MX2014013919A - Catalizadores nucleofilicos para enlace de oxima. - Google Patents
Catalizadores nucleofilicos para enlace de oxima.Info
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- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
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- A—HUMAN NECESSITIES
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- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
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- C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
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Abstract
La invención se refiere a materiales y métodos de conjugación de un polímero soluble en agua a una porción de carbohidrato oxidada de una proteína terapéutica, que comprende poner en contacto la porción de carbohidrato oxidada con un polímero soluble en agua activado bajo condiciones que permiten la conjugación. Más específicamente la invención se refiere a los materiales antes mencionados y métodos, en donde el polímero soluble en agua contiene un grupo aminooxi activo y en donde se forma un enlace de oxima o hidrazona entre la porción de carbohidrato oxidada y el grupo aminooxi activo en el polímero soluble en agua, y en donde la conjugación se realiza en presencia de un catalizador nucleofílico.
Description
CATALIZADORES NÜCLEOFÍLICOS PARA ENLACE DE OXIMA Campo de la invención La presente invención se refiere a materiales y métodos para conjugar un polímero soluble en agua con una Antecedentes de la invención La preparación de conjugados mediante la formación de un enlace covalente entre el polímero soluble en agua y la proteína terapéutica se puede llevar a cabo a través de diversos métodos La PEGilación de fármacos de polipéptidos los protege en circulación y mejora sus perfiles farmacodinámico y farmacocinético y Nat Rev Drug El proceso de PEGilación une unidades de repetición de etilenglicol con un fármaco de Las moléculas de PEG tienen un gran volumen hidrodinámico 10 veces el tamaño de las proteínas son altamente solubles en agua y están son no no inmunogénicas y se eliminan rápidamente del La PEGilación de las moléculas puede conducir a una mayor resistencia de los fármacos a la degradación mayor semivida in vivo reducción de la frecuencia de dosificación disminución de la mayor estabilidad física y mayor mayor estabilidad líquida y menor Los primeros fármacos PEGilados fueron aprobados por la FDA a principios de A partir de la FDA ha aprobado diversos fármacos PEGilados para administración inyectable y El ácido polisiálico también denominado ácido colomínico es un polisacárido Es un homopolímero del ácido nico con enlace cetosídico y contiene grupos diol vecinales en su extremo no Tiene carga negativa y es un constituyente natural del cuerpo Se puede producir fácilmente a partir de bacterias en grandes cantidades y con características físicas predeterminadas estadounidense Como el PSA producido por bacterias es química e inmunológicamente idéntico al PSA producido en el cuerpo el PSA bacteriano es no incluso cuando se acopla con A diferencia de algunos el ácido PSA es biodegradable Se ha demostrado que el acoplamiento covalente del ácido colomínico con la catalasa y la asparaginasa aumenta la estabilidad enzimática en presencia de enzimas proteolíticas o plasma Estudios comparativos in vivo con asparaginasa polisialilada y no modificada revelaron que la polisialilación aumentó la semivida de la enzima y Int J El acoplamiento de derivados de PEG con péptidos o proteínas fue estudiado por Roberts et Drug Deliv Rev Un enfoque para el acoplamiento de polímeros solubles en agua con proteínas terapéuticas es la conjugación de los polímeros a través de los restos de carbohidratos de la Los grupos hidroxilo vecinos de los carbohidratos en las proteínas se pueden oxidar fácilmente con periodato de sodio para formar grupos aldehido activos et J Biol Chem van Lenten et J Biol Chem el polímero se puede acoplar con los grupos aldehido del carbohidrato mediante el uso de reactivos que por un grupo hidrazida activo M y Bayer Methods Enzymol Una teenología más reciente es el uso de reactivos que contienen grupos aminooxi que reaccionan con aldehidos para formar los enlaces de oxima Aparecen otros ejemplos que describen la conjugación de un polímero soluble en agua con una proteína terapéutica en WO que presenta la oxidación de restos de carbohidratos en el factor Von Willebrand y el acoplamiento posterior con PEG utilizando química de la publicación estadounidense que presenta la oxidación de rFVIII y el acoplamiento posterior con PEG y otros polímeros solubles en agua utilizando química de WO presenta la oxidación de diferentes factores de ej FVIII y FVIIa y el acoplamiento posterior con utilizando química aminooxi mediante la formación de un enlace de y la patente estadounidense presenta la oxidación de FIX y el acoplamiento posterior con PEG utilizando química de se describió un método mejorado que comprende la oxidación de periodato leve de ácidos siálicos para generar aldehidos seguidos de la reacción con un grupo aminooxi que contiene el reactivo en presencia de cantidades catalíticas de anilina y Dawson Bioconjugate y Zeng Y et Nature Methods La catálisis de anilina acelera drásticamente la ligación de lo que permite el uso de concentraciones muy bajas del El uso de nucleofí líeos también se describe en et J Am Chem et Angew Int ChemBioChem et J Am Chem y et J Org Aunque la catálisis de anilina puede acelerar la ligación a oxima permitiendo tiempos de reacción breves y el uso de concentraciones bajas del reactivo de la anilina tiene propiedades tóxicas que se deben por cuando la proteina terapéutica conjugada forma la base de un producto Por se ha demostrado que la anilina induce la metemoglobinemia y Molecular Pharmacology Se ha demostrado que el tratamiento alimenticio a largo plazo de ratas induce tumores en el bazo et J Nati Cáncer Los estudios in vitro también han demostrado que la anilina tiene la capacidad de inducir mutaciones del cromosoma y tiene actividad genotóxica potencial et Herbold Critical Reviews in Toxicology Aún existe la necesidad de desarrollar materiales y métodos para conjugar polímeros solubles en agua con proteínas que mejoren las propiedades farmacodinámicas farmacocinéticas de la proteina a su los costos asociados con los diversos reactivos y minimizando los riesgos a la salud para el paciente receptor Breve descripción de la invención La presente invención proporciona materiales y métodos para conjugar polímeros con proteínas que mejoran las propiedades farmacodinámi cas farmacocinéticas de las proteínas a su reducen los costos asociados con los diversos reactivos y los riesgos para la salud de los pacientes receptores cuando la reacción de conjugación es catalizada por un catalizador nucleofilico En diversas modalidades de la se proporcionan catalizadores alternativos para sustituir por La presente descripción también proporciona un procedimiento optimizado para la preparación de diversos reactivos de ligadores de solubles en agua que se pueden utilizar para conjugar las proteínas terapéuticas como se describe Estudios de NMR recientes mostraron que las reacciones secundarias en el extremo reductor de PSA se pueden producir si la preparación del reactivo de se realiza a temperatura Por lo tanto en diversas modalidades de la presente el nuevo proceso se lleva a cabo a una temperatura de entre En una el reactivo de se prepara a 4 de acuerdo con el proceso descrito la purificación del reactivo utilizando una etapa de purificación cromatográf ica a una temperatura de entre también se contempla por la presente Las reacciones secundarias no deseadas en el extremo reductor del PSA se reducen sustancialmente cuando el proceso completo química y purificación del conjugado por se realiza a una temperatura de entre En una modalidad de acuerdo con la presente se proporciona un método para conjugar un polímero soluble en agua con un resto de carbohidrato oxidado de una proteína terapéutica que comprende poner en contacto el resto de carbohidrato oxidado con un polímero soluble en agua activado en condiciones que permiten la dicho polímero soluble en agua que contiene un grupo aminooxi activo y que se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol PEG Effect ácido polisiálico almidón hidroxialquilo almidón hidroxi letilo polisacáridos ácido sulfato de sulfato de carboximeti óxido de polialquileno polialquilenglicol pol ipropi1englico1 polioxa po1iacr polivinilalcohol poli polioxazolina anhídrido de ácido anhídrido de ácido hidroximetiletileno etiltri etilamoniofosfato en donde el polímero soluble en agua que contiene un grupo aminooxi activo se prepara a través de un método que incubar una solución que comprende un polímero soluble en agua oxidado con un ligador de aminooxi que comprende un grupo aminooxi activo en condiciones que permiten la formación de un enlace de oxima estable entre el polímero soluble en agua oxidado y el ligador de aminooxi dichas condiciones comprenden un período de entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 24 una temperatura de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 8 con o sin luz y con o sin formando así un polímero soluble en agua que contiene un grupo aminooxi y purificar el polímero soluble en agua que contiene un grupo aminooxi activo a través de un método seleccionado del grupo que consiste en diálisis y a una temperatura de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 8 dicho resto de carbohidrato se oxida por incubación con un amortiguador que comprende un agente oxidante seleccionado del grupo que consiste en periodato de sodio tetraacetato de plomo y perrutenato de potasio en donde se forma un enlace de oxima entre el resto de carbohidrato oxidado y el grupo aminooxi activo sobre el polímero soluble en y en donde dicha formación de enlace de oxima es catalizada por un catalizador nucleofílico seleccionado del grupo que consiste en ácido ácido ácido ácido y En otra se proporciona el método anterior en donde la solución que comprende el polímero soluble en agua oxidado y el ligador de aminooxi que comprende un grupo aminooxi activo se incuba a 4 durante 1 h sin con En otra se proporciona el método anterior en donde el polímero soluble en agua que contiene un grupo aminooxi activo se purifica mediante cromatografía de intercambio aniónico a una temperatura de 4 En otra se proporciona el método mencionado anteriormente en donde el polímero soluble en agua oxidado es PSA y se oxida por incubación con En una modalidad de acuerdo con la presente se proporciona un método para conjugar un polímero soluble en agua con un resto de carbohidrato oxidado de una proteína terapéutica que comprende poner en contacto el resto de carbohidrato oxidado con un polímero soluble en agua activado en condiciones que permiten la dicho polímero soluble en agua que contiene un grupo aminooxi activo y que se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol PEG Effect ácido polisiálico almidón hidroxialquilo almidón hidroxiletilo ácido sulfato de sulfato de óxido de polialquileno polialquilenglicol polipropilenglicol poliacriloilmorf polivinilalcohol po po1ifos anhídrido de ácido anhídrido de ácido poli etiltrimetilamoniof osfato en donde el polímero soluble en agua que contiene un grupo aminooxi activo se prepara a través de un método que incubar una solución que comprende un polímero soluble en agua con un ligador de aminooxi que comprende un grupo aminooxi activo en condiciones que permiten la formación de un enlace de oxima estable entre el polímero soluble en agua y el ligador de aminooxi dichas condiciones comprenden un período de entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 24 una temperatura de entre aproximadamente 22 y aproximadamente 37 con o sin luz y con o sin formando así un polímero soluble en agua que contiene un grupo aminooxi y purificar el polímero soluble en agua que contiene un grupo aminooxi activo a través de un método seleccionado del grupo que consiste en diálisis y dicho resto de carbohidrato se oxida por incubación con un amortiguador que comprende un agente oxidante seleccionado del grupo que consiste en periodato de sodio tetraacetato de plomo y perrutenato de potasio en donde se forma un enlace de oxi a entre el resto de carbohidrato oxidado y el grupo aminooxi activo sobre el polímero soluble en y en donde dicha formación de enlace de oxi a es catalizada por un catalizador nucleofilico seleccionado del grupo que consiste en ácido ácido ácido ácido anisidina y En otra se proporciona el método anterior en donde la solución que comprende el polímero soluble en agua y el ligador de aminooxi que comprende un grupo aminooxi activo se incuba a 22 durante 2 h sin con En otra se proporciona el método anterior en donde la solución que comprende el polímero soluble en agua y el ligador de aminooxi que comprende un grupo aminooxi activo se incuba a 22 durante 2 h sin con dicho método comprende además la etapa de aumentar la temperatura de la solución hasta una temperatura de entre aproximadamente 32 y aproximadamente 37 e incubar durante otras En otra se proporciona el método anterior que comprende la etapa adicional de añadir una cantidad adicional de ligador de aminooxi que comprende un grupo aminooxi activo inmediatamente antes de aumentar la En otra se proporciona el método anterior en donde se purifica el polímero soluble en agua que contiene un grupo aminooxi activo a través de un método seleccionado del grupo que consiste en ultraf y cromatografía a una temperatura de 22 En otra se proporciona el método anterior que además comprende la etapa de purificación del polímero soluble en agua que contiene un grupo aminooxi activo a través de un método seleccionado del grupo que consiste en o cromatografía a 4 En diversas modalidades de la presente se proporciona el método anterior en donde la proteína terapéutica seleccionada del grupo que consiste en Factor IX Factor VIII Factor Vlla Factor de Von Willebrand Factor FV Factor X Factor XI Factor XII trombina proteina proteína factor tisular proteasa ADAMTS factor estimulador de factor estimulador de colonia de granulocitos interferón de alfa trombopoyetina polipéptido 1 similar angiopoyetina polipéptido 2 similar angiopoyetina polipéptido 3 similar angiopoyetina polipéptido 4 similar angiopoyetina polipéptido 5 similar angiopoyetina polipéptido 6 similar angiopoyetina polipéptido 7 similar angiopoyetina factor de crecimiento endotelial vascular activina activina activina proteina morfogénica proteina morfogénica proteina morfogénica proteina morfogénica proteina morfogénica proteina morfogénica proteina morfogénica proteina morfogénica proteina morfogénica proteina morfogénica proteina morfogénica proteina morfogénica proteina morfogénica proteina morfogénica proteina morfogénica receptor IA de proteina morfogénica receptor IB de proteina morfogénica receptor II de proteina morfogénica factor neurotrófico derivado del factor neutrófico receptor del factor neutrófico factor 1 quimiotáctico de neutrófilos inducido por neutrófilo inducido por factor 2a quimiotáctico factor 2b quimiotáctico de neutrófilos inducido por factor de crecimiento de células endoteliales endotelina factor de crecimiento atrayente de neutrófilos derivado del factor de crecimiento de fibroblastos factor de crecimiento de fibroblastos factor de crecimiento de fibroblastos factor de crecimiento de fibroblastos factor de crecimiento de fibroblastos factor de crecimiento de fibroblastos factor de crecimiento de fibroblastos factor de crecimiento de fibroblastos factor de crecimiento de fibroblastos factor de crecimiento de fibroblastos factor de crecimiento de fibroblastos factor de crecimiento de fibroblastos factor de crecimiento de fibroblastos factor de crecimiento de fibroblastos factor de crecimiento de fibroblastos factor de crecimiento de fibroblastos factor de crecimiento de fibroblastos factor de crecimiento de fibroblastos factor de crecimiento de fibroblastos receptor al de factor neutrófico derivado de linea de células receptor a2 de factor neutrófico derivado de linea de células proteina relacionada con el proteina a relacionada con el proteína b relacionada con el proteina g relacionada con el factor de crecimiento epidérmico de unión a factor de crecimiento de receptor del factor de crecimiento de factor de crecimiento derivado de factor de crecimiento I similar a receptor del factor de crecimiento similar a factor de crecimiento II similar a proteina de unión de factor de crecimiento similar a factor de crecimiento de factor inhibitorio de receptor a del factor inhibitorio de factor de crecimiento receptor del factor de crecimiento neuropoyetina oncostatina M factor de crecimiento de factor de crecimiento 2 de factor de crecimiento de célula endotelial derivada de factor de crecimiento derivado de cadena A del factor de crecimiento derivado de factor de crecimiento AA derivado de factor de crecimiento AB derivado de cadena B del factor de crecimiento derivado de factor de crecimiento BB derivado de receptor a del factor de crecimiento derivado de receptor b del factor de crecimiento derivado de factor de estimulación del crecimiento de células factor de células madres receptor del factor de células TNF2 factor de crecimiento transformante factor de crecimiento transformante factor de crecimiento transformante factor de crecimiento transformante factor de crecimiento transformante factor de crecimiento transformante factor de crecimiento transformante factor de crecimiento transformante latente proteina I de unión a factor de crecimiento transformante proteína II de unión a factor de crecimiento transformante proteína III de unión a factor de crecimiento transformante linfopoyetina estromal tímica receptor del factor de necrosis tumoral tipo receptor del factor de necrosis tumoral tipo receptor activador de plasminógeno tipo proteína activada por fosfolipasa lectina gonadot opina hormona estimulante de hormona estimulante de activador de plasminógeno de IgA y hormona transferr trombopoyetina trombina leptina Humira Prolia Enbrel una proteína en la tabla 1 o un fragmento biológicamente un derivado o variante de En otra se proporciona el método anterior en donde una solución que comprende una concentración inicial de la proteína terapéutica de entre aproximadamente y aproximadamente se ajusta a un valor de pH de entre aproximadamente y aproximadamente antes de contactarse con el polímero soluble con agua En una la concentración inicial de la proteína terapéutica es de aproximadamente y el pH es de aproximadamente En otra se proporciona el método anterior en donde la proteína terapéutica se pone en contacto con una concentración excesiva deseada de polímero soluble en agua en donde la concentración excesiva es un exceso molar de entre aproximadamente 1 y aproximadamente En una la concentración excesiva es un exceso molar de aproximadamente 50 En otra se proporciona el método anterior en donde la proteína terapéutica se incuba con el polímero soluble en agua activado en condiciones que comprenden un período de tiempo de entre aproximadamente horas y aproximadamente 24 una temperatura de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 37 con o sin y con o sin En una las condiciones comprenden un periodo de aproximadamente 120 una temperatura de aproximadamente 22 ausencia de luz y En otra se proporciona el método anterior en donde el catalizador nucleofilico se añade en una cantidad para obtener una concentración final de entre aproximadamente mM y aproximadamente 50 mM de catalizador en condiciones que comprenden un tiempo de entre aproximadamente minutos y aproximadamente 30 una temperatura de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 37 con o sin y con o sin En una la concentración final del catalizador nucleofilico es de aproximadamente 10 mM y las condiciones comprenden un periodo de hasta aproximadamente 15 una temperatura de aproximadamente 22 ausencia de luz y agitación En otra se proporciona el método anterior en donde el agente oxidante se añade en una cantidad para obtener una concentración final de entre aproximadamente 50 mM y aproximadamente 1000 mM de catalizador en condiciones que comprenden un tiempo de entre aproximadamente minutos y 120 una temperatura de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 37 con o sin y con o sin En una la concentración final del agente oxidante es de aproximadamente 400 mM y las condiciones comprenden un periodo de aproximadamente 10 una temperatura de aproximadamente 22 ausencia de luz y En otra se proporciona el método anterior en donde la conjugación del polímero soluble en agua con el resto de carbohidrato oxidado de la proteína terapéutica se detiene por el añadido de un agente de inactivación seleccionado del grupo que consiste en bisulfito de sodio meta histidina o derivados de imidazol y combinaciones de en donde el agente de inactivación se añade en una cantidad para producir una concentración final de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 100 de agente de en condiciones que comprenden un período de entre aproximadamente 5 minutos y aproximadamente 120 una temperatura de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 37 con o sin y con o sin En una el agente de inactivación es En otra se añade la para producir una concentración final de aproximadamente 10 mM y las condiciones comprenden un periodo de aproximadamente 60 una temperatura de aproximadamente 22 ausencia de luz y agitación En otra se proporciona el método mencionado anteriormente que una primera etapa que comprende ajustar el valor del pH de una solución que comprende la proteina terapéutica a un valor de pH de entre aproximadamente y aproximadamente en donde la concentración de la proteina terapéutica es de entre aproximadamente y aproximadamente una segunda etapa que comprende oxidar uno o más carbohidratos sobre la proteina en donde el agente oxidante se añade a la solución en la primera etapa para producir una concentración final de entre aproximadamente 50 mM y aproximadamente 1000 en condiciones que comprenden un periodo de entre aproximadamente minutos y aproximadamente 120 una temperatura de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 37 con o sin luz y con o sin una tercera etapa que comprende poner en contacto la proteina terapéutica con una concentración de exceso deseada de polímero soluble en agua en donde la concentración de exceso se encuentra entre aproximadamente 1 de exceso molar y aproximadamente 300 de exceso en condiciones que comprenden un periodo de entre aproximadamente horas y aproximadamente 24 una temperatura de entre 2 y aproximadamente 37 con o sin y con o sin una cuarta etapa que comprende añadir un catalizador nucleofilico a la solución de la tercera en donde el catalizador nucleofilico se añade para producir una concentración final de entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 50 en condiciones que comprenden un periodo de entre aproximadamente minutos y aproximadamente 30 una temperatura de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 37 con o sin y con o sin una quinta etapa en donde la proteina terapéutica se incuba con el polímero soluble en agua activado y catalizador nucleofilico en condiciones que permiten la conjugación del polímero soluble en agua activado con uno o más carbohidratos oxidados sobre la proteína dichas condiciones comprenden un período de entre aproximadamente horas y aproximadamente 24 una temperatura de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 37 con o sin y con o sin y una sexta etapa en donde la conjugación del polímero soluble en agua con uno o más carbohidratos oxidados de la proteina terapéutica de la quinta etapa se detiene mediante el añadido de un agente de inactivación seleccionados del grupo que consiste en Na2S205 de sodio histidina o derivados de imidazol y combinaciones de en donde el agente de inactivación se añade para producir una concentración final de entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 100 en condiciones que comprenden un periodo de entre aproximadamente 5 minutos y aproximadamente 120 una temperatura de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 37 con o sin y con o sin En otra la concentración inicial de la proteina terapéutica en la primera etapa es de aproximadamente 1 y el pH es de aproximadamente en donde la concentración final de agente oxidante en la segunda etapa es de aproximadamente 400 mM y las condiciones en la quinta etapa comprenden un periodo de aproximadamente 10 una temperatura de aproximadamente 22 la ausencia de luz y con en donde la concentración de exceso en la tercera etapa es un exceso molar de aproximadamente en donde las condiciones en la tercera etapa comprenden un periodo de aproximadamente 15 una temperatura de aproximadamente 22 la ausencia de luz y con en donde la concentración final del catalizador nucleofilico en la cuarta etapa es de aproximadamente 10 mM y las condiciones en la cuarta etapa comprenden un periodo de aproximadamente 15 una temperatura de aproximadamente 22 la ausencia de luz y con en donde las condiciones de incubación de la proteina terapéutica con el polímero soluble en agua activado y el catalizador nucleofilico en la quinta etapa comprenden un período de aproximadamente 2 una temperatura de aproximadamente 22 la ausencia de y con y en donde el agente de inactivación en la sexta etapa es y en donde la se añade para producir una concentración final de aproximadamente 10 mM y las condiciones en la sexta etapa comprenden un período de aproximadamente 60 una temperatura de aproximadamente 22 la ausencia de luz y con En otra el polímero soluble en agua es En una el polímero soluble en agua es En otra el polímero soluble en agua es En otra el polímero soluble en agua es En otra el PSA está compuesto por aproximadamente 10 300 unidades de ácido En otra la proteína terapéutica es En otra la proteina terapéutica es En otra la proteina terapéutica es En otra se proporciona el método anterior en done el agente oxidante es periodato de sodio En otra se proporciona el método anterior en donde el resto de carbohidrato oxidado de la proteina terapéutica se ubica en el péptido de activación de la proteina de coagulación de En otra se proporciona el método anterior en donde el PSA comprende un ligador aminooxi activado seleccionado del grupo que consiste un ligador de la un ligador de la y un ligador dioxiamina de la en donde el PSA se oxida por incubación con un agente oxidante para formar un grupo aldehido terminal en el extremo no reductor del En otra el ligador aminooxi es En otra se proporciona el método anterior en donde se proporciona el catalizador nucleofilico a una concentración de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 En otra el catalizador nucleofilico es En otra la está presente en la reacción de conjugación a una concentración de aproximadamente 10 En otra se proporciona el método anterior que además comprende la etapa de purificar la proteina terapéutica En una se purifica la proteina terapéutica conjugada a través de un método seleccionado del grupo que consiste en filtración y En otra la cromatografía se selecciona del grupo que consiste en cromatografía de interacción hidrofóbica cromatografía de intercambio iónico cromatografía de exclusión por tamaño cromatografía de afinidad y cromatografía de fase En una se utiliza una sal anticaotrópica en una etapa de carga de la cromatografía y en una etapa de lavado de la En otra la cromatografía se produce en una En un la columna comprende una resina de cromatografía seleccionada del grupo que consiste en arosa FF y En otra se presenta la resina en la columna a una altura de lecho de entre aproximadamente 5 cm y aproximadamente 20 En otra la altura del lecho es de aproximadamente 10 cm En otra se proporciona el método anterior que comprende una o más etapas de lavado en donde la dirección de flujo se configura de forma ascendente en la velocidad de flujo se encuentra entre aproximadamente y aproximadamente En una la velocidad de flujo es de aproximadamente 2 En otra se proporciona el método anterior que comprende una o más etapas de en donde la dirección de flujo se configura de forma descendente en la velocidad de flujo se encuentra entre aproximadamente y aproximadamente En una la velocidad de flujo es de aproximadamente 1 En otra se proporciona el método anterior que además comprende la proteína terapéutica conjugada mediante En otra se proporciona el método anterior en donde la concentración final de proteína terapéutica es de entre aproximadamente y aproximadamente 3 En otra se proporciona el método anterior en donde la proteína terapéutica comprende entre aproximadamente 5 y aproximadamente 11 restos de polímero soluble en En otra se proporciona el método anterior en donde la proteína terapéutica conjugada se purifica utilizando en donde se utiliza una sal anticaotrópica para una etapa de carga y para una etapa de el cual método comprende una o más etapas de lavado en donde la dirección de flujo se configura de forma ascendente y en donde la velocidad de flujo se encuentra entre aproximadamente y aproximadamente y una o más etapas de elución en donde la dirección del flujo se configura de forma descendente y en donde la velocidad de flujo es de entre aproximadamente y aproximadamente que además comprende concentrar la proteína terapéutica conjugada mediante En otra se proporciona el método anterior en donde la cromatografía es cromatografía de interacción hidrofóbica en donde la velocidad de flujo de la o las etapas de lavado es de aproximadamente 2 y en donde la velocidad de flujo de la o las etapas de elución es de aproximadamente 1 La presente descripción también proporciona una proteina terapéutica modificada producida a través del método mencionado En una modalidad de la presente se proporciona un método para preparar un polímero soluble en agua que contiene un grupo aminooxi activo que incubar una solución que comprende un polímero soluble en agua oxidado con un ligador de aminooxi que comprende un grupo aminooxi activo en condiciones que permiten la formación de un enlace de oxima estable entre el polímero soluble en agua oxidado y el ligador de aminooxi dichas condiciones comprenden un período de entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 24 una temperatura de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 8 con o sin luz y con o sin formando así un polímero soluble en agua que contiene un grupo aminooxi y purificar el polímero soluble en agua que contiene un grupo aminooxi activo a través de un método seleccionado del grupo que consiste en diálisis y a una temperatura de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 8 dicho polímero soluble en agua se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol PEG Effect ácido polisiálico almidón hidroxialquilo almidón hidroxiletilo polisacár ácido sulfato de sulfato de óxido de polialquileno polialquilenglicol polipropilenglicol polioxazol po1iacr polivinilalcohol polivinilpirrolidona po1ifos anhídrido de ácido anhídrido de ácido etiltrimet ilamoniofosfato mediante lo cual se forma un enlace de oxima entre el polímero soluble en agua y el ligador En otra se proporciona el método anterior en donde la formación del enlace de oxima es catalizada por un catalizador nucleofílico seleccionado del grupo que consiste en ácido ácido ácido ácido y En otra modalidad se proporciona el método anterior en donde el polímero soluble en agua es En otra se proporciona el método anterior en donde el polímero soluble en agua es En otra se proporciona el método anterior en donde la solución que comprende el polímero soluble en agua oxidado y el ligador de aminooxi que comprende un grupo aminooxi activo se incuba a 4 durante 1 h sin con En otra se proporciona el método anterior en donde el polímero soluble en agua que contiene un grupo aminooxi activo se purifica mediante cromatografía de intercambio aniónico a una temperatura de 4 En otra modalidad de la presente se proporciona un método para preparar un polímero soluble en agua que contiene un grupo aminooxi activo que incubar una solución que comprende un polímero soluble en agua con un ligador de aminooxi que comprende un grupo aminooxi activo en condiciones que permiten la formación de un enlace de oxima estable entre el polímero soluble en agua y el ligador de aminooxi dichas condiciones comprenden un período de entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 24 una temperatura de entre aproximadamente 22 y aproximadamente 37 con o sin luz y con o sin mediante lo cual se forma un polímero soluble en agua que contiene un grupo aminooxi y purificar el polímero soluble en agua que contiene un grupo aminooxi activo a través de un método seleccionado del grupo que consiste en diálisis y mediante lo cual se forma un enlace de oxima entre el polímero soluble en agua y el ligador En otra se proporciona el método anterior en donde dicha formación del enlace de oxima es catalizada por un catalizador nucleofílico seleccionado del grupo que consiste en ácido ácido ácido ácido y En otra se proporciona el método anterior en donde la solución que comprende el polímero soluble en agua y el ligador de aminooxi que comprende un grupo aminooxi activo se incuba a 22 durante 2 h sin con En otra se proporciona el método anterior en donde la solución que comprende el polímero soluble en agua y el ligador de aminooxi que comprende un grupo aminooxi activo se incuba a 22 durante 2 h sin con dicho método comprende además la etapa de aumentar la temperatura de la solución hasta una temperatura de entre aproximadamente 32 y aproximadamente 37 e incubar durante otras En otra se proporciona el método anterior que comprende la etapa adicional de añadir una cantidad adicional de ligador de aminooxi que comprende un grupo aminooxi activo inmediatamente antes de aumentar la En otra se proporciona el método anterior en donde se purifica el polímero soluble en agua que contiene un grupo aminooxi activo a través de un método seleccionado del grupo que consiste en iltración y cromatografía a una temperatura de 22 En otra se proporciona el método anterior que además comprende la etapa de purificación del polímero soluble en agua que contiene un grupo aminooxi activo a través de un método seleccionado del grupo que consiste en o cromatografía a 4 En otra modalidad de la presente se proporciona un método para preparar un grupo aminooxi de reactivo que incubar una solución que comprende un PSA oxidado con un ligador de aminooxi que comprende un grupo aminooxi activo en condiciones que permiten la formación de un enlace de oxi a estable entre el PSA oxidado y el ligador de aminooxi dichas condiciones comprenden un periodo de 1 una temperatura de 4 con o sin luz y con o sin mediante lo cual se forma un PSA que contiene un grupo aminooxi y purificar el PSA que contiene un grupo aminooxi activo a través de cromatografía de intercambio una temperatura de 4 dicho ligador aminooxi activado es un ligador de la mediante lo cual se forma un enlace de oxima entre el PSA y el ligador En otra modalidad de la presente se proporciona un método para preparar un grupo aminooxi de reactivo que incubar una solución que comprende un PSA no oxidado con un ligador de aminooxi que comprende un grupo aminooxi activo en condiciones que permiten la formación de un enlace de oxima estable entre el PSA no oxidado y el ligador de aminooxi dichas condiciones comprenden un periodo de 2 una temperatura de 22 con o sin luz y con o sin mediante lo cual se forma un PSA que contiene un grupo aminooxi y purificar el PSA que contiene un grupo aminooxi activo a través de diálisis a una temperatura de 22 dicho ligador aminooxi activado es un ligador de la mediante lo cual se forma un enlace de oxima entre el PSA no oxidado y el ligador En otra modalidad de la presente se proporciona un método para conjugar un polímero soluble en agua con un resto de carbohidrato oxidado de una proteína de coagulación sanguínea que comprende poner en contacto el resto de carbohidrato oxidado con un polímero soluble en agua activado en condiciones que permiten la dicha proteína de coagulación sanguínea se selecciona del grupo que consiste en Factor IX Factor VIII Factor Vlla Factor de Von Willebrand Factor FV Factor X Factor XI Factor XII trombina proteína proteína factor tisular y proteasa ADAMTS 13 o un fragmento biológicamente un derivado o variante de dicho polímero soluble en agua contiene un grupo aminooxi activo y se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol PEG ácido polisiálico po1isacáridos ácido sulfato de sulfato de óxido de polialquileno polialquilenglicol polipropilenglicol po1iacr polivinilalcohol pol polifos anhídrido de ácido polieti anhídrido de ácido po hidroximetiletileno etiltrimetilamoniof osfato y dicho resto de carbohidrato está oxidado por incubación con un amortiguador que comprende un agente oxidante seleccionado del grupo que consiste en periodato de sodio tetraacetato de plomo y perrutenato de potasio en donde se forma un enlace de oxima entre el resto de carbohidrato oxidado y el grupo aminooxi activo sobre el polímero soluble en agua Breve descripción de las figuras La figura 1 muestra la estructura primaria del Factor IX de coagulación ID La figura 2 muestra el acoplamiento del rFIX oxidado con La figura 3 muestra la síntesis de los ligadores solubles en agua y La figura 4 muestra la preparación de Las figuras muestran la visualización de los conjugados de preparados en presencia de diferentes catalizadores mediante SDS PAGE Comparación de anilina con utilizando diferentes Comparación de anilina con ácido ácido aminobenzoico ácido y ácido Comparación de anilina y toluidina con y La figura 6 muestra el porcentaje de polisialilación con diversos catalizadores nucleof Descripción detallada de la invención Las propiedades farmacológicas e inmunológicas de las proteínas terapéuticas se pueden mejorar mediante modificación química y conjugación con compuestos poliméricos como polietilenglicol PEG ácido polisiálico almidón de hidroxialquilo almidón de hidroxiletilo carbohidrato polisacáridos ácido sulfato de sulfato de carboximeti óxido de po1ialqui1eno polialquilenglicol polipropilenglicol poliacr alcohol polivinilico anhídrido de ácido anhídrido de ácido formal eti1trime ti1amoniofosfato Las propiedades de los conjugados resultantes generalmente dependen mucho de la estructura y del tamaño del Por lo los polímeros con una distribución de tamaño definida y estrecha se suelen preferir en la Los polímeros sintéticos como PEG se pueden fabricar fácilmente con una distribución de tamaño mientras que el PSA se puede purificar de tal manera que se obtenga una preparación de PSA final con una distribución de tamaño los reactivos de PEGilación con cadenas de polímeros definidas y distribución de tamaño estrecha se encuentran en el mercado y están disponibles a nivel comercial por un precio El añadido de un polímero por mediante es un enfoque para mejorar las propiedades de las proteínas terapéuticas como la proteína de coagulación sanguínea así como otras proteínas de coagulación FVIIa US que se incorpora al presente por y Proteínas terapéuticas En determinadas modalidades de la los polipéptidos y polinucleótidos mencionados anteriormente se ejemplifican por las siguientes proteínas proteínas de coagulación factores de hormonas y En determinadas la proteína terapéutica es una proteína de coagulación sanguínea como Factor IX Factor VIII Factor Vlla Factor de Von Willebrand Factor FV Factor X Factor XI XII trombina proteína proteína factor tisular o proteasa ADAMTS En una una proteína terapéutica de acuerdo con la invención es una glicoproteína en diversas una proteína que no es glicosilada naturalmente in vivo una proteína que no contiene un sitio de glicosilación natural o una proteína que no es glicosilada en una célula hospedadora antes de la En determinadas la proteina terapéutica es inmunoglobulinas citocinas como factor estimulante de colonias 1 factor estimulante de colonias de granulocitos interferón alfa interferón de 32 trombopoyet ina por polipéptidos de ANGPTL1 a 7 similares a la angiopoyetina factor de crecimiento endotelial vascular activina activina activina proteina morfogénica ósea proteina morfogénica ósea proteina morfogénica ósea proteina morfogénica ósea proteina morfogénica ósea proteina morfogénica ósea proteina morfogénica ósea proteina morfogénica ósea proteina morfogénica ósea proteina morfogénica ósea proteina morfogénica ósea proteina morfogénica ósea proteina morfogénica ósea proteina morfogénica ósea proteina morfogénica ósea receptor de la proteina morfogénica ósea receptor de la proteina morfogénica ósea receptor de la proteina morfogénica ósea II factor neurotrófico derivado del factor neurotrófico receptor del factor neurotrófico factor quimiotáctico de neutrófilos inducido por citocinas factor quimiotáctico de neutrófilos inducido por citocinas factor quimiotáctico de neutrófilos inducido por citocinas factor de crecimiento celular endotelial endotelina factor de crecimiento atrayente de neutrófilos derivado del factor de crecimiento de fibroblastos factor de crecimiento de fibroblastos factor de crecimiento de fibroblastos factor de crecimiento de fibroblastos factor de crecimiento de fibroblastos factor de crecimiento de fibroblastos factor de crecimiento de fibroblastos factor de crecimiento de fibroblastos factor de crecimiento de fibroblastos factor de crecimiento de fibroblastos factor de crecimiento de fibroblastos factor de crecimiento de fibroblastos factor de crecimiento de fibroblastos factor de crecimiento de fibroblastos factor de crecimiento de fibroblastos factor de crecimiento de fibroblastos factor de crecimiento de fibroblastos factor de crecimiento de fibroblastos factor de crecimiento de fibroblastos receptor del factor neurotrófico derivado de la linea celular glial receptor del factor neurotrófico derivado de la linea celular glial proteina relacionada con el proteina relacionada con el crecimiento proteina relacionada con el crecimiento proteina relacionada con el crecimiento factor de crecimiento epidérmico de unión a factor de crecimiento de receptor del factor de crecimiento de factor de crecimiento derivado de factor de crecimiento tipo insulina receptor del factor de crecimiento tipo factor de crecimiento tipo insulina proteina de unión al factor de crecimiento tipo factor de crecimiento de queratinocitos factor de inhibición de receptor del factor de inhibición de leucemia factor de crecimiento receptor del factor de crecimiento neuropoyet neurotrof neurotrof oncostatina M factor de crecimiento de la factor de crecimiento de la placenta factor de crecimiento celular endotelial derivado de factor de crecimiento derivado de factor de crecimiento derivado de plaquetas de cadena factor de crecimiento derivado de plaquetas factor de crecimiento derivado de plaquetas AB factor de crecimiento derivado de plaquetas de cadena factor de crecimiento derivado de plaquetas receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas factor de estimulación del crecimiento de precursores de linfocitos factor de células madre receptor del factor de células incluso factor de crecimiento transformante factor de crecimiento transformante factor de crecimiento transformante factor de crecimiento transformante factor de crecimiento transformante factor de crecimiento transformante factor de crecimiento transformante factor de crecimiento transformante latente proteina de unión al factor de crecimiento transformante b proteina de unión al factor de crecimiento transformante b proteina de unión al factor de crecimiento transformante b linfopoyetina estromal timica receptor del factor de necrosis tumoral tipo receptor del factor de necrosis tumoral tipo receptor del activador de plasminógeno tipo factor de crecimiento endotelial vascular y proteínas quiméricas y sus fragmentos biológica o inmunológicamente En determinadas la proteína terapéutica son interferones alfa beta y factores estimulantes de colonias incluido factores estimulantes de colonias de factores de crecimiento de factores de crecimiento derivados de proteina activadora de fosfolipasa proteínas vegetales como lectinas y factores de necrosis tumoral y alelos formas solubles de receptores de factores de necrosis receptores de interleucina y formas solubles de receptores de factores de crecimiento como factores de crecimiento como TGFa o y factores de crecimiento somatomedinas hormonas factores de liberación hipotalámico hormonas gonadotropina hormona estimulante de hormona estimulante de activador de plasminógeno de tejidos e inmunoglobulinas como IgA e una galactosidasa hormona lipoproteí trombopoyetina factores de crecimiento hematopoyético glicosidasas Humira Prolia Enbrel y fragmentos de o cualquier proteina de fusión que comprende cualquiera de las proteínas mencionadas anteriormente o fraqmentos de Además de las proteínas la siguiente tabla 1 proporciona proteínas terapéuticas contempladas por la presente O en O n o en o o o en o o o o o o o n o o o o o o n o o o o o en o o o o en o o n O en o o CP n O en O en o o n o o O O n o o en o en o en O en O o o o o C o en o o o o n n o o I n o o o o o o en o o i O o o n o o en O en o o o o en o en n o en o o en o o en o n o en o n o o en o o n o o en o n o o o en o o O o o o o O o en o o n o en o en O en o O n O 1 o O O 00 o o en o o en o en o o o en o n o n o en n O en n en o en o o n o en o o o o en o o o o n O o o n o n O en o o en en o o O O 00 C O o n O o o o o en eo n en o en o en o o o n o en e I o o n o C 00 en O n o o o O O o en n o e o en o en en en en n n O en o o n O en en en on n O o n o en o en o o O en o o cn n o O 0 t Cfl P o o O P cu CD P presente no se considerarán En cambio como es evidente a partir de la descripción proporcionada en la los métodos de la invención se pueden aplicar a cualquier proteina en donde se desea la unión de polímero soluble en agua de acuerdo con la Por las proteínas terapéuticas se describen en US que se incorpora en la presente por referencia en su Proteínas de coagulación sanguínea En un el material de partida de la presente invención es una proteína de coagulación sanguínea que puede derivar del plasma humano o puede ser producida mediante téenicas de modificación como se describe en la patente estadounidense la patente estadounidense la patente estadounidense la patente estadounidense la patente estadounidense y EP Los polipéptidos terapéuticos como las proteínas de coagulación sanguínea que incluyen Factor IX Factor VIII Factor Vlla Factor de Von Willebrand Factor FV Factor X Factor XI Factor XII trombina proteína proteína factor tisular y proteasa ADAMTS se degradan rápidamente mediante enzimas proteoliticas y se neutralizan mediante Esto reduce su semivida y el tiempo de limitando asi su eficacia Se necesitan dosis relativamente altas y una administración frecuente para alcanzar y sostener el efecto profiláctico y terapéutico deseado de estas proteínas de Como es difícil obtener una regulación de dosis adecuada y la necesidad de administraciones intravenosas frecuentes impone restricciones en la forma de vida del Según se describe en la las proteínas de coagulación sanguínea que entre Factor IX Factor VIII Factor Vlla Factor de Von Willebrand Factor FV Factor X Factor Factor XII trombina proteína proteína factor tisular y proteasa ADAMTS están contempladas por la Según se utiliza en la el término de coagulación se refiere a cualquiera de Factor IX Factor VIII Factor Vlla Factor de Von Willebrand Factor FV Factor X Factor XII trombina proteína proteína factor tisular y proteasa ADAMTS 13 que presenta actividad biológica que está asociada con esa proteina de coagulación sanguínea nativa La cascada de coagulación sanguínea está dividida en tres segmentos las vías extrínsecas y comunes et Curr Opin Hematol La cascada implica una serie de enzimas de serina proteasa y cofactores de Cuando se un precursor zimógeno inactivo se convierte en la forma activa en convierte la siguiente enzima en la cascada La vía intrínseca requiere los factores de coagulación XI y El inicio de la vía intrínseca se produce cuando quininógeno de alto peso factor XI y factor XII se exponen a una superficie cargada También se requieren iones de calcio y fosfolípidos secretados de La vía extrínseca se inicia cuando la luz vascular de los vasos sanguíneos está El factor tisular de glicoproteína de membrana se expone y luego se une al factor de circulación VII y a cantidades preexistentes pequeñas de su forma activada Le unión facilita la conversión completa de FVII a FVIIa en presencia de calcio y la conversión del factor IX al factor IXa y del factor X al factor Xa La asociación de FVIIa con factor tisular aumenta la actividad proteolítica mediante la unión de los sitios de unión de FVII para el sustrato y en más cercanos y mediante la inducción de un cambio conformacional que aumenta la actividad enzimática de La activación de FX es el punto común de las dos Junto con fosfolipido y los factores Va y Xa convierten protrombina a trombina de protrombinasa que luego escinde fibrinógeno para formar monómeros de Los monómeros se polimerizan para formar hebras de El factor XlIIa une covalentemente estas hebras entre si para formar una malla La conversión de FVII a FVIIa también se cataliza por un número de incluso factor Xla y factor Xlla Para la inhibición de la fase temprana la el inhibidor de la vía de factor tisular se dirige a un complejo de producto Factor Vlla FVII conocido como factor estable o proconvert es una glicoproteína de serina proteasa dependiente de vitamina K con un papel fundamental en la hemostasis y la coagulación Curr Protein Pept FVII se sintetiza en el hígado y se secreta como una glicoproteí na de cadena simple de 48 FVII comparte con todas las glicoproteínas de serina proteasa dependientes de vitamina una estructura de dominio de proteína similar que consiste de un dominio de ácido de extremo amino con residuos responsables de la interacción de la proteína con membranas un dominio de seria proteasa de extremo carboxi y dos dominios similares al factor de crecimiento epidérmico que contienen un sitio de unión de iones de calcio que actúa como intermediario de la interacción con el factor La carboxilasa cataliza la carboxilación de los residuos de Gla en la parte del extremo amino de la La carboxilasa depende de una forma reducida de vitamina K para su la cual se oxida a la forma Se requiere que la vitamina K epóxido reductasa convierta la forma epóxido de la vitamina K nuevamente a la forma La principal proporción de FVII circula en plasma en forma de zimógeno y la activación de esta forma provoca la escisión del enlace peptídico entre arginina 152 e isoleucina El FVIIa activado resultante consiste de una cadena ligera derivada de NH2 y una cadena pesada derivada del terminal COOH vinculadas mediante un enlace de disulfuro simple Cys 135 y Cys La cadena ligera contiene el dominio Gla de unión a la mientras que la cadena pesada contiene el dominio La concentración plasmática de FVII determinada por factores genéticos y ambientales es aproximadamente et Diferentes genotipos de FVII pueden producir diferencias varias veces en niveles medios de Los niveles plasmáticos de FVII se elevan durante el embarazo en mujeres sanas y también aumenta con la edad y son mayores en mujeres y en personas con hipertrigliceridemia FVII tiene la semivida más corta de todos los factores procoagulantes La concentración plasmática media de FVIIa es en individuos sanos y la semivida de circulación de FVIIa es relativamente larga en comparación con otros factores de La deficiencia hereditaria de FVII es un trastorno hemorrágico autosómico recesivo poco frecuente con una prevalencia estimada en 1 caso por personas en la población general et J Thromb 2004 La deficiencia de FVII adquirida de inhibidores también es muy poco También se han reportado casos con la deficiencia producida en asociación con fármacos tales como penicilinas y anticoagulantes se ha informado que la deficiencia de FVII adquirida se produce espontáneamente o con otras por ejemplo anemia con terapia de y globulina Las secuencias de polipéptidos y polinucleótidos de referencia las que tienen números de acceso en GenBank J02933 para la secuencia M13232 para la ADNc et PNAS y P08709 para la secuencia de polipéptidos referencias se incorporan a la presente en su Se ha descrito una variedad de polimorfismos de por ejemplo véase et referencia se incorpora a la presente en su Factor IX FIX es una proteina plasmática dependiente de vitamina K que participa en la vía intrínseca de la coagulación sanguínea mediante la conversión de FX a su forma activa en presencia de iones de fosfolípidos y FVII La capacidad catalítica predominante de FIX es como una serina proteasa con especificidad para un enlace de particular con La activación de FIX se produce por FXIa que provoca la escisión del péptido de activación de FIX para producir una molécula de FIX activada que comprende dos cadenas mantenidas por uno o más enlaces Los defectos en FIX son la causa de hemofilia B vinculada a X La hemofilia A y B son enfermedades heredadas caracterizadas por las deficiencias en los polipéptidos FVIII y La causa subyacente de las deficiencias es frecuentemente el resultado de las mutaciones en los genes FVIII y ambos de los cuales están ubicados en el cromosoma La terapia tradicional para las hemofilias suelen implicar la administración intravenosa de proteínas de coagulación semipurificadas o de plasma agrupadas de individuos Estas prepar ciones se pueden contaminar por virus o agentes por ejemplo priones hepatitis A y hepatitis Por lo existe la necesidad urgente de agentes terapéuticos que no requieran el uso de suero El nivel de la disminución de la actual de FIX es directamente proporcional a la gravedad de la hemofilia El tratamiento actual de hemofilia B consiste en el reemplazo de la proteína faltante por FIX recombinante o derivado de plasma terapia o tratamiento de reemplazo o sustitución de Las secuencias de polipéptidos o polinucleótidos de FIX se pueden encontrar por ejemplo en el número de acceso en la patente estadounidense y en la figura 1 ID Factor VIII El factor de coagulación VIII circula en plasma en una concentración muy lenta y se une de manera no covalente al factor de Von Willebrand Durante la FVIII se separa de VWF y actúa como un cofactor para la activación de FX mediada por factor IX activado mediante la mejora de la velocidad de la activación en presencia de calcio y fosfolípidos o membranas FVIII se sintetiza como un precursor de cadena simple de aproximadamente kD con la estructura de dominio Cuando se purifica desde el plasma de o FVIII está compuesto de una cadena pasada y una cadena ligera La masa molecular de la cadena ligera es 80 kD mientras debido a la proteólisis dentro del dominio la cadena pasada se encuentra en el intervalo de FVIII también se sintetiza como una proteina recombinante para el uso terapéutico en los trastornos hemorrágicos Se han desarrollado diversos ensayos in vitro para determinar la eficacia potencial del FVIII recombinante como medicina Estos ensayos imitan los efectos in vivo del FVIII El tratamiento de trombina in vitro de FVIII provoca un rápido aumento y una disminución posterior de su actividad según lo medido por los ensayos in Esta activación e inactivación coincide con la proteólisis limitada especifica tanto en la cadena pesada como en la cadena ligera que alteran la disponibilidad de diferentes epitopos de unión en permitiendo que FVIII se disocie de VWF y se una a una superficie de fosfolipido o alterando la capacidad de unión a determinados anticuerpos La falta o disfunción de FVIII está asociada con el trastorno hemorrágico más hemofilia El tratamiento de elección para el tratamiento de hemofilia A es la terapia de reemplazo con plasma derivada o concentrados de Los pacientes con hemofilia A severa con niveles de FVIII inferiores al 1 en se encuentran en terapia profiláctica con el objetivo de mantener FVIII por encima del 1 entre Teniendo en cuenta las semividas promedio de los diversos productos de FVIII en la este se puede lograr proporcionando FVIII de dos a tres veces a la Las secuencias de polipéptidos y polinucleótidos de referencia P00451 Gitschier J et Characterization of the human Factor VIII Vehar GH et Structure of human Factor 312 Thompson Structure and Function of the Factor VIII gene and Semin Thromb Factor de Von Willebrand El factor de Von Willebrand es una glicoproteina que circula en plasma como una serie de multí eros con un tamaño que oscila entre aproximadamente 500 y Las formas multiméricas de VWF están compuestas de subunidades de polipéptidos de 250 kD vinculadas por enlaces VWF actúa como intermedio de la adhesión plaquetaria inicial al subendotelio de la pared del vaso Solo los multimeros más largos presentan actividad Se asume que las células endoteliales secretan grandes formas poliméricas de VWF y las formas de VWF que tienen un peso molecular bajo de peso molecular surgen de la escisión Los multimeros que tienen grandes masas moleculares se almacenan en los cuerpos de de las células endoteliales y se liberan tras la VWF se sintetiza mediante las células endoteliales y los megacariocitos como que consiste en gran medida de dominios Tras la escisión del péptido se dimeriza a través de enlaces disulfuro en su región de extremo Los dimeros sirven como protómeros para la la cual está regida por enlaces disulfuro entre los extremos finales Al ensamblaje a multimeros es seguido por la remoción proteolitica de la secuencia de propéptidos et El producto de traducción primaria predicho a partir del ADNc clonado de VWF es un polipéptido precursor de residuo 2813 El consiste en un péptido señal de 22 aminoácido y un propéptido de aminoácido con el VWF maduro que comprende 2050 aminoácidos y FASEB Los defectos en VWF son causales de la enfermedad de Von Willebrand que está caracterizada por un fenotipo hemorrágico más o menos El tipo 3 de VWD es la forma más en cuyo VWF falta por y el tipo 1 de VWD se relaciona con una pérdida cuantitativa de VWF y su fenotipo puede ser muy El tipo 2 de VWD se relaciona con los defectos cualitativos de VWF y puede ser tan severo como el tipo 3 de El tipo 2 de VWD tiene muchas algunas asociadas con la pérdida o la disminución de multimeros de alto peso El tipo 2a de la enfermedad de Von Willebrand se caracteriza por una pérdida de multimeros intermedios y se caracteriza por una pérdida de multimeros del peso molecular más En la téenica se conocen otras enfermedades y trastornos relacionados con Las secuencias de polinucleótidos y aminoácidos de se encuentran disponibles en los números de acceso en GenBank y respectivamente Otras proteínas de coagulación sanguínea de acuerdo con la presente invención se describen en la Mann Thromb Polipéptidos En un el material de partida de la presente invención es una proteina o Según se describe en la el término proteina terapéutica se refiere a cualquier molécula de proteina terapéutica que presenta actividad biológica asociada con la proteina En una modalidad de i S la molécula de proteina terapéutica es una proteina de longitud Las moléculas de proteínas terapéuticas contempladas incluyen proteínas de longitud precursores de proteínas de longitud subunidades biológicamente activas o fragmentos de proteínas de longitud así como derivados biológicamente activos y variantes de cualquiera de estas formas de proteínas Por lo la proteína terapéutica incluye las que tienen una secuencia de aminoácidos que tiene más que aproximadamente el aproximadamente el 65 aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el o aproximadamente el o mayor identidad de secuencia de sobre una región de al menos aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente 400 o más con un polipéptido codificado por una 5 secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos de referencia descrita en la se unen específicamente a ej anticuerpos policlonales o monoclonales generados contra un inmunógeno que comprende una secuencia de aminoácidos de 10 referencia como se describe un fragmento inmunogénico de estos una variante modificadas de manera conservadora de De acuerdo con la presente el término terapéutica incluye cualquier 15 proteína terapéutica obtenida mediante teenología de ADN En determinadas el término comprende proteínas como se describen en la Según se utiliza en la terapéutica incluye una proteína terapéutica 20 que se origina a partir del mamífero destinado a recibir el El término también incluye proteína terapéutica transcrita de un transgen o cualquier otro ADN foráneo DNA presente en dicho Según se utiliza en la terapéutica 25 incluye una proteína de coagulación sanguínea que no se origina a partir del mamífero destinado a recibir el tratamiento Según se utiliza en la de coagulación sanguínea derivada de o incluye todas las formas de la proteína encontrada en la sangre obtenida de un mamífero que tiene la propiedad de participar en la vía de Según se utiliza en la biológicamente o biológicamente incluye cualquier derivado o variante de una molécula que tiene sustancialmente las mismas propiedades funcionales biológicas de dicha por ejemplo propiedades de la misma base por ejemplo una estructura principal peptídica o una unidad polimérica Un por ejemplo una o un es un compuesto sustancialmente similar en estructura y que tiene la misma actividad aunque en determinados casos en un grado que una molécula de origen Por una variante de polipéptido se refiere a un polipéptido que comparte una estructura sustancialmente similar y que tiene la misma actividad biológica que un polipéptido de Las variantes o análogos difieren en la composición de su secuencias de aminoácidos en comparación con el polipéptido de origen natural del cual deriva el según una o más mutaciones que implican eliminación de uno o más residuos de aminoácidos en uno o más extremos del polipéptido una o más regiones internas de la secuencia de polipéptidos de origen natural inserción o adición de uno o más aminoácidos a uno o más extremos una o del polipéptido una o más regiones internas una de la secuencia de polipéptidos de origen natural o sustitución de uno o más aminoácidos por otros aminoácidos en la secuencia de polipéptidos de origen A modo de un es un tipo de análogo y se refiere a un polipéptido que comparte la misma estructura o una sustancialmente similar que un polipéptido de referencia que se ha químicamente Un polipéptido variante es un tipo de polipéptido análogo e incluye variantes de en donde uno o más residuos de aminoácidos se añaden a una secuencia de aminoácidos de proteína terapéutica de la Las inserciones pueden estar ubicadas cualquiera de los extremos de la proteína o en ambos pueden estar posicionadas dentro de las regiones internas de la secuencia de aminoácidos de proteina Las variantes de con residuos adicionales en cualquiera de los extremos o en ambos por proteínas de fusión y proteínas que incluyen etiquetas de aminoácido u otras etiquetas de En un la molécula de proteína de coagulación sanguínea un Met especialmente cuando la molécula se expresa de forma recombinante en una célula bacteriana como En las variantes de se eliminan uno o más residuos de ácido en un polipéptido de proteína terapéutica como se describe en la Las eliminaciones se pueden llevar a cabo en uno o ambos extremos del polipéptido de proteína terapéutica con la eliminación de uno o más residuos dentro de la secuencia de aminoácidos de proteína Las variantes de por lo incluyen fragmentos de una secuencia de polipéptidos de proteína En las variantes de se eliminan uno o más residuos de aminoácido de un polipéptido de polipéptido terapéutico y se reemplazan con residuos En un las sustituciones son conservadoras de naturaleza y las sustituciones conservadoras de este tipo se conocen en la la invención abarca las sustituciones que también son no Algunas s conservadoras ejemplares se describen en 2 Worth Nueva York y se establecen a continuación Sustituciones conservadoras CARACTERISTICA DE LA CADENA LATERAL AMINOACIDO No polar Alifática A L I V P Aromática F W Contiene azufre M Limitante G Polar no Hidroxilo S T Y Amidas N Q Sulfidrilo C Limitante G Cargada positivamente K R H Cargada negativamente D E Alternativamente a1gunas sustituciones conservadoras ejemplares se establecen inmediatamente continuación Sustituciones conservadoras II RESIDUO ORIGINAL SUSTITUCIÓN EJEMPLAR Ala lie Arg Asn Asn Arg Asp Glu Cys Ser Gln Asn Glu Asp His Arg H e Leu Phe Lys Asn Met lie Phe Ala Pro Gli Ser Thr Thr Ser Trp Tyr Tyr Ser Val Ala Algunos ácidos nucleicos que codifican una proteina terapéutica de la invención por ejemplo y sin ADNc variantes polimór mutantes sintéticos y de origen natural Algunos polinucleótidos que codifican una proteina terapéutica de la invención también sin los que se hibridan específicamente en condiciones de hibridación rigurosa a un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de referencia como se describe en la presente y variantes modificadas de manera conservadora de tienen una secuencia de ácidos nucleicos que tienen más que aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el aproximadamente el o más de identidad de secuencia de sobre una región de al menos aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente 1000 o más nucleótidos la secuencia de longitud completa de 1218 nucleótidos de la proteina con una secuencia de ácidos nucleicos de referencia como se describe en la Algunas condiciones de ejemplares incluyen la hibridación a 42 en formamida al 5X 20 pH y lavado en IX SSC a 55 durante 30 Se entiende que la variación en estas condiciones ejemplares se puede realizar en base a la longitud y el contenido de nucleótido GC de las secuencias que se Las fórmulas estándar en la téenica son adecuadas para determinar las condiciones de hibridación Véase Sambroo et Molecular A Laboratory Manual Coid Spring Harbor Laboratory Un polinucleótido o secuencia de polipéptidos origen deriva típicamente de un mamífero que entre oveja o cualquier Los ácidos nucleicos y las proteínas de la invención pueden ser moléculas recombinantes heterólogas y que codifican la secuencia tipo salvaje de una variante de o de origen no Producción de proteínas terapéuticas La producción de una proteína terapéutica incluye cualquier método conocido en la técnica para la producción de ADN recombinante mediante ingeniería la introducción de ADN recombinante en células procariotas o eucariotas por ejemplo y sin electroporación o el cultivo de dichas células la expresión de la proteina de manera constitutiva o tras la y el aislamiento de dicha proteina de coagulación del método de cultivo o mediante la recolección de las células para obtener proteína terapéutica En otros la proteína terapéutica se produce mediante la expresión en un sistema hospedador procariota o eucariota adecuado caracterizado por la producción de una molécula de proteína sanguínea farmacológicamente Algunos ejemplos de células eucariotas son células de por ejemplo HEK y Una amplia variedad de vectores se utilizan para la preparación de la proteína terapéutica y se seleccionan de vectores de expresión eucariotas y Algunos ejemplos de vectores para la expresión procariota incluyen plásmidos y sin pRSET pET y en donde los promotores utilizados en vectores de expresión procariotas incluyen uno o más y sin recA o Algunos ejemplos de vectores para la expresión eucariota para la expresión en vectores y sin pYES o que utilizan promotores y sin GAL1 o para la expresión en células de vectores como y sin pMIB o que utilizan promotores como y sin limitación gp64 o y para la expresión en células de vectores como y sin limitación pADNc3 o y vectores derivados en un sistemas virales como y sin limitación virus virus virus de o que utilizan promotores como y sin limitación BPV y Administración En una una proteína terapéutica conjugada de la presente invención se puede administrar mediante por ejemplo inyección intramuscular o Para administrar composiciones que comprenden una proteína terapéutica conjugada de la presente invención a seres humanos o animales de la en un las composiciones comprenden uno o más portadores farmacéuticamente Los términos o se refieren a entidades moleculares y composiciones que son inhiben la degradación de proteina como productos de escisión y agregación y además no producen reacciones alérgicas u otras reacciones adversas cuando se administran utilizando vías conocidas en la según se describe más Algunos farmacéuticamente incluyen cualesquiera y todos los disolventes clínicamente medios de agentes antibacterianos y antifúngi agentes isotónicos y que retrasan la absorción y incluso los agentes divulgados anteriormente Según se utiliza incluye una dosis adecuada para tratar una enfermedad o trastorno o mejorar un síntoma de una enfermedad o En una incluye una dosis adecuada para tratar un mamífero que tiene un trastorno hemorrágico como se describe en la Las composiciones se pueden administrar de forma mediante inhalación por de forma rectal o mediante inyección El término parenteral como se utiliza aquí incluye inyecciones inyección intracisternal o téenicas de También se contempla la administración por inyección intramamaria intrapulmonar implante quirúrgico en un sitio las composiciones son esencialmente libres de asi como otras impurezas que pueden ser dañinas para el receptor Se puede realizar una única administración o múltiples administraciones de las composiciones con los niveles de dosis y el patrón seleccionados por el médico Para la prevención o el tratamiento de la la dosificación adecuada dependerá del tipo de enfermedad que se como se describió de la gravedad y curso de la de si se administra el fármaco para fines preventivos o de la terapia de la historia clínica del paciente y de la respuesta al fármaco y de la discreción del médico La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de una proteína terapéutica conjugada como se define en la La composición farmacéutica además puede comprender un amortiguador o excipiente farmacéuticamente La composición farmacéutica se puede utilizar para tratar los trastornos hemorrágicos definidos La composición farmacéutica de la invención puede ser una solución o un producto Las soluciones de la composición farmacéutica se pueden someter a cualquier proceso de liofili zación Como un aspecto la invención incluye kits que comprenden una composición de la invención empaquetada de una forma que facilita su uso para la administración a En una dicho kit incluye un compuesto o composición descrita en la presente una composición que comprende una proteina terapéutica empaquetada en un recipiente tal como un vaso o frasco con una etiqueta fijada al recipiente o incluida en el envase que describe el uso del compuesto o composición en la práctica del En una el kit contiene un primer recipiente que tiene una composición que comprende una proteina terapéutica conjugada y un segundo recipiente que tiene una solución de reconstitución fisiológicamente aceptable para la composición en el primer En un el compuesto o composición está empaquetada en forma de dosificación El kit además puede incluir un dispositivo adecuado para administrar la composición de acuerdo con una vía especifica de el kit contiene una etiqueta que describe el uso de la proteina terapéutica o la composición de Polímeros solubles en agua En un una molécula de derivado de proteína terapéutica una proteína terapéutica proporcionada se une a un polímero soluble en agua que entre polietilenglicol PEG ácido polisiálico almidón de hidroxialquilo almidón de hidroxiletilo polisacáridos ácido sulfato de sulfato de óxido de polialquileno po1ia1qui1englico1 polipropilenglicol poliacrilo il alcohol polivinílico polivinilpirrolidona po anhídrido de ácido anhídrido de ácido poli osfato En una modalidad de la el polímero soluble en agua consiste en molécula de ácido siálico que tiene un intervalo de peso molecular de entre 350 y entre 500 y entre 1000 y entre 1500 y entre y entre y Da y entre y El acoplamiento del polímero soluble en agua se puede llevar a cabo mediante el acoplamiento directo a la proteína o por medio de moléculas Un ejemplo de un ligador químico es MBPH de ácido que contiene una hidrazida selectiva de carbohidrato y un grupo de maleimida reactiva de sulfidrilo et J Biol Abajo se describen otros ligadores ejemplares y En una el derivado retiene la actividad funcional completa de los productos de proteína terapéutica nativa y proporciona una semivida in vivo en comparación con los productos de proteína terapéutica En otra el derivado retiene al menos el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el el 140 o el 150 por ciento de actividad biológica con respecto a la proteina de coagulación sanguínea En un aspecto las actividades biológicas del derivado y la proteína de coagulación sanguínea nativa se determinan por las proporciones de actividad cromogénica con el valor de antígeno de factor de coagulación sanguínea de coagulación sanguínea factor de coagulación En otra modalidad de la la semivida de la construcción se disminuye o aumenta 9 o 10 veces con respecto a la semivida in vivo de la proteína terapéutica Ácido siálico y PSA Los PSA consisten en polímeros homopolimeros de ácido El grupo amino secundario normalmente tiene un grupo pero en su lugar puede tener un grupo Algunos posibles sustituyentes en los grupos hidroxilo incluyen grupos sulfato y ácido Neu5Ac Estructura de ácido siálico Los PSA y mPSA generalmente comprenden polímeros lineales que consisten esencialmente en restos de ácido vinculados por enlaces glicosídicos o o combinaciones de estos enlaces y En los PSA y particularmente los enlaces glicosídicos son Dichos PSA y mPSA derivan de forma conveniente de ácidos colomínicos y se denominan en la presente y Los PSA y mPSA típicos comprenden al menos preferentemente al menos más preferentemente al menos 10 y más preferentemente al menos 20 restos de ácido acetilneuramí Por lo pueden comprender entre 2 y 300 restos de ácido preferentemente entre 5 y 200 restos de ácido acetilneuramí nico o más preferentemente entre 10 y 100 restos de ácido Los PSA y son esencialmente libres de restos de azúcar diferentes del ácido Por lo los PSA y comprenden al menos el 90 más preferentemente al menos el 95 y más preferentemente al menos el 98 de restos de ácido Cuando PSA y CA comprenden restos diferentes del ácido por en mPSA y estos preferentemente se encuentran ubicados en uno o ambos extremos de la cadena de Dichos restos por pueden ser restos derivados de los restos de ácido terminal por oxidación o Por describe dichos mPSA y mCA en los cuales la unidad de ácido terminal no reductor se convierte a un grupo aldehido mediante la reacción con periodato de WO describe dichos mPSA y mCA en los cuales la unidad de ácido terminal reductora se somete a reducción para abrir reductivamente el anillo en la unidad de ácido acetilneuramínico terminal por lo cual se forma un grupo diol seguido de la oxidación para convertir el grupo diol vecinal en un grupo aldehido Las glicoproteinas ricas en ácido siálico se unen a la selectina en seres humanos y otros Cumplen un papel importante en las infecciones por influenza en seres el ácido siálico puede ocultar los antigenos de mañosa en la superficie de las células hospedadoras o bacterias de la lectina de unión a Esto evita la activación del Los ácidos siálicos también ocultan el residuo de galactosa evitando asi la eliminación rápida de la glicoproteina por el receptor de galactosa en las células parenquimales Estructura de ácido colomínico de ácido Los ácidos colominicos subclase de son homopolimeros de ácido ilneuramínico con enlace cetosídico a y se entre por cepas particulares de Escherichia coli que poseen antígeno Los ácidos colominicos tienen muchas funciones Son importantes como un material en bruto para fármacos y Estudios comparativos in vivo con asparaginasa po1isia 1i1ada y no modificada revelaron que la polisialilación aumentó la semivida de la enzima y Biochimica Biophysica Acta 1341 Según se utiliza de ácido incluye monómeros o polímeros de ácido siálico que son solubles en una solución o suspensión acuosa y tienen poco o ningún impacto por ejemplo efectos para los mamíferos tras la administración del conjugado de proteína de coagulación sanguínea PSA en una cantidad farmacéuticamente Los polímeros se en un por tener 400 o 500 unidades de ácido En determinados se combinan diferentes unidades de ácido siálico en una En una modalidad de la la parte de ácido siálico del compuesto polisacárido es altamente hidrofilica y en otra el compuesto completo es altamente La hidrofilicidad es conferida principalmente por los grupos carboxilo pendientes de las unidades de ácido asi como los grupos La unidad de sacárido puede contener otros grupos por grupos hidroxilo o o combinaciones de Estos grupos pueden estar presentes en compuestos de sacáridos de origen natural o se pueden introducir en compuestos polisacáridos El polímero PSA de origen natural está disponible como una preparación polidispersa que muestra una amplia distribución de tamaño Sigma y alta polidispersidad Debido a que los polisacáridos usualmente se producen en bacterias con el riesgo inherente de copurificar la purificación de largas cadenas de polímero de ácido siálico puede elevar la probabilidad de un aumento del contenido de Las moléculas de PSA cortas con unidades de ácido siálico también se pueden preparar sintéticamente SH et Chem Ress DK y Linhardt Current Organic minimizando así el riesgo de niveles altos de Sin ahora se pueden fabricar preparaciones de PSA con una distribución de tamaño estrecha y baja que también son libres de Los compuestos polisacáridos de uso particular para la en un son los producidos por Algunos de estos polisacáridos de origen natural se conocen como En una los compuestos polisacáridos son sustancialmente libres de unidades de galactosa terminal Polietilengl icol y pegilación En determinados las proteínas terapéuticas se conjugan a un polímero soluble en agua mediante cualquiera de diversos métodos químicos JM et Advan Drug Delivery Rev Por en una una proteína terapéutica se modifica por la conjugación de PEG con grupos amino libres de la proteína utilizando ésteres de En otra el polímero soluble en por ejemplo se acopla a grupos SH libres utilizando la química de la aleimida o el acoplamiento de hidrazidas de PEG o aminas de PEG a restos de carbohidrato de la proteína terapéutica después de la oxidación La en un se realiza por acoplamiento directo acoplamiento mediante sistemas del polímero soluble en agua a una proteína terapéutica bajo la formación de enlaces en determinados aspectos de la presente se utilizan sistemas ligadores liberables o hidrolizables et J Biol Greenwald et J Med Chem Zhao et Bioconj Chem 51 US7259224B2 En una modalidad de la una proteina terapéutica se modifica mediante residuos de lisina a través del uso de derivados de polietilenglicol que contienen un éster de activo como succinimidil succini idil glutarato o succini idil Estos derivados reaccionan con los residuos de lisina de la proteina terapéutica en condiciones moderadas mediante la formación de un enlace amida En una modalidad de la la longitud de cadena del derivado de PEG es Otros derivados de PEG con longitudes de cadena de entre 500 y entre y superiores a hasta superiores a hasta Da o superiores a hasta se utilizan en diversas incluso estructuras lineales o ramificadas Algunos métodos alternativos para la PEGilación de grupos amino sin la conjugación química con carbonatos de PEG mediante la formación de enlaces uretano o la reacción con aldehidos o cetonas mediante la formación por aminación reductiva de enlaces amida En una modalidad de la presente una molécula de proteína terapéutica se modifica químicamente utilizando derivados de PEG que se encuentran disponibles a nivel comercial Estos derivados de PEG en aspectos alternativos tienen estructuras lineales o A continuación se indican algunos ejemplos de derivados de PEG que contienen grupos Los siguientes derivados de PEG son ejemplos no taxativos de los comerci lizados por Nektar Therapeutics véase reagent Nektar Advanced price list 1 propionato imeti l Estructura de un derivado de PEG ramificado Therapeutics de PEG ramificada Este reactivo con estructura ramificada se describe más detalladamente en Kozlowski et Algunos ejemplos no limitantes de derivados de PEG son comercializados por NOF Corporation véase Catalogue Estructura general de derivados de PEG lineal e s Cor ilo mPEG succinimidil succinato mPEG succinimidil glutarato Estructuras de derivados de PEG ramificados propano Estos derivados de propano muestran una estructura principal de glicerol con un patrón de sustitución de En la presente también se contemplan los derivados de PEG ramificados basados en estructuras de glicerol con sustitución u otras estructuras ramificadas descritas en También se contemplan los derivados de PEG con ligadores degradables según se describe en Tsubery et Biol Chem 2004 y Shechter et De manera la proteina terapéutica PEGilada de la presente invención presenta actividad combinada con una semivida in vivo FIX u otro factor de coagulación sanguínea PEGilado parece ser más resistente contra la inactivación de Hidroxialquilalmidón y hidroxietilalmidón En diversas modalidades de la presente una molécula de proteína terapéutica se modifica químicamente utilizando hidroxialquilalmidón o hidroxi 1eti1almidón o derivados de HES es un derivado de amilopectina de origen natural y se degrada por en el HES es un derivado sustituido de la amilopectina de polímero de que está presenta en el almidón de maíz en una concentración de hasta el 95 en HES presenta propiedades biológicas ventajosas y se utiliza como un agente de reemplazo de volumen de sangre y en la terapia de hemodilución en el ámbito clínico et Krankenhauspharmazie 8 y Weidler et g La amilopectina consiste en restos de en donde en la cadena principal hay enlaces glicosídicos presentes y en los sitios de ramificación se encuentran enlaces Las propiedades de esta molécula se determinan principalmente por el tipo de enlaces glicosídicos Debido al enlace se producen estructuras helicoidales con alrededor de seis monómeros de glucosa por Las propiedades fisicoquímicas así como las propiedades bioquímicas del polímero se pueden modificar mediante La introducción de un grupo hidroxietilo se puede lograr mediante hidroxietilación Al adaptar las condiciones de reacción es posible explotar la reactividad diferente del grupo hidroxi respectivo en el monómero de glucosa insustituido con respecto a una Debido a este el entendido puede influenciar el patrón de sustitución en una medida limitada HAS se refiere a un derivado de almidón que se ha sustituido por al menos un grupo Por lo el término hidroxialquilalmidón no se limita a compuestos donde el resto de carbohidrato terminal comprende los grupos hidroxialquilo R2 sino que también se refiere a compuestos en los cuales al menos un grupo hidroxi presente en cualquier ya sea en el resto de carbohidrato terminal en la parte restante de la molécula de se sustituye con un grupo hidroxialquilo R2 o El grupo alquilo puede ser un grupo alquilo lineal 0 ramificado que se puede sustituir de manera el grupo hidroxialquilo contiene entre 1 y 10 átomos de más preferentemente entre 1 y 6 átomos de más preferentemente entre 1 y 4 átomos de carbono e incluso más preferentemente átomos de por lo comprende preferentemente hidroxipropi lalmidón y en donde hidroxietilalmidón e hidroxipropilalmidón son particularmente Hidroxialquilalmidón que comprende dos o más grupos hidroxialquilo diferentes también está comprendido en la presente El al menos un grupo hidroxialquilo comprendido en HAS puede contener dos o más grupo hidroxi De acuerdo con una el al menos un grupo hidroxialquilo comprendido en HAS contiene un grupo El término HAS también incluye derivados en donde el grupo alquilo es mono o polisustituido En una el grupo alquilo está sustituido con un especialmente o con un grupo siempre y cuando el HAS permanezca soluble en el grupo hidroxi terminal de un grupo hidroxialquilo se puede esterificar o Algunos derivados de HAS se describen en que se incorpora por referencia a la presente en su totalidad Métodos de unión Una proteina terapéutica se puede unir de forma covalente a los compuestos polisacáridos a través de cualquiera de diversas téenicas conocidas por los entendidos en la En diversas aspectos de la los restos de ácido siálico se unen a un proteina FVIIa o por a través del método descrito en la patente estadounidense la cual se incorpora por Otras téenicas para el acoplamiento de PSA a polipéptidos son conocidas y se contemplan por la Por la publicación estadounidense describe la conjugación de un derivado de amina o de a la publicación estadounidense describe los derivados de PSA que contienen un grupo aldehido para la reacción con sustratos en el extremo Estas referencias se incorporan por referencia en su Diversas métodos se divulgan en la columna línea hasta la columna línea 5 de la patente estadounidense por referencia en su Algunas técnicas ejemplares incluyen un enlace a través de un enlace peptídico entre un grupo carboxilo en una de la proteína de coagulación sanguínea o el polisacárido y un grupo amina de la proteina de coagulación sanguínea o el o un enlace éster entre un grupo carboxilo de la proteína de coagulación sanguínea o el polisacárido y un grupo hidroxilo de la proteína terapéutica o el Otro enlace por el cual la proteína terapéutica se une de forma covalente al compuesto polisacárido es mediante una base Schiff entre un grupo amino libre en la proteina de coagulación sanguínea que se hace reaccionar con un grupo aldehido formado en el extremo no reductor del polisacárido mediante oxidación de periodato HJ y Lugowski J Fernandes y Gregoriadis Biochim Biophys La base Schiff en un se estabiliza mediante la reducción específica con NaCNBH3 para formar una amina Un enfoque alternativo es la generación de grupos amino libres terminales en el PSA mediante la aminación reductiva con NH4C1 después de la oxidación Se pueden utilizar reactivos bifuncionales para unir dos grupos amino o dos grupos Por el PSA que contiene un grupo amino está acoplado a grupos amino de la proteína con reactivos como BS3 se utilizan reactivos de reticulación heterobifuncionales como maleimidocaproiloxi sulfosuccinimida éster por para unir grupos amina y En otro una hidrazida de PSA se prepara y se acopla al resto de carbohidrato de la proteína después de la oxidación previa y la generación de funciones de Como se describió un grupo amina libre de la proteína terapéutica reacciona con el grupo del residuo de ácido siálico para formar un enlace peptidilo o un enlace éster se forma entre el grupo de ácido y un grupo hidroxilo u otro grupo activo adecuado en una proteína de coagulación un grupo carboxilo forma un enlace peptídico con grupo deacetilado o un grupo aldehido de una molécula de una proteína terapéutica forma una base Schiff con el grupo de un residuo de ácido el compuesto polisacárido está asociado de una forma no covalente con una proteína Por el compuesto polisacárido y el compuesto farmacéuticamente en un están vinculados mediante interacciones Otras asociaciones no covalentes incluyen interacciones electrostáticas con iones con carga opuesta que se atraen entre En diversas la proteína terapéutica está vinculada o asociada con el compuesto polisacárido en cantidades estequiométricas o En diversas o polisacáridos están vinculados con la proteína de coagulación En otras 20 o más polisacáridos están vinculados con la proteina de coagulación En diversas la proteína terapéutica se modifica para introducir sitios de glicosi1ación sitios diferentes de los sitios de glicosi1ación Dicha modificación se puede llevar a cabo utilizando téenicas biológicas moleculares estándar conocidas en la la proteína antes de la conjugación con un polímero soluble en agua mediante uno o más restos de se puede glicosilar in vivo o in Estos sitios glicosilados pueden servir como dianas para la conjugación de las proteínas con polímeros soluble en agua de patente estadounidense solicitud de patente estadounidense solicitud de patente estadounidense solicitud de patente estadounidense solicitud de patente estadounidense y DeFrees et Por una proteína que no está glicosilada naturalmente in vivo una proteína que no es una se puede modificar como se describió Enlace aminooxi En una modalidad de la la reacción de hidroxilamina o los derivados hidroxilamina con aldehidos un resto de carbohidrato que sigue la oxidación mediante periodato de para formar un grupo oxima se aplica a la preparación de conjugados de proteina de coagulación Por una glicoproteí na ej una proteína terapéutica de acuerdo con la presente primero se oxida con un agente de oxidación como periodato de sodio JA et Smith J Biol Chem y Van Lenten L y Ashwell J Biol Chem La oxidación de periodato de las glicoproteínas se basa en la reacción Malaprade clásica descrita en la oxidación de dioles vecinos con periodato para formar un grupo aldehido activo Analytical Bull Soc Chim Algunos ejemplos adicionales para dicho agente de oxidación son tetraacetato de plomo acetato de manganeso acetato de cobalto acetato de talio sulfato de cerio o perrutenato de potasio KRu04 et J Am Chem Soc Por de se entiende un compuesto oxidante suave que puede oxidar dioles vecinos en generando asi grupos aldehido activos en condiciones de reacción La segunda etapa es el acoplamiento del polímero que contiene un grupo aminooxi al resto de carbohidrato oxidado para formar un enlace En una modalidad de la esta etapa se puede llevar a cabo en presencia de cantidades catalíticas de la anilina de catalizador nucleofílico o derivados de anilina A et Dawson Bioconjugate Zeng Y et Nature Methods La catálisis de anilina acelera drásticamente la ligación de lo que permite el uso de concentraciones muy bajas de los En otra modalidad de la el enlace oxima se estabiliza mediante la reducción con NaCNBH3 para formar un enlace alcoxiamina A continuación se describen catalizadores En las siguientes referencias se puede encontrar información adicional sobre la teenología de cada una de las referencias se incorpora en su EP 1681303A1 WO of a polymer and a protein linked by an oxime linking linker compounds and their application in WO Peri F et Tetrahedron J Pozsgay J Org Chem Lees A et Vaccine y Heredia KL et Macromoecules Varios métodos de acoplamiento de un polímero soluble en agua a un ligador aminooxi se contemplan por la presente Por en la presente se describe al acoplamiento de un ligador al extremo reductor o no reductor de un polímero soluble en agua como El sitio de acoplamiento extremo reductor contra extremo no se determina por una o más condiciones tiempo y del proceso de acoplamiento así como el estado nativo contra del polímero soluble en En una un polímero soluble en agua oxidado como PSA se acopla en su extremo no reductor a un ligador aminooxi mediante la realización de la reacción de acoplamiento a una temperatura reducida entre En otra un polímero soluble en agua nativo no como PSA se acopla en su extremo reductor a un ligador aminooxi mediante la realización de la reacción de acoplamiento a una temperatura mayor entre Las modalidades mencionadas anteriormente se describen más detalladamente abajo y en los Según se describe en la la reacción de PSA oxidado con un ligador diaminooxi muestra dos una del grupo aldehido en el extremo no reductor y una en el extremo Si el PSA nativo cual no está oxidado y no contiene un grupo aldehido se hacer reaccionar con el extremo reductor a temperatura se puede observar un PSA Por lo en diversas para minimizar una reacción lateral no deseada en el extremo reductor de un polímero soluble en agua como la preparación de reactivo de ligador se realiza a una temperatura entre En otra modalidad de la presente se proporciona la derivación del PSA nativo en el extremo Según se describe en la el PSA nativo cual no está oxidado por por lo no contiene un grupo aldehido libre en su extremo no se hace reaccionar con un ligador diaminooxi a temperatura ambiente y se puede observar una derivación del PSA en su extremo Este acoplamiento se produce a través de la apertura del anillo en el extremo reductor y la formación de oxima posterior reacción lateral real descrita anteriormente y la causa de la presencia de subproducto en el reactivo Esta reacción se puede realizar con un rendimiento de PSA nativo en un grado de modificación de hasta aproximadamente el 70 Como producto la siguiente estructura se determinó por espectroscopia de 13C NMR La reacción se puede transferir a otros carbohidratos como dextrano y almidón u otros polisacár idos que contienen grupos de extremo También se contempla el uso de un catalizador nucleofílico como o Por lo en la presente se proporciona la preparación de reactivos utilizando PSA nativo sin oxidación que luego se puede utilizar para la modificación química de las proteínas Por lo en diversas modalidades de la presente se proporcionan métodos en donde las condiciones de acoplamiento temperatura de incubación de de un ligador diaminooxi a un polímero soluble en agua como PSA favorecen el acoplamiento al extremo no reductor en una en donde las condiciones de acoplamiento la incubación a temperatura de un ligador diaminooxi a un polímero soluble en agua como PSA no oxidado favorecen el acoplamiento al extremo En diversas modalidades de la el polímero soluble en agua que está vinculado de acuerdo con la teenología de aminooxi descrita en la presente a un resto de carbohidrato oxidado de una proteína terapéutica FVIIa o entre polietilenglicol PEG ácido polisiálico polisacáridos ácido sulfato de sulfato de carboximet óxido polialquileno polialquilenglicol polipropilenglicol polioxa poliacri po 1ivini1alcoho1 polifos anhídrido de ácido anhídrido de ácido poli hidroximetil osfato Catalizadores nucleofilicos Según se describe la conjugación de polímeros solubles en agua con proteínas terapéuticas se puede catalizar mediante La anilina cataliza fuertemente las reacciones acuosas de los aldehidos y las cetonas con aminas para formar iminas estables como hidrazonas y El siguiente diagrama compara una reacción de ligación de oxima sin catalizar contra la reacción de ligación de oxima catalizada con anilina ChemBioChem i producto ligación de exima para la salud asociados con anilina se desean catalizadores La presente invención proporciona derivados de anilina como catalizadores de ligación de oxima Dichos derivados de anilina entre ácido ácido ácido ácido y En una modalidad de la conocida como o se utiliza para catalizar las reacciones de conjugación descritas en la y anilina tienen propiedades físicas similares y esencialmente el mismo valor de pKa pKa pKa Los catalizadores nucleofílíeos de la invención son útiles para la ligación de oxima utilizando enlace o la formación de hidrazona utilizando química de En diversas modalidades de la el catalizador nucleofílico se proporciona en la reacción de conjugación en una concentración de 45 o 50 mM En una el catalizador nucleofilico se proporciona entre 1 y 10 En diversas modalidades de la el intervalo de pH de la reacción de conjugación es y En una el pH es entre y Purificación de proteínas conjugadas En diversas se desea la purificación de una proteína que se ha incubado con un agente de oxidación una proteína terapéutica que se ha conjugado con un polímero soluble en agua de acuerdo en la presente En la téenica se conocen numerosas técnicas de purificación que sin métodos cromatográf icos como cromatografía de intercambio cromatografía de interacción cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de afinidad o combinaciones de métodos de filtración y métodos de precipitación así como procedimientos de diálisis y cualquier combinación de las técnicas mencionadas anteriormente to Protein Purificat Enzymology Vol 463 por Burgess RR and Deutscher Academic Press Los siguientes ejemplos no pretenden ser limitantes sino solo ejemplares de modalidades específicas de la invención Ejemplos Ejemplo 1 Preparación del ligador homobifuncional Ligador Se sintetizó que contenía dos grupos aminooxi activos de acuerdo con Boturyn et en una reacción orgánica de dos etapas empleando una síntesis de aminas primarias de Gabriel modificada En la primera se hizo reaccionar una molécula de con dos moléculas de en dimeti1formamida Se preparó el producto homobifuncional deseado a partir del intermedio resultante mediante hidrazonólisis en etanol Ejemplo 2 Preparación del ligador homobifuncional Ligador homobifuncional Se sintetizó que contenía dos grupos aminooxi activos de acuerdo con Boturyn et en una reacción orgánica de dos etapas empleando una síntesis de aminas primarias de Gabriel modificada En la primera se hizo reaccionar una molécula de con dos moléculas de en Se preparó el producto homobifuncional deseado a partir del intermedio resultante mediante hidrazonólisis en Ejemplo 3 Preparación del ligador homobifuncional Ligador homobifuncional Se sintetizó que contenía dos grupos aminooxi activos de acuerdo con Boturyn et en una reacción orgánica de dos etapas empleando una síntesis de aminas primarias de Gabriel En la primera se hizo reaccionar una molécula de dicloruro dehexaetilenglicol con dos moléculas de en Se preparó el producto homobifuncional deseado a partir del intermedio resultante mediante hidrazonólisis en Ejemplo 4 Síntesis detallada del reactivo Se sintetizó dioxiamina de acuerdo con Botyryn et en una síntesis orgánica de dos etapas como se describe en el ejemplo Etapa A una solución de dicarboxiimida en 700 i de dimeti1 formamida se añadieron anhidro y Se agitó la mezcla de reacción durante 22 h a 50 Se evaporó la mezcla a sequedad a presión Se suspendió el residuo en 2 de diclorometano y se extrajo dos veces con solución acuosa saturada de NaCl L cada Se secó la capa de diclorometano sobre y se evaporó a sequedad a presión reducida y se secó en alto vacío para dar g de dicarboxidiimidenorborneno como un sólido amarillo Etapa A una solución del intermedio 1 en 800 mi de etanol se le añadieron de hidrato de hidrazina Se sometió a reflujo la mezcla de reacción durante 2 Se concentró la mezcla a la mitad del volumen de partida mediante evaporación del disolvente a presión Se filtró el precipitado que se Se evaporó la capa de etanol restante a sequedad a presión Se secó al vacio el residuo que contenía el producto bruto dioxiamina para producir Se purificó adicionalmente el producto bruto mediante cromatografía en columna de sílice elución isocrática con mezcla para proporcionar g del producto puro final dioxiamina Ejemplo 5 Preparación de Se disolvieron 1000 mg de PSA oxidado 20 obtenido del Serum Institute of India en 16 mi de 50 mM amortiguador de fosfato pH Se proporcionaron 170 mg de a la mezcla de Después de agitar durante 2 h a se añadieron mg de cianoborohidruro de sodio y se realizó la reacción durante 18 horas durante la Se sometió la mezcla de reacción a un procedimiento de afiltración utilizando una membrana con un corte de 5 kD hecho de celulosa regenerada Ejemplo 6 Preparación de empleando una etapa de purificación cromatográfica Se disolvieron 1290 mg de PSA oxidado 20 obtenido del Serum Institute of India en 25 mi de 50 mM amortiguador de fosfato pH Se proporcionaron 209 mg a la mezcla de Después de agitar durante 1 h a se añadieron 101 mg de cianoborohidruro de sodio y se realizó la reacción durante 3 Se sometió la mezcla a una etapa de cromatografía de intercambio aniónico débil empleando un gel de cromatografía Fractogel EMD DEAE de la Se diluyó la mezcla de reacción con 110 mi de amortiguador A y se cargó en una columna DEAE preequilibrada con amortiguador A a una velocidad de flujo de 1 Se lavó la columna con 20 CV de amortiguador B mM pH para retirar la libre y cianuro a una velocidad de flujo de 2 Se eluyó el reactivo con un gradiente escalonado que consistía en de amortiguador B y de amortiguador C mM 1M pH Se concentró el eluato mediante utilizando una membrana de 5 kD hecha de poliéter sulfona Se realizó la etapa de diafiltración final contra el amortiguador D mM 90 pH Se caracterizó analíticamente la preparación mediante la medición del PSA total de y los grupos aminooxi totales para determinar el grado de se determinaron la polidispersidad y la y el cianuro Ejemplo 7 Preparación de sin etapa de reducción Se disolvieron 573 mg de PSA oxidado 20 obtenido del Serum Institute of India en mi de 50 mM amortiguador de fosfato pH Se proporcionaron 94 mg a la mezcla de Después de agitar durante 5 h a se sometió la mezcla a una etapa de cromatografía de intercambio aniónico débil empleando un gel de cromatografía Fractogel EMD DEAE de la Se diluyó la mezcla de reacción con 50 de amortiguador A y se cargó en una columna DEAE preequilibrada con amortiguador A a una velocidad de flujo de 1 Se lavó la columna con 20 CV de amortiguador B mM pH para retirar la dioxiamina libre y cianuro a una velocidad de flujo de 2 Se eluyó el reactivo con un gradiente escalonado que consistía en 67 de amortiguador B y 43 de amortiguador C mM 1M pH Se concentró el eluato mediante utilizando una membrana de 5 kD hecha de poliéter sulfona Se realizó la etapa de diafiltración final contra el amortiguador D mM 90 pH Se caracterizó analíticamente la preparación mediante la medición del PSA total de y los grupos aminooxi totales para determinar el grado de se determinaron la polidispersidad y la Ejemplo 8 Preparación de sin etapa de reducción en presencia del catalizador nucleofílico Se disolvieron 573 mg de PSA oxidado 20 obtenido del Serum Institute of India en 9 mi de 50 mM amortiguador de fosfato pH Se proporcionaron 94 mg de dioxiamina a esta se añadieron mi de una solución madre de 50 mM a esta mezcla de Después de agitar durante 2 h a se sometió la mezcla a una etapa de cromatografía de intercambio aniónico débil empleando un gel de cromatografía Fractogel EMD DEAE de la Se diluyó la mezcla de reacción con 50 mi de amortiguador A y se cargó en una columna DEAE preequilibrada con amortiguador A a una velocidad de flujo de 1 Se lavó la columna con 20 CV de amortiguador B mM pH para retirar la libre y cianuro a una velocidad de flujo de 2 Se eluyó el reactivo con un gradiente escalonado que consistía en 67 de amortiguador B y 43 de amortiguador C mM 1M pH Se concentró el eluato mediante utilizando una membrana de 5 kD hecha de poliéter sulfona Se realizó la etapa de diafiltración final contra el amortiguador D mM 90 mM pH Se caracterizó analíticamente la preparación mediante la medición del PSA total de y los grupos aminooxi totales para determinar el grado de se determinaron la polidispersidad y la Ejemplo 9 Preparación de reactivo Se preparó un reactivo aminooxi PSA de acuerdo con los ejemplos 4 Después de la se congeló el producto a y se Después de la se disolvió el reactivo en el volumen adecuado de agua y se utilizó para la preparación de conjugados de a través de la modificación de Ejemplo 10 Evaluación de la eficacia de diferentes catalizadores nucleof ilicos alternativos Se incubó rFIX con periodato de reactivo en condiciones estándar rFIX en 20 mM 150 mM 5 mM pH exceso molar de reactivo de 5 100 mM utilizando diferentes catalizadores nucleofilicos ácido ácido ácido aminobenzoico ácido sulfaní 10 Se realizó la reacción durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de solución acuosa de cisteina con una concentración final de 1 mM Se determinó la eficacia de acoplamiento mediante utilizando un sistema mini de Se agregó amortiguador dodecilsulf ato de litio a las muestras y se desnaturalizaron durante 10 min a 70 Se aplicaron las muestras sobre de geles de y se ejecutaron a 150 V durante 60 se tiñeron los geles con se caracterizaron las muestras mediante el uso de un sistema que emplea un sistema de HPLC Agilent 1200 equipado con una columna Shodex KW 803 en las condiciones descritas anteriormente et Transfusión Se inyectaron 50 de las muestras sin diluir y se eluyeron isocráticamente con de solución filtrada de 20 mM 50 mM pH a una velocidad de flujo de Se registró el patrón de elución a 280 Los resultados se resumen en las figuras y 6 y en la tabla 2 de Se demostró el efecto catalítico de las diferentes Se muestra que el uso de produce resultados equivalentes que los obtenidos con la anilina Tabla 2 Ejemplo 11 Polisialilación de rFIX utilizando y toluidina como catalizador nucleofilico Método Se disolvieron mg de rFIX en mi amortiguador de pH mM 150 mM 5 mM de una solución acuosa de periodato de sodio se añadió y se incubó la mezcla de reacción durante 1 h en la oscuridad a 4 con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de de 1 M solución acuosa de se sometió la mezcla a empleando filtradores centrífugos Vivaspin 15R 10 kD para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de Se mezcló la fracción retenida que contenía rFIX con mi de una solución acuosa de y se incubó durante 30 min a temperatura Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de reactivo de 5 Se incubó esta mezcla durante h a TA en la oscuridad con agitación suave Se retiró el rFIX libre mediante cromatografía de intercambio aniónico Se diluyó la mezcla de reacción con 15 mi de amortiguador A mM 5 mM pH y se cargó en una columna de 20 mi HiPrep QFF preequilibrada con amortiguador Se eluyó la columna con amortiguador B mM 1 M 5 mM pH El rFIX libre se eluyó con una conductividad de y el conjugado de La conductividad de las fracciones que contenían el conjugado se elevó a 190 con amortiguador C mM 5M 5 mM pH y se cargó a una columna de 20 mi HiPrep Butyl FF preequilibrada con amortiguador D mM 3 M 5 mM pH Se lavó el reactivo PSA libre dentro de 5 CV de amortiguador se eluyó el conjugado con 100 de amortiguador E mM 5 mM pH Se concentraron las fracciones que contenían el conjugado mediante utilizando un filtrador centrífugo Vivaspin 15R 10 kD Se realizó la etapa de diafiltración final contra amortiguador de Ph que contenía 150 mM NaCl y 5 mM La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad cromogénica Se determinó que el conjugado mostró una actividad específica de en comparación con el rFIX Método Se disolvieron mg de rFIX en amortiguador de pH 150 mM 5 mM para obtener una concentración final de proteina de 1 mg rFIX Se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 5 mM para obtener una concentración final de 100 mM y se incubó la mezcla de reacción durante 1 hora en la oscuridad a 4 con agitación suave a pH y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de una solución acuosa de 1 M otros reactivos de para obtener una concentración final de 10 se sometió la mezcla a empleando filtradores centrífugos Vivaspin 15R 10 kD para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de Se mezcló la fracción retenida obtenida que contenía rFIX con una solución acuosa de toluidina para dar una concentración final de 10 mM y se incubó durante 30 min a temperatura Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de reactivo de 5 Se incubó la mezcla a pH durante horas a temperatura horas a 18 horas a en la oscuridad con agitación Se retiró el rFIX libre mediante cromatografía de intercambio aniónico Se diluyó la mezcla de reacción con las cantidades adecuadas de amortiguador A mM 5 mM pH para corregir la conductividad y el pH de la solución antes de cargarse en una columna de 20 mi HiPrep QFF preequilibrada con amortiguador Se eluyó la columna con amortiguador B mM 1 M 5 mM pH Se eluyó el rFIX libre mediante un gradiente escalonado con 25 de amortiguador que produjo una conductividad de en la fracción obtenida y el conjugado con un gradiente escalonado de 50 de amortiguador que produjo una conductividad de en la fracción de La conductividad del conjugado que contenía la fracción se elevó a 190 con amortiguador C mM 5 M 5 mM pH o mediante el uso de sales sulfato de acetato de y se cargó a una columna de 20 mi HiPrep Butyl FF CT o un medio HIC preequilibrada con amortiguador D mM 3 M 5 mM pH Se lavó el reactivo PSA libre dentro de 5 CV de amortiguador Se eluyó el conjugado con 100 de amortiguador E mM 5 mM pH Se concentraron las fracciones que contenían el conjugado mediante utilizando una membrana de 10 kD hecha de celulosa regenerada corte 10 Se realizó la etapa de diafiltración final contra amortiguador de pH que contenía 150 mM NaCl y 5 La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y procedimiento y la actividad cromogénica FIX y de Para el conjugado se determinó una actividad específica de 50 en comparación con el rFIX Método Se disolvieron mg de rFIX en mi de amortiguador de pH mM 150 mM 5 mM Se añadieron 531 de una solución acuosa de periodato de sodio y mi de una solución acuosa de se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de reactivo de 5 Se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de 25 de solución acuosa de cisteína 1 Se retiró el rFIX libre mediante cromatografía de intercambio aniónico Se diluyó la mezcla de reacción con 20 mi de amortiguador A mM 5 mM CaCl2 pH y se cargó en una columna de 20 mi HiPrep QFF preequilibrada con amortiguador Se eluyó la columna con amortiguador B mM 1 M 5 mM pH El rFIX libre se eluyó con una conductividad de y el conjugado de La conductividad de las fracciones que contenían el conjugado se elevó a 190 con amortiguador C mM 5 M 5 mM pH y se cargó a una columna de 20 mi HiPrep Butyl FF preequilibrada con amortiguador D mM 3 M 5 mM pH Se lavó el reactivo PSA libre dentro de 5 CV de amortiguador Se eluyó el conjugado con 100 de amortiguador E mM 5 mM pH Se concentraron las fracciones que contenían el conjugado mediante utilizando una membrana de 10 kD hecha de celulosa regenerada corte 10 Se realizó la etapa de diafiltración final contra amortiguador de pH que contenía 150 mM NaCl y 5 mM La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad cromogénica Para el conjugado se determinó una actividad específica de 50 en comparación con el rFIX se caracterizó analíticamente el conjugado mediante HPLC de exclusión por tamaño utilizando un sistema de HPLC Agilent 1200 equipado con una columna Shodex KW 803 en las condiciones descritas anteriormente et Transfusión Se demostró que la preparación no contiene FIX El conjugado consistía en 57 de producto 31 y 12 Método Se disolvieron mg de rFIX en amortiguador de pH mM 150 mM 5 mM para obtener una concentración final de proteína de 2 mg rFIX se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 5 mM en 15 minutos para dar una concentración final de 100 seguido del añadido de una solución acuosa de toluidina 50 mM para obtener una concentración final de 10 mM en un período de 30 Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de reactivo de 5 Después de la corrección del pH a se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de solución acuosa de 1 M para dar una concentración final de 10 Se retiró el rFIX libre mediante cromatografía de intercambio iónico Se diluyó la mezcla de reacción con las cantidades adecuadas de amortiguador A mM 5 mM para corregir la conductividad y el pH de la solución antes de cargarse en una columna de 20 HiPrep QFF preequilibrada con amortiguador Se eluyó la columna con amortiguador B mM 1 M 5 mM pH Se eluyó el rFIX libre mediante un gradiente escalonado con 25 de amortiguador que produjo una conductividad de en la fracción obtenida y el conjugado con un gradiente escalonado de 50 de amortiguador que produjo una conductividad de en la fracción de La conductividad del conjugado que contenía la fracción se elevó a 190 con amortiguador C mM 5 M 5 mM pH mediante el uso de sales acetato de y se cargó a una columna de 20 mi HiPrep Butyl FF o un medio HIC preequilibrada con amortiguador D mM 3 M 5 mM pH Se lavó el reactivo libre dentro de 5 CV de amortiguador se eluyó el conjugado con 100 de amortiguador E mM 5 mM pH Se concentraron las fracciones que contenían el conjugado mediante utilizando una membrana de 10 kD hecha de celulosa regenerada corte 10 Se realizó la etapa de diafiltración final contra amortiguador de pH que contenía 150 mM NaCl y 5 mM La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y procedimiento y la actividad cromogénica FIX y de Para el conjugado se determinó una actividad específica de 50 en comparación con el rFIX se caracterizó analíticamente el conjugado mediante HPLC de exclusión por tamaño utilizando un sistema de HPLC Agilent 1200 equipado con una columna Shodex KW 803 en las condiciones descritas anteriormente et Transfusión Se demostró que la preparación no contiene FIX El conjugado consistía en 57 de producto 31 y 12 Ejemplo 12 Polisialilación de rFVIII utilizando y toluidina como catalizador nucleofilico Método Se transfirieron 50 de rFVIII a amortiguador de reacción mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se diluyó para obtener una concentración de proteina de 1 A esta se añadió NaI04 para dar una concentración final de 200 Se realizó la oxidación a TA durante 30 min en la oscuridad con agitación Se inactivó la reacción con cisteina 10 durante 60 min a Se sometió la solución a una columna con un volumen de 20 mi EMD TMAE que se equilibró con amortiguador A mM 5 mM pH Se equilibró la columna con 5 CV de amortiguador Se eluyó el rFVIII oxidado con amortiguador B mM 5 mM 1M pH Se recogieron las fracciones que contenían Se determinó el contenido de proteina y se ajustó a 1 con amortiguador de reacción y se ajustó a pH mediante añadido de M por Se añadió un exceso molar de 50 veces de un reactivo con un MW de 20 kD seguido de como catalizador nucleofilico 10 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura Se retiró el exceso de reactivo mediante Se aumentó la conductividad de la mezcla de reacción a 130 mediante el añadido de un amortiguador que contenía acetato de amonio mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de 8 M acetato de pH y se cargó en una columna llena con 80 mi de Phenyl Sepharose FF preequilibrada con 50 mM M acetato de 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH se eluyó el conjugado con 50 mM de amortiguador Hepes pH que contenía 5 mM Por se recogieron las fracciones que contenían y se sometieron a mediante el uso de una membrana de 30 kD hecha de celulosa regenerada La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad cromogénica Se determinó que el conjugado rFVIII mostró una actividad específica de en comparación con el rFVIII Método Se disolvieron 58 de factor recombinante VIII derivado del proceso ADVATE en amortiguador Hepes mM mM cloruro de 5 mM cloruro de polisorbúto pH en amortiguador de reacción mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteina de Se corrigió el pH de la solución a mediante añadido por goteo de una solución acuosa de se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 40 mM en 10 minutos para dar una concentración de 200 Se realizó la reacción de oxidación durante 30 5 min a una temperatura de 2 Se detuvo la reacción mediante el añadido de una solución acuosa de en 15 minutos a 2 para dar una concentración final de 10 mM en la mezcla de reacción e incubación durante 60 5 Se purificó adicionalmente el rFVIII oxidado mediante cromatografía de intercambio aniónico sobre EMD TMAE Se diluyó la mezcla con amortiguador A mM 5 mM pH para dar una conductividad de 5 Se cargó esta solución en la columna IEX del con un volumen de columna de 10 mi utilizando una velocidad de flujo de se lavó esta columna de con 5 CV de una mezcla de amortiguador A y amortiguador B mM 5 mM M pH Se eluyó el rFVIII oxidado con una mezcla de amortiguador A y amortiguador seguido de la etapa de postelución con 5 CV de amortiguador Las etapas de elución se realizaron mediante el uso de una velocidad de flujo de se añadió el reactivo de ácido en un exceso molar de 50 veces al eluato que contenía el rFVIII oxidado purificado en un período máximo de 15 minutos con agitación Se añadió una solución acuosa de toluidina en 15 minutos para obtener una concentración final de 10 Se incubó la mezcla de reacción durante 120 10 min en la oscuridad a una temperatura de 2 con agitación Se purificó el conjugado de obtenido mediante cromatografía de interacción hidrofóbica utilizando una resina de sustitución baja Phenyl Sepharose FF empaquetada en una columna fabricada por GE Healthcare con una altura de lecho de 15 cm y un volumen de columna resultante de 81 Se agregó acetato de amonio a la mezcla de reacción mediante el añadido de 50 mM amortiguador que contenía 350 mM cloruro de 8 M acetato de 5 mM cloruro de pH Se mezclaron dos volúmenes de la mezcla de reacción con 1 volumen de acetato de amonio que contenía el sistema de amortiguador y se corrigió el valor del pH a pH mediante el añadido por goteo de una solución acuosa de NaOH Se cargó esta mezcla en una columna HIC a una velocidad de flujo de 1 seguido de una etapa de lavado utilizando 3 CV de amortiguador de equilibrio mM 350 mM cloruro de M acetato de 5 mM cloruro de pH Para la remoción de los subproductos de reacción y de la sal se realizó una segunda etapa de lavado con 5 CV de amortiguador de lavado 1 mM 3 M cloruro de 5 mM cloruro de pH en modo de flujo ascendente a una velocidad de flujo de 2 Se realizó la elución del conjugado de purificado en modo de flujo descendente utilizando un gradiente escalonado de 40 de amortiguador de lavado 2 mM M cloruro de 5 mM cloruro de pH y 60 de amortiguador de elución mM 5 mM cloruro de pH a una velocidad de flujo de 1 Se monitorizó la elución del conjugado de a UV 280 nm y se recogió el eluato que contenía el conjugado en 4 Se realizó la etapa de postelución con 3 CV de amortiguador de elución en las mismas condiciones para separar el rFVIII poco modificado no modificado del producto Por se concentró el conjugado purificado mediante utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada con un corte de peso molecular de 30 kD Se caracterizó analíticamente el conjugado preparado mediante el uso de este procedimiento a través de la medición de la proteína actividad cromogénica de FVIII y la determinación del grado de polisia 1iación mediante la medición del contenido de PSA de Para el conjugado se calculó una actividad específica y un grado de PSA Método Se transfirieron 50 mg de rFVIII a amortiguador de reacción mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de y se diluyó para obtener una concentración de proteína de 1 Se añadió un exceso molar de 50 veces de un reactivo con un MW de 20 kD seguido de toluidina como catalizador nucleofílico 10 y NaI04 400 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura se inactivó la reacción con cisteina durante 60 min a TA 10 Se aumentó la conductividad de la mezcla de reacción a 130 mediante el añadido de un amortiguador que contenía acetato de amonio mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de 8 M acetato de pH y se cargó en una columna llena con 80 mi de Phenyl Sepharose FF preequilibrada con 50 mM M acetato de 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de Tween pH se eluyó el conjugado con 50 mM 5 mM cloruro de pH Por se recogieron las fracciones que contenían rFVIII y se sometieron a mediante el uso de una membrana de 30 kD hecha de celulosa regenerada La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad cromogénica Para el conjugado se determinó una actividad específica de en comparación con el rFVIII Método Se disolvieron 50 mg de factor recombinante VIII derivado del proceso ADVATE en 50 mM amortiguador Hepes mM mM cloruro de 5 mM cloruro de polisorbato pH en amortiguador de reacción mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteina de Se corrigió el pH de la solución a mediante añadido por goteo de una solución acuosa de se añadió el reactivo de ácido en un exceso molar de 50 veces a la solución de rFVIII en un periodo máximo de 15 minutos con agitación Se añadió una solución acuosa de en 15 minutos para obtener una concentración final de 10 Por se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 40 mM para dar una concentración de 400 Se incubó la mezcla de reacción durante 120 10 min en la oscuridad a una temperatura de 2 con agitación Se detuvo la reacción mediante el añadido de una solución acuosa de para dar una concentración final de 10 en la mezcla de reacción e incubación durante 60 5 Se purificó el conjugado de obtenido mediante cromatografía de interacción hidrofóbica utilizando una resina de sustitución baja Phenyl Sepharose FF empaquetada en una columna fabricada por GE Healthcare con una altura de lecho de 15 cm y un volumen de columna resultante de 81 Se agregó acetato de amonio a la mezcla de reacción mediante el añadido de 50 mM amortiguador que contenía 350 cloruro de 8 M acetato de 5 mM cloruro de pH Se mezclaron dos volúmenes de la mezcla de reacción con 1 volumen de acetato de amonio que contenía el sistema de amortiguador y se corrigió el valor del pH a pH mediante el añadido por goteo de una solución acuosa de NaOH Se cargó esta mezcla en una columna HIC a una velocidad de flujo de 1 seguido de una etapa de lavado utilizando 3 CV de amortiguador de equilibrio mM 350 mM cloruro de M acetato de 5 mM cloruro de pH Para la remoción de los subproductos de reacción y de la sal se realizó una segunda etapa de lavado con 5 CV de amortiguador de lavado 1 mM 3 M cloruro de 5 mM cloruro de pH en modo de flujo ascendente a una velocidad de flujo de 2 Se realizó la elución del conjugado de rFVIII purificado en modo de flujo descendente utilizando un gradiente escalonado de 40 de amortiguador de lavado 2 mM M cloruro de 5 mM cloruro de pH y 60 de amortiguador de elución mM 5 mM cloruro de pH a una velocidad de flujo de 1 Se monitorizó la elución del conjugado de a UV 280 y se recogió el eluato que contenía el conjugado en 4 Se realizó la etapa de postelución con 3 CV de amortiguador de elución en las mismas condiciones para separar el rFVIII poco modificado no modificado del producto Por se concentró el conjugado purificado mediante ón utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada con un corte de peso molecular de 30 kD Se caracterizaron analíticamente los conjugados preparados mediante el uso de este procedimiento a través de la medición de la proteína actividad cromogénica de FVIII y la determinación del grado de po1isia 1iación mediante la medición del contenido de PSA de Datos analíticos de 6 lotes consecutivos Rendimiento del proceso Rendimiento del proceso Actividad mg 4148 Actividad especifica de material de Grado de PSA Ejemplo 13 PEGilación de r FVIII utilizando un reactivo PEG y como catalizador nucleofilico Método Se realizó la PEGilación de rFVlll mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright de NOF Se disolvieron mg de rFVIII en mi de amortiguador de pH mM 150 mM 5 mM 296 de una solución acuosa de periodato de sodio se añadió y se incubó la mezcla de reacción durante 1 h en la oscuridad a 4 con agitación suave y se inactivó durante 15 a temperatura ambiente mediante el añadido de de 1 M solución acuosa de se sometió la mezcla a empleando filtradores centrífugos Vivaspin 15R 10 kD para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de Se mezcló la fracción retenida que contenia rFVIII con mi de una solución acuosa de y se incubó durante 30 min a temperatura Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de reactivo de 5 Se incubó esta mezcla durante h a temperatura ambiente en la oscuridad con agitación suave Por se purificó el conjugado de mediante cromatografía de intercambio iónico sobre Q Sepharose Se cargaron mg de gel en la columna equilibrada con 50 mM amortiguador pH que contenía 5 mM Se eluyó el conjugado con 50 mM amortiguador Hepes que contenía 5 mM CaCl2 y 500 mM cloruro de pH y se sometió a utilizando una membrana de 30 kD La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad cromogénica Se espera que el conjugado de demuestre una actividad específica de en comparación con el rFVIII Método Se realizó la PEGilación de rFVIII mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se disolvió un peso o concentración de partida de rFVIII o se transfirió a un amortiguador de reacción mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para producir una concentración final de proteína de Se corrigió el pH de la solución a mediante añadido por goteo de una solución acuosa de se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 40 M en 10 minutos para dar una concentración de 200 Se realizó la reacción de oxidación durante 30 min a una temperatura de 2 Se detuvo la reacción mediante el añadido de una solución acuosa de en 15 minutos a 2 para dar una concentración final de 10 mM en la mezcla de reacción e incubación durante 60 5 Se purificó adicionalmente el rFVIII oxidado mediante cromatografía de intercambio aniónico sobre EMD TMAE Se diluyó la mezcla con amortiguador A mM 5 mM pH para dar una conductividad de 5 Se cargó esta solución en la columna IEX del con un volumen de columna de 10 mi utilizando una velocidad de flujo de 1 5 se lavó esta columna de con 5 CV de una mezcla de amortiguador A y amortiguador B mM 5 M pH Se eluyó el rFVIII oxidado con una mezcla de amortiguador A y amortiguador seguido de la etapa de postelución con 5 CV de amortiguador Las etapas de elución se realizaron mediante el uso de una velocidad de flujo de se añadió el reactivo de PEG con un MW de 20 kD en un exceso molar de 50 veces al eluato que contenía el rFVIII oxidado purificado en un período máximo de 15 minutos con agitación Se añadió una solución acuosa de en 15 minutos para obtener una concentración final de 10 Se incubó la mezcla de reacción durante 120 10 min en la oscuridad a una temperatura de 2 con agitación Se purificó el conjugado de obtenido mediante cromatografía de interacción hidrofóbica utilizando una resina de sustitución baja Phenyl Sepharose FF empaquetada en una columna fabricada por GE Healthcare con una altura de lecho de 15 cm y un volumen de columna resultante de 81 mi Se agregó acetato de amonio a la mezcla de reacción mediante el añadido de 50 mM amortiguador que contenía 350 mM cloruro de 8 M acetato de 5 mM cloruro de pH Se mezclaron dos volúmenes de la mezcla de reacción con 1 volumen de acetato de amonio que contenía el sistema de amortiguador y se corrigió el valor del pH a pH mediante el añadido por goteo de una solución acuosa de NaOH Se cargó esta mezcla en una columna HIC a una velocidad de flujo de 1 seguido de una etapa de lavado utilizando 3 CV de amortiguador de equilibrio mM 350 mM cloruro de M acetato de 5 mM cloruro de pH Para la remoción de los subproductos de reacción y de la sal se realizó una segunda etapa de lavado con 5 CV de amortiguador de lavado 1 mM 3 M cloruro de 5 mM cloruro de pH en modo de flujo ascendente a una velocidad de flujo de 2 Se realizó la elución del conjugado de rFVIII purificado en modo de flujo descendente utilizando un gradiente escalonado de 40 de amortiguador de lavado 2 mM M cloruro de 5 mM cloruro de pH y 60 de amortiguador de elución mM 5 mM cloruro de pH a una velocidad de flujo de Se monitorizó la elución del conjugado de a UV 280 nm y se recogió el eluato que contenía el conjugado en 4 Se realizó la etapa de postelución con 3 CV de amortiguador de elución en las mismas condiciones para separar el rFVIII poco modificado no modificado del producto Por se concentró el conjugado purificado mediante utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada con un corte de peso molecular de 30 kD Se caracterizó analíticamente el conjugado preparado mediante el uso de este procedimiento mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la téenica Método Se realizó la PEGilación de rFVIII mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se mezclaron de disueltos en 6 mi de amortiguador Hepes mM 150 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH con 314 de una solución acuosa de periodato de sodio y mi de una solución acuosa de se añadió el reactivo aminooxi para dar un exceso molar de 20 veces de Se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de 8 de solución acuosa de cisteina Por se purificó el conjugado de mediante cromatografía de intercambio iónico sobre Sepharose Se cargaron mg de gel en la columna preequilibrada con 50 mM amortiguador pH que contenía 5 mM Se eluyó el conjugado con 50 mM amortiguador Hepes que contenía 5 mM CaCl2 y 500 mM cloruro de pH y se sometió a utilizando una membrana de 30 kD La caracterización analítica del conjugado mediante ensayo cromogénico de FVIII y la determinación de proteína total muestra una actividad específica de en comparación con el material de partida Método Se realizó la PEGilación de rFVIII mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se transfirió una concentración o peso inicial de rFVIII o se disolvió en amortiguador Hepes mM 150 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteina de 2 mg rFVIII se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 5 mM en 15 minutos para dar una concentración final de 100 seguido del añadido de una solución acuosa de toluidina 50 mM para obtener una concentración final de 10 mM en un periodo de 30 Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de 20 Después de la corrección del pH a se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de solución acuosa de cisteína 1 M para dar una concentración final de 10 Se retiró el rFVIII libre mediante cromatografía de intercambio iónico Se diluyó la mezcla de reacción con las cantidades adecuadas de amortiguador A mM 5 mM pH para corregir la conductividad y el pH de la solución antes de cargarse en una columna de 20 mi HiPrep QFF preequilibrada con amortiguador Se eluyó la columna con amortiguador B mM 1 M 5 mM pH Se eluyó el rFVIII libre mediante un gradiente escalonado con 25 de amortiguador que produjo una conductividad de en la fracción obtenida y el conjugado con un gradiente escalonado de 50 de amortiguador que produjo una conductividad de en la fracción de La conductividad del conjugado que contenia la fracción se elevó con amortiguador C mM 5 M 5 mM pH mediante el uso de sales anticaotrópicas ej acetato de sulfato de y se cargó a una columna de 20 mi HiPrep Butyl FF o un medio HIC preequilibrada con amortiguador D mM 3 M 5 mM pH Se lavó el libre dentro de 5 CV de amortiguador Se eluyó el conjugado con 100 de amortiguador E mM 5 mM pH Se concentraron las fracciones que contenían el conjugado mediante utilizando una membrana de 10 kD hecha de celulosa regenerada corte 10 Se realizó la etapa de diafiltración final contra el amortiguador Hepes mM 5 mM pH La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y procedimiento y la actividad biológica de acuerdo con los métodos Ejemplo 14 Polisialilación de rFVIIa utilizando y toluidina como catalizador nucleofilico Método Se transfirió o se disolvió una concentración o peso de partida de factor Vlla recombinante en amortiguador de reacción mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para producir una concentración final de proteína de Se corrigió el pH de la solución a mediante añadido por goteo de una solución acuosa de NaOH se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 40 mM en 10 minutos para dar una concentración de 50 m Se realizó la reacción de oxidación durante 30 5 min a una temperatura de 2 Se detuvo la reacción mediante el añadido de una solución acuosa de en 15 minutos a 2 para dar una concentración final de 10 mM en la mezcla de reacción e incubación durante 60 5 Se purificó adicionalmente el rFVIIa oxidado mediante cromatografía de intercambio aniónico sobre EMD TMAE Se diluyó la mezcla con amortiguador A mM 5 mM pH para dar una conductividad de 5 Se cargó esta solución en la columna IEX del c con un volumen de columna de 10 mi utilizando una velocidad de flujo de se lavó esta columna de con 5 CV de una mezcla de amortiguador A y amortiguador B mM 5 mM M pH Se eluyó el rFVIIa oxidado con una mezcla de amortiguador A y amortiguador seguido de la etapa de postelución con 5 CV de amortiguador Las etapas de elución se realizaron mediante el uso de una velocidad de flujo de se añadió el reactivo de ácido en un exceso molar de 50 veces al eluato que contenia el rFVIIa oxidado purificado en un periodo máximo de 15 minutos con agitación Se añadió una solución acuosa de toluidina en 15 minutos para obtener una concentración final de 10 Se incubó la mezcla de reacción durante 120 10 min en la oscuridad a una temperatura de 2 con agitagión Se purificó el conjugado de obtenido mediante cromatografía de interacción hidrofóbica utilizando una resina de sustitución baja Phenyl Sepharose FF empaquetada en una columna fabricada por GE Healthcare con una altura de lecho de 15 cm y un volumen de columna resultante de 81 mi Se agregó acetato de amonio a la mezcla de reacción mediante el añadido de 50 mM amortiguador que contenía 350 mM cloruro de 8 M acetato de 5 mM cloruro de pH Se mezclaron dos volúmenes de la mezcla de reacción con 1 volumen de acetato de amonio que contenía el sistema de amortiguador y se corrigió el valor del pH a pH mediante el añadido por goteo de una solución acuosa de NaOH Se cargó esta mezcla en una columna HIC a una velocidad de flujo de 1 seguido de una etapa de lavado utilizando 3 CV de amortiguador de equilibrio mM 350 mM cloruro de M acetato de 5 mM cloruro de pH Para la remoción de los subproductos de reacción y de la sal se realizó una segunda etapa de lavado con 5 CV de amortiguador de lavado 1 mM 3 M cloruro de 5 mM cloruro de pH en modo de flujo ascendente a una velocidad de flujo de 2 Se realizó la elución del conjugado de rFVIIa purificado en modo de flujo descendente utilizando un gradiente escalonado de 40 de amortiguador de lavado 2 mM M cloruro de 5 mM cloruro de pH y 60 de amortiguador de elución 5 mM cloruro de pH a una velocidad de flujo de 1 Se monitorizó la elución del conjugado de a UV 280 nm y se recogió el eluato que contenia el conjugado en 4 Se realizó la etapa de postelución con 3 CV de amortiguador de elución en las mismas condiciones para separar el rFVIIa poco modificado no modificado del producto Por se concentró el conjugado purificado mediante utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada con un corte de peso molecular adecuado 10 kD 88 Se caracterizó analíticamente el conjugado preparado mediante el uso de este procedimiento a través de la medición de la proteína actividad biológica y la determinación del grado de polisialiación mediante la medición del contenido de PSA de Método Se disolvió un peso o concentración de partida de rFVIIa o se transfirió a un amortiguador de reacción mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para producir una concentración final de proteína de Se corrigió el pH de la solución a mediante añadido por goteo de una solución acuosa de NaOH se añadió el reactivo de ácido en un exceso molar de 50 veces a la solución de rFVIIa en un periodo máximo de 15 minutos con agitación Se añadió una solución acuosa de en 15 minutos para obtener una concentración final de 10 Por se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 40 mM para dar una concentración de 150 Se incubó la mezcla de reacción durante 120 10 min en la oscuridad a una temperatura de 2 con agitación Se detuvo la reacción mediante el añadido de una solución acuosa de para dar una concentración final de 10 mM en la mezcla de reacción e incubación durante 60 5 Se purificó el conjugado de obtenido mediante cromatografía de interacción hidrofóbica utilizando una resina de sustitución baja Phenyl Sepharose FF empaquetada en una columna fabricada por GE Healthcare con una altura de lecho de 15 cm y un volumen de columna resultante de 81 mi Se agregó acetato de amonio a la mezcla de reacción mediante el añadido de 50 mM amortiguador que contenía 350 mM cloruro de 8 M acetato de 5 mM cloruro de pH Se mezclaron dos volúmenes de la mezcla de reacción con 1 volumen de acetato de amonio que contenía el sistema de amortiguador y se corrigió el valor del pH a pH mediante el añadido por goteo de una solución acuosa de NaOH Se cargó esta mezcla en una columna HIC a una velocidad de flujo de 1 seguido de una etapa de lavado utilizando 3 CV de amortiguador de equilibrio mM 350 mM cloruro de M acetato de 5 mM cloruro de pH Para la remoción de los subproductos de reacción y de la sal se realizó una segunda etapa de lavado con 5 CV de amortiguador de lavado 1 mM 3 M cloruro de 5 mM cloruro de pH en modo de flujo ascendente a una velocidad de flujo de 2 Se realizó la elución del conjugado de rFVIIa purificado en modo de flujo descendente utilizando un gradiente escalonado de 40 de amortiguador de lavado 2 mM M cloruro de 5 mM cloruro de pH y 60 de amortiguador de elución mM 5 mM cloruro de pH a una velocidad de flujo de 1 Se monitorizó la elución del conjugado de a UV 280 nm y se recogió el eluato que contenía el conjugado en 4 Se realizó la etapa de postelución con 3 CV de amortiguador de elución en las mismas condiciones para separar el rFVIII poco modificado no modificado del producto Por se concentró el conjugado purificado mediante utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada Se caracterizaron analíticamente los conjugados preparados mediante el uso de este procedimiento a través de la medición de la proteína actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la téenica y la determinación del grado de polisialiación mediante la medición del contenido de PSA de resorcinol Ejemplo 15 PEGilación de rFIX utilizando un reactivo y como catalizador nucleofílico Método Se realizó la PEGilación de rFIX mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se disolvió un peso o concentración de partida de rFIX o se transfirió a un amortiguador de reacción 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para producir una concentración final de proteina de Se corrigió el pH de la solución a mediante añadido por goteo de una solución acuosa de se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 40 mM en 10 minutos para dar una concentración de 200 Se realizó la reacción de oxidación durante 30 5 min a una temperatura de 2 Se detuvo la reacción mediante el añadido de una solución acuosa de en 15 minutos a 2 para dar una concentración final de 10 mM en la mezcla de reacción e incubación durante 60 5 Se purificó adicionalmente el rFVIII oxidado mediante cromatografía de intercambio aniónico sobre EMD TMAE Se diluyó la mezcla con amortiguador A mM 5 mM pH para dar una conductividad de 5 Se cargó esta solución en la columna IEX del con un volumen de columna de 10 mi utilizando una velocidad de flujo de se lavó esta columna de con 5 CV de una mezcla de amortiguador A y amortiguador B 5 mM M pH Se eluyó el rFIX oxidado con una mezcla de amortiguador A y amortiguador seguido de la etapa de postelución con 5 CV de amortiguador Las etapas de elución se realizaron mediante el uso de una velocidad de flujo de se añadió el reactivo de PEG con un de 20 kD en un exceso molar de 50 veces al eluato que contenía el rFIX oxidado purificado en un período máximo de 15 minutos con agitación Se añadió una solución acuosa de en 15 minutos para obtener una concentración final de 10 Se incubó la mezcla de reacción durante 120 10 en la oscuridad a una temperatura de 2 con agitación Se purificó el conjugado de obtenido mediante cromatografía de interacción hidrofóbica utilizando una resina de sustitución baja Phenyl Sepharose FF empaquetada en una columna fabricada por GE Healthcare con una altura de lecho de 15 cm y un volumen de columna resultante de 81 Se agregó acetato de amonio a la mezcla de reacción mediante el añadido de 50 mM amortiguador que contenía 350 mM cloruro de 8 M acetato de 5 rtiM cloruro de pH Se mezclaron dos volúmenes de la mezcla de reacción con 1 volumen de acetato de amonio que contenía el sistema de amortiguador y se corrigió el valor del pH a pH mediante el añadido por goteo de una solución acuosa de NaOH Se cargó esta mezcla en una columna HIC a una velocidad de flujo de 1 seguido de una etapa de lavado utilizando 3 CV de amortiguador de equilibrio mM 350 mM cloruro de M acetato de 5 mM cloruro de pH Para la remoción de los subproductos de reacción y de la sal se realizó una segunda etapa de lavado con 5 CV de amortiguador de lavado 1 3 M cloruro de 5 mM cloruro de pH en modo de flujo ascendente a una velocidad de flujo de 2 Se realizó la elución del conjugado de rFIX purificado en modo de flujo descendente utilizando un gradiente escalonado de 40 de amortiguador de lavado 2 mM M cloruro de 5 mM cloruro de pH y 60 de amortiguador de elución mM 5 mM cloruro de pH a una velocidad de flujo de 1 Se monitorizó la elución del conjugado de a UV 280 nm y se recogió el eluato que contenía el conjugado en 4 Se realizó la etapa de postelución con 3 CV de amortiguador de elución en las mismas condiciones para separar el rFIX poco modificado no modificado del producto Por se concentró el conjugado purificado mediante utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada con un corte de peso molecular de 10 kD Se caracterizó analíticamente el conjugado preparado mediante el uso de este procedimiento mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la téenica Método Se realizó la PEGilación de rFIX mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se transfirió una concentración o peso inicial de rFIX o se disolvió en amortiguador Hepes 150 M cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteina de 2 mg rFIX se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 5 mM en 15 minutos para dar una concentración final de 100 seguido del añadido de una solución acuosa de 50 mM para obtener una concentración final de 10 mM en un periodo de 30 Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de 20 veces de Después de la corrección del pH a se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de solución acuosa de 1 M para dar una concentración final de 10 Se retiró el rFIX libre mediante cromatografía de intercambio iónico Se diluyó la mezcla de reacción con las cantidades adecuadas de amortiguador A 5 mM pH para corregir la conductividad y el pH de la solución antes de cargarse en una columna de 20 mi HiPrep QFF preequilibrada con amortiguador Se eluyó la columna con amortiguador B mM 1 M 5 mM pH Se eluyó el rFIX libre mediante un gradiente escalonado con 25 de amortiguador que produjo una conductividad de en la fracción obtenida y el conjugado con un gradiente escalonado de 50 de amortiguador que produjo una conductividad de en la fracción de La conductividad del conjugado que contenía la fracción se elevó con amortiguador C mM 5 M 5 mM pH mediante el uso de sales anticaotrópicas acetato de y se cargó a una columna de 20 HiPrep Butyl FF o un medio HIC preequilibrada con amortiguador D mM 3 M 5 mM pH Se lavó el reactivo PEG libre dentro de 5 CV de amortiguador Se eluyó el conjugado con 100 de amortiguador E mM 5 mM pH Se concentraron las fracciones que contenían el conjugado mediante utilizando una membrana de 10 kD hecha de celulosa regenerada corte 10 Se realizó la etapa de diafiltración final contra el amortiguador Hepes mM 5 mM pH La se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y procedimiento y la actividad biológica de acuerdo con los métodos Ejemplo 16 PEGilación de rFVIIa utilizando un reactivo y como catalizador nucleofilico Método Se realizó la PEGilación de rFVIIa mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenia un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se disolvió un peso o concentración de partida de rFVIIa o se transfirió a un amortiguador de reacción mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para producir una concentración final de proteina de Se corrigió el pH de la solución a mediante añadido por goteo de una solución acuosa de NaOH se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 40 mM en 10 minutos para dar una concentración de 50 Se realizó la reacción de oxidación durante 30 5 min a una temperatura de 2 Se detuvo la reacción mediante el añadido de una solución acuosa de en 15 minutos a 2 para dar una concentración final de 10 mM en la mezcla de reacción e incubación durante 60 5 Se purificó adicionalmente el rFVIIa oxidado mediante cromatografía de intercambio aniónico sobre EMD TMAE Se diluyó la mezcla con amortiguador A M 5 mM pH para dar una conductividad de 5 Se cargó esta solución en la columna IEX del con un volumen de columna de 10 mi utilizando una velocidad de flujo de se lavó esta columna de con 5 CV de una mezcla de amortiguador A y amortiguador B mM He 5 mM M pH Se eluyó el rFVIIa oxidado con una mezcla de amortiguador A y amortiguador seguido de la etapa de postelución con 5 CV de amortiguador Las etapas de elución se realizaron mediante el uso de una velocidad de flujo de se añadió el reactivo de PEG con un MW de 20 kD en un exceso molar de 50 veces al eluato que contenía el rFVIIa oxidado purificado en un período máximo de 15 minutos con agitación Se añadió una solución acuosa de en 15 minutos para obtener una concentración final de 10 Se incubó la mezcla de reacción durante 120 10 min en la oscuridad a una temperatura de 2 con agitación Se purificó el conjugado de obtenido mediante cromatografía de interacción hidrofóbica utilizando una resina de sustitución baja Phenyl Sepharose FF empaquetada en una columna fabricada por GE Healthcare con una altura de lecho de 15 cm y un volumen de columna resultante de 81 mi Se agregó acetato de amonio a la mezcla de reacción mediante el añadido de 50 m amortiguador que contenía 350 mM cloruro de 8 M acetato de 5 mM cloruro de pH Se mezclaron dos volúmenes de la mezcla de reacción con 1 volumen de acetato de amonio que contenía el sistema de amortiguador y se corrigió el valor del pH a pH mediante el añadido por goteo de una solución acuosa de NaOH Se cargó esta mezcla en una columna HIC a una velocidad de flujo de 1 seguido de una etapa de lavado utilizando 3 CV de amortiguador de equilibrio mM 350 mM cloruro de M acetato de 5 mM cloruro de pH Para la remoción de los subproductos de reacción y de la sal se realizó una segunda etapa de lavado con 5 CV de amortiguador de lavado 1 mM 3 M cloruro de 5 mM cloruro de pH en modo de flujo ascendente a una velocidad de flujo de 2 Se realizó la elución del conjugado de rFVIIa purificado en modo de flujo descendente utilizando un gradiente escalonado de 40 de amortiguador de lavado 2 mM M cloruro de 5 mM cloruro de pH y 60 de amortiguador de elución mM 5 mM cloruro de pH a una velocidad de flujo de 1 Se monitorizó la elución del conjugado de a UV 280 nm y se recogió el eluato que contenia el conjugado en 4 Se realizó la etapa de postelución con 3 CV de amortiguador de elución en las mismas condiciones para separar el rFVIIa poco modificado no modificado del producto Por se concentró el conjugado purificado mediante utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada con un corte de peso molecular de 10 kD Se caracterizó analíticamente el conjugado preparado mediante el uso de este procedimiento mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la téenica Método Se realizó la PEGilación de rFVIIa mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se transfirió una concentración o peso inicial de rFVIIa o se disolvió en amortiguador Hepes mM 150 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteina de 2 mg rFVIIa se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 5 mM en 15 minutos para dar una concentración final de 100 seguido del añadido de una solución acuosa de toluidina 50 mM para obtener una concentración final de 10 mM en un periodo de 30 Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de 20 veces de Después de la corrección del pH a se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de solución acuosa de 1 M para dar una concentración final de 10 Se retiró el rFVIIa libre mediante cromatografía de intercambio iónico Se diluyó la mezcla de reacción con las cantidades adecuadas de amortiguador A mM 5 mM pH para corregir la conductividad y el pH de la solución antes de cargarse en una columna de 20 mi HiPrep QFF preequilibrada con amortiguador Se eluyó la columna con amortiguador B mM 1 M 5 mM pH Se eluyó el rFVIIa libre mediante un gradiente escalonado con 25 de amortiguador que produjo una conductividad de en la fracción obtenida y el conjugado con un gradiente escalonado de 50 de amortiguador que produjo una conductividad de en la fracción de La conductividad del conjugado que contenia la fracción se elevó con amortiguador C mM 5 M 5 pH mediante el uso de sales anticaotrópicas acetato de y se cargó a una columna de 20 mi HiPrep Butyl FF o un medio HIC preequilibrada con amortiguador D mM 3 M 5 mM pH Se lavó el libre dentro de 5 CV de amortiguador se eluyó el conjugado con de amortiguador E mM 5 mM pH Se concentraron las fracciones que contenían el conjugado mediante utilizando una membrana de 10 kD hecha de celulosa regenerada corte 10 Se realizó la etapa de diafiltración final contra el amortiguador Hepes mM 5 mM pH La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y procedimiento y la actividad biológica de acuerdo con los métodos Ejemplo 17 Polisialilación de rFIX en presencia de ácido benzoico Método Se disolvieron mg de rFIX en mi de amortiguador de pH mM 150 mM 5 mM 82 de una solución acuosa de periodato de sodio se añadió y se incubó la mezcla de reacción durante 1 h en la oscuridad a 4 con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de 4 de 1 M solución acuosa de se sometió la mezcla a empleando filtradores centrífugos Vivaspin 6 10 kD para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de Se mezcló la fracción retenida que contenía rFIX con mi de un ácido benzoico acuoso y se incubó durante 30 min a temperatura Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de reactivo de 5 Se incubó esta mezcla durante h a temperatura ambiente en la oscuridad con agitación La purificación adicional del conjugado se realizó como se describe Método Se preparó una solución de 1 mg de rFIX en mi de amortiguador de fosfato de pH que contenia un exceso molar de 5 veces de reactivo con un MW de 20 kD Se añadieron 333 de una solución acuosa de ácido benzoico como catalizador nucleofilico para dar una concentración final de 10 mM se añadieron 20 de una solución acuosa de NaI04 que produjeron una concentración final de 100 Se realizó el proceso de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura ambiente y se inactivó durante 15 in a temperatura ambiente mediante el añadido de 1 m? de solución acuosa de cisteina La purificación adicional del conjugado se realizó como se describe Ejemplo 18 Polisialilación de EPO utilizando y toluidina como catalizador nucleofilico Método Se transfirió una concentración de partida de eritropoyet ina a un amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de calcio pH y se diluyó para obtener una concentración de proteina de 1 A esta se añadió NaI04 para dar una concentración final de 200 mM Se realizó la oxidación a TA durante 30 min en la oscuridad con agitación Se inactivó la reacción con cisteina 10 durante 60 min a se sometió la solución a empleando filtradores centrífugos Vivaspin para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de este en la a una columna IEX con un volumen de 20 mi EMD TMAE que se equilibró con amortiguador A mM 5 mM pH Se equilibró la columna con 5 CV de amortiguador Se eluyó el EPO oxidado con amortiguador B mM 5 1M pH Se recogieron las fracciones que contenían Se determinó el contenido de proteína y se ajustó a 1 con amortiguador de reacción y se ajustó a pH mediante añadido de M por Se añadió un exceso molar de 50 veces de un reactivo con un MW de 20 kD seguido de como catalizador nucleofílico 10 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura Se retiró el exceso de reactivo mediante Se ajustó la conductividad de la mezcla de reacción mediante el añadido de un amortiguador que contenia acetato de amonio mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de 8 M acetato de pH y se cargó en una columna llena con 80 de Phenyl Sepharose FF preequilibrada con 50 mM M acetato de 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH se eluyó el conjugado con 50 mM de amortiguador Hepes pH que contenia 5 mM Por se recogieron las fracciones que contenían y se sometieron a mediante el uso de una membrana hecha de celulosa regenerada 10 50 la preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la En una modalidad se realizó el método 1 del siguiente Se disolvieron 10 mg de EPO en 5 de amortiguador de pH mM 150 mM 100 de una solución acuosa de periodato de sodio se añadió y se incubó la mezcla de reacción durante 1 h en la oscuridad a 50 con agitación suave y se inactivó durante 15 a temperatura ambiente mediante el añadido de 4 de 1 M solución acuosa de se sometió la mezcla a empleando filtradores centrífugos Vivaspin 15R 10 kD para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de Se mezcló la fracción retenida 7 que contenía EPO con 2 mi de una solución acuosa de y se incubó durante 30 min a temperatura Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de reactivo de 5 Se incubó esta mezcla durante h a TA en la oscuridad con agitación suave Se retiró el EPO libre mediante cromatografía de intercambio aniónico Se diluyó la mezcla de reacción con 20 i de amortiguador A mM pH y se cargó en una columna de 20 mi HiPrep QFF preequilibrada con amortiguador Se eluyó la columna con amortiguador B mM 1 M pH Se eluyó el EPO libre mediante lavado de la columna con 25 de amortiguador B y el conjugado con 50 de amortiguador La conductividad de las fracciones que contenían el conjugado se elevó a con amortiguador C mM 5 M pH y se cargó a una columna de 20 mi HiPrep Butyl FF preequilibrada con amortiguador D mM 3 M pH Se lavó el libre dentro de 5 CV de amortiguador Se eluyó el conjugado con 100 de amortiguador E pH Se concentraron las fracciones que contenían el conjugado mediante utilizando una membrana de 10 kD hecha de celulosa regenerada corte 10 Se realizó la etapa de diafiltración final contra amortiguador de pH que contenía 150 mM La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Para el conjugado se determinó una actividad específica de 50 en comparación con el EPO se caracterizó analíticamente el conjugado mediante HPLC de exclusión por tamaño utilizando un sistema de HPLC Agilent 1200 equipado con una columna Shodex KW 803 en las condiciones descritas anteriormente et Transfusión Se demostró que la preparación no contiene EPO Método Se transfirió o se disolvió EPO en amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteina de Se corrigió el pH de la solución a mediante añadido por goteo de una solución acuosa de se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 40 mM en 10 minutos para dar una concentración de 200 Se realizó la reacción de oxidación durante 30 5 min a una temperatura de 2 Se detuvo la reacción mediante el añadido de una solución acuosa de en 15 minutos a 2 para dar una concentración final de 10 mM en la mezcla de reacción e incubación durante 60 5 Se purificó adicionalmente el EPO oxidado mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían EPO oxidado del eluato y se utilizaron para la reacción de Se añadió el reactivo de ácido en un exceso molar de 50 veces al eluato que contenía el EPO oxidado purificado en un período máximo de 15 minutos con agitación Se añadió una solución acuosa de en 15 minutos para obtener una concentración final de 10 Se incubó la mezcla de reacción durante 120 10 min a pH en la oscuridad a una temperatura de con agitación suave de 1 Se purificó adicionalmente el conjugado de obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado de y se concentraron mediante utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada con un corte de peso molecular adecuado Se caracterizó analíticamente el conjugado preparado mediante el uso de este procedimiento a través de la medición de la proteína actividad biológica y la determinación del grado de polisialiación mediante la medición del contenido de PSA de Método Se transfirió eritropoyetina a amortiguador de reacción mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se diluyó para obtener una concentración de proteína de 1 Se añadió un exceso molar de 50 veces de un reactivo con un MW de 20 kD seguido de toluidina como catalizador nucleofílico M de concentración y NaI04 400 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura se inactivó la reacción con cisteina durante 60 min a TA de 10 Se ajustó la conductividad de la mezcla de reacción mediante el añadido de un amortiguador que contenia acetato de amonio mM 350 mM cloruro de 5 M cloruro de 8 M acetato de pH y se cargó en una columna llena con Phenyl Sepharose FF preequilibrada con 50 M M acetato de 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de Tween pH se eluyó el conjugado con 50 mM 5 mM cloruro de pH Por se recogieron las fracciones que contenían EPO y se sometieron a mediante el uso de una membrana hecha de celulosa regenerada 10 88 La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la En una modalidad se realizó el método 3 del siguiente Se disolvieron 10 mg de EPO en 8 mi de amortiguador de pH 150 mM Se añadieron 200 de una solución acuosa de periodato de sodio y 2 i de una solución acuosa de se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de reactivo de 5 Se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de 100 de solución acuosa de cisteina 1 Se retiró el EPO libre mediante cromatografía de intercambio aniónico Se diluyó la mezcla de reacción con 20 mi de amortiguador A mM pH y se cargó en una columna de 20 mi HiPrep QFF preequilibrada con amortiguador Se eluyó la columna con amortiguador B mM 1 M pH Se eluyó el EPO libre mediante lavado de la columna con 25 de amortiguador B y el conjugado con 50 de amortiguador La conductividad de las fracciones que contenían el conjugado se elevó a con amortiguador C mM 5 M pH y se cargó a una columna de 20 mi HiPrep Butyl FF preequilibrada con amortiguador D mM 3 M pH Se lavó el libre dentro de 5 CV de amortiguador Se eluyó el conjugado con de amortiguador E mM pH Se concentraron las fracciones que contenían el conjugado mediante utilizando una membrana de 10 kD hecha de celulosa regenerada corte 10 Se realizó la etapa de diafiltración final contra amortiguador de pH que contenía 150 mM La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Para el conjugado se determinó una actividad específica de 50 en comparación con el EPO se caracterizó analíticamente el conjugado mediante HPLC de exclusión por tamaño utilizando un sistema de HPLC Agilent 1200 equipado con una columna Shodex KW 803 en las condiciones descritas anteriormente et Transfusión Se demostró que la preparación no contiene EPO Método Se disolvió o se transfirió EPO a un amortiguador de reacción 50 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteína de Se corrigió el pH de la solución a mediante añadido por goteo de una solución acuosa de se añadió el reactivo de ácido en un exceso molar de 50 veces a la solución de EPO en un periodo máximo de 15 minutos con agitación Se añadió una solución acuosa de en 15 minutos para obtener una concentración final de 10 Por se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 40 M para dar una concentración de 400 Se incubó la mezcla de reacción durante 120 10 en la oscuridad a una temperatura de 2 con agitación Se detuvo la reacción mediante el añadido de una solución acuosa de para dar una concentración final de 10 en la mezcla de reacción e incubación durante 60 5 Se purificó el conjugado de obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían del eluato y se concentraron mediante utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada 10 88 Se caracterizaron analíticamente los conjugados preparados mediante el uso de este procedimiento a través de la medición de la proteína actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la téenica y la determinación del grado de polisialiación mediante la medición del contenido de PSA de resorcinol Ejemplo 19 Polisialilación de utilizando y toluidina como catalizador nucleofilico Mé odo Se transfirió una concentración de partida de angiopoyet a un amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 cloruro de pH y se diluyó para obtener una concentración de proteina de 1 A esta se añadió NaI04 para dar una concentración final de 200 Se realizó la oxidación a TA durante 30 min en la oscuridad con agitación Se inactivó la reacción con cisteina 10 durante 60 min a se sometió la solución a empleando filtradores centrífugos Vivaspin para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos en la se sometió a una columna con un volumen de 20 mi EMD TMAE que se equilibró con amortiguador A 5 mM pH Se equilibró la columna con 5 CV de amortiguador Se eluyó el oxidado con amortiguador B raM 5 mM 1 M pH Se recogieron las fracciones que contenían Se determinó el contenido de proteína y se ajustó a 1 con amortiguador de reacción y se ajustó a pH mediante añadido de M por Se añadió un exceso molar de 50 veces de reactivo con un MW de 20 kD seguido de como catalizador nucleofílico 10 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura Se retiró el exceso de reactivo aminooxi mediante Se ajustó la conductividad de la mezcla de reacción mediante el añadido de un amortiguador que contenía acetato de amonio mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de 8 M acetato de pH y se cargó en una columna llena con 80 de Phenyl Sepharose FF preequilibrada con 50 mM M acetato de 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH se eluyó el conjugado con 50 mM de amortiguador Hepes pH que contenía 5 Por se recogieron las fracciones que contenían PSA y se sometieron a mediante el uso de una membrana hecha de celulosa regenerada Posteriormente la preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la En una modalidad se realizó el método 1 del siguiente Se transfirió a un amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se diluyó para obtener una concentración de proteína de 1 A esta se añadió NaI04 para dar una concentración final de 200 m Se realizó la oxidación a TA durante 30 min en la oscuridad con agitación Se inactivó la reacción con cisteína 10 durante 60 min a se sometió la solución a empleando filtradores centrífugos Vivaspin para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de Se añadió un exceso molar de 50 veces de reactivo con un MW de 20 kD seguido de como catalizador nucleofílico 10 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura Se retiró el exceso de reactivo aminooxi mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado del eluato y se sometieron a mediante el uso de una membrana hecha de celulosa regenerada la preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Método Se transfirió o se disolvió en amortiguador de reacción 50 350 mM cloruro de 5 cloruro de para obtener una concentración final de proteína de Se corrigió el pH de la solución a mediante añadido por goteo de una solución acuosa de se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 40 mM en 10 minutos para dar una concentración de 200 Se realizó la reacción de oxidación durante 30 5 min a una temperatura de 2 Se detuvo la reacción mediante el añadido de una solución acuosa de en 15 minutos a 2 para dar una concentración final de 10 mM en la mezcla de reacción e incubación durante 60 5 Se purificó adicionalmente el oxidado mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían oxidado del eluato y se utilizaron para la reacción de conjugación Se añadió el reactivo de ácido en un exceso molar de 50 veces al eluato que contenía el oxidado purificado en un período máximo de 15 minutos con agitación Se añadió una solución acuosa de en 15 minutos para obtener una concentración final de 10 Se incubó la mezcla de reacción durante 120 10 min a pH en la oscuridad a una temperatura de con agitación suave de 1 Se purificó adicionalmente el conjugado de 2 obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado de y se concentraron mediante utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada con un corte de peso molecular adecuado Se caracterizó analíticamente el conjugado preparado mediante el uso de este procedimiento a través de la medición de la proteína actividad biológica y la determinación del grado de polisialiación mediante la medición del contenido de PSA de Método Se transfirió a un amortiguador de reacción mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se diluyó para obtener una concentración de proteina de 1 Se añadió un exceso molar de 50 veces de un reactivo PSA aminooxi con un MW de 20 kD seguido de como catalizador nucleofilico mM de concentración y NaI04 400 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura se inactivó la reacción con cisterna durante 60 min a TA de 10 Se ajustó la conductividad de la mezcla de reacción medrante el añadido de un amortiguador que contenia acetato de amonio mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de 8 M acetato de pH y se cargó en una columna llena con Phenyl Sepharose FF preequilibrada con 50 mM M acetato de 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de Tween pH se eluyó el conjugado con 50 mM 5 mM cloruro de pH Por se recogieron las fracciones que contenían PSA y se sometieron a mediante el uso de una membrana hecha de celulosa regenerada La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la En una modalidad se realizó el método 3 del siguiente Se transfirió a un amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se diluyó para obtener una concentración de proteína de 1 Se añadió un exceso molar de 50 veces de un reactivo PSA aminooxi con un MW de 20 kD seguido de como catalizador nucleofílico mM de concentración y NaI04 400 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura se inactivó la reacción con cisteína durante 60 min a TA de 10 y se purificó el conjugado mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían del eluato y se sometieron a mediante el uso de una membrana hecha de celulosa regenerada La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Método Se transfirió o se disolvió en un amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteína de Se corrigió el pH de la solución a mediante añadido por goteo de una solución acuosa de se añadió el reactivo de ácido en un exceso molar de 50 veces a la solución de en un período máximo de 15 minutos con agitación Se añadió una solución acuosa de en 15 minutos para obtener una concentración final de 10 Por se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 40 mM para dar una concentración de 400 Se incubó la mezcla de reacción durante 120 10 min en la oscuridad a una temperatura de 2 con agitación Se detuvo la reacción mediante el añadido de una solución acuosa de para dar una concentración final de 10 mM en la mezcla de reacción e incubación durante 60 5 Se purificó el conjugado de obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían del eluato y se concentraron mediante utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada Se caracterizaron analíticamente los conjugados preparados mediante el uso de este procedimiento a través de la medición de la proteína actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la téenica y la determinación del grado de polisialiación mediante la medición del contenido de PSA de resorcinol Ejemplo 20 Polisia1 i1ación de VEGF utilizando y toluidina como catalizador nucleofílico Método Se transfirió una concentración de partida de factor de crecimiento endotelial vascular a un amortiguador de reacción 50 350 mM cloruro de 5 cloruro de pH y se diluyó para obtener una concentración de proteina de 1 A esta se añadió NaI04 para dar una concentración final de 200 Se realizó la oxidación a TA durante 30 min en la oscuridad con agitación Se inactivó la reacción con cisteina 10 durante 60 min a se sometió la solución a empleando filtradores centrífugos Vivaspin para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de este en la a una columna IEX con un volumen de 20 mi EMD TMAE que se equilibró con amortiguador A mM 5 mM pH Se equilibró la columna con 5 CV de amortiguador Se eluyó el VEGF oxidado con amortiguador B mM 5 mM 1 M pH Se recogieron las fracciones que contenían Se determinó el contenido de proteína y se ajustó a 1 con amortiguador de reacción y se ajustó a pH mediante añadido de M NaOH por Se añadió un exceso molar de 50 veces de reactivo con un MW de 20 kD seguido de como catalizador nucleofílico 10 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura Se retiró el exceso de reactivo aminooxi mediante Se ajustó la conductividad de la mezcla de reacción mediante el añadido de un amortiguador que contenía acetato de amonio mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de 8 M acetato de pH y se cargó en una columna llena con 80 mi de Phenyl Sepharose FF preequilibrada con 50 mM M acetato de 350 mM cloruro de 5 M cloruro de pH se eluyó el conjugado con 50 mM de amortiguador Hepes pH que contenía 5 mM Por se recogieron las fracciones que contenían PSA VEGF y se sometieron a mediante el uso de una membrana hecha de celulosa regenerada la preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la En una modalidad se realizó el método 1 del siguiente Se transfirió factor de crecimiento endotelial vascular a un amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 cloruro de pH y se diluyó para obtener una concentración de proteína de 1 A esta se añadió NaIC para dar una concentración final de 200 Se realizó la oxidación a TA durante 30 min en la oscuridad con agitación Se inactivó la reacción con cisteina 10 durante 60 min a se sometió la solución a empleando filtradores centrífugos Vivaspin para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de Se añadió un exceso molar de 50 veces de reactivo con un MW de 20 kD seguido de como catalizador nucleofílico 10 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura Se retiró el exceso de reactivo aminooxi mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían PSA VEGF del eluato y se sometieron a mediante el uso de una membrana hecha de celulosa regenerada la preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Método Se transfirió o se disolvió VEGF en amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteina de Se corrigió el pH de la solución a mediante añadido por goteo de una solución acuosa de se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 40 mM en 10 minutos para dar una concentración de 200 Se realizó la reacción de oxidación durante 30 5 min a una temperatura de 2 Se detuvo la reacción mediante el añadido de una solución acuosa de en 15 minutos a 2 para dar una concentración final de 10 mM en la mezcla de reacción e incubación durante 60 5 Se purificó adicionalmente el VEGF oxidado mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían VEGF oxidado del eluato y se utilizaron para la reacción de Se añadió el reactivo de ácido en un exceso molar de 50 veces al eluato que contenía el VEGF oxidado purificado en un período máximo de 15 minutos con agitación Se añadió una solución acuosa de en 15 minutos para obtener una concentración final de 10 Se incubó la mezcla de reacción durante 120 10 min a pH en la oscuridad a una temperatura de con agitación suave de 1 Se purificó adicionalmente el conjugado de obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado de y se concentraron mediante utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada con un corte de peso molecular adecuado Se caracterizó analíticamente el conjugado preparado mediante el uso de este procedimiento a través de la medición de la proteína actividad biológica y la determinación del grado de o1isia1iación mediante la medición del contenido de PSA de Método Se transfirió factor de crecimiento endotelial vascular a un amortiguador de reacción mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se diluyó para obtener una concentración de proteína de 1 Se añadió un exceso molar de 50 veces de un reactivo PSA aminooxi con un MW de 20 kD seguido de como catalizador nucleofílico mM de concentración y NaI04 400 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura se inactivó la reacción con cisteina durante 60 a TA de 10 Se ajustó la conductividad de la mezcla de reacción mediante el añadido de un amortiguador que contenía acetato de amonio mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de 8 M acetato de pH y se cargó en una columna llena con Phenyl Sepharose FF preequilibrada con 50 mM M acetato de 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de Tween pH se eluyó el conjugado con 50 mM 5 mM cloruro de pH Por se recogieron las fracciones que contenían y se sometieron a mediante el uso de una membrana hecha de celulosa regenerada La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la En una modalidad se realizó el método 3 del siguiente Se transfirió factor de crecimiento endotelial vascular a un amortiguador de reacción 50 mM 350 cloruro de 5 mM cloruro de pH y se diluyó para obtener una concentración de proteina de 1 Se añadió un exceso molar de 50 veces de un reactivo con un MW de 20 kD seguido de como catalizador nucleofilico mM de concentración y NaI04 400 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura se inactivó la reacción con cisteina durante 60 min a TA de 10 y se purificó el conjugado mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el del eluato y se sometieron a mediante el uso de una membrana hecha de celulosa regenerada La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la téenica Método Se transfirió o se disolvió VEGF en un amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteína de Se corrigió el de la solución a mediante añadido por goteo de una solución acuosa de se añadió el reactivo de ácido en un exceso molar de 50 veces a la solución de VEGF en un periodo máximo de 15 minutos con agitación Se añadió una solución acuosa de en 15 minutos para obtener una concentración final de 10 Por se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 40 mM para dar una concentración de 400 Se incubó la mezcla de reacción durante 120 10 min en la oscuridad a una temperatura de 2 con agitación Se detuvo la reacción mediante el añadido de una solución acuosa de para dar una concentración final de 10 mM en la mezcla de reacción e incubación durante 60 5 Se purificó el conjugado de obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían del eluato y se concentraron mediante ón utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada Se caracterizaron analíticamente los conjugados preparados mediante el uso de este procedimiento a través de la medición de la proteina actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la téenica y la determinación del grado de polisialiación mediante la medición del contenido de PSA de resorcinol Ejemplo 21 Polisialilación de EGF utilizando y toluidina como catalizador nucleofilico Método Se transfirió una concentración de partida de factor de crecimiento epidérmico a un amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 cloruro de pH y se diluyó para obtener una concentración de proteina de 1 A esta se añadió NaI04 para dar una concentración final de 200 Se realizó la oxidación a TA durante 30 min en la oscuridad con agitación Se inactivó la reacción con cisteina 10 durante 60 min a se sometió la solución a empleando filtradores centrífugos Vivaspin para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de este en la a una columna IEX con un volumen de 20 mi EMD TMAE que se equilibró con amortiguador A mM 5 mM pH Se equilibró la columna con 5 CV de amortiguador Se eluyó el EGF oxidado con amortiguador B mM 5 mM 1M pH Se recogieron las fracciones que contenían Se determinó el contenido de proteína y se ajustó a 1 con amortiguador de reacción y se ajustó a pH mediante añadido de M por Se añadió un exceso molar de 50 veces de reactivo con un MW de 20 kD seguido de como catalizador nucleofílico 10 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura Se retiró el exceso de reactivo aminooxi mediante Se ajustó la conductividad de la mezcla de reacción mediante el añadido de un amortiguador que contenía acetato de amonio mM 350 cloruro de 5 mM cloruro de 8 M acetato de pH y se cargó en una columna llena con 80 de Phenyl Sepharose FF preequilibrada con 50 mM M acetato de 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH se eluyó el conjugado con 50 mM de amortiguador Hepes pH que contenía 5 mM Por se recogieron las fracciones que contenían y se sometieron a mediante el uso de una membrana hecha de celulosa regenerada la preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la téenica En una modalidad se realizó el método 1 del siguiente Se transfirió factor de crecimiento epidérmico a un amortiguador de reacción 50 M 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se diluyó para obtener una concentración de proteína de 1 A esta se añadió NaI04 para dar una concentración final de 200 m Se realizó la oxidación a TA durante 30 min en la oscuridad con agitación Se inactivó la reacción con cisteína 10 durante 60 min a se sometió la solución a empleando filtradores centrífugos Vivaspin para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de Se añadió un exceso molar de 50 veces de reactivo con un MW de 20 kD seguido de como catalizador nucleofílico 10 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura Se retiró el exceso de reactivo aminooxi mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el del eluato y se sometieron a mediante el uso de una membrana hecha de celulosa regenerada la preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Método Se transfirió o se disolvió EGF en amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteína de Se corrigió el pH de la solución a mediante añadido por goteo de una solución acuosa de se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 40 en 10 minutos para dar una concentración de 200 Se realizó la reacción de oxidación durante 30 5 min a una temperatura de 2 Se detuvo la reacción mediante el añadido de una solución acuosa de en 15 minutos a 2 para dar una concentración final de 10 mM en la mezcla de reacción e incubación durante 60 5 Se purificó adicionalmente el EGF oxidado mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían EGF oxidado del eluato y se utilizaron para la reacción de Se añadió el reactivo de ácido en un exceso molar de 50 veces al eluato que contenía el EGF oxidado purificado en un período máximo de 15 minutos con agitación Se añadió una solución acuosa de en 15 minutos para obtener una concentración final de 10 m Se incubó la mezcla de reacción durante 120 10 min a pH en la oscuridad a una temperatura de con agitación suave de 1 Se purificó adicionalmente el conjugado de obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado de y se concentraron mediante utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada con un corte de peso molecular adecuado Se caracterizó analíticamente el conjugado preparado mediante el uso de este procedimiento a través de la medición de la proteina actividad biológica y la determinación del grado de polisialiación mediante la medición del contenido de PSA de Método Se transfirió factor de crecimiento epidérmico a un amortiguador de reacción 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se diluyó para obtener una concentración de proteina de 1 Se añadió un exceso molar de 50 veces de un reactivo PSA aminooxi con un MW de 20 kD seguido de como catalizador nucleofilico mM de concentración y NaI04 400 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura se inactivó la reacción con cisteina durante 60 in a TA de 10 Se ajustó la conductividad de la mezcla de reacción mediante el añadido de un amortiguador que contenía acetato de amonio M 350 cloruro de 5 mM cloruro de 8 M acetato de pH y se cargó en una columna llena con Phenyl Sepharose FF preequilibrada con 50 mM M acetato de 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de Tween pH se eluyó el conjugado con 50 mM 5 mM cloruro de pH Por se recogieron las fracciones que contenían y se sometieron a mediante el uso de una membrana hecha de celulosa regenerada La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la En una modalidad se realizó el método 3 del siguiente Se transfirió factor de crecimiento epidérmico a un amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se diluyó para obtener una concentración de proteína de 1 Se añadió un exceso molar de 50 veces de un reactivo PSA aminooxi con un MW de 20 kD seguido de toluidina como catalizador nucleofílico mM de concentración y NaI04 400 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura se inactivó la reacción con cisteína durante 60 min a TA de 10 y se purificó el conjugado mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado del eluato y se sometieron a mediante el uso de una membrana hecha de celulosa regenerada La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Método Se transfirió o se disolvió EGF en un amortiguador de reacción 50 m 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteína de Se corrigió el pH de la solución a mediante añadido por goteo de una solución acuosa de se añadió el reactivo de ácido en un exceso molar de 50 veces a la solución de EGF en un período máximo de 15 minutos con agitación Se añadió una solución acuosa de en 15 minutos para obtener una concentración final de 10 Por se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 40 mM para dar una concentración de 400 Se incubó la mezcla de reacción durante 120 10 min en la oscuridad a una temperatura de 2 con agitación Se detuvo la reacción mediante el añadido de una solución acuosa de para dar una concentración final de 10 mM en la mezcla de reacción e incubación durante 60 5 Se purificó el conjugado de EGF obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían del eluato y se concentraron mediante utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada Se caracterizaron analíticamente los conjugados preparados mediante el uso de este procedimiento a través de la medición de la proteína actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la téenica y la determinación del grado de po1isialiación mediante la medición del contenido de PSA de resorcinol Ejemplo 22 Po1isia 1i1ación de NGF utilizando y toluidina como catalizador nucleofílico Método Se transfirió una concentración de partida de factor de crecimiento nervioso a un amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se diluyó para obtener una concentración de proteina de 1 A esta se añadió NaI04 para dar una concentración final de 200 Se realizó la oxidación a TA durante 30 min en la oscuridad con agitación Se inactivó la reacción con cisteina 10 durante 60 min a se sometió la solución a empleando filtradores centrífugos Vivaspin para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de este en la a una columna IEX con un volumen de 20 mi EMD TMAE que se equilibró con amortiguador A mM 5 mM pH Se equilibró la columna con 5 CV de amortiguador Se eluyó el NGF oxidado con amortiguador B mM 5 mM 1M pH Se recogieron las fracciones que contenían Se determinó el contenido de proteína y se ajustó a 1 con amortiguador de reacción y se ajustó a pH mediante añadido de M por Se añadió un exceso molar de 50 veces de reactivo con un MW de 20 kD seguido de como catalizador nucleofílico 10 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura Se retiró el exceso de reactivo aminooxi mediante Se ajustó la conductividad de la mezcla de reacción mediante el añadido de un amortiguador que contenía acetato de amonio mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de 8 M acetato de pH y se cargó en una columna llena con 80 mi de Phenyl Sepharose FF preequilibrada con 50 mM M acetato de 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH se eluyó el conjugado con 50 mM de amortiguador Hepes pH que contenía 5 mM Por se recogieron las fracciones que contenían y se sometieron a mediante el uso de una membrana hecha de celulosa regenerada la preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la téenica En una modalidad se realizó el método 1 del siguiente Se transfirió factor de crecimiento nervioso a un amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se diluyó para obtener una concentración de proteína de 1 A esta se añadió NaI04 para dar una concentración final de 200 m Se realizó la oxidación a TA durante 30 min en la oscuridad con agitación Se inactivó la reacción con cisteina 10 durante 60 min a se sometió la solución a empleando filtradores centrífugos Vivaspin para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de Se añadió un exceso molar de 50 veces de reactivo con un MW de 20 kD seguido de como catalizador nucleofílico 10 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura Se retiró el exceso de reactivo aminooxi mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el del eluato y se sometieron a mediante el uso de una membrana hecha de celulosa regenerada la preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la téenica Método Se transfirió o se disolvió NGF en amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 M cloruro de pH para obtener una concentración final de proteina de Se corrigió el pH de la solución a mediante añadido por goteo de una solución acuosa de se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 40 en 10 minutos para dar una concentración de 200 Se realizó la reacción de oxidación durante 30 5 min a una temperatura de 2 Se detuvo la reacción mediante el añadido de una solución acuosa de en 15 minutos a 2 para dar una concentración final de 10 mM en la mezcla de reacción e incubación durante 60 5 Se purificó adicionalmente el NGF oxidado mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían NGF oxidado del eluato y se utilizaron para la reacción de Se añadió el reactivo de ácido en un exceso molar de 50 veces al eluato que contenía el NGF oxidado purificado en un período máximo de 15 minutos con agitación Se añadió una solución acuosa de en 15 minutos para obtener una concentración final de 10 Se incubó la mezcla de reacción durante 120 10 min a pH en la oscuridad a una temperatura de con agitación suave de 1 Se purificó adicionalmente el conjugado de obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado de y se concentraron mediante utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada con un corte de peso molecular adecuado Se caracterizó analíticamente el conjugado preparado mediante el uso de este procedimiento a través de la medición de la proteína actividad biológica y la determinación del grado de mediante la medición del contenido de PSA de Método Se transfirió factor de crecimiento nervioso a un amortiguador de reacción mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se diluyó para obtener una concentración de proteína de 1 Se añadió un exceso molar de 50 veces de un reactivo con un MW de 20 kD seguido de como catalizador nucleofílico mM de concentración y NaI04 400 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura se inactivó la reacción con cisteina durante 60 min a TA de 10 Se ajustó la conductividad de la mezcla de reacción mediante el añadido de un amortiguador que contenía acetato de amonio mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de 8 M acetato de pH y se cargó en una columna llena con Phenyl Sepharose FF preequilibrada con 50 mM M acetato de 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de Tween pH se eluyó el conjugado con 50 mM 5 cloruro de pH Por se recogieron las fracciones que contenían PSA NGF y se sometieron a mediante el uso de una membrana hecha de celulosa regenerada La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la En una modalidad se realizó el método 3 del siguiente Se transfirió factor de crecimiento nervioso a un amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se diluyó para obtener una concentración de proteina de 1 Se añadió un exceso molar de 50 veces de un reactivo con un MW de 20 kD seguido de toluidina como catalizador nucleof mM de concentración y NaI04 400 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura se inactivó la reacción con cisteina durante 60 min a TA de 10 y se purificó el conjugado mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el del eluato y se sometieron a mediante el uso de una membrana hecha de celulosa regenerada La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Método Se transfirió o se disolvió NGF en un amortiguador de reacción 50 mM 350 cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteína de Se corrigió el pH de la solución a mediante añadido por goteo de una solución acuosa de se añadió el reactivo de ácido en un exceso molar de 50 veces a la solución de NGF en un periodo máximo de 15 minutos con agitación Se añadió una solución acuosa de en 15 minutos para obtener una concentración final de 10 Por se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 40 mM para dar una concentración de 400 Se incubó la mezcla de reacción durante 120 10 min en la oscuridad a una temperatura de 2 con agitación Se detuvo la reacción mediante el añadido de una solución acuosa de para dar una concentración final de 10 mM en la mezcla de reacción e incubación durante 60 5 Se purificó el conjugado de obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían del eluato y se concentraron mediante utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada Se caracterizaron analíticamente los conjugados preparados mediante el uso de este procedimiento a través de la medición de la proteina actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la téenica y la determinación del grado de polisialiación mediante la medición del contenido de PSA de resorcinol Ejemplo 23 Polisialilación de HGH utilizando y toluidina como catalizador nucleofilico Método Como se describió en la la secuencia de aminoácidos de la hormona del crecimiento humano se modificó en primer lugar para incorporar al menos un sitio de Después de la se glicosiló HGH in vitro de acuerdo con los métodos conocidos en la Se transfirió una concentración de partida de hormona del crecimiento humano a un amortiguador de reacción 50 mM 350 cloruro de 5 mM cloruro de pH y se diluyó para obtener una concentración de proteina de 1 A esta se añadió NaI04 para dar una concentración final de 200 m Se realizó la oxidación a TA durante 30 min en la oscuridad con agitación Se inactivó la reacción con cisterna 10 durante 60 min a se sometió la solución a empleando filtradores centrífugos Vivaspin para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de este en la a una columna IEX con un volumen de 20 mi EMD TMAE que se equilibró con amortiguador A mM 5 mM pH Se equilibró la columna con 5 CV de amortiguador Se eluyó el HGH oxidado con amortiguador B mM 5 mM M pH Se recogieron las fracciones que contenían Se determinó el contenido de proteína y se ajustó a 1 con amortiguador de reacción y se ajustó a pH mediante añadido de M por Se añadió un exceso molar de 50 veces de reactivo con un MW de 20 kD seguido de como catalizador nucleofílico 10 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura Se retiró el exceso de reactivo aminooxi mediante Se ajustó la conductividad de la mezcla de reacción mediante el añadido de un amortiguador que contenía acetato de amonio M 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de 8 M acetato de pH y se cargó en una columna llena con 80 mi de Phenyl Sepharose FF preequilibrada con 50 mM M acetato de 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH se eluyó el conjugado con 50 mM de amortiguador Hepes pH que contenía 5 mM Por se recogieron las fracciones que contenían y se sometieron a mediante el uso de una membrana hecha de celulosa regenerada la preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la téenica En una modalidad se realizó el método 1 del siguiente Como se describió en la la secuencia de aminoácidos de la hormona del crecimiento humano se modificó en primer lugar para incorporar al menos un sitio de Después de la se glicosiló HGH in vitro de acuerdo con los métodos conocidos en la Se transfirió HGH a un amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se diluyó para obtener una concentración de proteína de 1 A esta se añadió NaI04 para dar una concentración final de 200 Se realizó la oxidación a TA durante 30 min en la oscuridad con agitación Se inactivó la reacción con cisteina 10 durante 60 min a se sometió la solución a empleando filtradores centrífugos Vivaspin para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de Se añadió un exceso molar de 50 veces de reactivo con un MW de 20 kD seguido de como catalizador nucleofílico 10 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura Se retiró el exceso de reactivo aminooxi mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el del eluato y se sometieron a mediante el uso de una membrana hecha de celulosa regenerada la preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la téenica Método Como se describió en la la secuencia de aminoácidos de la hormona del crecimiento humano se modificó en primer lugar para incorporar al menos un sitio de Después de la se glicosiló HGH in vitro de acuerdo con los métodos conocidos en la Se transfirió o se disolvió HGH en amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteina de Se corrigió el pH de la solución a mediante añadido por goteo de una solución acuosa de se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 40 mM en 10 minutos para dar una concentración de 200 m Se realizó la reacción de oxidación durante 30 5 min a una temperatura de 2 Se detuvo la reacción mediante el añadido de una solución acuosa de en 15 minutos a 2 para dar una concentración final de 10 mM en la mezcla de reacción e incubación durante 60 5 Se purificó adicionalmente el HGH oxidado mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían HGH oxidado del eluato y se utilizaron para la reacción de Se añadió el reactivo de ácido en un exceso molar de 50 veces al eluato que contenía el HGH oxidado purificado en un período máximo de 15 minutos con agitación Se añadió una solución acuosa de en 15 minutos para obtener una concentración final de 10 Se incubó la mezcla de reacción durante 120 10 min a pH en la oscuridad a una temperatura de con agitación suave de 1 Se purificó adicionalmente el conjugado de obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado de y se concentraron mediante utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada con un corte de peso molecular adecuado Se caracterizó analíticamente el conjugado preparado mediante el uso de este procedimiento a través de la medición de la proteína actividad biológica y la determinación del grado de polisialiación mediante la medición del contenido de PSA de Método Como se describió en la la secuencia de aminoácidos de la hormona del crecimiento humano se modificó en primer lugar para incorporar al menos un sitio de Después de la se glicosiló HGH in vitro de acuerdo con los métodos conocidos en la Se transfirió la hormona del crecimiento humano a un amortiguador de reacción mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se diluyó para obtener una concentración de proteina de 1 Se añadió un exceso molar de 50 veces de un reactivo con un MW de 20 kD seguido de como catalizador nucleofilico mM de concentración y NaI04 400 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura se inactivó la reacción con cisteina durante 60 min a TA de 10 Se ajustó la conductividad de la mezcla de reacción mediante el añadido de un amortiguador que contenia acetato de amonio mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de 8 M acetato de pH y se cargó en una columna llena con Phenyl Sepharose FF preequilibrada con 50 mM M acetato de 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de Tween pH se eluyó el conjugado con 50 mM 5 mM cloruro de pH Por se recogieron las fracciones que contenían PSA HGH y se sometieron a mediante el uso de una membrana hecha de celulosa regenerada La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la En una modalidad se realizó el método 3 del siguiente Como se describió en la la secuencia de aminoácidos de la hormona del crecimiento humano se modificó en primer lugar para incorporar al menos un sitio de Después de la se glicosiló HGH in vitro de acuerdo con los métodos conocidos en la Se transfirió HGH a un amortiguador de reacción 50 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se diluyó para obtener una concentración de proteína de 1 Se añadió un exceso molar de 50 veces de un reactivo con un MW de 20 kD seguido de toluidina como catalizador nucleofílico mM de concentración y NaI04 400 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura se inactivó la reacción con cisteina durante 60 min a TA de 10 y se purificó el conjugado mediante de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el PSA del eluato y se sometieron a mediante el uso de una membrana hecha de celulosa regenerada La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Método Como se describió en la la secuencia de aminoácidos de la hormona del crecimiento humano se modificó en primer lugar para incorporar al menos un sitio de Después de la se glicosiló HGH in vitro de acuerdo con los métodos conocidos en la Se transfirió o se disolvió HGH en un amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteína de Se corrigió el pH de la solución a mediante añadido por goteo de una solución acuosa de se añadió el reactivo de ácido en un exceso molar de 50 veces a la solución de en un período máximo de 15 minutos con agitación Se añadió una solución acuosa de en 15 minutos para obtener una concentración final de 10 Por se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 40 mM para dar una concentración de 400 Se incubó la mezcla de reacción durante 120 10 min en la oscuridad a una temperatura de 2 con agitación Se detuvo la reacción mediante el añadido de una solución acuosa de para dar una concentración final de 10 mM en la mezcla de reacción e incubación durante 60 5 Se purificó el conjugado de obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían del eluato y se concentraron mediante utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada Se caracterizaron analíticamente los conjugados preparados mediante el uso de este procedimiento a través de la medición de la proteína actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la téenica y la determinación del grado de polisialiación mediante la medición del contenido de PSA de resorcinol Ejemplo 24 Po1is ia1ilación de utilizando y toluidina como catalizador nucleofilico Se transfirió una concentración de partida de factor de necrosis a un amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se diluyó para obtener una concentración de proteina de 1 A esta se añadió NaI04 para dar una concentración final de 200 Se realizó la oxidación a TA durante 30 min en la oscuridad con agitación Se inactivó la reacción con cisteina 10 durante 60 min a se sometió la solución a empleando filtradores centrífugos Vivaspin para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de este en la a una columna IEX con un volumen de 20 mi EMD TMAE que se equilibró con amortiguador A mM 5 mM pH Se equilibró la columna con 5 CV de amortiguador Se eluyó el oxidado con amortiguador B mM 5 mM 1M pH Se recogieron las fracciones que contenían Se determinó el contenido de proteína y se ajustó a 1 con amortiguador de reacción y se ajustó a pH mediante añadido de M por Se añadió un exceso molar de 50 veces de reactivo con un MW de 20 seguido de como catalizador nucleofilico 10 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura Se retiró el exceso de reactivo aminooxi mediante Se ajustó la conductividad de la mezcla de reacción mediante el añadido de un amortiguador que contenía acetato de amonio mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de 8 M acetato de pH y se cargó en una columna llena con 80 mi de Phenyl Sepharose FF preequilibrada con 50 M acetato de 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH se eluyó el conjugado con 50 mM de amortiguador Hepes pH que contenía 5 mM Por se recogieron las fracciones que contenían y se sometieron a mediante el uso de una membrana hecha de celulosa regenerada la preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en l a técnica En una modalidad se realizó el método 1 del siguiente Se transfirió factor de necrosis a un amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se diluyó para obtener una concentración de proteína de 1 A esta se añadió Nal04 para dar una concentración final de 200 Se realizó la oxidación a TA durante 30 min en la oscuridad con agitación Se inactivó la reacción con cisteina 10 durante 60 min a se sometió la solución a empleando filtradores centrífugos Vivaspin para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de Se añadió un exceso molar de 50 veces de reactivo con un MW de 20 kD seguido de como catalizador nucleofílico 10 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura Se retiró el exceso de reactivo aminooxi mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el del eluato y se sometieron a mediante el uso de una membrana hecha de celulosa regenerada Mi l l ipore Pos teriormente la preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la téenica Método Se transfirió o se disolvió en amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteína de Se corrigió el pH de la solución a mediante añadido por goteo de una solución acuosa de se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 40 mM en 10 minutos para dar una concentración de 200 Se realizó la reacción de oxidación durante 30 5 min a una temperatura de 2 Se detuvo la reacción mediante el añadido de una solución acuosa de en 15 minutos a 2 para dar una concentración final de 10 mM en la mezcla de reacción e incubación durante 60 5 Se purificó adicionalmente el oxidado mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían oxidado del eluato y se utilizaron para la reacción de conjugación Se añadió el reactivo de ácido en un exceso molar de 50 veces al eluato que contenía el oxidado purificado en un período máximo de 15 minutos con agitación Se añadió una solución acuosa de en 15 minutos para obtener una concentración final de 10 m Se incubó la mezcla de reacción durante 120 10 min a pH en la oscuridad a una temperatura de con agitación suave de 1 Se purificó adicionalmente el conjugado de alfa obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado de y se concentraron mediante iltración utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada con un corte de peso molecular adecuado Se caracterizó analíticamente el conjugado preparado mediante el uso de este procedimiento a través de la medición de la proteína actividad biológica y la determinación del grado de polisialiación mediante la medición del contenido de PSA de Método Se transfirió factor de necrosis a un amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se diluyó para obtener una concentración de proteina de 1 Se añadió un exceso molar de 50 veces de un reactivo con un MW de 20 kD seguido de como catalizador nucleofilico mM de concentración y NaI04 400 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura se inactivó la reacción con cisteina durante 60 min a TA de 10 Se ajustó la conductividad de la mezcla de reacción mediante el añadido de un amortiguador que contenía acetato de amonio mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de 8 M acetato de pH y se cargó en una columna llena con Phenyl Sepharose FF preequilibrada con 50 mM M acetato de 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de Tween pH se eluyó el conjugado con 50 mM 5 mM cloruro de pH Por se recogieron las fracciones que contenían y se sometieron a mediante el uso de una membrana hecha de celulosa regenerada La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la En una modalidad se realizó el método 3 del siguiente Se transfirió factor de necrosis a un amortiguador de reacción 50 mM 350 cloruro de 5 cloruro de pH y se diluyó para obtener una concentración de proteína de 1 Se añadió un exceso molar de 50 veces de un reactivo con un MW de 20 kD seguido de toluidina como catalizador nucleofílico mM de concentración y NaI04 400 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura se inactivó la reacción con cisteína durante 60 min a TA ción de 10 y se purificó el conjugado mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el del eluato y se sometieron a mediante el uso de una membrana hecha de celulosa regenerada La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Método Se transfirió o se disolvió en un amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteina de Se corrigió el pH de la solución a mediante añadido por goteo de una solución acuosa de se añadió el reactivo de ácido en un exceso molar de 50 veces a la solución de en un periodo máximo de 15 minutos con agitación Se añadió una solución acuosa de en 15 minutos para obtener una concentración final de 10 Por se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 40 mM para dar una concentración de 400 Se incubó la mezcla de reacción durante 120 10 in en la oscuridad a una temperatura de 2 con agitación Se detuvo la reacción mediante el añadido de una solución acuosa de para dar una concentración final de 10 mM en la mezcla de reacción e incubación durante 60 5 Se purificó el conjugado de obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían del eluato y se concentraron mediante utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada Se caracterizaron analíticamente los conjugados preparados mediante el uso de este procedimiento a través de la medición de la proteína actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la téenica y la determinación del grado de po1isialiación mediante la medición del contenido de PSA de resorcinol Ejemplo 25 Polisialilación de insulina utilizando y toluidina como catalizador nucleofílico Método Como se describió en la la secuencia de aminoácidos de insulina se modificó en primer lugar para incorporar al menos un sitio de Después de la se glicosiló insulina in vitro de acuerdo con los métodos conocidos en la Se transfirió una concentración de partida de insulina a un amortiguador de reacción 50 350 cloruro de 5 mM cloruro de pH y se diluyó para obtener una concentración de proteína de 1 A esta se añadió NaI04 para dar una concentración final de 200 Se realizó la oxidación a TA durante 30 min en la oscuridad con agitación Se inactivó la reacción con cisterna 10 durante 60 min a se sometió la solución a empleando filtradores centrífugos Vivaspin para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de este en la a una columna IEX con un volumen de 20 mi EMD TMAE que se equilibró con amortiguador A mM 5 mM pH Se equilibró la columna con 5 CV de amortiguador Se eluyó la insulina oxidada con amortiguador B mM 5 mM CaCl2 1 M pH Se recogieron las fracciones que contenían Se determinó el contenido de proteína y se ajustó a 1 con amortiguador de reacción y se ajustó a pH mediante añadido de M por Se añadió un exceso molar de 50 veces de reactivo con un MW de 20 kD seguido de como catalizador nucleofílico 10 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura Se retiró el exceso de reactivo aminooxi mediante Se ajustó la conductividad de la mezcla de reacción mediante el añadido de un amortiguador que contenía acetato de amonio mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de 8 M acetato de pH y se cargó en una columna llena con 80 mi de Phenyl Sepharose FF preequi1ibrada con 50 mM M acetato de 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH se eluyó el conjugado con 50 mM de amortiguador Hepes pH que contenía 5 mM Por se recogieron las fracciones que contenían y se sometieron a mediante el uso de una membrana hecha de celulosa regenerada la preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la En una modalidad se realizó el método 1 del siguiente Como se describió en la la secuencia de aminoácidos de insulina se modificó en primer lugar para incorporar al menos un sitio de glicosilación Después de la se glicosiló insulina in vitro de acuerdo con los métodos conocidos en la Se transfirió insulina a un amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se diluyó para obtener una concentración de proteina de 1 A esta se añadió NaI04 para dar una concentración final de 200 Se realizó la oxidación a TA durante 30 min en la oscuridad con agitación Se inactivó la reacción con cisteina 10 durante 60 min a se sometió la solución a empleando filtradores centrífugos Vivaspin para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de Se añadió un exceso molar de 50 veces de reactivo con un MW de 20 kD seguido de como catalizador nucleofílico 10 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura Se retiró el exceso de reactivo aminooxi mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían del eluato y se sometieron a mediante el uso de una membrana hecha de celulosa regenerada la preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica Método Como se describió en la la secuencia de aminoácidos de insulina se modificó en primer lugar para incorporar al menos un sitio de Después de la se glicosiló insulina in vitro de acuerdo con los métodos conocidos en la Se transfirió o se disolvió insulina en amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteina de Se corrigió el pH de la solución a mediante añadido por goteo de una solución acuosa de se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 40 en 10 minutos para dar una concentración de 200 Se realizó la reacción de oxidación durante 30 5 min a una temperatura de 2 Se detuvo la reacción mediante el añadido de una solución acuosa de en 15 minutos a 2 para dar una final de 10 mM en la mezcla de reacción e incubación durante 60 5 Se purificó adicionalmente la insulina oxidada mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían insulina oxidada del eluato y se utilizaron para la reacción de conjugación Se añadió el reactivo de ácido en un exceso molar de 50 veces al eluato que contenía la insulina oxidada purificada en un período máximo de 15 minutos con agitación Se añadió una solución acuosa de en 15 minutos para obtener una concentración final de 10 mM Se incubó la mezcla de reacción durante 120 10 a pH en la oscuridad a una temperatura de con agitación suave de 1 Se purificó adicionalmente el conjugado de insulina obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado de y se concentraron mediante iltración utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada con un corte de peso molecular adecuado Se caracterizó analíticamente el conjugado preparado mediante el uso de este procedimiento a través de la medición de la proteína actividad biológica y la determinación del grado de polisialiación mediante la medición del contenido de PSA de Método Como se describió en la la secuencia de aminoácidos de insulina se modificó en primer lugar para incorporar al menos un sitio de Después de la se glicosiló insulina in vitro de acuerdo con los métodos conocidos en la Se transfirió insulina a un amortiguador de reacción 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se diluyó para obtener una concentración de proteina de 1 Se añadió un exceso molar de 50 veces de un reactivo con un MW de 20 kD seguido de toluidina como catalizador nucleofilico mM de concentración y NaI04 400 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura se inactivó la reacción con cisteina durante 60 min a TA de 10 Se ajustó la conductividad de la mezcla de reacción mediante el añadido de un amortiguador que contenía acetato de amonio mM 350 mM cloruro de 5 cloruro de 8 M acetato de pH y se cargó en una columna llena con Phenyl Sepharose FF preequilibrada con 50 mM M acetato de 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de Tween pH se eluyó el conjugado con 50 mM 5 mM cloruro de pH Por se recogieron las fracciones que contenían insulina y se sometieron a mediante el uso de una membrana hecha de celulosa regenerada La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la téenica En una modalidad se realizó el método 3 del siguiente Como se describió en la la secuencia de aminoácidos de insulina se modificó en primer lugar para incorporar al menos un sitio de glicosilación Después de la se glicosiló insulina in vitro de acuerdo con los métodos conocidos en la Se transfirió insulina a un amortiguador de reacción 50 mM 350 cloruro de 5 mM cloruro de pH y se diluyó para obtener una concentración de proteína de 1 Se añadió un exceso molar de 50 veces de un reactivo con un MW de 20 kD seguido de toluidina como catalizador nucleofílico mM de concentración y NaI04 400 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura se inactivó la reacción con cisteina durante 60 min a TA de 10 y se purificó el conjugado mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían del eluato y se sometieron a mediante el uso de una membrana hecha de celulosa regenerada La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Método Como se describió en la la secuencia de aminoácidos de insulina se modificó en primer lugar para incorporar al menos un sitio de Después de la se glicosiló insulina in vitro de acuerdo con los métodos conocidos en la Se transfirió o se disolvió insulina en un amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteína de Se corrigió el pH de la solución a mediante añadido por goteo de una solución acuosa de Posteriormente se añadió el reactivo de ácido en un exceso molar de 50 veces a la solución de insulina en un periodo máximo de 15 minutos con agitación Se añadió una solución acuosa de en 15 minutos para obtener una concentración final de 10 Por se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 40 mM para dar una concentración de 400 Se incubó la mezcla de reacción durante 120 10 min en la oscuridad a una temperatura de 2 con agitación Se detuvo la reacción mediante el añadido de una solución acuosa de para dar una concentración final de 10 mM en la mezcla de reacción e incubación durante 60 5 Se purificó el conjugado de insulina obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían insulina del eluato y se concentraron mediante utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada Se caracterizaron analíticamente los conjugados preparados mediante el uso de este procedimiento a través de la medición de la proteína actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la téenica y la determinación del grado de polisialiación mediante la medición del contenido de PSA de resorcinol Ejemplo 26 Polisialilación de fa utilizando PSA y como catalizador nucleofílico Método Se transfirió una concentración de partida de interf a un amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se diluyó para obtener una concentración de proteína de 1 A esta se añadió NaI04 para dar una concentración final de 200 Se realizó la oxidación a TA durante 30 min en la oscuridad con agitación Se inactivó la reacción con cisteína 10 durante 60 min a se sometió la solución a empleando filtradores centrífugos Vivaspin para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de este en la a una columna IEX con un volumen de 20 mi EMD TMAE que se equilibró con amortiguador A mM 5 mM pH Se equilibró la columna con 5 CV de amortiguador Se eluyó el oxidado con amortiguador B mM Hepe s 5 mM CaCl2 1M NaCl pH 7 0 Se recogie ron las fracciones que contenían Se determinó el contenido de proteína y se ajustó a 1 con amortiguador de reacción y se ajustó a pH mediante añadido de M por Se añadió un exceso molar de 50 veces de reactivo con un MW de 20 kD seguido de como catalizador nucleofilico 10 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura Se retiró el exceso de reactivo aminooxi mediante Se ajustó la conductividad de la mezcla de reacción mediante el añadido de un amortiguador que contenía acetato de amonio mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de 8 M acetato de pH y se cargó en una columna llena con 80 mi de Phenyl Sepharose FF preequi1ibrada con 50 M acetato de 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH se eluyó el conjugado con 50 M de amortiguador Hepes pH que contenía 5 mM Por se recogieron las fracciones que contenían fa y se sometieron a mediante el uso de una membrana hecha de celulosa regenerada la preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteina total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la En una modalidad se realizó el método 1 del siguiente Se transfirió a un amortiguador de reacción 50 mM 350 cloruro de 5 cloruro de pH y se diluyó para obtener una concentración de proteína de 1 A esta se añadió NaI04 para dar una concentración final de 200 Se realizó la oxidación a TA durante 30 min en la oscuridad con agitación Se inactivó la reacción con cisteína 10 durante 60 min a se sometió la solución a empleando filtradores centrífugos Vivaspin para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de Se añadió un exceso molar de 50 veces de reactivo con un MW de 20 kD seguido de como catalizador nucleofílico 10 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura Se retiró el exceso de reactivo aminooxi mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían alfa del eluato y se sometieron a mediante el uso de una membrana hecha de celulosa regenerada la preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Método Se transfirió o se disolvió a en amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteína de Se corrigió el pH de la solución a mediante añadido por goteo de una solución acuosa de se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 40 en 10 minutos para dar una concentración de 200 Se realizó la reacción de oxidación durante 30 5 min a una temperatura de 2 Se detuvo la reacción mediante el añadido de una solución acuosa de en 15 minutos a 2 para dar una concentración final de 10 mM en la mezcla de reacción e incubación durante 60 5 Se purificó adicionalmente el oxidado mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían oxidado del eluato y se utilizaron para la reacción de conjuga Se añadió el reactivo de ácido en un exceso molar de 50 veces al eluato que contenía el oxidado purificado en un período máximo de 15 minutos con agitación Se añadió una solución acuosa de en 15 minutos para obtener una concentración final de 10 Se incubó la mezcla de reacción durante 120 10 min a pH en la oscuridad a una temperatura de con agitación suave de 1 Se purificó adicionalmente el conjugado de obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado de a y se concentraron mediante utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada con un corte de peso molecular adecuado Método Se transfirió a un amortiguador de reacción mM 350 cloruro de 5 mM cloruro de pH y se diluyó para obtener una concentración de proteina de 1 Se añadió un exceso molar de 50 veces de un reactivo PSA aminooxi con un MW de 20 kD seguido de toluidina como catalizador nucleofilico mM de concentración y NaI04 400 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura se inactivó la reacción con cisteína durante 60 min a TA de 10 Se ajustó la conductividad de la mezcla de reacción mediante el añadido de un amortiguador que contenía acetato de amonio mM 350 mM cloruro de 5 cloruro de 8 M acetato de pH y se cargó en una columna llena con Phenyl Sepharose FF preequilibrada con 50 mM M acetato de 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de Tween pH se eluyó el conjugado con 50 mM 5 mM cloruro de pH Por se recogieron las fracciones que contenían interfe y se sometieron a mediante el uso de una membrana hecha de celulosa regenerada La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la En una modalidad se realizó el método 3 del siguiente Se transfirió a un amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se diluyó para obtener una concentración de proteina de 1 Se añadió un exceso molar de 50 veces de un reactivo con un MW de 20 kD seguido de como catalizador nucleofilico mM de concentración y NaI04 400 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura se inactivó la reacción con cisteina durante 60 min a TA de 10 y se purificó el conjugado mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían del eluato y se sometieron a mediante el uso de una membrana hecha de celulosa regenerada La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Método Se transfirió o se disolvió en un amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteina de Se corrigió el pH de la solución a mediante añadido por goteo de una solución acuosa de se añadió el reactivo de ácido en un exceso molar de 50 veces a la solución de en un periodo máximo de 15 minutos con agitación Se añadió una solución acuosa de en 15 minutos para obtener una concentración final de 10 Por se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 40 mM para dar una concentración de 400 Se incubó la mezcla de reacción durante 120 10 min en la oscuridad a una temperatura de 2 con agitación Se detuvo la reacción mediante el añadido de una solución acuosa de para dar una concentración final de 10 mM en la mezcla de reacción e incubación durante 60 5 Se purificó el conjugado de interf obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían ínter del eluato y se concentraron mediante iltración utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada Se caracterizaron analíticamente los conjugados preparados mediante el uso de este procedimiento a través de la medición de la proteína actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la téenica y la determinación del grado de polisialiación mediante la medición del contenido de PSA de resorcinol Ejemplo 27 Polisialilación de utilizando PSA y como catalizador nucleofílico Método Se disolvieron 10 mg de en 5 mi de amortiguador de pH mM 150 mM 100 de una solución acuosa de periodato de sodio se añadió y se incubó la mezcla de reacción durante 1 h en la oscuridad a 4 con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de 50 de 1 M solución acuosa de se sometió la mezcla a empleando filtradores centrífugos Vivaspin 15R 10 kD para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de Se mezcló la fracción retenida 7 que contenía con 2 mi de una solución acuosa de y se incubó durante 30 min a temperatura Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de reactivo de 5 Se incubó esta mezcla durante h a TA en la oscuridad con agitación Se retiró el libre mediante cromatografía de intercambio catiónico Se diluyó la mezcla de reacción con 20 mi de amortiguador A mM pH y se cargó en una columna de 20 mi HiPrep SPFF preequilibrada con amortiguador Se eluyó la columna con amortiguador B mM 1 M pH Se eluyó el libre mediante lavado de la columna con 25 de amortiguador B y el conjugado con 50 de amortiguador La conductividad de las fracciones que contenían el conjugado se elevó a con amortiguador C 5 M pH y se cargó a una columna de 20 mi HiPrep Butyl FF preequilibrada con amortiguador D mM 3 M pH Se lavó el libre dentro de 5 CV de amortiguador Se eluyó el conjugado con 100 de amortiguador E mM pH Se concentraron las fracciones que contenían el conjugado mediante utilizando una membrana de 10 kD hecha de celulosa regenerada corte 10 Se realizó la etapa de diafiltración final contra amortiguador de pH que contenía 150 mM La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Para el conjugado se determinó una actividad específica de 50 en comparación con el se caracterizó analíticamente el conjugado mediante HPLC de exclusión por tamaño utilizando un sistema de HPLC Agilent 1200 equipado con una columna Shodex KW 803 en las condiciones descritas anteriormente et Transfusión Se demostró que la preparación no contiene Método Se disolvieron 10 mg de en 8 mi de amortiguador de pH mM 150 mM Se añadieron 200 de una solución acuosa de periodato de sodio y 2 mi de una solución acuosa de se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de reactivo de 5 Se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de 100 de solución acuosa de cisteina 1 Se retiró el libre mediante cromatografía de intercambio catiónico Se diluyó la mezcla de reacción con 20 mi de amortiguador A mM pH y se cargó en una columna de 20 mi HiPrep SPFF preequilibrada con amortiguador Se eluyó la columna con amortiguador B mM 1 M pH Se eluyó el libre mediante lavado de la columna con 25 de amortiguador B y el conjugado con 50 de amortiguador La conductividad de las fracciones que contenían el conjugado se elevó a con amortiguador C mM 5 M pH y se cargó a una columna de 20 mi HiPrep Butyl FF preequilibrada con amortiguador D 3 M pH Se lavó el libre dentro de 5 CV de amortiguador Se eluyó el conjugado con 100 de amortiguador E mM pH Se concentraron las fracciones que contenían el conjugado mediante utilizando una membrana de 10 kD hecha de celulosa regenerada corte 10 Se realizó la etapa de diafiltración final contra amortiguador de pH que contenía 150 mM La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Para el conjugado se determinó una actividad específica de 50 en comparación con el se caracterizó analíticamente el conjugado mediante HPLC de exclusión por tamaño utilizando un sistema de HPLC Agilent 1200 equipado con una columna Shodex KW 803 en las condiciones descritas anteriormente et Transfusión Se demostró que la preparación no contiene Método Se disolvieron 10 mg de en 8 mi de amortiguador de pH mM 150 mM Se añadieron 200 de una solución acuosa de periodato de sodio y 2 mi de una solución acuosa de se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de reactivo de 5 Se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de 100 de solución acuosa de cisteina 1 Se retiró el libre mediante cromatografía de intercambio catiónico Se diluyó la mezcla de reacción con 20 mi de amortiguador A mM pH y se cargó en una columna de 20 mi HiPrep SPFF preequilibrada con amortiguador Se eluyó la columna con amortiguador B mM 1 M pH Se eluyó el libre mediante lavado de la columna con 25 de amortiguador B y el conjugado con 50 de amortiguador La conductividad de las fracciones que contenían el conjugado se elevó a con amortiguador C mM 5 M pH y se cargó a una columna de 20 mi HiPrep Butyl FF preequilibrada con amortiguador D mM 3 M pH Se lavó el libre dentro de 5 CV de amortiguador Se eluyó el conjugado con de amortiguador E mM pH Se concentraron las fracciones que contenían el conjugado mediante utilizando una membrana de 10 kD hecha de celulosa regenerada corte 10 Se realizó la etapa de diafilt ración final contra amortiguador de pH que contenia 150 mM La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Para el conjugado se determinó una actividad específica de 50 en comparación con el ínter se caracterizó analíticamente el conjugado mediante HPLC de exclusión por tamaño utilizando un sistema de HPLC Agilent 1200 equipado con una columna Shodex 803 en las condiciones descritas anteriormente et Transfusión Se demostró que la preparación no contiene Método Se transfirió o se disolvió en un amortiguador de reacción 50 mM 350 cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteína de Se corrigió el pH de la solución a mediante añadido por goteo de una solución acuosa de Posteriormente se añadió el reactivo de ácido en un exceso molar de 50 veces a la solución de en un período máximo de 15 minutos con agitación Se añadió una solución acuosa de en 15 minutos para obtener una concentración final de 10 Por se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 40 mM para dar una concentración de 400 Se incubó la mezcla de reacción durante 120 10 min en la oscuridad a una temperatura de 2 con agitación Se detuvo la reacción mediante el añadido de una solución acuosa de para dar una concentración final de 10 mM en la mezcla de reacción e incubación durante 60 5 Se purificó el conjugado de obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían del eluato y se concentraron mediante ación utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada Se caracterizaron analíticamente los conjugados preparados mediante el uso de este procedimiento a través de la medición de la proteína actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la téenica y la determinación del grado de polisialiación mediante la medición del contenido de PSA de resorcinol Ejemplo 28 Polisialilación de utilizando y toluidina como catalizador nucleofilico Método Se transfirió una concentración de partida de factor estimulante de colonia de granulocitos a un amortiguador de reacción 50 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se diluyó para obtener una concentración de proteina de 1 A esta se añadió NaI04 para dar una concentración final de 200 Se realizó la oxidación a TA durante 30 min en la oscuridad con agitación Se inactivó la reacción con cisteina 10 durante 60 min a se sometió la solución a empleando filtradores centrífugos Vivaspin para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de este en la a una columna IEX con un volumen de 20 EMD TMAE que se equilibró con amortiguador A 5 mM pH Se equilibró la columna con 5 CV de amortiguador Se eluyó el oxidado con amortiguador B mM 5 rtiM 1 M pH Se recogieron las fracciones que contenían Se determinó el contenido de proteína y se ajustó a 1 con amortiguador de reacción y se ajustó a pH mediante añadido de M por Se añadió un exceso molar de 50 veces de reactivo con un MW de 20 kD seguido de como catalizador nucleofílico 10 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura Se retiró el exceso de reactivo aminooxi mediante Se ajustó la conductividad de la mezcla de reacción mediante el añadido de un amortiguador que contenía acetato de amonio mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de 8 M acetato de pH y se cargó en una columna llena con 80 mi de Phenyl Sepharose FF preequilibrada con 50 mM M acetato de 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH se eluyó el conjugado con 50 mM de amortiguador Hepes pH que contenía 5 mM Por se recogieron las fracciones que contenían y se sometieron a mediante el uso de una membrana hecha de celulosa regenerada la preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteina total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la En una modalidad se realizó el método 1 del siguiente Se transfirió factor estimulante de colonia de granulocitos a un amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se diluyó para obtener una concentración de proteina de 1 A esta se añadió NaI04 para dar una concentración final de 200 Se realizó la oxidación a TA durante 30 min en la oscuridad con agitación Se inactivó la reacción con cisteina 10 durante 60 min a se sometió la solución a empleando filtradores centrífugos Vivaspin para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de Se añadió un exceso molar de 50 veces de reactivo con un MW de 20 kD seguido de como catalizador nucleofílico 10 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura Se retiró el exceso de reactivo aminooxi mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían del eluato y se sometieron a mediante el uso de una membrana hecha de celulosa regenerada la preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteina total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la téenica Método Se transfirió o se disolvió en amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteina de Se corrigió el pH de la solución a mediante añadido por goteo de una solución acuosa de se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 40 mM en 10 minutos para dar una concentración de 200 Se realizó la reacción de oxidación durante 30 5 in a una temperatura de 2 Se detuvo la reacción mediante el añadido de una solución acuosa de en 15 minutos a 2 para dar una concentración final de 10 mM en la mezcla de reacción e incubación durante 60 5 Se puri f i có adicionalmente el oxidado mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían oxidado del eluato y se utilizaron para la reacción de conjugación Se añadió el reactivo de ácido en un exceso molar de 50 veces al eluato que contenía oxidado purificado en un período máximo de 15 minutos con agitación Se añadió una solución acuosa de en 15 minutos para obtener una concentración final de 10 mM Se incubó la mezcla de reacción durante 120 10 a pH en la oscuridad a una temperatura de con agitación suave de 1 Se purificó adicionalmente el conjugado de CSF obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado de y se concentraron mediante utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada con un corte de peso molecular adecuado Se caracterizó analíticamente el conjugado preparado mediante el uso de este procedimiento a través de la medición de la proteína actividad biológica y la determinación del grado de polisialiación mediante la medición del contenido de PSA de Método Se transfirió factor estimulante de colonia de granulocitos a un amortiguador de reacción 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se diluyó para obtener una concentración de proteina de 1 Se añadió un exceso molar de 50 veces de un reactivo con un MW de 20 kD seguido de toluidina como catalizador nucleofilico mM de concentración y NaI04 400 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura se inactivó la reacción con cisteina durante 60 min a TA de 10 Se ajustó la conductividad de la mezcla de reacción mediante el añadido de un amortiguador que contenia acetato de amonio mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de 8 M acetato de pH y se cargó en una columna llena con Phenyl Sepharose FF preequilibrada con 50 mM M acetato de 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de Tween pH se eluyó el conjugado con 50 mM 5 mM cloruro de pH Por se recogieron las fracciones que contenían y se sometieron a mediante el uso de una membrana hecha de celulosa regenerada La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la téenica En una modalidad se realizó el método 3 del siguiente Se transfirió factor estimulante de colonia de granulocitos a un amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 cloruro de pH y se diluyó para obtener una concentración de proteína de 1 Se añadió un exceso molar de 50 veces de un reactivo con un MW de 20 kD seguido de toluidina como catalizador nucleofílico mM de concentración y NaI04 400 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura se inactivó la reacción con cisteína durante 60 min a TA de 10 y se purificó el conjugado mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían del eluato y se sometieron a mediante el uso de una membrana hecha de celulosa regenerada La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Método Se transfirió o se disolvió en un amortiguador de reacción 50 mM 350 cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteína de Se corrigió el pH de la solución a mediante añadido por goteo de una solución acuosa de se añadió el reactivo de ácido en un exceso molar de 50 veces a la solución de en un período máximo de 15 minutos con agitación Se añadió una solución acuosa de en 15 minutos para obtener una concentración final de 10 Por se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 40 mM para dar una concentración de 400 Se incubó la mezcla de reacción durante 120 10 min en la oscuridad a una temperatura de 2 con agitación Se detuvo la reacción mediante el añadido de una solución acuosa de para dar una concentración final de 10 mM en la mezcla de reacción e incubación durante 60 5 Se purificó el conjugado de obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían del eluato y se concentraron mediante utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada Se caracterizaron analíticamente los conjugados preparados mediante el uso de este procedimiento a través de la medición de la proteína actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la téenica y la determinación del grado de polisialiación mediante la medición del contenido de PSA de resorcinol Ejemplo 29 Polisialilación de Humira utilizando y toluidina como catalizador nucleofílico Método Se transfirió una concentración de partida de Humira a un amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se diluyó para obtener una concentración de proteína de 1 A esta se añadió NaI04 para dar una concentración final de 200 m Se realizó la oxidación a TA durante 30 min en la oscuridad con agitación Se inactivó la reacción con cisteína 10 durante 60 min a se sometió la solución a empleando filtradores centrífugos Vivaspin para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de este en la a una columna IEX con un volumen de 20 mi EMD TMAE que se equilibró con amortiguador A mM 5 mM pH Se equilibró la columna con 5 CV de amortiguador Se eluyó el Humira oxidado con amortiguador B mM 5 mM 1M pH Se recogieron las fracciones que contenían Se determinó el contenido de proteína y se ajustó a 1 con amortiguador de reacción y se ajustó a pH mediante añadido de M por Se añadió un exceso molar de 50 veces de reactivo con un MW de 20 kD seguido de como catalizador nucleofílico 10 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura Se retiró el exceso de reactivo aminooxi mediante Se ajustó la conductividad de la mezcla de reacción mediante el añadido de un amortiguador que contenía acetato de amonio mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de 8 M acetato de pH y se cargó en una columna llena con 80 mi de Phenyl Sepharose FF preequilibrada con 50 mM M acetato de 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH se eluyó el conjugado con 50 mM de amortiguador Hepes pH que contenia 5 mM Por se recogieron las fracciones que contenían y se sometieron a mediante el uso de una membrana hecha de celulosa regenerada la preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la En una modalidad se realizó el método 1 del siguiente Se transfirió Humira a un amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se diluyó para obtener una concentración de proteína de 1 A esta se añadió NaI04 para dar una concentración final de 200 Se realizó la oxidación a TA durante 30 min en la oscuridad con agitación Se inactivó la reacción con cisteína 10 durante 60 min a se sometió la solución a empleando filtradores centrífugos Vivaspin para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de Se añadió un exceso molar de 50 veces de reactivo con un MW de 20 kD seguido de como catalizador nucleofílico 10 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura Se retiró el exceso de reactivo aminooxi mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el del eluato y se sometieron a mediante el uso de una membrana hecha de celulosa regenerada la preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la téenica Método Se transfirió o se disolvió Humira en amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteína de Se corrigió el pH de la solución a mediante añadido por goteo de una solución acuosa de se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 40 mM en 10 minutos para dar una concentración de 200 Se realizó la reacción de oxidación durante 30 5 min a una temperatura de 2 Se detuvo la reacción mediante el añadido de una solución acuosa de en 15 minutos a 2 para dar una concentración final de 10 en la mezcla de reacción e incubación durante 60 5 Se purificó adicionalmente el Humira oxidado mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían Humira oxidado del eluato y se utilizaron para la reacción de conjugación Se añadió el reactivo de ácido en un exceso molar de 50 veces al eluato que contenía Humira oxidado purificado en un período máximo de 15 minutos con agitación Se añadió una solución acuosa de en 15 minutos para obtener una concentración final de 10 Se incubó la mezcla de reacción durante 120 10 min a pH en la oscuridad a una temperatura de con agitación suave de 1 Se purificó adicionalmente el conjugado de Humira obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado de y se concentraron mediante iltración utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada con un corte de peso molecular adecuado Se caracterizó analíticamente el conjugado preparado mediante el uso de este procedimiento a través de la medición de la proteína actividad biológica y la determinación del grado de polisialiación mediante la medición del contenido de PSA de Método Se transfirió Humira a un amortiguador de reacción 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se diluyó para obtener una concentración de proteína de 1 Se añadió un exceso molar de 50 veces de un reactivo con un MW de 20 kD seguido de toluidina como catalizador nucleofílico mM de concentración y NaI04 400 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura se inactivó la reacción con cisteina durante 60 min a TA de 10 Se ajustó la conductividad de la mezcla de reacción mediante el añadido de un amortiguador que contenia acetato de amonio mM 350 cloruro de 5 M cloruro de 8 M acetato de pH y se cargó en una columna llena con Phenyl Sepharose FF preequilibrada con 50 mM M acetato de 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de Tween pH se eluyó el conjugado con 50 mM 5 mM cloruro de pH Por se recogieron las fracciones que contenían Humira y se sometieron a mediante el uso de una membrana hecha de celulosa regenerada La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la téenica En una modalidad se realizó el método 3 del siguiente Se transfirió Humira a un amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se diluyó para obtener una concentración de proteína de 1 Se añadió un exceso molar de 50 veces de un reactivo con un MW de 20 kD seguido de como catalizador nucleofílico mM de concentración y NaI04 400 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura se inactivó la reacción con cisteina durante 60 min a TA de 10 y se purificó el conjugado mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían del eluato y se sometieron a mediante el uso de una membrana hecha de celulosa regenerada La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Método Se transfirió o se disolvió Hu ira en un amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteína de Se corrigió el pH de la solución a mediante añadido por goteo de una solución acuosa de se añadió el reactivo de ácido en un exceso molar de 50 veces a la solución de Humira en un período máximo de 15 minutos con agitación Se añadió una solución acuosa de en 15 minutos para obtener una concentración final de 10 Por se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 40 mM para dar una concentración de 400 Se incubó la mezcla de reacción durante 120 10 min en la oscuridad a una temperatura de 2 con agitación Se detuvo la reacción mediante el añadido de una solución acuosa de para dar una concentración final de 10 en la mezcla de reacción e incubación durante 60 5 Se purificó el conjugado de Humira obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían Humira del eluato y se concentraron mediante utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada Se caracterizaron analíticamente los conjugados preparados mediante el uso de este procedimiento a través de la medición de la proteína actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la téenica y la determinación del grado de polisialiación mediante la medición del contenido de PSA de resorcinol Ejemplo 30 Polisialilación de Prolia utilizando y toluidina como catalizador nucleofilico Método Se transfirió una concentración de partida de Prolia a un amortiguador de reacción 50 mM 350 M cloruro de 5 mM cloruro de pH y se diluyó para obtener una concentración de proteina de 1 A esta se añadió NaI04 para dar una concentración final de 200 Se realizó la oxidación a TA durante 30 min en la oscuridad con agitación Se inactivó la reacción con cisteina 10 durante 60 min a se sometió la solución a empleando filtradores centrífugos Vivaspin para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de este en la a una columna IEX con un volumen de 20 i EMD TMAE que se equilibró con amortiguador A mM 5 mM pH Se equilibró la columna con 5 CV de amortiguador Se eluyó el Prolia oxidado con amortiguador B M 5 mM 1M pH Se recogieron las fracciones que contenían Se determinó el contenido de proteína y se ajustó a 1 con amortiguador de reacción y se ajustó a pH mediante añadido de M por Se añadió un exceso molar de 50 veces de reactivo con un MW de 20 kD seguido de como catalizador nucleofilico 10 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura Se retiró el exceso de reactivo aminooxi mediante Se ajustó la conductividad de la mezcla de reacción mediante el añadido de un amortiguador que contenía acetato de amonio mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de 8 M acetato de pH y se cargó en una columna llena con 80 mi de Phenyl Sepharose FF preequilibrada con 50 mM M acetato de 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH se eluyó el conjugado con 50 mM de amortiguador Hepes pH que contenía 5 mM Por se recogieron las fracciones que contenían y se sometieron a mediante el uso de una membrana hecha de celulosa regenerada la preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la En una modalidad se realizó el método 1 del siguiente Se disolvieron 10 mg de Prolia en 5 mi de amortiguador de pH mM 150 mM 100 de una solución acuosa de periodato de sodio se añadió y se incubó la mezcla de reacción durante 1 h en la oscuridad a 4 con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de 50 de 1 M solución acuosa de se sometió la mezcla a empleando filtradores centrífugos Vivaspin 15R 10 kD para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de Se mezcló la fracción retenida 7 que contenía Prolia con 2 mi de una solución acuosa de y se incubó durante 30 a temperatura Se añadió reactivo con un de 20 kD para dar un exceso molar de reactivo de 5 Se incubó esta mezcla durante h a TA en la oscuridad con agitación suave Se retiró el Prolia libre mediante cromatografía de intercambio catiónico Se diluyó la mezcla de reacción con 20 mi de amortiguador A mM pH y se cargó en una columna de 20 mi HiPrep SPFF preequilibrada con amortiguador Se eluyó la columna con amortiguador B mM 1 M pH Se eluyó el Prolia libre mediante lavado de la columna con 25 de amortiguador B y el conjugado con 50 de amortiguador La conductividad de las fracciones que contenían el conjugado se elevó a con amortiguador C mM 5 M pH y se cargó a una columna de 20 mi HiPrep Butyl FF preequilibrada con amortiguador D mM 3 M pH Se lavó el libre dentro de 5 CV de amortiguador Se eluyó el conjugado con 100 de amortiguador E mM pH Se concentraron las fracciones que contenían el conjugado mediante utilizando una membrana de 10 kD hecha de celulosa regenerada corte 10 Se realizó la etapa de diafiltración final contra amortiguador de pH que contenía 150 mM La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Para el conjugado se determinó una actividad específica de 50 en comparación con el Prolia se caracterizó analíticamente el conjugado mediante HPLC de exclusión por tamaño utilizando un sistema de HPLC Agilent 1200 equipado con una columna Shodex KW 803 en las condiciones descritas anteriormente et Transfusión Se demostró que la preparación no contiene Prolia Método Se transfirió o se disolvió Prolia en amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteina de Se corrigió el pH de la solución a mediante añadido por goteo de una solución acuosa de se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 40 mM en 10 minutos para dar una concentración de 200 Se realizó la reacción de oxidación durante 30 5 min a una temperatura de 2 Se detuvo la reacción mediante el añadido de una solución acuosa de en 15 minutos a 2 para dar una concentración final de 10 mM en la mezcla de reacción e incubación durante 60 5 Se purificó adicionalmente el Prolia oxidado mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían Prolia oxidado del eluato y se utilizaron para la reacción de conjugación Se añadió el reactivo de ácido en un exceso molar de 50 veces al eluato que contenía Prolia oxidado purificado en un período máximo de 15 minutos con agitación Se añadió una solución acuosa de en 15 minutos para obtener una concentración final de 10 Se incubó la mezcla de reacción durante 120 10 min a pH en la oscuridad a una temperatura de con agitación suave de 1 Se purificó adicionalmente el conjugado de Prolia obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado de Prolia y se concentraron mediante utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada con un corte de peso molecular adecuado Se caracterizó analíticamente el conjugado preparado mediante el uso de este procedimiento a través de la medición de la proteína actividad biológica y la determinación del grado de polisialiación mediante la medición del contenido de PSA de Método Se transfirió Prolia a un amortiguador de reacción mM 350 cloruro de 5 mM cloruro de pH y se diluyó para obtener una concentración de proteina de 1 Se añadió un exceso molar de 50 veces de un reactivo con un MW de 20 kD seguido de toluidina como catalizador nucleofilico mM de concentración y NaI04 400 Se realizó la reacción de acoplamiento durante 2 horas en la oscuridad con agitación suave a temperatura se inactivó la reacción con cisteina durante 60 min a TA de 10 Se ajustó la conductividad de la mezcla de reacción mediante el añadido de un amortiguador que contenia acetato de amonio mM 350 cloruro de 5 mM cloruro de 8 M acetato de pH y se cargó en una columna llena con Phenyl Sepharose FF preequilibrada con 50 mM M acetato de 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de Tween pH se eluyó el conjugado con 50 mM 5 mM cloruro de pH Por se recogieron las fracciones que contenían PSA Prolia y se sometieron a mediante el uso de una membrana hecha de celulosa regenerada La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteina total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la En una modalidad se realizó el método 3 del siguiente Se disolvieron 10 mg de Prolia en 8 mi de amortiguador de pH mM 150 mM Se añadieron 200 de una solución acuosa de periodato de sodio y 2 mi de una solución acuosa de se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de reactivo de 5 Se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de 100 de solución acuosa de cisteína 1 Se retiró el Prolia libre mediante cromatografía de intercambio catiónico Se diluyó la mezcla de reacción con 20 mi de amortiguador A mM pH y se cargó en una columna de 20 mi HiPrep SPFF preequilibrada con amortiguador Se eluyó la columna con amortiguador B mM 1 M pH Se eluyó el Prolia libre mediante lavado de la columna con 25 de amortiguador B y el conjugado con de amortiguador La conductividad de las fracciones que contenían el conjugado se elevó a con amortiguador C mM 5 M pH y se cargó a una columna de 20 HiPrep Butyl FF preequilibrada con amortiguador D mM 3 M pH Se lavó el libre dentro de 5 CV de amortiguador Se eluyó el conjugado con de amortiguador E mM pH Se concentraron las fracciones que contenían el conjugado mediante utilizando una membrana de 10 kD hecha de celulosa regenerada corte 10 Se realizó la etapa de diafiltración final contra amortiguador de pH que contenía 150 mM La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Para el conjugado se determinó una actividad específica de 50 en comparación con el Prolia se caracterizó analíticamente el conjugado mediante HPLC de exclusión por tamaño utilizando un sistema de HPLC Agilent 1200 equipado con una columna Shodex KW 803 en las condiciones descritas anteriormente et Transfusión Se demostró que la preparación no contiene Prolia Método Se transfirió o se disolvió Prolia en un amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 M cloruro de pH para obtener una concentración final de proteina de Se corrigió el pH de la solución a mediante añadido por goteo de una solución acuosa de se añadió el reactivo de ácido en un exceso molar de 50 veces a la solución de Prolia en un periodo máximo de 15 minutos con agitación Se añadió una solución acuosa de en 15 minutos para obtener una concentración final de 10 Por se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 40 para dar una concentración de 400 Se incubó la mezcla de reacción durante 120 10 min en la oscuridad a una temperatura de 2 con agitación Se detuvo la reacción mediante el añadido de una solución acuosa de para dar una concentración final de 10 mM en la mezcla de reacción e incubación durante 60 5 Se purificó el conjugado de Prolia obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían Prolia del eluato y se concentraron mediante utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada Se caracterizaron analíticamente los conjugados preparados mediante el uso de este procedimiento a través de la medición de la proteína actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la téenica y la determinación del grado de polisialiación mediante la medición del contenido de PSA de resorcinol Ejemplo 31 Polisialilación de otras proteínas terapéuticas Las reacciones de polisialilación realizadas en presencia de catalizadores nucleofí líeos alternativos como o ácido según se describe se pueden extender a otras proteínas Por en diversos aspectos de la las reacciones de polisialilación o PEGilación según se describen con reactivos PSA aminooxi o PEG aminooxi se repiten con proteínas terapéuticas como las proteínas descritas en la Ejemplo 32 PEGilación de utilizando un reactivo y como catalizador nucleofilico Método Se realizó la PEGilación de eritropoyetina mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se disolvió EPO en de amortiguador de pH 150 mM 5 mM Se añadió una solución acuosa de periodato de sodio y se incubó la mezcla de reacción durante 1 h en la oscuridad a 4 con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de de 1 M solución acuosa de se sometió la mezcla a empleando filtradores centrífugos Vivaspin para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de Se mezcló la fracción que contenía EPO con una solución acuosa de y se incubó durante 30 min a temperatura Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de reactivo de 5 Se incubó esta mezcla durante h a temperatura ambiente en la oscuridad con agitación Por se purificó el conjugado de mediante cromatografía de intercambio iónico sobre Q Sepharose Por se cargaron mg de gel en la columna equilibrada con 50 mM amortiguador pH que contenía 5 mM Se eluyó el conjugado con 50 mM amortiguador Hepes que contenía 5 mM CaCl2 y 500 mM cloruro de pH y se sometió a utilizando una membrana de corte de MW la preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la téenica En una modalidad se realizó el método 1 del siguiente Se realizó la PEGilación de EPO mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Corp Se disolvieron 10 mg de EPO en 5 mi de amortiguador de pH mM 150 mM de una solución acuosa de periodato de sodio se añadió y se incubó la mezcla de reacción durante 1 h en la oscuridad a 4 con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de 50 de 1 M solución acuosa de se sometió la mezcla a empleando filtradores centrífugos Vivaspin 15R 10 kD para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de Se mezcló la fracción retenida 7 que contenía EPO con 2 mi de una solución acuosa de y se incubó durante 30 min a temperatura Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de reactivo de 5 Se incubó esta mezcla durante h a TA en la oscuridad con agitación suave Por se purificó el conjugado de mediante cromatografía de intercambio iónico sobre Q Sepharose Se diluyó la mezcla de reacción con 20 mi de amortiguador A mM pH y se cargó en una columna de 20 mi HiPrep QFF preequilibrada con amortiguador Se eluyó la columna con amortiguador B mM 1 M pH Se eluyó el EPO libre mediante lavado de la columna con 25 de amortiguador B y el conjugado con 50 de amortiguador Se concentraron las fracciones que contenían el conjugado mediante utilizando una membrana de 10 kD hecha de celulosa regenerada corte 10 Se realizó la etapa de diafiltración final contra amortiguador de pH que contenía 150 mM La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Para el conjugado se determinó una actividad específica de 50 en comparación con el EPO se caracterizó analíticamente el conjugado mediante HPLC de exclusión por tamaño utilizando un sistema de HPLC Agilent 1200 equipado con una columna Shodex KW 803 en las condiciones descritas anteriormente et Transfusión Se demostró que la preparación no contiene EPO Método Se realizó la PEGilación de EPO mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se transfirió o se disolvió EPO en amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteína de Se corrigió el de la solución a mediante añadido por goteo de una solución acuosa de se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 40 mM en 10 minutos para dar una concentración de 200 Se realizó la reacción de oxidación durante 30 5 min a una temperatura de 2 Se detuvo la reacción mediante el añadido de una solución acuosa de en 15 minutos a 2 para dar una concentración final de 10 mM en la mezcla de reacción e incubación durante 60 5 Se purificó adicionalmente el EPO oxidado mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían EPO oxidado del eluato y se utilizaron para la reacción de Se añadió el reactivo de con un MW de 20 kD en un exceso molar de 50 veces al eluato que contenía el EPO oxidado purificado en un período máximo de 15 minutos con agitación Se añadió una solución acuosa de en 15 minutos para obtener una concentración final de 10 m Se incubó la mezcla de reacción durante 120 10 min en la oscuridad a una temperatura de 2 con agitación Se purificó adicionalmente el conjugado de EPO obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado de y se concentraron mediante utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada con un corte de peso molecular adecuado Se caracterizó analíticamente el conjugado preparado mediante el uso de este procedimiento mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la téenica Método Se realizó la PEGilación de mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se disolvió EPO en amortiguador Hepes mM 150 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se mezcló con una solución acuosa de periodato de sodio y una solución acuosa de se añadió el reactivo aminooxi para dar un exceso molar de 20 veces de Se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de 8 de solución acuosa de cisteina Por se purificó el conjugado de mediante cromatografía de intercambio iónico sobre Q Sepharose Se cargaron mg de gel en la columna preequi1ibrada con 50 mM amortiguador pH que contenía 5 mM Se eluyó el conjugado con 50 mM amortiguador Hepes que contenía 5 mM CaCl2 y 500 mM cloruro de pH y se sometió a utilizando una La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la En una modalidad se realizó el método 3 del siguiente Se realizó la PEGilación de EPO mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Corp Se disolvieron 10 mg de EPO en mi de amortiguador de pH mM 150 mM Se añadieron 200 de una solución acuosa de periodato de sodio y 2 mi de una solución acuosa de se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de reactivo de 5 Se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de 100 de solución acuosa de cisteina 1 Por se purificó el conjugado de mediante cromatografía de intercambio iónico sobre Q Sepharose Se diluyó la mezcla de reacción con 20 mi de amortiguador A pH y se cargó en una columna de 20 HiPrep QFF preequilibrada con amortiguador Se eluyó la columna con amortiguador B mM 1 M pH Se eluyó el EPO libre mediante lavado de la columna con 25 de amortiguador B y el conjugado con 50 de amortiguador Se concentraron las fracciones que contenían el conjugado mediante utilizando una membrana de 10 kD hecha de celulosa regenerada corte 10 Se realizó la etapa de diafiltración final contra amortiguador de pH que contenía 150 mM La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Para el conjugado se determinó una actividad específica de 50 en comparación con el EPO se caracterizó analíticamente el conjugado mediante HPLC de exclusión por tamaño utilizando un sistema de HPLC Agilent 1200 equipado con una columna Shodex KW 803 en las condiciones descritas anteriormente et Transfusión Se demostró que la preparación no contiene EPO Método Se realizó la PEGilación de EPO mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se transfirió una concentración o peso inicial de EPO o se disolvió en amortiguador Hepes mM 150 mM cloruro de 5 cloruro de pH para obtener una concentración final de proteína de 2 mg EPO se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 5 mM en 15 minutos para dar una concentración final de 100 seguido del añadido de una solución acuosa de 50 mM para obtener una concentración final de 10 mM en un período de 30 Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de 20 veces de Después de la corrección del pH a se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de solución acuosa de 1 M para dar una concentración final de 10 Se purificó el conjugado de mediante cromatografía de intercambio iónico Se concentraron las fracciones que contenían el conjugado del eluato mediante utilizando una membrana de 10 kD hecha de celulosa regenerada corte 10 Se realizó la etapa de diafiltración final contra el amortiguador Hepes mM 5 CaCl2 pH La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y procedimiento y la actividad biológica de acuerdo con los métodos Ejemplo 33 PEGilación de utilizando un reactivo y como catalizador nucleofílico Método Se realizó la PEGilación de mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se disolvió en mi de amortiguador de pH 150 mM 5 mM Se añadió una solución acuosa de periodato de sodio y se incubó la mezcla de reacción durante 1 h en la oscuridad a 4 con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de de 1 M solución acuosa de se sometió la mezcla a empleando filtradores centrífugos Vivaspin para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de Se mezcló la fracción que contenía con una solución acuosa de y se incubó durante 30 min a temperatura Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de reactivo de 5 Se incubó esta mezcla durante h a temperatura ambiente en la oscuridad con agitación Por se purificó el conjugado de mediante cromatografía de intercambio iónico sobre Q Sepharose Por se cargaron mg de gel en la columna equilibrada con 50 mM amortiguador pH que contenia 5 mM Se eluyó el conjugado con 50 mM amortiguador Hepes que contenía 5 mM CaCl2 y 500 cloruro de pH y se sometió a utilizando una membrana de corte de MW la preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la téenica En una modalidad se realizó el método 1 del siguiente Se realizó la PEGilación de mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se disolvió en mi de amortiguador de pH mM 150 mM 5 mM Se añadió una solución acuosa de periodato de sodio y se incubó la mezcla de reacción durante 1 h en la oscuridad a 4 con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de de 1 M solución acuosa de se sometió la mezcla a empleando filtradores centrífugos Vivaspin para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de Se mezcló la fracción que contenía con una solución acuosa de y se incubó durante 30 min a temperatura Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de reactivo de 5 Se incubó esta mezcla durante h a temperatura ambiente en la oscuridad con agitación Por se purificó el conjugado de obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado del eluato y se sometieron a utilizando una membrana de corte de MW la preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Método Se realizó la PEGilación de mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se transfirió o se disolvió en amortiguador de reacción 50 M 350 mM cloruro de 5 M cloruro de pH para obtener una concentración final de proteína de Se corrigió el pH de la solución a mediante añadido por goteo de una solución acuosa de se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 40 mM en 10 minutos para dar una concentración de 200 Se realizó la reacción de oxidación durante 30 5 min a una temperatura de 2 Se detuvo la reacción mediante el añadido de una solución acuosa de en 15 minutos a 2 para dar una concentración final de 10 mM en la mezcla de reacción e incubación durante 60 5 Se purificó adicionalmente el oxidado mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían oxidado del eluato y se utilizaron para la reacción de conjugación Se añadió el reactivo de con un MW de 20 kD en un exceso molar de 50 veces al eluato que contenía el oxidado purificado en un período máximo de 15 minutos con agitación Se añadió una solución acuosa de en 15 minutos para obtener una concentración final de 10 Se incubó la mezcla de reacción durante 120 10 min en la oscuridad a una temperatura de 2 con agitación Se purificó adicionalmente el conjugado de obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado de y se concentraron mediante utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada con un corte de peso molecular adecuado Se caracterizó analíticamente el conjugado preparado mediante el uso de este procedimiento mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la téenica Método Se realizó la PEGilación de mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se disolvió en amortiguador Hepes mM 150 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se mezcló con una solución acuosa de periodato de sodio y una solución acuosa de toluidina se añadió el reactivo aminooxi para dar un exceso molar de 20 veces de Se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de 8 de solución acuosa de cisteina Por se purificó el conjugado de mediante cromatografía de intercambio iónico sobre Q Sepharose Se cargaron mg de gel en la columna preequilibrada con 50 mM amortiguador pH que contenía 5 mM Se eluyó el conjugado con 50 mM amortiguador Hepes que contenía 5 mM CaCl2 y 500 mM cloruro de pH y se sometió a utilizando una La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la En una modalidad se realizó el método 3 del siguiente Se realizó la PEGilación de mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se disolvió en amortiguador Hepes mM 150 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se mezcló con una solución acuosa de periodato de sodio y una solución acuosa de se añadió el reactivo aminooxi para dar un exceso molar de 20 veces de Se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de 8 de solución acuosa de cisteina Por se purificó el conjugado de obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado del eluato y se sometieron a La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Método Se realizó la PEGilación de mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se transfirió una concentración o peso inicial de o se disolvió en amortiguador Hepes mM 150 mM cloruro de 5 cloruro de pH para obtener una concentración final de proteína de 2 mg se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 5 mM en 15 minutos para dar una concentración final de 100 seguido del añadido de una solución acuosa de toluidina 50 mM para obtener una concentración final de 10 mM en un periodo de 30 Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de 20 veces de Después de la corrección del pH a se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de solución acuosa de 1 M para dar una concentración final de 10 mM Se purificó el conjugado de mediante cromatografía de intercambio iónico Se concentraron las fracciones que contenían el conjugado del eluato mediante utilizando una membrana de 10 kD hecha de celulosa regenerada corte 10 Se realizó la etapa de diafiltración final contra el amortiguador Hepes 5 mM pH La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y procedimiento y la actividad biológica de acuerdo con los métodos se retiró el libre mediante cromatografía de intercambio iónico Se concentraron las fracciones que contenían el conjugado del eluato mediante Ejemplo 34 PEGilación de VEGF utilizando un reactivo y como catalizador nucleofílico Método Se realizó la PEGilación de VEGF mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se disolvió VEGF en de amortiguador de pH mM 150 mM 5 mM Se añadió una solución acuosa de periodato de sodio y se incubó la mezcla de reacción durante 1 h en la oscuridad a 4 con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de de 1 M solución acuosa de se sometió la mezcla a empleando filtradores centrífugos Vivaspin para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de Se mezcló la fracción que contenía VEGF con una solución acuosa de y se incubó durante 30 min a temperatura Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de reactivo de 5 Se incubó esta mezcla durante h a temperatura ambiente en la oscuridad con agitación Por se purificó el conjugado de VEGF mediante cromatografía de intercambio iónico sobre Q Sepharose Por se cargaron mg de gel en la columna equilibrada con 50 mM amortiguador pH que contenía 5 mM Se eluyó el conjugado con 50 mM amortiguador Hepes que contenía 5 mM CaCl2 y 500 cloruro de pH y se sometió a utilizando una membrana de corte de MW la preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la téenica En una modalidad se realizó el método 1 del siguiente Se realizó la PEGilación de VEGF mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se disolvió VEGF en mi de amortiguador de pH mM 150 5 M Se añadió una solución acuosa de periodato de sodio y se incubó la mezcla de reacción durante 1 h en la oscuridad a 4 con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de de 1 M solución acuosa de se sometió la mezcla a empleando filtradores centrífugos Vivaspin para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de Se mezcló la fracción que contenía VEGF con una solución acuosa de y se incubó durante 30 min a temperatura Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de reactivo de 5 Se incubó esta mezcla durante h a temperatura ambiente en la oscuridad con agitación Por se purificó el conjugado de VEGF obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado del eluato y se sometieron a utilizando una membrana de corte de MW la preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Método Se realizó la PEGilación de VEGF mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenia un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF transfirió o se disolvió VEGF en amortiguador de reacción 50 350 cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteina de Se corrigió el pH de la solución a mediante añadido por goteo de una solución acuosa de se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 40 en 10 minutos para dar una concentración de 200 Se realizó la reacción de oxidación durante 30 5 a una temperatura de 2 Se detuvo la reacción mediante el añadido de una solución acuosa de en 15 minutos a 2 para dar una concentración final de 10 mM en la mezcla de reacción e incubación durante 60 5 Se purificó adicionalmente el VEGF oxidado mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían VEGF oxidado del eluato y se utilizaron para la reacción de Se añadió el reactivo de con un MW de 20 kD en un exceso molar de 50 veces al eluato que contenía el VEGF oxidado purificado en un período máximo de 15 minutos con agitación Se añadió una solución acuosa de en 15 minutos para obtener una concentración final de 10 Se incubó la mezcla de reacción durante 120 10 min en la oscuridad a una temperatura de 2 con agitación Se purificó adicionalmente el conjugado de obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado de y se concentraron mediante tración utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada con un corte de peso molecular adecuado Se caracterizó analíticamente el conjugado preparado mediante el uso de este procedimiento mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Método Se realizó la PEGilación de VEGF mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se disolvió VEGF en amortiguador Hepes mM 150 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se mezcló con una solución acuosa de periodato de sodio y una solución acuosa de se añadió el reactivo aminooxi para dar un exceso molar de 20 veces de Se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 a temperatura ambiente mediante el añadido de 8 de solución acuosa de cisteína Por se purificó el conjugado de VEGF mediante cromatografía de intercambio iónico sobre Q Sepharose Se cargaron mg de gel en la columna preequilibrada con 50 mM amortiguador pH que contenía 5 mM Se eluyó el conjugado con 50 mM amortiguador Hepes que contenía 5 M CaCl2 y 500 mM cloruro de pH y se sometió a utilizando una La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la En una modalidad se realizó el método 3 del siguiente Se realizó la PEGilación de VEGF mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se disolvió VEGF en amortiguador Hepes mM 150 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se mezcló con una solución acuosa de periodato de sodio y una solución acuosa de se añadió el reactivo aminooxi para dar un exceso molar de 20 veces de Se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de 8 de solución acuosa de cisteina Por se purificó el conjugado de obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado del eluato y se sometieron a La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Método Se realizó la PEGilación de VEGF mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Tokio Se transfirió una concentración o peso inicial de VEGF o se disolvió en amortiguador Hepes mM 150 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteina de 2 mg VEGF se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 5 mM en 15 minutos para dar una concentración final de 100 seguido del añadido de una solución acuosa de 50 mM para obtener una concentración final de 10 mM en un periodo de 30 Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de 20 veces de Después de la corrección del pH a se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de solución acuosa de 1 M para dar una concentración final de 10 Se purificó el conjugado de mediante cromatografía de intercambio iónico Se concentraron las fracciones que contenían el conjugado del eluato mediante utilizando una membrana de 10 kD hecha de celulosa regenerada corte 10 Se realizó la etapa de diafiltración final contra el amortiguador Hepes mM 5 mM CaCl2 La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y procedimiento y la actividad biológica de acuerdo con los métodos Ejemplo 35 PEGilación de EGF utilizando un reactivo y como catalizador nucleofílico Método Se realizó la PEGilación de EGF mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se disolvió EGF en mi de amortiguador de pH 150 mM 5 mM Se añadió una solución acuosa de periodato de sodio y se incubó la mezcla de reacción durante 1 h en la oscuridad a 4 con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de de 1 M solución acuosa de se sometió la mezcla a empleando filtradores centrífugos Vivaspin para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de Se mezcló la fracción que contenía EGF con una solución acuosa de y se incubó durante 30 min a temperatura Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de reactivo de 5 Se incubó esta mezcla durante a temperatura ambiente en la oscuridad con agitación Por se purificó el conjugado de mediante cromatografía de intercambio iónico sobre Q Sepharose Por se cargaron mg de gel en la columna equilibrada con 50 mM amortiguador pH que contenía 5 mM Se eluyó el conjugado con 50 mM amortiguador Hepes que contenía 5 mM CaCl2 y 500 mM cloruro de pH y se sometió a utilizando una membrana de corte de MW la preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la téenica En una modalidad se realizó el método 1 del siguiente Se realizó la PEGilación de EGF mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Corp Se disolvió EGF en mi de amortiguador de pH mM 150 mM 5 Se añadió una solución acuosa de periodato de sodio y se incubó la mezcla de reacción durante 1 h en la oscuridad a 4 con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de de 1 M solución acuosa de se sometió la mezcla a empleando filtradores centrífugos Vivaspin para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de Se mezcló la fracción que contenía EGF con una solución acuosa de y se incubó durante 30 min a temperatura Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de reactivo de 5 Se incubó esta mezcla durante h a temperatura ambiente en la oscuridad con agitación Por se purificó el conjugado de obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado del eluato y se sometieron a utilizando una membrana de corte de MW la preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica Método Se realizó la PEGilación de EGF mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se transfirió o se disolvió EGF en amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteína de Se corrigió el pH de la solución a mediante añadido por goteo de una solución acuosa de se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 40 mM en 10 minutos para dar una concentración de 200 Se realizó la reacción de oxidación durante 30 5 min a una temperatura de 2 Se detuvo la reacción mediante el añadido de una solución acuosa de en 15 minutos a 2 para dar una concentración final de 10 mM en la mezcla de reacción e incubación durante 60 5 Se purificó adicionalmente el EGF oxidado mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían EGF oxidado del eluato y se utilizaron para la reacción de Se añadió el reactivo de con un MW de 20 kD en un exceso molar de 50 veces al eluato que contenía el NGF oxidado purificado en un período máximo de 15 minutos con agitación Se añadió una solución acuosa de en 15 minutos para obtener una concentración final de 10 Se incubó la mezcla de reacción durante 120 10 min en la oscuridad a una temperatura de 2 con agitación Se purificó adicionalmente el conjugado de EGF obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado de y se concentraron mediante utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada con un corte de peso molecular adecuado Se caracterizó analíticamente el conjugado preparado mediante el uso de este procedimiento mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la téenica Método Se realizó la PEGilación de EGF mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se disolvió EGF en amortiguador Hepes mM 150 mM cloruro de 5 mM cloruro de y se mezcló con una solución acuosa de periodato de sodio y una solución acuosa de se añadió el reactivo aminooxi para dar un exceso molar de 20 veces de Se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de 8 de solución acuosa de cisteína Por se purificó el conjugado de mediante cromatografía de intercambio iónico sobre Sepharose Se cargaron mg de gel en la columna preequilibrada con 50 mM amortiguador pH que contenía 5 mM Se eluyó el conjugado con 50 mM amortiguador Hepes que contenía 5 mM CaCl2 y 500 mM cloruro de pH y se sometió a utilizando una La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la En una modalidad se realizó el método 3 del siguiente Se realizó la PEGilación de EGF mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se disolvió EGF en amortiguador Hepes mM 150 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se mezcló con una solución acuosa de periodato de sodio y una solución acuosa de se añadió el reactivo aminooxi para dar un exceso molar de 20 veces de Se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de 8 de solución acuosa de cisteina Por se purificó el conjugado de obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado del eluato y se sometieron a La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Método Se realizó la PEGilación de EGF mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF To kio Se transfirió una concentración o peso inicial de EGF o se disolvió en amortiguador Hepes mM 150 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteína de 2 mg EGF se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 5 mM en 15 minutos para dar una concentración final de 100 seguido del añadido de una solución acuosa de 50 mM para obtener una concentración final de 10 mM en un período de 30 Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de 20 veces de Después de la corrección del pH a se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de solución acuosa de 1 M para dar una concentración final de 10 Se purificó el conjugado de mediante cromatografía de intercambio iónico Se concentraron las fracciones que contenían el conjugado del eluato mediante utilizando una membrana de 10 kD hecha de celulosa regenerada corte 10 Se realizó la etapa de diafiltración final contra el amortiguador Hepes mM 5 mM pH La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y procedimiento y la actividad biológica de acuerdo con los métodos Ejemplo 36 PEGilación de NGF utilizando un reactivo y como catalizador nucleofílico Método Se realizó la PEGilación de NGF mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se disolvió NGF en mi de amortiguador de pH mM 150 5 mM Se añadió una solución acuosa de periodato de sodio y se incubó la mezcla de reacción durante 1 h en la oscuridad a 4 con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de de 1 M solución acuosa de se sometió la mezcla a empleando filtradores centrífugos Vivaspin para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de Se mezcló la fracción que contenía NGF con una solución acuosa de y se incubó durante 30 min a temperatura Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de reactivo de 5 Se incubó esta mezcla durante h a temperatura ambiente en la oscuridad con agitación Por se purificó el conjugado de mediante cromatografía de intercambio iónico sobre Por se cargaron mg de gel en la columna equilibrada con 50 mM amortiguador pH que contenía 5 mM Se eluyó el conjugado con 50 mM amortiguador Hepes que contenía 5 mM CaCl2 y 500 mM cloruro de pH y se sometió a utilizando una membrana de corte de MW la preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la En una modalidad se realizó el método 1 del siguiente Se realizó la PEGilación de NGF mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Corp Tokio Se disolvió NGF en mi de amortiguador de pH 150 mM 5 mM Se añadió una solución acuosa de periodato de sodio y se incubó la mezcla de reacción durante 1 h en la oscuridad a 4 con agitación suave y se inactivó durante 15 a temperatura ambiente mediante el añadido de de 1 M solución acuosa de se sometió la mezcla a empleando filtradores centrífugos Vivaspin para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de Se mezcló la fracción que contenía NGF con una solución acuosa de y se incubó durante 30 min a temperatura Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de reactivo de 5 Se incubó esta mezcla durante h a temperatura ambiente en la oscuridad con agitación Por se purificó el conjugado de obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado del eluato y se sometieron a utilizando una membrana de corte de MW la preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Método Se realizó la PEGilación de NGF mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenia un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se transfirió o se disolvió NGF en amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteina de Se corrigió el pH de la solución a mediante añadido por goteo de una solución acuosa de se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 40 mM en 10 minutos para dar una concentración de 200 Se realizó la reacción de oxidación durante 30 5 a una temperatura de 2 Se detuvo la reacción mediante el añadido de una solución acuosa de en 15 minutos a 2 para dar una concentración final de 10 mM en la mezcla de reacción e incubación durante 60 5 Se purificó adicionalmente el NGF oxidado mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían NGF oxidado del eluato y se utilizaron para la reacción de Se añadió el reactivo de con un MW de 20 kD en un exceso molar de 50 veces al eluato que contenía el NGF oxidado purificado en un período máximo de 15 minutos con agitación Se añadió una solución acuosa de en 15 minutos para obtener una concentración final de 10 m Se incubó la mezcla de reacción durante 120 10 min en la oscuridad a una temperatura de 2 con agitación Se purificó adicionalmente el conjugado de NGF obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado de y se concentraron mediante utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada con un corte de peso molecular adecuado Se caracterizó analíticamente el conjugado preparado mediante el uso de este procedimiento mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la téenica Método Se realizó la PEGilación de NGF mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenia un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se disolvió NGF en amortiguador Hepes mM 150 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se mezcló con una solución acuosa de periodato de sodio y una solución acuosa de se añadió el reactivo aminooxi para dar un exceso molar de 20 veces de Se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de 8 de solución acuosa de cisteina Por se purificó el conjugado de mediante cromatografía de intercambio iónico sobre Q Sepharose Se cargaron de gel en la columna preequilibrada con 50 mM amortiguador pH que contenía 5 mM Se eluyó el conjugado con 50 mM amortiguador Hepes que contenía 5 mM CaCl2 y 500 mM cloruro de pH y se sometió a utilizando una La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la En una modalidad se realizó el método 3 del siguiente Se realizó la PEGilación de NGF mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Corp Se disolvió NGF en amortiguador Hepes mM 150 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se mezcló con una solución acuosa de periodato de sodio y una solución acuosa de se añadió el reactivo aminooxi para dar un exceso molar de 20 veces de Se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de 8 de solución acuosa de cisteína Por se purificó el conjugado de obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado y se sometieron a La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Método Se realizó la PEGilación de NGF mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se transfirió una concentración o peso inicial de NGF o se disolvió en amortiguador Hepes mM 150 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteína de 2 mg NGF se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 5 mM en 15 minutos para dar una concentración final de 100 seguido del añadido de una solución acuosa de 50 mM para obtener una concentración final de 10 mM en un período de 30 Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de 20 veces de Después de la corrección del pH a se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 a temperatura ambiente mediante el añadido de solución acuosa de 1 M para dar una concentración final de 10 Se purificó el conjugado de NGF mediante cromatografía de intercambio iónico Se concentraron las fracciones que contenían el conjugado del eluato mediante utilizando una membrana de 10 kD hecha de celulosa regenerada corte 10 Se realizó la etapa de diafiltración final contra el amortiguador Hepes 5 mM pH La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y procedimiento y la actividad biológica de acuerdo con los métodos Ejemplo 37 PEGilación de HGH utilizando un reactivo y como catalizador nucleofílico Método Como se describió en la la secuencia de aminoácidos de la hormona del crecimiento humano se modificó en primer lugar para incorporar al menos un sitio de Después de la se glicosiló HGH in vitro de acuerdo con los métodos conocidos en la Se realizó la PEGilación de HGH mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright de NOF Se disolvió HGH en de amortiguador de pH mM 150 mM 5 mM Se añadió una solución acuosa de periodato de sodio y se incubó la mezcla de reacción durante 1 h en la oscuridad a 4 con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de de 1 M solución acuosa de se sometió la mezcla a empleando filtradores centrífugos Vivaspin para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de Se mezcló la fracción que contenía HGH con una solución acuosa de y se incubó durante 30 min a temperatura Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de reactivo de 5 Se incubó esta mezcla durante h a temperatura ambiente en la oscuridad con agitación Por se purificó el conjugado de HGH mediante cromatografía de intercambio iónico sobre Q Sepharose Por se cargaron mg de gel en la columna equilibrada con 50 mM amortiguador pH que contenía 5 mM Se eluyó el conjugado con 50 mM amortiguador Hepes que contenía 5 mM CaCl2 y 500 mM cloruro de pH y se sometió a utilizando una membrana de corte de MW la preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteina total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la téenica En una modalidad se realizó el método 1 del siguiente Como se describió en la la secuencia de aminoácidos de la hormona del crecimiento humano se modificó en primer lugar para incorporar al menos un sitio de Después de la se glicosiló HGH in vitro de acuerdo con los métodos conocidos en la Se realizó la PEGilación de HGH mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenia un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se disolvió HGH en mi de amortiguador de pH mM 150 mM 5 mM Se añadió una solución acuosa de periodato de sodio y se incubó la mezcla de reacción durante 1 h en la oscuridad a 4 con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de de M solución acuosa de se sometió la mezcla a empleando filtradores centrífugos Vivaspin para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de Se mezcló la fracción que contenía HGH con una solución acuosa de y se incubó durante 30 min a temperatura Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de reactivo de 5 Se incubó esta mezcla durante h a temperatura ambiente en la oscuridad con agitación Por se purificó el conjugado de obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado del eluato y se sometieron a utilizando una membrana de corte de MW la preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Método Como se describió en la la secuencia de aminoácidos de la hormona del crecimiento humano se modificó en primer lugar para incorporar al menos un sitio de Después de la se glicosiló HGH in vitro de acuerdo con los métodos conocidos en la Se realizó la PEGilación de HGH mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se transfirió o se disolvió HGH en amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteina de Se corrigió el pH de la solución a mediante añadido por goteo de una solución acuosa de se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 40 mM en 10 minutos para dar una concentración de 200 Se realizó la reacción de oxidación durante 30 5 min a una temperatura de 2 Se detuvo la reacción mediante el añadido de una solución acuosa de en 15 minutos a 2 para dar una concentración final de 10 mM en la mezcla de reacción e incubación durante 60 5 Se purificó adicionalmente el HGH oxidado mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían HGH oxidado del eluato y se utilizaron para la reacción de Se añadió el reactivo de con un MW de 20 kD en un exceso molar de 50 veces al eluato que contenía el HGH oxidado purificado en un período máximo de 15 minutos con agitación Se añadió una solución acuosa de en 15 minutos para obtener una concentración final de 10 Se incubó la mezcla de reacción durante 120 10 min en la oscuridad a una temperatura de 2 con agitación Se purificó adicionalmente el conjugado de HGH obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado de y se concentraron mediante utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada con un corte de peso molecular adecuado Se caracterizó analíticamente el conjugado preparado mediante el uso de este procedimiento mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la téenica Método Como se describió en la la secuencia de aminoácidos de la hormona del crecimiento humano se modificó en primer lugar para incorporar al menos un sitio de Después de la se glicosiló HGH in vitro de acuerdo con los métodos conocidos en la Se realizó la PEGilación de HGH mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenia un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se disolvió HGH en amortiguador Hepes mM 150 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se mezcló con una solución acuosa de periodato de sodio y una solución acuosa de se añadió el reactivo aminooxi para dar un exceso molar de 20 veces de Se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de 8 de solución acuosa de cisterna Por se purificó el conjugado de mediante cromatografía de intercambio iónico sobre Sepharose Se cargaron mg de gel en la columna preequilibrada con 50 mM amortiguador pH que contenía 5 mM Se eluyó el conjugado con 50 M amortiguador Hepes que contenía 5 M CaCl2 y 500 mM cloruro de pH y se sometió a utilizando una La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la En una modalidad se realizó el método 3 del siguiente Como se describió en la la secuencia de aminoácidos de la hormona del crecimiento humano se modificó en primer lugar para incorporar al menos un sitio de Después de la se glicosiló HGH in vitro de acuerdo con los métodos conocidos en la Se realizó la PEGilación de HGH mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se disolvió HGH en amortiguador Hepes M 150 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se mezcló con una solución acuosa de periodato de sodio y una solución acuosa de se añadió el reactivo aminooxi para dar un exceso molar de 20 veces de Se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de 8 de solución acuosa de cisteína Por se purificó el conjugado de obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado y se sometieron a La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Método Como se describió en la la secuencia de aminoácidos de la hormona del crecimiento humano se modificó en primer lugar para incorporar al menos un sitio de Después de la se glicosiló HGH in vitro de acuerdo con los métodos conocidos en la Se realizó la PEGilación de HGH mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenia un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se transfirió una concentración o peso inicial de HGH o se disolvió en amortiguador Hepes mM 150 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteina de 2 mg HGH se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 5 mM en 15 minutos para dar una concentración final de 100 seguido del añadido de una solución acuosa de 50 mM para obtener una concentración final de 10 mM en un periodo de 30 Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de 20 veces de Después de la corrección del pH a se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de solución acuosa de 1 M para dar una concentración final de 10 Se purificó el conjugado de PEG HGH mediante cromatografía de intercambio iónico Se concentraron las fracciones que contenían el conjugado del eluato mediante utilizando una membrana de 10 kD hecha de celulosa regenerada corte 10 Se realizó la etapa de diafiltración final contra el amortiguador Hepes mM 5 pH La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y procedimiento y la actividad biológica de acuerdo con los métodos Ejemplo 38 PEGilación de utilizando un reactivo PEG y como catalizador nucleofílico Método Se realizó la PEGilación de mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright de NOF Se disolvió en mi de amortiguador de pH 150 mM 5 Se añadió una solución acuosa de periodato de sodio y se incubó la mezcla de reacción durante 1 h en la oscuridad a 4 con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de de 1 M solución acuosa de se sometió la mezcla a empleando filtradores centrífugos Vivaspin para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de Se mezcló la fracción que contenía alfa con una solución acuosa de y se incubó durante 30 min a temperatura Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de reactivo de 5 Se incubó esta mezcla durante h a temperatura ambiente en la oscuridad con agitación Por se purificó el conjugado de alfa mediante cromatografía de intercambio iónico sobre Por se cargaron g de gel en la columna equilibrada con 50 mM amortiguador pH que contenía 5 mM Se eluyó el conjugado con 50 mM amortiguador Hepes que contenía 5 mM CaCl2 y 500 mM cloruro de pH y se sometió a utilizando una membrana de corte de MW la preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la En una modalidad se realizó el método 1 del siguiente Se realizó la PEGilación de alfa mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se disolvió en mi de amortiguador de pH mM 150 mM 5 mM Se añadió una solución acuosa de periodato de sodio y se incubó la mezcla de reacción durante en la oscuridad a 4 con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de de 1 M solución acuosa de se sometió la mezcla a empleando filtradores centrífugos Vivaspin para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de Se mezcló la fracción que contenía alfa con una solución acuosa de y se incubó durante 30 min a temperatura Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de reactivo de 5 Se incubó esta mezcla durante h a temperatura ambiente en la oscuridad con agitación Por se purificó el conjugado de alfa obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado del eluato y se sometieron a utilizando una membrana de corte de MW la preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Método Se realizó la PEGilación de mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se transfirió o se disolvió en amortiguador de reacción 50 mM 350 cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteína de Se corrigió el pH de la solución a mediante añadido por goteo de una solución acuosa de se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 40 mM en 10 minutos para dar una concentración de 200 Se realizó la reacción de oxidación durante 30 5 min a una temperatura de 2 Se detuvo la reacción mediante el añadido de una solución acuosa de en 15 minutos a 2 para dar una concentración final de 10 mM en la mezcla de reacción e incubación durante 60 5 Se purificó adicionalmente el oxidado mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían oxidado del eluato y se utilizaron para la reacción de conjugación Se añadió el reactivo de con un MW de 20 kD en un exceso molar de 50 veces al eluato que contenía el oxidado purificado en un período máximo de 15 minutos con agitación Se añadió una solución acuosa de en 15 minutos para obtener una concentración final de 10 m Se incubó la mezcla de reacción durante 120 10 min en la oscuridad a una temperatura de 2 con agitación Se purificó adicionalmente el conjugado de obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado de y se concentraron mediante iltración utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada con un corte de peso molecular adecuado Se caracterizó analíticamente el conjugado preparado mediante el uso de este procedimiento mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Método Se realizó la PEGilación de mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se disolvió en amortiguador Hepes mM 150 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se mezcló con una solución acuosa de periodato de sodio y una solución acuosa de se añadió el reactivo aminooxi para dar un exceso molar de 20 veces de Se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de 8 de solución acuosa de cisteina Por se purificó el conjugado de alfa mediante cromatografía de intercambio iónico sobre Se cargaron mg de gel en la columna preequilibrada con 50 mM amortiguador pH que contenía 5 mM Se eluyó el conjugado con 50 amortiguador Hepes que contenía 5 mM CaCl2 y 500 cloruro de pH y se sometió a utilizando una La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la En una modalidad se realizó el método 3 del siguiente Se realizó la PEGilación de alfa mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se disolvió en amortiguador Hepes mM 150 cloruro de 5 mM cloruro de pH y se mezcló con una solución acuosa de periodato de sodio y una solución acuosa de se añadió el reactivo aminooxi para dar un exceso molar de 20 veces de Se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de 8 de solución acuosa de cisterna Por se purificó el conjugado de alfa obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado y se sometieron a La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Método Se realizó la PEGilación de mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se transfirió una concentración o peso inicial de o se disolvió en amortiguador Hepes mM 150 mM cloruro de 5 cloruro de pH para obtener una concentración final de proteína de 2 mg se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 5 mM en 15 minutos para dar una concentración final de 100 seguido del añadido de una solución acuosa de toluidina 50 mM para obtener una concentración final de 10 mM en un periodo de 30 Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de 20 veces de Después de la corrección del pH a se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de solución acuosa de 1 M para dar una concentración final de 10 mM Se purificó el conjugado de mediante cromatografía de intercambio iónico Se concentraron las fracciones que contenían el conjugado del eluato mediante utilizando una membrana de 10 kD hecha de celulosa regenerada corte 10 Se realizó la etapa de diafiltración final contra el amortiguador Hepes mM 5 mM pH La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y procedimiento y la actividad biológica de acuerdo con los métodos Ejemplo 39 PEGilación de insulina utilizando un reactivo PEG y como catalizador nucleofilico Método Como se describió en la la secuencia de aminoácidos de insulina se modificó en primer lugar para incorporar al menos un sitio de Después de la se glicosiló insulina in vitro de acuerdo con los métodos conocidos en la Se realizó la PEGilación de insulina mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenia un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se disolvió insulina en mi de amortiguador de pH mM 150 mM 5 mM Se añadió una solución acuosa de periodato de sodio y se incubó la mezcla de reacción durante 1 h en la oscuridad a 4 con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de de 1 M solución acuosa de se sometió la mezcla a empleando filtradores centrífugos Vivaspin para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de Se mezcló la fracción que contenia insulina con una solución acuosa de y se incubó durante 30 min a temperatura Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de reactivo de 5 Se incubó esta mezcla durante h a temperatura ambiente en la oscuridad con agitación Por se purificó el conjugado de insulina mediante cromatografía de intercambio iónico sobre Por se cargaron mg de gel en la columna equilibrada con 50 mM amortiguador pH que contenía 5 mM Se eluyó el conjugado con 50 mM amortiguador Hepes que contenía 5 mM CaCl2 y 500 mM cloruro de pH y se sometió a utilizando una membrana de corte de MW la preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la En una modalidad se realizó el método 1 del siguiente Como se describió en la la secuencia de aminoácidos de insulina se modificó en primer lugar para incorporar al menos un sitio de glicosilación Después de la se glicosiló insulina in vitro de acuerdo con los métodos conocidos en la Se realizó la PEGilación de insulina mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Corp Se disolvió insulina en mi de amortiguador de pH mM 150 mM 5 mM Se añadió una solución acuosa de periodato de sodio y se incubó la mezcla de reacción durante 1 h en la oscuridad a 4 con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de de 1 M solución acuosa de se sometió la mezcla a empleando filtradores centrífugos Vivaspin para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de Se mezcló la fracción que contenía insulina con una solución acuosa de y se incubó durante 30 min a temperatura Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de reactivo de 5 Se incubó esta mezcla durante h a temperatura ambiente en la oscuridad con agitación Por se purificó el conjugado de insulina obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado del eluato y se sometieron a utilizando una membrana de corte de MW la preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Método Como se describió en la la secuencia de aminoácidos de insulina se modificó en primer lugar para incorporar al menos un sitio de Después de la se glicosiló insulina in vitro de acuerdo con los métodos conocidos en la Se realizó la PEGilación de insulina mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se transfirió o se disolvió insulina en amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteína de Se corrigió el pH de la solución a mediante añadido por goteo de una solución acuosa de se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 40 mM en 10 minutos para dar una concentración de 200 mM Se realizó la reacción de oxidación durante 30 5 min a una temperatura de 2 Se detuvo la reacción mediante el añadido de una solución acuosa de en 15 minutos a 2 para dar una concentración final de 10 mM en la mezcla de reacción e incubación durante 60 5 Se purificó adicionalmente la insulina oxidada mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían insulina oxidada del eluato y se utilizaron para la reacción de Se añadió el reactivo de con un MW de 20 kD en un exceso molar de 50 veces al eluato que contenía insulina oxidada purificada en un período máximo de 15 minutos con agitación Se añadió una solución acuosa de en 15 minutos para obtener una concentración final de 10 Se incubó la mezcla de reacción durante 120 10 min en la oscuridad a una temperatura de 2 con agitación Se purificó adicionalmente el conjugado de insulina obtenido mediante de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado de insulina y se concentraron mediante iltración utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada con un corte de peso molecular adecuado Se caracterizó analíticamente el conjugado preparado mediante el uso de este procedimiento mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la téenica Método Como se describió en la la secuencia de aminoácidos de insulina se modificó en primer lugar para incorporar al menos un sitio de Después de la se glicosiló insulina in vitro de acuerdo con los métodos conocidos en la Se realizó la PEGilación de insulina mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se disolvió insulina en amortiguador Hepes mM 150 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se mezcló con una solución acuosa de periodato de sodio y una solución acuosa de se añadió el reactivo aminooxi para dar un exceso molar de 20 veces de Se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de 8 de solución acuosa de cisteina Por se purificó el conjugado de insulina mediante cromatografía de intercambio iónico sobre Q Sepharose Se cargaron mg de gel en la columna preequilibrada con 50 mM amortiguador pH que contenía 5 mM Se eluyó el conjugado con 50 mM amortiguador Hepes que contenía 5 mM CaCl2 y 500 cloruro de pH y se sometió a utilizando una La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la En una modalidad se realizó el método 3 del siguiente Como se describió en la la secuencia de aminoácidos de insulina se modificó en primer lugar para incorporar al menos un sitio de glicosilació Después de la se glicosiló insulina in vitro de acuerdo con los métodos conocidos en la Se realizó la PEGilación de insulina mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se disolvió insulina en amortiguador Hepes mM 150 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se mezcló con una solución acuosa de periodato de sodio y una solución acuosa de se añadió el reactivo aminooxi para dar un exceso molar de 20 veces de Se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de 8 de solución acuosa de cisteina Por se purificó el conjugado de insulina obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado y se sometieron a La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Método Como se describió en la la secuencia de aminoácidos de insulina se modificó en primer lugar para incorporar al menos un sitio de Después de la se glicosiló insulina in vitro de acuerdo con los métodos conocidos en la Se realizó la PEGilación de insulina mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenia un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se transfirió una concentración o peso inicial de insulina o se disolvió en amortiguador Hepes mM 150 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteina de 2 mg insulina se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 5 mM en 15 minutos para dar una concentración final de 100 seguido del añadido de una solución acuosa de toluidina 50 para obtener una concentración final de 10 mM en un periodo de 30 Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de 20 veces de Después de la corrección del pH a se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de solución acuosa de 1 M para dar una concentración final de 10 mM Se purificó el conjugado de PEG insulina mediante cromatografía de intercambio iónico Se concentraron las fracciones que contenían el conjugado del eluato mediante utilizando una membrana de 10 kD hecha de celulosa regenerada corte 10 Se realizó la etapa de diafiltración final contra el amortiguador Hepes mM 5 CaCl pH La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y procedimiento y la actividad biológica de acuerdo con los métodos Ejemplo 40 PEGilación de utilizando un reactivo y como catalizador nucleofílico Método Se realizó la PEGilación de mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Corp Se disolvió en mi de amortiguador de pH M 150 mM 5 mM Se añadió una solución acuosa de periodato de sodio y se incubó la mezcla de reacción durante 1 h en la oscuridad a 4 con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de de 1 M solución acuosa de se sometió la mezcla a empleando filtradores centrífugos Vivaspin para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de Se mezcló la fracción que contenía ínter con una solución acuosa de toluidina y se incubó durante 30 a temperatura Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de reactivo de 5 Se incubó esta mezcla durante h a temperatura ambiente en la oscuridad con agitación suave Por se purificó el conjugado de mediante cromatografía de intercambio iónico sobre Por se cargaron mg de gel en la columna equilibrada con 50 mM amortiguador pH que contenía 5 M Se eluyó el conjugado con 50 mM amortiguador Hepes que contenía 5 mM CaCl2 y 500 mM cloruro de pH y se sometió a utilizando una membrana de corte de MW la preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la En una modalidad se realizó el método 1 del siguiente Se realizó la PEGilación de mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenia un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se disolvió en mi de amortiguador de pH mM 150 5 mM Se añadió una solución acuosa de periodato de sodio y se incubó la mezcla de reacción durante 1 h en la oscuridad a 4 con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de de 1 M solución acuosa de se sometió la mezcla a empleando filtradores centrífugos Vivaspin para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de Se mezcló la fracción que contenía con una solución acuosa de toluidina y se incubó durante 30 a temperatura Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de reactivo de 5 Se incubó esta mezcla durante h a temperatura ambiente en la oscuridad con agitación suave Por último se purificó el conjugado de inte obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado y se sometieron a utilizando una membrana de corte de MW la preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Método Se realizó la PEGilación de mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se transfirió o se disolvió a en amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteína de Se corrigió el pH de la solución a mediante añadido por goteo de una solución acuosa de se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 40 mM en 10 minutos para dar una concentración de 200 Se realizó la reacción de oxidación durante 30 5 min a una temperatura de 2 Se detuvo la reacción mediante el añadido de una solución acuosa de en 15 minutos a 2 para dar una concentración final de 10 mM en la mezcla de reacción e incubación durante 60 5 Se purificó adicionalmente el oxidado mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían oxidado del eluato y se utilizaron para la reacción de Se añadió el reactivo de con un MW de 20 kD en un exceso molar de 50 veces al eluato que contenía el inter oxidado purificado en un período máximo de 15 minutos con agitación Se añadió una solución acuosa de en 15 minutos para obtener una concentración final de 10 Se incubó la mezcla de reacción durante 120 10 min en la oscuridad a una temperatura de 2 con agitación Se purificó adicionalmente el conjugado de a obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado de y se concentraron mediante ón utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada con un corte de peso molecular adecuado Se caracterizó analíticamente el conjugado preparado mediante el uso de este procedimiento mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Método Se realizó la PEGilación de mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se disolvió en amortiguador Hepes mM 150 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se mezcló con una solución acuosa de periodato de sodio y una solución acuosa de se añadió el reactivo aminooxi para dar un exceso molar de 20 veces de Se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 in a temperatura ambiente mediante el añadido de 8 de solución acuosa de cisteína Por se purificó el conjugado de fa mediante cromatografía de intercambio iónico sobre Se cargaron mg de gel en la columna preequilibrada con 50 amortiguador pH que contenía 5 mM Se eluyó el conjugado con 50 amortiguador Hepes que contenía 5 mM CaCl2 y 500 mM cloruro de pH y se sometió a utilizando una La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la téenica En una modalidad se realizó el método 3 del siguiente Se realizó la PEGilación de fa mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo aminooxi Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se disolvió en amortiguador Hepes mM 150 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se mezcló con una solución acuosa de periodato de sodio y una solución acuosa de se añadió el reactivo aminooxi para dar un exceso molar de 20 veces de Se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 a temperatura ambiente mediante el añadido de 8 de solución acuosa de cisteína Por se purificó el conjugado de interf obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado y se sometieron a utilizando una La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Método Se realizó la PEGilación de mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se transfirió una concentración o peso inicial de o se disolvió en amortiguador Hepes mM 150 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteína de 2 se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 5 mM en 15 minutos para dar una concentración final de 100 seguido del añadido de una solución acuosa de 50 mM para obtener una concentración final de 10 mM en un período de 30 Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de 20 veces de Después de la corrección del pH a se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de solución acuosa de 1 M para dar una concentración final de 10 Se purificó el conjugado de mediante cromatografía de intercambio iónico Se concentraron las fracciones que contenían el conjugado del eluato mediante utilizando una membrana de 10 kD hecha de celulosa regenerada corte 10 Se realizó la etapa de diafiltración final contra el amortiguador Hepes mM 5 mM pH La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y procedimiento y la actividad biológica de acuerdo con los métodos Ejemplo 41 PEGilación de ínter utilizando un reactivo y como catalizador nucleofílico Método Se realizó la PEGilación de mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Corp Se disolvieron 10 mg de ínter en 5 mi de amortiguador de pH mM 150 100 de una solución acuosa de periodato de sodio se añadió y se incubó la mezcla de reacción durante 1 h en la oscuridad a 4 con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de 50 de 1 M solución acuosa de se sometió la mezcla a empleando filtradores centrífugos Vivaspin 15R 10 kD para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de Se mezcló la fracción retenida 7 que contenía con 2 mi de una solución acuosa de y se incubó durante 30 min a temperatura Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de reactivo de 5 Se incubó esta mezcla durante h a TA en la oscuridad con agitación Por se purificó el conjugado de mediante cromatografía de intercambio iónico sobre SP Sepharose Se diluyó la mezcla de reacción con 20 mi de amortiguador A mM pH y se cargó en una columna de 20 mi HiPrep SPFF preequilibrada con amortiguador Se eluyó la columna con amortiguador B mM 1 M pH Se eluyó el gamma libre mediante lavado de la columna con 25 de amortiguador B y el conjugado con 50 de amortiguador Se concentraron las fracciones que contenían el conjugado mediante utilizando una membrana de 10 kD hecha de celulosa regenerada corte 10 Se realizó la etapa de diafiltración final contra amortiguador de pH que contenía 150 La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Para el conjugado se determinó una actividad específica de 50 en comparación con el se caracterizó analíticamente el conjugado mediante HPLC de exclusión por tamaño utilizando un sistema de HPLC Agilent 1200 equipado con una columna Shodex KW 803 en las condiciones descritas anteriormente et al Transfusión Se demostró que la preparación no contiene l ibr e 2 Se realizó la PEGilación de mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se transfirió o se disolvió ínter en amortiguador de reacción 50 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteína de Se corrigió el pH de la solución a mediante añadido por goteo de una solución acuosa de se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 40 mM en 10 minutos para dar una concentración de 200 Se realizó la reacción de oxidación durante 30 5 min a una temperatura de 2 Se detuvo la reacción mediante el añadido de una solución acuosa de en 15 minutos a 2 para dar una concentración final de 10 mM en la mezcla de reacción e incubación durante 60 5 Se purificó adicionalmente el oxidado mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían oxidado del eluato y se utilizaron para la reacción de conj Se añadió el reactivo de con un MW de 20 kD en un exceso molar de 50 veces al eluato que contenía el oxidado purificado en un período máximo de 15 minutos con agitación Se añadió una solución acuosa de en 15 minutos para obtener una concentración final de 10 Se incubó la mezcla de reacción durante 120 10 min en la oscuridad a una temperatura de 2 con agitación Se purificó adicionalmente el conjugado de inter obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado de y se concentraron mediante utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada con un corte de peso molecular adecuado Se caracterizó analíticamente el conjugado preparado mediante el uso de este procedimiento mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la téenica Método Se realizó la PEGilación de mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se disolvieron 10 mg de en mi de amortiguador de pH mM 150 mM Se añadieron 200 de una solución acuosa de periodato de sodio y 2 mi de una solución acuosa de se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de reactivo de 5 Se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 in a temperatura ambiente mediante el añadido de 100 de solución acuosa de cisteína 1 Por se purificó el conjugado de mediante cromatografía de intercambio iónico sobre Se diluyó la mezcla de reacción con 20 mi de amortiguador A mM pH y se cargó en una columna de 20 mi HiPrep SP FF preequilibrada con amortiguador Se eluyó la columna con amortiguador B mM 1 M pH Se eluyó el gamma libre mediante lavado de la columna con 25 de amortiguador B y el conjugado con 50 de amortiguador Se concentraron las fracciones que contenían el conjugado mediante utilizando una membrana de 10 kD hecha de celulosa regenerada corte 10 Se realizó la etapa de diafiltración final contra amortiguador de pH que contenía 150 La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Para el conjugado se determinó una actividad específica de 50 en comparación con el se caracterizó analíticamente el conjugado mediante HPLC de exclusión por tamaño utilizando un sistema de HPLC Agilent 1200 equipado con una columna Shodex KW 803 en las condiciones descritas anteriormente et Transfusión Se demostró que la preparación no contiene libre Método Se realizó la PEGilación de mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se transfirió una concentración o peso inicial de ínter o se disolvió en amortiguador Hepes mM 150 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteína de 2 mg se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 5 mM en 15 minutos para dar una concentración final de 100 seguido del añadido de una solución acuosa de 50 M para obtener una concentración final de 10 mM en un período de 30 Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de 20 veces de Después de la corrección del pH a se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de solución acuosa de 1 M para dar una concentración final de 10 Se purificó el conjugado de mediante cromatografía de intercambio iónico Se concentraron las fracciones que contenían el conjugado del eluato mediante utilizando una membrana de 10 kD hecha de celulosa regenerada corte 10 Se realizó la etapa de diafiltración final contra el amortiguador Hepes mM 5 mM La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y procedimiento y la actividad biológica de acuerdo con los métodos Ejemplo 42 PEGilación de utilizando un reactivo y como catalizador nucleofílico Método Se realizó la PEGilación de mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se disolvió en de amortiguador de pH mM 150 mM 5 mM Se añadió una solución acuosa de periodato de sodio y se incubó la mezcla de reacción durante 1 h en la oscuridad a 4 con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de de 1 M solución acuosa de se sometió la mezcla a empleando filtradores centrífugos Vivaspin para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de Se mezcló la fracción que contenía con una solución acuosa de y se incubó durante 30 min a temperatura Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de reactivo de 5 Se incubó esta mezcla durante h a temperatura ambiente en la oscuridad con agitación Por se purificó el conjugado de mediante cromatografía de intercambio iónico sobre Por se cargaron mg de gel en la columna equilibrada con 50 mM amortiguador pH que contenía 5 mM Se eluyó el conjugado con 50 mM amortiguador Hepes que contenía 5 mM CaCl2 y 500 mM cloruro de pH y se sometió a utilizando una membrana de corte de MW la preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la En una modalidad se realizó el método 1 del siguiente Se realizó la PEGilación de mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se disolvió en mi de amortiguador de pH mM 150 mM 5 mM Se añadió una solución acuosa de periodato de sodio y se incubó la mezcla de reacción durante 1 h en la oscuridad a 4 con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de de 1 M solución acuosa de se sometió la mezcla a empleando filtradores centrífugos Vivaspin para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de Se mezcló la fracción que contenía con una solución acuosa de y se incubó durante 30 min a temperatura Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de reactivo de 5 Se incubó esta mezcla durante h a temperatura ambiente en la oscuridad con agitación Por se purificó el conjugado de obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado del eluato y se sometieron a utilizando una membrana de corte de MW la preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Método Se realizó la PEGilación de mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se transfirió o se disolvió en amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteína de Se corrigió el pH de la solución a mediante añadido por goteo de una solución acuosa de se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 40 mM en 10 minutos para dar una concentración de 200 Se realizó la reacción de oxidación durante 30 5 min a una temperatura de 2 Se detuvo la reacción mediante el añadido de una solución acuosa de en 15 minutos a 2 para dar una concentración final de 10 mM en la mezcla de reacción e incubación durante 60 5 Se purificó adicionalmente el oxidado mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían oxidado del eluato y se utilizaron para la reacción de conjugación Se añadió el reactivo de con un MW de 20 kD en un exceso molar de 50 veces al eluato que contenía el oxidado purificado en un período máximo de 15 minutos con agitación Se añadió una solución acuosa de en 15 minutos para obtener una concentración final de 10 Se incubó la mezcla de reacción durante 120 10 min en la oscuridad a una temperatura de 2 con agitación Se purificó adicionalmente el conjugado de CSF obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado de y se concentraron mediante iltración utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada con un corte de peso molecular adecuado Método Se realizó la PEGilación de mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se disolvió en amortiguador Hepes mM 150 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se mezcló con una solución acuosa de periodato de sodio y una solución acuosa de toluidina se añadió el reactivo aminooxi para dar un exceso molar de 20 veces de Se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 a temperatura ambiente mediante el añadido de 8 de solución acuosa de cisteina Por se purificó el conjugado de mediante cromatografía de intercambio iónico sobre Sepharose Se cargaron mg de gel en la columna preequilibrada con 50 mM amortiguador pH que contenía 5 mM Se eluyó el conjugado con 50 amortiguador Hepes que contenía 5 mM CaCl2 y 500 mM cloruro de pH y se sometió a utilizando una La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la En una modalidad se realizó el método 3 del siguiente Se realizó la PEGilación de mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenia un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se disolvió en amortiguador Hepes 150 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se mezcló con una solución acuosa de periodato de sodio y una solución acuosa de se añadió el reactivo aminooxi para dar un exceso molar de 20 veces de Se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de 8 de solución acuosa de cisteina Por se purificó el conjugado de obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado del eluato y se sometieron a utilizando una La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Método Se realizó la PEGilación de mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se transfirió una concentración o peso inicial de o se disolvió en amortiguador Hepes mM 150 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteína de 2 mg se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 5 mM en 15 minutos para dar una concentración final de 100 seguido del añadido de una solución acuosa de toluidina 50 mM para obtener una concentración final de 10 en un período de 30 Se añadió reactivo con un M de 20 kD para dar un exceso molar de 20 veces de Después de la corrección del pH a se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de solución acuosa de 1 M para dar una concentración final de 10 Se purificó el conjugado de mediante cromatografía de intercambio iónico Se concentraron las fracciones que contenían el conjugado del eluato mediante utilizando una membrana de 10 kD hecha de celulosa regenerada corte 10 Se realizó la etapa de diafiltración final contra el amortiguador Hepes mM 5 mM CaCl2 pH La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y procedimiento y la actividad biológica de acuerdo con los métodos Ejemplo 43 PEGilación de Humira utilizando un reactivo y como catalizador nucleofílico Método Se realizó la PEGilación de Humira mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se disolvió Humira en mi de amortiguador de pH mM 150 mM 5 mM Se añadió una solución acuosa de periodato de sodio y se incubó la mezcla de reacción durante 1 h en la oscuridad a 4 con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de de 1 M solución acuosa de se sometió la mezcla a empleando filtradores centrífugos Vivaspin para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de Se mezcló la fracción que contenía Humira con una solución acuosa de y se incubó durante 30 a temperatura Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de reactivo de 5 Se incubó esta mezcla durante h a temperatura ambiente en la oscuridad con agitación Por se purificó el conjugado de mediante cromatografía de intercambio iónico sobre Por se cargaron mg de gel en la columna equilibrada con 50 mM amortiguador pH que contenía 5 mM Se eluyó el conjugado con 50 mM amortiguador Hepes que contenía 5 mM CaCl2 y 500 mM cloruro de pH y se sometió a utilizando una membrana de corte de MW la preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la téenica En una modalidad se realizó el método 1 del siguiente Se realizó la PEGilación de Humira mediantfe el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se disolvió Humira en mi de amortiguador de mM 150 mM 5 mM Se añadió una solución acuosa de periodato de sodio y se incubó la mezcla de reacción durante 1 h en la oscuridad a 4 con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de de 1 M solución acuosa de se sometió la mezcla a empleando filtradores centrífugos Vivaspin para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de Se mezcló la fracción que contenía Humira con una solución acuosa de y se incubó durante 30 min a temperatura Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de reactivo de 5 Se incubó esta mezcla durante h a temperatura ambiente en la oscuridad con agitación Por se purificó el conjugado de Humira obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado del eluato y se sometieron a utilizando una membrana de corte de MW Posteriormente la preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Método Se realizó la PEGilación de Humira mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se transfirió o se disolvió Humira en amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 M cloruro de pH para obtener una concentración final de proteína de Se corrigió el pH de la solución a mediante añadido por goteo de una solución acuosa de se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 40 mM en 10 minutos para dar una concentración de 200 Se realizó la reacción de oxidación durante 30 5 min a una temperatura de 2 Se detuvo la reacción mediante el añadido de una solución acuosa de en 15 minutos a 2 para dar una concentración final de 10 mM en la mezcla de reacción e incubación durante 60 5 Se purificó adicionalmente el oxidado mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían Humira oxidado del eluato y se utilizaron para la reacción de conjugación Se añadió el reactivo de con un MW de 20 kD en un exceso molar de 50 veces al eluato que contenía el Humira oxidado purificado en un período máximo de 15 minutos con agitación Se añadió una solución acuosa de en 15 minutos para obtener una concentración final de 10 Se incubó la mezcla de reacción durante 120 10 min en la oscuridad a una temperatura de 2 con agitación Se purificó adicionalmente el conjugado de Humira obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado de y se concentraron mediante iltración utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada con un corte de peso molecular adecuado Método Se realizó la PEGilación de Humira mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenia un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright de NOF Se disolvió Humira en amortiguador Hepes mM 150 mM cloruro de 5 cloruro de pH y se mezcló con una solución acuosa de periodato de sodio y una solución acuosa de toluidina se añadió el reactivo aminooxi para dar un exceso molar de 20 veces de Se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de 8 de solución acuosa de cisteina Por se purificó el conjugado de Humira mediante cromatografía de intercambio iónico sobre Sepharose Se cargaron mg de gel en la columna preequilibrada con 50 M amortiguador pH que contenía 5 mM Se eluyó el conjugado con 50 amortiguador Hepes que contenía 5 mM CaCl2 y 500 mM cloruro de pH y se sometió a utilizando una La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la En una modalidad se realizó el método 3 del siguiente Se realizó la PEGilación de Humira mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se disolvió Humira en amortiguador Hepes mM 150 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se mezcló con una solución acuosa de periodato de sodio y una solución acuosa de se añadió el reactivo aminooxi para dar un exceso molar de 20 veces de Se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de 8 de solución acuosa de cisteína Por se purificó el conjugado de obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado y se sometieron a utilizando una La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Método Se realizó la PEGilación de Humira mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se transfirió una concentración o peso inicial de HJumira o se disolvió en amortiguador Hepes mM 150 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteína de 2 mg Humira se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 5 mM en 15 minutos para dar una concentración final de 100 seguido del añadido de una solución acuosa de toluidina 50 mM para obtener una concentración final de 10 mM en un período de 30 Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de 20 veces de Después de la corrección del pH a se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de solución acuosa de 1 M para dar una concentración final de 10 Se purificó el conjugado de Humira mediante cromatografía de intercambio iónico Se concentraron las fracciones que contenían el conjugado del eluato mediante utilizando una membrana de 10 kD hecha de celulosa regenerada corte 10 Se realizó la etapa de diafiltración final contra el amortiguador Hepes mM 5 mM pH La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y procedimiento y la actividad biológica de acuerdo con los métodos Ejemplo 44 PEGilación de Prolia utilizando un reactivo y como catalizador nucleofílico Método Se realizó la PEGilación de Prolia mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se disolvió Prolia en mi de amortiguador de pH mM 150 mM 5 mM Se añadió una solución acuosa de periodato de sodio y se incubó la mezcla de reacción durante 1 h en la oscuridad a 4 con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de de 1 M solución acuosa de se sometió la mezcla a empleando filtradores centrífugos Vivaspin para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de Se mezcló la fracción que contenía Prolia con una solución acuosa de y se incubó durante 30 min a temperatura Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de reactivo de 5 Se incubó esta mezcla durante h a temperatura ambiente en la oscuridad con agitación Por se purificó el conjugado de Prolia mediante cromatografía de intercambio iónico sobre Por se cargaron mg de gel en la columna equilibrada con 50 amortiguador pH que contenía 5 mM Se eluyó el conjugado con 50 mM amortiguador Hepes que contenía 5 M CaCl2 y 500 mM cloruro de pH y se sometió a utilizando una membrana de corte de MW la preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la téenica En una modalidad se realizó el método 1 del siguiente Se realizó la PEGilación de Prolia mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se disolvieron 10 de Prolia en 5 mi de amortiguador de pH mM 150 mM 100 de una solución acuosa de periodato de sodio se añadió y se incubó la mezcla de reacción durante 1 h en la oscuridad a 4 con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de 50 de 1 M solución acuosa de se sometió la mezcla a empleando filtradores centrífugos Vivaspin 15R 10 kD para eliminar el exceso de el extintor y los subproductos de Se mezcló la fracción retenida 7 que contenía Prolia con 2 mi de una solución acuosa de y se incubó durante 30 min a temperatura Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de reactivo de 5 Se incubó esta mezcla durante h a TA en la oscuridad con agitación suave Por se purificó el conjugado de mediante cromatografía de intercambio iónico sobre SP Sepharose Se diluyó la mezcla de reacción con 20 mi de amortiguador A mM pH y se cargó en una columna de 20 mi HiPrep SP FF preequilibrada con amortiguador Se eluyó la columna con amortiguador B mM 1 M pH Se eluyó el Prolia libre mediante lavado de la columna con 25 de amortiguador B y el conjugado con 50 de amortiguador Se concentraron las fracciones que contenían el conjugado mediante utilizando una membrana de 10 kD hecha de celulosa regenerada corte 10 Se realizó la etapa de diafiltración final contra amortiguador de pH que contenía 150 mM NaCl La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Para el conjugado se determinó una actividad específica de 50 en comparación con el Prolia se caracterizó analíticamente el conjugado mediante HPLC de exclusión por tamaño utilizando un sistema de HPLC Agilent 1200 equipado con una columna Shodex KW 803 en las condiciones descritas anteriormente et Transfusión Se demostró que la preparación no contiene Prolia Método Se realizó la PEGilación de Prolia mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se transfirió o se disolvió Prolia en amortiguador de reacción 50 mM 350 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteína de Se corrigió el pH de la solución a mediante añadido por goteo de una solución acuosa de se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 40 en 10 minutos para dar una concentración de 200 Se realizó la reacción de oxidación durante 30 5 min a una temperatura de 2 Se detuvo la reacción mediante el añadido de una solución acuosa de en 15 minutos a 2 para dar una concentración final de 10 mM en la mezcla de reacción e incubación durante 60 5 Se purificó adicionalmente el Prolia oxidado mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían Humira oxidado del eluato y se utilizaron para la reacción de Se añadió el reactivo de con un MW de 20 kD en un exceso molar de 50 veces al eluato que contenia el Prolia oxidado purificado en un periodo máximo de 15 minutos con agitación Se añadió una solución acuosa de en 15 minutos para obtener una concentración final de 10 Se incubó la mezcla de reacción durante 120 10 min en la oscuridad a una temperatura de 2 con agitación Se purificó adicionalmente el conjugado de Prolia obtenido mediante cromatografía de intercambio Se recogieron las fracciones que contenían el conjugado de Prolia y se concentraron mediante iltración utilizando una membrana hecha de celulosa regenerada con un corte de peso molecular adecuado Método Se realizó la PEGilación de Prolia mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se disolvió EPO en amortiguador Hepes mM 150 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH y se mezcló con una solución acuosa de periodato de sodio y una solución acuosa de toluidina se añadió el reactivo aminooxi para dar un exceso molar de 20 veces de Se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de 8 de solución acuosa de cisteina Por se purificó el conjugado de Prolia mediante cromatografía de intercambio iónico sobre Sepharose Se cargaron mg de gel en la columna preequilibrada con 50 mM amortiguador pH que contenía 5 mM Se eluyó el conjugado con 50 M amortiguador Hepes que contenía 5 mM CaCl2 y 500 mM cloruro de pH y se sometió a utilizando una La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos eri la En una modalidad se realizó el método 3 del siguiente Se realizó la PEGilación de Prolia mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se disolvieron 10 rag de Prolia en mi de amortiguador de pH mM 150 mM Se añadieron 200 de una solución acuosa de periodato de sodio y 2 mi de una solución acuosa de se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de reactivo de 5 Se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de 100 de solución acuosa de cisteina 1 Por se purificó el conjugado de mediante cromatografía de intercambio iónico sobre Sepharose Se diluyó la mezcla de reacción con 20 mi de amortiguador A mM pH y se cargó en una columna de 20 i HiPrep SPFF preequilibrada con amortiguador Se eluyó la columna con amortiguador B mM 1 M pH Se eluyó el Prolia libre mediante lavado de la columna con de amortiguador B y el conjugado con de amortiguador Se concentraron las fracciones gue contenían el conjugado mediante utilizando una membrana de 10 kD hecha de celulosa regenerada corte 10 Se realizó la etapa de diafiltración final contra amortiguador de pH que contenía 150 mM NaCl La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y la actividad biológica de acuerdo con los métodos conocidos en la Para el conjugado se determinó una actividad específica de 50 en comparación con el Prolia se caracterizó analíticamente el conjugado mediante HPLC de exclusión por tamaño utilizando un sistema de HPLC Agilent 1200 equipado con una columna Shodex KW 803 en las condiciones descritas anteriormente et Transfusión Se demostró que la preparación no contiene Prolia Método Se realizó la PEGilación de Prolia mediante el uso de un reactivo de PEGilación lineal de 20 kD que contenía un grupo Un ejemplo de este tipo de reactivo es la serie Sunbright CA de NOF Se transfirió una concentración o peso inicial de HJu ira o se disolvió en amortiguador Hepes mM 150 mM cloruro de 5 mM cloruro de pH para obtener una concentración final de proteína de 2 mg Prolia se añadió una solución acuosa de periodato de sodio 5 mM en 15 minutos para dar una concentración final de 100 seguido del añadido de una solución acuosa de toluidina 50 mM para obtener una concentración final de 10 mM en un periodo de 30 Se añadió reactivo con un MW de 20 kD para dar un exceso molar de 20 veces de Después de la corrección del pH a se incubó la mezcla durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave y se inactivó durante 15 min a temperatura ambiente mediante el añadido de solución acuosa de 1 M para dar una concentración final de 10 mM Se purificó el conjugado de Prolia mediante cromatografía de intercambio iónico Se concentraron las fracciones que contenían el conjugado del eluato mediante utilizando una membrana de 10 kD hecha de celulosa regenerada corte 10 Se realizó la etapa de diafiltración final contra el amortiguador Hepes 5 mM pH La preparación se caracterizó analíticamente mediante la medición de la proteína total y procedimiento y la actividad biológica de acuerdo con los métodos Ejemplo 45 PEGilación de una proteína terapéutica utilizando PEG rami ficado La PEGilación de una proteína terapéutica de la invención se puede extender a un reactivo de PEGilación ramificado o que está hecho de un aldehido y un ligador adecuado que contiene un grupo aminooxi Ejemplo 46 Acoplamiento de un ligador diamonooxi con PSA nativo Este ejemplo describe los procedimientos para preparar los reactivos utilizando PSA nativo sin oxidación que se pueden emplear para la modificación química de las proteínas terapéuticas Acoplamiento a temperatura ambiente Se disolvieron mg de PSA nativo 20 obtenido del Serum Institute of India en mi de 50 mM amortiguador de fosfato pH Se añadieron mg por goteo a la mezcla de Se incubó la reacción durante 2 h a temperatura ambiente con agitación suave en la Acoplamiento a mayor temperatura Se disolvieron mg de PSA nativo 20 obtenido del Serum Institute of India en mi de 50 mM amortiguador de fosfato pH Se añadieron mg por goteo a la mezcla de Se incubó la reacción durante 2 h a temperatura ambiente con agitación suave en la Se aumentó la temperatura a y se incubó la mezcla de reacción durante otras 14 Acoplamiento a mayor temperatura y mayor exceso de ligador Se disolvieron mg de PSA nativo 20 obtenido del Serum Institute of India en mi de 50 mM amortiguador de fosfato pH Se añadieron mg por goteo a la mezcla de Se incubó la reacción durante 2 h a temperatura ambiente con agitación suave en la Se añadieron mg por goteo a la se aumentó la temperatura a y se incubó la mezcla de reacción durante otras 14 Purificación de derivados de PSA Después de completar la se purificaron las mezclas de reacción generadas en los puntos mediante diálisis Por lo se cargaron las muestras de las mezclas de reacción en casetes de diálisis MWCO celulosa y se sometieron a diálisis contra 10 mM amortiguador de fosfato pH de acuerdo con el siguiente 2 contra 500 mi de amortiguador a temperatura ambiente 2 h contra 500 mi de amortiguador a temperatura ambiente 12 h contra 500 mi de amortiguador a 4 lh contra 50 mi de de concentración para diálisis a temperatura ambiente para la concentración hasta el volumen inicial de la Por el purificado está listo para utilizarse en una reacción de conjugación de proteínas de por con los ejemplos 14 y cualquiera de los polímeros solubles en agua descritos en la presente se puede acoplar con un ligador aminooxi como se describió en el presente ejemplo y después conjugar con una proteína como se estableció en los ejemplos Se caracterizó analíticamente la preparación mediante la medición del PSA total de y los grupos aminooxi totales para determinar el grado de modificación Para la preparación se determinó un grado de modificación de para y para MD se midieron la polidispersidad y la La polidispersidad fue inferior a para todas las preparaciones y el contenido de ligador libre fue inferior a mol de la concentración de Para el PSA modificado en el extremo se determinó la siguiente estructura mediante Ejemplo 47 Preparación de a 4 empleando una etapa de purificación cromatográfica Durante una caracterización analítica detallada del reactivo preparado a temperatura los estudios NMR solicitud provisional estadounidense que se incorpora al presente por revelaron que la derivación de PSA oxidado con el ligador diaminooxi consiste en dos reacciones una reacción rápida del grupo aldehido en el extremo no reductor del PSA y una reacción lenta del grupo aldehido forma de un en el extremo reductor de La última reacción se podría considerar una reacción secundaria no deseada que se debe evitar para la producción de reactivo Por lo el proceso para la preparación del reactivo se ha optimizado como se describió en el presente El extremo reductor solo se aparece en un grado significativo si el proceso se realiza a temperatura Por lo se ajustó el proceso y se realizó a Al realizar el proceso completo química y purificación del reactivo PSA por a se redujo sustancialmente la reacción secundaria en el extremo reductor de Este cambio en el proceso produce un reactivo de mayor calidad Procedimiento Se disolvieron 1290 mg de PSA oxidado 20 obtenido del Serum Institute of India en 25 mi de 50 mM amortiguador de fosfato pH Se añadieron 209 mg de a la mezcla de reacción y se incubó durante 1 h a con agitación suave en la Después de la se sometió la mezcla a una etapa de cromatografía de intercambio aniónico débil empleando un gel de cromatografía Fractogel EMD DEAE de la que se realizó en una habitación fría a una temperatura de Se diluyó la mezcla de reacción con 110 mi de amortiguador A preenfriado y se cargó en una columna DEAE preequilibrada con amortiguador A a una velocidad de flujo de 1 Se lavó la columna con 20 CV de amortiguador B mM pH a una velocidad de flujo de 2 para retirar la dioxiamina Se eluyó el reactivo con un gradiente escalonado que consistía en de amortiguador B y de amortiguador C mM 1M pH Se concentró el eluato mediante utilizando una membrana de 5 kD hecha de poliéter sulfona cm2 Se caracterizó analíticamente la preparación mediante la medición del PSA total de y los grupos aminooxi totales para determinar el grado de La concentración de PSA en la preparación final fue de y el grado de modificación fue de se determinó un valor de polidispersidad de se midió una concentración de mol de para la Por el purificado está listo para utilizarse en una reacción de conjugación de acuerdo con los ejemplos 14 y insufficientOCRQuality
Claims (75)
1. Un método de conjugación de un polímero soluble en agua con un resto de carbohidrato oxidado de una proteína terapéutica que comprende poner en contacto el resto de carbohidrato oxidado con un polímero soluble en agua activado en condiciones que permiten la conjugación; dicho polímero soluble en agua contiene un grupo aminooxi activo y se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG), PEG ramificado, PolyPEG® (Warwick Effect Polymers; Coventry, RU), ácido polisiálico (PSA ), almidón, almidón de hidroxialquilo (HAS), almidón de hidroxiletilo (HES), carbohidrato, polisacáridos , pululano, quitosán, ácido hialurónico, sulfato de condroitina, sulfato de dermatan, dextrano, carboximetil-dextrano, óxido de polialquileno (PAO), polialquilenglicol (PAG), polipropilenglicol (PPG), po1ioxa zolina, po1iaeri10ilmor fo1ina, alcohol polivinílico (PVA), po 1icarboxi1ato, polivinilpirrolidona , polifospazeno, polioxazolina, anhídrido de ácido polietilen-co-maleico, anhídrido de ácido poliestiren-co-maleico , po1i(hidroximeti1forma1 1-hidroximetiletileno ) (PHF), 2-metacriloiloxi-2 ' -etiltrimetilamoniof osfato (MPC); en donde el polímero soluble en agua que contiene un grupo aminooxi activo se prepara a través de un método que comprende: a) incubar una solución que comprende un polímero soluble en agua oxidado con un ligador aminooxi que comprende un grupo aminooxi activo en condiciones que permiten la formación de un enlace oxima estable entre el polímero soluble en agua oxidado y el ligador aminooxi activado, dichas condiciones comprenden un período entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 24 horas; una temperatura entre aproximadamente 2 °C y aproximadamente 8 °C; en presencia o ausencia de luz y con o sin agitación; formando así un polímero soluble en agua que contiene un grupo aminooxi activo; y b) purificar el polímero soluble en agua que contiene un grupo aminooxi activo a través de un método seleccionado del grupo que consiste en cromatografía, filtración, diálisis y precipitación, a una temperatura entre aproximadamente 2 °C y aproximadamente 8 °C; dicho resto de carbohidrato oxidado por incubación con un amortiguador comprende un agente de oxidación seleccionado del grupo que consiste en periodato de sodio (NaI04), tetraacetato de plomo (Pb(0Ac)4) y perrutenato de potasio (KRu04); en donde un enlace oxima se forma entre el resto de carbohidrato oxidado y el grupo aminooxi activo en el polímero soluble en agua; y en donde dicha formación del enlace de oxima es catalizada por un catalizador nucleofílico seleccionado del grupo que consiste en ácido o-amino benzoico, ácido m-amino benzoico, ácido p-amino benzoico, ácido sulfanílico, o-aminobenzamida, o-toluidina, m-toluidina, p-toluidina, o-anisidina, m-anisidina y p-anisidina.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizado por que la solución que comprende el polímero soluble en agua oxidado y el ligador de aminooxi que comprende un grupo aminooxi activo se incuba a 4 °C durante 1 h sin luz, con agitación.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 3 caracterizado por que el polímero soluble en agua que contiene un grupo aminooxi activo se purifica mediante cromatografía de intercambio aniónico a una temperatura de 4 °C.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 3 caracterizado por que el polímero soluble en agua oxidado es PSA y se oxida por incubación con NaI04.
5. Un método de conjugación de un polímero soluble en agua con un resto de carbohidrato oxidado de una proteína terapéutica que comprende poner en contacto el resto de carbohidrato oxidado con un polímero soluble en agua activado en condiciones que permiten la conjugación; dicho polímero soluble en agua contiene un grupo aminooxi activo y se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG), PEG ramificado, PolyPEG® (arwick Effect Polymers; Coventry, RU), ácido polisiálico (PSA ), almidón, almidón de hidroxialquilo (HAS), almidón de hidroxi1etilo (HES), carbohidrato, polisacáridos , pululano, quitosán, ácido hialurónico, sulfato de condroitina, sulfato de dermatan, dextrano, carboxime ti1-dextrano, óxido de po1ia 1qui1eno (PAO), polialquilenglicol (PAG), polipropilenglicol (PPG), polioxazolina, poliacriloilmorf olina, alcohol polivinílico (PVA), po 1icarboxi1ato, polivinilpirrolidona, polifospa zeno, polioxazolina, anhídrido de ácido polietilen-co-maleico, anhídrido de ácido poliestiren-co-maleico , po1i(hid oximeti1forma1 1-hidroxi etiletileno) (PHF), 2-metacriloiloxi-2 '-eti1trime ti1amoniofosfato (MPC); en donde el polímero soluble en agua que contiene un grupo aminooxi activo se prepara a través de un método que comprende: a) incubar una solución que comprende un polímero soluble en agua con un ligador aminooxi que comprende un grupo aminooxi activo en condiciones que permiten la formación de un enlace oxima estable entre el polímero soluble en agua y el ligador aminooxi activado, dichas condiciones comprenden un período entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 24 horas; una temperatura entre aproximadamente 22 °C y aproximadamente 37 °C; en presencia o ausencia de luz y con o sin agitación; formando así un polímero soluble en agua que contiene un grupo aminooxi activo; y b) purificar el polímero soluble en agua que contiene un grupo aminooxi activo a través de un método seleccionado del grupo que consiste en cromatografía, filtración, diálisis y precipitación; dicho resto de carbohidrato oxidado por incubación con un amortiguador comprende un agente de oxidación seleccionado del grupo que consiste en periodato de sodio (NaI04), tetraacetato de plomo (Pb(0Ac)4 ) y perrutenato de potasio (KRu04); en donde un enlace oxima se forma entre el resto de carbohidrato oxidado y el grupo aminooxi activo en el polímero soluble en agua; y en donde dicha formación del enlace de oxima es catalizada por un catalizador nucleofílico seleccionado del grupo que consiste en ácido o-amino benzoico, ácido m-amino benzoico, ácido p-amino benzoico, ácido sulfanílico, o-aminobenzamida, o-toluidina, m-toluidina, p-toluidina, o-anisidina, m-anisidina y p-anisidina.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 5 caracterizado por que la solución que comprende el polímero soluble en agua y el ligador de aminooxi que comprende un grupo aminooxi activo se incuba a 22 °C durante 2 h sin luz, con agitación.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 5 caracterizado por que la solución que comprende el polímero soluble en agua y el ligador de aminooxi que comprende un grupo aminooxi activo se incuba a 22 °C durante 2 h sin luz, con agitación; dicho método comprende además la etapa de aumentar la temperatura de la solución hasta una temperatura de entre aproximadamente 32 °C y aproximadamente 37 °C e incubar durante otras 12-24 horas.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 7 que comprende la etapa adicional de añadir una cantidad adicional de ligador de aminooxi que comprende un grupo aminooxi activo inmediatamente antes de aumentar la temperatura .
9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5-9 caracterizado por que se purifica el polímero soluble en agua que contiene un grupo aminooxi activo a través de un método seleccionado del grupo que consiste en diálisis, (UF/DF) y cromatografía a una temperatura de 22 °C.
10. El método de acuerdo con la reivindicación 9 que además comprende la etapa de purificación del polímero soluble en agua que contiene un grupo aminooxi activo a través de un método seleccionado del grupo que consiste en diálisis, UF/DF o cromatografía a 4 °C.
11. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10 caracterizado por que la proteína terapéutica seleccionada del grupo que consiste en Factor IX (FIX), Factor VIII (FVIII), Factor Vlla (FVIIa), Factor de Von Willebrand (VWF), Factor FV (FV), Factor X (FX), Factor XI (FXI), Factor XII (FXII), trombina (FII), proteína C, proteína S, tPA, PAI-1, factor tisular (TF), proteasa ADAMTS 13, IL-1 alfa, IL-1 beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, factor estimulador de colonias-1 (CSF-1), M-CSF, SCF, GM-CSF, factor estimulador de colonia de granulocitos (G-CSF), EPO, interferón-alfa (IFN-alfa), interferón de consenso, IFN-beta, iFN-gamma, IFN-omega, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12 , IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-31, IL-32 alfa, IL-33, trombopoyetina (TPO), Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y, polipéptido 1 similar a angiopoyetina (ANGPTL1), polipéptido 2 similar a angiopoyetina (ANGPTL2), polipéptido 3 similar a angiopoyetina (ANGPTL3), polipéptido 4 similar a angiopoyetina (ANGPTL4), polipéptido 5 similar a angiopoyetina (ANGPTL5), polipéptido 6 similar a angiopoyetina (ANGPTL6), polipéptido 7 similar a angiopoyetina (ANGPTL7), vitronectina , factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), angiogenina, activina A, activina B, activina C, proteina morfogénica ósea-1, proteina morfogénica ósea-2, proteina morfogénica ósea-3, proteina morfogénica ósea-4, proteina morfogénica ósea-5, proteina morfogénica ósea-6, proteina morfogénica ósea-7, proteina morfogénica ósea-8, proteina morfogénica ósea-9, proteina morfogénica ósea-10, proteina morfogénica ósea-11, proteina morfogénica ósea-12, proteina morfogénica ósea-13, proteina morfogénica ósea-14, proteina morfogénica ósea-15, receptor IA de proteina morfogénica ósea, receptor IB de proteina morfogénica ósea, receptor II de proteina morfogénica ósea, factor neurotrófico derivado del cerebro, cardiotropina-1 , factor neutrófico ciliar, receptor del factor neutrófico ciliar, cripto, críptico, factor 1 quimiotáctico de neutrófilos inducido por citocina, neutrófilo inducido por citocina, factor 2a quimiotáctico, factor 2b quimiotáctico de neutrófilos inducido por citocina, factor de crecimiento de células endoteliales b, endotelina 1, factor de crecimiento epidérmico, epigen, epiregulina, atrayente de neutrófilos derivado del epitelio, factor de crecimiento de fibroblastos 4, factor de crecimiento de fibroblastos 5, factor de crecimiento de fibroblastos 6, factor de crecimiento de fibroblastos 7, factor de crecimiento de fibroblastos 8, factor de crecimiento de fibroblastos 8b, factor de crecimiento de fibroblastos 8c, factor de crecimiento de fibroblastos 9, factor de crecimiento de fibroblastos 10, factor de crecimiento de fibroblastos 11, factor de crecimiento de fibroblastos 12, factor de crecimiento de fibroblastos 13, factor de crecimiento de fibroblastos 16, factor de crecimiento de fibroblastos 17, factor de crecimiento de fibroblastos 19, factor de crecimiento de fibroblastos 20, factor de crecimiento de fibroblastos 21, factor de crecimiento de fibroblastos ácido, factor de crecimiento de fibroblastos básico, receptor al de factor neutrófico derivado de linea de células gliales, receptor a2 de factor neutrófico derivado de linea de células gliales, proteina relacionada con el crecimiento, proteina a relacionada con el crecimiento, proteina b relacionada con el crecimiento, proteina g relacionada con el crecimiento, factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina, factor de crecimiento de hepatocito, receptor del factor de crecimiento de hepatocito, factor de crecimiento derivado de hepatoma, factor de crecimiento I similar a insulina, receptor del factor de crecimiento similar a insulina, factor de crecimiento II similar a insulina, proteina de unión de factor de crecimiento similar a insulina, factor de crecimiento de queratinoci to, factor inhibitorio de leucemia, receptor a del factor inhibitorio de leucemia, factor de crecimiento nervioso, receptor del factor de crecimiento nervioso, neuropoyet ina, neurotropin-3, neurotropin-4 , oncostatina M (OSM), factor de crecimiento de placenta, factor de crecimiento 2 de placenta, factor de crecimiento de célula endotelial derivada de plaquetas, factor de crecimiento derivado de plaquetas, cadena A del factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento AA derivado de plaquetas, factor de crecimiento AB derivado de plaquetas, cadena B del factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento BB derivado de plaquetas, receptor a del factor de crecimiento derivado de plaquetas, receptor b del factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de estimulación del crecimiento de células pre-células B, factor de células madres (SCF), receptor del factor de células madres, TNF, TNFO, TNFl, TNF2 , factor de crecimiento transformante a, factor de crecimiento transformante b, factor de crecimiento transformante b?, factor de crecimiento transformante b?.2, factor de crecimiento transformante b2, factor de crecimiento transformante b3, factor de crecimiento transformante b5, factor de crecimiento transformante latente b?, proteina I de unión a factor de crecimiento transformante b, proteina II de unión a factor de crecimiento transformante b, proteina III de unión a factor de crecimiento transformante b, linfopoyetina estromal timica (TSLP), receptor del factor de necrosis tumoral tipo I, receptor del factor de necrosis tumoral tipo II, receptor activador de plasminógeno tipo urocinasa, proteina activada por fosfolipasa (PUP), insulina, lectina ricina, prolactina, gonadotropina coriónica, hormona estimulante de folículos, hormona estimulante de tiroides, activador de plasminógeno de tejidos, IgG, IgE, IgM, IgA y IgD, a-galactosid sa, b-ga1 ctosidasa, ADNsa, fetuin, hormona leutinizante, estrógeno, insulina, albúmina, lipoproteíñas , fetoproteína, transferrina , trombopoyetina, urocinasa, integrina, trombina, leptina, Humira (adalimumab), Prolia (denosumab), Enbrel (etañercept), una proteina en la tabla 1 o un fragmento biológicamente activo, un derivado o variante de estos.
12. El método de acuerdo con la reivindicación 11 caracterizado por que una solución que comprende una concentración inicial de la proteina terapéutica de entre aproximadamente 0,3 mg/ml y aproximadamente 3,0 mg/ml se ajusta a un valor de pH de entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 8,0 antes de contactarse con el polímero soluble con agua activado.
13. El método de la reivindicación 12 caracterizado por que la concentración inicial de la proteína terapéutica es de aproximadamente 1,0 mg/ml y el pH es de aproximadamente 6,0.
14. El método de la reivindicación 11 caracterizado por que la proteína terapéutica se pone en contacto con una concentración excesiva deseada de polímero soluble en agua activado, en donde la concentración excesiva es un exceso molar de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 300.
15. El método de la reivindicación 14 caracterizado por que la el exceso de concentración es aproximadamente 50 veces el exceso molar.
16. El método de la reivindicación 14 caracterizado por que la proteína terapéutica se incuba con el polímero soluble en agua activado en condiciones que comprenden un período de tiempo de entre aproximadamente 0,5 horas y aproximadamente 24 horas; una temperatura de entre aproximadamente 2 °C y aproximadamente 37 °C; con o sin luz; y con o sin agitación .
17. El método de conformidad con la reivindicación 16 caracterizado por que las condiciones comprenden un periodo de aproximadamente 120 minutos, una temperatura de aproximadamente 22 °C, ausencia de luz y agitación.
18. El método de acuerdo con la reivindicación 11 caracterizado por que el catalizador nucleofilico se añade en una cantidad para obtener una concentración final de entre aproximadamente 1,0 mM y aproximadamente 50 mM de catalizador nucleofilico, en condiciones que comprenden un tiempo de entre aproximadamente 0,1 minutos y aproximadamente 30 minutos; una temperatura de entre aproximadamente 2 °C y aproximadamente 37 °C; con o sin luz; y con o sin agitación.
19. El método de la reivindicación 18 caracterizado por que la concentración final del catalizador nucleofilico es de aproximadamente 10 mM y las condiciones comprenden un periodo de hasta aproximadamente 15 minutos, una temperatura de aproximadamente 22 °C, ausencia de luz y agitación.
20. El método de acuerdo con la reivindicación 11 caracterizado por que el agente oxidante se añade en una cantidad para obtener una concentración final de entre aproximadamente 50 mM y aproximadamente 1000 mM de catalizador nuc1eofi 1ico, en condiciones que comprenden un tiempo de entre aproximadamente 0,1 minutos y 120 minutos; una temperatura de entre aproximadamente 2 °C y aproximadamente 37 °C; con o sin luz; y con o sin agitación .
21. El método de la reivindicación 20 caracterizado por que la concentración final del agente oxidante es de aproximadamente 400 mM y las condiciones comprenden un periodo de aproximadamente 1.0 minutos, una temperatura de aproximadamente 22 °C, ausencia de luz y agitación .
22. El método de la reivindicación 11 caracterizado por que la conjugación del polímero soluble en agua con el resto de carbohidrato oxidado de la proteína terapéutica se detiene por el añadido de un agente de inactivación seleccionado del grupo que consiste en L-cisteína, metionina, glutationa, glicerol, bisulfito de sodio meta (Na2S205), triptofán, tirosina, histidina o derivados de esta, kresol, imidazol y combinaciones de estos; en donde el agente de inactivación se añade en una cantidad para obtener una concentración final de entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 100 mM de agente de inactivación, en condiciones que comprenden un tiempo de entre aproximadamente 5 minutos y aproximadamente 120 minutos; una temperatura de entre aproximadamente 2 °C y aproximadamente 37 °C; con o sin luz; y con o sin agitación .
23. El método de la reivindicación 22 caracterizado por que el agente de inactivación es L-cisterna .
24. El método de la reivindicación 23 caracter izado por que se añade la L-cisteina para producir una concentración final de aproximadamente 10 mM y las condiciones comprenden un periodo de aproximadamente 60 minutos, una temperatura de aproximadamente 22 °C, ausencia de luz y agitación.
25. El método de la reivindicación 11 que comprende : a) una primera etapa que comprende ajustar el valor del pH de una solución que comprende la proteina terapéutica a un valor de pH de entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 8,0, en donde la concentración de la proteina terapéutica es de entre aproximadamente 0,3 mg/ml y aproximadamente 3,0 mg/ml; b) una segunda etapa que comprende oxidar uno o más carbohidratos en la proteina terapéutica, en donde el agente de oxidación se añade a la solución en la primera etapa para producir una concentración final entre aproximadamente 50mM y aproximadamente 1000mM, en condiciones que comprenden un periodo entre aproximadamente 0,1 minutos y aproximadamente 120 minutos; una temperatura entre aproximadamente 2 °C y aproximadamente 37 °C; en presencia o ausencia de luz y con o sin agitación; c) una tercera etapa que comprende poner en contacto la proteina terapéutica con un exceso de concentración deseado de polímero soluble en agua activado, en donde el exceso de concentración es de entre un exceso molar de aproximadamente 1 y un exceso molar de aproximadamente 300, en condiciones que comprenden un período entre aproximadamente 0,5 horas y aproximadamente 24 horas, una temperatura entre aproximadamente 2 °C y aproximadamente 37 °C; en presencia o ausencia de luz; y con o sin agitación; d) una cuarta etapa que comprende añadir un catalizador nucleofílico a la solución de la tercera etapa, en donde el catalizador nucleofílico se añade para obtener una concentración final de entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 50 mM, en condiciones que comprenden un tiempo de entre aproximadamente 0,1 minutos y aproximadamente 30 minutos; una temperatura de entre aproximadamente 2 °C y aproximadamente 37 °C; con o sin luz, y con o sin agitación; e) una quinta etapa en donde la proteina terapéutica se incuba con el polímero soluble en agua activado y el catalizador nucleofílico en condiciones que permiten la conjugación del polímero soluble en agua activado con uno o más carbohidratos oxidados en la proteína terapéutica, dichas condiciones comprenden un período de entre aproximadamente 0,5 horas y aproximadamente 24 horas, una temperatura entre aproximadamente 2 °C y aproximadamente 37 °C; en presencia o ausencia de luz, y con o sin agitación; y f) una sexta etapa en donde la conjugación del polímero soluble en agua con uno o más carbohidratos oxidados de la proteína terapéutica en la quinta etapa se detiene por la adición del agente de inactivación seleccionado del grupo que consiste en L-cisteína, metionina, glutationa, glicerol, Na2S205 (bisulfito de sodio meta), triptofán, tirosina, histidina o derivados de esta, kresol, imidazol y combinaciones de estos; en donde el agente de inactivación se añade para producir una concentración final de aproximadamente 1 mM y aproximadamente 100 mM, en condiciones que comprenden un período de entre aproximadamente 5 minutos y aproximadamente 120 minutos; una temperatura de entre aproximadamente 2 °C y aproximadamente 37 °C; con o sin luz, y con o sin agitación.
26. El método de la reivindicación 25 caracterizado por que la concentración inicial de la proteina terapéutica en la primera etapa es de aproximadamente 1 mg/ml y el pH es de aproximadamente 6,0; en donde la concentración final del agente oxidante en la segunda etapa es de aproximadamente 400 mM y las condiciones en la quinta etapa comprenden un periodo de aproximadamente 10 minutos, una temperatura de aproximadamente 22 °C, ausencia de luz y agitación; en donde el exceso de concentración en la tercera etapa es de un exceso molar de aproximadamente 50 mM; en donde las condiciones en· la tercera etapa comprenden un periodo de aproximadamente 15 minutos, una temperatura de aproximadamente 22 °C, la ausencia de luz y agitación; en donde la concentración final del catalizador nucleofilico en la cuarta etapa es aproximadamente 10 mM y las condiciones en la cuarta etapa comprenden un periodo de aproximadamente 15 minutos, una temperatura de aproximadamente 22 °C, la ausencia de luz y sin agitación ; en donde las condiciones de incubación de la proteina terapéutica con el polímero soluble en agua activado y el catalizador nucleofilico en la quinta etapa comprenden un período de aproximadamente 2 horas; una temperatura de aproximadamente 22 °C; la ausencia de luz; y con agitación; y en donde el agente de inactivación en la sexta etapa es L-cisteína; y en donde se añade la L-cisteína para producir una concentración final de aproximadamente 10 mM y las condiciones en la sexta etapa comprenden un período de aproximadamente 60 minutos, una temperatura de aproximadamente 22 °C, ausencia de luz y agitación.
27. El método de acuerdo con la reivindicación 11 caracterizado por que el polímero soluble en agua es PSA.
28. El método de acuerdo con la reivindicación 11 caracterizado por que el polímero soluble en agua es PEG.
29. El método de acuerdo con la reivindicación 11 caracterizado por que el polímero soluble en agua es HES.
30. El método de acuerdo con la reivindicación 11 caracterizado por que el polímero soluble en agua es HAS.
31. El método de acuerdo con la reivindicación 27 caracterizado por que el PSA está compuesto de aproximadamente 10 - 300 unidades de ácido siálico.
32. El método de acuerdo con cualquiera de las 11-31 caracte izado por que la proteína terapéutica es FIX.
33. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-31 caracterizado por que la proteina terapéutica es FVIIa.
34. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-31 caracterizado por que la proteina terapéutica es FVIII.
35. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-34 caracterizado por que el agente de oxidación es periodato de sodio (NaI04).
36. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 32-34 caracterizado por que el resto de carbohidrato oxidado de la proteina terapéutica se ubica en el péptido de activación de la proteina de coagulación sanguínea.
37. El método de acuerdo con la reivindicación 27 caracterizado por que PSA comprende un ligador aminooxi activado seleccionado del grupo que consiste en: a) un ligador 3-oxa-pentano- 1,5-dioxiamina de la fórm b) un ligador 3,6,9-trioxa-undecan-1 ,11-dioxiamina de la fórmula: c) un ligador 3,6,9,12,15-penatoxa-heptadecan-1,17-dioxiamina de la fórmula: en donde el PSA se oxida por incubación con un agente oxidante para formar un grupo aldehido terminal en el extremo no reductor del PSA.
38. El método de acuerdo con la reivindicación 37 caracterizado por que el ligador aminooxi es 3-oxa-pentano-1, 5-dioxiamina.
39. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-38 caracterizado por que se proporciona el catalizador nucleofilico a una concentración de entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 50 mM.
40. El método de acuerdo con la reivindicación 39 caracterizado por que el catalizador nucleofilico es m-toluidina .
41. El método de acuerdo con la reivindicación 40 caracterizado por que la m-toluidina está presente en la reacción de conjugación a una concentración de aproximadamente 10 mM.
El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-41 que además comprende la etapa de purificar la proteina terapéutica conjugada.
43. El método de acuerdo con la reivindicación 42 caracterizado por que se purifica la proteina terapéutica conjugada a través de un método seleccionado del grupo que consiste en cromatografía, filtración y precipitación.
44. El método de acuerdo con la reivindicación 43 caracterizado por que la cromatografía se selecciona del grupo que consiste en cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC), cromatografía de intercambio iónico (IEC), cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), cromatografía de afinidad y cromatografía de fase inversa .
45. El método de la reivindicación 44 caracterizado por que se utiliza una sal anticaotrópica en una etapa de carga de la cromatografía y en una etapa de lavado de la cromatografía.
46. El método de la reivindicación 44 caracterizado por que la cromatografía se produce en una columna .
47. El método de la reivindicación 46 caracterizado porque la columna comprende una resina de cromatografía seleccionada del grupo que consiste en fenil-sefarosa FF y butil-sefarosa FF.
48. El método de la reivindicación 47 caracterizado por que se presenta la resina en la columna a una altura de lecho de entre aproximadamente 5 cm y aproximadamente 20 cm.
49. El método de acuerdo con la reivindicación 48 caracterizado por que la altura de lecho es aproximadamente 10 cm.
50. El método de la reivindicación 46 que comprende una o más etapas de lavado en donde la dirección de flujo se configura de forma ascendente y, en donde, la velocidad de flujo se encuentra entre aproximadamente 0,2 cm/min y aproximadamente 6,7 cm/min.
51. El método de acuerdo con la reivindicación 50 caracterizado por que la velocidad de flujo es aproximadamente 2 cm/min.
52. El método de cualquiera de las reivindicaciones 47-52 que comprende una o más etapas de elución en donde la dirección de flujo se configura de forma descendente y, en donde, la velocidad de flujo se encuentra entre aproximadamente 0,1 cm/min y aproximadamente 6,7 cm/min.
53. El método de acuerdo con la reivindicación 52 caracterizado por que la velocidad de flujo es aproximadamente 1 cm/min.
54. El método de cualquiera de las reivindicaciones 42-53 que además comprende la proteina terapéutica conjugada mediante ultra-/diaf iltración (UF/DF).
55. El método de cualquiera de las reivindicaciones 42-54 caracterizado por que la concentración final de la proteina terapéutica es entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 3 mg/ml.
56. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 42-55 caracterizado por que la proteina terapéutica comprende entre aproximadamente 5 y aproximadamente 11 restos de polímero soluble en agua.
57. El método de la reivindicación 11 caracterizado por que la proteína terapéutica conjugada se purifica utilizando eromatogr afi ; en donde se utiliza una sal anticaotrópica para una etapa de carga y para una etapa de lavado; el cual método comprende una o más etapas de lavado en donde la dirección de flujo se configura de forma ascendente y en donde la velocidad de flujo se encuentra entre aproximadamente 0,2 cm/min y aproximadamente 6,7 cm/min y una o más etapas de elución en donde la dirección del flujo se configura de forma descendente y en donde la velocidad de flujo es de entre aproximadamente 0,2 cm/min y aproximadamente 6,7 cm/min; que además comprende concentrar la proteína terapéutica conjugada mediante ultra-/diafi11ración (UF/DF).
58. El método de la reivindicación 51 caracterizado por que la cromatografía es cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC); en donde la velocidad de flujo de la o las etapas de lavado es de aproximadamente 2 cm/min; y en donde la velocidad de flujo de la o las etapas de elución es de aproximadamente 1 cm/min.
59. Una proteína terapéutica modificada producida a través del método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-58.
60. Un método para preparar un polímero soluble en agua que contiene un grupo aminooxi activo que comprende : a) incubar una solución que comprende un polímero soluble en agua oxidado con un ligador aminooxi que comprende un grupo aminooxi activo en condiciones que permiten la formación de un enlace oxima estable entre el polímero soluble en agua oxidado y el ligador aminooxi activado, dichas condiciones comprenden un período entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 24 horas; una temperatura entre aproximadamente 2 °C y aproximadamente 8 °C; en presencia o ausencia de luz y con o sin agitación; formando así un polímero soluble en agua que contiene un grupo aminooxi activo; y b) purificar el polímero soluble en agua que contiene un grupo aminooxi activo a través de un método seleccionado del grupo que consiste en cromatografía, filtración, diálisis y precipitación, a una temperatura entre aproximadamente 2 °C y aproximadamente 8 °C; dicho polímero soluble en agua se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG), PEG ramificado, PolyPEG® (Warwick Effect Polymers; Coventry, RU), ácido polisiálico (PSA ), almidón de hidroxialquilo (HAS), almidón de hidroxiletilo (HES), carbohidrato, polisacáridos , pululano, quitosán, ácido hialurónico, sulfato de condroitina, sulfato de dermatan, almidón, dextrano, carboximetil-dextrano, óxido de polialquileno (PAO), polialquilenglicol (PAG), o1ipr opi1englico1 (PPG), polioxazolina , poliacr iloilmorfo1ina, alcohol polivinílico (PVA), pol icarboxi1ato, polivinilpirrolidona, polifospazeno, polioxazolina, anhídrido de ácido polietilen-co-maleico, anhídrido de ácido poliestiren-co-maleico , poli(hidroximetilformal 1-hidroxime ti1eti1eno) (PHF), 2-metacriloiloxi-2' -etiltrimetilamoniofosfato (MPC); mediante lo cual se forma un enlace de oxima entre el polímero soluble en aminooxilo y el ligador aminooxi.
61. El método de acuerdo con la reivindicación 60 caracterizado por que dicha formación del enlace de oxima es catalizada por un catalizador nucleofílico seleccionado del grupo que consiste en ácido o-amino benzoico, ácido m-amino benzoico, ácido p-amino benzoico, ácido sulfanilico, o-aminobenzamida, o-toluidina, -toluidin , p-toluidina, o-anisidina, m-anisidina y p-anisidina.
62. El método de acuerdo con la reivindicación 60 caracterizado por que el polímero soluble en agua es PSA.
63. El método de acuerdo con la reivindicación 60 caracterizado por que el polímero soluble en agua es PEG.
64. El método de acuerdo con la reivindicación 60 caracterizado por que la solución que comprende el polímero soluble en agua oxidado y el ligador de aminooxi que comprende un grupo aminooxi activo se incuba a 4 °C durante 1 h sin luz, con agitación.
65. El método de acuerdo con la reivindicación 64 caracterizado por que el polímero soluble en agua que contiene un grupo aminooxi activo se purifica mediante cromatografía de intercambio aniónico a una temperatura de 4 °C.
66. Un método para preparar un polímero soluble en agua que contiene un grupo aminooxi activo que comprende : a) incubar una solución que comprende un polímero soluble en agua con un ligador aminooxi que comprende un grupo aminooxi activo en condiciones que permiten la formación de un enlace oxima estable entre el polímero soluble en agua y el ligador aminooxi activado, dichas condiciones comprenden un período entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 24 horas; una temperatura entre aproximadamente 22 °C y aproximadamente 37 °C; en presencia o ausencia de luz y con o sin agitación; formando así un polímero soluble en agua que contiene un grupo aminooxi activo; y b) purificar el polímero soluble en agua que contiene un grupo aminooxi activo a través de un método seleccionado del grupo que consiste en cromatografía, filtración, diálisis y precipitación; mediante lo cual se forma un enlace de oxima entre el polímero soluble en aminooxilo y el ligador aminooxi.
67. El método de acuerdo con la reivindicación 66 caracterizado por que dicha formación del enlace de oxima es catalizada por un catalizador nucleofílico seleccionado del grupo que consiste en ácido o-amino benzoico, ácido m-amino benzoico, ácido p-amino benzoico, ácido sulfanílico, o-aminobenzamida , o-toluidina, m-toluidina, p-toluidina, o-anisidina, m-anisidina y p-anisidina.
68. El método de acuerdo con la reivindicación 66 por que la solución que comprende el polímero soluble en agua y el ligador de aminooxi que comprende un grupo aminooxi activo se incuba a 22 °C durante 2 h sin luz, con agitación.
69. El método de acuerdo con la reivindicación 66 caracterizado por que la solución que comprende el polímero soluble en agua y el ligador de aminooxi que comprende un grupo aminooxi activo se incuba a 22 °C durante 2 h sin luz, con agitación; dicho método comprende además la etapa de aumentar la temperatura de la solución hasta una temperatura de entre aproximadamente 32 °C y aproximadamente 37 °C e incubar durante otras 12-24 horas.
70. El método de acuerdo con la reivindicación 69 que comprende la etapa adicional de añadir una cantidad adicional de ligador de aminooxi que comprende un grupo aminooxi activo inmediatamente antes de aumentar la temperatura .
71. El método de acuerdo con la reivindicación 66 caracterizado por que se purifica el polímero soluble en agua que contiene un grupo aminooxi activo a través de un método seleccionado del grupo que consiste en diálisis, ultrafiltración/diaf iltración (UF/DF) y cromatografía a una temperatura de 22 °C.
72. El método de acuerdo con la reivindicación 71 que además comprende la etapa de purificación del polímero soluble en agua que contiene un grupo aminooxi activo a través de un método seleccionado del grupo que consiste en diálisis, UF/DF o cromatografía a 4 °C.
73. Un método para preparar un grupo aminooxi de reactivo PSA-aminooxi que comprende: a) incubar una solución que comprende un PSA oxidado con un ligador aminooxi que comprende un grupo aminooxi activo en condiciones que permiten la formación de un enlace oxima estable entre el PSA oxidado y el ligador aminooxi activado, dichas condiciones comprenden un período de 1 hora; una temperatura de 4 °C; en ausencia de luz, y sin agitación; formando así un PSA que contiene un grupo aminooxi activo; y b) purificar el PSA que contiene un grupo aminooxi activo mediante cromatografía de intercambio aniónico, una temperatura de 4 °C; dicho ligador aminooxi activado es ligador 3-oxa-pentano-1 ,5-dioxiamina de la fórmula: mediante lo cual se forma un enlace de oxima entre el PSA y el ligador aminooxi.
74. Un método para preparar un grupo aminooxi de reactivo PSA-aminooxi que comprende: a) incubar una solución que comprende un PSA no oxidado con un ligador aminooxi que comprende un grupo aminooxi activo en condiciones que permiten la formación de un enlace oxima estable entre el PSA no oxidado y el ligador aminooxi activado, dichas condiciones comprenden un período de 2 horas; una temperatura de 22 °C; en ausencia de luz, y sin agitación; formando así un PSA que contiene un grupo aminooxi activo; y b) purificar el PSA que contiene un grupo aminooxi activo mediante diálisis a una temperatura de 22 °C; dicho ligador aminooxi activado es ligador 3-oxa-pentano- 1,5-dioxiamina de la fórmula: mediante lo cual se forma un enlace de oxima entre el PSA no oxidado y el ligador aminooxi.
75. Un método de conjugación de un polímero soluble en agua con un resto de carbohidrato oxidado de una proteína de coagulación sanguínea que comprende poner en contacto el resto de carbohidrato oxidado con un polímero soluble en agua activado en condiciones que permiten la conjugación; dicha proteína de coagulación sanguínea seleccionada del grupo que consiste en Factor IX (FIX), Factor VIII (FVIII), Factor Vlla (FVIIa), Factor de Von Willebrand (VWF), Factor FV (FV), Factor X (FX), Factor XI (FXI), Factor XII (FXII), trombina (FII), proteina C, proteína S, tPA, PAI-1, factor tisular (TF) y proteasa ADAMTS 13 o un fragmento, derivado o variante biológicamente activa de estos; dicho polímero soluble en agua contiene un grupo aminooxi activo y se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol (PEG), PEG ramificado, ácido polisiálico (PSA ), carbohidrato, polisacáridos , pululano, quitosán, ácido hialurónico, sulfato de condroitina, sulfato de dermatan, dextrano, carboximetil-dextrano, óxido de polialquileno (PAO), polialquilenglicol (PAG), polipropilenglicol (PPG), polioxazolina, poliacriloilmorf olina, alcohol polivinílico (PVA), po1 icarboxi1ato, polivinilpirrolidona , polifospazeno, polioxazolina, anhídrido de ácido polietilen-co-maleico, anhídrido de ácido poliestiren-co-maleico , po1i(hidroximeti1forma1 1-hidroximetiletileno ) (PHF), 2-metacriloiloxi-2 '-etiltrimetilamoniof osfato (MPC); y dicho resto de carbohidrato oxidado por incubación con un amortiguador que comprende un agente de oxidación selecciona del grupo que consiste en periodato de sodio (NaI04), tetraacetato de plomo (Pb(OAc)4 ) y perrutenato de potasio (KRu04); en donde un enlace oxima se forma entre el resto de carbohidrato oxidado y el grupo aminooxi activo en el polímero soluble en agua.
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