JP6711935B2 - オキシム連結のための求核触媒 - Google Patents

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Description

本発明は、水溶性ポリマーをタンパク質に複合化させるための物質および方法に関する。
水溶性ポリマーと治療用タンパク質との間の共有結合を形成することによる複合体の調製が、様々な化学方法によって実施することができる。ポリペプチド薬物のＰＥＧ化は、循環中にそれらを保護し、それらの薬力学的および薬物動態プロファイルを改善させる（Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ｃｈｅｓｓ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２００３；２：２１４−２１）。ＰＥＧ化プロセスは、エチレングリコールの反復単位（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を、ポリペプチド薬物に付着させる。ＰＥＧ分子は、大きな流体力学的体積（球状タンパク質の５〜１０倍の大きさ）を有し、非常に水溶性であり、水和されており、非毒性であって、非免疫原性であり、身体から迅速に除去される。分子のＰＥＧ化は、薬物の酵素分解に対する耐性の増大、インビボでの半減期の増大、投与頻度の減少、免疫原性の減少、物理的および熱安定性の増大、溶解度の増大、液体安定性の増大、凝集の低減をもたらすことができる。最初のＰＥＧ化薬物は、１９９０年代初期にＦＤＡによって承認された。それ以降、ＦＤＡは、経口、注入可能、および局所投与のための種々のＰＥＧ化薬物を承認している。
コロミン酸（ＣＡ）とも称されるポリシアル酸（ＰＳＡ）は、天然由来の多糖類である。それは、α（２→８）ケトシド連結を有するＮ−アセチルノイラミン酸のホモポリマーであり、その非還元末端において隣接ジオール基を含有する。それは負荷電され、かつヒトの身体の天然成分である。それは細菌から大量に、および規定の物理的特徴を有して容易に産生することができる（米国特許第５，８４６，９５１号）。細菌によって産生されたＰＳＡが、ヒトの身体内で産生されたＰＳＡと化学的および免疫学的に同一であるため、細菌性ＰＳＡは、タンパク質に結合したときでさえ、非免疫原性である。幾つかのポリマーとは異なり、ＰＳＡ酸は、生物分解性である。カタラーゼおよびアスパラギナーゼへのコロミン酸の共有結合は、タンパク質分解酵素または血漿の存在下での酵素安定性を増大することが明らかになっている。ポリシアル化と非修飾アスパラギナーゼとのインビボ比較研究は、ポリシアル化が酵素の半減期を増大させたことを明らかにした（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ ａｎｄ Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ．２００１；２１７：２１５−２４）。
ペプチドまたはタンパク質へのＰＥＧ誘導体の結合は、Ｒｏｂｅｒｔｓら（Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ２００２；５４：４５９−７６）によって検討されている。治療用タンパク質への水溶性ポリマーの結合のための１つのアプローチは、タンパク質の炭水化物部分を介するポリマーの複合化である。タンパク質中の炭水化物の隣接ヒドロキシル（ＯＨ）基は、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）で容易に酸化され、活性アルデヒド基を形成することができる（Ｒｏｔｈｆｕｓ ｅｔ Ｓｍｉｔｈ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９６３；２３８：１４０２−１０；ｖａｎ Ｌｅｎｔｅｎ ｅｔ Ａｓｈｗｅｌｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９７１；２４６：１８８９−９４）。その後、ポリマーは、例えば、活性ヒドラジド基を含有する試薬の使用によって、炭水化物のアルデヒド基に結合することができる（Ｗｉｌｃｈｅｋ Ｍ ａｎｄ Ｂａｙｅｒ ＥＡ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １９８７；１３８：４２９−４２）。より近年の技術は、アルデヒドと反応してオキシム連結を形成するアミノオキシ基を含有する試薬の使用である（国際公開第９６／４０６６２号、国際公開第２００８／０２５８５６号）。
治療用タンパク質への水溶性ポリマーの複合化を説明する更なる例は、フォンヴィレブランド因子中の炭水化物部分の酸化、およびそれに続くヒドラジド化学を使用するＰＥＧへの結合を教示する国際公開第０６／０７１８０１号、ｒＦＶＩＩＩの酸化、ならびにそれに続くヒドラジド化学を使用するＰＥＧおよび他の水溶性ポリマー（例えば、ＰＳＡ、ＨＥＳ、デキストラン）への結合を教示する米国公開第２００９／００７６２３７号、異なる凝固因子（例えば、ｒＦＩＸ、ＦＶＩＩＩ、およびＦＶＩＩａ）の酸化、ならびにそれに続くオキシム連結を形成することによって、アミノオキシ化学を使用する、例えば、ＰＥＧへの結合を教示する国際公開第２００８／０２５８５６号、およびＦＩＸの酸化、ならびにそれに続くヒドラジド化学を使用するＰＥＧへの結合を教示する米国特許第５，６２１，０３９号に説明されている。
近年、アルデヒドを生成するためのシアル酸の緩やかな過ヨウ素酸塩酸化後、触媒量のアニリンの存在下での、試薬を含有するアミノオキシ基との反応を含む、改善された方法が、説明された（Ｄｉｒｋｓｅｎ Ａ．，ａｎｄ Ｄａｗｓｏｎ ＰＥ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２００８；１９，２５４３−８、およびＺｅｎｇ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００９；６：２０７−９）。アニリン触媒は、オキシムライゲーションを著しく加速させ、非常に低い濃度の試薬の使用を可能にする。求核触媒の使用はまた、Ｄｉｒｋｓｅｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．，１２８：１５６０２−３（２００６）、Ｄｉｒｋｓｅｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ Ｅｄ．，４５：７５８１−４（２００６）、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｊ．Ｊ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ．，１０：２１４７−５０（２００９）、Ｇｉｕｓｅｐｐｏｎｅ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．，１２７：５５２８−３９（２００５）、およびＴｈｙｇｅｓｅｎ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｏｒｇ
Ｃｈｅｍ．，７５：１７５２−５（２０１０）にも説明されている。
アニリン触媒は、オキシムライゲーションを加速させ、短い反応時間および低い濃度のアミノオキシ試薬の使用を可能にするが、アニリンは、例えば、複合化される治療用タンパク質が、薬剤の基礎を形成する際には、考慮しなければならない、有毒性を有する。例えば、アニリンは、メトヘモグロビン血症を誘発することが示されている（Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｈ．．，ａｎｄ Ｊｏｌｌｏｗ，Ｄ．Ｊ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，３２（３）４２３−４３１，１９８７）。ラットの長期間の食餌療法は、脾臓中に腫瘍を誘発することが示されている（Ｇｏｏｄｍａｎ，ＤＧ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，７３（１）：２６５−７３，１９８４）。インビトロ研究はまた、アニリンが、染色体突然変異を誘発する可能性があり、遺伝毒性作用を起こす可能性があることも示している（Ｂｏｍｂｈａｒｄ Ｅ．Ｍ．ｅｔ Ｈｅｒｂｏｌｄ Ｂ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ３５，７８３−８３５，２００５）。
種々の試薬に関連する費用を最小限に抑え、患者の受容者への健康上のリスクを最小限に抑えつつ、タンパク質の薬力学的および／または薬物動態特性を改善する、水溶性ポリマーをタンパク質に複合化させるための物質および方法を開発する必要性が、依然として存在する。
米国特許第５，８４６，９５１号明細書 国際公開第９６／４０６６２号 国際公開第２００８／０２５８５６号 国際公開第０６／０７１８０１号 米国公開第２００９／００７６２３７号明細書 国際公開第２００８／０２５８５６号 米国特許第５，６２１，０３９号明細書
Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ｃｈｅｓｓ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２００３；２：２１４−２１ Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ ａｎｄ Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ．２００１；２１７：２１５−２４ Ｒｏｂｅｒｔｓら（Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ２００２；５４：４５９−７６） Ｒｏｔｈｆｕｓ ｅｔ Ｓｍｉｔｈ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９６３；２３８：１４０２−１０ ｖａｎ Ｌｅｎｔｅｎ ｅｔ Ａｓｈｗｅｌｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９７１；２４６：１８８９−９４ Ｗｉｌｃｈｅｋ Ｍ ａｎｄ Ｂａｙｅｒ ＥＡ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １９８７；１３８：４２９−４２ Ｄｉｒｋｓｅｎ Ａ．，ａｎｄ Ｄａｗｓｏｎ ＰＥ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２００８；１９，２５４３−８ Ｚｅｎｇ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００９；６：２０７−９ Ｄｉｒｋｓｅｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．，１２８：１５６０２−３（２００６） Ｄｉｒｋｓｅｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ Ｅｄ．，４５：７５８１−４（２００６） Ｋｏｈｌｅｒ，Ｊ．Ｊ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ．，１０：２１４７−５０（２００９） Ｇｉｕｓｅｐｐｏｎｅ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．，１２７：５５２８−３９（２００５） Ｔｈｙｇｅｓｅｎ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ．，７５：１７５２−５（２０１０） Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｈ．．，ａｎｄ Ｊｏｌｌｏｗ，Ｄ．Ｊ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，３２（３）４２３−４３１，１９８７ Ｇｏｏｄｍａｎ，ＤＧ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，７３（１）：２６５−７３，１９８４ Ｂｏｍｂｈａｒｄ Ｅ．Ｍ．ｅｔ Ｈｅｒｂｏｌｄ Ｂ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ３５，７８３−８３５，２００５
本発明は、タンパク質にポリマーを複合化させるための物質および方法を提供し、複合化反応が求核触媒によって触媒されるとき、それは種々の試薬に関連する費用を最小限に抑え、かつ患者の受容者への健康上のリスクを最小限に抑えつつ、タンパク質の薬力学的および／または薬物動態特性を改善する。本発明の種々の実施形態において、アニリンの代わりに使用するための代替的な触媒が提供される。
本開示はまた、本明細書に記載の治療用タンパク質を複合化するために使用することができる種々の水溶性ポリマー−アミノオキシリンカー試薬の調製のための最適化された手順を提供する。最近のＮＭＲ研究は、ＰＳＡ−アミノオキシ試薬の調製が室温で行われる場合、ＰＳＡの還元末端における副反応が起こり得ることを示した。したがって、本開示の様々な実施形態において、新しいプロセスが、２〜８℃の温度で行われる。一実施形態において、ＰＳＡ−アミノオキシ試薬を、本明細書に記載されるプロセスに従って、４℃で調製する。加えて、２〜８℃の温度でのクロマトグラフィ精製ステップ（例えば、ＩＥＸ）を使用した試薬の精製もまた、本開示によって企図される。全体のプロセス（化学反応およびＩＥＸによる複合体の精製）を２〜８℃の温度で行うとき、ＰＳＡの還元末端における望ましくない副反応は、実質的に低減される。
本開示に従う一実施形態において、水溶性ポリマーを治療用タンパク質の酸化炭水化物部分へ複合化させる方法が提供され、本方法は、複合化を可能にする条件下で、酸化炭水化物部分を活性化水溶性ポリマーと接触させることを含み、該水溶性ポリマーは、活性アミノオキシ基を含有し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧ、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）（Ｗａｒｗｉｃｋ Ｅｆｆｅｃｔ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｃｏｖｅｎｔｒｙ、ＵＫ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレンコマレイン酸無水物、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）からなる群から選択され、活性アミノオキシ基を含む水溶性ポリマーを、以下を含む方法によって調整する：ａ）酸化水溶性ポリマーと活性化アミノオキシリンカーとの間の安定したオキシム連結の形成を可能にする条件下で、酸化水溶性ポリマーを含む溶液を、活性アミノオキシ基を含むアミノオキシリンカーとともにインキュベートし、該条件が、約１分〜約２４時間の期間、約２℃〜約８℃の温度、光の存在下または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含み、それによって活性アミノオキシ基を含む水溶性ポリマーを形成すること、ｂ）約２℃〜約８℃の温度でクロマトグラフィ、濾過、透析、および沈殿からなる群から選択される方法により活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーを精製し、前述の炭水化物部分を、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）、四酢酸鉛（Ｐｂ（ＯＡｃ）４）、および過ルテニウム酸カリウム（ＫＲｕＯ４）からなる群から選択される酸化剤を含む緩衝液とともにインキュベーションすることによって酸化し、オキシム連結が、酸化炭水化物部分と水溶性ポリマー上の活性アミノオキシ基との間に形成され、前述のオキシム連結形成を、ｏ−アミノ安息香酸、ｍ−アミノ安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸、スルファニル酸、ｏ−アミノベンズアミド、ｏ−トルイジン、ｍ−トルイジン、ｐ−トルイジン、ｏ−アニシジン、ｍ−アニシジン、およびｐ−アニシジンからなる群から選択される求核触媒によって触媒すること。
別の実施形態において、酸化水溶性ポリマーと、活性アミノオキシ基を含むアミノオキシリンカーとを含む溶液を、撹拌しながら光の非存在下で１時間４℃でインキュベートする上述の方法が提供される。別の実施形態において、活性アミノオキシ基を含む水溶性ポリマーを、４℃の温度で陰イオン交換クロマトグラフィにより精製する上述の方法が提供される。別の実施形態において、酸化水溶性ポリマーが、ＰＳＡであり、ＮａＩＯ４とのインキュベーションにより酸化される上述の方法が提供される。
本開示の別の実施形態において、水溶性ポリマーを治療用タンパク質の酸化炭水化物部分へ複合化させる方法が提供され、本方法は、複合化を可能にする条件下で、酸化炭水化物部分を活性化水溶性ポリマーと接触させることを含み、該水溶性ポリマーは、活性アミノオキシ基を含有し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧ、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）（Ｗａｒｗｉｃｋ Ｅｆｆｅｃｔ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｃｏｖｅｎｔｒｙ、ＵＫ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレンコマレイン酸無水物、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）からなる群から選択され、活性アミノオキシ基を含む前述の水溶性ポリマーを、以下を含む方法によって調整する：ａ）水溶性ポリマーと活性化アミノオキシリンカーとの間の安定したオキシム連結の形成を可能にする条件下で、水溶性ポリマーを含む溶液を、活性アミノオキシ基を含むアミノオキシリンカーとともにインキュベートし、該条件が、約１分〜約２４時間の期間、約２２℃〜約３７℃の温度、光の存在下または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含み、それによって活性アミノオキシ基を含む水溶性ポリマーを形成すること、ｂ）クロマトグラフィ、濾過、透析、および沈殿からなる群から選択される方法により活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーを精製し、前述の炭水化物部分を、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）、四酢酸鉛（Ｐｂ（ＯＡｃ）４）、および過ルテニウム酸カリウム（ＫＲｕＯ４）からなる群から選択される酸化剤を含む緩衝液とともにインキュベーションすることによって酸化し、オキシム連結が、酸化炭水化物部分と水溶性ポリマー上の活性アミノオキシ基との間に形成され、前述のオキシム連結形成を、ｏ−アミノ安息香酸、ｍ−アミノ安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸、スルファニル酸、ｏ−アミノベンズアミド、ｏ−トルイジン、ｍ−トルイジン、ｐ−トルイジン、ｏ−アニシジン、ｍ−アニシジン、およびｐ−アニシジンからなる群から選択される求核触媒によって触媒すること。
別の実施形態において、水溶性ポリマーと、活性アミノオキシ基を含むアミノオキシリンカーとを含む溶液を撹拌しながら、光の非存在下で２２℃で２時間インキュベートする上述の方法が提供される。別の実施形態において、水溶性ポリマーと、活性アミノオキシ基を含むアミノオキシリンカーとを含む溶液を撹拌しながら、光の非存在下で２２℃で２時間インキュベートする上述の方法が提供され、前述の方法が、溶液の温度を約３２℃〜約３７℃の温度に上昇させ、更に１２〜２４時間インキュベートするステップを更に含む。別の実施形態において、温度を上昇させる直前に活性アミノオキシ基を含む付加的な量のアミノオキシリンカーを添加する更なるステップを含む、上述の方法が提供される。別の実施形態において、活性アミノオキシ基を含む水溶性ポリマーを、２２℃の温度で透析、限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）、およびクロマトグラフィからなる群から選択される方法によって精製する上述の方法が提供される。別の実施形態において、４℃で透析、ＵＦ／ＤＦ、またはクロマトグラフィからなる群から選択される方法によって活性アミノオキシ基を含む水溶性ポリマーを精製するステップを更に含む上述の方法が提供される。
本開示の様々な実施形態において、治療用タンパク質が、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、第ＦＶ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、トロンビン（ＦＩＩ）、プロテインＣ、プロテインＳ、ｔＰＡ、ＰＡＩ−１、組織因子（ＴＦ）、ＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＥＰＯ、インターフェロンα（ＩＦＮ−α）、コンセンサスインターフェロン、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−ω、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２α、ＩＬ−３３、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ａｎｇ−１、Ａｎｇ−２、Ａｎｇ−４、Ａｎｇ−Ｙ、アンジオポエチン様ポリペプチド１（ＡＮＧＰＴＬ１）、アンジオポエチン様ポリペプチド２（ＡＮＧＰＴＬ２）、アンジオポエチン様ポリペプチド３（ＡＮＧＰＴＬ３）、アンジオポエチン様ポリペプチド４（ＡＮＧＰＴＬ４）、アンジオポエチン様ポリペプチド５（ＡＮＧＰＴＬ５）、アンジオポエチン様ポリペプチド６（ＡＮＧＰＴＬ６）、アンジオポエチン様ポリペプチド７（ＡＮＧＰＴＬ７）、ビトロネクチン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオゲニン、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、骨形態形成タンパク質１、骨形態形成タンパク質２、骨形態形成タンパク質３、骨形態形成タンパク質４、骨形態形成タンパク質５、骨形態形成タンパク質６、骨形態形成タンパク質７、骨形態形成タンパク質８、骨形態形成タンパク質９、骨形態形成タンパク質１０、骨形態形成タンパク質１１、骨形態形成タンパク質１２、骨形態形成タンパク質１３、骨形態形成タンパク質１４、骨形態形成タンパク質１５、骨形態形成タンパク質受容体ＩＡ、骨形態形成タンパク質受容体ＩＢ、骨形態形成タンパク質受容体ＩＩ、脳由来神経栄養因子、カルジオトロフィン−１、繊毛様神経栄養因子、繊毛様神経栄養因子受容体、クリプト、クリプティック、サイトカイン誘導好中球走化性因子１、サイトカイン誘導好中球走化性因子２α、サイトカイン誘導好中球走化性因子２β、β内皮細胞増殖因子、エンドセリン１、上皮増殖因子、エピゲン、エピレグリン、上皮由来好中球誘引物質、線維芽細胞増殖因子４、線維芽細胞増殖因子５、線維芽細胞増殖因子６、線維芽細胞増殖因子７、線維芽細胞増殖因子８、線維芽細胞増殖因子８ｂ、線維芽細胞増殖因子８ｃ、線維芽細胞増殖因子９、線維芽細胞増殖因子１０、線維芽細胞増殖因子１１、線維芽細胞増殖因子１２、線維芽細胞増殖因子１３、線維芽細胞増殖因子１６、線維芽細胞増殖因子１７、線維芽細胞増殖因子１９、線維芽細胞増殖因子２０、線維芽細胞増殖因子２１、酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、グリア細胞株由来好中球因子受容体α１、グリア細胞株由来好中球因子受容体α２、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質α、増殖関連タンパク質β、増殖関連タンパク質γ、ヘパリン結合上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、肝細胞癌由来増殖因子、インスリン様増殖因子Ｉ、インスリン様増殖因子受容体、インスリン様増殖因子ＩＩ、インスリン様増殖因子結合タンパク質、ケラチノサイト増殖因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受容体α、神経増殖因子 神経増殖因子受容体、ニューロポエチン、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、胎盤増殖因子、胎盤増殖因子２、血小板由来内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子Ａ鎖、血小板由来増殖因子ＡＡ、血小板由来増殖因子ＡＢ、血小板由来増殖因子Ｂ鎖、血小板由来増殖因子ＢＢ、血小板由来増殖因子受容体α、血小板由来増殖因子受容体β、プレＢ細胞増殖刺激因子、幹細胞因子（ＳＣＦ）、幹細胞因子受容体、ＴＮＦ、ＴＮＦ０、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、形質転換増殖因子α、形質転換増殖因子β、形質転換増殖因子β１、形質転換増殖因子β１．２、形質転換増殖因子β２、形質転換増殖因子β３、形質転換増殖因子β５、潜在型形質転換増殖因子β１、形質転換増殖因子β結合タンパク質Ｉ、形質転換増殖因子β結合タンパク質ＩＩ、形質転換増殖因子β結合タンパク質ＩＩＩ、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）、Ｉ型腫瘍壊死因子受容体、ＩＩ型腫瘍壊死因子受容体、ウロキナーゼタイププラスミノーゲン活性剤受容体、ホスホリパーゼ活性化タンパク質（ＰＵＰ）、インスリン、レクチン リシン、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノーゲン活性化因子、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、およびＩｇＤ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ＤＮＡｓｅ、フェチュイン、黄体形成ホルモン、エストロゲン、インスリン、アルブミン、リポタンパク質、フェトプロテイン、トランスフェリン、トロンボポエチン、ウロキナーゼ、インテグリン、トロンビン、レプチン、ヒュミラ（アダリムマブ）、プロリア（デノスマブ）、エンブレル（エタネルセプト）、表１中のタンパク質、またはその生物学的に活性なフラグメント、誘導体、もしくは変異体からなる群から選択される、上述の方法が提供される。
更に別の実施形態において、約０．３ｍｇ／ｍＬ〜約３．０ｍｇ／ｍＬの初期濃度の治療用タンパク質を含む溶液が、活性化水溶性ポリマーと接触させる前に、ｐＨ値が約５．０〜約８．０になるように調整される上述の方法が提供される。一実施形態において、治療用タンパク質の初期濃度が、約１．０ｍｇ／ｍＬであり、ｐＨが、約６．０である。
別の実施形態において、治療用タンパク質が、所望の過剰濃度の活性化水溶性ポリマーによって接触され、過剰濃度が、約１モル〜約３００モル過剰である上述の方法が提供される。一実施形態において、過剰濃度が、約５０倍のモル過剰である。
別の実施形態において、治療用タンパク質が、約０．５時間〜約２４時間の期間、約２℃〜約３７℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、活性化水溶性ポリマーとともにインキュベートされる、上述の方法が提供される。一実施形態において、条件が、約１２０分の期間、約２２℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含む。
更に別の実施形態において、求核触媒が、約０．１分〜約３０分の期間、約２℃〜約３７℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、約１．０ｍＭ〜約５０ｍＭの求核触媒の最終濃度をもたらす量で添加される、上述の方法が提供される。一実施形態において、求核触媒の最終濃度が、約１０ｍＭであり、条件が、最大約１５分の期間、約２２℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含む。
更に別の実施形態において、酸化剤が、約０．１分〜１２０分の期間、約２℃〜約３７℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、約５０μＭ〜約１０００μＭの酸化剤の最終濃度をもたらす量で添加される、上述の方法が提供される。一実施形態において、酸化剤の最終濃度が、約４００μＭであり、条件が、約１０分の期間、約２２℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含む。
更に別の実施形態において、治療用タンパク質の酸化炭水化物部分への水溶性ポリマーの複合化が、Ｌ−システイン、メチオニン、グルタチオン、グリセロール、メタ重亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ５）、トリプトファン、チロシン、ヒスチジン、またはそれらの誘導体、クレゾール、イミダゾール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される反応停止剤の添加によって停止される上述の方法が提供され、前述の反応停止剤が、約５分〜約１２０分の期間、約２℃〜約３７℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、約１ｍＭ〜約１００ｍＭの反応停止剤の最終濃度をもたらす量で添加される。一実施形態において、反応停止剤が、Ｌ−システインである。更に別の実施形態において、Ｌ−システインが、約１０ｍＭの最終濃度をもたらすように添加され、条件が、約６０分の期間、約２２℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含む。
別の実施形態において、以下を含む上述の方法が提供される：ａ）ｐＨ値が約５．０〜約８．０になるように、治療用タンパク質を含む溶液のｐＨ値を調整させることを含み、治療用タンパク質濃度が、約０．３ｍｇ／ｍＬ〜約３．０ｍｇ／ｍＬである、第１のステップ、ｂ）治療用タンパク質において、１つ以上の炭水化物を酸化させることを含み、酸化剤が、約０．１分〜約１２０分の期間、約２℃〜約３７℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、約５０μＭ〜約１０００μＭの最終濃度をもたらすように、第１のステップ中の溶液に添加される、第２のステップ、ｃ）約０．５時間〜約２４時間の期間、約２℃〜約３７℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、所望の過剰濃度の活性化水溶性ポリマーと治療用タンパク質を接触させることを含み、過剰濃度が約１モル過剰〜約３００モル過剰である、第３のステップ、ｄ）第３のステップの溶液に、求核触媒を添加することを含み、求核触媒が、約０．１分〜約３０分の期間、約２℃〜約３７℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、約１ｍＭ〜約５０ｍＭの最終濃度をもたらすように添加される、第４のステップ、ｅ）治療用タンパク質が、治療用タンパク質の１つ以上の酸化炭水化物への活性化水溶性ポリマーの複合化を可能にする条件下で、活性化水溶性ポリマーおよび求核触媒とともにインキュベートされ、前述の条件が、約０．５時間〜約２４時間の期間、約２℃〜約３７℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む、第５のステップ、ｆ）第５のステップ中の治療用タンパク質の１つ以上の酸化炭水化物への水溶性ポリマーの複合化が、Ｌ−システイン、メチオニン、グルタチオン、グリセロール、Ｎａ２Ｓ２Ｏ５（メタ重亜硫酸ナトリウム）、トリプトファン、チロシン、ヒスチジン、またはそれらの誘導体、クレゾール、イミダゾール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される反応停止剤の添加によって停止され、反応停止剤が、約５分〜約１２０分の期間、約２℃〜約３７℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、約１ｍＭ〜約１００ｍＭの最終濃度をもたらすように添加される、第６のステップ。別の実施形態において、第１のステップ中の治療用タンパク質の初期濃度が、約１ｍｇ／ｍＬであり、ｐＨが、約６．０であり、第２のステップ中の酸化剤の最終濃度が、約４００μＭであり、第５のステップ中の条件が、約１０分の期間、約２２℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含み、第３のステップ中の過剰濃度が、約５０モル過剰であり、第３のステップ中の条件が、約１５分の期間、約２２℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含み、第４のステップ中の求核触媒の最終濃度が、約１０ｍＭであり、第４のステップ中の条件が、約１５分の期間、約２２℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含み、第５のステップ中の活性化水溶性ポリマーおよび求核触媒とともに治療用タンパク質をインキュベートする条件が、約２時間の期間、約２２℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含み、第６のステップ中の反応停止剤が、Ｌ−システインであり、Ｌ−システインが、約１０ｍＭの最終濃度をもたらすように添加され、第６のステップ中の条件が、約６０分の期間、約２２℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含む。更に別の実施形態において、水溶性ポリマーがＰＳＡである。一実施形態において、水溶性ポリマーがＰＥＧである。別の実施形態において、水溶性ポリマーがＨＥＳである。更に別の実施形態において、水溶性ポリマーがＨＡＳである。別の実施形態において、ＰＳＡが約１０〜３００個のシアル酸単位からなる。更に別の実施形態において、治療用タンパク質がＦＩＸである。更に別の実施形態において、治療用タンパク質がＦＶＩＩａである。更に別の実施形態において、治療用タンパク質がＦＶＩＩＩである。
別の実施形態において、酸化剤が過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）である上述の方法が提供される。
別の実施形態において、治療用タンパク質の酸化炭水化物部分が、血液凝固タンパク質の活性化ペプチド内に位置する上述の方法が提供される。
別の実施形態において、ＰＳＡが、活性化アミノオキシリンカーを含み、該活性化アミノオキシリンカーが、ａ）式：


の３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンリンカー、
ｂ）式：


の３，６，９−トリオキサ−ウンデカン−１，１１−ジオキシアミンリンカー、および
ｃ）式：


の３，６，９，１２，１５−ペナトキサ（ｐｅｎａｔｏｘａ）−ヘプタデカン−１，１７−ジオキシアミンリンカーからなる群より選択され、ＰＳＡが、酸化剤とともにインキュベーションすることによって酸化され、前述のＰＳＡの非還元末端において、末端アルデヒド基を形成する、上述の方法が提供される。
別の実施形態において、アミノオキシリンカーが、３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンである。
別の実施形態において、求核触媒が、約１ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度で提供される上述の方法が提供される。別の実施形態において、求核触媒が、ｍ−トルイジンである。更に別の実施形態において、ｍ−トルイジンが、約１０ｍＭの濃度で、複合化反応において存在する。
別の実施形態において、複合化された治療用タンパク質を精製するステップを更に含む上述の方法が提供される。一実施形態において、複合化された治療用タンパク質が、クロマトグラフィ、濾過、および沈殿からなる群から選択される方法によって精製される。更に別の実施形態において、クロマトグラフィが、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）、イオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＣ）、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）、親和性クロマトグラフィ、および逆相クロマトグラフィからなる群から選択される。一実施形態において、抗カオトロピック塩が、クロマトグラフィの負荷ステップおよびクロマトグラフィの洗浄ステップにおいて使用される。更に別の実施形態において、クロマトグラフィが、カラムにおいて行われる。一実施形態において、カラムが、フェニル−セファロースＦＦおよびブチル−セファロースＦＦからなる群から選択されるクロマトグラフィ樹脂を含む。更に別の実施形態において、樹脂が、約５ｃｍ〜約２０ｃｍの床高さでカラム中に存在する。
更に別の実施形態において、床高さが、約１０ｃｍである。別の実施形態において、流れ方向が、上向流に設定され、流速が、約０．２ｃｍ／分〜約６．７ｃｍ／分である、１つ以上の洗浄ステップを含む上述の方法が提供される。一実施形態において、流速が、約２ｃｍ／分である。別の実施形態において、流れ方向が、下向流に設定され、流速が、約０．１ｃｍ／分〜約６．７ｃｍ／分である、１つ以上の溶出ステップを含む上述の方法が提供される。一実施形態において、流速が、約１ｃｍ／分である。
更に別の実施形態において、限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって、複合化された治療用タンパク質を濃縮させることを更に含む上述の方法が提供される。別の実施形態において、治療用タンパク質の最終濃度が、約０．５〜約３ｍｇ／ｍＬである上述の方法が提供される。別の実施形態において、治療用タンパク質が、約５〜約１１個の水溶性ポリマー部分を含む上述の方法が提供される。
更に別の実施形態において、複合化された治療用タンパク質が、クロマトグラフィを用いて精製され、抗カオトロピック塩が、負荷ステップおよび洗浄ステップにおいて使用される上述の方法が提供され、この方法が、流れ方向が、上向流に設定され、流速が、約０．２ｃｍ／分〜約６．７ｃｍ／分である、１つ以上の洗浄ステップと、流れ方向が、下向流に設定され、流速が、約０．２ｃｍ／分〜約６．７ｃｍ／分である、１つ以上の溶出ステップとを含み、限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって、複合化された治療用タンパク質を濃縮させることを更に含む。
別の実施形態において、クロマトグラフィが、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）であり、１つ以上の洗浄ステップの流速が、約２ｃｍ／分であり、１つ以上の溶出ステップの流速が、約１ｃｍ／分である、上述の方法が提供される。
上述の方法によって産生される修飾された治療用タンパク質もまた、本開示により提供される。
本開示の一実施形態において、活性アミノオキシ基を含有する活性化水溶性ポリマーを調製する方法が提供され、本方法は以下を含む：ａ）酸化水溶性ポリマーと活性化アミノオキシリンカーとの間の安定したオキシム連結の形成を可能にする条件下で、酸化水溶性ポリマーを含む溶液を、活性アミノオキシ基を含むアミノオキシリンカーとともにインキュベートし、該条件が、約１分〜約２４時間の期間、約２℃〜約８℃の温度、光の存在下または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含み、それによって活性アミノオキシ基を含む水溶性ポリマーを形成すること、ｂ）約２℃〜約８℃の温度でクロマトグラフィ、濾過、透析、および沈殿からなる群から選択される方法により活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーを精製し、該水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧ、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）（Ｗａｒｗｉｃｋ Ｅｆｆｅｃｔ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｃｏｖｅｎｔｒｙ、ＵＫ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレンコマレイン酸無水物、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）からなる群から選択され、それによって水溶性ポリマーとアミノオキシリンカーとの間のオキシム連結を形成すること。
別の実施形態において、オキシム連結形成が、ｏ−アミノ安息香酸、ｍ−アミノ安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸、スルファニル酸、ｏ−アミノベンズアミド、ｏ−トルイジン、ｍ−トルイジン、ｐ−トルイジン、ｏ−アニシジン、ｍ−アニシジン、およびｐ−アニシジンからなる群から選択される求核触媒によって触媒される上述の方法が提供される。
別の実施形態において、水溶性ポリマーがＰＳＡである上述の方法が提供される。別の実施形態において、水溶性ポリマーがＰＥＧである上述の方法が提供される。別の実施形態において、酸化水溶性ポリマーと、活性アミノオキシ基を含むアミノオキシリンカーとを含む溶液を撹拌しながら、光の非存在下で４℃で１時間インキュベートする上述の方法が提供される。別の実施形態において、活性アミノオキシ基を含む水溶性ポリマーを、４℃の温度で陰イオン交換クロマトグラフィにより精製する上述の方法が提供される。
本開示の更に別の実施形態において、活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーを調製する方法が提供され、本方法は以下を含む：ａ）水溶性ポリマーと活性化アミノオキシリンカーとの間の安定したオキシム連結の形成を可能にする条件下で、水溶性ポリマーを含む溶液を、活性アミノオキシ基を含むアミノオキシリンカーとともにインキュベートし、該条件が、約１分〜約２４時間の期間、約２２℃〜約３７℃の温度、光の存在下または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含み、それによって活性アミノオキシ基を含む水溶性ポリマーを形成すること、ｂ）クロマトグラフィ、濾過、透析、および沈殿からなる群から選択される方法により活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーを精製し、それによって水溶性ポリマーとアミノオキシリンカーとの間のオキシム連結を形成すること。
別の実施形態において、前述のオキシム連結形成が、ｏ−アミノ安息香酸、ｍ−アミノ安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸、スルファニル酸、ｏ−アミノベンズアミド、ｏ−トルイジン、ｍ−トルイジン、ｐ−トルイジン、ｏ−アニシジン、ｍ−アニシジン、およびｐ−アニシジンからなる群から選択される求核触媒によって触媒される上述の方法が提供される。
別の実施形態において、水溶性ポリマーと、活性アミノオキシ基を含むアミノオキシリンカーとを含む溶液を撹拌しながら、光の非存在下で２２℃で２時間インキュベートする上述の方法が提供される。別の実施形態において、水溶性ポリマーと、活性アミノオキシ基を含むアミノオキシリンカーとを含む溶液を撹拌しながら、光の非存在下で２２℃で２時間インキュベートする上述の方法が提供され、前述の方法が、溶液の温度を約３２℃〜約３７℃の温度に上昇させ、更に１２〜２４時間インキュベートするステップを更に含む。別の実施形態において、温度を上昇させる直前に活性アミノオキシ基を含む付加的な量のアミノオキシリンカーを添加する更なるステップを含む、上述の方法が提供される。
別の実施形態において、活性アミノオキシ基を含む水溶性ポリマーを、２２℃の温度で透析、限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）、およびクロマトグラフィからなる群から選択される方法によって精製する上述の方法が提供される。別の実施形態において、４℃で透析、ＵＦ／ＤＦ、またはクロマトグラフィからなる群から選択される方法によって活性アミノオキシ基を含む水溶性ポリマーを精製するステップを更に含む上述の方法が提供される。
本開示の更に別の実施形態において、ＰＳＡ−アミノオキシ試薬アミノオキシ基を調製する方法が提供され、本方法は以下を含む：ａ）酸化ＰＳＡと活性化アミノオキシリンカーとの間の安定したオキシム連結の形成を可能にする条件下で、酸化ＰＳＡを含む溶液を、活性アミノオキシ基を含むアミノオキシリンカーとともにインキュベートし、該条件が、１時間の期間、４℃の温度、光の非存在下、撹拌しながらを含み、それによって活性アミノオキシ基を含有するＰＳＡを形成すること、ｂ）活性アミノオキシ基を含有するＰＳＡを、４℃の温度で陰イオン交換クロマトグラフィにより精製し、該活性化アミノオキシリンカーが、式：


の３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンリンカーであって、
それによってＰＳＡとアミノオキシリンカーとの間のオキシム連結を形成すること。
本開示の更に別の実施形態において、ＰＳＡ−アミノオキシ試薬アミノオキシ基を調製する方法が提供され、本方法は以下を含む：ａ）非酸化ＰＳＡと活性化アミノオキシリンカーとの間の安定したオキシム連結の形成を可能にする条件下で、非酸化ＰＳＡを含む溶液を、活性アミノオキシ基を含むアミノオキシリンカーとともにインキュベートし、該条件が、２時間の期間、２２℃の温度、光の非存在下、撹拌しながらを含み、それによって活性アミノオキシ基を含有するＰＳＡを形成すること、ｂ）活性アミノオキシ基を含有するＰＳＡを、２２℃の温度で透析により精製し、該活性化アミノオキシリンカーが、式：


の３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンリンカーであって、
それによって非酸化ＰＳＡとアミノオキシリンカーとの間のオキシム連結を形成すること。
本開示の更に別の実施形態において、水溶性ポリマーを血液凝固タンパク質の酸化炭水化物部分へ複合化させる方法が提供され、本方法は、複合化を可能にする条件下で、酸化炭水化物部分を活性化水溶性ポリマーと接触させることを含み、該血液凝固タンパク質が、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、第ＦＶ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、トロンビン（ＦＩＩ）、プロテインＣ、プロテインＳ、ｔＰＡ、ＰＡＩ−１、組織因子（ＴＦ）、およびＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼ、またはその生物学的に活性なフラグメント、誘導体、もしくは変異体からなる群から選択され、前述の水溶性ポリマーが、活性アミノオキシ基を含有し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧ、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレンコマレイン酸無水物、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）からなる群から選択され、前述の炭水化物部分が、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）、四酢酸鉛（Ｐｂ（ＯＡｃ）４）、および過ルテニウム酸カリウム（ＫＲｕＯ４）からなる群から選択される酸化剤を含む緩衝液でインキュベートすることによって酸化され、オキシム連結が、酸化炭水化物部分と水溶性ポリマー上の活性アミノオキシ基との間に形成される。
本発明は、例えば、以下を提供する。
（項目１）
水溶性ポリマーを治療用タンパク質の酸化炭水化物部分へ複合化させる方法であって、複合化を可能にする条件下で、前記酸化炭水化物部分を活性化水溶性ポリマーと接触させることを含み、
前記水溶性ポリマーが、活性アミノオキシ基を含有し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧ、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）（Ｗａｒｗｉｃｋ Ｅｆｆｅｃｔ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｃｏｖｅｎｔｒｙ、ＵＫ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレンコマレイン酸無水物、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）からなる群から選択され、
活性アミノオキシ基を含む前記水溶性ポリマーが、
ａ）酸化水溶性ポリマーを含む溶液を、活性アミノオキシ基を含むアミノオキシリンカーとともに、前記酸化水溶性ポリマーと前記活性化アミノオキシリンカーとの間の安定したオキシム連結の形成を可能にする条件下で、インキュベートし、前記条件が、約１分〜約２４時間の期間、約２℃〜約８℃の温度、光の存在下または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含み、それによって活性アミノオキシ基を含む水溶性ポリマーを形成することと、
ｂ）約２℃〜約８℃の温度でクロマトグラフィ、濾過、透析、および沈殿からなる群から選択される方法により活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーを精製することと、を含む方法によって調製され、
前記炭水化物部分が、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）、四酢酸鉛（Ｐｂ（ＯＡｃ）４）、および過ルテニウム酸カリウム（ＫＲｕＯ４）からなる群から選択される酸化剤を含む緩衝液とともにインキュベーションすることによって酸化され、
オキシム連結が、前記酸化炭水化物部分と前記水溶性ポリマー上の前記活性アミノオキシ基との間に形成され、
前記オキシム連結形成が、ｏ−アミノ安息香酸、ｍ−アミノ安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸、スルファニル酸、ｏ−アミノベンズアミド、ｏ−トルイジン、ｍ−トルイジン、ｐ−トルイジン、ｏ−アニシジン、ｍ−アニシジン、およびｐ−アニシジンからなる群から選択される求核触媒によって触媒される、方法。
（項目２）
前記酸化水溶性ポリマーと、活性アミノオキシ基を含む前記アミノオキシリンカーとを含む前記溶液を、撹拌しながら光の非存在下で１時間４℃でインキュベートする、項目１に記載の方法。
（項目３）
活性アミノオキシ基を含む前記水溶性ポリマーを、４℃の温度で陰イオン交換クロマトグラフィにより精製する、項目３に記載の方法。
（項目４）
前記酸化水溶性ポリマーがＰＳＡであり、ＮａＩＯ４とのインキュベーションにより酸化される、項目３に記載の方法。
（項目５）
水溶性ポリマーを治療用タンパク質の酸化炭水化物部分へ複合化させる方法であって、複合化を可能にする条件下で、前記酸化炭水化物部分を活性化水溶性ポリマーと接触させることを含み、
前記水溶性ポリマーが、活性アミノオキシ基を含有し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧ、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）（Ｗａｒｗｉｃｋ Ｅｆｆｅｃｔ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｃｏｖｅｎｔｒｙ、ＵＫ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレンコマレイン酸無水物、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）からなる群から選択され、
活性アミノオキシ基を含む前記水溶性ポリマーが、
ａ）水溶性ポリマーを含む溶液を、活性アミノオキシ基を含むアミノオキシリンカーとともに、前記水溶性ポリマーと前記活性化アミノオキシリンカーとの間の安定したオキシム連結の形成を可能にする条件下で、インキュベートし、前記条件が、約１分〜約２４時間の期間、約２２℃〜約３７℃の温度、光の存在下または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含み、それによって活性アミノオキシ基を含む水溶性ポリマーを形成することと、
ｂ）クロマトグラフィ、濾過、透析、および沈殿からなる群から選択される方法により活性アミノオキシ基を含有する前記水溶性ポリマーを精製することと、を含む方法によって調製され、
前記炭水化物部分が、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）、四酢酸鉛（Ｐｂ（ＯＡｃ）４）、および過ルテニウム酸カリウム（ＫＲｕＯ４）からなる群から選択される酸化剤を含む緩衝液とともにインキュベーションすることによって酸化され、
オキシム連結が、前記酸化炭水化物部分と前記水溶性ポリマー上の前記活性アミノオキシ基との間に形成され、
前記オキシム連結形成が、ｏ−アミノ安息香酸、ｍ−アミノ安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸、スルファニル酸、ｏ−アミノベンズアミド、ｏ−トルイジン、ｍ−トルイジン、ｐ−トルイジン、ｏ−アニシジン、ｍ−アニシジン、およびｐ−アニシジンからなる群から選択される求核触媒によって触媒される、方法。
（項目６）
前記水溶性ポリマーと、活性アミノオキシ基を含む前記アミノオキシリンカーとを含む前記溶液を撹拌しながら、光の非存在下で２２℃で２時間インキュベートする、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記水溶性ポリマーと、活性アミノオキシ基を含む前記アミノオキシリンカーとを含む前記溶液を撹拌しながら、光の非存在下で２２℃で２時間インキュベートする方法であって、前記方法が、前記溶液の温度を約３２℃〜約３７℃の温度に上昇させ、更に１２〜２４時間インキュベートするステップを更に含む、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記温度を上昇させる直前に活性アミノオキシ基を含む付加的な量のアミノオキシリンカーを添加する更なるステップを含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
活性アミノオキシ基を含む前記水溶性ポリマーを、２２℃の温度で透析、限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）、およびクロマトグラフィからなる群から選択される方法によって精製する、項目５〜９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
４℃で透析、ＵＦ／ＤＦ、またはクロマトグラフィからなる群から選択される方法によって活性アミノオキシ基を含む前記水溶性ポリマーを精製するステップを更に含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記治療用タンパク質が、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、第ＦＶ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、トロンビン（ＦＩＩ）、プロテインＣ、プロテインＳ、ｔＰＡ、ＰＡＩ−１、組織因子（ＴＦ）、ＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＥＰＯ、インターフェロンα（ＩＦＮ−α）、コンセンサスインターフェロン、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−ω、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２α、ＩＬ−３３、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ａｎｇ−１、Ａｎｇ−２、Ａｎｇ−４、Ａｎｇ−Ｙ、アンジオポエチン様ポリペプチド１（ＡＮＧＰＴＬ１）、アンジオポエチン様ポリペプチド２（ＡＮＧＰＴＬ２）、アンジオポエチン様ポリペプチド３（ＡＮＧＰＴＬ３）、アンジオポエチン様ポリペプチド４（ＡＮＧＰＴＬ４）、アンジオポエチン様ポリペプチド５（ＡＮＧＰＴＬ５）、アンジオポエチン様ポリペプチド６（ＡＮＧＰＴＬ６）、アンジオポエチン様ポリペプチド７（ＡＮＧＰＴＬ７）、ビトロネクチン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオゲニン、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、骨形態形成タンパク質１、骨形態形成タンパク質２、骨形態形成タンパク質３、骨形態形成タンパク質４、骨形態形成タンパク質５、骨形態形成タンパク質６、骨形態形成タンパク質７、骨形態形成タンパク質８、骨形態形成タンパク質９、骨形態形成タンパク質１０、骨形態形成タンパク質１１、骨形態形成タンパク質１２、骨形態形成タンパク質１３、骨形態形成タンパク質１４、骨形態形成タンパク質１５、骨形態形成タンパク質受容体ＩＡ、骨形態形成タンパク質受容体ＩＢ、骨形態形成タンパク質受容体ＩＩ、脳由来神経栄養因子、カルジオトロフィン−１、繊毛様神経栄養因子、繊毛様神経栄養因子受容体、クリプト、クリプティック、サイトカイン誘導好中球走化性因子１、サイトカイン誘導好中球走化性因子２α、サイトカイン誘導好中球走化性因子２β、β内皮細胞増殖因子、エンドセリン１、上皮増殖因子、エピゲン、エピレグリン、上皮由来好中球誘引物質、線維芽細胞増殖因子４、線維芽細胞増殖因子５、線維芽細胞増殖因子６、線維芽細胞増殖因子７、線維芽細胞増殖因子８、線維芽細胞増殖因子８ｂ、線維芽細胞増殖因子８ｃ、線維芽細胞増殖因子９、線維芽細胞増殖因子１０、線維芽細胞増殖因子１１、線維芽細胞増殖因子１２、線維芽細胞増殖因子１３、線維芽細胞増殖因子１６、線維芽細胞増殖因子１７、線維芽細胞増殖因子１９、線維芽細胞増殖因子２０、線維芽細胞増殖因子２１、酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、グリア細胞株由来好中球因子受容体α１、グリア細胞株由来好中球因子受容体α２、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質α、増殖関連タンパク質β、増殖関連タンパク質γ、ヘパリン結合上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、肝細胞癌由来増殖因子、インスリン様増殖因子Ｉ、インスリン様増殖因子受容体、インスリン様増殖因子ＩＩ、インスリン様増殖因子結合タンパク質、ケラチノサイト増殖因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受容体α、神経増殖因子 神経増殖因子受容体、ニューロポエチン、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、胎盤増殖因子、胎盤増殖因子２、血小板由来内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子Ａ鎖、血小板由来増殖因子ＡＡ、血小板由来増殖因子ＡＢ、血小板由来増殖因子Ｂ鎖、血小板由来増殖因子ＢＢ、血小板由来増殖因子受容体α、血小板由来増殖因子受容体β、プレＢ細胞増殖刺激因子、幹細胞因子（ＳＣＦ）、幹細胞因子受容体、ＴＮＦ、ＴＮＦ０、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、形質転換増殖因子α、形質転換増殖因子β、形質転換増殖因子β１、形質転換増殖因子β１．２、形質転換増殖因子β２、形質転換増殖因子β３、形質転換増殖因子β５、潜在型形質転換増殖因子β１、形質転換増殖因子β結合タンパク質Ｉ、形質転換増殖因子β結合タンパク質ＩＩ、形質転換増殖因子β結合タンパク質ＩＩＩ、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）、Ｉ型腫瘍壊死因子受容体、ＩＩ型腫瘍壊死因子受容体、ウロキナーゼタイププラスミノーゲン活性剤受容体、ホスホリパーゼ活性化タンパク質（ＰＵＰ）、インスリン、レクチン リシン、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノーゲン活性化因子、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、およびＩｇＤ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ＤＮＡｓｅ、フェチュイン、黄体形成ホルモン、エストロゲン、インスリン、アルブミン、リポタンパク質、フェトプロテイン、トランスフェリン、トロンボポエチン、ウロキナーゼ、インテグリン、トロンビン、レプチン、ヒュミラ（アダリムマブ）、プロリア（デノスマブ）、エンブレル（エタネルセプト）、表１中のタンパク質、またはその生物学的に活性なフラグメント、誘導体、もしくは変異体からなる群から選択される、項目１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
約０．３ｍｇ／ｍＬ〜約３．０ｍｇ／ｍＬの初期濃度の前記治療用タンパク質を含む溶液が、前記活性化水溶性ポリマーと接触させる前に、ｐＨ値が約５．０〜約８．０になるように調整される、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記治療用タンパク質の前記初期濃度が、約１．０ｍｇ／ｍＬであり、前記ｐＨが、約６．０である、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記治療用タンパク質が、所望の過剰濃度の活性化水溶性ポリマーによって接触され、前記過剰濃度が、約１モル〜約３００モル過剰である、項目１１に記載の方法。
（項目１５）
前記過剰濃度が、約５０倍のモル過剰である、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記治療用タンパク質が、約０．５時間〜約２４時間の期間、約２℃〜約３７℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、前記活性化水溶性ポリマーとともにインキュベートされる、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
前記条件が、約１２０分の期間、約２２℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記求核触媒が、約０．１分〜約３０分の期間、約２℃〜約３７℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、約１．０ｍＭ〜約５０ｍＭの求核触媒の最終濃度をもたらす量で添加される、項目１１に記載の方法。
（項目１９）
前記求核触媒の前記最終濃度が、約１０ｍＭであり、前記条件が、最大約１５分の期間、約２２℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含む、項目１８に記載の方法。（項目２０）
前記酸化剤が、約０．１分〜１２０分の期間、約２℃〜約３７℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、約５０μＭ〜約１０００μＭの酸化剤の最終濃度をもたらす量で添加される、項目１１に記載の方法。
（項目２１）
前記酸化剤の前記最終濃度が、約４００μＭであり、前記条件が、約１０分の期間、約２２℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含む、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記治療用タンパク質の前記酸化炭水化物部分への前記水溶性ポリマーの前記複合化が、Ｌ−システイン、メチオニン、グルタチオン、グリセロール、メタ重亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ５）、トリプトファン、チロシン、ヒスチジン、またはそれらの誘導体、クレゾール、イミダゾール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される反応停止剤の添加によって停止され、
前記反応停止剤が、約５分〜約１２０分の期間、約２℃〜約３７℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、約１ｍＭ〜約１００ｍＭの反応停止剤の最終濃度をもたらす量で添加される、項目１１に記載の方法。
（項目２３）
前記反応停止剤が、Ｌ−システインである、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記Ｌ−システインが、約１０ｍＭの最終濃度をもたらすように添加され、前記条件が、約６０分の期間、約２２℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含む、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
ａ）ｐＨ値が約５．０〜約８．０になるように、前記治療用タンパク質を含む溶液の前記ｐＨ値を調整させることを含み、前記治療用タンパク質濃度が、約０．３ｍｇ／ｍＬ〜約３．０ｍｇ／ｍＬである、第１のステップと、
ｂ）前記治療用タンパク質において、１つ以上の炭水化物を酸化させることを含み、前記酸化剤が、約０．１分〜約１２０分の期間、約２℃〜約３７℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、約５０μＭ〜約１０００μＭの最終濃度をもたらすように、前記第１のステップ中の前記溶液に添加される、第２のステップと、
ｃ）約０．５時間〜約２４時間の期間、約２℃〜約３７℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、所望の過剰濃度の活性化水溶性ポリマーと前記治療用タンパク質を接触させることを含み、前記過剰濃度が、約１モル過剰〜約３００モル過剰である、第３のステップと、
ｄ）前記第３のステップの前記溶液に、求核触媒を添加することを含み、前記求核触媒が、約０．１分〜約３０分の期間、約２℃〜約３７℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、約１ｍＭ〜約５０ｍＭの最終濃度をもたらすように添加される、第４のステップと、
ｅ）前記治療用タンパク質が、前記治療用タンパク質の１つ以上の酸化炭水化物への前記活性化水溶性ポリマーの複合化を可能にする条件下で、前記活性化水溶性ポリマーおよび求核触媒とともにインキュベートされ、前記条件が、約０．５時間〜約２４時間の期間、約２℃〜約３７℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む、第５のステップと、
ｆ）第５のステップ中の前記治療用タンパク質の前記１つ以上の酸化炭水化物への前記水溶性ポリマーの前記複合化が、Ｌ−システイン、メチオニン、グルタチオン、グリセロール、Ｎａ２Ｓ２Ｏ５（メタ重亜硫酸ナトリウム）、トリプトファン、チロシン、ヒスチジン、またはそれらの誘導体、クレゾール、イミダゾール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される反応停止剤の添加によって停止され、前記反応停止剤が、約５分〜約１２０分の期間、約２℃〜約３７℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、約１ｍＭ〜約１００ｍＭの最終濃度をもたらすように添加される、第６のステップと、を含む、項目１１に記載の方法。
（項目２６）
前記第１のステップ中の前記治療用タンパク質の前記初期濃度が、約１ｍｇ／ｍＬであり、前記ｐＨが、約６．０であり、
前記第２のステップ中の前記酸化剤の前記最終濃度が、約４００μＭであり、前記第５のステップ中の前記条件が、約１０分の期間、約２２℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含み、
前記第３のステップ中の前記過剰濃度が、約５０モル過剰であり、前記第３のステップ中の前記条件が、約１５分の期間、約２２℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含み、
前記第４のステップ中の前記求核触媒の前記最終濃度が、約１０ｍＭであり、前記第４のステップ中の前記条件が、約１５分の期間、約２２℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含み、
前記第５のステップ中の前記活性化水溶性ポリマーおよび求核触媒とともに前記治療用タンパク質をインキュベートする前記条件が、約２時間の期間、約２２℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含み、
前記第６のステップ中の前記反応停止剤が、Ｌ−システインであり、前記Ｌ−システインが、約１０ｍＭの最終濃度をもたらすように添加され、前記第６のステップ中の前記条件が、約６０分の期間、約２２℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記水溶性ポリマーがＰＳＡである、項目１１に記載の方法。
（項目２８）
前記水溶性ポリマーがＰＥＧである、項目１１に記載の方法。
（項目２９）
前記水溶性ポリマーがＨＥＳである、項目１１に記載の方法。
（項目３０）
前記水溶性ポリマーがＨＡＳである、項目１１に記載の方法。
（項目３１）
前記ＰＳＡが約１０〜３００個のシアル酸単位からなる、項目２７に記載の方法。
（項目３２）
前記治療用タンパク質がＦＩＸである、項目１１〜３１のいずれか１項に記載の方法。（項目３３）
前記治療用タンパク質がＦＶＩＩａである、項目１１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
（項目３４）
前記治療用タンパク質がＦＶＩＩＩである、項目１１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
（項目３５）
前記酸化剤が過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）である、項目１１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３６）
前記治療用タンパク質の前記酸化炭水化物部分が、血液凝固タンパク質の活性化ペプチド内に位置する、項目３２〜３４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３７）
前記ＰＳＡが、活性化アミノオキシリンカーを含み、前記アミノオキシリンカーが、
ａ）式：



の３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンリンカー、
ｂ）式：


の３，６，９−トリオキサ−ウンデカン−１，１１−ジオキシアミンリンカー、および
ｃ）式：



の３，６，９，１２，１５−ペナトキサ（ｐｅｎａｔｏｘａ）−ヘプタデカン−１，１７−ジオキシアミンリンカーからなる群より選択され、前記ＰＳＡが、酸化剤とともにインキュベーションすることによって酸化され、前記ＰＳＡの非還元末端において、末端アルデヒド基を形成する、項目２７に記載の方法。
（項目３８）
前記アミノオキシリンカーが、３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンである、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記求核触媒が、約１ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度で提供される、項目１１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
（項目４０）
前記求核触媒が、ｍ−トルイジンである、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記ｍ−トルイジンが、約１０ｍＭの濃度で、複合化反応において存在する、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記複合化された治療用タンパク質を精製するステップを更に含む、項目１１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
（項目４３）
前記複合化された治療用タンパク質が、クロマトグラフィ、濾過、および沈殿からなる群から選択される方法によって精製される、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記クロマトグラフィが、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）、イオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＣ）、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）、親和性クロマトグラフィ、および逆相クロマトグラフィからなる群から選択される、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
抗カオトロピック塩が、クロマトグラフィの負荷ステップおよびクロマトグラフィの洗浄ステップにおいて使用される、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記クロマトグラフィが、カラムにおいて行われる、項目４４に記載の方法。
（項目４７）
前記カラムが、フェニル−セファロースＦＦおよびブチル−セファロースＦＦからなる群から選択されるクロマトグラフィ樹脂を含む、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記樹脂が、約５ｃｍ〜約２０ｃｍの床高さで前記カラム中に存在する、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記床高さが、約１０ｃｍである、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
流れ方向が、上向流に設定され、流速が、約０．２ｃｍ／分〜約６．７ｃｍ／分である、１つ以上の洗浄ステップを含む、項目４６に記載の方法。
（項目５１）
前記流速が、約２ｃｍ／分である、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
流れ方向が、下向流に設定され、流速が、約０．１ｃｍ／分〜約６．７ｃｍ／分である、１つ以上の溶出ステップを含む、項目４７〜５２のいずれか１項に記載の方法。
（項目５３）
前記流速が、約１ｃｍ／分である、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって、前記複合化された治療用タンパク質を濃縮させることを更に含む、項目４２〜５３のいずれか１項に記載の方法。
（項目５５）
前記治療用タンパク質の前記最終濃度が、約０．５〜約３ｍｇ／ｍＬである、項目４２〜５４のいずれか１項に記載の方法。
（項目５６）
前記治療用タンパク質が、約５〜約１１個の水溶性ポリマー部分を含む、項目４２〜５５のいずれか１項に記載の方法。
（項目５７）
前記複合化された治療用タンパク質が、クロマトグラフィを用いて精製され、抗カオトロピック塩が、負荷ステップおよび洗浄ステップにおいて使用され、前記方法が、流れ方向が、上向流に設定され、流速が、約０．２ｃｍ／分〜約６．７ｃｍ／分である、１つ以上の洗浄ステップと、流れ方向が、下向流に設定され、流速が、約０．２ｃｍ／分〜約６．７ｃｍ／分である、１つ以上の溶出ステップと、を含み、限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって、前記複合化された治療用タンパク質を濃縮させることを更に含む、項目１１に記載の方法。
（項目５８）
前記クロマトグラフィが、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）であり、前記１つ以上の洗浄ステップの流速が、約２ｃｍ／分であり、前記１つ以上の溶出ステップの流速が、約１ｃｍ／分である、項目５１に記載の方法。
（項目５９）
項目１〜５８のいずれか１項に記載の方法によって産生される、修飾された治療用タンパク質。
（項目６０）
活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーを調製する方法であって、
ａ）酸化水溶性ポリマーを含む溶液を、活性アミノオキシ基を含むアミノオキシリンカーとともに、前記酸化水溶性ポリマーと前記活性化アミノオキシリンカーとの間の安定したオキシム連結の形成を可能にする条件下で、インキュベートし、前記条件が、約１分〜約２４時間の期間、約２℃〜約８℃の温度、光の存在下または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含み、それによって活性アミノオキシ基を含む水溶性ポリマーを形成することと、
ｂ）約２℃〜約８℃の温度でクロマトグラフィ、濾過、透析、および沈殿からなる群から選択される方法により活性アミノオキシ基を含有する前記水溶性ポリマーを精製することと、を含む方法によって調製され、
前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧ、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）（Ｗａｒｗｉｃｋ Ｅｆｆｅｃｔ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｃｏｖｅｎｔｒｙ、ＵＫ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレンコマレイン酸無水物、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）からなる群から選択され、
それによって前記水溶性ポリマーと前記アミノオキシリンカーとの間のオキシム連結を形成する、方法。
（項目６１）
前記オキシム連結形成が、ｏ−アミノ安息香酸、ｍ−アミノ安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸、スルファニル酸、ｏ−アミノベンズアミド、ｏ−トルイジン、ｍ−トルイジン、ｐ−トルイジン、ｏ−アニシジン、ｍ−アニシジン、およびｐ−アニシジンからなる群から選択される求核触媒によって触媒される、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記水溶性ポリマーがＰＳＡである、項目６０に記載の方法。
（項目６３）
前記水溶性ポリマーがＰＥＧである、項目６０に記載の方法。
（項目６４）
前記酸化水溶性ポリマーと、活性アミノオキシ基を含む前記アミノオキシリンカーとを含む前記溶液を撹拌しながら、光の非存在下で４℃で１時間インキュベートする、項目６０に記載の方法。
（項目６５）
活性アミノオキシ基を含む前記水溶性ポリマーを、４℃の温度で陰イオン交換クロマトグラフィにより精製する、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーを調製する方法であって、
ａ）水溶性ポリマーを含む溶液を、活性アミノオキシ基を含むアミノオキシリンカーとともに、前記水溶性ポリマーと前記活性化アミノオキシリンカーとの間の安定したオキシム連結の形成を可能にする条件下で、インキュベートし、前記条件が、約１分〜約２４時間の期間、約２２℃〜約３７℃の温度、光の存在下または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含み、それによって活性アミノオキシ基を含む水溶性ポリマーを形成することと、
ｂ）クロマトグラフィ、濾過、透析、および沈殿からなる群から選択される方法により活性アミノオキシ基を含有する前記水溶性ポリマーを精製することと、を含み、
それによって前記水溶性ポリマーとアミノオキシリンカーとの間のオキシム連結を形成する、方法。
（項目６７）
前記オキシム連結形成が、ｏ−アミノ安息香酸、ｍ−アミノ安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸、スルファニル酸、ｏ−アミノベンズアミド、ｏ−トルイジン、ｍ−トルイジン、ｐ−トルイジン、ｏ−アニシジン、ｍ−アニシジン、およびｐ−アニシジンからなる群から選択される求核触媒によって触媒される、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
前記水溶性ポリマーと、活性アミノオキシ基を含む前記アミノオキシリンカーとを含む前記溶液を撹拌しながら、光の非存在下で２２℃で２時間インキュベートする、項目６６に記載の方法。
（項目６９）
前記水溶性ポリマーと、活性アミノオキシ基を含む前記アミノオキシリンカーとを含む前記溶液を撹拌しながら、光の非存在下で２２℃で２時間インキュベートする方法であって、前記方法が、前記溶液の温度を約３２℃〜約３７℃の温度に上昇させ、更に１２〜２４時間インキュベートするステップを更に含む、項目６６に記載の方法。
（項目７０）
前記温度を上昇させる直前に活性アミノオキシ基を含む付加的な量のアミノオキシリンカーを添加する更なるステップを含む、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
活性アミノオキシ基を含む前記水溶性ポリマーを、２２℃の温度で透析、限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）、およびクロマトグラフィからなる群から選択される方法によって精製する、項目６６に記載の方法。
（項目７２）
４℃で透析、ＵＦ／ＤＦ、またはクロマトグラフィからなる群から選択される方法によって活性アミノオキシ基を含む前記水溶性ポリマーを精製するステップを更に含む、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
ＰＳＡ−アミノオキシ試薬アミノオキシ基を調製する方法であって、
ａ）酸化ＰＳＡを含む溶液を、活性アミノオキシ基を含むアミノオキシリンカーとともに、前記酸化ＰＳＡと前記活性化アミノオキシリンカーとの間の安定したオキシム連結の形成を可能にする条件下で、インキュベートし、前記条件が、１時間の期間、４℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含み、それによって活性アミノオキシ基を含有するＰＳＡを形成することと、
ｂ）活性アミノオキシ基を含有する前記ＰＳＡを、４℃の温度で陰イオン交換クロマトグラフィにより精製することと、を含み、
前記活性化アミノオキシリンカーが、式：



の３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンリンカーであって、
それによって前記ＰＳＡと前記アミノオキシリンカーとの間のオキシム連結を形成する、方法。
（項目７４）
ＰＳＡ−アミノオキシ試薬アミノオキシ基を調製する方法であって、
ａ）非酸化ＰＳＡを含む溶液を、活性アミノオキシ基を含むアミノオキシリンカーとともに、前記非酸化ＰＳＡと前記活性化アミノオキシリンカーとの間の安定したオキシム連結の形成を可能にする条件下で、インキュベートし、前記条件が、２時間の期間、２２℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含み、それによって活性アミノオキシ基を含有するＰＳＡを形成することと、
ｂ）活性アミノオキシ基を含有する前記ＰＳＡを、２２℃の温度で透析により精製することと、を含み、
前記活性化アミノオキシリンカーが、式：



の３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンリンカーであって、
それによって前記非酸化ＰＳＡと前記アミノオキシリンカーとの間のオキシム連結を形成する、方法。
（項目７５）
水溶性ポリマーを血液凝固タンパク質の酸化炭水化物部分へ複合化させる方法であって、複合化を可能にする条件下で、前記酸化炭水化物部分を活性化水溶性ポリマーと接触させることを含み、
前記血液凝固タンパク質が、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、第ＦＶ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、トロンビン（ＦＩＩ）、プロテインＣ、プロテインＳ、ｔＰＡ、ＰＡＩ−１、組織因子（ＴＦ）、およびＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼ、またはその生物学的に活性なフラグメント、誘導体、もしくは変異体からなる群から選択され、
前記水溶性ポリマーが、活性アミノオキシ基を含有し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧ、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレンコマレイン酸無水物、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）からなる群から選択され、
前記炭水化物部分が、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）、四酢酸鉛（Ｐｂ（ＯＡｃ）４）、および過ルテニウム酸カリウム（ＫＲｕＯ４）からなる群から選択される酸化剤を含む緩衝液とともにインキュベーションすることによって酸化され、オキシム連結が、前記酸化炭水化物部分と前記水溶性ポリマー上の前記活性アミノオキシ基との間に形成される、方法。
凝固第ＩＸ因子（配列番号１）の一次構造を示す。 アミノオキシ−ＰＳＡへの酸化ｒＦＩＸの結合を示す。 水溶性ジアミノオキシリンカー（３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンおよび３，６，９−トリオキサ−ウンデカン−１，１１−ジオキシアミン）の合成を示す。 アミノオキシ−ＰＳＡの調製を示す。 ＳＤＳ ＰＡＧＥによる、異なる触媒の存在下で調製されるＰＳＡ−ＦＩＸ複合体の可視化を示す。ａ）異なる濃度を用いた、アニリンとｍ−トルイジンとの比較、ｂ）アニリンとｏ−アミノ安息香酸、ｍ−アミノ安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸、ｐ−アミノベンズアミド、およびスルファニル酸との比較。 ＳＤＳ ＰＡＧＥによる、異なる触媒の存在下で調製されるＰＳＡ−ＦＩＸ複合体の可視化を示す。ｃ）アニリンおよびｍ−トルイジンとｏ−アニシジンおよびｍ−アニシジンとの比較。 様々な求核触媒を用いたポリシアル化のパーセントを示す。
治療用タンパク質の薬理学的および免疫学的性質は、化学修飾、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧ、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレンコマレイン酸無水物、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）等のポリマー化合物との複合化によって改善することができる。得られる複合体の特性は、一般に、ポリマーの構造および大きさに強く左右される。したがって、画定された狭い大きさの分布を有するポリマーが、通常、当該技術分野において好ましいとされる。ＰＥＧ等の合成ポリマーは、狭い大きさの分布で容易に製造することができ、一方、ＰＳＡは、狭い大きさの分布を有する最終ＰＳＡ調製をもたらすような様式で精製することができる。加えて、画定されたポリマー鎖および狭い大きさの分布を有するＰＥＧ化試薬は、市場に出回っており、手頃な価格で市販されている。
ポリシアル化等を介する可溶性ポリマーの添加は、血液凝固タンパク質ＦＩＸ、ならびに他の凝固タンパク質（例えば、ＶＷＦ、ＦＶＩＩａ（例えば、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００８／０２２１０３２Ａ１号を参照）およびＦＶＩＩＩ）等の治療用タンパク質の特性を改善するための１つの方法である。
治療用タンパク質
本発明のある特定の実施形態において、上述のポリペプチドおよびポリヌクレオチドの典型的なものは以下の治療用タンパク質である：酵素、抗原、抗体、受容体、血液凝固タンパク質、増殖因子、ホルモン、およびリガンド。ある特定の実施形態において、治療用タンパク質は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、第ＦＶ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、トロンビン（ＦＩＩ）、プロテインＣ、プロテインＳ、ｔＰＡ、ＰＡＩ−１、組織因子（ＴＦ）、またはＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼ等の血液凝固タンパク質である。一実施形態において、本発明による治療用タンパク質は糖タンパク質であるか、または様々な実施形態において、インビボで天然にグリコシル化されないタンパク質（即ち、天然にグリコシル化部位を含有しないタンパク質か、または精製前に宿主細胞中においてグリコシル化されないタンパク質）である。
ある特定の実施形態において、治療用タンパク質は、免疫グロブリン、サイトカイン、例えばＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＥＰＯ、インターフェロンα（ＩＦＮ−α）、コンセンサスインターフェロン、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−ω、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２α、ＩＬ−３３、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、例えばＡｎｇ−１、Ａｎｇ−２、Ａｎｇ−４、Ａｎｇ−Ｙ等のアンジオポエチン、ヒトアンジオポエチン様ポリペプチド（ＡＮＧＰＴＬ１〜７）、ビトロネクチン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオゲニン、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、骨形態形成タンパク質１、骨形態形成タンパク質２、骨形態形成タンパク質３、骨形態形成タンパク質４、骨形態形成タンパク質５、骨形態形成タンパク質６、骨形態形成タンパク質７、骨形態形成タンパク質８、骨形態形成タンパク質９、骨形態形成タンパク質１０、骨形態形成タンパク質１１、骨形態形成タンパク質１２、骨形態形成タンパク質１３、骨形態形成タンパク質１４、骨形態形成タンパク質１５、骨形態形成タンパク質受容体ＩＡ、骨形態形成タンパク質受容体ＩＢ、骨形態形成タンパク質受容体ＩＩ、脳由来神経栄養因子、カルジオトロフィン−１、繊毛様神経栄養因子、繊毛様神経栄養因子受容体、クリプト、クリプティック、サイトカイン誘導好中球走化性因子１、サイトカイン誘導好中球走化性因子２α、サイトカイン誘導好中球走化性因子２β、β内皮細胞増殖因子、エンドセリン１、上皮増殖因子、エピゲン、エピレグリン、上皮由来好中球誘引物質、線維芽細胞増殖因子４、線維芽細胞増殖因子５、線維芽細胞増殖因子６、線維芽細胞増殖因子７、線維芽細胞増殖因子８、線維芽細胞増殖因子８ｂ、線維芽細胞増殖因子８ｃ、線維芽細胞増殖因子９、線維芽細胞増殖因子１０、線維芽細胞増殖因子１１、線維芽細胞増殖因子１２、線維芽細胞増殖因子１３、線維芽細胞増殖因子１６、線維芽細胞増殖因子１７、線維芽細胞増殖因子１９、線維芽細胞増殖因子２０、線維芽細胞増殖因子２１、酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、グリア細胞株由来好中球因子受容体α１、グリア細胞株由来好中球因子受容体α２、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質α、増殖関連タンパク質β、増殖関連タンパク質γ、ヘパリン結合上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、肝細胞癌由来増殖因子、インスリン様増殖因子Ｉ、インスリン様増殖因子受容体、インスリン様増殖因子ＩＩ、インスリン様増殖因子結合タンパク質、ケラチノサイト増殖因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受容体α、神経増殖因子 神経増殖因子受容体、ニューロポエチン、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、胎盤増殖因子、胎盤増殖因子２、血小板由来内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子Ａ鎖、血小板由来増殖因子ＡＡ、血小板由来増殖因子ＡＢ、血小板由来増殖因子Ｂ鎖、血小板由来増殖因子ＢＢ、血小板由来増殖因子受容体α、血小板由来増殖因子受容体β、プレＢ細胞増殖刺激因子、幹細胞因子（ＳＣＦ）、幹細胞因子受容体、ＴＮＦ、ＴＮＦ０、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、形質転換増殖因子α、形質転換増殖因子β、形質転換増殖因子β１、形質転換増殖因子β１．２、形質転換増殖因子β２、形質転換増殖因子β３、形質転換増殖因子β５、潜在型形質転換増殖因子β１、形質転換増殖因子β結合タンパク質Ｉ、形質転換増殖因子β結合タンパク質ＩＩ、形質転換増殖因子β結合タンパク質ＩＩＩ、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）、Ｉ型腫瘍壊死因子受容体、ＩＩ型腫瘍壊死因子受容体、ウロキナーゼタイププラスミノーゲン活性剤受容体、血管内皮増殖因子、ならびにそれらのキメラタンパク質および生物学的もしくは免疫学的に活性なフラグメントである。
ある特定の実施形態において、治療用タンパク質は、α−、β−、およびγ−インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子を含むコロニー刺激因子、線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、ホスホリパーゼ活性化タンパク質（ＰＵＰ）、インスリン、レクチンおよびリシン等の植物タンパク質、腫瘍壊死因子および関連対立遺伝子、腫瘍壊死因子受容体の可溶性形態、インターロイキン受容体および可溶性形態のインターロイキン受容体、増殖因子、例えばＴＧＦαまたはＴＧＦβおよび上皮増殖因子のような組織増殖因子、ホルモン、ソマトメジン、色素ホルモン、視床下部放出因子、抗利尿ホルモン、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノーゲン活性化因子、およびＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、およびＩｇＤのような免疫グロブリン、ガラクトシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ＤＮＡｓｅ、フェチュイン、黄体形成ホルモン、エストロゲン、コルチコステロイド、インスリン、アルブミン、リポタンパク質、フェトプロテイン、トランスフェリン、トロンボポエチン、ウロキナーゼ、ＤＮａｓｅ、インテグリン、トロンビン、造血成長因子、レプチン、グリコシダーゼ、ヒュミラ（アダリムマブ）、プロリア（デノスマブ）、エンブレル（エタネルセプト）、ならびにそれらのフラグメント、または上記のタンパク質もしくはそれらのフラグメントのいずれかを含む任意の融合タンパク質である。上述のタンパク質に加えて、下表１は、本発明によって企図される治療用タンパク質を提供する。
























本明細書に提供される治療用タンパク質は、排他的であると考えられるべきではない。むしろ、本明細書に提供される開示から明白であるように、本発明の方法は、本発明に従って水溶性ポリマーの付着が望ましい、任意のタンパク質に適用可能である。例えば、治療用タンパク質は、米国特許出願公開第２００７／００２６４８５号に記載され、これはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
血液凝固タンパク質
一態様では、本発明の出発物質は、血液凝固タンパク質であり、これは、ヒト血漿に由来され得るか、または米国特許第４，７５７，００６号、米国特許第５，７３３，８７３号、米国特許第５，１９８，３４９号、米国特許第５，２５０，４２１号、米国特許第５，９１９，７６６号、欧州特許第３０６ ９６８号に説明されるように、組換え操作技術によって産生され得る。
第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、第ＦＶ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、トロンビン（ＦＩＩ）、プロテインＣ、プロテインＳ、ｔＰＡ、ＰＡＩ−１、組織因子（ＴＦ）、およびＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼを含む血液凝固タンパク質等の治療的ポリペプチドは、タンパク質分解酵素によって急速に分解され、抗体によって中和される。これは、それらの半減期および循環時間を低下させ、それによってその治療効果を制限する。これらの凝固タンパク質の所望の治療効果または予防効果を達成し、かつ維持するには、比較的高い投与量および頻繁な投与が必要である。結果として、適切な投与量の調節を得るのは困難であり、頻繁な静脈内投与を必要とするために、患者の生活様式を制限する。
本明細書で説明されるように、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、第ＦＶ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、トロンビン（ＦＩＩ）、プロテインＣ、プロテインＳ、ｔＰＡ、ＰＡＩ−１、組織因子（ＴＦ）、およびＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼが含まれるが、これらに限定されない、血液凝固タンパク質が、本発明によって企図される。本明細書で使用される「血液凝固タンパク質」という用語は、任意の第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、第ＦＶ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、トロンビン（ＦＩＩ）、プロテインＣ、プロテインＳ、ｔＰＡ、ＰＡＩ−１、組織因子（ＴＦ）、およびＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼを指し、それらは特定の天然血液凝固タンパク質に関連する、生物学的活性を呈する。
血液凝固カスケードは、３つの異なるセグメント、即ち、内因性、外因性、および一般的経路に分割される（Ｓｃｈｅｎｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ．２００４；１１：２７２−７）。カスケードには、一連のセリンプロテアーゼ酵素（チモーゲン）およびタンパク質補因子が関与する。必要なとき、不活性キモーゼン前駆体が活性形態に変換され、それは、その後、カスケード中の次の酵素を変換する。
内因性経路は、凝固因子ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、およびＸＩＩを必要とする。内因性経路の開始は、プレカリクレイン、高分子量キニノゲン、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、および第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）が負荷電された表面に暴露されるときに生じる。血小板から分泌されるカルシウムイオンおよびリン脂質も必要とされる。
外因性経路は、血管の血管腔が損傷されたときに開始される。膜糖タンパク質組織因子が暴露され、次いで、循環因子ＶＩＩ（ＦＶＩＩ）および既存の少量のその活性型ＦＶＩＩａに結合する。この結合は、ＦＶＩＩａへのＦＶＩＩの完全な変換を促進し、続いてカルシウムおよびリン脂質の存在下で、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）の第ＩＸａ因子（ＦＩＸａ）への変換、および第Ｘ因子（ＦＸ）の第Ｘａ因子（ＦＸａ）への変換を促進する。組織因子とのＦＶＩＩａの会合は、基質（ＦＩＸおよびＦＸ）のためのＦＶＩＩの結合部位を接近させることによって、および構造変化を誘発させて、ＦＶＩＩａの酵素活性を増進することにより、タンパク質分解活性を増進させる。
ＦＸの活性化は、２つの経路の共有点である。リン脂質およびカルシウムとともに、第Ｖａ因子（ＦＶａ）および第Ｘａ因子は、プロトロンビンをトロンビンに変換させ（プロトロンビナーゼ複合体）、それは、次いで、フィブリノゲンを開裂して、フィブリンモノマーを形成する。モノマーは、重合してフィブリン鎖を形成する。第ＸＩＩＩａ因子（ＦＸＩＩＩａ）は、これらの鎖を互いに共有結合させて、剛性のメッシュを形成する。
ＦＶＩＩのＦＶＩＩａへの変換もまた、トロンビン、ＦＩＸａ、ＦＸａ、第ＸＩａ因子（ＦＸＩａ）、および第ＸＩＩａ因子（ＦＸＩＩａ）を含む、多くのプロテアーゼによって触媒される。カスケードの初期段階の阻害のために、組織因子経路阻害剤は、ＦＶＩＩａ／組織因子／ＦＸａ産物複合体を標的にする。
第ＶＩＩａ因子
ＦＶＩＩ（安定因子またはプロコンベルチンとしても公知である）は、止血および凝固で中枢的役割を有する、ビタミンＫ依存性セリンプロテアーゼ糖タンパク質である（Ｅｉｇｅｎｂｒｏｔ，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｓｃｉ．２００２；３：２８７−９９）。
ＦＶＩＩは、肝臓内で合成され、４８ｋＤの単鎖糖タンパク質として分泌される。ＦＶＩＩは、すべてのビタミンＫ依存性セリンプロテアーゼ糖タンパク質と、脂質膜とのタンパク質の相互作用に関与する、９〜１２残基を有するアミノ末端γカルボキシシグルタミン酸（Ｇｌａ）ドメイン、カルボキシ末端セリンプロテアーゼドメイン（触媒ドメイン）、および組織因子との相互作用を媒介する、カルシウムイオン結合部位を含有する２つの上皮成長因子様ドメインからなる類似するタンパク質ドメイン構造を共有する。γグルタミルカルボキシラーゼは、分子のアミノ末端部分でＧｌａ残基のカルボキシル化を触媒する。カルボキシラーゼは、還元型ビタミンＫにその作用のために依存し、それは、エポキシド型に酸化される。ビタミンＫエポキシド還元酵素が、ビタミンＫのエポキシド型を還元型に再変換するために必要である。
ＦＶＩＩの主要部分は、チモーゲン型で、血漿中で循環し、この型の活性化は、アルギニン１５２とイソロイシン１５３との間のペプチド結合の開裂をもたらす。結果として生じる活性化ＦＶＩＩａは、単一ジスルフィド結合（Ｃｙｓ１３５〜Ｃｙｓ２６２）を介して連結した、ＮＨ２由来軽鎖（２０ｋＤ）およびＣＯＯＨ末端由来重鎖（３０ｋＤ）からなる。軽鎖は、膜結合Ｇｌａドメインを含有し、重鎖は、触媒ドメインを含有する。
遺伝因子および環境因子によって決定されるＦＶＩＩの血漿濃度は約０．５ｍｇ／ｍＬである（Ｐｉｎｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０００；９５：３４２３−８）。ＦＶＩＩの異なる遺伝子型は、ＦＶＩＩの平均レベルにおいて数倍の差異をもたらし得る。血漿中ＦＶＩＩレベルは、健康な女性では妊娠中に上昇し、また、年齢とともに上昇し、女性および高トリグリセリド血症に罹患しているヒトにおいてより高い。ＦＶＩＩは、すべての凝固促進因子のうちで最短の半減期（３〜６時間）を有する。健康な個人におけるＦＶＩＩａの平均血漿濃度は３．６ｎｇ／ｍＬであり、ＦＶＩＩａの循環半減期は、他の凝固因子と比較して、比較的長い（２．５時間）。
遺伝性ＦＶＩＩ欠損症は、稀な常染色体劣性出血性障害であり、その有病率は一般集団において５００，０００人当たり１症例であると推定される（Ａｃｈａｒｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．２００４；２２４８−５６）。阻害剤からの後天的ＦＶＩＩ欠損症もまた、非常に稀である。セファロスポリン、ペニシリン、および経口抗凝固剤等の薬物に関連して生じる欠損症の症例も報告されている。更にまた、後天的ＦＶＩＩ欠損症は、自然発症的に、または例えば骨髄腫、敗血症、再生不良性貧血等の他の状態とともに、インターロイキン−２および抗胸腺細胞グロブリン療法で生じることが報告されている。
参照ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列としては、例えば、ゲノム配列のＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ０２９３３、ｃＤＮＡのＭ１３２３２（Ｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ １９８６；８３：２４１２−６）、およびポリペプチド配列のＰ０８７０９（参照は、その全体が本明細書に組み込まれる）が挙げられる。ＦＶＩＩの種々の多型性は、に説明されており、例えば、Ｓａｂａｔｅｒ−Ｌｌｅａｌら（Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．２００６；１１８：７４１−５１）を参照（参照は、その全体が本明細書に組み込まれる）。
第ＩＸ因子
ＦＩＸは、カルシウムイオン、リン脂質、およびＦＶＩＩＩａの存在下で、ＦＸをその活性型に変換することによって、血液凝固の内因性経路に関与するビタミンＫ依存性血漿タンパク質である。ＦＩＸの主な触媒能は、ＦＸ内の特定のアルギニン−イソロイシン結合に対して特異性を有するセリンプロテアーゼとしての触媒能である。ＦＩＸの活性化は、ＦＩＸからの活性化ペプチドの除去をもたらし、１つまたは複数のジスルフィド結合によって保持される２つの鎖を含む活性化したＦＩＸ分子を産生する、ＦＸＩａによって生じる。ＦＩＸの欠損は、劣性Ｘ連鎖血友病Ｂの原因である。
血友病ＡおよびＢはそれぞれ、ＦＶＩＩＩおよびＦＩＸポリペプチドの欠損を特徴とする遺伝性疾患である。欠損の根本的な原因は、頻繁に、ＦＶＩＩＩおよびＦＩＸ遺伝子の突然変異の結果であり、それらの両方は、Ｘ染色体上に位置する。血友病に対する従来の療法は、しばしば、正常の個人からのプール血漿または半精製された凝固タンパク質の静脈内投与を伴う。これらの調製は、感染性プリオン、ＨＩＶ、パルボウイルス、Ａ型肝炎、およびＣ型肝炎等の病原体またはウイルスによって汚染される可能性がある。したがって、ヒト血清の使用を必要としない治療薬に対する緊急の必要性がある。
ＦＩＸ活性の減少レベルは、血友病Ｂの重症度に正比例する。血友病Ｂの現在の治療は、血漿由来または組換えＦＩＸ（ＦＩＸ置換または交換治療もしくは療法と称される）による、不足したタンパク質の交換からなる。
ＦＩＸのポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ００７４０、米国特許第６，５３１，２９８号、および図１（配列番号１）において見出すことができる。
第ＶＩＩＩ因子
凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は、非常に低い濃度で血漿中を循環し、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）に非共有結合する。止血中、ＦＶＩＩＩは、ＶＷＦから分離され、カルシウムおよびリン脂質、または細胞膜の存在下で、活性化の速度を強化させることによって、活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）媒介のＦＸ活性化のための補因子として機能する。
ＦＶＩＩＩは、ドメイン構造Ａ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２を有する、約２７０〜３３０ｋＤの単鎖前駆体として合成される。血漿から精製されるとき（例えば、「血漿由来」または「血漿性」）、ＦＶＩＩＩは、重鎖（Ａ１−Ａ２−Ｂ）および軽鎖（Ａ３−Ｃ１−Ｃ２）からなる。軽鎖の分子量は８０ｋＤであり、Ｂドメイン内のタンパク質分解により、重鎖は９０〜２２０ｋＤの範囲内である。
ＦＶＩＩＩはまた、出血性障害における治療用途のための組換えタンパク質としても合成される。種々のインビトロアッセイが、治療薬物としての組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）の潜在的有効性を決定するために考案されている。これらのアッセイは、内在性ＦＶＩＩＩのインビボ効果を模倣する。ＦＶＩＩＩのインビトロトロンビン治療は、インビトロアッセイによって測定される、その凝固促進活性の迅速な増加およびその後の減少をもたらす。この活性化および不活性化は、例えば、ＦＶＩＩＩをＶＷＦから解離させ、かつリン脂質表面に結合させて、異なる結合エピトープの有効性を調整するか、またはある特定のモノクローナル抗体への結合能を調整する、重鎖および軽鎖の両方における特定の制限されたタンパク質分解と一致する。
ＦＶＩＩＩの欠如および機能不全は、最も頻度の高い出血性障害である血友症Ａと関連する。血友症Ａの管理のための最適な治療は、血漿由来、またはｒＦＶＩＩＩ濃縮物を用いる交換療法である。１％を下回るＦＶＩＩＩレベルを有する重篤な血友症Ａに罹患している患者は、一般に、ＦＶＩＩＩを投与と投与の間に１％を超えて維持することを目的とする予防療法を受けている。循環血中の種々のＦＶＩＩＩ産物の平均半減期を考慮すると、この結果は、通常、ＦＶＩＩＩを週に２〜３回投与することによって達成することができる。
参照ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列としては、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ００４５１（ＦＡ８＿ＨＵＭＡＮ）、Ｇｉｔｓｃｈｉｅｒ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｇｅｎｅ，Ｎａｔｕｒｅ，３１２（５９９２）：３２６−３０（１９８４）、Ｖｅｈａｒ ＧＨ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ
Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ，Ｎａｔｕｒｅ，３１２（５９９２）：３３７−４２（１９８４）、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＡＲ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｔｈｅ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｓｅｍｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈｅｍｏｓｔ，２００３：２９；１１−２９（２００２）が挙げられる。
フォンヴィレブランド因子
フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）は、約５００〜２０，０００ｋＤの範囲のサイズの一連の多量体として血漿中を循環する糖タンパク質である。ＶＷＦの多量体形態は、ジスルフィド結合によって相互に連結された２５０ｋＤのポリペプチドサブユニットからなる。ＶＷＦは、損傷した血管壁の内皮下層への初期血小板粘着を媒介する。より大きな多量体のみが止血活性を呈する。内皮細胞は大きいポリマー形態のＶＷＦを分泌し、低分子量を有するＶＷＦの形態（低分子量のＶＷＦ）はタンパク質分解開裂から生じることが想定されている。高分子質量を有する多量体は、内皮細胞のバイベルパラーデ小体内に保存され、刺激時に遊離される。
ＶＷＦは、大部分反復ドメインからなるプレプロＶＷＦとして内皮細胞および巨核球によって合成される。シグナルペプチドの開裂時に、プロＶＷＦは、そのＣ末端領域においてジスルフィド連結を介して二量体化する。二量体は、多量体化のためのプロトマーとして機能し、それは、遊離末端間のジスルフィド連結によって支配される。多量体へのアセンブリの後、プロペプチド配列のタンパク質分解除去が続く（Ｌｅｙｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７４（１９９１），２５７−２６１）。
ＶＷＦのクローン化ｃＤＮＡから予測される一次翻訳生成物は、２８１３残基の前駆体ポリペプチド（プレプロＶＷＦ）である。プレプロＶＷＦは、２２個のアミノ酸シグナルペプチドおよび７４１個のアミノ酸プロペプチドからなり、成熟ＶＷＦは２０５０個のアミノ酸を含む（Ｒｕｇｇｅｒｉ Ｚ．Ａ．，ａｎｄ Ｗａｒｅ，Ｊ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，３０８−３１６（１９９３）。
ＶＷＦの欠損は、ある程度の顕著な出血性表現型を特徴とする、フォンヴィレブランド病（ＶＷＤ）の原因である。３型ＶＷＤは、ＶＷＦが完全に欠損している最も重度な形態であり、１型ＶＷＤは、ＶＷＦの量的減少に関連し、その表現型は、非常に軽度である可能性がある。２型ＶＷＤは、ＶＷＦの質的欠損に関連し、３型ＶＷＤと同様の重度である可能性がある。２型ＶＷＤは、多くの亜種形態を有し、そのうちの幾つかは、高分子量の多量体の損失または減少に関連する。２ａ型フォンヴィレブランド病（ＶＷＤ−２Ａ）は、中間および大きい多量体の両方の損失を特徴とする。ＶＷＤ−２Ｂは、最も高い分子量の多量体の損失を特徴とする。ＶＷＦに関連する他の疾患および障害は、当該技術分野において公知である。
プレプロＶＷＦのポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００５５２およびＮＰ＿０００５４３で入手可能である。
本発明に従う他の血液凝固タンパク質は、当該技術分野において、例えば、Ｍａｎｎ ＫＧ，Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ，１９９９；８２：１６５−７４において説明されている。
Ａ．ポリペプチド
一態様では、本発明の出発物質は、タンパク質またはポリペプチドである。本明細書に説明するとき、治療用タンパク質という用語は、治療用タンパク質に関連する生物学的活性を呈する、任意の治療用タンパク質分子を指す。本発明の一実施形態において、治療用タンパク質分子は、完全長のタンパク質である。
企図される治療用タンパク質分子は、完全長のタンパク質、完全長のタンパク質の前駆体、完全長のタンパク質の生物学的に活性なサブユニットまたはフラグメント、ならびに治療用タンパク質のこれらの形態のうちのいずれかの生物学的に活性な誘導体および変異体を含む。したがって、治療用タンパク質は、（１）少なくとも約２５、約５０、約１００、約２００、約３００、約４００、またはそれ以上のアミノ酸の領域にわたって、参照核酸、または本明細書に説明されるアミノ酸配列によってコードされたポリペプチドと、約６０％超、約６５％超、約７０％超、約７５％超、約８０％超、約８５％超、約９０％超、約９１％超、約９２％超、約９３％超、約９４％超、約９５％超、約９６％超、約９７％超、約９８％超、または約９９％超、またはそれより高いアミノ酸配列同一性を有する、アミノ酸配列を有する、および／または（２）本明細書に説明される参照アミノ酸配列を含む免疫原、その免疫原性フラグメント、および／またはその保存的に修飾された変異体に対して生成された抗体、例えば、ポリクロナールまたはモノクローナル抗体に特異的に結合する、治療用タンパク質を含む。
本発明に従い、「組換え治療用タンパク質」という用語は、組換えＤＮＡ技術を介して得られた任意の治療用タンパク質を含む。ある特定の実施形態において、この用語は、本明細書に説明されるタンパク質を包含する。
本明細書で使用される「内在性治療用タンパク質」は、治療を受けることを意図されている哺乳動物に由来する治療用タンパク質を含む。該用語はまた、該哺乳動物に存在する導入遺伝子または任意の他の外来ＤＮＡから転写された治療用タンパク質を含む。本明細書で使用される「外在性治療用タンパク質」は、治療を受けることを意図されている哺乳動物に由来しない血液凝固タンパク質を含む。
本明細書で使用される「血漿由来血液凝固タンパク質」または「血漿性」は、凝固経路に関与する特性を有する哺乳動物から得られた、血中に見られるタンパク質のすべての形態を含む。
本明細書で使用される「生物学的に活性な誘導体」または「生物学的に活性な変異体」は、分子の任意の誘導体または変異体であって、該分子の実質的に同一の機能的および／または生物学的特性（結合特性等）、および／または同一の構造基盤（ペプチド主鎖または塩基ポリマー単位）を有する分子の任意の誘導体または変異体を含む。
「変異体」または「誘導体」等の「類似体」は、天然由来の分子と構造が実質的に同様であり、ある特定の例では、異なる程度ではあるが、同一の生物学的活性を有する化合物である。例えば、ポリペプチド変異体は、参照ポリペプチドと実質的に同様の構造を共有し、同一の生物学的活性を有するポリペプチドを指す。変異体または類似体は、類似体が由来する天然ポリペプチドと比較して、（ｉ）ポリペプチドの１つまたは複数の末端および／または天然由来のポリペプチド配列の１つまたは複数の内部領域（例えば、フラグメント）における１つまたは複数のアミノ酸残基の欠失、（ｉｉ）ポリペプチドの１つまたは複数の末端における１つまたは複数のアミノ酸の挿入または付加（一般的に「付加」または「融合」）、および／または天然由来のポリペプチド配列の１つまたは複数の内部領域における１つまたは複数のアミノ酸の挿入または付加（一般的に「挿入」）、あるいは（ｉｉｉ）天然由来のポリペプチド配列での１つまたは複数のアミノ酸の他のアミノ酸に代えての置換を含む１つまたは複数の変異に基づき、それらのアミノ酸配列の組成が異なる。例として、「誘導体」は、一種の類似体であり、例えば、化学的に修飾されている参照ポリペプチドと同一または実質的に同様の構造を共有するポリペプチドを指す。
変異体ポリペプチドは、１種の類似体ポリペプチドであり、挿入変異体を含み、そこでは１つまたは複数のアミノ酸残基が本発明の治療用タンパク質アミノ酸配列に付加される。挿入は、タンパク質のいずれか末端または両末端に位置してもよい、および／または治療用タンパク質アミノ酸配列の内部領域内に位置付けられてもよい。いずれかの末端または両方の末端に付加残基を有する挿入変異体は、例えば、融合タンパク質、およびアミノ酸タグまたは他のアミノ酸標識を含むタンパク質を含む。一態様では、血液凝固タンパク質分子は、特に、分子を大腸菌等の細菌性細胞内に組換え発現させるとき、任意に、Ｎ末端Ｍｅｔを含有する。
欠失変異体では、本明細書に説明される治療用タンパク質ポリペプチド内の１つまたは複数のアミノ酸残基が除去される。欠失は、治療用タンパク質ポリペプチドの１つまたは両方の末端において、および／または治療用タンパク質アミノ酸配列内の１つまたは複数の残基の除去によって達成することができる。したがって、欠失変異体は、治療用タンパク質ポリペプチド配列のフラグメントを含む。
置換変異体では、治療用タンパク質ポリペプチドの１つまたは複数のアミノ酸残基が除去され、代替の残基と置き換えられる。一態様では、置換は、保存的な性質を有し、このタイプの保存的置換は、当該技術分野において周知である。あるいは、本発明は、非保存的でもある置換を包含する。例示的な保存的置換が、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７５），ｐｐ．７１−７７］に記載されており、すぐ下に提示する。
代替的に、例示的な保存的置換をすぐ下に提示する。
Ｂ．ポリヌクレオチド
本発明の治療用タンパク質をコードする核酸としては、例えば、遺伝子、プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、多形変異体、対立遺伝子、合成、および天然由来の変異体が挙げられるが、これらに限定されない。
また、本発明の治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、（１）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に説明される参照アミノ酸配列をコードする核酸、およびその保存的に修飾された変異体に特異的にハイブリダイズする、（２）少なくとも約２５、約５０、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約５００、約１０００、またはそれ以上のヌクレオチド（最大、成熟タンパク質の１２１８ヌクレオチドの完全長配列）の領域にわたって、本明細書に説明される参照核酸配列と、約９５％超、約９６％超、約９７％超、約９８％超、約９９％超、またはそれより高いヌクレオチド配列同一性を有する、核酸配列を有するポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」条件は、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、２０ｍＭのＮａ・ＰＯ４、ｐＨ６．８中の４２℃でのハイブリダイゼーション、および３０分間、５５℃での１×ＳＳＣの洗浄を含む。これらの例示的な条件は、ハイブリダイズされる配列の長さおよびＧＣヌクレオチド含有量に基づき変化し得ることを理解されたい。当該技術分野における標準的な式は、適切なハイブリダイゼーション条件を決定するために適切である。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）§§９．４７−９．５１を参照されたい。
「天然（ｎａｔｕｒａｌｌｙ−ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）」ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、典型的には、霊長類（例えば、ヒト）、齧歯類（例えば、ラット、マウス、ハムスター）、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、または任意の哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されない哺乳動物に由来する。本発明の核酸およびタンパク質は、（例えば、異種の、野生型配列またはその変異体をコードする、または非天然発生の）組換え分子であり得る。
Ｃ．治療用タンパク質の産生
治療用タンパク質の産生には、（ｉ）遺伝子操作による組換えＤＮＡの産生、（ｉｉ）例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、またはマイクロインジェクションによる（これらに限定されない）原核細胞または真核細胞への組換えＤＮＡの導入、（ｉｉｉ）前述の形質転換細胞の培養、（ｉｖ）例えば構造的または誘発時の治療用タンパク質の発現、（ｖ）精製した治療用タンパク質を得るために、例えば培養培地から、または形質転換細胞を収集することによる前述の血液凝固タンパク質の単離、に関して当該技術分野で公知の任意の方法が含まれる。
他の態様では、治療用タンパク質は、薬理学的に許容される血液凝固タンパク質分子を産生することによって特徴付けられる好適な原核または真核宿主系内の発現によって産生される。真核細胞の例は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＳＫ−Ｈｅｐ、およびＨｅｐＧ２等の哺乳動物細胞である。
多種多様なベクターが治療用タンパク質の調製に使用され、真核および原核発現ベクターから選択される。原核発現のためのベクターの例としては、ｐＲＳＥＴ、ｐＥＴ、およびｐＢＡＤ等のプラスミドが挙げられるが、これらに限定されず、原核発現ベクターに使用されるプロモーターとしては、ｌａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ｒｅｃＡ、またはａｒａＢＡＤのうちの１つまたは複数が挙げられるが、これらに限定されない。真核発現のためのベクターの例としては、（ｉ）酵母における発現では、ＡＯＸ１、ＧＡＰ、ＧＡＬ１、またはＡＵＧ１等であるが、これらに限定されないプロモーターを使用する、ｐＡＯ、ｐＰＩＣ、ｐＹＥＳ、またはｐＭＥＴ等であるが、これらに限定されないベクター、（ｉｉ）昆虫細胞における発現では、ＰＨ、ｐ１０、ＭＴ、Ａｃ５、ＯｐＩＥ２、ｇｐ６４、またはｐｏｌｈ等であるが、これらに限定されないプロモーターを使用する、ｐＭＴ、ｐＡｃ５、ｐＩＢ、ｐＭＩＢ、またはｐＢＡＣ等であるが、これらに限定されないベクター、および（ｉｉｉ）哺乳動物細胞における発現では、ｐＳＶＬ、ｐＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、またはｐＢＰＶ等であるが、これらに限定されないベクター、および一態様では、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ−１、ＵｂＣ、ＲＳＶ、ＡＤＶ、ＢＰＶ、およびβ−アクチン等であるが、これらに限定されないプロモーターを使用する、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、またはレトロウイルス等であるが、これらに限定されないウイルス系に由来するベクターが挙げられる。
Ｄ．投与
一実施形態において、本発明の複合化された治療用タンパク質は、静脈内、筋肉内、または腹腔内注入等の注入によって投与されてもよい。
本発明の複合化された治療用タンパク質を含む組成物をヒトまたは試験動物に投与するために、一態様では、組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容される担体を含む。「薬学的に」または「薬理学的に許容される」という用語は、下に説明されるように、安定しており、凝集および開裂生成物等のタンパク質分解を阻害し、加えて、当該技術分野で周知の経路を使用して投与されるとき、アレルギー反応または他の有害反応を起こさない分子的実体および組成物を指す。「薬学的に許容される担体」としては、上に開示した薬剤を含む、任意かつ全ての臨床的に有用な溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、および吸収遅延剤等が挙げられる。
本明細書で使用される「有効量」は、疾患または障害を治療するまたは疾患または障害の症状を改善するために好適な用量を含む。一実施形態において、「有効量」は、本明細書に説明される出血性障害を有する哺乳動物を治療するために好適な用量を含む。
組成物は、経口的、局所的、経皮的、非経口的、吸引スプレーによって、経膣的、経直腸的、または頭蓋内注入によって、投与されてもよい。本明細書で使用される非経口という用語には、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射、胸骨内注射、または注入技法が含まれる。静脈内、皮下、筋肉内、乳房内、腹腔内、髄腔内、眼球後、肺内注入、およびまたは特定の部位での外科的移植による投与も企図される。一般に、組成物は、発熱物質、ならびに受容者に有害である可能性がある他の不純物を本質的に含んでいない。
組成物の単回または複数回投与は、治療する医師によって選択される用量レベルおよびパターンで実行することができる。疾患の予防または治療では、適切な投与量は、上述のように、治療すべき疾患の種類、疾患の重症度および経過、薬物が予防または治療目的のために投与されているか、治療歴、患者の病歴および薬物への応答、ならびに担当医の裁量に依存するであろう。
本発明はまた、本明細書に定義する有効量の複合化された治療用タンパク質を含む薬学的組成物に関する。薬学的組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、塩、緩衝液、または賦形剤を更に含んでもよい。薬学的組成物は、上に定義する出血性障害を治療するために使用することができる。本発明の薬学的組成物は、溶液または凍結乾燥された生成物であってもよい。薬学的組成物の溶液は、任意の好適な凍結乾燥プロセスに供してもよい。
更なる態様として、本発明は、対象に投与するためのその使用を促進する様式で梱包された本発明の組成物を含むキットを含む。一実施形態において、かかるキットは、本明細書に説明される化合物または組成物（例えば、複合化された治療用タンパク質を含む組成物）を含み、それは密封ボトルまたは器等の容器に梱包され、方法を実践する上での化合物または組成物の使用法を説明するラベルがその容器に貼られているか、パッケージに含まれる。一実施形態において、キットは、複合化された治療用タンパク質を含む組成物を有する第１の容器、および第１の容器内の組成物のための生理的に許容される再構成溶液を有する第２の容器を含有する。一態様では、化合物または組成物は、単位用量形態で梱包される。キットは、特定の投与経路に従い組成物を投与するための好適な装置を更に含んでもよい。好ましくは、キットは、治療用タンパク質またはペプチド組成物の使用法を説明するラベルを含有する。
水溶性ポリマー
一態様では、提供される治療用タンパク質誘導体（即ち、複合化された治療用タンパク質）分子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧ、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレン−コマレイン酸無水物、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）が挙げられるが、これらに限定されない、水溶性ポリマーに結合される。本発明の一実施形態において、水溶性ポリマーは、３５０〜１２０，０００、５００〜１００，０００、１０００〜８０，０００、１５００〜６０，０００、２，０００〜４５，０００Ｄａ、３，０００〜３５，０００Ｄａ、および５，０００〜２５，０００Ｄａの範囲の分子量を有する、シアル酸分子からなる。水溶性ポリマーの結合は、タンパク質への直接結合によって、またはリンカー分子を介して実行することができる。化学的リンカーの一例は、炭水化物選択的ヒドラジドおよびスルフヒドリル反応マレイミド基を含有する、ＭＢＰＨ（４−［４−Ｎ−マレイミドフェニル］酪酸ヒドラジド）である（Ｃｈａｍｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９２；２６７：１５９１６−２２）。他の例示的および好ましいリンカーは、下に説明される。
一実施形態において、誘導体は、天然の治療用タンパク質生成物の完全な機能活性を保持し、天然の治療用タンパク質生成物と比較して、延長したインビボ半減期を提供する。別の実施形態において、誘導体は、天然の血液凝固タンパク質に対して、少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０パーセント（％）の生物学的活性を保持する。関連する態様では、誘導体および天然の血液凝固タンパク質の生物学的活性は、血液凝固因子抗原値に対する色原体活性の比（血液凝固因子：Ｃｈｒ：血液凝固因子：Ａｇ）によって決定される。本発明の更に別の実施形態において、構築物の半減期は、天然の治療用タンパク質のインビボ半減期に対して、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍減少または増大する。
Ａ．シアル酸およびＰＳＡ
ＰＳＡは、Ｎ−アセチルノイラミン酸のポリマー（通常、ホモポリマー）からなる。二級アミノ基は、一般に、アセチル基を保有するが、その代わりにグリコリル基を保有してもよい。ヒドロキシル基における可能な置換基としては、アセチル基、ラクチル基、エチル基、硫酸基、およびリン酸基が挙げられる。
シアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸）の構造
ＰＳＡおよびｍＰＳＡは、一般的には、２，８−または２，９−グリコシド連結、あるいはこれらの組み合わせ（例えば、２，８−および２，９−で交互に連結したもの）によって連結されたＮ−アセチルノイラミン酸部分から本質的になる直鎖状ポリマーを含む。特に好ましいＰＳＡおよびｍＰＳＡでは、グリコシド連結はα−２，８である。そのようなＰＳＡおよびｍＰＳＡは、好都合には、コロミン酸に由来し、本明細書中では「ＣＡ」および「ｍＣＡ」と称される。典型的なＰＳＡおよびｍＰＳＡは、少なくとも２個、好ましくは少なくとも５個、より好ましくは少なくとも１０個、および最も好ましくは少なくとも２０個のＮ−アセチルノイラミン酸部分を含む。したがって、それらは、２〜３００個のＮ−アセチルノイラミン酸部分、好ましくは５〜２００個のＮ−アセチルノイラミン酸部分、または最も好ましくは１０〜１００個のＮ−アセチルノイラミン酸部分を含み得る。ＰＳＡおよびＣＡは、好ましくは、Ｎ−アセチルノイラミン酸以外の糖部分を本質的に含まない。したがって、ＰＳＡおよびＣＡは、好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、および最も好ましくは少なくとも９８％のＮ−アセチルノイラミン酸部分を含む。
ＰＳＡおよびＣＡがＮ−アセチルノイラミン酸以外の部分を含む場合（例えば、ｍＰＳＡＳおよびｍＣＡ等の場合）、これらは、好ましくは、ポリマー鎖の一端または両端に位置している。例えば、そのような「他の」部分は、酸化または還元により末端Ｎ−アセチルノイラミン酸部分から誘導された部分であり得る。
例えば、国際公開第Ａ−０１８７９２２号には、過ヨウ素酸ナトリウムとの反応によって、非還元末端Ｎ−アセチルノイラミン酸単位がアルデヒド基に変換されたｍＰＳＡおよびｍＣＡが記載されている。更に、国際公開第２００５／０１６９７４号には、還元末端Ｎ−アセチルノイラミン酸単位が還元を受け、この還元末端Ｎ−アセチルノイラミン酸単位で還元的に開環し、それによって隣接ジオール基が形成され、続いて、酸化され、隣接ジオール基をアルデヒド基に変換したｍＰＳＡおよびｍＣＡが記載されている。
シアル酸リッチの糖タンパク質は、ヒトおよび他の生物でセレクチンに結合する。それらは、ヒトインフルエンザ感染に重要な役割を果たす。例えば、シアル酸は、マンノース結合レクチンから、宿主細胞または細菌の表面上のマンノース抗原を隠し得る。このことは、補体の活性化を妨げる。また、シアル酸は、最後から２番目の位置にあるガラクトース残基を隠し、これにより肝実質細胞上のガラクトース受容体による、糖タンパク質の急速な排除を妨げる。
コロミン酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸のホモポリマー）の構造
コロミン酸（ＰＳＡの部分集合）は、α（２→８）ケトシド連結によるＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）のホモポリマーであり、とりわけ、Ｋ１抗原を有する大腸菌の特定の株によって産生される。コロミン酸は、多くの生理学的機能を有する。それらは、薬物および化粧品の原材料として重要である。
ポリシアル化および非修飾アスパラギナーゼとのインビボ比較研究は、ポリシアル化が酵素の半減期を増大させたことを明らかにした（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ ａｎｄ Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １３４１：２６−３４，１９９７）。
本明細書で使用される「シアル酸部分」は、水性溶液または懸濁液中で可溶性であり、薬学的に有効量のＰＳＡ−血液凝固タンパク質複合体の投与時に、哺乳動物への副作用等の悪影響がわずか、または全くない、シアル酸モノマーまたはポリマー（「多糖類」）を含む。一態様では、ポリマーは、１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、または５００個のシアル酸単位を有することを特徴とする。ある特定の態様では、異なるシアル酸単位が鎖に組み込まれる。
本発明の一実施形態において、多糖化合物のシアル酸部分は、非常に親水性であり、別の実施形態において、全化合物は、非常に親水性である。親水性は、主に、シアル酸単位のペンダントカルボキシル基、ならびにヒドロキシル基によって与えられる。糖類単位は、アミン基、ヒドロキシル基、または硫酸基等の他の官能基、またはそれらの組み合わせを含有してもよい。これらの基は、天然由来の糖類化合物上に存在してもよいか、または誘導体多糖類化合物中に導入されてもよい。
天然由来のポリマーＰＳＡは、広域な大きさの分布（例えば、Ｓｉｇｍａ Ｃ−５７６２）、および高い多分散性（ＰＤ）を示す、多分散調製物として利用可能である。多糖類は、通常、共精製する内毒素の特有のリスクを持つ細菌内で産生されるため、長いシアル酸ポリマー鎖の精製は、内毒素含有量の増大の可能性を上げる場合がある。１〜４個のシアル酸単位を有する短いＰＳＡ分子はまた、合成的に調製することができ（Ｋａｎｇ ＳＨ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ．２０００；２２７−８、Ｒｅｓｓ ＤＫ ａｎｄ Ｌｉｎｈａｒｄｔ ＲＪ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．２００４；１：３１−４６）、したがって、高い内毒素レベルのリスクを最小限化させる。しかしながら、ここで、内毒素もない、狭い大きさの分布および低い多分散性を有するＰＳＡ調製物を製造することができる。一態様では、本発明のための特定の使用の多糖類化合物は、細菌によって産生された多糖類化合物である。これらの天然の多糖類のうちの幾つかは、糖脂質として知られている。一実施形態において、多糖類化合物には、末端ガラクトース単位を実質的に含まない。
Ｂ．ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびＰＥＧ化
ある特定の態様では、治療用タンパク質は、種々の化学的方法のいずれかによって、水溶性ポリマーに複合化される（Ｒｏｂｅｒｔｓ ＪＭ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ ２００２；５４：４５９−７６）。例えば、一実施形態において、治療用タンパク質は、ＰＥＧの複合化によって、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを使用して、タンパク質の遊離アミノ基に修飾される。別の実施形態において、水溶性ポリマー、例えば、ＰＥＧは、マレインイミド化学、または事前酸化後に、治療用タンパク質の炭水化物部分へのＰＥＧヒドラジドもしくはＰＥＧアミンの結合を使用して、遊離ＳＨ基に結合される。
一態様では、複合化は、水溶性ポリマーの直接結合（またはリンカー系を介する結合）によって、安定結合の形成下で、治療用タンパク質に対して実行される。更に、分解性、放出性、または加水分解性リンカー系が本発明のある特定の態様に使用される（Ｔｓｕｂｅｒｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００４；２７９：３８１１８−２４／Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １９９９；４２：３６５７−６７／Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ Ｃｈｅｍ ２００６；１７：３４１−５１／国際公開第２００６／１３８５７２Ａ２号／米国特許第７２５９２２４Ｂ２号／米国特許第７０６０２５９Ｂ２号）。
本発明の一実施形態において、治療用タンパク質は、コハク酸スクシンイミジル、グルタル酸スクシンイミジル、またはプロピオン酸スクシンイミジル等の活性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）を含有するポリエチレングリコール誘導体の使用によって、リシン残基を介して修飾される。これらの誘導体は、安定アミド結合を形成することによって、温和な条件下で、治療用タンパク質のリシン残基と反応する。本発明の一実施形態において、ＰＥＧ誘導体の鎖長は、５，０００Ｄａである。直鎖および分岐構造を含む、５００〜２，０００Ｄａ、２，０００〜５，０００Ｄａ、５，０００超〜最大１０，０００Ｄａ、または１０，０００超〜最大２０，０００Ｄａ、または２０，０００超〜最大１５０，０００Ｄａの鎖長を有する他のＰＥＧ誘導体が、種々の実施形態に使用される。
アミノ基のＰＥＧ化のための代替の方法としては、ウレタン結合を形成することによるＰＥＧカルボン酸との化学的複合化、または二級アミド結合を形成する還元アミノ化によるアルデヒドもしくはケトンとの反応が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の一実施形態において、治療用タンパク質分子は、市販されるＰＥＧ誘導体を使用して化学修飾される。代替的態様におけるこれらのＰＥＧ誘導体は、直鎖または分岐構造を有する。ＮＨＳ基を含有するＰＥＧ誘導体の例が、下に列挙される。
以下のＰＥＧ誘導体は、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａ．、ｗｗｗ．ｎｅｋｔａｒ．ｃｏｍ／ＰＥＧ試薬カタログ、Ｎｅｋｔａｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ、価格表２００５〜２００６を参照）から市販されるＰＥＧ誘導体の非制限的な例である：
ｍＰＥＧ−プロピオン酸スクシンイミジル（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）


ｍＰＥＧ−スクシンイミジルα−メチルブタノアート（ｍＰＥＧ−ＳＭＢ）


ｍＰＥＧ−ＣＭ−ＨＢＡ−ＮＨＳ（ＣＭ＝カルボキシメチル、ＨＢＡ＝ヒドロキシ酪酸）


分岐ＰＥＧ誘導体（Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）の構造：
分岐ＰＥＧ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ）
分岐構造を有するこの試薬は、Ｋｏｚｌｏｗｓｋｉら（ＢｉｏＤｒｕｇｓ ２００１；５：４１９−２９）によって、より詳細に記載されている。
ＰＥＧ誘導体の他の非制限的例は、ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ、ｗｗｗ．ｎｏｆ．ｃｏ．ｊｐ／ｅｎｇｌｉｓｈ：カタログ２００５を参照）から市販されている。
直鎖ＰＥＧ誘導体（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．）の一般構造：


Ｘ＝カルボキシメチル


Ｘ＝カルボキシペンチル


ｘ＝コハク酸

ｘ＝グルタル酸

分岐ＰＥＧ誘導体（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．）の構造：２，３−ビス（メチルポリオキシエチレン−オキシ）−１−（１，５−ジオキソ−５−スクシンイミジルオキシ、ペンチルオキシ）プロパン


２，３−ビス（メチルポリオキシエチレン−オキシ）−１−（スクシンイミジルカルボキシペンチルオキシ）プロパン
これらのプロパン誘導体は、１，２置換パターンを有するグリセロール主鎖を示す。本発明では、１，３置換を有するグリセロール構造、または米国特許出願公開第２００３／０１４３５９６Ａ１号に説明される他の分岐構造に基づく分岐ＰＥＧ誘導体もまた、企図される。
Ｔｓｕｂｅｒｙら（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００４；２７９：３８１１８−２４）およびＳｈｅｃｈｔｅｒら（国際公開第０４０８９２８０Ａ３号）によって説明される、分解性（例えば、加水分解性）リンカーを有するＰＥＧ誘導体もまた、企図される。
驚くべきことに、本発明のＰＥＧ化された治療用タンパク質は、延長したインビボ半減期と組み合わせて、機能活性を呈する。加えて、ＰＥＧ化されたｒＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸ、または他の血液凝固因子は、トロンビン不活性化に対してより耐性であるように思える。
Ｃ．ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）およびヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）
本発明の種々の実施形態において、治療用タンパク質分子は、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）もしくはヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、またはそれらの誘導体を使用して化学的に修飾される。
ＨＥＳは、天然由来のアミロペクチンの誘導体であり、体内ではα−アミラーゼによって分解される。ＨＥＳは、炭水化物ポリマーのアミロペクチンの置換誘導体であり、これはコーンスターチ中に最大９５重量％の濃度で存在する。ＨＥＳは、有利な生物学的特性を示し、血液量置換剤として診療所の血液希釈療法で使用される（Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｋｒａｎｋｅｎｈａｕｓｐｈａｒｍａｚｉｅ，８（８），２７１−２７８、およびＷｅｉｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ａｒｚｎｅｉｍ．−Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ／Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．ｇ ４１９ ４９４−４９８）。
アミロペクチンは、主鎖においてα−１，４−グリコシド結合が存在し、分岐鎖部位においてα−１，６−グリコシド結合が見出される、グルコース部分からなる。この分子の物理化学的特性は、主に、グリコシド結合の型によって決定される。切れ目の入った（ｎｉｃｋｅｄ）α−１，４−グリコシド結合のために、１回転当たり約６つのグリコースモノマーを有するらせん構造が作られる。ポリマーの物理化学的特性ならびに生化学的特性は、置換により改変し得る。ヒドロキシエチル基の導入は、アルカリ性ヒドロキシエチル化により達成することができる。反応条件を適合させることにより、ヒドロキシエチル化に関して非置換グルコースモノマーにおけるそれぞれのヒドロキシ基の異なる反応性を活用することが可能である。この事実により、当業者は限定される程度に置換パターンに影響を及ぼすことができる。
ＨＡＳは、少なくとも１つのヒドロキシアルキル基によって置換されているデンプン誘導体を指す。したがって、ヒドロキシアルキルデンプンという用語は、末端炭水化物成分がヒドロキシアルキル基Ｒ１、Ｒ２、および／またはＲ３を含む化合物に限定されず、少なくとも１つのヒドロキシ基がどこかに存在し、末端炭水化物成分および／またはデンプン分子の残りの部分のいずれかにて、ＨＡＳ’がヒドロキシアルキル基Ｒ１、Ｒ２、またはＲ３で置換されている化合物も指す。
アルキル基は、直鎖または分岐鎖アルキル基であってもよく、これは好適に置換されてもよい。好ましくは、ヒドロキシアルキル基は、１〜１０個の炭素原子、より好ましくは１〜６個の炭素原子、より好ましくは１〜４個の炭素原子、なおより好ましくは２〜４個の炭素原子を含有する。したがって、「ヒドロキシアルキルデンプン」は、好ましくは、ヒドロキシエチルデンプン、ヒドロキシプロピルデンプン、およびヒドロキシブチルデンプンを含み、ヒドロキシエチルデンプンおよびヒドロキシプロピルデンプンが特に好ましい。
２つ以上の異なるヒドロキシアルキル基を含むヒドロキシアルキルデンプンもまた、本発明に含まれる。ＨＡＳに含まれる少なくとも１つのヒドロキシアルキル基は、２つ以上のヒドロキシ基を含有してもよい。一実施形態によれば、ＨＡＳに含まれる少なくとも１つのヒドロキシアルキル基は、１つのヒドロキシ基を含有する。
ＨＡＳという用語はまた、アルキル基がモノ置換または多置換である誘導体も含む。一実施形態において、アルキル基がハロゲン、特にフッ素、またはアリール基で置換されているが、但し、ＨＡＳは水溶性のままであるものとする。更に、ヒドロキシアルキル基の末端ヒドロキシ基は、エステル化またはエーテル化することができる。ＨＡＳ誘導体は、国際公開第２００４／０２４７７６号に説明されており、これは参照によってその全体が組み込まれる。
Ｄ．付着方法
治療用タンパク質は、当業者に公知の種々の技術のいずれかによって、多糖類化合物に共有連結され得る。本発明の種々の態様では、シアル酸部分は、例えば、米国特許第４，３５６，１７０号に説明される方法（参照により、本明細書に組み込まれる）によって、治療用タンパク質、例えば、ＦＩＸ、ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩａ、またはＶＷＦに結合される。
ＰＳＡをポリペプチドに結合するための他の技術もまた、知られており、本発明によって企図される。例えば、米国特許出願公開第２００７／０２８２０９６号は、例えば、ＰＳＡのアミンまたはヒドラジド誘導体をタンパク質に複合化させることを説明する。加えて、米国特許出願公開第２００７／０１９１５９７号は、還元末端において基質（例えば、タンパク質）との反応のためのアルデヒド基を含有するＰＳＡ誘導体を説明する。これらの参照文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
種々の方法が米国特許第５，８４６，９５１号の７列、１５行〜８列、５行に開示される（参照によってその全体が組み込まれる）。例示的な技術は、血液凝固タンパク質または多糖類のうちのいずれかの上のカルボキシル基と、血液凝固タンパク質または多糖のアミン基との間のペプチド結合、または血液凝固タンパク質または多糖のカルボキシル基と、治療用タンパク質または多糖類のヒドロキシル基との間のエステル連結を介する連結を含む。治療用タンパク質が多糖類化合物に共有結合される、別の連結は、過ヨウ素酸塩酸化によって多糖類の非還元末端において形成されたアルデヒド基と反応させられる血液凝固タンパク質上の遊離アミノ基の間のシッフ塩基を介する（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ ＨＪ ａｎｄ Ｌｕｇｏｗｓｋｉ Ｃ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８１；１２７：１０１１−８；Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ ＡＩ ａｎｄ Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ Ｇ，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９９７；１３４１；２６−３４）。一態様では、生成されたシッフ塩基は、ＮａＣＮＢＨ３での特異的還元によって安定化され、二級アミンを形成する。代替のアプローチは、事前酸化後のＮＨ４Ｃｌでの還元アミノ化によるＰＳＡ内の末端遊離アミノ基の生成である。二官能性試薬を、２つのアミノ基または２つのヒドロキシル基に連結するために使用することができる。例えば、アミノ基を含有するＰＳＡが、ＢＳ３（ビス（スルホスクシンイミジル）スベリン酸／Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）等の試薬で、タンパク質のアミノ基に結合される。加えて、スルホ−ＥＭＣＳ（Ｎ−ε−マレイミドカプロイルオキシ）スルホスクシンイミドエステル／Ｐｉｅｒｃｅ）等のヘテロ二官能性架橋連結試薬を使用して、例えば、アミン基およびチオール基を連結する。
別のアプローチでは、ＰＳＡヒドラジドが、事前酸化、およびアルデヒド官能基の生成の後に調製され、タンパク質の炭水化物部分に結合される。
上述の通り、治療用タンパク質の遊離アミノ基は、シアル酸残基の１−カルボキシル基と反応してペプチジル結合を形成するか、またはエステル連結が１−カルボキシル酸基と血液凝固タンパク質上のヒドロキシルまたは他の好適な活性基との間に形成される。代替的には、カルボキシル基は、脱アセチル化５−アミノ基とのペプチド連結を形成するか、または治療用タンパク質の分子のアルデヒド基は、シアル酸残基のＮ−脱アセチル化５−アミノ基とともにシッフ塩基を形成する。
代替的には、多糖類化合物は、非共有様式で治療用タンパク質と会合する。例えば、一態様では、多糖類化合物および薬学的に活性な化合物は、疎水性相互作用を介して連結される。他の非共有会合は、相互に求引する逆帯電されたイオンでの静電相互作用を含む。
種々の実施形態において、治療用タンパク質は、化学量論量（例えば１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：７、１：８、１：９、または１：１０等）の多糖類化合物に連結、または会合される。種々の実施形態において、１〜６、７〜１２、または１３〜２０の多糖類が血液凝固タンパク質に連結される。更に他の実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の多糖類が血液凝固タンパク質に連結される。
種々の実施形態において、治療用タンパク質は、修飾されて、グリコシル化部位（即ち、天然のグリコシル化部位以外の部位）が導入される。かかる修飾は、当該技術分野で公知の標準分子生物学的技術を用いて達成されてもよい。その上、１つまたは複数の炭水化物部分を介する水溶性ポリマーへの複合化の前に、治療用タンパク質は、インビボまたはインビトロでグリコシル化されてもよい。これらのグリコシル化部位は、水溶性ポリマーとのタンパク質の共役のための標的として機能することができる（米国特許出願第２００９００２８８２２号、米国特許出願第２００９／００９３３９９号、米国特許出願第２００９／００８１１８８号、米国特許出願第２００７／０２５４８３６号、米国特許出願第２００６／０１１１２７９号、およびＤｅＦｒｅｅｓ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００６，１６，９，８３３−４３）。例えば、インビボで天然にグリコシル化されないタンパク質（例えば糖タンパク質ではないタンパク質）は、上述の通り、修飾され得る。
Ｅ．アミノオキシ連結 本発明の一実施形態において、オキシム基を形成するための、アルデヒド（例えば過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化後の炭水化物部分上）とのヒドロキシルアミンまたはヒドロキシルアミン誘導体の反応が、血液凝固タンパク質の複合体の調製に適用される。例えば、糖タンパク質（例えば本発明に従う治療用タンパク質）は、まず、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）等の酸化剤で酸化される（Ｒｏｔｈｆｕｓ ＪＡ ｅｔ Ｓｍｉｔｈ ＥＬ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９６３，２３８，１４０２−１０、およびＶａｎ Ｌｅｎｔｅｎ Ｌ ａｎｄ Ａｓｈｗｅｌｌ Ｇ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９７１，２４６，１８８９−９４）。糖タンパク質の過ヨウ素酸酸化は、１９２８年の過ヨウ素酸塩との隣接ジオールの酸化に説明された古典的マラプラード反応に基づいて、活性アルデヒド基を形成する（Ｍａｌａｐｒａｄｅ Ｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｂｕｌｌ Ｓｏｃ Ｃｈｉｍ Ｆｒａｎｃｅ，１９２８，４３，６８３−９６）。かかる酸化剤の更なる例としては、四酢酸鉛（Ｐｂ（ＯＡｃ）４）、酢酸マンガン（ＭｎＯ（Ａｃ）３）、酢酸コバルト（Ｃｏ（ＯＡｃ）２）、酢酸タリウム（ＴｌＯＡｃ）、硫酸セリウム（Ｃｅ（ＳＯ４）２）（米国特許第４，３６７，３０９号）、または過ルテニウム酸カリウム（ＫＲｕＯ４）（Ｍａｒｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ
Ｓｏｃ １９９７，１１９，１２６６１−２）が挙げられる。「酸化剤」とは、炭水化物中の隣接ジオールを酸化し、それによって、生理学的反応条件下で、活性アルデヒド基を生成することが可能な温和な酸化化合物を意味する。
第２のステップは、オキシム連結を形成するための、酸化炭水化物部分へのアミノオキシ基を含有するポリマーの結合である。本発明の一実施形態において、このステップは、触媒量の求核触媒アニリンまたはアニリン誘導体の存在下で実行することができる（Ｄｉｒｋｓｅｎ Ａ ｅｔ Ｄａｗｓｏｎ ＰＥ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２００８；Ｚｅｎｇ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００９；６：２０７−９）。アニリン触媒は、オキシムライゲーションを著しく加速させ、非常に低い濃度の試薬の使用を可能にする。本発明の別の実施形態において、オキシム連結は、ＮａＣＮＢＨ３での還元により安定化され、アルコキシアミン連結を形成する（図２）。更なる触媒を以下に説明する。
アミノオキシ技術についての更なる情報は、以下の参照文献で確認することができ、それらのそれぞれは、その全体が組み込まれる：欧州特許第１６８１３０３Ａ１号（ＨＡＳ化エリスロポエチン）、国際公開第２００５／０１４０２４号（オキシム連結基によって連結されるポリマーおよびタンパク質の複合体）、国際公開第９６／４０６６２号（アミノオキシ含有リンカー化合物、およびそれらの複合体における用途）、国際公開第２００８／０２５８５６号（修飾タンパク質）、Ｐｅｒｉ Ｆ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９８，５４，１２２６９−７８、Ｋｕｂｌｅｒ−Ｋｉｅｌｂ Ｊ ｅｔ．Ｐｏｚｓｇａｙ Ｖ．，Ｊ Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ ２００５，７０，６８８７−９０、Ｌｅｅｓ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ ２００６，２４（６），７１６−２９、およびＨｅｒｅｄｉａ ＫＬ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｅｃｕｌｅｓ ２００７，４０（１４），４７７２−９。
アミノオキシリンカーに水溶性ポリマーを結合する多くの方法が、本開示によって企図される。例えば、ＰＳＡ等の水溶性ポリマーの還元または非還元末端のいずれかへのリンカーの結合が、本明細書中に説明されている。結合部位（例えば、還元末端対非還元末端）は、結合プロセスの１つまたは複数の条件（例えば、時間および温度）、ならびに水溶性ポリマーの状態（例えば、天然対酸化）によって決定される。一実施形態において、ＰＳＡ等の酸化水溶性ポリマーは、低温（例えば、２〜８℃）でカップリング反応を行うことによりアミノオキシリンカーにその非還元末端で結合する。別の実施形態において、ＰＳＡ等の天然の（例えば、非酸化）水溶性ポリマーは、より高い温度（例えば、２２〜３７℃）でカップリング反応を実行することによりアミノオキシリンカーにその還元末端で結合している。上述の実施形態は、以下および実施例においてより詳細に説明される。
本明細書で説明されるように、ジアミノオキシリンカーを有する酸化ＰＳＡの反応は、２つの反応を示す：非還元末端でのアルデヒド基の「即応」および還元末端での「遅い反応」。（酸化されていない、活性アルデヒド基を含有しない）天然のＰＳＡを室温での還元末端と反応させる場合、誘導体化ＰＳＡを観察することができる。したがって、様々な実施形態において、ＰＳＡのような水溶性ポリマーの還元末端での望ましくない副反応を最小限にするために、ＰＳＡ−アミノオキシリンカーの試薬調製を２〜８℃の温度で行う。
本開示の更に別の実施形態において、還元末端での天然のＰＳＡの誘導体化が提供される。本明細書で説明されるように、（ＮａＩＯ４により酸化されていない、したがって、その非還元末端で遊離アルデヒド基を含有しない）天然のＰＳＡを室温でジアミノオキシリンカーと反応させ、ＰＳＡの誘導体化がその還元末端で観察することができる。この結合は、還元末端での開環およびその後のオキシム形成（上で説明する実際の副反応、およびアミノオキシ−ＰＳＡ試薬中の副生成物が存在する原因）を介して起こる。この反応は、天然のＰＳＡを用いて行い、最大約７０％の程度の修飾をもたらすことができる。
主生成物として、次のような構造が１３Ｃ ＮＭＲ分光法によって決定される。



この反応は、デキストランおよびデンプンまたは還元末端基を含有する他の多糖類のような他の炭水化物に移すことができる。ｍ−トルイジンまたはアニリンのような求核触媒の使用も企図される。したがって、その後、治療用タンパク質の化学修飾のために使用することができる天然の（即ち、事前酸化されていない）ＰＳＡを使用したアミノオキシ−ＰＳＡ試薬の調製が本明細書で提供される。
したがって、本開示の様々な実施形態において、ジアミノオキシリンカーを酸化ＰＳＡ等の水溶性ポリマーに結合する条件（例えば、２〜８℃のインキュベーション温度）が、いずれかの非還元末端への結合に有利である、または一つの代替として、ジアミノオキシリンカーを天然の非酸化ＰＳＡ等の水溶性ポリマーに結合する条件（例えば、室温でのインキュベーション）が、いずれかの還元末端への結合に有利である方法が提供される。
本発明の種々の実施形態において、本明細書に説明するアミノオキシ技術に従う治療用タンパク質（例えば、ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩａ、またはＦＩＸ）の酸化炭水化物部分に連結される水溶性ポリマーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧ、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレン−コマレイン酸無水物、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。
求核触媒
本明細書に説明される通り、治療用タンパク質への水溶性ポリマーの複合化は、アニリンによって触媒され得る。アニリンは、アルデヒドおよびケトンのアミンとの水性反応を強く触媒し、ヒドラゾンおよびオキシム等の安定したイミンを形成する。以下の略図は、無触媒オキシムライゲーション反応とアニリン触媒オキシムライゲーション反応を比較する（Ｋｏｈｌｅｒ ＪＪ，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ２００９；１０：２１４７−５０）：
しかしながら、アニリンに関連する多くの健康リスクを考慮すると、代替となる触媒が望ましい。本発明は、代替となるオキシムライゲーション触媒としてアニリン誘導体を提供する。かかるアニリン誘導体としては、ｏ−アミノ安息香酸、ｍ−アミノ安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸、スルファニル酸、ｏ−アミノベンズアミド、ｏ−トルイジン、ｍ−トルイジン、ｐ−トルイジン、ｏ−アニシジン、ｍ−アニシジン、およびｐ−アニシジンが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の一実施形態において、ｍ−トルイジン（メタ−トルイジン、ｍ−メチルアニリン、３−メチルアニリン、または３−アミノ−１−メチルベンゼンとしても知られている）を使用して、本明細書に説明される複合化反応を触媒する。Ｍ−トルイジンおよびアニリンは、同様の物理的特性、および本質的に同じｐＫａ値（ｍ−トルイジン：ｐＫａ４．７３、アニリン：ｐＫａ４．６３）を有する。
本発明の求核触媒は、オキシムライゲーション（例えばアミノオキシ連結を使用）またはヒドラゾン形成（例えばヒドラジド化学を使用）において有用である。本発明の種々の実施形態において、求核触媒は、複合化反応において０．１、０．２、０．３、０．５、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｍＭの濃度で提供される。一実施形態において、求核触媒は、１〜１０ｍＭで提供される。本発明の種々の実施形態において、複合化反応のｐＨ範囲は、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、および７．５である。一実施形態において、ｐＨは、５．５〜６．５である。
共役タンパク質の精製
種々の実施形態において、酸化剤でインキュベートされているタンパク質および／または本開示に従って水溶性ポリマーで複合化されている治療用タンパク質の精製が望ましい。多くの精製技術が、当該技術分野で公知であり、これには、イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、および親和性クロマトグラフィ、またはそれらの組み合わせ等のクロマトグラフィ法、濾過法（例えば、ＵＦ／ＤＦ）、および沈殿法、ならびに透析手順、および上述の技術の任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈ．，Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ ４６３（ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｂｕｒｇｅｓｓ ＲＲ ａｎｄ Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ ＭＰ），２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ２００９）。
以下の実施例は、本発明の具体的な実施形態を制限するものではなく、例示目的のみである。
実施例１
ホモ二官能性リンカーＮＨ ２ ［ＯＣＨ ２ ＣＨ ２ ］ ２ ＯＮＨ ２ の調製
ホモ二官能性リンカーＮＨ２［ＯＣＨ２ＣＨ２］２ＯＮＨ２
２つの活性アミノオキシ基を含有する（３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミン）を、一級アミンの修飾ガブリエル合成を採用する２ステップ有機反応で、Ｂｏｔｕｒｙｎら（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９７；５３：５４８５−９２）に従って合成した（図３）。第１のステップでは、２，２−クロロジエチルエーテルの１つの分子を、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で、エンド−Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシミドの２つの分子と反応させた。所望のホモ二官能性生成物を、得られた中間体からエタノール中のヒドラジン分解によって調製した。
実施例２
ホモ二官性リンカーＮＨ ２ ［ＯＣＨ ２ ＣＨ ２ ］ ４ ＯＮＨ ２ の調製
ホモ二官能性リンカーＮＨ２［ＯＣＨ２ＣＨ２］４ＯＮＨ２
２つの活性アミノオキシ基を含有する（３，６，９−トリオキサ−ウンデカン−１，１１−ジオキシアミン）を、一級アミンの修飾ガブリエル合成を採用する２ステップ有機反応で、Ｂｏｔｕｒｙｎら（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９７；５３：５４８５−９２）に従って合成した（図３）。第１のステップでは、ビス−（２−（２−クロロエトキシ）−エチル）−エーテルの１つの分子を、ＤＭＦ中で、エンド−Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシミドの２つの分子と反応させた。所望のホモ二官能性生成物を、得られた中間体からエタノール中のヒドラジン分解によって調製した。
実施例３
ホモ二官性リンカーＮＨ ２ ［ＯＣＨ ２ ＣＨ ２ ］ ６ ＯＮＨ ２ の調製
ホモ二官能性リンカーＮＨ２［ＯＣＨ２ＣＨ２］６ＯＮＨ２
２つの活性アミノオキシ基を含有する（３，６，９，１２，１５−ペナトキサ（ｐｅｎａｔｏｘａ）−ヘプタデカン−１，１７−ジオキシアミン）を、一級アミンの修飾ガブリエル合成を採用する２ステップ有機反応で、Ｂｏｔｕｒｙｎら（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
１９９７；５３：５４８５−９２）に従って合成した。第１のステップでは、ヘキサエチレングリコール二塩化物の１つの分子を、ＤＭＦ中で、エンド−Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシミドの２つの分子と反応させた。所望のホモ二官能性生成物を、得られた中間体からエタノール中のヒドラジン分解によって調製した。
実施例４
アミノオキシ−ＰＳＡ試薬の詳細な合成
３−オキサ−ペンタン−１，５ジオキシアミンを、実施例１に概説される２ステップ有機合成で、Ｂｏｔｙｒｙｎら（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９７；５３：５４８５−９２）に従って合成した。
ステップ１：
７００ｍＬの無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中のエンド−Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド（５９．０ｇ、１．００当量）の溶液に、無水Ｋ２ＣＯ３（４５．５１ｇ、１．００当量）および２，２−ジクロロジエチルエーテル（１５．８４ｍＬ、０．４１当量）を添加した。反応混合物を５０℃で２２時間撹拌した。混合物を減圧下で乾燥するまで蒸発させた。残渣を、２Ｌのジクロロメタン中で懸濁し、ＮａＣｌ飽和水溶液（各１Ｌ）で２回、抽出した。ジクロロメタン層を、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、次いで、減圧下で乾燥するまで蒸発させ、高真空内で乾燥して、白黄色の固体（中間体１）として６４．５ｇの３−オキサペンタン−１，５−ジオキシ−エンド−２’，３’−ジカルボキシジイミドノルボルネンを得た。
ステップ２：
８００ｍＬの無水エタノール中の中間体１（６４．２５ｇ、１．００当量）の溶液に、３１．０ｍＬのヒドラジン水和物（４．２６当量）を添加した。次いで、反応混合物を２時間還流させた。混合物を、減圧下で溶媒を蒸発させることによって、出発体積の半分まで濃縮した。生じた沈殿物を濾去した。残りのエタノール層を、減圧下で乾燥するまで蒸発させた。粗生成物３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンを含有する残渣を、真空内で乾燥させ、４６．３ｇを得た。粗生成物を更に、カラムクロマトグラフィ（シリカゲル６０、ジクロロメタン／メタノール混合物での定組成溶離、９／１）によって精製して、１１．７ｇの純最終生成物３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンを得た。
実施例５
アミノオキシ−ＰＳＡの調製
Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｉｎｄｉａ（Ｐｕｎｅ，Ｉｎｄｉａ）から得た１０００ｍｇの酸化ＰＳＡ（分子量＝２０ｋＤ）を、１６ｍＬの５０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ６．０中に溶解した。次いで、１７０ｍｇの３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンを反応混合物に添加した。室温で２時間振とうした後、７８．５ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、反応を、一晩かけて１８時間行った。次いで、反応混合物を、再生成されたセルロースから作製された５ｋＤのカットオフを有する膜（５０ｃｍ２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過の手順（ＵＦ／ＤＦ）に供した。
実施例６
クロマトグラフィ精製ステップを採用するアミノオキシ−ＰＳＡの調製
Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｉｎｄｉａ（Ｐｕｎｅ，Ｉｎｄｉａ）から得た１２９０ｍｇの酸化ＰＳＡ（分子量＝２０ｋＤ）を、２５ｍＬの５０ｍＭのリン酸緩衝液（緩衝液Ａ）、ｐＨ６．０中に溶解した。次いで、２０９ｍｇの３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンを反応混合物に添加した。室温で１時間振とうした後、１０１ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、反応を、３時間行った。次いで、混合物を、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＤＥＡＥ ６５０−Ｍクロマトグラフィゲル（カラム寸法：ＸＫ２６／１３５）を採用する穏やかな陰イオン交換クロマトグラフィに供した。反応混合物を１１０ｍＬの緩衝液Ａで希釈し、１ｃｍ／分の流速で、緩衝液Ａで事前に平衡化したＤＥＡＥカラム上に負荷した。次いで、カラムを２０ＣＶの緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ６．０）で洗浄し、２ｃｍ／分の流速で、遊離３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンおよびシアン化物を除去した。次いで、アミノオキシ−ＰＳＡ試薬を、６７％の緩衝液Ｂおよび４３％の緩衝液Ｃ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）からなるステップ勾配で溶出した。溶出液を、ポリエーテルスルホンから作製された５ｋＤの膜（５０ｃｍ２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過によって濃縮した。最終透析濾過ステップを緩衝液Ｄ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、９０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に対して行った。調製物を、全ＰＳＡ（レゾルシノールアッセイ）および全アミノオキシ基（ＴＮＢＳアッセイ）を測定し、修飾の度合いを決定することによって分析的に特徴付けた。更に、多分散性、ならびに遊離３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンおよびシアン化物を決定した。
実施例７
還元ステップを行わないアミノオキシ−ＰＳＡの調製
Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｉｎｄｉａ（Ｐｕｎｅ，Ｉｎｄｉａ）から得た５７３ｍｇの酸化ＰＳＡ（分子量＝２０ｋＤ）を、１１，３ｍＬの５０ｍＭのリン酸緩衝液（緩衝液Ａ）、ｐＨ６．０中に溶解した。次いで、９４ｍｇの３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンを反応混合物に添加した。次いで、室温で５時間振とうした後、混合物を、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＤＥＡＥ ６５０−Ｍクロマトグラフィゲル（カラム寸法：ＸＫ１６／１０５）を採用する穏やかな陰イオン交換クロマトグラフィのステップに供した。反応混合物を５０ｍＬの緩衝液Ａで希釈し、１ｃｍ／分の流速で、緩衝液Ａで事前に平衡化したＤＥＡＥカラム上に負荷した。次いで、カラムを２０ＣＶの緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ６．０）で洗浄し、２ｃｍ／分の流速で、遊離３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンおよびシアン化物を除去した。アミノオキシ−ＰＳＡ試薬を、６７％の緩衝液Ｂおよび４３％の緩衝液Ｃ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）からなるステップ勾配で溶出した。溶出液を、ポリエーテルスルホンから作製された５ｋＤの膜（５０ｃｍ２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過によって濃縮した。最終透析濾過ステップを緩衝液Ｄ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、９０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に対して行った。調製物を、全ＰＳＡ（レゾルシノールアッセイ）および全アミノオキシ基（ＴＮＢＳアッセイ）を測定し、修飾の度合いを決定することによって分析的に特徴付けた。更に、多分散性、ならびに遊離３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンを決定した。
実施例８
求核触媒ｍ−トルイジンの存在下で、還元ステップを行わないアミノオキシ−ＰＳＡの調製
Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｉｎｄｉａ（Ｐｕｎｅ，Ｉｎｄｉａ）から得た５７３ｍｇの酸化ＰＳＡ（分子量＝２０ｋＤ）を、９ｍＬの５０ｍＭのリン酸緩衝液（緩衝液Ａ）、ｐＨ６．０中に溶解する。次いで、９４ｍｇの３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンをこの溶液に添加する。続いて、２．３ｍＬの５０ｍＭのｍ−トルイジン原液をこの反応混合物に添加する。次いで、室温で２時間振とうした後、混合物を、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＤＥＡＥ ６５０−Ｍクロマトグラフィゲル（カラム寸法：ＸＫ１６／１０５）を採用する穏やかな陰イオン交換クロマトグラフィステップに供する。反応混合物を５０ｍＬの緩衝液Ａで希釈し、１ｃｍ／分の流速で、緩衝液Ａで事前に平衡化したＤＥＡＥカラム上に負荷する。次いで、カラムを２０ＣＶの緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ６．０）で洗浄し、２ｃｍ／分の流速で、遊離３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンおよびシアン化物を除去する。アミノオキシ−ＰＳＡ試薬を、６７％の緩衝液Ｂおよび４３％の緩衝液Ｃ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）からなるステップ勾配で溶出する。溶出液を、ポリエーテルスルホンから作製された５ｋＤの膜（５０ｃｍ２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップを緩衝液Ｄ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、９０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に対して行う。調製物を、全ＰＳＡ（レゾルシノールアッセイ）および全アミノオキシ基（ＴＮＢＳアッセイ）を測定し、修飾の度合いを決定することによって分析的に特徴付ける。更に、多分散性、ならびに遊離３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンを決定する。
実施例９
アミノオキシ−ＰＳＡ試薬の調製
アミノオキシ−ＰＳＡ試薬を実施例４〜８に従い調製した。透析濾過後、生成物を−８０℃で凍結し、凍結乾燥した。凍結乾燥後、試薬を適切な体積の水中で溶解し、炭水化物修飾を介するＰＳＡ−タンパク質複合体の調製のために使用した。
実施例１０
異なる代替の求核触媒の有効性の評価
ｒＦＩＸを、異なる求核触媒（アニリン、ｍ−トルイジン、ｏ−アニシジン、ｍ−アニシジン、ｏ−アミノ安息香酸、ｍ−アミノ安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸、ｐ−アミノベンズアミド、スルファニル酸／標準濃度：１０ｍＭ）を使用して、標準条件（２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２中の１ｍｇ／ｍＬのｒＦＩＸ、ｐＨ６．０、５倍のモル過剰のアミノオキシ−ＰＳＡ試薬、１００μＭのＮａＩＯ４）下で、過ヨウ素酸ナトリウム、アミノオキシ−ＰＳＡ試薬でインキュベートした。反応を、穏やかな撹拌下で、暗室で、室温で２時間行い、１ｍＭの最終濃度でシステイン水溶液の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行った。
カップリング効率を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｘ−ｃｅｌｌミニシステムを使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定した。試料をリチウムドデシル硫酸塩（ＬＤＳ）緩衝液でスパイクし、７０℃で１０分間変性した。次いで、試料を３〜８％のトリス−酢酸塩ゲルに適用し、１５０Ｖで６０分間行った。続いて、ゲルをクマシーで染色した。
加えて、試料を、以前に説明されている条件下で、Ｓｈｏｄｅｘ ＫＷ ８０３カラムを搭載したＡｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣシステムを使用するＳＥＣ−ＨＰＬＣシステムの使用によって特徴付けた（Ｋｏｌａｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ２００６；４６：１９５９−７７）。
不希釈の５０μＬの試料を注入し、０．５ｍＬ／分の流速で、２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、５０ｍＭのＮａ２ＳＯ４、ｐＨ６．１の０．２２μｍの濾過溶液を使用して均一濃度で溶出した。溶出パターンを２８０ｎｍで記録した。
これらの結果を図５Ａ〜Ｃおよび６（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）ならびに表２（ＳＥＣ− ＨＰＬＣの結果）に要約する。異なる調製物の触媒効果を示す。ｍ−トルイジンの使用が、アニリンで得たものと同等の結果をもたらすことが示される。
実施例１１
アミノオキシ−ＰＳＡおよび求核触媒としてｍ−トルイジンを使用するｒＦＩＸのポリシアル化
方法１：
１２．３ｍｇのｒＦＩＸを、６．１ｍＬのヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０（２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２）中に溶解した。次いで、２５４μＬの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（５ｍＭ）を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、４℃で１時間インキュベートし、６．５μＬの１Ｍのシステイン水溶液の添加によって室温で１５分間反応停止処理を行った。続いて、その混合物をＶｉｖａｓｐｉｎ １５Ｒ １０ｋＤの遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去した。
酸化ｒＦＩＸを含有する残余分（８．８ｍＬ）を、２．４６ｍＬのｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合し、室温で３０分間インキュベートした。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加して、５倍モル過剰の試薬を得た。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２．５時間インキュベートした。
遊離ｒＦＩＸを、陰イオン交換クロマトグラフィ（ＡＥＣ）によって除去した。反応混合物を、１５ｍＬの緩衝液Ａ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）で希釈し、緩衝液Ａで事前に平衡化した２０ｍＬのＨｉＰｒｅｐ ＱＦＦ１６／１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）上に負荷した。次いで、カラムを緩衝液Ｂ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）で溶出した。遊離ｒＦＩＸは、１２〜２５ｍＳ／ｃｍの伝導率で溶出し、複合体は、２７〜４５ｍＳ／ｃｍの伝導率で溶出する。続いて、複合体を含有する画分の伝導率を、緩衝液Ｃ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ６．９）を用いて１９０ｍＳ／ｃｍに引き上げ、緩衝液Ｄ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ６．９）を用いて事前に平衡化した２０ｍＬのＨｉＰｒｅｐブチルＦＦ１６／１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）上に負荷した。遊離アミノオキシ−ＰＳＡ試薬を、５ＣＶの緩衝液Ｄ内で洗浄した。続いて、その複合体を、１００％の緩衝液Ｅ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）で溶出する。複合体を含有する画分を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ １５Ｒ １０ｋＤの遠心分離濾過機を使用する限外濾過／透析濾過によって濃縮した。最終透析濾過ステップを、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび５ｍＭのＣａＣｌ２を含有するヒスチジン緩衝液、ｐＨ７．２に対して行った。調製物を、総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）およびＦＩＸ色原体活性の測定によって分析的に特徴付けた。ＰＳＡ−ｒＦＩＸ複合体は、天然のｒＦＩＸと比較して５０％超の特異的活性を決定することを示した。
方法２：
１２．３ｍｇのｒＦＩＸを、Ｌ−ヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０（２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２）中に溶解し、ｒＦＩＸの１ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。５ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を添加し、１００μＭの最終濃度を得、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、ｐＨ６．０で、４℃で１時間インキュベートし、１ＭのＬ−システイン水溶液（または他の反応停止試薬）の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行い、１０ｍＭの最終濃度を得る。続いて、その混合物をＶｉｖａｓｐｉｎ １５Ｒ １０ｋＤの遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
酸化ｒＦＩＸを含有する得られた残余分（８．８ｍＬ）を、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合し、１０ｍＭの最終濃度を得、室温で３０分間インキュベートする。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、５倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、ｐＨ６．０で、室温で２．５時間インキュベートし、暗室で、穏やかな撹拌下で、＋４℃）で０．５時間〜１８時間インキュベートした。
遊離ｒＦＩＸを、陰イオン交換クロマトグラフィ（ＡＥＣ）によって除去する。反応混合物を、適切な量の緩衝液Ａ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）で希釈し、緩衝液Ａで事前に平衡化した２０ｍＬのＨｉＰｒｅｐ ＱＦＦ１６／１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）上に負荷する前に、溶液の伝導率およびｐＨを修正する。次いで、カラムを緩衝液Ｂ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）で溶出する。遊離ｒＦＩＸを、２５％の緩衝液Ｂを使用するステップ勾配によって溶出し、得られた画分中１２〜２５ｍＳ／ｃｍの伝導率をもたらし、その複合体を、５０％の緩衝液Ｂのステップ勾配を使用して溶出し、複合体画分中２７〜４５ｍＳ／ｃｍの伝導率をもたらす。続いて、複合体を含有する画分の伝導率を、緩衝液Ｃを使用して（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ６．９、または例えば硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の抗カオトロピック塩の使用によって）、１９０ｍＳ／ｃｍに引き上げ、緩衝液Ｄ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ６．９）で事前に平衡化した２０ｍＬのＨｉＰｒｅｐブチルＦＦ１６／１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴまたは同等のＨＩＣ培地）上に負荷する。遊離アミノオキシ−ＰＳＡ試薬を、５ＣＶの緩衝液Ｄ内で洗浄する。続いて、その複合体を、１００％の緩衝液Ｅ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）で溶出する。複合体を含有する画分を、再生成されたセルロースから作製された１０ｋＤの膜（８８ｃｍ２、カットオフ１０ｋＤ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップを、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび５ｍＭのＣａＣｌ２を含有するＬ−ヒスチジン緩衝液、ｐＨ７．２に対して行う。調製物を、総タンパク質（ＢｒａｄｆｏｒｄおよびＢＣＡ手順）ならびにＦＩＸ色原体活性および凝固活性の測定によって分析的に特徴付ける。ＰＳＡ−ｒＦＩＸ複合体に対して、天然のｒＦＩＸと比較して５０％超の特異的活性を決定する。
方法３：
２５．４ｍｇのｒＦＩＸを、１８．７ｍＬのヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０（２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２）中に溶解した。次いで、５３１μＬの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（５ｍＭ）および５．０７ｍＬのｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を添加した。続いて、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、５倍モル過剰の試薬を得た。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、２５μＬの１Ｍのシステイン水溶液の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行った。
遊離ｒＦＩＸを、陰イオン交換クロマトグラフィ（ＡＥＣ）によって除去した。反応混合物を、２０ｍＬの緩衝液Ａ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）で希釈し、緩衝液Ａで事前に平衡化した２０ｍＬのＨｉＰｒｅｐ ＱＦＦ１６／１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）上に負荷した。次いで、カラムを緩衝液Ｂ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）で溶出した。遊離ｒＦＩＸを、１２〜２５ｍＳ／ｃｍの伝導率で溶出し、複合体を、２７〜４５ｍＳ／ｃｍの伝導率で溶出した。続いて、複合体を含有する画分の伝導率を、緩衝液Ｃ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ６．９）を用いて１９０ｍＳ／ｃｍに引き上げ、緩衝液Ｄ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ６．９）で事前に平衡化した２０ｍＬのＨｉＰｒｅｐブチルＦＦ１６／１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）上に負荷した。遊離アミノオキシ−ＰＳＡ試薬を、５ＣＶの緩衝液Ｄ内で洗浄した。続いて、その複合体を、１００％の緩衝液Ｅ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）で溶出した。複合体を含有する画分を、再生成されたセルロースから作製された１０ｋＤの膜（８８ｃｍ２、カットオフ１０ｋＤ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過によって濃縮した。最終透析濾過ステップを、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび５ｍＭのＣａＣｌ２を含有するヒスチジン緩衝液、ｐＨ７．２に対して行った。調製物を、総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）およびＦＩＸ色原体活性を測定することによって分析的に特徴付けた。ＰＳＡ−ｒＦＩＸ複合体に対して、天然のｒＦＩＸと比較して５０％超の特異的活性を決定した。更に、その複合体を、以前に説明されている条件下で、Ｓｈｏｄｅｘ ＫＷ ８０３カラムを搭載したＡｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣシステムを使用するサイズ排除ＨＰＬＣによって分析的に特徴付けた（Ｋｏｌａｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ２００６；４６：１９５９−７７）。調製物が遊離ＦＩＸを含有しないことを示した。複合体は、５７％のモノポリシアル化、３１％のジポリシアル化、および１２％のトリポリシアル化された生成物からなった。
方法４：
２５．４ｍｇのｒＦＩＸを、Ｌ−ヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０（２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２）中に溶解し、ｒＦＩＸの２ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得た。続いて、５ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を１５分間以内で添加し、１００μＭの最終濃度を得、続いて、５０ｍＭのｍ−トルイジン水溶液の添加によって、３０分以内に１０ｍＭの最終濃度を得た。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、５倍モル過剰の試薬を得た。ｐＨを６．０に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、１ＭのＬ−システイン水溶液の添加によって室温で１５分間反応停止処理を行い、１０ｍＭの最終濃度を得た。
遊離ｒＦＩＸを、イオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＣ）によって除去した。反応混合物を、適切な量の緩衝液Ａ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）で希釈し、緩衝液Ａで事前に平衡化した２０ｍＬのＨｉＰｒｅｐ ＱＦＦ １６／１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）上に負荷する前に、溶液の伝導率およびｐＨ値を修正した。次いで、カラムを緩衝液Ｂ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）で溶出した。遊離ｒＦＩＸを、２５％の緩衝液Ｂを使用するステップ勾配によって溶出し、得られた画分中１２〜２５ｍＳ／ｃｍの伝導率をもたらし、その複合体を、５０％の緩衝液Ｂのステップ勾配を使用して溶出し、複合体画分中２７〜４５ｍＳ／ｃｍの伝導率をもたらした。続いて、複合体を含有する画分の伝導率を、緩衝液Ｃを使用して（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ６．９、例えば酢酸アンモニウム等の抗カオトロピック塩の使用によって）、１９０ｍＳ／ｃｍに引き上げ、緩衝液Ｄ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ６．９）で事前に平衡化した２０ｍＬのＨｉＰｒｅｐブチルＦＦ１６／１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ；または同等のＨＩＣ培地）上に負荷した。遊離アミノオキシ−ＰＳＡ試薬を、５ＣＶの緩衝液Ｄ内で洗浄した。続いて、その複合体を、１００％の緩衝液Ｅ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）で溶出した。複合体を含有する画分を、再生成されたセルロースから作製された１０ｋＤの膜（８８ｃｍ２、カットオフ１０ｋＤ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過によって濃縮した。最終透析濾過ステップを、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび５ｍＭのＣａＣｌ２を含有するＬ−ヒスチジン緩衝液、ｐＨ７．２に対して行った。調製物を、総タンパク質（ＢｒａｄｆｏｒｄおよびＢＣＡ手順）ならびにＦＩＸ色原体活性および凝固活性を測定することによって分析的に特徴付けた。ＰＳＡ−ｒＦＩＸ複合体に対して、天然のｒＦＩＸと比較して５０％超の特異的活性を決定した。更に、その複合体を、以前に説明されている条件下で、Ｓｈｏｄｅｘ ＫＷ ８０３カラムを搭載したＡｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣシステムを使用するサイズ排除ＨＰＬＣによって分析的に特徴付けた（Ｋｏｌａｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ２００６；４６：１９５９−７７）。調製物が遊離ＦＩＸを含有しないことを示した。複合体は、５７％のモノポリシアル化、３１％のジポリシアル化、および１２％のトリポリシアル化された生成物からなった。
実施例１２
アミノオキシ−ＰＳＡおよび求核触媒としてｍ−トルイジンを使用するｒＦＶＩＩＩのポリシアル化
方法１：
５０ｍｇのｒＦＶＩＩＩを、反応緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈して、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得た。この溶液に、ＮａＩＯ４を添加して、２００μＭの最終濃度を得た。酸化を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で３０分間行った。次いで、反応物は、システイン（最終濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行った。溶液を、緩衝液Ａ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．０）で平衡化した２０ｍＬの体積を有するＩＥＸカラム（Ｍｅｒｃｋ ＥＭＤ ＴＭＡＥ（Ｍ））に供した。カラムを、５ＣＶの緩衝液Ａで平衡化した。次いで、酸化ｒＦＶＩＩＩを、緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）を使用して溶出した。ｒＦＶＩＩＩを含有する画分を収集した。タンパク質含有量を決定し（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）、反応緩衝液を使用して１ｍｇ／ｍＬに調整し、０．５ＭのＨＣｌの滴加によってｐＨ６．０に調整した。次いで、５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒（最終濃度：１０ｍＭ）として、ｍ−トルイジンを添加した。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行った。過剰のアミノオキシ−ＰＳＡ試薬をＨＩＣによって除去した。反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、８Ｍの酢酸アンモニウム、ｐＨ６．９）を含有する緩衝液を添加することによって１３０ｍＳ／ｃｍに引き上げ、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２．５Ｍの酢酸アンモニウム、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９で事前に平衡化した８０ｍＬのフェニルセファロースＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）で充填したカラム上に負荷した。続いて、その複合体を、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液ｐＨ７．５で溶出した。最後に、ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された３０ｋＤの膜（８８ｃｍ２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供した。調製物を、総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）およびＦＶＩＩＩ色原体活性の測定によって分析的に特徴付けた。ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ複合体は、天然のｒＦＶＩＩＩと比較して７０％超の特異的活性を決定することを示した。
方法２：
Ｈｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、約３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、０．１％のポリソルベート８０、ｐＨ７．４）中のＡＤＶＡＴＥプロセス由来の５８ｍｇの組換え因子ＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）を、反応緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中に溶解し、１．０＋／−０．２５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のｐＨを、０．５ＮのＨＣｌ水溶液の滴加によって６．０に修正する。続いて、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、１０分以内で添加し、２００μＭの濃度を得る。酸化反応をＴ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で３０＋／−５分間行う。次いで、Ｔ＝＋２２＋／−２℃で、１５分以内のＬ−システイン水溶液（１Ｍ）の添加により反応を停止し、反応混合物中で１０ｍＭの最終濃度を得て、６０＋／−５分間インキュベートする。
酸化ｒＦＶＩＩＩを、ＥＭＤ ＴＭＡＥ（Ｍ）（Ｍｅｒｃｋ）上で陰イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。混合物を、緩衝液Ａ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ６．５）で希釈し、５ｍｓ／ｃｍの伝導率を得る。この溶液を、１．５ｃｍ／分の流速を用いて、１０ｍＬのカラム体積を有するＩＥＸカラム（床高さ：５．４ｃｍ）上に負荷する。続いて、このカラムを、５ＣＶの緩衝液Ａと緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、１．０ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）の９２：８の混合物（ｗ／ｗ）で洗浄する（流速：１．５ｃｍ／分）。次いで、酸化ｒＦＶＩＩＩを、緩衝液Ａと緩衝液Ｂの５０：５０（ｗ／ｗ）の混合物で溶出し、続いて、５ＣＶの緩衝液Ｂを使用して溶出後のステップを行う。１．０ｃｍ／分の流速の使用によって溶出ステップを行う。
続いて、アミノオキシ−ポリシアル酸（ＰＳＡ−ＯＮＨ２）試薬を、穏やかな撹拌下で、５０倍モル過剰で、精製された酸化ｒＦＶＩＩＩを含有する溶出液に最長期間（ｔ）の１５分以内で添加する。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で添加し、１０ｍＭの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で、１２０＋／−１０分間インキュベートする。
得られたＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ複合体を、１５ｃｍの床高さ（ｈ）および８１ｍＬの得られたカラム体積（ＣＶ）を有するＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって製造されたカラムに充填されたフェニルセファロースＦＦ低ｓｕｂ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）によって精製する。
反応混合物を、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、８Ｍの酢酸アンモニウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液の添加によって、酢酸アンモニウムでスパイクする。２体積の反応混合物を、緩衝液系を含有する１体積の酢酸アンモニウムと混合し、ｐＨ値は、０．５ＮのＮａＯＨ水溶液の滴加によってｐＨ６．９に修正する。この混合物を、１ｃｍ／分の流速でＨＩＣカラム上に負荷し、続いて、３ＣＶ超の平衡化緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、２．５Ｍの酢酸アンモニウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９）を使用する洗浄ステップを行う。
反応副生成物および抗カオトロピック塩の除去に関しては、第２の洗浄ステップを、２ｃｍ／分の流速の上向流モードで、５ＣＶ超の洗浄緩衝液１（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３Ｍの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９）を使用して行う。次いで、精製されたＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ複合体の溶出を、１ｃｍ／分の流速の下向流モードで、４０％の洗浄緩衝液２（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１．５Ｍの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９）および６０％の溶出緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ７．５）のステップ勾配を使用して行う。ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ複合体の溶出は、ＵＶ２８０ｎｍでモニタリングし、複合体を含有する溶出液を、４ＣＶ未満以内で収集する。溶出後のステップを同じ条件下で、３ＣＶ超の溶出緩衝液を使用して行い、主な生成物から微量および／または修飾されないｒＦＶＩＩＩを分離する。
最後に、精製された複合体を、３０ｋＤの分子量カットオフを有する再生成されたセルロースから作製された膜（８８ｃｍ２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮する。
この手順の使用によって調製された複合体を、総タンパク質、ＦＶＩＩＩ色原体活性の測定によって、およびＰＳＡ含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定（レゾルシノールアッセイ）によって分析的に特徴付ける。得られた複合体に対して、５０％超の特異的特性および５．０超のＰＳＡの度合いを算出する。
方法３：
５０ｍｇのｒＦＶＩＩＩを、反応緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈して、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得た。５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒としてｍ−トルイジン（最終濃度：１０ｍＭ）およびＮａＩＯ４（最終濃度：４００μＭ）を添加した。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行った。続いて、反応物を、システイン（最終濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行った。次いで、反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウムを含有する緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、８Ｍの酢酸アンモニウム、ｐＨ６．９）を添加することによって、１３０ｍＳ／ｃｍに引き上げ、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２．５Ｍの酢酸アンモニウム、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．９で事前に平衡化した８０ｍＬのフェニルセファロースＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）で充填したカラム上に負荷した。続いて、その複合体を５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ７．５で溶出した。最後に、ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された３０ｋＤの膜（８８ｃｍ２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供した。調製物を、総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）およびＦＶＩＩＩ色原体活性の測定によって分析的に特徴付けた。ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ複合体に対して、天然のｒＦＶＩＩＩと比較して７０％以上の特異的活性を決定した。
方法４：
５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、約３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、０．１％のポリソルベート８０、ｐＨ７．４）中のＡＤＶＡＴＥプロセス由来の５０ｍｇの組換え因子ＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）を、反応緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中に溶解し、１．０＋／−０．２５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得た。次いで、溶液のｐＨを、０．５ＮのＨＣｌ水溶液の滴加によって６．０に修正した。
続いて、アミノオキシ−ポリシアル酸（ＰＳＡ−ＯＮＨ２）試薬を、穏やかな撹拌下で、５０倍モル過剰で、このｒＦＶＩＩＩ溶液に最長期間（ｔ）の１５分以内で添加した。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で添加し、１０ｍＭの最終濃度を得た。最後に、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を添加し、４００μＭの濃度を得た。
反応混合物を、穏やかな振とう下で、暗室で、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で１２０＋／−１０分間インキュベートした。次いで、Ｌ−システイン水溶液（１Ｍ）の添加によって反応を停止し、反応混合物中で１０ｍＭの最終濃度を得て、６０＋／−５分間インキュベートした。
得られたＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ複合体を、１５ｃｍの床高さ（ｈ）および８１ｍＬの得られたカラム体積（ＣＶ）を有するＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって製造されたカラムに充填されたフェニルセファロースＦＦ低ｓｕｂ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）によって精製した。
反応混合物を、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、８Ｍの酢酸アンモニウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液の添加によって、酢酸アンモニウムでスパイクした。２体積の反応混合物を、緩衝液系を含有する１体積の酢酸アンモニウムと混合し、ｐＨ値は、０．５ＮのＮａＯＨ水溶液の滴加によってｐＨ６．９に修正した。この混合物を、１ｃｍ／分の流速でＨＩＣカラム上に負荷し、続いて、３ＣＶ超の平衡化緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、２．５Ｍの酢酸アンモニウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９）を使用する洗浄ステップを行った。
反応副生成物および抗カオトロピック塩の除去に関しては、第２の洗浄ステップを、２ｃｍ／分の流速の上向流モードで、５ＣＶ超の洗浄緩衝液１（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３Ｍの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９）を使用して行った。次いで、精製されたｒＦＶＩＩＩ複合体の溶出を、１ｃｍ／分の流速の下向流モードで、４０％の洗浄緩衝液２（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１．５Ｍの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９）および６０％の溶出緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ７．５）のステップ勾配を使用して行った。ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ複合体の溶出は、ＵＶ２８０ｎｍでモニタリングし、複合体を含有する溶出液を、４ＣＶ未満以内で収集した。溶出後のステップを同じ条件下で、３ＣＶ超の溶出緩衝液を使用して行い、主な生成物から微量および／または修飾されないｒＦＶＩＩＩを分離した。
最後に、精製された複合体を、３０ｋＤの分子量カットオフを有する再生成されたセルロースから作製された膜（８８ｃｍ２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮した。
この手順の使用によって調製された複合体を、総タンパク質、ＦＶＩＩＩ色原体活性の測定によって、およびＰＳＡ含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定（レゾルシノールアッセイ）によって分析的に特徴付けた。
分析データ（６つの連続するバッチの平均）：
プロセス収率（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）：５８．９％
プロセス収率（ＦＶＩＩＩ色原体活性）：４６．４％
特異的活性：（ＦＶＩＩＩ色原体活性／ｍｇタンパク質）：４１４８ＩＵ／ｍｇ
特異的活性（出発物質の割合（％））：７９．９％
ＰＳＡの度合い（ｍｏｌ／ｍｏｌ）：８．１
実施例１３
アミノオキシ−ＰＥＧ試薬および求核触媒としてｍ−トルイジンを使用するｒＦＶＩＩＩのＰＥＧ化
方法１：
ｒＦＶＩＩＩを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によって、ＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。１４．７ｍｇのｒＦＶＩＩＩを、７．０ｍＬのヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０（２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２）中に溶解する。次いで、２９６μＬの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（５ｍＭ）を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、４℃で１時間インキュベートし、７．５μＬの１Ｍのシステイン水溶液の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物をＶｉｖａｓｐｉｎ １５Ｒ １０ｋＤの遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去した。
酸化ｒＦＶＩＩＩを含有する残余分（１０．９ｍＬ）を、２．９４ｍＬのｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合し、室温で３０分間インキュベートする。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬を添加して、５倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２．５時間インキュベートした。
最後に、ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ複合体を、ＱセファロースＦＦ上でイオン交換クロマトグラフィによって精製する。１．５ｍｇのタンパク質／ｍＬゲルを、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．４で平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、５ｍＭのＣａＣｌ２および５００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液で溶出し、次いで、３０ｋＤの膜（５０ｃｍ２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過に供する。調製物を、総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）およびＦＶＩＩＩ色原体活性の測定によって分析的に特徴付ける。ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ複合体では、天然のｒＦＶＩＩＩと比較して７０％超の特異的活性が決定されることを示すことが予測される。
方法２：
ｒＦＶＩＩＩを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によって、ＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。出発重量または濃度のｒＦＶＩＩＩを、反応緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中に溶解するか、またはそれに移して、１．０＋／−０．２５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のｐＨを、０．５ＮのＨＣｌ水溶液の滴加によって６．０に修正する。続いて、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、１０分以内で添加し、２００μＭの濃度を得る。酸化反応を、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で３０＋／−５分間で行う。次いで、Ｔ＝＋２２＋／−２℃で、１５分以内のＬ−システイン水溶液（１Ｍ）の添加により反応を停止し、反応混合物中での１０ｍＭの最終濃度を得て、６０＋／−５分間インキュベートする。
酸化ｒＦＶＩＩＩを、ＥＭＤ ＴＭＡＥ（Ｍ）（Ｍｅｒｃｋ）上で陰イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。混合物を、緩衝液Ａ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ６．５）で希釈し、５ｍｓ／ｃｍの伝導率を得る。この溶液を、１．５ｃｍ／分の流速を用いて、１０ｍＬのカラム体積を有するＩＥＸカラム（床高さ：５．４ｃｍ）上に負荷する。続いて、このカラムを、５ＣＶの緩衝液Ａと緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、１．０ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）の９２：８の混合物（ｗ／ｗ）で洗浄する（流速：１．５ｃｍ／分）。次いで、酸化ｒＦＶＩＩＩを、緩衝液Ａと緩衝液Ｂの５０：５０（ｗ／ｗ）の混合物で溶出し、続いて、５ＣＶの緩衝液Ｂを使用して溶出後のステップを行う。１．０ｃｍ／分の流速の使用によって溶出ステップを行う。
続いて、２０ｋＤの分子量の試薬を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬を、穏やかな撹拌下で、５０倍モル過剰で、精製された酸化ｒＦＶＩＩＩを含有する溶出液に最長期間（ｔ）の１５分以内で添加する。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で添加し、１０ｍＭの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で、１２０＋／−１０分間インキュベートする。
得られたＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ複合体を、１５ｃｍの床高さ（ｈ）および８１ｍＬの得られたカラム体積（ＣＶ）を有するＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって製造されたカラムに充填されたフェニルセファロースＦＦ低ｓｕｂ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）によって精製する。
反応混合物を、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、８Ｍの酢酸アンモニウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液の添加によって、酢酸アンモニウムでスパイクする。２体積の反応混合物を、緩衝液系を含有する１体積の酢酸アンモニウムと混合し、ｐＨ値を、０．５ＮのＮａＯＨ水溶液の滴加によってｐＨ６．９に修正する。この混合物を、１ｃｍ／分の流速を用いてＨＩＣカラム上に負荷し、続いて、３ＣＶ超の平衡化緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、２．５Ｍの酢酸アンモニウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９）を使用する洗浄ステップを行う。
反応副生成物および抗カオトロピック塩の除去に関しては、第２の洗浄ステップを、２ｃｍ／分の流速の上向流モードで、５ＣＶ超の洗浄緩衝液１（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３Ｍの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９）を使用して行う。次いで、精製されたｒＦＶＩＩＩ複合体の溶出を、１ｃｍ／分の流速の下向流モードで、４０％の洗浄緩衝液２（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１．５Ｍの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９）および６０％の溶出緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ７．５）のステップ勾配を使用して行う。ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ複合体の溶出は、ＵＶ２８０ｎｍでモニタリングし、複合体を含有する溶出液を、４ＣＶ未満以内で収集する。溶出後のステップを同じ条件下で、３ＣＶ超の溶出緩衝液を使用して行い、主な生成物から微量および／または修飾されないｒＦＶＩＩＩを分離する。
最後に、精製された複合体を、３０ｋＤの分子量カットオフを有する再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮する。
この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法３：
ｒＦＶＩＩＩを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によって、ＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。６ｍＬのＨｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中に溶解される７．８４ｍｇのｒＦＶＩＩＩを、３１４μＬの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（１０ｍＭ）、および１．５７ｍＬのｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、２０倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、８μＬのシステイン水溶液（１Ｍ）の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。
最後に、ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ複合体を、ＱセファロースＦＦ上でイオン交換クロマトグラフィによって精製する。１．５ｍｇのタンパク質／ｍＬゲルを、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．４で事前に平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、５ｍＭのＣａＣｌ２および５００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液で溶出し、次いで、３０ｋＤの膜（８８ｃｍ２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過に供する。ＦＶＩＩＩ色原体アッセイおよび総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）の決定による複合体の分析的特徴付けは、ｒＦＶＩＩＩ出発物質と比較して６０％超の特異的活性を示す。
方法４：
ｒＦＶＩＩＩを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によって、ＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。初期濃度または重量のｒＦＶＩＩＩを、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移すか、またはその中に溶解して、ｒＦＶＩＩＩの２ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。続いて、５ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を１５分以内で添加し、１００μＭの最終濃度を得、続いて、５０ｍＭのｍ−トルイジン水溶液の添加によって、３０分の期間以内に１０ｍＭの最終濃度を得る。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬（上述）を添加し、２０倍モル過剰を得る。ｐＨを６．０に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、１ＭのＬ−システイン水溶液の添加によって室温で１５分間反応停止処理を行い、１０ｍＭの最終濃度を得る。
遊離ｒＦＶＩＩＩを、イオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＣ）によって除去する。反応混合物を、適切な量の緩衝液Ａ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）で希釈し、緩衝液Ａで事前に平衡化した２０ｍＬのＨｉＰｒｅｐ ＱＦＦ１６／１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）上に負荷する前に、溶液の伝導率およびｐＨ値を修正した。次いで、カラムを緩衝液Ｂ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）で溶出した。遊離ｒＦＶＩＩＩを、２５％の緩衝液Ｂを使用するステップ勾配によって溶出し、得られた画分中１２〜２５ｍＳ／ｃｍの伝導率をもたらし、その複合体を、５０％の緩衝液Ｂのステップ勾配を使用して溶出し、複合体画分中２７〜４５ｍＳ／ｃｍの伝導率をもたらした。続いて、複合体を含有する画分の伝導率は、緩衝液Ｃを使用して（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ６．９、例えば酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等の抗カオトロピック塩の使用によって）、引き上げ、緩衝液Ｄ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ６．９）で事前に平衡化した２０ｍＬのＨｉＰｒｅｐブチルＦＦ１６／１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴまたは同等のＨＩＣ培地）上に負荷する。遊離ＰＥＧ試薬を、５ＣＶの緩衝液Ｄ内で洗浄した。続いて、その複合体を、１００％の緩衝液Ｅ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）で溶出した。複合体を含有する画分を、再生成されたセルロースから作製された１０ｋＤの膜（８８ｃｍ２、カットオフ１０ｋＤ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップをＨｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）に対して行う。
調製物を、公知の方法に従う総タンパク質（ＢｒａｄｆｏｒｄおよびＢＣＡ手順）ならびに生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
実施例１４
アミノオキシ−ＰＳＡおよび求核触媒としてｍ−トルイジンを使用するｒＦＶＩＩａのポリシアル化
方法１：
出発濃度または重量の組換え因子ＶＩＩａ（ｒＦＶＩＩａ）を、反応緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移すか、またはその中に溶解して、１．０＋／−０．２５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のｐＨを、０．５ＮのＮａＯＨ水溶液の滴加によって６．０に修正する。続いて、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、１０分以内で添加し、５０μＭの濃度を得る。酸化反応をＴ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で３０＋／−５分間行う。次いで、Ｔ＝＋２２＋／−２℃で、１５分以内のＬ−システイン水溶液（１Ｍ）の添加により反応を停止し、反応混合物中で１０ｍＭの最終濃度を得て、６０＋／−５分間インキュベートする。
酸化ｒＦＶＩＩａを、ＥＭＤ ＴＭＡＥ（Ｍ）（Ｍｅｒｃｋ）上で陰イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。混合物を、緩衝液Ａ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ６．５）で希釈し、５ｍｓ／ｃｍの伝導率を得る。この溶液を、１．５ｃｍ／分の流速を用いて、１０ｍＬのカラム体積を有するＩＥＸカラム（床高さ：５．４ｃｍ）上に負荷する。続いて、このカラムを、５ＣＶの緩衝液Ａと緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、１．０ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）の９２：８の混合物（ｗ／ｗ）で洗浄する（流速：１．５ｃｍ／分）。次いで、酸化ｒＦＶＩＩａを、緩衝液Ａと緩衝液Ｂの５０：５０（ｗ／ｗ）の混合物で溶出し、続いて、５ＣＶの緩衝液Ｂを使用して溶出後のステップを行う。１．０ｃｍ／分の流速の使用によって溶出ステップを行う。
続いて、アミノオキシ−ポリシアル酸（ＰＳＡ−ＯＮＨ２）試薬を、穏やかな撹拌下で、５０倍モル過剰で、精製された酸化ｒＦＶＩＩａを含有する溶出液に最長期間（ｔ）の１５分以内で添加する。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で添加し、１０ｍＭの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で、１２０＋／−１０分間インキュベートする。
得られたＰＳＡ−ｒＦＶＩＩａ複合体を、１５ｃｍの床高さ（ｈ）および８１ｍＬの得られたカラム体積（ＣＶ）を有するＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって製造されたカラムに充填されたフェニルセファロースＦＦ低ｓｕｂ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）によって精製する。
反応混合物を、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、８Ｍの酢酸アンモニウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液の添加によって、酢酸アンモニウムでスパイクする。２体積の反応混合物を、緩衝液系を含有する１体積の酢酸アンモニウムと混合し、ｐＨ値を、０．５ＮのＮａＯＨ水溶液の滴加によってｐＨ６．９に修正する。この混合物を、１ｃｍ／分の流速でＨＩＣカラム上に負荷し、続いて、３ＣＶ超の平衡化緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、２．５Ｍの酢酸アンモニウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９）を使用する洗浄ステップを行う。
反応副生成物および抗カオトロピック塩の除去に関しては、第２の洗浄ステップを、２ｃｍ／分の流速の上向流モードで、５ＣＶ超の洗浄緩衝液１（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３Ｍの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９）を使用して行う。次いで、精製されたｒＦＶＩＩａ複合体の溶出を、１ｃｍ／分の流速の下向流モードで、４０％の洗浄緩衝液２（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１．５Ｍの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９）および６０％の溶出緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ７．５）のステップ勾配を使用して行う。ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩａ複合体の溶出は、ＵＶ２８０ｎｍでモニタリングし、複合体を含有する溶出液を、４ＣＶ未満以内で収集する。溶出後のステップを同じ条件下で、３ＣＶ超の溶出緩衝液を使用して行い、主な生成物から微量および／または修飾されないｒＦＶＩＩａを分離する。
最後に、精製された複合体を、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースから作製された膜（例えば１０ｋＤのＭＷＣＯ、８８ｃｍ２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮する。
この手順の使用によって調製された複合体を、総タンパク質、生物活性の測定、およびＰＳＡ含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定（レゾルシノールアッセイ）によって分析的に特徴付ける。
方法２：
出発重量または濃度のｒＦＶＩＩａを、反応緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中に溶解するか、またはそれに移して、１．０＋／−０．２５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のｐＨを、０．５ＮのＮａＯＨ水溶液の滴加によって６．０に修正する。
続いて、アミノオキシ−ポリシアル酸（ＰＳＡ−ＯＮＨ２）試薬を、穏やかな撹拌下で、５０倍モル過剰で、このｒＦＶＩＩａ溶液に最長期間（ｔ）の１５分以内で添加する。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で添加し、１０ｍＭの最終濃度を得る。最後に、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を添加し、１５０μＭの濃度を得る。
反応混合物を、穏やかな振とう下で、暗室で、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で１２０＋／−１０分間インキュベートする。次いで、Ｌ−システイン水溶液（１Ｍ）の添加によって反応を停止し、反応混合物中で１０ｍＭの最終濃度を得て、６０＋／−５分間インキュベートする。
得られたＰＳＡ−ｒＦＶＩＩａ複合体を、１５ｃｍの床高さ（ｈ）および８１ｍＬの得られたカラム体積（ＣＶ）を有するＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって製造されたカラムに充填されたフェニルセファロースＦＦ低ｓｕｂ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）によって精製する。
反応混合物を、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、８Ｍの酢酸アンモニウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液の添加によって、酢酸アンモニウムでスパイクする。２体積の反応混合物を、緩衝液系を含有する１体積の酢酸アンモニウムと混合し、ｐＨ値は、０．５ＮのＮａＯＨ水溶液の滴加によってｐＨ６．９に修正する。この混合物を、１ｃｍ／分の流速を使用するＨＩＣカラム上に負荷し、続いて、３ＣＶ超の平衡化緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、２．５Ｍの酢酸アンモニウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９）を使用する洗浄ステップを行う。
反応副生成物および抗カオトロピック塩の除去に関しては、第２の洗浄ステップを、２ｃｍ／分の流速の上向流モードで、５ＣＶ超の洗浄緩衝液１（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３Ｍの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９）を使用して行う。次いで、精製されたｒＦＶＩＩａ複合体の溶出を、１ｃｍ／分の流速の下向流モードで、４０％の洗浄緩衝液２（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１．５Ｍの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９）および６０％の溶出緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ７．５）のステップ勾配を使用して行う。ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩａ複合体の溶出は、ＵＶ２８０ｎｍでモニタリングし、複合体を含有する溶出液を、４ＣＶ未満以内で収集した。溶出後のステップを同じ条件下で、３ＣＶ超の溶出緩衝液を使用して行い、主な生成物から微量および／または修飾されないｒＦＶＩＩＩを分離する。
最後に、精製された複合体を、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮する。
この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質、生物活性の測定、およびＰＳＡ含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定（レゾルシノールアッセイ）によって分析的に特徴付ける。
実施例１５
アミノオキシ−ＰＥＧ試薬および求核触媒としてｍ−トルイジンを使用するｒＦＩＸのＰＥＧ化
方法１：
ｒＦＩＸを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によって、ＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。出発重量または濃度のｒＦＩＸを、反応緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中に溶解するか、またはそれに移して、１．０＋／−０．２５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のｐＨを、０．５ＮのＨＣｌ水溶液の滴加によって６．０に修正する。続いて、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、１０分以内で添加し、２００μＭの濃度を得る。酸化反応をＴ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で３０＋／−５分間行う。次いで、Ｔ＝＋２２＋／−２℃で、１５分以内のＬ−システイン水溶液（１Ｍ）の添加により反応を停止し、反応混合物中で１０ｍＭの最終濃度を得て、６０＋／−５分間インキュベートする。
酸化ｒＦＶＩＩＩを、ＥＭＤ ＴＭＡＥ（Ｍ）（Ｍｅｒｃｋ）上で陰イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。混合物を、緩衝液Ａ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ６．５）で希釈し、５ｍＳ／ｃｍの伝導率を得る。この溶液を、１．５ｃｍ／分の流速を用いて、１０ｍＬのカラム体積を有するＩＥＸカラム（床高さ：５．４ｃｍ）上に負荷する。続いて、このカラムを、５ＣＶの緩衝液Ａと緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、１．０ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）の９２：８の混合物（ｗ／ｗ）で洗浄する（流速：１．５ｃｍ／分）。次いで、酸化ｒＦＩＸを、緩衝液Ａと緩衝液Ｂの５０：５０（ｗ／ｗ）の混合物で溶出し、続いて、５ＣＶの緩衝液Ｂを使用して溶出後のステップを行う。１．０ｃｍ／分の流速の使用によって溶出ステップを行う。
続いて、２０ｋＤの分子量の試薬を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬を、穏やかな撹拌下で、５０倍モル過剰で、精製された酸化ｒＦＩＸを含有する溶出液に最長期間（ｔ）の１５分以内で添加する。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で添加し、１０ｍＭの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で、１２０＋／−１０分間インキュベートする。
得られたＰＥＧ−ｒＦＩＸ複合体を、１５ｃｍの床高さ（ｈ）および８１ｍＬの得られたカラム体積（ＣＶ）を有するＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって製造されたカラムに充填されたフェニルセファロースＦＦ低ｓｕｂ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）によって精製する。
反応混合物を、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、８Ｍの酢酸アンモニウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液の添加によって、酢酸アンモニウムでスパイクする。２体積の反応混合物を、緩衝液系を含有する１体積の酢酸アンモニウムと混合し、ｐＨ値を、０．５ＮのＮａＯＨ水溶液の滴加によってｐＨ６．９に修正する。この混合物を、１ｃｍ／分の流速を用いてＨＩＣカラム上に負荷し、続いて、３ＣＶ超の平衡化緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、２．５Ｍの酢酸アンモニウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９）を使用する洗浄ステップを行う。
反応副生成物および抗カオトロピック塩の除去に関しては、第２の洗浄ステップを、２ｃｍ／分の流速の上向流モードで、５ＣＶ超の洗浄緩衝液１（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３Ｍの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９）を使用して行う。次いで、精製されたｒＦＩＸ複合体の溶出を、１ｃｍ／分の流速の下向流モードで、４０％の洗浄緩衝液２（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１．５Ｍの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９）および６０％の溶出緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ７．５）のステップ勾配を使用して行う。ＰＳＡ−ｒＦＩＸ複合体の溶出は、ＵＶ２８０ｎｍでモニタリングし、複合体を含有する溶出液を、４ＣＶ未満以内で収集する。溶出後のステップを同じ条件下で、３ＣＶ超の溶出緩衝液を使用して行い、主な生成物から微量および／または修飾されないｒＦＩＸを分離する。
最後に、精製された複合体を、１０ｋＤの分子量カットオフを有する再生成されたセルロースから作製された膜（８８ｃｍ２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮する。
この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法２：
ｒＦＩＸを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によって、ＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。初期濃度または重量のｒＦＩＸを、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移すか、またはその中に溶解して、ｒＦＩＸの２ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。続いて、５ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を１５分以内で添加し、１００μＭの最終濃度を得、続いて、５０ｍＭのｍ−トルイジン水溶液の添加によって、３０分の期間以内に１０ｍＭの最終濃度を得る。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬（上述）を添加し、２０倍モル過剰の試薬を得る。ｐＨを６．０に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、１ＭのＬ−システイン水溶液の添加によって室温で１５分間反応停止処理を行い、１０ｍＭの最終濃度を得る。
遊離ｒＦＩＸを、イオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＣ）によって除去する。反応混合物を、適切な量の緩衝液Ａ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）で希釈し、緩衝液Ａで事前に平衡化した２０ｍＬのＨｉＰｒｅｐ ＱＦＦ１６／１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）上に負荷する前に、溶液の伝導率およびｐＨ値を修正した。次いで、カラムを緩衝液Ｂ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）で溶出した。遊離ｒＦＩＸを、２５％の緩衝液Ｂを使用するステップ勾配によって溶出し、得られた画分中１２〜２５ｍＳ／ｃｍの伝導率をもたらし、その複合体を、５０％の緩衝液Ｂのステップ勾配を使用して溶出し、複合体画分中２７〜４５ｍＳ／ｃｍの伝導率をもたらした。続いて、複合体を含有する画分の伝導率は、緩衝液Ｃを使用して（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ６．９、例えば酢酸アンモニウム等の抗カオトロピック塩の使用によって）、引き上げ、緩衝液Ｄ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ６．９）で事前に平衡化した２０ｍＬのＨｉＰｒｅｐブチルＦＦ１６／１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴまたは同等のＨＩＣ培地）上に負荷する。遊離アミノオキシ−ＰＥＧ試薬を、５ＣＶの緩衝液Ｄ内で洗浄した。続いて、その複合体を、１００％の緩衝液Ｅ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）で溶出した。複合体を含有する画分を、再生成されたセルロースから作製された１０ｋＤの膜（８８ｃｍ２、カットオフ１０ｋＤ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップをＨｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）に対して行う。
調製物を、公知の方法に従って総タンパク質（ＢｒａｄｆｏｒｄおよびＢＣＡ手順）ならびに生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
実施例１６
アミノオキシ−ＰＥＧ試薬および求核触媒としてｍ−トルイジンを使用するｒＦＶＩＩａのＰＥＧ化
方法１：
ｒＦＶＩＩａを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によって、ＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。出発重量または濃度のｒＦＶＩＩａを、反応緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中に溶解するか、またはそれに移して、１．０＋／−０．２５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のｐＨを、０．５ＮのＮａＯＨ水溶液の滴加によって６．０に修正する。続いて、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、１０分以内で添加し、５０μＭの濃度を得る。酸化反応をＴ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で３０＋／−５分間行う。次いで、Ｔ＝＋２２＋／−２℃で、１５分以内のＬ−システイン水溶液（１Ｍ）の添加により反応を停止し、反応混合物中で１０ｍＭの最終濃度を得て、６０＋／−５分間インキュベートする。
酸化ｒＦＶＩＩａを、ＥＭＤ ＴＭＡＥ（Ｍ）（Ｍｅｒｃｋ）上で陰イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。混合物を、緩衝液Ａ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ６．５）で希釈し、５ｍＳ／ｃｍの伝導率を得る。この溶液を、１．５ｃｍ／分の流速を用いて、１０ｍＬのカラム体積を有するＩＥＸカラム（床高さ：５．４ｃｍ）上に負荷する。続いて、このカラムを、５ＣＶの緩衝液Ａと緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、１．０ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）の９２：８の混合物（ｗ／ｗ）で洗浄する（流速：１．５ｃｍ／分）。次いで、酸化ｒＦＶＩＩａを、緩衝液Ａと緩衝液Ｂの５０：５０（ｗ／ｗ）の混合物で溶出し、続いて、５ＣＶの緩衝液Ｂを使用して溶出後のステップを行う。１．０ｃｍ／分の流速の使用によって溶出ステップを行う。
続いて、２０ｋＤの分子量の試薬を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬を、穏やかな撹拌下で、５０倍モル過剰で、精製された酸化ｒＦＶＩＩａを含有する溶出液に最長期間（ｔ）の１５分以内で添加する。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で添加し、１０ｍＭの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で、１２０＋／−１０分間インキュベートする。
得られたＰＥＧ−ｒＦＶＩＩａ複合体を、１５ｃｍの床高さ（ｈ）および８１ｍＬの得られたカラム体積（ＣＶ）を有するＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって製造されたカラムに充填されたフェニルセファロースＦＦ低ｓｕｂ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）によって精製する。
反応混合物に、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、８Ｍの酢酸アンモニウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液の添加によって、酢酸アンモニウムでスパイクする。２体積の反応混合物を、緩衝液系を含有する１体積の酢酸アンモニウムと混合し、ｐＨ値を、０．５ＮのＮａＯＨ水溶液の滴加によってｐＨ６．９に修正する。この混合物を、１ｃｍ／分の流速を用いてＨＩＣカラム上に負荷し、続いて、３ＣＶ超の平衡化緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、２．５Ｍの酢酸アンモニウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９）を使用する洗浄ステップを行う。
反応副生成物および抗カオトロピック塩の除去に関しては、第２の洗浄ステップを、２ｃｍ／分の流速の上向流モードで、５ＣＶ超の洗浄緩衝液１（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３Ｍの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９）を使用して行う。次いで、精製されたｒＦＶＩＩａ複合体の溶出を、１ｃｍ／分の流速の下向流モードで、４０％の洗浄緩衝液２（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１．５Ｍの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９）および６０％の溶出緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ７．５）のステップ勾配を使用して行う。ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩａ複合体の溶出は、ＵＶ２８０ｎｍでモニタリングし、複合体を含有する溶出液を、４ＣＶ未満以内で収集する。溶出後のステップを同じ条件下で、３ＣＶ超の溶出緩衝液を使用して行い、主な生成物から微量および／または修飾されないｒＦＶＩＩａを分離する。
最後に、精製された複合体を、１０ｋＤの分子量カットオフを有する再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮する。
この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法２：
ｒＦＶＩＩａを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によって、ＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。初期濃度または重量のｒＦＶＩＩａを、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移すか、またはその中に溶解して、ｒＦＶＩＩａの２ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。続いて、５ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を１５分以内で添加し、１００μＭの最終濃度を得、続いて、５０ｍＭのｍ−トルイジン水溶液の添加によって、３０分の期間以内に１０ｍＭの最終濃度を得る。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬（上述）を添加し、２０倍モル過剰の試薬を得る。ｐＨを６．０に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、１ＭのＬ−システイン水溶液の添加によって室温で１５分間反応停止処理を行い、１０ｍＭの最終濃度を得る。
遊離ｒＦＶＩＩａを、イオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＣ）によって除去する。反応混合物を、適切な量の緩衝液Ａ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）で希釈し、緩衝液Ａで事前に平衡化した２０ｍＬのＨｉＰｒｅｐ ＱＦＦ１６／１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）上に負荷する前に、溶液の伝導率およびｐＨ値を修正した。次いで、カラムを緩衝液Ｂ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）で溶出した。遊離ｒＦＶＩＩａを、２５％の緩衝液Ｂを使用するステップ勾配によって溶出し、得られた画分中１２〜２５ｍＳ／ｃｍの伝導率をもたらし、その複合体を、５０％の緩衝液Ｂのステップ勾配を使用して溶出し、複合体画分中２７〜４５ｍＳ／ｃｍの伝導率をもたらした。続いて、複合体を含有する画分の伝導率は、緩衝液Ｃを使用して（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ６．９、例えば酢酸アンモニウム等の抗カオトロピック塩の使用によって）、引き上げ、緩衝液Ｄ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ６．９）で事前に平衡化した２０ｍＬのＨｉＰｒｅｐブチルＦＦ１６／１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴまたは同等のＨＩＣ培地）上に負荷する。遊離ＰＥＧ試薬を、５ＣＶの緩衝液Ｄ内で洗浄した。続いて、その複合体を、１００％の緩衝液Ｅ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）で溶出した。複合体を含有する画分を、再生成されたセルロースから作製された１０ｋＤの膜（８８ｃｍ２、カットオフ１０ｋＤ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップをＨｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）に対して行う。
調製物を、公知の方法に従う総タンパク質（ＢｒａｄｆｏｒｄおよびＢＣＡ手順）ならびに生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
実施例１７
ｏ−アミノ安息香酸の存在下でのｒＦＩＸのポリシアル化
方法１：
８．２ｍｇのｒＦＩＸを、４．０ｍＬのヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０（２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２）中に溶解する。次いで、８２μＬの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（５ｍＭ）を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、４℃で１時間インキュベートし、４μＬの１Ｍのシステイン水溶液の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物をＶｉｖａｓｐｉｎ
６ １０ｋＤの遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
酸化ｒＦＩＸを含有する残余分（６．５ｍＬ）を、１．６４ｍＬの水性ｏ−アミノ安息香酸（５０ｍＭ）と混合し、室温で３０分間インキュベートする。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、５倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２．５時間インキュベートした。
本明細書に説明される通りに複合体の更なる精製を行う。
方法２：
５倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を含有する０．６５ｍＬのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０中の１ｍｇのｒＦＩＸの溶液を調製した。３３３μＬのｏ−アミノ安息香酸水溶液（３０ｍＭ）を求核触媒として添加し、１０ｍＭの最終濃度を得た。続いて、２０μＬのＮａＩＯ４水溶液（５ｍＭ）を添加し、１００μＭの最終濃度を生じた。カップリングプロセスを、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行い、１μＬのシステイン水溶液（１Ｍ）の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行った。本明細書に説明される通りに複合体の更なる精製を行う。
実施例１８
アミノオキシ−ＰＳＡおよび求核触媒としてｍ−トルイジンを使用するＥＰＯのポリシアル化
方法１：
出発濃度のエリスロポエチン（ＥＰＯ）を、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈し、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。この溶液に、ＮａＩＯ４を添加して、２００μＭの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で３０分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン（最終濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行う。
次に、溶液を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去するか、代替法において、緩衝液Ａ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．０）で平衡化された２０ｍＬの体積を有するＩＥＸカラム（Ｍｅｒｃｋ ＥＭＤ ＴＭＡＥ（Ｍ））に供する。カラムを、５ＣＶの緩衝液Ａで平衡化する。酸化ＥＰＯを緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）を使用して溶出する。ＥＰＯを含有する画分を収集する。タンパク質含有量を決定し（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）、反応緩衝液を使用して１ｍｇ／ｍＬに調整し、０．５ＭのＨＣｌの滴加によってｐＨ６．０に調整する。
５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒としてｍ−トルイジン（最終濃度：１０ｍＭ）を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行う。過剰のアミノオキシ−ＰＳＡ試薬をＨＩＣによって除去する。反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、８Ｍの酢酸アンモニウム、ｐＨ６．９）を含有する緩衝液を添加することによって調整し、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２．５Ｍの酢酸アンモニウム、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９で事前に平衡化した８０ｍＬのフェニルセファロースＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）で充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液ｐＨ７．５で溶出する。最後に、ＰＳＡ−ＥＰＯを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースで作製された膜（ＭＷＣＯ １０ｋＤ、５０ｃｍ２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法１を実行する。
１０ｍｇのＥＰＯを、５ｍＬのヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０（２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中に溶解する。次いで、１００μＬの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（５ｍＭ）を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、４℃で１時間インキュベートし、５０μＬの１Ｍのシステイン水溶液の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物をＶｉｖａｓｐｉｎ １５Ｒ １０ｋＤの遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
酸化ＥＰＯを含有する残余分（約７ｍＬ）を、２ｍＬのｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合し、室温で３０分間インキュベートする。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、５倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２．５時間インキュベートする。
遊離ＥＰＯを、陰イオン交換クロマトグラフィ（ＡＥＣ）によって除去する。反応混合物を、２０ｍＬの緩衝液Ａ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５）で希釈し、緩衝液Ａで事前に平衡化した２０ｍＬのＨｉＰｒｅｐ ＱＦＦ１６／１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）上に負荷する。次いで、カラムを、緩衝液Ｂ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で溶出する。遊離ＥＰＯを、２５％の緩衝液Ｂを使用してカラムを洗浄することによって溶出し、その複合体を、５０％の緩衝液Ｂで溶出する。続いて、複合体を含有する画分の伝導率を、緩衝液Ｃ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．９）を使用して約１９０ｍＳ／ｃｍに引き上げ、緩衝液Ｄ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．９）で事前に平衡化した２０ｍＬのＨｉＰｒｅｐブチルＦＦ１６／１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）上に負荷する。遊離ＰＳＡ試薬を、５ＣＶの緩衝液Ｄ内で洗浄する。続いて、その複合体を、１００％の緩衝液Ｅ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４）で溶出する。複合体を含有する画分を、再生成されたセルロースから作製された１０ｋＤの膜（８８ｃｍ２、カットオフ１０ｋＤ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップを、１５０ｍＭのＮａＣｌを含有するヒスチジン緩衝液、ｐＨ７．２に対して行う。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。ＰＳＡ−ＥＰＯ複合体に対して、天然のＥＰＯと比較して５０％超の特異性活性を決定する。更に、その複合体を、以前に説明されている条件下で、Ｓｈｏｄｅｘ ＫＷ ８０３カラムを搭載したＡｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣシステムを使用するサイズ排除ＨＰＬＣによって分析的に特徴付ける（Ｋｏｌａｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ２００６；４６：１９５９−７７）。調製物が遊離ＥＰＯを含有しないことを示す。
方法２：
ＥＰＯを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移すか、またはその中に溶解して、１．０＋／−０．２５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のｐＨを、０．５ＮのＨＣｌ水溶液の滴加によって６．０に修正する。続いて、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、１０分以内で添加し、２００μＭの濃度を得る。酸化反応をＴ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で３０＋／−５分間行う。次いで、Ｔ＝＋２２＋／−２℃で、１５分以内のＬ−システイン水溶液（１Ｍ）の添加により反応を停止し、反応混合物中で１０ｍＭの最終濃度を得て、６０＋／−５分間インキュベートする。
酸化ＥＰＯを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。溶出液の酸化ＥＰＯを含有する画分を収集し、複合化反応に使用する。
アミノオキシ−ポリシアル酸（ＰＳＡ−ＯＮＨ２）試薬を、穏やかな撹拌下で、５０倍モル過剰で、精製された酸化ＥＰＯを含有する溶出液に最長期間（ｔ）の１５分以内で添加する。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で添加し、１０ｍＭの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で、ｐＨ６．０で１２０＋／−１０分間インキュベートする（タンパク質濃度：１ｍｇ／ｍＬ）。
得られたＰＳＡ−ＥＰＯ複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。ＰＳＡ−ＥＰＯ複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮する。
この手順の使用によって調製された複合体を、総タンパク質、生物活性の測定、およびＰＳＡ含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定（レゾルシノールアッセイ）によって分析的に特徴付ける。
方法３：
エリスロポエチン（ＥＰＯ）を、反応緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈して、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒としてｍ−トルイジン（１０ｍＭの最終濃度）およびＮａＩＯ４（最終濃度：４００μＭ）を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行う。続いて、反応物を、システイン（システイン濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行う。次いで、反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、８Ｍの酢酸アンモニウム、ｐＨ６．９）を含有する緩衝液を添加することによって調整し、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２．５Ｍの酢酸アンモニウム、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．９で事前に平衡化したフェニルセファロースＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）で充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ７．５で溶出する。最後に、ＰＳＡ−ＥＰＯを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（ＭＷＣＯ
１０ｋＤ、８８ｃｍ２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法３を実行する。１０ｍｇのＥＰＯを、８ｍＬのヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０（２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中に溶解する。次いで、２００μＬの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（５ｍＭ）および２ｍＬのｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を添加する。続いて、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、５倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、１００μＬの１Ｍのシステイン水溶液の添加によって室温で１５分間反応停止処理を行う。
遊離ＥＰＯを、陰イオン交換クロマトグラフィ（ＡＥＣ）によって除去する。反応混合物を、２０ｍＬの緩衝液Ａ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５）で希釈し、緩衝液Ａで事前に平衡化した２０ｍＬのＨｉＰｒｅｐ ＱＦＦ１６／１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）上に負荷する。次いで、カラムを、緩衝液Ｂ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で溶出する。遊離ＥＰＯを、２５％の緩衝液Ｂを使用してカラムを洗浄することによって溶出し、その複合体を、５０％の緩衝液Ｂで溶出する。続いて、複合体を含有する画分の伝導率を、緩衝液Ｃ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．９）を使用して約１９０ｍＳ／ｃｍに引き上げ、緩衝液Ｄ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．９）で事前に平衡化した２０ｍＬのＨｉＰｒｅｐブチルＦＦ１６／１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）上に負荷する。遊離ＰＳＡ試薬を、５ＣＶの緩衝液Ｄ内で洗浄する。続いて、その複合体を、１００％の緩衝液Ｅ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４）で溶出する。複合体を含有する画分を、再生成されたセルロースから作製された１０ｋＤの膜（８８ｃｍ２、カットオフ１０ｋＤ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップを、１５０ｍＭのＮａＣｌを含有するヒスチジン緩衝液、ｐＨ７．２に対して行う。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。ＰＳＡ−ＥＰＯ複合体に対して、天然のＥＰＯと比較して５０％超の特異性活性を決定する。更に、その複合体を、以前に説明されている条件下で、Ｓｈｏｄｅｘ ＫＷ ８０３カラムを搭載したＡｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣシステムを使用するサイズ排除ＨＰＬＣによって分析的に特徴付ける（Ｋｏｌａｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ２００６；４６：１９５９−７７）。調製物が遊離ＥＰＯを含有しないことを示す。
方法４：
ＥＰＯを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中に溶解するか、またはそれに移して、１．０＋／−０．２５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のｐＨを、０．５ＮのＨＣｌ水溶液の滴加によって６．０に修正する。
続いて、アミノオキシ−ポリシアル酸（ＰＳＡ−ＯＮＨ２）試薬を、穏やかな撹拌下で、５０倍モル過剰で、このＥＰＯ溶液に最長期間（ｔ）の１５分以内で添加する。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で添加し、１０ｍＭの最終濃度を得る。最後に、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を添加し、４００μＭの濃度を得る。
反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で、１２０＋／−１０分間インキュベートする。次いで、Ｌ−システイン水溶液（１Ｍ）の添加によって反応を停止し、反応混合物中で１０ｍＭの最終濃度を得て、６０＋／−５分間インキュベートする。
得られたＰＳＡ−ＥＰＯ複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。溶出液のＰＳＡ−ＥＰＯを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（ＭＷＣＯ １０ｋＤ、８８ｃｍ２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮する。
この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質、生物活性の測定、およびＰＳＡ含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定（レゾルシノールアッセイ）によって分析的に特徴付ける。
実施例１９
アミノオキシ−ＰＳＡおよび求核触媒としてｍ−トルイジンを使用するＡｎｇ−２のポリシアル化
方法１：
出発濃度のアンジオポエチン−２（Ａｎｇ−２）を、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈し、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。この溶液に、ＮａＩＯ４を添加して、２００μＭの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で３０分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン（最終濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行う。
次に、溶液を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去するか、代替法において、緩衝液Ａ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．０）で平衡化した２０ｍＬの体積を有するＩＥＸカラム（Ｍｅｒｃｋ ＥＭＤ ＴＭＡＥ（Ｍ））に供する。カラムを、５ＣＶの緩衝液Ａで平衡化する。酸化Ａｎｇ−２を緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）を使用して溶出する。Ａｎｇ−２を含有する画分を収集する。タンパク質含有量を決定し（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）、反応緩衝液を使用して１ｍｇ／ｍＬに調整し、０．５ＭのＨＣｌの滴加によってｐＨ６．０に調整する。
５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒としてｍ−トルイジン（最終濃度：１０ｍＭ）を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行う。過剰のアミノオキシ試薬をＨＩＣによって除去する。反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、８Ｍの酢酸アンモニウム、ｐＨ６．９）を含有する緩衝液を添加することによって調整し、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２．５Ｍの酢酸アンモニウム、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９で事前に平衡化した８０ｍＬのフェニルセファロースＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）で充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液ｐＨ７．５で溶出する。最後に、ＰＳＡ−Ａｎｇ−２−を含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法１を実行する。アンジオポエチン−２（Ａｎｇ−２）を、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈し、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。この溶液に、ＮａＩＯ４を添加して、２００μＭの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で３０分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン（最終濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行う。
次に、溶液を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒としてｍ−トルイジン（最終濃度：１０ｍＭ）を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行う。過剰のアミノオキシ試薬をイオン交換クロマトグラフィによって除去する。溶出液のＰＳＡ−Ａｎｇ−２複合体を含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法２：
Ａｎｇ−２を、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移すか、またはその中に溶解して、１．０＋／−０．２５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のｐＨを、０．５ＮのＨＣｌ水溶液の滴加によって６．０に修正する。続いて、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、１０分以内で添加し、２００μＭの濃度を得る。酸化反応をＴ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で３０＋／−５分間行う。次いで、Ｔ＝＋２２＋／−２℃で、１５分以内のＬ−システイン水溶液（１Ｍ）の添加により反応を停止し、反応混合物中で１０ｍＭの最終濃度を得て、６０＋／−５分間インキュベートする。
酸化Ａｎｇ−２を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。溶出液の酸化Ａｎｇ−２を含有する画分を収集し、複合化反応に使用する。
アミノオキシ−ポリシアル酸（ＰＳＡ−ＯＮＨ２）試薬を、穏やかな撹拌下で、５０倍モル過剰で、精製された酸化Ａｎｇ−２を含有する溶出液に最長期間（ｔ）の１５分以内で添加する。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で添加し、１０ｍＭの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で、ｐＨ６．０で１２０＋／−１０分間インキュベートする（タンパク質濃度：１ｍｇ／ｍＬ）。
得られたＰＳＡ−Ａｎｇ−２複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。
ＰＳＡ−Ａｎｇ−２複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮する。
この手順の使用によって調製された複合体を、総タンパク質、生物活性の測定、およびＰＳＡ含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定（レゾルシノールアッセイ）によって分析的に特徴付ける。
方法３：
アンジオポエチン−２（Ａｎｇ−２）を、反応緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈し、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するＰＳＡアミノオキシ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒としてｍ−トルイジン（１０ｍＭの最終濃度）およびＮａＩＯ４（最終濃度：４００μＭ）を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行う。続いて、反応物を、システイン（システイン濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行う。次いで、反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、８Ｍの酢酸アンモニウム、ｐＨ６．９）を含有する緩衝液を添加することによって調整し、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２．５Ｍの酢酸アンモニウム、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．９で事前に平衡化したフェニルセファロースＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）で充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ７．５で溶出する。最後に、ＰＳＡ−Ａｎｇ−２−を含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法３を実行する。アンジオポエチン−２（Ａｎｇ−２）を、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈し、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するＰＳＡアミノオキシ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒としてｍ−トルイジン（１０ｍＭの最終濃度）およびＮａＩＯ４（最終濃度：４００μＭ）を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行う。続いて、反応物を、システイン（システイン濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行い、その複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。溶出液のＰＳＡ Ａｎｇ−２−を含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法４：
Ａｎｇ−２を、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中に溶解するか、またはそれに移して、１．０＋／−０．２５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のｐＨを、０．５ＮのＨＣｌ水溶液の滴加によって６．０に修正する。
続いて、アミノオキシ−ポリシアル酸（ＰＳＡ−ＯＮＨ２）試薬を、穏やかな撹拌下で、５０倍モル過剰で、このＡｎｇ−２溶液に最長期間（ｔ）の１５分以内で添加する。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で添加し、１０ｍＭの最終濃度を得る。最後に、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を添加し、４００μＭの濃度を得る。
反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で、１２０＋／−１０分間インキュベートする。次いで、Ｌ−システイン水溶液（１Ｍ）の添加によって反応を停止し、反応混合物中で１０ｍＭの最終濃度を得て、６０＋／−５分間インキュベートする。
得られたＰＳＡ−Ａｎｇ−２複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。溶出液のＰＳＡ−Ａｎｇ−２を含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮する。
この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質、生物活性の測定、およびＰＳＡ含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定（レゾルシノールアッセイ）によって分析的に特徴付ける。
実施例２０
アミノオキシ−ＰＳＡおよび求核触媒としてｍ−トルイジンを使用するＶＥＧＦのポリシアル化
方法１：
出発濃度の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈し、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。この溶液に、ＮａＩＯ４を添加して、２００μＭの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で３０分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン（最終濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行う。
次に、溶液を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去するか、代替法において、緩衝液Ａ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．０）で平衡化された２０ｍＬの体積を有するＩＥＸカラム（Ｍｅｒｃｋ ＥＭＤ ＴＭＡＥ（Ｍ））に供する。カラムを、５ＣＶの緩衝液Ａで平衡化する。酸化ＶＥＧＦを、緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で溶出する。ＶＥＧＦを含有する画分を収集する。タンパク質含有量を決定し（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）、反応緩衝液を使用して１ｍｇ／ｍＬに調整し、０．５ＭのＮａＯＨの滴加によってｐＨ６．０に調整する。
５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒としてｍ−トルイジン（最終濃度：１０ｍＭ）を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行う。過剰のアミノオキシ試薬をＨＩＣによって除去する。反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、８Ｍの酢酸アンモニウム、ｐＨ６．９）を含有する緩衝液を添加することによって調整し、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２．５Ｍの酢酸アンモニウム、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９で事前に平衡化した８０ｍＬのフェニルセファロースＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）で充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液ｐＨ７．５で溶出する。最後に、ＰＳＡ−ＶＥＧＦを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法１を実行する。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈し、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。この溶液に、ＮａＩＯ４を添加して、２００μＭの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で３０分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン（最終濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行う。
次に、溶液を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒としてｍ−トルイジン（最終濃度：１０ｍＭ）を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行う。過剰のアミノオキシ試薬をイオン交換クロマトグラフィによって除去する。溶出液のＰＳＡ−ＶＥＧＦを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法２：
ＶＥＧＦを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移すか、またはその中に溶解して、１．０＋／−０．２５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のｐＨを、０．５ＮのＨＣｌ水溶液の滴加によって６．０に修正する。続いて、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、１０分以内で添加し、２００μＭの濃度を得る。酸化反応をＴ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で３０＋／−５分間行う。次いで、Ｔ＝＋２２＋／−２℃で、１５分以内のＬ−システイン水溶液（１Ｍ）の添加により反応を停止し、反応混合物中で１０ｍＭの最終濃度を得て、６０＋／−５分間インキュベートする。
酸化ＶＥＧＦを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。溶出液の酸化ＶＥＧＦを含有する画分を収集し、複合化反応に使用する。
アミノオキシ−ポリシアル酸（ＰＳＡ−ＯＮＨ２）試薬を、穏やかな撹拌下で、５０倍モル過剰で、精製された酸化ＶＥＧＦを含有する溶出液に最長期間（ｔ）の１５分以内で添加する。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で添加し、１０ｍＭの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で、ｐＨ６．０で１２０＋／−１０分間インキュベートする（タンパク質濃度：１ｍｇ／ｍＬ）。
得られたＰＳＡ−ＶＥＧＦ複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。ＰＳＡ−ＶＥＧＦ複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮する。
この手順の使用によって調製された複合体を、総タンパク質、生物活性の測定、およびＰＳＡ含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定（レゾルシノールアッセイ）によって分析的に特徴付ける。
方法３：
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を、反応緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈し、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するＰＳＡアミノオキシ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒としてｍ−トルイジン（１０ｍＭの最終濃度）およびＮａＩＯ４（最終濃度：４００μＭ）を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行う。続いて、反応物を、システイン（システイン濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行う。次いで、反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、８Ｍの酢酸アンモニウム、ｐＨ６．９）を含有する緩衝液を添加することによって調整し、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２．５Ｍの酢酸アンモニウム、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．９で事前に平衡化したフェニルセファロースＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）で充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ７．５で溶出する。最後に、ＰＳＡ−ＶＥＧＦを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法３を実行する。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈し、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒としてｍ−トルイジン（１０ｍＭの最終濃度）およびＮａＩＯ４（最終濃度：４００μＭ）を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行う。続いて、反応物を、システイン（システイン濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行い、その複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。溶出液のＰＳＡ−ＶＥＧＦを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法４：
ＶＥＧＦを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中に溶解するか、またはそれに移して、１．０＋／−０．２５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のｐＨを、０．５ＮのＨＣｌ水溶液の滴加によって６．０に修正する。
続いて、アミノオキシ−ポリシアル酸（ＰＳＡ−ＯＮＨ２）試薬を、穏やかな撹拌下で、５０倍モル過剰で、このＶＥＧＦ溶液に最長期間（ｔ）の１５分以内で添加する。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で添加し、１０ｍＭの最終濃度を得る。最後に、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を添加し、４００μＭの濃度を得る。
反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で、１２０＋／−１０分間インキュベートする。次いで、Ｌ−システイン水溶液（１Ｍ）の添加によって反応を停止し、反応混合物中で１０ｍＭの最終濃度を得て、６０＋／−５分間インキュベートする。
得られたＶＥＧＦ複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。溶出液のＰＳＡ−ＶＥＧＦを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮する。
この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質、生物活性の測定、およびＰＳＡ含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定（レゾルシノールアッセイ）によって分析的に特徴付ける。
実施例２１
アミノオキシ−ＰＳＡおよび求核触媒としてｍ−トルイジンを使用するＥＧＦのポリシアル化
方法１：
出発濃度の上皮増殖因子（ＥＧＦ）を、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈し、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。この溶液に、ＮａＩＯ４を添加して、２００μＭの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で３０分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン（最終濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行う。
次に、溶液を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去するか、代替法において、緩衝液Ａ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．０）で平衡化された２０ｍＬの体積を有するＩＥＸカラム（Ｍｅｒｃｋ ＥＭＤ ＴＭＡＥ（Ｍ））に供する。カラムを、５ＣＶの緩衝液Ａで平衡化する。酸化ＥＧＦを緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で溶出する。ＥＧＦを含有する画分を収集する。タンパク質含有量を決定し（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）、反応緩衝液を使用して１ｍｇ／ｍＬに調整し、０．５ＭのＨＣｌの滴加によってｐＨ６．０に調整する。
５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒としてｍ−トルイジン（最終濃度：１０ｍＭ）を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行う。過剰のアミノオキシ試薬をＨＩＣによって除去する。反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、８Ｍの酢酸アンモニウム、ｐＨ６．９）を含有する緩衝液を添加することによって調整し、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２．５Ｍの酢酸アンモニウム、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９で事前に平衡化した８０ｍＬのフェニルセファロースＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）で充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液ｐＨ７．５で溶出する。最後に、ＰＳＡ−ＥＧＦを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法１を実行する。上皮増殖因子（ＥＧＦ）を、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈し、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。この溶液に、ＮａＩＯ４を添加して、２００μＭの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で３０分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン（最終濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行う。
次に、溶液を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒としてｍ−トルイジン（最終濃度：１０ｍＭ）を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行う。過剰のアミノオキシ試薬をイオン交換クロマトグラフィによって除去する。溶出液のＰＳＡ−ＥＧＦを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法２：
ＥＧＦを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移すか、またはその中に溶解して、１．０＋／−０．２５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のｐＨを、０．５ＮのＨＣｌ水溶液の滴加によって６．０に修正する。続いて、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、１０分以内で添加し、２００μＭの濃度を得る。酸化反応をＴ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で３０＋／−５分間行う。次いで、Ｔ＝＋２２＋／−２℃で、１５分以内のＬ−システイン水溶液（１Ｍ）の添加により反応を停止し、反応混合物中で１０ｍＭの最終濃度を得て、６０＋／−５分間インキュベートする。
酸化ＥＧＦを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。溶出液の酸化ＥＧＦを含有する画分を収集し、複合化反応に使用する。
アミノオキシ−ポリシアル酸（ＰＳＡ−ＯＮＨ２）試薬を、穏やかな撹拌下で、５０倍モル過剰で、精製された酸化ＥＧＦを含有する溶出液に最長期間（ｔ）の１５分以内で添加する。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で添加し、１０ｍＭの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で、ｐＨ６．０で１２０＋／−１０分間インキュベートする（タンパク質濃度：１ｍｇ／ｍＬ）。
得られたＰＳＡ−ＥＧＦ複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。ＰＳＡ−ＥＧＦ複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮する。
この手順の使用によって調製された複合体を、総タンパク質、生物活性の測定、およびＰＳＡ含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定（レゾルシノールアッセイ）によって分析的に特徴付ける。
方法３：
上皮増殖因子（ＥＧＦ）を、反応緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈し、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するＰＳＡアミノオキシ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒としてｍ−トルイジン（１０ｍＭの最終濃度）およびＮａＩＯ４（最終濃度：４００μＭ）を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行う。続いて、反応物を、システイン（システイン濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行う。次いで、反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、８Ｍの酢酸アンモニウム、ｐＨ６．９）を含有する緩衝液を添加することによって調整し、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２．５Ｍの酢酸アンモニウム、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．９で事前に平衡化したフェニルセファロースＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）で充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ７．５で溶出する。最後に、ＰＳＡ−ＥＧＦを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法３を実行する。上皮増殖因子（ＥＧＦ）を、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈し、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するＰＳＡアミノオキシ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒としてｍ−トルイジン（１０ｍＭの最終濃度）およびＮａＩＯ４（最終濃度：４００μＭ）を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行う。続いて、反応物を、システイン（システイン濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行い、その複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。溶出液の複合体を含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法４：
ＥＧＦを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中に溶解するか、またはそれに移して、１．０＋／−０．２５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のｐＨを、０．５ＮのＨＣｌ水溶液の滴加によって６．０に修正する。
続いて、アミノオキシ−ポリシアル酸（ＰＳＡ−ＯＮＨ２）試薬を、穏やかな撹拌下で、５０倍モル過剰で、このＥＧＦ溶液に最長期間（ｔ）の１５分以内で添加する。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で添加し、１０ｍＭの最終濃度を得る。最後に、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を添加し、４００μＭの濃度を得る。
反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で、１２０＋／−１０分間インキュベートする。次いで、Ｌ−システイン水溶液（１Ｍ）の添加によって反応を停止し、反応混合物中で１０ｍＭの最終濃度を得て、６０＋／−５分間インキュベートする。
得られたＥＧＦ−複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。溶出液のＰＳＡ−ＥＧＦを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮する。
この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質、生物活性の測定、およびＰＳＡ含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定（レゾルシノールアッセイ）によって分析的に特徴付ける。
実施例２２
アミノオキシ−ＰＳＡおよび求核触媒としてｍ−トルイジンを使用するＮＧＦのポリシアル化
方法１：
出発濃度の神経増殖因子（ＮＧＦ）を、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈し、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。この溶液に、ＮａＩＯ４を添加して、２００μＭの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で３０分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン（最終濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行う。
次に、溶液を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去するか、代替法において、緩衝液Ａ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．０）で平衡化された２０ｍＬの体積を有するＩＥＸカラム（Ｍｅｒｃｋ ＥＭＤ ＴＭＡＥ（Ｍ））に供する。カラムを、５ＣＶの緩衝液Ａで平衡化する。酸化ＮＧＦを緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）を使用して溶出する。ＮＧＦを含有する画分を収集する。タンパク質含有量を決定し（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）、反応緩衝液を使用して１ｍｇ／ｍＬに調整し、０．５ＭのＨＣｌの滴加によってｐＨ６．０に調整する。
５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒としてｍ−トルイジン（最終濃度：１０ｍＭ）を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行う。過剰のアミノオキシ試薬をＨＩＣによって除去する。反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、８Ｍの酢酸アンモニウム、ｐＨ６．９）を含有する緩衝液を添加することによって調整し、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２．５Ｍの酢酸アンモニウム、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９で事前に平衡化した８０ｍＬのフェニルセファロースＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）で充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液ｐＨ７．５で溶出する。最後に、ＰＳＡ−ＮＧＦを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法１を実行する。神経増殖因子（ＮＧＦ）を、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈し、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。この溶液に、ＮａＩＯ４を添加して、２００μＭの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で３０分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン（最終濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行う。
次に、溶液を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒としてｍ−トルイジン（最終濃度：１０ｍＭ）を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行う。過剰のアミノオキシ試薬をイオン交換クロマトグラフィによって除去する。溶出液のＰＳＡ−ＮＧＦを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法２：
ＮＧＦを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移すか、またはその中に溶解して、１．０＋／−０．２５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のｐＨを、０．５ＮのＨＣｌ水溶液の滴加によって６．０に修正する。続いて、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、１０分以内で添加し、２００μＭの濃度を得る。酸化反応をＴ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で３０＋／−５分間行う。次いで、Ｔ＝＋２２＋／−２℃で、１５分以内のＬ−システイン水溶液（１Ｍ）の添加により反応を停止し、反応混合物中で１０ｍＭの最終濃度を得て、６０＋／−５分間インキュベートする。
酸化ＮＧＦを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。溶出液の酸化ＮＧＦを含有する画分を収集し、複合化反応に使用する。
アミノオキシ−ポリシアル酸（ＰＳＡ−ＯＮＨ２）試薬を、穏やかな撹拌下で、５０倍モル過剰で、精製された酸化ＮＧＦを含有する溶出液に最長期間（ｔ）の１５分以内で添加する。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で添加し、１０ｍＭの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で、ｐＨ６．０で１２０＋／−１０分間インキュベートする（タンパク質濃度：１ｍｇ／ｍＬ）。
得られたＰＳＡ−ＮＧＦ複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。ＰＳＡ−ＮＧＦ複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮する。
この手順の使用によって調製された複合体を、総タンパク質、生物活性の測定、およびＰＳＡ含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定（レゾルシノールアッセイ）によって分析的に特徴付ける。
方法３：
神経増殖因子（ＮＧＦ）を、反応緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈し、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒としてｍ−トルイジン（１０ｍＭの最終濃度）およびＮａＩＯ４（最終濃度：４００μＭ）を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行う。続いて、反応物を、システイン（システイン濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行う。次いで、反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、８Ｍの酢酸アンモニウム、ｐＨ６．９）を含有する緩衝液を添加することによって調整し、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２．５Ｍの酢酸アンモニウム、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．９で事前に平衡化したフェニルセファロースＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）で充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ７．５で溶出する。最後に、ＰＳＡ−ＮＧＦを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法３を実行する。神経増殖因子（ＮＧＦ）を、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈し、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒としてｍ−トルイジン（１０ｍＭの最終濃度）およびＮａＩＯ４（最終濃度：４００μＭ）を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行う。続いて、反応物を、システイン（システイン濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行い、その複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。次いで、溶出液のＰＳＡ−ＮＧＦを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法４：
ＮＧＦを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中に溶解するか、それに移して、１．０＋／−０．２５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のｐＨを、０．５ＮのＨＣｌ水溶液の滴加によって６．０に修正する。
続いて、アミノオキシ−ポリシアル酸（ＰＳＡ−ＯＮＨ２）試薬を、穏やかな撹拌下で、５０倍モル過剰で、このＮＧＦ溶液に最長期間（ｔ）の１５分以内で添加する。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で添加し、１０ｍＭの最終濃度を得る。最後に、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を添加し、４００μＭの濃度を得る。
反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で、１２０＋／−１０分間インキュベートする。次いで、Ｌ−システイン水溶液（１Ｍ）の添加によって反応を停止し、反応混合物中で１０ｍＭの最終濃度を得て、６０＋／−５分間インキュベートする。
得られたＮＧＦ複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。溶出液のＰＳＡ−ＮＧＦを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮する。
この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質、生物活性の測定、およびＰＳＡ含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定（レゾルシノールアッセイ）によって分析的に特徴付ける。
実施例２３
アミノオキシ−ＰＳＡおよび求核触媒としてｍ−トルイジンを使用するＨＧＨのポリシアル化
方法１：
本明細書に説明されるように、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）のアミノ酸配列は、まず、少なくとも１つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、ＨＧＨは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル酸化される。
出発濃度のヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）を、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈し、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。この溶液に、ＮａＩＯ４を添加して、２００μＭの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で３０分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン（最終濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行う。
次に、溶液を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去するか、代替法において、緩衝液Ａ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．０）で平衡化された２０ｍＬの体積を有するＩＥＸカラム（Ｍｅｒｃｋ ＥＭＤ ＴＭＡＥ（Ｍ））に供する。カラムを、５ＣＶの緩衝液Ａで平衡化する。酸化ＨＧＨを、緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で溶出する。ＨＧＨを含有する画分を収集する。タンパク質含有量を決定し（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）、反応緩衝液を使用して１ｍｇ／ｍＬに調整し、０．５ＭのＨＣｌの滴加によってｐＨ６．０に調整する。
５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒としてｍ−トルイジン（最終濃度：１０ｍＭ）を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行う。過剰のアミノオキシ試薬をＨＩＣによって除去する。反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、８Ｍの酢酸アンモニウム、ｐＨ６．９）を含有する緩衝液を添加することによって調整し、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２．５Ｍの酢酸アンモニウム、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９で事前に平衡化した８０ｍＬのフェニルセファロースＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）で充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液ｐＨ７．５で溶出する。最後に、ＰＳＡ−ＨＧＨを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法１を実行する。本明細書に説明されるように、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）のアミノ酸配列は、まず、少なくとも１つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、ＨＧＨは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。ＨＧＨを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈し、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。この溶液に、ＮａＩＯ４を添加して、２００μＭの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で３０分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン（最終濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行う。
次に、溶液を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒としてｍ−トルイジン（最終濃度：１０ｍＭ）を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行う。過剰のアミノオキシ試薬をイオン交換クロマトグラフィによって除去する。溶出液のＰＳＡ−ＨＧＨを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法２：
本明細書に説明されるように、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）のアミノ酸配列は、まず、少なくとも１つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、ＨＧＨは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。
ＨＧＨを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移すか、またはその中に溶解して、１．０＋／−０．２５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のｐＨを、０．５ＮのＨＣｌ水溶液の滴加によって６．０に修正する。続いて、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、１０分以内で添加し、２００μＭの濃度を得る。酸化反応をＴ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で３０＋／−５分間行う。次いで、Ｔ＝＋２２＋／−２℃で、１５分以内のＬ−システイン水溶液（１Ｍ）の添加により反応を停止し、反応混合物中で１０ｍＭの最終濃度を得て、６０＋／−５分間インキュベートする。
酸化ＨＧＨを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。溶出液の酸化ＨＧＨを含有する画分を収集し、複合化反応に使用する。
アミノオキシ−ポリシアル酸（ＰＳＡ−ＯＮＨ２）試薬を、穏やかな撹拌下で、５０倍モル過剰で、精製された酸化ＨＧＨを含有する溶出液に最長期間（ｔ）の１５分以内で添加する。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で添加し、１０ｍＭの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で、ｐＨ６．０で１２０＋／−１０分間インキュベートする（タンパク質濃度：１ｍｇ／ｍＬ）。
得られたＰＳＡ−ＨＧＨ複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。ＰＳＡ−ＨＧＨ複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮する。
この手順の使用によって調製された複合体を、総タンパク質、生物活性の測定、およびＰＳＡ含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定（レゾルシノールアッセイ）によって分析的に特徴付ける。
方法３：
本明細書に説明されるように、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）のアミノ酸配列は、まず、少なくとも１つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、ＨＧＨは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。
ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）を、反応緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈し、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒としてｍ−トルイジン（１０ｍＭの最終濃度）およびＮａＩＯ４（最終濃度：４００μＭ）を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行う。続いて、反応物を、システイン（システイン濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行う。次いで、反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、８Ｍの酢酸アンモニウム、ｐＨ６．９）を含有する緩衝液を添加することによって調整し、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２．５Ｍの酢酸アンモニウム、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．９で事前に平衡化したフェニルセファロースＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）で充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ７．５で溶出する。最後に、ＰＳＡ ＨＧＨを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法３を実行する。本明細書に説明されるように、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）のアミノ酸配列は、まず、少なくとも１つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、ＨＧＨは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。ＨＧＨを、反応緩衝液（例えば、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈し、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒としてｍ−トルイジン（１０ｍＭの最終濃度）およびＮａＩＯ４（最終濃度：４００μＭ）を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行う。続いて、反応物を、システイン（システイン濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行い、その複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。次いで、溶出液のＰＳＡ−ＨＧＨを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法４：
本明細書に説明されるように、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）のアミノ酸配列は、まず、少なくとも１つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、ＨＧＨは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。
ＨＧＨを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中に溶解するか、またはそれに移して、１．０＋／−０．２５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のｐＨを、０．５ＮのＨＣｌ水溶液の滴加によって６．０に修正する。
続いて、アミノオキシ−ポリシアル酸（ＰＳＡ−ＯＮＨ２）試薬を、穏やかな撹拌下で、５０倍モル過剰で、このＨＧＨ溶液に最長時間（ｔ）の１５分以内で添加する。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で添加し、１０ｍＭの最終濃度を得る。最後に、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を添加し、４００μＭの濃度を得る。
反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で、１２０＋／−１０分間インキュベートする。次いで、Ｌ−システイン水溶液（１Ｍ）の添加によって反応を停止し、反応混合物中で１０ｍＭの最終濃度を得て、６０＋／−５分間インキュベートする。
得られたＨＧＨ−複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。溶出液のＰＳＡ−ＨＧＨを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮する。
この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質、生物活性の測定、およびＰＳＡ含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定（レゾルシノールアッセイ）によって分析的に特徴付ける。
実施例２４
アミノオキシ−ＰＳＡおよび求核触媒としてｍ−トルイジンを使用するＴＮＦ−αのポリシアル化
出発濃度の腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）を、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈し、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。この溶液に、ＮａＩＯ４を添加して、２００μＭの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で３０分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン（最終濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行う。
次に、溶液を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去するか、代替法において、緩衝液Ａ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．０）で平衡化された２０ｍＬの体積を有するＩＥＸカラム（Ｍｅｒｃｋ ＥＭＤ ＴＭＡＥ（Ｍ））に供する。カラムを、５ＣＶの緩衝液Ａで平衡化する。酸化ＴＮＦ−αを緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で溶出する。ＴＮＦ−αを含有する画分を収集する。タンパク質含有量を決定し（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）、反応緩衝液を使用して１ｍｇ／ｍＬに調整し、０．５ＭのＨＣｌの滴加によってｐＨ６．０に調整する。
５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒としてｍ−トルイジン（最終濃度：１０ｍＭ）を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行う。過剰のアミノオキシ試薬をＨＩＣによって除去する。反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、８Ｍの酢酸アンモニウム、ｐＨ６．９）を含有する緩衝液を添加することによって調整し、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２．５Ｍの酢酸アンモニウム、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９で事前に平衡化した８０ｍＬのフェニルセファロースＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）で充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液ｐＨ７．５で溶出する。最後に、ＰＳＡ−ＴＮＦ−α−を含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法１を実行する。腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）を、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈し、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。この溶液に、ＮａＩＯ４を添加して、２００μＭの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で３０分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン（最終濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行う。
次に、溶液を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒としてｍ−トルイジン（最終濃度：１０ｍＭ）を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行う。過剰のアミノオキシ試薬をイオン交換クロマトグラフィによって除去する。溶出液のＰＳＡ−ＴＮＦ−αを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法２：
ＴＮＦ−αを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移すか、またはその中に溶解して、１．０＋／−０．２５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のｐＨを、０．５ＮのＨＣｌ水溶液の滴加によって６．０に修正する。続いて、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、１０分以内で添加し、２００μＭの濃度を得る。酸化反応をＴ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で３０＋／−５分間行う。次いで、Ｔ＝＋２２＋／−２℃で、１５分以内のＬ−システイン水溶液（１Ｍ）の添加により反応を停止し、反応混合物中で１０ｍＭの最終濃度を得て、６０＋／−５分間インキュベートする。
酸化ＴＮＦ−αを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。溶出液の酸化ＴＮＦ−αを含有する画分を収集し、複合化反応に使用する。
アミノオキシ−ポリシアル酸（ＰＳＡ−ＯＮＨ２）試薬を、穏やかな撹拌下で、５０倍モル過剰で、精製された酸化ＴＮＦ−αを含有する溶出液に最長期間（ｔ）の１５分以内で添加する。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で添加し、１０ｍＭの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で、ｐＨ６．０で１２０＋／−１０分間インキュベートする（タンパク質濃度：１ｍｇ／ｍＬ）。
得られたＰＳＡ−ＴＮＦ−α複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。ＰＳＡ−ＴＮＦ−α複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮する。
この手順の使用によって調製された複合体を、総タンパク質、生物活性の測定、およびＰＳＡ含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定（レゾルシノールアッセイ）によって分析的に特徴付ける。
方法３：
腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）を、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈し、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒としてｍ−トルイジン（１０ｍＭの最終濃度）およびＮａＩＯ４（最終濃度：４００μＭ）を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行う。続いて、反応物を、システイン（システイン濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行う。次いで、反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、８Ｍの酢酸アンモニウム、ｐＨ６．９）を含有する緩衝液を添加することによって調整し、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２．５Ｍの酢酸アンモニウム、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．９で事前に平衡化したフェニルセファロースＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）で充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ７．５で溶出する。最後に、ＰＳＡ−ＴＮＦ−αを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法３を実行する。腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）を、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈して、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒としてｍ−トルイジン（１０ｍＭの最終濃度）およびＮａＩＯ４（最終濃度：４００μＭ）を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行う。続いて、反応物を、システイン（システイン濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行い、その複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。溶出液のＰＳＡ−ＴＮＦ−αを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法４：
ＴＮＦ−αを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中に溶解するか、またはそれに移して、１．０＋／−０．２５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のｐＨを、０．５ＮのＨＣｌ水溶液の滴加によって６．０に修正する。
続いて、アミノオキシ−ポリシアル酸（ＰＳＡ−ＯＮＨ２）試薬を、穏やかな撹拌下で、５０倍モル過剰で、このＴＮＦ−α溶液に最長期間（ｔ）の１５分以内で添加する。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で添加し、１０ｍＭの最終濃度を得る。最後に、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を添加し、４００μＭの濃度を得る。
反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で、１２０＋／−１０分間インキュベートする。次いで、Ｌ−システイン水溶液（１Ｍ）の添加によって反応を停止し、反応混合物中で１０ｍＭの最終濃度を得て、６０＋／−５分間インキュベートする。
得られたＴＮＦ−α複合体をイオン交換クロマトグラフィによって精製する。溶出液のＰＳＡ−ＴＮＦ−αを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮する。
この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質、生物活性の測定、およびＰＳＡ含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定（レゾルシノールアッセイ）によって分析的に特徴付ける。
実施例２５
アミノオキシ−ＰＳＡおよび求核触媒としてｍ−トルイジンを使用するインスリンのポリシアル化
方法１：
本明細書に説明されるように、インスリンのアミノ酸配列は、まず、少なくとも１つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、インスリンは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。出発濃度のインスリンを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈して、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。この溶液に、ＮａＩＯ４を添加して、２００μＭの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で３０分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン（最終濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行う。
次に、溶液を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去するか、代替法において、緩衝液Ａ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．０）で平衡化された２０ｍＬの体積を有するＩＥＸカラム（Ｍｅｒｃｋ ＥＭＤ ＴＭＡＥ（Ｍ））に供する。カラムを、５ＣＶの緩衝液Ａで平衡化する。酸化インスリンを、緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で溶出する。インスリンを含有する画分を収集する。タンパク質含有量を決定し（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）、反応緩衝液を使用して１ｍｇ／ｍＬに調整し、０．５ＭのＨＣｌの滴加によってｐＨ６．０に調整する。
５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒としてｍ−トルイジン（最終濃度：１０ｍＭ）を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行う。過剰のアミノオキシ試薬をＨＩＣによって除去する。反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、８Ｍの酢酸アンモニウム、ｐＨ６．９）を含有する緩衝液を添加することによって調整し、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２．５Ｍの酢酸アンモニウム、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９で事前に平衡化した８０ｍＬのフェニルセファロースＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）で充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液ｐＨ７．５で溶出する。最後に、ＰＳＡ−インスリンを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法１を実行する。本明細書に説明されるように、インスリンのアミノ酸配列は、まず、少なくとも１つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、インスリンは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。インスリンを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈して、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。この溶液に、ＮａＩＯ４を添加して、２００μＭの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で３０分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン（最終濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行う。
次に、溶液を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒としてｍ−トルイジン（最終濃度：１０ｍＭ）を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行う。過剰のアミノオキシ試薬をイオン交換クロマトグラフィによって除去する。溶出液のＰＳＡ−インスリンを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法２：
本明細書に説明されるように、インスリンのアミノ酸配列は、まず、少なくとも１つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、インスリンは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。
インスリンを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移すか、またはその中に溶解して、１．０＋／−０．２５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のｐＨを、０．５ＮのＨＣｌ水溶液の滴加によって６．０に修正する。続いて、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、１０分以内で添加し、２００μＭの濃度を得る。酸化反応をＴ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で３０＋／−５分間行う。次いで、Ｔ＝＋２２＋／−２℃で、１５分以内のＬ−システイン水溶液（１Ｍ）の添加により反応を停止し、反応混合物中で１０ｍＭの最終濃度を得て、６０＋／−５分間インキュベートする。
酸化インスリンを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。溶出液の酸化インスリンを含有する画分を収集し、複合化反応に使用する。
アミノオキシ−ポリシアル酸（ＰＳＡ−ＯＮＨ２）試薬を、穏やかな撹拌下で、５０倍モル過剰で、精製された酸化インスリンを含有する溶出液に最長期間（ｔ）の１５分以内で添加する。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で添加し、１０ｍＭの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で、ｐＨ６．０で１２０＋／−１０分間インキュベートする（タンパク質濃度：１ｍｇ／ｍＬ）。
得られたＰＳＡ−インスリン複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。ＰＳＡ−インスリン複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮する。
この手順の使用によって調製された複合体を、総タンパク質、生物活性の測定、およびＰＳＡ含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定（レゾルシノールアッセイ）によって分析的に特徴付ける。
方法３：
本明細書に説明されるように、インスリンのアミノ酸配列は、まず、少なくとも１つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、インスリンは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。
インスリンを、反応緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈して、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒としてｍ−トルイジン（１０ｍＭの最終濃度）およびＮａＩＯ４（最終濃度：４００μＭ）を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行う。続いて、反応物を、システイン（システイン濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行う。次いで、反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、８Ｍの酢酸アンモニウム、ｐＨ６．９）を含有する緩衝液を添加することによって調整し、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２．５Ｍの酢酸アンモニウム、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．９で事前に平衡化したフェニルセファロースＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）で充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ７．５で溶出する。最後に、ＰＳＡ−インスリンを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法３を実行する。本明細書に説明されるように、インスリンのアミノ酸配列は、まず、少なくとも１つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、インスリンは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。
インスリンを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈して、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒としてｍ−トルイジン（１０ｍＭの最終濃度）およびＮａＩＯ４（最終濃度：４００μＭ）を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行う。続いて、反応物を、システイン（システイン濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行い、その複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。溶出液のＰＳＡ−インスリンを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法４：
本明細書に説明されるように、インスリンのアミノ酸配列は、まず、少なくとも１つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、インスリンは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。
インスリンを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中に溶解するか、またはそれに移して、１．０＋／−０．２５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のｐＨを、０．５ＮのＨＣｌ水溶液の滴加によって６．０に修正する。
続いて、アミノオキシ−ポリシアル酸（ＰＳＡ−ＯＮＨ２）試薬を、穏やかな撹拌下で、５０倍モル過剰で、このインスリン溶液に最長期間（ｔ）の１５分以内で添加する。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で添加し、１０ｍＭの最終濃度を得る。最後に、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を添加し、４００μＭの濃度を得る。
反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で、１２０＋／−１０分間インキュベートする。次いで、Ｌ−システイン水溶液（１Ｍ）の添加によって反応を停止し、反応混合物中で１０ｍＭの最終濃度を得て、６０＋／−５分間インキュベートする。
得られたインスリン複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。溶出液のＰＳＡ−インスリンを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮する。
この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質、生物活性の測定、およびＰＳＡ含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定（レゾルシノールアッセイ）によって分析的に特徴付ける。
実施例２６
アミノオキシ−ＰＳＡおよび求核触媒としてｍ−トルイジンを使用するインターフェロンαのポリシアル化
方法１：
出発濃度のインターフェロンαを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈して、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。この溶液に、ＮａＩＯ４を添加して、２００μＭの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で３０分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン（最終濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行う。
次に、溶液を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去するか、代替法において、緩衝液Ａ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．０）で平衡化された２０ｍＬの体積を有するＩＥＸカラム（Ｍｅｒｃｋ ＥＭＤ ＴＭＡＥ（Ｍ））に供する。カラムを、５ＣＶの緩衝液Ａで平衡化する。酸化インターフェロン−αを緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で溶出する。インターフェロンαを含有する画分を収集する。タンパク質含有量を決定し（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）、反応緩衝液を使用して１ｍｇ／ｍＬに調整し、０．５ＭのＨＣｌの滴加によってｐＨ６．０に調整する。
５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒としてｍ−トルイジン（最終濃度：１０ｍＭ）を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行う。過剰のアミノオキシ試薬をＨＩＣによって除去する。反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、８Ｍの酢酸アンモニウム、ｐＨ６．９）を含有する緩衝液を添加することによって調整し、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２．５Ｍの酢酸アンモニウム、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９で事前に平衡化した８０ｍＬのフェニルセファロースＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）で充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液ｐＨ７．５で溶出する。最後に、ＰＳＡ−インターフェロンαを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法１を実行する。インターフェロンαを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈して、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。この溶液に、ＮａＩＯ４を添加して、２００μＭの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で３０分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン（最終濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行う。
次に、溶液を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒としてｍ−トルイジン（最終濃度：１０ｍＭ）を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行う。過剰のアミノオキシ試薬をイオン交換クロマトグラフィによって除去する。溶出液のＰＳＡ−インターフェロンαを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法２：
インターフェロンαを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移すか、またはその中に溶解して、１．０＋／−０．２５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のｐＨを、０．５ＮのＨＣｌ水溶液の滴加によって６．０に修正する。続いて、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、１０分以内で添加し、２００μＭの濃度を得る。酸化反応をＴ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で３０＋／−５分間行う。次いで、Ｔ＝＋２２＋／−２℃で、１５分以内のＬ−システイン水溶液（１Ｍ）の添加により反応を停止し、反応混合物中で１０ｍＭの最終濃度を得て、６０＋／−５分間インキュベートする。
酸化インターフェロンαを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。溶出液の酸化インターフェロンαを含有する画分を収集し、複合化反応に使用する。
アミノオキシ−ポリシアル酸（ＰＳＡ−ＯＮＨ２）試薬を、穏やかな撹拌下で、５０倍モル過剰で、精製された酸化インターフェロンγを含有する溶出液に最長期間（ｔ）の１５分以内で添加する。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で添加し、１０ｍＭの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で、ｐＨ６．０で１２０＋／−１０分間インキュベートする（タンパク質濃度：１ｍｇ／ｍＬ）。
得られたＰＳＡ−インターフェロンα複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。ＰＳＡ−インターフェロンα複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮する。
方法３：
インターフェロンαを、反応緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈して、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するＰＳＡアミノオキシ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒としてｍ−トルイジン（１０ｍＭの最終濃度）およびＮａＩＯ４（最終濃度：４００μＭ）を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行う。続いて、反応物を、システイン（システイン濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行う。次いで、反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、８Ｍの酢酸アンモニウム、ｐＨ６．９）を含有する緩衝液を添加することによって調整し、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２．５Ｍの酢酸アンモニウム、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．９で事前に平衡化したフェニルセファロースＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）で充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ７．５で溶出する。最後に、ＰＳＡ−インターフェロンαを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法３を実行する。インターフェロンαを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈して、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒としてｍ−トルイジン（１０ｍＭの最終濃度）およびＮａＩＯ４（最終濃度：４００μＭ）を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行う。続いて、反応物を、システイン（システイン濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行い、その複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。溶出液のＰＳＡ−インターフェロンαを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法４：
インターフェロンαを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中に溶解するか、またはそれに移して、１．０＋／−０．２５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のｐＨを、０．５ＮのＨＣｌ水溶液の滴加によって６．０に修正する。
続いて、アミノオキシ−ポリシアル酸（ＰＳＡ−ＯＮＨ２）試薬を、穏やかな撹拌下で、５０倍モル過剰で、このインターフェロンα溶液に最長期間（ｔ）の１５分以内で添加する。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で添加し、１０ｍＭの最終濃度を得る。最後に、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を添加し、４００μＭの濃度を得る。
反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で、１２０＋／−１０分間インキュベートする。次いで、Ｌ−システイン水溶液（１Ｍ）の添加によって反応を停止し、反応混合物中で１０ｍＭの最終濃度を得て、６０＋／−５分間インキュベートする。
得られたインターフェロンα複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。溶出液のＰＳＡ−インターフェロンαを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮する。
この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質、生物活性の測定、およびＰＳＡ含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定（レゾルシノールアッセイ）によって分析的に特徴付ける。
実施例２７
アミノオキシ−ＰＳＡおよび求核触媒としてｍ−トルイジンを使用するインターフェロンγのポリシアル化
方法１：
１０ｍｇのインターフェロンγを、５ｍＬのヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０（２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中に溶解する。次いで、１００μＬの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（５ｍＭ）を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、４℃で１時間インキュベートし、５０μＬの１Ｍのシステイン水溶液の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物をＶｉｖａｓｐｉｎ １５Ｒ １０ｋＤの遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
酸化インターフェロンγを含有する残余分（約７ｍＬ）を、２ｍＬのｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合し、室温で３０分間インキュベートする。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加して、５倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２．５時間インキュベートする。
遊離インターフェロンγを、陽イオン交換クロマトグラフィ（ＣＥＣ）によって除去する。反応混合物を、２０ｍＬの緩衝液Ａ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ６．５）で希釈し、緩衝液Ａで事前に平衡化した２０ｍＬのＨｉＰｒｅｐ ＳＰＦＦ１６／１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）上に負荷する。次いで、カラムを、緩衝液Ｂ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５）で溶出する。遊離インターフェロンγを、２５％の緩衝液Ｂを使用してカラムを洗浄することによって溶出し、その複合体を、５０％の緩衝液Ｂで溶出する。続いて、複合体を含有する画分の伝導率を、緩衝液Ｃ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．９）を使用して約１９０ｍＳ／ｃｍに引き上げ、緩衝液Ｄ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．９）で事前に平衡化した２０ｍＬのＨｉＰｒｅｐブチルＦＦ１６／１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）上に負荷する。遊離ＰＳＡ試薬を、５ＣＶの緩衝液Ｄ内で洗浄する。続いて、その複合体を、１００％の緩衝液Ｅ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ６．９）で溶出する。複合体を含有する画分を、再生成されたセルロースから作製された１０ｋＤの膜（８８ｃｍ２、カットオフ１０ｋＤ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップを、１５０ｍＭのＮａＣｌを含有するヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．９に対して行う。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。ＰＳＡ−インターフェロンγ複合体に対して、天然のインターフェロンγと比較して５０％超の特異的活性を決定する。更に、その複合体を、以前に説明されている条件下で、Ｓｈｏｄｅｘ ＫＷ ８０３カラムを搭載したＡｇｉｌｅｎｔ
１２００ ＨＰＬＣシステムを使用するサイズ排除ＨＰＬＣによって分析的に特徴付ける（Ｋｏｌａｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ２００６；４６：１９５９−７７）。調製物が遊離インターフェロンγを含有しないことを示す。
方法２：
１０ｍｇのインターフェロンγを、８ｍＬのヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０（２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中に溶解する。次いで、２００μＬの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（５ｍＭ）および２ｍＬのｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を添加する。続いて、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、５倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、１００μＬの１Ｍのシステイン水溶液の添加によって室温で１５分間反応停止処理を行う。
遊離インターフェロンγを、陽イオン交換クロマトグラフィ（ＣＥＣ）によって除去する。反応混合物を、２０ｍＬの緩衝液Ａ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ６．５）で希釈し、緩衝液Ａで事前に平衡化した２０ｍＬのＨｉＰｒｅｐ ＳＰＦＦ１６／１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）上に負荷する。次いで、カラムを、緩衝液Ｂ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５）で溶出する。遊離インターフェロンγを、２５％の緩衝液Ｂを使用してカラムを洗浄することによって溶出し、その複合体を、５０％の緩衝液Ｂで溶出する。続いて、複合体を含有する画分の伝導率を、緩衝液Ｃ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．９）を使用して約１９０ｍＳ／ｃｍに引き上げ、緩衝液Ｄ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．９）で事前に平衡化した２０ｍＬのＨｉＰｒｅｐブチルＦＦ１６／１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）上に負荷する。遊離ＰＳＡ試薬を、５ＣＶの緩衝液Ｄ内で洗浄する。続いて、その複合体を、１００％の緩衝液Ｅ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ６．９）で溶出する。複合体を含有する画分を、再生成されたセルロースから作製された１０ｋＤの膜（８８ｃｍ２、カットオフ１０ｋＤ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップを、１５０ｍＭのＮａＣｌを含有するヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．９に対して行う。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。ＰＳＡ−インターフェロンγ複合体に対して、天然のインターフェロンγと比較して５０％超の特異的活性を決定する。更に、その複合体を、以前に説明されている条件下で、Ｓｈｏｄｅｘ ＫＷ ８０３カラムを搭載したＡｇｉｌｅｎｔ
１２００ ＨＰＬＣシステムを使用するサイズ排除ＨＰＬＣによって分析的に特徴付ける（Ｋｏｌａｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ２００６；４６：１９５９−７７）。調製物が遊離インターフェロンγを含有しないことを示す。
方法３：
１０ｍｇのインターフェロンγを、８ｍＬのヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０（２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中に溶解する。次いで、２００μＬの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（５ｍＭ）および２ｍＬのｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を添加する。続いて、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、５倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、１００μＬの１Ｍのシステイン水溶液の添加によって室温で１５分間反応停止処理を行う。
遊離インターフェロンγを、陽イオン交換クロマトグラフィ（ＣＥＣ）によって除去する。反応混合物を、２０ｍＬの緩衝液Ａ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ６．５）で希釈し、緩衝液Ａで事前に平衡化した２０ｍＬのＨｉＰｒｅｐ ＳＰＦＦ１６／１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）上に負荷する。次いで、カラムを、緩衝液Ｂ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５）で溶出する。遊離インターフェロンγを、２５％の緩衝液Ｂを使用してカラムを洗浄することによって溶出し、その複合体を、５０％の緩衝液Ｂで溶出する。続いて、複合体を含有する画分の伝導率を、緩衝液Ｃ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．９）を使用して約１９０ｍＳ／ｃｍに引き上げ、緩衝液Ｄ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．９）で事前に平衡化した２０ｍＬのＨｉＰｒｅｐブチルＦＦ１６／１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）上に負荷する。遊離ＰＳＡ試薬を、５ＣＶの緩衝液Ｄ内で洗浄する。続いて、その複合体を、１００％の緩衝液Ｅ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ６．９）で溶出する。複合体を含有する画分を、再生成されたセルロースから作製された１０ｋＤの膜（８８ｃｍ２、カットオフ１０ｋＤ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップを、１５０ｍＭのＮａＣｌを含有するヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．９に対して行う。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。ＰＳＡ−インターフェロンγ複合体に対して、天然のインターフェロンγと比較して５０％超の特異的活性を決定する。更に、その複合体を、以前に説明されている条件下で、Ｓｈｏｄｅｘ ＫＷ ８０３カラムを搭載したＡｇｉｌｅｎｔ
１２００ ＨＰＬＣシステムを使用するサイズ排除ＨＰＬＣによって分析的に特徴付ける（Ｋｏｌａｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ２００６；４６：１９５９−７７）。調製物が遊離インターフェロンγを含有しないことを示す。
方法４：
インターフェロンγを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中に溶解するか、またはそれに移して、１．０＋／−０．２５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のｐＨを、０．５ＮのＨＣｌ水溶液の滴加によって６．０に修正する。
続いて、アミノオキシ−ポリシアル酸（ＰＳＡ−ＯＮＨ２）試薬を、穏やかな撹拌下で、５０倍モル過剰で、このインターフェロンγ溶液に最長期間（ｔ）の１５分以内で添加する。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で添加し、１０ｍＭの最終濃度を得る。最後に、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を添加し、４００μＭの濃度を得る。
反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で、１２０＋／−１０分間インキュベートする。次いで、Ｌ−システイン水溶液（１Ｍ）の添加によって反応を停止し、反応混合物中で１０ｍＭの最終濃度を得て、６０＋／−５分間インキュベートする。
得られたインターフェロンγ複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。溶出液のＰＳＡ−インターフェロンγを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮する。
この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質、生物活性の測定、およびＰＳＡ含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定（レゾルシノールアッセイ）によって分析的に特徴付ける。
実施例２８
アミノオキシ−ＰＳＡおよび求核触媒としてｍ−トルイジンを使用するＧ−ＣＳＦのポリシアル化
方法１：
出発濃度の顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈して、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。この溶液に、ＮａＩＯ４を添加して、２００μＭの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で３０分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン（最終濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行う。
次に、溶液を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去するか、代替法において、緩衝液Ａ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．０）で平衡化された２０ｍＬの体積を有するＩＥＸカラム（Ｍｅｒｃｋ ＥＭＤ ＴＭＡＥ（Ｍ））に供する。カラムを、５ＣＶの緩衝液Ａで平衡化する。酸化Ｇ−ＣＳＦを緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で溶出する。Ｇ−ＣＳＦを含有する画分を収集する。タンパク質含有量を決定し（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）、反応緩衝液を使用して１ｍｇ／ｍＬに調整し、０．５ＭのＨＣｌの滴加によってｐＨ６．０に調整する。
５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒としてｍ−トルイジン（最終濃度：１０ｍＭ）を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行う。過剰のアミノオキシ試薬をＨＩＣによって除去する。反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、８Ｍの酢酸アンモニウム、ｐＨ６．９）を含有する緩衝液を添加することによって調整し、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２．５Ｍの酢酸アンモニウム、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９で事前に平衡化した８０ｍＬのフェニルセファロースＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）で充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液ｐＨ７．５で溶出する。最後に、ＰＳＡ−Ｇ−ＣＳＦを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法１を実行する。顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈して、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。この溶液に、ＮａＩＯ４を添加して、２００μＭの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で３０分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン（最終濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行う。
次に、溶液を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒としてｍ−トルイジン（最終濃度：１０ｍＭ）を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行う。過剰のアミノオキシ試薬をイオン交換クロマトグラフィによって除去する。溶出液のＰＳＡ−Ｇ−ＣＳＦを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法２：
Ｇ−ＣＳＦを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移すか、またはその中に溶解して、１．０＋／−０．２５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のｐＨを、０．５ＮのＨＣｌ水溶液の滴加によって６．０に修正する。続いて、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、１０分以内で添加し、２００μＭの濃度を得る。酸化反応をＴ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で３０＋／−５分間行う。次いで、Ｔ＝＋２２＋／−２℃で、１５分以内のＬ−システイン水溶液（１Ｍ）の添加により反応を停止し、反応混合物中で１０ｍＭの最終濃度を得て、６０＋／−５分間インキュベートする。
酸化Ｇ−ＣＳＦを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。溶出液の酸化Ｇ−ＣＳＦを含有する画分を収集し、複合化反応に使用する。
アミノオキシ−ポリシアル酸（ＰＳＡ−ＯＮＨ２）試薬を、穏やかな撹拌下で、５０倍モル過剰で、精製された酸化Ｇ−ＣＳＦを含有する溶出液に最長期間（ｔ）の１５分以内で添加する。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で添加し、１０ｍＭの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で、ｐＨ６．０で１２０＋／−１０分間インキュベートする（タンパク質濃度：１ｍｇ／ｍＬ）。
得られたＰＳＡ−Ｇ−ＣＳＦ複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。ＰＳＡ−Ｇ−ＣＳＦ複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮する。
この手順の使用によって調製された複合体を、総タンパク質、生物活性の測定、およびＰＳＡ含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定（レゾルシノールアッセイ）によって分析的に特徴付ける。
方法３：
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を、反応緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈して、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒としてｍ−トルイジン（１０ｍＭの最終濃度）およびＮａＩＯ４（最終濃度：４００μＭ）を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行う。続いて、反応物を、システイン（システイン濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行う。次いで、反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、８Ｍの酢酸アンモニウム、ｐＨ６．９）を含有する緩衝液を添加することによって調整し、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２．５Ｍの酢酸アンモニウム、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．９で事前に平衡化したフェニルセファロースＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）で充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ７．５で溶出する。最後に、ＰＳＡ−Ｇ−ＣＳＦを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法３を実行する。顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈して、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒としてｍ−トルイジン（１０ｍＭの最終濃度）およびＮａＩＯ４（最終濃度：４００μＭ）を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行う。続いて、反応物を、システイン（システイン濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行い、その複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。溶出液のＰＳＡ−Ｇ−ＣＳＦを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法４：
Ｇ−ＣＳＦを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中に溶解するか、またはそれに移して、１．０＋／−０．２５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のｐＨを、０．５ＮのＨＣｌ水溶液の滴加によって６．０に修正する。
続いて、アミノオキシ−ポリシアル酸（ＰＳＡ−ＯＮＨ２）試薬を、穏やかな撹拌下で、５０倍モル過剰で、このＧ−ＣＳＦ溶液に最長期間（ｔ）の１５分以内で添加する。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で添加し、１０ｍＭの最終濃度を得る。最後に、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を添加し、４００μＭの濃度を得る。
反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で、１２０＋／−１０分間インキュベートする。次いで、Ｌ−システイン水溶液（１Ｍ）の添加によって反応を停止し、反応混合物中で１０ｍＭの最終濃度を得て、６０＋／−５分間インキュベートする。
得られたＧ−ＣＳＦ複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。溶出液のＰＳＡ−Ｇ−ＣＳＦを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮する。
この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質、生物活性の測定、およびＰＳＡ含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定（レゾルシノールアッセイ）によって分析的に特徴付ける。
実施例２９
アミノオキシ−ＰＳＡおよび求核触媒としてｍ−トルイジンを使用するヒュミラ（Ｈｕｍｉｒａ）のポリシアル化
方法１：
出発濃度のヒュミラを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈して、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。この溶液に、ＮａＩＯ４を添加して、２００μＭの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で３０分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン（最終濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行う。
次に、溶液を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去するか、代替法において、緩衝液Ａ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．０）で平衡化された２０ｍＬの体積を有するＩＥＸカラム（Ｍｅｒｃｋ ＥＭＤ ＴＭＡＥ（Ｍ））に供する。カラムを、５ＣＶの緩衝液Ａで平衡化する。酸化ヒュミラを緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で溶出する。ヒュミラを含有する画分を収集する。タンパク質含有量を決定し（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）、反応緩衝液を使用して１ｍｇ／ｍＬに調整し、０．５ＭのＨＣｌの滴加によってｐＨ６．０に調整する。
５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒としてｍ−トルイジン（最終濃度：１０ｍＭ）を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行う。過剰のアミノオキシ試薬をＨＩＣによって除去する。反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、８Ｍの酢酸アンモニウム、ｐＨ６．９）を含有する緩衝液を添加することによって調整し、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２．５Ｍの酢酸アンモニウム、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９で事前に平衡化した８０ｍＬのフェニルセファロースＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）で充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液ｐＨ７．５で溶出する。最後に、ＰＳＡ−ヒュミラを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法１を実行する。ヒュミラを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈して、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。この溶液に、ＮａＩＯ４を添加して、２００μＭの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で３０分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン（最終濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行う。
次に、溶液を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒としてｍ−トルイジン（最終濃度：１０ｍＭ）を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行う。過剰のアミノオキシ試薬をイオン交換クロマトグラフィによって除去する。溶出液のＰＳＡ−ヒュミラを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法２：
ヒュミラを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移すか、またはその中に溶解して、１．０＋／−０．２５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のｐＨを、０．５ＮのＨＣｌ水溶液の滴加によって６．０に修正する。続いて、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、１０分以内で添加し、２００μＭの濃度を得る。酸化反応をＴ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で３０＋／−５分間行う。次いで、Ｔ＝＋２２＋／−２℃で、１５分以内のＬ−システイン水溶液（１Ｍ）の添加により反応を停止し、反応混合物中で１０ｍＭの最終濃度を得て、６０＋／−５分間インキュベートする。
酸化ヒュミラを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。溶出液の酸化ヒュミラを含有する画分を収集し、複合化反応に使用する。
アミノオキシ−ポリシアル酸（ＰＳＡ−ＯＮＨ２）試薬を、穏やかな撹拌下で、５０倍モル過剰で、精製された酸化ヒュミラを含有する溶出液に最長期間（ｔ）の１５分以内で添加する。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で添加し、１０ｍＭの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で、ｐＨ６．０で１２０＋／−１０分間インキュベートする（タンパク質濃度：１ｍｇ／ｍＬ）。
得られたＰＳＡ−ヒュミラ複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。ＰＳＡ−ヒュミラ複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮する。
この手順の使用によって調製された複合体を、総タンパク質、生物活性の測定、およびＰＳＡ含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定（レゾルシノールアッセイ）によって分析的に特徴付ける。
方法３：
ヒュミラを、反応緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈して、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒としてｍ−トルイジン（１０ｍＭの最終濃度）およびＮａＩＯ４（最終濃度：４００μＭ）を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行う。続いて、反応物を、システイン（システイン濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行う。次いで、反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、８Ｍの酢酸アンモニウム、ｐＨ６．９）を含有する緩衝液を添加することによって調整し、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２．５Ｍの酢酸アンモニウム、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．９で事前に平衡化したフェニルセファロースＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）で充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ７．５で溶出する。最後に、ＰＳＡ−ヒュミラを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法３を実行する。ヒュミラを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈して、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒としてｍ−トルイジン（１０ｍＭの最終濃度）およびＮａＩＯ４（最終濃度：４００μＭ）を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行う。続いて、反応物を、システイン（システイン濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行い、その複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。溶出液のＰＳＡ−ヒュミラを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法４：
ヒュミラを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中に溶解するか、またはそれに移して、１．０＋／−０．２５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のｐＨを、０．５ＮのＨＣｌ水溶液の滴加によって６．０に修正する。
続いて、アミノオキシ−ポリシアル酸（ＰＳＡ−ＯＮＨ２）試薬を、穏やかな撹拌下で、５０倍モル過剰で、このヒュミラ溶液に最長期間（ｔ）の１５分以内で添加する。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で添加し、１０ｍＭの最終濃度を得る。最後に、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を添加し、４００μＭの濃度を得る。
反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で、１２０＋／−１０分間インキュベートする。次いで、Ｌ−システイン水溶液（１Ｍ）の添加によって反応を停止し、反応混合物中で１０ｍＭの最終濃度を得て、６０＋／−５分間インキュベートする。
得られたヒュミラ複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。溶出液のＰＳＡ−ヒュミラを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮する。
この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質、生物活性の測定、およびＰＳＡ含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定（レゾルシノールアッセイ）によって分析的に特徴付ける。
実施例３０
アミノオキシ−ＰＳＡおよび求核触媒としてｍ−トルイジンを使用するプロリアのポリシアル化
方法１：
出発濃度のプロリアを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈して、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。この溶液に、ＮａＩＯ４を添加して、２００μＭの最終濃度を得る。暗室で、穏やかな振とう下で、室温で３０分間酸化を行う。次いで、反応物を、システイン（最終濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行う。
次に、溶液を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去するか、代替法において、緩衝液Ａ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．０）で平衡化された２０ｍＬの体積を有するＩＥＸカラム（Ｍｅｒｃｋ ＥＭＤ ＴＭＡＥ（Ｍ））に供する。カラムを、５ＣＶの緩衝液Ａで平衡化する。酸化プロリアを緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）を使用して溶出する。プロリアを含有する画分を収集する。タンパク質含有量を決定し（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）、反応緩衝液を使用して１ｍｇ／ｍＬに調整し、０．５ＭのＨＣｌの滴加によってｐＨ６．０に調整する。
５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒としてｍ−トルイジン（最終濃度：１０ｍＭ）を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行う。過剰のアミノオキシ試薬をＨＩＣによって除去する。反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、８Ｍの酢酸アンモニウム、ｐＨ６．９）を含有する緩衝液を添加することによって調整し、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２．５Ｍの酢酸アンモニウム、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．９で事前に平衡化した８０ｍＬのフェニルセファロースＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）で充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液ｐＨ７．５で溶出する。最後に、ＰＳＡ−プロリアを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法１を実行する。１０ｍｇのプロリアを、５ｍＬのヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０（２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中に溶解する。次いで、１００μＬの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（５ｍＭ）を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、４℃で１時間インキュベートし、５０μＬの１Ｍのシステイン水溶液の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物をＶｉｖａｓｐｉｎ １５Ｒ １０ｋＤの遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
酸化プロリアを含有する残余分（約７ｍＬ）を、２ｍＬのｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合し、室温で３０分間インキュベートする。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加して、５倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２．５時間インキュベートする。
遊離プロリアを、陽イオン交換クロマトグラフィ（ＣＥＣ）によって除去する。反応混合物を、２０ｍＬの緩衝液Ａ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ６．５）で希釈し、緩衝液Ａで事前に平衡化した２０ｍＬのＨｉＰｒｅｐ ＳＰＦＦ１６／１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）上に負荷する。次いで、カラムを、緩衝液Ｂ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５）で溶出する。遊離プロリアを、２５％の緩衝液Ｂを使用してカラムを洗浄することによって溶出し、その複合体を、５０％の緩衝液Ｂで溶出する。続いて、複合体を含有する画分の伝導率を、緩衝液Ｃ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．９）を使用して約１９０ｍＳ／ｃｍに引き上げ、緩衝液Ｄ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．９）で事前に平衡化した２０ｍＬのＨｉＰｒｅｐブチルＦＦ１６／１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）上に負荷する。遊離ＰＳＡ試薬を、５ＣＶの緩衝液Ｄ内で洗浄する。続いて、その複合体を、１００％の緩衝液Ｅ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ６．９）で溶出する。複合体を含有する画分を、再生成されたセルロースから作製された１０ｋＤの膜（８８ｃｍ２、カットオフ１０ｋＤ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップを、１５０ｍＭのＮａＣｌを含有するヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．９に対して行う。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。ＰＳＡ−プロリア複合体に対して、天然のプロリアと比較して５０％超の特異的活性を決定する。更に、その複合体を、以前に説明されている条件下で、Ｓｈｏｄｅｘ ＫＷ ８０３カラムを搭載したＡｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣシステムを使用するサイズ排除ＨＰＬＣによって分析的に特徴付ける（Ｋｏｌａｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ２００６；４６：１９５９−７７）。調製物が遊離プロリアを含有しないことを示す。
方法２：
プロリアを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移すか、またはその中に溶解して、１．０＋／−０．２５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のｐＨを、０．５ＮのＨＣｌ水溶液の滴加によって６．０に修正する。続いて、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、１０分以内で添加し、２００μＭの濃度を得る。酸化反応をＴ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で３０＋／−５分間行う。次いで、Ｔ＝＋２２＋／−２℃で、１５分以内のＬ−システイン水溶液（１Ｍ）の添加により反応を停止し、反応混合物中で１０ｍＭの最終濃度を得て、６０＋／−５分間インキュベートする。
酸化プロリアを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。溶出液の酸化プロリアを含有する画分を収集し、複合化反応に使用する。
アミノオキシ−ポリシアル酸（ＰＳＡ−ＯＮＨ２）試薬を、穏やかな撹拌下で、５０倍モル過剰で、精製された酸化プロリアを含有する溶出液に最長期間（ｔ）の１５分以内で添加する。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で添加し、１０ｍＭの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で、ｐＨ６．０で１２０＋／−１０分間インキュベートする（タンパク質濃度：１ｍｇ／ｍＬ）。
得られたプロリア複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。プロリア複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮する。
この手順の使用によって調製された複合体を、総タンパク質、生物活性の測定、およびＰＳＡ含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定（レゾルシノールアッセイ）によって分析的に特徴付ける。
方法３：
プロリアを、反応緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移し、希釈して、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。５０倍モル過剰の２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、続いて、求核触媒としてｍ−トルイジン（１０ｍＭの最終濃度）およびＮａＩＯ４（最終濃度：４００μＭ）を添加する。カップリング反応を、暗室で、穏やかな振とう下で、室温で２時間行う。続いて、反応物を、システイン（システイン濃度：１０ｍＭ）を使用して、室温で６０分間反応停止処理を行う。次いで、反応混合物の伝導率を、酢酸アンモニウム（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、８Ｍの酢酸アンモニウム、ｐＨ６．９）を含有する緩衝液を添加することによって調整し、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２．５Ｍの酢酸アンモニウム、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．９で事前に平衡化したフェニルセファロースＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）で充填したカラム上に負荷する。続いて、その複合体を、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ７．５で溶出する。最後に、ＰＳＡ プロリアを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって限外濾過／透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法３を実行する。１０ｍｇのプロリアを、８ｍＬのヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０（２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中に溶解する。次いで、２００μＬの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（５ｍＭ）および２ｍＬのｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を添加する。続いて、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＳＡ試薬（上述）を添加し、５倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、１００μＬの１Ｍのシステイン水溶液の添加によって室温で１５分間反応停止処理を行う。
遊離プロリアを、陽イオン交換クロマトグラフィ（ＣＥＣ）によって除去する。反応混合物を、２０ｍＬの緩衝液Ａ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ６．５）で希釈し、緩衝液Ａで事前に平衡化した２０ｍＬのＨｉＰｒｅｐ ＳＰＦＦ１６／１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）上に負荷する。次いで、カラムを、緩衝液Ｂ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５）で溶出する。遊離プロリアを、２５％の緩衝液Ｂを使用してカラムを洗浄することによって溶出し、その複合体を、５０％の緩衝液Ｂで溶出する。続いて、複合体を含有する画分の伝導率を、緩衝液Ｃ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．９）を使用して約１９０ｍＳ／ｃｍに引き上げ、緩衝液Ｄ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．９）で事前に平衡化した２０ｍＬのＨｉＰｒｅｐブチルＦＦ１６／１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）上に負荷する。遊離ＰＳＡ試薬を、５ＣＶの緩衝液Ｄ内で洗浄する。続いて、その複合体を、１００％の緩衝液Ｅ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ６．９）で溶出する。複合体を含有する画分を、再生成されたセルロースから作製された１０ｋＤの膜（８８ｃｍ２、カットオフ１０ｋＤ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップを、１５０ｍＭのＮａＣｌを含有するヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．９に対して行う。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。ＰＳＡ−プロリア複合体に対して、天然のプロリアと比較して５０％超の特異的活性を決定する。更に、その複合体を、以前に説明されている条件下で、Ｓｈｏｄｅｘ ＫＷ ８０３カラムを搭載したＡｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣシステムを使用するサイズ排除ＨＰＬＣによって分析的に特徴付ける（Ｋｏｌａｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ２００６；４６：１９５９−７７）。調製物が遊離プロリアを含有しないことを示す。
方法４：
プロリアを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中に溶解するか、またはそれに移して、１．０＋／−０．２５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のｐＨを、０．５ＮのＨＣｌ水溶液の滴加によって６．０に修正する。
続いて、アミノオキシ−ポリシアル酸（ＰＳＡ−ＯＮＨ２）試薬を、穏やかな撹拌下で、５０倍モル過剰で、このプロリア溶液に最長時間（ｔ）の１５分以内で添加する。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で添加し、１０ｍＭの最終濃度を得る。最後に、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を添加し、４００μＭの濃度を得る。
反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で、１２０＋／−１０分間インキュベートする。次いで、Ｌ−システイン水溶液（１Ｍ）の添加によって反応を停止し、反応混合物中で１０ｍＭの最終濃度を得て、６０＋／−５分間インキュベートする。
得られたプロリア複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。溶出液のＰＳＡ−プロリアを含有する画分を収集し、再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮する。
この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質、生物活性の測定、およびＰＳＡ含有量の測定によるポリシアル化の度合いの決定（レゾルシノールアッセイ）によって分析的に特徴付ける。
実施例３１
他の治療用タンパク質のポリシアル化
本明細書に説明される、ｍ−トルイジンまたはｏ−アミノ安息香酸のような代替的な求核触媒の存在下で行われるポリシアル化反応は、他の治療用タンパク質まで拡大され得る。例えば、本発明の種々の態様において、本明細書に説明されるＰＳＡアミノオキシもしくはＰＥＧアミノオキシ試薬による上述のポリシアル化またはＰＥＧ化反応が、本明細書に説明されるこれらのタンパク質等の治療用タンパク質で繰り返される。
実施例３２
アミノオキシ−ＰＥＧ試薬および求核触媒としてｍ−トルイジンを使用するＥＰＯのＰＥＧ化
方法１：
エリスロポエチン（ＥＰＯ）を、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によって、ＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。ＥＰＯを、７．０ｍＬのヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０（２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２）中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（５ｍＭ）を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、４℃で１時間インキュベートし、７．５μＬの１Ｍのシステイン水溶液の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
次に、酸化ＥＰＯを含有する残余分を、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合し、室温で３０分間インキュベートする。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬を添加し、５倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２．５時間インキュベートする。
最後に、ＰＥＧ−ＥＰＯ複合体を、イオン交換クロマトグラフィ（例えばＱセファロースＦＦ上で）によって精製する。例えば、１．５ｍｇのタンパク質／ｍＬゲルを、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．４で平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、５ｍＭのＣａＣｌ２および５００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液で溶出し、次いで、適切な分子量のカットオフ膜を使用する限外濾過／透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法１を実行する。ＥＰＯを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によって、ＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。１０ｍｇのＥＰＯを、５ｍＬのヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０（２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中に溶解する。次いで、１００μＬの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（５ｍＭ）を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、４℃で１時間インキュベートし、５０μＬの１Ｍのシステイン水溶液の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物をＶｉｖａｓｐｉｎ １５Ｒ １０ｋＤの遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
酸化ＥＰＯを含有する残余分（約７ｍＬ）を、２ｍＬのｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合し、室温で３０分間インキュベートする。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬（上述）を添加し、５倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２．５時間インキュベートする。
最後に、ＰＥＧ−ＥＰＯ複合体を、ＱセファロースＦＦ上でイオン交換クロマトグラフィによって精製する。反応混合物を、２０ｍＬの緩衝液Ａ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５）で希釈し、緩衝液Ａで事前に平衡化した２０ｍＬのＨｉＰｒｅｐ ＱＦＦ１６／１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）上に負荷する。次いで、カラムを、緩衝液Ｂ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で溶出する。遊離ＥＰＯを、２５％の緩衝液Ｂを使用してカラムを洗浄することによって溶出し、その複合体を、５０％の緩衝液Ｂで溶出する。複合体を含有する画分を、再生成されたセルロースから作製された１０ｋＤの膜（８８ｃｍ２、カットオフ１０ｋＤ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップを、１５０ｍＭのＮａＣｌを含有するヒスチジン緩衝液、ｐＨ７．２に対して行う。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。ＰＥＧ−ＥＰＯ複合体に対して、天然ＥＰＯと比較して５０％超の特異的活性を決定する。更に、その複合体を、以前に説明されている条件下で、Ｓｈｏｄｅｘ ＫＷ ８０３カラムを搭載したＡｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣシステムを使用するサイズ排除ＨＰＬＣによって分析的に特徴付ける（Ｋｏｌａｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ２００６；４６：１９５９−７７）。調製物が遊離ＥＰＯを含有しないことを示す。
方法２：
ＥＰＯを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によって、ＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。
ＥＰＯを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移すか、またはその中に溶解して、１．０＋／−０．２５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のｐＨを、０．５ＮのＨＣｌ水溶液の滴加によって６．０に修正する。続いて、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、１０分以内で添加し、２００μＭの濃度を得る。酸化反応をＴ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で３０＋／−５分間行う。次いで、Ｔ＝＋２２＋／−２℃で、１５分以内のＬ−システイン水溶液（１Ｍ）の添加により反応を停止し、反応混合物中で１０ｍＭの最終濃度を得て、６０＋／−５分間インキュベートする。
酸化ＥＰＯを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。溶出液の酸化ＥＰＯを含有する画分を収集し、複合化反応に使用する。
２０ｋＤの分子量の試薬を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬を、穏やかな撹拌下で、５０倍モル過剰で、精製された酸化ＥＰＯを含有する溶出液に最長期間（ｔ）の１５分以内で添加する。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で添加し、１０ｍＭの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で、１２０＋／−１０分間インキュベートする。
得られたＰＥＧ−ＥＰＯ複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。ＰＥＧ−ＥＰＯ複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮する。
この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法３：
ＥＰＯを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によって、ＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。ＥＰＯを、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（１０ｍＭ）およびｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、２０倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、８μＬのシステイン水溶液（１Ｍ）の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。
最後に、ＰＥＧ−ＥＰＯ複合体を、ＱセファロースＦＦ上でイオン交換クロマトグラフィによって精製する。１．５ｍｇのタンパク質／ｍＬゲルを、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．４で事前に平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、５ｍＭのＣａＣｌ２および５００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液で溶出し、次いで、膜を使用する限外濾過／透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法３を実行する。ＥＰＯを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によって、ＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。１０ｍｇのＥＰＯを、約８ｍＬのヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０（２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中に溶解する。次いで、２００μＬの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（５ｍＭ）および２ｍＬのｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を添加する。続いて、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬（上述）を添加し、５倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、１００μＬの１Ｍのシステイン水溶液の添加によって室温で１５分間反応停止処理を行う。
最後に、ＰＥＧ−ＥＰＯ複合体を、ＱセファロースＦＦ上でイオン交換クロマトグラフィによって精製する。反応混合物を、２０ｍＬの緩衝液Ａ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５）で希釈し、緩衝液Ａで事前に平衡化した２０ｍＬのＨｉＰｒｅｐ ＱＦＦ１６／１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）上に負荷する。次いで、カラムを、緩衝液Ｂ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で溶出する。遊離ＥＰＯを、２５％の緩衝液Ｂを使用してカラムを洗浄することによって溶出し、その複合体を、５０％の緩衝液Ｂで溶出する。複合体を含有する画分を、再生成されたセルロースから作製された１０ｋＤの膜（８８ｃｍ２、カットオフ１０ｋＤ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップを、１５０ｍＭのＮａＣｌを含有するヒスチジン緩衝液、ｐＨ７．２に対して行う。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。ＰＥＧ−ＥＰＯ複合体に対して、天然ＥＰＯと比較して５０％超の特異的活性を決定する。更に、その複合体を、以前に説明されている条件下で、Ｓｈｏｄｅｘ ＫＷ ８０３カラムを搭載したＡｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣシステムを使用するサイズ排除ＨＰＬＣによって分析的に特徴付ける（Ｋｏｌａｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ２００６；４６：１９５９−７７）。調製物が遊離ＥＰＯを含有しないことを示す。
方法４：
ＥＰＯを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によって、ＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。初期濃度または重量のＥＰＯを、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移すか、またはその中に溶解して、ＥＰＯの２ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。続いて、５ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を１５分以内で添加し、１００μＭの最終濃度を得、続いて、５０ｍＭのｍ−トルイジン水溶液の添加によって、３０分の期間以内に１０ｍＭの最終濃度を得る。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬（上述）を添加し、２０倍モル過剰の試薬を得る。ｐＨを６．０に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、１ＭのＬ−システイン水溶液の添加によって室温で１５分間反応停止処理を行い、１０ｍＭの最終濃度を得る。
ＰＥＧ−ＥＰＯ複合体を、イオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＣ）によって精製する。溶出液の複合体を含有する画分を、再生成されたセルロースから作製された１０ｋＤの膜（８８ｃｍ２、カットオフ１０ｋＤ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップをＨｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）に対して行う。
調製物を、公知の方法に従う総タンパク質（ＢｒａｄｆｏｒｄおよびＢＣＡ手順）ならびに生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
実施例３３
アミノオキシ−ＰＥＧ試薬および求核触媒としてｍ−トルイジンを使用するＡｎｇ−２のＰＥＧ化
方法１：
Ａｎｇ−２を、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。Ａｎｇ−２を、７．０ｍＬのヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０（２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２））中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（５ｍＭ）を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、４℃で１時間インキュベートし、７．５μＬの１Ｍのシステイン水溶液の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
次に、酸化Ａｎｇ−２を含有する残余分を、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合し、室温で３０分間インキュベートする。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬を添加し、５倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２．５時間インキュベートする。
最後に、ＰＥＧ−Ａｎｇ−２複合体を、イオン交換クロマトグラフィ（例えばＱセファロースＦＦ上で）によって精製する。例えば、１．５ｍｇのタンパク質／ｍＬゲルを、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．４で平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、５ｍＭのＣａＣｌ２および５００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液で溶出し、次いで、適切な分子量のカットオフ膜を使用する限外濾過／透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法１を実行する。Ａｎｇ−２を、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。Ａｎｇ−２を、７．０ｍＬのヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０（２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２））中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（５ｍＭ）を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、４℃で１時間インキュベートし、７．５μＬの１Ｍのシステイン水溶液の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
次に、酸化Ａｎｇ−２を含有する残余分を、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合し、室温で３０分間インキュベートする。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬を添加し、５倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２．５時間インキュベートする。
最後に、ＰＥＧ−Ａｎｇ−２複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。溶出液の複合体を含有する画分を収集し、次いで、適切な分子量カットオフの膜を使用する限外濾過／透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法２：
Ａｎｇ−２を、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。
Ａｎｇ−２を、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移すか、またはその中に溶解して、１．０＋／−０．２５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のｐＨを、０．５ＮのＨＣｌ水溶液の滴加によって６．０に修正する。続いて、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、１０分以内で添加し、２００μＭの濃度を得る。酸化反応をＴ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で３０＋／−５分間行う。次いで、Ｔ＝＋２２＋／−２℃で、１５分以内のＬ−システイン水溶液（１Ｍ）の添加により反応を停止し、反応混合物中で１０ｍＭの最終濃度を得て、６０＋／−５分間インキュベートする。
酸化Ａｎｇ−２を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。溶出液の酸化Ａｎｇ−２を含有する画分を収集し、複合化反応に使用する。
２０ｋＤの分子量の試薬を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬を、穏やかな撹拌下で、５０倍モル過剰で、精製された酸化Ａｎｇ−２を含有する溶出液に最長期間（ｔ）の１５分以内で添加する。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で添加し、１０ｍＭの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で、１２０＋／−１０分間インキュベートする。
得られたＰＥＧ−Ａｎｇ−２複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。ＰＥＧ−Ａｎｇ−２複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮する。
この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法３：
Ａｎｇ−２を、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。Ａｎｇ−２を、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（１０ｍＭ）およびｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、２０倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、８μＬのシステイン水溶液（１Ｍ）の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。
最後に、ＰＥＧ−Ａｎｇ−２複合体を、ＱセファロースＦＦ上でイオン交換クロマトグラフィによって精製する。１．５ｍｇのタンパク質／ｍＬゲルを、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．４で事前に平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、５ｍＭのＣａＣｌ２および５００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液で溶出し、次いで、膜を使用する限外濾過／透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法３を実行する。Ａｎｇ−２を、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。Ａｎｇ−２を、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（１０ｍＭ）およびｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、２０倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、８μＬのシステイン水溶液（１Ｍ）の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。
最後に、ＰＥＧ−Ａｎｇ−２複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。溶出液の複合体を含有する画分を収集し、次いで、限外濾過／透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法４：
Ａｎｇ−２を、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。初期濃度または重量のＡｎｇ−２を、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移すか、またはその中に溶解して、Ａｎｇ−２の２ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。続いて、５ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を１５分以内で添加し、１００μＭの最終濃度を得、続いて、５０ｍＭのｍ−トルイジン水溶液の添加によって、３０分の期間以内に１０ｍＭの最終濃度を得る。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬（上述）を添加し、２０倍モル過剰の試薬を得る。ｐＨを６．０に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、１ＭのＬ−システイン水溶液の添加によって室温で１５分間反応停止処理を行い、１０ｍＭの最終濃度を得る。
ＰＥＧ−Ａｎｇ−２複合体を、イオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＣ）によって精製する。溶出液の複合体を含有する画分を、再生成されたセルロースから作製された１０ｋＤの膜（８８ｃｍ２、カットオフ１０ｋＤ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップをＨｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）に対して行う。
調製物を、公知の方法に従う総タンパク質（ＢｒａｄｆｏｒｄおよびＢＣＡ手順）ならびに生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
続いて、遊離Ａｎｇ−２を、イオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＣ）によって除去する。溶出液の複合体を含有する画分を、限外濾過／透析濾過によって濃縮する。
実施例３４
アミノオキシ−ＰＥＧ試薬および求核触媒としてｍ−トルイジンを使用するＶＥＧＦのＰＥＧ化
方法１：
ＶＥＧＦを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。ＶＥＧＦを、７．０ｍＬのヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０（２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２）中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（５ｍＭ）を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、４℃で１時間インキュベートし、７．５μＬの１Ｍのシステイン水溶液の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
次に、酸化ＶＥＧＦを含有する残余分を、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合し、室温で３０分間インキュベートする。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬を添加し、５倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２．５時間インキュベートする。
最後に、ＰＥＧ−ＶＥＧＦ複合体を、イオン交換クロマトグラフィ（例えばＱセファロースＦＦ上で）によって精製する。例えば、１．５ｍｇのタンパク質／ｍＬゲルを、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．４で平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、５ｍＭのＣａＣｌ２および５００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液で溶出し、次いで、適切な分子量のカットオフ膜を使用する限外濾過／透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法１を実行する。ＶＥＧＦを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。ＶＥＧＦを、７．０ｍＬのヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０（２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２）中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（５ｍＭ）を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、４℃で１時間インキュベートし、７．５μＬの１Ｍのシステイン水溶液の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
次に、酸化ＶＥＧＦを含有する残余分を、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合し、室温で３０分間インキュベートする。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬を添加し、５倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２．５時間インキュベートする。
最後に、ＰＥＧ−ＶＥＧＦ複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。溶出液の複合体を含有する画分を収集し、次いで、適切な分子量のカットオフ膜を使用する限外濾過／透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法２：
ＶＥＧＦを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。ＶＥＧＦを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移すか、またはその中に溶解して、１．０＋／−０．２５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のｐＨを、０．５ＮのＨＣｌ水溶液の滴加によって６．０に修正する。続いて、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、１０分以内で添加し、２００μＭの濃度を得る。酸化反応をＴ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で３０＋／−５分間行う。次いで、Ｔ＝＋２２＋／−２℃で、１５分以内のＬ−システイン水溶液（１Ｍ）の添加により反応を停止し、反応混合物中で１０ｍＭの最終濃度を得て、６０＋／−５分間インキュベートする。
酸化ＶＥＧＦを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。溶出液の酸化ＶＥＧＦを含有する画分を収集し、複合化反応に使用する。
２０ｋＤの分子量の試薬を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬を、穏やかな撹拌下で、５０倍モル過剰で、精製された酸化ＶＥＧＦを含有する溶出液に最長期間（ｔ）の１５分以内で添加する。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で添加し、１０ｍＭの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で、１２０＋／−１０分間インキュベートする。
得られたＰＥＧ−ＶＥＧＦ複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。ＰＥＧ−ＶＥＧＦ複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮する。
この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法３：
ＶＥＧＦを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。ＶＥＧＦを、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（１０ｍＭ）およびｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、２０倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、８μＬのシステイン水溶液（１Ｍ）の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。
最後に、ＰＥＧ−ＶＥＧＦ複合体を、ＱセファロースＦＦ上でイオン交換クロマトグラフィによって精製する。１．５ｍｇのタンパク質／ｍＬゲルを、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．４で事前に平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、５ｍＭのＣａＣｌ２および５００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液で溶出し、次いで、膜を使用する限外濾過／透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法３を実行する。ＶＥＧＦを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。ＶＥＧＦを、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（１０ｍＭ）およびｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、２０倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、８μＬのシステイン水溶液（１Ｍ）の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。
最後に、ＰＥＧ−ＶＥＧＦ複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。溶出液の複合体複合体の画分を収集し、次いで、限外濾過／透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法４：
ＶＥＧＦを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。初期濃度または重量のＶＥＧＦを、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移すか、またはその中に溶解して、ＶＥＧＦの２ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。続いて、５ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を１５分以内で添加し、１００μＭの最終濃度を得、続いて、５０ｍＭのｍ−トルイジン水溶液の添加によって、３０分の期間以内に１０ｍＭの最終濃度を得る。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬（上述）を添加し、２０倍モル過剰の試薬を得る。ｐＨを６．０に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、１ＭのＬ−システイン水溶液の添加によって室温で１５分間反応停止処理を行い、１０ｍＭの最終濃度を得る。
ＰＥＧ−ＶＥＧＦ複合体を、イオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＣ）によって精製する。溶出液の複合体を含有する画分を、再生成されたセルロースから作製された１０ｋＤの膜（８８ｃｍ２、カットオフ１０ｋＤ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップをＨｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）に対して行う。
調製物を、公知の方法に従う総タンパク質（ＢｒａｄｆｏｒｄおよびＢＣＡ手順）ならびに生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
実施例３５
アミノオキシ−ＰＥＧ試薬および求核触媒としてｍ−トルイジンを使用するＥＧＦのＰＥＧ化
方法１：
ＥＧＦを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。ＥＧＦを、７．０ｍＬのヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０（２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２）中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（５ｍＭ）を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、４℃で１時間インキュベートし、７．５μＬの１Ｍのシステイン水溶液の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
次に、酸化ＥＧＦを含有する残余分を、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合し、室温で３０分間インキュベートする。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬を添加し、５倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２．５時間インキュベートする。
最後に、ＰＥＧ−ＥＧＦ複合体を、イオン交換クロマトグラフィ（例えばＱセファロースＦＦ上で）によって精製する。例えば、１．５ｍｇのタンパク質／ｍＬゲルを、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．４で平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、５ｍＭのＣａＣｌ２および５００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液で溶出し、次いで、適切な分子量のカットオフ膜を使用する限外濾過／透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法１を実行する。ＥＧＦを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。ＥＧＦを、７．０ｍＬのヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０（２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２）中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（５ｍＭ）を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、４℃で１時間インキュベートし、７．５μＬの１Ｍのシステイン水溶液の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
次に、酸化ＥＧＦを含有する残余分を、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合し、室温で３０分間インキュベートする。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬を添加し、５倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２．５時間インキュベートする。
最後に、ＰＥＧ−ＥＧＦ複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。溶出液の複合体を含有する画分を収集し、次いで、適切な分子量カットオフの膜を使用する限外濾過／透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法２：
ＥＧＦを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。ＥＧＦを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移すか、またはその中に溶解して、１．０＋／−０．２５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のｐＨを、０．５ＮのＨＣｌ水溶液の滴加によって６．０に修正する。続いて、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、１０分以内で添加し、２００μＭの濃度を得る。酸化反応をＴ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で３０＋／−５分間行う。次いで、Ｔ＝＋２２＋／−２℃で、１５分以内のＬ−システイン水溶液（１Ｍ）の添加により反応を停止し、反応混合物中で１０ｍＭの最終濃度を得て、６０＋／−５分間インキュベートする。
酸化ＥＧＦを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。溶出液の酸化ＥＧＦを含有する画分を収集し、複合化反応に使用する。
２０ｋＤの分子量の試薬を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬を、穏やかな撹拌下で、５０倍モル過剰で、精製された酸化ＮＧＦを含有する溶出液に最長期間（ｔ）の１５分以内で添加する。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で添加し、１０ｍＭの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で、１２０＋／−１０分間インキュベートする。
得られたＰＥＧ−ＥＧＦ複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。ＰＥＧ−ＥＧＦ複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮する。
この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法３：
ＥＧＦを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。ＥＧＦを、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（１０ｍＭ）およびｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、２０倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、８μＬのシステイン水溶液（１Ｍ）の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。
最後に、ＰＥＧ−ＥＧＦ複合体を、ＱセファロースＦＦ上でイオン交換クロマトグラフィによって精製する。１．５ｍｇのタンパク質／ｍＬゲルを、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．４で事前に平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、５ｍＭのＣａＣｌ２および５００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液で溶出し、次いで、膜を使用する限外濾過／透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法３を実行する。ＥＧＦを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。ＥＧＦを、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（１０ｍＭ）およびｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、２０倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、８μＬのシステイン水溶液（１Ｍ）の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。
最後に、ＰＥＧ−ＥＧＦ複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。溶出液の複合体を含有する画分を収集し、次いで、限外濾過／透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法４：
ＥＧＦを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。初期濃度または重量のＥＧＦを、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移すか、またはその中に溶解して、ＥＧＦの２ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。続いて、５ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を１５分以内で添加し、１００μＭの最終濃度を得、続いて、５０ｍＭのｍ−トルイジン水溶液の添加によって、３０分の期間以内に１０ｍＭの最終濃度を得る。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬（上述）を添加し、２０倍モル過剰の試薬を得る。ｐＨを６．０に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、１ＭのＬ−システイン水溶液の添加によって室温で１５分間反応停止処理を行い、１０ｍＭの最終濃度を得る。
ＰＥＧ−ＥＧＦ複合体を、イオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＣ）によって精製する。溶出液の複合体を含有する画分を、再生成されたセルロースから作製された１０ｋＤの膜（８８ｃｍ２、カットオフ１０ｋＤ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップをＨｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）に対して行う。
調製物を、公知の方法に従う総タンパク質（ＢｒａｄｆｏｒｄおよびＢＣＡ手順）ならびに生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
実施例３６
アミノオキシ−ＰＥＧ試薬および求核触媒としてｍ−トルイジンを使用するＮＧＦのＰＥＧ化
方法１：
ＮＧＦを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。ＮＧＦを、７．０ｍＬのヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０（２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２）中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（５ｍＭ）を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、４℃で１時間インキュベートし、７．５μＬの１Ｍのシステイン水溶液の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
次に、酸化ＮＧＦを含有する残余分を、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合し、室温で３０分間インキュベートする。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬を添加し、５倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２．５時間インキュベートする。
最後に、ＰＥＧ−ＮＧＦ複合体を、イオン交換クロマトグラフィ（例えばＱセファロースＦＦ上で）によって精製する。例えば、１．５ｍｇのタンパク質／ｍＬゲルを、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．４で平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、５ｍＭのＣａＣｌ２および５００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液で溶出し、次いで、適切な分子量のカットオフ膜を使用する限外濾過／透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法１を実行する。ＮＧＦを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。ＮＧＦを、７．０ｍＬのヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０（２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２）中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（５ｍＭ）を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、４℃で１時間インキュベートし、７．５μＬの１Ｍのシステイン水溶液の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
次に、酸化ＮＧＦを含有する残余分を、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合し、室温で３０分間インキュベートする。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬を添加し、５倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２．５時間インキュベートする。
最後に、ＰＥＧ−ＮＧＦ複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。溶出液の複合体を含有する画分を収集し、次いで、適切な分子量のカットオフ膜を使用する限外濾過／透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法２：
ＮＧＦを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。ＮＧＦを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移すか、またはその中に溶解して、１．０＋／−０．２５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のｐＨを、０．５ＮのＨＣｌ水溶液の滴加によって６．０に修正する。続いて、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、１０分以内で添加し、２００μＭの濃度を得る。酸化反応をＴ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で３０＋／−５分間行う。次いで、Ｔ＝＋２２＋／−２℃で、１５分以内のＬ−システイン水溶液（１Ｍ）の添加により反応を停止し、反応混合物中で１０ｍＭの最終濃度を得て、６０＋／−５分間インキュベートする。
酸化ＮＧＦを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。溶出液の酸化ＮＧＦを含有する画分を収集し、複合化反応に使用する。
２０ｋＤの分子量の試薬を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬を、穏やかな撹拌下で、５０倍モル過剰で、精製された酸化ＮＧＦを含有する溶出液に最長期間（ｔ）の１５分以内で添加する。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で添加し、１０ｍＭの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で、１２０＋／−１０分間インキュベートする。
得られたＰＥＧ−ＮＧＦ複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。ＰＥＧ−ＮＧＦ複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮する。
この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法３：
ＮＧＦを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。ＮＧＦを、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（１０ｍＭ）およびｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、２０倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、８μＬのシステイン水溶液（１Ｍ）の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。
最後に、ＰＥＧ−ＮＧＦ複合体を、ＱセファロースＦＦ上でイオン交換クロマトグラフィによって精製する。１．５ｍｇのタンパク質／ｍＬゲルを、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．４で事前に平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、５ｍＭのＣａＣｌ２および５００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液で溶出し、次いで、膜を使用する限外濾過／透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法３を実行する。ＮＧＦを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。ＮＧＦを、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（１０ｍＭ）およびｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、２０倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、８μＬのシステイン水溶液（１Ｍ）の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。
最後に、ＰＥＧ−ＮＧＦ複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。複合体を含有する画分を収集し、次いで、限外濾過／透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法４：
ＮＧＦを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。初期濃度または重量のＮＧＦを、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移すか、またはその中に溶解して、ＮＧＦの２ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。続いて、５ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を１５分以内で添加し、１００μＭの最終濃度を得、続いて、５０ｍＭのｍ−トルイジン水溶液の添加によって、３０分の期間以内に１０ｍＭの最終濃度を得る。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬（上述）を添加し、２０倍モル過剰の試薬を得る。ｐＨを６．０に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、１ＭのＬ−システイン水溶液の添加によって室温で１５分間反応停止処理を行い、１０ｍＭの最終濃度を得る。
ＰＥＧ−ＮＧＦ複合体を、イオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＣ）によって精製する。溶出液の複合体を含有する画分を、再生成されたセルロースから作製された１０ｋＤの膜（８８ｃｍ２、カットオフ１０ｋＤ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップをＨｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）に対して行う。
調製物を、公知の方法に従う総タンパク質（ＢｒａｄｆｏｒｄおよびＢＣＡ手順）ならびに生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
実施例３７
アミノオキシ−ＰＥＧ試薬および求核触媒としてｍ−トルイジンを使用するＨＧＨのＰＥＧ化
方法１：
本明細書に説明されるように、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）のアミノ酸配列は、まず、少なくとも１つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、ＨＧＨは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。
ＨＧＨを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。ＨＧＨを、７．０ｍＬのヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０（２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２）中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（５ｍＭ）を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、４℃で１時間インキュベートし、７．５μＬの１Ｍのシステイン水溶液の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
次に、酸化ＨＧＨを含有する残余分を、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合し、室温で３０分間インキュベートする。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬を添加し、５倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２．５時間インキュベートする。
最後に、ＰＥＧ−ＨＧＨ複合体を、イオン交換クロマトグラフィ（例えばＱセファロースＦＦ上で）によって精製する。例えば、１．５ｍｇのタンパク質／ｍＬゲルを、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．４で平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、５ｍＭのＣａＣｌ２および５００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液で溶出し、次いで、適切な分子量のカットオフ膜を使用する限外濾過／透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法１を実行する。本明細書に説明されるように、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）のアミノ酸配列は、まず、少なくとも１つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、ＨＧＨは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。
ＨＧＨを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。ＨＧＨを、７．０ｍＬのヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０（２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２）中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（５ｍＭ）を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、４℃で１時間インキュベートし、７．５μＬの１Ｍのシステイン水溶液の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
次に、酸化ＨＧＨを含有する残余分を、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合し、室温で３０分間インキュベートする。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬を添加し、５倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２．５時間インキュベートする。
最後に、ＰＥＧ−ＨＧＨ複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。溶出液の複合体を含有する画分を収集し、次いで、適切な分子量のカットオフ膜を使用する限外濾過／透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法２：
本明細書に説明されるように、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）のアミノ酸配列は、まず、少なくとも１つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、ＨＧＨは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。
ＨＧＨを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。ＨＧＨを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移すか、またはその中に溶解して、１．０＋／−０．２５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のｐＨを、０．５ＮのＨＣｌ水溶液の滴加によって６．０に修正する。続いて、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、１０分以内で添加し、２００μＭの濃度を得る。酸化反応をＴ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で３０＋／−５分間行う。次いで、Ｔ＝＋２２＋／−２℃で、１５分以内のＬ−システイン水溶液（１Ｍ）の添加により反応を停止し、反応混合物中で１０ｍＭの最終濃度を得て、６０＋／−５分間インキュベートする。
酸化ＨＧＨを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。溶出液の酸化ＨＧＨを含有する画分を収集し、複合化反応に使用する。
２０ｋＤの分子量の試薬を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬を、穏やかな撹拌下で、５０倍モル過剰で、精製された酸化ＨＧＨを含有する溶出液に最長期間（ｔ）の１５分以内で添加する。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で添加し、１０ｍＭの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で、１２０＋／−１０分間インキュベートする。
得られたＰＥＧ−ＨＧＨ複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。ＰＥＧ−ＮＧＦ複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮する。
この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法３：
本明細書に説明されるように、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）のアミノ酸配列は、まず、少なくとも１つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、ＨＧＨは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。
ＨＧＨを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。ＨＧＨを、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（１０ｍＭ）およびｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、２０倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、８μＬのシステイン水溶液（１Ｍ）の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。
最後に、ＰＥＧ−ＨＧＨ複合体を、ＱセファロースＦＦ上でイオン交換クロマトグラフィによって精製する。１．５ｍｇのタンパク質／ｍＬゲルを、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．４で事前に平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、５ｍＭのＣａＣｌ２および５００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液で溶出し、次いで、膜を使用する限外濾過／透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法３を実行する。本明細書に説明されるように、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）のアミノ酸配列は、まず、少なくとも１つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、ＨＧＨは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。ＨＧＨを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。ＨＧＨを、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（１０ｍＭ）およびｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、２０倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、８μＬのシステイン水溶液（１Ｍ）の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。
最後に、ＰＥＧ−ＨＧＨ複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。複合体を含有する画分を収集し、次いで、限外濾過／透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法４：
本明細書に説明されるように、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）のアミノ酸配列は、まず、少なくとも１つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、ＨＧＨは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。
ＨＧＨを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。初期濃度または重量のＨＧＨを、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移すか、またはその中に溶解して、ＨＧＨの２ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。続いて、５ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を１５分以内で添加し、１００μＭの最終濃度を得、続いて、５０ｍＭのｍ−トルイジン水溶液の添加によって、３０分の期間以内に１０ｍＭの最終濃度を得る。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬（上述）を添加し、２０倍モル過剰の試薬を得る。ｐＨを６．０に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、１ＭのＬ−システイン水溶液の添加によって室温で１５分間反応停止処理を行い、１０ｍＭの最終濃度を得る。
ＰＥＧ−ＨＧＨ複合体を、イオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＣ）によって精製する。溶出液の複合体を含有する画分を、再生成されたセルロースから作製された１０ｋＤの膜（８８ｃｍ２、カットオフ１０ｋＤ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップをＨｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）に対して行う。
調製物を、公知の方法に従う総タンパク質（ＢｒａｄｆｏｒｄおよびＢＣＡ手順）ならびに生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
実施例３８
アミノオキシ−ＰＥＧ試薬および求核触媒としてｍ−トルイジンを使用するＴＮＦ−αのＰＥＧ化
方法１：
ＴＮＦ−αを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。ＴＮＦ−αを、７．０ｍＬのヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０（２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２）中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（５ｍＭ）を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、４℃で１時間インキュベートし、７．５μＬの１Ｍのシステイン水溶液の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
次に、酸化ＴＮＦ−αを含有する残余分を、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合し、室温で３０分間インキュベートする。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬を添加し、５倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２．５時間インキュベートする。
最後に、ＰＥＧ−ＴＮＦ−α複合体を、イオン交換クロマトグラフィ（例えばＱセファロースＦＦ上で）によって精製する。例えば、１．５ｍｇのタンパク質／ｍＬゲルを、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．４で平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、５ｍＭのＣａＣｌ２および５００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液で溶出し、次いで、適切な分子量のカットオフ膜を使用する限外濾過／透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法１を実行する。ＴＮＦ−αを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。ＴＮＦ−αを、７．０ｍＬのヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０（２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２）中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（５ｍＭ）を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、４℃で１時間インキュベートし、７．５μＬの１Ｍのシステイン水溶液の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
次に、酸化ＴＮＦ−αを含有する残余分を、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合し、室温で３０分間インキュベートする。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬を添加し、５倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２．５時間インキュベートする。
最後に、ＰＥＧ−ＴＮＦ−α複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。溶出液の複合体を含有する画分を収集し、次いで、適切な分子量カットオフの膜を使用する限外濾過／透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法２：
ＴＮＦ−αを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。ＴＮＦ−αを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移すか、またはその中に溶解して、１．０＋／−０．２５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のｐＨを、０．５ＮのＨＣｌ水溶液の滴加によって６．０に修正する。続いて、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、１０分以内で添加し、２００μＭの濃度を得る。酸化反応をＴ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で３０＋／−５分間行う。次いで、Ｔ＝＋２２＋／−２℃で、１５分以内のＬ−システイン水溶液（１Ｍ）の添加により反応を停止し、反応混合物中で１０ｍＭの最終濃度を得て、６０＋／−５分間インキュベートする。
酸化ＴＮＦ−αを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。溶出液の酸化ＴＮＦ−αを含有する画分を収集し、複合化反応に使用する。
２０ｋＤの分子量の試薬を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬を、穏やかな撹拌下で、５０倍モル過剰で、精製された酸化ＴＮＦ−αを含有する溶出液に最長期間（ｔ）の１５分以内で添加する。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で添加し、１０ｍＭの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で、１２０＋／−１０分間インキュベートする。
得られたＰＥＧ−ＴＮＦ−α複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。ＰＥＧ−ＴＮＦ−α複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮する。
この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法３：
ＴＮＦ−αを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。ＴＮＦ−αを、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（１０ｍＭ）およびｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、２０倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、８μＬのシステイン水溶液（１Ｍ）の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。
最後に、ＰＥＧ−ＴＮＦ−α複合体を、ＱセファロースＦＦ上でイオン交換クロマトグラフィによって精製する。１．５ｍｇのタンパク質／ｍＬゲルを、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．４で事前に平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、５ｍＭのＣａＣｌ２および５００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液で溶出し、次いで、膜を使用する限外濾過／透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法３を実行する。ＴＮＦ−αを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。ＴＮＦ−αを、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（１０ｍＭ）およびｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、２０倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、８μＬのシステイン水溶液（１Ｍ）の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。
最後に、ＰＥＧ−ＴＮＦ−α複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。複合体を含有する画分を収集し、次いで、限外濾過／透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法４：
ＴＮＦ−αを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。初期濃度または重量のＴＮＦ−αを、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移すか、またはその中に溶解して、ＴＮＦ−αの２ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。続いて、５ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を１５分以内で添加し、１００μＭの最終濃度を得、続いて、５０ｍＭのｍ−トルイジン水溶液の添加によって、３０分の期間以内に１０ｍＭの最終濃度を得る。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬（上述）を添加し、２０倍モル過剰の試薬を得る。ｐＨを６．０に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、１ＭのＬ−システイン水溶液の添加によって室温で１５分間反応停止処理を行い、１０ｍＭの最終濃度を得る。
ＰＥＧ−ＴＮＦ−α複合体を、イオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＣ）によって精製する。溶出液の複合体を含有する画分を、再生成されたセルロースから作製された１０ｋＤの膜（８８ｃｍ２、カットオフ１０ｋＤ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップをＨｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）に対して行う。
調製物を、公知の方法に従う総タンパク質（ＢｒａｄｆｏｒｄおよびＢＣＡ手順）ならびに生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
実施例３９
アミノオキシ−ＰＥＧ試薬および求核触媒としてｍ−トルイジンを使用するインスリンのＰＥＧ化
方法１：
本明細書に説明されるように、インスリンのアミノ酸配列は、まず、少なくとも１つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、インスリンは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。インスリンを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。インスリンを、７．０ｍＬのヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０（２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２）中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（５ｍＭ）を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、４℃で１時間インキュベートし、７．５μＬの１Ｍのシステイン水溶液の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
次に、酸化インスリンを含有する残余分を、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合し、室温で３０分間インキュベートする。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬を添加し、５倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２．５時間インキュベートする。
最後に、ＰＥＧ−インスリン複合体を、イオン交換クロマトグラフィ（例えばＱセファロースＦＦ上で）によって精製する。例えば、１．５ｍｇのタンパク質／ｍＬゲルを、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．４で平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、５ｍＭのＣａＣｌ２および５００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液で溶出し、次いで、適切な分子量のカットオフ膜を使用する限外濾過／透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法１を実行する。本明細書に説明されるように、インスリンのアミノ酸配列は、まず、少なくとも１つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、インスリンは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。インスリンを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。インスリンを、７．０ｍＬのヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０（２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２）中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（５ｍＭ）を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、４℃で１時間インキュベートし、７．５μＬの１Ｍのシステイン水溶液の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
次に、酸化インスリンを含有する残余分を、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合し、室温で３０分間インキュベートする。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬を添加し、５倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２．５時間インキュベートする。
最後に、ＰＥＧ−インスリン複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。溶出液の複合体を含有する画分を収集し、次いで、適切な分子量カットオフの膜を使用する限外濾過／透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法２：
本明細書に説明されるように、インスリンのアミノ酸配列は、まず、少なくとも１つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、インスリンは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。
インスリンを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。インスリンを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移すか、またはその中に溶解して、１．０＋／−０．２５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のｐＨを、０．５ＮのＨＣｌ水溶液の滴加によって６．０に修正する。続いて、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、１０分以内で添加し、２００μＭの濃度を得る。酸化反応をＴ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で３０＋／−５分間行う。次いで、Ｔ＝＋２２＋／−２℃で、１５分以内のＬ−システイン水溶液（１Ｍ）の添加により反応を停止し、反応混合物中で１０ｍＭの最終濃度を得て、６０＋／−５分間インキュベートする。
酸化インスリンを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。溶出液の酸化インスリンを含有する画分を収集し、複合化反応に使用する。
２０ｋＤの分子量の試薬を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬を、穏やかな撹拌下で、５０倍モル過剰で、精製された酸化インスリンを含有する溶出液に最長期間（ｔ）の１５分以内で添加する。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で添加し、１０ｍＭの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で、１２０＋／−１０分間インキュベートする。
得られたＰＥＧ−インスリン複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。ＰＥＧ−インスリン複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮する。
この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法３：
本明細書に説明されるように、インスリンのアミノ酸配列は、まず、少なくとも１つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、インスリンは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。
インスリンを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。インスリンを、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（１０ｍＭ）およびｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、２０倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、８μＬのシステイン水溶液（１Ｍ）の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。
最後に、ＰＥＧ−インスリン複合体を、ＱセファロースＦＦ上でイオン交換クロマトグラフィによって精製する。１．５ｍｇのタンパク質／ｍＬゲルを、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．４で事前に平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、５ｍＭのＣａＣｌ２および５００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液で溶出し、次いで、膜を使用する限外濾過／透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法３を実行する。本明細書に説明されるように、インスリンのアミノ酸配列は、まず、少なくとも１つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、インスリンは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。インスリンを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。インスリンを、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（１０ｍＭ）およびｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、２０倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、８μＬのシステイン水溶液（１Ｍ）の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。
最後に、インスリン複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。複合体を含有する画分を収集し、次いで、限外濾過／透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法４：
本明細書に説明されるように、インスリンのアミノ酸配列は、まず、少なくとも１つのグリコシル化部位を組み込むように修飾される。精製後、インスリンは、当該技術分野で公知の方法に従ってインビトロでグリコシル化される。
インスリンを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。初期濃度または重量のインスリンを、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移すか、またはその中に溶解して、インスリンの２ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。続いて、５ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を１５分以内で添加し、１００μＭの最終濃度を得、続いて、５０ｍＭのｍ−トルイジン水溶液の添加によって、３０分の期間以内に１０ｍＭの最終濃度を得る。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬（上述）を添加し、２０倍モル過剰の試薬を得る。ｐＨを６．０に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、１ＭのＬ−システイン水溶液の添加によって室温で１５分間反応停止処理を行い、１０ｍＭの最終濃度を得る。
ＰＥＧ−インスリン複合体を、イオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＣ）によって精製する。溶出液の複合体を含有する画分を、再生成されたセルロースから作製された１０ｋＤの膜（８８ｃｍ２、カットオフ１０ｋＤ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップをＨｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）に対して行う。
調製物を、公知の方法に従う総タンパク質（ＢｒａｄｆｏｒｄおよびＢＣＡ手順）ならびに生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
実施例４０
アミノオキシ−ＰＥＧ試薬および求核触媒としてｍ−トルイジンを使用するインターフェロンαのＰＥＧ化
方法１：
インターフェロンαを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。インターフェロンαを、７．０ｍＬのヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０（２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２）中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（５ｍＭ）を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、４℃で１時間インキュベートし、７．５μＬの１Ｍのシステイン水溶液の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
次に、酸化インターフェロンαを含有する残余分を、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合し、室温で３０分間インキュベートする。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬を添加し、５倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２．５時間インキュベートする。
最後に、ＰＥＧ−インターフェロンα複合体を、イオン交換クロマトグラフィ（例えばＱセファロースＦＦ上で）によって精製する。例えば、１．５ｍｇのタンパク質／ｍＬゲルを、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．４で平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、５ｍＭのＣａＣｌ２および５００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液で溶出し、次いで、適切な分子量のカットオフ膜を使用する限外濾過／透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法１を実行する。インターフェロンαを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。インターフェロンαを、７．０ｍＬのヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０（２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２）中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（５ｍＭ）を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、４℃で１時間インキュベートし、７．５μＬの１Ｍのシステイン水溶液の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
次に、酸化インターフェロンαを含有する残余分を、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合し、室温で３０分間インキュベートする。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬を添加し、５倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２．５時間インキュベートする。
最後に、ＰＥＧ−インターフェロンα複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。複合体を含有する画分を収集し、次いで、適切な分子量のカットオフ膜を使用する限外濾過／透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法２：
インターフェロンαを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。インターフェロンαを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移すか、またはその中に溶解して、１．０＋／−０．２５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のｐＨを、０．５ＮのＨＣｌ水溶液の滴加によって６．０に修正する。続いて、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、１０分以内で添加し、２００μＭの濃度を得る。酸化反応をＴ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で３０＋／−５分間行う。次いで、Ｔ＝＋２２＋／−２℃で、１５分以内のＬ−システイン水溶液（１Ｍ）の添加により反応を停止し、反応混合物中で１０ｍＭの最終濃度を得て、６０＋／−５分間インキュベートする。
酸化インターフェロンαを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。溶出液の酸化インターフェロンαを含有する画分を収集し、複合化反応に使用する。
２０ｋＤの分子量の試薬を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬を、穏やかな撹拌下で、５０倍モル過剰で、精製された酸化インターフェロンαを含有する溶出液に最長期間（ｔ）の１５分以内で添加する。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で添加し、１０ｍＭの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で、１２０＋／−１０分間インキュベートする。
得られたＰＥＧ−インターフェロンα複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。ＰＥＧ−インターフェロンα複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮する。
この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法３：
インターフェロンαを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。インターフェロンαを、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（１０ｍＭ）およびｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、２０倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、８μＬのシステイン水溶液（１Ｍ）の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。
最後に、ＰＥＧ−インターフェロンα複合体を、ＱセファロースＦＦ上でイオン交換クロマトグラフィによって精製する。１．５ｍｇのタンパク質／ｍＬゲルを、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．４で事前に平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、５ｍＭのＣａＣｌ２および５００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液で溶出し、次いで、膜を使用する限外濾過／透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法３を実行する。インターフェロンαを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。インターフェロンαを、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（１０ｍＭ）およびｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、２０倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、８μＬのシステイン水溶液（１Ｍ）の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。
最後に、ＰＥＧ−インターフェロンα複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。複合体を含有する画分を収集し、次いで、膜を使用する限外濾過／透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法４：
インターフェロンαを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。初期濃度または重量のインターフェロンαを、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移すか、またはその中に溶解して、インターフェロンαの２ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。続いて、５ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を１５分以内で添加し、１００μＭの最終濃度を得、続いて、５０ｍＭのｍ−トルイジン水溶液の添加によって、３０分の期間以内に１０ｍＭの最終濃度を得る。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬（上述）を添加し、２０倍モル過剰の試薬を得る。ｐＨを６．０に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、１ＭのＬ−システイン水溶液の添加によって室温で１５分間反応停止処理を行い、１０ｍＭの最終濃度を得る。
ＰＥＧ−インターフェロンα複合体を、イオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＣ）によって精製する。溶出液の複合体を含有する画分を、再生成されたセルロースから作製された１０ｋＤの膜（８８ｃｍ２、カットオフ１０ｋＤ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップをＨｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）に対して行う。
調製物を、公知の方法に従う総タンパク質（ＢｒａｄｆｏｒｄおよびＢＣＡ手順）ならびに生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
実施例４１
アミノオキシ−ＰＥＧ試薬および求核触媒としてｍ−トルイジンを使用するインターフェロンγのＰＥＧ化
方法１：
インターフェロンγを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。１０ｍｇのインターフェロンγを、５ｍＬのヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０（２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中に溶解する。次いで、１００μＬの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（５ｍＭ）を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、４℃で１時間インキュベートし、５０μＬの１Ｍのシステイン水溶液の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物をＶｉｖａｓｐｉｎ １５Ｒ １０ｋＤの遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
酸化インターフェロンγを含有する残余分（約７ｍＬ）を、２ｍＬのｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合し、室温で３０分間インキュベートする。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬（上述）を添加し、５倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２．５時間インキュベートする。
最後に、ＰＥＧ−インターフェロンγ複合体を、ＳＰセファロースＦＦ上でイオン交換クロマトグラフィによって精製する。反応混合物を、２０ｍＬの緩衝液Ａ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ６．５）で希釈し、緩衝液Ａで事前に平衡化した２０ｍＬのＨｉＰｒｅｐ
ＳＰＦＦ１６／１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）上に負荷する。次いで、カラムを、緩衝液Ｂ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５）で溶出する。遊離インターフェロンγを、２５％の緩衝液Ｂを使用してカラムを洗浄することによって溶出し、その複合体を、５０％の緩衝液Ｂで溶出する。複合体を含有する画分を、再生成されたセルロースから作製された１０ｋＤの膜（８８ｃｍ２、カットオフ１０ｋＤ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップを、１５０ｍＭのＮａＣｌを含有するヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．９に対して行う。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。ＰＥＧ−インターフェロンγ複合体に対して、天然のインターフェロンγと比較して５０％超の特異的活性を決定する。更に、その複合体を、以前に説明されている条件下で、Ｓｈｏｄｅｘ ＫＷ
８０３カラムを搭載したＡｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣシステムを使用するサイズ排除ＨＰＬＣによって分析的に特徴付ける（Ｋｏｌａｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ２００６；４６：１９５９−７７）。調製物が遊離インターフェロンγを含有しないことを示す。
方法２：
インターフェロンγを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。インターフェロンγを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移すか、またはその中に溶解して、１．０＋／−０．２５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のｐＨを、０．５ＮのＨＣｌ水溶液の滴加によって６．０に修正する。続いて、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、１０分以内で添加し、２００μＭの濃度を得る。酸化反応をＴ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で３０＋／−５分間行う。次いで、Ｔ＝＋２２＋／−２℃で、１５分以内のＬ−システイン水溶液（１Ｍ）の添加により反応を停止し、反応混合物中で１０ｍＭの最終濃度を得て、６０＋／−５分間インキュベートする。
酸化インターフェロンγを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。溶出液の酸化インターフェロンγを含有する画分を収集し、複合化反応に使用する。
２０ｋＤの分子量の試薬を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬を、穏やかな撹拌下で、５０倍モル過剰で、精製された酸化インターフェロンγを含有する溶出液に最長期間（ｔ）の１５分以内で添加する。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で添加し、１０ｍＭの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で、１２０＋／−１０分間インキュベートする。
得られたＰＥＧ−インターフェロンγ複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。ＰＥＧ−インターフェロンγ複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮する。
この手順の使用によって調製された複合体を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法３：
インターフェロンγを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。１０ｍｇのインターフェロンγを、約８ｍＬのヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０（２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中に溶解する。次いで、２００μＬの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（５ｍＭ）および２ｍＬのｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を添加する。続いて、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬（上述）を添加し、５倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、１００μＬの１Ｍのシステイン水溶液の添加によって室温で１５分間反応停止処理を行う。
最後に、ＰＥＧ−インターフェロンγ複合体を、ＳＰセファロースＦＦ上でイオン交換クロマトグラフィによって精製する。反応混合物を、２０ｍＬの緩衝液Ａ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ６．５）で希釈し、緩衝液Ａで事前に平衡化した２０ｍＬのＨｉＰｒｅｐ
ＳＰ ＦＦ１６／１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）上に負荷する。次いで、カラムを、緩衝液Ｂ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５）で溶出する。遊離インターフェロンγを、２５％の緩衝液Ｂを使用してカラムを洗浄することによって溶出し、その複合体を、５０％の緩衝液Ｂで溶出する。複合体を含有する画分を、再生成されたセルロースから作製された１０ｋＤの膜（８８ｃｍ２、カットオフ１０ｋＤ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップを、１５０ｍＭのＮａＣｌを含有するヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．９に対して行う。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。ＰＥＧ−インターフェロンγ複合体に対して、天然のインターフェロンγと比較して５０％超の特異的活性を決定する。更に、その複合体を、以前に説明されている条件下で、Ｓｈｏｄｅｘ ＫＷ ８０３カラムを搭載したＡｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣシステムを使用するサイズ排除ＨＰＬＣによって分析的に特徴付ける（Ｋｏｌａｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ２００６；４６：１９５９−７７）。調製物が遊離インターフェロンγを含有しないことを示す。
方法４：
インターフェロンγを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。初期濃度または重量のインターフェロンγを、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移すか、またはその中に溶解して、インターフェロンγの２ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。続いて、５ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を１５分以内で添加し、１００μＭの最終濃度を得、続いて、５０ｍＭのｍ−トルイジン水溶液の添加によって、３０分の期間以内に１０ｍＭの最終濃度を得る。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬（上述）を添加し、２０倍モル過剰の試薬を得る。ｐＨを６．０に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、１ＭのＬ−システイン水溶液の添加によって室温で１５分間反応停止処理を行い、１０ｍＭの最終濃度を得る。
ＰＥＧ−インターフェロンγ複合体を、イオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＣ）によって精製する。溶出液の複合体を含有する画分を、再生成されたセルロースから作製された１０ｋＤの膜（８８ｃｍ２、カットオフ１０ｋＤ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップをＨｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）に対して行う。
調製物を、公知の方法に従う総タンパク質（ＢｒａｄｆｏｒｄおよびＢＣＡ手順）ならびに生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
実施例４２
アミノオキシ−ＰＥＧ試薬および求核触媒としてｍ−トルイジンを使用するＧ−ＣＳＦのＰＥＧ化
方法１：
Ｇ−ＣＳＦを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。Ｇ−ＣＳＦを、７．０ｍＬのヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０（２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２）中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（５ｍＭ）を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、４℃で１時間インキュベートし、７．５μＬの１Ｍのシステイン水溶液の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
次に、酸化Ｇ−ＣＳＦを含有する残余分を、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合し、室温で３０分間インキュベートする。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬を添加し、５倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２．５時間インキュベートする。
最後に、ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ複合体を、イオン交換クロマトグラフィ（例えばＱセファロースＦＦ上で）によって精製する。例えば、１．５ｍｇのタンパク質／ｍＬゲルを、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．４で平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、５ｍＭのＣａＣｌ２および５００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液で溶出し、次いで、適切な分子量のカットオフ膜を使用する限外濾過／透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法１を実行する。Ｇ−ＣＳＦを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。Ｇ−ＣＳＦを、７．０ｍＬのヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０（２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２）中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（５ｍＭ）を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、４℃で１時間インキュベートし、７．５μＬの１Ｍのシステイン水溶液の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
次に、酸化Ｇ−ＣＳＦを含有する残余分を、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合し、室温で３０分間インキュベートする。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬を添加し、５倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２．５時間インキュベートする。
最後に、ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。溶出液の複合体を含有する画分を収集し、次いで、適切な分子量のカットオフ膜を使用する限外濾過／透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法２：
Ｇ−ＣＳＦを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。Ｇ−ＣＳＦを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移すか、またはその中に溶解して、１．０＋／−０．２５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のｐＨを、０．５ＮのＨＣｌ水溶液の滴加によって６．０に修正する。続いて、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、１０分以内で添加し、２００μＭの濃度を得る。酸化反応をＴ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で３０＋／−５分間行う。次いで、Ｔ＝＋２２＋／−２℃で、１５分以内のＬ−システイン水溶液（１Ｍ）の添加により反応を停止し、反応混合物中で１０ｍＭの最終濃度を得て、６０＋／−５分間インキュベートする。
酸化Ｇ−ＣＳＦを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。溶出液の酸化Ｇ−ＣＳＦを含有する画分を収集し、複合化反応に使用する。
２０ｋＤの分子量の試薬を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬を、穏やかな撹拌下で、５０倍モル過剰で、精製された酸化Ｇ−ＣＳＦを含有する溶出液に最長期間（ｔ）の１５分以内で添加する。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で添加し、１０ｍＭの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で、１２０＋／−１０分間インキュベートする。
得られたＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮する。
方法３：
Ｇ−ＣＳＦを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。Ｇ−ＣＳＦを、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（１０ｍＭ）およびｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、２０倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、８μＬのシステイン水溶液（１Ｍ）の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。
最後に、ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ複合体を、ＱセファロースＦＦ上でイオン交換クロマトグラフィによって精製する。１．５ｍｇのタンパク質／ｍＬゲルを、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．４で事前に平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、５ｍＭのＣａＣｌ２および５００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液で溶出し、次いで、膜を使用する限外濾過／透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法３を実行する。Ｇ−ＣＳＦを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。Ｇ−ＣＳＦを、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（１０ｍＭ）およびｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、２０倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、８μＬのシステイン水溶液（１Ｍ）の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。
最後に、ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。溶出液の複合体を含有する画分を収集し、次いで、膜を使用する限外濾過／透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法４：
Ｇ−ＣＳＦを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。初期濃度または重量のＧ−ＣＳＦを、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移すか、またはその中に溶解して、Ｇ−ＣＳＦの２ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。続いて、５ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を１５分以内で添加し、１００μＭの最終濃度を得、続いて、５０ｍＭのｍ−トルイジン水溶液の添加によって、３０分の期間以内に１０ｍＭの最終濃度を得る。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬（上述）を添加し、２０倍モル過剰の試薬を得る。ｐＨを６．０に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、１ＭのＬ−システイン水溶液の添加によって室温で１５分間反応停止処理を行い、１０ｍＭの最終濃度を得る。
Ｇ−ＣＳＦ複合体を、イオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＣ）によって精製する。溶出液の複合体を含有する画分を、再生成されたセルロースから作製された１０ｋＤの膜（８８ｃｍ２、カットオフ１０ｋＤ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップをＨｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）に対して行う。
調製物を、公知の方法に従う総タンパク質（ＢｒａｄｆｏｒｄおよびＢＣＡ手順）ならびに生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
実施例４３
アミノオキシ−ＰＥＧ試薬および求核触媒としてｍ−トルイジンを使用するヒュミラのＰＥＧ化
方法１：
ヒュミラを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。ヒュミラを、７．０ｍＬのヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０（２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２）中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（５ｍＭ）を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、４℃で１時間インキュベートし、７．５μＬの１Ｍのシステイン水溶液の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
次に、酸化ヒュミラを含有する残余分を、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合し、室温で３０分間インキュベートする。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬を添加し、５倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２．５時間インキュベートする。
最後に、ＰＥＧ−ヒュミラ複合体を、イオン交換クロマトグラフィ（例えばＱセファロースＦＦ上で）によって精製する。例えば、１．５ｍｇのタンパク質／ｍＬゲルを、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．４で平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、５ｍＭのＣａＣｌ２および５００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液で溶出し、次いで、適切な分子量のカットオフ膜を使用する限外濾過／透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法１を実行する。ヒュミラを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。ヒュミラを、７．０ｍＬのヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０（２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２）中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（５ｍＭ）を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、４℃で１時間インキュベートし、７．５μＬの１Ｍのシステイン水溶液の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
次に、酸化ヒュミラを含有する残余分を、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合し、室温で３０分間インキュベートする。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬を添加し、５倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２．５時間インキュベートする。
最後に、ＰＥＧ−ヒュミラ複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。溶出液の複合体を含有する画分を収集し、次いで、適切な分子量カットオフの膜を使用する限外濾過／透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法２：
ヒュミラを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。ヒュミラを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移すか、またはその中に溶解して、１．０＋／−０．２５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のｐＨを、０．５ＮのＨＣｌ水溶液の滴加によって６．０に修正する。続いて、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、１０分以内で添加し、２００μＭの濃度を得る。酸化反応をＴ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で３０＋／−５分間行う。次いで、Ｔ＝＋２２＋／−２℃で、１５分以内のＬ−システイン水溶液（１Ｍ）の添加により反応を停止し、反応混合物中で１０ｍＭの最終濃度を得て、６０＋／−５分間インキュベートする。
酸化ヒュミラを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。溶出液の酸化ヒュミラを含有する画分を収集し、複合化反応に使用する。
２０ｋＤの分子量の試薬を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬を、穏やかな撹拌下で、５０倍モル過剰で、精製された酸化ヒュミラを含有する溶出液に最長期間（ｔ）の１５分以内で添加する。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で添加し、１０ｍＭの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で、１２０＋／−１０分間インキュベートする。
得られたＰＥＧ−ヒュミラ複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。ＰＥＧ−ヒュミラ複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮する。
方法３：
ヒュミラを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。ヒュミラを、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（１０ｍＭ）およびｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、２０倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、８μＬのシステイン水溶液（１Ｍ）の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。
最後に、ＰＥＧ−ヒュミラ複合体を、ＱセファロースＦＦ上でイオン交換クロマトグラフィによって精製する。１．５ｍｇのタンパク質／ｍＬゲルを、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．４で事前に平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、５ｍＭのＣａＣｌ２および５００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液で溶出し、次いで、膜を使用する限外濾過／透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法３を実行する。ヒュミラを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。ヒュミラを、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（１０ｍＭ）およびｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、２０倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、８μＬのシステイン水溶液（１Ｍ）の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。
最後に、ＰＥＧ−ヒュミラ複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって精製する。複合体を含有する画分を収集し、次いで、膜を使用する限外濾過／透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
方法４：
ヒュミラを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。初期濃度または重量のヒュミラを、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移すか、またはその中に溶解して、ヒュミラの２ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。続いて、５ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を１５分以内で添加し、１００μＭの最終濃度を得、続いて、５０ｍＭのｍ−トルイジン水溶液の添加によって、３０分の期間以内に１０ｍＭの最終濃度を得る。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬（上述）を添加し、２０倍モル過剰の試薬を得る。ｐＨを６．０に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、１ＭのＬ−システイン水溶液の添加によって室温で１５分間反応停止処理を行い、１０ｍＭの最終濃度を得る。
ヒュミラ複合体を、イオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＣ）によって精製する。溶出液の複合体を含有する画分を、再生成されたセルロースから作製された１０ｋＤの膜（８８ｃｍ２、カットオフ１０ｋＤ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップをＨｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）に対して行う。
調製物を、公知の方法に従う総タンパク質（ＢｒａｄｆｏｒｄおよびＢＣＡ手順）ならびに生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
実施例４４
アミノオキシ−ＰＥＧ試薬および求核触媒としてｍ−トルイジンを使用するプロリアのＰＥＧ化
方法１：
プロリアを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。プロリアを、７．０ｍＬのヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０（２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２）中に溶解する。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（５ｍＭ）を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、４℃で１時間インキュベートし、７．５μＬの１Ｍのシステイン水溶液の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
次に、酸化プロリアを含有する残余分を、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合し、室温で３０分間インキュベートする。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬を添加し、５倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２．５時間インキュベートする。
最後に、ＰＥＧ−プロリア複合体を、イオン交換クロマトグラフィ（例えばＱセファロースＦＦ上で）によって精製する。例えば、１．５ｍｇのタンパク質／ｍＬゲルを、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．４で平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、５ｍＭのＣａＣｌ２および５００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液で溶出し、次いで、適切な分子量のカットオフ膜を使用する限外濾過／透析濾過に供する。次に、調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法１を実行する。プロリアを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。１０ｍｇのｒＦＩＸを、５ｍＬのヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０（２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中に溶解する。次いで、１００μＬの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（５ｍＭ）を添加し、反応混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、４℃で１時間インキュベートし、５０μＬの１Ｍのシステイン水溶液の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。続いて、その混合物をＶｉｖａｓｐｉｎ １５Ｒ １０ｋＤの遠心分離濾過機を採用する限外濾過／透析濾過に供し、過剰な過ヨウ素酸塩、反応停止剤、およびその副生成物を除去する。
酸化プロリアを含有する残余分（約７ｍＬ）を、２ｍＬのｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合し、室温で３０分間インキュベートする。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬（上述）を添加し、５倍モル過剰の試薬を得る。この混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２．５時間インキュベートする。
最後に、ＰＥＧ−プロリア複合体を、ＳＰセファロースＦＦ上でイオン交換クロマトグラフィによって精製する。反応混合物を、２０ｍＬの緩衝液Ａ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ６．５）で希釈し、緩衝液Ａで事前に平衡化した２０ｍＬのＨｉＰｒｅｐ ＳＰ ＦＦ１６／１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）上に負荷する。次いで、カラムを、緩衝液Ｂ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５）で溶出する。遊離プロリアを、２５％の緩衝液Ｂを使用してカラムを洗浄することによって溶出し、その複合体を、５０％の緩衝液Ｂで溶出する。複合体を含有する画分を、再生成されたセルロースから作製された１０ｋＤの膜（８８ｃｍ２、カットオフ１０ｋＤ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップを、１５０ｍＭのＮａＣｌを含有するヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．９に対して行う。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。ＰＥＧ−プロリア複合体に対して、天然のプロリアと比較して５０％超の特異的活性を決定する。更に、その複合体を、以前に説明されている条件下で、Ｓｈｏｄｅｘ ＫＷ ８０３カラムを搭載したＡｇｉｌｅｎｔ
１２００ ＨＰＬＣシステムを使用するサイズ排除ＨＰＬＣによって分析的に特徴付ける（Ｋｏｌａｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ２００６；４６：１９５９−７７）。調製物が遊離プロリアを含有しないことを示す。
方法２：
プロリアを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。プロリアを、反応緩衝液（例えば５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移すか、またはその中に溶解して、１．０＋／−０．２５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。次いで、溶液のｐＨを、０．５ＮのＨＣｌ水溶液の滴加によって６．０に修正する。続いて、４０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を、１０分以内で添加し、２００μＭの濃度を得る。酸化反応をＴ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で３０＋／−５分間行う。次いで、Ｔ＝＋２２＋／−２℃で、１５分以内のＬ−システイン水溶液（１Ｍ）の添加により反応を停止し、反応混合物中で１０ｍＭの最終濃度を得て、６０＋／−５分間インキュベートする。
酸化プロリアを、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。溶出液の酸化ヒュミラを含有する画分を収集し、複合化反応に使用する。
２０ｋＤの分子量の試薬を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬を、穏やかな撹拌下で、５０倍モル過剰で、精製された酸化プロリアを含有する溶出液に最長期間（ｔ）の１５分以内で添加する。次いで、ｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を１５分以内で添加し、１０ｍＭの最終濃度を得る。反応混合物を、暗室で、穏やかな振とう下で、Ｔ＝＋２２＋／−２℃の温度（Ｔ）で、１２０＋／−１０分間インキュベートする。
得られたＰＥＧ−プロリア複合体を、イオン交換クロマトグラフィによって更に精製する。ＰＥＧ−プロリア複合体を含有する画分を収集し、適切な分子量カットオフを有する再生成されたセルロースから作製された膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮する。
方法３：
プロリアを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。ＥＰＯを、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（１０ｍＭ）およびｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）と混合する。続いて、アミノオキシ試薬を添加し、２０倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、８μＬのシステイン水溶液（１Ｍ）の添加によって、室温で１５分間反応停止処理を行う。
最後に、ＰＥＧ−プロリア複合体を、ＱセファロースＦＦ上でイオン交換クロマトグラフィによって精製する。１．５ｍｇのタンパク質／ｍＬゲルを、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．４で事前に平衡化したカラム上に負荷する。複合体を、５ｍＭのＣａＣｌ２および５００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４を含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液で溶出し、次いで、膜を使用する限外濾過／透析濾過に供する。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
代替的な実施形態において、以下の通りに方法３を実行する。
プロリアを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。１０ｍｇのプロリアを、約８ｍＬのヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０（２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中に溶解する。次いで、２００μＬの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（５ｍＭ）および２ｍＬのｍ−トルイジン水溶液（５０ｍＭ）を添加する。続いて、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬（上述）を添加し、５倍モル過剰の試薬を得る。その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、１００μＬの１Ｍのシステイン水溶液の添加によって室温で１５分間反応停止処理を行う。
最後に、ＰＥＧ−プロリア複合体を、ＳＰセファロースＦＦ上でイオン交換クロマトグラフィによって精製する。反応混合物を、２０ｍＬの緩衝液Ａ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ６．５）で希釈し、緩衝液Ａで事前に平衡化した２０ｍＬのＨｉＰｒｅｐ ＳＰＦＦ１６／１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，ＣＴ）上に負荷する。次いで、カラムを、緩衝液Ｂ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５）で溶出する。遊離プロリアを、２５％の緩衝液Ｂを使用してカラムを洗浄することによって溶出し、その複合体を、５０％の緩衝液Ｂで溶出する。複合体を含有する画分を、再生成されたセルロースから作製された１０ｋＤの膜（８８ｃｍ２、カットオフ１０ｋＤ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップを、１５０ｍＭのＮａＣｌを含有するヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．９に対して行う。調製物を、当該技術分野で公知の方法に従う総タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）および生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。ＰＥＧ−プロリア複合体に対して、天然のプロリアと比較して５０％超の特異的活性を決定する。更に、その複合体を、以前に説明されている条件下で、Ｓｈｏｄｅｘ ＫＷ ８０３カラムを搭載したＡｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣシステムを使用するサイズ排除ＨＰＬＣによって分析的に特徴付ける（Ｋｏｌａｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ２００６；４６：１９５９−７７）。調製物が遊離プロリアを含有しないことを示す。
方法４：
プロリアを、アミノオキシ基を含有する直鎖２０ｋＤのＰＥＧ化試薬の使用によってＰＥＧ化する。このタイプの試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＣＡシリーズである。初期濃度または重量のヒュミラを、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０）に移すか、またはその中に溶解して、プロリアの２ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る。続いて、５ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を１５分以内で添加し、１００μＭの最終濃度を得、続いて、５０ｍＭのｍ−トルイジン水溶液の添加によって、３０分の期間以内に１０ｍＭの最終濃度を得る。次いで、２０ｋＤの分子量を有するアミノオキシ−ＰＥＧ試薬（上述）を添加し、２０倍モル過剰の試薬を得る。ｐＨを６．０に修正した後、その混合物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートし、１ＭのＬ−システイン水溶液の添加によって室温で１５分間反応停止処理を行い、１０ｍＭの最終濃度を得る。
プロリア複合体を、イオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＣ）によって精製する。溶出液の複合体を含有する画分を、再生成されたセルロースから作製された１０ｋＤの膜（８８ｃｍ２、カットオフ１０ｋＤ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過によって濃縮する。最終透析濾過ステップをＨｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）に対して行う。
調製物を、公知の方法に従う総タンパク質（ＢｒａｄｆｏｒｄおよびＢＣＡ手順）ならびに生物活性の測定によって分析的に特徴付ける。
実施例４５
分岐鎖ＰＥＧを使用する治療用タンパク質のＰＥＧ化
本発明の治療用タンパク質のＰＥＧ化は、アルデヒドおよび活性アミノオキシ基を含有する適切なリンカーから作製される分岐鎖または直鎖ＰＥＧ化試薬まで拡大され得る。
実施例４６
天然のＰＳＡへのジアミノオキシリンカーの結合
この実施例は、治療用タンパク質の化学修飾に使用することができる天然（即ち、事前酸化なし）のＰＳＡを使用したアミノオキシ−ＰＳＡ試薬を調製する手順を説明する。
ａ）周囲温度での結合
Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｉｎｄｉａ（Ｐｕｎｅ，Ｉｎｄｉａ）から得た５２．２ｍｇの天然のＰＳＡ（分子量＝２０ｋＤ）を、１．０５ｍＬの５０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ６．０中に溶解した。次いで、１０．３ｍｇの３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミン（リンカー分子）を反応混合物に滴加した。この反応物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートした。
ｂ）上昇した温度での結合
Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｉｎｄｉａ（Ｐｕｎｅ，Ｉｎｄｉａ）から得た５２．２ｍｇの天然のＰＳＡ（分子量＝２０ｋＤ）を、１．０５ｍＬの５０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ６．０中に溶解した。次いで、１０．３ｍｇの３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミン（リンカー分子）を反応混合物に滴加した。この反応物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートした。次いで、温度を３２〜３７℃に上昇させ、反応混合物を更に１４時間インキュベートした。
ｃ）上昇した温度でのおよび増加したリンカー過剰での結合
Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｉｎｄｉａ（Ｐｕｎｅ，Ｉｎｄｉａ）から得た５２．２ｍｇの天然のＰＳＡ（分子量＝２０ｋＤ）を、１．０５ｍＬの５０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ６．０中に溶解した。次いで、１０．３ｍｇの３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミン（リンカー分子）を反応混合物に滴加した。この反応物を、暗室で、穏やかな撹拌下で、室温で２時間インキュベートした。次いで、２６．３ｍｇの３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンを反応物に滴加し、温度を３２〜３７℃に上昇させ、反応混合物を更に１４時間インキュベートした。
ｄ）ＰＳＡ誘導体の精製
インキュベーションが完了した後、ポイントａ〜ｃ下で生成した反応混合物を十分な透析により精製した。したがって、反応混合物の試料を、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット（０−５−３ｍｌ、ＭＷＣＯ３．５ｋＤ、再生成されたセルロース、Ｐｉｅｒｃｅ）中に負荷し、以下のパターンに従い１０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ８．０に対して透析した：
５００ｍＬの緩衝液に対して室温で２時間
５００ｍＬの緩衝液に対して室温で２時間
５００ｍＬの緩衝液に対して４℃で１２時間
初期試料の体積まで濃縮するために５０ｍＬの「透析のためのＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ濃縮溶液」に対して室温で１時間
したがって、精製されたアミノオキシ−ＰＳＡは、例えば、上の実施例１１、１２、１４、および１７〜３１に従ってタンパク質の複合化反応に使用できる状態である。同様に、本明細書に記載の水溶性ポリマーのいずれかは、この実施例に記載のアミノオキシリンカーに結合し、次いで、上の実施例に記載のタンパク質に複合化することができる。
調製物を、全ＰＳＡ（レゾルシノールアッセイ）および全アミノオキシ基（ＴＮＢＳアッセイ）を測定し、修飾の度合いを決定することによって分析的に特徴付けた。調製物について、（ａ）修飾の度合い（ＭＤ）０．３５、（ｂ）ＭＤ＝０．５４、および（ｃ）ＭＤ＝０．５８を決定した。更に、多分散性、ならびに遊離３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンを測定した。多分散性は、全ての調製について１．１５より低く、遊離リンカーの含有量は、０．１５モル％のＰＳＡ濃度より低いものであった。
還元末端で修飾されたＰＳＡについて、以下の構造が１３Ｃ ＮＭＲ分光法によって決定された。
実施例４７
クロマトグラフィ精製ステップを採用するアミノオキシ−ＰＳＡの４℃での調製
室温で調製されたアミノオキシ−ＰＳＡ試薬の詳細な分析的特長付けの間に、ＮＭＲ研究（例えば、参照によってその全体が組み込まれる米国仮出願第６１／６４７，８１４号を参照されたい）は、ジアミノオキシリンカーを有する酸化ＰＳＡの誘導体化が、２つの別個の反応（ＰＳＡの非還元末端でのアルデヒド基の迅速な反応およびＰＳＡの還元末端での（ヘミケタール形態の）アルデヒド基の遅い反応）からなることを明らかにした。後者の反応は、試薬の産生のために回避されるべきである望ましくない副反応と考えることができる。
したがって、本実施例に記載のように、アミノオキシ−ＰＳＡ試薬を調製するためのプロセスが最適化されている。還元末端は、プロセスが室温で実行される場合にかなりの程度で起こるのみである。したがって、プロセスは調整され、２〜８℃で行われる。２〜８℃でプロセス全体（化学反応、およびＩＥＸによるＰＳＡ試薬の精製）を実行することにより、ＰＳＡの還元末端での副反応が実質的に減少した。したがって、このプロセスの変更は、より高い品質の試薬をもたらす。
手順
Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｉｎｄｉａ（Ｐｕｎｅ，Ｉｎｄｉａ）から得た１２９０ｍｇの酸化ＰＳＡ（分子量＝２０ｋＤ）を、２５ｍＬの５０ｍＭのリン酸緩衝液（緩衝液Ａ）、ｐＨ６．０中に溶解した。次いで、２０９ｍｇの３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンを反応混合物に添加し、暗室で、穏やかな撹拌下で、２〜８℃で１時間インキュベートした。
インキュベーション後、混合物を、２〜８°Ｃの温度の冷室で実施されたＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＤＥＡＥ ６５０−Ｍクロマトグラフィゲル（カラム寸法：ＸＫ２６／１３５）を採用する穏やかな陰イオン交換クロマトグラフィステップに供した。反応混合物を予め冷却した１１０ｍＬの緩衝液Ａで希釈し、１ｃｍ／分の流速で、緩衝液Ａで事前に平衡化したＤＥＡＥカラム上に負荷した。次いで、２ｃｍ／分の流速で、カラムを２０ＣＶの緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ６．０）で洗浄し、遊離３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンを除去した。次いで、アミノオキシ−ＰＳＡ試薬を、６７％の緩衝液Ｂおよび４３％の緩衝液Ｃ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）からなるステップ勾配で溶出した。溶出液を、ポリエーテルスルホンから作製された５ｋＤの膜（５０ｃｍ２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過によって濃縮した。調製物を、全ＰＳＡ（レゾルシノールアッセイ）および全アミノオキシ基（ＴＮＢＳアッセイ）を測定し、修飾の度合いを決定することによって分析的に特徴付けた。最終調製物中のＰＳＡ濃度は、４６．０ｍｇ／ｍｌであり、修飾の度合いは８３．５％であった。更に、１．１３１の多分散性値が決定された。加えて、０．２２μｇ／ｍｌの濃度（ＰＳＡの０．０７ｍｏｌ％）が、遊離３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンについて測定された。
したがって、精製されたアミノオキシ−ＰＳＡは、上の実施例１１、１２、１４、および１７〜３１に従って複合化反応に使用できる状態である。

Claims (11)

  1. 活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーを調製する方法であって、
    ａ）非酸化水溶性ポリマーを含む溶液を、活性アミノオキシ基を含むアミノオキシリンカーとともに、前記非酸化水溶性ポリマーと前記活性化アミノオキシリンカーとの間の安定したオキシム連結の形成を可能にする条件下で、インキュベートし、前記条件が、約２時間の期間、撹拌しながら光の非存在下での約２時間の約２２℃の温度を含み、前記条件が、前記溶液の温度を約３２℃〜約３７℃の温度まで上昇させるステップ、および更に約１２時間〜約２４時間の間インキュベートするステップを更に含み、それによって活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーを形成することと、
    ｂ）クロマトグラフィ、濾過、透析、および沈殿からなる群から選択される方法により活性アミノオキシ基を含有する前記水溶性ポリマーを精製することと、
    を含み、
    それによって前記水溶性ポリマーとアミノオキシリンカーとの間にオキシム連結を形成し、
    ここで、前記水溶性ポリマーがＰＳＡである、
    方法。
  2. 前記オキシム連結の形成が、ｏ−アミノ安息香酸、ｍ−アミノ安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸、スルファニル酸、ｏ−アミノベンズアミド、ｏ−トルイジン、ｍ−トルイジン、ｐ−トルイジン、ｏ−アニシジン、ｍ−アニシジン、およびｐ−アニシジンからなる群から選択される求核触媒によって触媒される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記温度を上昇させる直前に活性アミノオキシ基を含む付加的な量のアミノオキシリンカーを添加する更なるステップを含む、請求項１に記載の方法。
  4. 活性アミノオキシ基を含有する前記水溶性ポリマーを、約２２℃の温度で透析、限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）、およびクロマトグラフィからなる群から選択される方法によって精製する、請求項１に記載の方法。
  5. 約４℃で透析、ＵＦ／ＤＦおよびクロマトグラフィからなる群から選択される方法によって活性アミノオキシ基を含有する前記水溶性ポリマーを精製するステップを更に含む、請求項４に記載の方法。
  6. 前記活性化アミノオキシリンカーが、
    ａ）式：

    の３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンリンカー、
    ｂ）式：

    の３，６，９−トリオキサ−ウンデカン−１，１１−ジオキシアミンリンカー、および
    ｃ）式：

    の３，６，９，１２，１５−ペンタオキサ−ヘプタデカン−１，１７−ジオキシアミンリンカーからなる群より選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記活性化アミノオキシリンカーが、式：

    の３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンリンカーである、請求項６に記載の方法。
  8. 請求項１に記載の活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーを治療用タンパク質の酸化炭水化物部分へ複合化させる方法であって、複合化を可能にする条件下で、前記酸化炭水化物部分を、活性アミノオキシ基を含有する前記水溶性ポリマーと接触させることを含み、
    前記炭水化物部分が、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）、四酢酸鉛（Ｐｂ（ＯＡｃ）４）、および過ルテニウム酸カリウム（ＫＲｕＯ４）からなる群から選択される酸化剤を含む緩衝液とともにインキュベーションすることによって酸化され、
    オキシム連結が、前記酸化炭水化物部分と前記水溶性ポリマー上の前記活性アミノオキシ基との間に形成され、
    前記オキシム連結形成が、求核触媒であるｍ−トルイジンによって触媒される、方法。
  9. 前記治療用タンパク質が、糖タンパク質またはインビトロでグリコシル化された治療用タンパク質であり、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、第Ｖ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、トロンビン（ＦＩＩ）、プロテインＣ、プロテインＳ、ｔＰＡ、ＰＡＩ−１、組織因子（ＴＦ）、ＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＥＰＯ、インターフェロンα（ＩＦＮ−α）、コンセンサスインターフェロン、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−ω、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２α、ＩＬ−３３、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ａｎｇ−１、Ａｎｇ−２、Ａｎｇ−４、Ａｎｇ−Ｙ、アンジオポエチン様ポリペプチド１（ＡＮＧＰＴＬ１）、アンジオポエチン様ポリペプチド２（ＡＮＧＰＴＬ２）、アンジオポエチン様ポリペプチド３（ＡＮＧＰＴＬ３）、アンジオポエチン様ポリペプチド４（ＡＮＧＰＴＬ４）、アンジオポエチン様ポリペプチド５（ＡＮＧＰＴＬ５）、アンジオポエチン様ポリペプチド６（ＡＮＧＰＴＬ６）、アンジオポエチン様ポリペプチド７（ＡＮＧＰＴＬ７）、ビトロネクチン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオゲニン、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、骨形態形成タンパク質１、骨形態形成タンパク質２、骨形態形成タンパク質３、骨形態形成タンパク質４、骨形態形成タンパク質５、骨形態形成タンパク質６、骨形態形成タンパク質７、骨形態形成タンパク質８、骨形態形成タンパク質９、骨形態形成タンパク質１０、骨形態形成タンパク質１１、骨形態形成タンパク質１２、骨形態形成タンパク質１３、骨形態形成タンパク質１４、骨形態形成タンパク質１５、骨形態形成タンパク質受容体ＩＡ、骨形態形成タンパク質受容体ＩＢ、骨形態形成タンパク質受容体ＩＩ、脳由来神経栄養因子、カルジオトロフィン−１、繊毛様神経栄養因子、繊毛様神経栄養因子受容体、クリプト、クリプティック、サイトカイン誘導好中球走化性因子１、サイトカイン誘導好中球走化性因子２α、サイトカイン誘導好中球走化性因子２β、β内皮細胞増殖因子、エンドセリン１、上皮増殖因子、エピゲン、エピレグリン、上皮由来好中球誘引物質、線維芽細胞増殖因子４、線維芽細胞増殖因子５、線維芽細胞増殖因子６、線維芽細胞増殖因子７、線維芽細胞増殖因子８、線維芽細胞増殖因子８ｂ、線維芽細胞増殖因子８ｃ、線維芽細胞増殖因子９、線維芽細胞増殖因子１０、線維芽細胞増殖因子１１、線維芽細胞増殖因子１２、線維芽細胞増殖因子１３、線維芽細胞増殖因子１６、線維芽細胞増殖因子１７、線維芽細胞増殖因子１９、線維芽細胞増殖因子２０、線維芽細胞増殖因子２１、酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、グリア細胞株由来好中球因子受容体α１、グリア細胞株由来好中球因子受容体α２、増殖関連タンパク質、ヘパリン結合上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、肝細胞癌由来増殖因子、インスリン様増殖因子Ｉ、インスリン様増殖因子受容体、インスリン様増殖因子ＩＩ、インスリン様増殖因子結合タンパク質、ケラチノサイト増殖因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受容体α、神経増殖因子 神経増殖因子受容体、ニューロポエチン、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、胎盤増殖因子、血小板由来内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子受容体α、血小板由来増殖因子受容体β、プレＢ細胞増殖刺激因子、幹細胞因子（ＳＣＦ）、幹細胞因子受容体、ＴＮＦ、ＴＮＦ０、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、形質転換増殖因子α、形質転換増殖因子β、形質転換増殖因子β１、形質転換増殖因子β１．２、形質転換増殖因子β２、形質転換増殖因子β３、形質転換増殖因子β５、潜在型形質転換増殖因子β１、形質転換増殖因子β結合タンパク質Ｉ、形質転換増殖因子β結合タンパク質ＩＩ、形質転換増殖因子β結合タンパク質ＩＩＩ、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）、Ｉ型腫瘍壊死因子受容体、ＩＩ型腫瘍壊死因子受容体、ウロキナーゼタイププラスミノーゲン活性剤受容体、ホスホリパーゼ活性化タンパク質（ＰＵＰ）、インスリン、レクチン、リシン、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノーゲン活性化因子、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、およびＩｇＤ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ＤＮＡｓｅ、フェチュイン、黄体形成ホルモン、エストロゲン、アルブミン、リポタンパク質、フェトプロテイン、トランスフェリン、トロンボポエチン、ウロキナーゼ、インテグリン、トロンビン、レプチン、ヒュミラ（アダリムマブ）、プロリア（デノスマブ）、エンブレル（エタネルセプト）、明細書の表１中のタンパク質、またはその生物学的に活性なフラグメント、誘導体、もしくは変異体からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
  10. 活性アミノオキシ基を含有するＰＳＡを治療用タンパク質の酸化炭水化物部分へ複合化させる方法であって、複合化を可能にする条件下で、前記酸化炭水化物部分を、活性アミノオキシ基を含有する前記ＰＳＡと接触させることを含み、
    活性アミノオキシ基を含有する前記ＰＳＡが、
    ａ）非酸化ＰＳＡを含む溶液を、活性アミノオキシ基を含むアミノオキシリンカーとともに、前記非酸化ＰＳＡと前記活性化アミノオキシリンカーとの間の安定したオキシム連結の形成を可能にする条件下で、インキュベートし、前記条件が、約２時間の期間、撹拌しながら光の非存在下での約２時間の約２２℃の温度を含み、前記条件が、前記溶液の温度を約３２℃〜約３７℃の温度まで上昇させるステップ、および更に約１２時間〜約２４時間の間インキュベートするステップを更に含み、それによって活性アミノオキシ基を含有するＰＳＡを形成することと、
    ｂ）クロマトグラフィ、濾過、透析、および沈殿からなる群から選択される方法により活性アミノオキシ基を含有する前記ＰＳＡを精製することと、
    を含む方法によって調製され、
    それによって前記ＰＳＡと前記アミノオキシリンカーとの間にオキシム連結を形成し、
    前記炭水化物部分が、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）、四酢酸鉛（Ｐｂ（ＯＡｃ）４）、および過ルテニウム酸カリウム（ＫＲｕＯ４）からなる群から選択される酸化剤を含む緩衝液とともにインキュベーションすることによって酸化され、
    オキシム連結が、前記酸化炭水化物部分とＰＳＡ上の前記活性アミノオキシ基との間に形成され、
    前記オキシム連結形成が、求核触媒であるｍ−トルイジンによって触媒され、
    前記治療用タンパク質がＦＶＩＩＩの生物活性を有する、
    方法。
  11. 活性アミノオキシ基を含有するＰＳＡを治療用タンパク質の酸化炭水化物部分へ複合化させる方法であって、複合化を可能にする条件下で、前記酸化炭水化物部分を、活性アミノオキシ基を含有する前記ＰＳＡと接触させることを含み、
    活性アミノオキシ基を含有する前記ＰＳＡが、
    ａ）酸化ＰＳＡを含む溶液を、活性アミノオキシ基を含むアミノオキシリンカーとともに、前記酸化ＰＳＡと前記活性化アミノオキシリンカーとの間の安定したオキシム連結の形成を可能にする条件下で、インキュベートし、前記条件が、約１時間の期間、約４℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含み、それによって活性アミノオキシ基を含有するＰＳＡを形成することと、
    ｂ）約４℃の温度でクロマトグラフィの方法により活性アミノオキシ基を含有する前記ＰＳＡを精製することと、
    を含む方法によって調製され、
    それによってＰＳＡと前記アミノオキシリンカーとの間にオキシム連結を形成し、
    前記炭水化物部分が、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）、四酢酸鉛（Ｐｂ（ＯＡｃ）４）、および過ルテニウム酸カリウム（ＫＲｕＯ４）からなる群から選択される酸化剤を含む緩衝液とともにインキュベーションすることによって酸化され、
    オキシム連結が、前記酸化炭水化物部分とＰＳＡ上の前記活性アミノオキシ基との間に形成され、
    前記オキシム連結形成が、求核触媒であるｍ−トルイジンによって触媒され、
    前記治療用タンパク質がＦＶＩＩＩの生物活性を有する、
    方法。
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