TWI534152B - 用於肟連接的親核性催化劑 - Google Patents

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Description

用於肟連接的親核性催化劑
本發明係關於用於使水溶性聚合物與蛋白質結合之物質及方法。
藉由在水溶性聚合物與治療性蛋白質之間形成共價連接來製備結合物可藉由各種化學方法進行。多肽藥物之聚乙二醇化在循環過程中保護該等藥物且改良其藥效學及藥物動力學特徵(Harris及Chess,Nat Rev Drug Discov. 2003;2:214-21)。聚乙二醇化過程使乙二醇(聚乙二醇(PEG))之重複單元連接於多肽藥物。PEG分子具有大流體動力學體積(為球狀蛋白質大小之5-10倍)，水溶性較高且成水合物，無毒，非免疫原性並自身體快速清除。分子之聚乙二醇化可使得藥物對酶降解之抗性增加，活體內半衰期延長，給藥頻率降低，免疫原性降低，物理及熱穩定性增加，可溶性增加，液體穩定性增加及聚集減少。在1990年代初，第一種聚乙二醇化藥物由FDA批准。自此以後，FDA已批准數種聚乙二醇化藥物用於經口、可注射及局部投藥。
聚唾液酸(polysialic acid，PSA)亦稱為多聚乙醯神經胺糖酸(colominic acid，CA)，為一種天然存在的多醣。其為具有α(2→8)酮苷連接(ketosidic linkage)之N-乙醯神經胺糖酸均聚物且在其非還原端含有鄰二醇基團。其帶負電且為人體之天然組分。其可容易由細菌大量產生且具有預定物理特徵(美國專利第5,846,951號)。因為細菌產生之PSA在化學及免疫學上與人體內產生之PSA一致，所以細菌PSA為非免疫原性的，即使當與蛋白質偶合時。不同於一些聚合物，PSA酸為生物可降解的。已顯示多聚乙醯神經胺糖酸與觸酶及天冬醯胺酶之共價偶合可在蛋白水解酶或血漿存在下增加酶穩定性。使用聚唾液酸化及未經修飾之天冬醯胺酶的活體內比較研究揭露聚唾液酸化延長該酶之半衰期(Fernandes及Gregoriadis,Int J Pharm. 2001;217:215-24)。
PEG-衍生物與肽或蛋白質之偶合由Roberts等人(Adv Drug Deliv Rev 2002;54:459-76)評述。一種使水溶性聚合物與治療性蛋白質偶合之方法為經由蛋白質之碳水化合物部分結合該等聚合物。蛋白質中碳水化合物之鄰羥基(OH)可容易經過碘酸鈉(NaIO4)氧化形成活性醛基(Rothfus et Smith,J Biol Chem 1963;238:1402-10；van Lenten et Ashwell,J Biol Chem 1971;246:1889-94)。隨後可藉由使用含有例如活性醯肼基之試劑使聚合物與碳水化合物之醛基偶合(Wilchek M及Bayer EA,Methods Enzymol 1987;138:429-42)。最新技術為使用含有胺氧基之試劑，其與醛反應形成肟連接(WO 96/40662、WO2008/025856)。
描述水溶性聚合物與治療性蛋白質之結合之其他實施例描述於以下專利中：WO 06/071801，其教示馮威里氏因子(Von Willebrand factor)中之碳水化合物部分的氧化及隨後使用醯肼化學反應與PEG偶合；美國公開案第2009/0076237號，其教示rFVIII之氧化及隨後使用醯肼化學反應與PEG及其他水溶性聚合物(例如PSA、HES、葡聚糖)偶合；WO 2008/025856，其教示不同凝血因子(例如rFIX、FVIII及FVIIa)之氧化及隨後使用胺氧基化學反應藉由形成肟連接而與例如PEG偶合；及美國專利第5,621,039號，其教示FIX之氧化及隨後使用醯肼化學反應與PEG偶合。
近來，描述一種改良方法，其包含唾液酸之輕度過碘酸鹽氧化以產生醛，隨後在催化量之苯胺存在下與含有胺氧基之試劑反應(Dirksen A.及Dawson PE,Bioconjugate Chem. 2008;19,2543-8；及Zeng Y等人,Nature Methods 2009;6:207-9)。苯胺催化顯著加速肟接合，從而允許使用極低濃度之試劑。親核性催化劑之使用亦描述於以下文獻中：Dirksen,A.等人,J Am Chem Soc.,128:15602-3(2006)；Dirksen,A.等人,Angew chem. Int Ed.,45:7581-4(2006)；Kohler,J.J.,ChemBioChem.,10:2147-50(2009)；Giuseppone,N.等人,J Am Chem Soc.,127:5528-39(2005)；及Thygesen,M.B.等人,J Org Chem.,75:1752-5(2010)。
儘管苯胺催化可加速肟接合，從而允許短反應時間及使用低濃度之胺氧基試劑，但苯胺具有毒性，當例如結合之治療性蛋白質形成藥物基劑時，此必須加以考慮。舉例而言，已顯示苯胺誘發變性血紅素血症(Harrison,J.H..及Jollow,D.J.,Molecular Pharmacology,32(3)423-431,1987)。已顯示對大鼠之長期膳食處理誘發脾腫瘤(Goodman,DG.等人,J Natl Cancer Inst.,73(1):265-73,1984)。試管內研究亦已顯示苯胺具有誘發染色體突變之可能性且具有可能的基因毒性活性(Bombhard E.M. et Herbold B,Critical Reviews in Toxicology 35,783-835,2005)。
考慮到苯胺之可能危險性質且儘管該等方法可用於使水溶性聚合物與治療性蛋白質結合，但仍需要開發用於使水溶性聚合物與蛋白質結合之物質及方法，其改良蛋白質之藥效學及/或藥物動力學性質，同時使與各種試劑相關之成本降至最小且使患者接受者之健康風險降至最小。
本發明提供用於使聚合物與蛋白質結合之物質及方法，其改良該等蛋白質之藥效學及/或藥物動力學性質，同時使與各種試劑相關之成本及當由親核性催化劑催化結合反應時患者接受者之健康風險降至最小。在本發明之各種具體實例中，提供取代苯胺之替代性催化劑。
在一具體實例中，提供一種使水溶性聚合物與治療性蛋白質之經氧化碳水化合物部分結合之方法，其包含在允許結合之條件下使該經氧化碳水化合物部分與活化之水溶性聚合物接觸；該水溶性聚合物含有活性胺氧基且選自由以下者所組成之群組：聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)、分支PEG、PolyPEG(Warwick Effect Polymers；Coventry,UK)、聚唾液酸(PSA)、澱粉、羥烷澱粉(hydroxyalkyl starch，HAS)、羥乙澱粉(hydroxylethyl starch，HES)、碳水化合物、多醣、普魯蘭(pullulane)、聚葡萄胺糖、玻尿酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、澱粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚烷醚(polyalkylene oxide，PAO)、聚伸烷基二醇(polyalkylene glycol，PAG)、聚丙二醇(polypropylene glycol，PPG)、聚唑啉、聚丙烯醯基嗎啉、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯啶酮、聚磷氮烯、聚唑啉、聚乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚(1-羥甲基伸乙基羥甲基縮甲醛)(poly(1-hydroxymethylethylene hydroxymethylformal)，PHF)、磷酸2-甲基丙烯醯氧基-2'-乙基三甲基銨(2-methacryloyloxy-2'-ethyltrimethylammoniumphosphate，MPC)；及該碳水化合物部分藉由與包含選自由以下者所組成之群組的氧化劑之緩衝液一起培育而氧化：過碘酸鈉(NaIO4)、四乙酸鉛(Pb(OAc)4)及高釕酸鉀(KRuO4)；其中在該經氧化碳水化合物部分與該水溶性聚合物上之活性胺氧基之間形成肟連接；且其中該肟連接形成由選自由以下者所組成之群組的親核性催化劑催化：鄰胺基苯甲酸、間胺基苯甲酸、對胺基苯甲酸、對胺基苯磺酸、鄰胺基苯甲醯胺、鄰甲苯胺、間甲苯胺、對甲苯胺、鄰茴香胺、間茴香胺及對茴香胺。
在另一具體實例中，提供一種使水溶性聚合物與治療性蛋白質之經氧化碳水化合物部分結合之方法，其包含在允許結合之條件下使該經氧化碳水化合物部分與活化之水溶性聚合物接觸；該治療性蛋白質選自由以下者所組成之群組：因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、馮威里氏因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白C、蛋白S、tPA、PAI-1、組織因子(TF)、ADAMTS 13蛋白酶、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-11、群落刺激因子-1(colony stimulating factor-1，CSF-1)、M-CSF、SCF、GM-CSF、顆粒球群落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)、EPO、干擾素-α(IFN-α)、複合干擾素(consensus interferon)、IFN-β、IFN-γ、IFN-ω、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-31、IL-32 α、IL-33、血小板生成素(thrombopoietin，TPO)、Ang-1、Ang-2、Ang-4、Ang-Y、促血管生成素樣多肽1(angiopoietin-like polypeptide 1，ANGPTL1)、促血管生成素樣多肽2(ANGPTL2)、促血管生成素樣多肽3(ANGPTL3)、促血管生成素樣多肽4(ANGPTL4)、促血管生成素樣多肽5(ANGPTL5)、促血管生成素樣多肽6(ANGPTL6)、促血管生成素樣多肽7(ANGPTL7)、玻璃連結蛋白(vitronectin)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血管生成素、活化素A、活化素B、活化素C、骨形態發生蛋白-1、骨形態發生蛋白-2、骨形態發生蛋白-3、骨形態發生蛋白-4、骨形態發生蛋白-5、骨形態發生蛋白-6、骨形態發生蛋白-7、骨形態發生蛋白-8、骨形態發生蛋白-9、骨形態發生蛋白-10、骨形態發生蛋白-11、骨形態發生蛋白-12、骨形態發生蛋白-13、骨形態發生蛋白-14、骨形態發生蛋白-15、骨形態發生蛋白受體IA、骨形態發生蛋白受體IB、骨形態發生蛋白受體II、腦源性神經營養因子、心營養素-1(cardiotrophin-1)、纖毛神經營養因子、纖毛神經營養因子受體、畸胎瘤衍化生長因子(cripto)、隱秘因子(cryptic)、細胞激素誘導性嗜中性球趨化因子1、細胞激素誘導性嗜中性球、趨化因子2α、細胞激素誘導性嗜中性球趨化因子2β、β內皮細胞生長因子、內皮素1、表皮生長因子、促紅血球生成素(epigen)、表皮調節素(epiregulin)、上皮源性嗜中性球引誘劑、纖維母細胞生長因子4、纖維母細胞生長因子5、纖維母細胞生長因子6、纖維母細胞生長因子7、纖維母細胞生長因子8、纖維母細胞生長因子8b、纖維母細胞生長因子8c、纖維母細胞生長因子9、纖維母細胞生長因子10、纖維母細胞生長因子11、纖維母細胞生長因子12、纖維母細胞生長因子13、纖維母細胞生長因子16、纖維母細胞生長因子17、纖維母細胞生長因子19、纖維母細胞生長因子20、纖維母細胞生長因子21、酸性纖維母細胞生長因子、鹼性纖維母細胞生長因子、膠細胞系源性神經營養因子受體α1、膠細胞系源性神經營養因子受體α2、生長相關蛋白、生長相關蛋白α、生長相關蛋白β、生長相關蛋白γ、肝素結合表皮生長因子、肝細胞生長因子、肝細胞生長因子受體、肝瘤源性生長因子、胰島素樣生長因子I、胰島素樣生長因子受體、胰島素樣生長因子II、胰島素樣生長因子結合蛋白、角質化細胞生長因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受體α、神經生長因子、神經生長因子受體、神經生成素、神經營養素-3、神經營養素-4、抑瘤素M(oncostatin M，OSM)、胎盤生長因子、胎盤生長因子2、血小板衍生內皮細胞生長因子、血小板衍生生長因子、血小板衍生生長因子A鏈、血小板衍生生長因子AA、血小板衍生生長因子AB、血小板衍生生長因子B鏈、血小板衍生生長因子BB、血小板衍生生長因子受體α、血小板衍生生長因子受體β、前B細胞生長刺激因子、幹細胞因子(stem cell factor，SCF)、幹細胞因子受體、TNF、TNF0、TNF1、TNF2、轉型生長因子α、轉型生長因子β、轉型生長因子β1、轉型生長因子β1.2、轉型生長因子β2、轉型生長因子β3、轉型生長因子β5、潛伏轉型生長因子β1、轉型生長因子β結合蛋白I、轉型生長因子β結合蛋白II、轉型生長因子β結合蛋白III、胸腺基質淋巴細胞生成素(thymic stromal lymphopoietin，TSLP)、腫瘤壞死因子受體I型、腫瘤壞死因子受體II型、尿激酶型血纖維蛋白溶酶原活化因子受體、磷脂酶活化蛋白(phospholipase-activating protein，PUP)、胰島素、凝集素蓖麻毒素、泌乳素、絨毛膜促性腺素、卵泡刺激素、甲狀腺刺激素、組織血纖維蛋白溶酶原活化因子、IgG、IgE、IgM、IgA及IgD、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、DNA酶、胎球蛋白、黃體生成激素、雌激素、胰島素、白蛋白、脂蛋白、胎蛋白、運鐵蛋白、血小板生成素、尿激酶、整合素、凝血酶、瘦素、修美樂(Humira)(阿達木單抗(adalimumab))、普羅利亞(Prolia)(地諾單抗(denosumab))、恩利(Enbrel)(依那西普(etanercept))、表1中之蛋白或其生物活性片段、衍生物或變異體；該水溶性聚合物含有活性胺氧基且選自由以下者所組成之群組：聚乙二醇(PEG)、分支PEG、PolyPEG(Warwick Effect Polymers；Coventry,UK)、聚唾液酸(PSA)、澱粉、羥烷澱粉(HAS)、羥乙澱粉(HES)、碳水化合物、多醣、普魯蘭、聚葡萄胺糖、玻尿酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、澱粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚烷醚(PAO)、聚伸烷基二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚唑啉、聚丙烯醯基嗎啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯啶酮、聚磷氮烯、聚唑啉、聚乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚(1-羥甲基伸乙基羥甲基縮甲醛)(PHF)、磷酸2-甲基丙烯醯氧基-2'-乙基三甲基銨(MPC)；及該碳水化合物部分藉由與包含選自由以下者所組成之群組的氧化劑之緩衝液一起培育而氧化：過碘酸鈉(NaIO4)、四乙酸鉛(Pb(OAc)4)及高釕酸鉀(KRuO4)；其中在該經氧化碳水化合物部分與該水溶性聚合物上之活性胺氧基之間形成肟連接；且其中該肟連接形成由選自由以下者所組成之群組的親核性催化劑催化：鄰胺基苯甲酸、間胺基苯甲酸、對胺基苯甲酸、對胺基苯磺酸、鄰胺基苯甲醯胺、鄰甲苯胺、間甲苯胺、對甲苯胺、鄰茴香胺、間茴香胺及對茴香胺。
在又一具體實例中，提供一種上述方法，其中在與活化之水溶性聚合物接觸之前，包含初始濃度介於約0.3 mg/ml與約3.0 mg/ml之間的治療性蛋白質之溶液經調整至介於約5.0與約8.0之間的pH值。
如本文中所使用，術語「約(about)」意謂高於或低於規定值之值。在各種具體實例中，術語「約」包括規定值加上或減去規定值之0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10%。
在另一具體實例中，提供一種上述方法，其中治療性蛋白質之初始濃度為約1.0 mg/ml且pH值為約6.0。在一相關具體實例中，治療性蛋白質之初始濃度為約0.75 mg/ml且pH值為約6.0。在又一相關具體實例中，治療性蛋白質之初始濃度為約1.25 mg/ml且pH值為約6.0。
在另一具體實例中，提供一種上述方法，其中治療性蛋白質接觸所欲的過量濃度之活化之水溶性聚合物，其中該過量濃度介於約1莫耳與約300莫耳過量之間。在另一具體實例中，過量濃度為約50倍莫耳過量。
在又一具體實例中，提供一種上述方法，其中治療性蛋白質在包含以下者之條件下與活化之水溶性聚合物一起培育：介於約0.5小時與約24小時之間的時段；介於約2℃與約37℃之間的溫度；在光存在或不存在下；及在攪拌或不攪拌下。在另一具體實例中，該等條件包含約120分鐘之時段、約22℃之溫度、不存在光；及在攪拌下。如本文中所使用，術語「攪拌(stirring)」欲包括由常用實驗室或製造設備及產品在各種速度及強度下攪拌(例如平緩攪拌)。
在另一具體實例中，提供一種上述方法，其中親核性催化劑在包含以下者之條件下以使得親核性催化劑之最終濃度介於約1.0 mM與約50 mM之間的量添加：介於約0.1分鐘與約30分鐘之間的時段；介於約2℃與約37℃之間的溫度；在光存在或不存在下；及在攪拌或不攪拌下。在另一具體實例中，親核性催化劑之最終濃度為約10 mM，且該等條件包含至多約15分鐘之時段、約22℃之溫度、不存在光；及在攪拌下。
在又一具體實例中，提供一種上述方法，其中氧化劑在包含以下者之條件下以使得氧化劑之最終濃度介於約50 μM與約1000 μM之間的量添加：介於約0.1分鐘與120分鐘之間的時段；介於約2℃與約37℃之間的溫度；在光存在或不存在下；及在攪拌或不攪拌下。在另一具體實例中，氧化劑之最終濃度為約400 μM，且該等條件包含約10分鐘之時段、約22℃之溫度、不存在光及在攪拌下。
在另一具體實例中，提供一種上述方法，其中水溶性聚合物與治療性蛋白質之經氧化碳水化合物部分的結合藉由添加選自由以下者所組成之群組的中止劑而終止：L-半胱胺酸、甲硫胺酸、麩胱甘肽、甘油、偏亞硫酸氫鈉(Na2S2O5)、色胺酸、酪胺酸、組胺酸或其衍生物、甲酚、咪唑及其組合；其中該中止劑在包含以下者之條件下以使得中止劑之最終濃度介於約1 mM與約100 mM之間的量添加：介於約5分鐘與約120分鐘之間的時段；介於約2℃與約37℃之間的溫度；在光存在或不存在下；及在攪拌或不攪拌下。在另一具體實例中，中止劑為L-半胱胺酸。在又一具體實例中，L-半胱胺酸經添加以使得最終濃度為約10 mM且該等條件包含約60分鐘之時段、約22℃之溫度、不存在光及在攪拌下。
在另一具體實例中，提供一種上述方法，其包含：a)第一步驟，其包含將包含治療性蛋白質之溶液的pH值調整至介於約5.0與約8.0之間的pH值，其中治療性蛋白質濃度介於約0.3 mg/ml與約3.0 mg/ml之間；b)第二步驟，其包含氧化治療性蛋白質上之一或多個碳水化合物，其中氧化劑在包含以下者之條件下添加至該第一步驟中之溶液中以使得最終濃度介於約50 μM與約1000 μM之間：介於約0.1分鐘與約120分鐘之間的時段；介於約2℃與約37℃之間的溫度；在光存在或不存在下；及在攪拌或不攪拌下；c)第三步驟，其包含在包含以下者之條件下使治療性蛋白質與所欲的過量濃度之活化之水溶性聚合物接觸，其中該過量濃度介於約1莫耳過量與約300莫耳過量之間：介於約0.5小時與約24小時之間的時段；介於約2℃與約37℃之間的溫度；在光存在或不存在下；及在攪拌或不攪拌下；d)第四步驟，其包含將親核性催化劑添加至該第三步驟之溶液中，其中該親核性催化劑在包含以下者之條件下經添加以使得最終濃度介於約1 mM與約50 mM之間：介於約0.1分鐘與約30分鐘之間的時段；介於約2℃與約37℃之間的溫度；在光存在或不存在下；及在攪拌或不攪拌下；e)第五步驟，其中治療性蛋白質在允許活化之水溶性聚合物與治療性蛋白質上之一或多個經氧化碳水化合物結合的條件下與活化之水溶性聚合物及親核性催化劑一起培育，該等條件包含介於約0.5小時與約24小時之間的時段、介於約2℃與約37℃之間的溫度；在光存在或不存在下；及在攪拌或不攪拌下；及f)第六步驟，其中該第五步驟中水溶性聚合物與治療性蛋白質之一或多個經氧化碳水化合物的結合藉由添加選自由以下者所組成之群組的中止劑而終止：L-半胱胺酸、甲硫胺酸、麩胱甘肽、甘油、Na2S2O5(偏亞硫酸氫鈉)、色胺酸、酪胺酸、組胺酸或其衍生物、甲酚、咪唑及其組合；其中該中止劑在包含以下者之條件下經添加以使得最終濃度為約1 mM及約100 mM：介於約5分鐘與約120分鐘之間的時段；介於約2℃與約37℃之間的溫度；在光存在或不存在下；及在攪拌或不攪拌下。在另一具體實例中，第一步驟中治療性蛋白質之初始濃度為約1 mg/ml且pH值為約6.0；其中第二步驟中氧化劑之最終濃度為約400 μM，且第五步驟中之條件包含約10分鐘之時段、約22℃之溫度、不存在光及在攪拌下；其中第三步驟中之過量濃度為約50莫耳過量；其中第三步驟中之條件包含約15分鐘之時段、約22℃之溫度、不存在光及在攪拌下；其中第四步驟中親核性催化劑之最終濃度為約10 mM，且第四步驟中之條件包含約15分鐘之時段、約22℃之溫度、不存在光及在攪拌下；其中第五步驟中將治療性蛋白質與活化之水溶性聚合物及親核性催化劑一起培育之條件包含約2小時之時段；約22℃之溫度；不存在光；及在攪拌下；且其中第六步驟中之中止劑為L-半胱胺酸；且其中L-半胱胺酸經添加以使得最終濃度為約10 mM且第六步驟中之條件包含約60分鐘之時段、約22℃之溫度、不存在光及在攪拌下。
在另一具體實例中，提供一種上述方法，其中水溶性聚合物為PSA。在另一具體實例中，PSA由約10-300個唾液酸單元構成。在另一具體實例中，水溶性聚合物為PEG。在另一具體實例中，水溶性聚合物為HES。在又一具體實例中，水溶性聚合物為HAS。
在又一具體實例中，提供一種上述方法，其中治療性蛋白質為FIX。在另一具體實例中，治療性蛋白質為FVIIa。在另一具體實例中，治療性蛋白質為FVIII。
在另一具體實例中，提供一種上述方法，其中氧化劑為過碘酸鈉(NaIO4)。
在另一具體實例中，提供一種上述方法，其中治療性蛋白質之經氧化碳水化合物部分位於凝血蛋白之活化肽中。
在一具體實例中，提供一種上述方法，其中PSA藉由使活化之胺氧基連接子與經氧化PSA反應來製備；其中該胺氧基連接子選自由以下者所組成之群組：
a)　下式之3-氧雜-戊烷-1，5-二氧基胺連接子：
b)　下式之3,6,9-三氧雜-十一烷-1,11-二氧基胺連接子：
c)　下式之3,6,9,12,15-五氧雜-十七烷-1,17-二氧基胺連接子：
其中PSA藉由與氧化劑一起培育而氧化以在PSA之非還原端形成末端醛基。在一相關具體實例中，胺氧基連接子為3-氧雜-戊烷-1,5-二氧基胺。
在又一具體實例中，提供一種上述方法，其中氧化劑為NaIO4。
在另一具體實例中，提供一種上述方法，其中親核性催化劑以介於約1 mM與約50 mM之間的濃度提供。在一具體實例中，親核性催化劑為間甲苯胺。在又一具體實例中，間甲苯胺以約10 mM之濃度存在於結合反應中。
在另一具體實例中，提供一種上述方法，其進一步包含以下步驟：藉由在包含選自由以下者所組成之群組的還原化合物之緩衝液中培育結合之治療性蛋白質來還原結合之治療性蛋白質中的肟連接：氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)、抗壞血酸(維生素C)及NaBH3。在一具體實例中，該還原化合物為氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)。
在又一具體實例中，提供一種上述方法，其進一步包含純化結合之治療性蛋白質的步驟。在另一具體實例中，結合之治療性蛋白質藉由選自由層析、過濾及沈澱所組成之群組的方法來純化。在另一具體實例中，該層析選自由以下者所組成之群組：疏水性相互作用層析(Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC)、離子交換層析(Ion Exchange chromatography，IEC)、尺寸排阻層析(Size exclusion chromatography，SEC)、親和層析及逆相層析。在又一具體實例中，於層析加載步驟及層析洗滌步驟中使用抗離液鹽。在另一具體實例中，該層析在管柱中進行。在另一具體實例中，管柱包含選自由苯基-瓊脂糖FF及丁基-瓊脂糖FF所組成之群組的層析樹脂。在另一具體實例中，該樹脂以介於約5 cm與約20 cm之間的床高度存在於管柱中。在一具體實例中，該床高度為約10 cm。
在另一具體實例中，提供一種上述方法，其包含一或多個洗滌步驟，其中流動方向設定為向上流動且其中流速介於約0.2 cm/min與約6.7 cm/min之間。如本文中所使用，術語「向下流動(down-flow)」指自層析管柱頂部至層析管柱底部之流動方向(正常流動方向/標準模式)。如本文中所使用，術語「向上流動(up-flow)」指自管柱底部至頂部之流動方向(反向流動方向)。在一具體實例中，流速為約2 cm/min。
在另一具體實例中，提供一種上述方法，其包含一或多個洗提步驟，其中流動方向設定為向下流動且其中流速介於約0.1 cm/min與約6.7 cm/min之間。在一相關具體實例中，流速為約1 cm/min。
在又一具體實例中，提供一種上述方法，其包含藉由超濾/透濾(UF/DF)濃縮結合之治療性蛋白質。在另一具體實例中，治療性蛋白質之最終濃度介於約0.5 mg/ml與約3 mg/ml之間。
在另一具體實例中，提供一種上述方法，其中治療性蛋白質包含約5個至約11個水溶性聚合物部分。在另一具體實例中，治療性蛋白質包含約1個至約3個水溶性聚合物。
在又一具體實例中，提供一種上述方法，其中結合之治療性蛋白質使用層析純化；其中於加載步驟及洗滌步驟使用抗離液鹽；該方法包含一或多個洗滌步驟，其中流動方向設定為向上流動且其中流速介於約0.2 cm/min與約6.7 cm/min之間；及一或多個洗提步驟，其中流動方向設定為向下流動且其中流速介於約0.2 cm/min與約6.7 cm/min之間；該方法進一步包含藉由超濾/透濾(UF/DF)濃縮結合之治療性蛋白質。在另一具體實例中，該層析為疏水性相互作用層析(HIC)；其中該一或多個洗滌步驟流速為約2 cm/min；且其中該一或多個洗提步驟流速為約1 cm/min。
在另一具體實例中，提供藉由任何上述方法產生之經修飾之治療性蛋白質。
在又一具體實例中，提供一種在治療性蛋白質上之經氧化碳水化合物部分與含有活性胺氧基之活化之水溶性聚合物之間形成肟連接之方法，其包含以下步驟：a)藉由將治療性蛋白質與選自由以下者所組成之群組的氧化劑一起培育來氧化該蛋白質上之碳水化合物部分：過碘酸鈉(NaIO4)、四乙酸鉛(Pb(OAc)4)及高釕酸鉀(KRuO4)；及b)在允許在該治療性蛋白質之經氧化碳水化合物部分與該含有活性胺氧基之活化之水溶性聚合物之間形成肟連接的條件下在親核性催化劑存在下形成該肟連接；其中該含有活性胺氧基之水溶性聚合物選自由以下者所組成之群組：聚乙二醇(PEG)、分支PEG、PolyPEG(Warwick Effect Polymers；Coventry,UK)、聚唾液酸(PSA)、澱粉、羥烷澱粉(HAS)、羥乙澱粉(HES)、碳水化合物、多醣、普魯蘭、聚葡萄胺糖、玻尿酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、澱粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚烷醚(PAO)、聚伸烷基二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚唑啉、聚丙烯醯基嗎啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯啶酮、聚磷氮烯、聚唑啉、聚乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚(1-羥甲基伸乙基羥甲基縮甲醛)(PHF)、磷酸2-甲基丙烯醯氧基-2'-乙基三甲基銨(MPC)；其中該親核性催化劑選自由以下者所組成之群組：鄰胺基苯甲酸、間胺基苯甲酸、對胺基苯甲酸、對胺基苯磺酸、鄰胺基苯甲醯胺、鄰甲苯胺、間甲苯胺、對甲苯胺、鄰茴香胺、間茴香胺及對茴香胺。
在另一具體實例中，提供一種在治療性蛋白質上之經氧化碳水化合物部分與含有活性胺氧基之活化之水溶性聚合物之間形成肟連接之方法，其包含以下步驟：a)藉由將治療性蛋白質與選自由以下者所組成之群組的氧化劑一起培育來氧化該蛋白質上之碳水化合物部分：過碘酸鈉(NaIO4)、四乙酸鉛(Pb(OAc)4)及高釕酸鉀(KRuO4)；及b)在允許在該治療性蛋白質之經氧化碳水化合物部分與該含有活性胺氧基之活化之水溶性聚合物之間形成肟連接的條件下在親核性催化劑存在下形成該肟連接；其中該治療性蛋白質選自由以下者所組成之群組：因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、馮威里氏因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白C、蛋白S、tPA、PAI-1、組織因子(TF)、ADAMTS 13蛋白酶、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-11、群落刺激因子-1(CSF-1)、M-CSF、SCF、GM-CSF、顆粒球群落刺激因子(G-CSF)、EPO、干擾素-α(IFN-α)、複合干擾素、IFN-β、IFN-γ、IFN-ω、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-31、IL-32α、IL-33、血小板生成素(TPO)、Ang-1、Ang-2、Ang-4、Ang-Y、促血管生成素樣多肽1(ANGPTL1)、促血管生成素樣多肽2(ANGPTL2)、促血管生成素樣多肽3(ANGPTL3)、促血管生成素樣多肽4(ANGPTL4)、促血管生成素樣多肽5(ANGPTL5)、促血管生成素樣多肽6(ANGPTL6)、促血管生成素樣多肽7(ANGPTL7)、玻璃連結蛋白、血管內皮生長因子(VEGF)、血管生成素、活化素A、活化素B、活化素C、骨形態發生蛋白-1、骨形態發生蛋白-2、骨形態發生蛋白-3、骨形態發生蛋白-4、骨形態發生蛋白-5、骨形態發生蛋白-6、骨形態發生蛋白-7、骨形態發生蛋白-8、骨形態發生蛋白-9、骨形態發生蛋白-10、骨形態發生蛋白-11、骨形態發生蛋白-12、骨形態發生蛋白-13、骨形態發生蛋白-14、骨形態發生蛋白-15、骨形態發生蛋白受體IA、骨形態發生蛋白受體IB、骨形態發生蛋白受體II、腦源性神經營養因子、心營養素-1、纖毛神經營養因子、纖毛神經營養因子受體、畸胎瘤衍化生長因子、隱秘因子、細胞激素誘導性嗜中性球趨化因子1、細胞激素誘導性嗜中性球、趨化因子2α、細胞激素誘導性嗜中性球趨化因子2β、β內皮細胞生長因子、內皮素1、表皮生長因子、促紅血球生成素、表皮調節素、上皮源性嗜中性球引誘劑、纖維母細胞生長因子4、纖維母細胞生長因子5、纖維母細胞生長因子6、纖維母細胞生長因子7、纖維母細胞生長因子8、纖維母細胞生長因子8b、纖維母細胞生長因子8c、纖維母細胞生長因子9、纖維母細胞生長因子10、纖維母細胞生長因子11、纖維母細胞生長因子12、纖維母細胞生長因子13、纖維母細胞生長因子16、纖維母細胞生長因子17、纖維母細胞生長因子19、纖維母細胞生長因子20、纖維母細胞生長因子21、酸性纖維母細胞生長因子、鹼性纖維母細胞生長因子、膠細胞系源性神經營養因子受體α1、膠細胞系源性神經營養因子受體α2、生長相關蛋白、生長相關蛋白α、生長相關蛋白β、生長相關蛋白γ、肝素結合表皮生長因子、肝細胞生長因子、肝細胞生長因子受體、肝瘤源性生長因子、胰島素樣生長因子I、胰島素樣生長因子受體、胰島素樣生長因子II、胰島素樣生長因子結合蛋白、角質化細胞生長因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受體α、神經生長因子、神經生長因子受體、神經生成素、神經營養素-3、神經營養素-4、抑瘤素M(OSM)、胎盤生長因子、胎盤生長因子2、血小板衍生內皮細胞生長因子、血小板衍生生長因子、血小板衍生生長因子A鏈、血小板衍生生長因子AA、血小板衍生生長因子AB、血小板衍生生長因子B鏈、血小板衍生生長因子BB、血小板衍生生長因子受體α、血小板衍生生長因子受體β、前B細胞生長刺激因子、幹細胞因子(SCF)、幹細胞因子受體、TNF、TNF0、TNF1、TNF2、轉型生長因子α、轉型生長因子β、轉型生長因子β1、轉型生長因子β1.2、轉型生長因子β2、轉型生長因子β3、轉型生長因子β5、潛伏轉型生長因子β1、轉型生長因子β結合蛋白I、轉型生長因子β結合蛋白II、轉型生長因子β結合蛋白III、胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)、腫瘤壞死因子受體I型、腫瘤壞死因子受體II型、尿激酶型血纖維蛋白溶酶原活化因子受體、磷脂酶活化蛋白(PUP)、胰島素、凝集素蓖麻毒素、泌乳素、絨毛膜促性腺素、卵泡刺激素、甲狀腺刺激素、組織血纖維蛋白溶酶原活化因子、IgG、IgE、IgM、IgA及IgD、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、DNA酶、胎球蛋白、黃體生成激素、雌激素、胰島素、白蛋白、脂蛋白、胎蛋白、運鐵蛋白、血小板生成素、尿激酶、整合素、凝血酶、瘦素、修美樂(阿達木單抗)、普羅利亞(地諾單抗)、恩利(依那西普)、來自表1之蛋白或其生物活性片段、衍生物或變異體；其中該含有活性胺氧基之水溶性聚合物選自由以下者所組成之群組：聚乙二醇(PEG)、分支PEG、PolyPEG(Warwick Effect Polymers；Coventry,UK)、聚唾液酸(PSA)、澱粉、羥烷澱粉(HAS)、羥乙澱粉(HES)、碳水化合物、多醣、普魯蘭、聚葡萄胺糖、玻尿酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、澱粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚烷醚(PAO)、聚伸烷基二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚唑啉、聚丙烯醯基嗎啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯啶酮、聚磷氮烯、聚唑啉、聚乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚(1-羥甲基伸乙基羥甲基縮甲醛)(PHF)、磷酸2-甲基丙烯醯氧基-2'-乙基三甲基銨(MPC)；其中該親核性催化劑選自由以下者所組成之群組：鄰胺基苯甲酸、間胺基苯甲酸、對胺基苯甲酸、對胺基苯磺酸、鄰胺基苯甲醯胺、鄰甲苯胺、間甲苯胺、對甲苯胺、鄰茴香胺、間茴香胺及對茴香胺。
在另一具體實例中，提供一種在治療性蛋白質上之經氧化碳水化合物部分與含有活性醯肼基之活化之水溶性聚合物之間形成腙連接之方法，其包含以下步驟：a)藉由將治療性蛋白質與選自由以下者所組成之群組的氧化劑一起培育來氧化該蛋白質上之碳水化合物部分：過碘酸鈉(NaIO4)、四乙酸鉛(Pb(OAc)4)及高釕酸鉀(KRuO4)；及b)在允許在該治療性蛋白質之經氧化碳水化合物部分與該含有活性醯肼基之活化之水溶性聚合物之間形成腙連接的條件下在親核性催化劑存在下形成該腙連接；其中該含有活性醯肼基之水溶性聚合物選自由以下者所組成之群組：聚乙二醇(PEG)、分支PEG、PolyPEG(Warwick Effect Polymers；Coventry,UK)、聚唾液酸(PSA)、澱粉、羥烷澱粉(HAS)、羥乙澱粉(HES)、碳水化合物、多醣、普魯蘭、聚葡萄胺糖、玻尿酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、澱粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚烷醚(PAO)、聚伸烷基二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚唑啉、聚丙烯醯基嗎啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯啶酮、聚磷氮烯、聚唑啉、聚乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚(1-羥甲基伸乙基羥甲基縮甲醛)(PHF)、磷酸2-甲基丙烯醯氧基-2'-乙基三甲基銨(MPC)；其中該親核性催化劑選自由以下者所組成之群組：鄰胺基苯甲酸、間胺基苯甲酸、對胺基苯甲酸、對胺基苯磺酸、鄰胺基苯甲醯胺、鄰甲苯胺、間甲苯胺、對甲苯胺、鄰茴香胺、間茴香胺及對茴香胺。
在另一具體實例中，提供一種在治療性蛋白質上之經氧化碳水化合物部分與含有活性醯肼基之活化之水溶性聚合物之間形成腙連接之方法，其包含以下步驟：a)藉由將治療性蛋白質與選自由以下者所組成之群組的氧化劑一起培育來氧化該蛋白質上之碳水化合物部分：過碘酸鈉(NaIO4)、四乙酸鉛(Pb(OAc)4)及高釕酸鉀(KRuO4)；及b)在允許在該治療性蛋白質之經氧化碳水化合物部分與該含有活性醯肼基之活化之水溶性聚合物之間形成腙連接的條件下在親核性催化劑存在下形成該腙連接；其中該治療性蛋白質選自由以下者所組成之群組：因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、馮威里氏因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白C、蛋白S、tPA、PAI-1、組織因子(TF)、ADAMTS 13蛋白酶、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-11、群落刺激因子-1(CSF-1)、M-CSF、SCF、GM-CSF、顆粒球群落刺激因子(G-CSF)、EPO、干擾素-α(IFN-α)、複合干擾素、IFN-β、IFN-γ、IFN-ω、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-31、IL-32α、IL-33、血小板生成素(TPO)、Ang-1、Ang-2、Ang-4、Ang-Y、促血管生成素樣多肽1(ANGPTL1)、促血管生成素樣多肽2(ANGPTL2)、促血管生成素樣多肽3(ANGPTL3)、促血管生成素樣多肽4(ANGPTL4)、促血管生成素樣多肽5(ANGPTL5)、促血管生成素樣多肽6(ANGPTL6)、促血管生成素樣多肽7(ANGPTL7)、玻璃連結蛋白、血管內皮生長因子(VEGF)、血管生成素、活化素A、活化素B、活化素C、骨形態發生蛋白-1、骨形態發生蛋白-2、骨形態發生蛋白-3、骨形態發生蛋白-4、骨形態發生蛋白-5、骨形態發生蛋白-6、骨形態發生蛋白-7、骨形態發生蛋白-8、骨形態發生蛋白-9、骨形態發生蛋白-10、骨形態發生蛋白-11、骨形態發生蛋白-12、骨形態發生蛋白-13、骨形態發生蛋白-14、骨形態發生蛋白-15、骨形態發生蛋白受體IA、骨形態發生蛋白受體IB、骨形態發生蛋白受體II、腦源性神經營養因子、心營養素-1、纖毛神經營養因子、纖毛神經營養因子受體、畸胎瘤衍化生長因子、隱秘因子、細胞激素誘導性嗜中性球趨化因子1、細胞激素誘導性嗜中性球、趨化因子2α、細胞激素誘導性嗜中性球趨化因子2β、β內皮細胞生長因子、內皮素1、表皮生長因子、促紅血球生成素、表皮調節素、上皮源性嗜中性球引誘劑、纖維母細胞生長因子4、纖維母細胞生長因子5、纖維母細胞生長因子6、纖維母細胞生長因子7、纖維母細胞生長因子8、纖維母細胞生長因子8b、纖維母細胞生長因子8c、纖維母細胞生長因子9、纖維母細胞生長因子10、纖維母細胞生長因子11、纖維母細胞生長因子12、纖維母細胞生長因子13、纖維母細胞生長因子16、纖維母細胞生長因子17、纖維母細胞生長因子19、纖維母細胞生長因子20、纖維母細胞生長因子21、酸性纖維母細胞生長因子、鹼性纖維母細胞生長因子、膠細胞系源性神經營養因子受體α1、膠細胞系源性神經營養因子受體α2、生長相關蛋白、生長相關蛋白α、生長相關蛋白β、生長相關蛋白γ、肝素結合表皮生長因子、肝細胞生長因子、肝細胞生長因子受體、肝瘤源性生長因子、胰島素樣生長因子I、胰島素樣生長因子受體、胰島素樣生長因子II、胰島素樣生長因子結合蛋白、角質化細胞生長因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受體α、神經生長因子、神經生長因子受體、神經生成素、神經營養素-3、神經營養素-4、抑瘤素M(OSM)、胎盤生長因子、胎盤生長因子2、血小板衍生內皮細胞生長因子、血小板衍生生長因子、血小板衍生生長因子A鏈、血小板衍生生長因子AA、血小板衍生生長因子AB、血小板衍生生長因子B鏈、血小板衍生生長因子BB、血小板衍生生長因子受體α、血小板衍生生長因子受體β、前B細胞生長刺激因子、幹細胞因子(SCF)、幹細胞因子受體、TNF、TNF0、TNF1、TNF2、轉型生長因子α、轉型生長因子β、轉型生長因子β1、轉型生長因子β1.2、轉型生長因子β2、轉型生長因子β3、轉型生長因子β5、潛伏轉型生長因子β1、轉型生長因子β結合蛋白I、轉型生長因子β結合蛋白II、轉型生長因子β結合蛋白III、胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)、腫瘤壞死因子受體I型、腫瘤壞死因子受體II型、尿激酶型血纖維蛋白溶酶原活化因子受體、磷脂酶活化蛋白(PUP)、胰島素、凝集素蓖麻毒素、泌乳素、絨毛膜促性腺素、卵泡刺激素、甲狀腺刺激素、組織血纖維蛋白溶酶原活化因子、IgG、IgE、IgM、IgA及IgD、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、DNA酶、胎球蛋白、黃體生成激素、雌激素、胰島素、白蛋白、脂蛋白、胎蛋白、運鐵蛋白、血小板生成素、尿激酶、整合素、凝血酶、瘦素、修美樂(阿達木單抗)、普羅利亞(地諾單抗)、恩利(依那西普)、來自表1之蛋白或其生物活性片段、衍生物或變異體；其中該含有活性醯肼基之水溶性聚合物選自由以下者所組成之群組：聚乙二醇(PEG)、分支PEG、PolyPEG(Warwick Effect Polymers；Coventry,UK)、聚唾液酸(PSA)、澱粉、羥烷澱粉(HAS)、羥乙澱粉(HES)、碳水化合物、多醣、普魯蘭、聚葡萄胺糖、玻尿酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、澱粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚烷醚(PAO)、聚伸烷基二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚唑啉、聚丙烯醯基嗎啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯啶酮、聚磷氮烯、聚唑啉、聚乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚(1-羥甲基伸乙基羥甲基縮甲醛)(PHF)、磷酸2-甲基丙烯醯氧基-2'-乙基三甲基銨(MPC)；其中該親核性催化劑選自由以下者所組成之群組：鄰胺基苯甲酸、間胺基苯甲酸、對胺基苯甲酸、對胺基苯磺酸、鄰胺基苯甲醯胺、鄰甲苯胺、間甲苯胺、對甲苯胺、鄰茴香胺、間茴香胺及對茴香胺。
在另一具體實例中，提供一種上述方法，其中含有活性胺氧基之水溶性聚合物藉由包含以下者之方法來製備：在允許在經氧化水溶性聚合物與活化之胺氧基連接子之間形成穩定肟連接的條件下將包含經氧化水溶性聚合物之溶液與包含活性胺氧基之活化之胺氧基連接子一起培育，該等條件包含介於約1分鐘與約24小時之間的時段；介於約2℃與約37℃之間的溫度；在光存在或不存在下；及在攪拌或不攪拌下；從而形成含有活性胺氧基之水溶性聚合物；及b)藉由選自由層析、過濾及沈澱所組成之群組的方法來純化該含有活性胺氧基之水溶性聚合物。在一具體實例中，術語「活化之水溶性聚合物(activated water-soluble polymer)」指含有醛基之水溶性聚合物。
在另一具體實例中，提供一種上述方法，其中含有活性胺氧基之水溶性聚合物藉由包含以下者之方法來製備：a)在允許在經氧化水溶性聚合物與活化之胺氧基連接子之間形成穩定肟連接的條件下將包含經氧化水溶性聚合物之溶液與包含活性胺氧基之活化之胺氧基連接子一起培育，該等條件包含介於約1分鐘與約24小時之間的時段；介於約2℃與約37℃之間的溫度；在光存在或不存在下；及在攪拌或不攪拌下；從而形成含有活性胺氧基之水溶性聚合物；b)在允許在經氧化水溶性聚合物與活化之胺氧基連接子之間形成穩定烷氧胺連接的條件下將步驟a)之包含含有活性胺氧基之水溶性聚合物的溶液與還原劑一起培育，該等條件包含介於約1分鐘與約24小時之間的時段；介於約2℃與約37℃之間的溫度；在光存在或不存在下；及在攪拌或不攪拌下；及c)藉由選自由層析、過濾及沈澱所組成之群組的方法來純化含有活性胺氧基之水溶性聚合物。
在又一具體實例中，提供一種上述方法，其中含有活性胺氧基之水溶性聚合物藉由包含以下者之方法來製備：a)在允許在經氧化水溶性聚合物與活化之胺氧基連接子之間形成穩定肟連接的條件下將包含經氧化水溶性聚合物之溶液與包含活性胺氧基之活化之胺氧基連接子一起培育，該等條件包含介於約1分鐘與約24小時之間的時段；介於約2℃與約37℃之間的溫度；在光存在或不存在下；及在攪拌或不攪拌下；從而形成含有活性胺氧基之水溶性聚合物；b)在包含以下的條件下將步驟a)之包含含有活性胺氧基之水溶性聚合物的溶液與親核性催化劑一起培育：介於1分鐘與24小時之間的時段；介於2℃與37℃之間的溫度；在光存在或不存在下；及在攪拌或不攪拌下；及c)藉由選自由層析、過濾及沈澱所組成之群組的方法來純化含有活性胺氧基之水溶性聚合物。
在另一具體實例中，提供一種上述方法，其中含有活性胺氧基之水溶性聚合物藉由包含以下者之方法來製備：a)在允許在經氧化水溶性聚合物與活化之胺氧基連接子之間形成穩定肟連接的條件下將包含經氧化水溶性聚合物之溶液與包含活性胺氧基之活化之胺氧基連接子一起培育，該等條件包含介於約1分鐘與約24小時之間的時段；介於約2℃與約37℃之間的溫度；在光存在或不存在下；及在攪拌或不攪拌下；從而形成含有活性胺氧基之水溶性聚合物；b)在包含以下的條件下將步驟a)之包含含有活性胺氧基之水溶性聚合物的溶液與親核性催化劑一起培育：介於1分鐘與24小時之間的時段；介於2℃與37℃之間的溫度；在光存在或不存在下；及在攪拌或不攪拌下；c)在允許在經氧化水溶性聚合物與活化之胺氧基連接子之間形成穩定烷氧胺連接的條件下將步驟b)之包含含有活性胺氧基之水溶性聚合物的溶液與還原劑一起培育，該等條件包含介於約1分鐘與約24小時之間的時段；介於約2℃與約37℃之間的溫度；在光存在或不存在下；及在攪拌或不攪拌下；及d)藉由選自由層析、過濾及沈澱所組成之群組的方法來純化含有活性胺氧基之水溶性聚合物。
在另一具體實例中，提供一種上述方法，其中經氧化水溶性聚合物選自由以下者所組成之群組：聚乙二醇(PEG)、分支PEG、PolyPEG(Warwick Effect Polymers；Coventry,UK)、聚唾液酸(PSA)、澱粉、羥烷澱粉(HAS)、羥乙澱粉(HES)、碳水化合物、多醣、普魯蘭、聚葡萄胺糖、玻尿酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、澱粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚烷醚(PAO)、聚伸烷基二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚唑啉、聚丙烯醯基嗎啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯啶酮、聚磷氮烯、聚唑啉、聚乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚(1-羥甲基伸乙基羥甲基縮甲醛)(PHF)、磷酸2-甲基丙烯醯氧基-2'-乙基三甲基銨(MPC)，且其中該水溶性聚合物藉由與氧化劑一起培育而氧化以在該水溶性聚合物之非還原端形成末端醛基。在一具體實例中，水溶性聚合物為PSA。
在另一具體實例中，提供一種上述方法，其中氧化劑為NaIO4。
在又一具體實例中，提供一種上述方法，其中胺氧基連接子選自由以下者所組成之群組：
a)　下式之3-氧雜-戊烷-1,5-二氧基胺連接子：
b)　下式之3,6,9-三氧雜-十一烷-1,11-二氧基胺連接子：
c)　下式之3,6,9,12,15-五氧雜-十七烷-1,17-二氧基胺連接子：
在另一具體實例中，提供一種上述方法，其中還原劑選自由以下者所組成之群組：氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)、抗壞血酸(維生素C)及NaBH3。在一具體實例中，還原劑為氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)。
在另一具體實例中，提供一種上述方法，其中親核性催化劑選自由以下者所組成之群組：鄰胺基苯甲酸、間胺基苯甲酸、對胺基苯甲酸、對胺基苯磺酸、鄰胺基苯甲醯胺、鄰甲苯胺、間甲苯胺、對甲苯胺、鄰茴香胺、間茴香胺及對茴香胺。在一具體實例中，親核性催化劑為間甲苯胺。在另一具體實例中，親核性催化劑以使得親核性催化劑之最終濃度介於約1.0 mM與約50 mM之間的量添加。
在另一具體實例中，提供一種上述方法，其進一步包含藉由超濾/透濾(UF/DF)濃縮結合之治療性蛋白質。
治療性蛋白質之藥理學及免疫學性質可藉由化學修飾及與諸如以下之聚合化合物結合來改良：聚乙二醇(PEG)、分支PEG、聚唾液酸(PSA)、羥烷澱粉(HAS)、羥乙澱粉(HES)、碳水化合物、多醣、普魯蘭、聚葡萄胺糖、玻尿酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、澱粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚烷醚(PAO)、聚伸烷基二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚唑啉、聚丙烯醯基嗎啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯啶酮、聚磷氮烯、聚唑啉、聚乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚(1-羥甲基伸乙基羥甲基縮甲醛)(PHF)、磷酸2-甲基丙烯醯氧基-2'-乙基三甲基銨(MPC)。所得結合物之性質一般高度取決於聚合物之結構及大小。因此，具有規定之窄的大小分佈之聚合物通常在此項技術中為較佳。如PEG之合成聚合物可容易製造成具有窄的大小分佈，而PSA可以產生具有窄的大小分佈之最終PSA製劑的方式純化。另外，具有規定聚合物鏈及窄的大小分佈之聚乙二醇化試劑可在市場上以合理價格購得。
添加可溶性聚合物(諸如經由聚唾液酸化)為一種改良治療性蛋白質之性質的方法，該等治療性蛋白質諸如凝血蛋白FIX以及其他凝血蛋白(例如VWF、FVIIa(參見例如US 2008/0221032A1，該專利以引用的方式併入本文中)及FVIII)。
治療性蛋白質
在本發明之某些具體實例中，上述多肽及聚核苷酸以如下治療性蛋白質例示：酶、抗原、抗體、受體、凝血蛋白、生長因子、激素及配位體。在某些具體實例中，治療性蛋白質為凝血蛋白，諸如因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、馮威里氏因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白C、蛋白S、tPA、PAI-1、組織因子(TF)或ADAMTS 13蛋白酶。在一具體實例中，本發明之治療性蛋白質為醣蛋白，或在各種具體實例中為未在活體內經天然糖基化之蛋白質(亦即不含有天然糖基化部位之蛋白質或在純化之前未在宿主細胞中糖基化之蛋白質)。
在某些具體實例中，治療性蛋白質為免疫球蛋白、細胞激素(諸如IL-1 α、IL-1 β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-11)、群落刺激因子-1(CSF-1)、M-CSF、SCF、GM-CSF、顆粒球群落刺激因子(G-CSF)、EPO、干擾素-α(IFN-α)、複合干擾素、IFN-β、IFN-γ、IFN-ω、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-31、IL-32α、IL-33、血小板生成素(TPO)、促血管生成素(例如Ang-1、Ang-2、Ang-4、Ang-Y)、人類促血管生成素樣多肽ANGPTL1至7、玻璃連結蛋白、血管內皮生長因子(VEGF)、血管生成素、活化素A、活化素B、活化素C、骨形態發生蛋白-1、骨形態發生蛋白-2、骨形態發生蛋白-3、骨形態發生蛋白-4、骨形態發生蛋白-5、骨形態發生蛋白-6、骨形態發生蛋白-7、骨形態發生蛋白-8、骨形態發生蛋白-9、骨形態發生蛋白-10、骨形態發生蛋白-11、骨形態發生蛋白-12、骨形態發生蛋白-13、骨形態發生蛋白-14、骨形態發生蛋白-15、骨形態發生蛋白受體IA、骨形態發生蛋白受體IB、骨形態發生蛋白受體II、腦源性神經營養因子、心營養素-1、纖毛神經營養因子、纖毛神經營養因子受體、畸胎瘤衍化生長因子、隱秘因子、細胞激素誘導性嗜中性球趨化因子1、細胞激素誘導性嗜中性球趨化因子2α、細胞激素誘導性嗜中性球趨化因子2β、β內皮細胞生長因子、內皮素1、表皮生長因子、促紅血球生成素、表皮調節素、上皮源性嗜中性球引誘劑、纖維母細胞生長因子4、纖維母細胞生長因子5、纖維母細胞生長因子6、纖維母細胞生長因子7、纖維母細胞生長因子8、纖維母細胞生長因子8b、纖維母細胞生長因子8c、纖維母細胞生長因子9、纖維母細胞生長因子10、纖維母細胞生長因子11、纖維母細胞生長因子12、纖維母細胞生長因子13、纖維母細胞生長因子16、纖維母細胞生長因子17、纖維母細胞生長因子19、纖維母細胞生長因子20、纖維母細胞生長因子21、酸性纖維母細胞生長因子、鹼性纖維母細胞生長因子、膠細胞系源性神經營養因子受體α1、膠細胞系源性神經營養因子受體α2、生長相關蛋白、生長相關蛋白α、生長相關蛋白β、生長相關蛋白γ、肝素結合表皮生長因子、肝細胞生長因子、肝細胞生長因子受體、肝瘤源性生長因子、胰島素樣生長因子I、胰島素樣生長因子受體、胰島素樣生長因子II、胰島素樣生長因子結合蛋白、角質化細胞生長因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受體α、神經生長因子、神經生長因子受體、神經生成素、神經營養素-3、神經營養素-4、抑瘤素M(OSM)、胎盤生長因子、胎盤生長因子2、血小板衍生內皮細胞生長因子、血小板衍生生長因子、血小板衍生生長因子A鏈、血小板衍生生長因子AA、血小板衍生生長因子AB、血小 板衍生生長因子B鏈、血小板衍生生長因子BB、血小板衍生生長因子受體α、血小板衍生生長因子受體β、前B細胞生長刺激因子、幹細胞因子(SCF)、幹細胞因子受體、TNF(包括TNF0、TNF1、TNF2)、轉型生長因子α、轉型生長因子β、轉型生長因子β1、轉型生長因子β1.2、轉型生長因子β2、轉型生長因子β3、轉型生長因子β5、潛伏轉型生長因子β1、轉型生長因子β結合蛋白I、轉型生長因子β結合蛋白II、轉型生長因子β結合蛋白III、胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)、腫瘤壞死因子受體I型、腫瘤壞死因子受體II型、尿激酶型血纖維蛋白溶酶原活化因子受體、血管內皮生長因子及其嵌合蛋白及生物或免疫活性片段。
在某些具體實例中，治療性蛋白質為α-干擾素、β-干擾素及γ-干擾素、群落刺激因子(包括顆粒球群落刺激因子)、纖維母細胞生長因子、血小板衍生生長因子、磷脂酶活化蛋白(PUP)、胰島素、植物蛋白質(諸如凝集素及蓖麻毒素)、腫瘤壞死因子及相關對偶基因、可溶形式之腫瘤壞死因子受體、介白素受體及可溶形式之介白素受體、生長因子(諸如組織生長因子，諸如TGFα或TGFβ及表皮生長因子)、激素、促生長因子、色素激素、下視丘釋放因子、抗利尿素、泌乳素、絨毛膜促性腺素、卵泡刺激素、甲狀腺刺激素、組織血纖維蛋白溶酶原活化因子及免疫球蛋白(諸如IgG、IgE、IgM、IgA及1gD)、半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、DNA酶、胎球蛋白、黃體生成激素、雌激素、皮質類固醇、胰島素、白蛋白、脂蛋白、胎蛋白、運鐵蛋白、血小板生成素、尿激酶、DNA酶、整合素、凝血酶、造血生長因子、瘦素、糖苷酶、修美樂(阿達木單抗)、普羅利亞(地諾單抗)、恩利(依那西普)及其片段，或包含任何以上所述的蛋白質或其片段之任何融合蛋白。除上述蛋白質外，下表1亦提供本發明所涵蓋之治療性蛋白質：
本文所提供之治療性蛋白質不應視為排他性的。相反，如自本文所提供之揭示內容顯而易見，本發明之方法適用於根據本發明所欲的連接水溶性聚合物之任何蛋白質。舉例而言，治療性蛋白質描述於US 2007/0026485中，該專利以全文引用的方式併入本文中。
凝血蛋白
在一態樣中，本發明之起始物質為凝血蛋白，其可來源於人類血漿，或藉由重組工程改造技術產生，如專利美國專利第4,757,006號、美國專利第5,733,873號、美國專利第5,198,349號、美國專利第5,250,421號、美國專利第5,919,766號及EP 306 968中所述。
諸如包括以下之凝血蛋白的治療性多肽由蛋白水解酶快速降解且經抗體中和：因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、馮威里氏因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白C、蛋白S、tPA、PAI-1、組織因子(TF)及ADAMTS 13蛋白酶。此縮短其半衰期及循環時間，從而限制其療效。相對較高的劑量及頻繁投藥為達到及維持此等凝血蛋白之所欲的治療性或預防性效應所必需的。因此，難以進行適當劑量調節且頻繁靜脈內投藥之需要對患者生活方式加以限制。
如本文所述，本發明涵蓋包括(但不限於)以下之凝血蛋白：因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、馮威里氏因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白C、蛋白S、tPA、PAI-1、組織因子(TF)及ADAMTS 13蛋白酶。如本文中所使用，術語「凝血蛋白(blood coagulation protein)」指任何因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、馮威里氏因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白C、蛋白S、tPA、PAI-1、組織因子(TF)及ADAMTS 13蛋白酶，其展現與特定天然凝血蛋白相關之生物活性。
凝血級聯反應分成三個不同區段：內在、外在及共同路徑(Schenone等人,Curr Opin Hematol. 2004;11:272-7)。級聯反應涉及一系列絲胺酸蛋白酶(酶原)及蛋白質輔因子。需要時，失活酶原前驅體轉化為活性形式，從而轉化級聯反應中之下一種酶。
內在路徑需要凝血因子VIII、IX、X、XI及XII。當前激肽釋放素(prekallikrein)、高分子量激肽原(kininogen)、因子XI(FXI)及因子XII(FXII)曝露於帶負電表面時，起始內在路徑。亦需要自血小板分泌之鈣離子及磷脂。
當血管之血管腔受損時，起始外在路徑。膜醣蛋白組織因子曝露，接著結合於循環因子VII(FVII)及原有的少量其活化形式FVIIa。此結合有助於使FVII完全轉化為FVIIa，且隨後在鈣及磷脂存在下使因子IX(FIX)轉化為因子IXa(FIXa)及使因子X(FX)轉化為因子Xa(FXa)。FVIIa與組織因子締合可藉由使FVII與受質(FIX及FX)之結合部位更接近及藉由誘導構形變化並因此增強FVIIa之酶活性來增強蛋白水解活性。
FX之活化為兩種路徑之共同點。在磷脂及鈣下，因子Va(FVa)及Xa使凝血酶原轉化為凝血酶(凝血酶原酶複合物)，隨後裂解血纖維蛋白原以形成血纖維蛋白單體。該等單體聚合形成血纖維蛋白股。因子XIIIa(FXIIIa)使此等股彼此共價鍵結形成剛性篩網。
FVII轉化為FVIIa亦由許多蛋白酶催化，該等蛋白酶包括凝血酶、FIXa、FXa、因子XIa(FXIa)及因子XIIa(FXIIa)。對於抑制早期級聯反應，組織因子路徑抑制劑以FVIIa/組織因子/FXa產物複合物為目標。
因子VIIa
FVII(亦稱為穩定因子或前轉化素)為維生素K依賴性絲胺酸蛋白酶醣蛋白，其在止血及凝血中具有關鍵作用(Eigenbrot,Curr Protein Pept Sci. 2002;3:287-99)。
FVII在肝臟中合成且以48 kD單鏈醣蛋白形式分泌。FVII與所有維生素K依賴性絲胺酸蛋白酶醣蛋白共有類似蛋白質域結構，其由以下組成：具有9-12個殘基之胺基端γ-羧基麩胺酸(Gla)域，負責蛋白質與脂膜之相互作用；羧基端絲胺酸蛋白酶域(催化域)；及兩個表皮生長因子樣域，其含有介導與組織因子之相互作用的鈣離子結合部位。γ-麩胺醯基羧酶催化分子胺基端部分中之Gla殘基的羧化。羧酶之作用依賴於維生素K之還原形式，其氧化為環氧化物形式。需要維生素K環氧化物還原酶使維生素K之環氧化物形式轉化回還原形式。
大部分FVII在血漿中以酶原形式循環，且此形式之活化導致精胺酸152與異白胺酸153之間的肽鍵裂解。所得活化之FVIIa由經由單個二硫鍵(Cys 135至Cys 262)連接之NH2衍生輕鏈(20 kD)及COOH端衍生重鏈(30 kD)組成。輕鏈含有膜結合Gla域，而重鏈含有催化域。
藉由遺傳學及環境因素測定之FVII的血漿濃度為約0.5 mg/mL(Pinotti等人,Blood. 2000;95:3423-8)。不同FVII基因型會導致平均FVII含量相差數倍。血漿FVII含量在健康女性懷孕期間升高且亦隨年齡而增加，並在女性及患有高三酸甘油酯血症之人中較高。在所有促凝血因子中，FVII具有最短半衰期(3-6小時)。FVIIa之平均血漿濃度在健康個體中為3.6 ng/mL且FVIIa之循環半衰期與其他凝血因子相比相對較長(2.5小時)。
遺傳性FVII缺乏為罕見體染色體隱性出血病症，其發病率估計為在一般人群中每500,000個人中有1例(Acharya等人,J Thromb Haemost. 2004;2248-56)。由抑制劑引起之後天性FVII缺乏亦極其罕見。亦已報導具有與諸如頭孢菌素(cephalosporin)、青黴素(penicillin)及口服抗凝劑之藥物有關發生之缺乏的病例。此外，已報導後天性FVII缺乏自發地發生或在諸如骨髓瘤、敗血症、再生不能性貧血、使用介白素-2及抗胸腺細胞球蛋白療法之其他條件下發生。
參考聚核苷酸及多肽序列包括例如基因組序列之GenBank寄存編號J02933、cDNA之M13232(Hagen等人PNAS 1986;83: 2412-6)及多肽序列之P08709(參考文獻以全文引用的方式併入本文中)。已描述FVII之各種多晶型現象，例如參見Sabater-Lleal等人(Hum Genet. 2006;118:741-51)(參考文獻以全文引用的方式併入本文中)。
因子IX
FIX為維生素K依賴性血漿蛋白，其藉由在鈣離子、磷脂及FVIIIa存在下使FX轉化為其活性形式而參與凝血之內在路徑。FIX之主要催化能力係如對於FX中之特定精胺酸-異白胺酸鍵具有特異性之絲胺酸蛋白酶。由FXIa活化FIX，使得自FIX切除活化肽以產生包含由一或多個二硫鍵固定之雙鏈的活化FIX分子。FIX缺乏為B型隱性X性聯血友病之病因。
A型及B型血友病為遺傳疾病，其特徵分別為FVIII及FIX多肽缺乏。缺乏之潛在原因常常為FVIII及FIX基因突變之結果，兩種基因皆位於X染色體上。用於血友病之傳統療法通常涉及靜脈內投予來自正常個體之混合血漿或半純化凝血蛋白。此等製劑可受病原體或病毒污染，諸如傳染性朊病毒、HIV、小病毒、A型肝炎及C型肝炎。因此，急需不需要使用人類血清之治療劑。
FIX活性之降低程度與B型血友病之嚴重程度成正比。B型血友病之當前治療由用血漿源性或重組FIX替代損失的蛋白質(所謂FIX取代或替代治療或療法)組成。
FIX之聚核苷酸及多肽序列可例如見於UniProtKB/Swiss-Prot寄存編號P00740、美國專利第6,531,298號及圖1(SEQ ID NO: 1)中。
因子VIII
凝血因子VIII(FVIII)在血漿中以極低濃度循環且非共價結合於馮威里氏因子(VWF)。在止血期間，FVIII與VWF分離且藉由在鈣及磷脂或細胞膜存在下增強活化速率而充當活化因子IX(FIXa)介導性FX活化之輔因子。
FVIII以約270-330 kD之單鏈前驅體形式合成，其具有域結構A1-A2-B-A3-C1-C2。當自血漿純化(例如「血漿源性」或「原生質」)時，FVIII由重鏈(A1-A2-B)及輕鏈(A3-C1-C2)構成。輕鏈之分子質量為80 kD，而由於B域中之蛋白水解，重鏈在90-220 kD之範圍內。
FVIII亦以重組蛋白質形式合成以用於出血病症之治療性用途。已設計各種試管內檢定來測定重組FVIII(rFVIII)作為治療性藥物之潛在功效。此等檢定模擬內源性FVIII之活體內效應。FVIII之試管內凝血酶治療導致其促凝血活性快速增加及隨後降低，如藉由試管內檢定所量測。此活化及失活與重鏈及輕鏈中之特定限制性蛋白水解一致，其改變FVIII中之不同結合抗原決定基的可用性，例如使得FVIII自VWF解離且結合於磷脂表面或改變與特定單株抗體之結合能力。
FVIII之缺乏或功能異常與最常發生之出血病症A型血友病相關。所選用於控制A型血友病之治療為使用血漿源性或rFVIII濃縮物之替代療法。為了在各次給藥之間保持FVIII高於1%，FVIII含量低於1%之重度A型血友病患者一般使用預防性療法。考慮各種FVIII產物在循環過程中之平均半衰期，此結果通常可藉由一週兩至三次給與FVIII來達成。
參考聚核苷酸及多肽序列包括例如UniProtKB/Swiss-Prot P00451(FA8_HUMAN)；Gitschier J等人,Characterization of the human Factor VIII gene,Nature,312(5992): 326-30(1984)；Vehar GH等人,Structure of human Factor VIII,Nature,312(5992):337-42(1984)；Thompson AR. Structure and Function of the Factor VIII gene and protein,Semin Thromb Hemost,2003:29;11-29(2002)。
馮威里氏因子
馮威里氏因子(VWF)為在血漿中以一系列多聚體形式循環之醣蛋白，其大小範圍為約500 kD至20,000 kD。多聚體形式之VWF由以二硫鍵連接在一起之250 kD多肽次單元構成。VWF介導初始血小板黏著於受損血管壁之內皮下膜。僅較大多聚體展現止血活性。假設內皮細胞分泌大聚合物形式之VWF且具有低分子量之彼等形式之VWF(低分子量VWF)由蛋白水解裂解產生。具有大分子質量之多聚體儲存於內皮細胞之威貝爾-帕拉地小體(Weibel-Pallade body)中且在刺激後釋放。
VWF由內皮細胞及巨核細胞以前原VWF形式合成，該前原VWF基本上由重複域組成。裂解信號肽後，原VWF在其C端區經由二硫鍵二聚合。二聚體用作多聚化之原聚體，多聚化受自由端末端之間的二硫鍵支配。組裝成多聚體後蛋白水解移除原肽序列(Leyte等人,Biochem. J. 274(1991),257-261)。
自VWF之經選殖cDNA預測的主要轉譯產物為2813個殘基的前驅多肽(前原VWF)。前原VWF由22個胺基酸的信號肽及741個胺基酸的原肽組成，成熟VWF包含2050個胺基酸(Ruggeri Z.A.及Ware,J.,FASEB J.,308-316(1993))。
VWF缺乏導致馮威里氏病(Von Willebrand disease，VWD)，其特徵為不同程度的顯著出血表型。3型VWD為最嚴重形式，其中VWF完全損失，且1型VWD與VWF之定量損失有關且其表型可為極輕的。2型VWD與VWF之定性缺乏有關且可如3型VWD般嚴重。2型VWD具有許多亞型，一些亞型與高分子量多聚體之損失或減少相關。2a型馮威里氏病(VWD-2A)之特徵為損失中間物與大多聚體。VWD-2B之特徵為損失最高分子量多聚體。其他與VWF有關之疾病及病症為此項技術所已知。
前原VWF之聚核苷酸及胺基酸序列可分別以GenBank寄存編號NM_000552及NP_000543獲得。
本發明之其他凝血蛋白描述於此項技術中，例如Mann KG,Thromb Haemost,1999;82:165-74。
A.多肽
在一態樣中，本發明之起始物質為蛋白質或多肽。如本文所述，術語治療性蛋白質(therapeutic protein)指展現與治療性蛋白質相關之生物活性的任何治療性蛋白質分子。在本發明之一具體實例中，治療性蛋白質分子為全長蛋白質。
所涵蓋之治療性蛋白質分子包括全長蛋白質、全長蛋白質之前驅體、全長蛋白質之生物活性次單元或片段，以及任何此等形式之治療性蛋白質之生物活性衍生物及變異體。因此，治療性蛋白質包括如下蛋白質：(1)在至少約25個、約50個、約100個、約200個、約300個、約400個或更多胺基酸之區域中，具有與由本文所述之參考核酸或胺基酸序列編碼之多肽具有大於約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%或更大胺基酸序列一致性之胺基酸序列；及/或(2)特異性結合於針對包含如本文所述之參考胺基酸序列的免疫原、其免疫原性片段及/或其經保守修飾之變異體產生之抗體，例如多株或單株抗體。
根據本發明，術語「重組治療性蛋白質(recombinant therapeutic protein)」包括經由重組DNA技術獲得之任何治療性蛋白質。在某些具體實例中，該術語涵蓋如本文所述之蛋白質。
如本文中所使用，「內源性治療性蛋白質」包括來源於意欲接受治療之哺乳動物的治療性蛋白質。該術語亦包括自該哺乳動物中存在之轉殖基因或任何其他外來DNA轉錄之治療性蛋白質。如本文中所使用，「外源性治療性蛋白質」包括不來源於意欲接受治療之哺乳動物的凝血蛋白。
如本文中所使用，「血漿源性凝血蛋白(plasma-derived blood coagulation protein)」或「原生質(plasmatic)」包括自具有參與凝血路徑之性質的哺乳動物獲得之血液中可見的所有形式之蛋白質。
如本文中所使用，「生物活性衍生物(biologically active derivative)」或「生物活性變異體(biologically active variant)」包括分子的任何衍生物或變異體，其具有該分子之實質上相同功能及/或生物性質(諸如結合性質)及/或相同結構基礎(諸如肽主鏈或基礎聚合單元)。
諸如「變異體(variant)」或「衍生物(derivative)」之「類似物(analog)」為與天然存在的分子在結構上實質上類似且具有相同生物活性(儘管在某些情況下程度不同)之化合物。舉例而言，多肽變異體指與參考多肽共有實質上類似結構且具有相同生物活性之多肽。基於涉及以下之一或多種突變，與得到類似物之天然存在的多肽相比，變異體或類似物在其胺基酸序列之組成方面不同：(i)在多肽之一或多個末端及/或天然存在的多肽序列之一或多個內部區域(例如片段)缺失一或多個胺基酸殘基；(ii)在多肽之一或多個末端(典型為「添加」或「融合」)及/或天然存在的多肽序列之一或多個內部區域(典型為「插入」)插入或添加一或多個胺基酸；或(iii)用一或多個胺基酸取代天然存在的多肽序列中之其他胺基酸。舉例而言，「衍生物」為一類類似物且指與已例如以化學方法經修飾之參考多肽共有相同或實質上類似結構的多肽。
變異多肽為一類類似物多肽且包括插入變異體，其中一或多個胺基酸殘基添加至本發明之治療性蛋白質胺基酸序列中。插入可位於蛋白質之任一個或兩個末端，及/或可定位於治療性蛋白質胺基酸序列之內部區域中。任一個或兩個末端具有其他殘基之插入變異體包括例如融合蛋白及包括胺基酸標籤或其他胺基酸標記之蛋白質。在一態樣中，凝血蛋白分子視情況含有N端Met，尤其當分子在諸如大腸桿菌之細菌細胞中重組表現時。
在缺失變異體中，如本文所述之治療性蛋白質多肽中的一或多個胺基酸殘基經移除。缺失可在治療性蛋白質多肽之一個或兩個末端實現，及/或藉由移除治療性蛋白質胺基酸序列中之一或多個殘基實現。因此，缺失變異體包括治療性蛋白質多肽序列之片段。
在取代變異體中，移除治療性蛋白質多肽之一或多個胺基酸殘基且以替代性殘基替代。在一態樣中，取代實際上為保守性的且此類保守性取代為此項技術所熟知。或者，本發明涵蓋亦為非保守性之取代。例示性保守性取代描述於Lehninger,[Biochemistry,第2版；Worth Publishers公司,New York(1975),第71-77頁]中且即刻陳述如下。
保守性取代
或者，例示性保守性取代即刻陳述如下。
保守性取代II
B.　聚核苷酸
編碼本發明之治療性蛋白質的核酸包括例如(但不限於)基因、前mRNA、mRNA、cDNA、多晶型變異體、對偶基因、合成及天然存在之突變體。
編碼本發明之治療性蛋白質的聚核苷酸亦包括(但不限於)以下聚核苷酸：(1)在嚴格雜交條件下與編碼如本文所述之參考胺基酸序列的核酸及其經保守修飾之變異體特異性雜交；(2)在至少約25個、約50個、約100個、約150個、約200個、約250個、約500個、約1000個或更多核苷酸(至多成熟蛋白質之1218個核苷酸的全長序列)之區域中，具有與如本文所述之參考核酸序列具有大於約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更高核苷酸序列一致性之核酸序列。例示性「嚴格雜交」條件包括在42℃下在50%甲醯胺、5×SSC、20 mM Na‧PO4(pH 6.8)中雜交；及在55℃下用1×SSC洗滌30分鐘。應瞭解，在此等例示性條件下可基於待雜交之序列的長度及GC核苷酸含量來進行變異。此項技術中之式標準適於測定適當雜交條件。參見Sambrook等人,Molecular Cloning: A Laboratory Manual(第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989) §§ 9.47-9.51。
「天然存在」的聚核苷酸或多肽序列典型地來源於哺乳動物，包括(但不限於)靈長類動物，例如人類；齧齒動物，例如大鼠、小鼠、倉鼠；母牛、豬、馬、綿羊或任何哺乳動物。本發明之核酸及蛋白質可為重組分子(例如異源的且編碼野生型序列或其變異體，或非天然存在的)。
C.　治療性蛋白質之產生
治療性蛋白質之產生包括此項技術中已知用於以下之任何方法：(i)藉由基因工程改造產生重組DNA；(ii)藉由例如(但不限於)轉染、電穿孔或顯微注射將重組DNA引入原核或真核細胞中；(iii)培養該等轉型細胞；(iv)表現治療性蛋白質，例如組成性或誘導後表現；及(v)分離該凝血蛋白，例如自培養基或藉由收集轉型細胞分離以獲得經純化之治療性蛋白質。
在其他態樣中，藉由在特徵為產生藥理學上可接受之凝血蛋白分子的適合原核或真核生物宿主系統中表現來產生治療性蛋白質。真核細胞之實例為哺乳動物細胞，諸如CHO、COS、HEK 293、BHK、SK-Hep及HepG2。
多種載體可用於製備治療性蛋白質且選自真核及原核表現載體。用於原核表現之載體的實例包括質體，諸如(但不限於)pRSET、pET及pBAD，其中原核表現載體中所用之啟動子包括以下一或多者(但不限於)：lac、trc、trp、recA或araBAD。用於真核表現之載體的實例包括：(i)針對在酵母中表現，載體諸如(但不限於)pAO、pPIC、pYES或pMET，其使用諸如(但不限於)AOX1、GAP、GAL1或AUG1之啟動子；(ii)針對在昆蟲細胞中表現，載體諸如(但不限於)pMT、pAc5、pIB、pMIB或pBAC，其使用諸如(但不限於)PH、p10、MT、Ac5、OpIE2、gp64或polh之啟動子；及(iii)針對在哺乳動物細胞中表現，載體諸如(但不限於)pSVL、pCMV、pRc/RSV、pcDNA3或pBPV，且在一態樣中，載體來源於病毒系統，諸如(但不限於)痘瘡病毒、腺相關病毒、疱疹病毒或反轉錄病毒，該等載體使用諸如(但不限於)CMV、SV40、EF-1、UbC、RSV、ADV、BPV及β-肌動蛋白之啟動子。
D.　投藥
在一具體實例中，本發明之結合之治療性蛋白質可藉由注射，諸如靜脈內、肌肉內或腹膜內注射來投予。
在一態樣中，為向人類或測試動物投予包含本發明之結合之治療性蛋白質的組成物，組成物包含一或多種醫藥學上可接受之載劑。術語「醫藥學上(pharmaceutically)」或「藥理學上可接受(pharmacologically acceptable)」指分子實體及組成物為穩定的，抑制蛋白質降解(諸如聚集及裂解產物)且另外當使用如下文所述此項技術中熟知之途徑投予時不產生過敏性或其他不良反應。「醫藥學上可接受之載劑」包括任何及所有臨床適用溶劑、分散介質、塗料、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似物，包括上文所揭示之彼等藥劑。
如本文中所使用，「有效量(effective amount)」包括適合於治療疾病或病症或改善疾病或病症之症狀的劑量。在一具體實例中，「有效量」包括適合於治療患有如本文所述之出血病症之哺乳動物的劑量。
組成物可經口、局部、經皮、非經腸、藉由吸入噴霧、經陰道、經直腸或藉由顱內注射來投予。如本文中所使用，術語非經腸(parenteral)包括皮下注射、靜脈內、肌肉內、腦池內注射或輸注技術。亦涵蓋藉由在特定部位靜脈內、皮內、肌肉內、乳房內、腹膜內、鞘內、眼球後、肺內注射及/或手術植入來投藥。一般，組成物基本上不含熱原質，以及可對接受者有害之其他雜質。
單次或多次投予組成物可以治療醫師所選之劑量及模式進行。對於預防或治療疾病，適當劑量將視如上文所述之待治療之疾病類型、疾病之嚴重程度及病程、是否出於預防性或治療性目的投予藥物、先前療法、患者之臨床病史及對藥物之反應及主治醫師之判斷而定。
本發明亦關於一種包含有效量之如本文所定義之結合之治療性蛋白質的醫藥組成物。醫藥組成物可進一步包含醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑、鹽、緩衝液或賦形劑。醫藥組成物可用於治療以上所定義之出血病症。本發明之醫藥組成物可為溶液或凍乾產品。醫藥組成物之溶液可經受任何適合之凍乾製程。
作為另一態樣，本發明包括套組，其包含以有助於使用其投予個體之方式包裝的本發明組成物。在一具體實例中，該套組包括本文所述之化合物或組成物(例如包含結合之治療性蛋白質的組成物)，其包裝於諸如密封瓶子或容器之容器中，貼附於該容器上或包括於該包裝中之標籤描述化合物或組成物於實踐方法中之用途。在一具體實例中，套組含有具有包含結合之治療性蛋白質的組成物之第一容器及具有用於該第一容器中之組成物的生理學上可接受之復原溶液的第二容器。在一態樣中，化合物或組成物以單位劑型包裝。套組可進一步包括適合於根據特定投藥途徑投予組成物之裝置。較佳地，套組含有描述治療性蛋白質或肽組成物之用途的標籤。
水溶性聚合物
在一態樣中，所提供之治療性蛋白質衍生物(亦即結合之治療性蛋白質)分子結合於水溶性聚合物，包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、分支PEG、聚唾液酸(PSA)、羥烷澱粉(HAS)、羥乙澱粉(HES)、碳水化合物、多醣、普魯蘭、聚葡萄胺糖、玻尿酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、澱粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚烷醚(PAO)、聚伸烷基二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚唑啉、聚丙烯醯基嗎啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯啶酮、聚磷氮烯、聚唑啉、聚乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚(1-羥甲基伸乙基羥甲基縮甲醛)(PHF)、磷酸2-甲基丙烯醯氧基-2'-乙基三甲基銨(MPC)。在本發明之一具體實例中，水溶性聚合物由具有以下分子量範圍之唾液酸分子組成：350至120,000 Da、500至100,000 Da、1000至80,000 Da、1500至60,000 Da、2,000至45,000 Da、3,000至35,000 Da及5,000至25,000 Da。水溶性聚合物之偶合可藉由直接或經由連接分子與蛋白質偶合來進行。化學連接子之一個實例為含有碳水化合物選擇性醯肼及氫硫基反應性順丁烯二醯亞胺基之MBPH(4-[4-N-順丁烯二醯亞胺基苯基]丁酸肼)(Chamow等人,J Biol Chem 1992;267:15916-22)。下文描述其他例示性及較佳連接子。
在一具體實例中，衍生物保留天然治療性蛋白質產物之完整功能活性，且與天然治療性蛋白質產物相比，提供延長之活體內半衰期。在另一具體實例中，相對於天然凝血蛋白，衍生物保留至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56，57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140或150百分比(%)生物活性。在一相關態樣中，藉由產色活性與凝血因子抗原值之比率(凝血因子：Chr：凝血因子：Ag)來測定衍生物及天然凝血蛋白之生物活性。在本發明之又一具體實例中，相對於天然治療性蛋白質之活體內半衰期，構築體之半衰期縮短或延長0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。
A.　唾液酸及PSA
PSA由N-乙醯神經胺糖酸之聚合物(一般為均聚物)組成。第二胺基通常帶有乙醯基，但其可改為帶有乙醇醯基。羥基上之可能取代基包括乙醯基、乳醯基、乙基、硫酸酯基及磷酸酯基。
N-乙醯神經胺糖酸Neu5Ac
唾液酸(N-乙醯神經胺糖酸)之結構
PSA及mPSA一般包含基本上由以2,8-醣苷連接或2,9-醣苷連接或此等醣苷連接之組合(例如交替2,8-連接及2,9-連接)連接之N-乙醯神經胺糖酸部分組成的線性聚合物。在特定較佳PSA及mPSA中，醣苷連接為α-2,8。該等PSA及mPSA宜來源於多聚乙醯神經胺糖酸，且在本文中稱為「CA」及「mCA」。典型PSA及mPSA包含至少2個、較佳至少5個、更佳至少10個及最佳至少20個N-乙醯神經胺糖酸部分。因此，其可包含2至300個N-乙醯神經胺糖酸部分、較佳5至200個N-乙醯神經胺糖酸部分或最佳10至100個N-乙醯神經胺糖酸部分。除N-乙醯神經胺糖酸外，PSA及CA較佳基本上不含糖部分。因此，PSA及CA較佳包含至少90%、更佳至少95%及最佳至少98%N-乙醯神經胺糖酸部分。
當PSA及CA包含除N-乙醯神經胺糖酸外之部分時(例如mPSA及mCA中)，此等部分較佳位於聚合物鏈之一端或兩端。該等「其他」部分可例如為藉由氧化或還原衍生自末端N-乙醯神經胺糖酸部分之部分。
舉例而言，WO-A-0187922描述如下mPSA及mCA，其中非還原末端N-乙醯神經胺糖酸單元藉由與過碘酸鈉反應而轉化為醛基。另外，WO 2005/016974描述如下mPSA及mCA，其中還原末端N-乙醯神經胺糖酸單元經受還原以在還原末端N-乙醯神經胺糖酸單元處還原性開環，由此形成鄰二醇基團，隨後氧化以使該鄰二醇基團轉化為醛基。
富含唾液酸之醣蛋白結合人類及其他生物體中之選擇素。其在人類流感感染中起重要作用。舉例而言，唾液酸可掩蔽宿主細胞或細菌之表面上的甘露糖抗原以免受甘露糖結合凝集素影響。此可防止補體活化。唾液酸亦掩蔽次末半乳糖殘基，由此防止醣蛋白由肝實質細胞上之半乳糖受體快速清除。
多聚乙醯神經胺糖酸(N-乙醯神經胺糖酸之均聚物)之結構
多聚乙醯神經胺糖酸(PSA之亞類)為具有α(2→8)酮苷連接之N-乙醯神經胺糖酸(NANA)之均聚物，且由具有K1抗原之大腸桿菌的特定菌株產生。多聚乙醯神經胺糖酸具有許多生理功能。其作為藥物及化妝品之原料很重要。
使用聚唾液酸化及未經修飾之天冬醯胺酶的活體內比較研究揭露聚唾液酸化延長酶之半衰期(Fernandes及Gregoriadis,Biochimica Biophysica Acta 1341: 26-34,1997)。
如本文中所使用，「唾液酸部分(sialic acid moieties)」包括唾液酸單體或聚合物(「多醣(polysaccharides)」)，其可溶於水溶液或水性懸浮液中且在投予醫藥有效量之PSA-凝血蛋白結合物後對哺乳動物具有極小或無負面影響，諸如副作用。在一態樣中，聚合物之特徵為具有1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400或500個唾液酸單元。在某些態樣中，不同唾液酸單元組合於鏈中。
在本發明之一具體實例中，多醣化合物之唾液酸部分具有高親水性，且在另一具體實例中，整個化合物具有高親水性。親水性主要由唾液酸單元之側位羧基以及羥基賦予。醣單元可含有其他官能基，諸如胺、羥基或硫酸酯基或其組合。此等基團可存在於天然存在的醣化合物上，或引入衍生物多醣化合物中。
天然存在的聚合物PSA可以多分散製劑形式得到，其顯示寬的大小分佈(例如Sigma C-5762)及高多分散性(PD)。因為多醣通常在帶有共純化內毒素之固有風險的細菌中產生，所以長唾液酸聚合物鏈之純化可提高增加內毒素含量之可能性。具有1-4個唾液酸單元之短PSA分子亦可以合成方法製備(Kang SH等人,Chem Commun. 2000;227-8；Ress DK及Linhardt RJ,Current Organic Synthesis. 2004;1:31-46)，由此降低高內毒素含量之風險。然而，現可製造具有窄的大小分佈及低多分散性之PSA製劑，其亦不含內毒素。在一態樣中，特定用於本發明之多醣化合物為細菌產生之多醣化合物。此等天然存在之多醣中的一些多醣稱為醣脂。在一具體實例中，多醣化合物實質上不含末端半乳糖單元。
B.　聚乙二醇(PEG)及聚乙二醇化
在某些態樣中，藉由各種化學方法中之任一者使治療性蛋白質與水溶性聚合物結合(Roberts JM等人,Advan Drug Delivery Rev 2002;54:459-76)。舉例而言，在一具體實例中，藉由使用N-羥基丁二醯亞胺(NHS)酯使PEG與治療性蛋白質之自由胺基結合來修飾該蛋白質。在另一具體實例中，使用順丁烯二醯亞胺化學反應或在先前氧化後PEG醯肼或PEG胺與治療性蛋白質之碳水化合物部分的偶合，使水溶性聚合物(例如PEG)與自由SH基偶合。
在一態樣中，藉由經由形成穩定鍵使水溶性聚合物與治療性蛋白質直接偶合(或經由連接子系統偶合)來進行結合。另外，可降解、可釋放或可水解的連接子系統用於本發明之特定態樣中(Tsubery等人J Biol Chem 2004;279:38118-24/Greenwald等人,J Med Chem 1999;42:3657-67/Zha0等人,Bioconj Chem 2006;17:341-51/WO2006/138572A2/US7259224B2/US7060259B2)。
在本發明之一具體實例中，藉由使用含有活性N-羥基丁二醯亞胺酯(NHS)(諸如丁二酸丁二醯亞胺酯、戊二酸丁二醯亞胺酯或丙酸丁二醯亞胺酯)之聚乙二醇衍生物，經由離胺酸殘基修飾治療性蛋白質。此等衍生物在溫和條件下藉由形成穩定醯胺鍵而與治療性蛋白質之離胺酸殘基反應。在本發明之一具體實例中，PEG衍生物之鏈長度為5,000 Da。鏈長度為500至2,000 Da、2,000至5,000 Da、大於5,000至10,000 Da或大於10,000至20,000 Da或大於20,000至150,000 Da之其他PEG衍生物用於各種具體實例中，包括線性及分支結構。
聚乙二醇化胺基之替代性方法為(但不限於)藉由形成胺基甲酸酯鍵而與PEG碳酸酯化學結合，或藉由形成二級醯胺鍵之還原胺化而與醛或酮反應。
在本發明之一具體實例中，治療性蛋白質分子使用市售PEG衍生物進行化學修飾。在替代性態樣中，此等PEG衍生物具有線性或分支結構。下文列舉含有NHS基團之PEG-衍生物的實例。
以下PEG衍生物為購自Nektar Therapeutics之彼等PEG衍生物的非限制性實例(Huntsville,Ala.；參見www.nektar.com/PEG試劑目錄；Nektar Advanced PEGylation,價格表2005-2006)：
mPEG-丙酸丁二醯亞胺酯(mPEG-SPA)
mPEG-α-甲基丁酸丁二醯亞胺酯(mPEG-SMB)
mPEG-CM-HBA-NHS(CM=羧甲基；HBA=羥基丁酸)
分支PEG-衍生物(Nektar Therapeutics)之結構：分支PEG N-羥基丁二醯亞胺(mPEG2-NHS)
具有分支結構之此試劑由Kozlowski等人(BioDrugs 2001;5:419-29)更詳細地描述。
PEG衍生物之其他非限制性實例購自NOF公司(Tokyo,Japan；參見www.nof.co.jp/english：目錄2005)。
線性PEG-衍生物(NOF公司)之通用結構：
X=羧甲基
X=羧戊基
x=丁二酸酯基
mPEG丁二酸丁二醯亞胺酯 x=戊二酸酯基
mPEG戊二酸丁二醯亞胺酯 分支PEG-衍生物(NOF公司)之結構：2,3-雙(甲基聚氧伸乙基-氧基)-1-(1,5-二側氧基-5-丁二醯亞胺基氧基，戊氧基)丙烷
2,3-雙(甲基聚氧伸乙基-氧基)-1-(丁二醯亞胺基羧戊基氧基)丙烷
此等丙烷衍生物顯示具有1,2取代模式之甘油主鏈。在本發明中，亦涵蓋基於具有1,3取代之甘油結構或US2003/0143596A1中所述之其他分支結構的分支PEG衍生物。
亦涵蓋如由Tsubery等人(J Biol Chem 2004;279:38118-24)及Shechter等人(WO04089280A3)所述之具有可降解(例如可水解)連接子之PEG衍生物。
令人驚訝的是，本發明之聚乙二醇化治療性蛋白質展現功能活性以及延長之活體內半衰期。另外，聚乙二醇化rFVIII、FVIIa、FIX或其他凝血因子似乎針對凝血酶失活之抗性更大。
C.　羥烷澱粉(HAS)及羥乙澱粉(HES)
在本發明之各種具體實例中，治療性蛋白質分子使用羥烷澱粉(HAS)或羥乙澱粉(HES)或其衍生物進行化學修飾。
HES為天然存在的支鏈澱粉之衍生物且在體內由α-澱粉酶降解。HES為碳水化合物聚合物支鏈澱粉之經取代之衍生物，其以至多95重量%之濃度存在於玉米澱粉中。HES展現有利生物性質且用作血容量替代藥劑及用於臨床血稀釋療法中(Sommermeyer等人,1987,Krankenhauspharmazie,8(8),271-278；及Weidler等人,1991,Arzneim.-Forschung/Drug Res. g 419 494-498)。
支鏈澱粉由葡萄糖部分組成，其中α-1,4-醣苷鍵存在於主鏈中且α-1,6-醣苷鍵見於分支部位。此分子之物理化學性質主要由醣苷鍵之類型決定。由於切口α-1,4-醣苷鍵，產生每個轉角具有約6個葡萄糖單體之螺旋結構。聚合物之物理化學以及生物化學性質可經由取代加以修飾。羥乙基之引入可經由鹼性羥乙基化達成。關於羥乙基化，藉由修改反應條件，有可能利用未經取代之葡萄糖單體中各別羥基之不同反應性。由於此事實，熟習此項技術者能夠在有限程度上影響取代模式。
HAS指經至少一個羥烷基取代之澱粉衍生物。因此，術語羥烷澱粉(hydroxyalkyl starch)並不限於末端碳水化合物部分包含羥烷基R1、R2及/或R3之化合物，而且指無論何處(末端碳水化合物部分及/或澱粉分子(HAS')之其餘部分中)存在之至少一個羥基經羥烷基R1、R2或R3取代的化合物。
烷基可為可適當經取代之直鏈或分支鏈烷基。較佳地，羥烷基含有1至10個碳原子、更佳1至6個碳原子、更佳1至4個碳原子及甚至更佳2-4個碳原子。因此，「羥烷澱粉」較佳包含羥乙澱粉、羥丙澱粉及羥丁澱粉，其中羥乙澱粉及羥丙澱粉尤為較佳。
包含兩個或兩個以上不同羥烷基之羥烷澱粉亦包含於本發明中。HAS中所包含之至少一個羥烷基可含有兩個或兩個以上羥基。根據一具體實例，包含至少一個羥烷基之HAS含有一個羥基。
術語HAS亦包括烷基經單取代或多取代之衍生物。在一具體實例中，烷基經鹵素、尤其氟取代，或經芳基取代，其限制條件為HAS仍可溶於水。此外，羥烷基之末端羥基可經酯化或醚化。HAS衍生物描述於WO/2004/024776中，該案以全文引用的方式併入本文中。
D.　連接方法
治療性蛋白質可藉由熟習此項技術者已知之各種技術中之任一者與多醣化合物共價連接。在本發明之各種態樣中，唾液酸部分結合於治療性蛋白質，例如FIX、FVIII、FVIIa或VWF，例如利用美國專利第4,356,170號中所述之方法，該案以引用的方式併入本文中。
使PSA與多肽偶合之其他技術亦為已知的且由本發明涵蓋。舉例而言，美國公開案第2007/0282096號描述使例如PSA之胺或醯肼衍生物與蛋白質結合。另外，美國公開案第2007/0191597號描述在還原端含有用於與受質(例如蛋白質)反應之醛基的PSA衍生物。此等參考文獻以全文引用的方式併入本文中。
多種方法揭示於美國專利第5,846,951號(以全文引用的方式併入本文中)之第7欄第15行至第8欄第5行中。例示性技術包括經由凝血蛋白或多醣中之一者上的羧基與凝血蛋白或多醣之胺基之間的肽鍵，或凝血蛋白或多醣之羧基與治療性蛋白質或多醣之羥基之間的酯連接來連接。使治療性蛋白質共價鍵結於多醣化合物之另一連接係經由席夫鹼(Schiff base)進行，其中凝血蛋白上之自由胺基藉由過碘酸鹽氧化與多醣非還原端所形成之醛基反應(Jennings HJ及Lugowski C,J Immunol. 1981;127:1011-8；Fernandes AI及Gregoriadis G,Biochim Biophys Acta. 1997;1341;26-34)。在一態樣中，藉由用NaCNBH3特定還原形成二級胺來使所產生之席夫鹼穩定。替代性方法為藉由在先前氧化之後用NH4Cl還原胺化而在PSA中產生末端自由胺基。雙官能試劑可用於連接兩個胺基或兩個羥基。舉例而言，使用如BS3(辛二酸雙(磺酸基丁二醯亞胺基)酯/Pierce,Rockford,IL)之試劑使含有胺基之PSA與蛋白質之胺基偶合。另外，例如使用如Sulfo-EMCS(N-ε-順丁烯二醯亞胺基己醯氧基)磺酸基丁二醯亞胺酯/Pierce)之異型雙官能交聯劑連接胺及巰基。
在另一方法中，製備聚唾液酸肼且在先前氧化及產生醛官能基之後使其與蛋白質之碳水化合物部分偶合。
如上文所述，治療性蛋白質之自由胺基與唾液酸殘基之1-羧基反應形成肽基鍵，或在1-羧酸基與凝血蛋白上之羥基或其他適合之活性基團之間形成酯連接。或者，羧基與去乙醯化5-胺基形成肽連接，或治療性蛋白質分子之醛基與唾液酸殘基之N-去乙醯化5-胺基形成席夫鹼。
或者，多醣化合物以非共價方式與治療性蛋白質締合。舉例而言，在一態樣中，多醣化合物及醫藥活性化合物經由疏水性相互作用連接。其他非共價締合包括靜電相互作用，其中帶相反電荷的離子彼此吸引。
在各種具體實例中，治療性蛋白質以化學計算量(例如1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:7、1:8、1:9或1:10等)與多醣化合物連接或締合。在各種具體實例中，1-6個、7-12個或13-20個多醣與凝血蛋白連接。在其他具體實例中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多多醣與凝血蛋白連接。
在各種具體實例中，治療性蛋白質經修飾以引入糖基化部位(亦即除天然糖基化部位外之部位)。該修飾可使用此項技術中已知之標準分子生物技術來實現。另外，治療性蛋白質在經由一或多個碳水化合物部分與水溶性聚合物結合之前可在活體內或試管內經糖基化。此等糖基化部位可用作蛋白質與水溶性聚合物結合之目標(美國專利申請案第20090028822號、美國專利申請案第2009/0093399號、美國專利申請案第2009/0081188號、美國專利申請案第2007/0254836號、美國專利申請案第2006/0111279號及DeFrees S.等人,Glycobiology,2006,16,9,833-43)。舉例而言，未在活體內經天然糖基化之蛋白質(例如非醣蛋白之蛋白質)可如上文所述加以修飾。
E.胺氧基連接
在本發明之一具體實例中，羥胺或羥胺衍生物與醛(例如經過碘酸鈉氧化後之碳水化合物部分上的醛)反應形成肟基可應用於製備凝血蛋白之結合物。舉例而言，醣蛋白(例如本發明之治療性蛋白質)首先用諸如過碘酸鈉(NaIO4)之氧化劑氧化(Rothfus JA et Smith EL.,J Biol Chem 1963,238,1402-10；及Van Lenten L及Ashwell G.,J Biol Chem 1971,246,1889-94)。醣蛋白之過碘酸鹽氧化基於1928年所述之典型馬拉普拉德反應(Malaprade reaction)，即用過碘酸鹽氧化鄰二醇，形成活性醛基(Malaprade L.,Analytical application,Bull Soc Chim France,1928,43,683-96)。該氧化劑之其他實例為四乙酸鉛(Pb(OAc)4)、乙酸錳(MnO(Ac)3)、乙酸鈷(Co(OAc)2)、乙酸亞鉈(TlOAc)、硫酸鈰(Ce(SO4)2)(US 4,367,309)或高釕酸鉀(KRuO4)(Marko等人,J Am Chem Soc 1997,119,12661-2)。「氧化劑」意謂能夠在生理反應條件下氧化碳水化合物中之鄰二醇、從而產生活性醛基的溫和氧化化合物。
第二步驟為含有胺氧基之聚合物與經氧化碳水化合物部分偶合，形成肟連接。在本發明之一具體實例中，此步驟可在催化量之親核性催化劑苯胺或苯胺衍生物存在下進行(Dirksen A et Dawson PE,Bioconjugate Chem. 2008；Zeng Y等人,Nature Methods 2009;6:207-9)。苯胺催化顯著加速肟接合，從而允許使用極低濃度之試劑。在本發明之另一具體實例中，藉由用NaCNBH3還原形成烷氧基胺連接來使肟連接穩定(圖2)。下文描述其他催化劑。
關於胺氧基技術之其他資訊可見於以下參考文獻中，其中每一參考文獻均以全文引用的方式併入本文中：EP 1681303A1(HAS化紅血球生成素)；WO 2005/014024(由肟連接基團連接之聚合物與蛋白質的結合物)；WO96/40662(含有胺氧基之連接子化合物及其在結合物中之應用)；WO2008/025856(經修飾之蛋白質)；Peri F等人,Tetrahedron 1998,54,12269-78；Kubler-Kielb J et. Pozsgay V.,J Org Chem 2005,70,6887-90；Lees A等人,Vaccine 2006,24(6),716-29；及Heredia KL等人,Macromoecules 2007,40(14),4772-9。
在本發明之各種具體實例中，根據本文所述之胺氧基技術與治療性蛋白質(例如FVIII、FVIIa或FIX)之經氧化碳水化合物部分連接的水溶性聚合物包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、分支PEG、聚唾液酸(PSA)、碳水化合物、多醣、普魯蘭、聚葡萄胺糖、玻尿酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、澱粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚烷醚(PAO)、聚伸烷基二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚唑啉、聚丙烯醯基嗎啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯啶酮、聚磷氮烯、聚唑啉、聚乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚(1-羥甲基伸乙基羥甲基縮甲醛)(PHF)、磷酸2-甲基丙烯醯氧基-2'-乙基三甲基銨(MPC)。
親核性催化劑
如本文所述，水溶性聚合物與治療性蛋白質之結合可由苯胺催化。苯胺強烈催化醛及酮與胺之水性反應以形成穩定亞胺，諸如腙及肟。下圖比較未經催化相對於經苯胺催化之肟接合反應(Kohler JJ,ChemBioChem 2009;10:2147-50)：
然而，考慮到與苯胺相關之多種健康風險，需要替代性催化劑。本發明提供苯胺衍生物作為替代性肟接合催化劑。該等苯胺衍生物包括(但不限於)鄰胺基苯甲酸、間胺基苯甲酸、對胺基苯甲酸、對胺基苯磺酸、鄰胺基苯甲醯胺、鄰甲苯胺、間甲苯胺、對甲苯胺、鄰茴香胺、間茴香胺及對茴香胺。
在本發明之一具體實例中，使用間甲苯胺(亦稱為間甲基苯胺、3-甲基苯胺或3-胺基-1-甲基苯)催化本文所述之結合反應。間甲苯胺及苯胺具有類似物理性質及基本上相同的pKa值(間甲苯胺：pKa 4.73，苯胺：pKa 4.63)。
本發明之親核性催化劑適用於肟接合(例如使用胺氧基連接)或腙形成(例如使用醯肼化學反應)。在本發明之各種具體實例中，親核性催化劑以如下濃度提供於結合反應中：0.1、0.2、0.3、0.5、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50 mM。在一具體實例中，提供1 mM至10 mM之親核性催化劑。在本發明之各種具體實例中，結合反應之pH值範圍為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0及7.5。在一具體實例中，pH值為5.5至6.5。
結合蛋白質之純化
在各種具體實例中，純化已與氧化劑一起培育之蛋白質及/或已與本發明之水溶性聚合物結合的治療性蛋白質是所欲的。多種純化技術為此項技術所已知且包括(但不限於)層析法(諸如離子交換層析、疏水性相互作用層析、尺寸排阻層析及親和層析或其組合)、過濾法及沈澱法(Guide to Protein Purification,Meth. Enzymology第463卷(由Burgess RR及Deutscher MP編輯)，第2版,Academic Press 2009)。
以下實施例不欲限制本發明，而僅例示本發明之特定具體實例。
實施例 實施例1 製備同型雙官能連接子NH2[OCH2CH2]2ONH2
同型雙官能連接子NH2[OCH2CH2]2ONH2
根據Boturyn等人(Tetrahedron 1997;53:5485-92)，在使用經修改之一級胺的加柏利合成(Gabriel-Synthesis)之兩步有機反應(圖3)中合成含有兩個活性胺氧基之(3-氧雜-戊烷-1,5-二氧基胺)。在第一步驟中，一個2,2-氯乙醚分子與兩個內-N-羥基-5-降冰片烯-2,3-二甲醯亞胺分子在二甲基甲醯胺(DMF)中反應。藉由肼解作用，在乙醇中由所得中間物製備所欲的同型雙官能產物。
實施例2 製備同型雙官能連接子NH2[OCH2CH2]4ONH2
同型雙官能連接子NH2[OCH2CH2]4ONH2
根據Boturyn等人(Tetrahedron 1997;53:5485-92)，在使用經修改之一級胺的加柏利合成之兩步有機反應(圖3)中合成含有兩個活性胺氧基之(3,6,9-三氧雜-十一烷-1,11-二氧基胺)。在第一步驟中，一個雙-(2-(2-氯乙氧基)-乙基)-醚分子與兩個內-N-羥基-5-降冰片烯-2,3-二甲醯亞胺分子在DMF中反應。藉由肼解作用，在乙醇中由所得中間物製備所欲的同型雙官能產物。
實施例3 製備同型雙官能連接子NH2[OCH2CH2]6ONH2
同型雙官能連接子NH2[OCH2CH2]6ONH2
根據Boturyn等人(Tetrahedron 1997;53:5485-92)，在使用經修改之一級胺的加柏利合成之兩步有機反應中合成含有兩個活性胺氧基之(3,6,9,12,15-五氧雜-十七烷-1,17-二氧基胺)。在第一步驟中，一個二氯化六乙二醇分子與兩個內-N-羥基-5-降冰片烯-2,3-二甲醯亞胺分子在DMF中反應。藉由肼解作用，在乙醇中由所得中間物製備所欲的同型雙官能產物。
實施例4 胺氧基-PSA試劑之詳細合成
根據Botyryn等人(Tetrahedron 1997;53:5485-92)，在如實施例1中所概述之兩步有機合成中合成3-氧雜-戊烷-1,5二氧基胺。
步驟1：
向內-N-羥基-5-降冰片烯-2,3-二甲醯亞胺(59.0 g；1.00當量)於700 ml無水N,N-二甲基甲醯胺中之溶液中添加無水K2CO3(45.51 g；1.00當量)及2,2-二氯乙醚(15.84 ml；0.41當量)。在50℃下攪拌反應混合物22小時。在減壓下蒸發混合物至乾。使殘餘物懸浮於2 L二氯甲烷中且用飽和NaCl水溶液萃取兩次(每次1 L)。二氯甲烷層經Na2SO4脫水，接著在減壓下蒸發至乾並在高度真空下乾燥，得到64.5 g呈白黃色固體狀之3-氧雜戊烷-1,5-二氧基-內-2',3'-二甲醯亞胺降冰片烯(中間物1)。
步驟2：
向中間物1(64.25 g；1.00當量)於800 ml無水乙醇中之溶液中添加31.0 ml水合肼(4.26當量)。接著使反應混合物回流2小時。藉由在減壓下蒸發溶劑將混合物濃縮至起始體積之一半。濾出產生之沈澱物。在減壓下蒸發殘餘乙醇層至乾。在真空中乾燥含有粗產物3-氧雜-戊烷-1,5-二氧基胺之殘餘物，得到46.3 g。進一步藉由管柱層析(矽膠60；用二氯甲烷/甲醇混合物9/1進行同溶劑洗提)純化粗產物，得到11.7 g純最終產物3-氧雜-戊烷-1,5-二氧基胺。
實施例5 製備胺氧基-PSA
將自印度血清研究所(Serum Institute of India)(Pune,India)獲得之1000 mg經氧化PSA(MW=20 kD)溶解於16 ml 50 mM磷酸鹽緩衝液(pH 6.0)中。接著向反應混合物提供170 mg 3-氧雜-戊烷-1,5-二氧基胺。在室溫下震盪2小時後，添加78.5 mg氰基硼氫化鈉且反應18小時隔夜。接著使用由再生纖維素製成之具有5 kD截止的膜(50 cm2，Millipore)使反應混合物經受超濾/透濾程序(UF/DF)。
實施例6 使用層析純化步驟製備胺氧基-PSA
將自印度血清研究所(Pune,India)獲得之1290 mg經氧化PSA(MW=20 kD)溶解於25 ml 50 mM磷酸鹽緩衝液(pH 6.0)(緩衝液A)中。接著向反應混合物提供209 mg 3-氧雜-戊烷-1,5-二氧基胺。在室溫下震盪1小時後，添加101 mg氰基硼氫化鈉且反應3小時。接著使用Fractogel EMD DEAE 650-M層析凝膠(管柱尺寸：XK26/135)使混合物進行弱陰離子交換層析步驟。用110 ml緩衝液A稀釋反應混合物且以1 cm/min之流速加載於經緩衝液A預平衡之DEAE管柱上。接著以2 cm/min之流速用20 CV緩衝液B(20 mM Hepes，pH 6.0)洗滌管柱以移除自由3-氧雜-戊烷-1,5-二氧基胺及氰化物。接著用由67%緩衝液B與43%緩衝液C組成之階段梯度(20 mM Hepes、1M NaCl，pH 7.5)洗提胺氧基-PSA試劑。藉由UF/DF，使用由聚醚碸製成之5 kD膜(50 cm2，Millipore)濃縮洗提液。針對緩衝液D(20 mM Hepes、90 mM NaCl，pH 7.4)進行最後透濾步驟。藉由量測總PSA(間苯二酚檢定)及總胺氧基(TNBS檢定)以測定修飾程度而以分析法特性化製劑。此外，測定多分散性以及自由3-氧雜-戊烷-1,5-二氧基胺及氰化物。
實施例7 不使用還原步驟製備胺氧基-PSA
將自印度血清研究所(Pune,India)獲得之573 mg經氧化PSA(MW=20 kD)溶解於11.3 ml 50 mM磷酸鹽緩衝液(pH 6.0)(緩衝液A)中。接著向反應混合物提供94 mg 3-氧雜-戊烷-1,5-二氧基胺。在室溫下震盪5小時後，接著使用Fractogel EMD DEAE 650-M層析凝膠(管柱尺寸：XK16/105)使混合物進行弱陰離子交換層析步驟。用50 ml緩衝液A稀釋反應混合物且以1 cm/min之流速加載於經緩衝液A預平衡之DEAE管柱上。接著以2 cm/min之流速用20 CV緩衝液B(20 mM Hepes，pH 6.0)洗滌管柱以移除自由3-氧雜-戊烷-1,5-二氧基胺及氰化物。用由67%緩衝液B與43%緩衝液C組成之階段梯度(20 mM Hepes、1 M NaCl，pH 7.5)洗提胺氧基-PSA試劑。藉由UF/DF，使用由聚醚碸製成之5 kD膜(50 cm2，Millipore)濃縮洗提液。針對緩衝液D(20 mM Hepes、90 mM NaCl，pH 7.4)進行最後透濾步驟。藉由量測總PSA(間苯二酚檢定)及總胺氧基(TNBS檢定)以測定修飾程度而以分析法特性化製劑。此外，測定多分散性以及自由3-氧雜-戊烷-1,5-二氧基胺。
實施例8 不使用還原步驟且在親核性催化劑間甲苯胺存在下製備胺氧基-PSA
將自印度血清研究所(Pune,India)獲得之573 mg經氧化PSA(MW=20 kD)溶解於9 ml 50 mM磷酸鹽緩衝液(pH 6.0)(緩衝液A)中。接著向此溶液提供94 mg 3-氧雜-戊烷-1,5-二氧基胺。隨後將2.3 ml 50 mM間甲苯胺儲備溶液添加至此反應混合物中。在室溫下震盪2小時後，接著使用Fractogel EMD DEAE 650-M層析凝膠(管柱尺寸：XK16/105)使混合物進行弱陰離子交換層析步驟。用50 ml緩衝液A稀釋反應混合物且以1 cm/min之流速加載於經緩衝液A預平衡之DEAE管柱上。接著以2 cm/min之流速用20 CV緩衝液B(20 mM Hepes，pH 6.0)洗滌管柱以移除自由3-氧雜-戊烷-1,5-二氧基胺及氰化物。用由67%緩衝液B與43%緩衝液C組成之階段梯度(20 mM Hepes、1 M NaCl，pH 7.5)洗提胺氧基-PSA試劑。藉由UF/DF，使用由聚醚碸製成之5 kD膜(50 cm2，Millipore)濃縮洗提液。針對緩衝液D(20 mM Hepes、90 mM NaCl，pH 7.4)進行最後透濾步驟。藉由量測總PSA(間苯二酚檢定)及總胺氧基(TNBS檢定)以測定修飾程度而以分析法特性化製劑。此外，測定多分散性以及自由3-氧雜-戊烷-1,5-二氧基胺。
實施例9 製備胺氧基-PSA試劑
根據實施例4-8製備胺氧基-PSA試劑。透濾後，在-80℃下冷凍產物且凍乾。凍乾後，將試劑溶解於適當體積之水中且用於經由碳水化合物修飾來製備PSA-蛋白質結合物。
實施例10 評估不同替代性親核性催化劑之功效
在標準化條件(含1 mg/ml rFIX之20 mM L-組胺酸、150 mM NaCl、5 mM CaCl2(pH 6.0)，5倍莫耳胺氧基-PSA試劑過量，100 μM NaIO4)下，使用不同親核性催化劑(苯胺、間甲苯胺、鄰茴香胺、間茴香胺、鄰胺基苯甲酸、間胺基苯甲酸、對胺基苯甲酸、對胺基苯甲醯胺、對胺基苯磺酸/標準濃度：10 mM)將rFIX與過碘酸鈉、胺氧基-PSA試劑一起培育。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下反應2小時且在室溫下藉由添加最終濃度為1 mM之半胱胺酸水溶液來中止，持續15分鐘。
藉由SDS-PAGE，使用Invitrogen X-cell小系統測定偶合效率。將十二烷基硫酸鋰(lithium dodecyl sulfate，LDS)緩衝液攙入樣品中且在70℃下變性10分鐘。接著將樣品施加於3-8% TRIS-乙酸酯凝膠上且在150 V下電泳60分鐘。隨後用庫馬斯法(Coomassie)將凝膠染色。
另外，藉由使用SEC-HPLC系統，使用裝備有Shodex KW 803管柱之Agilent 1200 HPLC系統，在如先前所述之條件(Kolarich等人,Transfusion 2006;46:1959-77)下特性化樣品。
注射未經稀釋之50 μl樣品且用20 mM NaH2PO4、50mM Na2SO4(pH 6.1)之0.22 μm濾液以0.5 ml/min之流速同溶劑洗提。在280 nm下記錄洗提圖案。
結果總結於圖5A-C及6(SDS PAGE)及表2(SEC-HPLC結果)中。說明不同製劑之催化效應。已顯示，使用間甲苯胺產生與用苯胺所獲得之結果相等的結果。
實施例11 使用胺氧基-PSA及作為親核性催化劑之間甲苯胺使rFIX聚唾液酸化 方法1：
將12.3 mg rFIX溶解於6.1 ml組胺酸緩衝液(pH 6.0)(20 mM L-組胺酸、150 mM NaCl、5 mM CaCl2)中。接著添加254 μl過碘酸鈉水溶液(5 mM)且在4℃下在黑暗中在輕輕攪拌下培育反應混合物，在室溫下藉由添加6.5 μl 1 M半胱胺酸水溶液來中止，持續15分鐘。隨後使用Vivaspin 15R 10 kD離心過濾器使混合物進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物。
將含有經氧化rFIX之保留物(8.8 ml)與2.46 ml間甲苯胺水溶液(50 mM)混合且在室溫下培育30分鐘。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PSA試劑(上述)，產生5倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育此混合物2.5小時。
藉助於陰離子交換層析(AEC)移除自由rFIX。用15 ml緩衝液A(50 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7.5)稀釋反應混合物且加載於經緩衝液A預平衡之20 ml HiPrep QFF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。接著用緩衝液B(50 mM Hepes、1 M NaCl、5 mM CaCl2，pH 7.5)洗提管柱。自由rFIX以12-25 mS/cm之傳導率洗提且結合物以27-45 mS/cm之傳導率洗提。含有結合物之洗提份的傳導率隨後使用緩衝液C(50 mM Hepes、5 M NaCl、5 mM CaCl2，pH 6.9)升至190 mS/cm且加載於經緩衝液D(50 mM Hepes、3 M NaCl、5 mM CaCl2，pH 6.9)預平衡之20 ml HiPrep丁基FF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。用5 CV緩衝液D洗滌出自由胺氧基-PSA試劑。隨後用100%緩衝液E(50 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7，4)洗提結合物。藉由UF/DF，使用Vivaspin 15R 10 kD離心過濾器濃縮含有結合物之洗提份。針對含有150 mM NaCl及5 mM CaCl2之組胺酸緩衝液(pH 7.2)進行最後透濾步驟。藉由量測總蛋白質(布萊德法(Bradford))及FIX產色活性以分析法特性化製劑。PSA-rFIX結合物顯示與天然rFIX相比，測得比活性>50%。
方法2：
將12.3 mg rFIX溶解於L-組胺酸緩衝液(pH 6.0)(20 mM L-組胺酸、150 mM NaCl、5 mM CaCl2)中，得到1 mg rFIX/ml之最終蛋白質濃度。添加5 mM過碘酸鈉水溶液，得到100 μM之最終濃度且在4℃下在黑暗中在輕輕攪拌下在pH 6.0下培育反應混合物1小時，在室溫下藉由添加1 M L-半胱胺酸水溶液(或其他中止試劑)來中止，持續15分鐘，得到10 mM之最終濃度。隨後使用Vivaspin 15R 10 kD離心過濾器使混合物進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物。
將含有經氧化rFIX之所得保留物(8.8 ml)與間甲苯胺水溶液(50 mM)混合，得到10 mM之最終濃度且在室溫下培育30分鐘。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PSA試劑(上述)，產生5倍莫耳試劑過量。在室溫下在pH 6.0下培育此混合物2.5小時；在+4℃下在黑暗中在輕輕攪拌下培育0.5小時至18小時。
藉助於陰離子交換層析(AEC)移除自由rFIX。用適量緩衝液A(50 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7.5)稀釋反應混合物以校正溶液傳導率及pH值，隨後加載於經緩衝液A預平衡之20 ml HiPrep QFF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。接著用緩衝液B(50 mM Hepes、1 M NaCl、5 mM CaCl2，pH 7.5)洗提管柱。藉由階段梯度，使用25%緩衝液B洗提自由rFIX，使得所得洗提份中之傳導率為12-25 mS/cm，且使用50%緩衝液B之階段梯度洗提結合物，使得結合物洗提份中之傳導率為27-45 mS/cm。含有結合物之洗提份的傳導率隨後使用緩衝液C(50 mM Hepes、5 M NaCl、5 mM CaCl2，pH 6.9，或藉由使用抗離液鹽，例如硫酸銨、乙酸銨等)升至190 mS/cm且加載於經緩衝液D(50 mM Hepes、3 M NaCl、5 mM CaCl2，pH 6.9)預平衡之20 ml HiPrep丁基FF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT或類似HIC介質)上。用5 CV緩衝液D洗滌出自由胺氧基-PSA試劑。隨後用100%緩衝液E(50 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7.4)洗提結合物。藉由UF/DF，使用由再生纖維素製成之10 kD膜(88 cm2，截止10 kD，Millipore)濃縮含有結合物之洗提份。針對含有150 mM NaCl及5 mM CaCl2之L-組胺酸緩衝液(pH 7.2)進.行最後透濾步驟。藉由量測總蛋白質(布萊德法及BCA程序)及FIX產色及凝結活性以分析法特性化製劑。對於PSA-rFIX結合物，與天然rFIX相比，測得比活性>50%。
方法3：
將25.4 mg rFIX溶解於18.7 ml組胺酸緩衝液(pH 6.0)(20 mM L-組胺酸、150 mM NaCl、5 mM CaCl2)中。接著添加531 μl過碘酸鈉水溶液(5 mM)及5.07 ml間甲苯胺水溶液(50 mM)。隨後添加MW為20 kD之胺氧基-PSA試劑(上述)，產生5倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且在室溫下藉由添加25 μl 1M半胱胺酸水溶液來中止，持續15分鐘。
藉助於陰離子交換層析(AEC)移除自由rFIX。用20 ml緩衝液A(50 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7.5)稀釋反應混合物且加載於經緩衝液A預平衡之20 ml HiPrep QFF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。接著用緩衝液B(50 mM Hepes、1 M NaCl、5 mM CaCl2，pH 7.5)洗提管柱。自由rFIX以12-25 mS/cm之傳導率洗提且結合物以27-45 mS/cm之傳導率洗提。含有結合物之洗提份的傳導率隨後使用緩衝液C(50 mM Hepes、5 M NaCl、5 mM CaCl2，pH 6.9)升至190 mS/cm且加載於經緩衝液D(50 mM Hepes、3 M NaCl、5 mM CaCl2，pH 6.9)預平衡之20 ml HiPrep丁基FF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。用5 CV緩衝液D洗滌出自由胺氧基-PSA試劑。隨後用100%緩衝液E(50 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7.4)洗提結合物。藉由UF/DF，使用由再生纖維素製成之10 kD膜(88 cm2，截止10 kD，Millipore)濃縮含有結合物之洗提份。針對含有150 mM NaCl及5 mM CaCl2之組胺酸緩衝液(pH 7.2)進行最後透濾步驟。藉由量測總蛋白質(布萊德法)及FIX產色活性以分析法特性化製劑。對於PSA-rFIX結合物，與天然rFIX相比，測得比活性>50%。另外藉由尺寸排阻HPLC，使用裝備有Shodex KW 803管柱之Agilent 1200 HPLC系統，在如先前所述之條件(Kolarich等人,Transfusion 2006;46:1959-77)下以分析法特性化結合物。顯示製劑不含有自由FIX。結合物由57%單聚唾液酸化產物及31%二聚唾液酸化產物及12%三聚唾液酸化產物組成。
方法4：
將25.4 mg rFIX溶解於L-組胺酸緩衝液(pH 6.0)(20 mM L-組胺酸、150 mM NaCl、5 mM CaCl2)中，得到2 mg rFIX/ml之最終蛋白質濃度。隨後在15分鐘內添加5 mM過碘酸鈉水溶液，得到100 μM之最終濃度，隨後在30分鐘之時段內添加50 mM間甲苯胺水溶液，得到10 mM之最終濃度。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PSA試劑(上述)，產生5倍莫耳試劑過量。校正pH值至6.0後，在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且藉由添加1 M L-半胱胺酸水溶液以得到10 mM之最終濃度來中止，持續15分鐘。
藉助於離子交換層析(IEC)移除自由rFIX。用適量緩衝液A(50 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7.5)稀釋反應混合物以校正溶液傳導率及pH值，隨後加載於經緩衝液A預平衡之20 ml HiPrep QFF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。接著用緩衝液B(50 mM Hepes、1 M NaCl、5 mM CaCl2，pH 7.5)洗提管柱。藉由階段梯度，使用25%緩衝液B洗提自由rFIX，使得所得洗提份中之傳導率為12-25 mS/cm，且使用50%緩衝液B之階段梯度洗提結合物，使得結合物洗提份中之傳導率為27-45 mS/cm。含有結合物之洗提份的傳導率隨後使用緩衝液C(50 mM Hepes、5 M NaCl、5 mM CaCl2，pH 6.9；藉由使用抗離液鹽，例如乙酸銨)升至190 mS/cm且加載於經緩衝液D(50 mM Hepes、3 M NaCl、5 mM CaCl2，pH 6.9)預平衡之20 ml HiPrep丁基FF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT；或類似HIC介質)上。用5 CV緩衝液D洗滌出自由胺氧基-PSA試劑。隨後用100%緩衝液E(50 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7.4)洗提結合物。藉由UF/DF，使用由再生纖維素製成之10 kD膜(88 cm2，截止10 kD，Millipore)濃縮含有結合物之洗提份。針對含有150 mM NaCl及5 mM CaCl2之L-組胺酸緩衝液(pH 7.2)進行最後透濾步驟。藉由量測總蛋白質(布萊德法及BCA程序)及FIX產色及凝結活性以分析法特性化製劑。對於PSA-rFIX結合物，與天然rFIX相比，測得比活性>50%。另外藉由尺寸排阻HPLC，使用裝備有Shodex KW 803管柱之Agilent 1200 HPLC系統，在如先前所述之條件(Kolarich等人,Transfusion 2006;46: 1959-77)下以分析法特性化結合物。顯示製劑不含有自由FIX。結合物由57%單聚唾液酸化產物及31%二聚唾液酸化產物及12%三聚唾液酸化產物組成。
實施例12 使用胺氧基-PSA及作為親核性催化劑之間甲苯胺使rFVIII聚唾液酸化 方法1：
將50 mg rFVIII轉移至反應緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。向此溶液中添加NaIO4，得到200 μM之最終濃度。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行氧化反應30分鐘。接著在室溫下用半胱胺酸(最終濃度：10 mM)中止反應，持續60分鐘。使溶液通過經緩衝液A(20 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7.0)平衡且體積為20 ml之IEX管柱(Merck EMD TMAE(M))。用5 CV緩衝液A平衡管柱。接著用緩衝液B(20 mM Hepes、5 mM CaCl2、1 M NaCl，pH 7.0)洗提經氧化rFVIII。收集含有rFVIII之洗提份。測定蛋白質含量(庫馬斯法、布萊德法)且用反應緩衝液調整至1 mg/ml並藉由逐滴添加0.5 MHCl調整至pH 6.0。接著添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的胺氧基-PSA試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(最終濃度：10 mM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。藉助於HIC移除過量胺氧基-PSA試劑。藉由添加含有乙酸銨之緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣、8 M乙酸銨，pH 6.9)使反應混合物之傳導率升至130 mS/cm且加載於經50 mM Hepes、2.5 M乙酸銨、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣(pH 6.9)預平衡且填充有80 ml苯基瓊脂糖FF之管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。隨後用含有5 mM CaCl2之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.5)洗提結合物。最後，收集含有PSA-rFVIII之洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之30 kD膜(88 cm2，Millipore)進行UF/DF。藉由量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及FVIII產色活性以分析法特性化製劑。PSA-rFVIII結合物顯示與天然rFVIII相比，測得比活性>70%。
方法2：
將含來源於ADVATE製程之58 mg重組因子VIII(rFVIII)的Hepes緩衝液(50 mM HEPES、約350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣、0.1%聚山梨酸酯80，pH 7.4)溶解於反應緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到1.0 +/- 0.25 mg/ml之最終蛋白質濃度。接著藉由逐滴添加0.5 N HCl水溶液將溶液之pH值校正至6.0。隨後在10分鐘內添加40 mM過碘酸鈉水溶液，得到200 μM之濃度。在T=+22 +/- 2℃之溫度(T)下進行氧化反應30 +/- 5分鐘。接著藉由在T=+22 +/- 2℃下在15分鐘內添加L-半胱胺酸水溶液(1 M)來中止反應，得到在反應混合物中10 mM之最終濃度並培育60 +/- 5分鐘。
進一步藉由陰離子交換層析，在EMD TMAE(M)(Merck)上純化經氧化rFVIII。用緩衝液A(20 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 6.5)稀釋混合物，得到5 ms/cm之傳導率。使用1.5 cm/min之流速將此溶液加載於管柱體積為10 ml之IEX管柱(床高度：5.4 cm)上。隨後用5 CV之緩衝液A與緩衝液B(20 mM Hepes、5 mM CaCl2、1.0 M NaCl，pH 7.0)之92:8混合物(w/w)洗滌(流速：1.5 cm/min)此管柱。接著用緩衝液A與緩衝液B之50:50(w/w)混合物洗提經氧化rFVIII，隨後用5 CV緩衝液B進行後洗提步驟。藉由使用1.0 cm/min之流速進行洗提步驟。
隨後，在最多15分鐘之時段(t)內在輕輕攪拌下將50倍莫耳過量之胺氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)試劑添加至含有經純化之經氧化rFVIII之洗提液中。接著在15分鐘內添加間甲苯胺水溶液(50 mM)，得到10 mM之最終濃度。在T=+22+/-2℃之溫度(T)下在黑暗中在輕輕震盪下培育反應混合物120+/-10分鐘。
藉由疏水性相互作用層析(HIC)，使用填充於由GE Healthcare製造之床高度為15 cm且所得管柱體積(CV)為81 ml的管柱中之苯基瓊脂糖FF低亞樹脂(GE Healthcare)來純化所得PSA-rFVIII結合物。
藉由添加含有350 mM氯化鈉、8 M乙酸銨、5 mM氯化鈣之50 mM Hepes緩衝液(pH 6.9)將乙酸銨攙入反應混合物中。將2體積之反應混合物與1體積之含有乙酸銨之緩衝系統混合且藉由逐滴添加0.5 N NaOH水溶液將pH值校正至pH 6.9。將此混合物以1 cm/min之流速加載於HIC管柱上，隨後使用>3 CV平衡緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、2.5 M乙酸銨、5 mM氯化鈣，pH 6.9)進行洗滌步驟。
為移除反應副產物及抗離液鹽，以向上流動模式以2 cm/min之流速用>5 CV洗滌緩衝液1(50 mM Hepes、3 M氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.9)進行第二個洗滌步驟。接著以向下流動模式以1 cm/min之流速使用40%洗滌緩衝液2(50 mM Hepes、1.5 M氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.9)及60%洗提緩衝液(20 mM Hepes、5 mM氯化鈣，pH 7.5)之階段梯度洗提經純化之PSA-rFVIII結合物。在UV 280 nm下監測PSA-rFVIII結合物之洗提且收集<4 CV之含有結合物之洗提液。用>3 CV洗提緩衝液在相同條件下進行後洗提步驟以自主要產物分離次要及/或未經修飾之rFVIII。
最後，藉由超濾/透濾(UF/DF)，使用由再生纖維素製成且分子量截止為30 kD之膜(88 cm2，Millipore)濃縮經純化之結合物。
藉由量測總蛋白質、FVIII產色活性及藉由量測PSA含量(間苯二酚檢定)測定聚唾液酸化程度以分析法特性化使用此程序所製備之結合物。對於所得結合物，計算得到比活性>50%及PSA程度>5.0。
方法3：
將50 mg rFVIII轉移至反應緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。接著添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的胺氧基-PSA試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(最終濃度：10 mM)及NaIO4(最終濃度：400 μM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。隨後在室溫下用半胱胺酸中止反應，持續60分鐘(最終濃度：10 mM)。接著藉由添加含有乙酸銨之緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣、8 M乙酸銨，pH 6.9)使反應混合物之傳導率升至130 mS/cm且加載於經50 mM Hepes、2.5 M乙酸銨、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣、0.01% Tween 80(pH 6.9)預平衡且填充有80 ml苯基瓊脂糖FF之管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。隨後用50 mM Hepes、5 mM氯化鈣(pH 7.5)洗提結合物。最後，收集含有PSA-rFVIII之洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之30 kD膜(88 cm2，Millipore)進行UF/DF。藉由量測總蛋白質(布萊德法)及FVIII產色活性以分析法特性化製劑。對於PSA-rFVIII結合物，與天然rFVIII相比，測得比活性70%。
方法4：
將含來源於ADVATE製程之50 mg重組因子VIII(rFVIII)的50 mM Hepes緩衝液(50 mM HEPES、約350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣、0.1%聚山梨酸酯80，pH 7.4)溶解於反應緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25 mg/ml之最終蛋白質濃度。接著藉由逐滴添加0.5 N HCl水溶液將溶液之pH值校正至6.0。
隨後，在最多15分鐘之時段(t)內在輕輕攪拌下將50倍莫耳過量之胺氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)試劑添加至此rFVIII溶液中。接著在15分鐘內添加間甲苯胺水溶液(50 mM)，得到10 mM之最終濃度。最後，添加40 mM過碘酸鈉水溶液，得到400 μM之濃度。
在T=+22+/-2℃之溫度(T)下在黑暗中在輕輕震盪下培育反應混合物120+/-10分鐘。接著藉由添加L-半胱胺酸水溶液(1 M)來中止反應，得到在反應混合物中10 mM之最終濃度並培育60+/-5分鐘。
藉由疏水性相互作用層析(HIC)，使用填充於由GE Healthcare製造之床高度為15 cm且所得管柱體積(CV)為81 ml的管柱中之苯基瓊脂糖FF低亞樹脂(GE Healthcare)來純化所得PSA-rFVIII結合物。
藉由添加含有350 mM氯化鈉、8 M乙酸銨、5 mM氯化鈣之50 mM Hepes緩衝液(pH 6.9)將乙酸銨攙入反應混合物中。將2體積之反應混合物與1體積之含有乙酸銨之緩衝系統混合且藉由逐滴添加0.5 N NanOH水溶液將pH值校正至pH 6.9。將此混合物以1 cm/min之流速加載於HIC管柱上，隨後使用>3 CV平衡緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、2.5 M乙酸銨、5 mM氯化鈣，pH 6.9)進行洗滌步驟。
為移除反應副產物及抗離液鹽，以向上流動模式以2 cm/min之流速用>5 CV洗滌緩衝液1(50 mM Hepes、3 M氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.9)進行第二個洗滌步驟。接著以向下流動模式以1 cm/min之流速使用40%洗滌緩衝液2(50 mM Hepes、1.5 M氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.9)及60%洗提緩衝液(20 mM Hepes、5 mM氯化鈣，pH 7.5)之階段梯度洗提經純化之PSA-rFVIII結合物。在UV 280 nm下監測PSA-rFVIII結合物之洗提且收集<4 CV之含有結合物之洗提液。用>3 CV洗提緩衝液在相同條件下進行後洗提步驟以自主要產物分離次要及/或未經修飾之rFVIII。
最後，藉由超濾/透濾(UF/DF)，使用由再生纖維素製成且具有分子量截止30 kD之膜(88 cm2，Millipore)濃縮經純化之結合物。
藉由量測總蛋白質、FVIII產色活性及藉由量測PSA含量(間苯二酚檢定)測定聚唾液酸化程度以分析法特性化使用此程序所製備之結合物。
分析數據(6個連續批次之平均值)：
製程產率(布萊德法)：58.9%
製程產率(FVIII層析)：46.4%
比活性：(FVIII層析/毫克蛋白質)：4148 IU/mg
比活性(起始物質%)：79.9%
PSA程度(mol/mol)：8.1
實施例13 使用胺氧基-PEG試劑及作為親核性催化劑之間甲苯胺來使rFVIII聚乙二醇化 方法1：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使rFVIII聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將14.7 mg rFVIII溶解於7.0 ml組胺酸緩衝液(pH 6.0)(20 mM L-組胺酸、150 mM NaCl、5 mM CaCl2)中。接著添加296 μl過碘酸鈉水溶液(5mM)且在4℃下在黑暗中在輕輕攪拌下培育反應混合物1小時，在室溫下藉由添加7.5 μl 1 M半胱胺酸水溶液來中止，持續15分鐘。隨後使用Vivaspin 15R 10 kD離心過濾器使混合物進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物。
將含有經氧化rFVIII之保留物(10.9 ml)與2.94 ml間甲苯胺水溶液(50 mM)混合且在室溫下培育30分鐘。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑，產生5倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育此混合物2.5小時。
最後，藉由離子交換層析，在Q瓊脂糖FF上純化PEG-rFVIII結合物。將每毫升凝膠1.5 mg蛋白質加載於經含有5 mM CaCl2之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)預平衡的管柱上。用含有5 mM CaCl2及500 mM氯化鈉之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)洗提結合物，接著使用30 kD膜(50 cm2，Millipore)進行UF/DF。藉由量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及FVIII產色活性以分析法特性化製劑。預期PEG-rFVIII結合物將說明與天然rFVIII相比，測得比活性>70%。
方法2：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使rFVIII聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將起始重量或濃度之rFVIII溶解於或轉移至反應緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25mg/ml之最終蛋白質濃度。接著藉由逐滴添加0.5 N HCl水溶液將溶液之pH值校正至6.0。隨後在10分鐘內添加40 mM過碘酸鈉水溶液，得到200 μM之濃度。在T=+22 +/- 2℃之溫度(T)下進行氧化反應30 +/- 5分鐘。接著藉由在T=+22 +/- 2℃下在15分鐘內添加L-半胱胺酸水溶液(1 M)來中止反應，得到在反應混合物中10 mM之最終濃度並培育60 +/- 5分鐘。
進一步藉由陰離子交換層析，在EMD TMAE(M)(Merck)上純化經氧化rFVIII。用緩衝液A(20 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 6.5)稀釋混合物，得到5 ms/cm之傳導率。使用1.5 cm/min之流速將此溶液加載於管柱體積為10 ml之IEX管柱(床高度：5.4 cm)上。隨後用5 CV之緩衝液A與緩衝液B(20 mM Hepes、5 mM CaCl2、1.0 M NaCl，pH 7.0)之92:8混合物(w/w)洗滌(流速：1.5 cm/min)此管柱。接著用緩衝液A與緩衝液B之50:50(w/w)混合物洗提經氧化rFVIII，隨後用5 CV緩衝液B進行後洗提步驟。藉由使用1.0 cm/min之流速進行洗提步驟。
隨後，在最多15分鐘之時段(t)內在輕輕攪拌下將MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑以50倍莫耳過量添加至含有經純化之經氧化rFVIII的洗提液中。接著在15分鐘內添加間甲苯胺水溶液(50 mM)，得到10 mM之最終濃度。在T=+22 +/- 2℃之溫度(T)下在黑暗中在輕輕震盪下培育反應混合物120 +/- 10分鐘。
藉由疏水性相互作用層析(HIC)，使用填充於由GEHealthcare製造之床高度為15 cm且所得管柱體積(CV)為81 ml的管柱中之苯基瓊脂糖FF低亞樹脂(GE Healthcare)來純化所得PSA-rFVIII結合物。
藉由添加含有350 mM氯化鈉、8 M乙酸銨、5 mM氯化鈣之50 mM Hepes緩衝液(pH 6.9)將乙酸銨攙入反應混合物中。將2體積之反應混合物與1體積之含有乙酸銨之緩衝系統混合且藉由逐滴添加0.5 N NaOH水溶液將pH值校正至pH 6.9。將此混合物以1 cm/min之流速加載於HIC管柱上，隨後使用>3 CV平衡緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、2.5 M乙酸銨、5 mM氯化鈣，pH 6.9)進行洗滌步驟。
為移除反應副產物及抗離液鹽，以向上流動模式以2 cm/min之流速用>5 CV洗滌緩衝液1(50 mM Hepes、3 M氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.9)進行第二個洗滌步驟。接著以向下流動模式以1 cm/min之流速使用40%洗滌緩衝液2(50 mM Hepes、1.5 M氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.9)及60%洗提緩衝液(20 mM Hepes、5 mM氯化鈣，pH 7.5)之階段梯度洗提經純化之rFVIII結合物。在UV 280 nm下監測PEG-rFVIII結合物之洗提且收集<4 CV之含有結合物之洗提液。用>3 CV洗提緩衝液在相同條件下進行後洗提步驟以自主要產物分離次要及/或未經修飾之rFVIII。
最後，藉由超濾/透濾(UF/DF)，使用由再生纖維素製成且具有分子量截止30 kD之膜(Millipore)濃縮經純化之結合物。
藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質及生物活性以分析法特性化使用此程序所製備之結合物。
方法3：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使rFVIII聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司，Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將溶解於6 ml Hepes緩衝液(50 mM Hepes、150 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中之7.84 mg rFVIII與314 μl過碘酸鈉水溶液(10 mM)及1.57 ml間甲苯胺水溶液(50 mM)混合。隨後添加胺氧基試劑，產生20倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且在室溫下藉由添加8 μl半胱胺酸水溶液(1M)來中止，持續15分鐘。
最後，藉由離子交換層析，在Q-瓊脂糖FF上純化PEG-rFVIII結合物。將每毫升凝膠1.5 mg蛋白質加載於經含有5 mM CaCl2之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)預平衡的管柱上。用含有5 mM CaCl2及500 mM氯化鈉之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)洗提結合物，接著使用30 kD膜(88 cm2，Millipore)進行UF/DF。藉由FVIII產色檢定及測定總蛋白質(布萊德法)以分析法特性化結合物，顯示與rFVIII起始物質相比，比活性>60%。
方法4：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使rFVIII聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司，Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將初始濃度或重量之rFVIII轉移至或溶解於Hepes緩衝液(50 mM Hepes、150 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到2 mg rFVIII/ml之最終蛋白質濃度。隨後，在15分鐘內添加5 mM過碘酸鈉水溶液，得到100 μM之最終濃度，隨後在30分鐘之時段內添加50 mM間甲苯胺水溶液，得到10 mM之最終濃度。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑(上述)，產生20倍莫耳過量。校正pH值至6.0後，在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且藉由添加1 M L-半胱胺酸水溶液以得到10 mM之最終濃度來中止，持續15分鐘。
藉助於離子交換層析(IEC)移除自由rFVIII。用適量緩衝液A(50 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7.5)稀釋反應混合物以校正溶液傳導率及pH值，隨後加載於經緩衝液A預平衡之20 ml HiPrep QFF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。接著用緩衝液B(50 mM Hepes、1 M NaCl、5 mM CaCl2，pH 7.5)洗提管柱。藉由階段梯度，使用25%緩衝液B洗提自由rFVIII，使得所得洗提份之傳導率為12-25 mS/cm，且使用50%緩衝液B之階段梯度洗提結合物，使得結合物洗提份之傳導率為27-45 mS/cm。含有結合物之洗提份的傳導率隨後使用緩衝液C(50 mM Hepes、5 M NaCl、5 mM CaCl2，pH 6.9；藉由使用抗離液鹽，例如硫酸銨、乙酸銨等)升高且加載於經緩衝液D(50 mMHepes、3 M NaCl、5 mM CaCl2，pH 6.9)預平衡之20 ml HiPrep丁基FF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT；類似HIC介質)上。用5 CV緩衝液D洗滌出自由PEG-試劑。隨後用100%緩衝液E(50 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7.4)洗提結合物。藉由UF/DF，使用由再生纖維素製成之10 kD膜(88 cm2，截止10 kD，Millipore)濃縮含有結合物之洗提份。針對Hepes緩衝液(50 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7.5)進行最後透濾步驟。
藉由根據已知方法量測總蛋白質(布萊德法及BCA程序)及生物活性以分析法特性化製劑。
實施例14 使用胺氧基-PSA及作為親核性催化劑之間甲苯胺使rFVIIa聚唾液酸化 方法1：
將起始濃度或重量之重組因子VIIa(rFVIIa)轉移至或溶解於反應緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25 mg/ml之最終蛋白質濃度。接著藉由逐滴添加0.5 N NaOH水溶液將溶液之pH值校正至6.0。隨後在10分鐘內添加40 mM過碘酸鈉水溶液，得到50 μM之濃度。在T=+22+/-2℃之溫度(T)下進行氧化反應30+/-5分鐘。接著藉由在T=+22+/-2℃下在15分鐘內添加L-半胱胺酸水溶液(1 M)來中止反應，得到在反應混合物中10 mM之最終濃度並培育60+/-5分鐘。
進一步藉由陰離子交換層析，在EMD TMAE(M)(Merck)上純化經氧化rFVIIa。用緩衝液A(20 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 6.5)稀釋混合物，得到5 ms/cm之傳導率。使用1.5 cm/min之流速將此溶液加載於管柱體積為10 ml之IEX管柱(床高度：5.4 cm)上。隨後用5 CV之緩衝液A與緩衝液B(20 mM Hepes、5 mM CaCl2、1.0 M NaCl，pH 7.0)之92:8混合物(w/w)洗滌(流速：1.5 cm/min)此管柱。接著用緩衝液A與緩衝液B之50:50(w/w)混合物洗提經氧化rFVIIa，隨後用5 CV緩衝液B進行後洗提步驟。藉由使用1.0 cm/min之流速進行洗提步驟。
隨後，在最多15分鐘之時段(t)內在輕輕攪拌下將50倍莫耳過量之胺氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)試劑添加至含有經純化之經氧化rFVIIa之洗提液中。接著在15分鐘內添加間甲苯胺水溶液(50 mM)，得到10 mM之最終濃度。在T=+22+/-2℃之溫度(T)下在黑暗中在輕輕震盪下培育反應混合物120+/-10分鐘。
藉由疏水性相互作用層析(HIC)，使用填充於由GE Healthcare製造之床高度為15 cm且所得管柱體積(CV)為81 ml的管柱中之苯基瓊脂糖FF低亞樹脂(GE Healthcare)來純化所得PSA-rFVIIa結合物。
藉由添加含有350 mM氯化鈉、8 M乙酸銨、5 mM氯化鈣之50 mM Hepes緩衝液(pH 6.9)將乙酸銨攙入反應混合物中。將2體積之反應混合物與1體積之含有乙酸銨之緩衝系統混合且藉由逐滴添加0.5 N NaOH水溶液將pH值校正至pH 6.9。將此混合物以1 cm/min之流速加載於HIC管柱上，隨後使用>3 CV平衡緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、2.5 M乙酸銨、5 mM氯化鈣，pH 6.9)進行洗滌步驟。
為移除反應副產物及抗離液鹽，以向上流動模式以2 cm/min之流速用>5 CV洗滌緩衝液1(50 mM Hepes、3 M氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.9)進行第二個洗滌步驟。接著以向下流動模式以1 cm/min之流速使用40%洗滌緩衝液2(50 mM Hepes、1.5 M氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.9)及60%洗提緩衝液(20 mM Hepes、5 mM氯化鈣，pH 7.5)之階段梯度洗提經純化之rFVIIa結合物。在UV 280 nm下監測PSA-rFVIIa結合物之洗提且收集<4 CV之含有結合物之洗提液。用>3 CV洗提緩衝液在相同條件下進行後洗提步驟以自主要產物分離次要及/或未經修飾之rFVIIa。
最後，藉由超濾/透濾(UF/DF)，使用由再生纖維素製成且具有適當分子量截止之膜(例如30 kD MWCO，88 cm2，Millipore)濃縮經純化之結合物。
藉由量測總蛋白質、生物活性及藉由量測PSA含量(間苯二酚檢定)測定聚唾液酸化程度以分析法特性化使用此程序所製備之結合物。
方法2：
將起始重量或濃度之rFVIIa溶解於或轉移至反應緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到1.0 +/- 0.25 mg/ml之最終蛋白質濃度。接著藉由逐滴添加0.5 N NaOH水溶液將溶液之pH值校正至6.0。
隨後，在最多15分鐘之時段(t)內在輕輕攪拌下將50倍莫耳過量之胺氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)試劑添加至此rFVIIa溶液中。接著在15分鐘內添加間甲苯胺水溶液(50 mM)，得到10 mM之最終濃度。最後，添加40 mM過碘酸鈉水溶液，得到150 μM之濃度。
在T=+22 +/- 2℃之溫度(T)下在黑暗中在輕輕震盪下培育反應混合物120 +/- 10分鐘。接著藉由添加L-半胱胺酸水溶液(1 M)來中止反應，得到在反應混合物中10 mM之最終濃度並培育60 +/- 5分鐘。
藉由疏水性相互作用層析(HIC)，使用填充於由GE Healthcare製造之床高度為15 cm且所得管柱體積(CV)為81 ml的管柱中之苯基瓊脂糖FF低亞樹脂(GE Healthcare)來純化所得PSA-rFVIIa結合物。
藉由添加含有350 mM氯化鈉、8 M乙酸銨、5 mM氯化鈣之50 mM Hepes緩衝液(pH 6.9)將乙酸銨攙入反應混合物中。將2體積之反應混合物與1體積之含有乙酸銨之緩衝系統混合且藉由逐滴添加0.5 N NanOH水溶液將pH值校正至pH 6.9。將此混合物以1 cm/min之流速加載於HIC管柱上，隨後使用>3 CV平衡緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、2.5 M乙酸銨、5 mM氯化鈣，pH 6.9)進行洗滌步驟。
為移除反應副產物及抗離液鹽，以向上流動模式以2 cm/min之流速用>5 CV洗滌緩衝液1(50 mM Hepes、3 M氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.9)進行第二個洗滌步驟。接著以向下流動模式以1 cm/min之流速使用40%洗滌緩衝液2(50 mM Hepes、1.5 M氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.9)及60%洗提緩衝液(20 mM Hepes、5 mM氯化鈣，pH 7.5)之階段梯度洗提經純化之rFVIIa結合物。在UV 280 nm下監測PSA-rFVIIa結合物之洗提且收集<4 CV之含有結合物之洗提液。用>3 CV洗提緩衝液在相同條件下進行後洗提步驟以自主要產物分離次要及/或未經修飾之rFVIII。
最後，藉由超濾/透濾(UF/DF)，使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)濃縮經純化之結合物。
藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質、生物活性及藉由量測PSA含量(間苯二酚檢定)測定聚唾液酸化程度以分析法特性化使用此程序所製備之結合物。
實施例15 使用胺氧基-PEG試劑及作為親核性催化劑之間甲苯胺使rFIX聚乙二醇化 方法1：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使rFIX聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將起始重量或濃度之rFIX溶解於或轉移至反應緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到1.0 +/- 0.25 mg/ml之最終蛋白質濃度。接著藉由逐滴添加0.5 N HCl水溶液將溶液之pH值校正至6.0。隨後在10分鐘內添加40 mM過碘酸鈉水溶液，得到200 μM之濃度。在T=+22+/-2℃之溫度(T)下進行氧化反應30+/-5分鐘。接著藉由在T=+22 +/- 2℃下在15分鐘內添加L-半胱胺酸水溶液(1M)來中止反應，得到在反應混合物中10 mM之最終濃度並培育60 +/- 5分鐘。
進一步藉由陰離子交換層析，在EMD TMAE(M)(Merck)上純化經氧化rFVIII。用緩衝液A(20 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 6.5)稀釋混合物，得到5 ms/cm之傳導率。使用1.5 cm/min之流速將此溶液加載於管柱體積為10 ml之IEX管柱(床高度：5.4 cm)上。隨後用5 CV之緩衝液A與緩衝液B(20 mM Hepes、5mM CaCl2、1.0 M NaCl，pH 7.0)之92:8混合物(w/w)洗滌(流速：1.5 cm/min)此管柱。接著用緩衝液A與緩衝液B之50:50(w/w)混合物洗提經氧化rFIX，隨後用5 CV緩衝液B進行後洗提步驟。藉由使用1.0 cm/min之流速進行洗提步驟。
隨後，在最多15分鐘之時段(t)內在輕輕攪拌下將MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑以50倍莫耳過量添加至含有經純化之經氧化rFIX的洗提液中。接著在15分鐘內添加間甲苯胺水溶液(50 mM)，得到10 mM之最終濃度。在T=+22 +/- 2℃之溫度(T)下在黑暗中在輕輕震盪下培育反應混合物120 +/- 10分鐘。
藉由疏水性相互作用層析(HIC)，使用填充於由GE Healthcare製造之床高度為15 cm且所得管柱體積(CV)為81 ml的管柱中之苯基瓊脂糖FF低亞樹脂(GE Healthcare)來純化所得PSA-rFIX結合物。
藉由添加含有350 mM氯化鈉、8 M乙酸銨、5 mM氯化鈣之50 mM Hepes緩衝液(pH 6.9)將乙酸銨攙入反應混合物中。將2體積之反應混合物與1體積之含有乙酸銨之緩衝系統混合且藉由逐滴添加0.5 N NaOH水溶液將pH值校正至pH 6.9。將此混合物以1 cm/min之流速加載於HIC管柱上，隨後使用>3 CV平衡緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、2.5 M乙酸銨、5 mM氯化鈣，pH 6.9)進行洗滌步驟。
為移除反應副產物及抗離液鹽，以向上流動模式以2 cm/min之流速用>5 CV洗滌緩衝液1(50 mM Hepes、3 M氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.9)進行第二個洗滌步驟。接著以向下流動模式以1 cm/min之流速使用40%洗滌緩衝液2(50 mM Hepes、1.5 M氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.9)及60%洗提緩衝液(20 mM Hepes、5 mM氯化鈣，pH 7.5)之階段梯度洗提經純化之rFIX結合物。在UV 280 nm下監測PEG-rFIX結合物之洗提且收集<4 CV之含有結合物之洗提液。用>3 CV洗提緩衝液在相同條件下進行後洗提步驟以自主要產物分離次要及/或未經修飾之rFIX。
最後，藉由超濾/透濾(UF/DF)，使用由再生纖維素製成且具有分子量截止10 kD之膜(88 cm2，Millipore)濃縮經純化之結合物。
藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質及生物活性以分析法特性化使用此程序所製備之結合物。
方法2：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使rFIX聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將初始濃度或重量之rFIX轉移至或溶解於Hepes緩衝液(50 mM Hepes、150 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到2 mg rFIX/ml之最終蛋白質濃度。隨後，在15分鐘內添加5 mM過碘酸鈉水溶液，得到100 μM之最終濃度，隨後在30分鐘之時段內添加50 mM間甲苯胺水溶液，得到10 mM之最終濃度。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑(上述)，產生20倍莫耳試劑過量。校正pH值至6.0後，在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且藉由添加1 M L-半胱胺酸水溶液以得到10 mM之最終濃度來中止，持續15分鐘。
藉助於離子交換層析(IEC)移除自由rFIX。用適量緩衝液A(50 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7.5)稀釋反應混合物以校正溶液傳導率及pH值，隨後加載於經緩衝液A預平衡之20 ml HiPrep QFF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。接著用緩衝液B(50 mM Hepes、1 M NaCl、5 mM CaCl2，pH 7.5)洗提管柱。藉由階段梯度，使用25%緩衝液B洗提自由rFIX，使得所得洗提份之傳導率為12-25 mS/cm，且使用50%緩衝液B之階段梯度洗提結合物，使得結合物洗提份之傳導率為27-45 mS/cm。含有結合物之洗提份的傳導率隨後使用緩衝液C(50 mM Hepes、5 M NaCl、5 mM CaCl2，pH 6.9；藉由使用抗離液鹽，例如乙酸銨等)升高且加載於經緩衝液D(50 mM Hepes、3 M NaCl、5 mM CaCl2，pH 6.9)預平衡之20 ml HiPrep丁基FF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT；類似HIC介質)上。用5 CV緩衝液D洗滌出自由胺氧基-PEG試劑。隨後用100%緩衝液E(50 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7.4)洗提結合物。藉由UF/DF，使用由再生纖維素製成之10 kD 膜(88 cm2，截止10 kD，Millipore)濃縮含有結合物之洗提份。針對Hepes緩衝液(50 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7.5)進行最後透濾步驟。
藉由根據已知方法量測總蛋白質(布萊德法及BCA程序)及生物活性以分析法特性化製劑。
實施例16 使用胺氧基-PEG試劑及作為親核性催化劑之間甲苯胺使rFVIIa聚乙二醇化 方法1：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使rFVIIa聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將起始重量或濃度之rFVIIa溶解於或轉移至反應緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25 mg/ml之最終蛋白質濃度。接著藉由逐滴添加0.5 N NaOH水溶液將溶液之pH值校正至6.0。隨後在10分鐘內添加40 mM過碘酸鈉水溶液，得到50 μM之濃度。在T=+22+/-2℃之溫度(T)下進行氧化反應30+/-5分鐘。接著藉由在T=+22+/-2℃下在15分鐘內添加L-半胱胺酸水溶液(1 M)來中止反應，得到在反應混合物中10 mM之最終濃度並培育60+/-5分鐘。
進一步藉由陰離子交換層析，在EMD TMAE(M)(Merck)上純化經氧化rFVIIa。用緩衝液A(20 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 6.5)稀釋混合物，得到5 ms/cm之傳導率。使用1.5 cm/min之流速將此溶液加載於管柱體積為10 ml之IEX管柱(床高度：5.4 cm)上。隨後用5 CV之緩衝液A與緩衝液B(20 mM Hepes、5 mM CaCl2、1.0 M NaCl，pH 7.0)之92:8混合物(w/w)洗滌(流速：1.5 cm/min)此管柱。接著用緩衝液A與緩衝液B之50:50(w/w)混合物洗提經氧化rFVIIa，隨後用5 CV緩衝液B進行後洗提步驟。藉由使用1.0 cm/min之流速進行洗提步驟。
隨後，在最多15分鐘之時段(t)內在輕輕攪拌下將MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑以50倍莫耳過量添加至含有經純化之經氧化rFVIIa的洗提液中。接著在15分鐘內添加間甲苯胺水溶液(50 mM)，得到10 mM之最終濃度。在T=+22+/-2℃之溫度(T)下在黑暗中在輕輕震盪下培育反應混合物120+/-10分鐘。
藉由疏水性相互作用層析(HIC)，使用填充於由GE Healthcare製造之床高度為15 cm且所得管柱體積(CV)為81 ml的管柱中之苯基瓊脂糖FF低亞樹脂(GE Healthcare)來純化所得PSA-rFVIIa結合物。
藉由添加含有350 mM氯化鈉、8 M乙酸銨、5 mM氯化鈣之50 mM Hepes緩衝液(pH 6.9)將乙酸銨攙入反應混合物中。將2體積之反應混合物與1體積之含有乙酸銨之緩衝系統混合且藉由逐滴添加0.5 N NaOH水溶液將pH值校正至pH 6.9。將此混合物以1 cm/min之流速加載於HIC管柱上，隨後使用>3 CV平衡緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、2.5 M乙酸銨、5 mM氯化鈣，pH 6.9)進行洗滌步驟。
為移除反應副產物及抗離液鹽，以向上流動模式以2 cm/min之流速用>5 CV洗滌緩衝液1(50 mM Hepes、3 M氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.9)進行第二個洗滌步驟。接著以向下流動模式以1 cm/min之流速使用40%洗滌緩衝液2(50 mM Hepes、1.5 M氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.9)及60%洗提緩衝液(20 mM Hepes、5 mM氯化鈣，pH 7.5)之階段梯度洗提經純化之rFVIIa結合物。在UV 280 nm下監測PEG-rFVIIa結合物之洗提且收集<4 CV之含有結合物之洗提液。用>3 CV洗提緩衝液在相同條件下進行後洗提步驟以自主要產物分離次要及/或未經修飾之rFVIIa。
最後，藉由超濾/透濾(UF/DF)，使用由再生纖維素製成且具有分子量截止10 kD之膜(Millipore)濃縮經純化之結合物。
藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質及生物活性以分析法特性化使用此程序所製備之結合物。
方法2：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使rFVIIa聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將初始濃度或重量之rFVIIa轉移至或溶解於Hepes緩衝液(50 mM Hepes、150 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到2 mg rFVIIa/ml之最終蛋白質濃度。隨後在15分鐘內添加5 mM過碘酸鈉水溶液，得到100 μM之最終濃度，隨後在30分鐘之時段內添加50 mM間甲苯胺水溶液，得到10 mM之最終濃度。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑(上述)，產生20倍莫耳試劑過量。校正pH值至6.0後，在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且藉由添加1 M L-半胱胺酸水溶液以得到10 mM之最終濃度來中止，持續15分鐘。
藉助於離子交換層析(IEC)移除自由rFVIIa。用適量緩衝液A(50 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7.5)稀釋反應混合物以校正溶液傳導率及pH值，隨後加載於經緩衝液A預平衡之20 ml HiPrep QFF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。接著用緩衝液B(50 mM Hepes、1 M NaCl、5 mM CaCl2，pH 7.5)洗提管柱。藉由階段梯度，使用25%緩衝液B洗提自由rFVIIa，使得所得洗提份之傳導率為12-25 mS/cm，且使用50%緩衝液B之階段梯度洗提結合物，使得結合物洗提份之傳導率為27-45 mS/cm。含有結合物之洗提份的傳導率隨後使用緩衝液C(50 mM Hepes、5 M NaCl、5 mM CaCl2，pH 6.9；藉由使用抗離液鹽，例如乙酸銨)升高且加載於經緩衝液D(50 mM Hepes、3 M NaCl、5 mM CaCl2，pH 6.9)預平衡之20 ml HiPrep丁基FF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT；類似HIC介質)上。用5 CV緩衝液D洗滌出自由PEG-試劑。隨後用100%緩衝液E(50 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7.4)洗提結合物。藉由UF/DF，使用由再生纖維素製成之10 kD膜(88 cm2，截止10 kD，Millipore)濃縮含有結合物之洗提份。針對Hepes緩衝液(50 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7.5)進行最後透濾步驟。
藉由根據已知方法量測總蛋白質(布萊德法及BCA程序)及生物活性以分析法特性化製劑。
實施例17 在鄰胺基苯甲酸存在下使rFIX聚唾液酸化 方法1：
將8.2 mg rFIX溶解於4.0 ml組胺酸緩衝液(pH 6.0)(20 mM L-組胺酸、150 mM NaCl、5 mM CaCl2)中。接著添加82 μl過碘酸鈉水溶液(5 mM)且在4℃下在黑暗中在輕輕攪拌下培育反應混合物1小時，在室溫下藉由添加4 μl 1 M半胱胺酸水溶液來中止，持續15分鐘。隨後使用Vivaspin 6 10 kD離心過濾器使混合物進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物。
將含有經氧化rFIX之保留物(6.5 ml)與1.64 ml鄰胺基苯甲酸水溶液(50 mM)混合且在室溫下培育30分鐘。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PSA試劑(上述)，產生5倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育此混合物2.5小時。
結合物之進一步純化如本文所述進行。
方法2：
製備0.65 ml含有5倍莫耳過量之MW為20 kD的胺氧基-PSA試劑(上述)之1 mg rFIX於磷酸鈉緩衝液(pH 6.0)中之溶液。接著添加333 μl鄰胺基苯甲酸水溶液(30 mM)作為親核性催化劑，得到10 mM之最終濃度。隨後添加20 μl NaIO4水溶液(5 mM)，得到100 μM之最終濃度。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合過程2小時且在室溫下藉由添加1 μl半胱胺酸水溶液(1 M)來中止，持續15分鐘。結合物之進一步純化如本文所述進行。
實施例18 使用胺氧基-PSA及作為親核性催化劑之間甲苯胺使EPO聚唾液酸化 方法1：
將起始濃度之紅血球生成素(EPO)轉移至反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。向此溶液中添加NaIO4，得到200 μM之最終濃度。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行氧化反應30分鐘。接著在室溫下用半胱胺酸(最終濃度：10 mM)中止反應，持續60分鐘。
接著使用Vivaspin離心過濾器使溶液進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物，或在替代性情況下通過經緩衝液A(20 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7.0)平衡且體積為20 ml之IEX管柱(Merck EMD TMAE(M))。用5 CV緩衝液A平衡管柱。用緩衝液B(20 mM Hepes、5 mM CaCl2、1 M NaCl，pH 7.0)洗提經氧化EPO。收集含有EPO之洗提份。測定蛋白質含量(庫馬斯法、布萊德法)且用反應緩衝液調整至1 mg/ml並藉由逐滴添加0.5 M HCl調整至pH 6.0。
添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的胺氧基-PSA試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(最終濃度：10 mM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。藉助於HIC移除過量胺氧基-PSA試劑。藉由添加含有乙酸銨之緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣、8 M乙酸銨，pH 6.9)調整反應混合物之傳導率且加載於經50 mM Hepes、2.5 M乙酸銨、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣(pH 6.9)預平衡且填充有80 ml苯基瓊脂糖FF之管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。隨後用含有5 mM CaCl2之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.5)洗提結合物。最後收集含有PSA-EPO之洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之膜(MWCO 10 kD，50 cm2，Millipore)進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法1。
將10 mg EPO溶解於5 ml組胺酸緩衝液(pH 6.0)(20 mM L-組胺酸、150 mM NaCl)中。接著添加100 μl過碘酸鈉水溶液(5 mM)且在4℃下在黑暗中在輕輕攪拌下培育反應混合物1小時，在室溫下藉由添加50 μl 1 M半胱胺酸水溶液來中止，持續15分鐘。隨後使用Vivaspin 15R 10 kD離心過濾器使混合物進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物。
將含有經氧化EPO之保留物(約7 ml)與2 ml間甲苯胺水溶液(50 mM)混合且在室溫下培育30分鐘。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PSA試劑(上述)，產生5倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育此混合物2.5小時。
藉助於陰離子交換層析(AEC)移除自由EPO。用20 ml緩衝液A(50 mM Hepes，pH 7.5)稀釋反應混合物且加載於經緩衝液A預平衡之20 ml HiPrep QFF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。接著用緩衝液B(50 mM Hepes、1 M NaCl，pH 7.5)洗提管柱。藉由用25%緩衝液B洗滌管柱來洗提自由EPO且用50%緩衝液B洗提結合物。含有結合物之洗提份的傳導率隨後使用緩衝液C(50 mM Hepes、5 M NaCl，pH 6.9)升至約190 mS/cm且加載於經緩衝液D(50 mM Hepes、3 M NaCl，pH 6.9)預平衡之20 ml HiPrep丁基FF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。用5 CV緩衝液D洗滌出自由PSA試劑。隨後，用100%緩衝液E(50 mM Hepes，pH 7.4)洗提結合物。藉由UF/DF使用由再生纖維素製成之10 kD膜(88 cm2，截止10 kD/Millipore)濃縮含有結合物之洗提份。針對含有150 mM NaCl之組胺酸緩衝液(pH 7.2)進行最後透濾步驟。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。對於PSA-EPO結合物，與天然EPO相比，測得比活性>50%。另外藉由尺寸排阻HPLC，使用裝備有Shodex KW 803管柱之Agilent 1200 HPLC系統，在如先前所述之條件(Kolarich等人,Transfusion 2006;46:1959-77)下以分析法特性化結合物。顯示製劑不含有自由EPO。
方法2：
將EPO轉移至或溶解於反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25 mg/ml之最終蛋白質濃度。接著藉由逐滴添加0.5 N HCl水溶液將溶液之pH值校正至6.0。隨後在10分鐘內添加40 mM過碘酸鈉水溶液，得到200 μM之濃度。在T=+22+/-2℃之溫度(T)下進行氧化反應30+/-5分鐘。接著藉由在T=+22+/-2℃下在15分鐘內添加L-半胱胺酸水溶液(1 M)來中止反應，得到在反應混合物中10 mM之最終濃度並培育60+/-5分鐘。
藉由離子交換層析進一步純化經氧化EPO。收集洗提液中含有經氧化EPO的洗提份且用於結合反應。
在最多15分鐘之時段(t)內在輕輕攪拌下將50倍莫耳過量之胺氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)試劑添加至含有經純化之經氧化EPO之洗提液中。接著在15分鐘內添加間甲苯胺水溶液(50 mM)，得到10 mM之最終濃度。在T=+22+/-2℃之溫度(T)下在黑暗中在輕輕震盪下培育反應混合物120+/-10分鐘(蛋白質濃度：1 mg/ml)。
藉由離子交換層析進一步純化所得PSA-EPO結合物。收集含有PSA-EPO結合物之洗提份並藉由超濾/透濾(UF/DF)使用由再生纖維素製成且具有適當分子量截止之膜(Millipore)濃縮。
藉由量測總蛋白質、生物活性及藉由量測PSA含量(間苯二酚檢定)測定聚唾液酸化程度以分析法特性化使用此程序所製備之結合物。
方法3：
將紅血球生成素(EPO)轉移至反應緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的胺氧基-PSA試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(10 mM最終濃度)及NaIO4(最終濃度：400 μM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。隨後在室溫下用半胱胺酸中止反應，持續60分鐘(半胱胺酸濃度：10 mM)。接著藉由添加含有乙酸銨之緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣、8 M乙酸銨，pH 6.9)調整反應混合物之傳導率且加載於經50 mM Hepes、2.5 M乙酸銨、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣、0.01% Tween 80(pH 6.9)預平衡且填充有苯基瓊脂糖FF之管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。隨後用50 mM Hepes、5 mM氯化鈣(pH 7.5)洗提結合物。最後收集含有PSA-EPO之洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之膜(MWCO 10 kD，88 cm2，Millipore)進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法3。將10 mg EPO溶解於8 ml組胺酸緩衝液(pH 6.0)(20 mM L-組胺酸、150 mM NaCl)中。接著添加200 μl過碘酸鈉水溶液(5 mM)及2 ml間甲苯胺水溶液(50 mM)。隨後添加MW為20 kD之胺氧基-PSA試劑(上述)，產生5倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且在室溫下藉由添加100 μl 1 M半胱胺酸水溶液來中止，持續15分鐘。
藉助於陰離子交換層析(AEC)移除自由EPO。用20 ml緩衝液A(50 mM Hepes，pH 7.5)稀釋反應混合物且加載於經緩衝液A預平衡之20 ml HiPrep QFF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。接著用緩衝液B(50 mM Hepes、1 M NaCl，pH 7.5)洗提管柱。藉由用25%緩衝液B洗滌管柱來洗提自由EPO且用50%緩衝液B洗提結合物。含有結合物之洗提份的傳導率隨後使用緩衝液C(50 mM Hepes、5 M NaCl，pH 6.9)升至約190 mS/cm且加載於經緩衝液D(50 mM Hepes、3 M NaCl，pH 6.9)預平衡之20 ml HiPrep丁基FF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。用5 CV緩衝液D洗滌出自由PSA試劑。隨後，用100%緩衝液E(50 mM Hepes，pH 7.4)洗提結合物。藉由UF/DF，使用由再生纖維素製成之10 kD膜(88 cm2，截止10 kD，Millipore)濃縮含有結合物之洗提份。針對含有150 mM NaCl之組胺酸緩衝液(pH 7.2)進行最後透濾步驟。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。對於PSA-EPO結合物，與天然EPO相比，測得比活性>50%。另外藉由尺寸排阻HPLC，使用裝備有Shodex KW 803管柱之Agilent 1200 HPLC系統，在如先前所述之條件(Kolarich等人,Transfusion 2006;46:1959-77)下以分析法特性化結合物。顯示製劑不含有自由EPO。
方法4：
將EPO溶解於或轉移至反應緩衝液(例如50 mMHepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25 mg/ml之最終蛋白質濃度。接著藉由逐滴添加0.5 N HCl水溶液將溶液之pH值校正至6.0。
隨後，在最多15分鐘之時段(t)內在輕輕攪拌下將50倍莫耳過量之胺氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)試劑添加至此EPO溶液中。接著在15分鐘內添加間甲苯胺水溶液(50 mM)，得到10 mM之最終濃度。最後，添加40 mM過碘酸鈉水溶液，得到400 μM之濃度。
在T=+22 +/- 2℃之溫度(T)下在黑暗中在輕輕震盪下培育反應混合物120 +/- 10分鐘。接著藉由添加L-半胱胺酸水溶液(1 M)來中止反應，得到在反應混合物中10 mM之最終濃度並培育60 +/- 5分鐘。
藉由離子交換層析純化所得PSA-EPO結合物。收集洗提液中含有PSA-EPO的洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之膜(MWCO 10 kD，88 cm2，Millipore)進行超濾/透濾(UF/DF)來濃縮。
藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質、生物活性及藉由量測PSA含量(間苯二酚檢定)測定聚唾液酸化程度以分析法特性化使用此程序所製備之結合物。
實施例19 使用胺氧基-PSA及作為親核性催化劑之間甲苯胺使Ang-2聚唾液酸化 方法1：
將起始濃度之促血管生成素-2(Ang-2)轉移至反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。向此溶液中添加NaIO4，得到200 μM之最終濃度。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行氧化反應30分鐘。接著在室溫下用半胱胺酸(最終濃度：10 mM)中止反應，持續60分鐘。
接著使用Vivaspin離心過濾器使溶液進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物，或在替代性情況下通過經緩衝液A(20 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7.0)平衡且體積為20 ml之IEX管柱(Merck EMD TMAE(M))。用5 CV緩衝液A平衡管柱。用緩衝液B(20 mM Hepes、5 mM CaCl2、1 M NaCl，pH 7.0)洗提經氧化Ang-2。收集含有Ang-2之洗提份。測定蛋白質含量(庫馬斯法、布萊德法)且用反應緩衝液調整至1 mg/ml並藉由逐滴添加0.5 M HCl調整至pH 6.0。
添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的胺氧基-PSA試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(最終濃度：10 mM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。藉助於HIC移除過量胺氧基試劑。藉由添加含有乙酸銨之緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣、8 M乙酸銨，pH 6.9)調整反應混合物之傳導率且加載於經50 mM Hepes、2.5 M乙酸銨、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣(pH 6.9)預平衡且填充有80 ml苯基瓊脂糖FF之管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。隨後用含有5 mM CaCl2之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.5)洗提結合物。最後收集含有PSA-Ang-2之洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法1。將促血管生成素-2(Ang-2)轉移至反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。向此溶液中添加NaIO4，得到200 μM之最終濃度。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行氧化反應30分鐘。接著在室溫下用半胱胺酸(最終濃度：10 mM)中止反應，持續60分鐘。
接著使用Vivaspih離心過濾器使溶液進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物。
添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的胺氧基-PSA試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(最終濃度：10 mM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。藉助於離子交換層析移除過量胺氧基試劑。收集洗提液中含有PSA-Ang-2結合物的洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
方法2：
將Ang-2轉移至或溶解於反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25 mg/ml之最終蛋白質濃度。接著藉由逐滴添加0.5 N HCl水溶液將溶液之pH值校正至6.0。隨後在10分鐘內添加40 mM過碘酸鈉水溶液，得到200 μM之濃度。在T=+22+/-2℃之溫度(T)下進行氧化反應30+/-5分鐘。接著藉由在T=+22+/-2℃下在15分鐘內添加L-半胱胺酸水溶液(1 M)來中止反應，得到在反應混合物中10 mM之最終濃度並培育60+/-5分鐘。
藉由離子交換層析進一步純化經氧化Ang-2。收集洗提液中含有經氧化Ang-2的洗提份且用於結合反應。
在最多15分鐘之時段(t)內在輕輕攪拌下將50倍莫耳過量之胺氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)試劑添加至含有經純化之經氧化Ang-2之洗提液中。接著在15分鐘內添加間甲苯胺水溶液(50 mM)，得到10 mM之最終濃度。在T=+22+/-2℃之溫度(T)下在黑暗中在輕輕震盪下培育反應混合物120+/-10分鐘(蛋白質濃度：1 mg/ml)。
藉由離子交換層析進一步純化所得PSA-Ang-2結合物。
收集含有PSA-Ang-2結合物之洗提份並藉由超濾/透濾(UF/DF)使用由再生纖維素製成且具有適當分子量截止之膜(Millipore)濃縮。
藉由量測總蛋白質、生物活性及藉由量測PSA含量(間苯二酚檢定)測定聚唾液酸化程度以分析法特性化使用此程序所製備之結合物。
方法3：
將促血管生成素-2(Ang-2)轉移至反應緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的PSA胺氧基試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(10 mM最終濃度)及NaIO4(最終濃度：400 μM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。隨後在室溫下用半胱胺酸中止反應，持續60分鐘(半胱胺酸濃度：10 mM)。接著藉由添加含有乙酸銨之緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣、8 M乙酸銨，pH 6.9)調整反應混合物之傳導率且加載於經50 mM Hepes、2.5 M乙酸銨、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣、0.01% Tween 80(pH 6.9)預平衡且填充有苯基瓊脂糖FF之管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。隨後用50 mM Hepes、5 mM氯化鈣(pH 7.5)洗提結合物。最後收集含有PSA Ang-2之洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法3。將促血管生成素-2(Ang-2)轉移至反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的PSA胺氧基試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(10 mM最終濃度)及NaIO4(最終濃度：400 μM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。隨後，在室溫下用半胱胺酸中止反應，持續60分鐘(半胱胺酸濃度：10 mM)且藉由離子交換層析純化結合物。收集洗提液中含有PSA Ang-2的洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
方法4：
將Ang-2溶解於或轉移至反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25 mg/ml之最終蛋白質濃度。接著藉由逐滴添加0.5 N HCl水溶液將溶液之pH值校正至6.0。
隨後，在最多15分鐘之時段(t)內在輕輕攪拌下將50倍莫耳過量之胺氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)試劑添加至此Ang-2溶液中。接著在15分鐘內添加間甲苯胺水溶液(50 mM)，得到10 mM之最終濃度。最後，添加40 mM過碘酸鈉水溶液，得到400 μM之濃度。
在T=+22+/-2℃之溫度(T)下在黑暗中在輕輕震盪下培育反應混合物120+/-10分鐘。接著藉由添加L-半胱胺酸水溶液(1 M)來中止反應，得到在反應混合物中10 mM之最終濃度並培育60+/-5分鐘。
藉由離子交換層析純化所得PSA-Ang-2結合物。收集洗提液中含有PSA-Ang-2的洗提份且藉由超濾/透濾(UF/DF)使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)濃縮。
藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質、生物活性及藉由量測PSA含量(間苯二酚檢定)測定聚唾液酸化程度以分析法特性化使用此程序所製備之結合物。
實施例20 使用胺氧基-PSA及作為親核性催化劑之間甲苯胺使VEGF聚唾液酸化 方法1：
將起始濃度之血管內皮生長因子(VEGF)轉移至反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。向此溶液中添加NaIO4，得到200 μM之最終濃度。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行氧化反應30分鐘。接著在室溫下用半胱胺酸(最終濃度：10 mM)中止反應，持續60分鐘。
接著使用Vivaspin離心過濾器使溶液進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物，或在替代性情況下通過經緩衝液A(20 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7.0)平衡且體積為20 ml之IEX管柱(Merck EMD TMAE(M))。用5 CV緩衝液A平衡管柱。用緩衝液B(20 mM Hepes、5 mM CaCl2、1 M NaCl，pH 7.0)洗提經氧化VEGF。收集含有VEGF之洗提份。測定蛋白質含量(庫馬斯法、布萊德法)且用反應緩衝液調整至1 mg/ml並藉由逐滴添加0.5 MNaOH調整至pH 6.0。
添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的胺氧基-PSA試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(最終濃度：10 mM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。藉助於HIC移除過量胺氧基試劑。藉由添加含有乙酸銨之緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣、8 M乙酸銨，pH 6.9)調整反應混合物之傳導率且加載於經50 mM Hepes、2.5 M乙酸銨、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣(pH 6.9)預平衡且填充有80 ml苯基瓊脂糖FF之管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。隨後用含有5 mM CaCl2之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.5)洗提結合物。最後收集含有PSA-VEGF之洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法1。將血管內皮生長因子(VEGF)轉移至反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。向此溶液中添加NaIO4，得到200 μM之最終濃度。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行氧化反應30分鐘。接著在室溫下用半胱胺酸(最終濃度：10 mM)中止反應，持續60分鐘。
接著使用Vivaspin離心過濾器使溶液進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物。
添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的胺氧基-PSA試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(最終濃度：10 mM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。藉助於離子交換層析移除過量胺氧基試劑。收集洗提液中含有PSA-VEGF的洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
方法2：
將VEGF轉移至或溶解於反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25 mg/ml之最終蛋白質濃度。接著藉由逐滴添加0.5 N HCl水溶液將溶液之pH值校正至6.0。隨後在10分鐘內添加40 mM過碘酸鈉水溶液，得到200 μM之濃度。在T=+22+/-2℃之溫度(T)下進行氧化反應30+/-5分鐘。接著藉由在T=+22+/-2℃下在15分鐘內添加L-半胱胺酸水溶液(1 M)來中止反應，得到在反應混合物中10 mM之最終濃度並培育60+/-5分鐘。
藉由離子交換層析進一步純化氧化VEGF。收集洗提液中含有經氧化VEGF的洗提份且用於結合反應。
在最多15分鐘之時段(t)內在輕輕攪拌下將50倍莫耳過量之胺氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)試劑添加至含有經純化之經氧化VEGF之洗提液中。接著在15分鐘內添加間甲苯胺水溶液(50 mM)，得到10 mM之最終濃度。在T=+22+/-2℃之溫度(T)下在黑暗中在輕輕震盪下培育反應混合物120+/-10分鐘(蛋白質濃度：1 mg/ml)。
藉由離子交換層析進一步純化所得PSA-VEGF結合物。收集含有PSA-VEGF結合物之洗提份並藉由超濾/透濾(UF/DF)使用由再生纖維素製成且具有適當分子量截止之膜(Millipore)濃縮。
藉由量測總蛋白質、生物活性及藉由量測PSA含量(間苯二酚檢定)測定聚唾液酸化程度以分析法特性化使用此程序所製備之結合物。
方法3：
將血管內皮生長因子(VEGF)轉移至反應緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的PSA胺氧基試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(10 mM最終濃度)及NaIO4(最終濃度：400 μM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。隨後在室溫下用半胱胺酸中止反應，持續60分鐘(半胱胺酸濃度：10 mM)。接著藉由添加含有乙酸銨之緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣、8 M乙酸銨，pH 6.9)調整反應混合物之傳導率且加載於經50 mM Hepes、2.5 M乙酸銨、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣、0.01% Tween 80(pH 6.9)預平衡且填充有苯基瓊脂糖FF之管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。隨後用50 mM Hepes、5 mM氯化鈣(pH 7.5)洗提結合物。最後收集含有PSA-VEGF之洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法3。將血管內皮生長因子(VEGF)轉移至反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的胺氧基-PSA試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(10 mM最終濃度)及NaIO4(最終濃度：400 μM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。隨後，在室溫下用半胱胺酸中止反應，持續60分鐘(半胱胺酸濃度：10 mM)且藉由離子交換層析純化結合物。收集洗提液中含有PSA-VEGF的洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
方法4：
將VEGF溶解於或轉移至反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到1.0 +/- 0.25 mg/ml之最終蛋白質濃度。接著藉由逐滴添加0.5 N HCl水溶液將溶液之pH值校正至6.0。
隨後，在最多15分鐘之時段(t)內在輕輕攪拌下將50倍莫耳過量之胺氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)試劑添加至此VEGF溶液中。接著在15分鐘內添加間甲苯胺水溶液(50 mM)，得到10 mM之最終濃度。最後，添加40 mM過碘酸鈉水溶液，得到400 μM之濃度。
在T=+22+/-2℃之溫度(T)下在黑暗中在輕輕震盪下培育反應混合物120+/-10分鐘。接著藉由添加L-半胱胺酸水溶液(1M)來中止反應，得到在反應混合物中10 mM之最終濃度並培育60+/-5分鐘。
藉由離子交換層析純化所得VEGF-結合物。收集洗提液中含有PSA-VEGF的洗提份且藉由超濾/透濾(UF/DF)使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)濃縮。
藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質、生物活性及藉由量測PSA含量(間苯二酚檢定)測定聚唾液酸化程度以分析法特性化使用此程序所製備之結合物。
實施例21 使用胺氧基-PSA及作為親核性催化劑之間甲苯胺使EGF聚唾液酸化 方法1：
將起始濃度之表皮生長因子(EGF)轉移至反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。向此溶液中添加NaIO4，得到200 μM之最終濃度。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行氧化反應30分鐘。接著在室溫下用半胱胺酸(最終濃度：10 mM)中止反應，持續60分鐘。
接著使用Vivaspin離心過濾器使溶液進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物，或在替代性情況下通過經緩衝液A(20 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7.0)平衡且體積為20 ml之IEX管柱(Merck EMD TMAE(M))。用5 CV緩衝液A平衡管柱。用緩衝液B(20 mM Hepes、5 mM CaCl2、1 M NaCl，pH 7.0)洗提經氧化EGF。收集含有EGF之洗提份。測定蛋白質含量(庫馬斯法、布萊德法)且用反應緩衝液調整至1 mg/ml並藉由逐滴添加0.5 M HCl調整至pH 6.0。
添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的胺氧基-PSA試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(最終濃度：10 mM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。藉助於HIC移除過量胺氧基試劑。藉由添加含有乙酸銨之緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣、8 M乙酸銨，pH 6.9)調整反應混合物之傳導率且加載於經50 mM Hepes、2.5 M乙酸銨、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣(pH 6.9)預平衡且填充有80 ml苯基瓊脂糖FF之管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。隨後用含有5 mM CaCl2之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.5)洗提結合物。最後收集含有PSA-EGF之洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法1。將表皮生長因子(EGF)轉移至反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。向此溶液中添加NaIO4，得到200 μM之最終濃度。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行氧化30分鐘。接著在室溫下用半胱胺酸(最終濃度：10 mM)中止反應，持續60分鐘。
接著使用Vivaspin離心過濾器使溶液進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物。
添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的胺氧基-PSA試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(最終濃度：10 mM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。藉助於離子交換層析移除過量胺氧基試劑。收集洗提液中含有PSA-EGF的洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
方法2：
將EGF轉移至或溶解於反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到1.0 +/- 0.25 mg/ml之最終蛋白質濃度。接著藉由逐滴添加0.5 N HCl水溶液將溶液之pH值校正至6.0。隨後在10分鐘內添加40 mM過碘酸鈉水溶液，得到200 μM之濃度。在T=+22 +/- 2℃之溫度(T)下進行氧化反應30 +/- 5分鐘。接著藉由在T=+22 +/- 2℃下在15分鐘內添加L-半胱胺酸水溶液(1 M)來中止反應，得到在反應混合物中10 mM之最終濃度並培育60 +/- 5分鐘。
藉由離子交換層析進一步純化經氧化EGF。收集洗提液中含有經氧化EGF的洗提份且用於結合反應。
在最多15分鐘之時段(t)內在輕輕攪拌下將50倍莫耳過量之胺氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)試劑添加至含有經純化之經氧化EGF之洗提液中。接著在15分鐘內添加間甲苯胺水溶液(50 mM)，得到10 mM之最終濃度。在T=+22 +/- 2℃之溫度(T)下在黑暗中在輕輕震盪下培育反應混合物120 +/- 10分鐘(蛋白質濃度：1 mg/ml)。
藉由離子交換層析進一步純化所得PSA-EGF結合物。收集含有PSA-EGF結合物之洗提份並藉由超濾/透濾(UF/DF)使用由再生纖維素製成且具有適當分子量截止之膜(Millipore)濃縮。
藉由量測總蛋白質、生物活性及藉由量測PSA含量(間苯二酚檢定)測定聚唾液酸化程度以分析法特性化使用此程序所製備之結合物。
方法3：
將表皮生長因子(EGF)轉移至反應緩衝液(50 mMHepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的PSA胺氧基試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(10 mM最終濃度)及NaIO4(最終濃度：400 μM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。隨後在室溫下用半胱胺酸中止反應，持續60分鐘(半胱胺酸濃度：10 mM)。接著藉由添加含有乙酸銨之緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣、8 M乙酸銨，pH 6.9)調整反應混合物之傳導率且加載於經50 mM Hepes、2.5 M乙酸銨、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣、0.01% Tween 80(pH 6.9)預平衡且填充有苯基瓊脂糖FF之管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。隨後用50 mM Hepes、5 mM氯化鈣(pH 7.5)洗提結合物。最後收集含有PSA-EGF之洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法3。將表皮生長因子(EGF)轉移至反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的PSA胺氧基試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(10 mM最終濃度)及NaIO4(最終濃度：400 μM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。隨後，在室溫下用半胱胺酸中止反應，持續60分鐘(半胱胺酸濃度：10 mM)且藉由離子交換層析純化結合物。收集洗提液中含有結合物的洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
方法4：
將EGF溶解於或轉移至反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25 mg/ml之最終蛋白質濃度。接著藉由逐滴添加0.5 N HCl水溶液將溶液之pH值校正至6.0。
隨後，在最多15分鐘之時段(t)內在輕輕攪拌下將50倍莫耳過量之胺氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)試劑添加至此EGF溶液中。接著在15分鐘內添加間甲苯胺水溶液(50 mM)，得到10 mM之最終濃度。最後，添加40 mM過碘酸鈉水溶液，得到400 μM之濃度。
在T=+22+/-2℃之溫度(T)下在黑暗中在輕輕震盪下培育反應混合物120+/-10分鐘。接著藉由添加L-半胱胺酸水溶液(1 M)來中止反應，得到在反應混合物中10 mM之最終濃度並培育60+/-5分鐘。
藉由離子交換層析純化所得EGF-結合物。收集洗提液中含有PSA-EGF的洗提份且藉由超濾/透濾(UF/DF)使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)濃縮。
藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質、生物活性及藉由量測PSA含量(間苯二酚檢定)測定聚唾液酸化程度以分析法特性化使用此程序所製備之結合物。
實施例22 使用胺氧基-PSA及作為親核性催化劑之間甲苯胺使NGF聚唾液酸化 方法1：
將起始濃度之神經生長因子(NGF)轉移至反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。向此溶液中添加NaIO4，得到200 μM之最終濃度。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行氧化30分鐘。接著在室溫下用半胱胺酸(最終濃度：10 mM)中止反應，持續60分鐘。
接著使用Vivaspin離心過濾器使溶液進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物，或在替代性情況下通過經緩衝液A(20 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7.0)平衡且體積為20 ml之IEX管柱(Merck EMD TMAE(M))。用5 CV緩衝液A平衡管柱。用緩衝液B(20 mM Hepes、5 mM CaCl2、1 M NaCl，pH 7.0)洗提經氧化NGF。收集含有NGF之洗提份。測定蛋白質含量(庫馬斯法、布萊德法)且用反應緩衝液調整至1 mg/ml並藉由逐滴添加0.5 M HCl調整至pH 6.0。
添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的胺氧基-PSA試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(最終濃度：10 mM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。藉助於HIC移除過量胺氧基試劑。藉由添加含有乙酸銨之緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣、8 M乙酸銨，pH 6.9)調整反應混合物之傳導率且加載於經50 mM Hepes、2.5 M乙酸銨、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣(pH 6.9)預平衡且填充有80 ml苯基瓊脂糖FF之管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。隨後用含有5 mM CaCl2之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.5)洗提結合物。最後收集含有PSA-NGF之洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法1。將神經生長因子(NGF)轉移至反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。向此溶液中添加NaIO4，得到200 μM之最終濃度。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行氧化反應30分鐘。接著在室溫下用半胱胺酸(最終濃度：10 mM)中止反應，持續60分鐘。
接著使用Vivaspin離心過濾器使溶液進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物。
添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的胺氧基-PSA試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(最終濃度：10 mM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。藉助於離子交換層析移除過量胺氧基試劑。收集洗提液中含有PSA-NGF的洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
方法2：
將NGF轉移至或溶解於反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到1.0 +/- 0.25 mg/ml之最終蛋白質濃度。接著藉由逐滴添加0.5 N HCl水溶液將溶液之pH值校正至6.0。隨後在10分鐘內添加40 mM過碘酸鈉水溶液，得到200 μM之濃度。在T=+22 +/- 2℃之溫度(T)下進行氧化反應30 +/- 5分鐘。接著藉由在T=+22 +/- 2℃下在15分鐘內添加L-半胱胺酸水溶液(1 M)來中止反應，得到在反應混合物中10 mM之最終濃度並培育60 +/- 5分鐘。
藉由離子交換層析進一步純化經氧化NGF。收集洗提液中含有經氧化NGF的洗提份且用於結合反應。
在最多15分鐘之時段(t)內在輕輕攪拌下將50倍莫耳過量之胺氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)試劑添加至含有經純化之經氧化NGF之洗提液中。接著在15分鐘內添加間甲苯胺水溶液(50 mM)，得到10 mM之最終濃度。在T=+22 +/- 2℃之溫度(T)下在黑暗中在輕輕震盪下培育反應混合物120 +/- 10分鐘(蛋白質濃度：1 mg/ml)。
藉由離子交換層析進一步純化所得PSA-NGF結合物。收集含有PSA-NGF結合物之洗提份並藉由超濾/透濾(UF/DF)使用由再生纖維素製成且具有適當分子量截止之膜(Millipore)濃縮。
藉由量測總蛋白質、生物活性及藉由量測PSA含量(間苯二酚檢定)測定聚唾液酸化程度以分析法特性化使用此程序所製備之結合物。
方法3：
將神經生長因子(NGF)轉移至反應緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的胺氧基-PSA試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(10 mM最終濃度)及NaIO4(最終濃度：400 μM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。隨後在室溫下用半胱胺酸中止反應，持續60分鐘(半胱胺酸濃度：10 mM)。接著藉由添加含有乙酸銨之緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣、8 M乙酸銨，pH 6.9)調整反應混合物之傳導率且加載於經50 mM Hepes、2.5 M乙酸銨、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣、0.01% Tween 80(pH 6.9)預平衡且填充有苯基瓊脂糖FF之管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。隨後用50 mM Hepes、5 mM氯化鈣(pH 7.5)洗提結合物。最後收集含有PSA-NGF之洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法3。將神經生長因子(NGF)轉移至反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的胺氧基-PSA試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(10 mM最終濃度)及NaIO4(最終濃度：400 μM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。隨後，在室溫下用半胱胺酸中止反應，持續60分鐘(半胱胺酸濃度：10 mM)且藉由離子交換層析純化結合物。接著收集洗提液中含有PSA-NGF的洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
方法4：
將NGF溶解於或轉移至反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25 mg/ml之最終蛋白質濃度。接著藉由逐滴添加0.5 N HCl水溶液將溶液之pH值校正至6.0。
隨後，在最多15分鐘之時段(t)內在輕輕攪拌下將50倍莫耳過量之胺氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)試劑添加至此NGF溶液中。接著在15分鐘內添加間甲苯胺水溶液(50mM)，得到10 mM之最終濃度。最後，添加40 mM過碘酸鈉水溶液，得到400 μM之濃度。
在T=+22+/-2℃之溫度(T)下在黑暗中在輕輕震盪下培育反應混合物120+/-10分鐘。接著藉由添加L-半胱胺酸水溶液(1 M)來中止反應，得到在反應混合物中10 mM之最終濃度並培育60+/-5分鐘。
藉由離子交換層析純化所得NGF-結合物。收集洗提液中含有PSA-NGF的洗提份且藉由超濾/透濾(UF/DF)使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)濃縮。
藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質、生物活性及藉由量測PSA含量(間苯二酚檢定)測定聚唾液酸化程度以分析法特性化使用此程序所製備之結合物。
實施例23 使用胺氧基-PSA及作為親核性催化劑之間甲苯胺使HGH聚唾液酸化 方法1：
如本文所述，人類生長激素(HGH)之胺基酸序列首先經修飾為併有至少一個糖基化部位。純化後，根據此項技術中已知之方法試管內使HGH糖基化。
將起始濃度之人類生長激素(HGH)轉移至反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。向此溶液中添加NaIO4，得到200 μM之最終濃度。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行氧化反應30分鐘。接著在室溫下用半胱胺酸(最終濃度：10 mM)中止反應，持續60分鐘。
接著使用Vivaspin離心過濾器使溶液進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物，或在替代性情況下通過經緩衝液A(20 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7.0)平衡且體積為20 ml之IEX管柱(Merck EMD TMAE(M))。用5 CV緩衝液A平衡管柱。用緩衝液B(20 mM Hepes、5 mM CaCl2、1 M NaCl，pH 7.0)洗提經氧化HGH。收集含有HGH之洗提份。測定蛋白質含量(庫馬斯法、布萊德法)且用反應緩衝液調整至1 mg/ml並藉由逐滴添加0.5 M HCl調整至pH 6.0。
添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的胺氧基-PSA試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(最終濃度：10 mM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。藉助於HIC移除過量胺氧基試劑。藉由添加含有乙酸銨之緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣、8 M乙酸銨，pH 6.9)調整反應混合物之傳導率且加載於經50 mM Hepes、2.5 M乙酸銨、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣(pH 6.9)預平衡且填充有80 ml苯基瓊脂糖FF之管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。隨後用含有5 mM CaCl2之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.5)洗提結合物。最後收集含有PSA-HGH之洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法1。如本文所述，人類生長激素(HGH)之胺基酸序列首先經修飾為併有至少一個糖基化部位。純化後，根據此項技術中已知之方法試管內使HGH糖基化。將HGH轉移至反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。向此溶液中添加NaIO4，得到200 μM之最終濃度。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行氧化反應30分鐘。接著在室溫下用半胱胺酸(最終濃度：10 mM)中止反應，持續60分鐘。
接著使用Vivaspin離心過濾器使溶液進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物。
添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的胺氧基-PSA試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(最終濃度：10 mM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。藉助於離子交換層析移除過量胺氧基試劑。收集洗提液中含有PSA-HGH的洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
方法2：
如本文所述，人類生長激素(HGH)之胺基酸序列首先經修飾為併有至少一個糖基化部位。純化後，根據此項技術中已知之方法試管內使HGH糖基化。
將HGH轉移至或溶解於反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25 mg/ml之最終蛋白質濃度。接著藉由逐滴添加0.5 N HCl水溶液將溶液之pH值校正至6.0。隨後在10分鐘內添加40 mM過碘酸鈉水溶液，得到200 μM之濃度。在T=+22+/-2℃之溫度(T)下進行氧化反應30+/-5分鐘。接著藉由在T=+22+/-2℃下在15分鐘內添加L-半胱胺酸水溶液(1 M)來中止反應，得到在反應混合物中10 mM之最終濃度並培育60+/-5分鐘。
藉由離子交換層析進一步純化經氧化HGH。收集洗提液中含有經氧化HGH的洗提份且用於結合反應。
在最多15分鐘之時段(t)內在輕輕攪拌下將50倍莫耳過量之胺氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)試劑添加至含有經純化之經氧化HGH之洗提液中。接著在15分鐘內添加間甲苯胺水溶液(50 mM)，得到10 mM之最終濃度。在T=+22+/-2℃之溫度(T)下在黑暗中在輕輕震盪下培育反應混合物120+/-10分鐘(蛋白質濃度：1 mg/ml)。
藉由離子交換層析進一步純化所得PSA-HGH結合物。收集含有PSA-HGH結合物之洗提份並藉由超濾/透濾(UF/DF)使用由再生纖維素製成且具有適當分子量截止之膜(Millipore)濃縮。
藉由量測總蛋白質、生物活性及藉由量測PSA含量(間苯二酚檢定)測定聚唾液酸化程度以分析法特性化使用此程序所製備之結合物。
方法3：
如本文所述，人類生長激素(HGH)之胺基酸序列首先經修飾為併有至少一個糖基化部位。純化後，根據此項技術中已知之方法試管內使HGH糖基化。
將人類生長激素(HGH)轉移至反應緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的胺氧基-PSA試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(10 mM最終濃度)及NaIO4(最終濃度：400 μM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。隨後在室溫下用半胱胺酸中止反應，持續60分鐘(半胱胺酸濃度：10 mM)。接著藉由添加含有乙酸銨之緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣、8 M乙酸銨，pH 6.9)調整反應混合物之傳導率且加載於經50 mM Hepes、2.5 M乙酸銨、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣、0.01% Tween 80(pH 6.9)預平衡且填充有苯基瓊脂糖FF之管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。隨後用50 mM Hepes、5 mM氯化鈣(pH 7.5)洗提結合物。最後收集含有PSA HGH之洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法3。如本文所述，人類生長激素(HGH)之胺基酸序列首先經修飾為併有至少一個糖基化部位。純化後，根據此項技術中已知之方法試管內使HGH糖基化。將HGH轉移至反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的胺氧基-PSA試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(10 mM最終濃度)及NaIO4(最終濃度：400 μM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。隨後，在室溫下用半胱胺酸中止反應，持續60分鐘(半胱胺酸濃度：10 mM)且藉由離子交換層析純化結合物。接著收集洗提液中含有PSA-HGH的洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
方法4：
如本文所述，人類生長激素(HGH)之胺基酸序列首先經修飾為併有至少一個糖基化部位。純化後，根據此項技術中已知之方法試管內使HGH糖基化。
將HGH溶解於或轉移至反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到1.0 +/- 0.25 mg/ml之最終蛋白質濃度。接著藉由逐滴添加0.5 N HCl水溶液將溶液之pH值校正至6.0。
隨後，在最多15分鐘之時段(t)內在輕輕攪拌下將50倍莫耳過量之胺氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)試劑添加至此HGH溶液中。接著在15分鐘內添加間甲苯胺水溶液(50 mM)，得到10 mM之最終濃度。最後，添加40 mM過碘酸鈉水溶液，得到400 μM之濃度。
在T=+22 +/- 2℃之溫度(T)下在黑暗中在輕輕震盪下培育反應混合物120 +/- 10分鐘。接著藉由添加L-半胱胺酸水溶液(1 M)來中止反應，得到在反應混合物中10 mM之最終濃度並培育60 +/- 5分鐘。
藉由離子交換層析純化所得HGH-結合物。收集洗提液中含有PSA-HGH的洗提份且藉由超濾/透濾(UF/DF)使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)濃縮。
藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質、生物活性及藉由量測PSA含量(間苯二酚檢定)測定聚唾液酸化程度以分析法特性化使用此程序所製備之結合物。
實施例24 使用胺氧基-PSA及作為親核性催化劑之間甲苯胺使TNF-α聚唾液酸化
將起始濃度之腫瘤壞死因子-α(TNF-α)轉移至反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。向此溶液中添加NaIO4，得到200 μM之最終濃度。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行氧化反應30分鐘。接著在室溫下用半胱胺酸(最終濃度：10 mM)中止反應，持續60分鐘。
接著使用Vivaspin離心過濾器使溶液進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物，或在替代性情況下通過經緩衝液A(20 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7.0)平衡且體積為20 ml之IEX管柱(Merck EMD TMAE(M))。用5 CV緩衝液A平衡管柱。用緩衝液B(20 mM Hepes、5 mM CaCl2、1 M NaCl，pH 7.0)洗提經氧化TNF-α。收集含有TNF-α之洗提份。測定蛋白質含量(庫馬斯法、布萊德法)且用反應緩衝液調整至1 mg/ml並藉由逐滴添加0.5 M HCl調整至pH 6.0。
添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的胺氧基-PSA試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(最終濃度：10 mM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。藉助於HIC移除過量胺氧基試劑。藉由添加含有乙酸銨之緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣、8 M乙酸銨，pH 6.9)調整反應混合物之傳導率且加載於經50 mM Hepes、2.5 M乙酸銨、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣(pH 6.9)預平衡且填充有80 ml苯基瓊脂糖FF之管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。隨後用含有5 mM CaCl2之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.5)洗提結合物。最後收集含有PSA-TNF-α之洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法1。將腫瘤壞死因子-α(TNF-α)轉移至反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。向此溶液中添加NaIO4，得到200 μM之最終濃度。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行氧化反應30分鐘。接著在室溫下用半胱胺酸(最終濃度：10 mM)中止反應，持續60分鐘。
接著使用Vivaspin離心過濾器使溶液進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物。添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的胺氧基-PSA試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(最終濃度：10 mM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。藉助於離子交換層析移除過量胺氧基試劑。收集洗提液中含有PSA-TNF-α的洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
方法2：
將TNF-α轉移至或溶解於反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25 mg/ml之最終蛋白質濃度。接著藉由逐滴添加0.5 N HCl水溶液將溶液之pH值校正至6.0。隨後在10分鐘內添加40 mM過碘酸鈉水溶液，得到200 μM之濃度。在T=+22+/-2℃之溫度(T)下進行氧化反應30+/-5分鐘。接著藉由在T=+22+/-2℃下在15分鐘內添加L-半胱胺酸水溶液(1 M)來中止反應，得到在反應混合物中10 mM之最終濃度並培育60+1-5分鐘。
藉由離子交換層析進一步純化經氧化TNF-α。收集洗提液中含有經氧化TNF-α的洗提份且用於結合反應。
在最多/5分鐘之時段(t)內在輕輕攪拌下將50倍莫耳過量之胺氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)試劑添加至含有經純化之經氧化TNF-α之洗提液中。接著在15分鐘內添加間甲苯胺水溶液(50 mM)，得到10 mM之最終濃度。在T=+22+/-2℃之溫度(T)下在黑暗中在輕輕震盪下培育反應混合物120+/-10分鐘(蛋白質濃度：1 mg/ml)。
藉由離子交換層析進一步純化所得PSA-TNF-α結合物。收集含有PSA-TNF-α結合物之洗提份並藉由超濾/透濾(UF/DF)使用由再生纖維素製成且具有適當分子量截止之膜(Millipore)濃縮。
藉由量測總蛋白質、生物活性及藉由量測PSA含量(間苯二酚檢定)測定聚唾液酸化程度以分析法特性化使用此程序所製備之結合物。
方法3：
將腫瘤壞死因子-α(TNF-α)轉移至反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的胺氧基-PSA試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(10 mM最終濃度)及NaIO4(最終濃度：400 μM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。隨後在室溫下用半胱胺酸中止反應，持續60分鐘(半胱胺酸濃度：10 mM)。接著藉由添加含有乙酸銨之緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣、8 M乙酸銨，pH 6.9)調整反應混合物之傳導率且加載於經50 mM Hepes、2.5 M乙酸銨、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣、0.01% Tween 80(pH 6.9)預平衡且填充有苯基瓊脂糖FF之管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。隨後用50 mM Hepes、5 mM氯化鈣(pH 7.5)洗提結合物。最後收集含有PSA-TNF-α之洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法3。將腫瘤壞死因子-α(TNF-α)轉移至反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的胺氧基-PSA試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(10 mM最終濃度)及NaIO4(最終濃度：400 μM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。隨後，在室溫下用半胱胺酸中止反應，持續60分鐘(半胱胺酸濃度：10 mM)且藉由離子交換層析純化結合物。收集洗提液中含有PSA-TNF-α的洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
方法4：
將TNF-α溶解於或轉移至反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到1.0 +/- 0.25 mg/ml之最終蛋白質濃度。接著藉由逐滴添加0.5 N HCl水溶液將溶液之pH值校正至6.0。
隨後，在最多15分鐘之時段(t)內在輕輕攪拌下將50倍莫耳過量之胺氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)試劑添加至此TNF-α溶液中。接著在15分鐘內添加間甲苯胺水溶液(50 mM)，得到10 mM之最終濃度。最後，添加40 mM過碘酸鈉水溶液，得到400 μM之濃度。
在T=+22 +/- 2℃之溫度(T)下在黑暗中在輕輕震盪下培育反應混合物120 +/- 10分鐘。接著藉由添加L-半胱胺酸水溶液(1 M)來中止反應，得到在反應混合物中10 mM之最終濃度並培育60 +/- 5分鐘。
藉由離子交換層析純化所得TNF-α結合物。收集洗提液中含有PSA-TNF-α的洗提份且藉由超濾/透濾(UF/DF)使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)濃縮。
藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質、生物活性及藉由量測PSA含量(間苯二酚檢定)測定聚唾液酸化程度以分析法特性化使用此程序所製備之結合物。
實施例25 使用胺氧基-PSA及作為親核性催化劑之間甲苯胺使胰島素聚唾液酸化 方法1：
如本文所述，胰島素之胺基酸序列首先經修飾為併有至少一個糖基化部位。純化後，根據此項技術中已知之方法試管內使胰島素糖基化。將起始濃度之胰島素轉移至反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。向此溶液中添加NaIO4，得到200 μM之最終濃度。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行氧化反應30分鐘。接著在室溫下用半胱胺酸(最終濃度：10 mM)中止反應，持續60分鐘。
接著使用Vivaspin離心過濾器使溶液進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物，或在替代性情況下通過經緩衝液A(20 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7.0)平衡且體積為20 ml之IEX管柱(Merck EMD TMAE(M))。用5 CV緩衝液A平衡管柱。用緩衝液B(20 mM Hepes、5 mM CaCl2、1 M NaCl，pH 7.0)洗提經氧化胰島素。收集含有胰島素之洗提份。測定蛋白質含量(庫馬斯法、布萊德法)且用反應緩衝液調整至1 mg/ml並藉由逐滴添加0.5 M HCl調整至pH 6.0。
添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的胺氧基-PSA試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(最終濃度：10 mM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。藉助於HIC移除過量胺氧基試劑。藉由添加含有乙酸銨之緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣、8 M乙酸銨，pH 6.9)調整反應混合物之傳導率且加載於經50 mM Hepes、2.5 M乙酸銨、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣(pH 6.9)預平衡且填充有80 ml苯基瓊脂糖FF之管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。隨後用含有5 mM CaCl2之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.5)洗提結合物。最後收集含有PSA-胰島素之洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法1。如本文所述，胰島素之胺基酸序列首先經修飾為併有至少一個糖基化部位。純化後，根據此項技術中已知之方法試管內使胰島素糖基化。將胰島素轉移至反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。向此溶液中添加NaIO4，得到200 μM之最終濃度。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行氧化反應30分鐘。接著在室溫下用半胱胺酸(最終濃度：10 mM)中止反應，持續60分鐘。
接著使用Vivaspin離心過濾器使溶液進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物。
添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的胺氧基-PSA試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(最終濃度：10 mM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。藉助於離子交換層析移除過量胺氧基試劑。收集洗提液中含有PSA-胰島素的洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
方法2：
如本文所述，胰島素之胺基酸序列首先經修飾為併有至少一固糖基化部位。純化後，根據此項技術中已知之方法試管內使胰島素糖基化。
將胰島素轉移至或溶解於反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25 mg/ml之最終蛋白質濃度。接著藉由逐滴添加0.5 N HCl水溶液將溶液之pH值校正至6.0。隨後在10分鐘內添加40 mM過碘酸鈉水溶液，得到200 μM之濃度。在T=+22+/-2℃之溫度(T)下進行氧化反應30+/-5分鐘。接著藉由在T=+22+/-2℃下在15分鐘內添加L-半胱胺酸水溶液(1 M)來中止反應，得到在反應混合物中10 mM之最終濃度並培育60+/-5分鐘。
藉由離子交換層析進一步純化經氧化胰島素。收集洗提液中含有經氧化胰島素的洗提份且用於結合反應。
在最多15分鐘之時段(t)內在輕輕攪拌下將50倍莫耳過量之胺氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)試劑添加至含有經純化之經氧化胰島素之洗提液中。接著在15分鐘內添加間甲苯胺水溶液(50 mM)，得到10 mM之最終濃度。在T=+22+/-2℃之溫度(T)下在黑暗中在輕輕震盪下培育反應混合物120+/-10分鐘(蛋白質濃度：1 mg/ml)。
藉由離子交換層析進一步純化所得PSA-胰島素結合物。收集含有PSA-胰島素結合物之洗提份並藉由超濾/透濾(UF/DF)使用由再生纖維素製成且具有適當分子量截止之膜(Millipore)濃縮。
藉由量測總蛋白質、生物活性及藉由量測PSA含量(間苯二酚檢定)測定聚唾液酸化程度以分析法特性化使用此程序所製備之結合物。
方法3：
如本文所述，胰島素之胺基酸序列首先經修飾為併有至少一個糖基化部位。純化後，根據此項技術中已知之方法試管內使胰島素糖基化。
將胰島素轉移至反應緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的胺氧基-PSA試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(10 mM最終濃度)及NaIO4(最終濃度：400 μM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。隨後在室溫下用半胱胺酸中止反應，持續60分鐘(半胱胺酸濃度：10 mM)。接著藉由添加含有乙酸銨之緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣、8 M乙酸銨，pH 6.9)調整反應混合物之傳導率且加載於經50 mM Hepes、2.5 M乙酸銨、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣、0.01% Tween 80(pH 6.9)預平衡且填充有苯基瓊脂糖FF之管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。隨後用50 mM Hepes、5 mM氯化鈣(pH 7.5)洗提結合物。最後收集含有PSA-胰島素之洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法3。如本文所述，胰島素之胺基酸序列首先經修飾為併有至少一個糖基化部位。純化後，根據此項技術中已知之方法試管內使胰島素糖基化。
將胰島素轉移至反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的胺氧基-PSA試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(10 mM最終濃度)及NaIO4(最終濃度：400 μM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。隨後，在室溫下用半胱胺酸中止反應，持續60分鐘(半胱胺酸濃度：10 mM)且藉由離子交換層析純化結合物。收集洗提液中含有PSA-胰島素的洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
方法4：
如本文所述，胰島素之胺基酸序列首先經修飾為併有至少一個糖基化部位。純化後，根據此項技術中已知之方法試管內使胰島素糖基化。
將胰島素溶解於或轉移至反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到1.0 +/- 0.25 mg/ml之最終蛋白質濃度。接著藉由逐滴添加0.5 N HCl水溶液將溶液之pH值校正至6.0。
隨後，在最多15分鐘之時段(t)內在輕輕攪拌下將50倍莫耳過量之胺氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)試劑添加至此胰島素溶液中。接著在15分鐘內添加間甲苯胺水溶液(50 mM)，得到10 mM之最終濃度。最後，添加40 mM過碘酸鈉水溶液，得到400 μM之濃度。
在T=+22 +/- 2℃之溫度(T)下在黑暗中在輕輕震盪下培育反應混合物120 +/- 10分鐘。接著藉由添加L-半胱胺酸水溶液(1 M)來中止反應，得到在反應混合物中10 mM之最終濃度並培育60 +/- 5分鐘。
藉由離子交換層析純化所得胰島素結合物。收集洗提液中含有PSA-胰島素的洗提份且藉由超濾/透濾(UF/DF)使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)濃縮。
藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質、生物活性及藉由量測PSA含量(間苯二酚檢定)測定聚唾液酸化程度以分析法特性化使用此程序所製備之結合物。
實施例26 使用胺氧基-PSA及作為親核性催化劑之間甲苯胺使干擾素-α聚唾液酸化 方法1：
將起始濃度之干擾素-α轉移至反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。向此溶液中添加NaIO4，得到200 μM之最終濃度。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行氧化反應30分鐘。接著在室溫下用半胱胺酸(最終濃度：10 mM)中止反應，持續60分鐘。
接著使用Vivaspin離心過濾器使溶液進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物，或在替代性情況下通過經緩衝液A(20 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7.0)平衡且體積為20 ml之IEX管柱(Merck EMD TMAE(M))。用5 CV緩衝液A平衡管柱。用緩衝液B(20 mM Hepes、5 mM CaCl2、1 M NaCl，pH 7.0)洗提經氧化干擾素-α。收集含有干擾素-α之洗提份。測定蛋白質含量(庫馬斯法、布萊德法)且用反應緩衝液調整至1 mg/ml並藉由逐滴添加0.5 M HCl調整至pH 6.0。
添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的胺氧基-PSA試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(最終濃度：10 mM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。藉助於HIC移除過量胺氧基試劑。藉由添加含有乙酸銨之緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣、8 M乙酸銨，pH 6.9)調整反應混合物之傳導率且加載於經50 mM Hepes、2.5 M乙酸銨、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣(pH 6.9)預平衡且填充有80 ml苯基瓊脂糖FF之管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。隨後用含有5 mM CaCl2之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.5)洗提結合物。最後收集含有PSA-干擾素-α之洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之膜(Mikkipore)進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法1。將干擾素-α轉移至反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。向此溶液中添加NaIO4，得到200 μM之最終濃度。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行氧化反應30分鐘。接著在室溫下用半胱胺酸(最終濃度：10 mM)中止反應，持續60分鐘。
接著使用Vivaspin離心過濾器使溶液進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物。
添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的胺氧基-PSA試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(最終濃度：10 mM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。藉助於離子交換層析移除過量胺氧基試劑。收集洗提液中含有PSA-干擾素-α的洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
方法2：
將干擾素-α轉移至或溶解於反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到1.0 +/- 0.25 mg/ml之最終蛋白質濃度。接著藉由逐滴添加0.5 N HCl水溶液將溶液之pH值校正至6.0。隨後在10分鐘內添加40 mM過碘酸鈉水溶液，得到2.00 μM之濃度。在T=+22 +/- 2℃之溫度(T)下進行氧化反應30 +/- 5分鐘。接著藉由在T=+22 +/- 2℃下在15分鐘內添加L-半胱胺酸水溶液(1 M)來中止反應，得到在反應混合物中10 mM之最終濃度並培育60 +/- 5分鐘。
藉由離子交換層析進一步純化經氧化干擾素-α。收集洗提液中含有經氧化干擾素-α的洗提份且用於結合反應。
在最多15分鐘之時段(t)內在輕輕攪拌下將50倍莫耳過量之胺氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)試劑添加至含有經純化之經氧化干擾素-γ之洗提液中。接著在15分鐘內添加間甲苯胺水溶液(50 mM)，得到10 mM之最終濃度。在T=+22 +/- 2℃之溫度(T)下在黑暗中在輕輕震盪下培育反應混合物120 +/- 10分鐘(蛋白質濃度：1 mg/ml)。
藉由離子交換層析進一步純化所得PSA-干擾素-α結合物。收集含有PSA-干擾素-α結合物之洗提份並藉由超濾/透濾(UF/DF)使用由再生纖維素製成且具有適當分子量截止之膜(Millipore)濃縮。
方法3：
將干擾素-α轉移至反應緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的PSA胺氧基試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(10 mM最終濃度)及NaIO4(最終濃度：400 μM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。隨後在室溫下用半胱胺酸中止反應，持續60分鐘(半胱胺酸濃度：10 mM)。接著藉由添加含有乙酸銨之緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣、8 M乙酸銨，pH 6.9)調整反應混合物之傳導率且加載於經50 mM Hepes、2.5 M乙酸銨、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣、0.01% Tween 80(pH 6.9)預平衡且填充有苯基瓊脂糖FF之管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。隨後用50 mM Hepes、5 mM氯化鈣(pH 7.5)洗提結合物。最後收集含有PSA-干擾素-α之洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)進行UF/DF。藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法3。將干擾素-α轉移至反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的胺氧基-PSA試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(10 mM最終濃度)及NaIO4(最終濃度：400 μM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。隨後，在室溫下用半胱胺酸中止反應，持續60分鐘(半胱胺酸濃度：10 mM)且藉由離子交換層析純化結合物。收集洗提液中含有PSA-干擾素-α的洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)進行UF/DF。藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
方法4：
將干擾素-α溶解於或轉移至反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25 mg/ml之最終蛋白質濃度。接著藉由逐滴添加0.5 N HCl水溶液將溶液之pH值校正至6.0。
隨後，在最多15分鐘之時段(t)內在輕輕攪拌下將50倍莫耳過量之胺氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)試劑添加至此干擾素-α溶液中。接著在15分鐘內添加間甲苯胺水溶液(50 mM)，得到10 mM之最終濃度。最後，添加40 mM過碘酸鈉水溶液，得到400 μM之濃度。
在T=+22+/-2℃之溫度(T)下在黑暗中在輕輕震盪下培育反應混合物120+/-10分鐘。接著藉由添加L-半胱胺酸水溶液(1 M)來中止反應，得到在反應混合物中10 mM之最終濃度並培育60+/-5分鐘。
藉由離子交換層析純化所得干擾素-α結合物。收集洗提液中含有PSA-干擾素-α的洗提份且藉由超濾/透濾(UF/DF)使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)濃縮。
藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質、生物活性及藉由量測PSA含量(間苯二酚檢定)測定聚唾液酸化程度以分析法特性化使用此程序所製備之結合物。
實施例27 使用胺氧基-PSA及作為親核性催化劑之間甲苯胺使干擾素-γ聚唾液酸化 方法1：
將10 mg干擾素-γ溶解於5 ml組胺酸緩衝液(pH 6.0)(20 mM L-組胺酸、150 mM NaCl)中。接著添加100 μl過碘酸鈉水溶液(5 mM)且在4℃下在黑暗中在輕輕攪拌下培育反應混合物1小時，在室溫下藉由添加50 μl 1 M半胱胺酸水溶液來中止，持續15分鐘。隨後使用Vivaspin 15R 10 kD離心過濾器使混合物進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物。
將含有經氧化干擾素-γ之保留物(約7 ml)與2 ml間甲苯胺水溶液(50 mM)混合且在室溫下培育30分鐘。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PSA試劑(上述)，產生5倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育此混合物2.5小時。
藉助於陽離子交換層析(cation exchange chromatography，CEC)移除自由干擾素-γ。用20 ml緩衝液A(50 mM Hepes，pH 6.5)稀釋反應混合物且加載於經緩衝液A預平衡之20 ml HiPrep SPFF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。接著用緩衝液B(50 mM Hepes、1 M NaCl，pH 6.5)洗提管柱。藉由用25%緩衝液B洗滌管柱來洗提自由干擾素-γ且用50%緩衝液B洗提結合物。含有結合物之洗提份的傳導率隨後使用緩衝液C(50 mM Hepes、5 M NaCl，pH 6.9)升至約190 mS/cm且加載於經緩衝液D(50 mM Hepes、3 M NaCl，pH 6.9)預平衡之20 ml HiPrep丁基FF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。用5 CV緩衝液D洗滌出自由PSA試劑。隨後，用100%緩衝液E(50 mM Hepes，pH 6.9)洗提結合物。藉由UF/DF，使用由再生纖維素製成之10 kD膜(88 cm2，截止10 kD，Millipore)濃縮含有結合物之洗提份。針對含有150 mM NaCl之組胺酸緩衝液(pH 6.9)進行最後透濾步驟。藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。對於PSA-干擾素-γ結合物，與天然干擾素-γ相比，測得比活性>50%。另外藉由尺寸排阻HPLC，使用裝備有Shodex KW 803管柱之Agilent 1200 HPLC系統，在如先前所述之條件(Kolarich等人,Transfusion 2006;46:1959-77)下以分析法特性化結合物。顯示製劑不含有自由干擾素γ。
方法2：
將10 mg干擾素-γ溶解於8 ml組胺酸緩衝液(pH 6.0)(20 mM L-組胺酸、150 mM NaCl)中。接著添加200 μl過碘酸鈉水溶液(5 mM)及2 ml間甲苯胺水溶液(50 mM)。隨後添加MW為20 kD之胺氧基-PSA試劑(上述)，產生5倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且在室溫下藉由添加100 μl 1 M半胱胺酸水溶液來中止，持續15分鐘。
藉助於陽離子交換層析(CEC)移除自由干擾素γ。用20 ml緩衝液A(50 mM Hepes，pH 6.5)稀釋反應混合物且加載於經緩衝液A預平衡之20 ml HiPrep SPFF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。接著用緩衝液B(50 mM Hepes、1 M NaCl，pH 6.5)洗提管柱。藉由用25%緩衝液B洗滌管柱來洗提自由干擾素-γ且用50%緩衝液B洗提結合物。含有結合物之洗提份的傳導率隨後使用緩衝液C(50 mM Hepes、5 M NaCl，pH 6.9)升至約190 mS/cm且加載於經緩衝液D(50 mM Hepes、3 M NaCl，pH 6.9)預平衡之20 ml HiPrep丁基FF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。用5 CV緩衝液D洗滌出自由PSA試劑。隨後，用100%緩衝液E(50 mM Hepes，pH 6.9)洗提結合物。藉由UF/DF/使用由再生纖維素製成之10 kD膜(88 cm2，截止10 kD/Millipore)濃縮含有結合物之洗提份。針對含有150 mM NaCl之組胺酸緩衝液(pH 6.9)進行最後透濾步驟。藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。對於PSA干擾素-γ結合物，與天然干擾素-γ相比，測得比活性>50%。另外藉由尺寸排阻HPLC，使用裝備有Shodex KW 803管柱之Agilent 1200 HPLC系統，在如先前所述之條件(Kolarich等人,Transfusion 2006;46:1959-77)下以分析法特性化結合物。顯示製劑不含有自由干擾素-γ。
方法3：
將10 mg干擾素-γ溶解於8 ml組胺酸緩衝液(pH 6.0)(20 mM L-組胺酸、150 mM NaCl)中。接著添加200 μl過碘酸鈉水溶液(5 mM)及2 ml間甲苯胺水溶液(50 mM)。隨後添加MW為20 kD之胺氧基-PSA試劑(上述)，產生5倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且在室溫下藉由添加100 μl 1 M半胱胺酸水溶液來中止，持續15分鐘。
藉助於陽離子交換層析(CEC)移除自由干擾素γ。用20 ml緩衝液A(50 mM Hepes，pH 6.5)稀釋反應混合物且加載於經緩衝液A預平衡之20 ml HiPrep SPFF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。接著用緩衝液B(50 mM Hepes、1 M NaCl，pH 6.5)洗提管柱。藉由用25%緩衝液B洗滌管柱來洗提自由干擾素-γ且用50%緩衝液B洗提結合物。含有結合物之洗提份的傳導率隨後使用緩衝液C(50 mM Hepes、5 M NaCl，pH 6.9)升至約190 mS/cm且加載於經緩衝液D(50 mM Hepes、3 M NaCl，pH 6.9)預平衡之20 ml HiPrep丁基FF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。用5 CV緩衝液D洗滌出自由PSA試劑。隨後，用100%緩衝液E(50 mM Hepes，pH 6.9)洗提結合物。藉由UF/DF/使用由再生纖維素製成之10 kD膜(88 cm2，截止10 kD/Millipore)濃縮含有結合物之洗提份。針對含有150 mM NaCl之組胺酸緩衝液(pH 6.9)進行最後透濾步驟。藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。對於PSA干擾素-γ結合物，與天然干擾素-γ相比，測得比活性>50%。另外藉由尺寸排阻HPLC，使用裝備有Shodex KW 803管柱之Agilent 1200 HPLC系統，在如先前所述之條件(Kolarich等人,Transfusion 2006;46:1959-77)下以分析法特性化結合物。顯示製劑不含有自由干擾素-γ。
方法4：
將干擾素-γ溶解於或轉移至反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25 mg/ml之最終蛋白質濃度。接著藉由逐滴添加0.5 N HCl水溶液將溶液之pH值校正至6.0。
隨後，在最多15分鐘之時段(t)內在輕輕攪拌下將50倍莫耳過量之胺氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)試劑添加至此干擾素-γ溶液中。接著在15分鐘內添加間甲苯胺水溶液(50 mM)，得到10 mM之最終濃度。最後，添加40 mM過碘酸鈉水溶液，得到400 μM之濃度。
在T=+22 +/- 2℃之溫度(T)下在黑暗中在輕輕震盪下培育反應混合物120 +/- 10分鐘。接著藉由添加L-半胱胺酸水溶液(1 M)來中止反應，得到在反應混合物中10 mM之最終濃度並培育60 +/- 5分鐘。
藉由離子交換層析純化所得干擾素-γ結合物。收集洗提液中含有PSA-干擾素-γ的洗提份且藉由超濾/透濾(UF/DF)使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)濃縮。
藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質、生物活性及藉由量測PSA含量(間苯二酚檢定)測定聚唾液酸化程度以分析法特性化使用此程序所製備之結合物。
實施例28 使用胺氧基-PSA及作為親核性催化劑之間甲苯胺使G-CSF聚唾液酸化 方法1：
將起始濃度之顆粒球群落刺激因子(G-CSF)轉移至反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。向此溶液中添加NaIO4，得到200 μM之最終濃度。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行氧化反應30分鐘。接著在室溫下用半胱胺酸(最終濃度：10 mM)中止反應，持續60分鐘。
接著使用Vivaspin離心過濾器使溶液進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物，或在替代性情況下通過經緩衝液A(20 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7.0)平衡且體積為20 ml之IEX管柱(Merck EMD TMAE(M))。用5 CV緩衝液A平衡管柱。用緩衝液B(20 mM Hepes、5 mM CaCl2、1 M NaCl，pH 7.0)洗提經氧化G-CSF。收集含有G-CSF之洗提份。測定蛋白質含量(庫馬斯法、布萊德法)且用反應緩衝液調整至1 mg/ml並藉由逐滴添加0.5 M HCl調整至pH 6.0。
添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的胺氧基-PSA試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(最終濃度：10 mM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。藉助於HIC移除過量胺氧基試劑。藉由添加含有乙酸銨之緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣、8 M乙酸銨，pH 6.9)調整反應混合物之傳導率且加載於經50 mM Hepes、2.5 M乙酸銨、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣(pH 6.9)預平衡且填充有80 ml苯基瓊脂糖FF之管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。隨後用含有5 mM CaCl2之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.5)洗提結合物。最後收集含有PSA-G-CSF之洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法1。將顆粒球群落刺激因子(G-CSF)轉移至反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。向此溶液中添加NaIO4，得到200 μM之最終濃度。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行氧化反應30分鐘。接著在室溫下用半胱胺酸(最終濃度：10 mM)中止反應，持續60分鐘。
接著使用Vivaspin離心過濾器使溶液進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物。添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的胺氧基-PSA試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(最終濃度：10 mM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。藉助於離子交換層析移除過量胺氧基試劑。收集洗提液中含有PSA-G-CSF的洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
方法2：
將G-CSF轉移至或溶解於反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25 mg/ml之最終蛋白質濃度。接著藉由逐滴添加0.5 N HCl水溶液將溶液之pH值校正至6.0。隨後在10分鐘內添加40 mM過碘酸鈉水溶液，得到200 μM之濃度。在T=+22+/-2℃之溫度(T)下進行氧化反應30+/-5分鐘。接著藉由在T=+22+/-2℃下在15分鐘內添加L-半胱胺酸水溶液(1 M)來中止反應，得到在反應混合物中10 mM之最終濃度並培育60+/-5分鐘。
藉由離子交換層析進一步純化經氧化G-CSF。收集洗提液中含有經氧化G-CSF的洗提份且用於結合反應。
在最多15分鐘之時段(t)內在輕輕攪拌下將50倍莫耳過量之胺氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)試劑添加至含有經純化之經氧化G-CSF之洗提液中。接著在15分鐘內添加間甲苯胺水溶液(50 mM)，得到10 mM之最終濃度。在T=+22+/-2℃之溫度(T)下在黑暗中在輕輕震盪下培育反應混合物120+/-10分鐘(蛋白質濃度：1 mg/ml)。
藉由離子交換層析進一步純化所得PSA-G-CSF結合物。收集含有PSA-G-CSF結合物之洗提份並藉由超濾/透濾(UF/DF)使用由再生纖維素製成且具有適當分子量截止之膜(Millipore)濃縮。
藉由量測總蛋白質、生物活性及藉由量測PSA含量(間苯二酚檢定)測定聚唾液酸化程度以分析法特性化使用此程序所製備之結合物。
方法3：
將顆粒球群落刺激因子(G-CSF)轉移至反應緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的胺氧基-PSA試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(10 mM最終濃度)及NaIO4(最終濃度：400 μM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。隨後在室溫下用半胱胺酸中止反應，持續60分鐘(半胱胺酸濃度：10 mM)。接著藉由添加含有乙酸銨之緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣、8 M乙酸銨，pH 6.9)調整反應混合物之傳導率且加載於經50 mM Hepes、2.5 M乙酸銨、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣、0.01% Tween 80(pH 6.9)預平衡且填充有苯基瓊脂糖FF之管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。隨後用50 mM Hepes、5 mM氯化鈣(pH 7.5)洗提結合物。最後收集含有PSA-G-CSF之洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)進行UF/DF。藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法3。將顆粒球群落刺激因子(G-CSF)轉移至反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的胺氧基-PSA試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(10 mM最終濃度)及NaIO4(最終濃度：400 μM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。隨後，在室溫下用半胱胺酸中止反應，持續60分鐘(半胱胺酸濃度：10 mM)且藉由離子交換層析純化結合物。收集洗提液中含有PSA-G-CSF的洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)進行UF/DF。藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
方法4：
將G-CSF溶解於或轉移至反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到1.0 +/- 0.25 mg/ml之最終蛋白質濃度。接著藉由逐滴添加0.5 N HCl水溶液將溶液之pH值校正至6.0。
隨後，在最多15分鐘之時段(t)內在輕輕攪拌下將50倍莫耳過量之胺氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)試劑添加至此G-CSF溶液中。接著在15分鐘內添加間甲苯胺水溶液(50 mM)，得到10 mM之最終濃度。最後，添加40 mM過碘酸鈉水溶液，得到400 μM之濃度。
在T=+22 +/- 2℃之溫度(T)下在黑暗中在輕輕震盪下培育反應混合物120 +/- 10分鐘。接著藉由添加L-半胱胺酸水溶液(1 M)來中止反應，得到在反應混合物中10 mM之最終濃度並培育60 +/- 5分鐘。
藉由離子交換層析純化所得G-CSF結合物。收集洗提液中含有PSA-G-CSF的洗提份且藉由超濾/透濾(UF/DF)使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)濃縮。
藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質、生物活性及藉由量測PSA含量(間苯二酚檢定)測定聚唾液酸化程度以分析法特性化使用此程序所製備之結合物。
實施例29 使用胺氧基-PSA及作為親核性催化劑之間甲苯胺使修美樂聚唾液酸化 方法1：
將起始濃度之修美樂轉移至反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。向此溶液中添加NaIO4，得到200 μM之最終濃度。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行氧化反應30分鐘。接著在室溫下用半胱胺酸(最終濃度：10 mM)中止反應，持續60分鐘。
接著使用Vivaspin離心過濾器使溶液進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物，或在替代性情況下通過經緩衝液A(20 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7.0)平衡且體積為20 ml之IEX管柱(Merck EMD TMAE(M))。用5 CV緩衝液A平衡管柱。用緩衝液B(20 mM Hepes、5 mM CaCl2、1 M NaCl，pH 7.0)洗提經氧化修美樂。收集含有修美樂之洗提份。測定蛋白質含量(庫馬斯法、布萊德法)且用反應緩衝液調整至1 mg/ml並藉由逐滴添加0.5 M HCl調整至pH 6.0。
添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的胺氧基-PSA試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(最終濃度：10 mM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。藉助於HIC移除過量胺氧基試劑。藉由添加含有乙酸銨之緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣、8 M乙酸銨，pH 6.9)調整反應混合物之傳導率且加載於經50 mM Hepes、2.5 M乙酸銨、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣(pH 6.9)預平衡且填充有80 ml苯基瓊脂糖FF之管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。隨後用含有5 mM CaCl2之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.5)洗提結合物。最後收集含有PSA-修美樂之洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法1。將修美樂轉移至反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。向此溶液中添加NaIO4，得到200 μM之最終濃度。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行氧化反應30分鐘。接著在室溫下用半胱胺酸(最終濃度：10 mM)中止反應，持續60分鐘。
接著使用Vivaspin離心過濾器使溶液進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物。添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的胺氧基-PSA試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(最終濃度：10 mM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。藉助於離子交換層析移除過量胺氧基試劑。收集洗提液中含有PSA-修美樂的洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
方法2：
將修美樂轉移至或溶解於反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到1.0 +/- 0.25 mg/ml之最終蛋白質濃度。接著藉由逐滴添加0.5 N HCl水溶液將溶液之pH值校正至6.0。隨後在10分鐘內添加40 mM過碘酸鈉水溶液，得到200 μM之濃度。在T=+22 +/- 2℃之溫度(T)下進行氧化反應30 +/- 5分鐘。接著藉由在T=+22 +/- 2℃下在15分鐘內添加L-半胱胺酸水溶液(1 M)來中止反應，得到在反應混合物中10 mM之最終濃度並培育60 +/- 5分鐘。
藉由離子交換層析進一步純化經氧化修美樂。收集洗提液中含有經氧化修美樂的洗提份且用於結合反應。
在最多15分鐘之時段(t)內在輕輕攪拌下將50倍莫耳過量之胺氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)試劑添加至含有經純化之經氧化修美樂之洗提液中。接著在15分鐘內添加間甲苯胺水溶液(50 mM)，得到10 mM之最終濃度。在T=+22 +/- 2℃之溫度(T)下在黑暗中在輕輕震盪下培育反應混合物120 +/- 10分鐘(蛋白質濃度：1 mg/ml)。
藉由離子交換層析進一步純化所得PSA-修美樂結合物。收集含有PSA-修美樂結合物之洗提份並藉由超濾/透濾(UF/DF)使用由再生纖維素製成且具有適當分子量截止之膜(Millipore)濃縮。
藉由量測總蛋白質、生物活性及藉由量測PSA含量(間苯二酚檢定)測定聚唾液酸化程度以分析法特性化使用此程序所製備之結合物。
方法3：
將修美樂轉移至反應緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的胺氧基-PSA試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(10 mM最終濃度)及NaIO4(最終濃度：400 μM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。隨後在室溫下用半胱胺酸中止反應，持續60分鐘(半胱胺酸濃度：10 mM)。接著藉由添加含有乙酸銨之緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣、8 M乙酸銨，pH 6.9)調整反應混合物之傳導率且加載於經50 mM Hepes、2.5 M乙酸銨、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣、0.01% Tween 80(pH 6.9)預平衡且填充有苯基瓊脂糖FF之管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。隨後用50 mM Hepes、5 mM 氯化鈣(pH 7.5)洗提結合物。最後收集含有PSA-修美樂之洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)進行UF/DF。藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法3。將修美樂轉移至反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的胺氧基-PSA試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(10 mM最終濃度)及NaIO4(最終濃度：400 μM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。隨後，在室溫下用半胱胺酸中止反應，持續60分鐘(半胱胺酸濃度：10 mM)且藉由離子交換層析純化結合物。收集洗提液中含有PSA-修美樂的洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)進行UF/DF。藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
方法4：
將修美樂溶解於或轉移至反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25 mg/ml之最終蛋白質濃度。接著藉由逐滴添加0.5 N HCl水溶液將溶液之pH值校正至6.0。
隨後，在最多15分鐘之時段(t)內在輕輕攪拌下將50倍莫耳過量之胺氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)試劑添加至此修美樂溶液中。接著在15分鐘內添加間甲苯胺水溶液(50 mM)，得到10 mM之最終濃度。最後，添加40 mM過碘酸鈉水溶液，得到400 μM之濃度。
在T=+22+/-2℃之溫度(T)下在黑暗中在輕輕震盪下培育反應混合物120+/-10分鐘。接著藉由添加L-半胱胺酸水溶液(1 M)來中止反應，得到在反應混合物中10 mM之最終濃度並培育60+/-5分鐘。
藉由離子交換層析純化所得修美樂-結合物。收集洗提液中含有PSA-修美樂的洗提份且藉由超濾/透濾(UF/DF)使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)濃縮。
藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質、生物活性及藉由量測PSA含量(間苯二酚檢定)測定聚唾液酸化程度以分析法特性化使用此程序所製備之結合物。
實施例30 使用胺氧基-PSA及作為親核性催化劑之間甲苯胺使普羅利亞聚唾液酸化 方法1：
將起始濃度之普羅利亞轉移至反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。向此溶液中添加NaIO4，得到200 μM之最終濃度。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行氧化反應30分鐘。接著在室溫下用半胱胺酸(最終濃度：10 mM)中止反應，持續60分鐘。
接著使用Vivaspin離心過濾器使溶液進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物，或在替代性情況下通過經緩衝液A(20 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7.0)平衡且體積為20 ml之IEX管柱(Merck EMD TMAE(M))。用5 CV緩衝液A平衡管柱。用緩衝液B(20 mM Hepes、5 mM CaCl2、1 M NaCl，pH 7.0)洗提經氧化普羅利亞。收集含有普羅利亞之洗提份。測定蛋白質含量(庫馬斯法、布萊德法)且用反應緩衝液調整至1 mg/ml並藉由逐滴添加0.5 M HCl調整至pH 6.0。
添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的胺氧基-PSA試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(最終濃度：10 mM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。藉助於HIC移除過量胺氧基試劑。藉由添加含有乙酸銨之緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣、8 M乙酸銨，pH 6.9)調整反應混合物之傳導率且加載於經50 mM Hepes、2.5 M乙酸銨、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣(pH 6.9)預平衡且填充有80 ml苯基瓊脂糖FF之管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。隨後用含有5 mM CaCl2之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.5)洗提結合物。最後收集含有PSA-普羅利亞之洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法1。將10 mg普羅利亞溶解於5 ml組胺酸緩衝液(pH 6.0)(20 mM L-組胺酸、150 mM NaCl)中。接著添加100 μl過碘酸鈉水溶液(5 mM)且在4℃下在黑暗中在輕輕攪拌下培育反應混合物1小時，在室溫下藉由添加50 μl 1 M半胱胺酸水溶液來中止，持續15分鐘。隨後使用Vivaspin 15R 10 kD離心過濾器使混合物進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物。
將含有經氧化普羅利亞之保留物(約7 ml)與2 ml間甲苯胺水溶液(50 mM)混合且在室溫下培育30分鐘。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PSA試劑(上述)，產生5倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育此混合物2.5小時。
藉助於陽離子交換層析(CEC)移除自由普羅利亞。用20 ml緩衝液A(50 mM Hepes，pH 6.5)稀釋反應混合物且加載於經緩衝液A預平衡之20 ml HiPrep SPFF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。接著用緩衝液B(50 mM Hepes、1 M NaCl，pH 6.5)洗提管柱。藉由用25%緩衝液B洗滌管柱來洗提自由普羅利亞且用50%緩衝液B洗提結合物。含有結合物之洗提份的傳導率隨後使用緩衝液C(50 mM Hepes、5 M NaCl，pH 6.9)升至約190 mS/cm且加載於經緩衝液D(50 mM Hepes、3 M NaCl，pH 6.9)預平衡之20 ml HiPrep丁基FF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。用5 CV緩衝液D洗滌出自由PSA試劑。隨後，用100%緩衝液E(50 mM Hepes，pH 6.9)洗提結合物。藉由UF/DF，使用由再生纖維素製成之10 kD膜(88 cm2，截止10 kD，Millipore)濃縮含有結合物之洗提份。針對含有150 mM NaCl之組胺酸緩衝液(pH 6.9)進行最後透濾步驟。藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。對於PSA-普羅利亞結合物，與天然普羅利亞相比，測得比活性>50%。另外藉由尺寸排阻HPLC，使用裝備有Shodex KW 803管柱之Agilent 1200 HPLC系統，在如先前所述之條件(Kolarich等人,Transfusion 2006;46:1959-77)下以分析法特性化結合物。顯示製劑不含有自由普羅利亞。
方法2：
將普羅利亞轉移至或溶解於反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到1.0 +/- 0.25 mg/ml之最終蛋白質濃度。接著藉由逐滴添加0.5 N HCl水溶液將溶液之pH值校正至6.0。隨後在10分鐘內添加40 mM過碘酸鈉水溶液，得到200 μM之濃度。在T=+22 +/- 2℃之溫度(T)下進行氧化反應30 +/- 5分鐘。接著藉由在T；+22 +/- 2℃下在15分鐘內添加L-半胱胺酸水溶液(1 M)來中止反應，得到在反應混合物中10 mM之最終濃度並培育60 +/- 5分鐘。
藉由離子交換層析進一步純化經氧化普羅利亞。收集洗提液中含有經氧化普羅利亞的洗提份且用於結合反應。
在最多15分鐘之時段(t)內在輕輕攪拌下將50倍莫耳過量之胺氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)試劑添加至含有經純化之經氧化普羅利亞之洗提液中。接著在15分鐘內添加間甲苯胺水溶液(50 mM)，得到10 mM之最終濃度。在T=+22+/-2℃之溫度(T)下在黑暗中在輕輕震盪下培育反應混合物120+/-10分鐘(蛋白質濃度：1 mg/ml)。
藉由離子交換層析進一步純化所得普羅利亞結合物。收集含有普羅利亞結合物之洗提份並藉由超濾/透濾(UF/DF)使用由再生纖維素製成且具有適當分子量截止之膜(Millipore)濃縮。
藉由量測總蛋白質、生物活性及藉由量測PSA(間苯二酚檢定)含量測定聚唾液酸化程度以分析法特性化使用此程序所製備之結合物。
方法3：
將普羅利亞轉移至反應緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且稀釋，獲得1 mg/ml之蛋白質濃度。添加50倍莫耳過量之MW為20 kD的胺氧基-PSA試劑(上述)，隨後添加作為親核性催化劑之間甲苯胺(10 mM最終濃度)及NaIO4(最終濃度：400 μM)。在室溫下在黑暗中在輕輕震盪下進行偶合反應2小時。隨後在室溫下用半胱胺酸中止反應，持續60分鐘(半胱胺酸濃度：10 mM)。接著藉由添加含有乙酸銨之緩衝液(50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣、8 M乙酸銨，pH 6.9)調整反應混合物之傳導率且加載於經50 mM Hepes、2.5 M乙酸銨、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣、0.01% Tween 80(pH 6.9)預平衡且填充有苯基瓊脂糖FF之管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。隨後用50 mM Hepes、5 mM氯化鈣(pH 7.5)洗提結合物。最後收集含有PSA普羅利亞之洗提份且藉由使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)進行UF/DF。藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法3。將10 mg普羅利亞溶解於8 ml組胺酸緩衝液(pH 6.0)(20 mM L-組胺酸、150 mM NaCl)中。接著添加200 μl過碘酸鈉水溶液(5 mM)及2 ml間甲苯胺水溶液(50 mM)。隨後添加MW為20 kD之胺氧基-PSA試劑(上述)，產生5倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且在室溫下藉由添加100 μl 1 M半胱胺酸水溶液來中止，持續15分鐘。
藉助於陽離子交換層析(CEC)移除自由普羅利亞。用20 ml緩衝液A(50 mM Hepes，pH 6.5)稀釋反應混合物且加載於經緩衝液A預平衡之20 ml HiPrep SPFF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。接著用緩衝液B(50 mM Hepes、1 M NaCl，pH 6.5)洗提管柱。藉由用25%緩衝液B洗滌管柱來洗提自由普羅利亞且用50%緩衝液B洗提結合物。含有結合物之洗提份的傳導率隨後使用緩衝液C(50 mM Hepes、5 M NaCl，pH 6.9)升至約190 mS/cm且加載於經緩衝液D(50 mM Hepes、3 M NaCl，pH 6.9)預平衡之20 ml HiPrep丁基FF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。用5 CV緩衝液D洗滌出自由PSA試劑。隨後，用100%緩衝液E(50 mM Hepes，pH 6.9)洗提結合物。藉由UF/DF/使用由再生纖維素製成之10 kD膜(88 cm2，截止10 kD/Millipore)濃縮含有結合物之洗提份。針對含有150 mM NaCl之組胺酸緩衝液(pH 6.9)進行最後透濾步驟。藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。對於PSA-普羅利亞結合物，與天然普羅利亞相比，測得比活性>50%。另外藉由尺寸排阻HPLC，使用裝備有Shodex KW 803管柱之Agilent 1200 HPLC系統，在如先前所述之條件(Kolarich等人,Transfusion 2006;46:1959-77)下以分析法特性化結合物。顯示製劑不含有自由普羅利亞。
方法4：
將普羅利亞溶解於或轉移至反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到1.0 +/- 0.25 mg/ml之最終蛋白質濃度。接著藉由逐滴添加0.5 N HCl水溶液將溶液之pH值校正至6.0。
隨後，在最多15分鐘之時段(t)內在輕輕攪拌下將50倍莫耳過量之胺氧基-聚唾液酸(PSA-ONH2)試劑添加至此普羅利亞溶液中。接著在15分鐘內添加間甲苯胺水溶液(50 mM)，得到10 mM之最終濃度。最後，添加40 mM過碘酸鈉水溶液，得到400 μM之濃度。
在T=+22 +/- 2℃之溫度(T)下在黑暗中在輕輕震盪下培育反應混合物120 +/- 10分鐘。接著藉由添加L-半胱胺酸水溶液(1 M)來中止反應，得到在反應混合物中10 mM之最終濃度並培育60 +/- 5分鐘。
藉由離子交換層析純化所得普羅利亞結合物。收集洗提液中含有PSA-普羅利亞的洗提份且藉由超濾/透濾(UF/DF)使用由再生纖維素製成之膜(Millipore)濃縮。
藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質、生物活性及藉由量測PSA含量(間苯二酚檢定)測定聚唾液酸化程度以分析法特性化使用此程序所製備之結合物。
實施例31 其他治療性蛋白質之聚唾液酸化
在替代性親核性催化劑(類似如本文所述之間甲苯胺或鄰胺基苯甲酸)存在下進行之聚唾液酸化反應可擴展至其他治療性蛋白質。舉例而言，在本發明之各種態樣中，對於治療性蛋白質(諸如本文所述之彼等蛋白質)重複如本文所述之以上使用PSA胺氧基或PEG胺氧基試劑的聚唾液酸化或聚乙二醇化反應。
實施例32 使用胺氧基-PEG試劑及作為親核性催化劑之間甲苯胺使EPO聚乙二醇化 方法1：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使紅血球生成素(EPO)聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將EPO溶解於7.0 ml組胺酸緩衝液(pH 6.0)(20 mM L-組胺酸、150 mM NaCl、5 mM CaCl2)中。接著添加過碘酸鈉水溶液(5 mM)且在4℃下在黑暗中在輕輕攪拌下培育反應混合物1小時，在室溫下藉由添加7.5 μl 1 M半胱胺酸水溶液來中止，持續15分鐘。隨後使用Vivaspin離心過濾器使混合物進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物。
接著將含有經氧化EPO之保留物與間甲苯胺水溶液(50 mM)混合且在室溫下培育30分鐘。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑，產生5倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育此混合物2.5小時。
最後，藉由離子交換層析(例如在Q瓊脂糖FF上)純化PEG-EPO結合物。舉例而言，將每毫升凝膠1.5 mg蛋白質加載於經含有5 mM CaCl2之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)平衡的管柱上。用含有5 mM CaCl2及500 mM氯化鈉之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)洗提結合物，接著使用適當MW截止膜進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法1。藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使EPO聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將10 mg EPO溶解於5 ml組胺酸緩衝液(pH 6.0)(20 mM L-組胺酸、150 mM NaCl)中。接著添加100 μl過碘酸鈉水溶液(5 mM)且在4℃下在黑暗中在輕輕攪拌下培育反應混合物1小時，在室溫下藉由添加50 μl 1 M半胱胺酸水溶液來中止，持續15分鐘。隨後使用Vivaspin 15R 10 kD離心過濾器使混合物進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物。
將含有經氧化EPO之保留物(約7 ml)與2 ml間甲苯胺水溶液(50 mM)混合且在室溫下培育30分鐘。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑(上述)，產生5倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育此混合物2.5小時。
最後，藉由離子交換層析，在Q瓊脂糖FF上純化PEG-EPO結合物。用20 ml緩衝液A(50 mM Hepes，pH 7.5)稀釋反應混合物且加載於經緩衝液A預平衡之20 ml HiPrep QFF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。接著用緩衝液B(50 mM Hepes、1 M NaCl，pH 7.5)洗提管柱。藉由用25%緩衝液B洗滌管柱來洗提自由EPO且用50%緩衝液B洗提結合物。藉由UF/DF/使用由再生纖維素製成之10 kD膜(88 cm2，截止10 kD/Millipore)濃縮含有結合物之洗提份。針對含有150 mM NaCl之組胺酸緩衝液(pH 7.2)進行最後透濾步驟。藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。對於PEG-EPO結合物，與天然EPO相比，測得比活性>50%。另外藉由尺寸排阻HPLC，使用裝備有Shodex KW 803管柱之Agilent 1200 HPLC系統，在如先前所述之條件(Kolarich等人,Transfusion 2006;46:1959-77)下以分析法特性化結合物。顯示製劑不含有自由EPO。
方法2：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使EPO聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。
將EPO轉移至或溶解於反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到1.0 +/- 0.25 mg/ml之最終蛋白質濃度。接著藉由逐滴添加0.5 N HCl水溶液將溶液之pH值校正至6.0。隨後在10分鐘內添加40 mM過碘酸鈉水溶液，得到200 μM之濃度。在T=+22 +/- 2℃之溫度(T)下進行氧化反應30 +/- 5分鐘。接著藉由在T=+22 +/- 2℃下在15分鐘內添加L-半胱胺酸水溶液(1 M)來中止反應，得到在反應混合物中10 mM之最終濃度並培育60 +/- 5分鐘。
藉由離子交換層析進一步純化經氧化EPO。收集洗提液中含有經氧化EPO的洗提份且用於結合反應。
隨後，在最多15分鐘之時段(t)內在輕輕攪拌下將MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑以50倍莫耳過量添加至含有經純化之經氧化EPO的洗提液中。接著在15分鐘內添加間甲苯胺水溶液(50 mM)，得到10 mM之最終濃度。在T=+22 +/- 2℃之溫度(T)下在黑暗中在輕輕震盪下培育反應混合物120 +/- 10分鐘。
藉由離子交換層析進一步純化所得PEG-EPO結合物。收集含有PEG-EPO結合物之洗提份並藉由超濾/透濾(UF/DF)使用由再生纖維素製成且具有適當分子量截止之膜(Millipore)濃縮。
藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質及生物活性以分析法特性化使用此程序所製備之結合物。
方法3：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使EPO聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將EPO溶解於Hepes緩衝液(50 mM Hepes、150 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且與過碘酸鈉水溶液(10 mM)及間甲苯胺水溶液(50 mM)混合。隨後添加胺氧基試劑，產生20倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且在室溫下藉由添加8 μl半胱胺酸水溶液(1 M)來中止，持續15分鐘。
最後，藉由離子交換層析，在Q瓊脂糖FF上純化PEG-EPO結合物。將每毫升凝膠1.5 mg蛋白質加載於經含有5 mM CaCl2之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)預平衡的管柱上。用含有5 mM CaCl2及500 mM氯化鈉之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)洗提結合物，接著使用膜進行UF/DF。藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法3。藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使EPO聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將10 mg EPO溶解於約8 ml組胺酸緩衝液(pH 6.0)(20 mM L-組胺酸、150 mM NaCl)中。接著添加200 μl過碘酸鈉水溶液(5 mM)及2 ml間甲苯胺水溶液(50 mM)。隨後添加MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑(上述)，產生5倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且在室溫下藉由添加100 μl 1 M半胱胺酸水溶液來中止，持續15分鐘。
最後，藉由離子交換層析，在Q瓊脂糖FF上純化PEG-EPO結合物。用20 ml緩衝液A(50 mM Hepes，pH 7.5)稀釋反應混合物且加載於經緩衝液A預平衡之20 ml HiPrep QFF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。接著用緩衝液B(50 mM Hepes、1 M NaCl，pH 7.5)洗提管柱。藉由用25%緩衝液B洗滌管柱來洗提自由EPO且用50%緩衝液B洗提結合物。藉由UF/DF/使用由再生纖維素製成之10 kD膜(88 cm2，截止10 kD/Millipore)濃縮含有結合物之洗提份。針對含有150 mM NaCl之組胺酸緩衝液(pH 7.2)進行最後透濾步驟。藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。對於PEG-EPO結合物，與天然EPO相比，測得比活性>50%。另外藉由尺寸排阻HPLC，使用裝備有Shodex KW 803管柱之Agilent 1200 HPLC系統，在如先前所述之條件(Kolarich等人,Transfusion 2006;46:1959-77)下以分析法特性化結合物。顯示製劑不含有自由EPO。
方法4：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使EPO聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司，Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將初始濃度或重量之EPO轉移至或溶解於Hepes緩衝液(50 mM Hepes、150 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到2 mg EPO/ml之最終蛋白質濃度。隨後在15分鐘內添加5 mM過碘酸鈉水溶液，得到100 μM之最終濃度，隨後在30分鐘之時段內添加50 mM間甲苯胺水溶液，得到10 mM之最終濃度。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑(上述)，產生20倍莫耳試劑過量。校正pH值至6.0後，在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且藉由添加1 M L-半胱胺酸水溶液以得到10 mM之最終濃度來中止，持續15分鐘。
藉助於離子交換層析(IEC)純化PEG-EPO結合物。藉由UF/DF，使用由再生纖維素製成之10 kD膜(88 cm2，截止10 kD/Millipore)濃縮洗提液中含有結合物的洗提份。針對Hepes緩衝液(50 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7.5)進行最後透濾步驟。
藉由根據已知方法量測總蛋白質(布萊德法及BCA程序)及生物活性以分析法特性化製劑。
實施例33 使用胺氧基-PEG試劑及作為親核性催化劑之間甲苯胺使Ang-2聚乙二醇化 方法1：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使Ang-2聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將Ang-2溶解於7.0 ml組胺酸緩衝液(pH 6.0)(20 mM L-組胺酸、150 mM NaCl、5 mM CaCl2)中。接著添加過碘酸鈉水溶液(5 mM)且在4℃下在黑暗中在輕輕攪拌下培育反應混合物1小時，在室溫下藉由添加7.5 μl 1 M半胱胺酸水溶液來中止，持續15分鐘。隨後使用Vivaspin離心過濾器使混合物進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物。
接著將含有經氧化Ang-2之保留物與間甲苯胺水溶液(50 mM)混合且在室溫下培育30分鐘。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑，產生5倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育此混合物2.5小時。
最後，藉由離子交換層析(例如在Q瓊脂糖FF上)純化PEG-Ang-2結合物。舉例而言，將每毫升凝膠1.5 mg蛋白質加載於經含有5 mM CaCl2之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)平衡的管柱上。用含有5 mM CaCl2及500 mM氯化鈉之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)洗提結合物，接著使用適當MW截止膜進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法1。藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使Ang-2聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將Ang-2溶解於7.0 ml組胺酸緩衝液(pH 6.0)(20 mM L-組胺酸、150 mM NaCl、5 mM CaCl2)中。接著添加過碘酸鈉水溶液(5 mM)且在4℃下在黑暗中在輕輕攪拌下培育反應混合物1小時，在室溫下藉由添加7.5 μl 1 M半胱胺酸水溶液來中止，持續15分鐘。隨後使用Vivaspin離心過濾器使混合物進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物。
接著將含有經氧化Ang-2之保留物與間甲苯胺水溶液(50 mM)混合且在室溫下培育30分鐘。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑，產生5倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育此混合物2.5小時。
最後，藉由離子交換層析純化PEG-Ang-2結合物。收集洗提液中含有結合物的洗提份，接著使用適當MW截止膜進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
方法2：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使Ang-2聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。
將Ang-2轉移至或溶解於反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到1.0 +/- 0.25 mg/ml之最終蛋白質濃度。接著藉由逐滴添加0.5 N HCl水溶液將溶液之pH值校正至6.0。隨後在10分鐘內添加40 mM過碘酸鈉水溶液，得到200 μM之濃度。在T=+22 +/- 2℃之溫度(T)下進行氧化反應30 +/- 5分鐘。接著藉由在T=+22 +/- 2℃下在15分鐘內添加L-半胱胺酸水溶液(1 M)來中止反應，得到在反應混合物中10 mM之最終濃度並培育60 +/- 5分鐘。
藉由離子交換層析進一步純化經氧化Ang-2。收集洗提液中含有經氧化Ang-2的洗提份且用於結合反應。
隨後，在最多15分鐘之時段(t)內在輕輕攪拌下將MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑以50倍莫耳過量添加至含有經純化之經氧化Ang-2的洗提液中。接著在15分鐘內添加間甲苯胺水溶液(50 mM)，得到10 mM之最終濃度。在T=+22 +/- 2℃之溫度(T)下在黑暗中在輕輕震盪下培育反應混合物120 +/- 10分鐘。
藉由離子交換層析進一步純化所得PEG-Ang-2結合物。收集含有PEG-Ang-2結合物之洗提份並藉由超濾/透濾(UF/DF)使用由再生纖維素製成且具有適當分子量截止之膜(Millipore)濃縮。
藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質及生物活性以分析法特性化使用此程序所製備之結合物。
方法3：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使Ang-2聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將Ang-2溶解於Hepes緩衝液(50 mM Hepes、150 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且與過碘酸鈉水溶液(10 mM)及間甲苯胺水溶液(50 mM)混合。隨後添加胺氧基試劑，產生20倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且在室溫下藉由添加8 μl半胱胺酸水溶液(1 M)來中止，持續15分鐘。
最後，藉由離子交換層析，在Q瓊脂糖FF上純化PEG-Ang-2結合物。將每毫升凝膠1.5 mg蛋白質加載於經含有5 mM CaCl2之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)預平衡的管柱上。用含有5 mM CaCl2及500 mM氯化鈉之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)洗提結合物，接著使用膜進行UF/DF。藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法3。藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使Ang-2聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo，Japan)之Sunbright CA系列。將Ang-2溶解於Hepes緩衝液(50 mM Hepes、150 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且與過碘酸鈉水溶液(10 mM)及間甲苯胺水溶液(50 mM)混合。隨後添加胺氧基試劑，產生20倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且在室溫下藉由添加8 μl半胱胺酸水溶液(1 M)來中止，持續15分鐘。
最後，藉由離子交換層析純化PEG-Ang-2結合物。收集洗提液中含有結合物的洗提份，接著進行UF/DF。藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
方法4：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使Ang-2聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司，Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將初始濃度或重量之Ang-2轉移至或溶解於Hepes緩衝液(50 mM Hepes、150 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到2 mg Ang-2/ml之最終蛋白質濃度。隨後在15分鐘內添加5 mM過碘酸鈉水溶液，得到100 μM之最終濃度，隨後在30分鐘之時段內添加50 mM間甲苯胺水溶液，得到10 mM之最終濃度。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑(上述)，產生20倍莫耳試劑過量。校正pH值至6.0後，在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且藉由添加1 M L-半胱胺酸水溶液以得到10 mM之最終濃度來中止，持續15分鐘。
藉助於離子交換層析(IEC)純化PEG-Ang-2結合物。藉由UF/DF，使用由再生纖維素製成之10 kD膜(88 cm2，截止10 kD/Millipore)濃縮洗提液中含有結合物的洗提份。針對Hepes緩衝液(50 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7.5)進行最後透濾步驟。
藉由根據已知方法量測總蛋白質(布萊德法及BCA程序)及生物活性以分析法特性化製劑。
隨後，藉助於離子交換層析(IEC)移除自由Ang-2。藉由UF/DF濃縮洗提液中含有結合物的洗提份。
實施例34 使用胺氧基-PEG試劑及作為親核性催化劑之間甲苯胺使VEGF聚乙二醇化 方法1：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使VEGF聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將VEGF溶解於7.0 ml組胺酸緩衝液(pH 6.0)(20 mM L-組胺酸、150 mM NaCl、5 mM CaCl2)中。接著添加過碘酸鈉水溶液(5 mM)且在4℃下在黑暗中在輕輕攪拌下培育反應混合物1小時，在室溫下藉由添加7.5 μl 1 M半胱胺酸水溶液來中止，持續15分鐘。隨後使用Vivaspin離心過濾器使混合物進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物。
接著將含有經氧化VEGF之保留物與間甲苯胺水溶液(50 mM)混合且在室溫下培育30分鐘。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑，產生5倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育此混合物2.5小時。
最後，藉由離子交換層析(例如在Q瓊脂糖FF上)純化PEG-VEGF結合物。舉例而言，將每毫升凝膠1.5 mg蛋白質加載於經含有5 mM CaCl2之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)平衡的管柱上。用含有5 mM CaCl2及500 mM氯化鈉之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)洗提結合物，接著使用適當MW截止膜進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法1。藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使VEGF聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將VEGF溶解於7.0 ml組胺酸緩衝液(pH 6.0)(20 mM L-組胺酸、150 mM NaCl、5 mM CaCl2)中。接著添加過碘酸鈉水溶液(5 mM)且在4℃下在黑暗中在輕輕攪拌下培育反應混合物1小時，在室溫下藉由添加7.5 μl 1 M半胱胺酸水溶液來中止，持續15分鐘。隨後使用Vivaspin離心過濾器使混合物進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物。
接著將含有經氧化VEGF之保留物與間甲苯胺水溶液(50 mM)混合且在室溫下培育30分鐘。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑，產生5倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育此混合物2.5小時。
最後，藉由離子交換層析純化PEG-VEGF結合物。收集洗提液中含有結合物的洗提份，接著使用適當MW截止膜進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
方法2：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使VEGF聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將VEGF轉移至或溶解於反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到1.0 +/- 0.25 mg/ml之最終蛋白質濃度。接著藉由逐滴添加0.5 N HCl水溶液將溶液之pH值校正至6.0。隨後在10分鐘內添加40 mM過碘酸鈉水溶液，得到200 μM之濃度。在T=+22 +/- 2℃之溫度(T)下進行氧化反應30 +/- 5分鐘。接著藉由在T=+22 +/- 2℃下在15分鐘內添加L-半胱胺酸水溶液(1 M)來中止反應，得到在反應混合物中10 mM之最終濃度並培育60 +/- 5分鐘。
藉由離子交換層析進一步純化經氧化VEGF。收集洗提液中含有經氧化VEGF的洗提份且用於結合反應。
隨後，在最多15分鐘之時段(t)內在輕輕攪拌下將MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑以50倍莫耳過量添加至含有經純化之經氧化VEGF的洗提液中。接著在15分鐘內添加間甲苯胺水溶液(50 mM)，得到10 mM之最終濃度。在T=+22 +/- 2℃之溫度(T)下在黑暗中在輕輕震盪下培育反應混合物120 +/- 10分鐘。
藉由離子交換層析進一步純化所得PEG-VEGF結合物。收集含有PEG-VEGF結合物之洗提份並藉由超濾/透濾(UF/DF)使用由再生纖維素製成且具有適當分子量截止之膜(Millipore)濃縮。
藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質及生物活性以分析法特性化使用此程序所製備之結合物。
方法3：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使VEGF聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將VEGF溶解於Hepes緩衝液(50 mM Hepes、150 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且與過碘酸鈉水溶液(10 mM)及間甲苯胺水溶液(50 mM)混合。隨後添加胺氧基試劑，產生20倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且在室溫下藉由添加8 μl半胱胺酸水溶液(1 M)來中止，持續15分鐘。
最後，藉由離子交換層析，在Q瓊脂糖FF上純化PEG-VEGF結合物。將每毫升凝膠1.5 mg蛋白質加載於經含有5 mM CaCl2之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)預平衡的管柱上。用含有5 mM CaCl2及500 mM氯化鈉之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)洗提結合物，接著使用膜進行UF/DF。藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法3。藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使VEGF聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將VEGF溶解於Hepes緩衝液(50 mM Hepes、150 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且與過碘酸鈉水溶液(10 mM)及間甲苯胺水溶液(50 mM)混合。隨後添加胺氧基試劑，產生20倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且在室溫下藉由添加8 μl半胱胺酸水溶液(1 M)來中止，持續15分鐘。
最後，藉由離子交換層析純化PEG-VEGF結合物。收集洗提液中含有結合物的洗提份，接著進行UF/DF。藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
方法4：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使VEGF聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將初始濃度或重量之VEGF轉移至或溶解於Hepes緩衝液(50 mM Hepes、150 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到2 mg VEGF/ml之最終蛋白質濃度。隨後，在15分鐘內添加5 mM過碘酸鈉水溶液，得到100 μM之最終濃度，隨後在30分鐘之時段內添加50 mM間甲苯胺水溶液，得到10 mM之最終濃度。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑(上述)，產生20倍莫耳試劑過量。校正pH值至6.0後，在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且藉由添加1 M L-半胱胺酸水溶液以得到10 mM之最終濃度來中止，持續15分鐘。
藉助於離子交換層析(IEC)純化PEG-VEGF結合物。藉由UF/DF，使用由再生纖維素製成之10 kD膜(88 cm2，截止10 kD/Millipore)濃縮洗提液中含有結合物的洗提份。針對Hepes緩衝液(50 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7.5)進行最後透濾步驟。
藉由根據已知方法量測總蛋白質(布萊德法及BCA程序)及生物活性以分析法特性化製劑。
實施例35 使用胺氧基-PEG試劑及作為親核性催化劑之間甲苯胺使EGF聚乙二醇化 方法1：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使EGF聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將EGF溶解於7.0 ml組胺酸緩衝液(pH 6.0)(20 mML-組胺酸、150 mM NaCl、5 mM CaCl2)中。接著添加過碘酸鈉水溶液(5 mM)且在4℃下在黑暗中在輕輕攪拌下培育反應混合物1小時，在室溫下藉由添加7.5 μl 1 M半胱胺酸水溶液來中止，持續15分鐘。隨後使用Vivaspin離心過濾器使混合物進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物。
接著將含有經氧化EGF之保留物與間甲苯胺水溶液(50 mM)混合且在室溫下培育30分鐘。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑，產生5倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育此混合物2.5小時。
最後，藉由離子交換層析(例如在Q瓊脂糖FF上)純化PEG-EGF結合物。舉例而言，將每毫升凝膠1.5 mg蛋白質加載於經含有5 mM CaCl2之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)平衡的管柱上。用含有5 mM CaCl2及500 mM氯化鈉之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)洗提結合物，接著使用適當MW截止膜進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法1。藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使EGF聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將EGF溶解於7.0 ml組胺酸緩衝液(pH 6.0)(20 mM L-組胺酸、150 mM NaCl、5 mM CaCl2)中。接著添加過碘酸鈉水溶液(5 mM)且在4℃下在黑暗中在輕輕攪拌下培育反應混合物1小時，在室溫下藉由添加7.5 μl 1 M半胱胺酸水溶液來中止，持續15分鐘。隨後使用Vivaspin離心過濾器使混合物進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物。
接著將含有經氧化EGF之保留物與間甲苯胺水溶液(50 mM)混合且在室溫下培育30分鐘。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑，產生5倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育此混合物2.5小時。
最後，藉由離子交換層析純化PEG-EGF結合物。收集洗提液中含有結合物的洗提份，接著使用適當MW截止膜進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
方法2：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使EGF聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司，Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將EGF轉移至或溶解於反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到1.0 +/- 0.25 mg/ml之最終蛋白質濃度。接著藉由逐滴添加0.5 N HCl水溶液將溶液之pH值校正至6.0。隨後在10分鐘內添加40 mM過碘酸鈉水溶液，得到200 μM之濃度。在T=+22 +/- 2℃之溫度(T)下進行氧化反應30 +/- 5分鐘。接著藉由在T=+22 +/- 2℃下在15分鐘內添加L-半胱胺酸水溶液(1 M)來中止反應，得到在反應混合物中10 mM之最終濃度並培育60 +/- 5分鐘。
藉由離子交換層析進一步純化經氧化EGF。收集洗提液中含有經氧化EGF的洗提份且用於結合反應。
隨後，在最多15分鐘之時段(t)內在輕輕攪拌下將MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑以50倍莫耳過量添加至含有經純化之經氧化NGF的洗提液中。接著在15分鐘內添加間甲苯胺水溶液(50 mM)，得到10 mM之最終濃度。在T=+22+/-2℃之溫度(T)下在黑暗中在輕輕震盪下培育反應混合物120+/-10分鐘。
藉由離子交換層析進一步純化所得PEG-EGF結合物。收集含有PEG-EGF結合物之洗提份並藉由超濾/透濾(UF/DF)使用由再生纖維素製成且具有適當分子量截止之膜(Millipore)濃縮。
藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質及生物活性以分析法特性化使用此程序所製備之結合物。
方法3：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使EGF聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將EGF溶解於Hepes緩衝液(50 mM Hepes、150 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且與過碘酸鈉水溶液(10 mM)及間甲苯胺水溶液(50 mM)混合。隨後添加胺氧基試劑，產生20倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且在室溫下藉由添加8 μl半胱胺酸水溶液(1 M)來中止，持續15分鐘。
最後，藉由離子交換層析，在Q-瓊脂糖FF上純化PEG-EGF結合物。將每毫升凝膠1.5 mg蛋白質加載於經含有5 mM CaCl2之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)預平衡的管柱上。用含有5 mM CaCl2及500 mM氯化鈉之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)洗提結合物，接著使用膜進行UF/DF。藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法3。藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使EGF聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將EGF溶解於Hepes緩衝液(50 mM Hepes、150 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且與過碘酸鈉水溶液(10 mM)及間甲苯胺水溶液(50 mM)混合。隨後添加胺氧基試劑，產生20倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且在室溫下藉由添加8 μl半胱胺酸水溶液(1 M)來中止，持續15分鐘。
最後，藉由離子交換層析純化PEG-EGF結合物。收集洗提液中含有結合物的洗提份，接著進行UF/DF。藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
方法4：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使EGF聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將初始濃度或重量之EGF轉移至或溶解於Hepes緩衝液(50 mM Hepes、150 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到2 mg EGF/ml之最終蛋白質濃度。隨後在15分鐘內添加5 mM過碘酸鈉水溶液，得到100 μM之最終濃度，隨後在30分鐘之時段內添加50 mM間甲苯胺水溶液，得到10 mM之最終濃度。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑(上述)，產生20倍莫耳試劑過量。校正pH值至6.0後，在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且藉由添加1 M L-半胱胺酸水溶液以得到10 mM之最終濃度來中止，持續15分鐘。
藉助於離子交換層析(IEC)純化PEG-EGF結合物。藉由UF/DF，使用由再生纖維素製成之10 kD膜(88 cm2，截止10 kD/Millipore)濃縮洗提液中含有結合物的洗提份。針對Hepes緩衝液(50 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7.5)進行最後透濾步驟。
藉由根據已知方法量測總蛋白質(布萊德法及BCA程序)及生物活性以分析法特性化製劑。
實施例36 使用胺氧基-PEG試劑及作為親核性催化劑之間甲苯胺使NGF聚乙二醇化 方法1：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使NGF聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將NGF溶解於7.0 ml 組胺酸緩衝液(pH 6.0)(20 mM L-組胺酸、150 mM NaCl、5 mM CaCl2)中。接著添加過碘酸鈉水溶液(5 mM)且在4℃下在黑暗中在輕輕攪拌下培育反應混合物1小時，在室溫下藉由添加7.5 μl 1 M半胱胺酸水溶液來中止，持續15分鐘。隨後使用Vivaspin離心過濾器使混合物進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物。
接著將含有經氧化NGF之保留物與間甲苯胺水溶液(50 mM)混合且在室溫下培育30分鐘。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑，產生5倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育此混合物2.5小時。
最後，藉由離子交換層析(例如在Q-瓊脂糖FF上)純化PEG-NGF結合物。舉例而言，將每毫升凝膠1.5 mg蛋白質加載於經含有5 mM CaCl2之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)平衡的管柱上。用含有5 mM CaCl2及500 mM氯化鈉之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)洗提結合物，接著使用適當MW截止膜進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法1。藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使NGF聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將NGF溶解於7.0 ml組胺酸緩衝液(pH 6.0)(20 mM L-組胺酸、150 mM NaCl、5 mM CaCl2)中。接著添加過碘酸鈉水溶液(5 mM)且在4℃下在黑暗中在輕輕攪拌下培育反應混合物1小時，在室溫下藉由添加7.5 μl 1 M半胱胺酸水溶液來中止，持續15分鐘。隨後使用Vivaspin離心過濾器使混合物進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物。
接著將含有經氧化NGF之保留物與間甲苯胺水溶液(50 mM)混合且在室溫下培育30分鐘。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑，產生5倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育此混合物2.5小時。
最後，藉由離子交換層析純化PEG-NGF結合物。收集洗提液中含有結合物的洗提份，接著使用適當MW截止膜進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
方法2：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使NGF聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將NGF轉移至或溶解於反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25 mg/ml之最終蛋白質濃度。接著藉由逐滴添加0.5 N HCl水溶液將溶液之pH值校正至6.0。隨後在10分鐘內添加40 mM過碘酸鈉水溶液，得到200 μM之濃度。在T=+22+/-2℃之溫度(T)下進行氧化反應30+/-5分鐘。接著藉由在T=+22+/-2℃下在15分鐘內添加L-半胱胺酸水溶液(1 M)來中止反應，得到在反應混合物中10 mM之最終濃度並培育60+/-5分鐘。
藉由離子交換層析進一步純化經氧化NGF。收集洗提液中含有經氧化NGF的洗提份且用於結合反應。
隨後，在最多15分鐘之時段(t)內在輕輕攪拌下將MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑以50倍莫耳過量添加至含有經純化之經氧化NGF的洗提液中。接著在15分鐘內添加間甲苯胺水溶液(50 mM)，得到10 mM之最終濃度。在T=+22+/-2℃之溫度(T)下在黑暗中在輕輕震盪下培育反應混合物120+/-10分鐘。
藉由離子交換層析進一步純化所得PEG-NGF結合物。收集含有PEG-NGF結合物之洗提份並藉由超濾/透濾(UF/DF)使用由再生纖維素製成且具有適當分子量截止之膜(Millipore)濃縮。
藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質及生物活性以分析法特性化使用此程序所製備之結合物。
方法3：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使NGF聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將NGF溶解於Hepes緩衝液(50 mM Hepes、150 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且與過碘酸鈉水溶液(10 mM)及間甲苯胺水溶液(50 mM)混合。隨後添加胺氧基試劑，產生20倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且在室溫下藉由添加8 μl半胱胺酸水溶液(1 M)來中止，持續15分鐘。
最後，藉由離子交換層析，在Q瓊脂糖FF上純化PEG-NGF結合物。將每毫升凝膠1.5 mg蛋白質加載於經含有5 mM CaCl2之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)預平衡的管柱上。用含有5 mM CaCl2及500 mM氯化鈉之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)洗提結合物，接著使用膜進行UF/DF。藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法3。藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使NGF聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將NGF溶解於Hepes緩衝液(50 mM Hepes、150 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且與過碘酸鈉水溶液(10 mM)及間甲苯胺水溶液(50 mM)混合。隨後添加胺氧基試劑，產生20倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且在室溫下藉由添加8 μl半胱胺酸水溶液(1 M)來中止，持續15分鐘。
最後，藉由離子交換層析純化PEG-NGF結合物。收集含有結合物之洗提份，接著進行UF/DF。藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
方法4：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使NGF聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將初始濃度或重量之NGF轉移至或溶解於Hepes緩衝液(50 mM Hepes、150 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到2 mg NGF/ml之最終蛋白質濃度。隨後在15分鐘內添加5 mM過碘酸鈉水溶液，得到100 μM之最終濃度，隨後在30分鐘之時段內添加50 mM間甲苯胺水溶液，得到10 mM之最終濃度。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑(上述)，產生20倍莫耳試劑過量。校正pH值至6.0後，在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且藉由添加1 M L-半胱胺酸水溶液以得到10 mM之最終濃度來中止，持續15分鐘。
藉助於離子交換層析(IEC)純化PEG-NGF結合物。藉由UF/DF，使用由再生纖維素製成之10 kD膜(88 cm2，截止10 kD/Millipore)濃縮洗提液中含有結合物的洗提份。針對Hepes緩衝液(50 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7.5)進行最後透濾步驟。
藉由根據已知方法量測總蛋白質(布萊德法及BCA程序)及生物活性以分析法特性化製劑。
實施例37 使用胺氧基-PEG試劑及作為親核性催化劑之間甲苯胺使HGH聚乙二醇化 方法1：
如本文所述，人類生長激素(HGH)之胺基酸序列首先經修飾為併有至少一個糖基化部位。純化後，根據此項技術中已知之方法試管內使HGH糖基化。
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使HGH聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將HGH溶解於7.0 ml組胺酸緩衝液(pH 6.0)(20 mM L-組胺酸、150 mM NaCl、5 mM CaCl2)中。接著添加過碘酸鈉水溶液(5 mM)且在4℃下在黑暗中在輕輕攪拌下培育反應混合物1小時，在室溫下藉由添加7.5 μl 1 M半胱胺酸水溶液來中止，持續15分鐘。隨後使用Vivaspin離心過濾器使混合物進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物。
接著將含有經氧化HGH之保留物與間甲苯胺水溶液(50 mM)混合且在室溫下培育30分鐘。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑，產生5倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育此混合物2.5小時。
最後，藉由離子交換層析(例如在Q瓊脂糖FF上)純化PEG-HGH結合物。舉例而言，將每毫升凝膠1.5 mg蛋白質加載於經含有5 mM CaCl2之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)平衡的管柱上。用含有5 mM CaCl2及500 mM氯化鈉之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)洗提結合物，接著使用適當MW截止膜進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在替代性具體實例中，如下進行方法1。如本文所述，人類生長激素(HGH)之胺基酸序列首先經修飾為併有至少一個糖基化部位。純化後，根據此項技術中已知之方法試管內使HGH糖基化。
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使HGH聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將HGH溶解於7.0 ml組胺酸緩衝液(pH 6.0)(20 mM L-組胺酸、150 mM NaCl、5 mM CaCl2)中。接著添加過碘酸鈉水溶液(5 mM)且在4℃下在黑暗中在輕輕攪拌下培育反應混合物1小時，在室溫下藉由添加7.5 μl 1 M半胱胺酸水溶液來中止，持續15分鐘。隨後使用Vivaspin離心過濾器使混合物進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物。
接著將含有經氧化HGH之保留物與間甲苯胺水溶液(50 mM)混合且在室溫下培育30分鐘。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑，產生5倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育此混合物2.5小時。
最後，藉由離子交換層析純化PEG-HGH結合物。收集洗提液中含有結合物的洗提份，接著使用適當MW截止膜進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
方法2：
如本文所述，人類生長激素(HGH)之胺基酸序列首先經修飾為併有至少一個糖基化部位。純化後，根據此項技術中已知之方法試管內使HGH糖基化。
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使HGH聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將HGH轉移至或溶解於反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25 mg/ml之最終蛋白質濃度。接著藉由逐滴添加0.5 N HCl水溶液將溶液之pH值校正至6.0。隨後在10分鐘內添加40 mM過碘酸鈉水溶液，得到200 μM之濃度。在T=+22+/-2℃之溫度(T)下進行氧化反應30+/-5分鐘。接著藉由在T=+22+/-2℃下在15分鐘內添加L-半胱胺酸水溶液(1M)來中止反應，得到在反應混合物中10 mM之最終濃度並培育60+/-5分鐘。
藉由離子交換層析進一步純化經氧化HGH。收集洗提液中含有經氧化HGH的洗提份且用於結合反應。
隨後，在最多15分鐘之時段(t)內在輕輕攪拌下將MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑以50倍莫耳過量添加至含有經純化之經氧化HGH的洗提液中。接著在15分鐘內添加間甲苯胺水溶液(50 mM)，得到10 mM之最終濃度。在T=+22+/-2℃之溫度(T)下在黑暗中在輕輕震盪下培育反應混合物120 +/- 10分鐘。
藉由離子交換層析進一步純化所得PEG-HGH結合物。收集含有PEG-NGF結合物之洗提份並藉由超濾/透濾(UF/DF)使用由再生纖維素製成且具有適當分子量截止之膜(Millipore)濃縮。
藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質及生物活性以分析法特性化使用此程序所製備之結合物。
方法3：
如本文所述，人類生長激素(HGH)之胺基酸序列首先經修飾為併有至少一個糖基化部位。純化後，根據此項技術中已知之方法試管內使HGH糖基化。
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使HGH聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將HGH溶解於Hepes緩衝液(50 mM Hepes、150 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且與過碘酸鈉水溶液(10 mM)及間甲苯胺水溶液(50 mM)混合。隨後添加胺氧基試劑，產生20倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且在室溫下藉由添加8 μl半胱胺酸水溶液(1 M)來中止，持續15分鐘。
最後，藉由離子交換層析，在Q-瓊脂糖FF上純化PEG-HGH結合物。將每毫升凝膠1.5 mg蛋白質加載於經含有5 mM CaCl2之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)預平衡的管柱上。用含有5 mM CaCl2及500 mM氯化鈉之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)洗提結合物，接著使用膜進行UF/DF。藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法3。如本文所述，人類生長激素(HGH)之胺基酸序列首先經修飾為併有至少一個糖基化部位。純化後，根據此項技術中已知之方法試管內使HGH糖基化。藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使HGH聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將HGH溶解於Hepes緩衝液(50 mM Hepes、150 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且與過碘酸鈉水溶液(10 mM)及間甲苯胺水溶液(50 mM)混合。隨後添加胺氧基試劑，產生20倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且在室溫下藉由添加8 μl半胱胺酸水溶液(1 M)來中止，持續15分鐘。
最後，藉由離子交換層析純化PEG-HGH結合物。收集含有結合物之洗提份，接著進行UF/DF。藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
方法4：
如本文所述，人類生長激素(HGH)之胺基酸序列首先經修飾為併有至少一個糖基化部位。純化後，根據此項技術中已知之方法試管內使HGH糖基化。
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使HGH聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將初始濃度或重量之HGH轉移至或溶解於Hepes緩衝液(50 mM Hepes、150 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到2 mg HGH/ml之最終蛋白質濃度。隨後在15分鐘內添加5 mM過碘酸鈉水溶液，得到100 μM之最終濃度，隨後在30分鐘之時段內添加50 mM間甲苯胺水溶液，得到10 mM之最終濃度。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑(上述)，產生20倍莫耳試劑過量。校正pH值至6.0後，在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且藉由添加1 M L-半胱胺酸水溶液以得到10 mM之最終濃度來中止，持續15分鐘。
藉助於離子交換層析(IEC)純化PEG-HGH結合物。藉由UF/DF，使用由再生纖維素製成之10 kD膜(88 cm2，截止10 kD/Millipore)濃縮洗提液中含有結合物的洗提份。針對Hepes緩衝液(50 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7.5)進行最後透濾步驟。
藉由根據已知方法量測總蛋白質(布萊德法及BCA程序)及生物活性以分析法特性化製劑。
實施例38 使用胺氧基-PEG試劑及作為親核性催化劑之間甲苯胺使TNF-α聚乙二醇化 方法1：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使TNF-α聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將TNF-α溶解於7.0 ml組胺酸緩衝液(pH 6.0)(20 mM L-組胺酸、150 mM NaCl、5 mM CaCl2)中。接著添加過碘酸鈉水溶液(5 mM)且在4℃下在黑暗中在輕輕攪拌下培育反應混合物1小時，在室溫下藉由添加7.5 μl 1 M半胱胺酸水溶液來中止，持續15分鐘。隨後使用Vivaspin離心過濾器使混合物進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物。
接著將含有經氧化TNF-α之保留物與間甲苯胺水溶液(50 mM)混合且在室溫下培育30分鐘。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑，產生5倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育此混合物2.5小時。
最後，藉由離子交換層析(例如在Q-瓊脂糖FF上)純化PEG-TNF-α結合物。舉例而言，將每毫升凝膠1.5 mg蛋白質加載於經含有5 mM CaCl2之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)平衡的管柱上。用含有5 mM CaCl2及500 mM氯化鈉之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)洗提結合物，接著使用適當MW截止膜進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法1。藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使TNF-α聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將TNF-α溶解於7.0 ml組胺酸緩衝液(pH 6.0)(20 mM L-組胺酸、150 mM NaCl、5 mM CaCl2)中。接著添加過碘酸鈉水溶液(5 mM)且在4℃下在黑暗中在輕輕攪拌下培育反應混合物1小時，在室溫下藉由添加7.5 μl 1 M半胱胺酸水溶液來中止，持續15分鐘。隨後使用Vivaspin離心過濾器使混合物進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物。
接著將含有經氧化TNF-α之保留物與間甲苯胺水溶液(50 mM)混合且在室溫下培育30分鐘。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑，產生5倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育此混合物2.5小時。
最後，藉由離子交換層析純化PEG-TNF-α結合物。收集洗提液中含有結合物的洗提份，接著使用適當MW截止膜進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
方法2：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使TNF-α聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將TNF-α轉移至或溶解於反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到1.0 +/- 0.25 mg/ml之最終蛋白質濃度。接著藉由逐滴添加0.5 N HCl水溶液將溶液之pH值校正至6.0。隨後在10分鐘內添加40 mM過碘酸鈉水溶液，得到200 μM之濃度。在T=+22 +/- 2℃之溫度(T)下進行氧化反應30 +/- 5分鐘。接著藉由在T=+22 +/- 2℃下在15分鐘內添加L-半胱胺酸水溶液(1 M)來中止反應，得到在反應混合物中10 mM之最終濃度並培育60 +/- 5分鐘。
藉由離子交換層析進一步純化經氧化TNF-α。收集洗提液中含有經氧化TNF-α的洗提份且用於結合反應。
隨後，在最多15分鐘之時段(t)內在輕輕攪拌下將MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑以50倍莫耳過量添加至含有經純化之經氧化TNF α的洗提液中。接著在15分鐘內添加間甲苯胺水溶液(50 mM)，得到10 mM之最終濃度。在T=+22 +/- 2℃之溫度(T)下在黑暗中在輕輕震盪下培育反應混合物120 +/- 10分鐘。
藉由離子交換層析進一步純化所得PEG-TNF-α結合物。收集含有PEG-TNF-α結合物之洗提份並藉由超濾/透濾(UF/DF)使用由再生纖維素製成且具有適當分子量截止之膜(Millipore)濃縮。
藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質及生物活性以分析法特性化使用此程序所製備之結合物。
方法3：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使TNF-α聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將TNF-α溶解於Hepes緩衝液(50 mM Hepes、150 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且與過碘酸鈉水溶液(10 mM)及間甲苯胺水溶液(50 mM)混合。隨後添加胺氧基試劑，產生20倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且在室溫下藉由添加8 μl半胱胺酸水溶液(1 M)來中止，持續15分鐘。
最後，藉由離子交換層析，在Q-瓊脂糖FF上純化PEG-TNF-α結合物。將每毫升凝膠1.5 mg蛋白質加載於經含有5 mM CaCl2之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)預平衡的管柱上。用含有5 mM CaCl2及500 mM氯化鈉之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)洗提結合物，接著使用膜進行UF/DF。藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法3。藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使TNF-α聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將TNF-α溶解於Hepes緩衝液(50 mM Hepes、150 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且與過碘酸鈉水溶液(10 mM)及間甲苯胺水溶液(50 mM)混合。隨後添加胺氧基試劑，產生20倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且在室溫下藉由添加8 μl半胱胺酸水溶液(1 M)來中止，持續15分鐘。
最後，藉由離子交換層析純化PEG-TNF-α結合物。收集含有結合物之洗提份，接著進行UF/DF。藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
方法4：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使TNF-α聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將初始濃度或重量之TNF-α轉移至或溶解於Hepes緩衝液(50 mM Hepes、150 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到2 mg TNF-α/ml之最終蛋白質濃度。隨後，在15分鐘內添加5 mM過碘酸鈉水溶液，得到100 μM之最終濃度，隨後在30分鐘之時段內添加50 mM間甲苯胺水溶液，得到10 mM之最終濃度。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑(上述)，產生20倍莫耳試劑過量。校正pH值至6.0後，在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且藉由添加1 M L-半胱胺酸水溶液以得到10 mM之最終濃度來中止，持續15分鐘。
藉助於離子交換層析(IEC)純化PEG-TNF-α結合物。藉由UF/DF，使用由再生纖維素製成之10 kD膜(88 cm2，截止10 kD/Millipore)濃縮洗提液中含有結合物的洗提份。針對Hepes緩衝液(50 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7.5)進行最後透濾步驟。
藉由根據已知方法量測總蛋白質(布萊德法及BCA程序)及生物活性以分析法特性化製劑。
實施例39 使用胺氧基-PEG試劑及作為親核性催化劑之間甲苯胺使胰島素聚乙二醇化 方法1：
如本文所述，胰島素之胺基酸序列首先經修飾為併有至少一個糖基化部位。純化後，根據此項技術中已知之方法試管內使胰島素糖基化。藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使胰島素聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將胰島素溶解於7.0 ml組胺酸緩衝液(pH 6.0)(20 mM L-組胺酸、150 mM NaCl、5 mM CaCl2)中。接著添加過碘酸鈉水溶液(5 mM)且在4℃下在黑暗中在輕輕攪拌下培育反應混合物1小時，在室溫下藉由添加7.5 μl 1 M半胱胺酸水溶液來中止，持續15分鐘。隨後使用Vivaspin離心過濾器使混合物進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物。
接著將含有經氧化胰島素之保留物與間甲苯胺水溶液(50 mM)混合且在室溫下培育30分鐘。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑，產生5倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育此混合物2.5小時。
最後，藉由離子交換層析(例如在Q-瓊脂糖FF上)純化PEG-胰島素結合物。舉例而言，將每毫升凝膠1.5 mg蛋白質加載於經含有5 mM CaCl2之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)平衡的管柱上。用含有5 mM CaCl2及500 mM氯化鈉之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)洗提結合物，接著使用適當MW截止膜進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法1。如本文所述，胰島素之胺基酸序列首先經修飾為併有至少一個糖基化部位。純化後，根據此項技術中已知之方法試管內使胰島素糖基化。藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使胰島素聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將胰島素溶解於7.0 ml組胺酸緩衝液(pH 6.0)(20 mM L-組胺酸、150 mM NaCl、5 mM CaCl2)中。接著添加過碘酸鈉水溶液(5 mM)且在4℃下在黑暗中在輕輕攪拌下培育反應混合物1小時，在室溫下藉由添加7.5 μl 1 M半胱胺酸水溶液來中止，持續15分鐘。隨後使用Vivaspin離心過濾器使混合物進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物。
接著將含有經氧化胰島素之保留物與間甲苯胺水溶液(50 mM)混合且在室溫下培育30分鐘。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑，產生5倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育此混合物2.5小時。
最後，藉由離子交換層析純化PEG-胰島素結合物。收集洗提液中含有結合物的洗提份，接著使用適當MW截止膜進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
方法2：
如本文所述，胰島素之胺基酸序列首先經修飾為併有至少一個糖基化部位。純化後，根據此項技術中已知之方法試管內使胰島素糖基化。
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使胰島素聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將胰島素轉移至或溶解於反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到1.0 +/- 0.25 mg/ml之最終蛋白質濃度。接著藉由逐滴添加0.5 N HCl水溶液將溶液之pH值校正至6.0。隨後在10分鐘內添加40 mM過碘酸鈉水溶液，得到200 μM之濃度。在T=+22 +/- 2℃之溫度(T)下進行氧化反應30 +/- 5分鐘。接著藉由在T=+22 +/- 2℃下在15分鐘內添加L-半胱胺酸水溶液(1 M)來中止反應，得到在反應混合物中10 mM之最終濃度並培育60 +/- 5分鐘。
藉由離子交換層析進一步純化經氧化胰島素。收集洗提液中含有經氧化胰島素的洗提份且用於結合反應。
隨後，在最多15分鐘之時段(t)內在輕輕攪拌下將MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑以50倍莫耳過量添加至含有經純化之經氧化胰島素的洗提液中。接著在15分鐘內添加間甲苯胺水溶液(50 mM)，得到10 mM之最終濃度。在T=+22+/-2℃之溫度(T)下在黑暗中在輕輕震盪下培育反應混合物120+/-10分鐘。
藉由離子交換層析進一步純化所得PEG-胰島素結合物。收集含有PEG-胰島素結合物之洗提份並藉由超濾/透濾(UF/DF)使用由再生纖維素製成且具有適當分子量截止之膜(Millipore)濃縮。
藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質及生物活性以分析法特性化使用此程序所製備之結合物。
方法3：
如本文所述，胰島素之胺基酸序列首先經修飾為併有至少一個糖基化部位。純化後，根據此項技術中已知之方法試管內使胰島素糖基化。
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使胰島素聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將胰島素溶解於Hepes緩衝液(50 mM Hepes、150 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且與過碘酸鈉水溶液(10 mM)及間甲苯胺水溶液(50 mM)混合。隨後添加胺氧基試劑，產生20倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且在室溫下藉由添加8 μl半胱胺酸水溶液(1 M)來中止，持續15分鐘。
最後，藉由離子交換層析，在Q瓊脂糖FF上純化PEG-胰島素結合物。將每毫升凝膠1.5 mg蛋白質加載於經含有5 mM CaCl2之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)預平衡的管柱上。用含有5 mM CaCl2及500 mM氯化鈉之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)洗提結合物，接著使用膜進行UF/DF。藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法3。如本文所述，胰島素之胺基酸序列首先經修飾為併有至少一個糖基化部位。純化後，根據此項技術中已知之方法試管內使胰島素糖基化。藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使胰島素聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將胰島素溶解於Hepes緩衝液(50 mM Hepes、150 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且與過碘酸鈉水溶液(10 mM)及間甲苯胺水溶液(50 mM)混合。隨後添加胺氧基試劑，產生20倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且在室溫下藉由添加8 μl半胱胺酸水溶液(1 M)來中止，持續15分鐘。
最後，藉由離子交換層析純化PEG-胰島素結合物。收集含有結合物之洗提份，接著進行UF/DF。藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
方法4：
如本文所述，胰島素之胺基酸序列首先經修飾為併有至少一個糖基化部位。純化後，根據此項技術中已知之方法試管內使胰島素糖基化。
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使胰島素聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將初始濃度或重量之胰島素轉移至或溶解於Hepes緩衝液(50 mM Hepes、150 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到2 mg胰島素-α/ml之最終蛋白質濃度。隨後在15分鐘內添加5 mM過碘酸鈉水溶液，得到100 μM之最終濃度，隨後在30分鐘之時段內添加50 mM間甲苯胺水溶液，得到10 mM之最終濃度。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑(上述)，產生20倍莫耳試劑過量。校正pH值至6.0後，在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且藉由添加1 M L-半胱胺酸水溶液以得到10 mM之最終濃度來中止，持續15分鐘。
藉助於離子交換層析(IEC)純化PEG-胰島素結合物。藉由UF/DF，使用由再生纖維素製成之10 kD膜(88 cm2，截止10 kD/Millipore)濃縮洗提液中含有結合物的洗提份。針對Hepes緩衝液(50 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7.5)進行最後透濾步驟。
藉由根據已知方法量測總蛋白質(布萊德法及BCA程序)及生物活性以分析法特性化製劑。
實施例40 使用胺氧基-PEG試劑及作為親核性催化劑之間甲苯胺使干擾素-α聚乙二醇化 方法1：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使干擾素-α聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將干擾素-α溶解於7.0 ml組胺酸緩衝液(pH 6.0)(20 mM L-組胺酸、150 mM NaCl、5 mM CaCl2)中。接著添加過碘酸鈉水溶液(5 mM)且在4℃下在黑暗中在輕輕攪拌下培育反應混合物1小時，在室溫下藉由添加7.5 μl 1 M半胱胺酸水溶液來中止，持續15分鐘。隨後使用Vivaspin離心過濾器使混合物進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物。
接著將含有經氧化干擾素-α之保留物與間甲苯胺水溶液(50 mM)混合且在室溫下培育30分鐘。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑，產生5倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育此混合物2.5小時。
最後，藉由離子交換層析(例如在Q-瓊脂糖FF上)純化PEG-干擾素-α結合物。舉例而言，將每毫升凝膠1.5 mg蛋白質加載於經含有5 mM CaCl2之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)平衡的管柱上。用含有5 mM CaCl2及500 mM氯化鈉之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)洗提結合物，接著使用適當MW截止膜進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法1。藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使干擾素-α聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將干擾素-α溶解於7.0 ml組胺酸緩衝液(pH 6.0)(20 mM L-組胺酸、150 mM NaCl、5 mM CaCl2)中。接著添加過碘酸鈉水溶液(5 mM)且在4℃下在黑暗中在輕輕攪拌下培育反應混合物1小時，在室溫下藉由添加7.5 μl 1 M半胱胺酸水溶液來中止，持續15分鐘。隨後使用Vivaspin離心過濾器使混合物進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物。
接著將含有經氧化干擾素-α之保留物與間甲苯胺水溶液(50 mM)混合且在室溫下培育30分鐘。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑，產生5倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育此混合物2.5小時。
最後，藉由離子交換層析純化PEG-干擾素-α結合物。收集含有結合物之洗提份，接著使用適當MW截止膜進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
方法2：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使干擾素-α聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japin)之Sunbright CA系列。將干擾素-α轉移至或溶解於反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25 mg/ml之最終蛋白質濃度。接著藉由逐滴添加0.5 N HCl水溶液將溶液之pH值校正至6.0。隨後在10分鐘內添加40 mM過碘酸鈉水溶液，得到200 μM之濃度。在T=+22+/-2℃之溫度(T)下進行氧化反應30+/-5分鐘。接著藉由在T=+22+/-2℃下在15分鐘內添加L-半胱胺酸水溶液(1 M)來中止反應，得到在反應混合物中10 mM之最終濃度並培育60+/-5分鐘。
藉由離子交換層析進一步純化經氧化干擾素-α。收集洗提液中含有經氧化干擾素-α的洗提份且用於結合反應。
隨後，在最多15分鐘之時段(t)內在輕輕攪拌下將MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑以50倍莫耳過量添加至含有經純化之經氧化干擾素-α的洗提液中。接著在15分鐘內添加間甲苯胺水溶液(50 mM)，得到10 mM之最終濃度。在T=+22+/-2℃之溫度(T)下在黑暗中在輕輕震盪下培育反應混合物120+/-10分鐘。
藉由離子交換層析進一步純化所得PEG-干擾素-α結合物。收集含有PEG-干擾素α結合物之洗提份並藉由超濾/透濾(UF/DF)使用由再生纖維素製成且具有適當分子量截止之膜(Millipore)濃縮。
藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質及生物活性以分析法特性化使用此程序所製備之結合物。
方法3：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使干擾素-α聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將干擾素-α溶解於Hepes緩衝液(50 mM Hepes、150 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且與過碘酸鈉水溶液(10 mM)及間甲苯胺水溶液(50 mM)混合。隨後添加胺氧基試劑，產生20倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且在室溫下藉由添加8 μl半胱胺酸水溶液(1 M)來中止，持續15分鐘。
最後，藉由離子交換層析，在Q-瓊脂糖FF上純化PEG-干擾素-α結合物。將每毫升凝膠1.5 mg蛋白質加載於經含有5 mM CaCl2之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)預平衡的管柱上。用含有5 mM CaCl2及500 mM氯化鈉之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)洗提結合物，接著使用膜進行UF/DF。藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法3。藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使干擾素-α聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將干擾素-α溶解於Hepes緩衝液(50 mM Hepes、150 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且與過碘酸鈉水溶液(10 mM)及間甲苯胺水溶液(50 mM)混合。隨後添加胺氧基試劑，產生20倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且在室溫下藉由添加8 μl半胱胺酸水溶液(1 M)來中止，持續15分鐘。
最後，藉由離子交換層析純化PEG-干擾素-α結合物。收集含有結合物之洗提份，接著使用膜進行UF/DF。藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
方法4：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使干擾素-α聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將初始濃度或重量之干擾素-α轉移至或溶解於Hepes緩衝液(50 mM Hepes、150 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到2 mg干擾素-α/ml之最終蛋白質濃度。隨後，在15分鐘內添加5 mM過碘酸鈉水溶液，得到100 μM之最終濃度，隨後在30分鐘之時段內添加50 mM間甲苯胺水溶液，得到10 mM之最終濃度。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑(上述)，產生20倍莫耳試劑過量。校正pH值至6.0後，在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且藉由添加1 M L-半胱胺酸水溶液以得到10 mM之最終濃度來中止，持續15分鐘。
藉助於離子交換層析(IEC)純化PEG-干擾素-α結合物。藉由UF/DF，使用由再生纖維素製成之10 kD膜(88 cm2，截止10 kD/Millipore)濃縮洗提液中含有結合物的洗提份。針對Hepes緩衝液(50 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7.5)進行最後透濾步驟。
藉由根據已知方法量測總蛋白質(布萊德法及BCA程序)及生物活性以分析法特性化製劑。
實施例41 使用胺氧基-PEG試劑及作為親核性催化劑之間甲苯胺使干擾素-γ聚乙二醇化 方法1：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使干擾素-γ聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將10 mg干擾素-γ溶解於5 ml組胺酸緩衝液(pH 6.0)(20 mM L-組胺酸、150 mM NaCl)中。接著添加100 μl過碘酸鈉水溶液(5 mM)且在4℃下在黑暗中在輕輕攪拌下培育反應混合物1小時，在室溫下藉由添加50 μl 1 M半胱胺酸水溶液來中止，持續15分鐘。隨後使用Vivaspin 15R 10 kD離心過濾器使混合物進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物。
將含有經氧化干擾素-γ之保留物(約7 ml)與2 ml間甲苯胺水溶液(50 mM)混合且在室溫下培育30分鐘。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑(上述)，產生5倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育此混合物2.5小時。
最後，藉由離子交換層析，在SP瓊脂糖FF上純化PEG-干擾素-γ結合物。用20 ml緩衝液A(50 mM Hepes，pH 6.5)稀釋反應混合物且加載於經緩衝液A預平衡之20 ml HiPrep SPFF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。接著用緩衝液B(50 mM Hepes、1 M NaCl，pH 6.5)洗提管柱。藉由用25%緩衝液B洗滌管柱來洗提自由干擾素-γ且用50%緩衝液B洗提結合物。藉由UF/DF/使用由再生纖維素製成之10 kD膜(88 cm2，截止10 kD/Millipore)濃縮含有結合物之洗提份。針對含有150 mM NaCl之組胺酸緩衝液(pH 6.9)進行最後透濾步驟。藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。對於PSA-干擾素-γ結合物，與天然干擾素γ相比，測得比活性>50%。另外藉由尺寸排阻HPLC，使用裝備有Shodex KW 803管柱之Agilent 1200 HPLC系統，在如先前所述之條件(Kolarich等人,Transfusion 2006;46:1959-77)下以分析法特性化結合物。顯示製劑不含有自由干擾素-γ。
方法2：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使干擾素-γ聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將干擾素-γ轉移至或溶解於反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到1.0 +/- 0.25 mg/ml之最終蛋白質濃度。接著藉由逐滴添加0.5 N HCl水溶液將溶液之pH值校正至6.0。隨後在10分鐘內添加40 mM過碘酸鈉水溶液，得到200 μM之濃度。在T=+22 +/- 2℃之溫度(T)下進行氧化反應30 +/- 5分鐘。接著藉由在T=+22 +/- 2℃下在15分鐘內添加L-半胱胺酸水溶液(1 M)來中止反應，得到在反應混合物中10 mM之最終濃度並培育60 +/- 5分鐘。
藉由離子交換層析進一步純化經氧化干擾素-γ。收集洗提液中含有經氧化干擾素-γ的洗提份且用於結合反應。
隨後，在最多15分鐘之時段(t)內在輕輕攪拌下將MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑以50倍莫耳過量添加至含有經純化之經氧化干擾素-γ的洗提液中。接著在15分鐘內添加間甲苯胺水溶液(50 mM)，得到10 mM之最終濃度。在T=+22 +/- 2℃之溫度(T)下在黑暗中在輕輕震盪下培育反應混合物120 +/- 10分鐘。
藉由離子交換層析進一步純化所得PEG-干擾素-γ結合物。收集含有PEG-干擾素-γ結合物之洗提份並藉由超濾/透濾(UF/DF)使用由再生纖維素製成且具有適當分子量截止之膜(Millipore)濃縮。
藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質及生物活性以分析法特性化使用此程序所製備之結合物。
方法3：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使干擾素-γ聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將10 mg干擾素-γ溶解於約8 ml組胺酸緩衝液(pH 6.0)(20 mM L-組胺酸、150 mM NaCl)中。接著添加200 μl過碘酸鈉水溶液(5 mM)及2 ml間甲苯胺水溶液(50 mM)。隨後添加MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑(上述)，產生5倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且在室溫下藉由添加100 μl 1 M半胱胺酸水溶液來中止，持續15分鐘。
最後，藉由離子交換層析，在SP-瓊脂糖FF上純化PEG-干擾素-γ結合物。用20 ml緩衝液A(50 mM Hepes，pH 6.5)稀釋反應混合物且加載於經緩衝液A預平衡之20 ml HiPrep SP FF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。接著用緩衝液B(50 mM Hepes、1 M NaCl，pH 6.5)洗提管柱。藉由用25%緩衝液B洗滌管柱來洗提自由干擾素-γ且用50%緩衝液B洗提結合物。藉由UF/DF/使用由再生纖維素製成之10 kD膜(88 cm2，截止10 kD/Millipore)濃縮含有結合物之洗提份。針對含有150 mM NaCl之組胺酸緩衝液(pH 6.9)進行最後透濾步驟。藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。對於PSA-干擾素-γ結合物，與天然干擾素-γ相比，測得比活性>50%。另外藉由尺寸排阻HPLC，使用裝備有Shodex KW 803管柱之Agilent 1200 HPLC系統，在如先前所述之條件(Kolarich等人,Transfusion 2006;46:1959-77)下以分析法特性化結合物。顯示製劑不含有自由干擾素-γ。
方法4：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使干擾素-γ聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將初始濃度或重量之干擾素-γ轉移至或溶解於Hepes緩衝液(50 mM Hepes、150 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到2 mg干擾素-γ/ml之最終蛋白質濃度。隨後在15分鐘內添加5 mM過碘酸鈉水溶液，得到100 μM之最終濃度，隨後在30分鐘之時段內添加50 mM間甲苯胺水溶液，得到10 mM之最終濃度。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑(上述)，產生20倍莫耳試劑過量。校正pH值至6.0後，在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且藉由添加1 M L-半胱胺酸水溶液以得到10 mM之最終濃度來中止，持續15分鐘。
藉助於離子交換層析(IEC)純化PEG-干擾素-γ結合物。藉由UF/DF，使用由再生纖維素製成之10 kD膜(88 cm2，截止10 kD/Millipore)濃縮洗提液中含有結合物的洗提份。針對Hepes緩衝液(50 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7.5)進行最後透濾步驟。
藉由根據已知方法量測總蛋白質(布萊德法及BCA程序)及生物活性以分析法特性化製劑。
實施例42 使用胺氧基-PEG試劑及作為親核性催化劑之間甲苯胺使G-CSF聚乙二醇化 方法1：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使G-CSF聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將G-CSF溶解於7.0 ml組胺酸緩衝液(pH 6.0)(20 mM L-組胺酸、150 mM NaCl、5 mM CaCl2)中。接著添加過碘酸鈉水溶液(5 mM)且在4℃下在黑暗中在輕輕攪拌下培育反應混合物1小時，在室溫下藉由添加7.5 μl 1 M半胱胺酸水溶液來中止，持續15分鐘。隨後使用Vivaspin離心過濾器使混合物進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物。
接著將含有經氧化G-CSF之保留物與間甲苯胺水溶液(50 mM)混合且在室溫下培育30分鐘。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑，產生5倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育此混合物2.5小時。
最後，藉由離子交換層析(例如在Q-瓊脂糖FF上)純化PEG-G-CSF結合物。舉例而言，將每毫升凝膠1.5 mg蛋白質加載於經含有5 mM CaCl2之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)平衡的管柱上。用含有5 mM CaCl2及500 mM氯化鈉之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)洗提結合物，接著使用適當MW截止膜進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法1。藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使G-CSF聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將G-CSF溶解於7.0 ml組胺酸緩衝液(pH 6.0)(20 mM L-組胺酸、150 mM NaCl、5 mM CaCl2)中。接著添加過碘酸鈉水溶液(5 mM)且在4℃下在黑暗中在輕輕攪拌下培育反應混合物1小時，在室溫下藉由添加7.5 μl 1 M半胱胺酸水溶液來中止，持續15分鐘。隨後使用Vivaspin離心過濾器使混合物進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物。
接著將含有經氧化G-CSF之保留物與間甲苯胺水溶液(50 mM)混合且在室溫下培育30分鐘。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑，產生5倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育此混合物2.5小時。
最後，藉由離子交換層析純化PEG-G-CSF結合物。收集洗提液中含有結合物的洗提份，接著使用適當MW截止膜進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
方法2：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使G-CSF聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將G-CSF轉移至或溶解於反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到1.0 +/- 0.25 mg/ml之最終蛋白質濃度。接著藉由逐滴添加0.5 N HCl水溶液將溶液之pH值校正至6.0。隨後在10分鐘內添加40 mM過碘酸鈉水溶液，得到200 μM之濃度。在T=+22 +/- 2℃之溫度(T)下進行氧化反應30 +/- 5分鐘。接著藉由在T=+22 +/- 2℃下在15分鐘內添加L-半胱胺酸水溶液(1 M)來中止反應，得到在反應混合物中10 mM之最終濃度並培育60 +/- 5分鐘。
藉由離子交換層析進一步純化經氧化G-CSF。收集洗提液中含有經氧化G-CSF的洗提份且用於結合反應。
隨後，在最多15分鐘之時段(t)內在輕輕攪拌下將MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑以50倍莫耳過量添加至含有經純化之經氧化G-CSF的洗提液中。接著在15分鐘內添加間甲苯胺水溶液(50 mM)，得到10 mM之最終濃度。在T=+22 +/- 2℃之溫度(T)下在黑暗中在輕輕震盪下培育反應混合物120 +/- 10分鐘。
藉由離子交換層析進一步純化所得PEG-G-CSF結合物。收集含有PEG-G-CSF結合物之洗提份並藉由超濾/透濾(UF/DF)使用由再生纖維素製成且具有適當分子量截止之膜(Millipore)濃縮。
方法3：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使G-CSF聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將G-CSF溶解於Hepes緩衝液(50 mM Hepes、150 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且與過碘酸鈉水溶液(10 mM)及間甲苯胺水溶液(50 mM)混合。隨後添加胺氧基試劑，產生20倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且在室溫下藉由添加8 μl半胱胺酸水溶液(1 M)來中止，持續15分鐘。
最後，藉由離子交換層析，在Q-瓊脂糖FF上純化PEG-G-CSF結合物。將每毫升凝膠1.5 mg蛋白質加載於經含有5 mM CaCl2之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)預平衡的管柱上。用含有5 mM CaCl2及500 mM氯化鈉之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)洗提結合物，接著使用膜進行UF/DF。藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法3。藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使G-CSF聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將G-CSF溶解於Hepes緩衝液(50 mM Hepes、150 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且與過碘酸鈉水溶液(10 mM)及間甲苯胺水溶液(50 mM)混合。隨後添加胺氧基試劑，產生20倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且在室溫下藉由添加8 μl半胱胺酸水溶液(1 M)來中止，持續15分鐘。
最後，藉由離子交換層析純化PEG-G-CSF結合物。收集洗提液中含有結合物的洗提份，接著使用膜進行UF/DF。藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
方法4：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使G-CSF聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將初始濃度或重量之G-CSF轉移至或溶解於Hepes緩衝液(50 mM Hepes、150 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到2 mg G-CSF/ml之最終蛋白質濃度。隨後，在15分鐘內添加5 mM過碘酸鈉水溶液，得到100 μM之最終濃度，隨後在30分鐘之時段內添加50 mM間甲苯胺水溶液，得到10 mM之最終濃度。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑(上述)，產生20倍莫耳試劑過量。校正pH值至6.0後，在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且藉由添加1 M L-半胱胺酸水溶液以得到10 mM之最終濃度來中止，持續15分鐘。
藉助於離子交換層析(IEC)純化G-CSF結合物。藉由UF/DF，使用由再生纖維素製成之10 kD膜(88 cm2，截止10 kD/Millipore)濃縮洗提液中含有結合物的洗提份。針對Hepes緩衝液(50 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7.5)進行最後透濾步驟。
藉由根據已知方法量測總蛋白質(布萊德法及BCA程序)及生物活性以分析法特性化製劑。
實施例43 使用胺氧基-PEG試劑及作為親核性催化劑之間甲苯胺使修美樂聚乙二醇化 方法1：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使修美樂聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將修美樂溶解於7.0 ml組胺酸緩衝液(pH 6.0)(20 mM L-組胺酸、150 mM NaCl、5 mM CaCl2)中。接著添加過碘酸鈉水溶液(5 mM)且在4℃下在黑暗中在輕輕攪拌下培育反應混合物1小時，在室溫下藉由添加7.5 μl 1 M半胱胺酸水溶液來中止，持續15分鐘。隨後使用Vivaspin離心過濾器使混合物進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物。
接著將含有經氧化修美樂之保留物與間甲苯胺水溶液(50 mM)混合且在室溫下培育30分鐘。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑，產生5倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育此混合物2.5小時。
最後，藉由離子交換層析(例如在Q-瓊脂糖FF上)純化PEG-修美樂結合物。舉例而言，將每毫升凝膠1.5 mg蛋白質加載於經含有5 mM CaCl2之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)平衡的管柱上。用含有5 mM CaCl2及500 mM氯化鈉之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)洗提結合物，接著使用適當MW截止膜進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法1。藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使修美樂聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將修美樂溶解於7.0 ml組胺酸緩衝液(pH 6.0)(20 mM L-組胺酸、150 mM NaCl、5 mM CaCl2)中。接著添加過碘酸鈉水溶液(5 mM)且在4℃下在黑暗中在輕輕攪拌下培育反應混合物1小時，在室溫下藉由添加7.5 μl 1 M半胱胺酸水溶液來中止，持續15分鐘。隨後使用Vivaspin離心過濾器使混合物進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物。
接著將含有經氧化修美樂之保留物與間甲苯胺水溶液(50 mM)混合且在室溫下培育30分鐘。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑，產生5倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育此混合物2.5小時。
最後，藉由離子交換層析純化PEG-修美樂結合物。收集洗提液中含有結合物的洗提份，接著使用適當MW截止膜進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
方法2：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使修美樂聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將修美樂轉移至或溶解於反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到1.0+/-0.25 mg/ml之最終蛋白質濃度。接著藉由逐滴添加0.5 N HCl水溶液將溶液之pH值校正至6.0。隨後在10分鐘內添加40 mM過碘酸鈉水溶液，得到200 μM之濃度。在T=+22+/-2℃之溫度(T)下進行氧化反應30+/-5分鐘。接著藉由在T=+22+/-2℃下在15分鐘內添加L-半胱胺酸水溶液(1 M)來中止反應，得到在反應混合物中10 mM之最終濃度並培育60+/-5分鐘。
藉由離子交換層析進一步純化經氧化修美樂。收集洗提液中含有經氧化修美樂的洗提份且用於結合反應。
隨後，在最多15分鐘之時段(t)內在輕輕攪拌下將MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑以50倍莫耳過量添加至含有經純化之經氧化修美樂的洗提液中。接著在15分鐘內添加間甲苯胺水溶液(50 mM)，得到10 mM之最終濃度。在T=+22+/-2℃之溫度(T)下在黑暗中在輕輕震盪下培育反應混合物120+/-10分鐘。
藉由離子交換層析進一步純化所得PEG-修美樂結合物。收集含有PEG-修美樂結合物之洗提份並藉由超濾/透濾(UF/DF)使用由再生纖維素製成且具有適當分子量截止之膜(Millipore)濃縮。
方法3：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使修美樂聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將修美樂溶解於Hepes緩衝液(50 mM Hepes、150 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且與過碘酸鈉水溶液(10 mM)及間甲苯胺水溶液(50 mM)混合。隨後添加胺氧基試劑，產生20倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且在室溫下藉由添加8 μl半胱胺酸水溶液(1 M)來中止，持續15分鐘。
最後，藉由離子交換層析，在Q-瓊脂糖FF上純化PEG-修美樂結合物。將每毫升凝膠1.5 mg蛋白質加載於經含有5 mM CaCl2之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)預平衡的管柱上。用含有5 mM CaCl2及500 mM氯化鈉之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)洗提結合物，接著使用膜進行UF/DF。藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法3。藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使修美樂聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將修美樂溶解於Hepes緩衝液(50 mM Hepes、150 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且與過碘酸鈉水溶液(10 mM)及間甲苯胺水溶液(50 mM)混合。隨後添加胺氧基試劑，產生20倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且在室溫下藉由添加8 μl半胱胺酸水溶液(1 M)來中止，持續15分鐘。
最後，藉由離子交換層析純化PEG-修美樂結合物。收集含有結合物之洗提份，接著使用膜進行UF/DF。藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
方法4：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使修美樂聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將初始濃度或重量之修美樂轉移至或溶解於Hepes緩衝液(50 mM Hepes、150 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到2 mg修美樂/ml之最終蛋白質濃度。隨後在15分鐘內添加5 mM過碘酸鈉水溶液，得到100 μM之最終濃度，隨後在30分鐘之時段內添加50 mM間甲苯胺水溶液，得到10 mM之最終濃度。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑(上述)，產生20倍莫耳試劑過量。校正pH值至6.0後，在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且藉由添加1 M L-半胱胺酸水溶液以得到10 mM之最終濃度來中止，持續15分鐘。
藉助於離子交換層析(IEC)純化修美樂結合物。藉由UF/DF，使用由再生纖維素製成之10 kD膜(88 cm2，截止10 kD/Millipore)濃縮洗提液中含有結合物的洗提份。針對Hepes緩衝液(50 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7.5)進行最後透濾步驟。
藉由根據已知方法量測總蛋白質(布萊德法及BCA程序)及生物活性以分析法特性化製劑。
實施例44 使用胺氧基-PEG試劑及作為親核性催化劑之間甲苯胺使普羅利亞聚乙二醇化 方法1：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使普羅利亞聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將普羅利亞溶解於7.0 ml組胺酸緩衝液(pH 6.0)(20 mM L-組胺酸、150 mM NaCl、5 mM CaCl2)中。接著添加過碘酸鈉水溶液(5 mM)且在4℃下在黑暗中在輕輕攪拌下培育反應混合物1小時，在室溫下藉由添加7.5 μl 1 M半胱胺酸水溶液來中止，持續15分鐘。隨後使用Vivaspin離心過濾器使混合物進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物。
接著將含有經氧化普羅利亞之保留物與間甲苯胺水溶液(50 mM)混合且在室溫下培育30分鐘。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑，產生5倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育此混合物2.5小時。
最後，藉由離子交換層析(例如在Q-瓊脂糖FF上)純化PEG-普羅利亞結合物。舉例而言，將每毫升凝膠1.5 mg蛋白質加載於經含有5 mM CaCl2之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)平衡的管柱上。用含有5 mM CaCl2及500 mM氯化鈉之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)洗提結合物，接著使用適當MW截止膜進行UF/DF。接著藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(庫馬斯法、布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法1。藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使普羅利亞聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將10 mg rFIX溶解於5 ml組胺酸緩衝液(pH 6.0)(20 mM L-組胺酸、150 mM NaCl)中。接著添加100 μl過碘酸鈉水溶液(5 mM)且在4℃下在黑暗中在輕輕攪拌下培育反應混合物1小時，在室溫下藉由添加50 μl 1 M半胱胺酸水溶液來中止，持續15分鐘。隨後使用Vivaspin 15R 10 kD離心過濾器使混合物進行UF/DF以移除過量過碘酸鹽、中止劑及其副產物。
將含有經氧化普羅利亞之保留物(約7 ml)與2 ml間甲苯胺水溶液(50 mM)混合且在室溫下培育30分鐘。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑(上述)，產生5倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育此混合物2.5小時。
最後，藉由離子交換層析，在SP瓊脂糖FF上純化PEG-普羅利亞結合物。用20 ml緩衝液A(50 mM Hepes，pH 6.5)稀釋反應混合物且加載於經緩衝液A預平衡之20 ml HiPrep SP FF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。接著用緩衝液B(50 mM Hepes、1 M NaCl，pH 6.5)洗提管柱。藉由用25%緩衝液B洗滌管柱來洗提自由普羅利亞且用50%緩衝液B洗提結合物。藉由UF/DF/使用由再生纖維素製成之10 kD膜(88 cm2，截止10 kD/Millipore)濃縮含有結合物之洗提份。針對含有150 mM NaCl之組胺酸緩衝液(pH 6.9)進行最後透濾步驟。藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。對於PEG-普羅利亞結合物，與天然普羅利亞相比，測得比活性>50%。另外藉由尺寸排阻HPLC，使用裝備有Shodex KW 803管柱之Agilent 1200 HPLC系統，在如先前所述之條件(Kolarich等人,Transfusion 2006;46:1959-77)下以分析法特性化結合物。顯示製劑不含有自由普羅利亞。
方法2：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使普羅利亞聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將普羅利亞轉移至或溶解於反應緩衝液(例如50 mM Hepes、350 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到1.0 +/- 0.25 mg/ml之最終蛋白質濃度。接著藉由逐滴添加0.5 N HCl水溶液將溶液之pH值校正至6.0。隨後在10分鐘內添加40 mM過碘酸鈉水溶液，得到200 μM之濃度。在T=+22 +/- 2℃之溫度(T)下進行氧化反應30 +/- 5分鐘。接著藉由在T=+22 +/- 2℃下在15分鐘內添加L-半胱胺酸水溶液(1 M)來中止反應，得到在反應混合物中10 mM之最終濃度並培育60 +/- 5分鐘。
藉由離子交換層析進一步純化經氧化普羅利亞。收集洗提液中含有經氧化修美樂的洗提份且用於結合反應。
隨後，在最多15分鐘之時段(t)內在輕輕攪拌下將MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑以50倍莫耳過量添加至含有經純化之經氧化普羅利亞的洗提液中。接著在15分鐘內添加間甲苯胺水溶液(50 mM)，得到10 mM之最終濃度。在T=+22 +/- 2℃之溫度(T)下在黑暗中在輕輕震盪下培育反應混合物120 +/- 10分鐘。
藉由離子交換層析進一步純化所得PEG-普羅利亞結合物。收集含有PEG-普羅利亞結合物之洗提份並藉由超濾/透濾(UF/DF)使用由再生纖維素製成且具有適當分子量截止之膜(Millipore)濃縮。
方法3：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使普羅利亞聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將EPO溶解於Hepes緩衝液(50 mM Hepes、150 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中且與過碘酸鈉水溶液(10 mM)及間甲苯胺水溶液(50 mM)混合。隨後添加胺氧基試劑，產生20倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且在室溫下藉由添加8 μl半胱胺酸水溶液(1 M)來中止，持續15分鐘。
最後，藉由離子交換層析，在Q-瓊脂糖FF上純化PEG-普羅利亞結合物。將每毫升凝膠1.5 mg蛋白質加載於經含有5 mM CaCl2之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)預平衡的管柱上。用含有5 mM CaCl2及500 mM氯化鈉之50 mM Hepes緩衝液(pH 7.4)洗提結合物，接著使用膜進行UF/DF。藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。
在一替代具體實例中，如下進行方法3。
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使普羅利亞聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司，Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將10 mg普羅利亞溶解於約8 ml組胺酸緩衝液(pH 6.0)(20 mM L-組胺酸、150 mM NaCl)中。接著添加200 μl過碘酸鈉水溶液(5 mM)及2 ml間甲苯胺水溶液(50 mM)。隨後添加MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑(上述)，產生5倍莫耳試劑過量。在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且在室溫下藉由添加100 μl 1 M半胱胺酸水溶液來中止，持續15分鐘。
最後，藉由離子交換層析，在SP-瓊脂糖FF上純化PEG-普羅利亞結合物。用20 ml緩衝液A(50 mM Hepes，pH 6.5)稀釋反應混合物且加載於經緩衝液A預平衡之20 ml HiPrep SPFF 16/10管柱(GE Healthcare,Fairfield,CT)上。接著用緩衝液B(50 mM Hepes、1 M NaCl，pH 6.5)洗提管柱。藉由用25%緩衝液B洗滌管柱來洗提自由普羅利亞且用50%緩衝液B洗提結合物。藉由UF/DF/使用由再生纖維素製成之10 kD膜(88 cm2，截止10 kD/Millipore)濃縮含有結合物之洗提份。針對含有150 mM NaCl之組胺酸緩衝液(pH 6.9)進行最後透濾步驟。藉由根據此項技術中已知之方法量測總蛋白質(布萊德法)及生物活性以分析法特性化製劑。對於PEG-普羅利亞結合物，與天然普羅利亞相比，測得比活性>50%。另外藉由尺寸排阻HPLC，使用裝備有Shodex KW 803管柱之Agilent 1200 HPLC系統，在如先前所述之條件(Kolarich等人,Transfusion 2006;46:1959-77)下以分析法特性化結合物。顯示製劑不含有自由普羅利亞。
方法4：
藉由使用含有胺氧基之線性20 kD聚乙二醇化試劑使普羅利亞聚乙二醇化。此類試劑之實例為來自NOF(NOF公司,Tokyo,Japan)之Sunbright CA系列。將初始濃度或重量之修美樂轉移至或溶解於Hepes緩衝液(50 mM Hepes、150 mM氯化鈉、5 mM氯化鈣，pH 6.0)中，得到2 mg普羅利亞/ml之最終蛋白質濃度。隨後在15分鐘內添加5 mM過碘酸鈉水溶液，得到100 μM之最終濃度，隨後在30分鐘之時段內添加50 mM間甲苯胺水溶液，得到10 mM之最終濃度。接著添加MW為20 kD之胺氧基-PEG試劑(上述)，產生20倍莫耳試劑過量。校正pH值至6.0後，在室溫下在黑暗中在輕輕攪拌下培育混合物2小時且藉由添加1 M L-半胱胺酸水溶液以得到10 mM之最終濃度來中止，持續15分鐘。
藉助於離子交換層析(IEC)純化普羅利亞結合物。藉由UF/DF，使用由再生纖維素製成之10 kD膜(88 cm2，截止10 kD/Millipore)濃縮洗提液中含有結合物的洗提份。針對Hepes緩衝液(50 mM Hepes、5 mM CaCl2，pH 7.5)進行最後透濾步驟。
藉由根據已知方法量測總蛋白質(布萊德法及BCA程序)及生物活性以分析法特性化製劑。
實施例45 使用分支PEG使治療性蛋白質聚乙二醇化
本發明之治療性蛋白質的聚乙二醇化可擴展至分支或線性聚乙二醇化試劑，其由醛及含有活性胺氧基之適合連接子製成。
<110>　塞克曼等人
<120>　用於肟連接的親核性催化劑
<130>　31315/46394
<160>　1
<170>　PatentIn第3.5版
<210>　1
<211>　422
<212>　PRT
<213>　智慧人
<400>　1
圖1展示凝血因子IX(SEQ ID NO: 1)之初級結構。
圖2展示經氧化rFIX與胺氧基-PSA之偶合。
圖3展示水溶性二胺氧基連接子3-氧雜-戊烷-1,5-二氧基胺及3,6,9-三氧雜-十一烷-1,11-二氧基胺之合成。
圖4展示胺氧基-PSA之製備。
圖5展示藉由SDS PAGE觀測在不同催化劑存在下製備之PSA-FIX結合物。a)使用不同濃度比較苯胺與間甲苯胺；b)比較苯胺與鄰胺基苯甲酸、間胺基苯甲酸、對胺基苯甲酸、對胺基苯甲醯胺及對胺基苯磺酸；c)比較苯胺及間甲苯胺與鄰茴香胺及間茴香胺。
圖6展示使用各種親核性催化劑達成之聚唾液酸化之百分比。

Claims (54)

  1. 一種使水溶性聚合物與治療性蛋白質之經氧化碳水化合物部分結合之方法，其包含在允許結合之條件下使該經氧化碳水化合物部分與活化之水溶性聚合物接觸；該水溶性聚合物含有活性胺氧基且選自由以下者所組成之群組：聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)、分支PEG、PolyPEG®(Warwick Effect Polymers；Coventry,UK)、聚唾液酸(polysialic acid，PSA)、碳水化合物、多醣、普魯蘭(pullulane)、聚葡萄胺糖、玻尿酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚烷醚(polyalkylene oxide，PAO)、聚伸烷基二醇(polyalkylene glycol，PAG)、聚丙二醇(polypropylene glycol，PPG)、聚唑啉、聚丙烯醯基嗎啉、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯啶酮、聚磷氮烯、聚唑啉、聚乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚(1-羥甲基伸乙基羥甲基縮甲醛)(poly(1-hydroxymethylethylene hydroxymethylformal)，PHF)、磷酸2-甲基丙烯醯氧基-2'-乙基三甲基銨(2-methacryloyloxy-2'-ethyltrimethylammoniumphosphate，MPC)；及該碳水化合物部分藉由與包含選自由以下者所組成之群組的氧化劑之緩衝液一起培育而氧化：過碘酸鈉(NaIO4)、四乙酸鉛(Pb(OAc)4)及高釕酸鉀(KRuO4)；其中在該經氧化碳水化合物部分與該水溶性聚合物上之活 性胺氧基之間形成肟連接；且其中該肟連接形成由間甲苯胺催化。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該治療性蛋白質選自由以下者所組成之群組：因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、馮威里氏因子(Von Willebrand Factor，VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白C、蛋白S、tPA、PAI-1、組織因子(TF)、ADAMTS 13蛋白酶、IL-1 α、IL-1 β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-11、群落刺激因子-1(colony stimulating factor-1，CSF-1)、M-CSF、SCF、GM-CSF、顆粒球群落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)、EPO、干擾素-α(IFN-α)、複合干擾素(consensus interferon)、IFN-β、IFN-γ、IFN-ω、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-31、IL-32 α、IL-33、血小板生成素(thrombopoietin，TPO)、Ang-1、Ang-2、Ang-4、Ang-Y、促血管生成素樣多肽1(angiopoietin-like polypeptide 1，ANGPTL1)、促血管生成素樣多肽2(ANGPTL2)、促血管生成素樣多肽3(ANGPTL3)、促血管生成素樣多肽4(ANGPTL4)、促血管生成素樣多肽5(ANGPTL5)、促血管生成素樣多肽6(ANGPTL6)、促血管生成素樣多肽7(ANGPTL7)、玻璃連結蛋白(vitronectin)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血管生 成素、活化素A、活化素B、活化素C、骨形態發生蛋白-1、骨形態發生蛋白-2、骨形態發生蛋白-3、骨形態發生蛋白-4、骨形態發生蛋白-5、骨形態發生蛋白-6、骨形態發生蛋白-7、骨形態發生蛋白-8、骨形態發生蛋白-9、骨形態發生蛋白-10、骨形態發生蛋白-11、骨形態發生蛋白-12、骨形態發生蛋白-13、骨形態發生蛋白-14、骨形態發生蛋白-15、骨形態發生蛋白受體IA、骨形態發生蛋白受體IB、骨形態發生蛋白受體II、腦源性神經營養因子、心營養素-1(cardiotrophin-1)、纖毛神經營養因子、纖毛神經營養因子受體、畸胎瘤衍化生長因子(cripto)、隱秘因子(cryptic)、細胞激素誘導性嗜中性球趨化因子1、細胞激素誘導性嗜中性球趨化因子2α、細胞激素誘導性嗜中性球趨化因子2β、β內皮細胞生長因子、內皮素1、表皮生長因子、促紅血球生成素(epigen)、表皮調節素(epiregulin)、上皮源性嗜中性球引誘劑、纖維母細胞生長因子4、纖維母細胞生長因子5、纖維母細胞生長因子6、纖維母細胞生長因子7、纖維母細胞生長因子8、纖維母細胞生長因子8b、纖維母細胞生長因子8c、纖維母細胞生長因子9、纖維母細胞生長因子10、纖維母細胞生長因子11、纖維母細胞生長因子12、纖維母細胞生長因子13、纖維母細胞生長因子16、纖維母細胞生長因子17、纖維母細胞生長因子19、纖維母細胞生長因子20、纖維母細胞生長因子21、酸性纖維母細胞生長因子、鹼性纖維母細胞生長因子、膠細胞系源性神經營養因子受體α1、膠細胞系源性神經營養因子受體α2、生長相 關蛋白、生長相關蛋白α、生長相關蛋白β、生長相關蛋白γ、肝素結合表皮生長因子、肝細胞生長因子、肝細胞生長因子受體、肝瘤源性生長因子、胰島素樣生長因子I、胰島素樣生長因子受體、胰島素樣生長因子II、胰島素樣生長因子結合蛋白、角質化細胞生長因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受體α、神經生長因子、神經生長因子受體、神經生成素(neuropoietin)、神經營養素-3(neurotrophin-3)、神經營養素-4、抑瘤素M(oncostatin M，OSM)、胎盤生長因子、胎盤生長因子2、血小板衍生內皮細胞生長因子、血小板衍生生長因子、血小板衍生生長因子A鏈、血小板衍生生長因子AA、血小板衍生生長因子AB、血小板衍生生長因子B鏈、血小板衍生生長因子BB、血小板衍生生長因子受體α、血小板衍生生長因子受體β、前B細胞生長刺激因子、幹細胞因子(stem cell factor，SCF)、幹細胞因子受體、TNF、TNF0、TNF1、TNF2、轉型生長因子α、轉型生長因子β、轉型生長因子β1、轉型生長因子β1.2、轉型生長因子β2、轉型生長因子β3、轉型生長因子β5、潛伏轉型生長因子β1、轉型生長因子β結合蛋白I、轉型生長因子β結合蛋白II、轉型生長因子β結合蛋白III、胸腺基質淋巴細胞生成素(thymic stromal lymphopoietin，TSLP)、腫瘤壞死因子受體I型、腫瘤壞死因子受體II型、尿激酶型血纖維蛋白溶酶原活化因子受體、磷脂酶活化蛋白(phospholipase-activating protein，PUP)、胰島素、凝集素蓖麻毒素、泌乳素、絨毛膜促性腺 素、卵泡刺激素、甲狀腺刺激素、組織血纖維蛋白溶酶原活化因子、IgG、IgE、IgM、IgA及IgD、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、DNA酶、胎球蛋白、黃體生成激素、雌激素、胰島素、白蛋白、脂蛋白、胎蛋白、運鐵蛋白、血小板生成素、尿激酶、整合素、凝血酶、瘦素、修美樂(Humira)(阿達木單抗(adalimumab))、普羅利亞(Prolia)(地諾單抗(denosumab))、恩利(Enbrel)(依那西普(etanercept))、下表中之蛋白 或其生物活性片段、衍生物或變異體。
  3. 如申請專利範圍第2項之方法，其中在與該活化之水溶性聚合物接觸之前，包含初始濃度介於約0.3mg/ml與約3.0mg/ml之間的該治療性蛋白質之溶液經調整至介於約5.0與約8.0之間的pH值。
  4. 如申請專利範圍第3項之方法，其中該治療性蛋白質之初始濃度為約1.0mg/ml且該pH值為約6.0。
  5. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該治療性蛋白質係與所欲的過量濃度之活化之水溶性聚合物接觸，其中該過量濃度介於約1莫耳與約300莫耳過量之間。
  6. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該過量濃度為約50倍莫耳過量。
  7. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該治療性蛋白質在包含以下者之條件下與該活化之水溶性聚合物一起培育：介於約0.5小時與約24小時之間的時段；介於約2℃與約37℃之間的溫度；在光存在或不存在下；及在攪拌或不攪拌下。
  8. 如申請專利範圍第7項之方法，其中該等條件包含約120分鐘之時段、約22℃之溫度、不存在光；及在攪拌下。
  9. 如申請專利範圍第2項之方法，其中間甲苯胺在包含以下者之條件下以使得間甲苯胺之最終濃度介於約1.0mM與約50mM之間的量添加：介於約0.1分鐘與約30分鐘之間的時段；介於約2℃與約37℃之間的溫度；在光存在或不存在下；及在攪拌或不攪拌下。
  10. 如申請專利範圍第9項之方法，其中間甲苯胺之最終濃度為約10mM，且該等條件包含至多約15分鐘之時段、約22℃之溫度、不存在光；及在攪拌下。
  11. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該氧化劑在包含以下者之條件下以使得氧化劑之最終濃度介於約50μM與約1000μM之間的量添加：介於約0.1分鐘與120分鐘之間的時段；介於約2℃與約37℃之間的溫度；在光存在或不存在下；及在攪拌或不攪拌下。
  12. 如申請專利範圍第11項之方法，其中該氧化劑之最終濃度為約400μM，且該等條件包含約10分鐘之時段、約22℃之溫度、不存在光及在攪拌下。
  13. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該水溶性聚合物與該治療性蛋白質之經氧化碳水化合物部分的結合藉由添加選自由以下者所組成之群組的中止劑而終止：L-半胱胺酸、甲硫胺酸、麩胱甘肽、甘油、偏亞硫酸氫鈉(Na2S2O5)、色胺酸、酪胺酸、組胺酸或其衍生物、甲酚、咪唑及其組合；其中該中止劑在包含以下者之條件下以使得中止劑之最終濃度介於約1mM與約100mM之間的量添加：介於約5分鐘與約120分鐘之間的時段；介於約2℃與約37℃之間的溫度；在光存在或不存在下；及在攪拌或不攪拌下。
  14. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該中止劑為L-半胱胺酸。
  15. 如申請專利範圍第14項之方法，其中該L-半胱胺 酸經添加以使得最終濃度為約10mM且該等條件包含約60分鐘之時段、約22℃之溫度、不存在光及在攪拌下。
  16. 如申請專利範圍第2項之方法，其包含：a)第一步驟，其包含將包含該治療性蛋白質之溶液的pH值調整至介於約5.0與約8.0之間的pH值，其中該治療性蛋白質濃度介於約0.3mg/ml與約3.0mg/ml之間；b)第二步驟，其包含氧化該治療性蛋白質上之一或多個碳水化合物，其中該氧化劑在包含以下者之條件下添加至該第一步驟中之溶液中以使得最終濃度介於約50μM與約1000μM之間：介於約0.1分鐘與約120分鐘之間的時段；介於約2℃與約37℃之間的溫度；在光存在或不存在下；及在攪拌或不攪拌下；c)第三步驟，其包含在包含以下者之條件下使該治療性蛋白質與所欲的過量濃度之活化之水溶性聚合物接觸，其中該過量濃度介於約1莫耳過量與約300莫耳過量之間：介於約0.5小時與約24小時之間的時段；介於約2℃與約37℃之間的溫度；在光存在或不存在下；及在攪拌或不攪拌下；d)第四步驟，其包含將間甲苯胺添加至該第三步驟之溶液中，其中間甲苯胺在包含以下者之條件下經添加以使得最終濃度介於約1mM與約50mM之間：介於約0.1分鐘與約30分鐘之間的時段；介於約2℃與約37℃之間的溫度；在光存在或不存在下；及在攪拌或不攪拌下；e)第五步驟，其中該治療性蛋白質在允許該活化之水溶性聚合物與該治療性蛋白質上之一或多個經氧化碳水化合物結 合的條件下與該活化之水溶性聚合物及間甲苯胺一起培育，該等條件包含介於約0.5小時與約24小時之間的時段、介於約2℃與約37℃之間的溫度；在光存在或不存在下；及在攪拌或不攪拌下；及f)第六步驟，其中該第五步驟中該水溶性聚合物與該治療性蛋白質之一或多個經氧化碳水化合物的結合藉由添加選自由以下者所組成之群組的中止劑而終止：L-半胱胺酸、甲硫胺酸、麩胱甘肽、甘油、Na2S2O5(偏亞硫酸氫鈉)、色胺酸、酪胺酸、組胺酸或其衍生物、甲酚、咪唑及其組合；其中該中止劑在包含以下者之條件下經添加以使得最終濃度為約1mM及約100mM：介於約5分鐘與約120分鐘之間的時段；介於約2℃與約37℃之間的溫度；在光存在或不存在下；及在攪拌或不攪拌下。
  17. 如申請專利範圍第16項之方法，其中該第一步驟中該治療性蛋白質之初始濃度為約1mg/ml且該pH值為約6.0；其中該第二步驟中該氧化劑之最終濃度為約400μM，且該等第五步驟中之條件包含約10分鐘之時段、約22℃之溫度、不存在光及在攪拌下；其中該第三步驟中之過量濃度為約50莫耳過量；其中該等第三步驟中之條件包含約15分鐘之時段、約22℃之溫度、不存在光及在攪拌下；其中該第四步驟中間甲苯胺之最終濃度為約10mM，且該等第四步驟中之條件包含約15分鐘之時段、約22℃之溫 度、不存在光及在攪拌下；其中該第五步驟中將該治療性蛋白質與該活化之水溶性聚合物及間甲苯胺一起培育之條件包含約2小時之時段；約22℃之溫度；不存在光；及在攪拌下；其中該第六步驟中之中止劑為L-半胱胺酸；且其中該L-半胱胺酸經添加以使得最終濃度為約10mM且該等第六步驟中之條件包含約60分鐘之時段、約22℃之溫度、不存在光及在攪拌下。
  18. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該水溶性聚合物為PSA且包含10-300個唾液酸單元。
  19. 如申請專利範圍第2項之方法，其中當該治療性蛋白質為凝血蛋白時，該治療性蛋白質之經氧化碳水化合物部分位於該凝血蛋白之活化肽中。
  20. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該PSA藉由使活化之胺氧基連接子與經氧化PSA反應來製備；其中該胺氧基連接子選自由以下者所組成之群組：a)下式之3-氧雜-戊烷-1,5-二氧基胺連接子： b)下式之3,6,9-三氧雜-十一烷-1,11-二氧基胺連接子：，及c)下式之3,6,9,12,15-五氧雜-十七烷-1,17-二氧基胺連接子： 其中該PSA藉由與氧化劑一起培育而氧化以在該PSA之非 還原端形成末端醛基。
  21. 如申請專利範圍第1至20項中任一項之方法，其中該氧化劑為NaIO4。
  22. 如申請專利範圍第1至20項中任一項之方法，其中間甲苯胺以介於約1mM與約50mM之間的濃度提供。
  23. 如申請專利範圍第22項之方法，其中該間甲苯胺以約10mM之濃度存在於該結合反應中。
  24. 如申請專利範圍第1至20項中任一項之方法，其進一步包含以下步驟：藉由在包含選自由以下者所組成之群組的還原化合物之緩衝液中培育該結合之治療性蛋白質來還原該結合之治療性蛋白質中的肟連接：氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)、抗壞血酸(維生素C)及NaBH3。
  25. 如申請專利範圍第1至20項中任一項之方法，其進一步包含純化該結合之治療性蛋白質的步驟。
  26. 如申請專利範圍第25項之方法，其中該結合之治療性蛋白質藉由選自由層析、過濾及沈澱所組成之群組的方法來純化。
  27. 如申請專利範圍第26項之方法，其中該層析選自由以下者所組成之群組：疏水性相互作用層析(Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC)、離子交換層析(Ion Exchange chromatography，IEC)、尺寸排阻層析(Size exclusion chromatography，SEC)、親和層析及逆相層析。
  28. 如申請專利範圍第27項之方法，其中於層析加載步驟及層析洗滌步驟中使用抗離液鹽。
  29. 如申請專利範圍第27項之方法，其中該層析在管柱中進行。
  30. 如申請專利範圍第29項之方法，其中該管柱包含選自由苯基-瓊脂糖FF及丁基-瓊脂糖FF所組成之群組的層析樹脂。
  31. 如申請專利範圍第30項之方法，其中該樹脂以介於約5cm與約20cm之間的床高度存在於該管柱中。
  32. 如申請專利範圍第31項之方法，其中該床高度為約10cm。
  33. 如申請專利範圍第29項之方法，其包含一或多個洗滌步驟，其中流動方向設定為向上流動且其中流速介於約0.2cm/min與約6.7cm/min之間。
  34. 如申請專利範圍第33項之方法，其中該流速為約2cm/min。
  35. 如申請專利範圍第29項之方法，其包含一或多個洗提步驟，其中流動方向設定為向下流動且其中流速介於約0.1cm/min與約6.7cm/min之間。
  36. 如申請專利範圍第35項之方法，其中該流速為約1cm/min。
  37. 如申請專利範圍第25項之方法，其進一步包含藉由超濾/透濾(UF/DF)濃縮該結合之治療性蛋白質。
  38. 如申請專利範圍第25項之方法，其中該治療性蛋白質之最終濃度介於約0.5mg/ml與約3mg/ml之間。
  39. 如申請專利範圍第25項之方法，其中該治療性蛋白 質包含約5個至約11個水溶性聚合物部分。
  40. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該結合之治療性蛋白質使用層析純化；其中於加載步驟及洗滌步驟使用抗離液鹽；該方法包含一或多個洗滌步驟，其中流動方向設定為向上流動且其中流速介於約0.2cm/min與約6.7cm/min之間；及一或多個洗提步驟，其中流動方向設定為向下流動且其中流速介於約0.2cm/min與約6.7cm/min之間；該方法進一步包含藉由超濾/透濾(UF/DF)濃縮該結合之治療性蛋白質。
  41. 如申請專利範圍第40項之方法，其中該層析為疏水性相互作用層析(HIC)；其中該一或多個洗滌步驟流速為約2cm/min；且其中該一或多個洗提步驟流速為約1cm/min。
  42. 如申請專利範圍第1至20項中任一項之方法，其中該含有活性胺氧基之水溶性聚合物藉由包含以下者之方法來製備：a)在允許在經氧化水溶性聚合物與包含活性胺氧基之活化之胺氧基連接子之間形成穩定肟連接的條件下將包含該經氧化水溶性聚合物之溶液與該活化之胺氧基連接子一起培育，該等條件包含介於約1分鐘與約24小時之間的時段；介於約2℃與約37℃之間的溫度；在光存在或不存在下；及在攪拌或不攪拌下；從而形成含有活性胺氧基之水溶性聚合物；及b)藉由選自由層析、過濾及沈澱所組成之群組的方法來純 化該含有活性胺氧基之水溶性聚合物。
  43. 如申請專利範圍第42項之方法，其進一步包含以下步驟：a’)在允許在該經氧化水溶性聚合物與該活化之胺氧基連接子之間形成穩定烷氧胺連接的條件下將步驟a)之包含該含有活性胺氧基之水溶性聚合物的溶液與還原劑一起培育，該等條件包含介於約1分鐘與約24小時之間的時段；介於約2℃與約37℃之間的溫度；在光存在或不存在下；及在攪拌或不攪拌下，其中步驟(a’)是在步驟(a)之後且步驟(b)之前進行。
  44. 如申請專利範圍第42項之方法，其進一步包含以下步驟：a’)在包含以下者之條件下將步驟a)之包含該含有活性胺氧基之水溶性聚合物的溶液與間甲苯胺一起培育：介於1分鐘與24小時之間的時段；介於2℃與37℃之間的溫度；在光存在或不存在下；及在攪拌或不攪拌下，其中步驟(a’)是在步驟(a)之後且步驟(b)之前進行。
  45. 如申請專利範圍第44項之方法，其進一步包含以下步驟：a”)在允許在該經氧化水溶性聚合物與該活化之胺氧基連接子之間形成穩定烷氧胺連接的條件下將步驟a’)之包含該含有活性胺氧基之水溶性聚合物的溶液與還原劑一起培育，該等條件包含介於約1分鐘與約24小時之間的時段；介於約2℃與約37℃之間的溫度；在光存在或不存在下；及 在攪拌或不攪拌下，其中步驟(a”)是在步驟(a’)之後且步驟(b)之前進行。
  46. 如申請專利範圍第42項之方法，其中該經氧化水溶性聚合物選自由以下者所組成之群組：聚乙二醇(PEG)、分支PEG、PolyPEG®(Warwick Effect Polymers；Coventry,UK)、聚唾液酸(PSA)、碳水化合物、多醣、普魯蘭、聚葡萄胺糖、玻尿酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚烷醚(PAO)、聚伸烷基二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚唑啉、聚丙烯醯基嗎啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯啶酮、聚磷氮烯、聚唑啉、聚乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚(1-羥甲基伸乙基羥甲基縮甲醛)(PHF)、磷酸2-甲基丙烯醯氧基-2'-乙基三甲基銨(MPC)，且其中該水溶性聚合物藉由與氧化劑一起培育而氧化以在該水溶性聚合物之非還原端形成末端醛基。
  47. 如申請專利範圍第46項之方法，其中該氧化劑為NaIO4。
  48. 如申請專利範圍第42項之方法，其中該胺氧基連接子選自由以下者所組成之群組：a)下式之3-氧雜-戊烷-1,5-二氧基胺連接子： b)下式之3,6,9-三氧雜-十一烷-1,11-二氧基胺連接子：，及c)下式之3,6,9,12,15-五氧雜-十七烷-1,17-二氧基胺連接 子：
  49. 如申請專利範圍第43項之方法，其中該還原劑選自由以下者所組成之群組：氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)、抗壞血酸(維生素C)及NaBH3。
  50. 如申請專利範圍第44項之方法，其中間甲苯胺以使得間甲苯胺之最終濃度介於約1.0mM與約50mM之間的量添加。
  51. 如申請專利範圍第42項之方法，其進一步包含藉由超濾/透濾(UF/DF)濃縮該結合之治療性蛋白質。
  52. 一種在治療性蛋白質上之經氧化碳水化合物部分與含有活性胺氧基之活化之水溶性聚合物之間形成肟連接之方法，其包含以下步驟：a)藉由將治療性蛋白質與選自由以下者所組成之群組的氧化劑一起培育來氧化該蛋白質上之碳水化合物部分：過碘酸鈉(NaIO4)、四乙酸鉛(Pb(OAc)4)及高釕酸鉀(KRuO4)；及b)在允許在該治療性蛋白質之經氧化碳水化合物部分與該含有活性胺氧基之活化之水溶性聚合物之間形成肟連接的條件下在親核性催化劑存在下形成該肟連接；其中該含有活性胺氧基之水溶性聚合物選自由以下者所組成之群組：聚乙二醇(PEG)、分支PEG、PolyPEG®(Warwick Effect Polymers；Coventry,UK)、聚唾液酸(PSA)、碳水化合物、多醣、普魯蘭、聚葡萄胺糖、玻尿酸、硫酸軟骨 素、硫酸皮膚素、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚烷醚(PAO)、聚伸烷基二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚唑啉、聚丙烯醯基嗎啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯啶酮、聚磷氮烯、聚唑啉、聚乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚(1-羥甲基伸乙基羥甲基縮甲醛)(PHF)、磷酸2-甲基丙烯醯氧基-2'-乙基三甲基銨(MPC)；其中該親核性催化劑係間甲苯胺。
  53. 一種在治療性蛋白質上之經氧化碳水化合物部分與含有活性醯肼基之活化之水溶性聚合物之間形成腙連接之方法，其包含以下步驟：a)藉由將治療性蛋白質與選自由以下者所組成之群組的氧化劑一起培育來氧化該蛋白質上之碳水化合物部分：過碘酸鈉(NaIO4)、四乙酸鉛(Pb(OAc)4)及高釕酸鉀(KRuO4)；及b)在允許在該治療性蛋白質之經氧化碳水化合物部分與該含有活性醯肼基之活化之水溶性聚合物之間形成腙連接的條件下在親核性催化劑存在下形成該腙連接；其中該含有活性醯肼基之水溶性聚合物選自由以下者所組成之群組：聚乙二醇(PEG)、分支PEG、PolyPEG®(Warwick Effect Polymers；Coventry,UK)、聚唾液酸(PSA)、碳水化合物、多醣、普魯蘭、聚葡萄胺糖、玻尿酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、聚烷醚(PAO)、聚伸烷基二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚唑啉、聚丙烯醯基嗎啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯啶 酮、聚磷氮烯、聚唑啉、聚乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚(1-羥甲基伸乙基羥甲基縮甲醛)(PHF)、磷酸2-甲基丙烯醯氧基-2'-乙基三甲基銨(MPC)；其中該親核性催化劑係間甲苯胺。
  54. 如申請專利範圍第52或53項之方法，其中該治療性蛋白質選自由以下者所組成之群組：因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VIIa(FVIIa)、馮威里氏因子(VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI(FXI)、因子XII(FXII)、凝血酶(FII)、蛋白C、蛋白S、tPA、PAI-1、組織因子(TF)、ADAMTS 13蛋白酶、IL-1 α、IL-1 β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-11、群落刺激因子-1(CSF-1)、M-CSF、SCF、GM-CSF、顆粒球群落刺激因子(G-CSF)、EPO、干擾素-α(IFN-α)、複合干擾素、IFN-β、IFN-γ、IFN-ω、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-31、IL-32 α、IL-33、血小板生成素(TPO)、Ang-1、Ang-2、Ang-4、Ang-Y、促血管生成素樣多肽1(ANGPTL1)、促血管生成素樣多肽2(ANGPTL2)、促血管生成素樣多肽3(ANGPTL3)、促血管生成素樣多肽4(ANGPTL4)、促血管生成素樣多肽5(ANGPTL5)、促血管生成素樣多肽6(ANGPTL6)、促血管生成素樣多肽7(ANGPTL7)、玻璃連結蛋白、血管內皮生長因子(VEGF)、血管生成素、活化素A、活化素B、活化素C、骨形態發生蛋白-1、骨形態發生蛋白-2、骨形態發生 蛋白-3、骨形態發生蛋白-4、骨形態發生蛋白-5、骨形態發生蛋白-6、骨形態發生蛋白-7、骨形態發生蛋白-8、骨形態發生蛋白-9、骨形態發生蛋白-10、骨形態發生蛋白-11、骨形態發生蛋白-12、骨形態發生蛋白-13、骨形態發生蛋白-14、骨形態發生蛋白-15、骨形態發生蛋白受體IA、骨形態發生蛋白受體IB、骨形態發生蛋白受體II、腦源性神經營養因子、心營養素-1、纖毛神經營養因子、纖毛神經營養因子受體、畸胎瘤衍化生長因子、隱秘因子、細胞激素誘導性嗜中性球趨化因子1、細胞激素誘導性嗜中性球、趨化因子2α、細胞激素誘導性嗜中性球趨化因子2β、β內皮細胞生長因子、內皮素1、表皮生長因子、促紅血球生成素、表皮調節素、上皮源性嗜中性球引誘劑、纖維母細胞生長因子4、纖維母細胞生長因子5、纖維母細胞生長因子6、纖維母細胞生長因子7、纖維母細胞生長因子8、纖維母細胞生長因子8b、纖維母細胞生長因子8c、纖維母細胞生長因子9、纖維母細胞生長因子10、纖維母細胞生長因子11、纖維母細胞生長因子12、纖維母細胞生長因子13、纖維母細胞生長因子16、纖維母細胞生長因子17、纖維母細胞生長因子19、纖維母細胞生長因子20、纖維母細胞生長因子21、酸性纖維母細胞生長因子、鹼性纖維母細胞生長因子、膠細胞系源性神經營養因子受體α1、膠細胞系源性神經營養因子受體α2、生長相關蛋白、生長相關蛋白α、生長相關蛋白β、生長相關蛋白γ、肝素結合表皮生長因子、肝細胞生長因子、肝細胞生長因子受體、肝瘤源性生長因子、 胰島素樣生長因子I、胰島素樣生長因子受體、胰島素樣生長因子II、胰島素樣生長因子結合蛋白、角質化細胞生長因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受體α、神經生長因子、神經生長因子受體、神經生成素、神經營養素-3、神經營養素-4、抑瘤素M(OSM)、胎盤生長因子、胎盤生長因子2、血小板衍生內皮細胞生長因子、血小板衍生生長因子、血小板衍生生長因子A鏈、血小板衍生生長因子AA、血小板衍生生長因子AB、血小板衍生生長因子B鏈、血小板衍生生長因子BB、血小板衍生生長因子受體α、血小板衍生生長因子受體β、前B細胞生長刺激因子、幹細胞因子(SCF)、幹細胞因子受體、TNF、TNF0、TNF1、TNF2、轉型生長因子α、轉型生長因子β、轉型生長因子β1、轉型生長因子β1.2、轉型生長因子β2、轉型生長因子β3、轉型生長因子β5、潛伏轉型生長因子β1、轉型生長因子β結合蛋白I、轉型生長因子β結合蛋白II、轉型生長因子β結合蛋白III、胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)、腫瘤壞死因子受體I型、腫瘤壞死因子受體II型、尿激酶型血纖維蛋白溶酶原活化因子受體、磷脂酶活化蛋白(PUP)、胰島素、凝集素蓖麻毒素、泌乳素、絨毛膜促性腺素、卵泡刺激素、甲狀腺刺激素、組織血纖維蛋白溶酶原活化因子、IgG、IgE、IgM、IgA及IgD、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、DNA酶、胎球蛋白、黃體生成激素、雌激素、胰島素、白蛋白、脂蛋白、胎蛋白、運鐵蛋白、血小板生成素、尿激酶、整合素、凝血酶、瘦素、修美樂(阿達木單抗)、普羅利亞(地 諾單抗)、恩利(依那西普)、來自下表之蛋白 或其生物活性片段、衍生物或變異體。
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