KR102326360B1 - 옥심 결합을 위한 친핵성 촉매 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 컨쥬게이션시키는 조건 하에서, 산화된 탄수화물 모이어티를 활성화된 수용성 중합체와 접촉시키는 단계를 포함하는 치료적 단백질의 산화된 탄수화물 모이어티에 수용성 중합체를 컨쥬게이팅하는 물질 및 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 본 발명은 앞서 언급한 재료 및 방법에 관한 것이되, 상기 수용성 중합체는 활성 아미노옥시기를 함유하고, 옥심 또는 하이드라존 결합은 수용성 중합체 상에서 산화된 탄수화물 모이어티와 활성 아미노옥시기 간에 형성되며, 상기 컨쥬게이션은 친핵성 촉매의 존재에서 수행된다.

Description

옥심 결합을 위한 친핵성 촉매{NUCLEOPHILIC CATALYSTS FOR OXIME LINKAGE}
본 발명은 단백질에 수용성 중합체를 컨쥬게이팅하기 위한 물질 및 방법에 관한 것이다.
수용성 중합체와 치료적 단백질 간에 공유 결합을 형성하는 것에 의한 컨쥬게이트의 제조는 다양한 화학적 방법에 의해 수행될 수 있다. 폴리펩타이드 약물의 페길화(PEGylation)는 폴리펩타이드 약물을 순환에서 보호하며, 폴리펩타이드 약물의 약역학적 및 약동학적 프로파일을 개선시킨다(Harris and Chess, Nat Rev Drug Discov. 2003;2:214-21). 페길화 공정은 폴리펩타이드 약물에 에틸렌 글라이콜(폴리에틸렌 글라이콜(polyethylene glycol: PEG))의 반복 단위를 부착시킨다. PEG 분자는 큰 유체역학 용량(구상 단백질 크기의 5 내지 10배)을 가지며, 고도로 수용성이고, 수화되며, 비독성이며, 비면역원성이고, 신체로부터 빠르게 클리어런스된다. 분자의 페길화는 효소적 분해에 대한 약물의 증가된 내성, 증가된 생체내 반감기, 감소된 투약 빈도, 감소된 면역원성, 증가된 물리적 및 열적 안정성, 증가된 용해도, 증가된 액체 안정성 및 감소된 응집을 야기할 수 있다. 처음 페길화 약물은 1990년대 초에 FDA에 의해 승인되었다. 이후로, FDA는 경구, 주사용 및 국소 투여를 위한 몇몇 페길화 약물을 승인하였다.
콜로민산(colominic acid: CA)으로도 지칭되는 폴리시알산(Polysialic acid: PSA)은 자연적으로 생기는 다당류이다. 이는 α(2→8) 케토시드 결합을 지니는 N-아세틸뉴라민산의 동종 중합체이며, 그의 비환원 말단에서 인접한 다이올기를 함유한다. 이는 음으로 하전되며 인체의 자연적 구성성분이다. 이는 박테리아로부터 다량으로 그리고 사전결정된 물리적 특징을 이용하여 용이하게 생성될 수 있다(미국 특허 제5,846,951호). 박테리아에 의해 생성된 PSA는 인체에서 생성된 PSA와 화학적으로 그리고 면역학적으로 동일하기 때문에, 박테리아 PSA는 단백질에 결합될 때 조차도 비면역원성이다. 일부 중합체와 달리, PSA 산은 생분해성이다. 카탈라제 및 아스파라기나제에 대한 콜로민산의 공유 결합은 단백질 분해효소 또는 혈장의 존재에서 효소 안정성을 증가시키는 것으로 나타났다. 폴리시알산화되고 미변형된 아스파라기나제에 의한 생체내 비교 연구는 폴리시알산화가 효소의 반감기를 증가시켰다는 것을 나타내었다(Fernandes and Gregoriadis, Int J Pharm. 2001;217:215-24).
펩타이드 또는 단백질에 대한 PEG-유도체의 결합은 로버츠(Roberts) 등(Adv Drug Deliv Rev 2002;54:459-76)에 의해 검토된다. 치료적 단백질에 수용성 중합체를 결합시키기 위한 일 접근은 단백질의 탄수화물 모이어티를 통한 중합체의 컨쥬게이션이다. 단백질에서 탄수화물의 인접한 하이드록실(OH) 기는 과요오드산나트륨(NaIO4)에 의해 용이하게 산화되어 활성 알데하이드기를 형성할 수 있다(Rothfus et Smith, J Biol Chem 1963; 238:1402-10; van Lenten et Ashwell, J Biol Chem 1971;246:1889-94). 후속적으로 중합체는, 예를 들어 활성 하이드라자이드기를 함유하는 시약의 사용에 의해 탄수화물의 알데하이드기에 결합될 수 있다(Wilchek M and Bayer EA, Methods Enzymol 1987;138:429-42). 더 최근의 기술은 알데하이드와 반응하는 아미노옥시기를 함유하는 시약을 사용하여 옥심 결합을 형성한다(WO 96/40662, WO2008/025856).
치료적 단백질에 대한 수용성 중합체의 컨쥬게이션을 설명하는 추가적인 예는 폰빌레브란트인자(Von Willebrand factor) 내 탄수화물 모이어티의 산화 및 후속적으로 하이드라자이드 화학을 사용하는 PEG에 대한 결합을 교시하는 WO 06/071801호; rFVIII의 산화 및 후속적으로 하이드라자이드 화학을 사용하여 PEG 및 다른 수용성 중합체(예를 들어, PSA, HES, 덱스트란)에 대한 결합을 교시하는 미국 특허 공개 제2009/0076237호; 상이한 응고 인자, 예를 들어, rFIX, FVIII 및 FVIIa의 산화 및 후속적으로 옥심 결합을 형성하는 것에 의한 아미노옥시 화학을 사용하는, 예를 들어 PEG에 대한 결합을 교시하는 WO 2008/025856호; 및 FIX의 산화 및 후속적으로 하이드라자이드 화학을 사용하는 PEG에 대한 결합을 교시하는 미국 특허 제5,621,039호에 기재되어 있다.
최근에, 알데하이드를 만들기 위한 시알산의 온화한 과요오드산염 산화 후에 촉매적 양의 아닐린의 존재에서 시약을 함유하는 아미노옥시기와의 반응을 포함하는 개선된 방법이 기재되었다(Dirksen A., andDawson PE, Bioconjugate Chem. 2008;19,2543-8; 및 Zeng Y et al., Nature Methods 2009;6:207-9). 아닐린 촉매는 옥심 결찰을 극적으로 가속화하며, 매우 저농도의 시약을 사용하게 한다. 친핵성 촉매의 사용은 또한 문헌[Dirksen, A., et al., J Am Chem Soc., 128:15602-3 (2006); Dirksen, A., et al., Angew chem. Int Ed., 45:7581-4 (2006); Kohler, J.J., ChemBioChem., 10:2147-50 (2009); Giuseppone, N., et al., J Am Chem Soc., 127:5528-39 (2005); 및 Thygesen, M.B., et al., J Org Chem., 75:1752-5 (2010)]에 기재되어 있다.
아닐린 촉매는 반응 시간을 짧게 하고 아미노옥시 시약을 저농도로 사용하게 하는 옥심 결찰을 가속화할 수 있지만, 아닐린은, 예를 들어 컨쥬게이트된 치료적 단백질이 약제의 기준을 형성할 때, 고려되어야 하는 독성 특성을 가진다. 예를 들어, 아닐린은 메트헤모글로빈혈증을 유발하는 것으로 나타났다(Harrison, J.H.., and Jollow, D.J., Molecular Pharmacology, 32(3) 423-431, 1987). 래트의 장기간 식이요법 처리는 비장에서 종양을 유발하는 것으로 나타났다(Goodman, DG., et al., J Natl Cancer Inst., 73(1):265-73, 1984). 시험관내 연구는 또한 아닐린이 염색체 돌연변이를 유발할 가능성을 가지고, 잠재적으로 유전 독성 물질 활성을 가진다는 것을 나타내었다(Bombhard E.M. et Herbold B, Critical Reviews in Toxicology 35,783-835, 2005).
단백질의 약역학적 및/또는 약동학적 특성을 개선시키는 한편, 다양한 시약과 관련된 비용을 최소화하면서 환자 수용인에 대한 건강상의 위험을 최소화하는, 단백질에 수용성 중합체를 컨쥬게이션을 위한 물질 및 방법을 개발할 필요가 남아있다.
본 발명은 단백질의 약역학적 및/또는 약동학적 특성을 개선시키는, 한편 다양한 시약과 관련된 비용 및 컨쥬게이션 반응이 친핵성 촉매에 의해 촉매될 때 환자 수용인에 대한 건강상의 위험을 최소화하는, 단백질에 대한 중합체의 컨쥬게이션을 위한 물질 및 방법을 제공한다. 본 발명의 다양한 실시형태에서, 아닐린을 대신하기 위한 대안의 촉매가 제공된다.
본 개시내용은 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 치료적 단백질을 컨쥬게이션하기 위해 사용될 수 있는 다양한 수용성 중합체-아미노옥시 링커 시약의 제조를 위한 최적화된 절차를 제공한다. 최근의 NMR 연구는 PSA-아미노옥시 시약의 제조가 실온에서 수행된다면, PSA의 환원말단에서의 부반응이 일어날 수 있다는 것을 나타내었다. 따라서, 본 개시내용의 다양한 실시형태에서, 새로운 공정은 2 내지 8℃의 온도에서 수행된다. 일 실시형태에서, PSA-아미노옥시 시약은 본 명세서에 기재된 공정에 따라 4℃에서 제조된다. 추가로, 2 내지 8℃의 온도에서 크로마토그래피 정제 단계(예를 들어, IEX)를 사용하는 시약의 정제가 또한 본 개시내용에 의해 상정된다. PSA의 환원말단에서 원치않는 부반응은, 전체 공정(화학 반응 및 IEX에 의한 컨쥬게이트의 정제)이 2 내지 8℃의 온도에서 수행될 때, 실질적으로 감소된다.
본 개시내용에 따른 일 실시형태에서, 컨쥬게이션시키는 조건 하에서 활성화된 수용성 중합체와 산화된 탄수화물 모이어티를 접촉시키는 단계를 포함하는 치료적 단백질의 산화된 탄수화물 모이어티에 수용성 중합체를 컨쥬게이팅하는 방법이 제공되며; 상기 수용성 중합체는 활성 아미노옥시기를 함유하고, 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 분지된 PEG, 폴리PEG(PolyPEG)(등록상표)(영국 코번트리에 소재한 워릭 이펙트 폴리머즈(Warwick Effect Polymers)), 폴리시알산(polysialic acid: PSA), 전분, 하이드록시알킬 전분(hydroxyalkyl starch: HAS), 하이드록실에틸 전분(hydroxylethyl starch: HES), 탄수화물, 다당류, 풀루란, 키토산, 하이알루론산, 황산콘드로이틴, 황산더마탄, 전분, 덱스트란, 카복시메틸-덱스트란, 폴리알킬렌 옥사이드(polyalkylene oxide: PAO), 폴리알킬렌 글라이콜(polyalkylene glycol: PAG), 폴리프로필렌 글라이콜(polypropylene glycol: PPG), 폴리옥사졸린, 폴리아크릴로일모르폴린, 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol: PVA), 폴리카복실레이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리에틸렌-코-말레산 무수물, 폴리스타이렌-코-말레산 무수물, 폴리(1-하이드록시메틸에틸렌 하이드록시메틸포말)(PHF), 2-메트아크릴로일옥시-2'-에틸트라이메틸암모늄포스페이트(MPC)로 이루어진 군으로부터 선택되되; 활성 아미노옥시기를 함유하는 수용성 중합체는: a) 산화된 수용성 중합체와 활성화된 아미노옥시 링커 간에 안정한 옥심 결합을 형성하게 하는 조건 하에서 활성 아미노옥시기를 포함하는 아미노옥시 링커와 함께 산화된 수용성 중합체를 포함하는 용액을 인큐베이션시키는 단계(상기 조건은 광의 존재 또는 부재에서, 교반하면서 또는 교반없이 약 1분 내지 약 24시간의 시간 기간; 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도를 포함하고; 이에 의해 활성 아미노옥시기를 함유하는 수용성 중합체를 형성함); 및 b) 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 크로마토그래피, 여과, 투석 및 침전으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의해 활성 아미노옥시기를 함유하는 수용성 중합체를 정제시키는 단계(상기 탄수화물 모이어티는 과요오드산나트륨(NaIO4), 테트라아세트산납(Pb(OAc)4) 및 과루테늄산칼륨(KRuO4)으로 이루어진 군으로부터 선택된 산화제를 포함하는 완충제와 함께 인큐베이션에 의해 산화됨)를 포함하는 방법에 의해 제조되되; 옥심 결합은 산화된 탄수화물 모이어티와 수용성 중합체 상의 활성 아미노옥시기 간에 형성되고; 상기 옥심 결합 형성은 o-아미노 벤조산, m-아미노 벤조산, p-아미노 벤조산, 설파닐산, o-아미노벤즈아마이드, o-톨루이딘, m-톨루이딘, p-톨루이딘, o-아니시딘, m-아니시딘 및 p-아니시딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 친핵성 촉매에 의해 촉매된다.
다른 실시형태에서, 앞서 언급한 방법이 제공되되, 산화된 수용성 중합체 및 활성 아미노옥시기를 포함하는 아미노옥시 링커를 포함하는 용액은 광 없이 교반하면서 1시간 동안 4℃에서 인큐베이션된다. 다른 실시형태에서, 앞서 언급한 방법이 제공되되, 활성 아미노옥시기를 함유하는 수용성 중합체는 4℃의 온도에서 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제된다. 다른 실시형태에서, 앞서 언급한 방법이 제공되되, 산화된 수용성 중합체는 PSA이고, NaIO4와 함께 인큐베이션에 의해 산화된다.
본 개시내용의 다른 실시형태에서, 컨쥬게이션시키는 조건 하에서 활성화된 수용성 중합체와 산화된 탄수화물 모이어티를 접촉시키는 단계를 포함하는 치료적 단백질의 산화된 탄수화물 모이어티에 수용성 중합체를 컨쥬게이팅하는 방법이 제공되며; 상기 수용성 중합체는 활성 아미노옥시기를 함유하고, 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 분지된 PEG, 폴리PEG(등록상표)(영국 코번트리에 소재한 워릭 이펙트 폴리머즈), 폴리시알산(PSA), 전분, 하이드록시알킬 전분(HAS), 하이드록실에틸 전분(HES), 탄수화물, 다당류, 풀루란, 키토산, 하이알루론산, 황산콘드로이틴, 황산더마탄, 전분, 덱스트란, 카복시메틸-덱스트란, 폴리알킬렌 옥사이드(PAO), 폴리알킬렌 글라이콜(PAG), 폴리프로필렌 글라이콜(PPG), 폴리옥사졸린, 폴리아크릴로일모르폴린, 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리카복실레이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리에틸렌-코-말레산 무수물, 폴리스타이렌-코-말레산 무수물, 폴리(1-하이드록시메틸에틸렌 하이드록시메틸포말)(PHF), 2-메트아크릴로일옥시-2'-에틸트라이메틸암모늄포스페이트(MPC)로 이루어진 군으로부터 선택되되; 활성 아미노옥시기를 함유하는 수용성 중합체는: a) 수용성 중합체와 활성화된 아미노옥시 링커 간에 안정한 옥심 결합을 형성하게 하는 조건 하에서 활성 아미노옥시기를 포함하는 아미노옥시 링커와 함께 수용성 중합체를 포함하는 용액을 인큐베이션시키는 단계(상기 조건은 광의 존재 또는 부재에서, 교반하면서 또는 교반없이 약 1분 내지 약 24시간의 시간 기간; 약 22℃ 내지 약 37℃의 온도를 포함하고; 이에 의해 활성 아미노옥시기를 함유하는 수용성 중합체를 형성함); 및 b) 크로마토그래피, 여과, 투석 및 침전으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의해 활성 아미노옥시기를 함유하는 수용성 중합체를 정제시키는 단계(상기 탄수화물 모이어티는 과요오드산나트륨(NaIO4), 테트라아세트산납(Pb(OAc)4) 및 과루테늄산칼륨(KRuO4)으로 이루어진 군으로부터 선택된 산화제를 포함하는 완충제와 함께 인큐베이션에 의해 산화됨)를 포함하는 방법에 의해 제공되되; 옥심 결합은 산화된 탄수화물 모이어티와 수용성 중합체 상의 활성 아미노옥시기 간에 형성되고; 상기 옥심 결합 형성은 o-아미노 벤조산, m-아미노 벤조산, p-아미노 벤조산, 설파닐산, o-아미노벤즈아마이드, o-톨루이딘, m-톨루이딘, p-톨루이딘, o-아니시딘, m-아니시딘 및 p-아니시딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 친핵성 촉매에 의해 촉매된다.
다른 실시형태에서, 앞서 언급한 방법이 제공되되, 수용성 중합체 및 활성 아미노옥시기를 포함하는 아미노옥시 링커를 포함하는 용액은 광 없이 교반하면서 22℃에서 2시간 동안 인큐베이션된다. 다른 실시형태에서, 앞서 언급한 방법이 제공되되, 수용성 중합체 및 활성 아미노옥시기를 포함하는 아미노옥시 링커를 포함하는 용액은 광의 부재에서 교반하면서 22℃에서 2시간 동안 인큐베이션되고; 상기 방법은 용액 온도를 약 32℃ 내지 약 37℃의 온도로 증가시키는 단계 및 추가의 12시간 내지 24시간 동안 인큐베이션시키는 단계를 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, 온도를 증가시키기 직전에 추가량의 활성 아미노옥시기를 포함하는 아미노옥시 링커를 첨가하는 추가 단계를 포함하는 앞서 언급한 방법이 제공된다. 다른 실시형태에서, 앞서 언급한 방법이 제공되되, 활성 아미노옥시기를 함유하는 수용성 중합체는 22℃의 온도에서의 투석, 한외여과/정용여과(ultrafiltration/diafiltration: UF/DF) 및 크로마토그래피로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의해 정제된다. 다른 실시형태에서, 4℃에서의 투석, UF/DF 또는 크로마토그래피로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의해 활성 아미노옥시기를 함유하는 수용성 중합체를 정제시키는 단계를 추가로 포함하는, 앞서 언급한 방법이 제공된다.
본 개시내용의 다양한 실시형태에서, 앞서 언급한 방법이 제공되되, 치료적 단백질은 인자 IX(FIX), 인자 VIII(FVIII), 인자 VIIa(FVIIa), 폰빌레브란트인자(VWF), 인자 FV(FV), 인자 X(FX), 인자 XI(FXI), 인자 XII(FXII), 트롬빈(FII), 단백질 C, 단백질 S, tPA, PAI-1, 조직 인자(tissue factor: TF), ADAMTS 13 프로테아제, IL-1 알파, IL-1 베타, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, 집락자극인자-1(CSF-1), M-CSF, SCF, GM-CSF, 과립구 집락 자극 인자(G-CSF), EPO, 인터페론-알파(IFN-알파), 컨센서스 인터페론, IFN-베타, IFN-감마, IFN-오메가, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-31, IL-32 알파, IL-33, 트롬보포이에틴(TPO), Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y, 안지오포이에틴-유사 폴리펩타이드 1(ANGPTL1), 안지오포이에틴-유사 폴리펩타이드 2(ANGPTL2), 안지오포이에틴-유사 폴리펩타이드 3(ANGPTL3), 안지오포이에틴-유사 폴리펩타이드 4(ANGPTL4), 안지오포이에틴-유사 폴리펩타이드 5(ANGPTL5), 안지오포이에틴-유사 폴리펩타이드 6(ANGPTL6), 안지오포이에틴-유사 폴리펩타이드 7(ANGPTL7), 비트로넥틴, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 엔지오제닌, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 골형성 단백질-1, 골형성 단백질-2, 골형성 단백질-3, 골형성 단백질-4, 골형성 단백질-5, 골형성 단백질-6, 골형성 단백질-7, 골형성 단백질-8, 골형성 단백질-9, 골형성 단백질-10, 골형성 단백질-11, 골형성 단백질-12, 골형성 단백질-13, 골형성 단백질-14, 골형성 단백질-15, 골형성 단백질 수용체 IA, 골형성 단백질 수용체 IB, 골형성 단백질 수용체 II, 뇌 유래 신경 성장 인자, 카디오트로핀-1, 섬모 신경영양 인자, 섬모 신경영양 인자 수용체, 크립토, 크립틱, 사이토카인-유발 호중구 주화성 인자 1, 사이토카인-유발 호중구, 주화성 인자 2α, 사이토카인-유발 호중구 주화성 인자 2β, β 내피세포 성장인자, 엔도텔린 1, 표피 성장 인자, 에피젠, 에피레귤린, 상피-유래 호중구 유인물질, 섬유아세포 성장 인자 4, 섬유아세포 성장 인자 5, 섬유아세포 성장 인자 6, 섬유아세포 성장 인자 7, 섬유아세포 성장 인자 8, 섬유아세포 성장 인자 8b, 섬유아세포 성장 인자 8c, 섬유아세포 성장 인자 9, 섬유아세포 성장 인자 10, 섬유아세포 성장 인자 11, 섬유아세포 성장 인자 12, 섬유아세포 성장 인자 13, 섬유아세포 성장 인자 16, 섬유아세포 성장 인자 17, 섬유아세포 성장 인자 19, 섬유아세포 성장 인자 20, 섬유아세포 성장 인자 21, 산성 섬유아세포 성장 인자, 염기성 섬유아세포 성장 인자, 신경교세포주-유래 신경영양 인자 수용체 α1, 신경교세포주-유래 신경영양 인자 수용체 α2, 성장 관련 단백질, 성장 관련 단백질 α, 성장 관련 단백질 β, 성장 관련 단백질 γ, 헤파린 결합 상피세포 성장인자, 간세포 성장 인자, 간세포 성장 인자 수용체, 간세포암종-유래 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자 I, 인슐린-유사 성장 인자 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 II, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질, 케라틴세포 성장 인자, 백혈병 억제인자, 백혈병 억제 인자 수용체 α, 신경 성장 인자 신경 성장 인자 수용체, 뉴로포이에틴, 뉴로트로핀-3, 뉴로트로핀-4, 온코스타틴 M(OSM), 태반 성장 인자, 태반 성장 인자 2, 혈소판-유래 내피세포 성장인자, 혈소판 유래 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자 A 쇄, 혈소판 유래 성장 인자 AA, 혈소판 유래 성장 인자 AB, 혈소판 유래 성장 인자 B 쇄, 혈소판 유래 성장 인자 BB, 혈소판 유래 성장 인자 수용체 α, 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β, 전-B 세포성장 자극인자, 줄기세포 인자(SCF), 줄기세포 인자 수용체, TNF, TNF0, TNF1, TNF2, 형질전환 성장 인자 α, 형질전환 성장 인자 β, 형질전환 성장 인자 β1, 형질전환 성장 인자 β1.2, 형질전환 성장 인자 β2, 형질전환 성장 인자 β3, 형질전환 성장 인자 β5, 잠복성 형질전환 성장 인자 β1, 형질전환 성장 인자 β 결합 단백질 I, 형질전환 성장 인자 β 결합 단백질 II, 형질전환 성장 인자 β 결합 단백질 III, 흉선 기질상 림포포이에틴(흉선 기질상 림포포이에틴: TSLP), I형 종양 괴사 인자 수용체, II형 종양 괴사 인자 수용체, 유로키나제-형 플라스미노겐 활성체 수용체, 포스포리파제-활성화 단백질(PUP), 인슐린, 렉틴 리신, 프로락틴, 융모성 성선 자극 호르몬, 여포 자극 호르몬, 갑상선-자극 호르몬, 조직 플라스미노겐 활성체, IgG, IgE, IgM, IgA 및 IgD, α-갈락토시다제, β-갈락토시다제, DNA분해효소, 페투인, 황체 형성 호르몬, 에스트로겐, 인슐린, 알부민, 리포단백질, 태아단백질, 트랜스페린, 트롬보포이에틴, 유로키나제, 인테그린, 트롬빈, 렙틴, 휴미라(Humira)(아달리무맙), 프롤리아(Prolia)(데노수맙), 엔브렐(Enbrel)(에타너셉트), 표 1의 단백질, 또는 이들의 생물학적으로 활성인 단편, 유도체 또는 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 앞서 언급한 방법이 제공되되, 약 0.3㎎/㎖ 내지 약 3.0㎎/㎖의 초기 농도의 치료적 단백질을 포함하는 용액은 활성화된 수용성 중합체와 접촉 전에 약 5.0 내지 약 8.0의 pH 값으로 조절된다. 일 실시형태에서, 치료적 단백질의 초기 농도는 약 1.0㎎/㎖이고, pH는 약 6.0이다.
다른 실시형태에서, 앞서 언급한 방법이 제공되되, 치료적 단백질은 활성화된 수용성 중합체의 원하는 과량의 농도에 의해 접촉되며, 과량의 농도는 약 1배 몰 내지 약 300배 몰 과량이다. 일 실시형태에서, 과량의 농도는 약 50배 몰 과량이다.
다른 실시형태에서, 앞서 언급한 방법이 제공되되, 치료적 단백질은 광의 존재 또는 부재에서 교반하면서 또는 교반 없이 약 0.5 시간 내지 약 24시간의 시간 기간; 약 2℃ 내지 약 37℃의 온도를 포함하는 조건 하에서 활성화된 수용성 중합체와 함께 인큐베이션된다. 일 실시형태에서, 조건은 광 없이 교반하면서 약 120분의 시간 기간, 약 22℃의 온도를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 앞서 언급한 방법이 제공되되, 친핵성 촉매는 광의 존재 또는 부재에서, 교반하면서 또는 교반없이 약 0.1분 내지 약 30분의 시간 기간; 약 2℃ 내지 약 37℃의 온도를 포함하는 조건 하에서 약 1.0mM 내지 약 50mM 친핵성 촉매의 최종 농도를 초래하는 양으로 첨가된다. 일 실시형태에서, 친핵성 촉매의 최종 농도는 약 10mM이며, 조건은 광 없이 교반하면서 약 15분의 시간 기간, 약 22℃의 온도를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 앞서 언급한 방법이 제공되되, 산화제는 광의 존재 또는 부재에서, 교반하면서 또는 교반없이 약 0.1분 내지 약 120분의 시간 기간; 약 2℃ 내지 약 37℃의 온도를 포함하는 조건 하에서 약 50μM 내지 약 1000μM 산화제의 최종 농도를 초래하는 양으로 첨가된다. 일 실시형태에서, 산화제의 최종 농도는 약 400μM이며, 조건은 광 없이 교반하면서 약 10분의 시간 기간, 약 22℃의 온도를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 앞서 언급한 방법이 제공되되, 치료적 단백질의 산화된 탄수화물 모이어티에 수용성 중합체를 컨쥬게이팅하는 것은 L-시스테인, 메티오닌, 글루타티온, 글라이세롤, 메타중아황산나트륨(Na2S2O5), 트립토판, 타이로신, 히스티딘 또는 이의 유도체, 크레졸, 이미다졸, 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 급랭제(quenching agent)의 첨가에 의해 중단되고; 급랭제는 약 1mM 내지 약 100mM 급랭제, 광의 존재 또는 부재에서 교반하면서 또는 교반 없이 약 5분 내지 약 120분의 시간 기간; 약 2℃ 내지 약 37℃의 온도를 포함하는 조건 하에서 최종 농도를 초래하는 양으로 첨가된다. 일 실시형태에서, 급랭제는 L-시스테인이다. 또 다른 실시형태에서, L-시스테인은 광 없이 교반하면서 약 60분의 시간 기간, 약 22℃의 온도를 포함하는 조건으로 약 10mM의 최종 농도를 초래하도록 첨가된다.
다른 실시형태에서, a) 치료적 단백질을 포함하는 용액의 pH 값을 약 5.0 내지 약 8.0의 pH 값으로 조절하는 것을 포함하되, 치료적 단백질 농도는 약 0.3㎎/㎖ 내지 약 3.0㎎/㎖인 제1 단계; b) 치료적 단백질 상에서 하나 이상의 탄수화물을 산화시키는 단계를 포함하되, 산화제는 제1 단계에서의 용액에 광의 존재 또는 부재에서, 교반하면서 또는 교반 없이 약 0.1분 내지 약 120분의 시간 기간; 약 2℃ 내지 약 37℃의 온도를 포함하는 조건 하에서, 약 50μM 내지 약 1000μM의 최종 농도를 초래하도록 첨가되는 제2 단계; c) 치료적 단백질을 원하는 과량의 농도의 활성화된 수용성 중합체와 접촉시키는 단계를 포함하되, 상기 과량의 농도는 광의 존재 또는 부재에서 교반하면서 또는 교반 없이 약 0.5 시간 내지 약 24시간 기간, 약 2℃ 내지 약 37℃의 온도를 포함하는 조건 하에서, 1배 몰 과량 내지 약 300배 몰 과량인 제3 단계; d) 친핵성 촉매를 제3 단계의 용액에 첨가하는 단계를 포함하되, 친핵성 촉매는 광의 존재 또는 부재에서 교반하면서 또는 교반 없이 약 0.1분 내지 약 30분의 시간 기간; 약 2℃ 내지 약 37℃의 온도를 포함하는 조건 하에서 약 1mM 내지 약 50mM의 최종 농도를 초래하도록 첨가되는 제4 단계; e) 상기 치료적 단백질 상에서 하나 이상의 산화된 탄수화물에 활성화된 수용성 중합체를 컨쥬게이션시키는 조건 하에 상기 치료적 단백질은 활성화된 수용성 중합체 및 친핵성 촉매와 함께 인큐베이션되되, 상기 조건은 광의 존재 또는 부재에서 교반하면서 또는 교반 없이 약 0.5 시간 내지 약 24시간의 시간 기간, 약 2℃ 내지 약 37℃의 온도를 포함하는 제5 단계; 및 f) 제5 단계에서의 치료적 단백질의 하나 이상의 산화된 탄수화물에 상기 수용성 중합체를 컨쥬게이팅하는 것이 L-시스테인, 메티오닌, 글루타티온, 글라이세롤, Na2S2O5(메타중아황산나트륨), 트립토판, 타이로신, 히스티딘 또는 이의 유도체, 크레졸, 이미다졸, 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 급랭제의 첨가에 의해 중단되는 단계이되, 상기 급랭제는 광의 존재 또는 부재에서, 교반하면서 또는 교반 없이 약 5분 내지 약 120분의 시간 기간; 약 2℃ 내지 약 37℃의 온도를 포함하는 조건 하에서 약 1mM 내지 약 100mM의 최종 농도를 초래하도록 첨가되는 제6 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 다른 실시형태에서, 제1 단계에서 치료적 단백질의 초기 농도는 약 1㎎/㎖이고, pH는 약 6.0이되; 제2 단계에서 산화제의 최종 농도는 약 400μM이고, 제5 단계에서의 조건은 광 없이 교반하면서 약 10분의 시간 기간, 약 22℃의 온도를 포함하고; 제3 단계에서 과량의 농도는 약 50 몰 과량이며; 제3 단계에서 조건은 광 없이 교반하면서 약 15분의 시간 기간, 약 22℃의 온도를 포함하고; 제4 단계에서 친핵성 촉매의 최종 농도는 약 10mM이며, 제4 단계에서 조건은 광 없이 교반하면서 약 15분의 시간 기간, 약 22℃의 온도를 포함하며; 제5 단계에서 활성화된 수용성 중합체 및 친핵성 촉매와 함께 치료적 단백질을 인큐베이션하는 조건은 광 없이 교반하면서 약 2 시간 기간; 약 22℃의 온도를 포함하고; 제6 단계에서 급랭제는 L-시스테인이며; L-시스테인은 약 10mM의 최종 농도를 초래하도록 첨가되고, 제6 단계에서의 조건은 광 없이 교반하면서 약 60분의 시간 기간, 약 22℃의 온도를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 수용성 중합체는 PSA이다. 일 실시형태에서, 수용성 중합체는 PEG이다. 또 다른 실시형태에서, 수용성 중합체는 HES이다. 또 다른 실시형태에서, 수용성 중합체는 HAS이다. 다른 실시형태에서, PSA는 약 10 내지 300개의 시알산 단위를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 치료적 단백질은 FIX이다. 다른 실시형태에서, 치료적 단백질은 FVIIa이다. 또 다른 실시형태에서, 치료적 단백질은 FVIII이다.
다른 실시형태에서, 앞서 언급한 방법이 제공되되, 산화제는 과요오드산나트륨(NaIO4)이다.
다른 실시형태에서, 앞서 언급한 방법이 제공되되, 치료적 단백질의 산화된 탄수화물 모이어티는 혈액응고 단백질의 활성화 펩타이드에 위치된다.
다른 실시형태에서, 앞서 언급한 방법이 제공되되, PSA는: a) 하기 화학식의 3-옥사-펜탄-1,5-다이옥시아민 링커:
Figure 112021088906918-pat00001
,
b) 하기 화학식의 3,6,9-트라이옥사-운데칸-1,11-다이옥시아민 링커:
Figure 112021088906918-pat00002
및
c) 하기 화학식의 3,6,9,12,15-펜타옥사-헵타데칸-1,17-다이옥시아민 링커로 이루어진 군으로부터 선택된 활성화된 아미노옥시 링커를 포함하되:
Figure 112021088906918-pat00003
PSA는 산화제와 함께 인큐베이션에 의해 산화되어 PSA의 비환원말단에서 말단 알데하이드기를 형성한다.
다른 실시형태에서, 아미노옥시 링커는 3-옥사-펜탄-1,5-다이옥시아민이다.
다른 실시형태에서, 앞서 언급한 방법이 제공되되, 친핵성 촉매는 약 1mM 내지 약 50mM의 농도에서 제공된다. 다른 실시형태에서, 친핵성 촉매는 m-톨루이딘이다. 또 다른 실시형태에서, m-톨루이딘은 컨쥬게이션 반응에서 약 10mM의 농도로 존재한다.
다른 실시형태에서, 컨쥬게이션된 치료적 단백질을 정제시키는 단계를 추가로 포함하는 앞서 언급한 방법이 제공된다. 일 실시형태에서, 컨쥬게이트된 치료적 단백질은 크로마토그래피, 여과 및 침전으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의해 정제된다. 또 다른 실시형태에서, 크로마토그래피는 소수성 상호작용 크로마토그래피(Hydrophobic Interaction Chromatography: HIC), 이온 교환 크로마토그래피(Ion Exchange chromatography: IEC), 크기 배제 크로마토그래피(Size exclusion chromatography: SEC), 친화성 크로마토그래피, 및 역상 크로마토그래피로 이루어진 군으로부터 선택되다. 일 실시형태에서, 항-카오트로픽(anti-chaotropic) 염은 크로마토그래피 장입 단계에서 및 크로마토그래피 세척 단계에서 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 크로마토그래피는 칼럼에서 이루어진다. 일 실시형태에서, 칼럼은 페닐-세파로스 FF 및 뷰틸-세파로스 FF로 이루어진 군으로부터 선택된 크로마토그래피 수지를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 수지는 칼럼에서 약 5㎝ 내지 약 20㎝의 층 높이에서 존재한다.
또 다른 실시형태에서, 층 높이는 약 10㎝이다. 다른 실시형태에서, 앞서 언급한 방법이 제공되되, 1회 이상의 세척 단계를 포함하고, 유동 방향은 상향 흐름(up-flow)으로 설정되며, 유속은 약 0.2㎝/분 내지 약 6.7㎝/분이다. 일 실시형태에서, 유속은 약 2㎝/분이다. 다른 실시형태에서, 1회 이상의 용리 단계를 포함하는 앞서 언급한 방법이 제공되되, 유동 방향은 하향 흐름(down-flow)으로 설정되며, 유속은 약 0.1㎝/분 내지 약 6.7㎝/분이다. 일 실시형태에서, 유속은 약 1㎝/분이다.
또 다른 실시형태에서, 한외여과/정용여과(ultra-/diafiltration: UF/DF)에 의해 컨쥬게이트된 치료적 단백질을 농축시키는 단계를 추가로 포함하는, 앞서 언급한 방법이 제공된다. 다른 실시형태에서, 앞서 언급한 방법이 제공되되, 치료적 단백질의 최종 농도는 약 0.5 내지 약 3㎎/㎖이다. 다른 실시형태에서, 앞서 언급한 방법이 제공되되, 치료적 단백질은 약 5 내지 약 11 수용성 중합체 모이어티를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 앞서 언급한 방법이 제공되되, 컨쥬게이트된 치료적 단백질은 크로마토그래피를 사용하여 정제되고; 항-카오트로픽 염은 장입 단계 및 세척 단계를 위해 사용되며; 상기 방법은 1회 이상의 세척 단계(유동 방향은 상향 흐름으로 설정되며, 유속은 약 0.2㎝/분 내지 약 6.7㎝/분임) 및 1회 이상의 용리 단계(유동 방향은 하향 흐름으로 설정되며, 유속은 약 0.2㎝/분 내지 약 6.7㎝/분임)를 포함하고; 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 컨쥬게이트된 치료적 단백질을 농축시키는 단계를 추가로 포함한다.
다른 실시형태에서, 앞서 언급한 방법이 제공되되, 크로마토그래피는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)이며; 1회 이상의 세척 단계 유속은 약 2㎝/분이고; 1회 이상의 용리 단계 유속은 약 1㎝/분이다.
앞서 언급한 방법에 의해 생성된 변형된 치료적 단백질이 또한 본 개시내용에 의해 제공된다.
본 개시내용의 일 실시형태에서, a) 산화된 수용성 중합체와 활성화된 아미노옥시 링커 간에 안정한 옥심 결합을 형성시키는 조건 하에서 활성 아미노옥시기를 포함하는 아미노옥시 링커와 함께 산화된 수용성 중합체를 포함하는 용액을 인큐베이션시킴으로써 활성 아미노옥시기를 함유하는 수용성 중합체를 형성하는 단계(상기 조건은 광의 존재 또는 부재에서 교반하면서 또는 교반 없이 약 1분 내지 약 24시간의 시간 기간; 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도를 포함함); 및 b) 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 크로마토그래피, 여과, 투석 및 침전으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의해 활성 아미노옥시기를 함유하는 수용성 중합체를 정제함으로써 수용성 중합체와 아미노옥시 링커 간에 옥심 결합을 형성하는 단계를 포함하는 활성 아미노옥시기를 함유하는 수용성 중합체를 제조하는 방법이 제공되며, 상기 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 분지된 PEG, 폴리PEG(등록상표)(영국 코번트리에 소재한 워릭 이펙트 폴리머즈), 폴리시알산(PSA), 전분, 하이드록시알킬 전분(HAS), 하이드록실에틸 전분(HES), 탄수화물, 다당류, 풀루란, 키토산, 하이알루론산, 황산콘드로이틴, 황산더마탄, 전분, 덱스트란, 카복시메틸-덱스트란, 폴리알킬렌 옥사이드(PAO), 폴리알킬렌 글라이콜(PAG), 폴리프로필렌 글라이콜(PPG), 폴리옥사졸린, 폴리아크릴로일모폴리, 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리카복실레이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리에틸렌-코-말레산 무수물, 폴리스타이렌-코-말레산 무수물, 폴리(1-하이드록시메틸에틸렌 하이드록시메틸포말)(PHF), 2-메트아크릴로일옥시-2'-에틸트라이메틸암모늄포스페이트(MPC)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 실시형태에서, 앞서 언급한 방법이 제공되되, 옥심 결합 형성은 o-아미노 벤조산, m-아미노 벤조산, p-아미노 벤조산, 설파닐산, o-아미노벤즈아마이드, o-톨루이딘, m-톨루이딘, p-톨루이딘, o-아니시딘, m-아니시딘 및 p-아니시딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 친핵성 촉매에 의해 촉매된다.
다른 실시형태에서, 앞서 언급한 방법이 제공되되, 수용성 중합체는 PSA이다. 다른 실시형태에서, 앞서 언급한 방법이 제공되되, 수용성 중합체는 PEG이다. 다른 실시형태에서, 앞서 언급한 방법이 제공되되, 산화된 수용성 중합체 및 활성 아미노옥시기를 포함하는 아미노옥시 링커를 포함하는 용액은 광 없이 교반하면서 1시간 동안 4℃에서 인큐베이션된다. 다른 실시형태에서, 앞서 언급한 방법이 제공되되, 활성 아미노옥시기를 함유하는 수용성 중합체는 4℃의 온도에서 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제된다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, a) 수용성 중합체와 활성화된 아미노옥시 링커 간에 안정한 옥심 결합을 형성시키는 조건 하에서 활성 아미노옥시기를 포함하는 아미노옥시 링커와 함께 산화된 수용성 중합체를 포함하는 용액을 인큐베이션시킴으로써 활성 아미노옥시기를 함유하는 수용성 중합체를 형성하는 단계(상기 조건은 광의 존재 또는 부재에서 교반하면서 또는 교반 없이 약 1분 내지 약 24시간의 시간 기간; 약 22℃ 내지 약 37℃의 온도를 포함함); 및 b) 크로마토그래피, 여과, 투석 및 침전으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의해 활성 아미노옥시기를 함유하는 수용성 중합체를 정제함으로써 수용성 중합체와 아미노옥시 링커 간에 옥심 결합을 형성하는 단계를 포함하는 활성 아미노옥시기를 함유하는 수용성 중합체를 제조하는 방법이 제공된다.
다른 실시형태에서, 앞서 언급한 방법이 제공되되, 상기 옥심 결합 형성은 o-아미노 벤조산, m-아미노 벤조산, p-아미노 벤조산, 설파닐산, o-아미노벤즈아마이드, o-톨루이딘, m-톨루이딘, p-톨루이딘, o-아니시딘, m-아니시딘 및 p-아니시딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 친핵성 촉매에 의해 촉매된다.
다른 실시형태에서, 앞서 언급한 방법이 제공되되, 수용성 중합체 및 활성 아미노옥시기를 포함하는 아미노옥시 링커를 포함하는 용액은 광 없이 교반하면서 22℃에서 2시간 동안 인큐베이션된다. 다른 실시형태에서, 앞서 언급한 방법이 제공되되, 수용성 중합체 및 활성 아미노옥시기를 포함하는 아미노옥시 링커를 포함하는 용액은 광의 부재에서 교반하면서 22℃에서 2시간 동안 인큐베이션되고; 상기 방법은 용액 온도를 약 32℃ 내지 약 37℃의 온도로 증가시키는 단계 및 추가의 12시간 내지 24시간 동안 인큐베이션시키는 단계를 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, 온도를 증가시키기 직전에 추가량의 활성 아미노옥시기를 포함하는 아미노옥시 링커를 첨가하는 추가 단계를 포함하는 앞서 언급한 방법이 제공된다.
다른 실시형태에서, 앞서 언급한 방법이 제공되되, 활성 아미노옥시기를 함유하는 수용성 중합체는 22℃의 온도에서의 투석, 한외여과/정용여과(UF/DF) 및 크로마토그래피로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의해 정제된다. 다른 실시형태에서, 4℃에서의 투석, UF/DF 또는 크로마토그래피로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의해 활성 아미노옥시기를 함유하는 수용성 중합체를 정제시키는 단계를 추가로 포함하는 앞서언급한 방법이 제공된다.
본 개시내용의 또 다른 실시형태에서, a) 수용성 중합체와 산화된 PSA와 활성화된 아미노옥시 링커 간에 안정한 옥심 결합을 형성시키는 조건 하에서 활성 아미노옥시기를 포함하는 아미노옥시 링커와 함께 산화된 PSA를 포함하는 용액을 인큐베이션시킴으로써 활성 아미노옥시기를 함유하는 PSA를 형성하는 단계(상기 조건은 광 없이 교반하면서 1시간의 시간 기간; 약 4℃의 온도를 포함함); 및 b) 4℃의 온도에서 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 활성 아미노옥시기를 함유하는 PSA를 정제함으로써, PSA와 아미노옥시 링커 간에 옥심 결함을 형성하는 단계를 포함하는, PSA-아미노옥시기 시약을 제조하는 방법이 제공되되, 상기 활성화된 아미노옥시 링커는 하기 화학식의 3-옥사-펜탄-1,5-다이옥시아민 링커이다:
Figure 112021088906918-pat00004
.
본 개시내용의 또 다른 실시형태에서, a) 비산화 PSA와 활성화된 아미노옥시 링커 간에 안정한 옥심 결합을 형성시키는 조건 하에서 활성 아미노옥시기를 포함하는 아미노옥시 링커와 함께, 비산화 PSA를 포함하는 용액을 인큐베이션시킴으로써 활성 아미노옥시기를 함유하는 PSA를 형성하는 단계(상기 조건은 광 없이 교반하면서 2 시간의 시간 기간; 22℃의 온도를 포함함); 및 b) 22℃의 온도에서의 투석에 의해 활성 아미노옥시기를 함유하는 PSA를 정제함으로써, 비산화 PSA와 아미노옥시 링커 간에 옥심 결함을 형성하는 단계를 포함하는, PSA-아미노옥시기 시약 아미노옥시기를 제조하는 방법이 제공되되, 상기 활성화된 아미노옥시 링커는 하기 화학식의 3-옥사-펜탄-1,5-다이옥시아민 링커이다:
Figure 112021088906918-pat00005
.
본 개시내용의 또 다른 실시형태에서, 컨쥬게이션시키는 조건 하에서 활성화된 수용성 중합체와 산화된 탄수화물 모이어티를 접촉시키는 단계를 포함하는, 혈액 응고 단백질의 산화된 탄수화물 모이어티에 수용성 중합체를 컨쥬게이팅하는 방법이 제공되며; 상기 혈액 응고 단백질은 인자 IX(FIX), 인자 VIII(FVIII), 인자 VIIa(FVIIa), 폰빌레브란트인자(VWF), 인자 FV(FV), 인자 X(FX), 인자 XI(FXI), 인자 XII(FXII), 트롬빈(FII), 단백질 C, 단백질 S, tPA, PAI-1, 조직 인자(TF) 및 ADAMTS 13 프로테아제 또는 이들의 생물학적으로 활성인 단편, 유도체 또는 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되고; 상기 활성 아미노옥시기를 함유하는 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 분지된 PEG, 폴리시알산(PSA), 탄수화물, 다당류, 풀루란, 키토산, 하이알루론산, 황산콘드로이틴, 황산더마탄, 전분, 덱스트란, 카복시메틸-덱스트란, 폴리알킬렌 옥사이드(PAO), 폴리알킬렌 글라이콜(PAG), 폴리프로필렌 글라이콜(PPG), 폴리옥사졸린, 폴리아크릴로일모르폴린, 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리카복실레이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리에틸렌-코-말레산 무수물, 폴리스타이렌-코-말레산 무수물, 폴리(1-하이드록시메틸에틸렌 하이드록시메틸포말)(PHF), 2-메트아크릴로일옥시-2'-에틸트라이메틸암모늄포스페이트(MPC)로 이루어진 군으로부터 선택되며; 완충제와 함께 인큐베이션에 의해 산화된 상기 탄수화물 모이어티는 과요오드산나트륨(NaIO4), 테트라아세트산납(Pb(OAc)4) 및 과루테늄산칼륨(KRuO4)으로 이루어진 군으로부터 선택된 산화제를 포함하되; 수용성 중합체 상에서 산화된 탄수화물 모이어티와 활성 아미노옥시기 간에 옥심 결합이 형성된다.
도 1은 응고 인자 IX(서열번호 1)의 1차 구조를 도시한 도면.
도 2는 아미노옥시-PSA에 대한 산화된 rFIX의 결합을 도시한 도면.
도 3은 수용성 다이-아미노옥시 링커 3-옥사-펜탄-1,5-다이옥시아민 및 3,6,9-트라이옥사-운데칸-1,11-다이옥시아민의 합성을 도시한 도면.
도 4는 아미노옥시-PSA의 제조를 도시한 도면.
도 5는 SDS PAGE에 의해 상이한 촉매의 존재에서 제조한 PSA-FIX 컨쥬게이트의 시각화를 도시한 도면. a) 상이한 농도를 이용한 아닐린과 m-톨루이딘의 비교; b) 아닐린과 o-아미노벤조산, m-아미노벤조산, p-아미노벤조산, p-아미노벤즈아마이드 및 설파닐산의 비교; c) 아닐린 및 m-톨루이딘과 o-아니시딘 및 m-아니시딘의 비교.
도 6은 다양한 친핵성 촉매에 의한 폴리시알산화의 백분율을 도시한 도면.
치료적 단백질의 약학적 및 면역학적 특성은 중합체 화합물, 예컨대 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 분지된 PEG, 폴리시알산(PSA), 하이드록시알킬 전분(HAS), 하이드록실에틸 전분(HES), 탄수화물, 다당류, 풀루란, 키토산, 하이알루론산, 황산콘드로이틴, 황산더마탄, 전분, 덱스트란, 카복시메틸-덱스트란, 폴리알킬렌 옥사이드(PAO), 폴리알킬렌 글라이콜(PAG), 폴리프로필렌 글라이콜(PPG), 폴리옥사졸린, 폴리아크릴로일모르폴린, 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리카복실레이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리에틸렌-코-말레산 무수물, 폴리스타이렌-코-말레산 무수물, 폴리(1-하이드록시메틸에틸렌 하이드록시메틸포말)(PHF), 2-메트아크릴로일옥시-2'-에틸트라이메틸암모늄포스페이트(MPC)를 이용하는 화학적 변형 및 컨쥬게이션에 의해 개선될 수 있다. 얻어진 컨쥬게이트의 특성은 일반적으로 중합체의 구조 및 크기에 강하게 의존한다. 따라서, 한정되고 좁은 크기 분포를 지니는 중합체는 보통 당업계에서 바람직하다. 합성 중합체 유사 PEG는 좁은 크기 분포에 의해 용이하게 제조될 수 있는 반면, PSA는 좁은 크기 분포를 지니는 최종 PSA 제조를 초래하는 방식으로 정제될 수 있다. 또한 한정된 중합체 쇄 및 좁은 크기 분포를 지니는 페길화 시약은 시판 중이며, 합리적인 가격으로 상업적으로 입수가능하다.
폴리시알산화를 통하는 것과 같은 가용성 중합체의 첨가는 치료적 단백질, 예컨대 혈액 응고 단백질 FIX뿐만 아니라 다른 응고 단백질(예를 들어, VWF, FVIIa(예를 들어, 본 명세서에 참조로서 포함되는 미국 특허 제2008/0221032A1호 참조) 및 FVIII)의 특성을 개선시키는 하나의 접근이다.
치료적 단백질
본 발명의 특정 실시형태에서, 앞서 언급한 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드는 다음의 치료적 단백질로 예시된다: 효소, 항원, 항체, 수용체, 혈액응고 단백질, 성장 인자, 호르몬 및 리간드. 특정 실시형태에서, 치료적 단백질은 혈액 응고 단백질, 예컨대 인자 IX(FIX), 인자 VIII(FVIII), 인자 VIIa(FVIIa), 폰빌레브란트인자(VWF), 인자 FV(FV), 인자 X(FX), 인자 XI(FXI), 인자 XII(FXII), 트롬빈(FII), 단백질 C, 단백질 S, tPA, PAI-1, 조직 인자(TF) 또는 ADAMTS 13 프로테아제이다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 치료적 단백질은 글라이코단백질 또는, 다양한 실시형태에서, 생체내에서 자연적으로 글라이코실화되지 않는 단백질(즉, 자연적 글라이코실화 부위를 함유하지 않는 단백질 또는 정제 전에 숙주 세포에서 글라이코실화되지 않는 단백질)이다.
특정 실시형태에서, 치료적 단백질은 면역글로불린, 사이토카인, 예컨대 IL-1 알파, IL-1 베타, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, 집락자극인자-1(CSF-1), M-CSF, SCF, GM-CSF, 과립구 집락 자극 인자(G-CSF), EPO, 인터페론-알파(IFN-알파), 컨센서스 인터페론, IFN-베타, IFN-감마, IFN-오메가, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-31, IL-32 알파, IL-33, 트롬보포이에틴(TPO), 안지오포이에틴, 예를 들어 Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y, 인간 안지오포이에틴-유사 폴리펩타이드 ANGPTL1 내지 7, 비트로넥틴, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 엔지오제닌, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 골형성 단백질-1, 골형성 단백질-2, 골형성 단백질-3, 골형성 단백질-4, 골형성 단백질-5, 골형성 단백질-6, 골형성 단백질-7, 골형성 단백질-8, 골형성 단백질-9, 골형성 단백질-10, 골형성 단백질-11, 골형성 단백질-12, 골형성 단백질-13, 골형성 단백질-14, 골형성 단백질-15, 골형성 단백질 수용체 IA, 골형성 단백질 수용체 IB, 골형성 단백질 수용체 II, 뇌 유래 신경 성장 인자, 카디오트로핀-1, 섬모 신경영양 인자, 섬모 신경영양 인자 수용체, 크립토, 크립틱, 사이토카인-유발 호중구 주화성 인자 1, 사이토카인-유발 호중구, 주화성 인자 2α, 사이토카인-유발 호중구 주화성 인자 2β, β 내피세포 성장인자, 엔도텔린 1, 표피 성장 인자, 에피젠, 에피레귤린, 상피-유래 호중구 유인물질, 섬유아세포 성장 인자 4, 섬유아세포 성장 인자 5, 섬유아세포 성장 인자 6, 섬유아세포 성장 인자 7, 섬유아세포 성장 인자 8, 섬유아세포 성장 인자 8b, 섬유아세포 성장 인자 8c, 섬유아세포 성장 인자 9, 섬유아세포 성장 인자 10, 섬유아세포 성장 인자 11, 섬유아세포 성장 인자 12, 섬유아세포 성장 인자 13, 섬유아세포 성장 인자 16, 섬유아세포 성장 인자 17, 섬유아세포 성장 인자 19, 섬유아세포 성장 인자 20, 섬유아세포 성장 인자 21, 산성 섬유아세포 성장 인자, 염기성 섬유아세포 성장 인자, 신경교세포주-유래 신경영양 인자 수용체 α1, 신경교세포주-유래 신경영양 인자 수용체 α2, 성장 관련 단백질, 성장 관련 단백질 α, 성장 관련 단백질 β, 성장 관련 단백질 γ, 헤파린 결합 상피세포 성장인자, 간세포 성장 인자, 간세포 성장 인자 수용체, 간세포암종-유래 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자 I, 인슐린-유사 성장 인자 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 II, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질, 케라틴세포 성장 인자, 백혈병 억제인자, 백혈병 억제 인자 수용체 α, 신경 성장 인자 신경 성장 인자 수용체, 뉴로포이에틴, 뉴로트로핀-3, 뉴로트로핀-4, 온코스타틴 M(OSM), 태반 성장 인자, 태반 성장 인자 2, 혈소판-유래 내피세포 성장인자, 혈소판 유래 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자 A 쇄, 혈소판 유래 성장 인자 AA, 혈소판 유래 성장 인자 AB, 혈소판 유래 성장 인자 B 쇄, 혈소판 유래 성장 인자 BB, 혈소판 유래 성장 인자 수용체 α, 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β, 전-B 세포성장 자극인자, 줄기세포 인자(SCF), 줄기세포 인자 수용체, TNF, including TNF0, TNF1, TNF2, 형질전환 성장 인자 α, 형질전환 성장 인자 β, 형질전환 성장 인자 β1, 형질전환 성장 인자 β1.2, 형질전환 성장 인자 β2, 형질전환 성장 인자 β3, 형질전환 성장 인자 β5, 잠복성 형질전환 성장 인자 β1, 형질전환 성장 인자 β 결합 단백질 I, 형질전환 성장 인자 β 결합 단백질 II, 형질전환 성장 인자 β 결합 단백질 III, 흉선 기질상 림포포이에틴(TSLP), I형 종양 괴사 인자 수용체, II형 종양 괴사 인자 수용체, 유로키나제-형 플라스미노겐 활성체 수용체, 혈관 내피 성장 인자 및 키메라 단백질 및 이들의 생물학적 또는 면역학적 활성 단편이다.
특정 실시형태에서, 치료적 단백질은 알파-, 베타- 및 감마-인터페론, 과립구 집락자극인자를 포함하는 집락자극인자, 섬유아세포 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 포스포리파제-활성화 단백질(PUP), 인슐린, 식물 단백질, 예컨대 렉틴 및 리신, 종양 괴사 인자 및 관련된 대립유전자, 종양 괴사 인자 수용체의 가용성 형태, 인터류킨 수용체 및 인터류킨 수용체의 가용성 형태, 조직 성장 인자와 같은 성장 인자, 예컨대 TGFα 또는 TGFβ 및 표피 성장 인자, 호르몬, 간장 호르몬, 색소성 호르몬, 시상하부 방출인자, 항이뇨 호르몬, 프로락틴, 융모성 성선 자극 호르몬, 여포 자극 호르몬, 갑상선-자극 호르몬, 조직 플라스미노겐 활성체, 및 면역글로불린, 예컨대 IgG, IgE, IgM, IgA 및 IgD, 갈락토시다제, α-갈락토시다제, β-갈락토시다제, DNA분해효소, 페투인, 황체 형성 호르몬, 에스트로겐, 콜티코스테로이드, 인슐린, 알부민, 리포단백질, 태아단백질, 트랜스페린, 트롬보포이에틴, 유로키나제, DNA 분해효소, 인테그린, 트롬빈, 조혈 성장 인자, 렙틴, 글라이코시다제, 휴미라(아달리무맙), 프롤리아(데노수맙), 엔브렐(에타너셉트) 및 이들의 단편, 또는 임의의 상기 언급한 단백질 또는 이들의 단편을 포함하는 임의의 융합 단백질이다. 앞서 언급한 단백질에 추가로, 다음의 표 1은 본 발명에 의해 상정되는 치료적 단백질을 제공한다:
Figure 112021088906918-pat00006
Figure 112021088906918-pat00007
Figure 112021088906918-pat00008
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본 명세서에 제공된 치료적 단백질은 배타적으로 되는 것으로 고려되어서는 안 된다. 오히려, 본 명세서에 제공된 개시내용으로부터 명백한 바와 같이, 본 발명의 방법은 임의의 단백질에 적용가능하되, 수용성 중합체의 부착이 본 발명에 따라 요망된다. 예를 들어, 치료적 단백질은 전문이 본 명세서에 참조로서 포함되는 미국 특허 제2007/0026485호에 기재되어 있다.
혈액 응고 단백질
일 양태에서, 본 발명의 출발 물질은 인간 혈장으로부터 유래될 수 있거나 또는 미국 특허 제4,757,006호; 미국 특허 제5,733,873호; 미국 특허 제5,198,349호; 미국 특허 제5,250,421호; 미국 특허 제5,919,766호; 및 EP 306 968호에 기재된 바와 같은 재조합 유전자 조작 기법에 의해 생성될 수 있는 혈액응고 단백질이다.
치료적 폴리펩타이드, 예컨대 인자 IX(FIX), 인자 VIII(FVIII), 인자 VIIa(FVIIa), 폰빌레브란트인자(VWF), 인자 FV(FV), 인자 X(FX), 인자 XI(FXI), 인자 XII(FXII), 트롬빈(FII), 단백질 C, 단백질 S, tPA, PAI-1, 조직 인자(TF) 및 ADAMTS 13 프로테아제를 포함하는 혈액응고 단백질은 단백질 분해 효소에 의해 빠르게 분해되고, 항체에 의해 중화된다. 이는 그들의 반감기 및 순환시간을 감소시킴으로써, 그들의 치료적 유효성을 제한한다. 상대적으로 고용량 및 빈번한 투여는 이들 응고 단백질의 원하는 치료적 또는 예방적 효과에 도달하고 지속하는데 필수적이다. 결과로서, 적절한 용량 조절을 얻는 것은 어려우며, 빈번한 정맥내 투여의 필요는 환자의 생활방식에 대한 제한을 강요한다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 인자 IX(FIX), 인자 VIII(FVIII), 인자 VIIa(FVIIa), 폰빌레브란트인자(VWF), 인자 FV(FV), 인자 X(FX), 인자 XI, 인자 XII(FXII), 트롬빈(FII), 단백질 C, 단백질 S, tPA, PAI-1, 조직 인자(TF) 및 ADAMTS 13 프로테아제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 혈액응고 단백질이 본 발명에 의해 상정된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "혈액응고 단백질" 은 특정 천연 혈액응고 단백질과 관련된 생물학적 활성을 나타내는 임의의 인자 IX(FIX), 인자 VIII(FVIII), 인자 VIIa(FVIIa), 폰빌레브란트인자(VWF), 인자 FV(FV), 인자 X(FX), 인자 XII(FXII), 트롬빈(FII), 단백질 C, 단백질 S, tPA, PAI-1, 조직 인자(TF) 및 ADAMTS 13 프로테아제를 지칭한다.
혈액 응고 캐스케이드는 3가지 별개의 부문: 내인성, 외인성 및 공통 경로로 나뉘어진다(Schenone et al., Curr Opin Hematol. 2004;11:272-7). 캐스케이드는 일련의 세린 프로테아제 효소(효소원) 및 단백질 보조인자를 수반한다. 필요하다면, 불활성 효소원 전구체는 활성 형태로 전환되는데, 이는 결과적으로 캐스케이드에서 다음 효소로 전환된다.
내인성 경로는 VIII, IX, X, XI 및 XII의 응고 인자를 필요로 한다. 내인성 경로의 개시는, 프레칼리크레인, 고분자량 키니노겐, 인자 XI(FXI) 및 인자 XII(FXII)가 음으로 하전된 표면에 노출될 때 일어난다. 또한 혈소판으로부터 분비된 칼슘 이온 및 인지질이 필요하다.
혈관의 내강이 손상될 때, 외인성 경로가 개시된다. 막 글라이코단백질 조직 인자는 노출된 다음, 순환 인자 VII(FVII)에 그리고 그의 활성화된 형태 FVIIa의 적은 사전존재하는 양에 결합된다. 이 결합은 FVII의 FVIIa로의 완전환 전환 및 후속적으로, 칼슘 및 인지질의 존재에서, 인자 IX(FIX)의 인자 IXa(FIXa)로의 전환 및 인자 X(FX)의 인자 Xa(FXa)로의 전환을 용이하게 한다. FVIIa의 조직 인자와의 결합은 기질(FIX 및 FX)에 대한 FVII의 결합 부위를 더 근접하게 가져오는 것에 의해, 그리고 FVIIa의 효소적 활성을 개선시키는 구조적 변화를 유발하는 것에 의해 단백질 분해 활성을 증진시킨다.
FX의 활성화는 2가지 경로의 공통점이다. 인지질 및 칼슘과 마찬가지로, 인자 Va(FVa) 및 Xa는 프로트롬빈을 트롬빈(프로트롬비나제 복합체)으로 전환시킨 다음, 피브리노겐을 절단하여 피브린 단량체를 형성한다. 단량체는 중합되어 피브린 가닥을 형성한다. 인자 XIIIa(FXIIIa)는 이들 가닥을 다른 가닥에 공유적으로 결합시켜 강성 메쉬(mesh)를 형성한다.
FVII의 FVIIa로의 전환은 또한 트롬빈, FIXa, FXa, 인자 XIa(FXIa) 및 인자 XIIa(FXIIa)를 포함하는 다수의 프로테아제에 의해 촉매된다. 캐스케이드의 초기 단계의 저해를 위해, 조직 인자 경로 저해제는 FVIIa/조직 인자/FXa 산물 복합체를 표적화한다.
인자 VIIa
FVII(또한 안정한 인자 또는 프로컨버틴으로서 알려짐)는 지혈 및 응고에서 중심 역할을 하는 비타민 K-의존성 세린 프로테아제 글라이코단백질이다(Eigenbrot, Curr Protein Pept Sci. 2002;3:287-99).
FVII는 간에서 합성되고 48kD의 단일쇄 글라이코단백질로서 분비된다. FVII는 모든 비타민 K-의존성 세린 프로테아제 글라이코단백질과, 단백질과 지질막의 상호작용을 초래하는 9 내지 12개 잔기를 지니는 아미노-말단 감마-카복시글루탐산(Gla) 도메인, 카복시-말단 세린 프로테아제 도메인(촉매적 도메인), 및 조직 인자와의 상호작용을 매개하는 칼슘 이온 결합 부위를 함유하는 2개의 표피 성장 인자-유사 도메인으로 이루어진 유사한 단백질 도메인 구조를 공유한다. 감마-글루타밀 카복실라제는 분자의 아미노-말단 부분에서 Gla 잔기의 카복실화를 촉매한다. 카복실라제는 그의 작용을 위해 비타민 K의 환원 형태(이는 에폭사이드 형태로 산화됨)에 의존한다. 비타민 K 에폭사이드 환원효소는 비타민 K의 에폭사이드 형태를 다시 환원 형태로 전환시키는데 필요하다.
FVII의 주요 부분은 효소원 형태로 혈장 중에서 순환하고, 이 활성화 형태는 알기닌 152와 아이소류신 153 간의 펩타이드 결합의 절단을 야기한다. 얻어진 활성화된 FVIIa는 단일 이황화 결합(Cys 135 내지 Cys 262)을 통해 연결된 NH2-유래 경쇄(20kD) 및 COOH 말단-유래 중쇄(30kD)로 이루어진다. 경쇄는 막-결합 Gla 도메인을 함유하는 한편, 중쇄는 촉매적 도메인을 함유한다.
유전적 및 환경적 인자에 의해 결정된 FVII의 혈장 농도는 약 0.5㎎/㎖이다(Pinotti et al., Blood. 2000;95:3423-8). 상이한 FVII 유전자형은 평균 FVII 수준에서 몇 배의 차이를 초래할 수 있다. 혈장 FVII 수준은 건강한 여성에서 임신 동안 상승되고, 또한 연령에 따라 증가하며, 여성 및 고중성지방혈증을 지니는 사람에서 더 높다. FVII는 모든 응혈 촉진(procoagulant) 인자 중에서 가장 짧은 반감기(3 내지 6시간)를 가진다. FVIIa의 평균 혈장 농도는 건강한 개체에서 3.6ng/㎖이고, FVIIa의 순환 반감기는 다른 응고 인자에 비해 상대적으로 길다(2.5시간).
유전성 FVII 결핍은 희귀한 상염색체 열성 출혈 장애이되, 유병률은 일반적인 집단에서 500,000명의 사람 당 1명의 경우인 것으로 추정된다(Acharya et al., J Thromb Haemost. 2004;2248-56). 저해제로부터의 후천성 FVII 결핍은 또한 매우 드물다. 세팔로스포린, 페니실린 및 경구 항응고제와 같은 약물과 관련되어 생기는 결핍을 지니는 사례가 보고되었다. 더 나아가, 후천성 FVII 결핍은 골수종, 패혈증, 재생불량성 빈혈, 자발적으로, 또는 인터류킨-2 및 항흉선세포 글로불린 요법을 이용하는 골수종, 패혈증, 재생불량성 빈혈과 같은 다른 병태에 의해 생기는 것으로 보고되었다.
기준 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열은, 예를 들어, 게놈 서열에 대해 젠뱅크 등록번호 J02933, cDNA에 대해 M13232(Hagen et al. PNAS 1986; 83: 2412-6), 및 폴리펩타이드 서열에 대해 P08709(본 명세서에 그 전문이 참조로서 포함됨)를 포함한다. FVII의 다양한 폴리형태는, 예를 들어 Sabater-Lleal 등(Hum Genet. 2006; 118:741-51)에 기재되어 있다(본 명세서에 그 전문이 참조로서 포함됨).
인자 IX
FIX는 칼슘 이온, 인지질 및 FVIIIa의 존재에서 FX를 그의 활성 형태로 전환시킴으로써 혈액 응고의 내인성 경로에 참여하는 비타민 K-의존성 혈장 단백질이다. FIX의 우세한 촉매적 능력은 FX 내에서 특정 알기닌-아이소류신 결합에 대해 특이성을 지니는 세린 프로테아제로서이다. FIX의 활성화는 하나 이상의 이황화 결합에 의해 보유되는 2개의 쇄를 포함하는 활성화된 FIX 분자를 생성하도록 FIX로부터 활성화 펩타이드를 절단시키는 FXIa에 의해 일어난다. FIX에서의 결합은 열성 X-결합 혈우병 B의 원인이다.
혈우병 A 및 B는 각각 FVIII 및 FIX 폴리펩타이드에서의 결핍을 특징으로 하는 유전병이다. 결핍의 근본적인 원인은 빈번하게는 FVIII 및 FIX 유전자에서의 돌연변이의 결과이며, 이들 둘 다 X 염색체 상에 위치된다. 혈우병에 대한 전통적인 요법은 종종 정상 개체로부터의 풀링(pooled) 혈장 또는 반정제된 응고 단백질의 정맥내 투여이다. 이들 제제는 병원성 작용제 또는 바이러스, 예컨대 감염성 프라이온, HIV, 파보바이러스, A형 간염 및 C형 간염에 의해 오염될 수 있다. 따라서, 인간 혈청의 사용을 필요로 하지 않는 치료제에 대한 긴급한 필요가 있다.
FIX 활성에서의 감소 수준은 혈우병 B의 중증도에 직접 비례한다. 혈우병 B의 현재 치료는 혈장-유래 또는 재조합체 FIX에 의한 미싱 단백질의 대체(소위 FIX 치환 또는 대체 치료 또는 요법)로 이루어진다.
FIX의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열은, 예를 들어 미국 특허 제6,531,298호 및 도 1(서열번호 1)에서의 UniProtKB/Swiss-Prot 등록번호 P00740에서 찾을 수 있다.
인자 VIII
응고 인자 VIII(FVIII)는 매우 저농도로 혈장에서 순환하며, 폰빌레브란트인자(VWF)에 비공유적으로 결합된다. 지혈 동안, FVIII는 VWF로부터 분리되고, 칼슘 및 인지질 또는 세포막의 존재에서 활성화 속도를 증진시킴으로써 활성화된 인자 IX(FIXa)-매개 FX 활성화에 대한 보조인자로서 작용한다.
FVIII은 도메인 구조 A1-A2-B-A3-C1-C2를 지니는 대략 270 내지 330kD의 단일쇄 전구체로서 합성된다. 혈장(예를 들어, "혈장-유래" 또는 "혈장의")으로부터 정제될 때, FVIII은 중쇄(A1-A2-B) 및 경쇄(A3-C1-C2)로 구성된다. 경쇄의 분자량은 80kD인 반면, B 도메인 내에서의 단백질 분해에 기인하여, 중쇄는 90 내지 220kD의 범위에 있다.
FVIII은 또한 출혈 장애에서 치료적 사용을 위한 재조합체 단백질로서 합성된다. 다양한 시험관내 분석은 치료적 의약으로서 재조합체 FVIII(rFVIII)의 잠재적 효능을 결정하도록 고안되었다. 이들 분석은 내인성 FVIII의 생체내 효과를 모방한다. FVIII의 시험관내 트롬빈 처리는 시험관내 분석에서 측정된 바와 같이 그의 응혈 촉진 활성의 빠른 증가 및 후속적 감소를 초래한다. 이 활성화 및 불활성화는 FVIII에서 상이한 결합 에피토프의 이용가능성을 변경시키는, 예를 들어 VWF로부터 FVIII를 해리시키면서 특정 단클론성 항체에 대한 결합 능력을 변경시키는, 중쇄와 경쇄 둘 다에서 특이적 제한 단백질 분해와 동시에 일어난다.
FVIII의 결여 또는 기능장애는 가장 빈번한 출혈 장애인 혈우병 A와 관련된다. 혈우병 A의 관리를 위한 선택 치료는 혈장 유래 또는 rFVIII 농축물에 의한 대체 요법이다. FVIII 수준이 1% 미만인 중증의 혈우병 A를 지니는 환자는 일반적으로 용량 간에 1% 초과의 FVIII를 유지할 목적으로 예방 요법이 행해진다. 순환에서 다양한 FVIII 산물의 평균 반감기를 고려하면, 이 결과는 보통 1주에 2 내지 3회 주어짐으로써 달성될 수 있다.
기준 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열은, 예를 들어, UniProtKB/Swiss-Prot P00451(FA8_인간); 문헌[itschier J et al., Characterization of the human Factor VIII gene, Nature, 312(5992): 326-30 (1984); Vehar GH et al., Structure of human Factor VIII, Nature, 312(5992):337-42 (1984); Thompson AR. Structure and Function of the Factor VIII gene and protein, Semin Thromb Hemost, 2003:29;11-29 (2002)]을 포함한다.
폰빌레브란트인자
폰빌레브란트인자(VWF)는 크기가 약 500 내지 20,000kD의 범위에 있는 일련의 다합체로서 혈장 중에서 순환하는 글라이코단백질이다. VWF의 다합체 형태는 이황화 결합에 의해 함께 연결된 250kD 폴리펩타이드 서브유닛으로 구성된다. VWF는 손상된 혈관벽의 하위-내피에 대한 초기 혈소판 부착을 매개한다. 더 큰 다합체만이 지혈 활성을 나타낸다. 내피 세포는 VWF의 큰 중합체 형태를 분비하며, 저분자량(저분자량 VWF)를 갖는 VWF의 해당 형태는 단백질 분해 절단으로부터 생기는 것으로 추정된다. 분자량이 큰 다합체는 내피세포의 바이벨-펠라드소체(Weibel-Pallade body)에 저장되며, 자극시 유리된다.
VWF는 큰 정도의 반복 도메인으로 이루어진 프레프로-VWF로서 내피 세포 및 거핵구에 의해 합성된다. 신호 펩타이드의 절단 시, 프로-VWF는 그의 C-말단 영역에서 이황화 결합을 통해 이합체화한다. 다이머는 다합체화를 위한 프로토머로서 작용하는데, 이는 유리 단부 말단 간의 이황화 결합에 의해 지배된다. 다합체에 대한 조립 다음에 프로펩타이드 서열의 단백질이 분해 제거된다(Leyte et al., Biochem. J. 274 (1991), 257-261).
VWF의 클로닝된 cDNA로부터 예측된 1차 번역 산물은 2813-잔기 전구체 폴리펩타이드(프레프로-VWF)이다. 프레프로-VWF는 22개 아미노산 단일 펩타이드 및 741개 아미노산 프로펩타이드로 이루어지며, 성숙 VWF는 2050개 아미노산을 포함한다(Ruggeri Z.A., and Ware, J., FASEB J., 308-316 (1993).
VWF에서의 결함은 폴빌레브란트병(VWD)에 대한 원인인데, 이는 덜 알려진 출혈 표현형이다. VWD 3형은 가장 중증의 형태인데, 이때 VWF는 완전히 상실되며, VWD 1형은 VWF의 정량적 손실에 관한 것이고, 그의 표현형은 매우 온화할 수 있다. VWD 2형은 VWF의 정량적 결함에 관한 것이며, VWD 3형만큼 중증일 수 있다. VWD 2형은 다수의 하위 형태를 가지며, 일부는 고분자량 다합체의 손실 또는 감소와 관련된다. 폴빌레브란트병 2a형(VWD-2A)은 중간체와 거대 다합체 둘 다의 손실을 특징으로 한다. VWD-2B는 가장 큰 분자량의 다합체의 손실을 특징으로 한다. VWF와 관련된 다른 질병 및 장애는 당업계에 공지되어 있다.
프레프로-VWF의 폴리뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 각각 젠뱅크 등록번호 NM_000552 및 NP_000543에서 입수가능하다.
본 발명에 따른 다른 혈액응고 단백질은 당업계에서, 예를 들어 문헌[Mann KG, Thromb Haemost, 1999;82:165-74]에 기재되어 있다.
A. 폴리펩타이드
일 양태에서, 본 발명의 출발 물질은 단백질 또는 폴리펩타이드이다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 용어 치료적 단백질은 치료적 단백질과 관련된 생물학적 활성을 나타내는 임의의 치료적 단백질 분자를 지칭한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 치료적 단백질 분자는 전장 단백질이다.
상정되는 치료적 단백질 분자는 전장 단백질, 전장 단백질의 전구체, 전장 단백질 생물학적으로 활성인 서브유닛 또는 단편뿐만 아니라 임의의 이들 치료적 단백질의 생물학적으로 활성인 유도체를 포함한다. 따라서, 치료적 단백질는 (1) 본 명세서에 기재된 기준 핵산 또는 아미노산 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드에 대해 적어도 약 25, 약 50, 약 100, 약 200, 약 300, 약 400개 이상의 아미노산에서의 영역에 걸쳐, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 이상의 아미노산 서열 또는 더 큰 아미노산 서열 동일성을 가지는 것; 및/또는 (2) 본 명세서에 기재된 기준 아미노산 서열, 이의 면역원성 단편 및/또는 이의 보존적으로 변형된 변이체를 포함하는 면역원에 대해 만들어진 항체, 예를 들어, 다클론성 또는 단클론성 항체에 특이적으로 결합하는 것을 포함한다.
본 발명에 따르면, 용어 "재조합체 치료적 단백질"은 재조합 DNA 기법을 통해 얻어진 임의의 치료적 단백질을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 용어는 본 명세서에 기재된 바와 같은 단백질을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, "내인성 치료적 단백질"은 치료를 받도록 의도되는 포유류로부터 유래하는 치료적 단백질을 포함한다. 상기 용어는 또한 상기 포유류에 존재하는 이식유전자 또는 임의의 다른 외래 DNA로부터 전사된 치료적 단백질을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은, "외인성 치료적 단백질"은 치료를 받을 것으로 의도되는 포유로로부터 유래되지 않는 혈액 응고 단백질을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, "혈장-유래 혈액 응고 단백질 " 또는 "혈장의"는 응고 경로에 참여하는 특성을 갖는 포유류로부터 얻어진 혈액에서 발견되는 모든 단백질 형태를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "생물학적으로 활성인 유도체" 또는 "생물학적으로 활성 변이체"는 상기 분자의 실질적으로 동일한 기능적 및/또는 생물학적 특성, 예컨대 결합 특성, 및/또는 동일 구조적 기반, 예컨대 펩타이드 백본 또는 염기성 중합체 단위를 갖는 분자의 임의의 유도체 또는 변이체를 포함한다.
"유사체," 예컨대 "변이체" 또는 "유도체"는, 특정 예에서 자연적으로 생기는 분자에 대해 정도가 다르기는 하지만, 구조가 실질적으로 유사하고, 동일한 생물학적 활성을 갖는 화합물이다. 예를 들어, 폴리펩타이드 변이체는 실질적으로 유사한 구조를 공유하고 기준 폴리펩타이드와 동일한 생물학적 활성을 갖는 폴리펩타이드를 지칭한다. 변이체 또는 유사체는 (i) 폴리펩타이드의 하나 이상의 말단 및/또는 자연적으로 생기는 폴리펩타이드 서열의 하나 이상의 내부 영역(예를 들어, 단편)에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실, (ii) 폴리펩타이드의 하나 이상의 말단(전형적으로, "첨가" 또는 "융합") 및/또는 자연적으로 생기는 폴리펩타이드 서열의 하나 이상의 내부 영역(전형적으로 "삽입")에서 하나 이상의 아미노산의 삽입 또는 첨가, 또는 (iii) 자연적으로 생기는 폴리펩타이드 서열에서 다른 아미노산에 대한 하나 이상의 아미노산의 치환을 수반하는 하나 이상의 돌연변이에 기반하여, 유사체가 유래된 자연적으로 생기는 폴리펩타이드에 비해 아미노산 서열의 조성물은 다르다. 예로서, "유도체"는 유사체의 유형이며, 예를 들어 화학적으로 변형된 기준 폴리펩타이드와 동일 또는 실질적으로 유사한 구조를 공유하는 폴리펩타이드를 지칭한다.
변이체 폴리펩타이드는 유사체 폴리펩타이드의 유형이며, 삽입 변이체를 포함하되, 하나 이상의 아미노산 잔기는 본 발명의 치료적 단백질 아미노산 서열에 첨가된다. 삽입은 단백질의 말단 중 하나 또는 둘 다에 위치될 수 있고/있거나, 치료적 단백질 아미노산 서열의 내부 영역 내에 위치될 수 있다. 말단 중 하나 또는 둘 다에서 추가적인 잔기를 지니는 삽입 변이체는, 예를 들어 아미노산 태그 또는 다른 아미노산 표지를 포함하는 융합 단백질 및 단백질을 포함한다. 일 양태에서, 특히 분자가 이콜라이(E. coli)와 같은 박테리아 세포에서 재조합적으로 발현될 때, 혈액 응고 단백질 분자는 선택적으로 N-말단 Met을 함유한다.
결실 변이체에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 치료적 단백질 폴리펩타이드 내의 하나 이상의 아미노산 잔기가 제거된다. 결실은 치료적 단백질 폴리펩타이드의 말단 중 하나 또는 둘 다에서, 및/또는 치료적 단백질 아미노산 서열 내의 하나 이상의 잔기의 제거에 의해 달성될 수 있다. 따라서, 결실 변이체는 치료적 단백질 폴리펩타이드 서열의 단편을 포함한다.
치환 변이체에서, 치료적 단백질 폴리펩타이드의 하나 이상의 아미노산 잔기는 제거되며, 대안의 잔기로 대체된다. 일 양태에서, 치환은 천연에서 보존적이며, 이 유형의 보존적 치환은 당업계에 잘 공지되어 있다. 대안적으로, 본 발명은 또한 비보존적인 치환을 포함한다. 예시적인 보존적 치환은 레닌저(Lehninger)[Biochemistry, 2nd Edition; Worth Publishers, Inc., New York (1975), pp.71-77]에 기재되어 있으며, 바로 밑에서 제시된다.
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대안적으로, 예시적인 보존적 치환은 바로 밑에 제시한다.
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B. 폴리뉴클레오타이드
본 발명의 치료적 단백질을 암호화하는 핵산은, 예를 들어 유전자, 프레-mRNA, mRNA, cDNA, 다형성 변이체, 대립유전자, 합성 및 자연적으로 생기는 돌연변이체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 발명의 치료적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드은 또한 (1) 본 명세서에 기재된 바와 같은 기준 아미노산 서열을 암호화하는 핵산, 및 이의 보존적으로 변형된 변이체에 대해 엄격한 혼성화 조건 하에서 특이적으로 혼성화하는 것; (2) 본 명세서에 기재된 기준 핵산 서열에 대해 적어도 약 25, 약 50, 약 100, 약 150, 약 200, 약 250, 약 500, 약 1000 또는 그 이상의 뉴클레오타이드에서의 영역에 걸쳐(성숙 단백질의 1218 뉴클레오타이드의 전장 서열까지) 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예시적인 "엄격한 혼성화" 조건은 42℃, 50% 폼아마이드 중에서, 5X SSC, 20mM Na
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PO4, pH 6.8에서의 혼성화; 및 55℃에서 30분 동안의 1X SSC 세척을 포함한다. 이들 예시적인 조건에서의 변화는 혼성화되는 서열의 길이 및 GC 뉴클레오타이드에 기반하여 만들어질 수 있는 것이 이해된다. 당업계에서 화학적 표준은 적절한 혼성화 조건을 결정하는데 적절하다. 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Second ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) §§ 9.47-9.51] 참조.
"자연적으로-생기는" 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열은 영장류, 예를 들어, 인간; 설치류, 예를 들어 래트, 마우스, 햄스터; 소, 돼지, 말, 양 또는 임의의 포유류를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 포유류로부터 전형적으로 유래된다. 본 발명의 핵산 및 단백질은 재조합체 분자(예를 들어, 이종성 및 야생형 서열 또는 이의 변이체를 암호화, 또는 비-자연적으로 생김)일 수 있다.
C. 치료적 단백질의 생성
치료적 단백질의 생성은 (i) 유전적 조작에 의해 재조합체 DNA의 생성하는 단계, (ii) 예를 들어 제한 없이, 형질감염, 전기천공법 또는 미세주입법에 의해 원핵세포 또는 진핵세포 내로 재조합체 DNA를 도입하는 단계, (iii) 상기 형질전환 세포를 배양하는 단계, (iv) 치료적 단백질을, 예를 들어, 구성적으로 또는 유도 시 발현시키는 단계, 및 (v) 상기 혈액응고 단백질을, 예를 들어, 배양 배지로부터 또는 형질전환 세포의 채취에 의해 단리시켜 정제된 치료적 단백질을 얻는 단계를 위해 임의의 공지된 방법을 포함한다.
다른 양태에서, 치료적 단백질은 약학적으로 허용가능한 혈액 응고 단백질 분자를 생성하는 것을 특징으로 하는 적합한 원핵 또는 진핵 숙주 시스템에서의 발현에 의해 생성된다. 진핵세포의 예는 포유류 세포, 예컨대 CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep 및 HepG2이다.
치료적 단백질의 제조를 위해 매우 다양한 벡터가 사용되며, 진핵 및 원핵세포 발현 벡터로부터 선택된다. 원핵세포 발현을 위한 벡터의 예는, 제한 없이, pRSET, pET 및 pBAD와 같은 플라스미드를 포함하되, 원핵세포 발현 벡터에서 사용되는 프로모터는 lac, trc, trp, recA 또는 araBAD 중 하나 이상을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 진핵세포 발현을 위한 벡터의 예는: (i) 효모에서 발현을 위해, 제한 없이, AOX1, GAP, GAL1, 또는 AUG1와 같은 프로모터를 사용하는, 제한 없이, pAO, pPIC, pYES 또는 pMET와 같은 벡터; (ii) 곤충 세포에서 발현을 위해, 제한 없이 PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64 또는 polh와 같은 프로모터를 사용하는, 제한 없이 pMT, pAc5, pIB, pMIB 또는 pBAC와 같은 벡터, 및 (iii) 포유류 세포에서 발현을 위해, 제한 없이 CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV 및 β-액틴과 같은 프로모터를 사용하여, 제한 없이 pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, 또는 pBPV와 같은 벡터, 및 일 양태에서, 제한 없이 백시니아 바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 또는 레트로바이러스와 같은 바이러스 시스템으로부터 유래된 벡터를 포함한다.
D. 투여
일 실시형태에서, 본 발명의 컨쥬게이트된 치료적 단백질은 정맥내, 근육내 또는 복강내 주사와 같은 주사에 의해 투여될 수 있다.
인간 또는 시험 동물에 대해 본 발명의 컨쥬게이트된 치료적 단백질을 포함하는 조성물을 투여하기 위해, 일 양태에서, 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 용어 "약제학적으로" 또는 "약학적으로 허용가능한"은 응집 및 절단 산물과 같이 안정하고 단백질 분해를 저해하는 분자 독립체 및 조성물을 지칭하며, 추가로 이하에 기재된 바와 같은 잘 공지된 경로를 사용하여 투여될 때 알레르기 또는 다른 유해반응을 만들지 않는다. "약제학적으로 허용가능한 담체"는 상기 개시된 작용제를 포함하는, 임의의 및 모든 임상적으로 유용한 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, "유효량"은 질병 또는 장애를 치료하는데 또는 질병 또는 장애의 증상을 개선시키는데 적합한 용량을 포함한다. 일 실시형태에서, "유효량"은 본 명세서에 기재된 바와 같은 출혈 장애가 있는 포유류를 치료하는데 적합한 용량을 포함한다.
조성물은 경구로, 국소적으로, 경피로, 비경구적으로, 흡입 스프레이에 의해, 질내로, 직장으로 또는 두개내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 비경구는 피하 주사, 정맥내, 근육내, 낭내 주사 또는 주입 기법을 포함한다. 특정 부위에서 정맥내, 진피내, 근육내, 유방내, 복강내, 척추강내, 안구후부, 폐내 주사 및 수술적 이식에 의한 투여가 마찬가지로 상정된다. 일반적으로, 조성물은 본질적으로 파이로젠뿐만 아닐 수용인에게 해로울 수 있는 다른 불순물이 없다.
조성물의 단일 또는 다수 투여는 치료하는 의사에 의해 선택되는 용량 수준 및 패턴에 의해 수행될 수 있다. 질병의 예방 또는 치료를 위해, 적절한 투약량은 상기 기재한 바와 같이 치료되어야 하는 질병의 유형, 질병의 중증도 및 과정, 약물이 예방적 또는 치료적 목적을 위해 투여되는지 여부, 선행 요법, 환자의 임상 이력 및 약물에 대한 반응 및 담당의사의 판단에 의존할 것이다.
본 발명은 또한 본 명세서에 정의된 바와 같은 유효량의 컨쥬게이트된 치료적 단백질을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 염, 완충제 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 상기-정의된 출혈 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 용액 또는 동결건조 생성물일 수 있다. 약제학적 조성물의 용액에 임의의 적합한 동결건조 과정이 실시될 수 있다.
추가 양태로서, 본 발명은 대상체에 투여를 위해 조성물의 사용을 용이하게 하는 방식으로 본 발명의 조성물을 포함하는 키트를 포함한다. 일 실시형태에서, 이러한 키트는 본 명세서에 기재된 화합물 또는 조성물(예를 들어, 컨쥬게이트된 치료적 단백질을 포함하는 조성물)은 용기에 라벨이 부착된 채로 밀봉 병 또는 그릇와 같은 용기에 포함되거나 또는 상기 방법을 실행함에 있어 화합물 또는 조성물의 사용을 기재하는 패키지에 포함된다. 일 실시형태에서, 키트는 컨쥬게이트된 치료적 단백질을 포함하는 조성물을 갖는 제1 용기 및 제1 용기 내 조성물에 대해 생리적으로 허용가능한 재구성 용액을 갖는 제2 용기를 포함한다. 일 양태에서, 화합물 또는 조성물은 단위 투약 형태로 포장된다. 키트는 구체적 투여 경로에 따라 조성물의 투여에 적합한 장치를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 키트는 치료적 단백질 또는 펩타이드 조성물의 용도를 기재하는 라벨을 포함한다.
수용성 중합체
일 양태에서, 제공된 치료적 단백질 유도체(즉, 컨쥬게이트된 치료적 단백질) 분자는 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 분지된 PEG, 폴리시알산(PSA), 하이드록시알킬 전분(HAS), 하이드록실에틸 전분(HES), 탄수화물, 다당류, 풀루란, 키토산, 하이알루론산, 황산콘드로이틴, 황산더마탄, 전분, 덱스트란, 카복시메틸-덱스트란, 폴리알킬렌 옥사이드(PAO), 폴리알킬렌 글라이콜(PAG), 폴리프로필렌 글라이콜(PPG) 폴리옥사졸린, 폴리 아크릴로일모르폴린, 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리카복실레이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리에틸렌-코-말레산 무수물, 폴리스타이렌-코-말레산 무수물, 폴리(1-하이드록시메틸에틸렌 하이드록시메틸포말)(PHF), 2-메트아크릴로일옥시-2'-에틸트라이메틸암모늄포스페이트(MPC)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 수용성 중합체에 결합된다. 본 발명의 일 실시형태에서, 수용성 중합체는 분자량 범위가 350 내지 120,000, 500 내지 100,000,1000 내지 80,000, 1500 내지 60,000, 2,000 내지 45,000Da, 3,000 내지 35,000Da 및 5,000 내지 25,000Da인 시알산 분자로 이루어진다. 수용성 중합체의 결합은 단백질에 직접 결합에 의해 또는 링커 분자를 통해 수행될 수 있다. 화학적 링커의 일 예는 탄수화물-선택적 하이드라자이드 및 설프하이드릴-반응성 말레이미드기를 함유하는 MBPH(4-[4-N-말레이미도페닐]부티르산 하이드라자이드)이다(Chamow et al., J Biol Chem 1992;267:15916-22). 다른 예시적이고 바람직한 링커는 이하에 기재된다.
일 실시형태에서, 유도체는 천연 치료적 단백질의 전체 기능적 활성을 보유하며, 천연 치료적 단백질 산물에 비해 연장된 생체내 반감기를 제공한다. 다른 실시형태에서, 유도체는 천연 혈액응고 단백질에 비해 적어도 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44. 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56,57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140 또는 150퍼센트(%)의 생물학적 활성을 보유한다. 관련 양태에서, 유도체 및 천연 혈액 응고 단백질의 생물학적 활성은 색원체 활성 대 혈액 응고 인자 항원 값의 비(혈액 응고 인자:Chr: 혈액 응고 인자:Ag)에 의해 결정된다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 작제물의 반감기는 천연 치료적 단백질의 생체내 반감기에 비해 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10배만큼 감소되거나 또는 증가된다.
A. 시알산 및 PSA
PSA는 N-아세틸뉴라민산의 중합체(일반적으로 동종 중합체)로 이루어진다. 2차 아미노기는 정상적으로 아세틸기를 보유하지만, 그 대신에 글라이콜릴기를 보유할 수도 있다. 하이드록실기 상에서 가능한 치환체는 아세틸, 락틸, 에틸, 설페이트 및 포스페이트기를 포함한다.
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시알산(N-아세틸뉴라민산)의 구조
PSA 및 mPSA는 일반적으로 2,8- 또는 2,9- 글라이코사이드 결합 또는 이들의 조합(예를 들어, 교번의 2,8- 및 2,9- 결합)에 의해 연결된 N-아세틸뉴라민산 모이어티로 본질적으로 이루어진 선형 중합체를 포함한다. 특히 바람직한 PSA 및 mPSA에서, 글라이코사이드 결합은 α-2,8이다. 이러한 PSA 및 mPSA는 콜로민산으로부터 편리하게 유래되고, 본 명세서에서 "CA" 및 "mCA"로서 지칭된다. 전형적인 PSA 및 mPSA는 적어도 2, 바람직하게는 적어도 5, 더 바람직하게는 적어도 10 및 가장 바람직하게는 적어도 20개의 N-아세틸뉴라민산 모이어티를 포함한다. 따라서, 그들은 2 내지 300개의 N-아세틸뉴라민산 모이어티, 바람직하게는 5 내지 200개의 N-아세틸뉴라민산 모이어티, 또는 가장 바람직하게는 10 내지 100개의 N-아세틸뉴라민산 모이어티를 포함할 수 있다. PSA 및 CA는 바람직하게는 N-아세틸뉴라민산 이외의 당 모이어티가 본질적으로 없다. 따라서, PSA 및 CA는 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95% 및 가장 바람직하게는 적어도 98% N-아세틸뉴라민산 모이어티를 포함한다.
PSA 및 CA가 N-아세틸뉴라민산 이외의 모이어티를 포함하는 경우(예를 들어, mPSAS 및 mCA에서와 같이), 이들은 바람직하게는 중합체 쇄의 말단 중 하나 또는 둘 다에 위치된다. 이러한 "다른" 모이어티는 산화 또는 환원에 의해, 예를 들어 말단의 N-아세틸뉴라민산 모이어티로부터 유래된 모이어티일 수 있다.
예를 들어, WO-A-0187922호는 비환원성 말단의 N-아세틸뉴라민산 단위가 과요오드산나트륨과의 반응에 의해 알데하이드기로 전환되는 mPSA 및 mCA를 기재한다. 추가적으로, WO 2005/016974호는 환원성 말단의 N-아세틸뉴라민산 단위에서 고리를 환원적으로 개방하도록 N-아세틸뉴라민산 단위를 환원시킴으로써, 인접한 다이올기가 형성된 다음 산화시켜 인접한 다이올기를 알데하이드기로 전환시키는, mPSA 및 mCA를 기재한다.
시알산풍부 글라이코단백질은 인간 및 다른 유기체에서 셀렉틴을 결합시킨다. 그들은 인간 인플루엔자 감염에서 중요한 역할을 한다. 예를 들어, 시알산은 만노스-결합 렉틴으로부터 숙주 세포 또는 박테리아의 표면 상의 만노스 항원을 숨길 수 있다. 이는 보체의 활성화를 방지한다. 시알산은 또한 끝에서 두 번째의 갈락토스 잔기를 숨기며, 따라서 간 실질세포 상의 갈락토스 수용체에 의해 글라이코단백질의 빠른 클리어런스를 방지한다.
Figure 112021088906918-pat00039
콜로민산(N-아세틸뉴라민산의 동종 중합체)의 구조
콜로민산(PSA의 서브-클래스)은 α(2→8) 케토시드 결합을 지니는 N-아세틸뉴라민산(NANA)의 동종 중합체이며, 그 중에서도, K1 항원을 소유하는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)의 특정 균주에 의해 생성된다. 콜로민산은 다수의 생리학적 기능을 가진다. 그들은 약물 및 화장료용 원재료로서 중요하다.
폴리시알릴화되고 미변형된 아스파라기나제에 의한 생체내 비교 연구는 폴리시알산화가 효소의 반감기를 증가시켰다는 것을 나타내었다(Fernandes and Gregoriadis, Biochimica Biophysica Acta 1341: 26-34, 1997).
본 명세서에 사용되는 바와 같은, "시알산 모이어티"는 수용액 또는 현탁액 중에서 가용성인 시알산 단량체 또는 중합체("다당류")를 포함하고, 약제학적으로 유효량으로 PSA-혈액 응고 단백질 컨쥬게이트의 투여 시 포유류에 대해 부작용과 같은 부정적인 영향이 거의 없거나 또는 전혀 없다. 중합체는, 일 양태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 또는 500개 시알산 단위를 갖는 것으로 특성규명된다. 특정 양태에서, 상이한 시알산 단위는 쇄에서 조합된다.
본 발명의 일 실시형태에서, 다당류 화합물의 시알산 부분은 고도로 친수성이고, 다른 실시형태에서 전체 화합물은 고도로 친수성이다. 친수성은 하이드록실기뿐만 아니라 시알산 단위의 현수 카복실기에 의해 부여된다. 다당류 단위는 다른 작용기, 예컨대 아민, 하이드록실 또는 설페이트기 또는 이들의 조합을 함유할 수 있다. 이들 기는 자연적으로-생기는 다당류 화합물 상에 존재할 수 있거나, 또는 유도체 다당류 화합물에 도입된다.
자연적으로 생기는 중합체 PSA는 넓은 크기 분포(예를 들어, 시그마 C-5762) 및 높은 다분산성(polydispersity: PD)을 나타내는 다분산 제제로서 이용가능하다. 다당류는 보통 엔도톡신을 공동정제시키는 것의 내재된 위험을 옮기는 박테리아에서 생성되기 때문에, 긴 시알산 중합체 쇄의 정제는 증가된 엔도톡신 함량의 가능성을 상승시킬 수 있다. 1 내지 4개의 시알산 단위를 지니는 짧은 PSA 분자가 또한 합성적으로 제조될 수 있고(Kang SH et al., Chem Commun. 2000;227-8; Ress DK and Linhardt RJ, Current Organic Synthesis. 2004;1:31-46), 이에 의해 높은 엔도톡신 수준의 위험을 최소화한다. 그러나 좁은 분포 및 낮은 다분산성을 지니고, 또한 엔도톡신이 없는 PSA 제제가 이제 제조될 수 있다. 본 발명에서 특정 사용을 위한 다당류 화합물은, 일 양태에서, 박테리아에 의해 생성되는 것이다. 이들 자연적으로-생기는 다당류 중 일부는 글라이코지질로서 공지되어 있다. 일 실시형태에서, 다당류 화합물 말단의 갈락토스 단위가 실질적으로 없다.
B. 폴리에틸렌 글라이콜(PEG) 및 페길화
특정 양태에서, 치료적 단백질은 임의의 다양한 화학적 방법에 의해 수용성 중합체에 컨쥬게이트된다(Roberts JM et al., Advan Drug Delivery Rev 2002;54:459-76). 예를 들어, 일 실시형태에서 치료적 단백질은 N-하이드록시숙신이미드(NHS) 에스터를 사용하여 단백질의 유리 아미노기에 대한 PEG의 컨쥬게이션에 의해 변형된다. 다른 실시형태에서, 수용성 중합체, 예를 들어 PEG는 말레이미드 화학을 사용하여 유리 SH에 결합되거나 또는 산화 후에 치료적 단백질의 탄수화물 모이어티에 PEG 하이드라자이드 또는 PEG 아민이 결합된다.
컨쥬게이션은 일 양태에서, 안정한 결합의 형성 하에서 치료적 단백질에 수용성 중합체의 직접 결합(또는 링커 시스템을 통한 결합)에 의해 수행된다. 추가로 분해가능하거나, 방출가능하거나 또는 가수분해가능한 링커 시스템에 본 발명의 특정 양태에서 사용된다(Tsubery et al. J Biol Chem 2004;279:38118-24 / Greenwald et al., J Med Chem 1999;42:3657-67 / Zhao et al., Bioconj Chem 2006;17:341-51/WO2006/138572A2호/미국 특허 제7259224B2호/미국 특허 제7060259B2호).
본 발명의 일 실시형태에서, 치료적 단백질은 활성 N-하이드록시숙신이미드 에스터(NHS), 예컨대 숙신이미딜숙시네이트, 숙신이미딜글루타레이트 또는 숙신이미딜프로피오네이트를 함유하는 폴리에틸렌 글라이콜 유도체의 사용에 의해 리신 잔기를 통해 변형된다. 이들 유도체는 안정한 아마이드 결합을 형성함으로써 온화한 조건 하에 치료적 단백질의 리신 잔기와 반응한다. 본 발명의 일 실시형태에서, PEG 유도체의 쇄 길이는 5,000Da이다. 선형 및 분지된 구조를 포함하는, 500 내지 2,000Da, 2,000 내지 5,000Da, 5,000 초과 내지 10,000Da 또는 10,000 초과 내지 20,000Da 또는 20,000 초과 내지 150,000Da의 쇄 길이를 지니는 다른 PEG 유도체가 다양한 실시형태에서 사용된다.
아미노기의 페길화를 위한 대안의 방법은 우레탄 결합을 형성하는 것에 의한 PEG 카보네이트와의 화학적 컨쥬게이션, 또는 2차 아마이드 결합을 형성하는 환원성 아미노화에 의한 알데하이드 또는 케톤과의 반응이지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시형태에서, 치료적 단백질 분자는 상업적으로 입수가능한 PEG 유도체를 사용하여 화학적으로 변형된다. 대안의 양태에서 이들 PEG 유도체는 선형 또는 분지된 구조를 가진다. NHS기를 함유하는 PEG-유도체의 예는 이하에 열거된다.
다음의 PEG 유도체는 넥타 세러퓨틱스(Nektar Therapeutics)로부터 상업적으로 입수가능한 것의 비제한적 예이다(Huntsville, Ala.; www.nektar.com/PEG reagent catalog; 문헌[Nektar Advanced PEGylation, price list 2005-2006] 참조):
mPEG-숙신이미딜프로피오네이트(mPEG-SPA)
Figure 112021088906918-pat00040
mPEG-숙신이미딜α-메틸뷰타노에이트(mPEG-SMB)
Figure 112021088906918-pat00041
mPEG-CM-HBA-NHS(CM=카복시메틸; HBA=하이드록시 부티르산)
Figure 112021088906918-pat00042
분지된 PEG-유도체의 구조(넥타 세러퓨틱스):
분지된 PEG N-하이드록시숙신이미드(mPEG2-NHS)
Figure 112021088906918-pat00043
분지된 구조를 지니는 이 시약은 코즐로스키(Kozlowski) 등에 의해 더 상세하게 기재된다(BioDrugs 2001;5:419-29).
PEG 유도체의 다른 비제한적 예는 NOF 코포레이션(NOF Corporation)(일본 도쿄에 소재; www.nof.co.jp/english: Catalogue 2005 참조)로부터 상업적으로 입수가능한 것이다.
선형 PEG-유도체의 일반적 구조(NOF 코포레이션):
Figure 112021088906918-pat00044
Figure 112021088906918-pat00045
분지된 PEG-유도체의 구조(NOF 코포레이션): 2,3-비스(메틸폴리옥시에틸렌-옥시)-1-(1,5-다이옥소-5-숙신이미딜옥시, 펜틸옥시)프로판
Figure 112021088906918-pat00046
2,3-비스(메틸폴리옥시에틸렌-옥시)-1-(숙신이미딜카복시펜틸옥시)프로판
Figure 112021088906918-pat00047
이들 프로판 유도체는 1,2 치환 패턴을 지니는 글라이세롤 백본을 나타낸다. 본 발명에서, 1,3 치환을 지니는 글라이세롤 구조 또는 미국 특허 제2003/0143596A1호에 기재된 다른 분지된 구조에 기반한 분지된 PEG 유도체가 또한 상정된다.
츠베리(Tsubery) 등(J Biol Chem 2004;279:38118-24) 및 쉑터(Shechter) 등(WO04089280A3)에 의해 기재된 바와 같은 분해성(예를 들어 가수분해성) 링커를 지니는 PEG 유도체가 또한 상정된다.
놀랍게도, 본 발명의 페길화 치료 단백질은 연장된 생체내 반감기와 조합하여 기능성 활성을 나타낸다. 추가로, 페길화 rFVIII, FVIIa, FIX 또는 다른 혈액 응고 인자은 트롬빈 불활성화에 대해 더 저항하는 것으로 보인다.
C. 하이드록시알킬 전분(HAS) 및 하이드록실에틸 전분(HES)
본 발명의 다양한 실시형태에서, 치료적 단백질 분자는 하이드록시알킬 전분(HAS) 또는 하이드록실에틸 전분(HES) 또는 이의 유도체를 사용하여 화학적으로 변형된다.
HES는 자연적으로 생기는 아밀로펙틴의 유도체이며, 신체내에서 알파-아밀라제에 의해 분해된다. HES는 95중량%까지의 농도로 옥수수 전분 중에 존재하는 카보-하이드레이트 중합체 아밀로펙틴의 치환된 유도체이다. HES는 유리한 생물학적 특성을 나타내고, 혈액 용적 대체제로서 그리고 병원에서의 혈액희석 요법에서 사용된다(Sommermeyer et al., 1987, Krankenhauspharmazie, 8 (8), 271-278; 및 Weidler et al., 1991, Arzneim.-Forschung/Drug Res. g 419 494-498).
아밀로펙틴은 글루코스 모이어티로 이루어지되, 주요 쇄에서 알파-1,4- 글라이코사이드 결합이 존재하며, 분지 부위에서 알파-1,6-글라이코사이드 결합이 발견된다. 이 분자의 물리-화학적 특성은 글라이코사이드 결합의 유형에 의해 주로 결정된다. 금이 간(nicked) 알파-1,4-글라이코사이드 결합 때문에, 회전 당 약 6개의 글루코스-단량체를 지니는 나선 구조가 만들어진다. 중합체의 물리-화학적뿐만 아니라 생화학적 특성은 치환을 통해 변형될 수 있다. 하이드록시에틸기의 도입은 알칼린 하이드록시에틸화를 통해 달성될 수 있다. 반응 조건을 적합하게 함으로써, 하이드록시에틸화에 대하여 비치환 글루코스 모노머에서 각각의 하이드록실기의 상이한 반응성을 이용할 수 있다. 이런 사실 때문에, 당업자는 제한된 정도로 치환 패턴에 영향을 미칠 수 있다.
HAS는 적어도 하나의 하이드록시알킬기에 의해 치환된 전분 유도체를 지칭한다. 따라서, 용어 하이드록시알킬 전분은 말단의 탄수화물 모이어티가 하이드록시알킬기 R1, R2 및/또는 R3을 포함하는 경우의 화합물일 뿐만 아니라, 적어도 하나의 하이드록시기가 어디에서나 존재하는 화합물을 지칭하며, 말단의 탄수화물 모이어티에서 및/또는 전분 분자인 HAS'의 남은 부분에서 하이드록시알킬기 R1, R2 또는 R3에 의해 치환된다.
Figure 112021088906918-pat00048
알킬기는 적합하게 치환될 수 있는 선형 또는 분지된 알킬기일 수 있다. 바람직하게는, 하이드록시알킬기는 1 내지 10개의 탄소 원자, 더 바람직하게는 1 내지 6개의 탄소 원자, 더 바람직하게는 1 내지 4개의 탄소 원자, 및 훨씬 더 바람직하게는 2 내지 4개의 탄소 원자를 함유한다. 따라서 "하이드록시알킬 전분"은 바람직하게는 하이드록시에틸 전분, 하이드록시프로필 전분 및 하이드록시뷰틸 전분을 포함하되, 하이드록시에틸 전분 및 하이드록시프로필 전분이 특히 바람직하다.
2개 이상의 상이한 하이드록시알킬기를 포함하는 하이드록시알킬 전분이 또한 본 발명에 포함된다. HAS에 포함된 적어도 하나의 하이드록시알킬기는 2 이상의 하이드록시기를 함유할 수 있다. 일 실시형태에 따르면, HAS를 포함한 적어도 하나의 하이드록시알킬기는 하나의 하이드록시기를 함유한다.
용어 HAS는 또한 유도체를 포함하되, 알킬기는 일- 또는 다치환된다. 일 실시형태에서, 알킬기는 할로겐, 특히 불소로, 또는 아릴기로 치환되며, 단, HAS는 수 중에서 가용성으로 남아있다. 더 나아가, 하이드록시알킬기의 말단의 하이드록시기는 에스터화되거나 또는 에터화될 수 있다. HAS 유도체는 WO/2004/024776호에 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 참조로서 포함된다.
D. 부착 방법
치료적 단백질은 당업자에게 공지된 임의의 다양한 기법에 공유적으로 결합될 수 있다. 본 발명의 다양한 양태에서, 시알산 모이어티는, 예를 들어 본 명세서에 참조로서 포함되는 미국 특허 제4,356,170호에 기재되어 있는 방법에 의해 치료적 단백질, 예를 들어, FIX, FVIII, FVIIa 또는 VWF에 결합된다.
폴리펩타이드에 PSA를 결합시키기 위한 다른 기법은 또한 공지되어 있으며, 본 발명에 의해 상정된다. 예를 들어, 미국 특허 공개 제2007/0282096호는, 예를 들어 PSA의 단백질에 대한 아민 또는 하이드라자이드 유도체를 컨쥬게이팅을 기재한다. 추가로, 미국 특허 공개 제2007/0191597호는 환원 말단에서 기질(예를 들어, 단백질)과의 반응을 위한 알데하이드기를 함유하는 PSA 유도체를 기재한다. 이들 참고문헌은 그 전문이 참조로서 포함된다.
다양한 방법이 미국 특허 제5,846,951호(그 전문이 참조로서 포함됨)의 칼럼 7의 15번째줄 내지 칼럼 8의 5번째줄에 개시된다. 예시적인 기법은 혈액 응고 단백질 또는 다당류 중 하나의 카복실기와 혈액 응고 단백질 또는 다당류의 아민기 사이의 펩타이드 결합, 또는 혈액 응고 단백질 또는 다당류의 카복실기와 또는 치료적 단백질 또는 다당류의 하이드록실기 사이의 에스터 결합을 통한 결합을 포함한다. 치료적 단백질이 다당류 화합물에 공유적으로 결합되는 것에 의한 다른 결합은 시프 염기(Schiff base)를 통하며, 혈액 응고 단백질 상의 유리 아미노기는 과요오드산염 산화에 의해 다당류의 비환원말단에서 형성된 알데하이드기와 반응된다(Jennings HJ and Lugowski C, J Immunol. 1981;127:1011-8; Fernandes AI and Gregoriadis G, Biochim Biophys Acta. 1997;1341;26-34). 만들어진 시프 염기는, 일 양태에서 NaCNBH3 와 특이적 환원에 의해 안정화되어 2차 아민을 형성한다. 대안의 접근은 사전 산화 후에 NH4Cl과의 환원성 아미노화에 의해 PSA에서 말단의 유리 아미노기를 생성하는 것이다. 2작용성 시약은 2개의 아미노 또는 2개의 하이드록실기를 연결하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 아미노기를 함유하는 PSA는 BS3과 같은 시약(비스(설포숙신이미딜)수베레이트/일리노이주 락포드에 소재한 피어스(Pierce))을 이용하여 단백질의 아미노기에 결합된다. 추가로, 설포-EMCS(N-ε-말레이미도카프로일옥시)(설포숙신이미드 에스터/피어스)와 같은 헤테로2작용성 가교 결합 시약은, 예를 들어 아민 및 티올기를 연결하기 위해 사용된다.
다른 접근에서, PSA 하이드라자이드가 제조되며, 사전 산화 및 알데하이드 작용기의 생성 후에 탄수화물 모이어티에 결합된다.
상기 기재한 바와 같이, 치료적 단백질의 유리 아민기는 시알산 잔기의 1-카복실기와 반응하여 펩티딜 결합을 형성하거나 또는 에스터 결합은 혈액응고 단백질 상에서 1-카복실산기과 하이드록실 또는 다른 적합한 활성기 간에 형성된다. 대안적으로, 카복실기는 탈아세틸화된 5-아미노기와의 펩타이드 결합을 형성하거나, 또는 치료적 단백질의 분자의 알데하이드기는 시알산 잔기의 N-탈아세틸화된 5-아미노기와 시프 염기를 형성한다.
대안적으로, 다당류 화합물은 치료적 단백질과 비공유적 방식으로 결합된다. 예를 들어, 다당류 화합물 및 약제학적으로 활성 화합물은 일 양태에서 소수성 상호작용을 통해 결합된다. 다른 비공유적 결합은 서로 끌어당기는 반대로 하전된 정전기적 상호작용을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 치료적 단백질은 화학량론적 양(예를 들어, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:7, 1:8, 1:9 또는 1:10 등)으로 다당류 화합물과 연결되거나 또는 결합된다. 다양한 실시형태에서, 1 내지 6, 7 내지 12 또는 13 내지 20개의 다당류가 혈액응고 단백질에 결합된다. 또 다른 실시형태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 다당류가 혈액응고 단백질에 결합된다.
다양한 실시형태에서, 치료적 단백질은 글라이코실화 부위(즉, 천연 글라이코실화 부위 이외의 부위)를 도입하도록 변형된다. 이러한 변형은 당업계에 공지된 표준 분자 생물학적 기법을 사용하여 수행될 수 있다. 게다가, 하나 이상의 탄수화물 모이어티를 통한 수용성 중합체에 컨쥬게이션 전에, 치료적 단백질은 생체내 또는 시험관내에서 글라이코실화될 수 있다. 이들 글라이코실화된 부위는 수용성 중합체와 단백질의 컨쥬게이션을 위한 표적으로서 작용할 수 있다(미국 특허 출원 제20090028822호, 미국 특허 출원 제2009/0093399호, 미국 특허 출원 제2009/0081188호, 미국 특허 출원 제2007/0254836호, 미국 특허 출원 제2006/0111279호 및 문헌[DeFrees S. et al., Glycobiology, 2006, 16, 9, 833-43]). 예를 들어, 생체내에서 자연적으로 글라이코실화된 단백질(예를 들어, 글라이코단백질이 아닌 단백질)은 상기 기재한 바와 같이 변형될 수 있다.
E. 아미노옥시 결합
본 발명의 일 실시형태에서, 옥심기를 형성하기 위한 하이드록실아민 또는 하이드록실아민 유도체와 알데하이드(예를 들어, 과요오드산나트륨에 의한 산화 후 탄수화물 모이어티 상에서)의 반응은 혈액응고 단백질의 컨쥬게이션 제조에 적용된다. 예를 들어, 글라이코단백질(예를 들어, 본 발명에 따른 치료적 단백질)은 우선 과요오드산나트륨 (NaIO4)과 같은 산화제에 의해 산화된다(Rothfus JA et Smith EL., J Biol Chem 1963, 238, 1402-10; 및 Van Lenten L and Ashwell G., J Biol Chem 1971, 246, 1889-94). 글라이코단백질의 과요오드산염 산화는 과요오드산염에 의한 비시날 다이올의 산화로 활성 알데하이드기를 형성하는 1928년에 설명된 고전적 말라프레이드(Malaprade) 반응에 기반한다(Malaprade L., Analytical application, Bull Soc Chim France, 1928, 43, 683-96). 이러한 산화제에 대한 추가적인 예는 테트라아세트산납(Pb(OAc)4), 아세트산 망간(MnO(Ac)3), 아세트산코발트(Co(OAc)2), 아세트산탈륨(TlOAc), 황산세륨(Ce(SO4)2)(미국 특허 제4,367,309호) 또는 과루테늄산칼륨(KRuO4)(Marko et al., J Am Chem Soc 1997,119, 12661-2)이다. "산화제"는 탄수화물에서 인접한 다이올을 산화시킬 수 있고, 이에 의해 생리학적 반응 조건 하에서 활성 알데하이드기를 만들 수 있는 온화한 산화 화합물을 의미한다.
제2 단계는 아미노옥시기를 함유하는 중합체를 산화된 탄수화물 모이어티에 결합시켜 옥심 결합을 형성하는 것이다. 본 발명의 일 실시형태에서, 이 단계는 촉매적 양의 친핵성 촉매 아닐린 또는 아닐린 유도체의 존재에서 수행될 수 있다(Dirksen A etDawson PE, Bioconjugate Chem. 2008; Zeng Y et al., Nature Methods 2009;6:207-9). 아닐린 촉매는 매우 저농도의 시약을 사용하게 하는 옥심 결찰을 극적으로 가속화시킨다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 옥심 결합은 NaCNBH3과 환원에 의해 안정화되어 알콕시아민 결합을 형성한다(도 2). 추가적인 촉매가 이하에 기재된다.
아미노옥시 기법에 대한 추가적인 정보는 다음의 참고문헌에서 찾을 수 있으며, 이들 각각은 그 전문이 포함된다: 유럽 특허 제1681303A1호(해실화(HASylated) 에리트로포이에틴); WO 2005/014024호(옥심 연결기에 의해 결합된 중합체 및 단백질의 컨쥬게이팅); WO96/40662호(아미노옥시-함유 링커 화합물 및 컨쥬게이팅에서 이들의 적용); WO 2008/025856호(변형된 단백질); 문헌[Peri F et al., Tetrahedron 1998, 54, 12269-78; Kubler-Kielb J et. Pozsgay V., J Org Chem 2005, 70, 6887-90; Lees A et al., Vaccine 2006, 24(6), 716-29; 및 Heredia KL et al., Macromoecules 2007, 40(14), 4772-9].
아미노옥시 링커에 수용성 중합체를 결합시키는 다수의 방법은 본 개시내용에 의해 상정된다. 예를 들어, 수용성 중합체, 예컨대 PSA의 환원 또는 비환원말단 중 하나에 링커를 결합시키는 것은 본 명세서에 기재되어 있다. 결합 부위(예를 들어, 환원말단 대 비환원말단)은 수용성 중합체의 결합 과정뿐만 아니라 상태(예를 들어, 천연 대 산화)의 하나 이상의 조건(예를 들어, 시간 및 온도) 에 의해 결정된다. 일 실시형태에서, 산화된 수용성 중합체, 예컨대 PSA는 감소된 온도(예를 들어, 2 내지 8℃)에서 결합 반응을 수행함으로써 그의 비-환원말단에서 아미노옥시 링커에 결합된다. 다른 실시형태에서, 천연(예를 들어, 비-산화된) 수용성 중합체, 예컨대 PSA는 더 고온(예를 들어, 22 내지 37℃)에서 결합 반응을 수행함으로써 그의 비-환원말단에서 아미노옥시 링커에 결합된다. 앞서 언급한 실시형태는 이하에 및 실시예에서 더욱 상세하게 기재된다.
본 명세서에 기재되는 바와 같은, 산화된 PSA와 다이아미노옥시 링커의 반응은 2가지 반응: 비-환원말단에서 알데하이드기의 "빠른 반응", 및 환원말단에서 "느린 반응"을 나타낸다. 천연 PSA(산화되지 않고 활성 알데하이드기를 함유하지 않음)가 실온에서 환원말단과 반응된다면, 유도체화된 PSA가 관찰될 수 있다. 따라서, 다양한 실시형태에서, 수용성 중합체, 예컨대 PSA의 환원말단에서 원치않는 부반응을 최소화하기 위해, PSA-아미노옥시 링커 시약 제조는 2 내지 8℃의 온도에서 수행된다.
본 개시내용의 또 다른 실시형태에서, 환원말단에서 천연 PSA의 유도체화가 제공된다. 본 명세서에 기재되는 바와 같은, 천연 PSA(NaIO4 에 의해 산화되지 않으며, 따라서 그의 비-환원말단에서 유리 알데하이드기를 함유하지 않음)는 실온에서 다이아미노옥시 링커와 반응되고, 그의 환원말단에서 PSA의 유도체화가 관찰될 수 있다. 이 결합은 환원말단에서 고리 열림, 그리고 후속적 옥심 형성(사실상 상기 기재된 부반응, 및 아미노옥시-PSA 시약에서 부산물의 존재에 대한 원인)을 통해 일어난다. 이 반응은 대략 70%까지의 변형도로 천연 PSA 수득에 의해 수행될 수 있다.
주생성물로서, 다음의 구조는 13C NMR 분광학에 의해 결정되었다.
Figure 112021088906918-pat00049
반응물은 덱스트란과 같은 다른 탄수화물 및 환원말단기를 함유하는 전분 또는 다른 다당류에 수송될 수 있다. m-톨루이딘 또는 아닐린과 같은 친핵성 촉매의 사용이 또한 상정된다. 따라서, 천연 PSA(즉, 산화 없이)를 사용하는 아미노옥시-PSA 시약(이어서, 치료적 단백질의 화학적 변형에 사용될 수 있음)의 제조가 본 명세서에 제공된다.
따라서, 본 개시내용의 다양한 실시형태에서, 수용성 중합체, 예컨대 산화된 PSA에 다이아미노옥시 링커를 결합시키는 조건(예를 들어, 2 내지 8℃ 인큐베이션 온도)이 비-환원말단 중 하나에 대한 결합을 선호하거나 또는, 일 대안에서, 수용성 중합체, 예컨대 천연, 비-산화된 PSA에 다이아미노옥시 링커를 결합시키는 조건(예를 들어, 실온 인큐베이션)이 환원말단 중 하나에 대한 결합을 선호하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다양한 실시형태에서, 치료적 단백질(예를 들어, FVIII, FVIIa 또는 FIX)의 산화된 탄수화물에 대해 본 명세서에 기재된 아미노옥시 기법에 따라 결합되는 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 분지된 PEG, 폴리시알산(PSA), 탄수화물, 다당류, 풀루란, 키토산, 하이알루론산, 황산콘드로이틴, 황산더마탄, 전분, 덱스트란, 카복시메틸-덱스트란, 폴리알킬렌 옥사이드(PAO), 폴리알킬렌 글라이콜(PAG), 폴리프로필렌 글라이콜(PPG) 폴리옥사졸린, 폴리 아크릴로일모르폴린, 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리카복실레이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리에틸렌-코-말레산 무수물, 폴리스타이렌-코-말레산 무수물, 폴리(1-하이드록시메틸에틸렌 하이드록시메틸포말)(PHF), 2-메트아크릴로일옥시-2'-에틸트라이메틸암모늄포스페이트(MPC)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
친핵성 촉매
본 명세서에 기재된 바와 같이, 치료적 단백질에 대한 수용성 중합체의 컨쥬게이션은 아닐린에 의해 촉매될 수 있다. 아닐린은 아민과 알데하이드 및 케톤의 수성 반응을 강하게 촉매하여 하이드라존 및 옥심과 같은 안저한 이민을 형성한다. 다음의 다이어그램은 비촉매 대 아닐린-촉매 옥심 결찰 반응을 비교하지만(Kohler JJ, ChemBioChem 2009;10:2147-50):
Figure 112021088906918-pat00050
그러나, 아닐린과 관련된 수많은 건강상의 위험을 고려하며, 대안의 촉매가 바람직하다. 본 발명은 대안의 옥심 결찰 촉매로서 아닐린 유도체를 제공한다. 이러한 아닐린 유도체는 o-아미노 벤조산, m-아미노 벤조산, p-아미노 벤조산, 설파닐산, o-아미노벤즈아마이드, o-톨루이딘, m-톨루이딘, p-톨루이딘, o-아니시딘, m-아니시딘 및 p-아니시딘을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시형태에서, m-톨루이딘(메타-톨루이딘, m-메틸아닐린, 3-메틸아닐린 또는 3-아미노-1-메틸벤젠으로도 알려짐)은 본 명세서에 기재된 컨쥬게이션 반응을 촉매하기 위해 사용된다. M-톨루이딘 및 아닐린은 유사한 물리적 특성을 가지며, 본질적으로 동일한 pKa 값을 가진다(m-톨루이딘: pKa 4.73, 아닐린: pKa 4.63).
본 발명의 친핵성 촉매는 옥심 결찰(예를 들어, 아미노옥시 결합을 사용) 또는 하이드라존 형성(예를 들어, 하이드라자이드 화학을 사용)에 유용하다. 본 발명의 다양한 실시형태에서, 친핵성 촉매는 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50mM의 농도에서의 컨쥬게이션 반응에서 제공된다. 일 실시형태에서, 친핵성 촉매는 1 내지 10mM로 제공된다. 본 발명의 다양한 실시형태에서, 컨쥬게이션 반응의 pH는4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 및 7.5이다. 일 실시형태에서, pH는 5.5 내지 6.5이다.
컨쥬게이트된 단백질의 정제
다양한 실시형태에서, 산화제와 함께 인큐베이션된 단백질 및/또는 본 개시내용에 따른 수용성 중합체와 컨쥬게이팅된 치료적 단백질의 정제가 요망된다. 수많은 정제 기법이 당업계에 공지되어 있으며, 크로마토그래피 방법, 예컨대 이온-교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피 또는 이들의 조합, 여과 방법(예를 들어, UF/DF), 및 침전 방법뿐만 아니라 투석 절차 및 앞서 언급한 기법의 임의의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다(Guide to Protein Purification, Meth. Enzymology Vol 463 (edited by Burgess RR and Deutscher MP), 2nd edition, Academic Press 2009).
다음의 실시예는 제한하지 않지만, 단지 예시적인 본 발명의 구체적 실시형태로 의도된다.
실시예
실시예 1
호모2작용성 링커 NH 2 [OCH 2 CH 2 ] 2 ONH 2 의 제조
호모2작용성 링커 NH2[OCH2CH2]2ONH2
Figure 112021088906918-pat00051
2개의 활성 아미노옥시기를 함유하는 (3-옥사-펜탄-1,5-다이옥시아민)을 보투린(Boturyn) 등(Tetrahedron 1997;53:5485-92)에 따라 1차 아민의 변형된 가브리엘-합성(Gabriel-Synthesis)을 사용하는 2단계 유기 반응에서 합성하였다(도 3). 제1 단계에서, 2,2-클로로다이에틸에터 중 하나의 분자를 다이메틸폼아마이드(DMF) 중에서 엔도-N-하이드록시-5-노보넨-2,3-다이카복시마이드 2개 분자와 반응시켰다. 원하는 호모2작용성 산물을 에탄올 중에서 하이드라진분해에 의해 얻어진 중합체로부터 제조하였다.
실시예 2
호모2작용성 링커 NH 2 [OCH 2 CH 2 ] 4 ONH 2 의 제조
호모2작용성 링커 NH2[OCH2CH2]4ONH2
Figure 112021088906918-pat00052
2개의 활성 아미노옥시기를 함유하는 (3,6,9-트라이옥사-운데칸-1,11-다이옥시아민)을 보투린(Boturyn) 등(Tetrahedron 1997;53:5485-92)에 따라 1차 아민의 변형된 가브리엘-합성을 사용하는 2단계 유기 반응에서 합성하였다(도 3). 제1 단계에서, 비스-(2-(2-클로르에톡시)-에틸)-에터 중 하나의 분자를 다이메틸폼아마이드(DMF) 중에서 엔도-N-하이드록시-5-노보넨-2,3-다이카복시마이드 2개 분자와 반응시켰다. 원하는 호모2작용성 산물을 에탄올 중에서 하이드라진분해에 의해 얻어진 중합체로부터 제조하였다.
실시예 3
호모2작용성 링커 NH 2 [OCH 2 CH 2 ] 6 ONH 2 의 제조
호모2작용성 링커 NH2[OCH2CH2]6ONH2
Figure 112021088906918-pat00053
2개의 활성 아미노옥시기를 함유하는 (3,6,9,12,15-페나톡사-헵타데칸-1,17-다이옥시아민) 을 보투린(Boturyn) 등(Tetrahedron 1997;53:5485-92)에 따라 1차 아민의 변형된 가브리엘-합성을 사용하는 2단계 유기 반응에서 합성하였다. 제1 단계에서, 헥사에틸렌 글라이콜 다이클로라이드 중 하나의 분자를 다이메틸폼아마이드(DMF) 중에서 엔도-N-하이드록시-5-노보넨-2,3-다이카복시마이드 2개 분자와 반응시켰다. 원하는 호모2작용성 산물을 에탄올 중에서 하이드라진분해에 의해 얻어진 중합체로부터 제조하였다.
실시예 4
아미노옥시-PSA 시약의 상세한 합성
3-옥사-펜탄-1,5 다이옥시아민을 보티린(Botyryn)(Tetrahedron 1997; 53:5485-92)에 따라 실시예 1에 약술한 바와 같은 2 단계 유기 합성에서 합성하였다.
단계 1:
700㎖ 무수 N,N-다이메틸폼아마이드 무수 K2CO3(45.51g; 1.00 당량) 및 2,2-다이클로로다이에틸에터(15.84㎖; 0.41 당량) 중에서 엔도-N-하이드록시-5-노보넨-2,3-다이카복시이미드 (59.0g; 1.00 당량) 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 22시간 동안 50℃에서 교반시켰다. 혼합물을 감압하에 증발건조시켰다. 잔기를 2ℓ 다이클로로메탄 중에서 현탁시켰고, 포화 수성 NaCl-용액(각각 1ℓ)로 2회 추출하였다. 다이클로로메탄층을 Na2SO4로 건조시킨 다음, 감압 하에 증발건조시켰으며, 고진공에서 건조시켜 64.5g의 3-옥사펜탄-1,5-다이옥시-엔도-2',3'-다이카복시다이이미드노보넨을 백황색 고체(중간체 1)로서 제공하였다.
단계 2:
800㎖ 무수 에탄올 중의 중간체 1(64.25 g; 1.00 당량)의 용액에, 31.0㎖ 하이드라진 수화물(4.26 당량)을 첨가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 2시간 동안 환류시켰다. 혼합물을 감압하에 용매를 증발시킴으로써 출발 용적의 절반으로 농축시켰다. 생긴 침전물을 여과시켰다. 남아있는 에탄올층을 감압하에 증발건조시켰다. 조질의 생성물 3-옥사-펜탄-1,5-다이옥시아민을 함유하는 잔기를 진공에서 건조시켜 46.3g을 수득하였다. 조질의 생성물을 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 60; 다이클로로메탄/메탄올 혼합물, 9/1에 의한 등용매 용리)에 의해 추가로 정제하여 11.7g의 순수한 최종 생성물 3-옥사-펜탄-1,5-다이옥시아민을 수득하였다.
실시예 5
아미노옥시-PSA의 제조
세럼 인스티튜트 오브 인디아(Serum Institute of India)(인도 푸네에 소재) 로부터 얻은 1000㎎의 산화된 PSA(MW = 20kD)를 16㎖ 50mM 인산염 완충제 pH 6.0 중에 용해시켰다. 이어서, 170㎎의 3-옥사-펜탄-1,5-다이옥시아민은 반응 혼합물을 제공하였다. 2시간 동안 실온에서 진탕시킨 후, 78.5㎎ 사이아노보로하이드레이트나트륨을 첨가하였고, 반응을 18시간 동안 밤새 수행하였다. 이어서, 반응 혼합물에 재생 셀룰로스(50㎠, 밀리포어(Millipore))로 만들어진 5kD 컷오프를 사용하여 한외여과/정용여과 절차(UF/DF)를 실시하였다.
실시예 6
크로마토그래피 정제 단계를 사용하는 아미노옥시-PSA의 제조
세럼 인스티튜트 오브 인디아(인도 푸네에 소재)로부터 얻은 1290㎎의 산화된 PSA(MW = 20kD)를 25㎖ 50mM 인산염 완충제 pH 6.0(완충제 A) 중에 용해시켰다. 이어서, 209㎎의 3-옥사-펜탄-1,5-다이옥시아민은 반응 혼합물을 제공하였다. 1시간 동안 실온에서 진탕시킨 후, 101㎎ 사이아노보로하이드레이트나트륨을 첨가하였고, 반응을 3시간 동안 밤새 수행하였다. 이어서, 혼합물에 프락토겔(Fractogel) EMD DEAE 650-M 크로마토그래피 겔(칼럼 치수: XK26/135)을 사용하는 약한 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 실시하였다. 반응 혼합물을 110㎖ 완충제 A로 희석시켰고, 1㎝/분의 유속에서 완충제 A를 이용하여 미리 평형상태로 만든 DEAE 칼럼 상에 장입하였다. 이어서, 칼럼을 20 CV 완충제 B(20mM 헤페스(Hepes), pH 6.0)로 세척하여 2㎝/분의 유속에서 유리 3-옥사-펜탄-1,5-다이옥시아민 및 사이아나이드를 제거하였다. 이어서, 아미노옥시-PSA 시약을 67% 완충제 B 및 43% 완충제 C(20mM 헤페스, 1M NaCl, pH 7.5)로 이루어진 단계 구배로 용리시켰다. 용리액을 폴리에터 설폰(50㎠, 밀리포어)으로 만들어진 5kD 막을 사용하여 UF/DF에 의해 농축시켰다. 완충제 D(20mM 헤페스, 90mM NaCl, pH 7.4)에 대해 최종 정용여과 단계를 수행하였다. 전체 PSA(레조시놀(Resorcinol) 분석) 및 전체 아미노옥시기(TNBS 분석)를 측정함으로써 제제를 분석적으로 특성규명하여 변형도를 결정하였다. 더 나아가, 다분산성뿐만 아니라 유리 3-옥사-펜탄-1,5-다이옥시아민 및 사이아나이드를 결정하였다.
실시예 7
환원 단계 없이 아미노옥시-PSA의 제조
세럼 인스티튜트 오브 인디아(인도 푸네에 소재)로부터 얻은 573㎎의 산화된 PSA(MW = 20kD)를 11.3㎖ 50mM 인산염 완충제 pH 6.0(완충제 A) 중에 용해시켰다. 이어서, 94㎎의 3-옥사-펜탄-1,5-다이옥시아민은 반응 혼합물을 제공하였다. 5시간 동안 실온에서 진탕시킨 후, 혼합물에 프락토겔 EMD DEAE 650-M 크로마토그래피 겔(칼럼 치수: XK16/105)을 사용하는 약한 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 실시하였다. 반응 혼합물을 50㎖ 완충제 A로 희석시켰고, 1㎝/분의 유속에서 완충제 A를 이용하여 미리 평형상태로 만든 DEAE 칼럼 상에 장입하였다. 이어서, 칼럼을 20 CV 완충제 B(20mM 헤페스, pH 6.0)로 세척하여 2㎝/분의 유속에서 유리 3-옥사-펜탄-1,5-다이옥시아민 및 사이아나이드를 제거하였다. 아미노옥시-PSA 시약을 67% 완충제 B 및 43% 완충제 C(20mM 헤페스, 1M NaCl, pH 7.5)로 이루어진 단계 구배로 용리시켰다. 용리액을 폴리에터 설폰(50㎠, 밀리포어)으로 만들어진 5kD 막을 사용하여 UF/DF에 의해 농축시켰다. 완충제 D(20mM 헤페스, 90mM NaCl, pH 7.4)에 대해 최종 정용여과 단계를 수행하였다. 전체 PSA(레조시놀 분석) 및 전체 아미노옥시기(TNBS 분석)를 측정함으로써 제제를 분석적으로 특성규명하여 변형도를 결정하였다. 더 나아가, 다분산성뿐만 아니라 유리 3-옥사-펜탄-1,5-다이옥시아민을 결정하였다.
실시예 8
친핵성 촉매 m-톨루이딘의 존재에서 환원 단계 없이 아미노옥시-PSA의 제조
세럼 인스티튜트 오브 인디아(인도 푸네에 소재)로부터 얻은 573㎎의 산화된 PSA(MW = 20kD)를 9㎖ 50mM 인산염 완충제 pH 6.0(완충제 A) 중에 용해시킨다. 이어서, 94㎎의 3-옥사-펜탄-1,5-다이옥시아민은 이 용액을 제공한다. 후속적으로 2.3㎖의 50mM m-톨루이딘 저장액을 이 반응 혼합물에 첨가한다. 2시간 동안 실온에서 진탕시킨 후, 혼합물에 프락토겔 EMD DEAE 650-M 크로마토그래피 겔(칼럼 치수: XK16/105)을 사용하는 약한 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 실시한다. 반응 혼합물을 50㎖ 완충제 A로 희석시키고, 1㎝/분의 유속에서 완충제 A를 이용하여 미리 평형상태로 만든 DEAE 칼럼 상에 장입시킨다. 이어서, 칼럼을 20CV 완충제 B(20mM 헤페스, pH 6.0)로 세척하여 2㎝/분의 유속에서 유리 3-옥사-펜탄-1,5-다이옥시아민 및 사이아나이드를 제거한다. 아미노옥시-PSA 시약을 67% 완충제 B 및 43% 완충제 C(20mM 헤페스, 1M NaCl, pH 7.5)로 이루어진 단계 구배로 용리시킨다. 용리액을 폴리에터 설폰(50㎠, 밀리포어)으로 만들어진 5kD 막을 사용하여 UF/DF에 의해 농축시킨다. 완충제 D(20mM 헤페스, 90mM NaCl, pH 7.4)에 대해 최종 정용여과 단계를 수행한다. 전체 PSA(레조시놀 분석) 및 전체 아미노옥시기(TNBS 분석)를 측정함으로써 제제를 분석적으로 특성규명하여 변형도를 결정한다. 더 나아가, 다분산성뿐만 아니라 유리 3-옥사-펜탄-1,5-다이옥시아민를 결정한다.
실시예 9
아미노옥시-PSA 시약의 제조
아미노옥시 - PSA 시약을 실시예 4 - 8에 따라 제조하였다. 정용여과 후에, 생성물을 -80℃에서 냉동시키고, 동결건조시켰다. 동결건조 후에, 시약을 적절한 용적의 수 중에서 용해시키고, 탄수화물 변형을 통한 PSA-단백질 컨쥬게이트의 제조를 위해 사용하였다.
실시예 10
상이한 대안의 친핵성 촉매의 효능 평가
상이한 친핵성 촉매(아닐린, m-톨루이딘, o-아니시딘, m-아니시딘, o-아미노벤조산, m-아미노벤조산, p-아미노벤조산, p-아미노벤즈아마이드, 설파닐산/표준 농도: 10mM)를 사용하여 rFIX를 표준화 조건(20mM L-히스티딘 중의 1㎎/㎖ rFIX, 150mM NaCl, 5mM CaCl2, pH 6.0, 5배 몰 과량의 아미노옥시-PSA 시약, 100μM NaIO4) 하에서 과요오드산나트륨, 아미노옥시-PSA 시약과 함께 인큐베이션시켰다. 반응을 부드러운 교반 하에서 실온에서 암실 내에서 2시간 동안 수행하고, 최종 농도 1mM로 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 실온에서 15분 동안 퀀칭시켰다.
결합 효율을 인비트로젠(Invitrogen) X-세포 미니 시스템을 사용하여 SDS-PAGE에 의해 결정하였다. 샘플에 리튬 도데실 설페이트(LDS) 완충제를 첨가하였고, 10분 동안 70℃에서 변성시켰다. 이어서, 샘플에 3 내지 8% TRIS-아세테이트 겔 상에 적용하였고, 150V에서 60분 동안 실행하였다. 후속적으로 겔을 쿠마씨로 염색하였다.
추가로, 앞서 기재한 조건 하에서 쇼덱스(Shodex) KW 803 칼럼을 구비한 애질런트(Agilent) 1200 HPLC 시스템을 사용하여 SEC-HPLC의 사용에 의해 샘플을 특성규명하였다(Kolarich et al, Transfusion 2006;46:1959-77).
50㎕의 샘플을 희석시키지 않고 주입하였고, 유속 0.5㎖/분에서 20mM NaH2PO4, 50mM Na2SO4, pH 6.1의 0.22㎛ 여과 용액으로 등용매적으로 용리시켰다. 용리 패턴을 280㎚에서 기록하였다.
결과를 도 5a 내지 도 5c 및 도 6(SDS PAGE) 및 표 2(SEC- HPLC 결과)에서 요약한다. 상이한 제제의 촉매적 효과를 입증한다. m-톨루이딘의 사용은 아닐린에 의해 얻어진 바와 동일한 결과를 야기한다는 것을 나타낸다.
친핵성 촉매 다이-프사일화(PSAylated) rFIX 모노-프사일화 rFIX 유리 rFIX
촉매 없음 4.5% 24.9% 70.6%
10mM 아닐린 47.7% 33.6% 18.7%
10mM m-톨루이딘 31.4% 40.8% 27.8%
10mM o-아미노벤조산 30.9% 38.5% 30.6%
10mM m-아미노벤조산 27.6% 38.0% 34.4%
10mM p-아미노벤조산 18.1% 39.3% 42.6%
10mM o-아미노벤즈아마이드 15.9% 38.4% 45.7%
10mM 설파닐산 11.8% 35.8% 52.4%
실시예 11 친핵성 촉매로서 아미노옥시-PSA 및 m-톨루이딘을 사용하는 rFIX의 폴리시알산화
방법 1:
12.3㎎ rFIX를 6.1㎖ 히스티딘 완충제, pH 6.0(20mM L-히스티딘, 150mM NaCl, 5mM CaCl2) 중에 용해시켰다. 이어서, 254㎕의 수성 과요오드산나트륨 용액(5mM)을 첨가하였고, 반응 혼합물을 1시간 동안 암실에서 4℃에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 6.5㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켰다. 혼합물에 과량의 과요오드산염, 퀀처(quencher) 및 이의 부산물을 제거하기 위해 바바스핀(Vivaspin) 15R 10kD 원심분리 여과기를 사용하여 UF/DF를 실시하였다.
산화된 rFIX를 함유하는 잔류물(8.8㎖)을 2.46㎖의 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합하였고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 이어서, MW가 20kD(상기 기재함)인 아미노옥시-PSA 시약을 첨가하여 5배몰 과량을 제공하였다. 이 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 암실에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰다.
유리 rFIX를 음이온 교환 크로마토그래피(AEC)에 의해 제거하였다. 반응 혼합물을 15㎖ 완충제 A(50mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 7.5)로 희석시키고, 완충제 A를 이용하여 사전에 평행상태로 만든 20㎖ HiPrep QFF 16/10 칼럼(코네티컷주 페어필드에 소재한 GE 헬스케어(GE Healthcare)) 상에 장입하였다. 이어서, 칼럼을 완충제 B(50mM 헤페스, 1M NaCl, 5mM CaCl2, pH 7.5)로 용리시켰다. 12 내지 25 mS/㎝의 전도도 및 27 내지 45mS/㎝의 컨쥬게이트에서 유리 rFIX를 용리시켰다. 컨쥬게이트 함유 분획의 전도도를 후속적으로 완충제 C(50mM 헤페스, 5M NaCl, 5mM CaCl2, pH 6.9)를 이용하여 190 mS/㎝로 상승시키고, 완충제 D(50mM 헤페스, 3M NaCl, 5mM CaCl2, pH 6.9)를 이용하여 사전에 평행상태로 만든 20㎖ HiPrep 뷰틸 FF 16/10 칼럼(GE 헬스케어, 코네티컷주 페어필드에 소재)에 장입하였다. 유리 아미노옥시-PSA 시약을 5 CV 완충제 D 내에서 세척하였다. 후속적으로 100% 완충제 E(50mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 7.4)를 이용하여 컨쥬게이트를 용리시킨다. 비바스핀(Vivaspin) 15R 10kD 원심분리 여과기를 사용하여 컨쥬게이트 함유 분획을 UF/DF에 의해 농축시켰다. 150mM NaCl 및 5mM CaCl2를 함유하는 히스티딘 완충제(Ph 7.2)에 대해 최종 정용여과 단계를 수행하였다. 전체 단백질(브래드퍼드(Bradford)) 및 FIX 색원체 활성을 측정함으로써 제제를 분석적으로 특성규명하였다. 천연 rFIX에 비해 50% 미만의 특이적 활성을 나타낸 PSA-rFIX 컨쥬게이트를 결정한다.
방법 2:
12.3㎎ rFIX를 L-히스티딘 완충제, pH 6.0(20mM L-히스티딘, 150mM NaCl, 5mM CaCl2) 중에 용해시켜 1㎎ rFIX/㎖의 최종 농도를 얻는다. 5mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 첨가하여 100μM의 최종 농도를 얻고, 반응 혼합물을 암실에서 1시간 동안 4℃에서 부드러운 교반 하에 pH 6.0에서 인큐베이션시키며, 1M 수성 L-시스테인 용액(또는 다른 퀀칭 시약)의 첨가에 의해 15분 동안 실온에서 퀀칭시켜 10mM의 최종 농도를 얻는다. 혼합물에 과량의 과요오드산염, 퀀처(quencher) 및 이의 부산물을 제거하기 위해 바바스핀(Vivaspin) 15R 10kD 원심분리 여과기를 사용하여 UF/DF를 실시한다.
산화된 rFIX를 함유하는 얻어진 잔류물(8.8㎖)을 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합하여 10mM의 최종 농도를 제공하고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션시킨다. 이어서, MW가 20kD(상기 기재함)인 아미노옥시-PSA 시약을 첨가하여 5배몰 과량을 제공한다. 이 혼합물을 pH 6.0에서 2.5 시간 동안 실온에서(+4℃에서 0.5 시간 내지 18 시간) 암실에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰다.
유리 rFIX를 음이온 교환 크로마토그래피(AEC)에 의해 제거한다. 반응 혼합물을 적절한 양의 완충제 A(50mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 7.5)로 희석시켜 완충제 A를 이용하여 미리 평형상태로 만든 20㎖ HiPrep QFF 16/10 칼럼(GE 헬스케어, 코네티컷주 페어필드에 소재)에 장입하기 전에 용액 전도도 및 pH를 보정한다. 이어서, 칼럼을 완충제 B(50mM 헤페스, 1M NaCl, 5mM CaCl2, pH 7.5)로 용리시킨다. 25%의 완충제 B를 사용하여 단계 구배에 의해 유리 rFIX를 용리시키는데, 이는 얻어진 분획에서 12 내지 25 mS/㎝의 전도도 및 50% 완충제 B의 단계 구배를 사용하는 컨쥬게이트를 초래하고, 컨쥬게이트 분획에서 27 내지 45mS/㎝의 전도도를 초래한다. 완충제 C(50mM 헤페스, 5 M NaCl, 5mM CaCl2, pH 6.9 또는 항-카오트로픽염(anti-chaotropic salt), 예를 들어, 황산 암모늄, 아세트산암모늄 등의 사용에 의해)를 이용하여 컨쥬게이트 함유 분획의 전도도를 후속적으로 190 mS/㎝로 상승시키고, 완충제 D(50mM 헤페스, 3M NaCl, 5mM CaCl2, pH 6.9)를 이용하여 사전에 평행상태로 만든 20㎖ HiPrep 뷰틸 FF 16/10 칼럼(GE 헬스케어, 코네티컷주 페어필드에 소재 또는 비슷한 HIC 매질) 상에 장입한다. 유리 아미노옥시-PSA 시약을 5 CV 완충제 D 내에서 세척한다. 후속적으로 100% 완충제 E(50mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 7.4)를 이용하여 컨쥬게이트를 용리시켰다. 컨쥬게이트 함유 분획을 재생 셀룰로스(88㎠, 컷-오프 10kD, 밀리포어)로 만들어진 10kD 막을 사용하여 UF/DF에 의해 농축시킨다. 150mM NaCl 및 5mM CaCl2를 함유하는 L-히스티딘 완충제(Ph 7.2)에 대해 최종 정용여과 단계를 수행한다. 전체 단백질(브래드퍼드 및 BCA 절차) 및 FIX 색원체- 및 응고 활성을 측정함으로써 제제를 분석적으로 특성규명한다. PSA-rFIX 컨쥬게이트에 대해 천연 rFIX에 비해 50% 미만의 특이적 활성을 결정한다.
방법 3:
25.4㎎ rFIX를 18.7㎖ 히스티딘 완충제, pH 6.0(20mM L-히스티딘, 150mM NaCl, 5mM CaCl2) 중에 용해시켰다. 531㎕의 수성 과요오드산나트륨 용액(5mM) 및 5.07㎖의 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 첨가하였다. 후속적으로, MW 20kD(상기 기재함)의 아미노옥시-PSA 시약을 첨가하여 5배 몰 과량의 시약을 제공하였다. 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 25㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켰다.
유리 rFIX를 음이온 교환 크로마토그래피(AEC)에 의해 제거하였다. 반응 혼합물을 20㎖ 완충제 A(50mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 7.5)로 희석시키고, 완충제 A를 이용하여 사전에 평행상태로 만든 20㎖ HiPrep QFF 16/10 칼럼(코네티컷주 페어필드에 소재한 GE 헬스케어(GE Healthcare)) 상에 장입하였다. 이어서, 칼럼을 완충제 B(50mM 헤페스, 1M NaCl, 5mM CaCl2, pH 7.5)로 용리시켰다. 12 내지 25 mS/㎝의 전도도 및 27 내지 45mS/㎝의 컨쥬게이트에서 유리 rFIX를 용리시킨다. 컨쥬게이트 함유 분획의 전도도를 후속적으로 완충제 C(50mM 헤페스, 5M NaCl, 5mM CaCl2, pH 6.9)를 이용하여 190 mS/㎝로 상승시키고, 완충제 D(50mM 헤페스, 3M NaCl, 5mM CaCl2, pH 6.9)를 이용하여 사전에 평행상태로 만든 20㎖ HiPrep 뷰틸 FF 16/10 칼럼(GE 헬스케어, 코네티컷주 페어필드에 소재)에 장입하였다. 유리 아미노옥시-PSA 시약을 5 CV 완충제 D 내에서 세척하였다. 후속적으로 100% 완충제 E(50mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 7.4)를 이용하여 컨쥬게이트를 용리시켰다. 컨쥬게이트 함유 분획을 재생 셀룰로스(88㎠, 컷-오프 10kD, 밀리포어)로 만들어진 10kD 막을 사용하여 UF/DF에 의해 농축시켰다. 150mM NaCl 및 5mM CaCl2를 함유하는 히스티딘 완충제(Ph 7.2)에 대해 최종 정용여과 단계를 수행하였다. 전체 단백질(브래드퍼드(Bradford)) 및 FIX 색원체 활성을 측정함으로써 제제를 분석적으로 특성규명하였다. PSA-rFIX 컨쥬게이트에 대해 천연 rFIX에 비해 50% 미만의 특이적 활성을 결정하였다. 앞서 기재한 조건 하에서 쇼덱스(Shodex) KW 803 칼럼을 구비한 애질런트(Agilent) 1200 HPLC 시스템을 사용하여 크기 배제 HPLC에 의해 컨쥬게이트를 추가적으로 분석적으로 특성규명하였다(Kolarich et al, Transfusion 2006;46:1959-77). 이는 제제가 유리 FIX를 함유하지 않는다는 것을 나타내었다. 컨쥬게이트는 57% 모노-폴리시알릴화된 및 31% 다이-폴리시알릴화된 및 12% 트라이-폴리시알릴화된 생성물로 이루어졌다.
방법 4:
25.4㎎ rFIX를 L-히스티딘 완충제, pH 6.0(20mM L-히스티딘, 150mM NaCl, 5mM CaCl2) 중에 용해시켜 2㎎ rFIX/㎖의 최종 농도를 얻었다. 후속적으로 15분 내에 5mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 첨가하여 최종 농도 100μM을 제공한 후, 50mM 수성 m-톨루이딘 용액의 첨가로 30분의 시간 기간 내에 최종 농도 10mM을 얻었다. 이어서, MW가 20kD(상기 기재함)인 아미노옥시-PSA 시약을 첨가하여 5배몰 과량을 제공하였다. pH를 6.0으로 보정한 후, 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 1M 수성 L-시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켜 최종 농도 10mM을 제공하였다.
유리 rFIX를 이온 교환 크로마토그래피(IEC)에 의해 제거하였다. 반응 혼합물을 적절한 양의 완충제 A(50mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 7.5)로 희석시켜 완충제 A를 이용하여 미리 평형상태로 만든 20㎖ HiPrep QFF 16/10 칼럼(GE 헬스케어, 코네티컷주 페어필드에 소재)에 장입하기 전에 용액 전도도 및 pH 값을 보정하였다. 이어서, 칼럼을 완충제 B(50mM 헤페스, 1M NaCl, 5mM CaCl2, pH 7.5)로 용리시켰다. 25%의 완충제 B를 사용하여 단계 구배에 의해 유리 rFIX를 용리시키는데, 이는 얻어진 분획에서 12 내지 25 mS/㎝의 전도도 및 50% 완충제 B의 단계 구배를 사용하는 컨쥬게이트를 초래하고, 컨쥬게이트 분획에서 27 내지 45mS/㎝의 전도도를 초래하였다. 완충제 C(50mM 헤페스, 5 M NaCl, 5mM CaCl2, pH 6.9를 이용하여 또는 항-카오트로픽염, 예를 들어, 아세트산암모늄 등의 사용에 의해)의 사용에 의해 컨쥬게이트 함유 분획의 전도도를 후속적으로 190 mS/㎝로 상승시키고, 완충제 D(50mM 헤페스, 3M NaCl, 5mM CaCl2, pH 6.9)를 이용하여 사전에 평행상태로 만든 20㎖ HiPrep 뷰틸 FF 16/10 칼럼(GE 헬스케어, 코네티컷주 페어필드에 소재 또는 비슷한 HIC 매질) 상에 장입하였다. 유리 아미노옥시-PSA 시약을 5 CV 완충제 D 내에서 세척하였다. 후속적으로 100% 완충제 E(50mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 7.4)를 이용하여 컨쥬게이트를 용리시켰다. 컨쥬게이트 함유 분획을 재생 셀룰로스(88㎠, 컷-오프 10kD, 밀리포어)로 만들어진 10kD 막을 사용하여 UF/DF에 의해 농축시켰다. 150mM NaCl 및 5mM CaCl2를 함유하는 L-히스티딘 완충제(Ph 7.2)에 대해 최종 정용여과 단계를 수행하였다. 전체 단백질(브래드퍼드 및 BCA 절차) 및 FIX 색원체- 및 응고 활성을 측정함으로써 제제를 분석적으로 특성규명하였다. PSA-rFIX 컨쥬게이트에 대해 천연 rFIX에 비해 50% 미만의 특이적 활성을 결정하였다. 앞서 기재한 조건 하에서 쇼덱스(Shodex) KW 803 칼럼을 구비한 애질런트 1200 HPLC 시스템을 사용하여 크기 배제 HPLC에 의해 컨쥬게이트를 추가적으로 분석적으로 특성규명하였다(Kolarich et al, Transfusion 2006;46:1959-77). 이는 제제가 유리 FIX를 함유하지 않는다는 것을 나타내었다. 컨쥬게이트는 57% 모노-폴리시알릴화된 및 31% 다이-폴리시알릴화된 및 12% 트라이-폴리시알릴화된 생성물로 이루어졌다.
실시예 12
친핵성 촉매로서 아미노옥시-PSA 및 m-톨루이딘을 사용하는 rFVIII의 폴리시알산화
방법 1:
50㎎ rFVIII을 반응 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮겼고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻었다. 이 용액에, NaIO4을 첨가하여 최종 농도 200μM을 제공하였다. 실온에서 30분 동안 암실에서 부드러운 진탕 하에서 산화를 수행하였다. 이어서, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인(최종 농도: 10mM)으로 퀀칭시켰다. 용액에 완충제 A(20mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 7.0)로 평형상태로 만든 용적이 20㎖(머렉(Merck) EMD TMAE (M))인 IEX 칼럼으로 실시하였다. 5 CV 완충제 A를 이용하여 칼럼을 평형상태로 만들었다. 이어서, 산화된 rFVIII을 완충제 B(20mM 헤페스, 5mM CaCl2, 1M NaCl, pH 7.0)를 이용하여 용리시켰다. RFVIII 함유 분획을 수집하였다. 단백질 함량을 결정하였고(쿠마씨, 브래드퍼드) 반응 완충제를 이용하여 1㎎/㎖로 조절하며, 0.5M HCl의 적가에 의해 pH 6.0으로 조절하였다. 이어서, MW 20kD인 50-배 몰 과량의 아미노옥시-PSA 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(최종 농도: 10mM)로서 m-톨루이딘을 첨가하였다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행하였다. 과량의 아미노옥시-PSA 시약을 HIC에 의해 제거하였다. 반응 혼합물의 전도도를 아세트산암모늄을 함유하는 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, 8 M 아세트산암모늄, pH 6.9)를 첨가함으로써 130mS/㎝로 상승시키고, 50mM 헤페스, 2.5M 아세트산암모늄, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.9를 이용하여 미리 평형상태로 만든 80㎖ 페닐 세파로스 FF(GE 헬스케어, 코네티컷주 페어필드에 소재)로 충전한 칼럼 상에 장입하였다. 후속적으로, 5mM CaCl2를 함유하는 50mM 헤페스 완충제 pH 7.5를 이용하여 컨쥬게이트를 용리시켰다. 최종적으로, PSA-rFVIII 함유 분획을 수집하였고, 재생 셀룰로스(88㎠, 밀리포어)로 만들어진 30kD 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시하였다. 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드(Bradford)) 및 FVIII 색원체 활성을 측정함으로써 제제를 분석적으로 특성규명하였다. 천연 rFVIII에 비해 > 70%의 특이적 활성을 나타낸 PSA-rFVIII 컨쥬게이트를 결정하였다.
방법 2:
헤페스 완충제(50mM 헤페스, ~350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, 0.1% 폴리솔베이트 80, pH 7.4) 중에서 ADVATE 과정으로부터 유래된 58㎎의 재조합체 인자 VIII(rFVIII)를 반응 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 용해시켜 최종 단백질 농도 1.0 +/- 0.25㎎/㎖을 얻는다. 이어서, 용액의 pH를 0.5N 수성 HCl 용액의 적가에 의해 6.0까지 보정한다. 후속적으로, 40mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 10분 내에 첨가하여 농도 200μM을 제공한다. T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 30 +/- 5분 동안 산화반응을 수행한다. 이어서, T= +22 +/- 2℃에서 15분 내에 수성 L-시스테인 용액(1M)의 첨가에 의해 반응을 중단시켜 반응 혼합물에서 최종 농도 10mM을 제공하였고 60 +/- 5분 동안 인큐베이션시킨다.
산화된 rFVIII을 EMD TMAE (M)(머렉) 상의 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. 혼합물을 완충제 A(20mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 6.5)로 희석시켜 전도도 5ms/㎝를 제공한다. 이 용액을 유속 1.5㎝/분을 사용하여 칼럼 용적이 10㎖인 IEX 칼럼(층 높이: 5.4 ㎝) 상에 장입한다. 이 칼럼을 후속적으로 완충제 A과 완충제 B(20mM 헤페스, 5mM CaCl2, 1.0M NaCl, pH 7.0)의 92:8 혼합물(w/w)의 5CV로 세척한다(유속: 1.5㎝/분). 이어서, 산화된 rFVIII을 완충제 A와 완충제 B의 50:50 (w/w) 혼합물로 용리시킨 후 완충제 B의 5CV에 의한 용리 후 단계 처리한다. 유속 1.0㎝/분의 사용에 의해 용리 단계를 수행한다.
후속적으로, 아미노옥시-폴리시알산(PSA-ONH2) 시약을 15분 부드러운 교반 하에 최대 시간 기간(t) 내에서 정제 산화된 rFVIII을 함유하는 용리액에 50배 몰 과량으로 첨가한다. 이어서, 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 15분 내에 첨가하여 최종 농도 10mM을 얻는다. 반응 혼합물을 암실에서 T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 120 +/- 10분 동안 부드러운 진탕 하에 인큐베이션시킨다.
얻어진 PSA-rFVIII 컨쥬게이트를 층 높이(h) 15㎝ 및 얻어진 칼럼 용적(CV)의 81㎖을 지니는 GE 헬스케어에 의해 제조된 칼럼에 채운 페닐 세파로스 FF 저 서브 수지(FF low sub resin)(GE 헬스케어)를 사용하여 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에 의해 정제한다.
반응 혼합물을 350mM 염화나트륨, 8M 아세트산암모늄, 5mM 염화칼슘을 함유하는 50mM 헤페스 완충제, pH 6.9의 첨가에 의해 아세트산암모늄으로 보충한다. 2 용적의 반응 혼합물을 1 용적의 아세트산암모늄 함유 완충제 시스템과 혼합하고, pH 값을 0.5N 수성 NaOH 용액의 적가에 의해 pH 6.9로 보정한다. 이 혼합물을 유속 1㎝/분에서 HIC 칼럼 상에 장입한 후, 3CV 초과의 평형상태 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 2.5M 아세트산암모늄, 5mM 염화칼슘, pH 6.9)를 사용하여 세척 단계를 수행한다.
반응 부산물 및 항-카오트로픽염의 제거를 위해, 제2 세척 단계를 유속 2㎝/분에서 상류 방식으로 > 5 CV 세척 완충제 1(50mM 헤페스, 3M 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.9)을 이용하여 수행한다. 이어서, 정제된PSA-rFVIII 컨쥬게이트의 용리를 유속 1㎝/분에서 40% 세척 완충제 2(50mM 헤페스, 1.5M 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.9) 및 60% 용리 완충제(20mM 헤페스, 5mM 염화칼슘, pH 7.5)의 단계 구배를 사용하여 하류 방식으로 수행한다. PSA-rFVIII 컨쥬게이트의 용리를 UV 280㎚에서 모니터링하고, 컨쥬게이트를 함유하는 용리액을 4CV 미만 이내에서 수집한다. 용리 후 단계를 동일한 조건 하에서 3CV 초과의 용리 완충제로 수행하여 주요 생성물로부터 부수적 및/또는 미변형 rFVIII을 분리시켰다.
최종적으로 정제된 컨쥬게이트를 분자량 컷 오프가 30kD(88㎠, 밀리포어)인 재생 셀룰로스로 만들어진 막을 사용하여 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 농축시킨다.
이 절차의 사용에 의해 제조한 컨쥬게이트를 전체 단백질, FVIII 색원체 활성 및 PSA 함량을 측정하는 것에 의한(레조시놀 분석) 폴리시알릴화 정도의 결정을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다. 얻어진 컨쥬게이트에 대해, 특이적 활성 > 50% 및 PSA 정도 > 5.0을 계산한다.
방법 3:
50㎎ rFVIII을 반응 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮겼고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻었다. MW 20kD인 50-배 몰 과량의 아미노옥시-PSA 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(최종 농도: 10mM) 및 NaIO4(최종 농도: 400μM)로서 m-톨루이딘을 첨가하였다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행하였다. 후속적으로, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인을 이용하여 퀀칭시켰다(최종 농도: 10mM). 이어서, 반응 혼합물의 전도도를 아세트산 암모늄을 함유하는 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, 8 M 아세트산 암모늄, pH 6.9)를 첨가함으로써 130 mS/㎝로 상승시키고, 50mM 헤페스, 2.5 M 아세트산 암모늄, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, 0.01% 트윈(Tween) 80, pH 6.9를 이용하여 미리 평형상태로 만든 80㎖ 페닐 세파로스 FF(GE 헬스케어, 코네티컷주 페어필드에 소재)로 충전한 칼럼 상에 장입하였다. 후속적으로, 50mM 헤페스 완충제, 5mM을 함유하는 염화칼슘, pH 7.5를 이용하여 컨쥬게이트를 용리시켰다. 최종적으로, PSA-rFVIII 함유 분획을 수집하였고, 재생 셀룰로스(88㎠, 밀리포어)로 만들어진 30kD 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시하였다. 전체 단백질(브래드퍼드) 및 FVIII 색원체 활성을 측정함으로써 제제를 분석적으로 특성규명하였다. PSA-rFVIII 컨쥬게이트에 대해, 천연 rFVIII에 비해 ≥ 70%의 특이적 활성을 결정하였다.
방법 4:
50mM 헤페스 완충제(50mM 헤페스, ~350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, 0.1% 폴리솔베이트 80, pH 7.4) 중에서 ADVATE 과정으로부터 유래된 50㎎의 재조합체 인자 VIII(rFVIII)를 반응 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 용해시켜 최종 단백질 농도 1.0 +/- 0.25㎎/㎖을 얻었다. 이어서, 용액의 pH를 0.5 N 수성 HCl 용액의 적가에 의해 6.0까지 보정하였다.
후속적으로, 아미노옥시-폴리시알산(PSA-ONH2) 시약을 15분 부드러운 교반 하에 최대 시간 기간(t) 내에서 이 rFVIII 용액을 함유하는 용리액에 50배 몰 과량으로 첨가하였다. 이어서, 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 15분 내에 첨가하여 최종 농도 10mM을 얻었다. 최종적으로, 40mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 첨가하여 농도 400μM을 제공하였다.
반응 혼합물을 암실에서 온도 (T) T= +22 +/- 2℃에서 120 +/- 10분 동안 부드러운 진탕 하에 인큐베이션시켰다. 이어서, 수성 L-시스테인 용액(1M)의 첨가에 의해 반응을 중단시켜 반응 혼합물에서 최종 농도 10mM을 제공하였고 60 +/- 5분 동안 인큐베이션시켰다.
얻어진 PSA-rFVIII 컨쥬게이트를 층 높이(h) 15㎝ 및 얻어진 칼럼 용적(CV)의 81㎖을 지니는 GE 헬스케어에 의해 제조된 칼럼에 채운 페닐 세파로스 FF 저 서브 수지(GE 헬스케어)를 사용하여 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에 의해 정제하였다.
반응 혼합물을 350mM 염화나트륨, 8M 아세트산암모늄, 5mM 염화칼슘을 함유하는 50mM 헤페스 완충제, pH 6.9의 첨가에 의해 아세트산암모늄으로 보충하였다. 2 용적의 반응 혼합물을 1 용적의 아세트산암모늄 함유 완충제 시스템과 혼합하고, pH 값을 0.5N 수성 NaOH 용액의 적가에 의해 pH 6.9로 보정하였다. 이 혼합물을 유속 1㎝/분을 사용하여 HIC 칼럼 상에 장입한 후, 3CV 초과의 평형상태 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 2.5M 아세트산암모늄, 5mM 염화칼슘, pH 6.9)를 사용하여 세척 단계를 수행하였다.
반응 부산물 및 항-카오트로픽염의 제거를 위해, 제2 세척 단계를 유속 2㎝/분에서 상류 방식으로 5CV 초과의 세척 완충제 1(50mM 헤페스, 3M 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.9)을 이용하여 수행하였다. 이어서, 정제된 rFVIII 컨쥬게이트의 용리를 유속 1㎝/분에서 40% 세척 완충제 2(50mM 헤페스, 1.5M 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.9) 및 60% 용리 완충제(20mM 헤페스, 5mM 염화칼슘, pH 7.5)의 단계 구배를 사용하여 하류 방식으로 수행하였다. PSA-rFVIII 컨쥬게이트의 용리를 UV 280㎚에서 모니터링하고, 컨쥬게이트를 함유하는 용리액을 4CV 미만 이내에서 수집하였다. 용리 후 단계를 동일한 조건 하에서 3CV 초과의 용리 완충제로 수행하여 주요 생성물로부터 부수적 및/또는 미변형 rFVIII을 분리시켰다.
최종적으로 정제된 컨쥬게이트를 분자량 컷 오프가 30kD(88㎠, 밀리포어)인 재생 셀룰로스로 만들어진 막을 사용하여 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 농축시켰다.
이 절차의 사용에 의해 제조한 컨쥬게이트를 전체 단백질, FVIII 색원체 활성 및 PSA 함량을 측정하는 것에 의한(레조시놀 분석) 폴리시알릴화 정도의 결정을 측정함으로써 분석적으로 특성규명하였다.
분석 데이터(6개 연속 배취(batch)의 평균):
공정 수율 (브래드퍼드): 58.9%
공정 수율(FVIII 염색체): 46.4%
특이적 활성: (FVIII 염색체/㎎ 단백질): 4148 IU/㎎
특이적 활성(출발 물질의%): 79.9%
PSA 정도(㏖/㏖): 8.1
실시예 13
친핵성 촉매로서 아미노옥시-PEG 시약 및 m-톨루이딘을 사용하는 r FVIII의 페길화
방법 1:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 rFVIII을 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(Sunbright)(등록상표) CA 시리즈이다. 14.7㎎ rFVIII을 7.0㎖ 히스티딘 완충제, pH 6.0(20mM L-히스티딘, 150mM NaCl, 5mM CaCl2) 중에 용해시킨다. 이어서, 296㎕의 수성 과요오드산나트륨 용액(5mM)을 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 암실에서 4℃에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 7.5㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켰다. 혼합물에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 바바스핀 15R 10kD 원심분리 여과기를 사용하여 UF/DF를 실시하였다.
산화된 rFVIII을 함유하는 잔류물(10.9㎖)을 2.94㎖의 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합하였고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 이어서, MW가 20kD인 아미노옥시-PEG 시약을 첨가하여 5배몰 과량을 제공한다. 이 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 암실에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰다.
최종적으로, PEG-rFVIII 컨쥬게이트를 Q 세파로스 FF 상에서 이온-교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 1.5㎎ 단백질/㎖ 겔을 5mM CaCl2를 함유하는 50mM 헤페스 완충제, pH 7.4를 이용하여 평형상태로 만든 칼럼 상에 장입한다. 컨쥬게이트를 5mM CaCl2 및 500mM 염화나트륨, pH 7.4를 함유하는 50mM 헤페스 완충제를 이용하여 용리시킨 다음, 30kD 막(50㎠, 밀리포어)을 사용하여 UF/DF를 실시한다. 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드(Bradford)) 및 FVIII 색원체 활성을 측정함으로써 제제를 분석적으로 특성규명한다. PEG-rFVIII 컨쥬게이트는 천연 rFVIII에 비해 > 70%의 특이적 활성이 결정되었다는 것을 입증할 것으로 예상된다.
방법 2:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 rFVIII을 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. rFVIII의 출발 중량 또는 농도를 반응 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 용해시키거나 또는 옮겨서 최종 단백질 농도 1.0 +/- 0.25㎎/㎖를 얻는다. 이어서, 용액의 pH를 0.5 N 수성 HCl 용액의 적가에 의해 6.0까지 보정한다. 후속적으로, 40mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 10분 내에 첨가하여 농도 200μM을 제공한다. T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 30 +/- 5분 동안 산화반응을 수행한다. 이어서, T= +22 +/- 2℃에서 15분 내에 수성 L-시스테인 용액(1M)의 첨가에 의해 반응을 중단시켜 반응 혼합물에서 최종 농도 10mM을 제공하였고 60 +/- 5분 동안 인큐베이션시킨다.
산화된 rFVIII을 EMD TMAE (M)(머렉) 상의 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. 혼합물을 완충제 A(20mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 6.5)로 희석시켜 전도도 5ms/㎝를 제공한다. 이 용액을 유속 1.5㎝/분을 사용하여 칼럼 용적이 10㎖인 IEX 칼럼(층 높이: 5.4 cm) 상에 장입한다. 이 칼럼을 후속적으로 완충제 A과 완충제 B(20mM 헤페스, 5mM CaCl2, 1.0M NaCl, pH 7.0)의 92:8 혼합물(w/w)의 5CV로 세척한다(유속: 1.5㎝/분). 이어서, 산화된 rFVIII을 완충제 A와 완충제 B의 50:50 (w/w) 혼합물로 용리시킨 후 완충제 B의 5CV에 의한 용리 후 단계 처리한다. 유속 1.0㎝/분의 사용에 의해 용리 단계를 수행한다.
후속적으로, MW 20kD의 아미노옥시-PEG 시약을 15분 부드러운 교반 하에 최대 시간 기간(t) 내에서 정제 산화된 rFVIII을 함유하는 용리액에 50배 몰 과량으로 첨가한다. 이어서, 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 15분 내에 첨가하여 최종 농도 10mM을 얻는다. 반응 혼합물을 암실에서 T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 120 +/- 10분 동안 부드러운 진탕 하에 인큐베이션시킨다.
얻어진 PEG-rFVIII 컨쥬게이트를 층 높이(h) 15㎝ 및 얻어진 칼럼 용적(CV)의 81㎖을 지니는 GE 헬스케어에 의해 제조된 칼럼에 채운 페닐 세파로스 FF 저 서브 수지(GE 헬스케어)를 사용하여 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에 의해 정제한다.
반응 혼합물을 350mM 염화나트륨, 8M 아세트산암모늄, 5mM 염화칼슘을 함유하는 50mM 헤페스 완충제, pH 6.9의 첨가에 의해 아세트산암모늄으로 보충한다. 2 용적의 반응 혼합물을 1 용적의 아세트산암모늄 함유 완충제 시스템과 혼합하고, pH 값을 0.5N 수성 NaOH 용액의 적가에 의해 pH 6.9로 보정한다. 이 혼합물을 유속 1㎝/분을 사용하여 HIC 칼럼 상에 장입한 후, 3CV 초과의 평형상태 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 2.5M 아세트산암모늄, 5mM 염화칼슘, pH 6.9)를 사용하여 세척 단계를 수행한다.
반응 부산물 및 항-카오트로픽염의 제거를 위해, 제2 세척 단계를 유속 2㎝/분에서 상류 방식으로 > 5 CV 세척 완충제 1(50mM 헤페스, 3M 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.9)을 이용하여 수행한다. 이어서, 정제된 rFVIII 컨쥬게이트의 용리를 유속 1㎝/분에서 40% 세척 완충제 2(50mM 헤페스, 1.5M 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.9) 및 60% 용리 완충제(20mM 헤페스, 5mM 염화칼슘, pH 7.5)의 단계 구배를 사용하여 하류 방식으로 수행한다. PEG-rFVIII 컨쥬게이트의 용리를 UV 280㎚에서 모니터링하고, 컨쥬게이트를 함유하는 용리액을 4CV 미만 이내에서 수집한다. 용리 후 단계를 동일한 조건 하에서 3CV 초과의 용리 완충제로 수행하여 주요 생성물로부터 부수적 및/또는 미변형 rFVIII을 분리시켰다.
최종적으로 정제된 컨쥬게이트를 분자량 컷 오프가 30kD(밀리포어)인 재생 셀룰로스로 만들어진 막을 사용하여 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 농축시킨다.
이 절차의 사용에 의해 제조한 컨쥬게이트를 전체 단백질 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 3:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 rFVIII을 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. 6㎖ 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 150mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 용해시킨 7.84㎎ rFVIII을 314㎕의 수성 과요오드산나트륨 용액(10mM), 및 1.57㎖의 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합한다. 후속적으로 아미노옥시 시약을 첨가하여 20배 몰 과량의 시약을 제공한다. 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 8㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시킨다.
최종적으로, PEG-rFVIII 컨쥬게이트를 Q-세파로스 FF 상에서 이온-교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 1.5㎎ 단백질/㎖ 겔을 5mM CaCl2를 함유하는 50mM 헤페스 완충제, pH 7.4를 이용하여 미리 평형상태로 만든 칼럼 상에 장입한다. 컨쥬게이트를 5mM CaCl2 및 500mM 염화나트륨, pH 7.4를 함유하는 50mM 헤페스 완충제를 이용하여 용리시킨 다음, 30kD 막(88㎠, 밀리포어)을 사용하여 UF/DF를 실시한다. FVIII 색원체 분석 및 전체 단백질의 결정(브래드퍼드)에 의한 컨쥬게이트의 분석적 특성규명은 rFVIII 출발물질에 비해 60% 초과의 특이적 활성을 나타낸다.
방법 4:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 rFVIII을 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. RFVIII의 초기 농도 또는 중량을 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 150mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 옮기거나 또는 용해시켜서 최종 단백질 농도 2㎎ rFVIII/㎖를 얻는다. 후속적으로 15분 내에 5mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 첨가하여 최종 농도 100μM을 제공한 후, 50mM 수성 m-톨루이딘 용액의 첨가로 30분의 시간 기간 내에 최종 농도 10mM을 얻는다. 이어서, MW가 20kD(상기 기재함)인 아미노옥시-PEG 시약 시약을 첨가하여 20배 몰 과량을 제공한다. pH를 6.0으로 보정한 후, 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 1M 수성 L-시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켜 최종 농도 10mM을 제공한다.
유리 rFVIII을 이온 교환 크로마토그래피(IEC)에 의해 제거하였다. 반응 혼합물을 적절한 양의 완충제 A(50mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 7.5)로 희석시켜 완충제 A를 이용하여 사전 평형상태로 만든 20㎖ HiPrep QFF 16/10 칼럼(GE 헬스케어, 코네티컷주 페어필드에 소재)에 장입하기 전에 용액 전도도 및 pH 값을 보정하였다. 이어서, 칼럼을 완충제 B(50mM 헤페스, 1M NaCl, 5mM CaCl2, pH 7.5)로 용리시켰다. 25%의 완충제 B를 사용하여 단계 구배에 의해 유리 rFVIII을 용리시키는데, 이는 얻어진 분획에서 12 내지 25 mS/㎝의 전도도 및 50% 완충제 B의 단계 구배를 사용하는 컨쥬게이트를 초래하고, 컨쥬게이트 분획에서 27 내지 45mS/㎝의 전도도를 초래하였다. 완충제 C(50mM 헤페스, 5 M NaCl, 5mM CaCl2, pH 6.9; 항-카오트로픽염, 예를 들어, 황산 암모늄, 아세트산 암모늄 등의 사용에 의해)를 이용하여 컨쥬게이트 함유 분획의 전도도를 후속적으로 상승시키고, 완충제 D(50mM 헤페스, 3M NaCl, 5mM CaCl2, pH 6.9)를 이용하여 사전에 평행상태로 만든 20㎖ HiPrep 뷰틸 FF 16/10 칼럼(GE 헬스케어, 코네티컷주 페어필드에 소재 또는 비슷한 HIC 매질) 상에 장입한다. 유리 PEG-시약을 5 CV 완충제 D 내에서 세척하였다. 후속적으로 100% 완충제 E(50mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 7.4)를 이용하여 컨쥬게이트를 용리시켰다. 컨쥬게이트 함유 분획을 재생 셀룰로스(88㎠, 컷-오프 10kD, 밀리포어)로 만들어진 10kD 막을 사용하여 UF/DF에 의해 농축시킨다. 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 7.5)에 대해 최종 정용여과 단계를 수행한다.
전체 단백질(브래드퍼드 및 BCA 절차) 및 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 제제를 분석적으로 특성규명한다.
실시예 14
친핵성 촉매로서 아미노옥시-PSA 및 m-톨루이딘을 사용하는 rFVIIa의 폴리시알산화
방법 1:
재조합 인자 VIIa(rFVIIa)의 출발 농도 또는 중량을 반응 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 옮기거나 또는 용해시켜서 최종 단백질 농도 1.0 +/- 0.25㎎/㎖를 얻는다. 이어서, 용액의 pH를 0.5N 수성 NaOH 용액의 적가에 의해 6.0까지 보정한다. 후속적으로, 40mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 10분 내에 첨가하여 농도 50μM을 제공한다. T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 30 +/- 5분 동안 산화반응을 수행한다. 이어서, T= +22 +/- 2℃에서 15분 내에 수성 L-시스테인 용액(1M)의 첨가에 의해 반응을 중단시켜 반응 혼합물에서 최종 농도 10mM을 제공하였고 60 +/- 5분 동안 인큐베이션시킨다.
산화된 rFVIIa를 EMD TMAE(M)(머렉) 상의 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. 혼합물을 완충제 A(20mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 6.5)로 희석시켜 전도도 5ms/㎝를 제공한다. 이 용액을 유속 1.5㎝/분을 사용하여 칼럼 용적이 10㎖인 IEX 칼럼(층 높이: 5.4 cm) 상에 장입한다. 이 칼럼을 후속적으로 완충제 A과 완충제 B(20mM 헤페스, 5mM CaCl2, 1.0M NaCl, pH 7.0)의 92:8 혼합물(w/w)의 5CV로 세척한다(유속: 1.5㎝/분). 이어서, 산화된 rFVIIa를 완충제 A와 완충제 B의 50:50 (w/w) 혼합물로 용리시킨 후 완충제 B의 5CV에 의한 용리 후 단계 처리한다. 유속 1.0㎝/분의 사용에 의해 용리 단계를 수행한다.
후속적으로, 아미노옥시-폴리시알산(PSA-ONH2) 시약을 15분 부드러운 교반 하에 최대 시간 기간(t) 내에서 정제 산화된 rFVIIa를 함유하는 용리액에 50배 몰 과량으로 첨가한다. 이어서, 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 15분 내에 첨가하여 최종 농도 10mM을 얻는다. 반응 혼합물을 암실에서 T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 120 +/- 10분 동안 부드러운 진탕 하에 인큐베이션시킨다.
얻어진 PSA-rFVIIa 컨쥬게이트를 층 높이(h) 15㎝ 및 얻어진 칼럼 용적(CV)의 81㎖을 지니는 GE 헬스케어에 의해 제조된 칼럼에 채운 페닐 세파로스 FF 저 서브 수지(GE 헬스케어)를 사용하여 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에 의해 정제한다.
반응 혼합물을 350mM 염화나트륨, 8M 아세트산암모늄, 5mM 염화칼슘을 함유하는 50mM 헤페스 완충제, pH 6.9의 첨가에 의해 아세트산암모늄으로 보충한다. 2 용적의 반응 혼합물을 1 용적의 아세트산암모늄 함유 완충제 시스템과 혼합하고, pH 값을 0.5N 수성 NaOH 용액의 적가에 의해 pH 6.9로 보정한다. 이 혼합물을 유속 1㎝/분을 사용하여 HIC 칼럼 상에 장입한 후, 3CV 초과의 평형상태 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 2.5M 아세트산암모늄, 5mM 염화칼슘, pH 6.9)를 사용하여 세척 단계를 수행한다.
반응 부산물 및 항-카오트로픽염의 제거를 위해, 제2 세척 단계를 유속 2㎝/분에서 상류 방식으로 5CV 초과의 세척 완충제 1(50mM 헤페스, 3M 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.9)을 이용하여 수행한다. 이어서, 정제된 rFVIIa 컨쥬게이트의 용리를 유속 1㎝/분에서 40% 세척 완충제 2(50mM 헤페스, 1.5M 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.9) 및 60% 용리 완충제(20mM 헤페스, 5mM 염화칼슘, pH 7.5)의 단계 구배를 사용하여 하류 방식으로 수행한다. PSA-rFVIIa 컨쥬게이트의 용리를 UV 280㎚에서 모니터링하고, 컨쥬게이트를 함유하는 용리액을 4CV 미만 이내에서 수집한다. 용리 후 단계를 동일한 조건 하에서 3CV 초과의 용리 완충제로 수행하여 주요 생성물로부터 부수적 및/또는 미변형 rFVIIa를 분리시켰다.
최종적으로, 적절한 분자량 컷 오프(예를 들어, 10kD MWCO, 88㎠, 밀리포어)를 지니는 정제된 컨쥬게이트를 재생 셀룰로스로 만들어진 막을 사용하여 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 농축시킨다.
이 절차의 사용에 의해 제조한 컨쥬게이트를 전체 단백질, 생물학적 활성 및 PSA 함량을 측정하는 것에 의한(레조시놀 분석) 폴리시알릴화 정도의 결정을 측정함으로써 분석적으로 특성규명하였다.
방법 2:
rFVIIa의 출발 중량 또는 농도를 반응 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 용해시키거나 또는 옮겨서 최종 단백질 농도 1.0 +/- 0.25㎎/㎖를 얻는다. 이어서, 용액의 pH를 0.5N 수성 NaOH 용액의 적가에 의해 6.0까지 보정한다.
후속적으로, 아미노옥시-폴리시알산(PSA-ONH2) 시약을 15분 부드러운 교반 하에 최대 시간 기간(t) 내에서 이 rFVIIa 용액을 함유하는 용리액에 50배 몰 과량으로 첨가한다. 이어서, 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 15분 내에 첨가하여 최종 농도 10mM을 얻는다. 최종적으로, 40mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 첨가하여 농도 150μM을 제공한다.
반응 혼합물을 암실에서 T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 120 +/- 10분 동안 부드러운 진탕 하에 인큐베이션시킨다. 이어서, 수성 L-시스테인 용액(1M)의 첨가에 의해 반응을 중단시켜 반응 혼합물에서 최종 농도 10mM을 제공하였고 60 +/- 5분 동안 인큐베이션시킨다.
얻어진 PSA-rFVIIa 컨쥬게이트를 층 높이(h) 15㎝ 및 얻어진 칼럼 용적(CV)의 81㎖을 지니는 GE 헬스케어에 의해 제조된 칼럼에 채운 페닐 세파로스 FF 저 서브 수지(GE 헬스케어)를 사용하여 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에 의해 정제한다.
반응 혼합물을 350mM 염화나트륨, 8M 아세트산암모늄, 5mM 염화칼슘을 함유하는 50mM 헤페스 완충제, pH 6.9의 첨가에 의해 아세트산암모늄으로 보충한다. 2 용적의 반응 혼합물을 1 용적의 아세트산암모늄 함유 완충제 시스템과 혼합하고, pH 값을 0.5N 수성 NaOH 용액의 적가에 의해 pH 6.9로 보정한다. 이 혼합물을 유속 1㎝/분을 사용하여 HIC 칼럼 상에 장입한 후, > 3CV 평형상태 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 2.5M 아세트산암모늄, 5mM 염화칼슘, pH 6.9)를 사용하여 세척 단계를 수행한다.
반응 부산물 및 항-카오트로픽염의 제거를 위해, 제2 세척 단계를 유속 2㎝/분에서 상류 방식으로 5CV 초과의 세척 완충제 1(50mM 헤페스, 3M 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.9)을 이용하여 수행한다. 이어서, 정제된 rFVIIa 컨쥬게이트의 용리를 유속 1㎝/분에서 40% 세척 완충제 2(50mM 헤페스, 1.5M 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.9) 및 60% 용리 완충제(20mM 헤페스, 5mM 염화칼슘, pH 7.5)의 단계 구배를 사용하여 하류 방식으로 수행한다. PSA-rFVIIa 컨쥬게이트의 용리를 UV 280㎚에서 모니터링하고, 컨쥬게이트를 함유하는 용리액을 4CV 미만 이내에서 수집하였다. 용리 후 단계를 동일한 조건 하에서 3CV 초과의 용리 완충제로 수행하여 주요 생성물로부터 부수적 및/또는 미변형 rFVIII을 분리시켰다.
최종적으로 정제된 컨쥬게이트를 재생 셀룰로스로 만들어진 막을 사용하여 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 농축시킨다.
이 절차의 사용에 의해 제조한 컨쥬게이트를 전체 단백질, 당업계에 공지된 방법에 따라 생물학적 활성 및 PSA 함량을 측정하는 것에 의한(레조시놀 분석) 폴리시알릴화 정도의 결정을 측정함으로써 분석적으로 특성규명하였다.
실시예 15
친핵성 촉매로서 아미노옥시-PEG 시약 및 m-톨루이딘을 사용하는 rFIX의 페길화
방법 1:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 rFIX를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. rFIX의 출발 중량 또는 농도를 반응 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 용해시키거나 또는 옮겨서 최종 단백질 농도 1.0 +/- 0.25㎎/㎖를 얻는다. 이어서, 용액의 pH를 0.5 N 수성 HCl 용액의 적가에 의해 6.0까지 보정한다. 후속적으로, 40mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 10분 내에 첨가하여 농도 200μM을 제공한다. T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 30 +/- 5분 동안 산화반응을 수행한다. 이어서, T= +22 +/- 2℃에서 15분 내에 수성 L-시스테인 용액(1M)의 첨가에 의해 반응을 중단시켜 반응 혼합물에서 최종 농도 10mM을 제공하였고 60 +/- 5분 동안 인큐베이션시킨다.
산화된 rFVIII을 EMD TMAE (M)(머렉) 상의 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. 혼합물을 완충제 A(20mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 6.5)로 희석시켜 전도도 5ms/㎝를 제공한다. 이 용액을 유속 1.5㎝/분을 사용하여 칼럼 용적이 10㎖인 IEX 칼럼(층 높이: 5.4 cm) 상에 장입한다. 이 칼럼을 후속적으로 완충제 A과 완충제 B(20mM 헤페스, 5mM CaCl2, 1.0M NaCl, pH 7.0)의 92:8 혼합물(w/w)의 5CV로 세척한다(유속: 1.5㎝/분). 이어서, 산화된 rFIX를 완충제 A와 완충제 B의 50:50(w/w) 혼합물로 용리시킨 후 완충제 B의 5CV에 의한 용리 후 단계 처리한다. 유속 1.0㎝/분의 사용에 의해 용리 단계를 수행한다.
후속적으로, MW 20kD의 아미노옥시-PEG 시약을 15분 부드러운 교반 하에 최대 시간 기간(t) 내에서 정제 산화된 rFIX를 함유하는 용리액에 50배 몰 과량으로 첨가한다. 이어서, 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 15분 내에 첨가하여 최종 농도 10mM을 얻는다. 반응 혼합물을 암실에서 T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 120 +/- 10분 동안 부드러운 진탕 하에 인큐베이션시킨다.
얻어진 PEG-rFIX 컨쥬게이트를 층 높이(h) 15㎝ 및 얻어진 칼럼 용적(CV)의 81㎖을 지니는 GE 헬스케어에 의해 제조된 칼럼에 채운 페닐 세파로스 FF 저 서브 수지(GE 헬스케어)를 사용하여 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에 의해 정제한다.
반응 혼합물을 350mM 염화나트륨, 8M 아세트산암모늄, 5mM 염화칼슘을 함유하는 50mM 헤페스 완충제, pH 6.9의 첨가에 의해 아세트산암모늄으로 보충한다. 2 용적의 반응 혼합물을 1 용적의 아세트산암모늄 함유 완충제 시스템과 혼합하고, pH 값을 0.5N 수성 NaOH 용액의 적가에 의해 pH 6.9로 보정한다. 이 혼합물을 유속 1㎝/분을 사용하여 HIC 칼럼 상에 장입한 후, 3CV 초과의 평형상태 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 2.5M 아세트산암모늄, 5mM 염화칼슘, pH 6.9)를 사용하여 세척 단계를 수행한다.
반응 부산물 및 항-카오트로픽염의 제거를 위해, 제2 세척 단계를 유속 2㎝/분에서 상류 방식으로 5CV 초과의 세척 완충제 1(50mM 헤페스, 3M 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.9)을 이용하여 수행한다. 이어서, 정제된 rFVIIa 컨쥬게이트의 용리를 유속 1㎝/분에서 40% 세척 완충제 2(50mM 헤페스, 1.5M 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.9) 및 60% 용리 완충제(20mM 헤페스, 5mM 염화칼슘, pH 7.5)의 단계 구배를 사용하여 하류 방식으로 수행한다. PEG-rFIX 컨쥬게이트의 용리를 UV 280㎚에서 모니터링하고, 컨쥬게이트를 함유하는 용리액을 4CV 미만 이내에서 수집한다. 용리 후 단계를 동일한 조건 하에서 3CV 초과의 용리 완충제로 수행하여 주요 생성물로부터 부수적 및/또는 미변형 rFIX를 분리시켰다.
최종적으로 정제된 컨쥬게이트를 분자량 컷 오프가 10kD(88㎠, 밀리포어)인 재생 셀룰로스로 만들어진 막을 사용하여 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 농축시킨다.
이 절차의 사용에 의해 제조한 컨쥬게이트를 전체 단백질 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 2:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 rFIX를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. rFIX의 초기 농도 또는 중량을 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 150mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 옮기거나 또는 용해시켜서 최종 단백질 농도 2㎎ rFIX/㎖를 얻는다. 후속적으로 15분 내에 5mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 첨가하여 최종 농도 100μM을 제공한 후, 50mM 수성 m-톨루이딘 용액의 첨가로 30분의 시간 기간 내에 최종 농도 10mM을 얻는다. 이어서, MW가 20kD(상기 기재함)인 아미노옥시-PEG 시약을 첨가하여 20배 몰 과량의 시약을 제공한다. pH를 6.0으로 보정한 후, 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 1M 수성 L-시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켜 최종 농도 10mM을 제공한다.
유리 rFIX를 이온 교환 크로마토그래피(IEC)에 의해 제거하였다. 반응 혼합물을 적절한 양의 완충제 A(50mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 7.5)로 희석시켜 완충제 A를 이용하여 사전 평형상태로 만든 20㎖ HiPrep QFF 16/10 칼럼(GE 헬스케어, 코네티컷주 페어필드에 소재)에 장입하기 전에 용액 전도도 및 pH 값을 보정하였다. 이어서, 칼럼을 완충제 B(50mM 헤페스, 1M NaCl, 5mM CaCl2, pH 7.5)로 용리시켰다. 25%의 완충제 B를 사용하여 단계 구배에 의해 유리 rFIX를 용리시키는데, 이는 얻어진 분획에서 12 내지 25 mS/㎝의 전도도 및 50% 완충제 B의 단계 구배를 사용하는 컨쥬게이트를 초래하고, 컨쥬게이트 분획에서 27 내지 45mS/㎝의 전도도를 초래하였다. 완충제 C(50mM 헤페스, 5 M NaCl, 5mM CaCl2, pH 6.9; 항-카오트로픽염, 예를 들어, 아세트산 암모늄 등의 사용에 의해)를 이용하여 컨쥬게이트 함유 분획의 전도도를 후속적으로 상승시키고, 완충제 D(50mM 헤페스, 3M NaCl, 5mM CaCl2, pH 6.9)를 이용하여 사전에 평행상태로 만든 20㎖ HiPrep 뷰틸 FF 16/10 칼럼(GE 헬스케어, 코네티컷주 페어필드에 소재 또는 비슷한 HIC 매질) 상에 장입한다. 유리 아미노옥시-PEG 시약을 5 CV 완충제 D 내에서 세척하였다. 후속적으로 100% 완충제 E(50mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 7.4)를 이용하여 컨쥬게이트를 용리시켰다. 컨쥬게이트 함유 분획을 재생 셀룰로스(88㎠, 컷-오프 10kD, 밀리포어)로 만들어진 10kD 막을 사용하여 UF/DF에 의해 농축시킨다. 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 7.5)에 대해 최종 정용여과 단계를 수행한다.
전체 단백질(브래드퍼드 및 BCA 절차) 및 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 제제를 분석적으로 특성규명한다.
실시예 16
친핵성 촉매로서 아미노옥시-PEG 시약 및 m-톨루이딘을 사용하는 rFVIIa 의 페길화
방법 1:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 rFVIIa를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. rFVIIa의 출발 중량 또는 농도를 반응 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 용해시키거나 또는 옮겨서 최종 단백질 농도 1.0 +/- 0.25㎎/㎖를 얻는다. 이어서, 용액의 pH를 0.5N 수성 NaOH 용액의 적가에 의해 6.0까지 보정한다. 후속적으로, 40mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 10분 내에 첨가하여 농도 50μM을 제공한다. T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 30 +/- 5분 동안 산화반응을 수행한다. 이어서, T= +22 +/- 2℃에서 15분 내에 수성 L-시스테인 용액(1M)의 첨가에 의해 반응을 중단시켜 반응 혼합물에서 최종 농도 10mM을 제공하였고 60 +/- 5분 동안 인큐베이션시킨다.
산화된 rFVIIa를 EMD TMAE (M)(머렉) 상의 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. 혼합물을 완충제 A(20mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 6.5)로 희석시켜 전도도 5ms/㎝를 제공한다. 이 용액을 유속 1.5㎝/분을 사용하여 칼럼 용적이 10㎖인 IEX 칼럼(층 높이: 5.4 cm) 상에 장입한다. 이 칼럼을 후속적으로 완충제 A과 완충제 B(20mM 헤페스, 5mM CaCl2, 1.0M NaCl, pH 7.0)의 92:8 혼합물(w/w)의 5CV로 세척한다(유속: 1.5㎝/분). 이어서, 산화된 rFVIIa를 완충제 A와 완충제 B의 50:50 (w/w) 혼합물로 용리시킨 후 완충제 B의 5CV에 의한 용리 후 단계 처리한다. 유속 1.0㎝/분의 사용에 의해 용리 단계를 수행한다.
후속적으로, MW 20kD의 아미노옥시-PEG 시약을 15분 부드러운 교반 하에 최대 시간 기간(t) 내에서 정제 산화된 rFVIIa를 함유하는 용리액에 50배 몰 과량으로 첨가한다. 이어서, 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 15분 내에 첨가하여 최종 농도 10mM을 얻는다. 반응 혼합물을 암실에서 T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 120 +/- 10분 동안 부드러운 진탕 하에 인큐베이션시킨다.
얻어진 PEG-rFVIIa 컨쥬게이트를 층 높이(h) 15㎝ 및 얻어진 칼럼 용적(CV)의 81㎖을 지니는 GE 헬스케어에 의해 제조된 칼럼에 채운 페닐 세파로스 FF 저 서브 수지(GE 헬스케어)를 사용하여 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에 의해 정제한다.
반응 혼합물을 350mM 염화나트륨, 8M 아세트산암모늄, 5mM 염화칼슘을 함유하는 50mM 헤페스 완충제, pH 6.9의 첨가에 의해 아세트산암모늄으로 보충한다. 2 용적의 반응 혼합물을 1 용적의 아세트산암모늄 함유 완충제 시스템과 혼합하고, pH 값을 0.5N 수성 NaOH 용액의 적가에 의해 pH 6.9로 보정한다. 이 혼합물을 유속 1㎝/분을 사용하여 HIC 칼럼 상에 장입한 후, 3CV 초과의 평형상태 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 2.5M 아세트산암모늄, 5mM 염화칼슘, pH 6.9)를 사용하여 세척 단계를 수행한다.
반응 부산물 및 항-카오트로픽염의 제거를 위해, 제2 세척 단계를 유속 2㎝/분에서 상류 방식으로 5CV 초과의 세척 완충제 1(50mM 헤페스, 3M 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.9)을 이용하여 수행한다. 이어서, 정제된 rFVIIa 컨쥬게이트의 용리를 유속 1㎝/분에서 40% 세척 완충제 2(50mM 헤페스, 1.5M 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.9) 및 60% 용리 완충제(20mM 헤페스, 5mM 염화칼슘, pH 7.5)의 단계 구배를 사용하여 하류 방식으로 수행한다. PEG-rFVIIa 컨쥬게이트의 용리를 UV 280㎚에서 모니터링하고, 컨쥬게이트를 함유하는 용리액을 4CV 미만 이내에서 수집한다. 용리 후 단계를 동일한 조건 하에서 3CV 초과의 용리 완충제로 수행하여 주요 생성물로부터 부수적 및/또는 미변형 rFVIIa를 분리시켰다.
최종적으로 정제된 컨쥬게이트를 분자량 컷 오프가 10kD(밀리포어)인 재생 셀룰로스로 만들어진 막을 사용하여 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 농축시킨다.
이 절차의 사용에 의해 제조한 컨쥬게이트를 전체 단백질 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 2:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 rFVIIa를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. rFVIIa의 초기 농도 또는 중량을 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 150mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 옮기거나 또는 용해시켜서 최종 단백질 농도 2㎎ rFVIIa/㎖를 얻는다. 후속적으로 15분 내에 5mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 첨가하여 최종 농도 100μM을 제공한 후, 50mM 수성 m-톨루이딘 용액의 첨가로 30분의 시간 기간 내에 최종 농도 10mM을 얻는다. 이어서, MW가 20kD(상기 기재함)인 아미노옥시-PEG 시약을 첨가하여 20배 몰 과량의 시약을 제공한다. Ph를 6.0으로 보정한 후, 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 1M 수성 L-시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켜 최종 농도 10mM을 제공한다.
유리 rFVIIa를 이온 교환 크로마토그래피(IEC)에 의해 제거하였다. 반응 혼합물을 적절한 양의 완충제 A(50mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 7.5)로 희석시켜 완충제 A를 이용하여 사전 평형상태로 만든 20㎖ HiPrep QFF 16/10 칼럼(GE 헬스케어, 코네티컷주 페어필드에 소재)에 장입하기 전에 용액 전도도 및 pH 값을 보정하였다. 이어서, 칼럼을 완충제 B(50mM 헤페스, 1M NaCl, 5mM CaCl2, pH 7.5)로 용리시켰다. 25%의 완충제 B를 사용하여 단계 구배에 의해 유리 rFVIIa를 용리시키는데, 이는 얻어진 분획에서 12 내지 25 mS/㎝의 전도도 및 50% 완충제 B의 단계 구배를 사용하는 컨쥬게이트를 초래하고, 컨쥬게이트 분획에서 27 내지 45mS/㎝의 전도도를 초래하였다. 완충제 C(50mM 헤페스, 5 M NaCl, 5mM CaCl2, pH 6.9; 항-카오트로픽염, 예를 들어, 아세트산 암모늄의 사용에 의해)를 이용하여 컨쥬게이트 함유 분획의 전도도를 후속적으로 상승시키고, 완충제 D(50mM 헤페스, 3M NaCl, 5mM CaCl2, pH 6.9)를 이용하여 사전에 평행상태로 만든 20㎖ HiPrep 뷰틸 FF 16/10 칼럼(GE 헬스케어, 코네티컷주 페어필드에 소재 또는 비슷한 HIC 매질) 상에 장입한다. 유리 PEG-시약을 5 CV 완충제 D 내에서 세척하였다. 후속적으로 100% 완충제 E(50mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 7.4)를 이용하여 컨쥬게이트를 용리시켰다. 컨쥬게이트 함유 분획을 재생 셀룰로스(88㎠, 컷-오프 10kD, 밀리포어)로 만들어진 10kD 막을 사용하여 UF/DF에 의해 농축시킨다. 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 7.5)에 대해 최종 정용여과 단계를 수행한다.
전체 단백질(브래드퍼드 및 BCA 절차) 및 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 제제를 분석적으로 특성규명한다.
실시예 17
o-아미노 벤조산의 존재에서 rFIX의 폴리시알산화
방법 1:
8.2㎎ rFIX를 4.0㎖ 히스티딘 완충제, pH 6.0(20mM L-히스티딘, 150mM NaCl, 5mM CaCl2) 중에 용해시킨다. 이어서, 82㎕의 수성 과요오드산나트륨 용액(5mM)을 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 암실에서 4℃에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 4㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켰다. 혼합물에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 바바스핀(Vivaspin) 6 10kD 원심분리 여과기를 사용하여 UF/DF를 실시한다.
산화된 rFIX를 함유하는 잔류물(6.5㎖)을 1.64㎖의 수성 o-아미노 벤조산(50mM)과 혼합하였고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 이어서, MW가 20kD(상기 기재함)인 아미노옥시-PSA 시약을 첨가하여 5배몰 과량을 제공한다. 이 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 암실에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰다.
컨쥬게이트의 추가 정제를 본 명세서에 기재한 바와 같이 수행한다.
방법 2:
MW 20kD(상기 기재함)인 5-배 몰 과량의 아미노옥시-PSA 시약을 함유하는 0.65㎖ 인산나트륨 완충제, pH 6.0 중의 1㎎ rFIX 용액을 제조하였다. 이어서, 친핵성 촉매로서 333㎕의 수성 o-아미노 벤조산 용액(30mM)을 첨가하여 최종 농도 10mM을 제공하였다. 후속적으로 NaIO4(5mM)의 20㎕ 수용액을 첨가하여 최종 농도 100μM을 수득하였다. 결합 공정을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 진탕하에 수행하였고, 15분 동안 실온에서 1㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시킨다. 컨쥬게이트의 추가 정제를 본 명세서에 기재한 바와 같이 수행한다.
실시예 18
친핵성 촉매로서 아미노옥시-PSA 및 m-톨루이딘을 사용하는 EPO의 폴리시알산화
방법 1:
에리트로포이에틴(EPO)의 출발 농도를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮겼고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻었다. 이 용액에, NaIO4를 첨가하여 최종 농도 200μM을 제공한다. 실온에서 30분 동안 암실에서 부드러운 진탕 하에서 산화를 수행한다. 이어서, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인(최종 농도: 10mM)으로 퀀칭시켰다.
다음에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 용액에 비바스핀 원심분리 여과기를 사용하는 UF/DF로 또는, 대안으로, 완충제 A(20mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 7.0)로 평형상태로 만든 20㎖ 용적을 지니는 IEX 칼럼(머렉 EMD TMAE (M))으로 처리한다. 5 CV 완충제 A를 이용하여 칼럼을 평형상태로 만든다. 이어서, 산화된 EPO를 완충제 B(20mM 헤페스, 5mM CaCl2, 1M NaCl, pH 7.0)를 이용하여 용리시켰다. EPO 함유 분획을 수집한다. 단백질 함량을 결정하고(쿠마씨, 브래드퍼드) 반응 완충제를 이용하여 1㎎/㎖로 조절하며, 0.5M HCl의 적가에 의해 pH 6.0으로 조절하였다.
MW 20kD인 50-배 몰 과량의 아미노옥시-PSA 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(최종농도: 10mM)로서 m-톨루이딘을 첨가한다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행한다. 과량의 아미노옥시-PSA 시약을 HIC에 의해 제거한다. 반응 혼합물의 전도도를 암모늄 아세테이트를 함유하는 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, 8M 암모늄 아세테이트, pH 6.9)를 첨가함으로써 조절하고, 50mM 헤페스, 2.5M 암모늄 아세테이트, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.9를 이용하여 사전 평형상태로 만든 80㎖ 페닐 세파로스 FF(GE 헬스케어, 코네티컷주 페어필드에 소재)로 충전한 칼럼 상에 장입하였다. 후속적으로, 5mM CaCl2를 함유하는 50mM 헤페스 완충제 pH 7.5를 이용하여 컨쥬게이트를 용리시킨다. 최종적으로, PSA-EPO 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(MWCO 10kD, 50㎠, 밀리포어)로 만들어진 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시한다. 다음에 제제를 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 1을 다음과 같이 수행한다.
10㎎ EPO를 5㎖ 히스티딘 완충제, pH 6.0(20mM L-히스티딘, 150mM NaCl) 중에 용해시킨다. 이어서, 100㎕의 수성 과요오드산나트륨 용액(5mM)을 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 암실에서 4℃에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 50㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켰다. 후속적으로 혼합물에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 바바스핀 15R 10kD 원심분리 여과기를 사용하여 UF/DF를 실시한다.
산화된 EPO를 함유하는 잔류물(대략 7㎖)을 2㎖의 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합하였고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 이어서, MW가 20kD(상기 기재함)인 아미노옥시-PSA 시약을 첨가하여 5배몰 과량을 제공한다. 이 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 암실에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시킨다.
유리 EPO를 음이온 교환 크로마토그래피(AEC)에 의해 제거한다. 반응 혼합물을 20㎖ 완충제 A(50mM 헤페스, pH 7.5)로 희석시키고, 완충제 A를 이용하여 사전에 평행상태로 만든 20㎖ HiPrep QFF 16/10 칼럼(코네티컷주 페어필드에 소재한 GE 헬스케어(GE Healthcare)) 상에 장입한다. 이어서, 칼럼을 완충제 B(50mM 헤페스, 1M NaCl, pH 7.5)로 용리시킨다. 25% 완충제 B 및 50% 완충제 B에서의 컨쥬게이트를 지니는 칼럼을 세척함으로써 유리 EPO를 용리시킨다. 컨쥬게이트 함유 분획의 전도도를 후속적으로 완충제 C(50mM 헤페스, 5M NaCl, pH 6.9)를 이용하여 190 mS/㎝로 상승시키고, 완충제 D(50mM 헤페스, 3M NaCl, pH 6.9)를 이용하여 사전에 평행상태로 만든 20㎖ HiPrep 뷰틸 FF 16/10 칼럼(GE 헬스케어, 코네티컷주 페어필드에 소재)에 장입하였다. 유리 PSA-시약을 5 CV 완충제 D 내에서 세척한다. 후속적으로 100% 완충제 E(50mM 헤페스, pH 7.4)를 이용하여 컨쥬게이트를 용리시켰다. 컨쥬게이트 함유 분획을 재생 셀룰로스(88㎠, 컷-오프 10kD/밀리포어)로 만들어진 10kD 막을 사용하여 UF/DF에 의해 농축시킨다. 150mM NaCl를 함유하는 히스티딘 완충제(Ph 7.2)에 대해 최종 정용여과 단계를 수행한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다. PSA-EPO 컨쥬게이트에 대해 천연 EPO에 비해 50% 미만의 특이적 활성을 결정한다. 앞서 기재한 조건 하에서 쇼덱스(Shodex) KW 803 칼럼을 구비한 애질런트 1200 HPLC 시스템을 사용하여 크기 배제 HPLC에 의해 컨쥬게이트를 추가적으로 분석적으로 특성규명한다(Kolarich et al, Transfusion 2006;46:1959-77). 이는 제제가 유리 EPO를 함유하지 않는다는 것을 나타낸다.
방법 2:
EPO를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 옮기거나 또는 용해시켜서 최종 단백질 농도 1.0 +/- 0.25㎎/㎖를 얻는다. 이어서, 용액의 pH를 0.5 N 수성 HCl 용액의 적가에 의해 6.0까지 보정한다. 후속적으로, 40mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 10분 내에 첨가하여 농도 200μM을 제공한다. T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 30 +/- 5분 동안 산화반응을 수행한다. 이어서, T= +22 +/- 2℃에서 15분 내에 수성 L-시스테인 용액(1M)의 첨가에 의해 반응을 중단시켜 반응 혼합물에서 최종 농도 10mM을 제공하였고 60 +/- 5분 동안 인큐베이션시킨다.
산화된 EPO를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. 용리액의 산화된 EPO 함유 분획을 수집하고 컨쥬게이션 반응을 위해 사용한다.
아미노옥시-폴리시알산(PSA-ONH2) 시약을 15분 부드러운 교반 하에 최대 시간 기간(t) 내에서 정제 산화된 EPO를 함유하는 용리액에 50배 몰 과량으로 첨가한다. 이어서, 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 15분 내에 첨가하여 최종 농도 10mM을 얻는다. 반응 혼합물을 암실에서 T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 120 +/- 10분 동안 pH 6.0에서 부드러운 진탕 하에 인큐베이션시킨다(단백질 농도: 1㎎/㎖).
얻어진 PSA-EPO 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. PSA-EPO 컨쥬게이트 함유 분획을 수집하고, 적절한 분자량 컷 오프(밀리포어)를 지니는 정제된 컨쥬게이트를 재생 셀룰로스로 만들어진 막을 사용하여 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 농축시킨다.
이 절차의 사용에 의해 제조한 컨쥬게이트를 전체 단백질, 생물학적 활성 및 PSA 함량을 측정하는 것에 의한(레조시놀 분석) 폴리시알릴화 정도의 결정을 측정함으로써 분석적으로 특성규명하였다.
방법 3:
에리트로포이에틴(EPO)을 반응 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮기고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻는다. MW 20kD인 50배 몰 과량의 아미노옥시-PSA 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(10mM 최종농도) 및 NaIO4(최종농도: 400μM)로서 m-톨루이딘을 첨가한다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행한다. 후속적으로, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인을 이용하여 퀀칭시킨다(시스테인 농도: 10mM). 이어서, 반응 혼합물의 전도도를 암모늄 아세테이트를 함유하는 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, 8M 암모늄 아세테이트, pH 6.9)를 첨가함으로써 조절하고, 50mM 헤페스, 2.5M 암모늄 아세테이트, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, 0.01% 트윈 80, pH 6.9를 이용하여 사전 평형상태로 만든 페닐 세파로스 FF(GE 헬스케어, 코네티컷주 페어필드에 소재)로 충전한 칼럼 상에 장입하였다. 후속적으로, 50mM 헤페스 완충제, 5mM을 함유하는 염화칼슘, pH 7.5를 이용하여 컨쥬게이트를 용리시킨다. 최종적으로, PSA-EPO 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(MWCO 10kD, 88㎠, 밀리포어)로 만들어진 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 3을 다음과 같이 수행한다. 10㎎ EPO를 8㎖ 히스티딘 완충제, pH 6.0(20mM L-히스티딘, 150mM NaCl) 중에 용해시킨다. 200㎕의 수성 과요오드산나트륨 용액(5mM) 및 2㎖의 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 첨가한다. 후속적으로, MW가 20kD(상기 기재함)인 아미노옥시-PSA 시약을 첨가하여 5배몰 과량을 제공한다. 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 100㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시킨다.
유리 EPO를 음이온 교환 크로마토그래피(AEC)에 의해 제거한다. 반응 혼합물을 20㎖ 완충제 A(50mM 헤페스, pH 7.5)로 희석시키고, 완충제 A를 이용하여 사전에 평행상태로 만든 20㎖ HiPrep QFF 16/10 칼럼(코네티컷주 페어필드에 소재한 GE 헬스케어(GE Healthcare)) 상에 장입한다. 이어서, 칼럼을 완충제 B(50mM 헤페스, 1M NaCl, pH 7.5)로 용리시킨다. 25% 완충제 B 및 50% 완충제 B에서의 컨쥬게이트를 지니는 칼럼을 세척함으로써 유리 EPO를 용리시킨다. 컨쥬게이트 함유 분획의 전도도를 후속적으로 완충제 C(50mM 헤페스, 5M NaCl, pH 6.9)를 이용하여 190 mS/㎝로 상승시키고, 완충제 D(50mM 헤페스, 3M NaCl, pH 6.9)를 이용하여 사전에 평행상태로 만든 20㎖ HiPrep 뷰틸 FF 16/10 칼럼(GE 헬스케어, 코네티컷주 페어필드에 소재)에 장입하였다. 유리 PSA-시약을 5 CV 완충제 D 내에서 세척한다. 후속적으로 100% 완충제 E(50mM 헤페스, pH 7.4)를 이용하여 컨쥬게이트를 용리시켰다. 컨쥬게이트 함유 분획을 재생 셀룰로스(88㎠, 컷-오프 10kD, 밀리포어)로 만들어진 10kD 막을 사용하여 UF/DF에 의해 농축시킨다. 150mM NaCl를 함유하는 히스티딘 완충제(Ph 7.2)에 대해 최종 정용여과 단계를 수행한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다. PSA-EPO 컨쥬게이트에 대해 천연 EPO에 비해 50% 미만의 특이적 활성을 결정한다. 앞서 기재한 조건 하에서 쇼덱스(Shodex) KW 803 칼럼을 구비한 애질런트 1200 HPLC 시스템을 사용하여 크기 배제 HPLC에 의해 컨쥬게이트를 추가적으로 분석적으로 특성규명한다(Kolarich et al, Transfusion 2006;46:1959-77). 이는 제제가 유리 EPO를 함유하지 않는다는 것을 나타낸다.
방법 4:
EPO를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 용해시키거나 또는 옮겨서 최종 단백질 농도 1.0 +/- 0.25㎎/㎖를 얻는다. 이어서, 용액의 pH를 0.5 N 수성 HCl 용액의 적가에 의해 6.0까지 보정한다.
후속적으로, 아미노옥시-폴리시알산(PSA-ONH2) 시약을 15분 부드러운 교반 하에 최대 시간 기간(t) 내에서 이 EPO 용액을 함유하는 용리액에 50배 몰 과량으로 첨가한다. 이어서, 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 15분 내에 첨가하여 최종 농도 10mM을 얻는다. 최종적으로, 40mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 첨가하여 농도 400μM을 제공한다.
반응 혼합물을 암실에서 T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 120 +/- 10분 동안 부드러운 진탕 하에 인큐베이션시킨다. 이어서, 수성 L-시스테인 용액(1M)의 첨가에 의해 반응을 중단시켜 반응 혼합물에서 최종 농도 10mM을 제공하였고 60 +/- 5분 동안 인큐베이션시킨다.
얻어진 PSA-EPO 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 용리액의 PSA-EPO 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(MWCO 10kD, 88㎠, 밀리포어)로 만들어진 막을 사용하여 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 농축시킨다.
이 절차의 사용에 의해 제조한 컨쥬게이트를 전체 단백질, 당업계에 공지된 방법에 따라 생물학적 활성 및 PSA 함량을 측정하는 것에 의한(레조시놀 분석) 폴리시알릴화 정도의 결정을 측정함으로써 분석적으로 특성규명하였다.
실시예 19
친핵성 촉매로서 아미노옥시-PSA 및 m-톨루이딘을 사용하는 Ang-2 의 폴리시알산화
방법 1:
안지오포이에틴-2(Ang-2)의 출발 농도를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮겼고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻었다. 이 용액에, NaIO4를 첨가하여 최종 농도 200μM을 제공한다. 실온에서 30분 동안 암실에서 부드러운 진탕 하에서 산화를 수행한다. 이어서, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인(최종 농도: 10mM)으로 퀀칭시켰다.
다음에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 부산물을 제거하기 위해 용액에 비바스핀 원심분리 여과기를 사용하는 UF/DF를 실시하고, 대안으로, 완충제 A(20mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 7.0)로 평형상태로 만든 20㎖ 용적을 지니는 IEX 칼럼(머렉 EMD TMAE (M))으로 처리한다. 5 CV 완충제 A를 이용하여 칼럼을 평형상태로 만든다. 이어서, 산화된 Ang-2를 완충제 B(20mM 헤페스, 5mM CaCl2, 1M NaCl, pH 7.0)를 이용하여 용리시켰다. Ang-2 함유 분획을 수집한다. 단백질 함량을 결정하고(쿠마씨, 브래드퍼드) 반응 완충제를 이용하여 1㎎/㎖로 조절하며, 0.5M HCl의 적가에 의해 pH 6.0으로 조절한다.
MW 20kD인 50-배 몰 과량의 아미노옥시-PSA 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(최종농도: 10mM)로서 m-톨루이딘을 첨가한다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행한다. 과량의 아미노옥시 시약을 HIC에 의해 제거한다. 반응 혼합물의 전도도를 암모늄 아세테이트를 함유하는 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, 8M 암모늄 아세테이트, pH 6.9)를 첨가함으로써 조절하고, 50mM 헤페스, 2.5M 암모늄 아세테이트, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.9를 이용하여 사전 평형상태로 만든 80㎖ 페닐 세파로스 FF(GE 헬스케어, 코네티컷주 페어필드에 소재)로 충전한 칼럼 상에 장입하였다. 후속적으로, 5mM CaCl2를 함유하는 50mM 헤페스 완충제 pH 7.5를 이용하여 컨쥬게이트를 용리시킨다. 최종적으로, PSA - Ang-2-함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시한다. 다음에 제제를 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 1을 다음과 같이 수행한다. 안지오포이에틴-2(Ang-2)를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮겼고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻었다. 이 용액에, NaIO4를 첨가하여 최종 농도 200μM을 제공한다. 실온에서 30분 동안 암실에서 부드러운 진탕 하에서 산화를 수행한다. 이어서, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인(최종 농도: 10mM)으로 퀀칭시켰다.
다음에 용액에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 바바스핀 원심분리 여과기를 사용하여 UF/DF를 실시한다.
MW 20kD인 50-배 몰 과량의 아미노옥시-PSA 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(최종농도: 10mM)로서 m-톨루이딘을 첨가한다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행한다. 과량의 아미노옥시 시약을 이온 교환 크로마토그래피에 의해 제거한다. 용리액의 PSA-Ang-2-컨쥬게이트-함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시한다. 다음에 제제를 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 2:
Ang-2를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 옮기거나 또는 용해시켜서 최종 단백질 농도 1.0 +/- 0.25㎎/㎖를 얻는다. 이어서, 용액의 pH를 0.5 N 수성 HCl 용액의 적가에 의해 6.0까지 보정한다. 후속적으로, 40mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 10분 내에 첨가하여 농도 200μM을 제공한다. T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 30 +/- 5분 동안 산화반응을 수행한다. 이어서, T= +22 +/- 2℃에서 15분 내에 수성 L-시스테인 용액(1M)의 첨가에 의해 반응을 중단시켜 반응 혼합물에서 최종 농도 10mM을 제공하였고 60 +/- 5분 동안 인큐베이션시킨다.
산화된 Ang-2를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. 용리액의 산화된 Ang-2 함유 분획을 수집하고 컨쥬게이션 반응을 위해 사용한다.
아미노옥시-폴리시알산(PSA-ONH2) 시약을 15분 부드러운 교반 하에 최대 시간 기간(t) 내에서 정제 산화된 Ang-2를 함유하는 용리액에 50배 몰 과량으로 첨가한다. 이어서, 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 15분 내에 첨가하여 최종 농도 10mM을 얻는다. 반응 혼합물을 암실에서 T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 120 +/- 10분 동안 pH 6.0에서 부드러운 진탕 하에 인큐베이션시킨다(단백질 농도: 1㎎/㎖).
얻어진 PSA-Ang-2 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다.
PSA-Ang-2 컨쥬게이트 함유 분획을 수집하고, 적절한 분자량 컷 오프(밀리포어)를 지니는 정제된 컨쥬게이트를 재생 셀룰로스로 만들어진 막을 사용하여 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 농축시킨다.
이 절차의 사용에 의해 제조한 컨쥬게이트를 전체 단백질, 생물학적 활성 및 PSA 함량을 측정하는 것에 의한(레조시놀 분석) 폴리시알릴화 정도의 결정을 측정함으로써 분석적으로 특성규명하였다.
방법 3:
안지오포이에틴-2(Ang-2)를 반응 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮기고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻는다. MW 20kD인 50배 몰 과량의 PSA 아미노옥시 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(10mM 최종농도) 및 NaIO4(최종농도: 400μM)로서 m-톨루이딘을 첨가한다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행한다. 후속적으로, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인을 이용하여 퀀칭시킨다(시스테인 농도: 10mM). 이어서, 반응 혼합물의 전도도를 암모늄 아세테이트를 함유하는 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, 8M 암모늄 아세테이트, pH 6.9)를 첨가함으로써 조절하고, 50mM 헤페스, 2.5M 암모늄 아세테이트, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, 0.01% 트윈 80, pH 6.9를 이용하여 사전 평형상태로 만든 페닐 세파로스 FF(GE 헬스케어, 코네티컷주 페어필드에 소재)로 충전한 칼럼 상에 장입하였다. 후속적으로, 50mM 헤페스 완충제, 5mM을 함유하는 염화칼슘, pH 7.5를 이용하여 컨쥬게이트를 용리시킨다. 최종적으로, PSA-Ang-2-함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 3을 다음과 같이 수행한다. 안지오포이에틴-2(Ang-2)를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮기고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻는다. MW 20kD인 50배 몰 과량의 PSA 아미노옥시 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(10mM 최종농도) 및 NaIO4(최종농도: 400μM)로서 m-톨루이딘을 첨가한다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행한다. 후속적으로, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인을 이용하여 퀀칭시키고(시스테인 농도: 10mM), 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 용리액의 PSA Ang-2-함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 4:
Ang-2를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 용해시키거나 또는 옮겨서 최종 단백질 농도 1.0 +/- 0.25㎎/㎖를 얻는다. 이어서, 용액의 pH를 0.5 N 수성 HCl 용액의 적가에 의해 6.0까지 보정한다.
후속적으로, 아미노옥시-폴리시알산(PSA-ONH2) 시약을 15분 부드러운 교반 하에 최대 시간 기간(t) 내에서 이 Ang-2 용액을 함유하는 용리액에 50배 몰 과량으로 첨가한다. 이어서, 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 15분 내에 첨가하여 최종 농도 10mM을 얻는다. 최종적으로, 40mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 첨가하여 농도 400μM을 제공한다.
반응 혼합물을 암실에서 T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 120 +/- 10분 동안 부드러운 진탕 하에 인큐베이션시킨다. 이어서, 수성 L-시스테인 용액(1M)의 첨가에 의해 반응을 중단시켜 반응 혼합물에서 최종 농도 10mM을 제공하였고 60 +/- 5분 동안 인큐베이션시킨다.
얻어진 PSA-Ang-2 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 용리액의 PSA-Ang-2 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막을 사용하여 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 농축시킨다.
이 절차의 사용에 의해 제조한 컨쥬게이트를 전체 단백질, 당업계에 공지된 방법에 따라 생물학적 활성 및 PSA 함량을 측정하는 것에 의한(레조시놀 분석) 폴리시알릴화 정도의 결정을 측정함으로써 분석적으로 특성규명하였다.
실시예 20
친핵성 촉매로서 아미노옥시-PSA 및 m-톨루이딘을 사용하는 VEGF의 폴리시알산화
방법 1:
혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 출발 농도를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮겼고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻었다. 이 용액에, NaIO4를 첨가하여 최종 농도 200μM을 제공한다. 실온에서 30분 동안 암실에서 부드러운 진탕 하에서 산화를 수행한다. 이어서, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인(최종 농도: 10mM)으로 퀀칭시켰다.
다음에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 용액에 비바스핀 원심분리 여과기를 사용하는 UF/DF로 또는, 대안으로, 완충제 A(20mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 7.0)로 평형상태로 만든 20㎖ 용적을 지니는 IEX 칼럼(머렉 EMD TMAE (M))으로 처리한다. 5 CV 완충제 A를 이용하여 칼럼을 평형상태로 만든다. 이어서, 산화된 VEGF를 완충제 B(20mM 헤페스, 5mM CaCl2, 1M NaCl, pH 7.0)를 이용하여 용리시켰다. VEGF 함유 분획을 수집한다. 단백질 함량을 결정하고(쿠마씨, 브래드퍼드) 반응 완충제를 이용하여 1㎎/㎖로 조절하며, 0.5M NaOH의 적가에 의해 pH 6.0으로 조절하였다.
MW 20kD인 50-배 몰 과량의 아미노옥시-PSA 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(최종농도: 10mM)로서 m-톨루이딘을 첨가한다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행한다. 과량의 아미노옥시 시약을 HIC에 의해 제거한다. 반응 혼합물의 전도도를 암모늄 아세테이트를 함유하는 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, 8M 암모늄 아세테이트, pH 6.9)를 첨가함으로써 조절하고, 50mM 헤페스, 2.5M 암모늄 아세테이트, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.9를 이용하여 사전 평형상태로 만든 80㎖ 페닐 세파로스 FF(GE 헬스케어, 코네티컷주 페어필드에 소재)로 충전한 칼럼 상에 장입하였다. 후속적으로, 5mM CaCl2를 함유하는 50mM 헤페스 완충제 pH 7.5를 이용하여 컨쥬게이트를 용리시킨다. 최종적으로, PSA-VEGF-함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시한다. 다음에 제제를 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 1을 다음과 같이 수행한다. 혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮겼고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻었다. 이 용액에, NaIO4를 첨가하여 최종 농도 200μM을 제공한다. 실온에서 30분 동안 암실에서 부드러운 진탕 하에서 산화를 수행한다. 이어서, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인(최종 농도: 10mM)으로 퀀칭시켰다.
다음에 용액에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 바바스핀 원심분리 여과기를 사용하여 UF/DF를 실시한다.
MW 20kD인 50-배 몰 과량의 아미노옥시-PSA 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(최종농도: 10mM)로서 m-톨루이딘을 첨가한다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행한다. 과량의 아미노옥시 시약을 이온 교환 크로마토그래피에 의해 제거한다. 용리액의 PSA-VEGF-함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시한다. 다음에 제제를 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 2:
VEGF를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 옮기거나 또는 용해시켜서 최종 단백질 농도 1.0 +/- 0.25㎎/㎖를 얻는다. 이어서, 용액의 pH를 0.5 N 수성 HCl 용액의 적가에 의해 6.0까지 보정한다. 후속적으로, 40mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 10분 내에 첨가하여 농도 200μM을 제공한다. T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 30 +/- 5분 동안 산화반응을 수행한다. 이어서, T= +22 +/- 2℃에서 15분 내에 수성 L-시스테인 용액(1M)의 첨가에 의해 반응을 중단시켜 반응 혼합물에서 최종 농도 10mM을 제공하였고 60 +/- 5분 동안 인큐베이션시킨다.
산화된 VEGF를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. 용리액의 산화된 VEGF 함유 분획을 수집하고 컨쥬게이션 반응을 위해 사용한다.
아미노옥시-폴리시알산(PSA-ONH2) 시약을 15분 부드러운 교반 하에 최대 시간 기간(t) 내에서 정제 산화된 VEGF를 함유하는 용리액에 50배 몰 과량으로 첨가한다. 이어서, 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 15분 내에 첨가하여 최종 농도 10mM을 얻는다. 반응 혼합물을 암실에서 T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 120 +/- 10분 동안 pH 6.0에서 부드러운 진탕 하에 인큐베이션시킨다(단백질 농도: 1㎎/㎖).
얻어진 PSA-VEGF 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. PSA-VEGF 컨쥬게이트 함유 분획을 수집하고, 적절한 분자량 컷 오프(밀리포어)를 지니는 정제된 컨쥬게이트를 재생 셀룰로스로 만들어진 막을 사용하여 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 농축시킨다.
이 절차의 사용에 의해 제조한 컨쥬게이트를 전체 단백질, 생물학적 활성 및 PSA 함량을 측정하는 것에 의한(레조시놀 분석) 폴리시알릴화 정도의 결정을 측정함으로써 분석적으로 특성규명하였다.
방법 3:
혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 반응 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮겼고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻었다. MW 20kD인 50배 몰 과량의 PSA 아미노옥시 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(10mM 최종농도) 및 NaIO4(최종농도: 400μM)로서 m-톨루이딘을 첨가한다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행한다. 후속적으로, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인을 이용하여 퀀칭시킨다(시스테인 농도: 10mM). 이어서, 반응 혼합물의 전도도를 암모늄 아세테이트를 함유하는 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, 8M 암모늄 아세테이트, pH 6.9)를 첨가함으로써 조절하고, 50mM 헤페스, 2.5M 암모늄 아세테이트, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, 0.01% 트윈 80, pH 6.9를 이용하여 사전 평형상태로 만든 페닐 세파로스 FF(GE 헬스케어, 코네티컷주 페어필드에 소재)로 충전한 칼럼 상에 장입하였다. 후속적으로, 50mM 헤페스 완충제, 5mM을 함유하는 염화칼슘, pH 7.5를 이용하여 컨쥬게이트를 용리시킨다. 최종적으로, PSA-VEGF 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 3을 다음과 같이 수행한다. 혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮겼고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻었다. MW 20kD인 50배 몰 과량의 아미노옥시-PSA 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(10mM 최종농도) 및 NaIO4(최종농도: 400μM)로서 m-톨루이딘을 첨가한다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행한다. 후속적으로, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인을 이용하여 퀀칭시키고(시스테인 농도: 10mM), 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 용리액의 PSA-VEGF 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 4:
VEGF를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 용해시키거나 또는 옮겨서 최종 단백질 농도 1.0 +/- 0.25㎎/㎖를 얻는다. 이어서, 용액의 pH를 0.5 N 수성 HCl 용액의 적가에 의해 6.0까지 보정한다.
후속적으로, 아미노옥시-폴리시알산(PSA-ONH2) 시약을 15분 부드러운 교반 하에 최대 시간 기간(t) 내에서 이 VEGF 용액을 함유하는 용리액에 50배 몰 과량으로 첨가한다. 이어서, 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 15분 내에 첨가하여 최종 농도 10mM을 얻는다. 최종적으로, 40mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 첨가하여 농도 400μM을 제공한다.
반응 혼합물을 암실에서 T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 120 +/- 10분 동안 부드러운 진탕 하에 인큐베이션시킨다. 이어서, 수성 L-시스테인 용액(1M)의 첨가에 의해 반응을 중단시켜 반응 혼합물에서 최종 농도 10mM을 제공하였고 60 +/- 5분 동안 인큐베이션시킨다.
얻어진 VEGF-컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 용리액의 PSA-VEGF 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막을 사용하여 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 농축시킨다.
이 절차의 사용에 의해 제조한 컨쥬게이트를 전체 단백질, 당업계에 공지된 방법에 따라 생물학적 활성 및 PSA 함량을 측정하는 것에 의한(레조시놀 분석) 폴리시알릴화 정도의 결정을 측정함으로써 분석적으로 특성규명하였다.
실시예 21
친핵성 촉매로서 아미노옥시-PSA 및 m-톨루이딘을 사용하는 EGF의 폴리시알산화
방법 1:
표피 성장 인자(EGF)의 출발 농도를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮겼고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻었다. 이 용액에, NaIO4를 첨가하여 최종 농도 200μM을 제공한다. 실온에서 30분 동안 암실에서 부드러운 진탕 하에서 산화를 수행한다. 이어서, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인(최종 농도: 10mM)으로 퀀칭시켰다.
다음에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 용액에 비바스핀 원심분리 여과기를 사용하는 UF/DF로 또는, 대안으로, 완충제 A(20mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 7.0)로 평형상태로 만든 20㎖ 용적을 지니는 IEX 칼럼(머렉 EMD TMAE (M))으로 처리한다. 5 CV 완충제 A를 이용하여 칼럼을 평형상태로 만든다. 이어서, 산화된 EGF를 완충제 B(20mM 헤페스, 5mM CaCl2, 1M NaCl, pH 7.0)를 이용하여 용리시켰다. EGF 함유 분획을 수집한다. 단백질 함량을 결정하고(쿠마씨, 브래드퍼드) 반응 완충제를 이용하여 1㎎/㎖로 조절하며, 0.5M HCl의 적가에 의해 pH 6.0으로 조절하였다.
MW 20kD인 50-배 몰 과량의 아미노옥시-PSA 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(최종농도: 10mM)로서 m-톨루이딘을 첨가한다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행한다. 과량의 아미노옥시 시약을 HIC에 의해 제거한다. 반응 혼합물의 전도도를 암모늄 아세테이트를 함유하는 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, 8M 암모늄 아세테이트, pH 6.9)를 첨가함으로써 조절하고, 50mM 헤페스, 2.5M 암모늄 아세테이트, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.9를 이용하여 사전 평형상태로 만든 80㎖ 페닐 세파로스 FF(GE 헬스케어, 코네티컷주 페어필드에 소재)로 충전한 칼럼 상에 장입하였다. 후속적으로, 5mM CaCl2를 함유하는 50mM 헤페스 완충제 pH 7.5를 이용하여 컨쥬게이트를 용리시킨다. 최종적으로, PSA-EGF 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시한다. 다음에 제제를 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 1을 다음과 같이 수행한다. 표피 성장 인자(EGF)를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮겼고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻었다. 이 용액에, NaIO4를 첨가하여 최종 농도 200μM을 제공한다. 실온에서 30분 동안 암실에서 부드러운 진탕 하에서 산화를 수행한다. 이어서, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인(최종 농도: 10mM)으로 퀀칭시켰다.
다음에 용액에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 바바스핀 원심분리 여과기를 사용하여 UF/DF를 실시한다.
MW 20kD인 50-배 몰 과량의 아미노옥시-PSA 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(최종농도: 10mM)로서 m-톨루이딘을 첨가한다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행한다. 과량의 아미노옥시 시약을 이온 교환 크로마토그래피에 의해 제거한다. 용리액의 PSA-EGF 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시한다. 다음에 제제를 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 2:
EGF를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 옮기거나 또는 용해시켜서 최종 단백질 농도 1.0 +/- 0.25㎎/㎖를 얻는다. 이어서, 용액의 pH를 0.5 N 수성 HCl 용액의 적가에 의해 6.0까지 보정한다. 후속적으로, 40mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 10분 내에 첨가하여 농도 200μM을 제공한다. T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 30 +/- 5분 동안 산화반응을 수행한다. 이어서, T= +22 +/- 2℃에서 15분 내에 수성 L-시스테인 용액(1M)의 첨가에 의해 반응을 중단시켜 반응 혼합물에서 최종 농도 10mM을 제공하였고 60 +/- 5분 동안 인큐베이션시킨다.
산화된 EGF를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. 용리액의 산화된 EGF 함유 분획을 수집하고 컨쥬게이션 반응을 위해 사용한다.
아미노옥시-폴리시알산(PSA-ONH2) 시약을 15분 부드러운 교반 하에 최대 시간 기간(t) 내에서 정제 산화된 EGF를 함유하는 용리액에 50배 몰 과량으로 첨가한다. 이어서, 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 15분 내에 첨가하여 최종 농도 10mM을 얻는다. 반응 혼합물을 암실에서 T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 120 +/- 10분 동안 pH 6.0에서 부드러운 진탕 하에 인큐베이션시킨다(단백질 농도: 1㎎/㎖).
얻어진 PSA-EGF 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. PSA-EGF 컨쥬게이트 함유 분획을 수집하고, 적절한 분자량 컷 오프(밀리포어)를 지니는 정제된 컨쥬게이트를 재생 셀룰로스로 만들어진 막을 사용하여 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 농축시킨다.
이 절차의 사용에 의해 제조한 컨쥬게이트를 전체 단백질, 생물학적 활성 및 PSA 함량을 측정하는 것에 의한(레조시놀 분석) 폴리시알릴화 정도의 결정을 측정함으로써 분석적으로 특성규명하였다.
방법 3:
표피 성장 인자(EGF)를 반응 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮겼고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻었다. MW 20kD인 50배 몰 과량의 PSA 아미노옥시 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(10mM 최종농도) 및 NaIO4(최종농도: 400μM)로서 m-톨루이딘을 첨가한다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행한다. 후속적으로, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인을 이용하여 퀀칭시킨다(시스테인 농도: 10mM). 이어서, 반응 혼합물의 전도도를 암모늄 아세테이트를 함유하는 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, 8M 암모늄 아세테이트, pH 6.9)를 첨가함으로써 조절하고, 50mM 헤페스, 2.5M 암모늄 아세테이트, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, 0.01% 트윈 80, pH 6.9를 이용하여 사전 평형상태로 만든 페닐 세파로스 FF(GE 헬스케어, 코네티컷주 페어필드에 소재)로 충전한 칼럼 상에 장입하였다. 후속적으로, 50mM 헤페스 완충제, 5mM을 함유하는 염화칼슘, pH 7.5를 이용하여 컨쥬게이트를 용리시킨다. 최종적으로, PSA-EGF 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 3을 다음과 같이 수행한다. 표피 성장 인자(EGF)를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮겼고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻었다. MW 20kD인 50배 몰 과량의 PSA 아미노옥시 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(10mM 최종농도) 및 NaIO4(최종농도: 400μM)로서 m-톨루이딘을 첨가한다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행한다. 후속적으로, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인을 이용하여 퀀칭시키고(시스테인 농도: 10mM), 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 용리액의 컨쥬게이트 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 4:
EGF를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 용해시키거나 또는 옮겨서 최종 단백질 농도 1.0 +/- 0.25㎎/㎖를 얻는다. 이어서, 용액의 pH를 0.5 N 수성 HCl 용액의 적가에 의해 6.0까지 보정한다.
후속적으로, 아미노옥시-폴리시알산(PSA-ONH2) 시약을 15분 부드러운 교반 하에 최대 시간 기간(t) 내에서 이 EGF-용액을 함유하는 용리액에 50배 몰 과량으로 첨가한다. 이어서, 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 15분 내에 첨가하여 최종 농도 10mM을 얻는다. 최종적으로, 40mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 첨가하여 농도 400μM을 제공한다.
반응 혼합물을 암실에서 T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 120 +/- 10분 동안 부드러운 진탕 하에 인큐베이션시킨다. 이어서, 수성 L-시스테인 용액(1M)의 첨가에 의해 반응을 중단시켜 반응 혼합물에서 최종 농도 10mM을 제공하였고 60 +/- 5분 동안 인큐베이션시킨다.
얻어진 EGF-컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 용리액의 PSA-EGF 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막을 사용하여 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 농축시킨다.
이 절차의 사용에 의해 제조한 컨쥬게이트를 전체 단백질, 당업계에 공지된 방법에 따라 생물학적 활성 및 PSA 함량을 측정하는 것에 의한(레조시놀 분석) 폴리시알릴화 정도의 결정을 측정함으로써 분석적으로 특성규명하였다.
실시예 22
친핵성 촉매로서 아미노옥시-PSA 및 m-톨루이딘을 사용하는 NGF의 폴리시알산화
방법 1:
신경 성장 인자(NGF)의 출발 농도를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮겼고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻었다. 이 용액에, NaIO4를 첨가하여 최종 농도 200μM을 제공한다. 실온에서 30분 동안 암실에서 부드러운 진탕 하에서 산화를 수행한다. 이어서, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인(최종 농도: 10mM)으로 퀀칭시켰다.
다음에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 용액에 비바스핀 원심분리 여과기를 사용하는 UF/DF로 또는, 대안으로, 완충제 A(20mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 7.0)로 평형상태로 만든 20㎖ 용적을 지니는 IEX 칼럼(머렉 EMD TMAE (M))으로 처리한다. 5 CV 완충제 A를 이용하여 칼럼을 평형상태로 만든다. 이어서, 산화된 NGF를 완충제 B(20mM 헤페스, 5mM CaCl2, 1M NaCl, pH 7.0)를 이용하여 용리시켰다. NGF 함유 분획을 수집한다. 단백질 함량을 결정하고(쿠마씨, 브래드퍼드) 반응 완충제를 이용하여 1㎎/㎖로 조절하며, 0.5M HCl의 적가에 의해 pH 6.0으로 조절하였다.
MW 20kD인 50-배 몰 과량의 아미노옥시-PSA 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(최종농도: 10mM)로서 m-톨루이딘을 첨가한다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행한다. 과량의 아미노옥시 시약을 HIC에 의해 제거한다. 반응 혼합물의 전도도를 암모늄 아세테이트를 함유하는 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, 8M 암모늄 아세테이트, pH 6.9)를 첨가함으로써 조절하고, 50mM 헤페스, 2.5M 암모늄 아세테이트, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.9를 이용하여 사전 평형상태로 만든 80㎖ 페닐 세파로스 FF(GE 헬스케어, 코네티컷주 페어필드에 소재)로 충전한 칼럼 상에 장입하였다. 후속적으로, 5mM CaCl2를 함유하는 50mM 헤페스 완충제 pH 7.5를 이용하여 컨쥬게이트를 용리시킨다. 최종적으로, PSA-NGF 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시한다. 다음에 제제를 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 1을 다음과 같이 수행한다. 신경 성장 인자(NGF)를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮겼고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻었다. 이 용액에, NaIO4를 첨가하여 최종 농도 200μM을 제공한다. 실온에서 30분 동안 암실에서 부드러운 진탕 하에서 산화를 수행한다. 이어서, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인(최종 농도: 10mM)으로 퀀칭시켰다.
다음에 용액에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 바바스핀 원심분리 여과기를 사용하여 UF/DF를 실시한다.
MW 20kD인 50-배 몰 과량의 아미노옥시-PSA 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(최종농도: 10mM)로서 m-톨루이딘을 첨가한다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행한다. 과량의 아미노옥시 시약을 이온 교환 크로마토그래피에 의해 제거한다. 용리액의 PSA-NGF 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시한다. 다음에 제제를 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 2:
NGF를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 옮기거나 또는 용해시켜서 최종 단백질 농도 1.0 +/- 0.25㎎/㎖를 얻는다. 이어서, 용액의 pH를 0.5 N 수성 HCl 용액의 적가에 의해 6.0까지 보정한다. 후속적으로, 40mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 10분 내에 첨가하여 농도 200μM을 제공한다. T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 30 +/- 5분 동안 산화반응을 수행한다. 이어서, T= +22 +/- 2℃에서 15분 내에 수성 L-시스테인 용액(1M)의 첨가에 의해 반응을 중단시켜 반응 혼합물에서 최종 농도 10mM을 제공하였고 60 +/- 5분 동안 인큐베이션시킨다.
산화된 NGF를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. 용리액의 산화된 NGF 함유 분획을 수집하고 컨쥬게이션 반응을 위해 사용한다.
아미노옥시-폴리시알산(PSA-ONH2) 시약을 15분 부드러운 교반 하에 최대 시간 기간(t) 내에서 정제 산화된 NGF를 함유하는 용리액에 50배 몰 과량으로 첨가한다. 이어서, 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 15분 내에 첨가하여 최종 농도 10mM을 얻는다. 반응 혼합물을 암실에서 T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 120 +/- 10분 동안 pH 6.0에서 부드러운 진탕 하에 인큐베이션시킨다(단백질 농도: 1㎎/㎖).
얻어진 PSA-NGF 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. PSA-NGF 컨쥬게이트 함유 분획을 수집하고, 적절한 분자량 컷 오프(밀리포어)를 지니는 정제된 컨쥬게이트를 재생 셀룰로스로 만들어진 막을 사용하여 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 농축시킨다.
이 절차의 사용에 의해 제조한 컨쥬게이트를 전체 단백질, 생물학적 활성 및 PSA 함량을 측정하는 것에 의한(레조시놀 분석) 폴리시알릴화 정도의 결정을 측정함으로써 분석적으로 특성규명하였다.
방법 3:
신경 성장 인자(NGF)를 반응 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮겼고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻었다. MW 20kD인 50배 몰 과량의 아미노옥시-PSA 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(10mM 최종농도) 및 NaIO4(최종농도: 400μM)로서 m-톨루이딘을 첨가한다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행한다. 후속적으로, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인을 이용하여 퀀칭시킨다(시스테인 농도: 10mM). 이어서, 반응 혼합물의 전도도를 암모늄 아세테이트를 함유하는 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, 8M 암모늄 아세테이트, pH 6.9)를 첨가함으로써 조절하고, 50mM 헤페스, 2.5M 암모늄 아세테이트, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, 0.01% 트윈 80, pH 6.9를 이용하여 사전 평형상태로 만든 페닐 세파로스 FF(GE 헬스케어, 코네티컷주 페어필드에 소재)로 충전한 칼럼 상에 장입하였다. 후속적으로, 50mM 헤페스 완충제, 5mM을 함유하는 염화칼슘, pH 7.5를 이용하여 컨쥬게이트를 용리시킨다. 최종적으로, PSA NGF-함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 3을 다음과 같이 수행한다. 신경 성장 인자(NGF)를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮겼고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻었다. MW 20kD인 50배 몰 과량의 아미노옥시-PSA 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(10mM 최종농도) 및 NaIO4(최종농도: 400μM)로서 m-톨루이딘을 첨가한다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행한다. 후속적으로, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인을 이용하여 퀀칭시키고(시스테인 농도: 10mM), 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 이어서, 용리액의 PSA-NGF 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 4:
NGF를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 용해시키거나 또는 옮겨서 최종 단백질 농도 1.0 +/- 0.25㎎/㎖를 얻는다. 이어서, 용액의 pH를 0.5 N 수성 HCl 용액의 적가에 의해 6.0까지 보정한다.
후속적으로, 아미노옥시-폴리시알산(PSA-ONH2) 시약을 15분 부드러운 교반 하에 최대 시간 기간(t) 내에서 이 NGF-용액을 함유하는 용리액에 50배 몰 과량으로 첨가한다. 이어서, 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 15분 내에 첨가하여 최종 농도 10mM을 얻는다. 최종적으로, 40mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 첨가하여 농도 400μM을 제공한다.
반응 혼합물을 암실에서 T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 120 +/- 10분 동안 부드러운 진탕 하에 인큐베이션시킨다. 이어서, 수성 L-시스테인 용액(1M)의 첨가에 의해 반응을 중단시켜 반응 혼합물에서 최종 농도 10mM을 제공하였고 60 +/- 5분 동안 인큐베이션시킨다.
얻어진 NGF-컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 용리액의 PSA-NGF 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막을 사용하여 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 농축시킨다.
이 절차의 사용에 의해 제조한 컨쥬게이트를 전체 단백질, 당업계에 공지된 방법에 따라 생물학적 활성 및 PSA 함량을 측정하는 것에 의한(레조시놀 분석) 폴리시알릴화 정도의 결정을 측정함으로써 분석적으로 특성규명하였다.
실시예 23
친핵성 촉매로서 아미노옥시-PSA 및 m-톨루이딘을 사용하는 HGH의 폴리시알산화
방법 1:
본 명세서에 기재되는 바와 같이, 적어도 하나의 글라이코실화 부위를 도입하기 위해 인간 성장 호르몬(HGH)의 아미노산 서열을 우선 변형시킨다. 정제 후에, 당업계에 공지된 방법에 따라 시험관내에서 HGH를 글라이코실화한다.
인간 성장 호르몬(HGH)의 출발 농도를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮겼고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻었다. 이 용액에, NaIO4를 첨가하여 최종 농도 200μM을 제공한다. 실온에서 30분 동안 암실에서 부드러운 진탕 하에서 산화를 수행한다. 이어서, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인(최종 농도: 10mM)으로 퀀칭시켰다.
다음에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 용액에 비바스핀 원심분리 여과기를 사용하는 UF/DF로 또는, 대안으로, 완충제 A(20mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 7.0)로 평형상태로 만든 20㎖ 용적을 지니는 IEX 칼럼(머렉 EMD TMAE (M))으로 처리한다. 5 CV 완충제 A를 이용하여 칼럼을 평형상태로 만든다. 이어서, 산화된 HGH를 완충제 B(20mM 헤페스, 5mM CaCl2, 1M NaCl, pH 7.0)를 이용하여 용리시켰다. HGH 함유 분획을 수집한다. 단백질 함량을 결정하고(쿠마씨, 브래드퍼드) 반응 완충제를 이용하여 1㎎/㎖로 조절하며, 0.5M HCl의 적가에 의해 pH 6.0으로 조절한다.
MW 20kD인 50-배 몰 과량의 아미노옥시-PSA 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(최종농도: 10mM)로서 m-톨루이딘을 첨가한다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행한다. 과량의 아미노옥시 시약을 HIC에 의해 제거한다. 반응 혼합물의 전도도를 암모늄 아세테이트를 함유하는 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, 8M 암모늄 아세테이트, pH 6.9)를 첨가함으로써 조절하고, 50mM 헤페스, 2.5M 암모늄 아세테이트, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.9를 이용하여 사전 평형상태로 만든 80㎖ 페닐 세파로스 FF(GE 헬스케어, 코네티컷주 페어필드에 소재)로 충전한 칼럼 상에 장입하였다. 후속적으로, 5mM CaCl2를 함유하는 50mM 헤페스 완충제 pH 7.5를 이용하여 컨쥬게이트를 용리시킨다. 최종적으로, PSA-HGH 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시한다. 다음에 제제를 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 1을 다음과 같이 수행한다. 본 명세서에 기재되는 바와 같이, 적어도 하나의 글라이코실화 부위를 도입하기 위해 인간 성장 호르몬(HGH)의 아미노산 서열을 우선 변형시킨다. 정제 후에, 당업계에 공지된 방법에 따라 시험관내에서 HGH를 글라이코실화한다. HGH를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮겼고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻었다. 이 용액에, NaIO4를 첨가하여 최종 농도 200μM을 제공한다. 실온에서 30분 동안 암실에서 부드러운 진탕 하에서 산화를 수행한다. 이어서, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인(최종 농도: 10mM)으로 퀀칭시켰다.
다음에 용액에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 바바스핀 원심분리 여과기를 사용하여 UF/DF를 실시한다.
MW 20kD인 50-배 몰 과량의 아미노옥시-PSA 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(최종농도: 10mM)로서 m-톨루이딘을 첨가한다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행한다. 과량의 아미노옥시 시약을 이온 교환 크로마토그래피에 의해 제거한다. 용리액의 PSA-HGH 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시한다. 다음에 제제를 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 2:
본 명세서에 기재되는 바와 같이, 적어도 하나의 글라이코실화 부위를 도입하기 위해 인간 성장 호르몬(HGH)의 아미노산 서열을 우선 변형시킨다. 정제 후에, 당업계에 공지된 방법에 따라 시험관내에서 HGH를 글라이코실화한다.
HGH를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 옮기거나 또는 용해시켜서 최종 단백질 농도 1.0 +/- 0.25㎎/㎖를 얻는다. 이어서, 용액의 pH를 0.5 N 수성 HCl 용액의 적가에 의해 6.0까지 보정한다. 후속적으로, 40mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 10분 내에 첨가하여 농도 200μM을 제공한다. T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 30 +/- 5분 동안 산화반응을 수행한다. 이어서, T= +22 +/- 2℃에서 15분 내에 수성 L-시스테인 용액(1M)의 첨가에 의해 반응을 중단시켜 반응 혼합물에서 최종 농도 10mM을 제공하였고 60 +/- 5분 동안 인큐베이션시킨다.
산화된 HGH를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. 용리액의 산화된 HGH 함유 분획을 수집하고 컨쥬게이션 반응을 위해 사용한다.
아미노옥시-폴리시알산(PSA-ONH2) 시약을 15분 부드러운 교반 하에 최대 시간 기간(t) 내에서 정제 산화된 HGH를 함유하는 용리액에 50배 몰 과량으로 첨가한다. 이어서, 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 15분 내에 첨가하여 최종 농도 10mM을 얻는다. 반응 혼합물을 암실에서 T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 120 +/- 10분 동안 pH 6.0에서 부드러운 진탕 하에 인큐베이션시킨다(단백질 농도: 1㎎/㎖).
얻어진 PSA-HGH 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. PSA-HGH 컨쥬게이트 함유 분획을 수집하고, 적절한 분자량 컷 오프(밀리포어)를 지니는 정제된 컨쥬게이트를 재생 셀룰로스로 만들어진 막을 사용하여 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 농축시킨다.
이 절차의 사용에 의해 제조한 컨쥬게이트를 전체 단백질, 생물학적 활성 및 PSA 함량을 측정하는 것에 의한(레조시놀 분석) 폴리시알릴화 정도의 결정을 측정함으로써 분석적으로 특성규명하였다.
방법 3:
본 명세서에 기재되는 바와 같이, 적어도 하나의 글라이코실화 부위를 도입하기 위해 인간 성장 호르몬(HGH)의 아미노산 서열을 우선 변형시킨다. 정제 후에, 당업계에 공지된 방법에 따라 시험관내에서 HGH를 글라이코실화한다.
인간 성장 호르몬(HGH)을 반응 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮기고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻는다. MW 20kD인 50배 몰 과량의 아미노옥시-PSA 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(10mM 최종농도) 및 NaIO4(최종농도: 400μM)로서 m-톨루이딘을 첨가한다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행한다. 후속적으로, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인을 이용하여 퀀칭시킨다(시스테인 농도: 10mM). 이어서, 반응 혼합물의 전도도를 암모늄 아세테이트를 함유하는 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, 8M 암모늄 아세테이트, pH 6.9)를 첨가함으로써 조절하고, 50mM 헤페스, 2.5M 암모늄 아세테이트, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, 0.01% 트윈 80, pH 6.9를 이용하여 사전 평형상태로 만든 페닐 세파로스 FF(GE 헬스케어, 코네티컷주 페어필드에 소재)로 충전한 칼럼 상에 장입하였다. 후속적으로, 50mM 헤페스 완충제, 5mM을 함유하는 염화칼슘, pH 7.5를 이용하여 컨쥬게이트를 용리시킨다. 최종적으로, PSA-HGH 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 3을 다음과 같이 수행한다. 본 명세서에 기재되는 바와 같이, 적어도 하나의 글라이코실화 부위를 도입하기 위해 인간 성장 호르몬(HGH)의 아미노산 서열을 우선 변형시킨다. 정제 후에, 당업계에 공지된 방법에 따라 시험관내에서 HGH를 글라이코실화한다. HGH를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮겼고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻었다. MW 20kD인 50배 몰 과량의 아미노옥시-PSA 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(10mM 최종농도) 및 NaIO4(최종농도: 400μM)로서 m-톨루이딘을 첨가한다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행한다. 후속적으로, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인을 이용하여 퀀칭시키고(시스테인 농도: 10mM), 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 이어서, 용리액의 PSA -HGH 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 4:
본 명세서에 기재되는 바와 같이, 적어도 하나의 글라이코실화 부위를 도입하기 위해 인간 성장 호르몬(HGH)의 아미노산 서열을 우선 변형시킨다. 정제 후에, 당업계에 공지된 방법에 따라 시험관내에서 HGH를 글라이코실화한다.
HGH를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 용해시키거나 또는 옮겨서 최종 단백질 농도 1.0 +/- 0.25㎎/㎖를 얻는다. 이어서, 용액의 pH를 0.5 N 수성 HCl 용액의 적가에 의해 6.0까지 보정한다.
후속적으로, 아미노옥시-폴리시알산(PSA-ONH2) 시약을 15분 부드러운 교반 하에 최대 시간 기간(t) 내에서 이 HGH-용액을 함유하는 용리액에 50배 몰 과량으로 첨가한다. 이어서, 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 15분 내에 첨가하여 최종 농도 10mM을 얻는다. 최종적으로, 40mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 첨가하여 농도 400μM을 제공한다.
반응 혼합물을 암실에서 T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 120 +/- 10분 동안 부드러운 진탕 하에 인큐베이션시킨다. 이어서, 수성 L-시스테인 용액(1M)의 첨가에 의해 반응을 중단시켜 반응 혼합물에서 최종 농도 10mM을 제공하였고 60 +/- 5분 동안 인큐베이션시킨다.
얻어진 HGH-컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 용리액의 PSA-HGH 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막을 사용하여 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 농축시킨다.
이 절차의 사용에 의해 제조한 컨쥬게이트를 전체 단백질, 당업계에 공지된 방법에 따라 생물학적 활성 및 PSA 함량을 측정하는 것에 의한(레조시놀 분석) 폴리시알릴화 정도의 결정을 측정함으로써 분석적으로 특성규명하였다.
실시예 24
친핵성 촉매로서 아미노옥시-PSA 및 m-톨루이딘을 사용하는 TNF-알파의 폴리시알산화
종양 괴사 인자-알파(TNF-알파)의 출발 농도를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮겼고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻었다. 이 용액에, NaIO4를 첨가하여 최종 농도 200μM을 제공한다. 실온에서 30분 동안 암실에서 부드러운 진탕 하에서 산화를 수행한다. 이어서, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인(최종 농도: 10mM)으로 퀀칭시켰다.
다음에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 용액에 비바스핀 원심분리 여과기를 사용하는 UF/DF로 또는, 대안으로, 완충제 A(20mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 7.0)로 평형상태로 만든 20㎖ 용적을 지니는 IEX 칼럼(머렉 EMD TMAE (M))으로 처리한다. 5 CV 완충제 A를 이용하여 칼럼을 평형상태로 만든다. 이어서, 산화된 TNF-알파를 완충제 B(20mM 헤페스, 5mM CaCl2, 1M NaCl, pH 7.0)를 이용하여 용리시켰다. TNF-알파 함유 분획을 수집한다. 단백질 함량을 결정하고(쿠마씨, 브래드퍼드) 반응 완충제를 이용하여 1㎎/㎖로 조절하며, 0.5M HCl의 적가에 의해 pH 6.0으로 조절한다.
MW 20kD인 50-배 몰 과량의 아미노옥시-PSA 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(최종농도: 10mM)로서 m-톨루이딘을 첨가한다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행한다. 과량의 아미노옥시 시약을 HIC에 의해 제거한다. 반응 혼합물의 전도도를 암모늄 아세테이트를 함유하는 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, 8M 암모늄 아세테이트, pH 6.9)를 첨가함으로써 조절하고, 50mM 헤페스, 2.5M 암모늄 아세테이트, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.9를 이용하여 사전 평형상태로 만든 80㎖ 페닐 세파로스 FF(GE 헬스케어, 코네티컷주 페어필드에 소재)로 충전한 칼럼 상에 장입하였다. 후속적으로, 5mM CaCl2를 함유하는 50mM 헤페스 완충제 pH 7.5를 이용하여 컨쥬게이트를 용리시킨다. 최종적으로, PSA-TNF-알파-함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시한다. 다음에 제제를 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 1을 다음과 같이 수행한다. 종양 괴사 인자-알파(TNF-알파)를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮겼고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻었다. 이 용액에, NaIO4를 첨가하여 최종 농도 200μM을 제공한다. 실온에서 30분 동안 암실에서 부드러운 진탕 하에서 산화를 수행한다. 이어서, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인(최종 농도: 10mM)으로 퀀칭시켰다.
다음에 용액에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 바바스핀 원심분리 여과기를 사용하여 UF/DF를 실시한다. MW 20kD인 50-배 몰 과량의 아미노옥시-PSA 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(최종농도: 10mM)로서 m-톨루이딘을 첨가한다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행한다. 과량의 아미노옥시 시약을 이온 교환 크로마토그래피에 의해 제거한다. 용리액의 PSA-TNF-알파 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시한다. 다음에 제제를 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 2:
TNF-알파를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 옮기거나 또는 용해시켜서 최종 단백질 농도 1.0 +/- 0.25㎎/㎖를 얻는다. 이어서, 용액의 pH를 0.5 N 수성 HCl 용액의 적가에 의해 6.0까지 보정한다. 후속적으로, 40mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 10분 내에 첨가하여 농도 200μM을 제공한다. T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 30 +/- 5분 동안 산화반응을 수행한다. 이어서, T= +22 +/- 2℃에서 15분 내에 수성 L-시스테인 용액(1M)의 첨가에 의해 반응을 중단시켜 반응 혼합물에서 최종 농도 10mM을 제공하였고 60 +/- 5분 동안 인큐베이션시킨다.
산화된 TNF-알파를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. 용리액의 산화된 TNF-알파 함유 분획을 수집하고 컨쥬게이션 반응을 위해 사용한다.
아미노옥시-폴리시알산(PSA-ONH2) 시약을 15분 부드러운 교반 하에 최대 시간 기간(t) 내에서 정제 산화된 TNF-알파를 함유하는 용리액에 50배 몰 과량으로 첨가한다. 이어서, 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 15분 내에 첨가하여 최종 농도 10mM을 얻는다. 반응 혼합물을 암실에서 T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 120 +/- 10분 동안 pH 6.0에서 부드러운 진탕 하에 인큐베이션시킨다(단백질 농도: 1㎎/㎖).
얻어진 PSA-TNF-알파 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. PSA-TNF-알파 컨쥬게이트 함유 분획을 수집하고, 적절한 분자량 컷 오프(밀리포어)를 지니는 정제된 컨쥬게이트를 재생 셀룰로스로 만들어진 막을 사용하여 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 농축시킨다.
이 절차의 사용에 의해 제조한 컨쥬게이트를 전체 단백질, 생물학적 활성 및 PSA 함량을 측정하는 것에 의한(레조시놀 분석) 폴리시알릴화 정도의 결정을 측정함으로써 분석적으로 특성규명하였다.
방법 3:
종양 괴사 인자-알파(TNF-알파)를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮겼고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻었다. MW 20kD인 50배 몰 과량의 아미노옥시-PSA 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(10mM 최종농도) 및 NaIO4(최종농도: 400μM)로서 m-톨루이딘을 첨가한다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행한다. 후속적으로, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인을 이용하여 퀀칭시킨다(시스테인 농도: 10mM). 이어서, 반응 혼합물의 전도도를 암모늄 아세테이트를 함유하는 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, 8M 암모늄 아세테이트, pH 6.9)를 첨가함으로써 조절하고, 50mM 헤페스, 2.5M 암모늄 아세테이트, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, 0.01% 트윈 80, pH 6.9를 이용하여 사전 평형상태로 만든 페닐 세파로스 FF(GE 헬스케어, 코네티컷주 페어필드에 소재)로 충전한 칼럼 상에 장입하였다. 후속적으로, 50mM 헤페스 완충제, 5mM을 함유하는 염화칼슘, pH 7.5를 이용하여 컨쥬게이트를 용리시킨다. 최종적으로, PSA-TNF-알파 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 3을 다음과 같이 수행한다. 종양 괴사 인자-알파(TNF-알파)를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮겼고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻었다. MW 20kD인 50배 몰 과량의 아미노옥시-PSA 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(10mM 최종농도) 및 NaIO4(최종농도: 400μM)로서 m-톨루이딘을 첨가한다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행한다. 후속적으로, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인을 이용하여 퀀칭시키고(시스테인 농도: 10mM), 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 용리액의 PSA-TNF-알파 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 4:
TNF-알파를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 용해시키거나 또는 옮겨서 최종 단백질 농도 1.0 +/- 0.25㎎/㎖를 얻는다. 이어서, 용액의 pH를 0.5 N 수성 HCl 용액의 적가에 의해 6.0까지 보정한다.
후속적으로, 아미노옥시-폴리시알산(PSA-ONH2) 시약을 15분 부드러운 교반 하에 최대 시간 기간(t) 내에서 이 TNF-알파-용액을 함유하는 용리액에 50배 몰 과량으로 첨가한다. 이어서, 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 15분 내에 첨가하여 최종 농도 10mM을 얻는다. 최종적으로, 40mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 첨가하여 농도 400μM을 제공한다.
반응 혼합물을 암실에서 T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 120 +/- 10분 동안 부드러운 진탕 하에 인큐베이션시킨다. 이어서, 수성 L-시스테인 용액(1M)의 첨가에 의해 반응을 중단시켜 반응 혼합물에서 최종 농도 10mM을 제공하였고 60 +/- 5분 동안 인큐베이션시킨다.
얻어진 TNF-알파 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 용리액의 PSA-TNF-알파 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막을 사용하여 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 농축시킨다.
이 절차의 사용에 의해 제조한 컨쥬게이트를 전체 단백질, 당업계에 공지된 방법에 따라 생물학적 활성 및 PSA 함량을 측정하는 것에 의한(레조시놀 분석) 폴리시알릴화 정도의 결정을 측정함으로써 분석적으로 특성규명하였다.
실시예 25
친핵성 촉매로서 아미노옥시-PSA 및 m-톨루이딘을 사용하는 인슐린의 폴리시알산화
방법 1:
본 명세서에 기재되는 바와 같이, 적어도 하나의 글라이코실화 부위를 도입하기 위해 인슐린의 아미노산 서열을 우선 변형시킨다. 정제 후에, 당업계에 공지된 방법에 따라 시험관내에서 인슐린을 글라이코실화한다. 인슐린의 출발 농도를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮겼고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻었다. 이 용액에, NaIO4를 첨가하여 최종 농도 200μM을 제공한다. 실온에서 30분 동안 암실에서 부드러운 진탕 하에서 산화를 수행한다. 이어서, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인(최종 농도: 10mM)으로 퀀칭시켰다.
다음에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 용액에 비바스핀 원심분리 여과기를 사용하는 UF/DF로 또는, 대안으로, 완충제 A(20mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 7.0)로 평형상태로 만든 20㎖ 용적을 지니는 IEX 칼럼(머렉 EMD TMAE (M))으로 처리한다. 5 CV 완충제 A를 이용하여 칼럼을 평형상태로 만든다. 이어서, 산화된 인슐린을 완충제 B(20mM 헤페스, 5mM CaCl2, 1M NaCl, pH 7.0)를 이용하여 용리시켰다. 인슐린 함유 분획을 수집한다. 단백질 함량을 결정하고(쿠마씨, 브래드퍼드) 반응 완충제를 이용하여 1㎎/㎖로 조절하며, 0.5M HCl의 적가에 의해 pH 6.0으로 조절한다.
MW 20kD인 50-배 몰 과량의 아미노옥시-PSA 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(최종농도: 10mM)로서 m-톨루이딘을 첨가한다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행한다. 과량의 아미노옥시 시약을 HIC에 의해 제거한다. 반응 혼합물의 전도도를 암모늄 아세테이트를 함유하는 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, 8M 암모늄 아세테이트, pH 6.9)를 첨가함으로써 조절하고, 50mM 헤페스, 2.5M 암모늄 아세테이트, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.9를 이용하여 사전 평형상태로 만든 80㎖ 페닐 세파로스 FF(GE 헬스케어, 코네티컷주 페어필드에 소재)로 충전한 칼럼 상에 장입하였다. 후속적으로, 5mM CaCl2를 함유하는 50mM 헤페스 완충제 pH 7.5를 이용하여 컨쥬게이트를 용리시킨다. 최종적으로, PSA-인슐린 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시한다. 다음에 제제를 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 1을 다음과 같이 수행한다. 본 명세서에 기재되는 바와 같이, 적어도 하나의 글라이코실화 부위를 도입하기 위해 인슐린의 아미노산 서열을 우선 변형시킨다. 정제 후에, 당업계에 공지된 방법에 따라 시험관내에서 인슐린을 글라이코실화한다. 인슐린을 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮겼고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻었다. 이 용액에, NaIO4를 첨가하여 최종 농도 200μM을 제공한다. 실온에서 30분 동안 암실에서 부드러운 진탕 하에서 산화를 수행한다. 이어서, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인(최종 농도: 10mM)으로 퀀칭시켰다.
다음에 용액에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 바바스핀 원심분리 여과기를 사용하여 UF/DF를 실시한다.
MW 20kD인 50-배 몰 과량의 아미노옥시-PSA 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(최종농도: 10mM)로서 m-톨루이딘을 첨가한다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행한다. 과량의 아미노옥시 시약을 이온 교환 크로마토그래피에 의해 제거한다. 용리액의 PSA-인슐린 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시한다. 다음에 제제를 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 2:
본 명세서에 기재되는 바와 같이, 적어도 하나의 글라이코실화 부위를 도입하기 위해 인슐린의 아미노산 서열을 우선 변형시킨다. 정제 후에, 당업계에 공지된 방법에 따라 시험관내에서 인슐린을 글라이코실화한다.
인슐린을 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 옮기거나 또는 용해시켜서 최종 단백질 농도 1.0 +/- 0.25㎎/㎖를 얻는다. 이어서, 용액의 pH를 0.5 N 수성 HCl 용액의 적가에 의해 6.0까지 보정한다. 후속적으로, 40mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 10분 내에 첨가하여 농도 200μM을 제공한다. T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 30 +/- 5분 동안 산화반응을 수행한다. 이어서, T= +22 +/- 2℃에서 15분 내에 수성 L-시스테인 용액(1M)의 첨가에 의해 반응을 중단시켜 반응 혼합물에서 최종 농도 10mM을 제공하였고 60 +/- 5분 동안 인큐베이션시킨다.
산화된 인슐린을 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. 용리액의 산화된 인슐린 함유 분획을 수집하고 컨쥬게이션 반응을 위해 사용한다.
아미노옥시-폴리시알산(PSA-ONH2) 시약을 15분 부드러운 교반 하에 최대 시간 기간(t) 내에서 정제 산화된 인슐린을 함유하는 용리액에 50배 몰 과량으로 첨가한다. 이어서, 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 15분 내에 첨가하여 최종 농도 10mM을 얻는다. 반응 혼합물을 암실에서 T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 120 +/- 10분 동안 pH 6.0에서 부드러운 진탕 하에 인큐베이션시킨다(단백질 농도: 1㎎/㎖).
얻어진 PSA-인슐린 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. PSA-인슐린 컨쥬게이트 함유 분획을 수집하고, 적절한 분자량 컷 오프(밀리포어)를 지니는 정제된 컨쥬게이트를 재생 셀룰로스로 만들어진 막을 사용하여 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 농축시킨다.
이 절차의 사용에 의해 제조한 컨쥬게이트를 전체 단백질, 생물학적 활성 및 PSA 함량을 측정하는 것에 의한(레조시놀 분석) 폴리시알릴화 정도의 결정을 측정함으로써 분석적으로 특성규명하였다.
방법 3:
본 명세서에 기재되는 바와 같이, 적어도 하나의 글라이코실화 부위를 도입하기 위해 인슐린의 아미노산 서열을 우선 변형시킨다. 정제 후에, 당업계에 공지된 방법에 따라 시험관내에서 인슐린을 글라이코실화한다.
인슐린을 반응 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮기고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻는다. MW 20kD인 50배 몰 과량의 아미노옥시-PSA 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(10mM 최종농도) 및 NaIO4(최종농도: 400μM)로서 m-톨루이딘을 첨가한다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행한다. 후속적으로, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인을 이용하여 퀀칭시킨다(시스테인 농도: 10mM). 이어서, 반응 혼합물의 전도도를 암모늄 아세테이트를 함유하는 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, 8M 암모늄 아세테이트, pH 6.9)를 첨가함으로써 조절하고, 50mM 헤페스, 2.5M 암모늄 아세테이트, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, 0.01% 트윈 80, pH 6.9를 이용하여 사전 평형상태로 만든 페닐 세파로스 FF(GE 헬스케어, 코네티컷주 페어필드에 소재)로 충전한 칼럼 상에 장입하였다. 후속적으로, 50mM 헤페스 완충제, 5mM을 함유하는 염화칼슘, pH 7.5를 이용하여 컨쥬게이트를 용리시킨다. 최종적으로, PSA-인슐린 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 3을 다음과 같이 수행한다. 본 명세서에 기재되는 바와 같이, 적어도 하나의 글라이코실화 부위를 도입하기 위해 인슐린의 아미노산 서열을 우선 변형시킨다. 정제 후에, 당업계에 공지된 방법에 따라 시험관내에서 인슐린을 글라이코실화한다.
인슐린을 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮겼고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻었다. MW 20kD인 50배 몰 과량의 아미노옥시-PSA 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(10mM 최종농도) 및 NaIO4(최종농도: 400μM)로서 m-톨루이딘을 첨가한다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행한다. 후속적으로, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인을 이용하여 퀀칭시키고(시스테인 농도: 10mM), 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 용리액의 PSA-인슐린 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 4:
본 명세서에 기재되는 바와 같이, 적어도 하나의 글라이코실화 부위를 도입하기 위해 인슐린의 아미노산 서열을 우선 변형시킨다. 정제 후에, 당업계에 공지된 방법에 따라 시험관내에서 인슐린을 글라이코실화한다.
인슐린을 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 용해시키거나 또는 옮겨서 최종 단백질 농도 1.0 +/- 0.25㎎/㎖를 얻는다. 이어서, 용액의 pH를 0.5 N 수성 HCl 용액의 적가에 의해 6.0까지 보정한다.
후속적으로, 아미노옥시-폴리시알산(PSA-ONH2) 시약을 15분 부드러운 교반 하에 최대 시간 기간(t) 내에서 이 인슐린 용액을 함유하는 용리액에 50배 몰 과량으로 첨가한다. 이어서, 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 15분 내에 첨가하여 최종 농도 10mM을 얻는다. 최종적으로, 40mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 첨가하여 농도 400μM을 제공한다.
반응 혼합물을 암실에서 T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 120 +/- 10분 동안 부드러운 진탕 하에 인큐베이션시킨다. 이어서, 수성 L-시스테인 용액(1M)의 첨가에 의해 반응을 중단시켜 반응 혼합물에서 최종 농도 10mM을 제공하였고 60 +/- 5분 동안 인큐베이션시킨다.
얻어진 인슐린 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 용리액의 PSA- 인슐린 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막을 사용하여 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 농축시킨다.
이 절차의 사용에 의해 제조한 컨쥬게이트를 전체 단백질, 당업계에 공지된 방법에 따라 생물학적 활성 및 PSA 함량을 측정하는 것에 의한(레조시놀 분석) 폴리시알릴화 정도의 결정을 측정함으로써 분석적으로 특성규명하였다.
실시예 26
친핵성 촉매로서 아미노옥시-PSA 및 m-톨루이딘을 사용하는 인터페론-알파의 폴리시알산화
방법 1:
인터페론-알파의 출발 농도를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮겼고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻었다. 이 용액에, NaIO4를 첨가하여 최종 농도 200μM을 제공한다. 실온에서 30분 동안 암실에서 부드러운 진탕 하에서 산화를 수행한다. 이어서, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인(최종 농도: 10mM)으로 퀀칭시켰다.
다음에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 용액에 비바스핀 원심분리 여과기를 사용하는 UF/DF로 또는, 대안으로, 완충제 A(20mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 7.0)로 평형상태로 만든 20㎖ 용적을 지니는 IEX 칼럼(머렉 EMD TMAE (M))으로 처리한다. 5 CV 완충제 A를 이용하여 칼럼을 평형상태로 만든다. 이어서, 산화된 인터페론-알파를 완충제 B(20mM 헤페스, 5mM CaCl2, 1M NaCl, pH 7.0)를 이용하여 용리시켰다. 인터페론-알파 함유 분획을 수집한다. 단백질 함량을 결정하고(쿠마씨, 브래드퍼드) 반응 완충제를 이용하여 1㎎/㎖로 조절하며, 0.5M HCl의 적가에 의해 pH 6.0으로 조절한다.
MW 20kD인 50-배 몰 과량의 아미노옥시-PSA 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(최종농도: 10mM)로서 m-톨루이딘을 첨가한다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행한다. 과량의 아미노옥시 시약을 HIC에 의해 제거한다. 반응 혼합물의 전도도를 암모늄 아세테이트를 함유하는 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, 8M 암모늄 아세테이트, pH 6.9)를 첨가함으로써 조절하고, 50mM 헤페스, 2.5M 암모늄 아세테이트, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.9를 이용하여 사전 평형상태로 만든 80㎖ 페닐 세파로스 FF(GE 헬스케어, 코네티컷주 페어필드에 소재)로 충전한 칼럼 상에 장입하였다. 후속적으로, 5mM CaCl2를 함유하는 50mM 헤페스 완충제 pH 7.5를 이용하여 컨쥬게이트를 용리시킨다. 최종적으로, PSA-인터페론-알파 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시한다. 다음에 제제를 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 1을 다음과 같이 수행한다. 인터페론-알파를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮겼고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻었다. 이 용액에, NaIO4를 첨가하여 최종 농도 200μM을 제공한다. 실온에서 30분 동안 암실에서 부드러운 진탕 하에서 산화를 수행한다. 이어서, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인(최종 농도: 10mM)으로 퀀칭시켰다.
다음에 용액에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 바바스핀 원심분리 여과기를 사용하여 UF/DF를 실시한다.
MW 20kD인 50-배 몰 과량의 아미노옥시-PSA 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(최종농도: 10mM)로서 m-톨루이딘을 첨가한다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행한다. 과량의 아미노옥시 시약을 이온-교환 크로마토그래피에 의해 제거한다. 용리액의 PSA-인터페론-알파 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시한다. 다음에 제제를 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 2:
인터페론-알파를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 옮기거나 또는 용해시켜서 최종 단백질 농도 1.0 +/- 0.25㎎/㎖를 얻는다. 이어서, 용액의 pH를 0.5 N 수성 HCl 용액의 적가에 의해 6.0까지 보정한다. 후속적으로, 40mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 10분 내에 첨가하여 농도 200μM을 제공한다. T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 30 +/- 5분 동안 산화반응을 수행한다. 이어서, T= +22 +/- 2℃에서 15분 내에 수성 L-시스테인 용액(1M)의 첨가에 의해 반응을 중단시켜 반응 혼합물에서 최종 농도 10mM을 제공하였고 60 +/- 5분 동안 인큐베이션시킨다.
산화된 인터페론-알파를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. 용리액의 산화된 인터페론-알파 함유 분획을 수집하고 컨쥬게이션 반응을 위해 사용한다.
아미노옥시-폴리시알산(PSA-ONH2) 시약을 15분 부드러운 교반 하에 최대 시간 기간(t) 내에서 정제 산화된 인터페론-감마를 함유하는 용리액에 50배 몰 과량으로 첨가한다. 이어서, 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 15분 내에 첨가하여 최종 농도 10mM을 얻는다. 반응 혼합물을 암실에서 T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 120 +/- 10분 동안 pH 6.0에서 부드러운 진탕 하에 인큐베이션시킨다(단백질 농도: 1㎎/㎖).
얻어진 PSA-인터페론-알파 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. PSA-인터페론-알파 컨쥬게이트 함유 분획을 수집하고, 적절한 분자량 컷 오프(밀리포어)를 지니는 정제된 컨쥬게이트를 재생 셀룰로스로 만들어진 막을 사용하여 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 농축시킨다.
방법 3:
인터페론-알파를 반응 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮기고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻는다. MW 20kD인 50배 몰 과량의 PSA 아미노옥시 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(10mM 최종농도) 및 NaIO4(최종농도: 400μM)로서 m-톨루이딘을 첨가한다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행한다. 후속적으로, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인을 이용하여 퀀칭시킨다(시스테인 농도: 10mM). 이어서, 반응 혼합물의 전도도를 암모늄 아세테이트를 함유하는 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, 8M 암모늄 아세테이트, pH 6.9)를 첨가함으로써 조절하고, 50mM 헤페스, 2.5M 암모늄 아세테이트, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, 0.01% 트윈 80, pH 6.9를 이용하여 사전 평형상태로 만든 페닐 세파로스 FF(GE 헬스케어, 코네티컷주 페어필드에 소재)로 충전한 칼럼 상에 장입하였다. 후속적으로, 50mM 헤페스 완충제, 5mM을 함유하는 염화칼슘, pH 7.5를 이용하여 컨쥬게이트를 용리시킨다. 최종적으로, PSA-인터페론-알파 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 3을 다음과 같이 수행한다. 인터페론-알파를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮겼고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻었다. MW 20kD인 50배 몰 과량의 아미노옥시-PSA 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(10mM 최종농도) 및 NaIO4(최종농도: 400μM)로서 m-톨루이딘을 첨가한다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행한다. 후속적으로, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인을 이용하여 퀀칭시키고(시스테인 농도: 10mM), 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 용리액의 PSA-인터페론-알파 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 4:
인터페론-알파를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 용해시키거나 또는 옮겨서 최종 단백질 농도 1.0 +/- 0.25㎎/㎖를 얻는다. 이어서, 용액의 pH를 0.5 N 수성 HCl 용액의 적가에 의해 6.0까지 보정한다.
후속적으로, 아미노옥시-폴리시알산(PSA-ONH2) 시약을 15분 부드러운 교반 하에 최대 시간 기간(t) 내에서 이 인터페론-알파 용액을 함유하는 용리액에 50배 몰 과량으로 첨가한다. 이어서, 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 15분 내에 첨가하여 최종 농도 10mM을 얻는다. 최종적으로, 40mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 첨가하여 농도 400μM을 제공한다.
반응 혼합물을 암실에서 T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 120 +/- 10분 동안 부드러운 진탕 하에 인큐베이션시킨다. 이어서, 수성 L-시스테인 용액(1M)의 첨가에 의해 반응을 중단시켜 반응 혼합물에서 최종 농도 10mM을 제공하였고 60 +/- 5분 동안 인큐베이션시킨다.
얻어진 인터페론-알파 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 용리액의 PSA-인터페론-알파 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막을 사용하여 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 농축시킨다.
이 절차의 사용에 의해 제조한 컨쥬게이트를 전체 단백질, 당업계에 공지된 방법에 따라 생물학적 활성 및 PSA 함량을 측정하는 것에 의한(레조시놀 분석) 폴리시알릴화 정도의 결정을 측정함으로써 분석적으로 특성규명하였다.
실시예 27
친핵성 촉매로서 아미노옥시-PSA 및 m-톨루이딘을 사용하는 인터페론-감마의 폴리시알산화
방법 1:
10㎎ 인터페론-감마를 5㎖ 히스티딘 완충제, pH 6.0(20mM L-히스티딘, 150mM NaCl) 중에 용해시킨다. 이어서, 100㎕의 수성 과요오드산나트륨 용액(5mM)을 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 암실에서 4℃에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 50㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켰다. 후속적으로 혼합물에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 바바스핀 15R 10kD 원심분리 여과기를 사용하여 UF/DF를 실시한다.
산화된 인터페론-감마를 함유하는 잔류물(대략 7㎖)을 2㎖의 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합하였고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 이어서, MW가 20kD(상기 기재함)인 아미노옥시-PSA 시약을 첨가하여 5배몰 과량을 제공한다. 이 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 암실에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시킨다.
유리 인터페론-감마를 양이온 교환 크로마토그래피(cation exchange chromatography: CEC)에 의해 제거한다. 반응 혼합물을 20㎖ 완충제 A(50mM 헤페스, pH 6.5)로 희석시키고, 완충제 A를 이용하여 사전에 평행상태로 만든 20㎖ HiPrep SPFF 16/10 칼럼(코네티컷주 페어필드에 소재한 GE 헬스케어(GE Healthcare)) 상에 장입한다. 이어서, 칼럼을 완충제 B(50mM 헤페스, 1M NaCl, pH 6.5)로 용리시킨다. 25% 완충제 B 및 50% 완충제 B에서의 컨쥬게이트를 지니는 칼럼을 세척함으로써 유리 인터페론-감마를 용리시킨다. 분획을 함유하는 컨쥬게이트의 전도도를 후속적으로 완충제 C(50mM 헤페스, 5M NaCl, pH 6.9)를 이용하여 190 mS/㎝로 상승시키고, 완충제 D(50mM 헤페스, 3M NaCl, pH 6.9)를 이용하여 사전에 평행상태로 만든 20㎖ HiPrep 뷰틸 FF 16/10 칼럼(GE 헬스케어, 코네티컷주 페어필드에 소재)에 장입하였다. 유리 PSA-시약을 5 CV 완충제 D 내에서 세척한다. 후속적으로 100% 완충제 E(50mM 헤페스, pH 6.9)를 이용하여 컨쥬게이트를 용리시켰다. 분획을 함유하는 컨쥬게이트를 재생 셀룰로스(88㎠, 컷-오프 10kD, 밀리포어)로 만들어진 10kD 막을 사용하여 UF/DF에 의해 농축시킨다. 150mM NaCl를 함유하는 히스티딘 완충제(Ph 6.9)에 대해 최종 정용여과 단계를 수행한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다. PSA-인터페론-감마 컨쥬게이트에 대해 천연 인터페론-감마에 비해 50% 미만의 특이적 활성을 결정한다. 앞서 기재한 조건 하에서 쇼덱스(Shodex) KW 803 칼럼을 구비한 애질런트 1200 HPLC 시스템을 사용하여 크기 배제 HPLC에 의해 컨쥬게이트를 추가적으로 분석적으로 특성규명한다(Kolarich et al, Transfusion 2006;46:1959-77). 이는 제제가 유리 인터페론-감마를 함유하지 않는다는 것을 나타낸다.
방법 2:
10㎎ 인터페론-감마를 8㎖ 히스티딘 완충제, pH 6.0(20mM L-히스티딘, 150mM NaCl) 중에 용해시킨다. 200㎕의 수성 과요오드산나트륨 용액(5mM) 및 2㎖의 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 첨가한다. 후속적으로, MW가 20kD(상기 기재함)인 아미노옥시-PSA 시약을 첨가하여 5배몰 과량을 제공한다. 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 100㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시킨다.
유리 인터페론 감마를 양이온 교환 크로마토그래피(CEC)에 의해 제거한다. 반응 혼합물을 20㎖ 완충제 A(50mM 헤페스, pH 6.5)로 희석시키고, 완충제 A를 이용하여 사전에 평행상태로 만든 20㎖ HiPrep SPFF 16/10 칼럼(코네티컷주 페어필드에 소재한 GE 헬스케어(GE Healthcare)) 상에 장입한다. 이어서, 칼럼을 완충제 B(50mM 헤페스, 1M NaCl, pH 6.5)로 용리시킨다. 25% 완충제 B 및 50% 완충제 B에서의 컨쥬게이트를 지니는 칼럼을 세척함으로써 유리 인터페론-감마를 용리시킨다. 분획을 함유하는 컨쥬게이트의 전도도를 후속적으로 완충제 C(50mM 헤페스, 5M NaCl, pH 6.9)를 이용하여 190 mS/㎝로 상승시키고, 완충제 D(50mM 헤페스, 3M NaCl, pH 6.9)를 이용하여 사전에 평행상태로 만든 20㎖ HiPrep 뷰틸 FF 16/10 칼럼(GE 헬스케어, 코네티컷주 페어필드에 소재)에 장입하였다. 유리 PSA-시약을 5 CV 완충제 D 내에서 세척한다. 후속적으로 100% 완충제 E(50mM 헤페스, pH 6.9)를 이용하여 컨쥬게이트를 용리시켰다. 컨쥬게이트 함유 분획을 재생 셀룰로스(88㎠, 컷-오프 10kD/밀리포어)로 만들어진 10kD 막을 사용하여 UF/DF에 의해 농축시킨다. 150mM NaCl를 함유하는 히스티딘 완충제(Ph 6.9)에 대해 최종 정용여과 단계를 수행한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다. PSA 인터페론-감마 컨쥬게이트에 대해 천연 인터페론-감마에 비해 50% 미만의 특이적 활성을 결정한다. 앞서 기재한 조건 하에서 쇼덱스(Shodex) KW 803 칼럼을 구비한 애질런트 1200 HPLC 시스템을 사용하여 크기 배제 HPLC에 의해 컨쥬게이트를 추가적으로 분석적으로 특성규명한다(Kolarich et al, Transfusion 2006;46:1959-77). 이는 제제가 유리 인터페론-감마를 함유하지 않는다는 것을 나타낸다.
방법 3:
10㎎ 인터페론-감마를 8㎖ 히스티딘 완충제, pH 6.0(20mM L-히스티딘, 150mM NaCl) 중에 용해시킨다. 200㎕의 수성 과요오드산나트륨 용액(5mM) 및 2㎖의 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 첨가한다. 후속적으로, MW가 20kD(상기 기재함)인 아미노옥시-PSA 시약을 첨가하여 5배몰 과량을 제공한다. 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 100㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시킨다.
유리 인터페론 감마를 양이온 교환 크로마토그래피(CEC)에 의해 제거한다. 반응 혼합물을 20㎖ 완충제 A(50mM 헤페스, pH 6.5)로 희석시키고, 완충제 A를 이용하여 사전에 평행상태로 만든 20㎖ HiPrep SPFF 16/10 칼럼(코네티컷주 페어필드에 소재한 GE 헬스케어(GE Healthcare)) 상에 장입한다. 이어서, 칼럼을 완충제 B(50mM 헤페스, 1M NaCl, pH 6.5)로 용리시킨다. 25% 완충제 B 및 50% 완충제 B에서의 컨쥬게이트를 지니는 칼럼을 세척함으로써 유리 인터페론-감마를 용리시킨다. 분획을 함유하는 컨쥬게이트의 전도도를 후속적으로 완충제 C(50mM 헤페스, 5M NaCl, pH 6.9)를 이용하여 190 mS/㎝로 상승시키고, 완충제 D(50mM 헤페스, 3M NaCl, pH 6.9)를 이용하여 사전에 평행상태로 만든 20㎖ HiPrep 뷰틸 FF 16/10 칼럼(GE 헬스케어, 코네티컷주 페어필드에 소재)에 장입하였다. 유리 PSA-시약을 5 CV 완충제 D 내에서 세척한다. 후속적으로 100% 완충제 E(50mM 헤페스, pH 6.9)를 이용하여 컨쥬게이트를 용리시켰다. 컨쥬게이트 함유 분획을 재생 셀룰로스(88㎠, 컷-오프 10kD/밀리포어)로 만들어진 10kD 막을 사용하여 UF/DF에 의해 농축시킨다. 150mM NaCl를 함유하는 히스티딘 완충제(Ph 6.9)에 대해 최종 정용여과 단계를 수행한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다. PSA 인터페론-감마 컨쥬게이트에 대해 천연 인터페론-감마에 비해 50% 미만의 특이적 활성을 결정한다. 앞서 기재한 조건 하에서 쇼덱스(Shodex) KW 803 칼럼을 구비한 애질런트 1200 HPLC 시스템을 사용하여 크기 배제 HPLC에 의해 컨쥬게이트를 추가적으로 분석적으로 특성규명한다(Kolarich et al, Transfusion 2006;46:1959-77). 이는 제제가 유리 인터페론-감마를 함유하지 않는다는 것을 나타낸다.
방법 4:
인터페론-감마를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 용해시키거나 또는 옮겨서 최종 단백질 농도 1.0 +/- 0.25㎎/㎖를 얻는다. 이어서, 용액의 pH를 0.5 N 수성 HCl 용액의 적가에 의해 6.0까지 보정한다.
후속적으로, 아미노옥시-폴리시알산(PSA-ONH2) 시약을 15분 부드러운 교반 하에 최대 시간 기간(t) 내에서 이 인터페론-감마 용액을 함유하는 용리액에 50배 몰 과량으로 첨가한다. 이어서, 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 15분 내에 첨가하여 최종 농도 10mM을 얻는다. 최종적으로, 40mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 첨가하여 농도 400μM을 제공한다.
반응 혼합물을 암실에서 T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 120 +/- 10분 동안 부드러운 진탕 하에 인큐베이션시킨다. 이어서, 수성 L-시스테인 용액(1M)의 첨가에 의해 반응을 중단시켜 반응 혼합물에서 최종 농도 10mM을 제공하였고 60 +/- 5분 동안 인큐베이션시킨다.
얻어진 인터페론-감마 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 용리액의 PSA-인터페론-감마 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막을 사용하여 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 농축시킨다.
이 절차의 사용에 의해 제조한 컨쥬게이트를 전체 단백질, 당업계에 공지된 방법에 따라 생물학적 활성 및 PSA 함량을 측정하는 것에 의한(레조시놀 분석) 폴리시알릴화 정도의 결정을 측정함으로써 분석적으로 특성규명하였다.
실시예 28
친핵성 촉매로서 아미노옥시-PSA 및 m-톨루이딘을 사용하는 G-CSF의 폴리시알산화
방법 1:
과립구-집락 자극 인자(G-CSF)의 출발 농도를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮겼고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻었다. 이 용액에, NaIO4를 첨가하여 최종 농도 200μM을 제공한다. 실온에서 30분 동안 암실에서 부드러운 진탕 하에서 산화를 수행한다. 이어서, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인(최종 농도: 10mM)으로 퀀칭시켰다.
다음에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 용액에 비바스핀 원심분리 여과기를 사용하는 UF/DF로 또는, 대안으로, 완충제 A(20mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 7.0)로 평형상태로 만든 20㎖ 용적을 지니는 IEX 칼럼(머렉 EMD TMAE (M))으로 처리한다. 5 CV 완충제 A를 이용하여 칼럼을 평형상태로 만든다. 이어서, 산화된 G-CSF 를 완충제 B(20mM 헤페스, 5mM CaCl2, 1M NaCl, pH 7.0)를 이용하여 용리시켰다. G-CSF 함유 분획을 수집한다. 단백질 함량을 결정하고(쿠마씨, 브래드퍼드) 반응 완충제를 이용하여 1㎎/㎖로 조절하며, 0.5M HCl의 적가에 의해 pH 6.0으로 조절한다.
MW 20kD인 50-배 몰 과량의 아미노옥시-PSA 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(최종농도: 10mM)로서 m-톨루이딘을 첨가한다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행한다. 과량의 아미노옥시 시약을 HIC에 의해 제거한다. 반응 혼합물의 전도도를 암모늄 아세테이트를 함유하는 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, 8M 암모늄 아세테이트, pH 6.9)를 첨가함으로써 조절하고, 50mM 헤페스, 2.5M 암모늄 아세테이트, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.9를 이용하여 사전 평형상태로 만든 80㎖ 페닐 세파로스 FF(GE 헬스케어, 코네티컷주 페어필드에 소재)로 충전한 칼럼 상에 장입하였다. 후속적으로, 5mM CaCl2를 함유하는 50mM 헤페스 완충제 pH 7.5를 이용하여 컨쥬게이트를 용리시킨다. 최종적으로, PSA-G-CSF-함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시한다. 다음에 제제를 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 1을 다음과 같이 수행한다. 과립구-집락 자극 인자(G-CSF)를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮겼고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻었다. 이 용액에, NaIO4를 첨가하여 최종 농도 200μM을 제공한다. 실온에서 30분 동안 암실에서 부드러운 진탕 하에서 산화를 수행한다. 이어서, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인(최종 농도: 10mM)으로 퀀칭시켰다.
다음에 용액에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 바바스핀 원심분리 여과기를 사용하여 UF/DF를 실시한다. MW 20kD인 50-배 몰 과량의 아미노옥시-PSA 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(최종농도: 10mM)로서 m-톨루이딘을 첨가한다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행한다. 과량의 아미노옥시 시약을 이온 교환 크로마토그래피에 의해 제거한다. 용리액의 PSA-G-CSF 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시한다. 다음에 제제를 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 2:
G-CSF를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 옮기거나 또는 용해시켜서 최종 단백질 농도 1.0 +/- 0.25㎎/㎖를 얻는다. 이어서, 용액의 pH를 0.5 N 수성 HCl 용액의 적가에 의해 6.0까지 보정한다. 후속적으로, 40mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 10분 내에 첨가하여 농도 200μM을 제공한다. T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 30 +/- 5분 동안 산화반응을 수행한다. 이어서, T= +22 +/- 2℃에서 15분 내에 수성 L-시스테인 용액(1M)의 첨가에 의해 반응을 중단시켜 반응 혼합물에서 최종 농도 10mM을 제공하였고 60 +/- 5분 동안 인큐베이션시킨다.
산화된 G-CSF를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. 용리액의 산화된 G-CSF 함유 분획을 수집하고 컨쥬게이션 반응을 위해 사용한다.
아미노옥시-폴리시알산(PSA-ONH2) 시약을 15분 부드러운 교반 하에 최대 시간 기간(t) 내에서 정제 산화된 G-CSF를 함유하는 용리액에 50배 몰 과량으로 첨가한다. 이어서, 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 15분 내에 첨가하여 최종 농도 10mM을 얻는다. 반응 혼합물을 암실에서 T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 120 +/- 10분 동안 pH 6.0에서 부드러운 진탕 하에 인큐베이션시킨다(단백질 농도: 1㎎/㎖).
얻어진 PSA-G-CSF 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. PSA-G-CSF 컨쥬게이트 함유 분획을 수집하고, 적절한 분자량 컷 오프(밀리포어)를 지니는 정제된 컨쥬게이트를 재생 셀룰로스로 만들어진 막을 사용하여 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 농축시킨다.
이 절차의 사용에 의해 제조한 컨쥬게이트를 전체 단백질, 생물학적 활성 및 PSA 함량을 측정하는 것에 의한(레조시놀 분석) 폴리시알릴화 정도의 결정을 측정함으로써 분석적으로 특성규명하였다.
방법 3:
과립구-집락 자극 인자(G-CSF)를 반응 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮기고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻는다. MW 20kD인 50배 몰 과량의 아미노옥시-PSA 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(10mM 최종농도) 및 NaIO4(최종농도: 400μM)로서 m-톨루이딘을 첨가한다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행한다. 후속적으로, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인을 이용하여 퀀칭시킨다(시스테인 농도: 10mM). 이어서, 반응 혼합물의 전도도를 암모늄 아세테이트를 함유하는 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, 8M 암모늄 아세테이트, pH 6.9)를 첨가함으로써 조절하고, 50mM 헤페스, 2.5M 암모늄 아세테이트, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, 0.01% 트윈 80, pH 6.9를 이용하여 사전 평형상태로 만든 페닐 세파로스 FF(GE 헬스케어, 코네티컷주 페어필드에 소재)로 충전한 칼럼 상에 장입하였다. 후속적으로, 50mM 헤페스 완충제, 5mM을 함유하는 염화칼슘, pH 7.5를 이용하여 컨쥬게이트를 용리시킨다. 최종적으로, PSA-G-CSF -함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 3을 다음과 같이 수행한다. 과립구-집락 자극 인자(G-CSF)를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮겼고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻었다. MW 20kD인 50배 몰 과량의 아미노옥시-PSA 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(10mM 최종농도) 및 NaIO4(최종농도: 400μM)로서 m-톨루이딘을 첨가한다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행한다. 후속적으로, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인을 이용하여 퀀칭시키고(시스테인 농도: 10mM), 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 용리액의 PSA-G-CSF 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 4:
G-CSF를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 용해시키거나 또는 옮겨서 최종 단백질 농도 1.0 +/- 0.25㎎/㎖를 얻는다. 이어서, 용액의 pH를 0.5 N 수성 HCl 용액의 적가에 의해 6.0까지 보정한다.
후속적으로, 아미노옥시-폴리시알산(PSA-ONH2) 시약을 15분 부드러운 교반 하에 최대 시간 기간(t) 내에서 이 G-CSF 용액을 함유하는 용리액에 50배 몰 과량으로 첨가한다. 이어서, 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 15분 내에 첨가하여 최종 농도 10mM을 얻는다. 최종적으로, 40mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 첨가하여 농도 400μM을 제공한다.
반응 혼합물을 암실에서 T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 120 +/- 10분 동안 부드러운 진탕 하에 인큐베이션시킨다. 이어서, 수성 L-시스테인 용액(1M)의 첨가에 의해 반응을 중단시켜 반응 혼합물에서 최종 농도 10mM을 제공하였고 60 +/- 5분 동안 인큐베이션시킨다.
얻어진 G-CSF 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 용리액의 PSA-G-CSF 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막을 사용하여 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 농축시킨다.
이 절차의 사용에 의해 제조한 컨쥬게이트를 전체 단백질, 당업계에 공지된 방법에 따라 생물학적 활성 및 PSA 함량을 측정하는 것에 의한(레조시놀 분석) 폴리시알릴화 정도의 결정을 측정함으로써 분석적으로 특성규명하였다.
실시예 29
친핵성 촉매로서 아미노옥시-PSA 및 m-톨루이딘을 사용하는 휴미라(Humira)의 폴리시알산화
방법 1:
휴미라의 출발 농도를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮겼고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻었다. 이 용액에, NaIO4를 첨가하여 최종 농도 200μM을 제공한다. 실온에서 30분 동안 암실에서 부드러운 진탕 하에서 산화를 수행한다. 이어서, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인(최종 농도: 10mM)으로 퀀칭시켰다.
다음에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 용액에 비바스핀 원심분리 여과기를 사용하는 UF/DF로 또는, 대안으로, 완충제 A(20mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 7.0)로 평형상태로 만든 20㎖ 용적을 지니는 IEX 칼럼(머렉 EMD TMAE (M))으로 처리한다. 5 CV 완충제 A를 이용하여 칼럼을 평형상태로 만든다. 이어서, 산화된 휴미라를 완충제 B(20mM 헤페스, 5mM CaCl2, 1M NaCl, pH 7.0)를 이용하여 용리시켰다. 휴미라 함유 분획을 수집한다. 단백질 함량을 결정하고(쿠마씨, 브래드퍼드) 반응 완충제를 이용하여 1㎎/㎖로 조절하며, 0.5M HCl의 적가에 의해 pH 6.0으로 조절하였다.
MW 20kD인 50-배 몰 과량의 아미노옥시-PSA 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(최종농도: 10mM)로서 m-톨루이딘을 첨가한다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행한다. 과량의 아미노옥시 시약을 HIC에 의해 제거한다. 반응 혼합물의 전도도를 암모늄 아세테이트를 함유하는 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, 8M 암모늄 아세테이트, pH 6.9)를 첨가함으로써 조절하고, 50mM 헤페스, 2.5M 암모늄 아세테이트, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.9를 이용하여 사전 평형상태로 만든 80㎖ 페닐 세파로스 FF(GE 헬스케어, 코네티컷주 페어필드에 소재)로 충전한 칼럼 상에 장입하였다. 후속적으로, 5mM CaCl2를 함유하는 50mM 헤페스 완충제 pH 7.5를 이용하여 컨쥬게이트를 용리시킨다. 최종적으로, PSA-휴미라 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시한다. 다음에 제제를 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 1을 다음과 같이 수행한다. 휴미라를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮겼고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻었다. 이 용액에, NaIO4를 첨가하여 최종 농도 200μM을 제공한다. 실온에서 30분 동안 암실에서 부드러운 진탕 하에서 산화를 수행한다. 이어서, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인(최종 농도: 10mM)으로 퀀칭시켰다.
다음에 용액에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 바바스핀 원심분리 여과기를 사용하여 UF/DF를 실시한다. MW 20kD인 50-배 몰 과량의 아미노옥시-PSA 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(최종농도: 10mM)로서 m-톨루이딘을 첨가한다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행한다. 과량의 아미노옥시 시약을 이온 교환 크로마토그래피에 의해 제거한다. 용리액의 PSA-휴미라 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시한다. 다음에 제제를 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 2:
휴미라를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 옮기거나 또는 용해시켜서 최종 단백질 농도 1.0 +/- 0.25㎎/㎖를 얻는다. 이어서, 용액의 pH를 0.5N 수성 HCl 용액의 적가에 의해 6.0까지 보정한다. 후속적으로, 40mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 10분 내에 첨가하여 농도 200μM을 제공한다. T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 30 +/- 5분 동안 산화반응을 수행한다. 이어서, T= +22 +/- 2℃에서 15분 내에 수성 L-시스테인 용액(1M)의 첨가에 의해 반응을 중단시켜 반응 혼합물에서 최종 농도 10mM을 제공하였고 60 +/- 5분 동안 인큐베이션시킨다.
산화된 휴미라를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. 용리액의 산화된 휴미라 함유 분획을 수집하고 컨쥬게이션 반응을 위해 사용한다.
아미노옥시-폴리시알산(PSA-ONH2) 시약을 15분 부드러운 교반 하에 최대 시간 기간(t) 내에서 정제 산화된 휴미라를 함유하는 용리액에 50배 몰 과량으로 첨가한다. 이어서, 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 15분 내에 첨가하여 최종 농도 10mM을 얻는다. 반응 혼합물을 암실에서 T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 120 +/- 10분 동안 pH 6.0에서 부드러운 진탕 하에 인큐베이션시킨다(단백질 농도: 1㎎/㎖).
얻어진 PSA-휴미라 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. PSA-휴미라 컨쥬게이트 함유 분획을 수집하고, 적절한 분자량 컷 오프(밀리포어)를 지니는 정제된 컨쥬게이트를 재생 셀룰로스로 만들어진 막을 사용하여 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 농축시킨다.
이 절차의 사용에 의해 제조한 컨쥬게이트를 전체 단백질, 생물학적 활성 및 PSA 함량을 측정하는 것에 의한(레조시놀 분석) 폴리시알릴화 정도의 결정을 측정함으로써 분석적으로 특성규명하였다.
방법 3:
휴미라를 반응 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮기고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻는다. MW 20kD인 50배 몰 과량의 아미노옥시-PSA 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(10mM 최종농도) 및 NaIO4(최종농도: 400μM)로서 m-톨루이딘을 첨가한다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행한다. 후속적으로, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인을 이용하여 퀀칭시킨다(시스테인 농도: 10mM). 이어서, 반응 혼합물의 전도도를 암모늄 아세테이트를 함유하는 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, 8M 암모늄 아세테이트, pH 6.9)를 첨가함으로써 조절하고, 50mM 헤페스, 2.5M 암모늄 아세테이트, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, 0.01% 트윈 80, pH 6.9를 이용하여 사전 평형상태로 만든 페닐 세파로스 FF(GE 헬스케어, 코네티컷주 페어필드에 소재)로 충전한 칼럼 상에 장입하였다. 후속적으로, 50mM 헤페스 완충제, 5mM을 함유하는 염화칼슘, pH 7.5를 이용하여 컨쥬게이트를 용리시킨다. 최종적으로, PSA-휴미라 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 3을 다음과 같이 수행한다. 휴미라를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮겼고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻었다. MW 20kD인 50배 몰 과량의 아미노옥시-PSA 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(10mM 최종농도) 및 NaIO4(최종농도: 400μM)로서 m-톨루이딘을 첨가한다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행한다. 후속적으로, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인을 이용하여 퀀칭시키고(시스테인 농도: 10mM), 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 용리액의 PSA-휴미라 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 4:
휴미라를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 용해시키거나 또는 옮겨서 최종 단백질 농도 1.0 +/- 0.25㎎/㎖를 얻는다. 이어서, 용액의 pH를 0.5 N 수성 HCl 용액의 적가에 의해 6.0까지 보정한다.
후속적으로, 아미노옥시-폴리시알산(PSA-ONH2) 시약을 15분 부드러운 교반 하에 최대 시간 기간(t) 내에서 이 휴미라 용액을 함유하는 용리액에 50배 몰 과량으로 첨가한다. 이어서, 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 15분 내에 첨가하여 최종 농도 10mM을 얻는다. 최종적으로, 40mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 첨가하여 농도 400μM을 제공한다.
반응 혼합물을 암실에서 T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 120 +/- 10분 동안 부드러운 진탕 하에 인큐베이션시킨다. 이어서, 수성 L-시스테인 용액(1M)의 첨가에 의해 반응을 중단시켜 반응 혼합물에서 최종 농도 10mM을 제공하였고 60 +/- 5분 동안 인큐베이션시킨다.
얻어진 휴미라-컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 용리액의 PSA 휴미라 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막을 사용하여 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 농축시킨다.
이 절차의 사용에 의해 제조한 컨쥬게이트를 전체 단백질, 당업계에 공지된 방법에 따라 생물학적 활성 및 PSA 함량을 측정하는 것에 의한(레조시놀 분석) 폴리시알릴화 정도의 결정을 측정함으로써 분석적으로 특성규명하였다.
실시예 30
친핵성 촉매로서 아미노옥시-PSA 및 m-톨루이딘을 사용하는 프롤리아의 폴리시알산화
방법 1:
프롤리아의 출발 농도를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮겼고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻었다. 이 용액에, NaIO4를 첨가하여 최종 농도 200μM을 제공한다. 실온에서 30분 동안 암실에서 부드러운 진탕 하에서 산화를 수행한다. 이어서, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인(최종 농도: 10mM)으로 퀀칭시켰다.
다음에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 용액에 비바스핀 원심분리 여과기를 사용하는 UF/DF로 또는, 대안으로, 완충제 A(20mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 7.0)로 평형상태로 만든 20㎖ 용적을 지니는 IEX 칼럼(머렉 EMD TMAE (M))으로 처리한다. 5 CV 완충제 A를 이용하여 칼럼을 평형상태로 만든다. 이어서, 산화된 프롤리아를 완충제 B(20mM 헤페스, 5mM CaCl2, 1M NaCl, pH 7.0)를 이용하여 용리시켰다. 프롤리아 함유 분획을 수집한다. 단백질 함량을 결정하고(쿠마씨, 브래드퍼드) 반응 완충제를 이용하여 1㎎/㎖로 조절하며, 0.5M HCl의 적가에 의해 pH 6.0으로 조절한다.
MW 20kD인 50-배 몰 과량의 아미노옥시-PSA 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(최종농도: 10mM)로서 m-톨루이딘을 첨가한다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행한다. 과량의 아미노옥시 시약을 HIC에 의해 제거한다. 반응 혼합물의 전도도를 암모늄 아세테이트를 함유하는 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, 8M 암모늄 아세테이트, pH 6.9)를 첨가함으로써 조절하고, 50mM 헤페스, 2.5M 암모늄 아세테이트, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.9를 이용하여 사전 평형상태로 만든 80㎖ 페닐 세파로스 FF(GE 헬스케어, 코네티컷주 페어필드에 소재)로 충전한 칼럼 상에 장입하였다. 후속적으로, 5mM CaCl2를 함유하는 50mM 헤페스 완충제 pH 7.5를 이용하여 컨쥬게이트를 용리시킨다. 최종적으로, PSA-프롤리아 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시한다. 다음에 제제를 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 1을 다음과 같이 수행한다. 10㎎ 프롤리아를 5㎖ 히스티딘 완충제, pH 6.0(20mM L-히스티딘, 150mM NaCl) 중에 용해시킨다. 이어서, 100㎕의 수성 과요오드산나트륨 용액(5mM)을 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 암실에서 4℃에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 50㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켰다. 후속적으로 혼합물에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 바바스핀 15R 10kD 원심분리 여과기를 사용하여 UF/DF를 실시한다.
산화된 프롤리아를 함유하는 잔류물(대략 7㎖)을 2㎖의 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합하였고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 이어서, MW가 20kD(상기 기재함)인 아미노옥시-PSA 시약을 첨가하여 5배몰 과량을 제공한다. 이 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 암실에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시킨다.
유리 프롤리아를 양이온 교환 크로마토그래피(CEC)에 의해 제거한다. 반응 혼합물을 20㎖ 완충제 A(50mM 헤페스, pH 6.5)로 희석시키고, 완충제 A를 이용하여 사전에 평행상태로 만든 20㎖ HiPrep SPFF 16/10 칼럼(코네티컷주 페어필드에 소재한 GE 헬스케어(GE Healthcare)) 상에 장입한다. 이어서, 칼럼을 완충제 B(50mM 헤페스, 1M NaCl, pH 6.5)로 용리시킨다. 25% 완충제 B 및 50% 완충제 B에서의 컨쥬게이트를 지니는 칼럼을 세척함으로써 유리 프롤리아를 용리시킨다. 분획을 함유하는 컨쥬게이트의 전도도를 후속적으로 완충제 C(50mM 헤페스, 5M NaCl, pH 6.9)를 이용하여 190 mS/㎝로 상승시키고, 완충제 D(50mM 헤페스, 3M NaCl, pH 6.9)를 이용하여 사전에 평행상태로 만든 20㎖ HiPrep 뷰틸 FF 16/10 칼럼(GE 헬스케어, 코네티컷주 페어필드에 소재)에 장입하였다. 유리 PSA-시약을 5 CV 완충제 D 내에서 세척한다. 후속적으로 100% 완충제 E(50mM 헤페스, pH 6.9)를 이용하여 컨쥬게이트를 용리시켰다. 분획을 함유하는 컨쥬게이트를 재생 셀룰로스(88㎠, 컷-오프 10kD, 밀리포어)로 만들어진 10kD 막을 사용하여 UF/DF에 의해 농축시킨다. 150mM NaCl를 함유하는 히스티딘 완충제(Ph 6.9)에 대해 최종 정용여과 단계를 수행한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다. PSA 프롤리아 컨쥬게이트에 대해 천연 프롤리아에 비해 50% 미만의 특이적 활성을 결정한다. 앞서 기재한 조건 하에서 쇼덱스(Shodex) KW 803 칼럼을 구비한 애질런트 1200 HPLC 시스템을 사용하여 크기 배제 HPLC에 의해 컨쥬게이트를 추가적으로 분석적으로 특성규명한다(Kolarich et al, Transfusion 2006;46:1959-77). 이는 제제가 유리 프롤리아를 함유하지 않는다는 것을 나타낸다.
방법 2:
프롤리아를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 옮기거나 또는 용해시켜서 최종 단백질 농도 1.0 +/- 0.25㎎/㎖를 얻는다. 이어서, 용액의 pH를 0.5 N 수성 HCl 용액의 적가에 의해 6.0까지 보정한다. 후속적으로, 40mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 10분 내에 첨가하여 농도 200μM을 제공한다. T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 30 +/- 5분 동안 산화반응을 수행한다. 이어서, T= +22 +/- 2℃에서 15분 내에 수성 L-시스테인 용액(1M)의 첨가에 의해 반응을 중단시켜 반응 혼합물에서 최종 농도 10mM을 제공하였고 60 +/- 5분 동안 인큐베이션시킨다.
산화된 프롤리아를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. 용리액의 산화된 프롤리아 함유 분획을 수집하고 컨쥬게이션 반응을 위해 사용한다.
아미노옥시-폴리시알산(PSA-ONH2) 시약을 15분 부드러운 교반 하에 최대 시간 기간(t) 내에서 정제 산화된 프롤리아를 함유하는 용리액에 50배 몰 과량으로 첨가한다. 이어서, 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 15분 내에 첨가하여 최종 농도 10mM을 얻는다. 반응 혼합물을 암실에서 T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 120 +/- 10분 동안 pH 6.0에서 부드러운 진탕 하에 인큐베이션시킨다(단백질 농도: 1㎎/㎖).
얻어진 프롤리아 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. 프롤리아 컨쥬게이트 함유 분획을 수집하고, 적절한 분자량 컷 오프(밀리포어)를 지니는 정제된 컨쥬게이트를 재생 셀룰로스로 만들어진 막을 사용하여 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 농축시킨다.
이 절차의 사용에 의해 제조한 컨쥬게이트를 전체 단백질, 생물학적 활성 및 PSA 함량을 측정하는 것에 의한(레조시놀 분석) 폴리시알릴화 정도의 결정을 측정함으로써 분석적으로 특성규명하였다.
방법 3:
프롤리아를 반응 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0)에 옮기고, 희석시켜 1㎎/㎖의 단백질 농도를 얻는다. MW 20kD인 50배 몰 과량의 아미노옥시-PSA 시약(상기 기재함)을 첨가한 다음 친핵성 촉매(10mM 최종농도) 및 NaIO4(최종농도: 400μM)로서 m-톨루이딘을 첨가한다. 암실에서 부드러운 진탕 하에 실온에서 2시간 동안 결합 반응을 수행한다. 후속적으로, 반응물을 실온에서 60분 동안 시스테인을 이용하여 퀀칭시킨다(시스테인 농도: 10mM). 이어서, 반응 혼합물의 전도도를 암모늄 아세테이트를 함유하는 완충제(50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, 8M 암모늄 아세테이트, pH 6.9)를 첨가함으로써 조절하고, 50mM 헤페스, 2.5M 암모늄 아세테이트, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, 0.01% 트윈 80, pH 6.9를 이용하여 사전 평형상태로 만든 페닐 세파로스 FF(GE 헬스케어, 코네티컷주 페어필드에 소재)로 충전한 칼럼 상에 장입하였다. 후속적으로, 50mM 헤페스 완충제, 5mM을 함유하는 염화칼슘, pH 7.5를 이용하여 컨쥬게이트를 용리시킨다. 최종적으로, 프롤리아-함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막의 사용에 의해 UF/DF를 실시한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 3을 다음과 같이 수행한다. 10㎎ 프롤리아를 8㎖ 히스티딘 완충제, pH 6.0(20mM L-히스티딘, 150mM NaCl) 중에 용해시킨다. 200㎕의 수성 과요오드산나트륨 용액(5mM) 및 2㎖의 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 첨가한다. 후속적으로, MW가 20kD(상기 기재함)인 아미노옥시-PSA 시약을 첨가하여 5배몰 과량을 제공한다. 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 100㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시킨다.
유리 프롤리아를 양이온 교환 크로마토그래피(CEC)에 의해 제거한다. 반응 혼합물을 20㎖ 완충제 A(50mM 헤페스, pH 6.5)로 희석시키고, 완충제 A를 이용하여 사전에 평행상태로 만든 20㎖ HiPrep SPFF 16/10 칼럼(코네티컷주 페어필드에 소재한 GE 헬스케어(GE Healthcare)) 상에 장입한다. 이어서, 칼럼을 완충제 B(50mM 헤페스, 1M NaCl, pH 6.5)로 용리시킨다. 25% 완충제 B 및 50% 완충제 B에서의 컨쥬게이트를 지니는 칼럼을 세척함으로써 유리 프롤리아를 용리시킨다. 분획을 함유하는 컨쥬게이트의 전도도를 후속적으로 완충제 C(50mM 헤페스, 5M NaCl, pH 6.9)를 이용하여 190 mS/㎝로 상승시키고, 완충제 D(50mM 헤페스, 3M NaCl, pH 6.9)를 이용하여 사전에 평행상태로 만든 20㎖ HiPrep 뷰틸 FF 16/10 칼럼(GE 헬스케어, 코네티컷주 페어필드에 소재)에 장입하였다. 유리 PSA-시약을 5 CV 완충제 D 내에서 세척한다. 후속적으로 100% 완충제 E(50mM 헤페스, pH 6.9)를 이용하여 컨쥬게이트를 용리시켰다. 컨쥬게이트 함유 분획을 재생 셀룰로스(88㎠, 컷-오프 10kD/밀리포어)로 만들어진 10kD 막을 사용하여 UF/DF에 의해 농축시킨다. 150mM NaCl를 함유하는 히스티딘 완충제(Ph 6.9)에 대해 최종 정용여과 단계를 수행한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다. PSA 프롤리아 컨쥬게이트에 대해 천연 프롤리아에 비해 50% 미만의 특이적 활성을 결정한다. 앞서 기재한 조건 하에서 쇼덱스(Shodex) KW 803 칼럼을 구비한 애질런트 1200 HPLC 시스템을 사용하여 크기 배제 HPLC에 의해 컨쥬게이트를 추가적으로 분석적으로 특성규명한다(Kolarich et al, Transfusion 2006;46:1959-77). 이는 제제가 유리 프롤리아를 함유하지 않는다는 것을 나타낸다.
방법 4:
프롤리아_를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 용해시키거나 또는 옮겨서 최종 단백질 농도 1.0 +/- 0.25㎎/㎖를 얻는다. 이어서, 용액의 pH를 0.5 N 수성 HCl 용액의 적가에 의해 6.0까지 보정한다.
후속적으로, 아미노옥시-폴리시알산(PSA-ONH2) 시약을 15분 부드러운 교반 하에 최대 시간 기간(t) 내에서 이 프롤리아-용액을 함유하는 용리액에 50배 몰 과량으로 첨가한다. 이어서, 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 15분 내에 첨가하여 최종 농도 10mM을 얻는다. 최종적으로, 40mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 첨가하여 농도 400μM을 제공한다.
반응 혼합물을 암실에서 T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 120 +/- 10분 동안 부드러운 진탕 하에 인큐베이션시킨다. 이어서, 수성 L-시스테인 용액(1M)의 첨가에 의해 반응을 중단시켜 반응 혼합물에서 최종 농도 10mM을 제공하였고 60 +/- 5분 동안 인큐베이션시킨다.
얻어진 프롤리아 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 용리액의 PSA-프롤리아 함유 분획을 수집하고, 재생 셀룰로스(밀리포어)로 만들어진 막을 사용하여 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 농축시킨다.
이 절차의 사용에 의해 제조한 컨쥬게이트를 전체 단백질, 당업계에 공지된 방법에 따라 생물학적 활성 및 PSA 함량을 측정하는 것에 의한(레조시놀 분석) 폴리시알릴화 정도의 결정을 측정함으로써 분석적으로 특성규명하였다.
실시예 31
다른 치료적 단백질의 폴리시알산화
본 명세서에 기재한 바와 같은 m-톨루이딘 또는 o-아미노벤조산과 같은 대안의 친핵성 촉매의 존재에서 수행한 폴리시알산화 반응을 다른 치료적 단백질로 확장할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 다양한 양태에서, PSA 아미노옥시 또는 PEG 아미노옥시 시약에 의한 본 명세서에 기재한 바와 같은 상기 폴리시알산화 또는 페길화 반응을 본 명세서에 기재한 것과 같은 치료적 단백질에 의해 반복한다.
실시예 32
친핵성 촉매로서 아미노옥시-PEG 시약 및 m-톨루이딘을 사용하는 EPO의 페길화
방법 1:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 에리트로포이에틴(EPO)을 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. EPO를 7.0㎖ 히스티딘 완충제, pH 6.0(20mM L-히스티딘, 150mM NaCl, 5mM CaCl2) 중에 용해시킨다. 이어서, 수성 과요오드산나트륨 용액(5mM)을 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 암실에서 4℃에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 7.5㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켰다. 후속적으로 혼합물에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 바바스핀 원심분리 여과기를 사용하여 UF/DF를 실시한다.
다음에 산화된 EPO를 함유하는 잔류물을 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합하고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션시킨다. MW가 20kD인 아미노옥시-PEG 시약을 첨가하여 5배몰 과량을 제공한다. 이 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 암실에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시킨다.
최종적으로, PEG-EPO 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피(예를 들어, Q 세파로스 FF 상에서)에 의해 정제한다. 예를 들어, 1.5㎎ 단백질/㎖ 겔을 5mM CaCl2를 함유하는 50mM 헤페스 완충제, pH 7.4를 이용하여 평형상태로 만든 칼럼 상에 장입한다. 컨쥬게이트를 5mM CaCl2 및 500mM 염화나트륨, pH 7.4를 함유하는 50mM 헤페스 완충제를 이용하여 용리시킨 다음, 적절한 MW 컷오프 막을 사용하여 UF/DF를 실시한다. 다음에 제제를 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 1을 다음과 같이 수행한다. 아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 EPO를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. 10㎎ EPO를 5㎖ 히스티딘 완충제, pH 6.0(20mM L-히스티딘, 150mM NaCl) 중에 용해시킨다. 이어서, 100㎕의 수성 과요오드산나트륨 용액(5mM)을 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 암실에서 4℃에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 50㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켰다. 후속적으로 혼합물에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 바바스핀 15R 10kD 원심분리 여과기를 사용하여 UF/DF를 실시한다.
산화된 EPO를 함유하는 잔류물(대략 7㎖)을 2㎖의 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합하였고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 이어서, MW가 20kD(상기 기재함)인 아미노옥시-PEG 시약을 첨가하여 5배몰 과량을 제공한다. 이 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 암실에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시킨다.
최종적으로, PEG-EPO 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피(Q 세파로스 FF 상에서)에 의해 정제한다. 반응 혼합물을 20㎖ 완충제 A(50mM 헤페스, pH 7.5)로 희석시키고, 완충제 A를 이용하여 사전에 평행상태로 만든 20㎖ HiPrep QFF 16/10 칼럼(코네티컷주 페어필드에 소재한 GE 헬스케어(GE Healthcare)) 상에 장입한다. 이어서, 칼럼을 완충제 B(50mM 헤페스, 1M NaCl, pH 7.5)로 용리시킨다. 25% 완충제 B 및 50% 완충제 B에서의 컨쥬게이트를 이용하여 칼럼을 세척함으로써 유리 EPO를 용리시킨다. 컨쥬게이트 함유 분획을 재생 셀룰로스(88㎠, 컷-오프 10kD/밀리포어)로 만들어진 10kD 막을 사용하여 UF/DF에 의해 농축시킨다. 150mM NaCl를 함유하는 히스티딘 완충제(Ph 7.2)에 대해 최종 정용여과 단계를 수행한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다. PEG-EPO 컨쥬게이트에 대해 천연 EPO에 비해 50% 미만의 특이적 활성을 결정한다. 앞서 기재한 조건 하에서 쇼덱스(Shodex) KW 803 칼럼을 구비한 애질런트 1200 HPLC 시스템을 사용하여 크기 배제 HPLC에 의해 컨쥬게이트를 추가적으로 분석적으로 특성규명한다(Kolarich et al, Transfusion 2006;46:1959-77). 이는 제제가 유리 EPO를 함유하지 않는다는 것을 나타낸다.
방법 2:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 EPO를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다.
EPO를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 옮기거나 또는 용해시켜서 최종 단백질 농도 1.0 +/- 0.25㎎/㎖를 얻는다. 이어서, 용액의 pH를 0.5 N 수성 HCl 용액의 적가에 의해 6.0까지 보정한다. 후속적으로, 40mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 10분 내에 첨가하여 농도 200μM을 제공한다. T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 30 +/- 5분 동안 산화반응을 수행한다. 이어서, T= +22 +/- 2℃에서 15분 내에 수성 L-시스테인 용액(1M)의 첨가에 의해 반응을 중단시켜 반응 혼합물에서 최종 농도 10mM을 제공하였고 60 +/- 5분 동안 인큐베이션시킨다.
산화된 EPO를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. 용리액의 산화된 EPO 함유 분획을 수집하고 컨쥬게이션 반응을 위해 사용한다.
MW 20kD의 아미노옥시-PEG 시약을 15분 부드러운 교반 하에 최대 시간 기간(t) 내에서 정제 산화된 EPO를 함유하는 용리액에 50배 몰 과량으로 첨가한다. 이어서, 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 15분 내에 첨가하여 최종 농도 10mM을 얻는다. 반응 혼합물을 암실에서 T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 120 +/- 10분 동안 부드러운 진탕 하에 인큐베이션시킨다.
얻어진 PEG- EPO 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. PEG- EPO 컨쥬게이트 함유 분획을 수집하고, 적절한 분자량 컷 오프(밀리포어)를 지니는 정제된 컨쥬게이트를 재생 셀룰로스로 만들어진 막을 사용하여 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 농축시킨다.
이 절차의 사용에 의해 제조한 컨쥬게이트를 전체 단백질 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 3:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 EPO를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. EPO를 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 150mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 용해시키고, 수성 과요오드산나트륨 용액(10mM), 및 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합한다. 후속적으로 아미노옥시 시약을 첨가하여 20배 몰 과량의 시약을 제공한다. 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 8㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시킨다.
최종적으로, PEG-EPO 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피(Q 세파로스 FF 상에서)에 의해 정제한다. 1.5㎎ 단백질/㎖ 겔을 5mM CaCl2를 함유하는 50mM 헤페스 완충제, pH 7.4를 이용하여 미리 평형상태로 만든 칼럼 상에 장입한다. 컨쥬게이트를 5mM CaCl2 및 500mM 염화나트륨, pH 7.4를 함유하는 50mM 헤페스 완충제를 이용하여 용리시킨 다음, 막을 사용하여 UF/DF를 실시한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 3을 다음과 같이 수행한다. 아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 EPO를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. 10㎎ EPO를 ~8㎖ 히스티딘 완충제, pH 6.0(20mM L-히스티딘, 150mM NaCl) 중에 용해시킨다. 200㎕의 수성 과요오드산나트륨 용액(5mM) 및 2㎖의 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 첨가한다. 후속적으로, MW가 20kD(상기 기재함)인 아미노옥시-PEG 시약을 첨가하여 5배몰 과량을 제공한다. 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 100㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시킨다.
최종적으로, PEG-EPO 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피(Q 세파로스 FF 상에서)에 의해 정제한다. 반응 혼합물을 20㎖ 완충제 A(50mM 헤페스, pH 7.5)로 희석시키고, 완충제 A를 이용하여 사전에 평행상태로 만든 20㎖ HiPrep QFF 16/10 칼럼(코네티컷주 페어필드에 소재한 GE 헬스케어(GE Healthcare)) 상에 장입한다. 이어서, 칼럼을 완충제 B(50mM 헤페스, 1M NaCl, pH 7.5)로 용리시킨다. 25% 완충제 B 및 50% 완충제 B에서의 컨쥬게이트를 이용하여 칼럼을 세척함으로써 유리 EPO를 용리시킨다. 컨쥬게이트 함유 분획을 재생 셀룰로스(88㎠, 컷-오프 10kD/밀리포어)로 만들어진 10kD 막을 사용하여 UF/DF에 의해 농축시킨다. 150mM NaCl를 함유하는 히스티딘 완충제(Ph 7.2)에 대해 최종 정용여과 단계를 수행한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다. PEG-EPO 컨쥬게이트에 대해 천연 EPO에 비해 50% 미만의 특이적 활성을 결정한다. 앞서 기재한 조건 하에서 쇼덱스(Shodex) KW 803 칼럼을 구비한 애질런트 1200 HPLC 시스템을 사용하여 크기 배제 HPLC에 의해 컨쥬게이트를 추가적으로 분석적으로 특성규명한다(Kolarich et al, Transfusion 2006;46:1959-77). 이는 제제가 유리 EPO를 함유하지 않는다는 것을 나타낸다.
방법 4:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 EPO를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. EPO의 초기 농도 또는 중량을 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 150mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 옮기거나 또는 용해시켜서 최종 단백질 농도 2㎎ EPO/㎖를 얻는다. 후속적으로 15분 내에 5mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 첨가하여 최종 농도 100μM을 제공한 후, 50mM 수성 m-톨루이딘 용액의 첨가로 30분의 시간 기간 내에 최종 농도 10mM을 얻는다. 이어서, MW가 20kD(상기 기재함)인 아미노옥시-PEG 시약을 첨가하여 20배 몰 과량의 시약을 제공한다. pH를 6.0으로 보정한 후, 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 1M 수성 L-시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켜 최종 농도 10mM을 제공한다.
PEG-EPO 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피(IEC)에 의해 정화하였다. 용리액의 컨쥬게이트 함유 분획을 재생 셀룰로스(88㎠, 컷-오프 10kD/밀리포어)로 만들어진 10kD 막을 사용하여 UF/DF에 의해 농축시킨다. 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 7.5)에 대해 최종 정용여과 단계를 수행한다.
전체 단백질(브래드퍼드 및 BCA 절차) 및 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 제제를 분석적으로 특성규명한다.
실시예 33
친핵성 촉매로서 아미노옥시-PEG 시약 및 m-톨루이딘을 사용하는 Ang-2의 페길화
방법 1:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 Ang-2를 페길화한 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. Ang-2를 7.0㎖ 히스티딘 완충제, pH 6.0(20mM L-히스티딘, 150mM NaCl, 5mM CaCl2) 중에 용해시킨다. 이어서, 수성 과요오드산나트륨 용액(5mM)을 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 암실에서 4℃에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 7.5㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켰다. 후속적으로 혼합물에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 바바스핀 원심분리 여과기를 사용하여 UF/DF를 실시한다.
산화된 Ang-2를 함유하는 잔류물을 다음에 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합하였고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 이어서, MW가 20kD인 아미노옥시-PEG 시약을 첨가하여 5배몰 과량을 제공한다. 이 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 암실에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시킨다.
최종적으로, PEG-Ang-2 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피(예를 들어, Q 세파로스 FF 상에서)에 의해 정제한다. 예를 들어, 1.5㎎ 단백질/㎖ 겔을 5mM CaCl2를 함유하는 50mM 헤페스 완충제, pH 7.4를 이용하여 평형상태로 만든 칼럼 상에 장입한다. 컨쥬게이트를 5mM CaCl2 및 500mM 염화나트륨, pH 7.4를 함유하는 50mM 헤페스 완충제를 이용하여 용리시킨 다음, 적절한 MW 컷오프 막을 사용하여 UF/DF를 실시한다. 다음에 제제를 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 1을 다음과 같이 수행한다. 아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 Ang-2를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. Ang-2를 7.0㎖ 히스티딘 완충제, pH 6.0(20mM L-히스티딘, 150mM NaCl, 5mM CaCl2) 중에 용해시킨다. 이어서, 수성 과요오드산나트륨 용액(5mM)을 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 암실에서 4℃에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 7.5㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켰다. 후속적으로 혼합물에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 바바스핀 원심분리 여과기를 사용하여 UF/DF를 실시한다.
산화된 Ang-2를 함유하는 잔류물을 다음에 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합하였고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 이어서, MW가 20kD인 아미노옥시-PEG 시약을 첨가하여 5배몰 과량을 제공한다. 이 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 암실에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시킨다.
최종적으로, 얻어진 PEG- Ang-2 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 용리액의 컨쥬게이트 함유 분획을 수집하고, 이어서, 적절한 MW 컷오프 막을 사용하여 UF/DF를 실시한다. 다음에 제제를 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 2:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 Ang-2를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다.
Ang-2를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 옮기거나 또는 용해시켜서 최종 단백질 농도 1.0 +/- 0.25㎎/㎖를 얻는다. 이어서, 용액의 pH를 0.5N 수성 HCl 용액의 적가에 의해 6.0까지 보정한다. 후속적으로, 40mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 10분 내에 첨가하여 농도 200μM을 제공한다. T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 30 +/- 5분 동안 산화반응을 수행한다. 이어서, T= +22 +/- 2℃에서 15분 내에 수성 L-시스테인 용액(1M)의 첨가에 의해 반응을 중단시켜 반응 혼합물에서 최종 농도 10mM을 제공하였고 60 +/- 5분 동안 인큐베이션시킨다.
산화된 Ang-2를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. 용리액의 산화된 Ang-2 함유 분획을 수집하고 컨쥬게이션 반응을 위해 사용한다.
MW 20kD의 아미노옥시-PEG 시약을 15분 부드러운 교반 하에 최대 시간 기간(t) 내에서 정제 산화된 Ang-2를 함유하는 용리액에 50배 몰 과량으로 첨가한다. 이어서, 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 15분 내에 첨가하여 최종 농도 10mM을 얻는다. 반응 혼합물을 암실에서 T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 120 +/- 10분 동안 부드러운 진탕 하에 인큐베이션시킨다.
얻어진 Ang-2 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. PEG-Ang-2 컨쥬게이트 함유 분획을 수집하고, 적절한 분자량 컷 오프(밀리포어)를 지니는 정제된 컨쥬게이트를 재생 셀룰로스로 만들어진 막을 사용하여 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 농축시킨다.
이 절차의 사용에 의해 제조한 컨쥬게이트를 전체 단백질 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 3:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 Ang-2를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. Ang-2를 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 150mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 용해시키고, 수성 과요오드산나트륨 용액(10mM), 및 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합한다. 후속적으로 아미노옥시 시약을 첨가하여 20배 몰 과량의 시약을 제공한다. 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 8㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시킨다.
최종적으로, 얻어진 PEG- Ang-2 컨쥬게이트를 Q 세파로스 FF 상에서 이온-교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 1.5㎎ 단백질/㎖ 겔을 5mM CaCl2를 함유하는 50mM 헤페스 완충제, pH 7.4를 이용하여 미리 평형상태로 만든 칼럼 상에 장입한다. 컨쥬게이트를 5mM CaCl2 및 500mM 염화나트륨, pH 7.4를 함유하는 50mM 헤페스 완충제를 이용하여 용리시킨 다음, 막을 사용하여 UF/DF를 실시한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 3을 다음과 같이 수행한다. 아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 Ang-2를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. Ang-2를 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 150mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 용해시키고, 수성 과요오드산나트륨 용액(10mM), 및 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합한다. 후속적으로 아미노옥시 시약을 첨가하여 20배 몰 과량의 시약을 제공한다. 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 8㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시킨다.
최종적으로, PEG-Ang-2 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 용리액의 컨쥬게이트 함유 분획을 수집한 다음, UF/DF를 실시한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 4:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 Ang-2를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. Ang-2의 초기 농도 또는 중량을 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 150mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 옮기거나 또는 용해시켜서 최종 단백질 농도 2㎎ Ang-2/㎖를 얻는다. 후속적으로 15분 내에 5mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 첨가하여 최종 농도 100μM을 제공한 후, 50mM 수성 m-톨루이딘 용액의 첨가로 30분의 시간 기간 내에 최종 농도 10mM을 얻는다. 이어서, MW가 20kD(상기 기재함)인 아미노옥시-PEG 시약을 첨가하여 20배 몰 과량의 시약을 제공한다. pH를 6.0으로 보정한 후, 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 1M 수성 L-시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켜 최종 농도 10mM을 제공한다.
PEG-Ang-2 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피(IEC)에 의해 정화하였다. 용리액의 컨쥬게이트 함유 분획을 재생 셀룰로스(88㎠, 컷-오프 10kD/밀리포어)로 만들어진 10kD 막을 사용하여 UF/DF에 의해 농축시킨다. 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 7.5)에 대해 최종 정용여과 단계를 수행한다.
전체 단백질(브래드퍼드 및 BCA 절차) 및 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 제제를 분석적으로 특성규명한다.
후속적으로, 유리 Ang-2를 이온 교환 크로마토그래피(IEC)에 의해 제거하였다. 용리액의 컨쥬게이트 함유 분획을 UF/DF에 의해 농축시킨다.
실시예 34
친핵성 촉매로서 아미노옥시-PEG 시약 및 m-톨루이딘을 사용하는 VEGF의 페길화
방법 1:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 VEGF를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. VEGF를 7.0㎖ 히스티딘 완충제, pH 6.0(20mM L-히스티딘, 150mM NaCl, 5mM CaCl2) 중에 용해시킨다. 이어서, 수성 과요오드산나트륨 용액(5mM)을 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 암실에서 4℃에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 7.5㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켰다. 후속적으로 혼합물에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 바바스핀 원심분리 여과기를 사용하여 UF/DF를 실시한다.
산화된 VEGF를 함유하는 잔류물을 다음에 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합하였고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 이어서, MW가 20kD인 아미노옥시-PEG 시약을 첨가하여 5배몰 과량을 제공한다. 이 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 암실에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시킨다.
최종적으로, PEG-VEGF 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피(예를 들어, Q 세파로스 FF 상에서)에 의해 정제한다. 예를 들어, 1.5㎎ 단백질/㎖ 겔을 5mM CaCl2를 함유하는 50mM 헤페스 완충제, pH 7.4를 이용하여 평형상태로 만든 칼럼 상에 장입한다. 컨쥬게이트를 5mM CaCl2 및 500mM 염화나트륨, pH 7.4를 함유하는 50mM 헤페스 완충제를 이용하여 용리시킨 다음, 적절한 MW 컷오프 막을 사용하여 UF/DF를 실시한다. 다음에 제제를 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 1을 다음과 같이 수행한다. 아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 VEGF를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. VEGF를 7.0㎖ 히스티딘 완충제, pH 6.0(20mM L-히스티딘, 150mM NaCl, 5mM CaCl2) 중에 용해시킨다. 이어서, 수성 과요오드산나트륨 용액(5mM)을 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 암실에서 4℃에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 7.5㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켰다. 후속적으로 혼합물에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 바바스핀 원심분리 여과기를 사용하여 UF/DF를 실시한다.
산화된 VEGF를 함유하는 잔류물을 다음에 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합하였고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 이어서, MW가 20kD인 아미노옥시-PEG 시약을 첨가하여 5배몰 과량을 제공한다. 이 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 암실에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시킨다.
최종적으로, PEG- VEGF 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 용리액의 컨쥬게이트 함유 분획을 수집하고, 이어서, 적절한 MW 컷오프 막을 사용하여 UF/DF를 실시한다. 다음에 제제를 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 2:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 VEGF를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)제의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. VEGF를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 옮기거나 또는 용해시켜서 최종 단백질 농도 1.0 +/- 0.25㎎/㎖를 얻는다. 이어서, 용액의 pH를 0.5N 수성 HCl 용액의 적가에 의해 6.0까지 보정한다. 후속적으로, 40mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 10분 내에 첨가하여 농도 200μM을 제공한다. T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 30 +/- 5분 동안 산화반응을 수행한다. 이어서, T= +22 +/- 2℃에서 15분 내에 수성 L-시스테인 용액(1M)의 첨가에 의해 반응을 중단시켜 반응 혼합물에서 최종 농도 10mM을 제공하였고 60 +/- 5분 동안 인큐베이션시킨다.
산화된 VEGF를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. 용리액의 산화된 VEGF 함유 분획을 수집하고 컨쥬게이션 반응을 위해 사용한다.
MW 20kD의 아미노옥시-PEG 시약을 15분 부드러운 교반 하에 최대 시간 기간(t) 내에서 정제 산화된 VEGF를 함유하는 용리액에 50배 몰 과량으로 첨가한다. 이어서, 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 15분 내에 첨가하여 최종 농도 10mM을 얻는다. 반응 혼합물을 암실에서 T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 120 +/- 10분 동안 부드러운 진탕 하에 인큐베이션시킨다.
얻어진 PEG-VEGF 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. PEG-VEGF 컨쥬게이트 함유 분획을 수집하고, 적절한 분자량 컷 오프(밀리포어)를 지니는 정제된 컨쥬게이트를 재생 셀룰로스로 만들어진 막을 사용하여 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 농축시킨다.
이 절차의 사용에 의해 제조한 컨쥬게이트를 전체 단백질 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 3:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 VEGF를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. VEGF를 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 150mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 용해시키고, 수성 과요오드산나트륨 용액(10mM), 및 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합한다. 후속적으로 아미노옥시 시약을 첨가하여 20배 몰 과량의 시약을 제공한다. 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 8㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시킨다.
최종적으로, PEG-VEGF 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피에 의해 Q 세파로스 FF 상에서 정제한다. 1.5㎎ 단백질/㎖ 겔을 5mM CaCl2를 함유하는 50mM 헤페스 완충제, pH 7.4를 이용하여 미리 평형상태로 만든 칼럼 상에 장입한다. 컨쥬게이트를 5mM CaCl2 및 500mM 염화나트륨, pH 7.4를 함유하는 50mM 헤페스 완충제를 이용하여 용리시킨 다음, 막을 사용하여 UF/DF를 실시한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 3을 다음과 같이 수행한다. 아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 VEGF를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. VEGF를 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 150mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 용해시키고, 수성 과요오드산나트륨 용액(10mM), 및 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합한다. 후속적으로 아미노옥시 시약을 첨가하여 20배 몰 과량의 시약을 제공한다. 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 8㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시킨다.
최종적으로, 얻어진 PEG-VEGF 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 용리액의 컨쥬게이트 함유 분획을 수집하고, 이어서, UF/DF를 실시한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 4:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 VEGF를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. VEGF의 초기 농도 또는 중량을 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 150mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 옮기거나 또는 용해시켜서 최종 단백질 농도 2㎎ VEGF/㎖를 얻는다. 후속적으로 15분 내에 5mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 첨가하여 최종 농도 100μM을 제공한 후, 50mM 수성 m-톨루이딘 용액의 첨가로 30분의 시간 기간 내에 최종 농도 10mM을 얻는다. 이어서, MW가 20kD(상기 기재함)인 아미노옥시-PEG 시약을 첨가하여 20배 몰 과량의 시약을 제공한다. pH를 6.0으로 보정한 후, 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 1M 수성 L-시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켜 최종 농도 10mM을 제공한다.
PEG-VEGF 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피(IEC)에 의해 정화하였다. 용리액의 컨쥬게이트 함유 분획을 재생 셀룰로스(88㎠, 컷-오프 10kD/밀리포어)로 만들어진 10kD 막을 사용하여 UF/DF에 의해 농축시킨다. 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 7.5)에 대해 최종 정용여과 단계를 수행한다.
전체 단백질(브래드퍼드 및 BCA 절차) 및 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 제제를 분석적으로 특성규명한다.
실시예 35
친핵성 촉매로서 아미노옥시-PEG 시약 및 m-톨루이딘을 사용하는 EGF의 페길화
방법 1:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 EGF를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. EGF를 7.0㎖ 히스티딘 완충제, pH 6.0(20mM L-히스티딘, 150mM NaCl, 5mM CaCl2) 중에 용해시킨다. 이어서, 수성 과요오드산나트륨 용액(5mM)을 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 암실에서 4℃에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 7.5㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켰다. 후속적으로 혼합물에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 바바스핀 원심분리 여과기를 사용하여 UF/DF를 실시한다.
산화된 EGF를 함유하는 잔류물을 다음에 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합하였고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 이어서, MW가 20kD인 아미노옥시-PEG 시약을 첨가하여 5배몰 과량을 제공한다. 이 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 암실에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시킨다.
최종적으로, PEG-EGF 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피(예를 들어, Q 세파로스 FF 상에서)에 의해 정제한다. 예를 들어, 1.5㎎ 단백질/㎖ 겔을 5mM CaCl2를 함유하는 50mM 헤페스 완충제, pH 7.4를 이용하여 평형상태로 만든 칼럼 상에 장입한다. 컨쥬게이트를 5mM CaCl2 및 500mM 염화나트륨, pH 7.4를 함유하는 50mM 헤페스 완충제를 이용하여 용리시킨 다음, 적절한 MW 컷오프 막을 사용하여 UF/DF를 실시한다. 다음에 제제를 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 1을 다음과 같이 수행한다. 아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 EGF를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. EGF를 7.0㎖ 히스티딘 완충제, pH 6.0(20mM L-히스티딘, 150mM NaCl, 5mM CaCl2) 중에 용해시킨다. 이어서, 수성 과요오드산나트륨 용액(5mM)을 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 암실에서 4℃에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 7.5㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켰다. 후속적으로 혼합물에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 바바스핀 원심분리 여과기를 사용하여 UF/DF를 실시한다.
산화된 EGF를 함유하는 잔류물을 다음에 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합하였고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 이어서, MW가 20kD인 아미노옥시-PEG 시약을 첨가하여 5배몰 과량을 제공한다. 이 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 암실에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시킨다.
최종적으로, PEG-EGF 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 용리액의 컨쥬게이트 함유 분획을 수집하고, 이어서, 적절한 MW 컷오프 막을 사용하여 UF/DF를 실시한다. 다음에 제제를 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 2:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 EGF를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. EGF를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 옮기거나 또는 용해시켜서 최종 단백질 농도 1.0 +/- 0.25㎎/㎖를 얻는다. 이어서, 용액의 pH를 0.5 N 수성 HCl 용액의 적가에 의해 6.0까지 보정한다. 후속적으로, 40mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 10분 내에 첨가하여 농도 200μM을 제공한다. T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 30 +/- 5분 동안 산화반응을 수행한다. 이어서, T= +22 +/- 2℃에서 15분 내에 수성 L-시스테인 용액(1M)의 첨가에 의해 반응을 중단시켜 반응 혼합물에서 최종 농도 10mM을 제공하였고 60 +/- 5분 동안 인큐베이션시킨다.
산화된 EGF를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. 용리액의 산화된 EGF 함유 분획을 수집하고 컨쥬게이션 반응을 위해 사용한다.
MW 20kD의 아미노옥시-PEG 시약을 15분 부드러운 교반 하에 최대 시간 기간(t) 내에서 정제 산화된 NGF를 함유하는 용리액에 50배 몰 과량으로 첨가한다. 이어서, 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 15분 내에 첨가하여 최종 농도 10mM을 얻는다. 반응 혼합물을 암실에서 T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 120 +/- 10분 동안 부드러운 진탕 하에 인큐베이션시킨다.
얻어진 PEG-EGF 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. PEG-EGF 컨쥬게이트 함유 분획을 수집하고, 적절한 분자량 컷 오프(밀리포어)를 지니는 정제된 컨쥬게이트를 재생 셀룰로스로 만들어진 막을 사용하여 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 농축시킨다.
이 절차의 사용에 의해 제조한 컨쥬게이트를 전체 단백질 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 3:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 EGF를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. EGF를 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 150mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 용해시키고, 수성 과요오드산나트륨 용액(10mM), 및 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합한다. 후속적으로 아미노옥시 시약을 첨가하여 20배 몰 과량의 시약을 제공한다. 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 8㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시킨다.
최종적으로, PEG-EGF 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피에 의해 Q-세파로스 FF 상에서 정제한다. 1.5㎎ 단백질/㎖ 겔을 5mM CaCl2를 함유하는 50mM 헤페스 완충제, pH 7.4를 이용하여 미리 평형상태로 만든 칼럼 상에 장입한다. 컨쥬게이트를 5mM CaCl2 및 500mM 염화나트륨, pH 7.4를 함유하는 50mM 헤페스 완충제를 이용하여 용리시킨 다음, 막을 사용하여 UF/DF를 실시한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 3을 다음과 같이 수행한다. 아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 EGF를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. EGF를 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 150mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 용해시키고, 수성 과요오드산나트륨 용액(10mM), 및 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합한다. 후속적으로 아미노옥시 시약을 첨가하여 20배 몰 과량의 시약을 제공한다. 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 8㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시킨다.
최종적으로, PEG-EGF 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 용리액의 컨쥬게이트 함유 분획을 수집하고, 이어서, UF/DF를 실시한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 4:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 EGF를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. EGF의 초기 농도 또는 중량을 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 150mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 옮기거나 또는 용해시켜서 최종 단백질 농도 2㎎ EGF/㎖를 얻는다. 후속적으로 15분 내에 5mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 첨가하여 최종 농도 100μM을 제공한 후, 50mM 수성 m-톨루이딘 용액의 첨가로 30분의 시간 기간 내에 최종 농도 10mM을 얻는다. 이어서, MW가 20kD(상기 기재함)인 아미노옥시-PEG 시약을 첨가하여 20배 몰 과량의 시약을 제공한다. pH를 6.0으로 보정한 후, 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 1M 수성 L-시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켜 최종 농도 10mM을 제공한다.
PEG-EGF 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피(IEC)에 의해 정화하였다. 용리액의 컨쥬게이트 함유 분획을 재생 셀룰로스(88㎠, 컷-오프 10kD/밀리포어)로 만들어진 10kD 막을 사용하여 UF/DF에 의해 농축시킨다. 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 7.5)에 대해 최종 정용여과 단계를 수행한다.
전체 단백질(브래드퍼드 및 BCA 절차) 및 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 제제를 분석적으로 특성규명한다.
실시예 36
친핵성 촉매로서 아미노옥시-PEG 시약 및 m-톨루이딘을 사용하는 NGF의 페길화
방법 1:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 NGF를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. NGF를 7.0㎖ 히스티딘 완충제, pH 6.0(20mM L-히스티딘, 150mM NaCl, 5mM CaCl2) 중에 용해시킨다. 이어서, 수성 과요오드산나트륨 용액(5mM)을 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 암실에서 4℃에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 7.5㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켰다. 후속적으로 혼합물에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 바바스핀 원심분리 여과기를 사용하여 UF/DF를 실시한다.
산화된 NGF를 함유하는 잔류물을 다음에 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합하였고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 이어서, MW가 20kD인 아미노옥시-PEG 시약을 첨가하여 5배몰 과량을 제공한다. 이 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 암실에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시킨다.
최종적으로, PEG-NGF 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피(예를 들어, Q-세파로스 FF 상에서)에 의해 정제한다. 예를 들어, 1.5㎎ 단백질/㎖ 겔을 5mM CaCl2를 함유하는 50mM 헤페스 완충제, pH 7.4를 이용하여 평형상태로 만든 칼럼 상에 장입한다. 컨쥬게이트를 5mM CaCl2 및 500mM 염화나트륨, pH 7.4를 함유하는 50mM 헤페스 완충제를 이용하여 용리시킨 다음, 적절한 MW 컷오프 막을 사용하여 UF/DF를 실시한다. 다음에 제제를 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 1을 다음과 같이 수행한다. 아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 NGF를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. NGF를 7.0㎖ 히스티딘 완충제, pH 6.0(20mM L-히스티딘, 150mM NaCl, 5mM CaCl2) 중에 용해시킨다. 이어서, 수성 과요오드산나트륨 용액(5mM)을 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 암실에서 4℃에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 7.5㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켰다. 후속적으로 혼합물에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 바바스핀 원심분리 여과기를 사용하여 UF/DF를 실시한다.
산화된 NGF를 함유하는 잔류물을 다음에 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합하였고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 이어서, MW가 20kD인 아미노옥시-PEG 시약을 첨가하여 5배몰 과량을 제공한다. 이 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 암실에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시킨다.
최종적으로, PEG-NGF 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 용리액의 컨쥬게이트 함유 분획을 수집하고, 이어서, 적절한 MW 컷오프 막을 사용하여 UF/DF를 실시한다. 다음에 제제를 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 2:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 NGF를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. NGF를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 옮기거나 또는 용해시켜서 최종 단백질 농도 1.0 +/- 0.25㎎/㎖를 얻는다. 이어서, 용액의 pH를 0.5N 수성 HCl 용액의 적가에 의해 6.0까지 보정한다. 후속적으로, 40mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 10분 내에 첨가하여 농도 200μM을 제공한다. T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 30 +/- 5분 동안 산화반응을 수행한다. 이어서, T= +22 +/- 2℃에서 15분 내에 수성 L-시스테인 용액(1M)의 첨가에 의해 반응을 중단시켜 반응 혼합물에서 최종 농도 10mM을 제공하였고 60 +/- 5분 동안 인큐베이션시킨다.
산화된 NGF를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. 용리액의 산화된 NGF 함유 분획을 수집하고 컨쥬게이션 반응을 위해 사용한다.
MW 20kD의 아미노옥시-PEG 시약을 15분 부드러운 교반 하에 최대 시간 기간(t) 내에서 정제 산화된 NGF를 함유하는 용리액에 50배 몰 과량으로 첨가한다. 이어서, 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 15분 내에 첨가하여 최종 농도 10mM을 얻는다. 반응 혼합물을 암실에서 T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 120 +/- 10분 동안 부드러운 진탕 하에 인큐베이션시킨다.
얻어진 PEG-NGF 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. PEG-NGF 컨쥬게이트 함유 분획을 수집하고, 적절한 분자량 컷 오프(밀리포어)를 지니는 정제된 컨쥬게이트를 재생 셀룰로스로 만들어진 막을 사용하여 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 농축시킨다.
이 절차의 사용에 의해 제조한 컨쥬게이트를 전체 단백질 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 3:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 NGF를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. NGF를 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 150mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 용해시키고, 수성 과요오드산나트륨 용액(10mM), 및 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합한다. 후속적으로 아미노옥시 시약을 첨가하여 20배 몰 과량의 시약을 제공한다. 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 8㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시킨다.
최종적으로, PEG-NGF 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피(Q 세파로스 FF 상에서)에 의해 정제한다. 1.5㎎ 단백질/㎖ 겔을 5mM CaCl2를 함유하는 50mM 헤페스 완충제, pH 7.4를 이용하여 미리 평형상태로 만든 칼럼 상에 장입한다. 컨쥬게이트를 5mM CaCl2 및 500mM 염화나트륨, pH 7.4를 함유하는 50mM 헤페스 완충제를 이용하여 용리시킨 다음, 막을 사용하여 UF/DF를 실시한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 3을 다음과 같이 수행한다. 아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 NGF를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. NGF를 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 150mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 용해시키고, 수성 과요오드산나트륨 용액(10mM), 및 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합한다. 후속적으로 아미노옥시 시약을 첨가하여 20배 몰 과량의 시약을 제공한다. 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 8㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시킨다.
최종적으로, PEG-NGF 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 컨쥬게이트 함유 분획을 수집하고, 이어서, UF/DF를 실시한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 4:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 NGF를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. NGF의 초기 농도 또는 중량을 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 150mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 옮기거나 또는 용해시켜서 최종 단백질 농도 2㎎ NGF/㎖를 얻는다. 후속적으로 15분 내에 5mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 첨가하여 최종 농도 100μM을 제공한 후, 50mM 수성 m-톨루이딘 용액의 첨가로 30분의 시간 기간 내에 최종 농도 10mM을 얻는다. 이어서, MW가 20kD(상기 기재함)인 아미노옥시-PEG 시약을 첨가하여 20배 몰 과량의 시약을 제공한다. pH를 6.0으로 보정한 후, 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 1M 수성 L-시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켜 최종 농도 10mM을 제공한다.
PEG-NGF 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피(IEC)에 의해 정화하였다. 용리액의 컨쥬게이트 함유 분획을 재생 셀룰로스(88㎠, 컷-오프 10kD/밀리포어)로 만들어진 10kD 막을 사용하여 UF/DF에 의해 농축시킨다. 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 7.5)에 대해 최종 정용여과 단계를 수행한다.
전체 단백질(브래드퍼드 및 BCA 절차) 및 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 제제를 분석적으로 특성규명한다.
실시예 37
친핵성 촉매로서 아미노옥시-PEG 시약 및 m-톨루이딘을 사용하는 HGH의 페길화
방법 1:
본 명세서에 기재되는 바와 같이, 적어도 하나의 글라이코실화 부위를 도입하기 위해 인간 성장 호르몬(HGH)의 아미노산 서열을 우선 변형시킨다. 정제 후에, 당업계에 공지된 방법에 따라 시험관내에서 HGH를 글라이코실화한다.
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 HGH를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. HGH를 7.0㎖ 히스티딘 완충제, pH 6.0(20mM L-히스티딘, 150mM NaCl, 5mM CaCl2) 중에 용해시킨다. 이어서, 수성 과요오드산나트륨 용액(5mM)을 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 암실에서 4℃에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 7.5㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켰다. 후속적으로 혼합물에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 바바스핀 원심분리 여과기를 사용하여 UF/DF를 실시한다.
산화된 HGH를 함유하는 잔류물을 다음에 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합하였고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 이어서, MW가 20kD인 아미노옥시-PEG 시약을 첨가하여 5배몰 과량을 제공한다. 이 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 암실에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시킨다.
최종적으로, HGH 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피(예를 들어, Q 세파로스 FF 상에서)에 의해 정제한다. 예를 들어, 1.5㎎ 단백질/㎖ 겔을 5mM CaCl2를 함유하는 50mM 헤페스 완충제, pH 7.4를 이용하여 평형상태로 만든 칼럼 상에 장입한다. 컨쥬게이트를 5mM CaCl2 및 500mM 염화나트륨, pH 7.4를 함유하는 50mM 헤페스 완충제를 이용하여 용리시킨 다음, 적절한 MW 컷오프 막을 사용하여 UF/DF를 실시한다. 다음에 제제를 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 1을 다음과 같이 수행한다. 본 명세서에 기재되는 바와 같이, 적어도 하나의 글라이코실화 부위를 도입하기 위해 인간 성장 호르몬(HGH)의 아미노산 서열을 우선 변형시킨다. 정제 후에, 당업계에 공지된 방법에 따라 시험관내에서 HGH를 글라이코실화한다.
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 HGH를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. HGH를 7.0㎖ 히스티딘 완충제, pH 6.0(20mM L-히스티딘, 150mM NaCl, 5mM CaCl2) 중에 용해시킨다. 이어서, 수성 과요오드산나트륨 용액(5mM)을 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 암실에서 4℃에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 7.5㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켰다. 후속적으로 혼합물에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 바바스핀 원심분리 여과기를 사용하여 UF/DF를 실시한다.
산화된 HGH를 함유하는 잔류물을 다음에 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합하였고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 이어서, MW가 20kD인 아미노옥시-PEG 시약을 첨가하여 5배몰 과량을 제공한다. 이 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 암실에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시킨다.
최종적으로, PEG-HGH 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 용리액의 컨쥬게이트 함유 분획을 수집하고, 이어서, 적절한 MW 막을 사용하여 UF/DF를 실시한다. 다음에 제제를 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 2:
본 명세서에 기재되는 바와 같이, 적어도 하나의 글라이코실화 부위를 도입하기 위해 인간 성장 호르몬(HGH)의 아미노산 서열을 우선 변형시킨다. 정제 후에, 당업계에 공지된 방법에 따라 시험관내에서 HGH를 글라이코실화한다.
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 HGH를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. HGH를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 옮기거나 또는 용해시켜서 최종 단백질 농도 1.0 +/- 0.25㎎/㎖를 얻는다. 이어서, 용액의 pH를 0.5N 수성 HCl 용액의 적가에 의해 6.0까지 보정한다. 후속적으로, 40mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 10분 내에 첨가하여 농도 200μM을 제공한다. T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 30 +/- 5분 동안 산화반응을 수행한다. 이어서, T= +22 +/- 2℃에서 15분 내에 수성 L-시스테인 용액(1M)의 첨가에 의해 반응을 중단시켜 반응 혼합물에서 최종 농도 10mM을 제공하였고 60 +/- 5분 동안 인큐베이션시킨다.
산화된 HGH를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. 용리액의 산화된 HGH 함유 분획을 수집하고 컨쥬게이션 반응을 위해 사용한다.
MW 20kD의 아미노옥시-PEG 시약을 15분 부드러운 교반 하에 최대 시간 기간(t) 내에서 정제 산화된 HGH를 함유하는 용리액에 50배 몰 과량으로 첨가한다. 이어서, 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 15분 내에 첨가하여 최종 농도 10mM을 얻는다. 반응 혼합물을 암실에서 T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 120 +/- 10분 동안 부드러운 진탕 하에 인큐베이션시킨다.
얻어진 PEG-HGH 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. PEG-NGF 컨쥬게이트 함유 분획을 수집하고, 적절한 분자량 컷 오프(밀리포어)를 지니는 정제된 컨쥬게이트를 재생 셀룰로스로 만들어진 막을 사용하여 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 농축시킨다.
이 절차의 사용에 의해 제조한 컨쥬게이트를 전체 단백질 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 3:
본 명세서에 기재되는 바와 같이, 적어도 하나의 글라이코실화 부위를 도입하기 위해 인간 성장 호르몬(HGH)의 아미노산 서열을 우선 변형시킨다. 정제 후에, 당업계에 공지된 방법에 따라 시험관내에서 HGH를 글라이코실화한다.
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 HGH를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. HGH를 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 150mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 용해시키고, 수성 과요오드산나트륨 용액(10mM), 및 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합한다. 후속적으로 아미노옥시 시약을 첨가하여 20배 몰 과량의 시약을 제공한다. 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 8㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시킨다.
최종적으로, PEG-HGH 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피에 의해 Q-세파로스 FF 상에서 정제한다. 1.5㎎ 단백질/㎖ 겔을 5mM CaCl2를 함유하는 50mM 헤페스 완충제, pH 7.4를 이용하여 미리 평형상태로 만든 칼럼 상에 장입한다. 컨쥬게이트를 5mM CaCl2 및 500mM 염화나트륨, pH 7.4를 함유하는 50mM 헤페스 완충제를 이용하여 용리시킨 다음, 막을 사용하여 UF/DF를 실시한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 3을 다음과 같이 수행한다. 본 명세서에 기재되는 바와 같이, 적어도 하나의 글라이코실화 부위를 도입하기 위해 인간 성장 호르몬(HGH)의 아미노산 서열을 우선 변형시킨다. 정제 후에, 당업계에 공지된 방법에 따라 시험관내에서 HGH를 글라이코실화한다. 아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 HGH를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. HGH를 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 150mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 용해시키고, 수성 과요오드산나트륨 용액(10mM), 및 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합한다. 후속적으로 아미노옥시 시약을 첨가하여 20배 몰 과량의 시약을 제공한다. 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 8㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시킨다.
최종적으로, PEG-HGH 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 컨쥬게이트 함유 분획을 수집하고, 이어서, UF/DF를 실시한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 4:
본 명세서에 기재되는 바와 같이, 적어도 하나의 글라이코실화 부위를 도입하기 위해 인간 성장 호르몬(HGH)의 아미노산 서열을 우선 변형시킨다. 정제 후에, 당업계에 공지된 방법에 따라 시험관내에서 HGH를 글라이코실화한다.
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 HGH를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. HGH의 초기 농도 또는 중량을 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 150mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 옮기거나 또는 용해시켜서 최종 단백질 농도 2㎎ HGH/㎖를 얻는다. 후속적으로 15분 내에 5mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 첨가하여 최종 농도 100μM을 제공한 후, 50mM 수성 m-톨루이딘 용액의 첨가로 30분의 시간 기간 내에 최종 농도 10mM을 얻는다. 이어서, MW가 20kD(상기 기재함)인 아미노옥시-PEG 시약을 첨가하여 20배 몰 과량의 시약을 제공한다. pH를 6.0으로 보정한 후, 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 1M 수성 L-시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켜 최종 농도 10mM을 제공한다.
PEG-HGH 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피(IEC)에 의해 정화하였다. 용리액의 컨쥬게이트 함유 분획을 재생 셀룰로스(88㎠, 컷-오프 10kD/밀리포어)로 만들어진 10kD 막을 사용하여 UF/DF에 의해 농축시킨다. 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 7.5)에 대해 최종 정용여과 단계를 수행한다.
전체 단백질(브래드퍼드 및 BCA 절차) 및 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 제제를 분석적으로 특성규명한다.
실시예 38
친핵성 촉매로서 아미노옥시-PEG 시약 및 m-톨루이딘을 사용하는 TNF-알파의 페길화
방법 1:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 TNF-알파를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. TNF-알파를 7.0㎖ 히스티딘 완충제, pH 6.0(20mM L-히스티딘, 150mM NaCl, 5mM CaCl2) 중에 용해시킨다. 이어서, 수성 과요오드산나트륨 용액(5mM)을 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 암실에서 4℃에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 7.5㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켰다. 후속적으로 혼합물에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 바바스핀 원심분리 여과기를 사용하여 UF/DF를 실시한다.
산화된 TNF-알파를 함유하는 잔류물을 다음에 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합하였고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 이어서, MW가 20kD인 아미노옥시-PEG 시약을 첨가하여 5배몰 과량을 제공한다. 이 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 암실에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시킨다.
최종적으로, PEG-TNF-알파 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피(예를 들어, Q-세파로스 FF 상에서)에 의해 정제한다. 예를 들어, 1.5㎎ 단백질/㎖ 겔을 5mM CaCl2를 함유하는 50mM 헤페스 완충제, pH 7.4를 이용하여 평형상태로 만든 칼럼 상에 장입한다. 컨쥬게이트를 5mM CaCl2 및 500mM 염화나트륨, pH 7.4를 함유하는 50mM 헤페스 완충제를 이용하여 용리시킨 다음, 적절한 MW 컷오프 막을 사용하여 UF/DF를 실시한다. 다음에 제제를 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 1을 다음과 같이 수행한다. 아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 TNF-알파를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. TNF-알파를 7.0㎖ 히스티딘 완충제, pH 6.0(20mM L-히스티딘, 150mM NaCl, 5mM CaCl2) 중에 용해시킨다. 이어서, 수성 과요오드산나트륨 용액(5mM)을 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 암실에서 4℃에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 7.5㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켰다. 후속적으로 혼합물에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 바바스핀 원심분리 여과기를 사용하여 UF/DF를 실시한다.
산화된 TNF-알파를 함유하는 잔류물을 다음에 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합하였고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 이어서, MW가 20kD인 아미노옥시-PEG 시약을 첨가하여 5배몰 과량을 제공한다. 이 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 암실에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시킨다.
최종적으로, PEG-TNF-알파 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 용리액의 컨쥬게이트 함유 분획을 수집하고, 이어서, 적절한 MW 컷오프 막을 사용하여 UF/DF를 실시한다. 다음에 제제를 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 2:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 TNF-알파를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. TNF-알파를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 옮기거나 또는 용해시켜서 최종 단백질 농도 1.0 +/- 0.25㎎/㎖를 얻는다. 이어서, 용액의 pH를 0.5N 수성 HCl 용액의 적가에 의해 6.0까지 보정한다. 후속적으로, 40mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 10분 내에 첨가하여 농도 200μM을 제공한다. T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 30 +/- 5분 동안 산화반응을 수행한다. 이어서, T= +22 +/- 2℃에서 15분 내에 수성 L-시스테인 용액(1M)의 첨가에 의해 반응을 중단시켜 반응 혼합물에서 최종 농도 10mM을 제공하였고 60 +/- 5분 동안 인큐베이션시킨다.
산화된 TNF-알파를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. 용리액의 산화된 TNF-알파 함유 분획을 수집하고 컨쥬게이션 반응을 위해 사용한다.
MW 20kD의 아미노옥시-PEG 시약을 15분 부드러운 교반 하에 최대 시간 기간(t) 내에서 정제 산화된 TNF 알파를 함유하는 용리액에 50배 몰 과량으로 첨가한다. 이어서, 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 15분 내에 첨가하여 최종 농도 10mM을 얻는다. 반응 혼합물을 암실에서 T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 120 +/- 10분 동안 부드러운 진탕 하에 인큐베이션시킨다.
얻어진 PEG- TNF-알파 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. PEG- TNF-알파 컨쥬게이트 함유 분획을 수집하고, 적절한 분자량 컷 오프(밀리포어)를 지니는 정제된 컨쥬게이트를 재생 셀룰로스로 만들어진 막을 사용하여 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 농축시킨다.
이 절차의 사용에 의해 제조한 컨쥬게이트를 전체 단백질 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 3:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 TNF-알파를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. TNF-알파를 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 150mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 용해시키고, 수성 과요오드산나트륨 용액(10mM), 및 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합한다. 후속적으로 아미노옥시 시약을 첨가하여 20배 몰 과량의 시약을 제공한다. 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 8㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시킨다.
최종적으로, PEG-TNF-알파 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피에 의해 Q-세파로스 FF 상에서 정제한다. 1.5㎎ 단백질/㎖ 겔을 5mM CaCl2를 함유하는 50mM 헤페스 완충제, pH 7.4를 이용하여 미리 평형상태로 만든 칼럼 상에 장입한다. 컨쥬게이트를 5mM CaCl2 및 500mM 염화나트륨, pH 7.4를 함유하는 50mM 헤페스 완충제를 이용하여 용리시킨 다음, 막을 사용하여 UF/DF를 실시한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 3을 다음과 같이 수행한다. 아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 TNF-알파를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. TNF-알파를 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 150mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 용해시키고, 수성 과요오드산나트륨 용액(10mM), 및 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합한다. 후속적으로 아미노옥시 시약을 첨가하여 20배 몰 과량의 시약을 제공한다. 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 8㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시킨다.
최종적으로, PEG-TNF-알파 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 컨쥬게이트 함유 분획을 수집하고, 이어서, UF/DF를 실시한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 4:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 TNF-알파를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. TNF-알파의 초기 농도 또는 중량을 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 150mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 옮기거나 또는 용해시켜서 최종 단백질 농도 2㎎ TNF-알파/㎖를 얻는다. 후속적으로 15분 내에 5mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 첨가하여 최종 농도 100μM을 제공한 후, 50mM 수성 m-톨루이딘 용액의 첨가로 30분의 시간 기간 내에 최종 농도 10mM을 얻는다. 이어서, MW가 20kD(상기 기재함)인 아미노옥시-PEG 시약을 첨가하여 20배 몰 과량의 시약을 제공한다. pH를 6.0으로 보정한 후, 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 1M 수성 L-시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켜 최종 농도 10mM을 제공한다.
TNF-알파 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피(IEC)에 의해 정화하였다. 용리액의 컨쥬게이트 함유 분획을 재생 셀룰로스(88㎠, 컷-오프 10kD/밀리포어)로 만들어진 10kD 막을 사용하여 UF/DF에 의해 농축시킨다. 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 7.5)에 대해 최종 정용여과 단계를 수행한다.
전체 단백질(브래드퍼드 및 BCA 절차) 및 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 제제를 분석적으로 특성규명한다.
실시예 39
친핵성 촉매로서 아미노옥시-PEG 시약 및 m-톨루이딘을 사용하는 인슐린의 페길화
방법 1:
본 명세서에 기재되는 바와 같이, 적어도 하나의 글라이코실화 부위를 도입하기 위해 인슐린의 아미노산 서열을 우선 변형시킨다. 정제 후에, 당업계에 공지된 방법에 따라 시험관내에서 인슐린을 글라이코실화한다. 아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 인슐린을 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. 인슐린을 7.0㎖ 히스티딘 완충제, pH 6.0(20mM L-히스티딘, 150mM NaCl, 5mM CaCl2) 중에 용해시킨다. 이어서, 수성 과요오드산나트륨 용액(5mM)을 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 암실에서 4℃에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 7.5㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켰다. 후속적으로 혼합물에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 바바스핀 원심분리 여과기를 사용하여 UF/DF를 실시한다.
산화된 인슐린을 함유하는 잔류물을 다음에 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합하였고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 이어서, MW가 20kD인 아미노옥시-PEG 시약을 첨가하여 5배몰 과량을 제공한다. 이 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 암실에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시킨다.
최종적으로, PEG-인슐린 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피(예를 들어, Q-세파로스 FF 상에서)에 의해 정제한다. 예를 들어, 1.5㎎ 단백질/㎖ 겔을 5mM CaCl2를 함유하는 50mM 헤페스 완충제, pH 7.4를 이용하여 평형상태로 만든 칼럼 상에 장입한다. 컨쥬게이트를 5mM CaCl2 및 500mM 염화나트륨, pH 7.4를 함유하는 50mM 헤페스 완충제를 이용하여 용리시킨 다음, 적절한 MW 컷오프 막을 사용하여 UF/DF를 실시한다. 다음에 제제를 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 1을 다음과 같이 수행한다. 본 명세서에 기재되는 바와 같이, 적어도 하나의 글라이코실화 부위를 도입하기 위해 인슐린의 아미노산 서열을 우선 변형시킨다. 정제 후에, 당업계에 공지된 방법에 따라 시험관내에서 인슐린을 글라이코실화한다. 아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 인슐린을 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. 인슐린을 7.0㎖ 히스티딘 완충제, pH 6.0(20mM L-히스티딘, 150mM NaCl, 5mM CaCl2) 중에 용해시킨다. 이어서, 수성 과요오드산나트륨 용액(5mM)을 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 암실에서 4℃에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 7.5㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켰다. 후속적으로 혼합물에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 바바스핀 원심분리 여과기를 사용하여 UF/DF를 실시한다.
산화된 인슐린을 함유하는 잔류물을 다음에 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합하였고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 이어서, MW가 20kD인 아미노옥시-PEG 시약을 첨가하여 5배몰 과량을 제공한다. 이 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 암실에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시킨다.
최종적으로, PEG-인슐린 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 용리액의 컨쥬게이트 함유 분획을 수집하고, 이어서, 적절한 MW 컷오프 막을 사용하여 UF/DF를 실시한다. 다음에 제제를 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 2:
본 명세서에 기재되는 바와 같이, 적어도 하나의 글라이코실화 부위를 도입하기 위해 인슐린의 아미노산 서열을 우선 변형시킨다. 정제 후에, 당업계에 공지된 방법에 따라 시험관내에서 인슐린을 글라이코실화한다.
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 인슐린을 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. 인슐린을 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 옮기거나 또는 용해시켜서 최종 단백질 농도 1.0 +/- 0.25㎎/㎖를 얻는다. 이어서, 용액의 pH를 0.5 N 수성 HCl 용액의 적가에 의해 6.0까지 보정한다. 후속적으로, 40mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 10분 내에 첨가하여 농도 200μM을 제공한다. T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 30 +/- 5분 동안 산화반응을 수행한다. 이어서, T= +22 +/- 2℃에서 15분 내에 수성 L-시스테인 용액(1M)의 첨가에 의해 반응을 중단시켜 반응 혼합물에서 최종 농도 10mM을 제공하였고 60 +/- 5분 동안 인큐베이션시킨다.
산화된 인슐린을 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. 용리액의 산화된 인슐린 함유 분획을 수집하고 컨쥬게이션 반응을 위해 사용한다.
MW 20kD의 아미노옥시-PEG 시약을 15분 부드러운 교반 하에 최대 시간 기간(t) 내에서 정제 산화된 인슐린을 함유하는 용리액에 50배 몰 과량으로 첨가한다. 이어서, 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 15분 내에 첨가하여 최종 농도 10mM을 얻는다. 반응 혼합물을 암실에서 T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 120 +/- 10분 동안 부드러운 진탕 하에 인큐베이션시킨다.
얻어진 PEG-인슐린 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. PEG-인슐린 컨쥬게이트 함유 분획을 수집하고, 적절한 분자량 컷 오프(밀리포어)를 지니는 정제된 컨쥬게이트를 재생 셀룰로스로 만들어진 막을 사용하여 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 농축시킨다.
이 절차의 사용에 의해 제조한 컨쥬게이트를 전체 단백질 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 3:
본 명세서에 기재되는 바와 같이, 적어도 하나의 글라이코실화 부위를 도입하기 위해 인슐린의 아미노산 서열을 우선 변형시킨다. 정제 후에, 당업계에 공지된 방법에 따라 시험관내에서 인슐린을 글라이코실화한다.
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 인슐린을 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. 인슐린을 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 150mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 용해시키고, 수성 과요오드산나트륨 용액(10mM), 및 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합한다. 후속적으로 아미노옥시 시약을 첨가하여 20배 몰 과량의 시약을 제공한다. 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 8㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시킨다.
최종적으로, PEG-인슐린 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피(Q 세파로스 FF 상에서)에 의해 정제한다. 1.5㎎ 단백질/㎖ 겔을 5mM CaCl2를 함유하는 50mM 헤페스 완충제, pH 7.4를 이용하여 미리 평형상태로 만든 칼럼 상에 장입한다. 컨쥬게이트를 5mM CaCl2 및 500mM 염화나트륨, pH 7.4를 함유하는 50mM 헤페스 완충제를 이용하여 용리시킨 다음, 막을 사용하여 UF/DF를 실시한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 3을 다음과 같이 수행한다. 본 명세서에 기재되는 바와 같이, 적어도 하나의 글라이코실화 부위를 도입하기 위해 인슐린의 아미노산 서열을 우선 변형시킨다. 정제 후에, 당업계에 공지된 방법에 따라 시험관내에서 인슐린을 글라이코실화한다. 아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 인슐린을 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. 인슐린을 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 150mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 용해시키고, 수성 과요오드산나트륨 용액(10mM), 및 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합한다. 후속적으로 아미노옥시 시약을 첨가하여 20배 몰 과량의 시약을 제공한다. 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 8㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시킨다.
최종적으로, 인슐린-컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 컨쥬게이트 함유 분획을 수집하고, 이어서, UF/DF를 실시한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 4:
본 명세서에 기재되는 바와 같이, 적어도 하나의 글라이코실화 부위를 도입하기 위해 인슐린의 아미노산 서열을 우선 변형시킨다. 정제 후에, 당업계에 공지된 방법에 따라 시험관내에서 인슐린을 글라이코실화한다.
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 인슐린을 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. 인슐린의 초기 농도 또는 중량을 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 150mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 옮기거나 또는 용해시켜서 최종 단백질 농도 2㎎ 인슐린/㎖를 얻는다. 후속적으로 15분 내에 5mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 첨가하여 최종 농도 100μM을 제공한 후, 50mM 수성 m-톨루이딘 용액의 첨가로 30분의 시간 기간 내에 최종 농도 10mM을 얻는다. 이어서, MW가 20kD(상기 기재함)인 아미노옥시-PEG 시약을 첨가하여 20배 몰 과량의 시약을 제공한다. pH를 6.0으로 보정한 후, 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 1M 수성 L-시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켜 최종 농도 10mM을 제공한다.
PEG-인슐린 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피(IEC)에 의해 정화하였다. 용리액의 컨쥬게이트 함유 분획을 재생 셀룰로스(88㎠, 컷-오프 10kD/밀리포어)로 만들어진 10kD 막을 사용하여 UF/DF에 의해 농축시킨다. 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 7.5)에 대해 최종 정용여과 단계를 수행한다.
전체 단백질(브래드퍼드 및 BCA 절차) 및 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 제제를 분석적으로 특성규명한다.
실시예 40
친핵성 촉매로서 아미노옥시-PEG 시약 및 m-톨루이딘을 사용하는 인터페론-알파의 페길화
방법 1:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 인터페론-알파를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. 인터페론-알파를 7.0㎖ 히스티딘 완충제, pH 6.0(20mM L-히스티딘, 150mM NaCl, 5mM CaCl2) 중에 용해시킨다. 이어서, 수성 과요오드산나트륨 용액(5mM)을 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 암실에서 4℃에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 7.5㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켰다. 후속적으로 혼합물에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 바바스핀 원심분리 여과기를 사용하여 UF/DF를 실시한다.
산화된 인터페론-알파를 함유하는 잔류물을 다음에 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합하였고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 이어서, MW가 20kD인 아미노옥시-PEG 시약을 첨가하여 5배몰 과량을 제공한다. 이 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 암실에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시킨다.
최종적으로, PEG-인터페론-알파 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피(예를 들어, Q-세파로스 FF 상에서)에 의해 정제한다. 예를 들어, 1.5㎎ 단백질/㎖ 겔을 5mM CaCl2를 함유하는 50mM 헤페스 완충제, pH 7.4를 이용하여 평형상태로 만든 칼럼 상에 장입한다. 컨쥬게이트를 5mM CaCl2 및 500mM 염화나트륨, pH 7.4를 함유하는 50mM 헤페스 완충제를 이용하여 용리시킨 다음, 적절한 MW 컷오프 막을 사용하여 UF/DF를 실시한다. 다음에 제제를 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 1을 다음과 같이 수행한다. 아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 인터페론-알파를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. 인터페론-알파를 7.0㎖ 히스티딘 완충제, pH 6.0(20mM L-히스티딘, 150mM NaCl, 5mM CaCl2) 중에 용해시킨다. 이어서, 수성 과요오드산나트륨 용액(5mM)을 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 암실에서 4℃에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 7.5㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켰다. 후속적으로 혼합물에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 바바스핀 원심분리 여과기를 사용하여 UF/DF를 실시한다.
산화된 인터페론-알파를 함유하는 잔류물을 다음에 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합하였고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 이어서, MW가 20kD인 아미노옥시-PEG 시약을 첨가하여 5배몰 과량을 제공한다. 이 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 암실에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시킨다.
최종적으로, PEG-인터페론-알파 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 컨쥬게이트 함유 분획을 수집하고, 이어서, 적절한 MW 컷오프 막을 사용하여 UF/DF를 실시한다. 다음에 제제를 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 2:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 인터페론-알파를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. 인터페론-알파를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 옮기거나 또는 용해시켜서 최종 단백질 농도 1.0 +/- 0.25㎎/㎖를 얻는다. 이어서, 용액의 pH를 0.5 N 수성 HCl 용액의 적가에 의해 6.0까지 보정한다. 후속적으로, 40mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 10분 내에 첨가하여 농도 200μM을 제공한다. T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 30 +/- 5분 동안 산화반응을 수행한다. 이어서, T= +22 +/- 2℃에서 15분 내에 수성 L-시스테인 용액(1M)의 첨가에 의해 반응을 중단시켜 반응 혼합물에서 최종 농도 10mM을 제공하였고 60 +/- 5분 동안 인큐베이션시킨다.
산화된 인터페론-알파를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. 용리액의 산화된 인터페론-알파 함유 분획을 수집하고 컨쥬게이션 반응을 위해 사용한다.
MW 20kD의 아미노옥시-PEG 시약을 15분 부드러운 교반 하에 최대 시간 기간(t) 내에서 정제 산화된 인터페론-알파를 함유하는 용리액에 50배 몰 과량으로 첨가한다. 이어서, 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 15분 내에 첨가하여 최종 농도 10mM을 얻는다. 반응 혼합물을 암실에서 T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 120 +/- 10분 동안 부드러운 진탕 하에 인큐베이션시킨다.
얻어진 PEG-인터페론-알파 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. PEG- 인터페론 알파 컨쥬게이트 함유 분획을 수집하고, 적절한 분자량 컷 오프(밀리포어)를 지니는 정제된 컨쥬게이트를 재생 셀룰로스로 만들어진 막을 사용하여 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 농축시킨다.
이 절차의 사용에 의해 제조한 컨쥬게이트를 전체 단백질 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 3:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 인터페론-알파를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. 인터페론-알파를 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 150mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 용해시키고, 수성 과요오드산나트륨 용액(10mM), 및 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합한다. 후속적으로 아미노옥시 시약을 첨가하여 20배 몰 과량의 시약을 제공한다. 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 8㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시킨다.
최종적으로, PEG-인터페론-알파 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피에 의해 Q-세파로스 FF 상에서 정제한다. 1.5㎎ 단백질/㎖ 겔을 5mM CaCl2를 함유하는 50mM 헤페스 완충제, pH 7.4를 이용하여 미리 평형상태로 만든 칼럼 상에 장입한다. 컨쥬게이트를 5mM CaCl2 및 500mM 염화나트륨, pH 7.4를 함유하는 50mM 헤페스 완충제를 이용하여 용리시킨 다음, 막을 사용하여 UF/DF를 실시한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 3을 다음과 같이 수행한다. 아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 인터페론-알파를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. 인터페론-알파를 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 150mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 용해시키고, 수성 과요오드산나트륨 용액(10mM), 및 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합한다. 후속적으로 아미노옥시 시약을 첨가하여 20배 몰 과량의 시약을 제공한다. 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 8㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시킨다.
최종적으로, PEG-인터페론-알파 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 컨쥬게이트 함유 분획을 수집하고, 이어서, 막을 사용하여 UF/DF를 실시한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 4:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 인터페론-알파를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. 인터페론-알파의 초기 농도 또는 중량을 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 150mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 옮기거나 또는 용해시켜서 최종 단백질 농도 2㎎ 인터페론-알파/㎖를 얻는다. 후속적으로 15분 내에 5mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 첨가하여 최종 농도 100μM을 제공한 후, 50mM 수성 m-톨루이딘 용액의 첨가로 30분의 시간 기간 내에 최종 농도 10mM을 얻는다. 이어서, MW가 20kD(상기 기재함)인 아미노옥시-PEG 시약을 첨가하여 20배 몰 과량의 시약을 제공한다. pH를 6.0으로 보정한 후, 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 1M 수성 L-시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켜 최종 농도 10mM을 제공한다.
PEG-인터페론-알파 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피(IEC)에 의해 정화하였다. 용리액의 컨쥬게이트 함유 분획을 재생 셀룰로스(88㎠, 컷-오프 10kD/밀리포어)로 만들어진 10kD 막을 사용하여 UF/DF에 의해 농축시킨다. 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 7.5)에 대해 최종 정용여과 단계를 수행한다.
전체 단백질(브래드퍼드 및 BCA 절차) 및 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 제제를 분석적으로 특성규명한다.
실시예 41
친핵성 촉매로서 아미노옥시-PEG 시약 및 m-톨루이딘을 사용하는 인터페론-감마의 페길화
방법 1:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 인터페론-감마를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. 10㎎ 인터페론-감마를 5㎖ 히스티딘 완충제, pH 6.0(20mM L-히스티딘, 150mM NaCl) 중에 용해시킨다. 이어서, 100㎕의 수성 과요오드산나트륨 용액(5mM)을 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 암실에서 4℃에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 50㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켰다. 후속적으로 혼합물에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 바바스핀 15R 10kD 원심분리 여과기를 사용하여 UF/DF를 실시한다.
산화된 인터페론-감마를 함유하는 잔류물(대략 7㎖)을 2㎖의 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합하였고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 이어서, MW가 20kD(상기 기재함)인 아미노옥시-PEG 시약을 첨가하여 5배몰 과량을 제공한다. 이 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 암실에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시킨다.
최종적으로, PEG-인터페론-감마 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피에 의해 SP 세파로스 FF 상에서 정제한다. 반응 혼합물을 20㎖ 완충제 A(50mM 헤페스, pH 6.5)로 희석시키고, 완충제 A를 이용하여 사전에 평행상태로 만든 20㎖ HiPrep SPFF 16/10 칼럼(코네티컷주 페어필드에 소재한 GE 헬스케어(GE Healthcare)) 상에 장입한다. 이어서, 칼럼을 완충제 B(50mM 헤페스, 1M NaCl, pH 6.5)로 용리시킨다. 25% 완충제 B 및 50% 완충제 B에서의 컨쥬게이트를 이용하여 칼럼을 세척함으로써 유리 인터페론-감마를 용리시킨다. 컨쥬게이트 함유 분획을 재생 셀룰로스(88㎠, 컷-오프 10kD/밀리포어)로 만들어진 10kD 막을 사용하여 UF/DF에 의해 농축시킨다. 150mM NaCl를 함유하는 히스티딘 완충제(Ph 6.9)에 대해 최종 정용여과 단계를 수행한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다. PEG 인터페론-감마 컨쥬게이트에 대해 천연 인터페론 감마에 비해 50% 미만의 특이적 활성을 결정한다. 앞서 기재한 조건 하에서 쇼덱스(Shodex) KW 803 칼럼을 구비한 애질런트 1200 HPLC 시스템을 사용하여 크기 배제 HPLC에 의해 컨쥬게이트를 추가적으로 분석적으로 특성규명한다(Kolarich et al, Transfusion 2006;46:1959-77). 이는 제제가 유리 인터페론-감마를 함유하지 않는다는 것을 나타낸다.
방법 2:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 인터페론-감마를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. 인터페론-감마를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 옮기거나 또는 용해시켜서 최종 단백질 농도 1.0 +/- 0.25㎎/㎖를 얻는다. 이어서, 용액의 pH를 0.5 N 수성 HCl 용액의 적가에 의해 6.0까지 보정한다. 후속적으로, 40mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 10분 내에 첨가하여 농도 200μM을 제공한다. T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 30 +/- 5분 동안 산화반응을 수행한다. 이어서, T= +22 +/- 2℃에서 15분 내에 수성 L-시스테인 용액(1M)의 첨가에 의해 반응을 중단시켜 반응 혼합물에서 최종 농도 10mM을 제공하였고 60 +/- 5분 동안 인큐베이션시킨다.
산화된 인터페론-감마를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. 용리액의 산화된 인터페론-감마 함유 분획을 수집하고 컨쥬게이션 반응을 위해 사용한다.
MW 20kD의 아미노옥시-PEG 시약을 15분 부드러운 교반 하에 최대 시간 기간(t) 내에서 정제 산화된 인터페론-감마를 함유하는 용리액에 50배 몰 과량으로 첨가한다. 이어서, 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 15분 내에 첨가하여 최종 농도 10mM을 얻는다. 반응 혼합물을 암실에서 T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 120 +/- 10분 동안 부드러운 진탕 하에 인큐베이션시킨다.
얻어진 PEG-인터페론-감마 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. PEG-인터페론-감마 컨쥬게이트 함유 분획을 수집하고, 적절한 분자량 컷 오프(밀리포어)를 지니는 정제된 컨쥬게이트를 재생 셀룰로스로 만들어진 막을 사용하여 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 농축시킨다.
이 절차의 사용에 의해 제조한 컨쥬게이트를 전체 단백질 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 3:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 인터페론-감마를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. 10㎎ 인터페론-감마를 ~8㎖ 히스티딘 완충제, pH 6.0(20mM L-히스티딘, 150mM NaCl) 중에 용해시킨다. 200㎕의 수성 과요오드산나트륨 용액(5mM) 및 2㎖의 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 첨가한다. 후속적으로, MW가 20kD(상기 기재함)인 아미노옥시-PEG 시약을 첨가하여 5배몰 과량을 제공한다. 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 100㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시킨다.
최종적으로, PEG-인터페론-감마 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피에 의해 SP-세파로스 FF 상에서 정제한다. 반응 혼합물을 20㎖ 완충제 A(50mM 헤페스, pH 6.5)로 희석시키고, 완충제 A를 이용하여 사전에 평행상태로 만든 20㎖ HiPrep SP FF 16/10 칼럼(코네티컷주 페어필드에 소재한 GE 헬스케어(GE Healthcare)) 상에 장입한다. 이어서, 칼럼을 완충제 B(50mM 헤페스, 1M NaCl, pH 6.5)로 용리시킨다. 25% 완충제 B 및 50% 완충제 B에서의 컨쥬게이트를 이용하여 칼럼을 세척함으로써 유리 인터페론-감마를 용리시킨다. 컨쥬게이트 함유 분획을 재생 셀룰로스(88㎠, 컷-오프 10kD/밀리포어)로 만들어진 10kD 막을 사용하여 UF/DF에 의해 농축시킨다. 150mM NaCl를 함유하는 히스티딘 완충제(Ph 6.9)에 대해 최종 정용여과 단계를 수행한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다. PEG 인터페론-감마 컨쥬게이트에 대해 천연 인터페론-감마에 비해 50% 미만의 특이적 활성을 결정한다. 앞서 기재한 조건 하에서 쇼덱스(Shodex) KW 803 칼럼을 구비한 애질런트 1200 HPLC 시스템을 사용하여 크기 배제 HPLC에 의해 컨쥬게이트를 추가적으로 분석적으로 특성규명한다(Kolarich et al, Transfusion 2006;46:1959-77). 이는 제제가 유리 인터페론-감마를 함유하지 않는다는 것을 나타낸다.
방법 4:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 인터페론-감마를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. 인터페론-감마의 초기 농도 또는 중량을 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 150mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 옮기거나 또는 용해시켜서 최종 단백질 농도 2㎎ 인터페론-감마/㎖를 얻는다. 후속적으로 15분 내에 5mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 첨가하여 최종 농도 100μM을 제공한 후, 50mM 수성 m-톨루이딘 용액의 첨가로 30분의 시간 기간 내에 최종 농도 10mM을 얻는다. 이어서, MW가 20kD(상기 기재함)인 아미노옥시-PEG 시약을 첨가하여 20배 몰 과량의 시약을 제공한다. pH를 6.0으로 보정한 후, 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 1M 수성 L-시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켜 최종 농도 10mM을 제공한다.
PEG-인터페론-감마 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피(IEC)에 의해 정화하였다. 용리액의 컨쥬게이트 함유 분획을 재생 셀룰로스(88㎠, 컷-오프 10kD/밀리포어)로 만들어진 10kD 막을 사용하여 UF/DF에 의해 농축시킨다. 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 7.5)에 대해 최종 정용여과 단계를 수행한다.
전체 단백질(브래드퍼드 및 BCA 절차) 및 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 제제를 분석적으로 특성규명한다.
실시예 42
친핵성 촉매로서 아미노옥시-PEG 시약 및 m-톨루이딘을 사용하는 G-CSF의 페길화
방법 1:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 G-CSF를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. G-CSF를 7.0㎖ 히스티딘 완충제, pH 6.0(20mM L-히스티딘, 150mM NaCl, 5mM CaCl2) 중에 용해시킨다. 이어서, 수성 과요오드산나트륨 용액(5mM)을 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 암실에서 4℃에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 7.5㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켰다. 후속적으로 혼합물에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 바바스핀 원심분리 여과기를 사용하여 UF/DF를 실시한다.
산화된 G-CSF를 함유하는 잔류물을 다음에 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합하였고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 이어서, MW가 20kD인 아미노옥시-PEG 시약을 첨가하여 5배몰 과량을 제공한다. 이 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 암실에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시킨다.
최종적으로, PEG-G-CSF 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피(예를 들어, Q-세파로스 FF 상에서)에 의해 정제한다. 예를 들어, 1.5㎎ 단백질/㎖ 겔을 5mM CaCl2를 함유하는 50mM 헤페스 완충제, pH 7.4를 이용하여 평형상태로 만든 칼럼 상에 장입한다. 컨쥬게이트를 5mM CaCl2 및 500mM 염화나트륨, pH 7.4를 함유하는 50mM 헤페스 완충제를 이용하여 용리시킨 다음, 적절한 MW 컷오프 막을 사용하여 UF/DF를 실시한다. 다음에 제제를 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 1을 다음과 같이 수행한다. 아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 G-CSF를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. G-CSF를 7.0㎖ 히스티딘 완충제, pH 6.0(20mM L-히스티딘, 150mM NaCl, 5mM CaCl2) 중에 용해시킨다. 이어서, 수성 과요오드산나트륨 용액(5mM)을 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 암실에서 4℃에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 7.5㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켰다. 후속적으로 혼합물에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 바바스핀 원심분리 여과기를 사용하여 UF/DF를 실시한다.
산화된 G-CSF를 함유하는 잔류물을 다음에 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합하였고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 이어서, MW가 20kD인 아미노옥시-PEG 시약을 첨가하여 5배몰 과량을 제공한다. 이 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 암실에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시킨다.
최종적으로, PEG-G-CSF 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 용리액의 컨쥬게이트 함유 분획을 수집하고, 이어서, 적절한 MW 컷오프 막을 사용하여 UF/DF를 실시한다. 다음에 제제를 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 2:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 G-CSF를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. G-CSF를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 옮기거나 또는 용해시켜서 최종 단백질 농도 1.0 +/- 0.25㎎/㎖를 얻는다. 이어서, 용액의 pH를 0.5N 수성 HCl 용액의 적가에 의해 6.0까지 보정한다. 후속적으로, 40mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 10분 내에 첨가하여 농도 200μM을 제공한다. T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 30 +/- 5분 동안 산화반응을 수행한다. 이어서, T= +22 +/- 2℃에서 15분 내에 수성 L-시스테인 용액(1M)의 첨가에 의해 반응을 중단시켜 반응 혼합물에서 최종 농도 10mM을 제공하였고 60 +/- 5분 동안 인큐베이션시킨다.
산화된 G-CSF를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. 용리액의 산화된 G-CSF 함유 분획을 수집하고 컨쥬게이션 반응을 위해 사용한다.
MW 20kD의 아미노옥시-PEG 시약을 15분 부드러운 교반 하에 최대 시간 기간(t) 내에서 정제 산화된 G-CSF를 함유하는 용리액에 50배 몰 과량으로 첨가한다. 이어서, 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 15분 내에 첨가하여 최종 농도 10mM을 얻는다. 반응 혼합물을 암실에서 T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 120 +/- 10분 동안 부드러운 진탕 하에 인큐베이션시킨다.
얻어진 PEG-G-CSF 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. PEG-G-CSF 컨쥬게이트 함유 분획을 수집하고, 적절한 분자량 컷 오프(밀리포어)를 지니는 정제된 컨쥬게이트를 재생 셀룰로스로 만들어진 막을 사용하여 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 농축시킨다.
방법 3:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 G-CSF를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. G-CSF를 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 150mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 용해시키고, 수성 과요오드산나트륨 용액(10mM), 및 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합한다. 후속적으로 아미노옥시 시약을 첨가하여 20배 몰 과량의 시약을 제공한다. 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 8㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시킨다.
최종적으로, PEG-G-CSF 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피에 의해 Q-세파로스 FF 상에서 정제한다. 1.5㎎ 단백질/㎖ 겔을 5mM CaCl2를 함유하는 50mM 헤페스 완충제, pH 7.4를 이용하여 미리 평형상태로 만든 칼럼 상에 장입한다. 컨쥬게이트를 5mM CaCl2 및 500mM 염화나트륨, pH 7.4를 함유하는 50mM 헤페스 완충제를 이용하여 용리시킨 다음, 막을 사용하여 UF/DF를 실시한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 3을 다음과 같이 수행한다. 아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 G-CSF를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. G-CSF를 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 150mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 용해시키고, 수성 과요오드산나트륨 용액(10mM), 및 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합한다. 후속적으로 아미노옥시 시약을 첨가하여 20배 몰 과량의 시약을 제공한다. 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 8㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시킨다.
최종적으로, PEG-G-CSF 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 용리액의 컨쥬게이트 함유 분획을 수집하고, 이어서, 막을 사용하여 UF/DF를 실시한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 4:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 G-CSF를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. G-CSF의 초기 농도 또는 중량을 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 150mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 옮기거나 또는 용해시켜서 최종 단백질 농도 2㎎ G-CSF/㎖를 얻는다. 후속적으로 15분 내에 5mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 첨가하여 최종 농도 100μM을 제공한 후, 50mM 수성 m-톨루이딘 용액의 첨가로 30분의 시간 기간 내에 최종 농도 10mM을 얻는다. 이어서, MW가 20kD(상기 기재함)인 아미노옥시-PEG 시약을 첨가하여 20배 몰 과량의 시약을 제공한다. pH를 6.0으로 보정한 후, 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 1M 수성 L-시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켜 최종 농도 10mM을 제공한다.
G-CSF 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피(IEC)에 의해 정화하였다. 용리액의 컨쥬게이트 함유 분획을 재생 셀룰로스(88㎠, 컷-오프 10kD/밀리포어)로 만들어진 10kD 막을 사용하여 UF/DF에 의해 농축시킨다. 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 7.5)에 대해 최종 정용여과 단계를 수행한다.
전체 단백질(브래드퍼드 및 BCA 절차) 및 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 제제를 분석적으로 특성규명한다.
실시예 43
친핵성 촉매로서 아미노옥시-PEG 시약 및 m-톨루이딘을 사용하는 휴미라의 페길화
방법 1:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 휴미라를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. 휴미라를 7.0㎖ 히스티딘 완충제, pH 6.0(20mM L-히스티딘, 150mM NaCl, 5mM CaCl2) 중에 용해시킨다. 이어서, 수성 과요오드산나트륨 용액(5mM)을 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 암실에서 4℃에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 7.5㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켰다. 후속적으로 혼합물에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 바바스핀 원심분리 여과기를 사용하여 UF/DF를 실시한다.
산화된 휴미라를 함유하는 잔류물을 다음에 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합하였고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 이어서, MW가 20kD인 아미노옥시-PEG 시약을 첨가하여 5배몰 과량을 제공한다. 이 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 암실에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시킨다.
최종적으로, PEG-휴미라 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피(예를 들어, Q-세파로스 FF 상에서)에 의해 정제한다. 예를 들어, 1.5㎎ 단백질/㎖ 겔을 5mM CaCl2를 함유하는 50mM 헤페스 완충제, pH 7.4를 이용하여 평형상태로 만든 칼럼 상에 장입한다. 컨쥬게이트를 5mM CaCl2 및 500mM 염화나트륨, pH 7.4를 함유하는 50mM 헤페스 완충제를 이용하여 용리시킨 다음, 적절한 MW 컷오프 막을 사용하여 UF/DF를 실시한다. 다음에 제제를 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 1을 다음과 같이 수행한다. 아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 휴미라를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. 휴미라를 7.0㎖ 히스티딘 완충제, pH 6.0(20mM L-히스티딘, 150mM NaCl, 5mM CaCl2) 중에 용해시킨다. 이어서, 수성 과요오드산나트륨 용액(5mM)을 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 암실에서 4℃에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 7.5㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켰다. 후속적으로 혼합물에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 바바스핀 원심분리 여과기를 사용하여 UF/DF를 실시한다.
산화된 휴미라를 함유하는 잔류물을 다음에 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합하였고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 이어서, MW가 20kD인 아미노옥시-PEG 시약을 첨가하여 5배몰 과량을 제공한다. 이 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 암실에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시킨다.
최종적으로, PEG-휴미라 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 용리액의 컨쥬게이트 함유 분획을 수집하고, 이어서, 적절한 MW 컷오프 막을 사용하여 UF/DF를 실시한다. 다음에 제제를 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 2:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 휴미라를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. 휴미라를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 옮기거나 또는 용해시켜서 최종 단백질 농도 1.0 +/- 0.25㎎/㎖를 얻는다. 이어서, 용액의 pH를 0.5N 수성 HCl 용액의 적가에 의해 6.0까지 보정한다. 후속적으로, 40mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 10분 내에 첨가하여 농도 200μM을 제공한다. T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 30 +/- 5분 동안 산화반응을 수행한다. 이어서, T= +22 +/- 2℃에서 15분 내에 수성 L-시스테인 용액(1M)의 첨가에 의해 반응을 중단시켜 반응 혼합물에서 최종 농도 10mM을 제공하였고 60 +/- 5분 동안 인큐베이션시킨다.
산화된 휴미라를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. 용리액의 산화된 휴미라 함유 분획을 수집하고 컨쥬게이션 반응을 위해 사용한다.
MW 20kD의 아미노옥시-PEG 시약을 15분 부드러운 교반 하에 최대 시간 기간(t) 내에서 정제 산화된 휴미라를 함유하는 용리액에 50배 몰 과량으로 첨가한다. 이어서, 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 15분 내에 첨가하여 최종 농도 10mM을 얻는다. 반응 혼합물을 암실에서 T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 120 +/- 10분 동안 부드러운 진탕 하에 인큐베이션시킨다.
얻어진 PEG-휴미라를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. PEG-휴미라 컨쥬게이트 함유 분획을 수집하고, 적절한 분자량 컷 오프(밀리포어)를 지니는 정제된 컨쥬게이트를 재생 셀룰로스로 만들어진 막을 사용하여 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 농축시킨다.
방법 3:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 휴미라를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. 휴미라를 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 150mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 용해시키고, 수성 과요오드산나트륨 용액(10mM), 및 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합한다. 후속적으로 아미노옥시 시약을 첨가하여 20배 몰 과량의 시약을 제공한다. 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 8㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시킨다.
최종적으로, PEG-휴미라 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피에 의해 Q-세파로스 FF 상에서 정제한다. 1.5㎎ 단백질/㎖ 겔을 5mM CaCl2를 함유하는 50mM 헤페스 완충제, pH 7.4를 이용하여 미리 평형상태로 만든 칼럼 상에 장입한다. 컨쥬게이트를 5mM CaCl2 및 500mM 염화나트륨, pH 7.4를 함유하는 50mM 헤페스 완충제를 이용하여 용리시킨 다음, 막을 사용하여 UF/DF를 실시한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 3을 다음과 같이 수행한다. 아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 휴미라를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. 휴미라를 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 150mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 용해시키고, 수성 과요오드산나트륨 용액(10mM), 및 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합한다. 후속적으로 아미노옥시 시약을 첨가하여 20배 몰 과량의 시약을 제공한다. 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 8㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시킨다.
최종적으로, PEG-휴미라 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피에 의해 정제한다. 컨쥬게이트 함유 분획을 수집하고, 이어서, 막을 사용하여 UF/DF를 실시한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
방법 4:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 휴미라를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. 휴미라의 초기 농도 또는 중량을 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 150mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 옮기거나 또는 용해시켜서 최종 단백질 농도 2㎎ 휴미라/㎖를 얻는다. 후속적으로 15분 내에 5mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 첨가하여 최종 농도 100μM을 제공한 후, 50mM 수성 m-톨루이딘 용액의 첨가로 30분의 시간 기간 내에 최종 농도 10mM을 얻는다. 이어서, MW가 20kD(상기 기재함)인 아미노옥시-PEG 시약을 첨가하여 20배 몰 과량의 시약을 제공한다. pH를 6.0으로 보정한 후, 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 1M 수성 L-시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켜 최종 농도 10mM을 제공한다.
휴미라 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피(IEC)에 의해 정화하였다. 용리액의 컨쥬게이트 함유 분획을 재생 셀룰로스(88㎠, 컷-오프 10kD/밀리포어)로 만들어진 10kD 막을 사용하여 UF/DF에 의해 농축시킨다. 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 7.5)에 대해 최종 정용여과 단계를 수행한다.
전체 단백질(브래드퍼드 및 BCA 절차) 및 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 제제를 분석적으로 특성규명한다.
실시예 44
친핵성 촉매로서 아미노옥시-PEG 시약 및 m-톨루이딘을 사용하는 프롤리아의 페길화
방법 1:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 프롤리아를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. 프롤리아를 7.0㎖ 히스티딘 완충제, pH 6.0(20mM L-히스티딘, 150mM NaCl, 5mM CaCl2) 중에 용해시킨다. 이어서, 수성 과요오드산나트륨 용액(5mM)을 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 암실에서 4℃에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 7.5㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켰다. 후속적으로 혼합물에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 바바스핀 원심분리 여과기를 사용하여 UF/DF를 실시한다.
산화된 프롤리아를 함유하는 잔류물을 다음에 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합하였고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 이어서, MW가 20kD인 아미노옥시-PEG 시약을 첨가하여 5배몰 과량을 제공한다. 이 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 암실에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시킨다.
최종적으로, PEG-프롤리아 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피(예를 들어, Q-세파로스 FF 상에서)에 의해 정제한다. 예를 들어, 1.5㎎ 단백질/㎖ 겔을 5mM CaCl2를 함유하는 50mM 헤페스 완충제, pH 7.4를 이용하여 평형상태로 만든 칼럼 상에 장입한다. 컨쥬게이트를 5mM CaCl2 및 500mM 염화나트륨, pH 7.4를 함유하는 50mM 헤페스 완충제를 이용하여 용리시킨 다음, 적절한 MW 컷오프 막을 사용하여 UF/DF를 실시한다. 다음에 제제를 전체 단백질(쿠마씨, 브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 1을 다음과 같이 수행한다. 아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 프롤리아를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. 10㎎ rFIX를 5㎖ 히스티딘 완충제, pH 6.0(20mM L-히스티딘, 150mM NaCl) 중에 용해시킨다. 이어서, 100㎕의 수성 과요오드산나트륨 용액(5mM)을 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 암실에서 4℃에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 50㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켰다. 후속적으로 혼합물에 과량의 과요오드산염, 퀀처 및 이의 부산물을 제거하기 위해 바바스핀 15R 10kD 원심분리 여과기를 사용하여 UF/DF를 실시한다.
산화된 프롤리아를 함유하는 잔류물(대략 7㎖)을 2㎖의 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합하였고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 이어서, MW가 20kD(상기 기재함)인 아미노옥시-PEG 시약을 첨가하여 5배몰 과량을 제공한다. 이 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 암실에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시킨다.
최종적으로, PEG-프롤리아 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피에 의해 SP 세파로스 FF 상에서 정제한다. 반응 혼합물을 20㎖ 완충제 A(50mM 헤페스, pH 6.5)로 희석시키고, 완충제 A를 이용하여 사전에 평행상태로 만든 20㎖ HiPrep SP FF 16/10 칼럼(코네티컷주 페어필드에 소재한 GE 헬스케어(GE Healthcare)) 상에 장입한다. 이어서, 칼럼을 완충제 B(50mM 헤페스, 1M NaCl, pH 6.5)로 용리시킨다. 25% 완충제 B 및 50% 완충제 B에서의 컨쥬게이트를 이용하여 칼럼을 세척함으로써 유리 프롤리아를 용리시킨다. 컨쥬게이트 함유 분획을 재생 셀룰로스(88㎠, 컷-오프 10kD/밀리포어)로 만들어진 10kD 막을 사용하여 UF/DF에 의해 농축시킨다. 150mM NaCl를 함유하는 히스티딘 완충제(Ph 6.9)에 대해 최종 정용여과 단계를 수행한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다. PEG-프롤리아 컨쥬게이트에 대해 천연 프롤리아에 비해 50% 미만의 특이적 활성을 결정한다. 앞서 기재한 조건 하에서 쇼덱스(Shodex) KW 803 칼럼을 구비한 애질런트 1200 HPLC 시스템을 사용하여 크기 배제 HPLC에 의해 컨쥬게이트를 추가적으로 분석적으로 특성규명한다(Kolarich et al, Transfusion 2006;46:1959-77). 이는 제제가 유리 프롤리아를 함유하지 않는다는 것을 나타낸다.
방법 2:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 프롤리아를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. 프롤리아를 반응 완충제(예를 들어, 50mM 헤페스, 350mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 옮기거나 또는 용해시켜서 최종 단백질 농도 1.0 +/- 0.25㎎/㎖를 얻는다. 이어서, 용액의 pH를 0.5N 수성 HCl 용액의 적가에 의해 6.0까지 보정한다. 후속적으로, 40mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 10분 내에 첨가하여 농도 200μM을 제공한다. T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 30 +/- 5분 동안 산화반응을 수행한다. 이어서, T= +22 +/- 2℃에서 15분 내에 수성 L-시스테인 용액(1M)의 첨가에 의해 반응을 중단시켜 반응 혼합물에서 최종 농도 10mM을 제공하였고 60 +/- 5분 동안 인큐베이션시킨다.
산화된 프롤리아를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. 용리액의 산화된 휴미라 함유 분획을 수집하고 컨쥬게이션 반응을 위해 사용한다.
MW 20kD의 아미노옥시-PEG 시약을 15분 부드러운 교반 하에 최대 시간 기간(t) 내에서 정제 산화된 프롤리아를 함유하는 용리액에 50배 몰 과량으로 첨가한다. 이어서, 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 15분 내에 첨가하여 최종 농도 10mM을 얻는다. 반응 혼합물을 암실에서 T= +22 +/- 2℃의 온도(T)에서 120 +/- 10분 동안 부드러운 진탕 하에 인큐베이션시킨다.
얻어진 PEG-프롤리아 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제한다. PEG-프롤리아 컨쥬게이트 함유 분획을 수집하고, 적절한 분자량 컷 오프(밀리포어)를 지니는 정제된 컨쥬게이트를 재생 셀룰로스로 만들어진 막을 사용하여 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 농축시킨다.
방법 3:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 프롤리아를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. EPO를 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 150mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 용해시키고, 수성 과요오드산나트륨 용액(10mM), 및 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)과 혼합한다. 후속적으로 아미노옥시 시약을 첨가하여 20배 몰 과량의 시약을 제공한다. 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 8㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시킨다.
최종적으로, PEG-프롤리아 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피에 의해 Q-세파로스 FF 상에서 정제한다. 1.5㎎ 단백질/㎖ 겔을 5mM CaCl2를 함유하는 50mM 헤페스 완충제, pH 7.4를 이용하여 미리 평형상태로 만든 칼럼 상에 장입한다. 컨쥬게이트를 5mM CaCl2 및 500mM 염화나트륨, pH 7.4를 함유하는 50mM 헤페스 완충제를 이용하여 용리시킨 다음, 막을 사용하여 UF/DF를 실시한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다.
대안의 실시형태에서, 방법 3을 다음과 같이 수행한다.
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 프롤리아를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. 10㎎ 프롤리아를 ~8㎖ 히스티딘 완충제, pH 6.0(20mM L-히스티딘, 150mM NaCl) 중에 용해시킨다. 200㎕의 수성 과요오드산나트륨 용액(5mM) 및 2㎖의 수성 m-톨루이딘 용액(50mM)을 첨가한다. 후속적으로, MW가 20kD(상기 기재함)인 아미노옥시-PEG 시약을 첨가하여 5배몰 과량을 제공한다. 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 100㎕의 1M 수성 시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시킨다.
최종적으로, PEG-프롤리아 컨쥬게이트를 이온-교환 크로마토그래피에 의해 SP-파로스 FF 상에서 정제한다. 반응 혼합물을 20㎖ 완충제 A(50mM 헤페스, pH 6.5)로 희석시키고, 완충제 A를 이용하여 사전에 평행상태로 만든 20㎖ HiPrep SPFF 16/10 칼럼(코네티컷주 페어필드에 소재한 GE 헬스케어(GE Healthcare)) 상에 장입한다. 이어서, 칼럼을 완충제 B(50mM 헤페스, 1M NaCl, pH 6.5)로 용리시킨다. 25% 완충제 B 및 50% 완충제 B에서의 컨쥬게이트를 이용하여 칼럼을 세척함으로써 유리 프롤리아를 용리시킨다. 컨쥬게이트 함유 분획을 재생 셀룰로스(88㎠, 컷-오프 10kD/밀리포어)로 만들어진 10kD 막을 사용하여 UF/DF에 의해 농축시킨다. 150mM NaCl를 함유하는 히스티딘 완충제(Ph 6.9)에 대해 최종 정용여과 단계를 수행한다. 제제를 전체 단백질(브래드퍼드) 및 당업계에 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 분석적으로 특성규명한다. PEG-프롤리아 컨쥬게이트에 대해 천연 프롤리아에 비해 50% 미만의 특이적 활성을 결정한다. 앞서 기재한 조건 하에서 쇼덱스(Shodex) KW 803 칼럼을 구비한 애질런트 1200 HPLC 시스템을 사용하여 크기 배제 HPLC에 의해 컨쥬게이트를 추가적으로 분석적으로 특성규명한다(Kolarich et al, Transfusion 2006;46:1959-77). 이는 제제가 유리 프롤리아를 함유하지 않는다는 것을 나타낸다.
방법 4:
아미노옥시기를 함유하는 선형 20kD 페길화 시약의 사용에 의해 프롤리아를 페길화한다. 이 유형의 시약의 예는 NOF제(일본 도쿄에 소재한 NOF 코포레이션)의 선브라이트(등록상표) CA 시리즈이다. 휴미라의 초기 농도 또는 중량을 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 150mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘, pH 6.0) 중에 옮기거나 또는 용해시켜서 최종 단백질 농도 2㎎ 프롤리아/㎖를 얻는다. 후속적으로 15분 내에 5mM 수성 과요오드산나트륨 용액을 첨가하여 최종 농도 100μM을 제공한 후, 50mM 수성 m-톨루이딘 용액의 첨가로 30분의 시간 기간 내에 최종 농도 10mM을 얻는다. 이어서, MW가 20kD(상기 기재함)인 아미노옥시-PEG 시약을 첨가하여 20배 몰 과량의 시약을 제공한다. pH를 6.0으로 보정한 후, 혼합물을 2시간 동안 암실에서 실온에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰으며, 15분 동안 실온에서 1M 수성 L-시스테인 용액의 첨가에 의해 퀀칭시켜 최종 농도 10mM을 제공한다.
프롤리아 컨쥬게이트를 이온 교환 크로마토그래피(IEC)에 의해 정화하였다. 용리액의 컨쥬게이트 함유 분획을 재생 셀룰로스(88㎠, 컷-오프 10kD/밀리포어)로 만들어진 10kD 막을 사용하여 UF/DF에 의해 농축시킨다. 헤페스 완충제(50mM 헤페스, 5mM CaCl2, pH 7.5)에 대해 최종 정용여과 단계를 수행한다.
전체 단백질(브래드퍼드 및 BCA 절차) 및 공지된 방법에 따른 생물학적 활성을 측정함으로써 제제를 분석적으로 특성규명한다.
실시예 45
분지된 PEG를 사용하는 치료적 단백질의 페길화
본 발명의 치료적 단백질의 페길화는 알데하이드 및 활성 아미노옥시기를 함유하는 적합한 링커로 만들어진 분지 또는 선형 페길화 시약으로 확장된다.
실시예 46
천연 PSA에 대한 다이아모노옥시 링커의 결합
본 실시예는 치료적 단백질의 화학적 변형을 위해 사용될 수 있는, 천연 PSA(즉, 산화 없이)를 사용하는 아미노옥시-PSA 시약을 제조하기 위한 절차를 기재한다.
a) 주위 온도에서의 결합
세럼 인스티튜트 오브 인디아(인도 푸네에 소재)로부터 얻은 52.2㎎의 천연 PSA(MW = 20kD)를 1.05㎖ 50mM 인산염 완충제 pH 6.0(완충제 A) 중에 용해시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 적가하면서 10.3㎎의 3-옥사-펜탄-1,5-다이옥시아민 (링커 분자)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 암실에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰다.
b) 증가된 온도에서의 결합
세럼 인스티튜트 오브 인디아(인도 푸네에 소재)로부터 얻은 52.2㎎의 천연 PSA(MW = 20kD)를 1.05㎖ 50mM 인산염 완충제 pH 6.0(완충제 A) 중에 용해시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 적가하면서 10.3㎎의 3-옥사-펜탄-1,5-다이옥시아민 (링커 분자)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 암실에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰다. 이어서, 온도를 32 내지 37℃로 증가시켰고, 반응 혼합물을 다른 14시간 동안 인큐베이션시켰다.
c) 증가된 온도 및 과량의 증가된 링커에서의 결합
세럼 인스티튜트 오브 인디아(인도 푸네에 소재)로부터 얻은 52.2㎎의 천연 PSA(MW = 20kD)를 1.05㎖ 50mM 인산염 완충제 pH 6.0(완충제 A) 중에 용해시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 적가하면서 10.3㎎의 3-옥사-펜탄-1,5-다이옥시아민 (링커 분자)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 암실에서 부드러운 교반 하에 인큐베이션시켰다. 이어서, 26.3㎎의 3-옥사-펜탄-1,5-다이옥시아민을 반응물에 적가하며, 온도를 32 내지 37℃로 증가시켰고, 반응 혼합물을 다른 14시간 동안 인큐베이션시켰다.
d) PSA 유도체의 정제
인큐베이션을 완료한 후, 시점 a 내지 c 하에 만들어진 반응 혼합물을 대규모 투석에 의해 정제하였다. 따라서 반응 혼합물의 샘플을 슬라이드-에이-라이저(Slide-A-Lyzer) 투석 카세트(0-5-3㎖, MWCO 3.5kD, 피어스(Pierce)의 레그 셀룰로스(reg. cellulose))에 장입하였고, 다음의 패턴에 따라 10mM 인산염 완충제 pH 8.0에 대해 투석하였다:
500㎖ 완충제에 대해 실온에서 2시간
500㎖ 완충제에 대해 실온에서 2시간
500㎖ 완충제에 대해 4℃에서 12시간
초기 샘플 용적으로 농축을 위해 50㎖ ‘투석용 슬라이드-에이-라이저 농축 용액’에 대해 실온에서 1시간.
따라서 정제된 아미노옥시-PSA는, 예를 들어, 상기 실시예 11, 12, 14 및 17 내지 31에 따른 단백질 컨쥬게이션 반응에서 사용할 준비가 되어 있다. 마찬가지로, 본 명세서에 기재한 임의의 수용성 중합체는 본 실시예에 기재한 바와 같은 아미노옥시 링커에 결합되고, 이어서, 상기 실시예에 제시한 바와 같은 단백질에 결합될 수 있다.
전체 PSA(레조시놀 분석) 및 전체 아미노옥시기(TNBS 분석)를 측정함으로써 제제를 분석적으로 특성규명하여 변형도를 결정하였다. 제조를 위해 (a) 변형도(modification degree: MD) 0.35, (b) MD=0.54 및 (c) MD = 0.58를 결정하였다. 더 나아가 다분산성뿐만 아니라 유리 3-옥사-펜탄-1,5-다이옥시아민을 측정하였다. 다분산성은 모든 제조에 대해 1.15보다 낮았고, 유리 링커의 함량은 0.15㏖%의 PSA 농도보다 낮았다.
환원말단에서 변형된 PSA에 대해, 다음의 구조를 13C NMR 분광학에 의해 결정하였다.
Figure 112021088906918-pat00054
실시예 47
4℃에서 크로마토그래피 정제 단계를 사용하는 아미노옥시-PSA의 제조
실온에서 제조된 아미노옥시-PSA 시약의 상세한 분석적 특성규명 동안, NMR 연구(예를 들어, 전문이 참조로서 포함된 미국 가출원 특허 제61/647,814호 참조)는 다이아미노옥시 링커를 이용하는 산화 PSA의 유도체화가 2가지 별개의 반응: PSA의 비-환원 말단에서 알데하이드기의 빠른 반응 및 PSA의 환원말단에서 알데하이드기(헤미케탈의 형성에서)의 느린 반응으로 이루어진다는 것을 나타내었다. 후자의 반응은 시약 생성을 위해 회피되어야 하는 원치않는 부반응을 고려할 수 있었다.
따라서, 아미노옥시-PSA 시약의 제조공정은 본 실시예에 기재된 바와 같이 최적화되었다. 공정이 실온에서 수행된다면 환원 말단만이 유의한 정도로 생긴다. 따라서, 공정을 조절하였고, 2 내지 8℃에서 수행한다. 2 내지 8℃에서 전체 공정(IEX에 의한 PSA 시약의 화학적 반응 및 정제)을 수행함으로써, PSA의 환원말단에서의 부반응을 실질적으로 감소시켰다. 따라서 본 공정 변화는 더 고품질의 시약을 야기한다.
절차
세럼 인스티튜트 오브 인디아(인도 푸네에 소재)로부터 얻은 1290㎎의 산화된 PSA(MW = 20kD)를 25㎖ 50mM 인산염 완충제 pH 6.0(완충제 A) 중에 용해시켰다. 이어서, 209㎎의 3-옥사-펜탄-1,5-다이옥시아민을 반응 혼합물에 첨가하였고, 2 내지 8℃에서 1시간 동안 암실에서 부드러운 교반하에 인큐베이션시켰다.
인큐베이션 후에, 혼합물에 2 내지 8℃에서 냉장실에서 수행한 프락토겔 EMD DEAE 650-M 크로마토그래피겔(칼럼치수: XK26/135)을 사용하여 약한 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 실시하였다. 반응 혼합물을 110㎖ 완충제 A로 희석시켰고, 1㎝/분의 유속에서 완충제 A를 이용하여 미리 평형상태로 만든 DEAE 칼럼 상에 장입시켰다. 이어서, 칼럼을 20 CV 완충제 B(20mM 헤페스, pH 6.0)로 세척하여 2㎝/분의 유속에서 유리 3-옥사-펜탄-1,5-다이옥시아민을 제거하였다. 이어서, 아미노옥시-PSA 시약을 67% 완충제 B 및 43% 완충제 C(20mM 헤페스, 1M NaCl, pH 7.5)로 이루어진 단계 구배로 용리시켰다. 용리액을 폴리에터 설폰(50㎠, 밀리포어)으로 만들어진 5kD 막을 사용하여 UF/DF에 의해 농축시켰다. 전체 PSA(레조시놀 분석) 및 전체 겔(칼럼 치수: XK16/105)을 측정함으로써 제제를 분석적으로 특성규명하여 변형도를 결정하였다. 최종 제조에서 PSA 농도는 46.0㎎/㎖였고, 변형도는 83.5%였다. 더 나아가, 다분산성 값 1.131을 결정하였다. 추가로, 유리 3-옥사-펜탄-1,5-다이옥시아민에 대해 농도 0.22 ㎍/㎖(0.07㏖%의 PSA)를 측정하였다.
따라서 정제된 아미노옥시-PSA는 상기 실시예 11, 12, 14 및 17 내지 31에 따른 컨쥬게이션 반응에서 사용할 준비가 되어 있다.
<110> TAKEDA PHARMACEUTICAL COMPANY LIMITED <120> NUCLEOPHILIC CATALYSTS FOR OXIME LINKAGE <130> 31315/46928 <150> 13/488,043 <151> 2012-06-04 <150> 61/647,814 <151> 2012-05-16 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 422 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Leu Asn Arg Pro Lys Arg Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val 1 5 10 15 Gln Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu 20 25 30 Glu Pro Arg Glu Val Phe Glu Asn Thr Glu Lys Thr Thr Glu Phe Trp 35 40 45 Lys Gln Tyr Val Asp Gly Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn 50 55 60 Gly Gly Ser Cys Lys Asp Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro 65 70 75 80 Phe Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile 85 90 95 Lys Asn Gly Arg Cys Glu Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys 100 105 110 Val Val Cys Ser Cys Thr Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys 115 120 125 Ser Cys Glu Pro Ala Val Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser 130 135 140 Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Ala Val Phe Pro Asp Val Asp 145 150 155 160 Tyr Val Asn Pro Thr Glu Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln 165 170 175 Gly Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp 180 185 190 Ala Lys Pro Gly Gln Phe Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val 195 200 205 Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser Ile Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr 210 215 220 Ala Ala His Cys Val Glu Thr Gly Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly 225 230 235 240 Glu His Asn Ile Glu Glu Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val 245 250 255 Ile Arg Ala Ile Ile Pro His His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys 260 265 270 Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu 275 280 285 Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile Cys Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn 290 295 300 Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly Tyr Val Ser Gly Trp Ala Arg Val 305 310 315 320 Phe His Lys Gly Arg Ser Ala Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro 325 330 335 Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Arg Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr 340 345 350 Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys 355 360 365 Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser 370 375 380 Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly 385 390 395 400 Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys 405 410 415 Glu Lys Thr Lys Leu Thr 420

Claims (57)

  1. 출혈 장애를 치료하기 위한 변형된 치료적 단백질을 제조하는 방법으로서, 활성화된 수용성 중합체가 옥심 결합을 통해 치료적 단백질의 산화된 탄수화물 모이어티(moiety)에 컨쥬게이트되어 변형된 치료적 단백질을 형성하고;
    상기 활성화된 수용성 중합체는 활성 아미노옥시기를 함유하고, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 분지된 PEG, 폴리PEG(PolyPEG)(등록상표)(영국 코번트리에 소재한 워윅 이펙트 폴리머즈(Warwick Effect Polymers)), 폴리시알산(polysialic acid: PSA), 탄수화물, 다당류, 풀루란, 키토산, 하이알루론산, 황산콘드로이틴, 황산더마탄, 덱스트란, 카복시메틸-덱스트란, 폴리알킬렌 옥사이드(polyalkylene oxide: PAO), 폴리알킬렌 글라이콜(polyalkylene glycol: PAG), 폴리프로필렌 글라이콜(polypropylene glycol: PPG), 폴리옥사졸린, 폴리아크릴로일모르폴린, 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol: PVA), 폴리카복실레이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리포스파젠, 폴리에틸렌-코-말레산 무수물, 폴리스티렌-코-말레산 무수물, 및 폴리(1-하이드록시메틸에틸렌 하이드록시메틸포말)(PHF)로 이루어진 군에서 선택되고;
    상기 치료적 단백질은 글라이코단백질(glycoprotein) 또는 시험관내에서 글라이코실화된 치료적 단백질이고, 인자 IX(FIX), 인자 VIII(FVIII), 인자 VIIa(FVIIa), 폰빌레브란트 인자(VWF), 인자 V(FV), 인자 X(FX), 인자 XI(FXI), 인자 XII(FXII), 트롬빈(FII), 단백질 C, 단백질 S, tPA, PAI-1, 조직 인자(TF) 및 이들의 생물학적으로 활성인 단편, 유도체 또는 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    상기 산화된 탄수화물 모이어티는 과요오드산나트륨(NaIO4), 테트라아세트산납(Pb(OAc)4) 및 과루테늄산칼륨(KRuO4)으로 이루어진 군으로부터 선택된 산화제를 포함하는 완충제와 함께 인큐베이션에 의해 산화된 탄수화물 모이어티이고;
    산화된 탄수화물 모이어티와 활성화된 수용성 중합체 상의 활성 아미노옥시기 사이에 옥심 결합이 형성되고;
    상기 옥심 결합 형성은 o-아미노 벤조산, m-아미노 벤조산, p-아미노 벤조산, 설파닐산, o-아미노벤즈아미드, o-톨루이딘, m-톨루이딘, p-톨루이딘, o-아니시딘, m-아니시딘 및 p-아니시딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 친핵성 촉매에 의해 촉매되고;
    상기 활성 아미노옥시기를 함유하는 활성화된 수용성 중합체는
    a) 산화된 수용성 중합체와 활성화된 아미노옥시 링커 사이에 안정한 옥심 결합을 형성시키는 조건 하에서 활성 아미노옥시기를 포함하는 아미노옥시 링커와 함께 산화된 수용성 중합체를 포함하는 용액을 인큐베이션시킴으로써, 활성 아미노옥시기를 함유하는 활성화된 수용성 중합체를 형성하는 단계 - 상기 조건은 교반하면서 또는 교반 없이, 광의 존재 또는 부재에서, 2℃ 내지 8℃의 온도, 및 1분 내지 24시간의 시간 기간을 포함함 -; 및
    b) 2℃ 내지 8℃의 온도에서, 크로마토그래피, 여과, 투석 및 침전으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의해 활성 아미노옥시기를 함유하는 활성화된 수용성 중합체를 정제시키는 단계
    를 포함하는 방법에 의해 제조되는, 출혈 장애를 치료하기 위한 변형된 치료적 단백질을 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 활성 아미노옥시기를 포함하는 아미노옥시 링커 및 산화된 수용성 중합체를 포함하는 용액을 4℃에서 1시간 동안 광의 부재에서 교반하면서 인큐베이션 하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 활성 아미노옥시기를 함유하는 활성화된 수용성 중합체를 4℃의 온도에서 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하는, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 산화된 수용성 중합체가 산화된 PSA이고; 산화된 PSA는 PSA의 비환원 말단에서 말단 알데히드기를 형성하기 위해 산화제와의 인큐베이션에 의해 산화된 PSA인, 방법.
  5. 출혈 장애를 치료하기 위한 변형된 치료적 단백질을 제조하는 방법으로서, 활성화된 수용성 중합체가 옥심 결합을 통해 치료적 단백질의 산화된 탄수화물 모이어티에 컨쥬게이트되어 변형된 치료적 단백질을 형성하고;
    상기 활성화된 수용성 중합체는 활성 아미노옥시기를 함유하고, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 분지된 PEG, 폴리PEG(등록상표)(영국 코번트리에 소재한 워윅 이펙트 폴리머즈), 폴리시알산(PSA), 탄수화물, 다당류, 풀루란, 키토산, 하이알루론산, 황산콘드로이틴, 황산더마탄, 덱스트란, 카복시메틸-덱스트란, 폴리알킬렌 옥사이드(PAO), 폴리알킬렌 글라이콜(PAG), 폴리프로필렌 글라이콜(PPG), 폴리옥사졸린, 폴리아크릴로일모르폴린, 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리카복실레이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리포스파젠, 폴리에틸렌-코-말레산 무수물, 폴리스티렌-코-말레산 무수물, 및 폴리(1-하이드록시메틸에틸렌 하이드록시메틸포말)(PHF)로 이루어진 군에서 선택되고;
    상기 치료적 단백질은 글라이코단백질 또는 시험관내에서 글라이코실화된 치료적 단백질이고, 인자 IX(FIX), 인자 VIII(FVIII), 인자 VIIa(FVIIa), 폰빌레브란트 인자(VWF), 인자 V(FV), 인자 X(FX), 인자 XI(FXI), 인자 XII(FXII), 트롬빈(FII), 단백질 C, 단백질 S, tPA, PAI-1, 조직 인자(TF) 및 이들의 생물학적으로 활성인 단편, 유도체 또는 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    상기 산화된 탄수화물 모이어티는 과요오드산나트륨(NaIO4), 테트라아세트산납(Pb(OAc)4) 및 과루테늄산칼륨(KRuO4)으로 이루어진 군으로부터 선택된 산화제를 포함하는 완충제와 함께 인큐베이션에 의해 산화된 탄수화물 모이어티이고;
    산화된 탄수화물 모이어티와 활성화된 수용성 중합체상의 활성 아미노옥시기 사이에 옥심 결합이 형성되고;
    상기 옥심 결합 형성은 o-아미노 벤조산, m-아미노 벤조산, p-아미노 벤조산, 설파닐산, o-아미노벤즈아미드, o-톨루이딘, m-톨루이딘, p-톨루이딘, o-아니시딘, m-아니시딘 및 p-아니시딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 친핵성 촉매에 의해 촉매되고;
    상기 활성 아미노옥시기를 함유하는 활성화된 수용성 중합체는
    a) 산화되지 않은 수용성 중합체와 활성화된 아미노옥시 링커 사이에 안정한 옥심 결합을 형성시키는 조건 하에서 활성 아미노옥시기를 포함하는 아미노옥시 링커와 함께 산화되지 않은 수용성 중합체를 포함하는 용액을 인큐베이션시킴으로써, 활성 아미노옥시기를 함유하는 활성화된 수용성 중합체를 형성하는 단계 - 상기 조건은 교반하면서 또는 교반 없이, 광의 존재 또는 부재에서, 22℃ 내지 37℃의 온도, 및 1분 내지 24시간의 시간 기간을 포함함 -; 및
    b) 크로마토그래피, 여과, 투석 및 침전으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의해 활성 아미노옥시기를 함유하는 활성화된 수용성 중합체를 정제시키는 단계
    를 포함하는 방법에 의해 제조되는, 출혈 장애를 치료하기 위한 변형된 치료적 단백질을 제조하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 수용성 중합체 및 활성 아미노옥시기를 포함하는 아미노옥시 링커를 포함하는 용액을 22℃에서 2시간 동안 광의 부재에서 교반하면서 인큐베이션 하는, 방법.
  7. 제5항에 있어서, 수용성 중합체 및 활성 아미노옥시기를 포함하는 아미노옥시 링커를 포함하는 용액을 22℃에서 2시간 동안 광의 부재에서 교반하면서 인큐베이션 하고; 상기 방법은 용액의 온도를 32℃ 내지 37℃의 온도로 증가시키고 추가의 12 내지 24시간 동안 인큐베이션 하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 온도를 증가시키기 직전에 활성 아미노옥시기를 포함하는 추가량의 아미노옥시 링커를 첨가하는 추가의 단계를 포함하는, 방법.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 아미노옥시기를 함유하는 수용성 중합체가 22℃의 온도에서 투석, 한외여과/정용여과(ultrafiltration/diafiltration: UF/DF) 및 크로마토그래피로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의해 정제되는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 4℃에서 투석, UF/DF 및 크로마토그래피로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의해 활성 아미노옥시기를 함유하는 수용성 중합체를 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 0.3mg/ml 내지 3.0mg/ml의 치료적 단백질의 초기 농도를 포함하는 용액이 활성화된 수용성 중합체와 접촉하기 전에 5.0 내지 8.0의 pH 값으로 조절되는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 치료적 단백질의 초기 농도가 1.0mg/ml이고 pH가 6.0인, 방법.
  13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 치료적 단백질이 원하는 과량 농도의 활성화된 수용성 중합체에 의해 접촉되고, 과량 농도는 1배 몰 내지 300배 몰 과량인, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 과량 농도가 5배 몰 과량 또는 50배 몰 과량인, 방법.
  15. 제13항에 있어서, 치료적 단백질이, 교반하면서 또는 교반 없이, 광의 존재 또는 부재에서, 2℃ 내지 37℃의 온도, 및 0.5시간 내지 24시간의 시간 기간을 포함하는 조건 하에서, 활성화된 수용성 중합체와 함께 인큐베이션되는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 조건은 교반하면서, 광의 부재에서, 22℃의 온도, 및 120분의 시간 기간을 포함하는, 방법.
  17. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 친핵성 촉매가, 교반하면서 또는 교반 없이, 광의 존재 또는 부재에서, 2℃ 내지 37℃의 온도, 및 0.1분 내지 30분의 시간 기간을 포함하는 조건 하에서, 최종 농도 1.0mM 내지 50mM의 친핵성 촉매가 되는 양으로 첨가되는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 친핵성 촉매의 최종 농도가 10mM이고, 상기 조건은 교반하면서, 광의 부재에서, 22℃의 온도, 및 최대 15분의 시간 기간을 포함하는, 방법.
  19. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산화제는 교반하면서 또는 교반 없이, 광의 존재 또는 부재에서, 2℃ 내지 37℃의 온도, 및 0.1분 내지 120분의 시간 기간을 포함하는 조건 하에서, 최종 농도 50μM 내지 1000μM의 산화제가 되는 양으로 첨가되는, 방법
  20. 제19항에 있어서, 산화제의 최종 농도가 400μM이고, 상기 조건은 교반하면서, 광의 부재에서, 22℃의 온도, 및 10분의 시간 기간을 포함하는, 방법.
  21. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 수용성 중합체를 치료적 단백질의 산화된 탄수화물 모이어티에 컨쥬게이팅시키는 것은 L-시스테인, 메티오닌, 글루타티온, 글라이세롤, 메타중아황산나트륨(Na2S2O5), 트립토판, 타이로신, 히스티딘 또는 이의 유도체, 크레졸, 이미다졸, 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 급랭제(quenching agent)의 첨가에 의해 중단되고,
    상기 급랭제는, 교반하면서 또는 교반 없이, 광의 존재 또는 부재에서, 2℃ 내지 37℃의 온도, 및 5분 내지 120분의 시간 기간을 포함하는 조건 하에서, 최종 농도 1mM 내지 100mM의 급랭제가 되는 양으로 첨가되는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 급랭제가 L-시스테인인, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 10mM의 최종 농도가 되도록 L-시스테인이 첨가되고, 상기 조건은 교반하면서, 광의 부재에서, 22℃의 온도, 및 60분의 시간 기간을 포함하는, 방법.
  24. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 치료적 단백질을 포함하는 용액의 pH 값을 5.0 내지 8.0의 pH 값으로 조절하는 것을 포함하는 제1 단계 - 치료적 단백질 농도는 0.3mg/ml 내지 3.0mg/ml임 -;
    b) 치료적 단백질 상의 하나 이상의 탄수화물을 산화시키는 것을 포함하는 제2 단계 - 산화제는, 교반하면서 또는 교반 없이, 광의 존재 또는 부재에서, 2℃ 내지 37℃의 온도, 및 0.1분 내지 120분의 시간 기간을 포함하는 조건 하에서, 최종 농도 50μM 내지 1000μM가 되도록 제1 단계 내의 용액에 첨가됨 -;
    c) 치료적 단백질을 원하는 과량 농도의 활성화된 수용성 중합체와 접촉시키는 것을 포함하는 제3 단계 - 과량 농도는, 교반하면서 또는 교반 없이, 광의 존재 또는 부재에서, 2℃ 내지 37℃의 온도, 및 0.5시간 내지 24시간의 시간 기간을 포함하는 조건 하에서, 1배 몰 과량 내지 300배 몰 과량임 -;
    d) 제3 단계의 용액에 친핵성 촉매를 첨가하는 것을 포함하는 제4 단계 - 친핵성 촉매는, 교반하면서 또는 교반 없이, 광의 존재 또는 부재에서, 2℃ 내지 37℃의 온도, 및 0.1분 내지 30분의 기간을 포함하는 조건 하에서, 최종 농도 1mM 내지 50mM가 되도록 첨가됨 -;
    e) 활성화된 수용성 중합체가 치료적 단백질 상의 하나 이상의 산화된 탄수화물에 컨쥬게이션 될 수 있도록 하기 위해 치료적 단백질이 활성화된 수용성 중합체 및 친핵성 촉매와 함께 인큐베이션되는 제5 단계 - 상기 조건은 교반하면서 또는 교반 없이, 광의 존재 또는 부재에서, 2℃ 내지 37℃의 온도, 및 0.5시간 내지 24시간의 시간 기간을 포함함 -; 및
    f) L-시스테인, 메티오닌, 글루타티온, 글라이세롤, 메타중아황산나트륨(Na2S2O5), 트립토판, 타이로신, 히스티딘 또는 이의 유도체, 크레졸, 이미다졸, 및 이들의 조합물으로 구성된 군에서 선택된 급랭제의 첨가에 의해 제5 단계 내의 치료적 단백질의 하나 이상의 산화된 탄수화물에 수용성 중합체를 컨쥬게이팅 시키는 것을 중단하는 제6 단계 - 급랭제는, 교반하면서 또는 교반 없이, 광의 존재 또는 부재에서, 2℃ 내지 37℃의 온도, 및 5분 내지 120분의 시간 기간을 포함하는 조건 하에서, 1mM 내지 100mM의 최종 농도가 되도록 첨가됨 -;
    를 포함하는, 방법.
  25. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 치료적 단백질을 포함하는 용액의 pH 값을 6.0의 pH 값으로 조절하는 것을 포함하는 제1 단계 - 치료적 단백질의 초기 농도는 1.0 mg/ml임 -;
    b) 치료적 단백질 상의 하나 이상의 탄수화물을 산화시키는 것을 포함하는 제2 단계 - 산화제는, 교반하면서, 광의 부재에서, 22℃의 온도, 및 10분의 시간 기간을 포함하는 조건 하에서, 최종 농도 100μM 내지 400μM가 되도록 제1 단계 내의 용액에 첨가됨 -;
    c) 치료적 단백질을 원하는 과량 농도의 활성화된 수용성 중합체와 접촉시키는 것을 포함하는 제3 단계 - 과량 농도는 교반하면서, 광의 부재에서, 22℃의 온도, 및 15분의 시간 기간을 포함하는 조건 하에서, 5배 몰 과량 또는 50배 몰 과량임 -;
    d) 제3 단계의 용액에 친핵성 촉매를 첨가하는 것을 포함하는 제4 단계 - 친핵성 촉매는, 교반하면서, 광의 부재에서, 22℃의 온도, 및 15분의 시간 기간을 포함하는 조건 하에서, 10mM의 최종 농도가 되도록 첨가됨 -;
    e) 활성화된 수용성 중합체가 치료적 단백질 상의 하나 이상의 산화된 탄수화물에 컨쥬게이션 될 수 있도록 하기 위해 치료적 단백질이 활성화된 수용성 중합체 및 친핵성 촉매와 함께 인큐베이션되는 제5 단계 - 상기 조건은 교반하면서, 광의 부재에서, 22℃의 온도, 및 2시간의 시간 기간을 포함함 -; 및
    f) 급랭제 L-시스테인의 첨가에 의해 제5 단계 내의 치료적 단백질의 하나 이상의 산화된 탄수화물에 수용성 중합체를 컨쥬게이팅 시키는 것을 중단하는 제6 단계 - L-시스테인은, 교반하면서, 광의 부재에서, 22℃의 온도, 및 60분의 시간 기간을 포함하는 조건 하에서, 10mM의 최종 농도가 되도록 첨가됨 -;
    를 포함하는, 방법.
  26. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 수용성 중합체는 PEG인, 방법.
  27. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 수용성 중합체는 PSA인, 방법.
  28. 제27항에 있어서, PSA가 10 내지 300개의 시알산 단위를 포함하는, 방법.
  29. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 치료적 단백질이 FIX의 생물학적 활성을 갖는, 방법.
  30. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 치료적 단백질이 FVIIa의 생물학적 활성을 갖는, 방법.
  31. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 치료적 단백질이 FVIII의 생물학적 활성을 갖는, 방법.
  32. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 산화제가 과요오드산나트륨(NaIO4)인, 방법.
  33. 제31항에 있어서, 치료적 단백질의 산화된 탄수화물 모이어티는 치료적 단백질의 활성화 펩티드에 위치하는, 방법.
  34. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 활성화된 수용성 중합체는 활성화된 PSA이고, 아미노옥시 링커는
    a) 하기 화학식의 3-옥사-펜탄-1,5-다이옥시아민 링커:
    Figure 112021088906918-pat00055
    ,
    b) 하기 화학식의 3,6,9-트라이옥사-운데칸-1,11-다이옥시아민 링커:
    Figure 112021088906918-pat00056
    ; 및
    c) 하기 화학식의 3,6,9,12,15-펜타옥사-헵타데칸-1,17-다이옥시아민 링커:
    Figure 112021088906918-pat00057

    로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 아미노옥시 링커가 3-옥사-펜탄-1,5-다이옥시아민인, 방법.
  36. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 친핵성 촉매가 1mM 내지 50mM의 농도로 제공되는, 방법.
  37. 제36항에 있어서, 친핵성 촉매가 m-톨루이딘인, 방법.
  38. 제37항에 있어서, m-톨루이딘이 10mM의 농도로 컨쥬게이션 반응 내에 존재하는, 방법.
  39. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 컨쥬게이트된 치료적 단백질을 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 컨쥬게이트된 치료적 단백질이 크로마토그래피, 여과 및 침전으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의해 정제되는, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 크로마토그래피가 소수성 상호 작용 크로마토그래피(HIC), 이온 교환 크로마토그래피(IEC), 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 친화성 크로마토그래피 및 역상 크로마토그래피로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 항-카오트로픽 염(anti-chaotropic salt)이 크로마토그래피 로딩 단계 및 크로마토그래피 세척 단계에서 사용되는, 방법.
  43. 제41항에 있어서, 크로마토그래피가 컬럼에서 일어나는, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 컬럼이 페닐-세파로스 FF(Phenyl-Sepharose FF) 및 부틸-세파로스 FF(Butyl-Sepharose FF)로 이루어진 군으로부터 선택된 크로마토그래피 수지를 포함하는, 방법.
  45. 제44항에 있어서, 수지가 5cm 내지 20cm의 층 높이에서 컬럼에 존재하는, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 층 높이가 10cm인, 방법.
  47. 제43항에 있어서, 흐름 방향이 상향 흐름으로 설정되고 유속이 0.2cm/분 내지 6.7cm/분인 하나 이상의 세척 단계를 포함하는, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 유속이 2cm/분인, 방법.
  49. 제43항에 있어서, 흐름 방향이 하향 흐름으로 설정되고 유속이 0.1cm/분 내지 6.7cm/분인 하나 이상의 용리 단계를 포함하는, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 유속이 1cm/분인, 방법.
  51. 제39항에 있어서, 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의해 컨쥬게이트된 치료적 단백질을 농축하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  52. 제39항에 있어서, 치료적 단백질의 최종 농도가 0.5 내지 3mg/ml인, 방법.
  53. 제39항에 있어서, 치료적 단백질이 5 내지 11개의 수용성 중합체 모이어티를 포함하는, 방법.
  54. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 컨쥬게이트된 치료적 단백질이 크로마토그래피를 사용하여 정제되고; 항-카오트로픽 염이 로딩 단계 및 세척 단계에 사용되고; 상기 방법은 흐름 방향이 상향 흐름으로 설정되고 유속이 0.2cm/분 내지 6.7cm/분인 하나 이상의 세척 단계 및 흐름 방향이 하향 흐름으로 설정되고 유속이 0.2cm/분 내지 6.7cm/분인 하나 이상의 용출 단계를 포함하고; 한외/정용 여과(UF/DF)에 의해 컨쥬게이트된 치료적 단백질을 농축하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  55. 제48항에 있어서, 하나 이상의 용출 단계를 포함하고, 크로마토그래피는 소수성 상호 작용 크로마토그래피(HIC)이고; 하나 이상의 세척 단계 유속은 2cm/분이고; 하나 이상의 용출 단계 유속은 1cm/분인, 방법.
  56. 제24항에 있어서, 단계 a) 내지 f)가 단일 용기에서 발생하는, 방법.
  57. 제25항에 있어서, 단계 a) 내지 f)가 단일 용기에서 발생하는, 방법.
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