГ-Апд-2 очищают при помощи ионообменной хроматографии (ГЕС). Конъюгатсодержащие фракции элюата концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/Мййроге). Конечный этап диафильтрации проводили против буфера Шре8 (50 мМ Шре8, 5 мМ СаС12, рН 7,5).
Препарат аналитически характеризуют измерением общего содержания белка (процедура Брэдфорд и ВСА) и биологической активности согласно известным способам.
После этого свободный Апд-2 удаляют при помощи ионообменной хроматографии (ЬЕС). Конъюгат-содержащие фракции элюата концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ).
- 110 025738
Пример 34.
ПЭГилирование УЕСР с использованием реактива аминоокси-ПЭГ и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора.
Способ 1.
УЕСР ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит διιηόπβΐιΐ® СА серий от NОР (ΝΟΕ Согр., Токио, Япония). УЕСР растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ №С1, 5 мМ СаС12). Затем добавляют водный раствор периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Уйакрш для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат, содержащий окисленный УЕСР, затем смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-УЕСР очищают ионообменной хроматографией (например, на О δерЬа^оке РР). К примеру, 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, уравновешенную 50 мМ буфером Нерек, рН
7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Нерек, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны с подходящим порогом отсечения по молекулярной массе. Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Соотакяе, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 1 выполняют следующим образом. УЕСР ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит διιηόπβΐιΐ® СА серий от ЫОР (ЫОР Согр., Токио, Япония). УЕСР растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ ЫаС1, 5 мМ СаС12). Затем добавляют водный раствор периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Уйакрш для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат, содержащий окисленный УЕСР, затем смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте, при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-УЕСР очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны с подходящим порогом отсечения по молекулярной массе. Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Соошакйе, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 2.
УЕСР ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит διιηόπβΐιΐ® СА серий от ЫОР (ЫОР Согр., Токио, Япония).УЕСР переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректировали до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора НС1. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30±5 мин при температуре (Т) Т=+22±2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора Ь-цистеина (1 М) в течение 15 мин при Т=+22±2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60±5 мин.
Окисленный УЕСР далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный УЕСР, собирают и используют для реакции конъюгации.
Реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный УЕСР, в течение максимального периода времени (ΐ) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120±10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С, при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПЭГ-УЕСР далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат ПЭГ-УЕСР, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с подходящим отсечением молеку- 111 025738 лярной массы (МПНроге).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 3.
УЕОР ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит 8ипЬпд1и® СА серий от ЫОР (ЫОР Согр., Токио, Япония). УЕОР растворяют в буфере Нерек (50 мМ Нерек, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и с водным раствором мтолуидина (50 мМ). Затем добавляют аминсюкси-реактив до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-УЕОР очищают ионообменной хроматографией на О 8еркагоке РР. 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, предварительно уравновешенную 50 мМ буфером Нерек, рН 7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Нерек, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 3 выполняют следующим образом. УЕОР ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит 8ипЬпдк1® СА серий от ЫОР (ЫОР Согр., Токио, Япония). УЕОР растворяют в буфере Нерек (50 мМ Нерек, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и с водным раствором м-толуидина (50 мМ). Затем добавляют аминоокси-реактив до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-УЕОР очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 4.
УЕОР ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит 8ипЬпдк1® СА серий от ЫОР (ЫОР Согр., Токио, Япония). Начальную концентрацию или массу УЕОР переносят или растворяют в буфере Нерек (50 мМ Нерек, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 2 мг УЕОР/мл. После этого в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 100 мкМ, затем добавляют 50 мМ водного раствора м-толуидина до получения конечной концентрации в 10 мМ в течение периода времени 30 мин. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описано выше) до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. После доведения рН до 6,0 смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора Ь-цистеина до конечной концентрации 10 мМ.
Конъюгат ПЭГ-УЕОР очищают при помощи ионообменной хроматографии (1ЕС). Конъюгатсодержащие фракции элюата концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/МПНроге). Конечный этап диафильтрации проводили против буфера Нерек (50 мМ Нерек, 5 мМ СаС12, рН 7,5).
Препарат аналитически характеризуют измерением общего содержания белка (процедура Брэдфорд и ВСА) и биологической активности согласно известным способам.
Пример 35.
ПЭГилирование ФРЭ с использованием реактива аминоокси-ПЭГ и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора.
Способ 1.
ФРЭ ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит 8ипЬпдк® СА серий от ЫОР (ЫОР Согр., Токио, Япония). ФРЭ растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ ЫаС1, 5 мМ СаС12). Затем добавляют водный раствор периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15
- 112 025738 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Угуаерш для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат, содержащий окисленный ФРЭ, затем смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте, при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ -ФРЭ очищают ионообменной хроматографией (например, на О 8ерйагоее РР). К примеру, 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, уравновешенную 50 мМ буфером Нерее, рН
7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Нерее, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны с подходящим порогом отсечения по молекулярной массе. Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Соотаее1е, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 1 выполняют следующим образом. ФРЭ ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит §ипЬп§Ы® СА серий от NΟР ^ОР Согр., Токио, Япония). ФРЭ растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ №С1, 5 мМ СаС12). Затем добавляют водный раствор периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Угуаерш для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат, содержащий окисленный ФРЭ, затем смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте, при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-ФРЭ очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны с подходящим порогом отсечения по молекулярной массе. Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Соотаее1е, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 2.
ФРЭ ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит §ипЬп§Ы® СА серий от NΟР ^ОР Согр., Токио, Япония). ФРЭ переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Нерее, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректировали до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора НС1. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30±5 мин при температуре (Т) Т=+22±2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора Ь-цистеина (1 М) в течение 15 мин при Т=+22±2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60±5 мин.
Окисленный ФРЭ далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный ФРЭ, собирают и используют для реакции конъюгации.
Реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный ФРН, в течение максимального периода времени (1) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120±10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С, при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПЭГ-ФРЭ далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат ПЭГ-ФРЭ, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы (МПНроге).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 3.
ФРЭ ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит §ипЬп§Ы® СА серий от NΟР ^ОР Согр., Токио, Япония). ФРЭ растворяют в буфере Нерее (50 мМ Нерее, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и с водным раствором м- 113 025738 толуидина (50 мМ). Затем добавляют аминоокси-реактив до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-ФРЭ очищают ионообменной хроматографией на Ц-ЗерНагоке РР. 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, предварительно уравновешенную 50 мМ буфером Нерек, рН 7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Нерек, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 3 выполняют следующим образом. ФРЭ ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит ЗипЬпдШ® СА серий от NΟР (NΟР Согр., Токио, Япония). ФРЭ растворяют в буфере Нерек (50 мМ Нерек, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и с водным раствором м-толуидина (50 мМ). Затем добавляют аминоокси-реактив до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-ФРЭ очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 4.
ФРЭ ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит ЗипЬпдШ® СА серий от NΟР (NΟР Согр., Токио, Япония). Начальную концентрацию или массу ФРЭ переносят или растворяют в буфере Нерек (50 мМ Нерек, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 2 мг ФРЭ/мл. После этого в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 100 мкМ, затем добавляют 50 мМ водного раствора м-толуидина до получения конечной концентрации в 10 мМ в течение периода времени 30 мин. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описано выше) до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. После доведения рН до 6,0 смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора Ьцистеина до конечной концентрации 10 мМ.
Конъюгат ПЭГ-ФРЭ очищают при помощи ионообменной хроматографии (ГЕС). Конъюгатсодержащие фракции элюата концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/МЛНроге). Конечный этап диафильтрации проводили против буфера Нерек (50 мМ Нерек, 5 мМ СаС12, рН 7,5).
Препарат аналитически характеризуют измерением общего содержания белка (процедура Брэдфорд и ВСА) и биологической активности согласно известным способам.
Пример 36.
ПЭГилирование ФРН с использованием реактива аминоокси-ПЭГ и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора.
Способ 1.
ФРН ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит ЗипЬпдШ® СА серий от NΟР (NΟР Согр., Токио, Япония). ФРН растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ ЫаС1, 5 мМ СаС12). Затем добавляют водный раствор периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов УГОакрш для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат, содержащий окисленный ФРН, затем смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ -ФРН очищают ионообменной хроматографией (например, на Ц-ЗерНагоке РР). К примеру, 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, уравновешенную 50 мМ буфером Нерек, рН
- 114 025738
7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Нерек, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны с подходящим порогом отсечения по молекулярной массе. Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Соотаккге, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 1 выполняют следующим образом. ФРН ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит 8ипЬпд1и® СА серий от ЫОР (ЫОР Согр., Токио, Япония). ФРН растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ ЫаС1, 5 мМ СаС12). Затем добавляют водный раствор периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов УП'акрт для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат, содержащий окисленный ФРН, затем смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте, при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-ФРН очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны с подходящим порогом отсечения по молекулярной массе. Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Соотакк1е, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 2.
ФРН ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит 8ипЬпдН1® СА серий от ЫОР (ЫОР Согр., Токио, Япония). ФРН переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора НС1. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30±5 мин при температуре (Т) Т=+22±2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора Ь-цистеина (1 М) в течение 15 мин при Т=+22±2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60±5 мин.
Окисленный ФРН далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный ФРН, собирают и используют для реакции конъюгации.
Реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный ФРН, в течение максимального периода времени (ί) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120±10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПЭГ-ФРН далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат ПЭГ-ФРН, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы (МППроге).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 3.
ФРН ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит 8ипЬпдЙ® СА серий от ЫОР (ЫОР Согр., Токио, Япония). ФРН растворяют в буфере Нерек (50 мМ Нерек, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и с водным раствором мтолуидина (50 мМ). Затем добавляют аминоокси-реактив до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-ФРН очищают ионообменной хроматографией на О 8ерЬагоке РР. 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, предварительно уравновешенную 50 мМ буфером Нерек, рН 7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Нерек, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка
- 115 025738 (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 3 выполняют следующим образом. ФРН ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит 8ипЬп§Ы® СА серий от ЫОР (ЫОР Согр., Токио, Япония). ФРН растворяют в буфере Нерек (50 мМ Нерек, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и с водным раствором м-толуидина (50 мМ). Затем добавляют аминоокси-реактив до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-ФРН очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции, содержащие конъюгат, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 4.
ФРН ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит 8ипЬп§Ы® СА серий от ЫОР (ЫОР Согр., Токио, Япония). Начальную концентрацию или массу ФРН переносят или растворяют в буфере Нерек (50 мМ Нерек, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 2 мг ФРН/мл. После этого в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 100 мкМ, затем добавляют 50 мМ водного раствора м-толуидина до получения конечной концентрации в 10 мМ в течение периода времени 30 мин. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описано выше) до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. После доведения рН до 6,0 смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора Ьцистеина до конечной концентрации 10 мМ.
Конъюгат ПЭГ-ФРН очищают при помощи ионообменной хроматографии (ГЕС). Конъюгатсодержащие фракции элюата концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/МПНроге). Конечный этап диафильтрации проводили против буфера Нерек (50 мМ Нерек, 5 мМ СаС12, рН 7,5).
Препарат аналитически характеризуют измерением общего содержания белка (процедура Брэдфорд и ВСА) и биологической активности согласно известным способам.
Пример 37.
ПЭГилирование ГРЧ - с использованием реактива аминоокси-ПЭГ и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора.
Способ 1.
Как описано здесь, аминокислотную последовательность гормона роста человека (ГРЧ) сначала модифицируют, чтобы внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки ГРЧ гликозилируют ш νίΙΐΌ способами, известными в данной области техники.
ГРЧ ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого, типа реактивов служит 8ипЬп§Ы® СА серий от ЫОР (ЫОР Согр., Токио, Япония). ГРЧ растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ ЫаС1, 5 мМ СаС12). Затем добавляют водный раствор периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Укакрш для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат, содержащий окисленный ГРЧ, затем смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте, при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ -ГРЧ очищают ионообменной хроматографией (например, на О 8ерЬагоке РР). К примеру, 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, уравновешенную 50 мМ буфером Нерек, рН
7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Нерек, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны с подходящим порогом отсечения по молекулярной массе. Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Соотакяе, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 1 выполняют следующим образом. Как описано
- 116 025738 здесь, аминокислотную последовательность гормона роста человека (ГРЧ) сначала модифицируют, чтобы внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки ГРЧ гликозилируют ίη νίίΐΌ способами, известными в данной области техники.
ГРЧ ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит ЗипЬпдШ® СА серий от ΝΟΓ (ΝΟΓ Согр., Токио, Япония). ГРЧ растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ №С1, 5 мМ СаС12). Затем добавляют водный раствор периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Укакрш для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат, содержащий окисленный ГРЧ, затем смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте, при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-ГРЧ очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны с подходящим порогом отсечения по молекулярной массе. Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Соотакые, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 2.
Как описано здесь, аминокислотную последовательность гормона роста человека (ГРЧ) сначала модифицируют, чтобы внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки ГРЧ гликозилируют ίη νίΐΐΌ способами, известными в данной области техники.
ГРЧ ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит ЗипЬпдШ® СА серий от ΝΟΓ (ΝΟΓ Согр., Токио, Япония). ГРЧ переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора НС1. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30±5 мин при температуре (Т) Т=+22±2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора Ь-цистеина (1 М) в течение 15 мин при Т=+22±2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60±5 мин.
Окисленный ГРЧ далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный ГРЧ, собирают и используют для реакции конъюгации.
Реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный ГРЧ, в течение максимального периода времени (ΐ) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120±10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С, при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПЭГ-ГРЧ далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат ПЭГ-ФРН, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы (Мккроге).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 3.
Как описано здесь, аминокислотную последовательность гормона роста человека (ГРЧ) сначала модифицируют, чтобы внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки ГРЧ гликозилируют ίη νίϋΌ способами, известными в данной области техники.
ГРЧ ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит ЗипЬпдШ® СА серий от ΝΟΓ (ΝΟΓ Согр., Токио, Япония). ГРЧ растворяют в буфере Нерек (50 мМ Нерек, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и с водным раствором мтолуидина (50 мМ). Затем добавляют аминоокси-реактив до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-ГРЧ очищают ионообменной хроматографией на Ц-БерЬагоке РР. 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, предварительно уравновешенную 50 мМ буфером Нерек, рН 7,4,
- 117 025738 содержащим 5 мМ СаС12. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Нерек, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 3 выполняют следующим образом. Как описано здесь, аминокислотную последовательность гормона роста человека (ГРЧ) сначала модифицируют, чтобы внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки ГРЧ гликозилируют ш уйго способами, известными в данной области техники. ГРЧ ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит 8ипЬг1§Ь!® СА серий от ИОР (ИОР Согр., Токио, Япония). ГРЧ растворяют в буфере Нерек (50 мМ Нерек, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и с водным раствором м-толуидина (50 мМ). Затем добавляют аминоокси-реактив до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-ГРЧ очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции, содержащие конъюгат, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 4.
Как описано здесь, аминокислотную последовательность гормона роста человека (ГРЧ) сначала модифицируют, чтобы внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки ГРЧ гликозилируют ш уйго способами, известными в данной области техники.
ГРЧ ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит 8ипЬпд1ц® СА серий от ИОР (ИОР Согр., Токио, Япония). Начальную концентрацию или массу ГРЧ переносят или растворяют в буфере Нерек (50 мМ Нерек, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 2 мг ГРЧ/мл. После этого в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 100 мкМ, затем добавляют 50 мМ водного раствора м-толуидина до получения конечной концентрации в 10 мМ в течение периода времени в 30 мин. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описано выше) до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. После доведения рН до 6,0 смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора Ьцистеина до конечной концентрации 10 мМ.
Конъюгат ПЭГ-ГРЧ очищают при помощи ионообменной хроматографии (ЛЕС). Конъюгатсодержащие фракции элюата концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/МЛНроге). Конечный этап диафильтрации проводили против буфера Нерек (50 мМ Нерек, 5 мМ СаС12, рН 7,5).
Препарат аналитически характеризуют измерением общего содержания белка (процедура Брэдфорд и ВСА) и биологической активности известными способами.
Пример 38.
ПЭГилирование ФНО-альфа с использованием реактива аминоокси-ПЭГ и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора.
Способ 1.
ФНО-альфа ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит 8ипЬг1§Ь!® СА серий от ИОР (ИОР Согр., Токио, Япония). ФНО-альфа растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ Ьгистидина, 150 мМ ИаС1, 5 мМ СаС12). Затем добавляют водный раствор периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Ууакрш для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат, содержащий окисленный ФНО-альфа, затем смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте, при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-ФНО-альфа очищают ионообменной хроматографией (например, на Ц8ерЬагоке РР). К примеру, 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, уравновешенную 50 мМ буфером Нерек, рН 7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Нерек, содержащим 5 мМ
- 118 025738
СаС12 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны с подходящим порогом отсечения по молекулярной массе. Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Сοοтазз^е. Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 1 выполняют следующим образом. ФНО-альфа ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит δиηЪ^^дЬ!® СА серий от ЫОР (ЫОР Согр., Токио, Япония). ФНО-альфа растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ ЫаС1, 5 мМ СаС12). Затем добавляют водный раствор периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов УЛазрш для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат, содержащий окисленный ФНО-альфа, затем смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте, при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-ФНО-альфа очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны с подходящим порогом отсечения по молекулярной массе. Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Сοοтазз^е. Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 2.
ФНО-альфа ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит διιΐ'Λ^ΙιΙ® СА серий от ЫОР (ЫОР Соцз., Токио, Япония). ФНО-альфа переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Нерез, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора НС1. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30±5 мин при температуре (Т) Т=+22±2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора Ь-цистеина (1 М) в течение 15 мин при Т=+22±2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60±5 мин.
Окисленный ФНО-альфа далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный ФНО-альфа, собирают и используют для реакции конъюгации.
Реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный ФНО-альфа, в течение максимального периода времени (!) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120±10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПЭГ-ФНО-альфа далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат ПЭГ-ФНО-альфа, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы ^Π^οΐΐ).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 3.
ФНО-альфа ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит διιΐ'Λ^ΙιΙ® СА серий от ЫОР (ЫОР Согр., Токио, Япония). ФНО-альфа растворяют в буфере Нерез (50 мМ Нерез, 150 мМ натрия хлорида/5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и с водным раствором м-толуидина (50 мМ). Затем добавляют аминоокси-реактив до достижения 20кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-ФНО-альфа очищают ионообменной хроматографией на О^ерПагозе РР.
1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, предварительно уравновешенную 50 мМ буфером Нерез, рН
7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Нерез, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной облас- 119 025738 ти техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 3 выполняют следующим образом. ФНО-альфа ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит 8ипЬг1дк1® СА серий от NΟΡ (NΟΡ Согр., Токио, Япония). ФНО-альфа растворяют в буфере Нерек (50 мМ Нерек, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и с водным раствором мтолуидина (50 мМ). Затем добавляют аминоокси-реактив до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-ФНО-альфа очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции, содержащие конъюгат, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 4.
ФНО-альфа ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит 8ипЬпдк1® СА серий от NΟΡ (NΟΡ Согр., Токио, Япония). Начальную концентрацию или массу ФНО-альфа переносят или растворяют в буфере Нерек (50 мМ Нерек, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 2 мг ФНО-альфа/мл. После этого в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 100 мкМ, затем добавляют 50 мМ водного раствора м-толуидина до получения конечной концентрации в 10 мМ в течение периода времени 30 мин. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описано выше) до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. После доведения рН до 6,0 смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора Ь-цистеина до конечной концентрации 10 мМ.
Конъюгат ПЭГ-ФНО-альфа очищают при помощи ионообменной хроматографии (1ЕС). Конъюгатсодержащие фракции элюата концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/МПИроге). Конечный этап диафильтрации проводили против буфера Нерек (50 мМ Нерек, 5 мМ СаС12, рН 7,5).
Препарат аналитически характеризуют измерением общего содержания белка (процедура Брэдфорд и ВСА) и биологической активности известными способами.
Пример 39.
ПЭГилирование инсулина с использованием реактива аминоокси-ПЭГ и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора.
Способ 1.
Как описано здесь, аминокислотную последовательность инсулина сначала модифицируют, чтобы внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки инсулин гликозилируют ш уйго способами, известными в данной области техники. Инсулин ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит 8ипЬп§Ы® СА серий от NΟΡ (NΟΡ Согр., Токио, Япония). Инсулин растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ №С1, 5 мМ СаС12). Затем добавляют водный раствор периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением
7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов УШакрш для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат, содержащий окисленный инсулин, затем смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте, при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-инсулин очищают ионообменной хроматографией (например, на Ц8еркагоке РР). К примеру, 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, уравновешенную 50 мМ буфером Нерек, рН 7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Нерек, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны с подходящим порогом отсечения по молекулярной массе. Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Соотакк1е, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 1 выполняют следующим образом. Как описано здесь, аминокислотную последовательность инсулина сначала модифицируют, чтобы внедрить по мень- 120 025738 шей мере один сайт гликозилирования. После очистки инсулин гликозилируют ш уйго способами, известными в данной области техники. Инсулин ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит διιΐ'ΐЬпдН® СА серий от ЛОР (ЛОР Согр., Токио, Япония). Инсулин растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ ЛаС1, 5 мМ СаС12). Затем добавляют водный раствор периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов УЮакрш для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат, содержащий окисленный инсулин, затем смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте, при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-инсулин очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны с подходящим порогом отсечения по молекулярной массе. Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Соотакяе, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 2.
Как описано здесь, аминокислотную последовательность инсулина сначала модифицируют, чтобы внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки инсулин гликозилируют ш уйго способами, известными в данной области техники.
Инсулин ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования,- содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит διιιΛπβΙιΙ®® СА серий от ЛОР (ЛОР Согр., Токио, Япония). Инсулин переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректировали до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора НС1. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30±5 мин при температуре (Т) Т=+22±2°С. Затем реакцию гасят добавлением водного раствора Ь-цистеина (1 М) в течение 15 мин при Т=+22±2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60±5 мин.
Окисленный инсулин далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный инсулин, собирают и используют для реакции конъюгации.
Реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный инсулин, в течение максимального периода времени (ΐ) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120±10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С, при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПЭГ-инсулин далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат ПЭГ-инсулин, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы (Мййроге).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 3.
Как описано здесь, аминокислотную последовательность инсулина сначала модифицируют, чтобы внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки инсулин гликозилируют ш уйго способами, известными в данной области техники.
Инсулин ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит διιιΛπβΙιΙ®® СА серий от ЛОР (ЛОР Согр., Токио, Япония). Инсулин растворяют в буфере Нерек (50 мМ Нерек, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и с водным раствором м-толуидина (50 мМ). Затем добавляют аминоокси-реактив до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-инсулин очищают ионообменной хроматографией на б δеρНа^οке РР. 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, предварительно уравновешенную 50 мМ буфером Нерек, рН 7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Нерек, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ
- 121 025738 натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 3 выполняют следующим образом. Как описано здесь, аминокислотную последовательность инсулина сначала модифицируют, чтобы внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки инсулин гликозилируют ш уйго способами, известными в данной области техники. Инсулин ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит 8ипЬй§Ы® СА серий от ΝΟΡ (ΝΟΡ Согр., Токио, Япония). Инсулин растворяют в буфере Нере8 (50 мМ Нере8, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и с водным раствором м-толуидина (50 мМ). Затем добавляют аминоокси-реактив до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат инсулина очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции, содержащие конъюгат, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 4.
Как описано здесь, аминокислотную последовательность инсулина сначала модифицируют, чтобы внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки инсулин гликозилируют ш уйго способами, известными в данной области техники.
Инсулин ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит 8ипЬп§Ы® СА серий от ΝΟΡ (ΝΟΡ Согр., Токио, Япония). Начальную концентрацию или массу инсулина переносят или растворяют в буфере Нере8 (50 мМ Нере8, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 2 мг инсулина/мл. После этого в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 100 мкМ, затем добавляют 50 мМ водного раствора м-толуидина до получения конечной концентрации в 10 мМ в течение периода времени 30 мин. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описано выше) до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. После доведения рН до 6,0 смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора Ь-цистеина до конечной концентрации 10 мМ.
Конъюгат ПЭГ-инсулин очищают при помощи ионообменной хроматографии (1ЕС). Конъюгатсодержащие фракции элюата концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/Мййроге). Конечный этап диафильтрации проводили против буфера Нере8 (50 мМ Нере8, 5 мМ СаС12, рН 7,5).
Препарат аналитически характеризуют измерением общего содержания белка (процедура Брэдфорд и ВСА) и биологической активности известными способами.
Пример 40.
ПЭГилирование интерферона-альфа с использованием реактива аминоокси-ПЭГ и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора.
Способ 1.
Интерферон-альфа ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит ЗипЬпдШ® СА серий от ΝΟΡ (ΝΟΡ Согр., Токио, Япония). Интерферон-альфа растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ №С1, 5 мМ СаС12). Затем добавляют водный раствор периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов У1уа8рш для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат, содержащий окисленный интерферон-альфа, затем смешивают с водным раствором мтолуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют
2,5 ч при комнатной температуре в темноте, при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-интерферон-альфа очищают ионообменной хроматографией (например, на О-8ерНаго8е ΡΡ). К примеру, 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, уравновешенную 50 мМ буфером Нере8, рН 7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Нере8, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ)
- 122 025738 с использованием мембраны с подходящим порогом отсечения по молекулярной массе. Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Соота881е, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 1 выполняют следующим образом. Интерферональфа ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит δϋώΓΪ§Η® СА серий от NОР (Ν0Ε Согр., Токио, Япония). Интерферон-альфа растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ №С1, 5 мМ СаС12). Затем добавляют водный раствор периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов ^уа8рш для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат, содержащий окисленный интерферон-альфа, затем смешивают с водным раствором мтолуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют
2,5 ч при комнатной температуре в темноте, при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-интерферон-альфа очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны с подходящим порогом отсечения по молекулярной массе. Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Соота881е, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 2.
Интерферон-альфа ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит δϋ^ΓΐβΗ® СА серий от NОР (Ν0Ε Согр., Токио, Япония). Интерферон-альфа переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Шре8, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректировали до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора ΗΟ. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30±5 мин при температуре (Т) Т=+22±2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора Ь-цистеина (1 М) в течение 15 мин при Т=+22±2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60±5 мин.
Окисленный интерферон-альфа далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный интерферон-альфа, собирают и используют для реакции конъюгации.
Реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный интерферон-альфа, в течение максимального периода времени (!) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120±10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С, при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПЭГ-интерферон-альфа далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат ПЭГ-интерферон-альфа, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы (Мййроге).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 3.
Интерферон-альфа ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит δϋώΓΪ§Η® СА серий от NОР (Ν0Ε Согр., Токио, Япония). Интерферон-альфа растворяют в буфере Шре8 (50 мМ Шре8, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и с водным раствором м-толуидина (50 мМ). Затем добавляют аминоокси-реактив до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-интерферон-альфа очищают ионообменной хроматографией на 0δерйа^о8е РР. 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, предварительно уравновешенную 50 мМ буфером №ре8, рН 7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Шре8, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
- 123 025738
В альтернативном варианте воплощения способ 3 выполняют следующим образом. Интерферональфа ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит 8ипЬг1§Ь!® СА серий от ЫОР (ЫОР Согр., Токио, Япония). Интерферон-альфа растворяют в буфере Нерек (50 мМ Нерек, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и с водным раствором м-толуидина (50 мМ). Затем добавляют аминоокси-реактив до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-интерферон-альфа очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции, содержащие конъюгат, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 4.
Интерферон-альфа ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит 8ипЬг1§Ь!® СА серий от ЫОР (ЫОР Согр., Токио, Япония). Начальную концентрацию или массу интерферона-альфа переносят или растворяют в буфере Нерек (50 мМ Нерек, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 2 мг интерферона-альфа/мл. После этого в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 100 мкМ, затем добавляют 50 мМ водного раствора м-толуидина до получения конечной концентрации в 10 мМ в течение периода времени 30 мин. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описано выше) до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. После доведения рН до 6,0 смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании,-затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора Ь-цистеина до конечной концентрации 10 мМ.
Конъюгат ПЭГ-интерферон-альфа очищают при помощи ионообменной хроматографии (1ЕС). Конъюгат-содержащие фракции элюата концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/МИНроге). Конечный этап диафильтрации проводили против буфера Нерек (50 мМ Нерек, 5 мМ СаС12, рН 7,5).
Препарат аналитически характеризуют измерением общего содержания белка (процедура Брэдфорд и ВСА) и биологической активности известными способами.
Пример 41.
ПЭГилирование интерферона-гамма с использованием реактива аминоокси-ПЭГ и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора.
Способ 1.
Интерферон-гамма ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит 8ипЬг1§Ь!® СА серий от ЫОР (ЫОР Согр., Токио, Япония). 10 мг интерферона-гамма растворяют в 5 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ ЫаС1). Затем добавляют 100 мкл водного раствора периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 50 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Укакрш 15К 10 кДА для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат (приблизительно 7 мл), содержащий окисленный интерферон-гамма, смешивают с 2 мл водного раствора м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описано выше) до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте, при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-интерферон-гамма очищают ионообменной хроматографией на 8Р 8ерЬагоке РР. Реакционную смесь разбавляют 20 мл буфера А (50 мМ Нерек, рН 6,5) и загружают в 20 мл колонку ШРгер 8РРР 16/10 (СЕ НеаИЬсаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером А. Затем колонку элюируют буфером В (50 мМ Нерек, 1 М ЫаС1, рН 6,5). Свободный интерферон-гамма элюируют, промывая колонку 25% буфером В, конъюгат - 50% буфером В. Конъюгатсодержащие фракции концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/МИНроге). Конечный этап диафильтрации проводили против гистидинового буфера, рН 6,9, содержащего 150 мМ ЫаС1. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания
- 124 025738 белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники. Для конъюгата ПЭГ-интерферон-гамма определили характерную активность >50% в сравнении с нативным интерфероном-гамма. Конъюгат дополнительно характеризуют аналитически эксклюзионной ВЭЖХ с использованием ВЭЖХ-системы АдПеШ 1200, оснащенной колонкой §Ьобех Κν 803, в описанных ранее условиях (Ко1апсЬ е1 а1., Τ^аηкίик^οη 2006; 46:1959-77). Показано, что в препарате не содержится свободный интерферон-гамма.
Способ 2.
Интерферон-гамма ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит ШпЬпдШ® СА серий от ΝΟΡ (ΝΟΡ Согр., Токио, Япония). Интерферон-гамма переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректировали до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора НС1. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30±5 мин при температуре (Т) Т=+22±2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора Ь-цистеина (1 М) в течение 15 мин при Т=+22±2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60±5 мин.
Окисленный интерферон-гамма далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный интерферон-гамма, собирают и используют для реакции конъюгации.
Реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный интерферон-гамма, в течение максимального периода времени (!) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120±10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С, при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПЭГ-интерферон-гамма далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат ПЭГ-интерферон-гамма, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы (МПНроге).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 3.
Интерферон-гамма ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит ШпЬпдШ® СА серий от ΝΟΡ (ΝΟΡ Согр., Токио, Япония). 10 мг интерферона-гамма растворяют в ~8 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ №С1). Затем добавляют 200 мкл водного раствора периодата натрия (5 мМ) и 2 мл водного раствора м-толуидина (50 мМ). После этого добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описано выше) до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 100 мкл 1 М водного раствора цистеина.
Наконец, конъюгат ПЭГ-интерферон-гамма очищают ионообменной хроматографией на 8Р8ерЬагоке ΡΡ. Реакционную смесь разбавляют 20 мл буфера А (50 мМ Нерек, рН 6,5) и загружают в 20 мл колонку ШРгер §Р ΡΡ 16/10 (ОЕ НеаИЬсаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером А. Затем колонку элюируют буфером В (50 мМ Нерек, 1 М №С1, рН 6,5). Свободный интерферон-гамма элюируют, промывая колонку 25% буфером В, конъюгат - 50% буфером В. Конъюгатсодержащие фракции концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/МПНроге). Конечный этап диафильтрации проводили против гистидинового буфера, рН 6,9, содержащего 150 мМ №С1. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники. Для конъюгата ПЭГ-интерферон-гамма определили характерную активность >50% в сравнении с нативным интерфероном-гамма. Конъюгат дополнительно характеризуют аналитически эксклюзионной ВЭЖХ с использованием ВЭЖХ-системы АдПеШ 1200, оснащенной колонкой §ЬоПех Κν 803, в описанных ранее условиях (Ко1апсЬ е1 а1., Τ^аηкίик^οη 2006; 46:1959-77). Показано, что в препарате не содержится свободный интерферон-гамма
Способ 4.
Интерферон-гамма ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит §ипЬпдЬ1® СА серий от ΝΟΡ (ΝΟΡ Согр., Токио, Япония). Начальную концентрацию или массу интерферона-гамма переносят или растворяют в буфере Нерек (50 мМ Нерек, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 2 мг интерферона-гамма/мл. После этого в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 100 мкМ, затем добавляют 50 мМ водного рас- 125 025738 твора м-толуидина до получения конечной концентрации в 10 мМ в течение периода времени 30 мин. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описано выше) до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. После доведения рН до 6, 0 смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора Ь-цистеина до конечной концентрации 10 мМ.
Конъюгат ПЭГ-интерферон-гамма очищают при помощи ионообменной хроматографии (1ЕС). Конъюгат-содержащие фракции элюата концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/МПНроге). Конечный этап диафильтрации проводили против буфера Нерек (50 мМ Нерек, 5 мМ СаС12, рН 7,5).
Препарат аналитически характеризуют измерением общего содержания белка (процедура Брэдфорд и ВСА) и биологической активности известными способами.
Пример 42.
ПЭГилирование Г-КСФ с использованием реактива аминоокси-ПЭГ и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора.
Способ 1.
Г-КСФ ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит διιηόπβΐιΐ®® СА серий от ЫОР (ЫОР Согр., Токио, Япония). Г-КСФ растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ ЫаС1, 5 мМ СаС12). Затем добавляют водный раствор периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Уйакрш для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат, содержащий окисленный Г-КСФ, затем смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте, при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-Г-КСФ очищают ионообменной хроматографией (например, на ЦδерЬа^оке РР). К примеру, 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, уравновешенную 50 мМ буфером Нерек, рН 7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Нерек, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны с подходящим порогом отсечения по молекулярной массе. Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Соотакк1е, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 1 выполняют следующим образом. Г-КСФ ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит διιηόπβΐιΐ®® СА серий от ЫОР (ЫОР Согр., Токио, Япония). Г-КСФ растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ ЫаС1, 5 мМ СаС12). Затем добавляют водный раствор периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Уйакрш для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат, содержащий окисленный Г-КСФ, затем смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте, при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-Г-КСФ очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны с подходящим порогом отсечения по молекулярной массе. Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Соотакяе, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 2.
Г-КСФ ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит διιηόπβΐιΐ®® СА серий от ЫОР (ЫОР Согр., Токио, Япония). Г-КСФ переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора НС1. После
- 126 025738 этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30±5 мин при температуре (Т) Т=+22±2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора Ь-цистеина (1 М) в течение 15 мин при Т=+22±2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60±5 мин.
Окисленный Г-КСФ далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный Г-КСФ, собирают и используют для реакции конъюгации.
Реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный Г-КСФ, в течение максимального периода времени (1) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120±10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С, при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПЭГ-Г-КСФ далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат ПЭГ-Г-КСФ, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы (МПНроге).
Способ 3.
Г-КСФ ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит §ипЬп§Ы® СА серий от NΟР ^ОР Согр., Токио, Япония). Г-КСФ растворяют в буфере Нерее (50 мМ Нерее, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и с водным раствором м-толуидина (50 мМ). Затем добавляют аминоокси-реактив до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-Г-КСФ очищают ионообменной хроматографией на С-ЗерНагоее РР. 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, предварительно уравновешенную 50 мМ буфером Нерее, рН 7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Нерее, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 3 выполняют следующим образом. Г-КСФ ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит §ипЬп§Ы® СА серий от NΟР ^ОР Согр., Токио, Япония). Г-КСФ растворяют в буфере Нерее (50 мМ Нерее, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и с водным раствором м-толуидина (50 мМ). Затем добавляют аминоокси-реактив до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-Г-КСФ очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 4.
Г-КСФ ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит §ипЬп§Ы® СА серий от NΟР ^ОР Согр., Токио, Япония). Начальную концентрацию или массу Г-КСФ переносят или растворяют в буфере Нерее (50 мМ Нерее, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 2 мг Г-КСФ/мл. После этого в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 100 мкМ, затем добавляют 50 мМ водного раствора м-толуидина до получения конечной концентрации в 10 мМ в течение периода времени 30 мин. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описано выше) до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. После доведения рН до 6,0 смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора Ь-цистеина до конечной концентрации 10 мМ.
Конъюгат Г-КСФ очищают при помощи ионообменной хроматографии (1ЕС). Конъюгатсодержащие фракции элюата концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/МПНроге). Конечный этап диафильтрации проводили против буфера Нерее (50 мМ Нерее, 5 мМ
- 127 025738
СаС12, рН 7,5).
Препарат аналитически характеризуют измерением общего содержания белка (процедура Брэдфорд и ВСА) и биологической активности известными способами.
Пример 43.
ПЭГ илирование Нитка с использованием реактива аминоокси-ПЭГ и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора
Способ 1.
Нитка ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит 8ипЬкдк® СА серий от ЫОР (ЫОР Согр., Токио, Япония). Нитка растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ ЫаС1, 5 мМ СаС12). Затем добавляют водный раствор периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Укакрш для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат, содержащий окисленный Нитка, затем смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-Нитка очищают ионообменной хроматографией (например, на 08еркагоке РР). К примеру, 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, уравновешенную 50 мМ буфером Нерек, рН 7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Нерек, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны с подходящим порогом отсечения по молекулярной массе. Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Соотакше, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 1 выполняют следующим образом. Нитка ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит 8ипЬпдк1®® СА серий от ЫОР (ЫОР Согр., Токио, Япония). Нитка растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ ЫаС1, 5 мМ СаС12). Затем добавляют водный раствор периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Укакрш для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат, содержащий окисленный Нитка, затем смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте, при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-Нитка очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны с подходящим порогом отсечения по молекулярной массе. Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Соотакые, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 2.
Нитка ПЭГ илируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГ илирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит 8ипЬпдк1®® СА серий от ЫОР (ЫОР Согр., Токио, Япония). Нитка переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора НС1. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30±5 мин при температуре (Т) Т=+22±2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора Ь-цистеина (1 М) в течение 15 мин при Т=+22±2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60±5 минт.
Окисленный Нитка далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный Нитка, собирают и используют для реакции конъюгации.
Реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный Нитка, в течение максимального периода времени (ΐ) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120±10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С, при осторожном встряхивании.
- 128 025738
Полученный конъюгат ПЭГ-Нитка далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат ПЭГ-Нитка, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы (МППроге).
Способ 3.
Нитка ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит 8ипЬпдЙ® СА серий от ЫОР (ЫОР Согр., Токио, Япония). Нитка растворяют в буфере Нерек (50 мМ Нерек, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и с водным раствором м-толуидина (50 мМ). Затем добавляют аминоокси-реактив до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-Нитка очищают ионообменной хроматографией на Ц-8ерЬагоке РР. 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, предварительно уравновешенную 50 мМ буфером Нерек, рН 7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Нерек, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 3 выполняют следующим образом. Нитка ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит 8ипЬг1дН1® СА серий от ЫОР (ЫОР Согр., Токио, Япония). Нитка растворяют в буфере Нерек (50 мМ Нерек, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и с водным раствором м-толуидина (50 мМ). Затем добавляют аминоокси-реактив до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ -Нитка очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции, содержащие конъюгат, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 4.
Нцтка ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит 8ипЬкдЫ® СА серий от ЫОР (ЫОР Согр., Токио, Япония). Начальную концентрацию или массу Нитка переносят или растворяют в буфере Нерек (50 мМ Нерек, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 2 мг Нцтка/мл. После этого в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 100 мкМ, затем добавляют 50 мМ водного раствора м-толуидина до получения конечной концентрации в 10 мМ в течение периода времени 30 мин. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описано выше) до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. После доведения рН до 6,0 смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора Ь-цистеина до конечной концентрации 10 мМ.
Конъюгат Нитка очищают при помощи ионообменной хроматографии (1ЕС). Конъюгатсодержащие фракции элюата концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/МППроге). Конечный этап диафильтрации проводили против буфера Нерек (50 мМ Нерек, 5 мМ СаС12, рН 7,5).
Препарат аналитически характеризуют измерением общего содержания белка (процедура Брэдфорд и ВСА) и биологической активности известными способами.
Пример 44.
ПЭГилирование РгоПа с использованием реактива аминоокси-ПЭГ и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора.
Способ 1.
РгоПа ПЭГ илируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГ илирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит 8ипЬкдЫ® СА серий от ЫОР (ЫОР Согр., Токио, Япония). РгоПа растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ ЫаС1, 5 мМ СаС12). Затем добавляют водный раствор периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение
- 129 025738 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Уйакрш для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат, содержащий окисленный РгоНа, затем смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте, при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ -РгоНа очищают ионообменной хроматографией (например, на Ц-ЗерНагоке РР). К примеру, 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, уравновешенную 50 мМ буфером Нерек, рН 7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Нерек, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны с подходящим порогом отсечения по молекулярной массе. Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Соотакяе, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 1 выполняют следующим образом. РгоНа ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит ЗипЬЛдЙ® СА серий от NΟР (NΟР Согр., Токио, Япония). 10 мг рф-ΙΧ растворяют в 5 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ ЫаС1). Затем добавляют 100 мкл водного раствора периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 50 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Уйакрш 15К 10 кДА для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат (приблизительно 7 мл), содержащий окисленный РгоНа, смешивают с 2 мл водного раствора м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описано выше) до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ -РгоНа очищают ионообменной хроматографией на ЗР ЗерНагоке РР. Реакционную смесь разбавляют 20 мл буфера А (50 мМ Нерек, рН 6,5) и загружают в 20 мл колонку ШРгер ЗР РР 16/10 (СЕ НеаННсаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером А. Затем колонку элюируют буфером В (50 мМ Нерек, 1 М ЫаС1, рН 6,5). Свободный РгоНа элюируют, промывая колонку 25% буфером В, конъюгат - 50% буфером В. Конъюгат-содержащие фракции концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/МйНроге). Конечный этап диафильтрации проводили против гистидинового буфера, рН 6,9, содержащего 150 мМ ЫаС1. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники. Для конъюгата ПЭГРгоНа определили характерную активность >50% в сравнении с нативным РгоНа. Конъюгат дополнительно характеризуют аналитически эксклюзионной ВЭЖХ с использованием ВЭЖХ-системы АдЛей 1200, оснащенной колонкой ЗНойех К\У 803, в описанных ранее условиях (Ко1апсН е( а1., Τ^аηкГик^οη 2006; 46:1959-77). Показано, что в препарате не содержится свободный РгоНа.
Способ 2.
РгоНа ПЭГ илируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГ илирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит ЗипЬЛдЙ® СА серий от NΟР (NΟР Согр., Токио, Япония). РгоНа переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Нерек, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора НС1. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30±5 мин при температуре (Т) Т=+22±2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора Ь-цистеина (1 М) в течение 15 мин при Т=+22±2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60±5 мин.
Окисленный РгоНа далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный Нитгга, собирают и используют для реакции конъюгации.
Реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный РгоНа в течение максимального периода времени (ί) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120±10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С, при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПЭГ-РгоНа далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат ПЭГ -РгоНа, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы с подходящим отсечением молеку- 130 025738 лярной массы (Мйкроге).
Способ 3.
Ргока ПЭГ илируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГ илирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит 8ипЬпдк1® СА серий от NΟΡ (NΟΡ Согр., Токио, Япония). ЭПО растворяют в буфере Нерек (50 мМ Нерек, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и с водным раствором мтолуидина (50 мМ). Затем добавляют аминоокси-реактив до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-Ргока очищают ионообменной хроматографией на Ц-8еркагоке РР. 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, предварительно уравновешенную 50 мМ буфером Нерек, рН 7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Нерек, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 3 выполняют следующим образом.
Ргока ПЭГ илируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГ илирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит 8ипЬпдк1® СА серий от NΟΡ (NΟΡ Согр., Токио, Япония). 10 мг Ргока растворяют в ~8 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ №С1). Затем добавляют 200 мкл водного раствора периодата натрия (5 мМ) и 2 мл водного раствора м-толуидина (50 мМ). После этого добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описан выше) до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 100 мкл 1 М водного раствора цистеина.
Наконец, конъюгат ПЭГ -Ргока очищают ионообменной хроматографией на 8Р-8еркагоке РР. Реакционную смесь разбавляют 20 мл буфера А (50 мМ Нерек, рН 6,5) и загружают в 20 мл колонку ШРгер 8РРР 16/10 (ОЕ Неакксаге, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером А. Затем колонку элюируют буфером В (50 мМ Нерек, 1 М №С1, рН 6,5). Свободный Ргока элюируют, промывая колонку 25% буфером В, конъюгат — 50% буфером В. Конъюгат-содержащие фракции концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ). с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/Мйкроге). Конечный этап диафильтрации проводили против гистидинового буфера, рН 6,9, содержащего 150 мМ №С1. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники. Для конъюгата ПЭГРгока определили характерную активность >50% в сравнении с нативным Ргока. Конъюгат дополнительно характеризуют аналитически эксклюзионной ВЭЖХ с использованием ВЭЖХ-системы ЛдПеШ 1200, оснащенной колонкой 8койех Κν 803, в описанных ранее условиях (Ко1апск еΐ а1., ТгапкГикюп 2006; 46:1959-77). Показано, что в препарате не содержится свободный Ргока.
Способ 4.
Ргока ПЭГ илируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГ илирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит 8ипЬпдк1® СА серий от NΟΡ (NΟΡ Согр., Токио, Япония). Начальную концентрацию или массу Нитка переносят или растворяют в буфере Нерек (50 мМ Нерек, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 2 мг Ргока/мл. После этого в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 100 мкМ, затем добавляют 50 мМ водного раствора м-толуидина до получения конечной концентрации в 10 мМ в течение периода времени 30 мин. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описано выше) до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. После доведения рН до 6,0 смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора Ь-цистеина до конечной концентрации 10 мМ.
Конъюгат Ргока очищают при помощи ионообменной хроматографии (1ЕС). Конъюгат-содержащие фракции элюата концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/Мйкроге). Конечный этап диафильтрации проводили против буфера Нерек (50 мМ Нерек, 5 мМ СаС12, рН 7,5).
Препарат аналитически характеризуют измерением общего содержания белка (процедура Брэдфорд и ВСА) и биологической активности известными способами.
- 131 025738
Пример 45.
ПЭГилирование терапевтического белка при помощи разветвленного ПЭГ.
ПЭГилирование терапевтического белка согласно изобретению может осуществляться также и с разветвленным или линейным реагентом для ПЭГилирования, который приготовлен из альдегида и подходящего сшивающего агента, содержащего активную аминооксигруппу.

Claims (68)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ конъюгирования водорастворимого полимера с окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка, включающий контактирование окисленного углеводного фрагмента с активированным водорастворимым полимером в условиях, позволяющих конъюгацию;
    указанный водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, биополимера с низкой вязкостью на основе полиэтиленгликоля Ро1уРЕС®, полисиаловой кислоты (ПСК), углеводов, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты хондроитинсульфата, дерматансульфата, декстрана, карбоксиметил-декстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полиоксазолина, полиакрилоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, сополимера этилена с малеиновым ангидридом, сополимера стирола с малеиновым ангидридом, поли(1-гидроксиметилэтилен гидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'этилтриметиламмонийфосфата (МРС);
    указанный углеводный фрагмент окисляется путем инкубирования в буфере, содержащем окислитель, выбранный из группы, состоящей из периодата натрия (ИаЮ4), тетраацетата свинца (РЬ(ОАс)4) и перрутената калия (ККиО4);
    причем между окисленным углеводным фрагментом и активной аминооксигруппой на водорастворимом полимере формируется оксимная связь;
    при этом образование оксимной связи катализируется нуклеофильным катализатором, таким как мтолуидин.
  2. 2. Способ конъюгирования водорастворимого полимера с окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка, включающий контактирование окисленного углеводного фрагмента с активированным водорастворимым полимером в условиях, которые позволяют конъюгацию;
    упомянутый терапевтический белок выбирают из группы, состоящей из фактора IX, фактора УШ, фактора УПа, ангиопоэтина, фактора роста сосудистого эндотелия (УЕСР), фактора роста эпидермиса, фактора роста нервов, гормона роста человека, фактора некроза опухолей, инсулина, интерферона (ХРИальфа, ШИ-гамма), гранулоцит-колониеобразующего фактора (С-С8Р), адалимумаба (Нитка) и денозумаба (РгоЛа);
    упомянутый водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, биополимера с низкой вязкостью на основе полиэтиленгликоля Ро1уРЕС®, полисиаловой кислоты (ПСК), углевода, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дераматансульфата, декстрана, карбоксиметил-декстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полиоксазолина, полиакролоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, сополимера этилена с малеиновым ангидридом, сополимера стирола с малеиновым ангидридом, поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'этилметиламмонийфосфата (МФС);
    упомянутый углеводный фрагмент окисляется путем инкубирования в буфере, содержащем окислитель, выбранный из группы, состоящей из натрия периодата (ИаЮ4), свинца тетраацетата (РЬ(ОАс)4) и калия перрутената (ККиО4);
    причем между окисленным углеводным фрагментом и активной аминооксигруппой на водорастворимом полимере формируется оксимная связь;
    причем образование упомянутой оксимной связи катализируется нуклеофильным катализатором, который представляет собой м-толуидин.
  3. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что величина рН раствора, содержащего исходную концентрацию терапевтического белка от 0,3 до 3,0 мг/мл, доводится до величины от 5,0 до 8,0 перед контактированием с активированным водорастворимым полимером.
  4. 4. Способ по п.3, отличающийся тем, что исходная концентрация терапевтического белка равна 1,0 мг/мл, а рН равен 6,0.
  5. 5. Способ по п.2, отличающийся тем, что терапевтический белок контактирует с активированным водорастворимым полимером в желаемой избыточной концентрации, причем избыточная концентрация составляет от 1- до 300-молярного избытка.
  6. 6. Способ по п.5, отличающийся тем, что избыточная концентрация равна 50-кратному молярному избытку.
  7. 7. Способ по п.5, отличающийся тем, что терапевтический белок инкубируют с активированным
    - 132 025738 водорастворимым полимером в условиях, которые включают период времени от 0,5 до 24 ч; температуру от 2 до 37°С при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него.
  8. 8. Способ по п.7, отличающийся тем, что условия включают период времени 120 мин, температуру 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания.
  9. 9. Способ по п.2, отличающийся тем, что нуклеофильный катализатор добавляют в таком количестве, чтобы итоговая концентрация нуклеофильного катализатора составила от 1,0 до 50 мМ, в условиях, которые включают период времени от 0,1 до 30 мин; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него.
  10. 10. Способ по п.9, отличающийся тем, что итоговая концентрация нуклеофильного катализатора равна 10 мМ, а условия включают период времени 15 мин, температуру 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания.
  11. 11. Способ по п.2, отличающийся тем, что окислитель добавляют в таком количестве, чтобы итоговая концентрация окислителя составила от 50 до 1000 мкМ, в условиях, которые включают период времени от 0,1 до 120 мин; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него.
  12. 12. Способ по п.11, отличающийся тем, что итоговая концентрация окислителя равна 400 мкМ, а условия включают период времени 10 мин, температуру 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания.
  13. 13. Способ по п.2, отличающийся тем, что конъюгацию водорастворимого полимера с окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка останавливают путем добавления гасителя, выбранного из группы, состоящей из Ь-цистеина, метионина, глутатиона, глицерина, натрия метабисульфита (Ла^2О5), триптофана, тирозина, гистидина или его производных, крезола, имидазола и их комбинаций; при этом гаситель добавляется в таком количестве, чтобы итоговая концентрация гасителя составила от 1 до 100 мМ, в условиях, которые включают период времени от 5 до 120 мин; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него.
  14. 14. Способ по п.13, отличающийся тем, что гасителем является Ь-цистеин.
  15. 15. Способ по п.14, отличающийся тем, что Ь-цистеин добавляют до итоговой концентрации 10 мМ, а условия включают период времени 60 мин, температуру 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания.
  16. 16. Способ по п.2, отличающийся тем, что включает:
    а) первый этап, включающий корректировку величины рН раствора, содержащего терапевтический белок, до уровня рН от 5,0 до 8,0, при этом концентрация терапевтического белка составляет от 0,3 до 3,0 мг/мл;
    б) второй этап, включающий окисление одного или более углеводных фрагментов в терапевтическом белке, при этом окислитель добавляют к раствору, полученному на первом этапе, до итоговой концентрации от 50 до 1000 мкМ, в условиях, которые включают период времени от 0,1 до 120 мин; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него;
    в) третий этап, включающий контактирование терапевтического белка с активированным водорастворимым полимером в желаемой избыточной концентрации, при этом избыточная концентрация составляет от 1-молярного избытка до 300-молярного избытка, в условиях, включающих период времени от 0,5 до 24 ч, температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него;
    г) четвертый этап, включающий добавление нуклеофильного катализатора к раствору, полученному на третьем этапе, при этом нуклеофильный катализатор добавляют в таком количестве, чтобы итоговая концентрация составила от 1 до 50 мМ, в условиях, которые включают период времени от 0,1 до 30 мин; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него;
    д) пятый этап, на котором терапевтический белок инкубируют с активированным водорастворимым полимером и нуклеофильным катализатором, в условиях, позволяющих конъюгацию активированного водорастворимого полимера с одним или более окисленными углеводными фрагментами терапевтического белка, в условиях, которые включают период времени от 0,5 до 24 ч; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него;
    е) шестой этап, на котором конъюгацию водорастворимого полимера с одним или более окисленных углеводных фрагментов терапевтического белка, начатую на пятом этапе, останавливают путем добавления гасителя, выбранного из группы, состоящей из Ь-цистеина, метионина, глутатиона, глицерина, Ла^2О5 (натрия метабисульфита), триптофана, тирозина, гистидина или его производных, крезола, имидазола и их комбинаций; при этом гаситель добавляется, чтобы итоговая концентрация гасителя составила от 1 до 100 мМ, в условиях, которые включают период времени от 5 до 120 мин; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него.
  17. 17. Способ по п.16, отличающийся тем, что исходная концентрация терапевтического белка на первом этапе равна 1 мг/мл, а рН равен 6,0;
    при этом итоговая концентрация окислителя на втором этапе равна 400 мкМ, а условия на пятом этапе включают период времени 10 мин, температуру 22°С, отсутствие света и перемешивание;
    - 133 025738 при этом избыточная концентрация на третьем этапе составляет 50 молярных избытков; при этом условия на третьем этапе включают период времени 15 мин, температуру 22°С, отсутствие света и перемешивание;
    при этом итоговая концентрация нуклеофильного катализатора на четвертом этапе равна 10 мМ, а условия на четвертом этапе включают период времени 15 мин, температуру 22°С, отсутствие света и перемешивание;
    при этом условия инкубирования терапевтического белка с активированным водорастворимым полимером и нуклеофильным катализатором на пятом этапе включают период времени 2 ч; температуру 22°С; отсутствие света и перемешивание;
    при этом гасителем на шестом этапе выступает Ь-цистеин; при этом Ь-цистеин добавляется до итоговой концентрации в 10 мМ, а условия на шестом этапе включают период времени 60 мин, температуру 22°С, отсутствие света и перемешивание.
  18. 18. Способ по п.2, отличающийся тем, что водорастворимым полимером является ПСК.
  19. 19. Способ по п.2, отличающийся тем, что водорастворимым полимером является ПЭГ.
  20. 20. Способ по п.18, отличающийся тем, что ПСК содержит 10-300 единиц сиаловой кислоты.
  21. 21. Способ по п.2, отличающийся тем, что терапевтическим белком является Ф-ΙΧ.
  22. 22. Способ по п.2, отличающийся тем, что терапевтическим белком является Ф-УПа.
  23. 23. Способ по п.2, отличающийся тем, что терапевтическим белком является Ф-УШ.
  24. 24. Способ по п.2, отличающийся тем, что окислителем является натрия периодат (ЫаЮ4).
  25. 25. Способ по п.23, отличающийся тем, что окисленный углеводный фрагмент терапевтического белка расположен в активационном пептиде белка системы свертывания крови.
  26. 26. Способ по п.18, отличающийся тем, что ПСК подготавливают путем взаимодействия активированного аминооксисшивающего агента с окисленной ПСК;
    при этом аминооксисшивающий агент выбирают из группы, состоящей из:
    а) сшивающего агента 3-оксопентан-1,5-диоксиамина формулы
    б) сшивающего агента 3,6,9-триокса-ундекан-1,11-диоксиамина формулы
    в) сшивающего агента 3,6,9,12,15-пентаокса-гептадекан-1,17-диоксиамина формулы при этом ПСК окислена путем инкубирования с окислителем для образования терминальной альдегидной группы на невосстанавливающем конце ПСК.
  27. 27. Способ по п.26, отличающийся тем, что в качестве аминооксисшивающего агента используют 3оксапентан-1,5 -диоксиамин.
  28. 28. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве окислителя используют ЫаЮ4.
  29. 29. Способ по п.2, отличающийся тем, что нуклеофильный катализатор вводится в концентрации 150 мМ.
  30. 30. Способ по п.2, отличающийся тем, что м-толуидин находится при реакции конъюгирования в концентрации 10 мМ.
  31. 31. Способ по п.2, отличающийся тем, что дополнительно содержит этап восстановления оксимной связи в конъюгированном терапевтическом белке путем инкубирования конъюгированного терапевтического белка в буфере, содержащем восстановитель, выбранный из группы, состоящей из цианоборогидрида натрия (ЫаСХВН3), аскорбиновой кислоты (витамина С) и ЫаВН3.
  32. 32. Способ по п.31, отличающийся тем, что в качестве восстановителя используют цианоборогидрид натрия (ЫаСХВН3).
  33. 33. Способ по п.2, отличающийся тем, что дополнительно содержит этап очистки конъюгированного терапевтического белка.
  34. 34. Способ по п.33, отличающийся тем, что конъюгированный терапевтический белок очищается способом, выбранным из группы, состоящей из хроматографии, фильтрации и осаждения.
  35. 35. Способ по п.34, отличающийся тем, что хроматография выбрана из группы, состоящей из хроматографии гидрофобного взаимодействия (ШС), ионообменной хроматографии (ШС), эксклюзионной хроматографии (8ЕС), аффинной хроматографии и обратно-фазовой хроматографии.
  36. 36. Способ по п.35, отличающийся тем, что на хроматографическом этапе загрузки и хроматографическом этапе промывания используют антихаотропическую соль.
  37. 37. Способ по п.35, отличающийся тем, что хроматографию выполняют в колонке.
  38. 38. Способ по п.37, отличающийся тем, что в колонке содержится хроматографическая смола, выбранная из группы, состоящей из фенил-сефарозы РР и бутил-сефарозы РР.
  39. 39. Способ по п.38, отличающийся тем, что в колонке находится слой смолы высотой от 5 до 20 см.
    - 134 025738
  40. 40. Способ по п.39, отличающийся тем, что высота слоя составляет 10 см.
  41. 41. Способ по п.37, отличающийся тем, что содержит один или более этапов отмывания, при которых поток направляется вверх и скорость потока составляет от 0,2 до 6,7 см/мин.
  42. 42. Способ по п.41, отличающийся тем, что скорость потока составляет 2 см/мин.
  43. 43. Способ по п.37, отличающийся тем, что содержит один или более этапов элюирования, при которых поток направляется вниз и при которых скорость потока составляет от 0,1 до 6,7 см/мин.
  44. 44. Способ по п.43, отличающийся тем, что скорость потока составляет 1 см/мин.
  45. 45. Способ по п.33, отличающийся тем, что дополнительно содержит концентрирование конъюгированного терапевтического белка способом ультра/диафильтрации (УФ/ДФ).
  46. 46. Способ по п.33, отличающийся тем, что итоговая концентрация терапевтического белка составляет от 0,5 до 3 мг/мл.
  47. 47. Способ по п.33, отличающийся тем, что терапевтический белок включает 5-11 фрагментов водорастворимого полимера.
  48. 48. Способ по п.2, отличающийся тем, что конъюгированный терапевтический белок очищают при помощи хроматографии; при этом на этапе загрузки и на этапе промывки используют антихаотропическую соль; при этом способ включает один или более этапов промывания, при которых поток направляется вверх и скорость потока составляет от 0,2 до 6,7 см/мин, и один или более этапов элюирования, при которых поток направляется вниз и скорость потока составляет от 0,2 до 6,7 см/мин; и дополнительно включает концентрирование конъюгированного терапевтического белка ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ).
  49. 49. Способ по п.48, отличающийся тем, что хроматография является хроматографией гидрофобного взаимодействия (ШС); при этом скорость потока на одном или более этапов промывки равна 2 см/мин; и при этом скорость потока на одном или более этапов элюирования равна 1 см/мин.
  50. 50. Модифицированный терапевтический белок, получаемый способом по п.2.
  51. 51. Способ формирования оксимной связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную аминооксигруппу, включающий этапы:
    а) окисление углеводного фрагмента терапевтического белка путем инкубирования упомянутого белка с окислителем, выбранным из группы, состоящей из натрия периодата (МаЮ4), свинца тетраацетата (РЪ(ОАс)4) и калия перрутената (ККиО4);
    б) формирование оксимной связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную аминооксигруппу, в присутствии нуклеофильного катализатора в условиях, позволяющих образование упомянутой оксимной связи;
    при этом упомянутый водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, биополимера с низкой вязкостью на основе полиэтиленгликоля Рο1уРЕΟ®, полисиаловой кислоты (ПСК), углевода, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дераматансульфата, декстрана, карбоксиметил-декстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полиоксазолина, полиакролоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, сополимера этилена с малеиновым ангидридом, сополимера стирола с малеиновым ангидридом, поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаля) (ПГФ), 2метакрилоилокси-2'-этилметиламмонийфосфата (МФС);
    при этом нуклеофильный катализатор представляет собой м-толуидин.
  52. 52. Способ формирования оксимной связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную аминооксигруппу, включающий этапы:
    а) окисление углеводного фрагмента терапевтического белка путем инкубирования упомянутого белка с окислителем, выбранным из группы, состоящей из натрия периодата (ЫаЮД свинца тетраацетата (РЪ(ОАс)4) и калия перрутената (ККиО4);
    б) формирование оксимной связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную аминооксигруппу, в присутствии нуклеофильного катализатора в условиях, позволяющих образование упомянутой оксимной связи;
    при этом терапевтический белок выбирают из группы, состоящей из фактора IX, фактора УШ, фактора УПа, ангиопоэтина, фактора роста сосудистого эндотелия (УЕОР), фактора роста эпидермиса, фактора роста нервов, гормона роста человека, фактора некроза опухолей, инсулина, интерферона (ΙΕΝальфа, ^Ν-гамма), гранулоцит-колониеобразующего фактора (Ο-СδР), адалимумаба (НитЛа) и денозумаба (РгоЛа);
    при этом упомянутый водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, биополимера с низкой
    - 135 025738 вязкостью на основе полиэтиленгликоля Ро1уРЕО®, полисиаловой кислоты (ПСК), углевода, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дераматансульфата, декстрана, карбоксиметил-декстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полиоксазолина, полиакролоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, сополимера этилена с малеиновым ангидридом, сополимера стирола с малеиновым ангидридом, поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаля) (ПГФ), 2метакрилоилокси-2'-этилметиламмонийфосфата (МФС);
    при этом нуклеофильный катализатор представляет собой м-толуидин.
  53. 53. Способ формирования гидразоновой связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную гидразидную группу, включающий этапы:
    а) окисление углеводного фрагмента терапевтического белка путем инкубирования упомянутого белка с окислителем, выбранным из группы, состоящей из натрия периодата (МаЮ4), свинца тетраацетата ^^ΟΑ^Α и калия перрутената (ΚΚηΟ4);
    б) формирование гидразоновой связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную гидразидную группу в присутствии нуклеофильного катализатора в условиях, позволяющих образование упомянутой гидразоновой связи;
    при этом упомянутый водорастворимый полимер, содержащий активную гидразидную группу, выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, биополимера с низкой вязкостью на основе полиэтиленгликоля Ро1уРЕО®, полисиаловой кислоты (ПСК), углевода, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дераматансульфата, декстрана, карбоксиметил-декстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полиоксазолина, полиакролоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, сополимера этилена с малеиновым ангидридом, сополимера стирола с малеиновым ангидридом, поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаля) (ПГФ), 2метакрилоилокси-2'-этилметиламмонийфосфата (МФС);
    при этом нуклеофильный катализатор представляет собой м-толуидин.
  54. 54. Способ формирования гидразоновой связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную гидразидную группу, включающий этапы:
    а) окисление углеводного фрагмента терапевтического белка путем инкубирования упомянутого белка с окислителем, выбранным из группы, состоящей из натрия периодата (ИаЮ4), свинца тетраацетата (Γ^ΟΑ^Α и калия перрутената (ΚΚηΟ4);
    б) формирование гидразоновой связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную гидразидную группу, в присутствии нуклеофильного катализатора в условиях, позволяющих образование упомянутой гидразоновой связи;
    при этом терапевтический белок выбирают из группы, состоящей из фактора ΙΧ, фактора УШ, фактора УПа, ангиопоэтина, фактора роста сосудистого эндотелия (УЕОР), фактора роста эпидермиса, фактора роста нервов, гормона роста человека, фактора некроза опухолей, инсулина, интерферона (ΙΕΝальфа, ΙΕΝ-гамма), гранулоцит-колониеобразующего фактора (О-С8Р), адалимумаба (Нитка) и денозумаба (РгоПа);
    при этом упомянутый водорастворимый полимер, содержащий активную гидразидную группу, выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, биополимера с низкой вязкостью на основе полиэтиленгликоля Ро1уРЕО®, полисиаловой кислоты (ПСК), углевода, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дераматансульфата, декстрана, карбоксиметил-декстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полиоксазолина, полиакролоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, сополимера этилена с малеиновым ангидридом, сополимера стирола с малеиновым ангидридом, поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаля) (ПГФ), 2метакрилоилокси-2'-этилметиламмонийфосфата (МФС);
    при этом нуклеофильный катализатор представляет собой м-толуидин.
  55. 55. Способ по п.2, отличающийся тем, что водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, изготавливают способом, включающим:
    а) инкубирование раствора, содержащего окисленный водорастворимый полимер, с активированным аминооксилинкером, включающим активную аминооксигруппу в условиях, позволяющих образование стабильной оксимной связи между окисленным водорастворимым полимером и активированным аминооксилинкером, упомянутые условия включают период времени от 1 мин до 24 ч; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света, при перемешивании или без него; с формированием водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу;
    - 136 025738
    б) очистку водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу, способом, выбранным из группы, состоящей из хроматографии, фильтрации и осаждения.
  56. 56. Способ по п.2, отличающийся тем, что водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, изготавливают способом, включающим:
    а) инкубирование раствора, содержащего окисленный водорастворимый полимер, с активированным аминооксилинкером, включающим активную аминооксигруппу, в условиях, позволяющих образование стабильной оксимной связи между окисленным водорастворимым полимером и активированным аминооксилинкером, упомянутые условия включают период времени от 1 мин до 24 ч; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него; с формированием водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу;
    б) инкубирование раствора, содержащего водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, введенную на этапе а), с восстанавливающим агентом в условиях, позволяющих образование стабильной алкоксаминной связи между окисленным водорастворимым полимером и активированным аминооксилинкером, упомянутые условия включают период времени от 1 мин до 24 ч; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него;
    в) очистку водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу, способом, выбранным из группы, состоящей из хроматографии, фильтрации и осаждения.
  57. 57. Способ по п.2, отличающийся тем, что водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, изготавливают способом, включающим:
    а) инкубирование раствора, содержащего окисленный водорастворимый полимер, с активированным аминооксилинкером, включающим активную аминооксигруппу, в условиях, позволяющих образование стабильной оксимной связи между окисленным водорастворимым полимером и активированным аминооксилинкером, упомянутые условия включают период времени от 1 мин до 24 ч; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него; с формированием водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу;
    б) инкубирование раствора, содержащего водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, введенную на этапе а), с нуклеофильным катализатором в условиях, которые включают период времени от 1 мин до 24 ч; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него;
    в) очистку водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу, способом, выбранным из группы, состоящей из хроматографии, фильтрации и осаждения.
  58. 58. Способ по п.2, отличающийся тем, что водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, изготавливают способом, включающим:
    а) инкубирование раствора, содержащего окисленный водорастворимый полимер, с активированным аминооксилинкером, включающим активную аминооксигруппу, в условиях, позволяющих образование стабильной оксимной связи между окисленным водорастворимым полимером и активированным аминооксилинкером, упомянутые условия включают период времени от 1 мин до 24 ч; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него; с формированием водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу;
    б) инкубирование раствора, содержащего водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, введенную на этапе а), с нуклеофильным катализатором в условиях, которые включают период времени от 1 мин до 24 ч; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него;
    в) инкубирование раствора, содержащего водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, введенную на этапе б), с восстанавливающим агентом в условиях, позволяющих образование стабильной алкоксаминной связи между окисленным водорастворимым полимером и активированным аминооксилинкером, упомянутые условия включают период времени от 1 мин до 24 ч; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него;
    г) очистку водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу, способом, выбранным из группы, состоящей из хроматографии, фильтрации и осаждения.
  59. 59. Способ по п.55, отличающийся тем, что окисленный водорастворимый полимер выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, биополимера с низкой вязкостью на основе полиэтиленгликоля Ро1уРЕО®, полисиаловой кислоты (ПСК), углеводов, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дерматансульфата, декстрана, карбоксиметил-декстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полиоксазолина, полиакрилоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, сополимера этилена с малеиновым ангидридом, сополимера стирола с малеиновым ангидридом, поли(1-гидроксиметилэтилен гидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'этилтриметиламмонийфосфата (МФС), при этом упомянутый водорастворимый полимер окисляется путем инкубирования с окислителем с образованием терминальной альдегидной группы на невосстанавливающем конце водорастворимого полимера.
  60. 60. Способ по п.59, отличающийся тем, что водорастворимым полимером является ПСК.
    - 137 025738
  61. 61. Способ по п.59, отличающийся тем, что окислителем является КаЮ(.
  62. 62. Способ по п.55, отличающийся тем, что аминооксисшивающий агент выбирают из группы, состоящей из:
    а) сшивающего агента 3-оксапентан-1,5-диоксиамина формулы
    б) сшивающего агента 3,6,9-триокса-ундекан-1,11-диоксиамина формулы
    в) сшивающего агента 3,6,9,12,15-пентаокса-гептадекан-1,17-диоксиамина формулы
  63. 63. Способ по п.56, отличающийся тем, что восстановитель выбирают из группы, состоящей из натрия цианоборогидрида (№СИВНз), аскорбиновой кислоты (витамин С) и NаВНз.
  64. 64. Способ по п.63, отличающийся тем, что восстановителем является натрия цианоборогидрид (№СИВН3).
  65. 65. Способ по п.57, отличающийся тем, что нуклеофильный катализатор добавляется в таком количестве, чтобы дать итоговую концентрацию от 1,0 до 50 мМ нуклеофильного катализатора.
  66. 66. Способ по п.55, отличающийся тем, что дополнительно содержит концентрирование конъюгированного терапевтического белка способом ультра/диафильтрации (УФ/ДФ).
  67. 67. Модифицированный терапевтический белок, полученный способом по п.1, где терапевтический белок выбран из группы, состоящей из фактора IX, фактора УШ, фактора У11а, ангиопоэтина, фактора роста сосудистого эндотелия (УЕОР), фактора роста эпидермиса, фактора роста нервов, гормона роста человека, фактора некроза опухолей, инсулина, интерферона (ΙΡΝ-альфа, ΙΡΝ-гамма), гранулоцитколониеобразующего фактора ^^δΡ), адалимумаба (Нитка) и денозумаба (Ргойа).
  68. 68. Модифицированный терапевтический белок по п.67, где белок выбран из группы, состоящей из фактора Ф-У11а, фактора Ф-УШ и фактора Ф-ΙΧ, и где водорастворимый полимер выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ) и полисалициловой кислоты (ПСК).
EA201300190A 2010-07-30 2011-07-29 Способ конъюгирования водорастворимого полимера с терапевтическим белком (варианты) и полученный модифицированный белок (варианты) EA025738B9 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US36918610P 2010-07-30 2010-07-30
PCT/US2011/045873 WO2012016131A1 (en) 2010-07-30 2011-07-29 Nucleophilic catalysts for oxime linkage

Publications (3)

Publication Number Publication Date
EA201300190A1 EA201300190A1 (ru) 2013-07-30
EA025738B1 true EA025738B1 (ru) 2017-01-30
EA025738B9 EA025738B9 (ru) 2018-05-31

Family

ID=44629987

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201300190A EA025738B9 (ru) 2010-07-30 2011-07-29 Способ конъюгирования водорастворимого полимера с терапевтическим белком (варианты) и полученный модифицированный белок (варианты)
EA201691292A EA201691292A1 (ru) 2010-07-30 2011-07-29 Нуклеофильные катализаторы для оксимного связывания

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201691292A EA201691292A1 (ru) 2010-07-30 2011-07-29 Нуклеофильные катализаторы для оксимного связывания

Country Status (25)

Country Link
EP (3) EP3505186B1 (ru)
JP (7) JP6325818B2 (ru)
KR (6) KR102325780B1 (ru)
CN (3) CN103370082A (ru)
AR (1) AR082941A1 (ru)
AU (1) AU2011282571C1 (ru)
BR (1) BR112013001611B1 (ru)
CA (1) CA2806684C (ru)
CY (1) CY1121943T1 (ru)
DK (1) DK2598172T3 (ru)
EA (2) EA025738B9 (ru)
ES (1) ES2731626T3 (ru)
HR (1) HRP20190990T1 (ru)
HU (1) HUE043790T2 (ru)
LT (1) LT2598172T (ru)
MX (1) MX346271B (ru)
NZ (1) NZ605972A (ru)
PL (1) PL2598172T3 (ru)
PT (1) PT2598172T (ru)
RS (1) RS58900B1 (ru)
SG (2) SG187171A1 (ru)
SI (1) SI2598172T1 (ru)
TR (1) TR201908836T4 (ru)
TW (1) TWI534152B (ru)
WO (1) WO2012016131A1 (ru)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
US8809501B2 (en) 2009-07-27 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
US8945897B2 (en) 2010-07-26 2015-02-03 Baxter International Inc. Materials and methods for conjugating a water soluble fatty acid derivative to a protein
SI2598172T1 (sl) * 2010-07-30 2019-08-30 Baxalta GmbH Nukleofilni katalizatorji za oksimsko vezavo
JP2015512927A (ja) * 2012-04-16 2015-04-30 カンタブ バイオファーマシューティカルズ パテンツ リミテッド 最適化された皮下治療薬
AU2013204754C1 (en) * 2012-05-16 2018-10-11 Takeda Pharmaceutical Company Limited Nucleophilic Catalysts for Oxime Linkage
MA39711A (fr) * 2014-04-03 2015-10-08 Nektar Therapeutics Conjugués d'une fraction d'il-15 et d'un polymère
WO2017096383A1 (en) * 2015-12-03 2017-06-08 Baxalta Incorporated Factor viii with extended half-life and reduced ligand-binding properties
WO2018017923A1 (en) * 2016-07-22 2018-01-25 Nektar Therapeutics Conjugates of a factor viii moiety having an oxime-containing linkage
WO2020154268A2 (en) 2019-01-23 2020-07-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Treatment of ophthalmic conditions with angiopoietin-like 7 (angptl7) inhibitors
US11845989B2 (en) 2019-01-23 2023-12-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Treatment of ophthalmic conditions with angiopoietin-like 7 (ANGPTL7) inhibitors
CA3210480A1 (en) 2021-02-26 2022-09-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Treatment of inflammation with glucocorticoids and angiopoietin-like 7 (angptl7) inhibitors

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994028024A1 (en) * 1993-06-01 1994-12-08 Enzon, Inc. Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity
WO2005014024A2 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of a polymer and a protein linked by an oxime linking group
WO2008025856A2 (en) * 2006-09-01 2008-03-06 Novo Nordisk Health Care Ag Modified glycoproteins
WO2010131015A1 (en) * 2009-05-15 2010-11-18 Almac Sciences (Scotland) Limited Method of labelling interferons with peg
WO2011012850A2 (en) * 2009-07-27 2011-02-03 Lipoxen Technologies Limited Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
WO2011017055A2 (en) * 2009-07-27 2011-02-10 Baxter International Inc. Blood coagulation protein conjugates

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS54113492A (en) 1978-02-24 1979-09-05 Sanyo Chem Ind Ltd Preparation of glucoprotein derivative
US4356170A (en) 1981-05-27 1982-10-26 Canadian Patents & Development Ltd. Immunogenic polysaccharide-protein conjugates
US4757006A (en) 1983-10-28 1988-07-12 Genetics Institute, Inc. Human factor VIII:C gene and recombinant methods for production
US5198349A (en) 1986-01-03 1993-03-30 Genetics Institute, Inc. Method for producing factor VIII:C and analogs
US5250421A (en) 1986-01-03 1993-10-05 Genetics Institute, Inc. Method for producing factor VIII:C-type proteins
JPH0387173A (ja) 1987-09-10 1991-04-11 Teijin Ltd ヒト活性化天然型ファクター８ｃの製造方法及びそれに用いる形質転換体
US5846951A (en) 1991-06-06 1998-12-08 The School Of Pharmacy, University Of London Pharmaceutical compositions
ATE198277T1 (de) 1992-10-02 2001-01-15 Genetics Inst Zusammensetzung, welche den koagulationsfaktor viii beinhaltet; verfahren zu deren herstellung und die benutzung eines oberflächenaktiven stoffes als stabilisator
US5621039A (en) 1993-06-08 1997-04-15 Hallahan; Terrence W. Factor IX- polymeric conjugates
US5574187A (en) * 1994-10-06 1996-11-12 Uniroyal Chemical Company, Inc. Process of preparing para substituted phenylamines
WO1996040662A2 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Cellpro, Incorporated Aminooxy-containing linker compounds and their application in conjugates
WO1999003496A1 (en) 1997-07-21 1999-01-28 The University Of North Carolina At Chapel Hill Factor ix antihemophilic factor with increased clotting activity
US7074878B1 (en) 1999-12-10 2006-07-11 Harris J Milton Hydrolytically degradable polymers and hydrogels made therefrom
US6413507B1 (en) 1999-12-23 2002-07-02 Shearwater Corporation Hydrolytically degradable carbamate derivatives of poly (ethylene glycol)
WO2001087922A2 (en) 2000-05-16 2001-11-22 Lipoxen Technologies Limited Derivatisation of proteins in aqueous solution
US7265084B2 (en) 2001-10-10 2007-09-04 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
CA2466027C (en) 2001-11-07 2013-01-08 Nektar Therapeutics Al, Corporation Branched polymers and their conjugates
BR0314106A (pt) 2002-09-11 2005-07-19 Fresenius Kabi De Gmbh Polipeptìdeos hasilados, especialmente eritropoietina hasilada
EP1681303B1 (en) 2002-09-11 2013-09-04 Fresenius Kabi Deutschland GmbH HASylated polypeptides, especially HASylated erythropoietin
EP1620118B1 (en) 2003-04-08 2014-06-18 Yeda Research And Development Co., Ltd. Reversible pegylated drugs
CA2522345A1 (en) 2003-04-09 2004-11-18 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
WO2005014655A2 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
CN1863549A (zh) * 2003-08-08 2006-11-15 费森尤斯卡比德国有限公司 通过肟连接基团进行连接的聚合物和蛋白质的缀合物
JP4566194B2 (ja) 2003-08-12 2010-10-20 リポクセン テクノロジーズ リミテッド タンパク質の誘導体化及び結合のためのシアル酸誘導体
US8633157B2 (en) 2003-11-24 2014-01-21 Novo Nordisk A/S Glycopegylated erythropoietin
US20060040856A1 (en) 2003-12-03 2006-02-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor IX
ES2422187T3 (es) 2003-12-03 2013-09-09 Biogenerix Ag Factor estimulante de colonias de granulocitos glicopegilados
EP1776389B1 (en) 2004-08-12 2016-06-29 Lipoxen Technologies Limited Sialic acid derivatives
EP1799249A2 (en) 2004-09-10 2007-06-27 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated interferon alpha
ES2434035T3 (es) 2004-12-27 2013-12-13 Baxter International Inc. Conjugados de polímero-factor von Willebrand
RS53968B1 (en) 2005-06-16 2015-08-31 Nektar Therapeutics CONJUGATES WHICH HAVE A COUPLING WHICH MAY BE DEGRADED AND POLYMER REAGENTS USED FOR THE PREPARATION OF SUCH CONJUGATES
US7645860B2 (en) * 2006-03-31 2010-01-12 Baxter Healthcare S.A. Factor VIII polymer conjugates
CN101535339B (zh) * 2006-09-01 2014-11-12 诺沃-诺迪斯克保健股份有限公司 改性糖蛋白
BRPI0720282B8 (pt) 2006-12-15 2021-05-25 Baxalta GmbH construção proteica, composição farmacêutica, e, kit
WO2009028573A1 (ja) * 2007-08-27 2009-03-05 National University Corporation Nagoya University 血液凝固障害におけるリバビリンの利用
BR112012002072A2 (pt) * 2009-07-31 2016-11-08 Bayer Healthcare Llc polipeptídeos de fator ix modificados e usos dos mesmos
SI2598172T1 (sl) * 2010-07-30 2019-08-30 Baxalta GmbH Nukleofilni katalizatorji za oksimsko vezavo

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994028024A1 (en) * 1993-06-01 1994-12-08 Enzon, Inc. Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity
WO2005014024A2 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of a polymer and a protein linked by an oxime linking group
WO2008025856A2 (en) * 2006-09-01 2008-03-06 Novo Nordisk Health Care Ag Modified glycoproteins
WO2010131015A1 (en) * 2009-05-15 2010-11-18 Almac Sciences (Scotland) Limited Method of labelling interferons with peg
WO2011012850A2 (en) * 2009-07-27 2011-02-03 Lipoxen Technologies Limited Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
WO2011017055A2 (en) * 2009-07-27 2011-02-10 Baxter International Inc. Blood coagulation protein conjugates

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANOUK DIRKSEN, DAWSON PHILIP E.: "Rapid Oxime and Hydrazone Ligations with Aromatic Aldehydes for Biomolecular Labeling", BIOCONJUGATE CHEMISTRY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 19, no. 12, 17 December 2008 (2008-12-17), pages 2543 - 2548, XP055011724, ISSN: 10431802, DOI: 10.1021/bc800310p *
DIRKSEN A, HACKENG T M, DAWSON P E: "Nucleophilic catalysis of oxime ligation.", ANGEWANDTE CHEMIE INTERNATIONAL EDITION, VERLAG CHEMIE, vol. 45, no. 45, 20 November 2006 (2006-11-20), pages 7581 - 7584, XP002605858, ISSN: 1433-7851, DOI: 10.1002/ANIE.200602877 *
EUGENE H. CORDES, WILLIAM P. JENCKS: "Nucleophilic Catalysis of Semicarbazone Formation by Anilines", JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, US, vol. 84, no. 5, 1 March 1962 (1962-03-01), US, pages 826 - 831, XP008145178, ISSN: 0002-7863, DOI: 10.1021/ja00864a030 *
MIKKEL B. THYGESEN, MUNCH HENRIK, SAUER J�RGEN, CLÓ EMILIANO, J�RGENSEN MALENE R., HINDSGAUL OLE, JENSEN KNUD J.: "Nucleophilic Catalysis of Carbohydrate Oxime Formation by Anilines", THE JOURNAL OF ORGANIC CHEMISTRY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY �ETC.|, vol. 75, no. 5, 5 March 2010 (2010-03-05), pages 1752 - 1755, XP055011729, ISSN: 00223263, DOI: 10.1021/jo902425v *

Also Published As

Publication number Publication date
MX2013001261A (es) 2013-03-22
TWI534152B (zh) 2016-05-21
BR112013001611B1 (pt) 2022-05-10
JP2017137358A (ja) 2017-08-10
CN103370082A (zh) 2013-10-23
KR101969601B1 (ko) 2019-04-17
NZ605972A (en) 2015-04-24
TW201217393A (en) 2012-05-01
EP2598172B1 (en) 2019-03-27
CN108079311A (zh) 2018-05-29
KR20210032542A (ko) 2021-03-24
LT2598172T (lt) 2019-08-26
EP4023247A1 (en) 2022-07-06
DK2598172T3 (da) 2019-07-01
SI2598172T1 (sl) 2019-08-30
CA2806684C (en) 2020-11-17
AR082941A1 (es) 2013-01-23
KR102088852B1 (ko) 2020-03-16
KR102269494B1 (ko) 2021-06-25
KR20130043211A (ko) 2013-04-29
WO2012016131A1 (en) 2012-02-02
BR112013001611A8 (pt) 2020-10-27
EA201691292A1 (ru) 2017-08-31
KR20210079392A (ko) 2021-06-29
KR102172133B1 (ko) 2020-11-02
KR20190040364A (ko) 2019-04-17
ES2731626T3 (es) 2019-11-18
KR102229967B1 (ko) 2021-03-19
AU2011282571C1 (en) 2018-04-05
CN108079312A (zh) 2018-05-29
JP2019116500A (ja) 2019-07-18
EA201300190A1 (ru) 2013-07-30
AU2011282571A1 (en) 2013-02-07
AU2011282571B2 (en) 2015-09-24
TR201908836T4 (tr) 2019-07-22
JP2021038256A (ja) 2021-03-11
RS58900B1 (sr) 2019-08-30
SG187171A1 (en) 2013-02-28
HUE043790T2 (hu) 2019-09-30
JP6325818B2 (ja) 2018-05-16
JP7054407B2 (ja) 2022-04-13
EA025738B9 (ru) 2018-05-31
KR20200029059A (ko) 2020-03-17
HRP20190990T1 (hr) 2019-10-04
SG10201913078SA (en) 2020-02-27
PT2598172T (pt) 2019-06-25
JP7258999B2 (ja) 2023-04-17
JP2013536180A (ja) 2013-09-19
EP3505186B1 (en) 2022-01-12
JP6757823B2 (ja) 2020-09-23
EP3505186A1 (en) 2019-07-03
JP2022046676A (ja) 2022-03-23
MX346271B (es) 2016-07-08
PL2598172T3 (pl) 2019-09-30
KR102325780B1 (ko) 2021-11-12
CY1121943T1 (el) 2020-10-14
KR20200126008A (ko) 2020-11-05
BR112013001611A2 (pt) 2016-05-17
JP2019116501A (ja) 2019-07-18
CA2806684A1 (en) 2012-02-02
JP2015164958A (ja) 2015-09-17
EP2598172A1 (en) 2013-06-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA025738B1 (ru) Способ конъюгирования водорастворимого полимера с терапевтическим белком (варианты) и полученный модифицированный белок (варианты)
EA032056B1 (ru) Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты, способы получения конъюгата терапевтического белка и производного жирной кислоты (варианты)
US10414793B2 (en) Nucleophilic catalysts for oxime linkage
US11564992B2 (en) Nucleophilic catalysts for oxime linkage
AU2013204754C1 (en) Nucleophilic Catalysts for Oxime Linkage
US20130310546A1 (en) Nucleophilic catalysts for oxime linkage and use of nmr analyses of the same
AU2017276255B2 (en) Nucleophilic Catalysts for Oxime Linkage
EA044273B1 (ru) Способ конъюгирования водорастворимого полимера с терапевтическим белком

Legal Events

Date Code Title Description
TH4A Publication of the corrected specification to eurasian patent
PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KG TJ TM