EA028186B1 - Способ конъюгации водорастворимого полимера с терапевтическим белком (варианты) и полученный модифицированный белок - Google Patents

Способ конъюгации водорастворимого полимера с терапевтическим белком (варианты) и полученный модифицированный белок Download PDF

Info

Publication number
EA028186B1
EA028186B1 EA201492115A EA201492115A EA028186B1 EA 028186 B1 EA028186 B1 EA 028186B1 EA 201492115 A EA201492115 A EA 201492115A EA 201492115 A EA201492115 A EA 201492115A EA 028186 B1 EA028186 B1 EA 028186B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
protein
growth factor
factor
receptor
absence
Prior art date
Application number
EA201492115A
Other languages
English (en)
Other versions
EA028186B9 (ru
EA201492115A1 (ru
Inventor
Юрген Зикманн
Штефан Хайдер
Ханспетер Роттенштайнер
Петер Турецек
Original Assignee
Баксалта Инкорпорейтид
Баксалта Гмбх
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US13/488,043 external-priority patent/US8809501B2/en
Application filed by Баксалта Инкорпорейтид, Баксалта Гмбх filed Critical Баксалта Инкорпорейтид
Publication of EA201492115A1 publication Critical patent/EA201492115A1/ru
Publication of EA028186B1 publication Critical patent/EA028186B1/ru
Publication of EA028186B9 publication Critical patent/EA028186B9/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Изобретение относится к материалам и способам конъюгации водорастворимого полимера с окисленным углеводным компонентом терапевтического белка, включающим осуществление контакта окисленного углеводного компонента с активированным водорастворимым полимером в условиях, которые допускают конъюгацию. Конкретнее, настоящее изобретение относится к вышеупомянутым материалам и способам, в которых водорастворимый полимер содержит активную аминооксигруппу и оксимная или гидразоновая связь образуется между окисленным углеводным компонентом и активной аминооксигруппой водорастворимого полимера, при этом конъюгацию осуществляют в присутствии нуклеофильного катализатора.

Description

Получение конъюгатов с помощью образования ковалентной связи между водорастворимым полимером и терапевтическим белком может выполняться разнообразными химическими способами. ПЭГилирование лекарственных веществ полипептидной природы защищает их при циркуляции и улучшает их фармакодинамические и фармакокинетические профили (Нат5 апб С1е55, ΝηΙ Ксу Огид Όίδεον. 2003; 2:214-21). В процессе ПЭГилирования повторяющиеся мономеры этиленгликоля (полиэтиленгликоль (ПЭГ)) присоединяются к полипептидному лекарственному веществу. Молекулы ПЭГ обладают большим гидродинамическим объемом (в 5-10 раз больше размера глобулярных белков), имеют высокую растворимость в воде и высокую способность к гидратации, не токсичны, не иммуногенны и быстро выводятся из организма. ПЭГилирование молекул может приводить к увеличению устойчивости лекарственных веществ к ферментативному расщеплению, увеличению периода полувыведения ίη νίνο, снижению частоты дозирования, уменьшению иммуногенности, увеличению физической и термической стабильности, увеличению растворимости, увеличению устойчивости в жидкостях и снижению агрегации. Первые ПЭГилированные лекарственные вещества были одобрены ΡΌΆ в начале 1990 гг. С тех пор ΡΌΆ одобрило несколько ПЭГилированных лекарственных веществ для перорального, инъекционного и местного применения.
Полисиаловая кислота (ПСК), также именуемая как коломиновая кислота (КК), представляет собой встречающийся в природе полисахарид. Это вещество является гомополимером Ν-ацетилнейраминовой кислоты с α(2^8) кетокислотной связью и содержит вицинальные диольные группы на невосстанавливающем конце. Это вещество является отрицательно заряженным и представляет собой природный компонент организма человека. Этот вещество может быть легко получено, в больших количествах и с предварительно установленными физическими свойствами, из бактерий (патент США № 5846951). В связи с тем, что полученная с помощью бактерий ПСК является химически и иммунологически идентичной ПСК, синтезированной в организме человека, бактериальная ПСК неиммуногенна даже при связывании с белками. В отличие от других полимеров кислота ПСК способна к биодеградации. Было показано, что ковалентное связывание коломиновой кислоты с каталазой и аспарагиназой увеличивает ферментную стабильность в присутствии протеолитических ферментов или в плазме крови. Сравнительные исследования ίη νίνο с полисиалированной и немодифицированной аспарагиназой выявили, что полисиалирование увеличивает период полувыведения данного фермента (Регпапбе5 апб Огедопаб18, Ιηΐ 1 РЬагт. 2001; 217: 215-24).
Обзор связывания производных ПЭГ с пептидами и белками представлен в статье РоЬег15 е! а1. (Α6ν Эгид Эейу Рет 2002;54:459-76). Одним подходом для связывания водорастворимых полимеров с терапевтическими белками является конъюгация полимеров посредством углеводных компонентов белка. Вицинальные гидроксильные (ОН) группы углеводов в белках могут легко окисляться перйодатом натрия (№ιΙΟ(Ι с образованием активных альдегидных групп (Ро1НГи5 е! διηίΐΐι, 1 ΒίοΙ Сйеш 1963; 238:140210; νаη БеШеп е! А5Й№е11, 1 ΒίοΙ Сйеш 1971; 246:1889-94). В дальнейшем полимер может соединяться с альдегидными группами углевода с помощью реагентов, содержащих, к примеру, активную гидразидную группу (ЛУПсНек М апб Вауег ЕА, МеίЬοб5 Εηζутο1, 1987; 138:429-42). Более поздняя технология предполагает использование реагентов, содержащих аминооксигруппы, которые реагируют с альдегидами с образованием оксимных связей (\УО 96/40662, \УО 2008/025856).
Дополнительные примеры, описывающие конъюгацию водорастворимого полимера с терапевтическим белком, описаны в заявке \УО 06/071801, в которой сообщается об окислении углеводных компонентов фактора фон Виллебранда и последующем связывании с ПЭГ с применением методов химии гидразидов; в публикации патента США № 2009/0076237, в которой сообщается об окислении гРУШ, последующем связывании с ПЭГ и другими водорастворимыми полимерами (например, ПСК, ГЭК, декстраном) с применением методов химии гидразидов; в заявке \УО 2008/025856, в которой сообщается об окислении разных факторов коагуляции, например, гР1Х, РУШ и РУПа, последующем связывании с, к примеру, ПЭГ с применением методов химии аминооксигрупп путем образования оксимной связи и в патенте США № 5621039, в котором сообщается об окислении Р1Х и последующем связывании с ПЭГ с применением методов химии гидразидов.
Недавно был описан улучшенный способ включающий осуществление мягкого окисления перйодатом сиаловых кислот до образования альдегидов с последующей реакцией с реагентом, содержащим аминоокси-группу, в присутствии каталитических количеств анилина (ЭМ^еп А., апб Ο;·ι\Υ5οπ РЕ, Βίοсοη^ида!е Сйеш. 2008; 19,2543-8; и 2епд Υ е! а1., №Лиге МеίЬοб5 2009;6:207-9). Анилиновый катализ кардинально ускоряет оксимное связывание, допуская использование очень низких концентраций реагента. Применение нуклеофильных катализаторов также описано в статьях ЭМ^еп А. е! а1., 1 Ат С1ет δο^ 128:15602-3 (2006); Пик5еп, А., е! а1., Апдете скет. 1п! Еб., 45:7581-4 (2006); КюЫег, РР, СйетВюСйет., 10:2147-50 (2009); Οш5еρροηе, Ν., е! а1., 1 Ат Сйет δο^ 127:5528-39 (2005); апб Тйуде5еп, М.В., е! а1., 1 Огд Сйет., 75:1752-5 (2010).
Несмотря на то, что анилиновый катализ может ускорить оксимное связывание, обеспечивая корот- 1 028186 кое время реакции и применение низких концентраций аминоокси реагента, анилин обладает токсическими свойствами, которые должны быть учтены, например, при получении конъюгированного терапевтического белка, образующего основу фармацевтического препарата. К примеру, было показано, что анилин индуцирует метгемоглобинемию (Наткоп ΙΗ. апб 1о11оте Ό.Ι, Мо1еси1аг Рйаттасо1оду, 32(3) 423431, 1987). Показано, что долговременное включение анилина в диету крыс индуцировало образование опухолей в селезенке (Сообтап ΌΟ., е! а1., 1 Ν;·ιΐ1 Сапсег Ιηδΐ, 73(1): 265-73, 1984). Исследования ίη уйто также показали, что анилин способствует индукции хромосомных мутаций и имеет потенциальную генотоксическую активность (ВотЬйатб Е.М. е! НетЬо1б В, Стйюа1 Ре\зе\У5 ш Тохюо1оду 35, 783-835, 2005).
Эти факты сохраняют необходимость разработки веществ и способов для конъюгации водорастворимых полимеров с белками, которые улучшают фармакодинамические и фармакокинетические свойства белков при минимизации затрат, связанных с применением различных реагентов, и минимизации рисков для здоровья пациента-потребителя.
Сущность изобретения
В настоящем изобретении предложены вещества и способы для конъюгации полимеров с белками, которые улучшают фармакодинамические и/или фармакокинетические свойства белков при минимизации затрат, связанных с применением различных реагентов, и рисков для здоровья пациентовпотребителей, если реакция конъюгации катализируется нуклеофильным катализатором. В разных вариантах реализации изобретения предложены альтернативные катализаторы для замены анилина.
В настоящем раскрытии изобретения также представлена оптимизированная методика для получения различных реагентов водорастворимых полимеров-аминоокси линкеров, которые можно применять для конъюгации терапевтических белков, как описано в данном документе. Недавние исследования методом ЯМР показали, что если получение ПСК-аминоокси реагента выполняется при комнатной температуре, то на восстанавливающем конце ПСК могут проходить побочные реакции. Поэтому в различных вариантах реализации настоящего раскрытия изобретения новый процесс получения проводят при температуре в пределах 2-8°С. В одном варианте реализации ПСК-аминоокси реагент получают при 4°С в соответствии с процессом, описанным в данном документе. Кроме того, в настоящем раскрытии изобретения также предполагается очистка реагента с применением стадии хроматографической очистки (например, ИОХ) при температуре в пределах 2-8°С. Прохождение нежелательных побочных реакций на восстанавливающем конце ПСК значительно снижается, когда весь процесс (химической реакции и очистки конъюгата методом ИОХ) проводится при температуре в пределах 2-8°С.
В одном варианте реализации в соответствии с настоящим раскрытием изобретения предложен способ конъюгации водорастворимого полимера с окисленным углеводным компонентом терапевтического белка, включающий осуществление контакта окисленного углеводного компонента с активированным водорастворимым полимером в условиях, позволяющих провести конъюгацию; указанный водорастворимый полимер содержит активную аминооксигруппу и выбран из группы, состоящей из: полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветленного ПЭГ, Ро1уРЕС® (ХУагМск ЕГГес! Ро1утегк; Соуепйу, ИК), полисиаловой кислоты (ПСК), крахмала, гидроксиалкилкрахмала (ГАК), гидроксилэтилкрахмала (ГЭК), углевода, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дерматансульфата, крахмала, декстрана, карбоксиметилдекстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полипропиленгликоля (ППГ), полиоксазолина, полиакрилоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, сополимера полиэтиленаангидрида малеиновой кислоты, сополимера полистирола-ангидрида малеиновой кислоты, поли(1гидроксиметилэтилен-гидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилтриметиламмония фосфата (МФК), причем этот водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, получают способом, включающим: а) инкубацию раствора, содержащего окисленный водорастворимый полимер с аминоокси линкером, содержащим активную аминооксигруппу, в условиях, которые допускают образование стабильной оксимной связи между окисленным водорастворимым полимером и активированным аминоокси линкером, указанные условия включают период времени между около 1 мин и около 24 ч; температуру между около 2 и около 8°С; присутствие или отсутствие света и наличие или отсутствие перемешивания; при этом образуется водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу; и Ь) очистку водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу методом, выбранным из группы, состоящей из хроматографии, фильтрации, диализа и осаждения при температуре между около 2 и около 8°С; указанный углеводный компонент окисляется инкубированием с буферным раствором, содержащим окисляющий агент, выбранный из группы, состоящей из: перйодата натрия (ХаЮ4), тетраацетата свинца (РЬ(ОАс)4) перрутената калия (ККцО4); причем оксимная связь образуется между окисленным углеводным компонентом и активной аминооксигруппой водорастворимого полимера и, причем, образование указанной оксимной связи катализируется нуклеофильным катализатором, выбранным из группы, состоящей из: о-аминобензойной кислоты, м-аминобензойной кислоты, паминобензойной кислоты, сульфаниловой кислоты, о-аминобензамида, о-толуидина, м-толуидина, птолуидина, о-анизидина, м-анизидина и п-анизидина.
В другом варианте реализации изобретения предложен вышеупомянутый способ, в котором рас- 2 028186 твор, содержащий окисленный водорастворимый полимер, и аминооксилинкер, содержащий активную аминооксигруппу, инкубируют при 4°С в течение 1 ч в отсутствие света и при перемешивании. В другом варианте реализации изобретения предложен вышеупомянутый способ, в котором водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, очищают анионообменной хроматографией при температуре 4°С. В другом варианте реализации предложен вышеуказанный способ, в котором окисленный водорастворимый полимер представляет собой ПСК и окисляется при инкубации с ИаЮ4.
В другом варианте реализации раскрытия изобретения предложен способ конъюгации водорастворимого полимера с окисленным углеводным компонентом терапевтического белка, включающий осуществление контакта окисленного углеводного компонента с активированным водорастворимым полимером в условиях, которые допускают конъюгацию; указанный водорастворимый полимер содержит активную аминооксигруппу и выбирается из группы, состоящей из: полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветленного ПЭГ, Ро1уРЕО® (\Уаг\\юк ЕГГсс1 Ро1ушег8; СоусШгу. ИК), полисиаловой кислоты (ПСК), крахмала, гидроксиалкилкрахмала (Г АК), гидроксилэтилкрахмала (ГЭК), углевода, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дерматансульфата, крахмала, декстрана, карбоксиметилдекстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полипропиленгликоля (ИНГ), полиоксазолина, полиакрилоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, сополимера полиэтилена-ангидрида малеиновой кислоты, сополимера полистирола-ангидрида малеиновой кислоты, поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилтриметиламмония фосфата (МФК), причем водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, получают способом, включающим: а) инкубирование раствора, содержащего водорастворимый полимер с аминоокси линкером, содержащим активную аминооксигруппу в условиях, которые допускают образование стабильной оксимной связи между водорастворимым полимером и активированным аминоокси линкером, указанные условия включают период времени между около 1 мин и около 24 ч; температуру между около 22°С и около 37°С; присутствие или отсутствие света, и наличие или отсутствие перемешивания; при этом образуется водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу; и Ь) очистку водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу, методом, выбранным из группы, состоящей из: хроматографии, фильтрации, диализа и осаждения; указанный углеводный компонент окисляется при инкубации с буферным раствором, содержащим окисляющий агент, выбранный из группы, состоящей из перйодата натрия (ИаЮ4), тетраацетата свинца (РЬ(ОАс)4) и перрутената калия (КК.иО4); при этом оксимная связь образуется между окисленным углеводным компонентом и активной аминооксигруппой водорастворимого полимера и, причем, образование указанной оксимной связи катализируется нуклеофильным катализатором, выбранным из группы, состоящей из о-аминобензойной кислоты, маминобензойной кислоты, п-аминобензойной кислоты, сульфаниловой кислоты, о-аминобензамида, отолуидина, м-толуидина, п-толуидина, о-анизидина, м-анизидина и п-анизидина.
В другом варианте реализации изобретения предложен вышеприведенный способ, в котором раствор, содержащий водорастворимый полимер и аминооксилинкер, содержащий активную аминооксигруппу, инкубируют при 22°С в течение 2 ч в отсутствие света и при перемешивании. В другом варианте реализации изобретения предложен вышеупомянутый способ, в котором раствор, содержащий водорастворимый полимер, и аминооксилинкер, содержащий активную аминооксигруппу, инкубируют при 22°С в течение 2 ч в отсутствие света и при перемешивании; указанный способ дополнительно включает стадию повышения температуры раствора до температуры между около 32 и около 37°С и инкубацию дополнительно в течение 12-24 ч. В другом варианте реализации изобретения предложен вышеупомянутый способ, включающий дополнительную стадию добавления дополнительного количества аминоокси линкера, содержащего активную аминооксигруппу, непосредственно перед повышением температуры. В другом варианте реализации изобретения предложен вышеупомянутый способ, в котором водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, очищают методом, выбранным из группы, состоящей из диализа, ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) и хроматографии при температуре 22°С. В другом варианте реализации изобретения предложенный вышеупомянутый способ дополнительно содержит стадию очистки водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу, методом, выбранным из группы, состоящей из диализа, УФ/ДФ и хроматографии при 4°С.
В разных вариантах реализации настоящего раскрытия изобретения предложен вышеупомянутый способ, в котором терапевтический белок выбран из группы, состоящей из Фактора IX (ΡΙΧ), Фактора VIII (РУШ), Фактора УПа (РУПа), Фактора фон Виллебранда (У^Р), Фактора РУ (РУ), Фактора X (ΡΧ), Фактора XI (РХ^, Фактора XII (РХП), тромбина (РН), белка С, белка 8, 1РА, РАН, тканевого фактора (ТФ), протеазы АИАМТ8 13, ИЛ-1 альфа, ИЛ-1 бета, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-11, колониестимулирующего фактора-1 (КСФ-1), М-КСФ, ФСК, ГМ-КСФ, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г -КСФ), ЭПО, интерферона-альфа (ИФН-альфа), консенсусного интерферона, ИФН-бета, ИФН-гамма, ИФН-омега, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-9, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-13, ИЛ-14, ИЛ-15, ИЛ-16, ИЛ-17, ИЛ-18, ИЛ-19, ИЛ-20, ИЛ-21, ИЛ-22, ИЛ-23, ИЛ-24, ИЛ-31, ИЛ-32 альфа, ИЛ-33, тромбопоэтина (ТПО), Апд-1, Апд-2, Апд-4, Апд-Υ, ангиопоэтинподобного полипептида 1 (АИСРТЫ), ангиопоэтинподобного поли- 3 028186 пептида 2 (ΑΝΟΡΤΕ2), ангиопоэтинподобного полипептида 3 (ΑΝΟΡΤΕ3), ангиопоэтинподобного полипептида 4 (ΑΝΟΡΤΕ4), ангиопоэтинподобного полипептида 5 (ΑΝΟΡΤΕ5), ангиопоэтинподобного полипептида 6 (ΑΝΟΡΤΕ6), ангиопоэтинподобного полипептида 7 (ΑΝΟΡΤΕ7), витронектина, фактора роста эндотелия сосудов (ФРЭС), ангиогенина, активина А, активина В, активина С, костного морфогенетического белка-1, костного морфогенетического белка-2, костного морфогенетического белка-3, костного морфогенетического белка-4, костного морфогенетического белка-5, костного морфогенетического белка-6, костного морфогенетического белка-7, костного морфогенетического белка-8, костного морфогенетического белка-9, костного морфогенетического белка-10, костного морфогенетического белка-11, костного морфогенетического белка-12, костного морфогенетического белка-13, костного морфогенетического белка-14, костного морфогенетического белка-15, рецептора ΙΑ костного морфогенетического белка, рецептора ΙΒ костного морфогенетического белка, рецептора II костного морфогенетического белка, нейротрофического фактора головного мозга, кардиотрофина-1, цилиарного нейротрофического фактора, рецептора цилиарного нейротрофического фактора, белка крипто, криптического белка, индуцированного цитокинами хемотаксического фактора 1 нейтрофилов, индуцированного цитокинами хемотаксического фактора 2α нейтрофилов, индуцированного цитокинами хемотаксического фактора 2β нейтрофилов, эндотелиального клеточного фактора роста β, эндотелина 1, эпидермального фактора роста, эпигена, эпирегулина, аттрактанта нейтрофилов эпителиального происхождения, фактора роста фибробластов 4, фактора роста фибробластов 5, фактора роста фибробластов 6, фактора роста фибробластов 7, фактора роста фибробластов 8, фактора роста фибробластов 8Ь, фактора роста фибробластов 8с, фактора роста фибробластов 9, фактора роста фибробластов 10, фактора роста фибробластов 11, фактора роста фибробластов 12, фактора роста фибробластов 13, фактора роста фибробластов 16, фактора роста фибробластов 17, фактора роста фибробластов 19, фактора роста фибробластов 20, фактора роста фибробластов 21, кислого фактора роста фибробластов, основного фактора роста фибробластов, рецептора α1 нейротрофического фактора глиальной клеточной линии, рецептора α2 нейротрофического фактора глиальной клеточной линии, связанного с ростом белка, связанного с ростом белка α, связанного с ростом белка β, связанного с ростом белка γ, связывающего гепарин эпидермального фактора роста, фактора роста гепатоцитов, рецептора фактора роста гепатоцитов, фактора роста, полученного из гепатомы, инсулиноподобного фактора роста I, рецептора инсулиноподобного фактора роста, инсулиноподобного фактора роста II, белка, связывающего инсулиноподобный фактор роста, фактора роста кератиноцитов, ингибирующего лейкемию фактора, рецептора α ингибирующего лейкемию фактора, фактора роста нервов, рецептора фактора роста нервов, нейропоэтина, нейротрофина-3, нейротрофина-4, онкостатина М (Θ8Μ), плацентарного фактора роста, плацентарного фактора роста 2, тромбоцитарного фактора роста эндотелиальных клеток, тромбоцитарного фактора роста, цепи А тромбоцитарного фактора роста, тромбоцитарного фактора роста АА, тромбоцитарного фактора роста АВ, цепи В тромбоцитарного фактора роста, тромбоцитарного фактора роста ВВ, рецептора α тромбоцитарного фактора роста, рецептора β тромбоцитарного фактора роста, стимулирующего фактора роста предшественников В-клеток, фактора стволовых клеток (ФСК), рецептора фактора стволовых клеток, ФНО, ФНО0, ФНО1, ФНО2, трансформирующего фактора роста α, трансформирующего фактора роста β, трансформирующего фактора роста β1, трансформирующего фактора роста β 1.2, трансформирующего фактора роста β2, трансформирующего фактора роста β3, трансформирующего фактора роста β5, латентного трансформирующего фактора роста β1, связывающего белка I трансформирующего фактора роста β, связывающего белка II трансформирующего фактора роста β, связывающего белка III трансформирующего фактора роста β, тимусного стромального лимфопоэтина (ТСЛП), рецептора I типа фактора некроза опухолей, рецептора II типа фактора некроза опухолей, рецептора активатора плазмогена урокиназного типа, активирующего белка фосфолипазы (ΡϋΡ), инсулина, лектина рицина, пролактина, хорионического гонадотропина, фолликулостимулирующего гормона, тиреостимулирующего гормона, тканевого активатора плазминогена, ЦС. ЦЕ. ЦМ, !^Α и ЦО, α-галактозидазы, β-галактозидазы, ДНКазы, фетуина, лютеинизирующего гормона, эстрогена, инсулина, альбумина, липопротеинов, фетопротеина, трансферрина, тромбопоэтина, урокиназы, интегрина, тромбина, лептина, белка Хумира (адалимумаба), белка Пролиа (деносумаба), белка Энбрел (этанерсепта), белка из табл. 1 или их биологически активного фрагмента, производного или варианта.
В еще одном варианте реализации изобретения предложен вышеупомянутый способ, в котором раствор, содержащий начальную концентрацию терапевтического белка между около 0,3 мг/мл и около 3,0 мг/мл, корректируют до значения рН между около 5,0 и около 8,0 перед осуществлением контакта с активированным водорастворимым полимером. В одном варианте реализации изобретения начальная концентрация терапевтического белка составляет около 1,0 мг/мл, а рН составляет около 6,0.
В другом варианте реализации изобретения предложен вышеупомянутый способ, в котором терапевтический белок приводят в контакт с требуемой избыточной концентрацией активированного водорастворимого полимера, причем избыточная концентрация находится между около 1-молярным и около 300-молярным избыточным количеством. В одном варианте реализации изобретения избыточная концентрация составляет около 50-кратное молярное избыточное количество.
- 4 028186
В другом варианте реализации изобретения предложен вышеупомянутый способ, в котором терапевтический белок инкубируют с активированным водорастворимым полимером в условиях, включающих период времени между около 0,5 и около 24 ч; температуру между около 2 и около 37°С; присутствие или отсутствие света и наличие или отсутствие перемешивания. В одном варианте реализации изобретения условия включают период времени около 120 мин, температуру около 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания.
В еще одном варианте реализации изобретения предложен вышеупомянутый способ, в котором нуклеофильный катализатор добавляют в количестве, обеспечивающем получение конечной концентрации нуклеофильного катализатора между около 1,0 и около 50 мМ, в условиях, включающих период времени между около 0,1 и около 30 мин; температуру между около 2 и около 37°С; присутствие или отсутствие света и наличие или отсутствие перемешивания. В одном варианте реализации изобретения конечная концентрация нуклеофильного катализатора составляет около 10 мМ, а условия включают период времени до около 15 мин, температуру около 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания.
В еще одном варианте реализации изобретения предложен вышеупомянутый способ, в котором окисляющий агент добавляют в количестве, обеспечивающем получение конечной концентрации окисляющего агента между около 50 и около 1000 мкМ, в условиях, включающих период времени между около 0,1 и около 120 мин; температуру между около 2 и около 37°С; присутствие или отсутствие света и наличие или отсутствие перемешивания. В одном варианте реализации изобретения конечная концентрация окисляющего агента составляет около 400 мкМ, а условия включают период времени около 10 мин, температуру около 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания.
В еще одном варианте реализации изобретения предложен вышеупомянутый способ, в котором конъюгацию водорастворимого полимера с окисленным углеводным компонентом терапевтического белка останавливают добавлением останавливающего агента, выбранного из группы, состоящей из: Ьцистеина, метионина, глутатиона, глицерина, метабисульфита натрия (Ыа282О5), триптофана, тирозина, гистидина или его производных, крезола, имидазола и их комбинаций; причем останавливающий агент добавляют в количестве, обеспечивающем получение конечной концентрации останавливающего агента между около 1 и около 100 мМ, в условиях, включающих период времени между около 5 и около 120 мин; температуру между около 2 и около 37°С; присутствие или отсутствие света и наличие или отсутствие перемешивания. В одном варианте реализации изобретения останавливающий агент является Ьцистеином. В еще одном варианте реализации изобретения Ь-цистеин добавляют в количестве, обеспечивающем получение конечной концентрации около 10 мМ, а условия включают период времени около 60 мин, температуру около 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания.
В другом варианте реализации предложен вышеприведенный способ, включающий: а) первую стадию, включающую корректирование значения рН раствора, содержащего терапевтический белок, до значения рН между около 5,0 и около 8,0, на которой концентрация терапевтического белка составляет между около 0,3 мг/мл и около 3,0 мг/мл; Ь) вторую стадию, включающую окисление одного или более углеводов терапевтического белка, причем окисляющий агент добавляют к раствору на первой стадии для получения конечной концентрации между около 50 и около 1000 мкМ в условиях, включающих период времени между около 0,1 и около 120 мин; температуру между около 2 и около 37°С; присутствие или отсутствие света и наличие или отсутствие перемешивания; с) третью стадию, включающую осуществление контакта терапевтического белка с требуемой избыточной концентрацией водорастворимого полимера, причем избыточная концентрация составляет количество между около 1-молярным избытком и около 300-молярным избытком в условиях, включающих период времени между около 0,5 ч и около 24 ч, температуру между около 2 и около 37°С, присутствие или отсутствие света и наличие или отсутствие перемешивания; ά) четвертую стадию, включающую добавление нуклеофильного катализатора к раствору с третьей стадии, причем нуклеофильный катализатор добавляют до получения конечной концентрации между около 1 и около 50 мМ в условиях, включающих период времени между около 0,1 мин и около 30 мин, температуру между около 2 и около 37°С, присутствие или отсутствие света и наличие или отсутствие перемешивания; е) пятую стадию, на которой терапевтический белок инкубируют с активированным водорастворимым полимером и нуклеофильным катализатором в условиях, которые допускают проведение конъюгации активированного водорастворимого полимера с одним и более окисленными углеводами терапевтического белка, указанные условия включают период времени между около 0,5 ч и около 24 ч, температуру между около 2 и около 37°С, присутствие или отсутствие света и наличие или отсутствие перемешивания; и ί) шестую стадию, на которой конъюгация водорастворимого полимера с одним и более окисленными углеводами терапевтического белка на пятой стадии останавливают добавлением останавливающего агента, выбранного из группы, состоящей из Ь-цистеина, метионина, глутатиона, глицерина, Ыа282О5 (метабисульфита натрия), триптофана, тирозина, гистидина или его производных, крезола, имидазола и их комбинаций; причем останавливающий агент добавляют в количестве, обеспечивающем получение конечной концентрации между около 1 и около 100 мМ, в условиях, включающих период времени между около 5 и около 120 мин; температуру между около 2 и около 37°С; присутствие или отсутствие света и наличие или отсутствие перемешивания. В другом варианте реализации
- 5 028186 изобретения начальная концентрация терапевтического белка на первой стадии составляет около 1 мг/мл, а рН составляет около 6,0; причем конечная концентрация окисляющего агента на второй стадии составляет около 400 мкМ, а условия на пятой стадии включают период времени около 10 мин, температуру около 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания; причем избыточная концентрация на третьей стадии составляет около 50-кратный молярный избыток; при этом условия на третьей стадии включают период времени, равный около 15 мин, температуру около 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания; причем конечная концентрация нуклеофильного катализатора на четвертой стадии составляет около 10 мМ, а условия на четвертой стадии включают период времени около 15 мин, температуру около 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания; при этом условия инкубирования терапевтического белка с активированным водорастворимым полимером и нуклеофильным катализатором на пятой стадии включают период времени около 2 ч, температуру около 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания; при этом останавливающий агент на шестой стадии является Ь-цистеином, и причем Ьцистеин добавляют до получения конечной концентрации около 10 мМ, а условия на шестой стадии включают период времени около 60 мин, температуру около 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания. В еще одном варианте реализации изобретения водорастворимый полимер является ПСК. В одном варианте реализации изобретения водорастворимый полимер является ПЭГ. В другом варианте реализации изобретения водорастворимый полимер является ГЭК. В еще одном варианте реализации изобретения водорастворимый полимер является Г АК. В другом варианте реализации изобретения ПСК содержит около 10-300 мономеров сиаловой кислоты. В еще одном варианте реализации изобретения терапевтический белок является ИХ. В другом варианте реализации изобретения терапевтический белок является РУ11а. В еще одном варианте реализации изобретения терапевтический белок является РУШ.
В другом варианте реализации изобретения предложен вышеупомянутый способ, в котором окисляющий агент представляет собой перйодат натрия (ЫаЮ4).
В другом варианте реализации изобретения предложен вышеупомянутый способ, в котором окисленный углеводный компонент терапевтического белка расположен на пептиде активации белка коагуляции крови.
В другом варианте реализации изобретения предложен вышеупомянутый способ, в котором ПСК включает активированный аминоокси линкер, выбранный из группы, состоящей из:
а) 3-окса-пентан-1,5-диоксиаминного линкера формулы
Ь) 3,6,9-триоксаундекан-1,11-диоксиаминного линкера формулы
и
с) 3,6,9,12,15-пентаоксагептадекан-1,17-диоксиаминного линкера формулы
где ПСК окисляют инкубацией с окисляющим агентом до образования концевой альдегидной группы на невосстанавливающем конце ПСК.
В другом варианте реализации изобретения аминооксилинкер является 3-оксапентан-1,5диоксиамином.
В другом варианте реализации изобретения предложен вышеупомянутый способ, в котором нуклеофильный катализатор применяют в концентрации между около 1 и около 50 мМ. В другом варианте реализации изобретения нуклеофильный катализатор является м-толуидином. В еще одном варианте реализации изобретения м-толуидин вводится в реакцию конъюгации в концентрации около 10 мМ.
В другом варианте реализации изобретения предложен вышеупомянутый способ, дополнительно включающий стадию очистки конъюгированного терапевтического белка. В одном варианте реализации изобретения конъюгированный терапевтический белок очищают методом, выбранным из группы, состоящей из хроматографии, фильтрации и осаждения. В еще одном варианте реализации изобретения хроматография выбрана из группы, состоящей из хроматографии с гидрофобными взаимодействиями (ХГВ), ионообменной хроматографии (ИОХ), эксклюзионной хроматографии (ЭХ), аффинной хроматографии и обращенно-фазовой хроматографии. В одном варианте реализации изобретения используется антихаотропная соль на стадии загрузки хроматографического носителя и на стадии отмывания хроматографического носителя. В еще одном варианте реализации изобретения хроматография проводится на колонке. В одном варианте реализации изобретения колонка содержит хроматографическую смолу, выбранную из группы, состоящей из фенил-сефарозы РР и бутил-сефарозы РР. В еще одном варианте реализации изобретения смола запакована в колонке на высоту слоя между около 5 и около 20 см.
В еще одном варианте реализации изобретения высота слоя составляет около 10 см. В другом варианте реализации изобретения предложен вышеупомянутый способ, включающий одну и более стадий отмывания, на которых направление потока выбрано в восходящем направлении и при этом скорость потока находится между около 0,2 и около 6,7 см/мин. В одном варианте реализации изобретения ско- 6 028186 рость потока равна около 2 см/мин. В другом варианте реализации изобретения предложен вышеупомянутый способ, включающий одну и более стадий элюирования, на которых направление потока выбрано в нисходящем направлении и при этом скорость потока находится между около 0,1 и около 6,7 см/мин. В одном варианте реализации изобретения скорость потока равна около 1 см/мин.
В еще одном варианте реализации изобретения предложен вышеупомянутый способ, дополнительно включающий концентрирование конъюгированного терапевтического белка методом ультра/диафильтрации (УФ/ДФ). В другом варианте реализации изобретения предложен вышеупомянутый способ, в котором конечная концентрация терапевтического белка находится между около 0,5 и около 3 мг/мл. В другом варианте реализации изобретения предложен вышеупомянутый способ, в котором терапевтический белок содержит в пределах около 5 и около 11 водорастворимых полимерных компонентов.
В еще одном варианте реализации изобретения предложен вышеупомянутый способ, в котором конъюгированный терапевтический белок очищают, применяя хроматографию, при этом антихаотропную соль используют на стадии загрузки и на стадии отмывания; этот способ включает одну и более стадий отмывания, на которых направление потока выбрано в восходящем направлении и при этом скорость потока находится между около 0,2 и около 6,7 см/мин, и одну и более стадий элюирования, на которых направление потока выбрано в нисходящем направлении и при этом скорость потока равна между около 0,2 см/мин и около 6,7 см/мин; способ дополнительно включает концентрирование конъюгированного терапевтического белка методом ультра-/диафильтрации (УФ/ДФ).
В другом варианте реализации изобретения предложен вышеупомянутый способ, в котором хроматография представляет собой хроматографию с гидрофобными взаимодействиями (ХГВ), при которой скорость потока на одной и более стадий отмывания составляет около 2 см/мин и при этом скорость потока на одной и более стадий элюирования составляет около 1 см/мин.
Модифицированный терапевтический белок получают вышеупомянутым способом, который также представлен в настоящем описании изобретения.
В одном варианте реализации настоящего раскрытия изобретения предложен способ получения водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу, включающий: а) инкубирование раствора, содержащего окисленный водорастворимый полимер с аминооксилинкером, содержащим активную аминооксигруппу в условиях, которые допускают образование стабильной оксимной связи между окисленным водорастворимым полимером и активированным аминооксилинкером, указанные условия включают период времени между около 1 мин и около 24 ч; температуру между около 2 и около 8°С; присутствие или отсутствие света, и наличие или отсутствие перемешивания; благодаря чему образуется водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу; и Ъ) очистку водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу, методом, выбранным из группы, состоящей из хроматографии, фильтрации, диализа и осаждения, при температуре между около 2°С и около 8°С; указанный водорастворимый полимер выбирается из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветленного ПЭГ, Ро1уРЕО® (ХУагМск ЕГГсс! Ро1утет§; Соуейгу, ИК), полисиаловой кислоты (ПСК), крахмала, гидроксиалкилкрахмала (ГАК), гидроксилэтилкрахмала (ГЭК), углевода, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дерматансульфата, крахмала, декстрана, карбоксиметилдекстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полипропиленгликоля (ППГ), полиоксазолина, полиакрилоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, сополимера полиэтилена-ангидрида малеиновой кислоты, сополимера полистирола-ангидрида малеиновой кислоты, поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилтриметиламмония фосфата (МФК), таким образом образуется оксимная связь между водорастворимым полимером и аминоокси линкером.
В другом варианте реализации изобретения предложен вышеупомянутый способ, в котором образование оксимной связи катализируется нуклеофильным катализатором, выбранным из группы, состоящей из о-аминобензойной кислоты, м-аминобензойной кислоты, п-аминобензойной кислоты, сульфаниловой кислоты, о-аминобензамида, о-толуидина, м-толуидина, п-толуидина, о-анизидина, м-анизидина и панизидина.
В другом варианте реализации изобретения предложен вышеупомянутый способ, в котором водорастворимый полимер является ПСК. В другом варианте реализации изобретения предложен вышеупомянутый способ, в котором водорастворимый полимер является ПЭГ. В другом варианте реализации изобретения предложен вышеупомянутый способ, в котором раствор, содержащий окисленный водорастворимый полимер, и аминоокси линкер, содержащий активную аминооксигруппу, инкубируют при 4°С в течение 1 ч в отсутствие света и при перемешивании. В другом варианте реализации изобретения предложен вышеупомянутый способ, в котором водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, очищают анионообменной хроматографией при температуре 4°С.
В еще одном варианте реализации настоящего раскрытия изобретения предложен способ получения водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу, включающий: а) инкубирование раствора, содержащего водорастворимый полимер, с аминооксилинкером, содержащим активную аминооксигруппу, в условиях, которые допускают образование стабильной оксимной связи между водорас- 7 028186 творимым полимером и активированным аминоокси линкером, указанные условия включают период времени между около 1 мин и около 24 ч; температуру между около 22 и около 37°С; присутствие или отсутствие света, и наличие или отсутствие перемешивания; благодаря чему образуется водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу; и Ь) очистку водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу методом, выбранным из группы, состоящей из хроматографии, фильтрации, диализа и осаждения; таким образом образуется оксимная связь между водорастворимым полимером и аминоокси линкером.
В другом варианте реализации изобретения предложен вышеупомянутый способ, в котором образование указанной оксимной связи катализируется нуклеофильным катализатором, выбранным из группы, состоящей из о-аминобензойной кислоты, м-аминобензойной кислоты, п-аминобензойной кислоты, сульфаниловой кислоты, о-аминобензамида, о-толуидина, м-толуидина, п-толуидина, о-анизидина, манизидина и п-анизидина.
В другом варианте реализации изобретения предложен вышеупомянутый способ, в котором раствор, содержащий водорастворимый полимер, и аминооксилинкер, содержащий активную аминооксигруппу, инкубируют при 22°С в течение 2 ч в отсутствие света и при перемешивании. В другом варианте реализации изобретения предложен вышеупомянутый способ, в котором раствор, содержащий водорастворимый полимер, и аминооксилинкер, содержащий активную аминооксигруппу, инкубируют при 22°С в течение 2 ч в отсутствие света и при перемешивании; указанный способ дополнительно включает стадию повышения температуры раствора до температуры между около 32 и около 37°С и инкубацию дополнительно в течение 12-24 ч. В другом варианте реализации изобретения предложен вышеупомянутый способ, включающий дополнительную стадию добавления дополнительного количества аминоокси линкера, содержащего активную аминооксигруппу, непосредственно перед повышением температуры.
В другом варианте реализации изобретения предложен вышеупомянутый способ, в котором водорастворимый полимер, содержащий аминооксигруппу очищают методом, выбранным из группы, состоящей из диализа, ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) и хроматографии при температуре 22°С. В другом варианте реализации изобретения предложен вышеупомянутый способ, дополнительно включающий стадию очистки водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу, методом, выбранным из группы, состоящей из диализа, УФ/ДФ или хроматографии при 4°С.
В еще одном варианте реализации настоящего раскрытия изобретения предложен способ получения аминооксигруппы ПСК-аминооксиреагента, включающий: а) инкубирование раствора, содержащего окисленную ПСК с аминооксилинкером, содержащим активную аминооксигруппу, в условиях, которые допускают образование стабильной оксимной связи между окисленной ПСК и активированным аминоокси линкером, указанные условия включают период времени 1 ч; температуру 4°С; отсутствие света и наличие перемешивания; благодаря чему образуется ПСК, содержащая активную аминооксигруппу; и Ь) очистку ПСК, содержащей активную аминооксигруппу, методом анионообменной хроматографии при температуре 4°С; указанный активированный аминоокси линкер представляет собой 3-оксапентан-1,5диоксиаминный линкер формулы:
таким образом образуется оксимная связь между ПСК и аминооксилинкером.
В еще одном варианте реализации настоящего раскрытия изобретения предложен способ получения аминооксигруппы ПСК-аминооксиреагента, включающий: а) инкубирование раствора, содержащего неокисленную ПСК с аминооксилинкером, содержащим активную аминооксигруппу, в условиях, которые допускают образование стабильной оксимной связи между неокисленной ПСК и активированным аминооксилинкером, указанные условия включают период времени 2 ч; температуру 22°С; отсутствие света и наличие перемешивания; благодаря чему образуется ПСК, содержащая активную аминоокси-группу; и
Ь) очистку ПСК, содержащей активную аминооксигруппу, методом диализа при температуре 22°С; указанный активированный аминооксилинкер представляет собой 3-оксапентан-1,5-диоксиаминный линкер формулы
таким образом образуется оксимная связь между неокисленной ПСК и аминооксилинкером.
В еще одном варианте реализации настоящего раскрытия изобретения предложен способ конъюгации водорастворимого полимера с окисленным углеводным компонентом белка коагуляции крови, включающий осуществление контакта окисленного углеводного компонента с активированным водорастворимым полимером в условиях, допускающих проведение конъюгации; указанный белок коагуляции крови выбрирается из группы, состоящей из Фактора IX (ИХ), Фактора VIII (РУШ), Фактора УПа (РУПа), Фактора фон Виллебранда (У^Р), Фактора РУ (РУ), Фактора X (РХ), Фактора XI (РХЦ, Фактора XII (РХП), тромбина (РИ), протеина С, проеина δ, ίΡΆ, ΡΆΣ-1, тканевого фактора (ТФ) и протеазы ΆΌΆΜΤδ 13 или их биологически активного фрагмента, производного или варианта; указанный водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу и выбранный из группы, состоящей из:
- 8 028186 полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветленного ПЭГ, полисиаловой кислоты (ПСК), углевода, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дерматансульфата, крахмала, декстрана, карбоксиметилдекстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полипропиленгликоля (ППГ), полиоксазолина, полиакрилоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, сополимера полиэтилена-ангидрида малеиновой кислоты, сополимера полистирола-ангидрида малеиновой кислоты, поли(1гидроксиметилэтилен-гидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилтриметиламмония фосфата (МФК); и указанный углеводный компонент окисляется инкубированием с буферным раствором, содержащим окисляющий агент, выбранный из группы, состоящей из перйодата натрия (ΝαΙΟ4), тетраацетата свинца (РЬ(ОАс)4) перрутената калия (ККпО4); причем оксимная связь образуется между окисленным углеводным компонентом и активной аминооксигруппой водорастворимого полимера.
Фигуры
На фиг. 1 показана первичная структура фактора коагуляции IX (8ЕО ГО N0: 1).
На фиг. 2 показано связывание окисленного τΡΙΧ с аминоокси-ПСК.
На фиг. 3 показан синтез водорастворимых диаминоксильных линкеров 3-оксапентан-1,5диоксиамина и 3,6,9-триоксаундекан-1,11-диоксиамина.
На фиг. 4 показано получение аминоокси-ПСК.
На фиг. 5 показано наглядное представление конъюгатов ПСК-ΡΙΧ, полученных в присутствии разных катализаторов методом ДСН-ПААГ-СЛЕКТРОФОРЕЗ: а) сравнение анилина с м-тодуидином при применении разных концентраций; Ь) сравнение анилина с о-аминобензойной кислотой, маминобензойной кислотой, п-аминобензойной кислотой, п-аминобензамидом и сульфаниловой кислотой;
с) сравнение анилина и м-толуидина с о-анизидином и м-анизидином.
На фиг. 6 показан процент полисиалирования с разными нуклеофильными катализаторами. Подробное описание сущности изобретения
Фармакологические и иммунологические свойства терапевтических белков можно улучшить химической модификацией и конъюгацией с полимерными соединениями, такими как полиэтиленгликоль (ПЭГ), разветленный ПЭГ, полисиаловая кислота (ПСК), гидроксиалкилкрахмал (ГАК), гидроксилэтилкрахмал (ГЭК), углевод, полисахариды, пуллулан, хитозан, гиалуроновая кислота, хондроитинсульфат, дерматансульфат, крахмал, декстран, карбоксиметилдекстран, полиалкиленоксид (ПАО), полиалкиленгликоль (ПАГ), полипропиленгликоль (ППГ), полиоксазолин, полиакрилоилморфолин, поливиниловый спирт (ПВС), поликарбоксилат, поливинилпирролидон, полифосфазен, полиоксазолин, сополимер полиэтилена-ангидрида малеиновой кислоты, сополимер полистирола-ангидрида малеиновой кислоты, поли(1-гидроксиметилэтилен-гидроксиметилформаль) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилтриметиламмония фосфат (МФК). Свойства получаемых конъюгатов обычно сильно зависимы от структуры и размера полимера. Поэтому полимеры с определенным и узким распределением размеров, как правило, предпочтительны в этой области. Синтетические полимеры, такие как ПЭГ, легко производятся с узким распределением размеров, тогда как ПСК можно очистить таким образом, что приводит к получению конечного препарата ПСК с узким распределением размеров. Кроме того, реагенты для ПЭГилирования с определенными полимерными цепями и узким распределением размеров представлены в продаже и коммерчески доступны по умеренным ценам.
Добавление растворимого полимера, например при полисиалировании, представляет собой один подход для улучшения свойств терапевтических белков, таких как белок коагуляции крови ΡΙΧ, а также других белков коагуляции (например, У\УР. РУПа (см., например, публикацию США 2008/0221032А1, включенную в данный документ посредством ссылки) и РУШ).
Терапевтические белки
В определенных вариантах реализации изобретения примерами вышеприведенных полипептидов и полинуклеотидов являются следующие терапевтические белки: ферменты, антигены, антитела, рецепторы, белки коагуляции крови, факторы роста, гормоны и лиганды. В определенных вариантах реализации изобретения терапевтический белок представляет собой белок коагуляции крови, такой как Фактор IX (ΡΙΧ), Фактор VIII (РУШ), Фактор У11а (РУПа), Фактор фон Виллебранда (У^Р), Фактор РУ (РУ), Фактор X (РХ), Фактор XI (РХО, Фактор XII (РХП), тромбин (РН), белок С, белок δ, 1РА, РАН, тканевый фактор (ТФ) или протеаза АЭАМТ8 13. В одном варианте реализации изобретения терапевтический белок в соответствии с изобретением является гликопротеином или, в разных вариантах реализации изобретения, белком, который не является природно гликозилированным ίη νινο (например, белком, который не содержит сайт природного гликозилирования или белком, который не гликозилирован в клеткехозяине перед проведением очистки).
В определенных вариантах реализации изобретения терапевтические белки представляют собой иммуноглобулины, цитокины, такие как: ИЛ-1 альфа, ИЛ-1 бета, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-11, колониестимулирующий фактор-1 (КСФ-1), М-КСФ, ФСК, ГМ-КСФ, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ), ЭПО, интерферон-альфа (ИФН-альфа), консенсусный интерферон, ИФНбета, ИФН-гамма, ИФН-омега, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-9, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-13, ИЛ-14, ИЛ-15, ИЛ-16, ИЛ-17, ИЛ-18, ИЛ-19, ИЛ-20, ИЛ-21, ИЛ-22, ИЛ-23, ИЛ-24, ИЛ-31, ИЛ-32 альфа, ИЛ-33, тромбопоэтин (ТПО),
- 9 028186 ангиопоэтины, например, Апд-1, Апд-2, Апд-4, Апд-Υ, ангиопоэтинподобные полипептиды человека АЫСРТЬ 1-7, витронектин, фактор роста эндотелия сосудов (ФРЭС), ангиогенин, активин А, активин В, активин С, костный морфогенетический белок-1, костный морфогенетический белок-2, костный морфогенетический белок-3, костный морфогенетический белок-4, костный морфогенетический белок-5, костный морфогенетический белок-6, костный морфогенетический белок-7, костный морфогенетический белок-8, костный морфогенетический белок-9, костный морфогенетический белок-10, костный морфогенетический белок-11, костный морфогенетический белок-12, костный морфогенетический белок-13, костный морфогенетический белок-14, костный морфогенетический белок-15, рецептор 1А костного морфогенетического белка, рецептор ΙΒ костного морфогенетического белка, рецептор II костного морфогенетического белка, нейротрофический фактор головного мозга, кардиотрофин-1, цилиарный нейротрофический фактор, рецептор цилиарного нейротрофического фактора, белок крипто, криптический белок, индуцированный цитокинами хемотаксический фактор 1 нейтрофилов, индуцированный цитокинами хемотаксический фактор 2α нейтрофилов, индуцированный цитокинами хемотаксический фактор 2β нейтрофилов, эндотелиальный клеточный фактор роста β, эндотелии 1, эпидермальный фактор роста, эпиген, эпирегулин, эпителиальный аттрактант нейтрофилов, фактор роста фибробластов 4, фактор роста фибробластов 5, фактор роста фибробластов 6, фактор роста фибробластов 7, фактор роста фибробластов 8, фактор роста фибробластов 8Ь, фактор роста фибробластов 8с, фактор роста фибробластов 9, фактор роста фибробластов 10, фактор роста фибробластов 11, фактор роста фибробластов 12, фактор роста фибробластов 13, фактор роста фибробластов 16, фактор роста фибробластов 17, фактор роста фибробластов 19, фактор роста фибробластов 20, фактор роста фибробластов 21, кислый фактор роста фибробластов, основный фактор роста фибробластов, рецептор α1 нейротрофического фактора глиальной клеточной линии, рецептор α2 нейротрофического фактора глиальной линии клеток, связанный с ростом белок, связанный с ростом белок α, связанный с ростом белок β, связанный с ростом белок γ, связывающий гепарин эпидермальный фактор роста, фактор роста гепатоцитов, рецептор фактора роста гепатоцитов, фактор роста гепатомы, инсулиноподобный фактор роста I, рецептор инсулиноподобного фактора роста, инсулиноподобный фактор роста II, связывающий белок инсулиноподобного фактора роста, фактор роста кератиноцитов, ингибирующий фактор лейкемии, рецептор α ингибирующего фактора лейкемии, фактор роста нервов, рецептор фактора роста нервов, нейропоэтин, нейротрофин-3, нейротрофин-4, онкостатин М (Θ8Μ), плацентарный фактор роста, плацентарный фактор роста 2, тромбоцитарный фактор роста эндотелиальных клеток, цепь А тромбоцитарного фактора роста, тромбоцитарный фактор роста АА, тромбоцитарный фактор роста АВ, цепь В тромбоцитарного фактора роста, тромбоцитарный фактор роста ВВ, рецептор α тромбоцитарного фактора роста, рецептор β тромбоцитарного фактора роста, стимулирующий фактор роста предшественников В-клеток, фактор стволовых клеток (ФСК), рецептор фактора стволовых клеток, ФНО, включая ФНО0, ФНО1, ФНО2, трансформирующий фактор роста α, трансформирующий фактор роста β, трансформирующий фактор роста β1, трансформирующий фактор роста β1.2, трансформирующий фактор роста β2, трансформирующий фактор роста β3, трансформирующий фактор роста β5, латентный трансформирующий фактор роста β1, связывающий белок I трансформирующего фактора роста β, связывающий белок II трансформирующего фактора роста β, связывающий белок III трансформирующего фактора роста β, тимусный стромальный лимфопоэтин (ТСЛП), рецептор I типа фактора некроза опухолей, рецептор II типа фактора некроза опухолей, рецептор активатора плазминогена урокиназного типа, фактор роста эндотелия сосудов и химерные белки и их биологически и иммунологически активные фрагменты.
В определенных вариантах реализации изобретения терапевтические белки представляют собой альфа-, бета- и гамма-интерфероны, колониестимулирующие факторы, включая колониестимулирующие факторы гранулоцитов, факторы роста фибробластов, тромбоцитарные факторы роста, активирующий фосфолипазу белок (РИР), инсулин, растительные белки, такие как лектины и рицины, факторы некроза опухолей и родственные им аллели, растворимые формы рецепторов факторов некроза опухолей, рецепторы интерлейкинов и растворимые формы рецепторов интерлейкинов, факторы роста, такие как тканевые факторы роста, такие как ТСРа или ΤΟΡβ и эпидермальные факторы роста, гормоны, соматомедины, гормоны пигментации, гипоталамические высвобождающие факторы, антидиуретические гормоны, пролактин, хорионический гонадотропин, фолликулостимулирующий гормон, тиреостимулирующий гормон, тканевый активатор плазминогена и иммуноглобулины, такие как ^С. ^Е. ^М, ^А и αгалактозидазу, β-галактозидазу, ДНКазу, фетуин, лютеинизирующий гормон, эстроген, кортикостероиды, инсулин, альбумин, липопротеины, фетопротеин, трансферрин, тромбопоэтин, урокиназу, ДНКазу, интегрины, тромбин, гематопоэтические факторы роста, лептин, гликозидазы, белок Хумира (адалимумаб), белок Пролиа (деносумаб), белок Энбрел (этанерсепт) и их фрагменты или любые гибридные белки, содержащие любые из вышеупомянутых белков или их фрагментов. В дополнение к вышеупомянутым белкам в следующей табл. 1 представлены терапевтические белки, предполагаемые в настоящем изобретении.
- 10 028186
Таблица 1
Пептид, секретируемый фолликулярными дендритными клетками Ангиотензинпревращающий фермент Представитель 6 семейства интерлейкина-1 Герстатин
Дермокин Антитромбин-1И Экспрессируемый простатой и яичками белок 2 Белок 28, содержащий богатые лейцином повторы
Секреторный белок 1, родственный белку Γπζζίβά Аполипопротеин В-100 Секреторная фосфолипаза А2 группы ХНА Белок с С-концом подобным ЬК1Ш4
Эктодисплазин-А Аполипопротеин ϋ Цепь коллагена альфа-З(У) Белок 2, содержащий домен Ьуб/РЬАЦК
Секреторный белок 2, родственный белку Γπζζίβά Аполипопротеин Е Белок 1, подобный альфа-2макроглобулину Трансмембранный белок 81
Резистин Бета-1,4-галактозилтрансфераза 1 Дерматопонтин Белок 3, подобный миелиновому белку гего
Остеопонтин Костный морфогенетический белок 7 Белок, ассоциированный с хрящевой тканью Гомолог белка пошт
Секреторный белок 5, родственный белку Γπζζίβά Субъединица В подкомпонента комплемента С 1ц Белок эфиопского ежа УДФ- глюкуронозилтрансфераза ЗА2
Секреторный белок 4, родственный белку ίϊίζζίβά Альфа цепь С4Ь-связывающего белка Белок 2 внеклеточного матрикса Протокадгерин альфа-1
Секреторный фосфопротеин 24 Калретикулин Желудочный мукопротеид Фосфолипаза 04
Глипикан-6 Связывающий кортикостероиды глобулин Интерлейкин-33 Ретинолдегидрогеназа 10
Секреторный белок 3, родственный белку Γπζζίβά Карбоксипептидаза А1 Костный морфогенетический белок 2 Связывающий сиаловую кислоту 1§-подобный лектин 14
Хемокин 4 с мотивом С-С Карбоксипептидаза А2 Костный морфогенетический белок 6 Трансмембранный белок 161А
Белок меланоцитов Рте! 17 Эотаксин Неохарактеризованный белок Трансмембранный белок
ΚΙΑΑ0564 161В
Секреторный белок 1, родственный Ьу-б/иРАК Хемокин 13 с мотивом С-С Белок СегЬегиз Трансмембранный белок 182
Бета-микросеминопротеин Хемокин 18 с мотивом С-С Углевод-сульфотрансфераза 8 Белок РАМ24В
Глипикан-4 Хемокин 20 с мотивом С-С Белок 3, подобный ассоциированному с контактином белку Трансмембранный белок 52
Представитель 15 суперсемейства лигандов фактора некроза опухолей Стимулирующий рецептор 2, экспрессируемый на миелоидных клетках Белок, подобный секреторной фосфолипазе А2 группы ХПВ Белок 4, содержащий домен суперсемейства мембранных переносчиков
Резистинподобный белок бета Хемокин 2 с мотивом С-С Кортиколиберин УДФ- глюкуронозилтрансфераза 2АЗ
Представитель 12 суперсемейства лигандов фактора некроза опухолей Белок 1£-ЬЗ, индуцируемый трансформирующим фактором роста бета Дезинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина 19 Ассоциированный с одонтогенными амелобластами белок
5РАК.С Лиганд СЦ40 Белок С19огП0 неохарактеризованного семейства белков ЦРРО556 Нейросекреторный белок УОР
Глипикан-5 Корнеодесмозин Хемокин 3 с мотивом С-Х-С Секретируемый фосфопротеин 2, 24 кДа
Гомолог антериального градиентного белка 2 Фактор комплемента ϋ Цистатин-М Белок РАМ 150В
Гомолог 2 белка покрова Хромогранин-А Дефензин-5 Фактор роста/дифференциации 9
Глипикан-1 Цепь альфа-1 (I) коллагена Дефензин-6 Белок 1, подобный кластерину
Белок 2, содержащий домен фактора фон Виллебранда А Белок 18, содержащий домены дезинтегрина и металлопротеиназы Дезинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина 18 Белок 2, содержащий домены трансмебранного белка и иммуноглобулина
Белок 1, индуцируемый механизмом Белок 1, содержащий домен ЬССЬ богатого цистеином секреторного Дезинтегрин и металлопротеиназа с мотивами Белок υΝς>5810/ΡΚΟ19627,
- 11 028186
передачи сигнала ΧΥΝΤΙ белка тромбоспондина 3 содержащий лектиновый домен С-типа
Хемокин 1 с мотивом С-С Цепь альфа-4 (IV) коллагена Белок 4, родственный белку БюккорГ Эпидидимальноспецифиче ский липокалин-10
Родственный 8РАКС модулярный кальцийсвязывающий белок 2 Белок, ассоциированный с дифференциацией кератиноцитов Дезинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина 5 Дезинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина 8
Представитель А семейства 11с лектиновым доменом С-типа Комплемент С4-В Белок 1, родственный эпендимину млекопитающих Эпидидимальноспецифиче ский липокалин-8
Секреторный белок 2, родственный Ьу-6/иРАК Цепь коллагена альфа-2(У) Фибриллин-3 Основный богатый пролином пептид Р-Е
Глипикан-3 Комплемент С5 Фетуин-В Предполагаемый ^охарактеризованный белок С 10ог£99
Секретируемый и трансмебранный белок 1 Цепь альфа-1 (VII) коллагена Фактор роста фибробластов 6 Неохарактеризованный белок С17огГ77
Экспрессируемый яичками белок с последовательностью 264 Компонент комплемента С7 Фактор роста кератиноцитов Белок 2, подобный арилацетамиддеацетилазе
Глипикан-2 Бета-цепь компонента комплемента С8 Фактор роста/дифференциации 8 Эпидидимальноспецифиче ский липокалин-12
Сериновая протеаза 23 Гамма-цепь компонента комплемента С8 Желудочный ингибирующий полипептид Антиген 2 В-меланомы
Рибосомный белок Ь55 субъединицы 395, митохондриальный Цепь альфа-1 (XV) коллагена Гликопротеиновый гормон бета-5 Антиген 3 В-меланомы
Гомолог ЗА белка Мр5пар Цепь альфа-1 (XVI) коллагена Гранзим М Гомолог 1 белка бычей семенной плазмы
Фибронектин Цепь альфа-1 (XVIII) коллагена Г астриносвобождающий пептид Белок 3, подобный комплементу С 1ц
Нейдезин Цепь альфа-1 (XIX) коллагена Сериновая протеаза ΗΤΚΑΙ Белок С2ог£69 семейства ЦРР0565
Рецептор 2 фактора роста фибробластов Белок олигомерного матрикса хряща Интерферон альфа-4 Белок С6огЛ20 семейства СРР0669
Карбоангидраза 6 С-реактивный белок Интерферон альфа-5 Белок С6огЯ27, подобный колипазе
Выделенный из злокачественных опухолей мозга белок 1 Колониестимулирующий фактор гранулоцитов Интерферон альфа-7 Неохарактеризованный белок С7огГ69
Родственный 5РАКС модулярный кальцийсвязывающий белок I Колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов Дезинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина 7 Белок, подобный рецептору тромбоцитарного фактора роста
Белок амилоида бета А4 Белок СУК61 Представитель 10 суперсемейства иммуноглобулинов Хондроадгеринподобный белок
Представитель 6 суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей Белок, подобный рецептору 1 компонентов комплемента Белок массой 21 кДа, содержащий протеазоассоциированный домен Предполагаемый неохарактеризованный белок 1Л4С)6490/РКО2В39
Субъединица 1 рецептора В-типа гамма-аминомасляной кислоты Фактор роста стволовых клеток. Лектин С-типа, секретируемый лимфоцитами Белок РАМ108А1, содержащий домен абгидролазы Предполагаемый неохарактеризованный белок 1Л4Ц6493/РКО21345
Про-нейрегулин-1, мембраносвязанная изоформа ЦМФ-]Ч-ацетилнейраминат-бета- галактозамид-альфа-2,3- сиалилтрансфераза Дезинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина 9 Предполагаемый неохарактеризованный белок υΝζ)5815/ΡΚΟ19632
Гликопротеиновый гормон альфа-2 Дипептилпептидаза 4 Рецептор интерлейкина-9 Цистатин-А
Белок 1, подобный мембранной металло-эндопептидазе Дентинный сиалофосфопротеин Интерлейкин-9 Ингибитор КЗНИМЬ пептидазы
Белок А, подобный рецептору Гс Эндотелии-1 Цепь В ингибина бета Ци статин-9
Белок, подобный хемокину 4 с мотивом С-С Эфрин-В! Ингибитор сериновой протеазы типа 2 Кага! Представитель 5 семейства с ΟΑΝ доменами
Рецептор 1, содержащий домен эпителиального дискоидина Белок, подобный эпидермальноспецифической сериновой протеазе КМБ-связывающий эндотелиальный регуляторный белок Белок 1, подобный связывающему инсулиноподобный
- 12 028186
фактор роста белку
Муцин-1 ΕΜΙΠΝ-1 Ассоциированный с кератиноцитами белок 2 Эпидидимальный белок 1 связывающий сперматозоиды
Фактор роста эндотелия сосудов А Эндоплазмин Субъединица альфа-1 ламинина Элафин
Фибулин-1 Рецептор 3 эфрина А-типа Хемотаксин-2 лейкоцитарных клеток Белок РАМ55А
Рецептор пролактина Рецептор 6 эфрина В-типа Желудочная триацилглицеринлипаза Фактор роста/дифференциации 6
Пропротеинконвертаза субтилизинаУклексина 6 типа Белок 1, содержащий домен гликозилтрансферазы 1 Белок 3, содержащий богатый лейцином повтор и гомологичный кальпонину домен Белок 1, содержащий домен глюкозо-фруктозооксидоредуктазы
Антиген СО209 Фактор коагуляции X Белок 2, родственный панкреатической липазе Эритропоэтин
Цепь коллагена альфа-2(Х1) Фактор коагуляции VIII Эпидидимоспецифическая альфа-маннозидаза Глютатионпероксидаза 6
Субъединица альфа рецептора колониестимулирующего фактора гранулоцитов-макрофагов Белок 7, родственный комплементу С1ц и фактору некроза опухолей Белок 7, содержащий домен фибронектина III типа Неохарактеризованный белок 11/РКО1026
Эластин Фибриллин-2 Ассоциированный с микрофибриллами белок 5 Бета-дефензин 128
Субъединица альфа рецептора интерлейкина-15 Альфа-2-Н5-гликопротеин Фактор, ингибирующий клетки Мюллера Интерлейкин-31
Мидкин Фактор роста фибробластов 10 Матриксная металлопротеиназа-21 Интерлейкин-34
Интегрин альфа-7 Цепь альфа фибриногена Матриксная металлопротеиназа-17 Белок 4, родственный калликреину плазмы
Муцин-4 Цепь бега фибриногена Матриксная мета л лопр отеи наза- 20 Эпидидимальноспецифиче ский липокалин-9
Пептидилглицин-альфа- Белок 1, ассоциированный с Субъединица гамма Ν- кДНК РЫ60957, в
амидирующая монооксигеназа карциномой эпителия длинного неба, легкого и носа ацетилглюкозамин-1- фосфотрансферазы значительной степени подобная секреторному белку 4, родственному белку Γήζζίβά
Аполипопротеин Α-Ι Гастрин Мультимерин-2 Представитель М липазы
Протеогликан 4 Цепь альфа гликопротеиновых гормонов Промотилин СЬЕСЗР12
Представитель 25 суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей Субъединицы альфаУбета Νацетилглюкозамин-1 фосфотрансферазы Белок 3 внеклеточного матрикса, родственный белку РКА51 Секреторная фосфолипаза А2 предполагаемой неактивной группы ПС
Аттрактин Гранзим А Белок Т4ЕЫЛ, связывающий протеинкиназу С Сериновая протеаза ΜΡΝ2
Микросеминопротеин, ассоциированный с простатой Белок, подобный фактору роста гепатоцитов Белок ХЕЬЬ2, связывающий протеинкиназу С Нетрин-5
Альфа-амилаза 1 Связывающий инсулиноподобный фактор роста белок 1 Нейротрипсин Белок 3, содержащий повтор ΝΗΕ
Нейротрофический фактор мозга Связывающий инсулиноподобный фактор роста белок 2 Нейросерпин Белок 2В, подобный олфактомедину
Представитель М семейства 4 с лектиновым доменом С-типа Связывающий инсулиноподобный фактор роста белок 4 Нидоген-2 Овохимаза-2
Рецептор колониестимулирующего фактора гранулоцитов Представитель 100 суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей Белок РАМ108В1, содержащий домен абгидролазы Предполагаемый неохарактеризованный белок 1Ж>3029/РКО9830
Инсулиноподобный фактор роста II Интерферон альфа-1/13 Нейротрофин-4 Овохимаза-1
Молекула 1 клеточной адгезии, родственная карциноэмбриональному антигену Белок 1, содержащий домен индуцированной интерферонами хеликазы С Эпидидимальная секреторная глютатионпероксидаза Предполагаемый бета-1гликопротеин 7, связанный с беременностью
Представитель А семейства 7 с лектиновым доменом С-типа Интерферон альфа-2 Секреторная фосфолипаза А2 группы 10 Гомолог 2 овостатина
СМКР35-подобная молекула 1 Интерферон бета Секреторная фосфолипаза А2 группы НО Орексигенный нейропептид ОКРР
- 13 028186
Белок 4, подобный холиновому транспортеру Интерферон гамма Лактопероксидаза Антиген 6К лимфоцитов
Белок А1, ассоциированный с легочным сурфактантом Инсулиноподобный фактор роста ΙΒ Эффектор апоптоза р53, родственный белку РМР-22 Экспрессируемый простатой и яичками белок 1
Сперминоксидаза Белок индийского ежа Плацентоспецифический белок 1 Белок 1, подобный предполагаемой фосфолипазе В
ЦМФ-Ы-ацетилнейраминат-бета1,4-галактоз ид-альфа-2,3сиал илтра н сф ераза Молекула адгезии нервных клеток Белок, подобный белку Ы Тубероинфудибулярный пептид из 39 остатков Предполагаемый неохарактеризованный белок РЫ42147
Калликреин-8 Интерлейкин-13 Проларган Отогелин
Активатор плазминогена тканевого типа Интерлейкин-2 Секретогранин-2 Рибонуклеаза 8
Пероксисомальная N(1)ацетилспермин/спермидин-оксидаза Представитель 2А семейства химотрипсинподобных эластаз Белок 1, содержащий домен эндонуклеазы Белок 2, подобный взаимодействующему с комплексом ядерной поры белку
Вероятная пальмитоилтрансфераза ΖϋΗΗ€4 Цепь А ингибина бета Семафорин-ЗВ Белок 1, подобный проактиваторному полипептиду
Белок-переносчик сложных эфиров холестерина Ингибитор панкреатического секреторного трипсина Соматостатин Гомолог 2 белка $р1П5Тег
Антиген гиСтОСОвместимОСти I класса НЬА, цепь А-2 альфа Представитель 21 суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей Белок 2, подобный представителю 4 семейства δϋΚ. дегидрогеназ/редуктаз Белок, подобный содержащему домен С фактора фон Виллебранда белку 2
Цепь альфа-1 (II) коллагена Тяжелая цепь Н1 интер-альфаингибитора трипсина Транскобаламин-1 У ротензин-2В
Про-интерлейкин-16 Тяжелая цепь Н2 интер-альфаингибитора трипсина Фактор «трилистника» 2 Тетраспанин-18
Рецептор лептина Тяжелая цепь НЗ интер-альфа- Тестикан-1 Мембранный белок
ингибитора трипсина ΡΑΜΙ 59А семейства иРР0514
Декорин Простатспецифический антиген Параоксоназа/лактоназа 3 Сыворотки Латерин
Фактор стромальных клеток 1 Калликреин-4 Толлоидоподобный белок 2 Белок 7В, подобный метилтрансферазе
Тенасцин Калликреин плазмы Трипсин-2 Белок ТЕХ261
Белок 12, содержащий домены дезинтегрина и металлопротеиназы Регулятор 4 активируемого кальцием хлоридного канала Белок 1, содержащий палец ΚΙΝΟ и домен 8ΡΚΥ Гомолог 7, репарирующего алкилированную ДНК белка а1кВ
Дезинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина 13 Белок 1, подобный бактерицидному/повышающему проницаемость белку Белок 1, содержащий кальцийсвязывающий и биспиральный домен Белок 6, содержащий домен трансмебранного белка етр24
Цепь альфа поверхностного гликопротеина СО8 Т-клеток Лептин Белок \Уп1-2 Белок 5, родственный белку ХК
Совместно амплифицируемый с ЕОРК и сверхэкспрессируемый белок Дезинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина 4 Эктонуклеозидтрифосфат дифосфогидролаза 8 Предполагаемый белок 7, содержащий ν-образный и иммуноглобулиновый домены
Связанный с аутофагией белок 16-1 Печеночная триацилглицеринлипаза Белок \νηί-8Β Представитель 3 семейства инсулиноподобных факторов роста
Белок 3 рака молочной железы с антиэстрогенной устойчивостью Белок Обе локуса комплекса антигена 6 лимфоцитов УДФ-ГлкИАц: бетаГал-бета1,3-Ν- ацетилглюкозаминилтрансфера за 4 Белок 1, подобный взаимодействующему с комплексом ядерной поры белку
Кадгерин-23 Эозинофильная лизофосфолипаза Белок 1, содержащий домен ΕΜΙ Секретируемый фосфопротеин 1
Колониестимулирующий фактор 1 макрофагов Субъединица бета лутропина Неохарактеризованный белок С6огГ15 Цепь альфа-5 (VI) коллагена
- 14 028186
Фолатный рецептор альфа Ассоциированный с микрофибриллами белок 1 Коллектин-10 Антиген 5 В-меланомы
Белок 8, родственный рецептору липопротеинов низкой ПЛОТНОСТИ Нейротропный фактор мезэнцефальных астроцитов Лигаза АС8ВС2 длинноцепочечных жирных кислот-КоА Белок 10А, содержащий основной домен четырех дисульфидных связей белка XV АР
Белок ΙΚ8ΑΜ1 убиквитинпротеинлигазы ЕЗ Матриксный белок О1а Белок индуцированного онкопротеином транскрипта 3 Белок С6огГ57 семейства иРР0369
Молекула адгезии нервных клеток 1 Коллагеназа IV типа массой 72 кДа Ингибитор 15 пептидазы Предполагаемый ^охарактеризованный белокС10ог131
Нейролигин-4, Х-связанный Стромелизин-1 Богатый пролином кислый белок 1 Предполагаемый неохарактеризованный белок С11огГ45
Нетрин-О1 Коллагеназа нейтрофилов Урокортин Неохарактеризованный белок С12ог128
Компонент РЮ-Т ГФИтрансамидазы Мезотелии Трипсин-ХЗ (ЕС 3.4.21.4) Неохарактеризованный белок С17огГ67
Лиганд Κίΐ Муцин-5АС ΗΗΙΡ-подобный белок 2 Бета-дефензин 121
Белок, подобный белку 8е1гиге 6 Муцин-6 Фракталкин Бета-дефензин 130
Представитель 7 семейства $ЬАМ Норрин Белок \\Ш-11 Белок 2, связывающий нуклеотидную триаду гистидина
Фактор некроза опухолей Окситоцин-нейрофизнн 1 Белок \Уп(-7а Апелин
Уромодулин Фактор роста бета-нервов Белок 1 с РСН и двойным 5НЗ доменами Плацентоспецифический белок 9
Представитель 13 суперсемейства лигандов фактора некроза опухолей Представитель 18 суперсемейства лигандов фактора некроза опухолей Белок 2, родственный фактору роста гепатомы Белок Τϋ26, ассоциированный с гепатоцеллюлярной карциномой
Белок СКЕС1 Нейротрофин-3 Субъединица альфа интерлейкина-12 Персефин
Белок 8, содержащий ЭФРподобный домен Субъединица А тромбоцитарного фактора роста Белок ΚΙΑΑ1324 семейства ΙΙΡΡ0577 Регулируемый эндокриноспецифический белок 18
Мультифункциональный белок 1, взаимодействующий с комплексом аминоацил-тРНК-синтетазы Фосфопантотеноилцистеиндекарбок силаза Белок 9, родственный комплементу С1ц и фактору некроза опухолей Белок 8, родственный комплементу С 1ц и фактору некроза опухолей
ΑϋΑΜΤδ-подобный белок 4 Ингибитор 1 активатора плазминогена Муцин-17 Костный морфогенетический белок 8А
Фактор коагуляции XI Ингибитор 2 активатора плазминогена Лизосомальный белок 14Си-О1 Белок ТОБС13
Субъединица альфа-2 рецептора интерлейкина-22 Энхансер 1 С-эндопептидазы проколлагена Субъединица альфа-3 пролил4-гидроксилазы Белок \¥ш-8а
Гомолог ауторегуляторного фактора 1 деформированного эпидермиса Белок 2, содержащий трансмебранный и убиквитинподобный домен Пептидил-пролил-цис-трансизомераза 8ОССАОЮ Белок ΕΝ8Ρ00000270642, содержащий 1§-подобный домен
Простагландин-Н2-О-изомераза Протеин-дисульфидизомераза Ингибитор 16 пептидазы Белок 15, содержащий домен абгидролазы
Альфа-1 -антитрипсин Фактор пигментного эпителия Белок 4, родственный рецептору полиовирусов Белок 9, подобный рибонуклеазе
Альфа-1 -антихимотрипсин Пепсин А Представитель 15 семейства 22 растворимых переносчиков Неохарактеризованный белок С2огГ66
Ацил-КоА-связывающий белок Гастриксин Г ФИ-инозит-деацил аза Неохарактеризованный белок С17огЙ9
Фактор комплемента В Белок ежа δοηΐΰ Трансмембранный белок 43 Белок РАМ 150А
Субъединица бета хориогонадотропина Белок 1-альфа распознавания пептидогликана Белок 2, родственный ангиопоэтину Белок, подобный плацентоспецифическому белку 1
Ядерный белок версикан Бигликан Белок 6, родственный ангиопоэтину Неохарактеризованный белок С18ог120
Рецептор эпидермального фактора роста Индуцируемый пролактином белок Арилсульфатаза К Бета-дефензин 110
- 15 028186
Экто-Ν ОХ-дисульфидтиол антипортер 2 Тромбоцитарный фактор 4 Аугурин Нейритинподобный белок
Г налу ронидаза-1 Плазминоген Сериновая протеаза 4, специфическая для мозга Богатый гистидином на карбоксильном конце белок 1
Белок-антагонист рецептора интерлейкина-1 Параоксоназа/арилэстераза 1 сыворотки Белок 1 монооксигеназы, подобной ДБГ Представитель А семейства 2 с лектиновым доменом С-типа
Субъединица бета рецептора интерлейкина-6 Щелочная фосфатаза, плацентарный тип Неохарактеризованный белок С1ог£56 Белок 70, содержащий повторы богатые лейцином
Белок 1, подобный рецептору интерлейкина-1 Пептидил-пролил-цис-трансизомераза В Церебеллин-3 Серпин А13
Инсулин Протеогликан костного мозга Церебеллин-4 Белок 17, содержащий домен ΒΤΒ/ΡΟΖ
Гликоделин Основный богатый пролином белок 1 слюны Белок С6огГ126, подобный колипазе Неохарактеризованный белок С12ог£53
Белок, родственный паратироидному гормону Белок С, ассоциированный с легочным сурфактантом Неохарактеризованный белок С11ог£83 Представитель А семейства 9 с лектиновым доменом С-типа
Нурим Паратироидный гормон Неохарактеризованный белок С16ог£89 Белок 4, подобный комплементу С Ιη
Субъединица альфа-2 пролил-4гидроксилазы Компонент амилоида Р сыворотки Белок Х2, подобный карбоксипептидазе Молекула 4, подобная белку СМКР35
Антиген СО276 Секретогранин-1 Белок, подобный цистатину-9 Белок РАМ 151В
Белок 1 с богатым цистеином ЭФРподобным доменом Ядерный белок гепарансульфатпротеогликана, связанный с базальной мембраной Представитель 13 семейства δϋΚ. дегидрогеназ/редуктаз Белок РАМ108А2/АЗ, содержащий домен абгидролазы
Белок 1, содержащий домен СЦВ и ί-ιΐδΕι Антилейкопротеиназа Бета-дефензин 123 Остеокрин
Фиколин-2 Стабилин-1 Бета-дефензин 132 Трансмебранная протеаза, сериновая 11Е2
Белок 5, подобный Рс-рецептору Внеклеточная супероксиддисмутаза [Си-Ζη] Белок 1, подобный цитокину Трансмембранный белок 14Е
Белок ОРК89 Соматотропин Белок 2, родственный белку ИкккорГ Трансмембранный белок 207
Молекула А соединительной адгезии Серпин В5 Белок 1, подобный белку ОгсккорГ Белок 1, подобный белку ТОММ20
Белок 8А, содержащий богатые лейцином повторы Спондин-1 Эпидидимальный секреторный белок ЕЗ-бета Неохарактеризованный белок СЗогГ41
Множественная инозитполифосфатфосфатаза 1 Белок 3 структурной поддержки хромосом Белок 3, содержащий ЭФРподобный повтор и дискоидинΙ-подобный домен Белок ЗА подчелюстной железы, регулируемый андрогенами
Нейропилин-1 Синтаксин-1 А Белок РАМ55О Антиген 1 В-меланомы
Плексин-А4 Тетранектин Фактор роста фибробластов 17 Неактивная карбоксилэстераза 4
Плексин-В1 Трансформирующий фактор роста бета-1 Фактор роста фибробластов 22 Белок 1 четверного боксового соединения
Периостин Т ироглобулин Белок 2, связывающий фактор роста фибробластов Белок Η5Ν2
Белок К1С-3 Ингибитор 1 металлопротеиназы Фактор роста/дифференциации 3 Хуманин
Белок 2, подобный белкам БЫТ и ΝΤΒΚ Ингибитор 2 металлопротеиназы СЫРК.1-подобный белок 1 Белок, подобный киелину/хордину
Модифицирующий сульфатазу фактор 1 Ингибитор 3 металлопротеиназы Ингибитор сериновой протеазы типа 6 Кага1 Белок С6ог£186 семейства и?Р0624
Модифицирующий сульфатазу фактор 2 Активатор плазминогена урокиназного типа Интерлейкин-17В Белок 4/6, подобный пред полагае мому нейрофибромину 1
Трансмебранная протеаза, сериновая 6 Лактотрансферрин Интер ле й кин-17С Белок, подобный пероксидазину
Лимфотоксин-альфа Трипсин-1 Интерлейкин-17И 5СО-СПОНДИН
Представитель 10В суперсемейства рецепторов фактора некроза Белок ЗВ подчелюстной железы, регулируемый андрогенами Белок 3 связи гиалуронана и Предполагаемый неохарактеризованный
- 16 028186
опухолей протеогликана белок υΝ(39165/ΡΚΟ28ό30
Поверхностный рецептор активатора плазминогена урокиназного типа Представитель 1А суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей Гомолог белка 1 внешнего слоя вителлиновой мембраны Представитель 3 семейства активируемых кальцием регуляторов хлоридного канала
Ингибитор 1 активации Т-клеток, содержащий ν-образный домен Рецептор 1 фактора роста эндотелия сосудов Субъединица бета хориогонадотропина, вариант 1 Вероятная сериновая протеаза ЕЖр9391/РКО34284
Глюкагон Белок, связывающий витамин ϋ Белок 1, подобный лизоциму Неохарактеризованный белок С4огЕ26
Ν-ацетилмурамоил-Ь- аланинамидаза Витронектин Матриксная металлопротеиназа-28 Неохарактеризованный белок С4огГ40
Сульфгидрилоксидаза 1 Фактор фон Виллебранда Нефронектин Неохарактеризованный белок С5огГ55
Представитель 4 семейства δϋΚ дегидрогеназ/редуктаз Белок О5с локуса комплекса антигена б лимфоцитов Белок 12, содержащий основной домен четырех дисульфидных связей белка ААР Предполагаемый стимулирующий макрофаги белок М8ТР9
Белок, связывающий интерлейкин18 Цинк-альфа-2-гликопротеин Белок 1, подобный олфактомедину Неохарактеризованный белок С15огГб1
Родственный белку подобному ЕККЕ белок 2 Неохарактеризованный белок С14огЕ93 Белок 2А, подобный олфактомедину Химотрипсиноген В2
Миелоид-ассоциированный маркер дифференциации Ретиношизин Сериновая протеаза 27 Бета-дефензин 108А
Хордин Альфа-1.3-маннозилтрансфераза АЬС2 Представитель 2 семейства ЗА секретоглобинов Бета-дефензин 111
1 -ацил-5п- гл ицерин-3фосфатацилтрансфераза гамма Изоформа СКА_Ь представителя А семейства 11с лектиновым доменом С-типа Дезинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина 2 Предполагаемый белок 6, содержащий У-образный и иммуноглобулиновый домены
Рецептор конечного про ду ктс п ециф и чес кого Белок 7, содержащий домен суперсемейства мембранных Белок 28, содержащий домены дезинтегрина и Белок 3, подобный ингибитору
дальнейшего гликозилирования посредников металлопротеиназы сериновой протеазы типа 5 Кага1
Белок 4, содержащий домен САКЛ семейства ΝίΚ Трансмебранный нейрональный белок 1 с повтором богатым лейцином Белок 2, подобный бактерицидному/повышающем у проницаемость белку Предполагаемый белок 2, подобный ингибитору сериновой протеазы типа 5 Кага1
Про-нейрегулин-2, мембраносвязанная изоформа Субъединица 11 субкомплекса НАДН-дегидрогеназы [убихинон] 1 бета, митохондриальной Фосфодиэстераза ЗЬ, подобная кислой сфингомиелиназе Представитель 7С семейства 8ЛК дегидрогеназ/редуктаз
Ассоциированный со сперматозоидами антиген 11А Мембранный белок С1 ог£91 семейства Е1РР0546 Ингибитор сериновой протеазы типа 7 Кага1 Бета-дефензин 131
Гомолог белка 1, секретируемого ооцитами Белок 10, родственный карбоангидразе Нейрексофилин-4 Бета-дефензин 134
Альбумин сыворотки Холецистокинин Белок \Уп1-9Ь Бета-дефензин 136
Кохлин Коданин-1 Гомолог В белка 16 гранул зимогена Бета-дефензин 116
Ингибитор протеазы С1 плазмы Неохарактеризованный белок С6огГ89 Семафорин-ЗЛ Белок РАМ132А
Субъединица альфа рецептора интерлейкина-7 Хондроитинсульфатглюкуронил- трансфераза Аполипопротеин Ь4 Белок РАМ 132В
Тяжелая цепь Н5 интер-альфаингибитора трипсина Белок 1, содержащий домен хитиназы Трансмебранная протеаза, сериновая 11Л Бета-дефензин 115
Тромбоцитарный фактор роста Л Трансмембранный белок С9огР Белок 1, отвечающий за заболевание Скрейпи Бета-дефензин 114
Белок 8100-А7 Молекула 9, подобная белку СМКР35 Белок, подобный предполагаемому аннексину А2 Ингибитор сериновой протеазы типа 9 Кага1
Связывающий сиаловую кислоту 1§подобный лектин 10 Цитохром Р450 281 Костный морфогенетический белок 10 Представитель N липазы
Белок, подобный антигену тубулоинтерстициального нефрита Гомолог 3 белка СгитЬз Секретогранин-3 Белок 3, родственный панкреатической липазе
Представитель 13В суперсемейства Представитель 7 семейства 8ЛК Белок 4, родственный Белок, экспрессируемый
- 17 028186
лигандов фактора некроза опухолей дегидрогеназ/редуктаз комплементу С1 ς и фактору некроза опухолей яичками, простатой и плацентой
Лигаза 5 длинноцепочечных жирных кислот-КоА Белок ΕΝΕΟ ^охарактеризованный белок С1огГ54 Нейромедин-5
Клаудин-14 Белок 4, родственный фактору Н комплемента Карбоксипептидаза Аб Нейропептид δ
Белок 20, содержащий богатые лейцином повторы Представитель 3 семейства ЬО1 с богатым лейцином повтором Хемокин 19 с мотивом С-С Белок С16ог138, подобный нейрональному пентраксину
Представитель 7 семейства интерлейкина-1 Глиомедин Хемокин 25 с мотивом С-С Отолин-1
Белок О5Ь локуса комплекса антигена 6 лимфоцитов Белок 5, содержащий домен глицерофосфодиэфирфосфодиэстер азы Представитель 2В семейства химотрипсинподобных эластаз Белок, подобный фосфотазе железо/цинк пурпуровой кислоты
Ацетилхолинэстераза Рецептор 113 вероятно связывающий О-белок Белок СЕ1 Гомолог 1 овостатина
Амелогенин, изоформа X Рецептор 114 вероятно связывающий О-белок ^охарактеризованный белок С6ог£1 Белок А, родственный плазминогену
Ангиогенин Глицерин-З-фосфатацилтрансфераза 4 ^охарактеризованный белок С7ог£34 Полисераза-3
Рецептор 2 сибиреязвенного токсина Гремлин-1 Ассоциированный с кератиноцитами белок 3 Предполагаемый пептид ΥΥ-2
Аннексии А2 Представитель 17 подсемейства К калиевого канала ^охарактеризованный белок С9ог£47 Предполагаемый пептид ΥΥ-3
Аполипопротеин С-Ш Белок 2, содержащий мотив КОЕЬ Цепь альфа-1 (VIII) коллагена Белок 10, подобный рибонуклеазе
Аполипопротеин Ы Лайилин ^охарактеризованный белок С18огГ54 Белок 12, подобный рибонуклеазе
Субъединица А подкомпонента комплемента С1 я Белок 8В, содержащий богатый лейцином повтор Цистатинподобный белок 1 Белок 13, подобный рибонуклеазе
Субъединица С подкомпонента комплемента С1 и Белок 80, содержащий богатый лейцином повтор Белок 2, содержащий домен С2 Серпин А11
Кальцитонин Связывающий сиаловую кислоту 15подобный лектин 6 Белок 1, содержащий домен ϋϋΚΟΚ Ингибитор 4 протеазы типа Κιιηίΐζ
Растворимая активируемая кальцием нуклеотидаза 1 Бета-1-гликопротеин 2, специфический для беременности Белок РАМ55С Метеоринподобный белок
Хемокин 15 с мотивом С-С Белок 1, содержащий домен Еуб/рьлик Цепьальфа-1 (XXVI) коллагена Предполагаемая сериновая протеаза 2 яичек
Антиген СО97 Белок 5, содержащий домен ьуб/РЬАик Белок РАМ19А2 Бета-дефензин 112
Контактин-4 Гомолог Ν-концевого домена ΜΕΝ64 Белок РАМ5В ^охарактеризованный белок ПЛЗ 7543
Комплемент С2 Фактор, ингибирующий миграцию макрофагов Фактор роста фибробластов 5 Белок РАМ24А
Цепь коллагена альфа-6(1У) 2-ацилглицерин-О-ацилтрансфераза 3 Вероятная сериновая протеаза НТК.АЗ Секреторный белок 4, родственный белку ίτΐζζίεύ
Цепь коллагена альфа-2(У1) Гомолог 1 митохондриального переносчика Представитель 8 семейства интерлейкина-1 Белок 2, подобный комплементу С1ц
Цепь альфа-1 коллагена (XI) Аполипопротеин Ь6 Ингибитор сериновой протеазы типа 4 Кага1 Предполагаемый ^охарактеризованный белок С17огГ69
Гомолог 1 белка СгшпЬз Протокадгерин альфа-6 Отоспиралин Предполагаемый цистатин-13
Цистатин-С Протокадгерин гамма-А12 Антимикробный пептид 2, экспрессируемый печенью Бета-дефензин 109
Дефензин 1 нейтрофилов Потенциалозависимый водородный канал 1 Гомолог 1 лизилоксидазы Бета-дефензин 113
Эндотелин-3 Универсальная транс-ретинол-13.14редуктаза Гомолог 2 лизилоксидазы Бета-дефензин 135
Рс-рецептор иммуноглобулина эпсилон низкой аффинности Белок 2 регулятор динамики микротрубочек Белок 4, ассоциированный с карциномой эпителия длинного неба, легкого и носа Белок БОС 136242, содержащий домен пептидазы 81
Рецептор 3 фактора роста фибробластов К-спондин-4 Белок 2, подобный лизоциму 5 Фактор роста/дифференциации 7
- 18 028186
Рецептор 4 фактора роста фибробластов Белок 3 транспорта длинноцепочечных жирных кислот Эндомуцин Гомолог ΙύΑиндуцируемого белка
Белок 6, связанный с остановкой пролиферации Белок 5ЕС22с миграции везикул Нейропептид В Предполагаемый белок 1, подобный липокалину 1
Рецептор гормона роста Клаудин-1 Кинезинподобный белок ΚΙΡ7 Предполагаемая сериновая протеаза 29
Бифункциональная УДФ-Ν- ацетилглюкозамин-2-эпимераза/Ы- ацетилманнозаминкиназа Белок 3, содержащий богатый лейциновыми повторами и иммуноглобулинподобный домены Иммуноглобулинподобный рецептор 2, ассоциированный с лейкоцитами Белок ЬОС619207, содержащий домен предполагаемого богатого цистеином фагоцитарного рецептора
Представитель δ суперсемейства иммуноглобулинов Представитель 9 семейства 8ЬАМ Кальцийзависимая фосфолипаза А2 Белок, подобный секретоглобину
Цепь альфа рецептора интерлейкина-4 Транстиретин Адапторный белок проапоптозной каспазы Предполагаемый стереоцилинподобный белок
Калликреин-14 Серин/треонин-протеинкиназа 32В Белок 1, подобный интегринубета Представитель 2 семейства инсулиноподобных факторов роста
Калликреин-6 Субъединица В тромбоцитарного фактора роста Толлоидоподобный белок 1 КЖ2ОЬ4
Субъединица бета-3 ламинина Ноггин Ингибитор 3 протеазы типа Κιιηΐΐζ Предполагаемый белок 1, подобный цинк-альфа-2гликопротеину
Лейцил-цистиниламинопептидаза Триптаза альфа-1 Белок ТМЕМ155 Представитель 4 семейства инсулиноподобных факторов роста
Лектин-сериновая протеаза 1, связывающая маннан Белок 14 с тетратрикопептидным повтором Просалузин Неохарактеризованный белок С2огГ72
Лектин-сериновая протеаза 2, Белок трансактивированного ХТРЗ Белок атп1оп1езз Белок, подобный белку
связывающая маннан гена В инициирующему репликацию
Липокалин нейтрофилов, ассоциированный с гелатиназой Пальмитоилтрансфераза ΖϋΗΗ015 Белок 10В Экспрессируемый простатой и яичками белок 3
Нейропептид Υ Связывающий сперматозоиды белок 3 блестящей оболочки яйцеклетки Белок 8, содержащий основной домен четырех дисульфидных связей белка XVАР Антиген 4 В-меланомы
Ядерный белок агтрекан Белок 39, содержащий повторы богатые лейцином Белок \¥п!-5Ь Предполагаемый неохарактеризованный белок С1огП91
Белок В, ассоциированный с легочным сурфактантом Панкреатическая триацилглицеринлипаза Белок Х¥п1-7Ъ Белок, подобный бетадефензину 108В
Белок 1, родственный рецептору полиовирусов Трансмембранный белок 139 Белок 2 связывающий блестящую оболочку яйцеклетки Неохарактеризованный белок ГЫ90687
Ренин Фактор, ингибирующий лейкемию Белок, подобный связывающему домен 5НЗ белку 5 Секреторный белок 2, родственный белку Γπζζίβά
Панкреатическая рибонуклеаза Галектин-1 Молекула адгезии адипоцитов Основный богатый пролином пептид ГВ-1
Семеногелин-1 Хемокин 21с мотивом С-С Неохарактеризованный белок С12огГ59 Фактор роста фибробластов 16
Молекула передачи сигнала активации лимфоцитов Белок, подобный антигену СЭ5 Белок, связывающий аполипопротеин Α-Ι Ингибитор сериновой протеазы типа 8 Кага1
Ингибитор механизма действия тканевого фактора Углевод-сульфотрансфераза 9 Клаудин-17 Неохарактеризованный белок ΚΙΑΑ0495
Ушерин Белок, связывающий липополисахариды Неактивная каспаза-12 Белок 2, подобный основному белку тромбоцитов
Фактор роста фибробластов 23 Богатый цистеином белок двигательного нейрона 1 Неохарактеризованный белок С7огГ58 Серпин ЕЗ
- 19 028186
Субъединица альфа интерлейкина23 Фактор роста соединительной ткани Цепь альфа-1 (XXVIII) коллагена Рецептор СК1
Эпидидимальный секреторный белок Е1 Гомолог белка закрывания глаз Белок 4 дентинового матрикса Секретируемый фосфопротеин 1
АРАМТ5-подобный белок 1 Муцинподобный белок 1 Неохарактеризованный белок С16ог£48 Индуцируемый стрессом секретируемый белок 1
Хемокинподобный фактор Фактор роста фибробластов 19 Карбоксилэстераза 3 Белок \Ущ
Белок 7, содержащий ЭФРподобный домен Белок 3, родственный фоллистатину Белок РАМ20В Белок \¥ηΐ (Фрагмент)
Тектоник-1 Белок, взаимодействующий с белком ежа ГТФаза 3 с петлей ΟΡΝ Предполагаемая сериновая протеаза ЬОС138652
Трансмембранный белок 25 Рецептор В интерлейкина-17 Белок 1В, содержащий домен ОКАМ Белок ТОМ1
УДФ-Гал1ЧАц:бета-1,3-Мацетилгалактозаминилтрансфераза 1 Регулятор ионного транспорта 5, содержащий домен ΡΧΥΕ) Белок биосинтеза фосфотидидинозитгликанового якоря класса и Предполагаемый неохарактеризованный белок РЫ46089
Интерлейкин-15 (ИЛ-15) Эндотелиальная липаза Субъединица альфа интерлейкина-27 Предполагаемый неохарактеризованный белок С1огП34
Белок 11, подобный множественным доменам эпидермального фактора роста Белок 2 внеклеточного матрикса, подобный ЭФР-содержащему фибулину Про-нейрегулин-4, мембраносвязанная изоформа УДФ-Глк1ЧАц:бетаГал- бета-1,3-Ы- ацетилглюкозаминилтранс фераза 9
Белок, подобный муцину и кадгерину Отораплин Нейрональный белок 3 с повтором богатым лейцином Неохарактеризованный белок С11 ог£44
Рибонуклеаза 4 Секреторная фосфолипаза А2 группы 3 Белок 2, регулируемый рецептором ΝΜΠΑ Неохарактеризованный белок С12огГ73
Белок ЗС, содержащий домен 5Н2 Фосфолипаза А2 группы XV НАДН-цитохром-Ь5-редуктаза 1 Предполагаемый подобный цистатину-9 белок 2
ЦМФ-1\(-ацетилнейраминат-бета- галактозамид-альфа-2.3- Представитель 14 суперсемейства лигандов фактора некроза опухолей Белок 1, содержащий домен 7 болезни Паркинсона Белок РАМ108А5, содержащий
сиалилтрансфераза предполагаемый домен абгидролазы
Трансмебранный белок 9 Плексин-А2 Белок 11, связывающий белок РК506 Бета-дефензин 133
Белок 2, содержащий основной домен четырех дисульфидных связей белка XVАР Папилин Представитель В семейства 12 с пектиновым доменом С-типа Фиброзин-1
Рецептор аденозина АЗ Проки нетицин-1 Представитель Р5 семейства 35 растворимых переносчиков Вероятный фолатный рецептор дельта
Субъединица АРН-1А гаммасекретазы Рибонуклеаза 7 Связывающий сиаловую кислоту подобный 1е лектин 12 КРЕ-спондилин
Базигин Ингибитор 1 протеазы типа Κτιηίΐζ Белок РАМ19АЗ Белок ΕΝ5Ρ00000346774, подобный белку ΝΡΙΡ
Белок 7, содержащий повтор бакуловирусов ΙΑΡ Спондин-2 Белок 82, содержащий повтор χνυ Предполагаемый прионный белок, специфический для яичек
Калуменин Тестикан-2 Белок 1, связывающий энхансер адипоцитов Богатый пролином белок 1
Альфа-51-казеин Неактивная сериновая протеаза РАМК1 Белок 3. подобный АЛАМТ5 Предполагаемый неохарактеризованный белок РР248
Циклин-Ы Торсин-2А Белок 80, содержащий биспиральный домен Белок С8ог£55 семейства ИРР0670
Фактор комплемента Н Вазогибин-1 Экто-ЬГОХ-дисульфидтиол антипортер 1 Предполагаемый белок 2, подобный цинк-альфа-2гликопротеину
Хорионический гормон соматомаммотропина Вазорин Нейрональный регулятор роста 1 Белок 8РАКС
Рецептор коксакивирусов и аденовирусов Ксилозилтрансфераза 1 Протеогликан 1 интерфоторецепторного матрикса Отопетрин-1
Представитель 2 семейства Представитель 6 семейства кДНК РЫ36603 ίΐδ, клон кДНК РЫ55667, в
- 20 028186
эктонуклеотидпирофосфатаз/фосфо диэстераз эктонуклеотидпирофосфатаз/фосфо диэстераз ТКАСН2015180, в значительной степени подобная секреторному белку 2, родственному белку ίπζζίεύ значительной степени подобная кислому и богатому цистеином секреторному белку
Белок альфа, подобный белку ЕК.О1 Онкостатин-М Представитель Н липазы Представитель К липазы
Фактор коагуляции IX Дерлин-1 Муцин-19 (МиС-19) Представитель С семейства 18 с лектиновым доменом С- типа
Рецептор ΙΗ-В Рс-участка иммуноглобулина гамма с низкой аффинностью Наследуемый полипротеин Εην провируса НЕКУ-РКО_6р24.1 Белок гена-кандидата 2 чувствительности к псориазу 1 типа Предполагаемый неох арактеризова и н ый белок 1ЛЧ06125/РК020090
Фиколин-3 Простазин Интегральный мембранный белок 2А Комплемент СЗ
Белок 2, подобный Рс-рецептору Трансмебранная протеаза, сериновая НЕ Белок 8РТ2В транспорта везикул Цепь коллагена альфа2(1У)
Трансмембранный белок РЬКТЗ с повтором богатым лейцином Антиген гистосовместимости РИА I класса, цепь альфа Ον-16 Белок ЗА, содержащий домен фактора фон Виллебранда А Неохарактеризованный белок ЬЛЧЦ6126/РКО2СЮ91
Г ельсолнн Ингибирующий λ¥πί фактор 1 Гомолог белка 5Ыза-2 Серпиноподобный белок НМ50
Гранулизин Натрийуретический пептид С-типа Субъединица 3 комплекса сигнальной пептидазы Экспрессируемый простатой и яичками белок 4
Трансмебранный гликопротеин ΝΜΒ Ангиопоэтин-2 Белок СЭ164, подобный сиаломуцину 2 Цепь альфа-1 (XXII) коллагена
Гранулины Дезоксирибонуклеаза гамма Кад герин-16 Пр ед полагае мы й неохарактеризованный белок С13ог128
Гепараназа Карбоксипептидаза А5 К ад герин-19 Цистатин-8
Участок цепи С 1д мю Хемокин 14 с мотивом С-С Церебеллин-2 К-спондин-1
Интерлейкин-1 альфа Интерлейкин-5 Трансмембранный белок С8огГ2
СЗогП
Рецептор А интерлейкина-31 Интерлейкин-10 Белок 1 экваториального сегмента сперматозоида Связывающий одоранты белок 2а
Молекула В соединительной адгезии Хемокин 2 с мотивом С-Х-С Неохарактеризованный белок С6ог172 Опиорфин
Липокалин-1 Хемокин 5 с мотивом С-Х-С Неохарактеризованный белок С11ог124 Белок, регулируемый андрогенами почек
Рецептор 6, связанный с содержащим повторы богатые лейцином О-белком Дезинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина 6 Представитель 2 семейства ацил-КоА-синтетаз, митохондриальный Предполагаемый неохарактеризованный белок Ш<25 8 ЗО/РКО19650/РКО1 9816
Белок 1, связывающий латентный трансформирующий фактор роста бета Полипептид Ν- ацетидгалактозаминилтрансферазы Белок 8ЬС35А5, вероятный транспортер УДФ-сахаров Предполагаемый неохарактеризованный белок υΝ96975ΖΡΕΟ21958
Матрилин-3 Фибулин-2 Представитель А семейства 1 с лектиновым доменом С-типа Тахикинин-3
Белок 1, подобный миелиновому белку гего Фиколин-1 Представитель А семейства 3 с лектиновым доменом С-типа Секретируемый фосфопротеин 1
Белок 2, подобный нейробеахину Цитокин 8Ь Представитель Е семейства 4 с лектиновым доменом С-типа Склеростин
Никастрин Фолли статин Представитель О семейства 4 с лектиновым доменом С-типа Белок 2, подобный ΑϋΑΜΤδ
АДФ-рибозопирофосфатаза, митохондриальная Белок 1 внеклеточного матрикса, родственный белку РКА81 Вероятная катионтранспортирующая АТФаза 13А4 Белок ШС284297, содержащий домен богатого цистеином фагоцитарного рецептора
Протокадгерин-15 Энамелин Белок С15ог£24 семейства иРР0480 Триптаза бета-1
Плацентарный фактор роста Белок 1 связи гиалуронана и протеогликана Связывающий сперматозоиды белок 4 блестящей оболочки яйцеклетки Триптаза дельта
- 21 028186
Белок О-связанной-маннозы-бета- 1.2-Ν- ацетилглюкозаминилтрансферазы 1 Представитель 3 подсемейства А рецепторов, подобных иммуноглобулину лейкоцитов Резидентный белок ЕКр27 эндоплазматического ретикулума Предполагаемый критический участок белка 9 синдрома кошачьего глаза
Вероятная гидролаза ΡΝΚϋ Интерлейкин-17Р Трансмембранный белок С1богГ54 Белок 1, содержащий домен плексина
Плейотрофин Акцессорный белок рецептора интерлейкина-1 Цитохром Р450 4Р12 Г омолог МС51Ь-53Е-54Е (Фрагмент)
Рецептор полиовируса Ингибитор сериновой протеазы типа 5 Кага1 Цитохром Р450 4X1 СОВАУ-подобный плацентарный белок (Фрагмент)
Рецептор ретикулона-4 Калликреин-15 Цитохром Р450 4Ζ1 Фактор 2, подобный рецептору цитокинов
Белок амилоида А сыворотки Интерферон альфа-14 Белок СКЕС2 Бета-дефензин 103
Глобулин, связывающий половые гормоны Бета-1-гликопротеин 4, специфический для беременности Представитель 9 подсемейства В гомологов Опа1 Бета-дефензин 106
Представитель 6 семейства 8ЬАМ Коллагеназа 3 Дипептидаза 3 Г иалуронидаза-3
Белок, ассоциированный с мембраной сарколеммы Матриксная металлопротеиназа-16 Мембранный белок РАМ174А Цепь альфа рецептора интерлейкина-28
Белок 1, содержащий домен ы&йи, фактора фон Виллебранда А, ЭФР и пентраксина Полипептид, активирующий аденилатциклазу гипофиза Белок 15, содержащий домен тиоредоксина Белок, содержащий домен гликозилтрансферазы 54
Связывающий тироксин глобулин Прокинетицин-2 Белок РАМ19А4 Хординподобный белок 1
Белок 1, содержащий трансмембранный и биспиральный домен Белок 3, связывающий латентный трансформирующий фактор роста бета Аденозинмонофосфатпротеинтрансфераза Р1СБ Предполагаемый ^охарактеризованный белок 1Ж>9370/РКО34162
Трансмебранная протеаза, сериновая 3 Соматолиберин Белок, подобный пренилцистеиноксидазе Рецептор нетринаЕПЧС5В
Представитель ЮС суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей Белок 1, содержащий домен тромбоспондина типа 1 Белок, подобный взаимодействующему с фитаноил-КоА-гидроксилазой белку Рецептор РОРК-1 фактора роста фибробластов, секретируемая форма белка (Фрагмент)
Представитель 11В суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей Ангиогенный фактор 1 с О-вставкой и доменами РИА Регулятор ионного транспорта 4, содержащий домен ΡΧΥΏ ^охарактеризованный белок ΕΝ8Ρ00000244321
Серотрансферрин Рецептор III типа ТОР-бета Фактор роста/дифференциации 11 ЕСЕ2
Триптаза бета-2 Субъединица бета тиротропина Нейротропный фактор церебрального дофамина ЕРА6
Белок ΥΙΡΡ5 ^охарактеризованный белок С19ог£36 ГТФаза 2 с петлей ΟΡΝ Предполагаемый рецептор 1 растворимого интерлейкина 18
Белок В/С, ассоциированный со связанным с везикулами мембранным белком Белок 2, родственный комплементу СЦ и фактору некроза опухолей Трансмебранный белок, индуцируемый гормоном роста Белок РАМ108А6, содержащий домен предполагаемой абгидролазы
кДНК РЫ96669, в значительной степени подобная секретируемому белку Ното заршпз, кислому, богатому цистеином (остеонектин)(8РАКС), мРНК Представитель 5 семейства эктонуклеотидпирофосфатаз/ фосфодиэстераз Белок 2, содержащий домен глицерофосфодиэфирфосфодиэ стеразы Белок ΕΝ8Ρ00000303034, подобный предполагаемому белку, содержащему У-образный и иммуноглобулиновый домен
кДНК РЫ77519, в значительной степени подобная мРНК секретируемого подобного Γπζζίβά белка Ното $ар1еп5 Белок 2, подобный полипептид-Ν- ацетилгалактозаминилтрансферазе Белок 1, содержащий домены XVАР, кагай иммуноглобулин, Ιαιηίΐζ и ΝΤΚ Транскрипционный вариант 4 антигена созревания В-клеток (Представитель 17 суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей)
Антиген дифференциации ΕΌ6 Τ'клеток Белок-гомолог 1 белка δΐΐί Белок 1, содержащий мотив КОЕЬ Белок СЗогГ58 семейства иРР0672
Пикакурин Вариант гормона роста Адипофилин Метилтиорибоза-1 фосфатизомераза
Бедок 1, подобный фибриногену Белок 3, родственный ангиопоэтину Белок, подобный лактазе 17-бета-гидроксистероид-
- 22 028186
дегидрогеназа 13
Интерлейкин-32 Белок 7, родственный ангиопоэтину Хондромодулин-1 Аминопептидаза В
Матрилин-4 Экто-АДФ-рибозилтрансфераза 5 Цепь коллагена альфа-6(1У) Дермицидин
Ассоциированный со сперматозоидами антиген 11В Белок 11, родственный карбоангидразе Белок 33, содержащий повторы богатые лейцином Метеорин
Фактор коагуляции XII Вероятная рибонуклеаза 11 Белок 1, содержащий домен МАИЗС Белок 7А, подобный метилтрансферазе
Г епцидин Вероятная карбоксипептидаза XI Липокалин-15 ΝΓ3
Белок ΚΙοϊΗο Белок РАМЗП Арилсульфатаза I Ν-ацетилтрансфераза 15
Серглицин Хемокин 14 с мотивом С-Х-С Фактор-кандидат развития мезодермы 2 Эфрин-А4
Томорегулин-2 Бета-дефензин 127 Белок 1, родственный белку ПкккорГ Белок Р1ипс
Хординподобный белок 2 Бета-дефензин 129 Подокан Калликреин-11
Представитель 6В суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей Белок 2, содержащий домен богатого цистеином секреторного белка ЬССЬ Белок 1, содержащий домен фибронектина III типа Сплайс-вариант х индуцируемого λΥΝΤΙ секретируемого белка 1 (Фрагмент)
Трансмембранный белок С20ог130 семейства ЦРР0414 Фактор роста фибробластов 21 Нейротримин Представитель 10 семейства интерлейкина-1
Представитель С семейства 4 с лектиновым доменом С-типа Альфа-Ь-фукозидаза плазмы Обонятельный рецептор 10\У 1 РЬА2С2Э
Белок С14огЛ 59 семейства ЦРР0317, митохондриальный Гастрокин-1 Белок РАКМ-1 Протеогликан 3
Нетрин-С2 Гастрокин-2 Белок 2, содержащий домен ΡΠΖ Инсулиноподобный пептид ΙΝ8ΙΑ
Металлоредуктаза 8ТЕАР2 Глютатионпероксидаза 7 Проэпирегулин Белок 3, подобный олфактомедину
Белок 4, содержащий домен κιΐδΐιί ΗΗΙΡ-подобный белок 1 Белок 1, подобный белку 1 поликистозного заболевания почек Внеклеточный гликопротеин лакритин
Белок ΥΙΡ1Β Интерферон каппа \УЬРЬ514 Ретинолдегидрогеназа 13
Аполипопротеин М Аполипопротеин С-1 Матриксная металлопротеиназа-26 Дефензин 3 нейтрофилов
Цепь бета белка, связывающего С4Ь Энхансер 2 С-эндопептидазы проколлагена Белок 2, подобный белку КЕЬТ ΟΕΟΙ35807
Цепь бета поверхностного гликопротеина СШ Т-клеток Фактор 1 определения левой-правой асимметрии Представитель ЕЗ семейства 35 растворимых переносчиков тигп
Белок 1, подобный хемокину 3 с мотивом С-С Представитель 4 семейства ЬО1 с богатыми лейцином повторами Транспортер цинка ΖΙΡ9 ОКЬУ8200
Фактор роста фибробластов 8 Субъединица АЬгахаз комплекса ВКСА1-А Ноэлин-2 ΙϋΓ\Υ5808
Сиаломуциновый ядерный белок 24 Белок 2 с лейциновой молнией Белок 2, подобный белку 5е1гиге 6 иВАР2
Лиганд 2 программируемой клеточной гибели 1 типа Нейрексофилин-3 Семафорин-ЗА Белок 8, родственный С1ц/ШР
Секретируемый и трансмебранный белок 1 Остеомодулин Семафорин-4С ΚΙΚ2ϋΙ_4 (Фрагмент)
Белок 6, родственный комплементу С1ц и фактору некроза опухолей Белок 1, содержащий домен ингибитора сериновой протеазы типа Кага1 Белок 14А, содержащий домен абгидролазы Транскрипционный вариант 2 суперсемейства 2 хемокинподобных факторов
Белок 3, подобный рецептору гормона, подобного содержащему муцин ЭФР-подобному элементу Белок 3, ассоциированный с акросомной мембраной сперматозоида Белок 36, содержащий домен анкиринового повтора Трансмебранный белок 1, связанный с кераноцитами
Ноэлин-3 Представитель 1 семейства ЗА секретоглобннов Белок зЫза-Д ОКОМ353
Связывающий одоранты белок 2Ь Белок ΐδΐιίαΐδΐιΐη Нейромедин-Ц МАТЬ2963
Уротензин-2 Клаудин-2 (5Р82) Гомолог белка Г4ос1а1 ΝΙΝΡ6167
Витрин Белок 2, родственный фактору комплемента Н Синаптогирин-2 РОМ 121-подобный белок
Белок 3, индуцируемый механизмом передачи сигнала \νΝΤ1 Белок, содержащий богатый лейцином повтор суперсемейства иммуноглобулинов Белок 2, подобный белку 2, ассоциированному с ингибитором ангиогенеза 1, КТРУ9368 (5ЬЕ-зависимое повышение экспрессии 1)
- 23 028186
специфическому для головного мозга
кДНК Р1Д75759, в значительной степени подобная фоллистатинподобному белку 3 Ното &ар1еп8 (секретируемый гликопротеин) (Р5ТЪЗ), мРНК Белок 1, взаимодействующий с рецептором по§о, содержащий богатый лейциновый повтор и иммуноглобулиноподобный домен Белок 104, содержащий биспиральный домен Белок 4, взаимодействующий с рецептором пойо, содержащий богатый лейциновый повтор и иммуноглобулиноподобны й домен
Ангиотензинпревращающий фермент 2 Родственный белку подобному ΙΚΚΕ белок 3 Представитель 20 семейства Ь6 трансмебранных белков 4 ΚΟΝ(32
Адипонектин Трансдуктор сигнала гематопоэтических клеток Трансмембранный белок 107 ЕЬСУ5929
Белок 4, родственный ангиопоэтину Субъединица бета фоллитропина Трансмембранный белок 143 ΚννΜ31Ο6
Аполипопротеин Α-ν Белок 3, ингибирующий активность меланомы Трансмембранный белок 178 Ι5ΡΡ6484
Аспорин Белок 4, содержащий повтор богатый лейцином Трансмембранный белок 205 РКНР9428
Белок, повышающий проницаемость бактерий Транспортер цинка 5 Трансмембранный белок 41А νΝΓΓ9373
Белок 1, содержащий домен СЦВ Нейрональный белок 1 с повтором богатым лейцином Трансмембранный белок 50А АСАН3104
Белок 1 хрящевого промежуточного слоя Апикальный эндосомальный гликопротеин Трансмембранный белок 50В К\'[_А1Ч44
Бета-Ала-Гис дипептидаза Белок амилоида А-4 сыворотки Интер ле й кин- 2 8В АУрер3002
Цепь альфа-1 (V) коллагена Пробетацеллулин Нейрональный пентраксин-2 ΖϋΗΗΌΙΙ
Цепьальфа-1 (XXV) коллагена Бета-1,4-галактозилтрансфераза 7 Коллектрин ΑΟΙΛΥ2560
Эстрадиол-17-бета-дегидрогеназа 11 3-гидроксибутиратдегидрогеназа 2 типа Трансмембранный белок 92 Т88РЗО28
Представитель 10 подсемейства С гомологов Опа.Т СЮАЬТ1-специфический шаперон 1 Трансмембранный белок 95 ΚΡνθ5814
Белок 6, содержащий ЭФР- Бета-казеин Трансмембранный белок 9В 5Н553124
подобный домен
Цепь А фактора коагуляции XIII Каппа-казеин Вероятная карбоксипептидаза РМ20О1 ММР 19
Глюкозо-6-фосфатизомераза Трансмембранный белок С2огГ18 Тетраспанин-12 <35(256193
Регулирующий аппетит гормон Ν-каталитическая цепь карбоксипептидазы Тетраспанин-13 νθΡλΥ2523
Субъединица бета интерлейкина-12 Антиген СБ320 Тетраспанин-15 ίΜΝΕ6487
Интерлейкин-22 Хондроитинсульфатсинтаза 1 Трансмембранный белок ирго513 АРЬА2487
Интелектин-1 Хондроитинсульфатсинтаза 2 Митохондриальный разобщающий белок 4 ОАЫ1870
Богатый лецином белок 1, инактивирующий глиому Молекула 7, подобная белку СМКР35 Полисераза-2 РК551829
Антиген 96 лимфоцитов Г омолог 3 белка покрова Вероятная пальмитоилтрансфераза ΖϋΗΗΟ24 МК556228
Матрилизин Короткоцепочечная дегидрогеназа/редуктаза 3 Связывающий сперматозоиды белок 1 блестящей оболочки яйцеклетки СКРК5811
Муцин-20 Белок 4, подобный белку дельта Связывающий сперматозоиды белок 2 блестящей оболочки яйцеклетки АУЬЬ58О9
Пропротеинконвертаза субтилизина/ клексина 9 типа Рецептор, родственный подобному Эека и Νοίοΐι эпидермальному фактору роста Субъединица 7 консервативного олигомерного комплекса Гольджи СК1 СЗЬ/С4Ь рецептор 8СК9 (или 16) С-конц. экзона 8СК. = короткий консенсусный повтор
Белок распознавания пептидогликана Долихолкиназа Белок 2 рецептора адипонектина ΡΙΚΚ2786
Интерферониндуцируемый белок 17 кДа Белок 1, подобный эндотелинконвертирующему ферменту Цепь С ингибина бета Белок 3, подобный 8100 кальцийсвязывающему белку А7
Белок \\Щ-4 Интегральный мембранный белок Белок Вгопп ОТЗУЗУ5826 (белок
- 24 028186
2В ЬР5О85)
Белок, подобный фактору 1 воспаления аллотрансплантата Связывающий инсулиноподобный фактор роста белок 5 Семафорин-ЗС ΚΤΙ88219 (НСС2020043)
Х-связанный белок 3, содержащий повтор АппасППо Молекула адгезии, селективная для эндотелиальных клеток Г епарансульфат-глюкозамин-30-сульфотрансфераза 2 Белок 4 связи гиалуронана и протеогликана
Хондроитинсульфат-Ν- ацетилгалактозаминилтрансфераза 1 Сигнальный пептид, белок 1, содержащий домен СЦВ и ЭФРподобный домен Белок 1, подобный перекрывающемуся транскрипту рецептора лектинов Микроновел
Хитотриозидаза-1 Белок 3, родственный фактору комплемента Н 5РАКС-подобный белок 1 5АМК3000
Белок 1, содержащий домен белка клаудина Прорелаксин Н1 Фибулин-7 УРЬЬЗО57
Эрлин-2 Белок 1, родственный фоллистатину Гомолог 1 белка НЕС СУЖ55837
Белок 1, содержащий домен гликозилтрансферазы 8 Глобозид-альфа-1,3-Ν- ацетилгалактозаминилтрансфераза 1 Белок 1, содержащий домен фибриногена С УС5А5840
Белок 1 мембраны Гольджи Г амма-глутамилгидролаза Представитель А фосфолипазы А1 ОНР53125
Рецептор 125 вероятно связывающий О-белок Кадгерин-24 Основный богатый пролином белок 2 слюны СКТК3118
Цепь альфа рецептора интерлейкина-20 Глицерин-З-фосфатацилтрансфераза 3 Белок 6, ассоциированный со сперматогенезом РАМР6501
Галектин-7 Рецептор 56 связывающий О-белок Белок 8КРХ2, содержащий повтор зиаЫ ЬТЬЬ9335
Лиганд 4 ΝΚΟ2ϋ Белок 2, связывающий гиалуронан Гомолог 1 белка скручивающей гаструляции УСЕ^У9374
Оксидаза Ь-аминокислот Связывающий прогепарин ЭФРподобный фактор роста Торсин-1В АНРА9419
Пролил-З-гидроксилаза 1 Гликопротеин, богатый ГИСТИДИНОМ Белок \Упр5а МОНУ1887
ГФИ-этаноламинфосфаттрансфераза 2 Углевод-сульфотрансфераза 14 Акрозинсвязывающий белок Η8ΑΣ5836
ГФИ-этаноламинфосфаттрансфераза 3 Цепь бета рецептора интерлейкина20 Представитель В семейства 18 с лектиновым доменом С-типа ЬНЬС1946
Белок 5СаМС-2 кальцийсвязывающий митохондриальный переносчик (белок 2 малый кальцийсвязывающий митохондриальный переносчик) Представитель 3 семейства эктонуклеотидпирофосфатаз/фосфо диэстераз Трансмембранный белок 4А, ассоциированный с лизосомами Белок 3, ассоциированный с карциномой эпителия длинного неба, легкого и носа (Лигандсвязывающий белок К УАЗ)
Белок А2, ассоциированный с легочным сурфактантом Связывающий инсулиноподобный фактор роста белок 7 Семафорин-ЗЕ ЬРРА601
Сплайсинг-фактор, белок 16 богатый аргинином/серином Каллистатин Амелобластин ΡΙΝΚ1
Альфа-К-аиетилгалактозаминидальфа-2,6-сиалилтрансфераза 6 Белок ЗВ, содержащий домен фибронектина III типа Белок 5, содержащий домен суперсемейства мембранных переносчиков 5ЕК.Н2790
Рецептор, родственный единому 1§ 1Ь-1 рецептору Рецептор фактора, ингибирующего лейкемию Ангиопоэтин-1 РЕРР9364
Тектоник-3 Гомолог В белка Ып-7 Ангиопоэтин-4 АРЕЫЫ
Представитель 11 суперсемейства лигандов фактора некроза опухолей Трансмебранный белок 1, родственный тиоредоксину Белок 9, подобный множественным доменам эпидермального фактора роста ОБ5Н6409
Представитель 19 суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей Белок 32, содержащий домены дезинтегрина и металлопротеиназы Фосфодиэстераза За, подобная кислой сфингомиелиназе 5ГУР255О
Пальмитоилтрансфераза 2ОННС9 Белок 3, содержащий домен ьуб/РЬАик ΑϋΑΜΤδ-подобный белок 5 ККЬР9220
Фибулин-5 Представитель А семейства 14 с лектиновым доменом С-типа Спексин РТМБ5838
Белковый Ζ-зависимый ингибитор протеаз Гомолог белка согтсЬоп Предполагаемый трипсин-6 νΈΟΝ1945
Альфа-2-макроглобулин Белок РАМ151А Прото-онкогенный белок λΥηΐ-1 АУРС1948
Белок, родственный белку адоип Белок 14, связывающий белок Костный морфогенетический Λ\ν06249Ι
- 25 028186
РК506 белок ЗЬ
Панкреатическая альфа-амилаза Нейропилин- и толлоидоподобный белок 2 Костный морфогенетический белок 5 Р5УЬ6168
Натрийуретический пептид В Протокадгерин бета-13 Костный морфогенетический белок 8В ЬСПЗОЗб
Атриальный натрийуретический фактор Пренилцистеиноксидаза 1 Белок ΡΑΜ26Ω РРКК6495
Нейтральная керамидаза Пефлин Фактор, родственный С 1ц КБ5С6348
Бета-2-микроглобулин Белок 1, подобный пептидилпропил-цис-транс-изомеразе Белок 1, содержащий основной домен четырех дисульфидных связей белка XVАР С5КР2ВР
Костный морфогенетический белок 4 Антиген стволовых клеток простаты Церебеллин-1 СЬЬУЗО61
Биотинидаза Гомолог 2 белковой вставки Карбоксипептидаза О СХУ516489
Белок М130, фагоцитарного рецептора типа 1 богатого цистеином Хитобиозилдифосфодолихол-бета- маннозилтрансфераза Белок 2, подобный миелиновому белку гего (Эпителиальный У-образный антиген 1) кДНК РЫ53955, в значительной степени подобная секреторному белку 4, родственному белку ίπζζίβά
Карбоксипептидаза В2 Гомолог 1 белка зе1-1 Белок 1, подобный сериновой протеазе 1 ΡΡΙΡ
Карбоксипептидаза Ζ Рго8АА8 Белок 70, содержащий биспиральный домен ν55\νΐ971
Хемокин 5 с мотивом С-С Связывающий сиаловую кислоту 1§подобный лектин 9 Хемокин 28 с мотивом С-С КЫА6249
Хемокин 7 с мотивом С-С Белок 1, подобный белкам 5ЫТ и ΝΤΚΚ Неохарактеризованный белок С4огГ29 АЫАУ195О
Хемокин 8 с мотивом С-С Статерин Белок 2, содержащий домен сив ОУЕ1466
Гликопротеин Οϋ59 Тестизин Белок транскрипта 4, подобного белку Тгет Ε8ΡΙ5812
Фактор комплемента I Белок 5, подобный белку Неохарактеризованный белок ΟΝΝΟ2999
трансмебранного канала С6ог£58
Кластерин Трансмебранная протеаза, сериновая 4 Хондроад герин ААОО6488
Цепь альфа-2(1) коллагена Супрессор метастаз Κί85-1 Белок 2 хрящевого промежуточного слоя НН5Е751
Цепь альфа-1(1П) коллагена Полипептид амилоида островковых клеток Неохарактеризованный белок С10о1‘Г25 Бета-дефензин 108В
Цепь альфа-1 (IV) коллагена Белок транскрипта 2, подобного белку Тгет Истмин-1 Бета-дефензин 118
Цепь альфа-3(1У) коллагена Белок 12, содержащий домен тиоредоксина Цистатин-8 Бета-дефензин 124
Цепь альфа-5(У1) коллагена Фактор роста эндотелия сосудов В Кардиотрофин-1 (СТ-1) Бета-дефензин 125
Цепь альфа-3( VI) коллагена Фактор роста эндотелия сосудов С Химотрипсиноген В Бета-дефензин 126
Компонент комплемента С6 Ретикулокалбин-3 Хемокин 9 с мотивом С-Х-С Белок 2, подобный дезоксирибонуклеазе-1
Цепь альфа-1 (IX) коллагена Фибриллин-1 Хемокин 13 с мотивом С-Х-С Станниокальцин-2
Цепь альфа-1 (X) коллагена Белок РАМЗА ΕΜΙΙΛΝ-3 Молекула 1, специфическая для эндотелиальных клеток
Цепь альфа-1(ХУП) коллагена Белок О7с Секретагогин Карбоксилэстераза 7
Цепь альфа-1(ХХ1) коллагена Нейропилин- и толлоидоподобный белок 1 Эпидидимальный секреторный белок ЕЗ-альфа Гомолог белка ΝΟν
Субъединица альфа белка соа(отег Бета-1-гликопротеин 11, специфический для беременности Эпификан Белок РАМ172А семейства ЦРР0528
Рецептор комплемента1 типа Серпин В4 Белок ГАМ5С Субъединица бета интерлейкина-27
Цистатин-δΝ ΑϋΑΜ ОЕС1 Фактор роста фибробластов 20 Белок РАМЗС
Дезоксирибонуклеаза-1 АДФ-зависимая глюкокиназа Белок 3, связывающий фактор роста фибробластов Белок 1, подобный фактору стромальных клеток 2
Белок 1 внеклеточного матрикса Альфа-амилаза 2В Трансмембранный белок 204 Представитель А1 подсемейства 1
- 26 028186
бутирофилина
Иммуноглобулин гамма низкой аффинности Рецептор ΙΙΙ-А Рс-участка УДФ-ГлкМ Аи:6етаГал бета-1,3-Νацетилглюкозаминилтрансфераза 3 Белок 4, связывающий фосфатидилэтаноламин Трансмебранный белок 2, ассоциированный с кератиноцитами
Ал ьф а-фетопр отеин Пептид 2, родственный гену кальцитонина Фактор коагуляции V Рс-рецептор иммуноглобулина альфа
Связывающий гепарин фактор роста 2 Карбоксипептидаза Е Фактор коагуляции VII ΕΜΙΠΝ-2
Цепь гамма фибриногена Цитокиновый фактор 1, подобный кардиотрофину Рго-МСН Рецептор 10 эфрина Атипа
Фактор роста/дифференциации 5 Цепь альфа-2(УШ) коллагена Фолатный рецептор гамма Белок 2, подобный экзостозину
Нейротрофический фактор глиальной клеточной линии Гомолог 2 белка СгитЬз Муцин-7 Белок 4, родственный фоллистатину
Связывающий инсулиноподобный фактор роста белок 3 Кислый фосфопротеин 1 дентинового матрикса Пептид, подобный галанину Белок 5, родственный фоллистатину
Инсулиноподобный фактор роста ΙΑ Молекула адгезии клеток при синдроме Дауна Гемицентин-1 Трансмембранный белок 66
Участок цепи С 1§ гамма-1 Представитель 1 суперсемейства и ммуногл обу л инов Интерлейкин-6 Фактор роста/дифференциации 2
Участок цепи С 1§ гамма-2 Интерлейкин-4 Эмбриональный фактор роста/дифференциации 1 Рецептор альфа-4 семейства ΟΌΝΡ
Участок цепи С 1§ гамма-3 Субъединица альфа рецептора интерлейкина-6 Интерлейкин-8 Участок цепи С 1§ гамма-4
Инсулиноподобный белок 3 Интерлейкин-24 Гремлин-2 Антиген лимфоцитов 86
Тяжелая цепь интер-альфаингибитора трипсина Ладинин-1 Стромелизин-2 Цепь Е ингибина бета
Белок ΚΙΑΑ0100 семейства ИРР0378 Представитель I липазы Рецептор 171 вероятно связывающий С-белок Белок 1С, содержащий домен ОКАМ
Кининоген-1 Белок 1, родственный панкреатической липазе Паппализин-2 Интерферон альфа-10
Субъединица альфа-2 ламинина Альфа-2-гликопротеин богатый Ассоциированный с Интерферон альфа-16
лейцином микрофибриллами гликопротеин 4
Субъединица альфа-4 ламинина Белок 5, ассоциированный с реконструкцией матрикса Нейромедин-В Интерферон альфа-6
Субъединица бета-1 ламинина Нетрин-4 Мимекан Представитель 21 суперсемейства иммуноглобулинов
Протеин-лизин-б-оксидаза Рецептор фактора роста гепатоцитов Матриксная металлопротеиназа-19 Агрин
Мультимерин-1 Хемокин 22 с мотивом С-С Интерлейкин-11 Пролактин
Вазопрессин-нейрофизин-2- копептин Никталопии Интер ле й кин-17 А Белок 11, подобный белку ке1сЬ
Нидоген-1 Остеокальцин Интерлейкин-18 Белок ΧΥηΐ-16
Фосфолипаза А2 Основный богатый пролином белок 3 слюны Интер ле й кин- 26 Пропердин
Перфорин-1 Бета-1-гликопротеин 10, специфический для беременности Интерлейкин-28А Калликреин-13
Фосфатидилинозитгликанспецифическая фосфолипаза ϋ Трансмембранный белок РЬЕ<Т2 с богатым лейцином повтором Белок 3, содержащий домен трансмебранного белка етр24 Гацил-зп-глицерин-З- фосфатацилтрансфераза дельта
Фиброцистин К-спондин-3 Интер ле й кин- 29 Калликреин-9
Белок-переносчик фосфолипидов Сиалоадгезин Инсулиноподобный пептид 1И5Ь6 Белок 5, зависимый от витамина К
Кислая фосфатаза простаты Трипсин-3 Белок λ¥ηί-2Β Белок 8, подобный бутирофилину
Белок Ζ, зависимый от витамина К Дипептидаза 2 Бета-1-гликопротеин 1, связанный с беременностью Субъединица бета-4 ламинина
Кислый богатый пролином фосфопротеин 1/2 слюны Белок 1, содержащий домен связывающий коллаген и кальций ЭФР Белок 4, ассоциированный с акросомной мембраной сперматозоида Рецептор 1 гиалуроновой кислоты эндотелиальных лимфатических сосудов
Белок зоны беременности Белок, подобный специфическому гену 1 зародышевых клеток Субъединица гамма-3 ламинина Цистатин-8А
- 27 028186
Прорелаксин Н2 Белок 31, содержащий повтор богатый лейцином Гомолог 3 лизилоксидазы Трансмембранный белок 59
Семафорин-40 Аполипопротеин О Нейротензин/нейромедин N Белок 2, подобный аподипопротеину(а)
Белок-гомолог 2 белка 51ίΐ Дистрогликан Белок 2, содержащий домен МАМ Белок 2, подобный лизоциму
Альфа-текторин Дефензин 4 нейтрофилов Ассоциированный с микрофибриллами белок 2 Белок 4, подобный лизоциму
Тенасцин-Х Белок 3, индуцируемый амфотерином Белок 2, ингибирующий активность меланомы Белок гееНп
Фактор «трилистника» 3 Субъединица АРН-1В гаммасекретазы Матриксная металлопротеиназа-24 Связывающий ретинол белок 4
Белок 1 рецептора трансферрина Аполипопротеин С-ΐν Матриксная металлопротеиназа-25 Карбоангидраза 14
Протрансформирующий фактор роста альфа Арилсульфатаза С Нетрин-1 Тубулоинтерстициальный антиген нефрита
Трансформирующий фактор роста бета-2 Фактор, активирующий глии Нетрин-3 Нейропептид XV
Представитель 6 суперсемейства лигандов фактора некроза опухолей Белок 18, содержащий домен рекрутирования каспазы Альфа-Ν- ацетилгалактозаминид-альфа2,6-сиалилтрансфераза 1 Альфа-1,3-маннозилгликопротеин-4-бета-14ацетилглюкозаминилтранс фераза В
Представитель 1В суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей Г епарансульфат- глюкозамин-З-Осульфотрансфераза ЗА1 Альфа-Ν- ацетилгалактозаминид-альфа2,6-сиалилтрансфераза 3 Белок 5, содержащий домен трансмебранного белка етр24
Представитель 5 суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей Эктоэнзим, разрушающий тиротропин-высвобождающий гормон Росторегулирующий белок меланомы Белок 3, родственный комплементу Ος и фактору некроза опухолей
Тромбопоэтин Гуанидин Пептиды, родственные РМКГамиду Белок 1, подобный подокану
Пептиды ΥΙΡ Белок 3, подобный холиновому транспортеру Отоконин-90 Бета-1-гликопротеин 5, специфический для
беременности
Кислая хитиназа млекопитающих 17-бета-гидроксистероиддегидрогеназа 14 Нейотурин Кератокан
Секреторный белок 2 богатый цистеином Полипептид 1, подобный иммуноглобулину лямбда Нейрексофилин-1 Секреторная фосфолипаза А2 группы НЕ
Белок, родственный гаптоглобину Представитель 14 подсемейства В гомологов Опа1 Нейрексофилин-2 Фактор 2 определения левой-правой асимметрии
Хемокин 26 с мотивом С-С Белок 8 только с боксом Г Вариант тромбоцитарного фактора 4 Лиганд 2 ΝΚΟ2ϋ
Коллектин-11 Фибролейкин Ноцицептин Металлоэстераза макрофагов
Белок 2, богатый цистеином с ЭФРподобным доменом Метионин-К-сульфоксидредуктаза ВЗ, митохондриальная Белок 1, содержащий Vобразный и трансмебранный домены Стимулирующий рецептор 1, экспрессируемый на миелоидных клетках
Хемокин 16 с мотивом С-Х-С Представитель 2 семейства ЬО1 с богатыми лейцином повторами Богатый пролином белок 4 Цитокиновый рецепторподобный фактор 1
Белок 1, связывающий фактор роста фибробластов Белок СОТ1В транспорта везикул Пролактинвысвобождаю щий пептид Секретин
Представитель 5 семейства интерлейкина-1 Интегральный мембранный белок ОРК 177 Сериновая протеаза 33 Фактор стромальных клеток 2
Представитель 9 семейства интерлейкина-1 Рецептор 78, вероятно связывающий О-белок Бета-1-гликопротеин 8, специфический для беременности Белок 6, подобный лизоциму
Калликреин-5 Представитель 2 семейства НЕРАСАМ Ретбиндин Серпин А9
Матрилин-2 Субъединица альфа рецептора интерлейкина-27 Пептиды, родственные РМКРамиду Белок 1, содержащий домен склеротина
Рецептор 1 гликопротеина С0200 клеточной поверхности Проэнкефалин-А Рибонуклеаза Кб Лизокардиолипин ацилтрансфераза 1
Фосфатаза лизофосфатидной кислоты 6 типа Интегрин альфа-10 Рибонуклеаза Т2 Глутаматкарбоксипептида за плазмы
Фактор обмена нуклеотидов ЗЕЛ Белок 1, содержащий мотив КТЕЬ Репетин Белок-гомолог 3 белка 51й
- 28 028186
Белок 4, содержащий домен тромбоспондина 1 типа Представитель 5 подсемейства А рецепторов, подобных иммуноглобулину лейкоцитов Белок, подобный подкомпоненту комплемента С1г Белок 8, содержащий СЗ и ΡΖΡ-подобный домены альфа-2-макроглобулина
Белок 2, индуцируемый механизмом передачи сигнала ΑΥΝΤΙ Белок 3, содержащий богатый лейцином повтор и домен фибронектина III типа Неохактеризованная гликозилтрансфераза АЕК.61 Белок 2, респондер рецептора ретиноевой кислоты
Белок 9, содержащий домен Ьгошо Утероглобин Семафорин-ЗО Кислый белок 1 хряща
Белок 2, подобный антигену СО99 Лиганд нетрина-О1 Представитель 1 семейства 1С секретоглобинов Станниокальцин-1
Неохарактеризованный белок С1огИ59 Паннексин-1 Представитель 1 семейства Ю секретоглобинов Бета-текторин
Углевод-сульфотрансфераза 12 Протокад герин-12 Представитель 2 семейства Ιϋ секретоглобинов Фактор 3 пост-ГФИ присоединения к белкам
Вероятная серинкарбоксипептидаза СРУЬ Протокадгерин альфа-10 Серпин А12 Белок, специфического гена 1 зародышевых клеток
Муцин-ЗА Протокадгерин бета-10 Серпин 12 Рецептор интерлейкина-21
Белок 1, содержащий СНВ домен и домен, подобный белку блестящей оболочкия яйцеклетки Трансмебранный белок 1, ассоциированный с остеопетрозом Белок, содержащий домены фактора фон Виллебранда С и ЭФР Белок 4, содержащий Vобразный и иммуноглобулиновый домены
Полипептид-Ν- ацетилгалактозаминилтрансфераза 14 Бета-галактозид-альфа-2,6сиапилтрансфераза 1 Дезинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина 15 Белок группы В, содержащий домен богатого цистеином фагоцитарного рецептора
Галектин-9 Компонент РЮ-8 ГФИтрансамидазы Субъединица бета-2 натриевого канала Протиролиберин
Белок 17, содержащий повтор богатый лейцином Трансмебранный белок 3 богатый пролином Ингибитор 4 металлопротеиназы Семафорин-4А
Нейрональный белок 2 с повтором богатым лейцином Сульфгидрилоксидаза 2 Иммуномодулирующий белок Т-клеток
Бифункциональная гепарансульфат- Дезинтегрин и металлопротеиназа с Дезинтегрин и Представитель 27
Ы-деацетилаза/Мсульфотрансфераза 3 мотивами тромбоспондина 16 металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина 10 суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей
Туфтелин Белок ЗА, содержащий домен 8Н2 Лимфопоэтин стромы тимуса Толл-подобный рецептор 7
Белок-переносчик митохондрий мозга Трансформирующий $НС белок 4 Трансмембранный белок 130
Сигнальный пептид, белок 3, содержащий домен СЦВ и ЭФРподобный домен Белок 23, содержащий домены дезинтегрина и металлопротеиназы Белок, ассоциированный с особым матриксом хряща Белок 16, содержащий домен тиоредоксина
Белок сигма 14-3-3 Белок 2, подобный трансдуцину бета Урокортин-2 Альфа-2-антипл азмин
Альфа-1 кислый гликопротеин 1 Белок 10, содержащий домен Тидог Урокортин-3 Белок 3, содержащий основной домен четырех дисульфидных связей белка XV АР
Альфа-1 кислый гликопротеин 2 Представитель 3 суперсемейства трансмебранных белков 9 Белок АМВР Белок \¥ГОС9
Белок 1, содержащий домен фактора фон Виллебранда А Белок, содержащий домены фактора фон Виллебранда О и ЭФР Белок, подобный белку 9, родственному комплементу С1ц и фактору некроза опухолей Дезинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина 14
Белок 9, содержащий домены дезинтегрина и металлопротеиназы Дезинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина 17 Белок 88, родственный фактору ингибирования роста и дифференциации Белок, ассоциированный с плазменной мембраной адипоцитов
Ангиотензиноген Белок 2, подобный белку трансмебранного канала Белок \Уп1-10а Гомолог пероксидазина
Аполипопротеин А-П (Аро-АП) (АроА-П) Бета-1-гликопротеин 3, специфический для беременности Белок АУгц-За Гомолог белка прогрессирующего анкилоза
Аполипопротеин Α-ΐν (Αρο-Αίν) (ΑροΑ-ΙΥ) Теномодулин Прото-онкогенный белок λ¥ητ-3 Белок 1, подобный хитиназе-3
- 29 028186
Аполипопротеин С-Н (Аро-СП) (АроС-П) Тетраспанин-6 Белок λ¥ηΐ-6 Белок СХог136 семейства иРР0672
Бета-2-глнкопротеин 1 Белок 5, содержащий домен тиоредоксина Белок \¥п1-9а Арилсульфатаза ί
Белок 3, связанный с апоптозом Фактор роста эндотелия сосудов ϋ Цитокин $СМ-1 бета Корти статин
Бета-секретаза-2 Бета-1-гликопротеин 9, специфический для беременности Мембранный белок 16 гранул зимогена Церулоплазмин
Трансфераза системы АВО гистогрупп крови Семафорин-ЗР Белок 1, связывающий блестящую оболочку яйцеклетки Белок 5, родственный ангиопоэтину
Катепсин Ь2 Белок 2, подобный кислой фосфотазе Гомолог антериального градиентного белка 3 Белок 126, содержащий биспиральный домен
Хемокин 3 с мотивом С-С Белок, подобный аполипопротеину О Амелотин Антиген СО177
Представитель В семейства 1 с лектиновым доменом С-типа Бета-дефензин 119 Неохарактеризованный белок С5ог£46 Гомолог 4 белка покрова
Регулятор 1 активируемого кальцием хлоридного канала Дезинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина 12 Протеинкиназа 1, содержащая домен неохарактеризованного белка аагР Белок С4огГ31, содержащий домен фибронектина III типа
Химаза Белок РАМ131А Драксин Белок РАМ180А
Цепь альфа-1 (VI) коллагена Белок РАМЗВ Фактор роста фибробластов 18 Основный белок тромбоцитов
Цепь альфа компонента комплемента С 8 Белок, подобный бетагалактозидазе-1 Хемокин 11с мотивом С-Х-С Интерферон эпсилон
Компонент комплемента С9 Белок 1, подобный лизоциму § Белок 6, содержащий домен ьуб/РЬАик Интелектин-2
Белок 2, содержащий домен глюкозо-фруктозо-оксидоредуктазы Белок, подобный тяжелой цепи Н5 интер-альфа-ингнбнтора трипсина Представитель 1 семейства химотрипсинподобных эластаз Альфа-1,3-маннозилгликопротеин-4-бета-14ацетилглюкозаминилтранс фераза А
Представитель 11 подсемейства В гомологов Опа.Т Белок 5, ассоциированный с акросомой сперматозоида Рецептор эритропоэтина Внеклеточный фосфогликопротеин
матрикса
Представитель 7 семейства эктонуклеотидпирофосфатаз/фосфо диэстераз Белок 2, взаимодействующий с рецептором поео. содержащим богатый лейциновый повтор и иммуноглобулиноподобный домен Белок 2 с гликозилфосфатидилинозитны м якорем, содержащий домен МАМ кДНК РП77863, в значительной степени подобная секретируемому и трансмебранному белку 1 (8ЕСТМ1), мРНК
Аминопептидаза 1 эндоплазматического ретикулума Белок 2, ассоциированный с сурфактантом Матриксная металлопротеиназа-27 Эпидидимальноспецифиче ский липокалин-6
Рецепторная тирозиновая протеинкиназа егЬВ-3 Белок 1 рецептора адипонектина Неактивная сериновая протеаза 35 Афамин
Резидентный белок ЕКр44 эндоплазматического ретикулума Белок 6, подобный множественным доменам эпидермального фактора роста Белок 134, содержащий биспиральный домен Вероятная катионтранспортирующая АТФаза 13А5
Белок, связывающий 1цОГс Нейроэндокринный белок 7В2 Супрабазин Глютатионпероксидаза 3
Белок 1, родственный фактору комплемента Н Альфа-1 В-гликопротеин Представитель 4 семейства Ю секретоглобинов Клаудин-18
Полипептид-Ν- ацетилгалактозаминилтрансфераза 2 Белок 2, содержащий домены ΑΥΑΡ, кага1, иммуноглобулина, Ιαιηίΐζ и ΝΤΚ Белок 2А, содержащий Vобразный и трансмебранный домены Белок ΚΙΚ3ΟΡ1, подобный пред полагае мому иммуноглобулиноподобно му рецептору клетоккиллеров
Гемопексин Подобный арилацетамиддеацетилазе белок 1 ΑϋΜ Рецептор секреторной фосфолипазы А2
Активатор фактора роста гепатоцитов Гистатин-3 Неохарактеризованный белок С2огГ82 Гаптоглобин
Белок гена, подобный главному комплексу гистосовместимости I класса Про-нейре гулин-3, мембраносвязанная изоформа Представитель 1 семейства инсулиноподобных факторов роста Молекула 20 клеточной адгезии, родственная карциноэмбриональному антигену
Связывающий инсулиноподобный фактор роста белок 6 Белок, передающий сигнал гена а<?оип Белок 29, подобный кадгерину Костный морфогенетический белок 3
- 30 028186
Участок цепи С 1§ дельта Клаудин-8 Костный морфогенетический белок 15 Антиген 2 стромы костного мозга
Интерлейкин-1 бета Белок С12огГ49 семейства ЦРР0454 Ингибитор сериновой протеазы плазмы Цитохром Р450 20А1
Белок 10, родственный рецептору липопротеинов НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ Белок 5В1, содержащий домен А фактора фон Виллебранда Молекула 21 клеточной адгезии, родственная карциноэмбриональному антигену Белок 3, подобный бактерицидному/повышаю тему проницаемость белку
Молекула С соединительной адгезии Кадгерин-6 Альфа-лактальбулин Гомолог 2 белка дру-19
Неохарактеризованный белок ΚΙΑΑΟ319 Антимикробный пептид кателицидин Белок ϋ€Ο1 когезии сестринских хроматид Секреторная фосфолипаза А2 группы ИГ
Субъединица альфа-5 ламинина Субъединица гамма-1 ламинина Белок, связывающий галектин- 3 Карбоксипептидаза В
Белок 4, содержащий домен фибронектина III типа Представитель 7В семейства δϋΚ. дегидрогеназ/редуктаз Белок 1, содержащий домен тяжелой цепи динеина Белок 2, содержащий домен гликозилтрансферазы 8
Липопротеинлипаза Хемокин 16 с мотивом С-С Хемокин 17 с мотивом С-С Белок РАМ19А1
Интерстициальная коллагеназа Хемокин 24 с мотивом С-С Редуктаза-1 жирных кислотКоА Белок, подобный рецептору альфа семейства ΟΠΝΡ
Матриксная металлопротеиназа-9 Белок С7ог£27, содержащий повтор НЕАТ Гомолог фактора инициации почки плавника Вероятная глютатионпероксидаза 8
Муцин-16 Цепь альфа-2(1Х) коллагена Рецептор полимерный иммуноглобулинов Цистатин-ϋ
Муцин-2 Цепь альфа-3(1Х) коллагена Прионоподобный белок 4орре1 Цистатин-Г
Муцин-5В Колипаза Хемокин 6 с мотивом С-Х-С Ацетилгидролаза активирующего тромбоциты фактора
Миоцилин Цепь альфа-1 (XXVII) коллагена Хемокин 10 с мотивом С-Х-С Паппализин-1
Рецептор 1 окисленного липопротеина низкой плотности Субъединица 2 карбоксипептидазы N Бета-дефензин 1 Представитель 12 семейства 22 растворимых
переносчиков
Белок, сверхэкспрессируемого гена 1 опухоли простаты Трансмебранный нейрональный белок 4 с повтором богатым лейцином Белок 2 связи гиалуронана и протеогликана Белок 1, подобный гормону хорионическому соматомаммотропину
Серин/треонин-протеинкиназа 2, взаимодействующая с рецептором Белок 1, содержащий коллагеновый трехспиральный повтор Белок 30, содержащий домены дезинтегрина и металлопротеиназы Белок 3 регулятор динамики движения микротрубочек
Транспортер 3 уравновешивающих нуклеозидов Эндотелин-2 Белок гена-суппрессора фьюздгомолога Ретинолдегидрогеназа 14
Селенопротеин Р Фибромодулин Фолатный рецептор бета Галанин
Белок Ω, ассоциированный с легочным сурфактантом Белок В, подобный Рс-рецептору Внеклеточная сульфатаза 8и1Г-2 Транскобаламин-2
Белковый гомолог гена 6, стимулированного ретиноевой КИСЛОТОЙ Белок С1огП24, содержащий домен цинкового пальца КАР) 18 Представитель 14 суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей Белок 1, содержащий домен катехол-Омегилтрансферазы
Фактор «трилистника» 1 Фактор роста/дифференциации 15 Артемии Трипептидил-пептидаза 1
Ингибитор 2 механизма действия тканевого фактора Нексин глии Цепь альфа-1 (XII) коллагена Белок транскрипта 1, подобного белку Тгет
Протромбин Прогонадолиберин-1 Цепь альфа-1 (XIV) коллагена Активатор 2В гуанилатциклазы
Толл-подобный рецептор 9 Гранзим К Бета-дефензин 2 Индуцибельный костимулятор Т-клеток
Молекула межклеточной адгезии 4 Интерферон альфа-17 Интерлейкин-21
Интерлейкин-19 Интерферон альфа-21 Интерлейкин-3
Истмин-2 Интерферон альфа-8 Интерлейкин-7 Белок, подобный Νконцевому гомологу 2 белка КотсН
Родственный белку подобному ΙΚΚΕ белок 1 Интерферон омега-1 Цепь альфа ингибина Субъединица бета-2 ламинина
Калликреин-10 Пептид, подобный раннему инсулину плаценты Субъединица альфа-3 ламинина Нейропилин-2
Белок 4, связывающий латентный Белок 1, содержащий домены ЭФР, Представитель хромосомы X Белок 1 внеклеточного
- 31 028186
трансформирующий фактор роста бета латрофилина и седьмой трансмебранный домен семейства δϋΚ дегидрогеназ/редуктаз матрикса, подобный ЭФРсодержащему фибулину
Рецептор альфа 2 типа подобный сдвоенному иммуноглобулину Белок 1 с доменами фибронектина 3 типа и анкиринового повтора Регулятор ионного транспорта 6, содержащий домен ΡΧΥΏ Рецепторный тип тирозинпротеинфосфатазы каппа
Белок 3 альфа регенерации островковых клеток Гомолог 4 лизилоксидазы Сериновый инкорпоратор 2 Белок 4 альфа регенерации островковых клеток
Белок ΚΝΕ5 убиквитинпротеинлигазы ЕЗ Люмикан Стромелизин-3 Тахикинин-4
Протахикинин-1 Адропин Секретируемый фосфопротеин 1 Матриксная металлопротеиназа-23
Секреторный белок 1, родственный белку Γπζζίβά, изоформа СКА_а Трансмембранный белок РБКТ1 с повтором богатым лейцином Белок ЬАСТВ, подобный серин-бета-лактамазе, митохондриальный Белок 5, родственный комплементу СЦ и фактору некроза опухолей
Белок В, родственный плазминогену Нуклеобиндин-2 Галектин-3 Оптицин
Вероятная пальмитоилтрансфераза 2ЛННС16 Фосфолипаза А2 Панкреатический прогормон Предшественник малого/секретируемого гликопротеина
Белок 1, родственный ангиопоэтину Проэнкефалин-В Бета-1-гликопротеин 6, срецифический для беременности Белок РТХЗ, родственный пентраксину
Белок С19ог£63 семейства ЦРР0510 Белок распознавания пептидогликана 1-бета Белок 3, родственный белку йюккорГ Карбоксилэстераза 8
Белок М160, фагоцитарного рецептора типа 1 богатого цистеином Белок 2, содержащий богатый лейцином повтор суперсемейства иммуноглобулинов Представитель 11 семейства 8ϋΚ дегидрогеназ/редуктаз Трансмебранный белок 4, родственный тиоредоксину
Белок 2, подобный альфаманнозидазе, усиливающей деградацию ЕК Белок 2, содержащий У-образный и иммуноглобулиновый домены Белок 3 гамма регенерации островковых клеток Белок 2, содержащий домен суперсемейства мембранных переносчиков
Белок 2, подобный бетагапактозидазе-1 Пептид ΥΥ Белок 43 пальца ΚΙΝΟ Калликреин-12
Рецептор Е интерлейкина-17 Связывающий ретинол белок 3 Семеногелин-2 Ядерный белок бревикан
Интерлейкин-20 Атерин Муцин-15 Поримин
Интерлейкин-25 Гомолог 5ЕС63 белка транслокации Костный сиалопротеин 2 Торсин-1А
Белок 11, содержащий домен ΡϋΖ Трансформирующий фактор роста бета-3 Лимфотактин Хемокин 23 с мотивом СС
Релаксин-3 Белок \Уп1-10Ь Регулирующий рост белок альфа Тестикан-3
Сериновая карбоксипептидаза, индуцируемая ретиноидами Реналаза К-спондин-2 Основный богатый пролином белок 4 слюны
Белок 2, ассоциированный с карциномой эпителия короткого неба, легкого и носа Пропротеинконвертаза типа 4 субтилизина/клексина Белок 3, содержащий трансмембранный и биспиральный домен Представитель 18 суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей
Белок 5, содержащий основной домен четырех дисульфидных связей белка А'АР Карбоксипептидаза А4 Корегулируемый ФРЭС хемокин 1 Белок Ьго(Ьег СЭО
Тромбоцитарный фактор роста С Олфактомедин-4 АГ>М2 Бета-1,4- галактозилтрансфераза 4
Белок 33, содержащий домены дезинтегрина и металлопротеиназы Кислотолабильная цепь белкового комплекса, связывающего инсулиноподобный фактор роста Белок, подобный гидроксистероид-11-бетадегидрогеназы 1 Представитель 9 семейства δϋΚ дегидрогеназ/редуктаз
Белок 1, содержащий домен Βδϋ Амелогенин, изоформа Υ Белок 1, подобный белку дельта Эппин
Молекула 3 адгезии клеток Арилсульфатаза Р Эфрин-А1 Отоанкорин
Белок, родственный СОС45 Вариант 2 субъединицы бета хориогонадотропина Белок 1, подобный рецептору фактора роста фибробластов Тенасцин-К
Хондролектин Бета-дефензин 104 Рецептор альфа-3 семейства ΠΟΝΕ Фактор роста
Диацилглицерин-Оацилтрансфераза 2 Бета-дефензин 105 Тромбоцитарный рецептор 0124 Белок Т5РЕАК
3- кето-стер о идреду ктаза Бета-дефензин 107 Прогонадолиберин-2 Гефестин
Рецептор С интерлейкина-17 Белок Ч Н)С11 Калликреин-7 Белок 3, подобный бутирофилину
- 32 028186
Рецептор ϋ интерлейкина-17 Белок 6, содержащий основной домен четырех дисульфидных связей белка XV АР Аполипопротеин Р Белок 9, подобный бутирофилину
Субъединица 1 комплекса интегратора Эпиген Белок СА5С4 Субъединица гамма-2 ламинина
Белок, подобный молекуле соединительной адгезии Белок РАМ19А5 Белок, подобный белку У1Р36 Белок ЬМВКТЬ
Белок ЬМХ убиквитинпротеинлигазы ЕЗ Клаудин-6 Белок 1 транспортер магния Муцин-21
Трансмебранный нейрональный белок 3 с повтором богатым лейцином Молекула 19 клеточной адгезии, родственная карциноэмбриональному антигену Чувствительная к амилориду аминоксидаза [медьсодержащая] Маннозилолигосохарид1.2-альфа-маннозидаза э ндо плаз матического ретикулума
Субъединица бета метионинаденозилтрансферазы 2 Дезинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина 1 Белок 2 модулятор регулируемой повреждением ДНК аутофагии Основной гликопротеин СР2 секреторной гранулярной мембраны поджелудочной железы
Белок 2, подобный подокаликсину Белок СОфЮ А, митохондриальный Трансмембранный белок С17ог£87 Семафорин-4В
Проминин-2 ^охарактеризованный белок С19огГ41 Белок 5, родственный фактору комплемента Н Семафорин-5В
Белок 2, содержащий домен плексина ^охарактеризованный белок С21огГ63 Белок 7, связывающий РК506 Эпсилон-саркогликан
Гомолог 4 белка КоипбаЬоиТ Гомолог 2 белка дельта Сериновый инкорпоратор 1 Связывающий гуанилат белок 5
Лактозилцерамид-альфа-2,3- сналилтрансфераза Транскрипционный белок, регулируемый кокаином и амфетамином Белок 1, содержащий трансмебранный и убиквитинподобный домен Эктонуклеозидтрифосфат дифосфогидролаза 6
Представитель 2 семейства трансмебранных белков 8ГО1 Белок, подобный белку 1 участнику слияния белка НМО1С липомы Белок, подобный белку ЕК.О1С53 Серпин ВЗ
Белок 1, содержащий домен зизЫ Белок 18, содержащий повтор богатый лейцином Толл-подобный рецептор 10 Гомолог В белка КМЭ5
Серин/треонин-протеинкиназа ТАО2 Белок 25, содержащий повтор богатый лейцином Толл-подобный рецептор 8 Представитель 5 фагоцитарного рецептора класса А
Трансмебранная протеаза, сериновая 2 Белок ЗВ, содержащий богатые лейцином повторы Селенопротеин Т Семафорин-бВ
Декарбоксилаза 1 УДФглюкуроновой кислоты Белок 3, содержащий повтор богатый лейцином Связывающий сиаловую кислоту ^-подобный лектин 11 Трансмембранный белок 108
Неохарактеризованный белок С10ог£58 Белок 4, содержащий домен Ьуб/РЬАиК Сортирующий белки нексин-24 Белок 3, содержащий домен зизЫ
Трансмебранный белок 2, родственный тиоредоксину Субъединица 1 комплекса эпоксидредуктазы витамина К Белок 1, родственный комплементу С 1(] и фактору некроза опухолей Белок 2, связывающий латентный трансформирующий фактор роста бета
ЦМФ-19-ацетилнейраминат-0етагалактозамид-альфа-2,3с иал и лтранс фер аз а Дезинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина 20 Предполагаемый неохарактеризованный белок υΝς>6494/ΡΚΟ2134ό Предполагаемый неохарактеризованный белок 1Ж<56190/РКО20217
Предполагаемый неохарактеризованный белок ΕΝ5Ρ00000380674 Предполагаемый неохарактеризованный белок ΕΝ5ΡΟΟΟΟΟ38183Ο Вариант предшественника секретируемого и трансмебранного белка 1 Вариант предшественника секретируемого и трансмебранного белка 1
Трансмембранный белок 119 Белок 1 критического участка синдрома «кошачьего глаза» Представитель А семейства 18 с лектиновым доменом С-типа Цепь альфа-1 (XX) коллагена
Трансмембранный белок 98 Экспресиируемый яичками белок 101 Секреторный белок 3 богатый цистеином Рецептор нетрина 1Л4С5Э
Белок 3 предшественников - Влимфоцитов Ксилозилтрансфераза 2 Комплемент С4-В Муцин-13
Предполагаемый неохарактеризованный белок С14огГ144 Белок ГАМ20А Предполагаемый неохарактеризованный белок РКО2829 АТФ-зависимая металлопротеаза ΥΜΕ1Π
Протеаза сайта-1 мембрансвязывающего фактора транскрипции Белок 1, содержащий домены трансмебранного белка и иммуноглобулина Регулятор 2 активируемого кальцием хлоридного канала Пропротеинконвертаза типа 5 субтилизина/кексина
Фиколин 3 (содержащий домен Белок ΚΙΚ3ΠΧ1, подобный Суппрессор туморогенности
коллагена/фибриногена) (антиген Наката) (N13) (Фиколин 3 (содержащий домен коллагена/фибриногена) (антиген НакаТа), изоформа СКА Ь) предполагаемому иммуноглобулиноподобному рецептору клеток-киллеров (Представитель 12 кластера лейкоцитарных рецепторов) нейробластомы 1
Представленные в данном документе терапевтические белки не должны считаться исчерпывающими примерами. Напротив, как видно из раскрытия изобретения, предложенного в данном документе, способы этого изобретения применимы к любому белку, к которому требуется присоединение водорастворимого полимера, в соответствии с данным изобретением. К примеру, терапевтические белки описаны в публикации США 2007/0026485, содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.
Белки коагуляции крови
В одном аспекте, исходным веществом настоящего изобретения является белок коагуляции крови, который может быть получен из плазмы человека или получен с помощью методик рекомбинантной инженериии как описано в патенте США № 4757006; патенте США № 5733873; патенте США № 5198349; патенте США № 5250421; патенте США № 5919766; и патенте ЕР 306968.
Терапевтические белки, такие как белки коагуляции крови, включающие Фактор IX (ΡΙΧ), Фактор
- 33 028186
VIII (РУШ), Фактор УПа (РУПа), Фактор фон Виллебранда (У^Р), Фактор РУ (РУ), Фактор X (РХ), Фактор XI (РХ^, Фактор XII (РХП), тромбин (РН), белок С, белок δ, ίΡΑ, ΡΑΜ, тканевый фактор (ТФ) и протеазу ΑΌΑΜΤδ 13, быстро разрушаются протеолитическими ферментами и нейтрализуются антителами. Это снижает их период полувыведения и время циркуляции, таким образом ограничивая их терапевтическую эффективность. Для достижения и поддержания требуемого терапевтического и профилактического действия этих белков коагуляции необходимы относительно высокие дозы и частое введение. Вследствие этого, трудно достичь надлежащей регуляции дозы, а потребность частых внутривенных введений накладывает ограничения на образ жизни пациента.
В данном документе описано, что белки коагуляции крови включают, но не ограничиваются: Фактором IX (РК), Фактором УШ (РУШ), Фактором УПа (РУПа), Фактором фон Виллебранда (У^Р), Фактором РУ (РУ), Фактором X (РX), Фактором XI, Фактором XII (РXII), тромбином (РН), белком С, белком δ, ίΡΑ, ΡΑΜ, тканевым фактором (ТФ) и протеазой ΑΌΑΜΤδ 13, которые подразумеваются данным изобретением. Используемый в данном документе термин белок коагуляции крови относится к любому Фактору IX (РК), Фактору УШ (РУШ), Фактору УПа (РУПа), Фактору фон Виллебранда (У^Р), Фактору РУ (РУ), Фактору X (РX), Фактору XII (РXΠ), тромбину (РН), белку С, белку δ, ίΡΑ, ΡΑΜ, тканевому фактору (ТФ) и протеазе ΑΌΑΜΤδ 13, которые проявляют биологическую активность, которая ассоциирована с такой активностью отдельного нативного белка коагуляции крови.
Каскад коагуляции крови разделяют на три отдельных сегмента: внутренний, внешний и общий механизмы ЛсНспопс с1 а1., Сигг Θρίη Нста1о1. 2004; 11:272-7). В каскад вовлекается группа ферментов сериновых протеаз (зимогенов) и белковых кофакторов. Если требуется, неактивный зимогенный предшественник превращается в активную форму, которая впоследствии превращается в следующий фермент каскада.
Для внутреннего механизма требуются факторы свертывания УШ, IX, X, XI и XII. Инициация внутреннего механизма происходит если прекалликреин, кининоген большой молекулярной массы, фактор XI (РXI) и фактор XII (РXΠ) взаимодействуют с отрицательно заряженной поверхостью. Также требуются секретируемые тромбоцитами ионы кальция и фосфолипиды.
Внешний механизм инициируется, если повреждается сосудистый просвет кровеносных сосудов. Выделяется гликопротеиновый тканевый фактор мембран и потом связывается с циркулирующим фактором УП (РУП) и с малым существующим количеством активной формы РУПа. Данное связывание облегчает полное превращение РУП в РУПа и, впоследствии, в присутствии кальция и фосфолипидов, превращение фактора IX (РIX) в фактор Ка (РКа) и фактора X (РX) в фактор Ха (РXа). Связывание РУПа с тканевым фактором усиливает протеолитическую активность путем перемещения сайтов связывания РУП на субстрат (РК и РX) в более близкое соседство и путем индуцирования конформационнного изменения, которое усиливает ферментную активность РУПа.
Активация РX является общей точкой этих двух механизмов. Вместе с фосфолипидом и кальцием факторы Уа (РУа) и Ха превращают протромбин в тромбин (комплекс протромбиназы), который потом расщепляет фибриноген с образованием мономеров фибрина. Эти мономеры полимеризуются с образованием фибриновых нитей. Фактор XΠIа (РXΠIа) ковалентно связывает эти нити дгуг с другом с образованием жесткой сетки.
Превращение РУП в РУПа также катализируется рядом протеаз, включая тромбин, РКа, РXа, фактор XIа (РXIа) и фактор XΠа (РXΠа). Для ингибирования ранней фазы каскада ингибитор механизма действия тканевого фактора взаимодействует с продуктом комплекса РУПа/тканевый фактор/Рха.
Фактор УПа
РУП (также известный как стабильный фактор или проконвертин) является гликопротеином зависимой от витамина К сериновой протеазы с ключевой ролью для гомеостаза и коагуляции (ЕщсиЬгок Сигг Ρτοίβίη Ρορί δ^. 2002; 3:287-99).
РУП синтезируется в печени и секретируется в виде одноцепочечного гликопротеина массой 48 кДа. РУП несет как все гликопротеины зависимых от витамина К сериновых протеаз структуру сходного белкового домена, содержащую аминоконцевой домен гамма-карбоксиглютаминовой кислоты (С1а) с 912 остатками, отвечающими за взаимодействие белка с липидными мембранами, карбоксиконцевой домен сериновой протеазы (каталитический домен) и два домена, подобные эпидермальному фактору роста, содержащие связывающий ион кальция сайт, который опосредует взаимодействие с тканевым фактором. Гамма-глутамилкарбоксилаза катализирует карбоксилирование остатков С1а на аминоконцевой части молекулы. Эта карбоксилаза для проявления своей активности зависима от восстановленной формы витамина К, который окисляется до эпоксидной формы. Эпоксидредуктаза витамина К необходима для обратного превращения эпоксидной формы витамина К в его восстановленную форму.
Основная часть РУП циркулирует в плазме в форме зимогена и активация этой формы приводит к расщеплению пептидной связи между аргинином 152 и изолейцином 153. Активированный в результате этого РУПа состоит из легкой цепи ΝΗΣ^ογπ (20 кДа) и тяжелой цепи СООН-концевой части (30 кДа) связанных посредством одной дисульфидной связи (Сук 135 к Сук 262). Легкая цепь содержит мембраносвязывающий домен С1а, в то время как тяжелая цепь содержит каталитический домен.
Концентрация в плазме РУЛ составляющая около 0,5 мг/мл определяется генетическими и внешни- 34 028186 ми факторами (Ρίηοΐίί е! а1., Βίοοά. 2000; 95:3423-8). Разные генотипы РУН могут приводить к отличиям в средних значениях концентраций РУН в несколько раз. Концентрации РУН в плазме повышаются во время беременности у здоровых женщин и также увеличиваются с возрастом и более высокие у женщин и у людей с гипертриглицеридемией. РУН имеет самый короткий период полувыведения из всех прокоагулянтных факторов (3-6 ч). Средняя концентрация в плазме РУНа у здоровых индивидов равна 3,6 нг/мл и период полувыведения РУНа при циркуляции по сравнению с другими факторами коагуляции относительно длительный (2,5 ч).
Наследственная недостаточность РУН является редким аутосомно-рецессивным нарушением, сопровождающимся повышенной кровоточивостьюс оцененной частотой распространения равной 1 случай на 500000 человек в общей популяции (ЛсЪагуа е! а1., 1 ТЪготЪ НаетокЪ 2004;2248-56). Приобретенная недостаточность РУН от действия ингибиторов также встречается очень редко. Сообщали также о случаях недостаточности, происходивших в связи с применением лекарств таких как цефалоспорины, пенициллины и пероральные антикоагулянты. Более того, сообщалось о приобретенной недостаточности РУН, которая происходила спонтанно или совмесно с другими состояниями, такими как миелома, сепсис, апластическая анемия, при лечении с помощью интерлейкина-2 и антитимоцитарного глобулина.
Эталонные полинуклеотидные и полипептидные последовательности включают, например, №№ доступа ОепВапк 102933 для геномной последовательности, М13232 для кДНК (Надеп е! а1. ΡΝΆδ 1986; 83: 2412-6) и Р08709 для полипептидной последовательности (включены в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки). Было описано множество видов полиморфизма РУН, например, см. статью 8аЪа1ег-Ь1еа1 е! а1. (Нит Сепе! 2006; 118:741-51) (включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки).
Фактор IX
Р1Х является зависимым от витамина К белком плазмы, который принимает участие во внутреннем механизме коагуляции крови путем превращения РХ в его активную форму в присутствии ионов кальция, фосфолипидов и РУШа. Доминирующая каталитическая способность Р1Х такая, как у сериновой протеазы, обладающей специфичностью к конкретной связи аргинина-изолейцина в молекуле РХ. Активация Р1Х происходит с помощью РХ1а, который вызывает удаление пептида активации из Р1Х, что приводит к получению активированной молекулы Р1Х, содержащей две цепи, удерживаемые одной или большим количеством дисульфидных связей. Дефекты Р1Х являются причиной рецессивной гемофилии В, сцепленной с хромосомой Х.
Гемофилия А и В являются наследственными заболеваниями, характеризующиеся недостаточностью, соответственно, полипептидов РУШ и Р1Х. Основная причина такой недостаточности часто является результатом мутаций генов РУ111 и Р1Х, оба из которых расположены на хромосоме Х. Традиционное лечение гемофилии часто включает внутривенное введение объединенной плазмы или частично очищенных белков коагуляции от здоровых индивидов. Эти препараты могут быть контаминированы патогенными агентами или вирусами, такими как инфекционные прионы, ВИЧ, парвовирус, гепатит А и гепатит С. Поэтому существует острая необходимость в лекарственных средствах, для которых не требуется использование сыворотки человека.
Уровень снижения активности Р1Х прямо пропорциональный тяжести гемофилии В. Существующее лечение гемофилии В включает замещение недостающего белка полученным из плазмы или рекомбинантным Р1Х (так называемое Р1Х-заместительное или замещающее лечение или терапия).
Полинуклеотидные и полипептидные последовательности Р1Х могут быть найдены, например, под № доступа итРго£КВ/§то88-Рго1 Р00740, пат. США № 6531298 и на фиг. 1 (8ЕО ГО ΝΟ: 1).
Фактор VIII
Фактор коагуляции УШ (РУ111) циркулирует в плазме в очень низкой концентрации и нековалентно связан с фактором фон Виллебранда (У^Р). При гемостазе РУШ отделяется от У\УР и действует как кофактор для активированного фактора 1Х (Р1Ха)-опосредованной активации РХ путем увеличения скорости активации в присутствии кальция и фосфолипидов или клеточных мембран.
РУШ синтезируется в виде одноцепочечного предшественника массой приблизительно 270-330 кДа с доменной структурой А1-А2-В-А3-С1-С2. Выделенный из плазмы (например, полученный из плазмы или плазматический), РУШ состоит из тяжелой цепи (А1-А2-В) и легкой цепи (А3-С1-С2). Молекулярная масса легкой цепи равна 80 кДа, тогда как из-за протеолиза домена В масса тяжелой цепи находится в диапазоне 90-220 кДа.
РУШ также синтезируется как рекомбинантный белок для терапевтического применения при нарушениях, сопровождающихся повышенной кровоточивостью. Были разработаны различные анализы ίη уйго для определения потенциальной эффективности рекомбинантных РУШ (гРУШ) как лекарственных препаратов. Эти анализы имитируют действие эндогенного РУШ ίη У1уо. Как определено при анализах ίη уйго, обработка тромбином РУШ ίη уПго приводит к быстрому увеличению и последующему снижению его прокоагулирующей активности. Эта активация и инактивация совпадают со специфическим ограниченным протеолизом обоих тяжелой и легкой цепей, что изменяет доступность разных связывающих эпитопов РУШ, например, допуская диссоциацию РУШ от У\УР и связывание с фосфолипидной поверхностью или изменяя связывающую способность с определенными моноклональными антителами.
- 35 028186
Недостаток или дисфункцию РУШ связывают с наиболее частым нарушением, сопровождающимся повышенной кровоточивостью - гемофилией А. Методом выбора лечения гемофилии А является заместительная терапия полученным из плазмы или концентратами гРУШ. Пациенты с тяжелой гемофилией А с уровнями РУШ ниже 1 % обычно находятся на профилактическом лечении с целью поддержания уровня РУШ между введением доз препаратов выше 1%. Принимая во внимание средние периоды полувыведения разных препаратов РУШ при циркуляции, этот результат обычно можно достичь введением РУШ два-три раза в неделю.
Эталонные полинуклеотидные и полипептидные последовательности включают, например, ИтРго1КВ/§№188-Рго1 Р00451 (РА8_НиМАК); СйзсЫег 1ю е( а1., СНагас(еп/а(юп оГ (Не Нитап Рас!ог УШ депе, ЫаШге, 312(5992): 326-30 (1984); УеНаг СН е( а1., 81гис1иге оГ Нитап Рас(ог УШ, Ыа1иге, 312(5992):337-42 (1984); ТНотрзоп АК. 8(гис(иге апй РипсИоп оГ (Не Рас(ог УШ депе апй рго!ет, 8етт ТНготЬ Нетозг 2003:29;11-29 (2002).
Фактор фон Виллебранда
Фактор фон Виллебранда (У^Р) представляет собой гликопротеин, циркулирующий в плазме в виде множества мультимеров в диапазоне размеров от около 500 до 20000 кДа. Мультимерные формы У^Р состоят из полипептидных субъединиц массой 250 кДа, связанных вместе дисульфидными связями. У^Р опосредует начальную адгезию тромбоцитов на субэндотелии поврежденных стенок сосудов. Гемостатическое действие проявляют только мультимеры большего размера. Предполагается, что эндотелиальные клетки секретируют большие полимерные формы У^Р, а те формы У^Р, которые имеют низкую молекулярную массу (У^Р с низкой молекулярной массой) получаются при протеолитическом расщеплении. Мультимеры, обладающие большими молекулярными массами, накапливаются в тельцах Вейбеля-Паладе эндотелиальных клеток и высвобождаются при стимуляции.
У^Р синтезируется эндотелиальными клетками и мегакариоцитами в виде препро-У^Р, который в значительной степени состоит из повторяющихся доменов. После отщепления сигнального пептида проУ^Р димеризуется при участии дисульфидных связей С-концевого участка. Эти димеры служат протомерами для мультимеризации, которая регулируется дисульфидными связями между свободными концевыми участками. После сборки мультимеров следует протеолитическое удаление пропептидной последовательности (Ьеу!е е( а1., ВюсНет. I. 274 (1991), 257-261).
Первичный продукт трансляции, найденный в клонированной кДНК У^Р, представлен полипептидом-предшественником из 2813 остатков (препро-У^Р). Препро-У^Р состоит из сигнального пептида из 22 аминокислот и пропептида из 741 аминокислоты, дополняющий зрелый белок У^Р, состоящий из 2050 аминокислот (Киддеп Ζ.Λ. апй ^аге, I., РА8ЕВ I., 308-316 (1993).
Дефекты У^Р являются причиной болезни Виллебранда (У^Б), которая характеризуется более или менее выраженным клиническим проявлением кровотечений. У^Б 3 типа является наиболее тяжелой формой болезни, при которой У^Р полностью отсутствует, а У^Б 1 типа относится к количественной потере У^Р и ее клиническое провление может быть очень легким. У^Б 2 типа относится к количественной нехватке У^Р и может иметь такое же тяжелое течение, как У^Б 3 типа. У^Б 2 типа обладает многими подформами, некоторые ассоциируются с потерей или снижением количества мультимеров с высокой молекулярной массой. Болезнь Виллебранда типа 2а (У^Б-2А) характеризуется потерей как промежуточных так и больших мультимеров. У^Б-2В характеризуется потерей мультимеров с самой большой молекулярной массой. В этой области известны другие заболевания и нарушения, связанные с У^Р.
Полинуклеотидные и аминокислотные последовательности препро-У^Р доступны, соответственно, под №№ доступа СепВапк ΝΜ_000552 и ΝΈ_000543.
Другие белки коагуляции крови, соответствующие настоящему изобретению, описаны в этой области, например, в статье Мапп КС, ТНготЬ Наетозр 1999;82:165-74.
А. Полипептиды
В одном аспекте изобретения исходным веществом настоящего изобретения является белок или полипептид. В данном документе считается, что термин терапевтический белок относится к любой молекуле терапевтического белка, которая проявляет биологическую активность, связанную с этим терапевтическим белком. В одном варианте реализации изобретения молекула терапевтического белка является полноразмерным белком.
Рассматриваемые молекулы терапевтических белков включают: полноразмерные белки, предшественники полноразмерных белков, биологически активные субъединицы или фрагменты полноразмерных белков, а также биологически активные производные и варианты любой из этих форм терапевтических белков. Таким образом, терапевтический белок включает те белки, которые: (1) имеют аминокислотную последовательность, которая обладает более чем около 60%, около 65%, около 70%, около 75%, около 80%, около 85%, около 90%, около 91%, около 92%, около 93%, около 94%, около 95%, около 96%, около 97%, около 98% или около 99% или больше идентичности аминокислотной последовательности на участке из по меньшей мере около 25, около 50, около 100, около 200, около 300, около 400 или более аминокислот к полипептиду, кодированному эталонной нуклеиновой кислотой или аминокислотной последовательностью, описанной в данном документе; и/или (2) специфично связываются с антителами,
- 36 028186 например, поликлональными или моноклональными антителами, синтезируемым против иммуногена, содержащего эталонную аминокислотную последовательность, описанную в данном документе, ее иммуногенный фрагмент и/или ее консервативно модифицированный вариант.
Согласно настоящему изобретению термин рекомбинантный терапевтический белок включает любой терапевтический белок, полученный с помощью технологии рекомбинантных ДНК. В определенных вариантах реализации изобретения это термин охватывает белки, которые описаны в данном документе.
В данном документе считается, что эндогенный терапевтический белок включает терапевтический белок, который происходит из организма предполагающего получение лечения млекопитающего. Этот термин также включает терапевтический белок, транскрибируемый с трансгена или любой другой чужеродной ДНК, представленной в указанном млекопитающем. В данном документе считается, что экзогенный терапевтический белок включает белок коагуляции крови, который не происходит из организма предполагающего получение лечения млекопитающего.
В данном документе считается, что термин полученный из плазмы белок коагуляции крови или плазматический белок, включает все формы этого белка, найденные в крови, полученной из организма млекопитающего, обладающие свойством участия в механизме коагуляции.
В данном документе считается, что термин биологически активное производное или биологически активный вариант включает любое производное или вариант молекулы, имеющей практически такие же функциональные и/или биологические свойства указанной молекулы, такие как свойства связывания, и/или такую же структурную основу, как пептидный остов или основная полимерная единица.
Термин аналог, также как вариант и производное, представляет практически подобное по структуре соединение и обладающее такой же биологической активностью, что и встречающаяся в природе молекула, хотя в определенных случаях несколько отличающееся от нее,. К примеру, вариант полипептида относится к полипептиду, разделяющему практически подобную структуру и обладающему такой же биологической активностью, как и эталонный полипептид. Варианты или аналоги в композиции их аминокислотных последовательностей по сравнению с встречающимся в природе полипептидом, от которого происходит этот аналог, основаны на одной или более мутациях, включая: (ί) делецию одного или большего количества аминокислотных остатков на одном или более концах полипептида и/или одном или более внутренних участках встречающейся в природе последовательности полипептида (например, фрагментов), (ίί) инсерцию или добавление одной или более аминокислот на одном и более концах (обычно добавление или слияние) полипептида и/или одного или более внутренних участков (обычно инсерция) встречающейся в природе последовательности полипептида или (ίίί) замену одной или более аминокислот другими аминокислотами в последовательности встречающего в природе полипептида. В качестве примера, производное представляет тип аналога и относится к полипептиду, разделяющему такую же или в основном подобную структуру эталонного полипептида, который модифицировали, например, химически.
Вариант полипептида является типом аналога полипептида и включает варианты инсерций, в которых один или более аминокислотных остатков добавлены к аминокислотной последовательности терапевтического белка данного изобретения. Инсерции могут располагаться на одном или на обоих концах белка и/или могут быть расположены в пределах внутренних участков аминокислотной последовательности терапевтического белка. Варианты инсерций с дополнительными остатками на любом или на обоих концах включают к примеру, белки слияния и белки, содержащие аминокислотные маркеры или другие аминокислотные метки. В одном аспекте изобретения молекула белка коагуляции крови необязательно содержит Ν-концевой Ме!, особенно, когда молекула экспрессируется рекомбинантно в бактериальной клетке, такой как Е. тоП.
В вариантах с делециями один или более аминокислотных остатков в полипептиде терапевтического белка, который описан в данном документе, удалены. Делеции могут быть реализованы на одном или обоих концах полипептида терапевтического белка и/или с удалением одного или более остатков в пределах аминокислотной последовательности терапевтического белка. Поэтому варианты с делециями включают фрагменты последовательности полипептида терапевтического белка.
В вариантах с заменами один или более аминокислотных остатков полипептида терапевтического белка удалены и замещены альтернативными остатками. В одном аспекте изобретения замены являются консервативными по природе, и консервативные замены такого вида хорошо известны в этой области знаний. Альтернативно, данное изобретение охватывает замены, которые также являются неконсервативными. Типичные консервативные замены описаны в издании ЬеЬтпдег, [ВюсЬет15!гу, 2-е издание; \νοΠΐι РиЫ15Ьег5, 1пс., №\ν Υοι1< (1975), стр. 71-77] и изложены непосредственно ниже.
- 37 028186
Консервативные замены
Свойство боковых Аминокислота цепей
A. Алифатические
B. Ароматические
C. Содержащие серу ϋ. Пограничные
Незаряженные полярные:
A. Гидроксил
B. Амиды
C. Сульфгидрил ϋ. Пограничные
Положительно заряженные (основные)
АЫ УР ργν
Μ о
5Т Υ
N0
С
О
КЕ.Н
Отрицательно заряженные ϋ Е (кислые)
Кроме того, типичные консервативные замены изложены непосредственно ниже.
Консервативные замены II
ОРИГИНАЛЬНЫЙ ОСТАТОК ТИПИЧНАЯ ЗАМЕНА
А1а (А) \'а1. Ьеи, Не
Аг§ (К) Ьуз, О1п, Αδη
Α&η (Ν) С1п, Пи, Ьуз, Аге
А&р (О) С1и
Сук (С) 5ег
О1п (<2) Αδη
О1и (Е) Аар
Ηίδ (Н) Αδη, О1п, Ьуз, Аге
Не (I) Ьеи, Уа1, Мее, А1а, Ρΐιΰ,
Ьеи (Ь) Не, Уа1, Мее, А1а, РЬе
Ьуй (К) Лее, О1п. Азп
Мее (М) Ьеи, РНе, Не
РЬе (р) Ьеи, Уа1, Не, А1а
Рго (Р) О1у
Зег (8) ТЬг
Пи (Т) Зег
Тгр <\У| Туг
Туг (Υ) Тгр, РЬе, ТЬг. Зег
Уа1 (V) Не, Ьеи, Мее, РЬе, А1а
В. Полинуклеотид
Нуклеиновые кислоты, кодирующие терапевтический белок данного изобретения включают, к примеру и без ограничения: гены, пре-мРНК, мРНК, кДНК, полиморфные варианты, аллельные, синтетические и встречающиеся в природе мутанты.
Полинуклеотиды, кодирующие терапевтический белок данного изобретения, также включают, без ограничения такие, которые: (1) специфически гибридизуются в жестких условиях гибридизации с нуклеиновой кислотой, кодирующей эталонную аминокислотную последовательность как описано в данном документе, и ее консервативно модифицированные варианты; (2) имеют последовательность нуклеиновой кислоты, которая обладает более чем около 95, около 96, около 97, около 98, около 99% или более идентичности нуклеотидной последовательности на участке из по меньшей мере около 25, около 50, около 100, около 150, около 200, около 250, около 500, около 1000 или более нуклеотидов (вплоть до полноразмерной последовательности из 1218 нуклеотидов зрелого белка) к эталонной последовательности
- 38 028186 нуклеиновой кислоты, как описано в данном документе. Типичные жесткие условия гибридизации включают гибридизацию при 42°С в 50% формамиде, 5Х 88С (цитратно-солевой раствор), 20 мМ Ν;·ι·ΡΘ4, рН 6,8 и промывку в 1Х 88С при 55°С в течение 30 мин. Само собой разумеется, что основываясь на длине и содержании нуклеотидов СС последовательностей, которые должны гибридизироваться, может проводиться вариация этих типичных условий. Для определения подходящих условий гибридизации предназначены стандартные формулы в этой области. См. книгу 8атЬгоок с1 а1., Мо1еси1аг С1отп§: А ЬаЬогаФгу Мапиа1 (8есопй ей., Со1й 8рппд НагЬог ЬаЬогаФгу Рге88, 1989) §§ 9.47-9.51.
Встречающуюся в природе последовательность полинуклеотида или полипептида обычно получают из организма млекопитающего, включая, но не ограничиваясь приматом, например, человеком; грызуном, например крысой, мышью, хомяком; коровой, свиньей, лошадью, овцой и любым млекопитающим. Нуклеиновые кислоты и белки этого изобретения могут быть рекомбинантными молекулами (например, гетерологическими и кодирующими последовательность дикого типа или ее вариант или не встречающимися в природе).
С. Получение терапевтических белков
Получение терапевтических белков включает любой способ, известный в этой области: (ί) получение рекомбинантной ДНК методом генетической инженерии, (ίί) введение рекомбинантной ДНК в прокариотические или эукариотические клетки с помощью, к примеру и без ограничения, трансфекции, электропорации или микроинъекции, (ίίί) культивирование указанных трансформированных клеток, (ίν) экспрессия терапевтического белка, например конституитивно или при индукции, и (ν) выделение указанного белка коагуляции крови, например из культуральной среды или путем сбора трансформированных клеток для того, чтобы получить очищенный терапевтический белок.
В других аспектах изобретения терапевтический белок получают экспрессией в подходящей прокариотической или эукариотической системе хозяина, способной продуцировать фармакологически приемлемую молекулу белка коагуляции крови. Примерами эукариотических клеток являются клетки млекопитающих такие как: СНО, СО8, НЕК 293, ВНК, 8К-Нер и НерС2.
Для получения терапевтического белка используется большое разнообразие векторов и они выбираются из эукариотических и прокариотических векторов экспрессии. Примеры векторов для прокариотической экспрессии включают плазмиды такие как и без ограничения: рК8ЕТ, рЕТ и рВАЭ, в которых промоторы, используемые в векторах прокариотической экспрессии, включают один или более таких и без ограничения: 1ас, 1гс, 1гр, гесА или агаВАЭ. Примеры векторов для эукариотической экспрессии включают: (ί) для экспрессии в дрожжах, векторы такие как и без ограничения рАО, рРЮ, рΥЕ8 или рМЕТ, используя промоторы такие как и без ограничения АОХ1, САР, САЬ1 или АИС1; (ίί) для экспрессии в клетках насекомых, векторы такие как и без ограничения рМТ, рАс5, рГВ, рМГВ или рВАС, используя промоторы такие как и без ограничения РН, р10, МТ, Ас5, ОрШ2, др64 или роШ, и (ίίί) для экспрессии в клетках млекопитающих, векторы такие как и без ограничения р8УЪ, рСМУ, рРс/Р8У, рс^NА3 или рВРУ, и векторы, полученные из, в одном аспекте изобретения, вирусных систем таких как и без ограничения вируса осповакцины, аденоассоциированные вирусы, герпес-вирусы или ретровирусы, используя промоторы такие как и без ограничения СМУ, 8У40, ЕР-1, ЦЬС, К8У, АЭУ, ВРУ и β-актин.
Ό. Введение
В одном варианте реализации конъюгированный терапевтический белок настоящего изобретения может вводиться с помощью инъекции, такой как внутривенная, внутримышечная или внутрибрюшинная инъекция.
Для введения композиции, содержащей конъюгированный терапевтический белок настоящего избретения человеку или подопытному животному, в одном аспекте композиция содержит один и более фармацевтически приемлемых носителей. Термины фармацевтически или фармакологически приемлемый относятся к молекулярным объектам и композициям, которые стабильны, ингибируют деградацию белков, такую как аггрегация и расщепление препаратов, и, кроме того, не вызывают аллергических или других нежелательных реакций при введении путями, широко известными в этой области, как описано ниже. Фармацевтически приемлемые носители включают любые и все применяемые в клинической практике растворители, диспергирующие среды, покрытия, противомикробные и противогрибковые агенты, изотонические вещества и агенты, замедляющие абсорбцию и им подобные, включая агенты, раскрытые выше.
В данном документе считается, что термин эффективное количество обозначает дозу, подходящую для лечения заболевания или нарушения, или облегчения симптома заболевания или нарушения. В одном варианте реализации термин эффективное количество обозначает дозу, подходящую для лечения млекопитающего, страдающего нарушением, сопровождающимся повышенной кровоточивостью, описанным в данном документе.
Такие композиции могут вводиться перорально, местно, трансдермально, парентерально, с помощью ингаляционного спрея, вагинально, ректально или с помощью внутричерепной инъекции. Термин парентеральный, как используется в данном документе, включает подкожные инъекции, внутривенную, внутримышечную, интрацистернальную инъекцию или процедуру инфузии. Также это подразуме- 39 028186 вает введение внутривенной, внутрикожной, внутримышечной, интрамаммарной, внутрибрюшинной, интратекальной, ретробульбарной, внутрилегочной инъекцией и/или хирургическим имплантированием в конкретное место. Обычно композиции преимущественно свободны от пирогенов, а также от других примесей, которые могут быть опасными для реципиента.
Однократное или многократные введения композиций могут проводиться на уровне доз и по схеме, выбранными лечащим врачом. Для предупреждения или лечения заболевания подходящая доза будет зависеть от типа заболевания, требующего лечения, как описано выше, тяжести и течения заболевания, от того, применяется ли это лекарство с профилактическими или терапевтическими целями, предыдущего лечения, истории болезни пациента и реакции на это лекарство и, усмотрения штатного врача.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество конъюгированного терапевтического белка, как определено в данном документе. Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель, растворитель, соль, буферное или вспомогательное вещество. Фармацевтическая композиция может применяться для лечения определенных выше нарушений, сопровождающихся повышенной кровоточивостью. Фармацевтическая композиция данного изобретения может быть раствором или лиофилизованным препаратом. Растворы этой фармацевтической композиции могут быть подвергнуты любому подходящему процессу лиофилизации.
В качестве дополнительного аспекта изобретение включает наборы, которые содержат композицию данного изобретения, упакованную способом, который облегчает ее использование для введения субъектам. В одном варианте реализации изобретения такой набор включает вещество или композицию, описанные в данном документе (например, композиция, содержащая конъюгированный терапевтический белок), упакованные в контейнер, такой как закрытый флакон или сосуд с этикеткой, прикрепленной к контейнеру или помещенной в упаковку, которая описывает применение вещества или композиции при практической реализации этого способа изобретения. В одном варианте реализации изобретения этот набор содержит первый контейнер с композицией, содержащей конъюгированный терапевтический белок и второй контейнер с физиологически приемлемым восстанавливающим раствором для композиции в первом контейнере. В одном аспекте изобретения вещество или композиция упакованы в форме одноразовой дозы. Набор может дополнительно включать устройство, пригодное для введения композиции в соответствии со специфическим путем введения. Предпочтительно, чтобы набор содержал этикетку, которая описывает применение терапевтического белка или пептидной композиции.
Водорастворимые полимеры
В одном аспекте изобретения предложена производная молекула терапевтического белка (например, конъюгированный терапевтический белок), связывающаяся с водорастворимым полимером, включающим, но не ограничивающимся полиэтиленгликолем (ПЭГ), разветленным ПЭГ, полисиаловой кислотой (ПСК), гидроксиалкилкрахмалом (ГАК), гидроксилэтилкрахмалом (ГЭК), углеводом, полисахаридами, пуллуланом, хитозаном, гиалуроновой кислотой, хондроитинсульфатом, дерматансульфатом, крахмалом, декстраном, карбоксиметилдекстраном, полиалкиленоксидом (ПАО), полиалкиленгликолем (ПАГ), полипропиленгликолем (ППГ), полиоксазолином, полиакрилоилморфолином, поливиниловым спиртом (ПВС), поликарбоксилатом, поливинилпирролидоном, полифосфазеном, полиоксазолином, сополимером полиэтилена-ангидрида малеиновой кислоты, сополимером полистирола-ангидрида малеиновой кислоты, поли(1-гидроксиметилэтилен-гидроксиметилформалем) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'этилтриметиламмония фосфатом (МФК). В одном варианте реализации изобретения водорастворимый полимер состоит из молекул сиаловой кислоты, имеющий молекулярную массу в диапазоне 350-120000, 500-100000, 1000-80000, 1500-60000, 2000-45000 Да, 3000-35000 Да и 5000-25000 Да. Связывание водорастворимого полимера может быть проведено прямым связыванием с белком или посредством линкерных молекул. Одним из примеров химического линкера является ГМФМ (гидразид 4-[4-Νмалеимидофенил]масляной кислоты ), содержащий углевод-селективный гидразид и сульфгидрильно реакционно-способную малеинимидную группу (СЬато\у с1 а1., 1 ΒίοΙ СЬет 1992;267:15916-22). Другие типичные и предпочтительные линкеры описаны ниже.
В одном варианте реализации производное сохраняет полную функциональную активность препаратов нативного терапевтического белка и обеспечивает пролонгированный период полувыведения ίη νίνο по сравнению с препаратами нативного терапевтического белка. В другом варианте реализации производное сохраняет по меньшей мере 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44. 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56,57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140 или 150 процентов (%) биологической активности по отношению к нативному белку коагуляции крови. В родственном аспекте изобретения биологическое действие производного и нативного белка коагуляции крови определяют по степени хромогенной активности к величине антигенности фактора коагуляции крови (фактор коагуляции крови:Хрм: фактор коагуляции крови:Аг). В еще одном варианте реализации изобретения период полувыведения конструкции снижен или увеличен в 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, или в 10 раз по отношению к периоду полувыведения ίη νίνο нативного терапевтического белка.
- 40 028186
А. Сиаловая кислота и ПСК
ПСК состоят из полимеров (обычно гомополимеров) Ν-ацетилнейраминовой кислоты. Вторичная аминогруппа обычно несет ацетильную группу, но вместо нее может нести гликолильную группу. Возможные заместители гидроксильных групп включают ацетильную, лактильную, этильную, сульфатную и фосфатную группы.
Структура сиаловой кислоты (Ν-ацетилнейраминовой кислоты)
ПСК и мПСК обычно включают линейные полимеры, состоящие в основном из фрагментов Νацетилнейраминовой кислоты связанных 2,8- или 2,9-гликозидными связями или их комбинациями (например, чередующимися 2,8- и 2,9-связями). В частности, для ПСК и мПСК предпочтительными являются гликозидные связи α-2,8. Такие ПСК и мПСК удобно получают из коломиновых кислот, которые называются в данном документе как КК и мКК. Обычные ПСК и мПСК содержат по меньшей мере 2, предпочтительно по меньшей мере 5, предпочтительнее по меньшей мере 10 и предпочтительнее всего по меньшей мере 20 фрагментов К-ацетилнейраминовой кислоты. Таким образом, они могут содержать от 2 до 300 фрагментов Ν-ацетилнейраминовой кислоты, предпочтительно от 5 до 200 фрагментов Νацетилнейраминовой кислоты или предпочтительнее всего от 10 до 100 фрагментов Νацетилнейраминовой кислоты. ПСК и мПСК преимущественно в основном свободны от компонентов Сахаров отличных от Ν-ацетилнейраминовой кислоты. Поэтому ПСК и КК предпочтительно содержат по меньшей мере 90 %, предпочтительнее по меньшей мере 95% и предпочтительнее всего по меньшей мере 98% фрагментов Ν-ацетилнейраминовой кислоты.
Когда ПСК и КК содержат фрагменты, отличные от Ν-ацетилнейраминовой кислоты (как, например, в мПСК и мКК), то они преимущественно расположены на одном или обоих концах полимерной цепи. Такие другие фрагменты могут, к примеру, быть фрагментами, полученными из концевых фрагментов Ν-ацетилнейраминовой кислоты при окислении или восстановлении.
Например, в публикации ^О-А-0187922 описываются такие мПСК и мКК, в которых невосстанавливающий остаток концевой Ν-ацетилнейраминовой кислоты превращают в альдегидную группу при реакции с перйодатом натрия. Кроме того, в публикации ^О 2005/016974 описываются такие мПСК и мКК, в которых восстанавливающий остаток концевой Ν-ацетилнейраминовой кислоты подвергают восстановлению до уменьшенного открытого кольца на восстанавливающем остатке концевой Νацетилнейраминовой кислоты, при этом образуется вицинальная диольная группа, с последующим окислением для превращения вицинальной диольной группы в альдегидную группу.
Богатые сиаловой кислотой гликопротеины связывают селектин в организме человека и других организмах. Они играют важную роль в организме человека при инфекциях гриппа. Например, сиаловая кислота может скрывать маннозные антигены от маннозосвязывающего лектина на поверхности клетокхозяев или бактерий. Это предупреждает активацию комплемента. Сиаловые кислоты также скрывают предпоследний остаток галактозы, тем самым предупреждая быстрое выведение этого гликопротеина рецептором галактозы паренхимальных клеток печени.
Структура коломиновой кислоты (гомополимер ^ацетилнейраминовой кислоты)
Коломиновые кислоты (подкласс ПСК) представляют собой гомополимеры Ν-ацетилнейраминовой кислоты (НАНК) с α (2^8) кетозидной связью и синтезируются, в частности, отдельными штаммами ЕзсйепсЫа сой, несущими антиген К1. Коломиновые кислоты обладают многими физиологическими функциями. Они важны в качестве сырья для производства лекарственных и косметических средств.
Сравнительные исследования ίη νίνο с полисиалированной и немодифицированной аспарагиназой выявили, что полисиалирование увеличивает период полувыведения данного фермента (Регпапдез апд Оге§опа<Й8. ВюсЫшюа ВюрНузюа Ас1а 1341: 26-34, 1997).
В данном документе считается, что термин фрагменты сиаловых кислот включает мономеры мономеры и полимеры сиаловой кислоты (полисахариды), которые растворимы в водном растворе или суспензии и обладают небольшим или не обладают вредным воздействием, таким как побочные эффекты, у млекопитающих при введении конъюгата ПСК-белок коагуляции крови в фармацевтически эффек- 41 028186 тивном количестве. Эти полимеры характеризуются, в одном аспекте, как содержащие 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 или 500 остатков сиаловых кислот. В определенных аспектах различные остатки сиаловых кислот соединяются в цепь.
В одном варианте реализации изобретения часть сиаловой кислоты полисахаридного соединения является сильно гидрофильной и в другом варианте реализации целое соединение является сильно гидрофильным. Гидрофильность сообщается, главным образом, выступающими карбоксильными группами остатков сиаловой кислоты, а также гидроксильными группами. Остаток сахарида может содержать другие функциональные группы такие как: аминная, гидроксильная или сульфатная группы или их комбинации. Эти группы могут присутствовать на встречающихся в природе соединениях сахаридов или вводиться в производные полисахаридные соединения.
Встречающийся в природе полимер ПСК доступен в виде полидисперсного препарата, демонстрирующего широкое распределение размеров молекул (например, 5>фта С-5762) и высокую полидисперсность (ПД). Благодаря тому, что полисахариды обычно синтезируются в бактериях, несущих неотъемлемый риск совместно выделяемых эндотоксинов, очистка длинных полимерных цепей сиаловой кислоты может повысить вероятность увеличенного содержания эндотоксинов. Короткие молекулы ПСК с 1-4 остатками сиаловой кислоты также могут быть получены синтетическим путем (Капд δΗ с1 а1., Сйет Соттип. 2000;227-8; Ке88 ΌΚ апб Ыпйагб! КЕ СиггеШ Огдаше 8уп1йе818. 2004; 1:31-46), при этом минимизируется риск получения высоких концентраций эндотоксинов. Несмотря на это, в данное времы могут производиться препараты ПСК с узким распределением размеров молекул и низкой полидисперсностью, которые также свободны от эндотоксинов. Полисахаридные соединения специального применения для данного изобретения, в одном аспекте, синтезируются бактериями. Некоторые из этих встречающихся в природе полисахаридов известны как гликолипиды. В одном варианте реализации полисахаридные соединения практически свободны от концевых остатков галактозы.
В. Полиэтиленгликоль (ПЭГ) и пэгилирование
В определенных аспектах изобретения терапевтические белки конъюгированы с водорастворимым полимером с помощью любого из многообразных химических методов (КоЪей8 6М е1 а1., Абуап Эгид ОеПуегу Кеу 2002;54:459-76). Например, в одном варианте реализации изобретения терапевтический белок модифицируется конъюгацией ПЭГ со свободными аминогруппами белка с использованием Νгидроксисукцинимидных (ΝΗδ) сложных эфиров. В другом варианте реализации изобретения водорастворимый полимер, к примеру ПЭГ, связывается со свободными δΗ-группами, с использованием методов малеинимидной химии или с помощью связывания ПЭГ-гидразидов или ПЭГ-аминов с остатками углеводов терапевтических белков после предварительного окисления.
Конъюгация в одном аспекте изобретения проводится прямым связыванием (или связыванием через линкерные системы) водорастворимого полимера с терапевтическим белком с образованием стабильных связей. Дополнительно в определенных аспектах настоящего изобретения используются способные к разрушению, высвобождению и гидролизу линкерные системы (Т8иЪегу е1 а1. ί ΒίοΙ Сйет 2004; 279:38118-24/Отееп№а1б е1 а1., б Меб Сйет 1999; 42:3657-67/2йао е1 а1., Вюсои) Сйет 2006; 17:341-51/^0 2006/138572А2/И8 7259224В2/И8 7060259 В2).
В одном варианте реализации изобретения терапевтический белок модифицируют по лизиновым остаткам путем использования производных полиэтиленгликоля, содержащих активный Νгидроксисукцинимидный эфир (ΝΗδ), такой как сукцинимидилсукцинат, сукцинимидилглутарат или сукцинимидилпропионат. Эти производные реагируют с лизиновыми остатками терапевтического белка в мягких условиях с образованием стабильной амидной связи. В одном варианте реализации изобретения длина цепи производного ПЭГ равна 5000 Да. Другие производные ПЭГ с длиной цепей 500-2000 Да, 2000-5000 Да, больше чем 5000 вплоть до 10000 Да, или больше чем 10000 вплоть до 20000 Да, или больше чем 20000 вплоть до 150000 Да используются в разных вариантах реализации, включая линейные и разветвленные структуры.
Альтернативные способы для ПЭГилирования аминогрупп являются, без ограничения, такими как химическая конъюгация с карбонатами ПЭГ с образованием уретановых связей или реакция с альдегидами и кетонами методом восстановительного аминирования с образованием вторичных амидных связей.
В одном варианте реализации настоящего изобретения молекула терапевтического белка химически модифицируется с применением производных ПЭГ, которые коммерчески доступны. Эти призводные ПЭГ в альтернативных аспектах изобретения имеют линейные или разветвленные структуры. Примеры ПЭГ-производных, содержащих группы ΝΗδ, перечислены ниже.
Следующие производные ПЭГ являются неограничивающими примерами коммерчески доступных производных компании №1<1аг Тйетареийс8 (Нип18\а11е. А1а.; см. каталог реагентов \у\у\у.пек1аг.сот/РЕС;
прайс-лист №к!ат Абуапсеб РЕОу1абюп, 2005-2006): мПЭГ-сукцинимидилпропионат (мПЭГ-СПК)
- 42 028186
мПЭГ -сукцинимидил-а-метилбутаноат (мПЭГ-СМБ)
мПЭГ -КМ-ГМК-ΝΗδ (КМ=карбоксиметил; ГМК=гидроксимасляная кислота)
Структура разветвленных производных ПЭГ (№к1аг Ткегареийск): разветвленный ПЭГ-Νгидроксисукцинимид (мПЭΓ2-NΗ§)
Этот реагент с разветвленной структурой более подробно описан автором Κοζ1ο\ν5ΐ<ί е1 а1. (ΒίοΌπίβδ 2001;5:419-29).
Другие неограничивающие примеры производных ПЭГ коммерчески доступны в компании ΝΘΡ Согрогайои (Токуо, .Гараи; см. сайт \у\у\у.поГ.со.)р/епдН5к: Каталог 2005)
Общая структура линейных производных ПЭГ (ΝΘΡ Согр.):
мПЭГ сукцинимидилглутарат
Структуры разветвленных ПЭГ-производных (ΝΘΡ Согр.): 2,3-бис(метилполиоксиэтилен-окси)-1(1,5-диоксо-5-сукцинимидилокси, пентилокси)пропан
- 43 028186
2,3-бис(метилполиоксиэтилен-окси)-1-(сукцинимидилкарбоксипентилокси)пропан
-(ОСН2-СН2),—о—сн2
НзС-(ОСНг-СН2)4—о—сн
СН2—О—СНгСНгСНгСН^СН!—С—О—N о
Эти производные пропана представляют глицериновый остов со схемой замещения 1,2. В настоящем изобретении также предусмотрены разветвленные производные ПЭГ основанные на структурах глицерина с замещением 1,3 или другими разветвленными структурами, описанными в патенте США 2003/0143596А1.
Также предусмотрены производные ПЭГ со способными к деградации (например, способные к гидролизу) линкерами, описанные в публикациях ΤκιΛογυ с1 а1. (1 Βίο1 СЬет 2004;279:38118-24) и δΗβΛίβΓ с1 а1. (№О 04089280Α3).
Удивительно, что ПЭГилированный терапевтический белок этого изобретения проявляет функциональную активность, сочетающую пролонгированный период полувыведения ίη νίνο. Кроме того, ПЭГилированный гРУШ, РУПа, РК или другой фактор коагуляции крови по-видимому более устойчивый к инактивации тромбином.
С. Гидроксиалкилкрахмал (ГАК) и гидроксилэтилкрахмал (ГЭК)
В разных вариантах реализации настоящего изобретения молекулу терапевтического белка химически модифицируют, используя гидроксиалкилкрахмал (ГАК) или гидроксилэтилкрахмал (ГЭК) или их производные.
ГЭК является производным встречающегося в природе амилопектина и расщепляется в организме альфа-амилазой. ГЭК представляет собой замещенное производное углеводного полимера амилопектина, который присутствует в кукурузном крахмале в концентрации вплоть до 95 мас.%. ГЭК проявляет полезные биологические свойства и применяется как агент замещения объема крови и при гемодилюционной терапии в клинике (Ьоттегтеуег е1 а1., 1987, КгапкепЬаикрЬагта71е, 8 (8), 271-278; и \Уе101ег е1 а1., 1991, Кек. д 419 494-498).
Амилопектин состоит из фрагментов глюкозы, причем в основной цепи присутствуют альфа-1,4гликозидные связи, а в местах разветвлений найдены альфа-1,6-гликозидные связи. Физико-химические свойства этой молекулы в основном определены типом гликозидных связей. Благодаря изгибу альфа-1,4гликозидной связи получаются спиральные структуры с около шестью мономерами глюкозы на один виток. Физико-химические, а также биохимические свойства этого полимера могут быть модифицированы с помощью замещения. Введение гидроксиэтильной группы может быть достигнуто посредством щелочного гидроксиэтилирования. Подбором условий реакции можно использовать разную реакционную способность соответствующей гидроксигруппы в незамещенном мономере глюкозы в отношении гидроксиэтилирования. Понимая этот факт, специалист способен влиять на схему замещения в ограниченном масштабе.
ГАК относится к производному крахмала, в котором есть замещение по меньшей мере одной гидроксиалкильной группой. Поэтому термин гидроксиалкилкрахмал не ограничен соединениями, в которых концевые углеводные фрагменты содержат гидроксиалкильные группы К1, К2 и/или К3, но также относится к соединениям, в которых по меньшей мере где-либо присутствует одна гидроксигруппа или в концевом углеводном фрагменте и/или в остальной части молекулы крахмала, Г АК' является крахмалом, замещенным гидроксиалкильной группой К1, К2 или К3.
>он
Алкильная группа может быть линейной или разветвленной алкильной группой, которая может быть подходящим образом замещена. Гидроксиалкильная группа предпочтительно содержит 1-10 атомов углерода, предпочтительнее от 1 до 6 атомов углерода, предпочтительнее от 1 до 4 атомов углерода и даже предпочтительнее 2-4 атома углерода. Термин гидроксиалкилкрахмал поэтому преимущественно включает гидроксиэтилкрахмал, гидроксипропилкрахмал и гидроксибутилкрахмал, причем гидроксиэтилкрахмал и гидроксипропилкрахмал особенно предпочтительны.
Гидроксиалкилкрахмал, содержащий две или более разных гидроксиалкильных групп, также охватывается настоящим изобретением. По меньшей мере одна гидроксиалкильная группа, находящаяся в
- 44 028186
ГАК, может содержать две или более гидроксигрупп. Согласно одному варианту реализации изобретения по меньшей мере одна гидроксиалкильная группа, находящаяся в Г АК, содержит одну гидроксигруппу.
Термин ГАК также включает производные, в которых алкильная группа является моно- или полизамещенной. В одном варианте реализации алкильная группа замещена галогеном, в частности фтором, или арильной группой, при условии, что ГАК сохраняет растворимость в воде. Более того, концевая гидроксигруппа гидроксиалкильной группы может быть превращена в сложный или простой эфир. Производные ГАК описаны в публикации ^0/2004/024776, содержание которой полностью включено в данный документ посредством ссылки.
Ό. Способы присоединения
Терапевтический белок может быть ковалентно связан с полисахаридными соединениями с помощью любой из разнообразных методик, известных специалистам в этой области. В различных аспектах данного изобретения фрагменты сиаловых кислот связывают с терапевтическим белком, например, РК, РУШ, РУПа или У\УР. к примеру способом, описанным в патенте США № 4356170, который включен в данный документ посредством ссылки.
Другие техники для связывания ПСК с полипептидами также известны и предусмотрены данным изобретением. К примеру, в публикации патента США № 2007/0282096 описано конъюгирование аминного или гидразидного производного, например, ПСК, с белками. Кроме того, в публикации патента США 2007/0191597 описаны производные ПСК, содержащие на восстанавливающем конце альдегидную группу для проведения реакции с субстратами (например, белками). Содержание этих ссылок полностью включено в данный документ посредством ссылки.
Различные способы раскрыты от столбца 7, строки 15 до столбца 8, строки 5 патента США № 5846951 (содержание которого полностью включено в данный документ посредством ссылки). Типичные методики включают связывание через пептидную связь между карбоксильной группой на одной или другой молекуле белка коагуляции крови или полисахарида и аминогруппой белка коагуляции крови или полисахарида, или сложноэфирную связь между карбоксильной группой белка коагуляции крови или полисахарида и гидроксильной группой терапевтического белка или полисахарида. Другая связь, с помощью которой терапевтический белок ковалентно связывается с полисахаридным соединением, осуществляется посредством основания Шиффа между свободной аминогруппой белка коагуляции крови, реагирующего с альдегидной группой, образованной на невосстанавливающем конце полисахарида при окислении перйодатом (1еип1и§8 Ш апй Ьидо№8к1 С, I ТттипоГ 1981; 127:1011-8; Регпапйек ΑI апй Огедопайб О, ВюсЫт ВюрЬук Ас1а. 1997;1341; 26-34). Полученное основание Шиффа в одном аспекте изобретения стабилизируют специфическим восстановлением Ν;·ιΓ'ΝΒΗ3, с образованием вторичного амина. Альтернативным подходом является образование концевых свободных аминогрупп в молекуле ПСК методом восстановительного аминирования с помощью ΝΗ4Ο1 после предварительного окисления. Для связывания двух аминных или двух гидроксильных групп могут применяться бифункциональные реагенты. К примеру, молекула ПСК, содержащая аминогруппу соединяется с аминогруппами белка с такими реагентами как БС3 (бис(сульфосукцинимидил)суберат/ Р1егсе, РоскГогй, Ш). Например для связывания амина и тиольных групп дополнительно используются гетеробифункциональные перекрестносвязывающие реагенты как сульфо-ЭМКС (Юе-малеимидокапроилокси)сульфосукцинимидный сложный эфир/ Р1егсе).
В другом подходе получают гидразид ПСК и связывают его с углеводным фрагментом белка после предварительного окисления и образования альдегидных связей.
Выше описано, что свободная аминогруппа терапевтического белка реагирует с 1-карбоксильной группой остатка сиаловой кислоты с образованием пептидильной связи или эфирная связь образуется между 1-карбоксильной группой кислоты и гидроксильной или другой подходящей активной группой белка коагуляции крови. Альтернативно, карбоксильная группа образует пептидную связь с деацетилированной 5-аминогруппой или альдегидная группа молекулы терапевтического белка образует основание Шиффа с Ν-деацетилированной 5-аминогруппой остатка сиаловой кислоты.
Альтернативно, полисахаридное соединение связывают нековалентным способом с терапевтическим белком. Например, полисахаридное соединение и фармацевтически активное соединение в одном аспекте изобретения связывают с помощью гидрофобных взаимодействий. Другие нековалентные связи включают электростатические взаимодействия с противоположно заряженными ионами, притягивающимися друг с другом.
В разных вариантах реализации изобретения терапевтический белок связан или ассоциирован с полисахаридным соединением в стехиометрических количествах (например, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:7, 1:8, 1:9 или 1:10 и т.д.). В разных вариантах реализации 1-6, 7-12 или 13-20 полисахаридов связывают с белком коагуляции крови. В еще одних вариантах реализации изобретения 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более полисахаридов связаны с белком коагуляции крови.
В разных вариантах реализации изобретения терапевтический белок модифицируют для введения сайтов гликозилирования (т.е. сайты отличные от нативных сайтов гликозилирования). Такие модификации могут быть выполнены с использованием стандартных молекулярно-биологических методик, известных в этой области. Более того, терапевтический белок перед конъюгацией с водорастворимым по- 45 028186 лимером с помощью одного или большего количества углеводных фрагентов может быть гликозилированный ш νίνο или ш νί!Γο. Эти гликозилированные сайты могут служить мишенями для конъюгации белков с водорастворимыми полимерами (патентная публикация США № 20090028822, патентная публикация США № 2009/0093399, патентная публикация США № 2009/0081188, патентная публикация США № 2007/0254836, патентная публикация США № 2006/0111279 и статья ЬеРгее5 δ. е! а1., Ο1\όοΝο1οду, 2006, 16, 9, 833-43). К примеру, белок, который не является природногликозилированным ш νίνο (например, белок, который не является гликопротеином) может быть гликозилирован как описано выше.
Е. Аминооксисвязывание
В одном варианте реализации изобретения реакция гидроксиламина или производных гидроксиламина с альдегидами (например, с углеводным фрагментом после окисления перйодатом натрия) с образованием оксимной группы применяется для получения конъюгатов белка коагуляции крови. К примеру, гликопротеин (например, терапевтический белок согласно настоящему изобретению) вначале окисленный окисляющим агентом таким как перйодат натрия (№1О4) (Κο11ιΓιΐ5 ίΛ е! διηίΐΐι ЕЬ., ί ΒίοΙ СЬет 1963, 238, 1402-10 и Уап Ьеп!еп Ь и А5Ьете11 О., 1 ΒίοΙ СЬет 1971, 246, 1889-94). Окисление перйодатом гликопротеинов основано на классической реакции Малапрада, описанной в 1928 году, окисление вицинальных диолов перйодатом с образованием активной альдегидной группы (Ма1аргабе Ь., Апа1у!юа1 аррЬса!юп, Βυΐΐ δοс СЬип Ргапсе, 1928, 43, 683-96). Дополнительные примеры такого окисляющего агента являются: тетраацетат свинца (РЬ(ОАс)4), ацетат марганца (МпО(Ас)3), ацетат кобальта (Со(ОАс)2), ацетат таллия (Т1ОАс), сульфат церия (Се^О4)2) (патент США 4367309) или перрутенат калия (ККиО4) (Маг1ю е! а1., 1 Ат СЬет δοс 1997,119, 12661-2). Под термином окисляющий агент подразумевается соединение-мягкий окислитель, который способен окислять вицинальные диолы в углеводах, благодаря чему образуются активные альдегидные группы при реакции в физиологических условиях.
Второй стадией является связывание полимера, содержащего аминооксигруппу, с окисленным углеводным фрагментом с образованием оксимной связи. В одном варианте реализации изобретения эта стадия может выполняться в присутствии каталитических количеств нуклеофильного катализатора анилина или производных анилина (Ь|гк5еп А е! □η\υ5οπ РЕ, Β^οсοη^ида!е СЬет. 2008; 2епд Υ е! а1., №!иге Ме!Ьοб5 2009;6:207-9). Анилиновый катализ значительно ускоряет оксимное лигирование, что позволяет использовать очень низкие концентрации реагентов. В другом варианте реализации изобретения оксимная связь стабилизируется восстановлением NаСNΒН3 с образованием алкоксиаминной связи (фиг. 2). Дополнительные катализаторы описаны ниже.
Дополнительная информация по аминоокситехнологии может быть найдена по следующим ссылкам, содержание каждой из которых включено в данных документ полностью: ЕР 1681303А1 (соединенный с ГАК эритропоэтин); VΟ 2005/014024 (конъюгаты полимера и белка, связанные оксимной связывающей группой); VΟ96/40662 (содержащие аминоокси линкер соединения и их применение в конъюгатах); VΟ 2008/025856 (модифицированные белки); Реп Р. е! а1., ТеЬаЬебгоп 1998, 54, 12269-78; КиЬ1егК1е1Ь 1. е!. Рοζ5дау У., 1 Огд СЬет 2005, 70, 6887-90; Ьее5 А. е! а1., Уассше 2006, 24(6), 716-29; и Негеб1а КЬ. е! а1., МасгоиюесиШ 2007, 40(14), 4772-9.
Настоящим раскрытием изобретения предусмотрены многочисленные способы связывания водорастворимого полимера с аминоокси линкером. К примеру, в данном документе описывается связывание линкера с восстанавливающим или невосстанавливающим концом водорастворимого примера, такого как ПСК. Сайт связывания (например, восстанавливающий или невосстанавливающий конец) определяется одним или большим количеством условий (например, время и температура) процесса связывания, а также состоянием (например, нативное или окисленное) водорастворимого полимера. В одном варианте реализации окисленный водорастворимый полимер, такой как ПСК, связывается своим невосстанавливающим концом с аминоокси линкером путем проведения реакции связывания при пониженной температуре (например, между 2-8°С). В другом варианте реализации нативный (например, неокисленный) водорастворимый полимер, такой как ПСК, связывается своим невосстанавливающим концом с аминоокси линкером путем проведения реакции связывания при повышенной температуре (например, между 22-37°С). Вышеупомянутые варианты реализации более подробно описаны ниже и в Примерах.
В данном документе описано, что реакция окисленной ПСК с диаминооксилинкером демонстрирует две реакции: быструю реакцию альдегидной группы на невосстанавливающем конце и медленную реакцию на восстанавливающем конце. Если нативная ПСК (которая не окислена и не содержит активной альдегидной группы) реагирует с восстанавливающим концом при комнатной температуре, могут образовываться производные ПСК. Таким образом, в разных вариантах реализации изобретения для минимизации нежелательной побочной реакции на восстанавливающем конце водорастворимого полимера, такого как ПСК, получение реагента ПСК-аминоокси линкера выполняется при температуре между 28°С.
В еще одном варианте реализации настоящего раскрытия предложена дериватизация нативной ПСК на восстанавливающем конце. В данном документе считается, что нативная ПСК (которая не окисляется №1О4 и поэтому не содержащая свободной альдегидной группы на своем невосстанавливающем конце) реагирует с диаминооксилинкером при комнатной температуре и может быть достигнута дериватизация
- 46 028186
ПСК на ее восстанавливающем конце. Это связывание происходит при раскрытии кольца на восстанавливающем конце и последующем образовании оксима (данная побочная реакция описана выше и является причиной наличия побочного продукта в реагенте аминоокси-ПСК). Эта реакция может проходить с нативной ПСК, приводя к получению степени модификации вплоть до приблизительно 70%.
В качестве основного продукта методом 13С-ЯМР спектроскопии была определена следующая структура:
Эта реакция может быть перенесена на другие углеводы, подобные декстрану и крахмалу или другим полисахаридам, содержащие восстанавливающие концевые группы. Также предусмотрено использование нуклеофильного катализатора, подобного м-толуидину или анилину. Таким образом, в данном документе предложено приготовление реагентов аминоокси-ПСК с использованием нативной ПСК (т.е. без предварительного окисления), которые потом могут применяться для химической модификации терапевтических белков.
Поэтому, в разных вариантах настоящего раскрытия изобретения представлены способы, в которых описаны условия связывания (например, температура инкубации 2-8°С) диаминооксилинкера с водорастворимым полимером, таким как окисленная ПСК, благоприятные для связывания с любым невосстанавливающим концом или, в одном альтернативном варианте, в котором условия связывания (например, комнатная температура инкубации) диаминооксилинкера с водорастворимым полимером, таким как нативная неокисленная ПСК, благоприятные для связывания с любым восстанавливающим концом.
В разных вариантах реализации изобретения водорастворимый полимер, который согласно аминоокситехнологии, описанной в данном документе, связан с окисленным углеводным компонентом терапевтического белка (например, РУШ, РУНа или ΡΙΧ), включает, но не ограничивается: полиэтиленгликолем (ПЭГ), разветленным ПЭГ, полисиаловой кислотой (ПСК), углеводом, полисахаридами, пуллуланом, хитозаном, гиалуроновой кислотой, хондроитин сульфатом, дерматан сульфатом, крахмалом, декстраном, карбоксиметилдекстраном, полиалкиленоксидом (ПАО), полиалкиленгликолем (ПАГ), полипропиленгликолем (ППГ), полиоксазолином, полиакрилоилморфолином, поливиниловым спиртом (ПВС), поликарбоксилатом, поливинилпирролидоном, полифосфазеном, полиоксазолином, сополимером полиэтилена-ангидрида малеиновой кислоты, сополимером полистирола-ангидрида малеиновой кислоты, поли(1-гидроксиметилэтилен-гидроксиметилформалем) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилтриметиламмония фосфатом (МФК).
Нуклеофильные катализаторы
Как описано в данном документе, конъюгация водорастворимых полимеров с терапевтическими белками может катализироваться анилином. Анилин сильно катализирует водные реакции альдегидов и кетонов с аминами с образованием стабильных иминов, таких как гидразоны и оксимы. На следующей диаграмме сравниваются некатализируемая и катализируемая анилином реакция оксимного лигирования (КоЫет Л, СЬешБюСЬеш. 2009; 10: 2147-50):
Однако, принимая во внимание многочисленные риски для здоровья, связанные с анилином, желательно использование альтернативных катализаторов. В настоящем изобретении предложены производные анилина в качестве альтернативных катализаторов оксимного лигирования. Такие производные ани- 47 028186 лина включают, но не ограничиваются, о-аминобензойной кислотой, м-аминобензойной кислотой, паминобензойной кислотой, сульфаниловой кислотой, о-аминобензамидом, о-толуидином, м-толуидином, п-толуидином, о-анизидином, м-анизидином и п-анизидином.
В одном варианте реализации изобретения м-толуидин (известный как мета-толуидин, мметиланилин, 3-метиланилин или 3-амино-1-метилбензол) применяют для катализа реакций конъюгации, описанных в данном документе. М-толуидин и анилин обладают подобными физическими свойствами и, особенно, одинаковым значением рКа (м-толуидин: рКа 4,73, анилин: рКа 4,63).
Нулеофильные катализаторы этого изобретения пригодны для оксимного лигирования (например, используя аминоокси связывание) или образования гидразонов (например, используя методы химии гидразидов). В разных вариантах реализации изобретения предложен нуклеофильный катализатор для реакции конъюгации в концентрации 0,1; 0,2; 0,3; 0,5; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5; 9,0; 9,5; 10,0; 11; 12, 13; 14; 15; 16; 17; 18; 19; 20; 25; 30; 35; 40; 45 или 50 мМ. В одном варианте реализации изобретения предложен нуклеофильный катализатор в концентрации между 1 и 10 мМ. В разных вариантах реализации изобретения диапазон рН реакции конъюгации находится в пределах 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0 и 7,5. В одном варианте реализации изобретения значение рН находится между 5,5 и 6,5.
Очистка конъюгированных белков
В разных вариантах реализации изобретения требуется очистка белка, который инкубировали с окисляющим агентом и/или терапевтическим белком, который был конъюгирован с водорастворимым полимером в соотвествии с настоящем ракрытием. В этой области известны многочисленные методики очистки, которые включают, без ограничения, хроматографические методы такие как ионообменная хроматография, хроматография с гидрофобными взаимодействиями, эксклюзионная хроматография и аффинная хроматография или их комбинации, методы фильтрации (например, УФ/ДФ) и методы осаждения, а также методики диализа и любые комбинации вышеупомянутых методов (Ошбе ΐο Рго1ет Риггйса1юп, МеШ. Εηζνιηοίοβν том 463 (под ред. Вигде88 КК апб ОеиЦсНег МР), 2е изд., Асабешю Рге88 2 0 09).
Следующие примеры не предназначены для ограничения, а являются лишь примерами отдельных вариантов реализации этого изобретения.
Примеры
Пример 1. Получение гомобифункционального линкера ΝΗ2[ΟΟΗ2ΟΗ2]2ΟΝΗ2
Гомобифункциональный линкер ΝΗ2[ΟΟΗ2ΟΗ2]2ΟΝΗ2
(3-окса-пентан-1,5-диоксиамин), содержащий две активные аминоокси группы, был синтезирован согласно статье ΒοΙιίΓγη е1 а1. (ТеЦаНебгоп 1997;53:5485-92) в двухстадийной органической реакции с применением модифицированного синтеза Габриэля из первичных аминов (фиг. 3). На первой стадии одна молекула 2,2-хлордиэтилового эфира реагировала с двумя молекулами эндо-^гидрокси-5норборнен-2,3-дикарбоксимида в диметилформамиде (ДМФ). Требуемый гомобифункциональный продукт был приготовлен из полученного промежуточного продукта путем гидразинолиза в этаноле.
Пример 2. Получение гомобифункционального линкера ΝΗ2[ΟΟΗ2ΟΗ2]4ΟΝΗ2
Гомобифункциональный линкер ΝΗ2[ΟΟΗ2ΟΗ2]4ΟΝΗ2 (3,6,9-триоксаундекан-1,11-диоксиамин), содержащий две активные аминооксигруппы, был синтезирован согласно статье ΒοΙιίΓγη е1 а1. (ТеЦаНебгоп 1997; 53:5485-92) в двухстадийной органической реакции с применением модифицированного синтеза Габриэля из первичных аминов (фиг. 3). На первой стадии одна молекула бис-(2-(2-хлорэтокси)этил)эфира реагировала с двумя молекулами эндо-Νгидрокси-5-норборнен-2,3-дикарбоксимида в ДМФ. Требуемый гомобифункциональный продукт был приготовлен из полученного промежуточного продукта путем гидразинолиза в этаноле.
Пример 3. Получение гомобифункционального линкера ΝΗ2[ΟΟΗ2ΟΗ2]6ΟΝΗ2
Гомобифункциональный линкер ΝΗ2[ΟΟΗ2ΟΗ2]6ΟΝΗ2
(3,6,9,12,15-пентаоксагептадекан-1,17-диоксиамин), содержащий две активные аминооксигруппы, был синтезирован согласно статье ΒοΙιίΓγη е1 а1. (ТеЦаНебгоп 1997; 53:5485-92) в двухстадийной органической реакции с применением модифицированного синтеза Габриэля из первичных аминов. На первой стадии одна молекула дихлорида гексаэтиленгликоля реагировала с двумя молекулами эндо-^гидрокси5-норборнен-2,3-дикарбоксимида в ДМФ. Требуемый гомобифункциональный продукт был приготовлен из полученного промежуточного продукта путем гидразинолиза в этаноле.
Пример 4. Подробный синтез реагента аминоокси-ПСК
3-Оксапентан-1,5-диоксиамин был синтезирован согласно статье Βοϊγτγη е1 а1 (ТеЦаНебгоп 1997; 53:5485-92) в двухстадийном органическом синетзе как изложено в примере 1.
- 48 028186
Стадия 1:
К раствору эндо^-гидрокси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимида (59,0 г; 1,00 экв.) в 700 мл безводного Ν,Ν-диметилформамида добавили безводный К2СО3 (45,51 г; 1,00 экв.) и 2,2-дихлордиэтиловый эфир (15,84 мл; 0,41 экв.). Реакционную смесь перемешали в течение 22 ч при 50°С. Смесь выпарили при пониженном давлении до сухого состояния. Остаток суспендировали в 2 л дихлорметана и два раза экстрагировали насыщенным водным раствором Ν;·ιΟ (каждый раз по 1 л). Слой с дихлорметаном высушили над №-ь8О4 потом выпарили при пониженном давлении до сухого состояния и высушили в высоком вакууме, что привело к получению 64,5 г 3-оксапентан-1,5-диокси-эндо-2',3'-дикарбоксидиимиденорборнена в виде бело-желтого твердого вещества (промежуточный продукт 1).
Стадия 2:
К раствору промежуточного продукта 1 (64,25 г; 1,00 экв.) в 800 мл безводного этанола добавили 31,0 мл гидрата гидразина (4,26 экв.). Потом реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течении 2 ч. Смесь сконцентрировали до половины исходного объема путем испарения растворителя под пониженным давлением. Появившийся осадок отфильтровали. Оставшийся этанольный слой выпарили под пониженным давлением до сухого состояния. Остаток, содержащий неочищенный продукт 3-оксапентан-1,5-диоксиамин высушили под вакуумом с выходом 46,3 г. Далее неочищенный продукт очистили методом колоночной хроматографии (Силикагель 60; изократическое элюирование смесью дихлорметана/метанола, 9/1) с получением 11,7 г чистого конечного продукта 3-окса-пентан-1,5-диоксиамина.
Пример 5. Получение аминоокси-ПСК
1000 мг окисленной ПСК (ММ = 20 кДа), полученной из 8егит ИъПиПе о£ ИзШа (Рипе, ИзШа), растворили в 16 мл 50 мМ фосфатного буферного раствора с рН 6,0. Потом к реакционной смеси добавили 170 мг 3-оксапентан-1,5-диоксиамина. После встряхивания в течение 2 ч при КТ добавили 78,5 мг цианборогидрида натрия и реакцию оставили протекать в течение 18 ч на ночь. Потом реакционную смесь подвергли процедуре ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны с отсекающим порогом 5 кДа, сделанной из регенерируемой целлюлозы (50 см2, МПИроге).
Пример 6. Получение аминоокси-ПСК с применением стадии хроматографической очистки
1290 мг окисленной ПСК (ММ = 20 кДа), полученной из 8егит ИъПиПе о£ ИзШа (Рипе, ИзШа), растворили в 25 мл 50 мМ фосфатного буферного раствора с рН 6,0 (Буферный раствор А). Потом к реакционной смеси добавили 209 мг 3-оксапентан-1,5-диоксиамина. После встряхивания в течение 1 ч при КТ добавили 101 мг цианборогидрида натрия, и реакцию оставили протекать в течение 3 ч. Потом смесь подвергли стадии неспецифической анионообменной хроматографии с применением геля для хроматографии Ргас!оде1 ЕМЭ ΌΕΛΕ 650-М (размер колонки: ХК26/135). Реакционную смесь разбавили 110 мл Буферного раствора А и нанесли на ДЭАЭ-колонку предварительно уравновешенную Буферным раствором А при скорости потока 1 см/мин. Потом колонку промыли 20 объемами колонки (ОК) Буферного раствора В (20 мМ Гэпэс, рН 6,0) для удаления свободного 3-оксапентан-1,5-диоксиамина и цианида при скорости потока 2 см/мин. Реагент аминоокси-ПСК потом элюировали со ступенчатым градиентом, содержащим 67% Буферного раствора В и 43% Буферного раствора С (20 мМ Гэпэс, 1М №С1, рН 7,5). Элюат сконцентрировали с помощью УФ/ДФ с применением мембраны с порогом 5 кДа, сделанной из полиэфирсульфона (50 см2, МПИроге). Конечную стадию диафильтрации провели против Буферного раствора Ό (20 мМ Гэпэс, 90 мМ №С1, рН 7,4). Препарат исследовали аналитическими методами путем измерения общей ПСК (анализ с резорцином) и общего количества аминоокси групп (анализ с ТНБС) для определения степени модификации. Более того была определена полидисперсность, а также содержание свободных 3-оксапентан-1,5-диоксиамина и цианида.
Пример 7. Получение аминоокси-ПСК без стадии восстановления
573 мг окисленной ПСК (ММ = 20 кДа), полученной из 8егит ИзкИиае о£ ИзШа (Рипе, ИзШа), растворили в 11,3 мл 50 мМ фосфатного буферного раствора с рН 6,0 (Буферный раствор А). Потом к реакционной смеси добавили 94 мг 3-окса-пентан-1,5-диоксиамина. После встряхивания в течение 5 часов при КТ смесь подвергли стадии неспецифической анионообменной хроматографии с применением геля для хроматографии Ргас1оде1 ЕМО ОЕАЕ 650-М (размер колонки: ХК16/105). Реакционную смесь разбавили 50 мл Буферного раствора А и нанесли на ДЭАЭ-колонку предварительно уравновешенную Буферным раствором А при скорости потока 1 см/мин. Потом колонку промыли 20 ОК Буферного раствора В (20 мМ Гэпэс, рН 6,0) для удаления свободного 3-окса-пентан-1,5-диоксиамина и цианида при скорости потока 2 см/мин. Реагент аминоокси-ПСК элюировали со ступенчатым градиентом, содержащим 67 % Буферного раствора В и 43 % Буферного раствора С (20 мМ Гэпэс, 1М №С1, рН 7,5). Элюат сконцентрировали с помощью УФ/ДФ с применением мембраны с порогом 5 кДа, сделанной из полиэфирсульфона (50 см2, МПИроге). Конечную стадию диафильтрации провели против Буферного раствора Ό (20 мМ Гэпэс, 90 мМ №С1, рН 7,4). Препарат исследовали аналитическими методами путем измерения общей ПСК (анализ с резорцином) и общего количества аминоокси групп (анализ с ТНБС) для определения степени модификации. Более того, была определена полидисперсность, а также содержание свободного 3-оксапентан-1,5-диоксиамина.
- 49 028186
Пример 8. Получение аминоокси-ПСК без стадии восстановления в присутствии нуклеофильного катализатора м-толуидина
573 мг окисленной ПСК (ММ = 20 кДа), полученной из 8егит ПъШШе о£ Ιηάία (Рипе, Ιηάία). растворяют в 9 мл 50 мМ фосфатного буферного раствора с рН 6,0 (Буферный раствор А). Потом в реакционную смесь вносят 94 мг 3-окса-пентан-1,5-диоксиамина. Далее к этой реакционной смеси добавляют 2,3 мл 50 мМ маточного раствора м-толуидина. Потом, после встряхивания в течение 2 ч при КТ смесь подвергают стадии неспецифической анионообменной хроматографии с применением геля для хроматографии Ргас1оде1 ΕΜΌ ΌΕΛΕ 650-М (размер колонки: ХК16/105). Реакционную смесь разбавляют 50 мл буферного раствора А и наносят на ДЭАЭ-колонку предваритильно уравновешенную Буферным раствором А при скорости потока 1 см/мин. Потом колонку промывают 20 ОК буферного раствора В (20 мМ Гэпэс, рН 6,0) для удаления свободного 3-окса-пентан-1,5-диоксиамина и цианида при скорости потока 2 см/мин. Реагент аминоокси-ПСК элюируют ступенчатым градиентом, содержащим 67 % Буферного раствора В и 43% Буферного раствора С (20 мМ Гэпэс, 1Μ ЫаС1, рН 7,5). Элюат концентрируют с помощью УФ/ДФ с применением мембраны с порогом 5 кДа, сделанной из полиэфирсульфона (50 см2, МПНроге). Конечную стадию диафильтрации проводят против Буферного раствора Ό (20 мМ Г эпэс, 90 мМ ЫаС1, рН
7,4). Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общей ПСК (анализ с резорцином) и общего количества аминоокси групп (анализ с ТНБС) для определения степени модификации. Более того определяют полидисперсность, а также содержание свободного 3-оксапентан-1,5-диоксиамина.
Пример 9. Получение реагента аминоокси-ПСК
Реагент аминоокси-ПСК был приготовлен в соответствии с примерами 4-8. После диафильтрации продукт был заморожен при -80°С и лиофилизирован. После лиофилизации реагент растворили в подходящем объеме воды и использовали для получения конъюгатов ПСК-белок с помощью модификации углеводов.
Пример 10. Оценка эффективности разных альтернативных нуклеофильных катализаторов гР1Х инкубировали с перйодатом натрия и реагентом аминоокси-ПСК в стандартизированных условиях (1 мг/мл гР1Х в 20 мМ Ь-гистидине, 150 мМ ЫаС1, 5 мМ СаС12, рН 6,0, 5-кратным молярным избытком реагента аминоокси-ПСК, 100 мкМ ЫаЮ4), используя разные нуклеофильные катализаторы (анилин, м-толуидин, о-анизидин, м-анизидин, о-аминобензойная кислота, м-аминобензойная кислота, паминобензойная кислота, п-аминобензамид, сульфаниловая кислота / стандартная концентрация: 10 мМ). Реакция проводилась в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и реакцию остановили в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением водного раствора цистеина до конечной концентрации 1 мМ.
Эффективность связывания определили методом ДСН-ПААГ-СЛЕКТРОФОРЕЗ, используя минисистему Х-се11 компании 1пуИгодеп. В образцы внесли добавки буферного раствора с додецилсульфатом лития (ДСЛ) и провели их денатурацию в течение 10 мин при 70°С. Потом образцы нанесли на 3-8% гель с ТРИС-ацетатом и провели анализ при напряжении 150 В в течение 60 мин. Потом гели окрасили с помощью Кумасси.
Дополнительно образцы исследовали с использованием системы для ЭХ-ВЭЖХ, системы для ВЭЖХ АдПеШ 1200, оборудованной колонкой 81ю0е\ Κν 803 в описаных ранее условиях (Ко1аг1сН е1 а1., Тгапз&зюп 2006;46:1959-77).
Образцы по 50 мкл ввели без разведения и элюировали в изократических условиях профильтрованным через фильтр с порами 0,22 мкм раствором из 20 мМ ЫаН2РО4, 50 мМ Ыа28О4 с рН 6,1 при скорости потока 0,5 мл/мин. Профиль элюции записывали при 280 нм.
Результаты анализа собраны на фиг. 5А-С и 6 (ДСН ПААГ-электрофорез) и в табл. 2 (результаты ЭХ-ВЭЖХ). Таким образом продемонстрировано каталитическое действие различных веществ. Показано, что использование м-толуидина приводит к результатам, эквивалентным результатам, полученным с анилином.
Таблица 2
Нуклеофильные катализаторы ди-ПСКсвязанный гПХ моно-ПСК- связанный гПХ Свободный гПХ
Без катализатора 4,5% 24,9% 70,6%
10 мМ анилин 47,7% 33,6% 18,7%
10 мМ м-толуидин 31,4% 40,8% 27,8%
10 мМ о-аминобензойная кислота 30,9% 38,5% 30,6%
10 мМ м-аминобензойная кислота 27,6% 38,0% 34,4%
10 мМ п-аминобензойная кислота 18,1% 39,3% 42,6%
10 мМ о-аминобензамид 15,9% 38,4% 45,7%
мМ Сульфаниловая кислота|11,8%|35,8%I 52,4%
- 50 028186
Пример 11. Полисиалирование гР1Х с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора
Способ 1:
12,3 мг гР1Х растворили в 6,1 мл гистидинового буферного раствора, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ №С1, 5 мМ СаС12). Потом добавили 254 мкл водного раствора перйодата натрия (5 мМ) и реакционную смесь инкубировали в течение 1 ч в темноте при 4°С при осторожном перемешивании и остановили реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 6,5 мкл 1М водного раствора цистеина. Далее смесь подвергли УФ/ДФ с применением центрифужных фильтрационных устройств Ущакрш 15Р 10 кДа для удаления избытка перйодата, гасителя реакции и их побочных продуктов.
Концентрат (8,8 мл), содержащий окисленный гР1Х, смешали с 2,46 мл водного раствора мтолуидина (50 мМ) и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Потом добавили реагент аминоокси-ПСК с мМ 20 кДа (описан выше) до получения 5-кратного молярного избытка реагента. Эту смесь инкубировали в течение 2,5 ч при КТ в темноте при осторожном перемешивании.
Свободный гР1Х удалили с помощью анионообменной хроматографии (АОХ). Реакционную смесь разбавили 15 мл Буферного раствора А (50 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 7,5) и нанесли на колонку ШРгер ОРР 16/10 объемом 20 мл (ОЕ НеаНЪсаге, РайНеИ, СТ) предварительно уравновешенную буферным раствором А. Колонку потом элюировали буферным раствором В (50 мМ Гэпэс, 1 М №С1, 5 мМ СаС12, рН
7,5). Свободный гР1Х элюируется при проводимости раствора в пределах 12-25 мСм/см, а конъюгат - в пределах 27-45 мСм/см. Далее повысили проводимость содержащих конъюгат фракций до 190 мСм/см буферным раствором С (50 мМ Гэпэс, 5М №С1, 5 мМ СаС12, рН 6,9) и нанесли на колонку ШРгер Ви1у1 РР 16/10 объемом 20 мл (ОЕ НеаНЪсаге, РайПеИ, СТ) предварительно уравновешенную буферным раствором Ό (50 мМ Гэпэс, 3 М №С1, 5 мМ СаС12, рН 6,9). Свободный реагент аминоокси-ПСК вымыли Буферным раствором Ό в количестве 5 ОК. Далее конъюгат элюировали 100% буферным раствором Е (50 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 7,4).
Содержащие конъюгат фракции сконцентрировали с помощью УФ/ДФ, используя центрифужное фильтрационное устройство Ущазрт 15Р 10 кДа. Конечную стадию диафильтрации провели против гистидинового буферного раствора, рН 7,2, содержащего 150 мМ №С1 и 5 мМ СаС12. Полученный препарат был исследован аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и хромогенной активности Р1Х. Определили, что конъюгат ПСК-гР1Х показал удельную активность > 50% по сравнению с активностью нативного гР1Х.
Способ 2.
12,3 мг гР1Х растворяют в Ь-гистидиновом Буферном растворе, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ №С1, 5 мМ СаС12) для получения конечной концентрации белка 1 мг гР1Х / мл. Добавляют 5 мМ водный раствор перйодата натрия до достижения конечной концентрации 100 мкМ и реакционную смесь инкубируют в течение 1 ч в темноте при 4°С, осторожном перемешивании и рН 6,0, останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора Ь-цистеина (или других останавливающих реагентов) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Далее смесь подвергают УФ/ДФ с применением центрифужных фильтрационных устройств Ущазрт 15Р 10 кДа для удаления избытка перйодата, гасителя реакции и их побочных продуктов.
Полученный концентрат (8,8 мл), содержащий окисленный гР1Х, смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) до получения конечной концентрации 10 мМ и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Потом добавляют реагент аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) до получения 5-кратного молярного избытка реагента. Эту смесь инкубировали (при рН 6,0 в течение 2,5 ч при комнатной температуре; от 0,5 до 18 ч при +4°С) в темноте при осторожном перемешивании.
Свободный гР1Х удаляют с помощью анионообменной хроматографии (АОХ). Реакционную смесь разбавляют подходящим количеством Буферного раствора А (50 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 7,5) для коррекции проводимости растворов и рН перед нанесением на колонку ШРгер ОРР 16/10 объемом 20 мл (ОЕ НеаНЪсаге, РайПеИ, СТ) предварительно уравновешенную Буферным раствором А. Потом колонку элюируют Буферным раствором В (50 мМ Гэпэс, 1 М №С1, 5 мМ СаС12, рН 7,5). Свободный гР1Х элюируют ступенчатым градиентом, используя 25% Буферного раствора В, что приводит к проводимости полученной фракции и конъюгата в пределах 12-25 мСм/см при использовании ступенчатого градиента с 50% Буферного раствора В, что приводит к проводимости фракции конъюгата в пределах 27-45 мСм/см. Далее повышают проводимость содержащей конъюгат фракции до 190 мСм/см Буферным раствором С (50 мМ Гэпэс, 5 М №С1, 5 мМ СаС12, рН 6,9 или при использовании антихаотропных солей, например, сульфата аммония, ацетата аммония и т.п.) и фракции наносят на колонку ШРгер Вн1у1 РР 16/10 объемом 20 мл (ОЕ НеаННсаге, РайПеИ, СТ или сравнимый носитель для ХГВ) предварительно уравновешенную Буферным раствором Ό (50 мМ Гэпэс, 3 М №С1, 5 мМ СаС12, рН 6,9). Свободный реагент аминоокси-ПСК вымывают Буферным раствором Ό в количестве 5 ОК. Далее конъюгат элюируют 100% Буферным раствором Е (50 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 7,4). Содержащие конъюгат фракции концентрируют с помощью УФ/ДФ, используя мембрану на 10 кДа, сделанную из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсекания 10 кДа, МгШроге). Конечную стадию диафильтрации проводят против Ь-гистидинового буферного
- 51 028186 раствора с рН 7,2, содержащего 150 мМ Ν;·ιΟ и 5 мМ СаС12. Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (методики Брэдфорда и БХК) и хромогенной и свертывающей активности Р1Х. Для конъюгата ПСК-гР1Х определили удельную активность > 50% по сравнению с активностью нативного гР1Х.
Метод 3:
25,4 мг гР1Х растворили в 18,7 мл гистидинового буферного раствора, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ №С1, 5 мМ СаС12). Потом добавили 531 мкл водного раствора перйодата натрия (5 мМ) и 5,07 мл водного раствора м-толуидина (50 мМ). Далее добавляют реагент аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) до получения 5-кратного молярного избытка реагента. Смесь инкубировали в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и остановили реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 25 мкл 1 М водного раствора цистеина.
Свободный гР1Х удалили с помощью анионообменной хроматографии (АОХ). Реакционную смесь разбавили 20 мл Буферного раствора А (50 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 7,5) и нанесли на колонку ШРгер ОРР 16/10 объемом 20 мл (СЕ НеаНЬсаге, РаиГлеШ, СТ) предварительно уравновешенную Буферным раствором А. Потом колонку элюировали Буферным раствором В (50 мМ Гэпэс, 1 М №С1, 5 мМ СаС12, рН
7,5). Свободный гР1Х элюировали при проводимости раствора в пределах 12-25 мСм/см, а конъюгат - в пределах 27-45 мСм/см. Далее повысили проводимость содержащих конъюгат фракций до 190 мСм/см Буферным раствором С (50 мМ Гэпэс, 5 М №С1, 5 мМ СаС12, рН 6,9) и нанесли на колонку ШРгер Ви!у1 РР 16/10 объемом 20 мл (СЕ НеаЪЬсаге, РаиГлеШ, СТ), предварительно уравновешенную Буферным раствором Ό (50 мМ Гэпэс, 3 М №С1, 5 мМ СаС12, рН 6,9). Свободный реагент аминоокси-ПСК вымыли Буферным раствором Ό в количестве 5 ОК. Далее конъюгат элюировали 100 % Буферным раствором Е (50 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 7,4). Содержащие конъюгат фракции концентрировали с помощью УФ/ДФ, используя мембрану на 10 кДа, сделанную из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсекания 10 кДа, МгШроге). Конечную стадию диафильтрации провели против гистидинового буферного раствора, рН 7,2, содержащего 150 мМ Ν;·ιΟ и 5 мМ СаС12. Полученный препарат был исследован аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и хромогенной активности Р1Х. Для конъюгата ПСК-гР1Х определили удельную активность > 50% по сравнению с активностью нативного гР1Х. Конъюгат дополнительно исследовали аналитическими методами с помощью эксклюзионной ВЭЖХ, используя систему ВЭЖХ ЛдПей 1200, оборудованную колонкой 8Ьойех К\У 803 в описаных ранее условиях (Ко1апсЬ е! а1., Т^аη8ίи8^οη 2006; 46:1959-77). Показано, что полученный препарат не содержит свободного Р1Х. Конъюгат состоял из 57% монополисиалированного, 31% диполисиалированного и 12% триполисиалированного продукта.
Способ 4:
25,4 мг гР1Х растворили в Ь-гистидиновом буферном растворе, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ №С1, 5 мМ СаС12) для получения конечной концентрации белка 2 мг гР1Х/мл. Далее в течение 15 мин добавили 5 мМ водный раствор перйодата натрия до получения конечной концентрации 100 мкМ с последующим добавлением 50 мМ водного раствора м-толуидина до достижения конечной концентрации 10 мМ в течение периода времени 30 мин. Потом добавили реагент аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) до получения 5-кратного молярного избытка реагента. После коррекции рН до значения 6,0 смесь инкубировали в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и остановили реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора Ь-цистеина до получения конечной концентрации 10 мМ.
Свободный гР1Х удалили с помощью ионообменной хроматографии (ИОХ). Реакционную смесь разбавили подходящим количеством Буферного раствора А (50 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 7,5) для коррекции проводимости растворов и значения рН перед нанесением на колонку ШРгер ОРР 16/10 объемом 20 мл (СЕ НеаНЬсаге, РапПеИ, СТ), предварительно уравновешенную Буферным раствором А. Потом колонку элюировали Буферным раствором В (50 мМ Гэпэс, 1 М №С1, 5 мМ СаС12, рН 7,5). Свободный гР1Х элюировали ступенчатым градиентом, используя 25% Буферного раствора В, что приводит к проводимости полученной фракции и конъюгата в пределах 12-25 мСм/см при использовании ступенчатого градиента с 50% Буферного раствора В, что приводит к проводимости фракции конъюгата в пределах 2745 мСм/см. Далее повысили проводимость содержащей конъюгат фракции до 190 мСм/см Буферным раствором С (50 мМ Гэпэс, 5 М №С1, 5 мМ СаС12, рН 6,9; с использованием антихаотропных солей, например, ацетата аммония) и фракции нанесли на колонку ШРгер Ви1у1 РР 16/10 объемом 20 мл (СЕ НеаЪЬсаге, РаМеМ, СТ или сравнимый носитель для ХГВ), предварительно уравновешенную Буферным раствором Ό (50 мМ Гэпэс, 3 М №С1, 5 мМ СаС12, рН 6,9). Свободный реагент аминоокси-ПСК вымыли Буферным раствором Ό в количестве 5 ОК. Далее конъюгат элюировали 100% Буферным раствором Е (50 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 7,4). Содержащие конъюгат фракции концентрировали с помощью УФ/ДФ, используя мембрану на 10 кДа, сделанную из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсекания 10 кДа, МлШроге). Конечную стадию диафильтрации провели против Ь-гистидинового буферного раствора с рН 7,2, содержащего 150 мМ Ν;·ιΟ и 5 мМ СаС12. Препарат исследовали аналитическими методами путем измерения общего белка (методики Брэдфорда и БХК) и хромогенной и свертывающей
- 52 028186 активности РК. Для конъюгата ПСК-гРК определили удельную активность > 50% по сравнению с активностью нативного гРК. Конъюгат дополнительно исследовали аналитическими методами с помощью эксклюзионной ВЭЖХ, используя систему ВЭЖХ АдПеШ 1200, оборудованную колонкой 8Нойех «XV 803 в описаных ранее условиях (Ко1апсН е( а1., ТгапзГизюп 2006; 46:1959-77). Показано, что полученный препарат не содержит свободного РК. Конъюгат состоял из 57% монополисиалированного, 31% диполисиалированного и 12% триполисиалированного продукта.
Пример 12. Полисиалирование гРУШ с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора
Способ 1:
В реакционный буферный раствор (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) перенесли 50 мг гРУШ и разбавили его до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавили ШЮ) до получения конечной концентрации 200 мкМ. Провели окисление при КТ в течение 30 мин в темноте при осторожном встряхивании. Потом реакцию остановили цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ. Полученный раствор перенесли на колонку для ИОХ объемом 20 мл (Мегск ЕМБ ТМАЕ (М)), которая была уравновешена Буферным раствором А (20 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 7,0). Колонку уравновесили 5 ОК Буферного раствора А. Окисленный гРУШ элюировали Буферным раствором В (20 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, 1М №С1, рН 7,0). Собрали фракции, содержащие гРУШ. Определили содержание белка (Кумасси, метод Брэдфорда), скорректировали его до 1 мг/мл с помощью реакционного буферного раствора и скорректировали рН до 6,0 добавлением по каплям 0,5 М НС1. Потом добавили 50-кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию связывания провели в течение 2 ч в темноте при осторожном встряхивании и при комнатной температуре. Избыток реагента аминоокси-ПСК удалили с помощью ХГВ. Проводимость реакционной смеси повысили до 130 мСм/см добавлением буферного раствора, содержащего ацетат аммония (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, 8 М ацетата аммония, рН 6,9) и смесь нанесли на колонку, заполненную 80 мл фенилсефарозы РР (СЕ НеаННсаге, Ра1гйе1й, СТ), предварительно уравновещенную раствором 50 мМ Гэпэс, 2,5 М ацетата аммония, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,9. Далее конъюгат элюировали 50 мМ буферным раствором Гэпэс с рН 7,5, содержащим 5 мМ СаС12. Наконец, содержащие ПСК-гРУШ фракции собрали и подвергли УФ/ДФ с использованием мембраны на 30 КДа, сделанной из регенерированной целлюлозы (88 см2, МППроге). Полученный препарат был исследован аналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и хромогенной активности РУШ. Определили, что конъюгат ПСКгРУШ показал удельную активность > 70% по сравнению с активностью нативного гРУШ.
Способ 2:
мг рекомбинантного фактора УШ (гРУШ), полученного в процессе производства АБУАТЕ в буферном растворе Гэпэс (50 мМ ГЭПЭС, ~ 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, 0,1% полисорбата 80, рН 7,4), растворяют в реакционном буферном растворе (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) для достижения конечной концентрации белка 1,0 +/- 0,25 мг/мл. Потом рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора НС1. Далее в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор периодата натрия до получения концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления выполняют в течение 30 +/- 5 мин при температуре (Т) Т = +22 +/-2°С. Потом реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь водного раствора Ь-цистеина (1М) в пределах 15 мин при Т = +22 +/- 2°С до получения конечной концентрации 10 мМ и инкубацией в течение 60 +/- 5 мин.
Окисленный гРУШ дополнительно очищают методом анионообменной хроматографии на носителе ЕМБ ТМАЕ (М) (Мегск). Полученную смесь разбавляют Буферным раствором А (20 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 6,5) до получения проводимости 5 мСм/см. Этот раствор наносят на колонку для ИОХ (толщина слоя: 5,4 см) с объемом колонки 10 мл, используя скорость потока 1,5 см/мин. Далее колонку промывают (скорость потока: 1,5 см/мин) 5 ОК смеси 92:8 (мас./мас.) Буферного раствора А и Буферного раствора В (20 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, 1,0 М №С1, рН 7,0). Потом окисленный гРУШ элююруют смесью 50:50 (мас./мас.) Буферного раствора А и Буферного раствора В, с последующей стадией постэлюирования 5 ОК Буферного раствора В. Стадии элюирования проводятся с использованием скорости потока 1,0 см/мин.
Далее к элюату, содержащему очищенный окисленный гРУШ, добавляют реагент аминооксиполисиаловую кислоту (ПСК-ОNН2) в 50-кратном молярном избытке при осторожном перемешивании в течение максимального периода времени (!) 15 мин. Потом в течение 15 мин добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют в течение 120 +/- 10 мин в темноте при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПСК-гРУШ очищают методом хроматографии с гидрофобными взаимодействиями (ХГВ), используя смолу низкого замещения фенилсефарозу РР (СЕ НеаННсаге), упакованную в колонку, произведенную СЕ НеаННсаге с толщиной слоя (Н) 15 см и конечным объемом колонки (ОК) 81 мл.
- 53 028186
В реакционную смесь вносят ацетат аммония добавлением 50 мМ буферного раствора Гэпэс, содержащего 350 мМ хлорида натрия, 8 М ацетата аммония, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,9. Два объема реакционной смеси перемешивают с 1 объемом буферной системы, содержащей ацетат аммония, а значение рН раствора корректируют до рН 6,9 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора ΝαΟΗ. Эту смесь наносят на колонку для ХГВ при скорости потока 1 см/мин с последующей стадией промывки, используя > 3 ОК уравновешивающего буферного раствора (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 2,5 М ацетата аммония, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,9).
Для удаления побочных продуктов реакции и антихаотропной соли проводят вторую стадию промывки > 5 ОК промывочного буферного раствора 1 (50 мМ Гэпэс, 3 М хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,9) в режиме восходящего потока при скорости потока 2 см/мин. Потом проводят элюирование очищенного конъюгата ПСК-гРУШ в режиме нисходящего потока, используя ступенчатый градиент из 40% промывочного буферного раствора 2 (50 мМ Гэпэс, 1,5 М хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,9) и 60% элюирующего буферного раствора (20 мМ Гэпэс, 5 мМ хлорида кальция, рН 7,5) при скорости потока 1 см/мин. Процесс элюирования конъюгата ПСК-гРУШ отслеживают при 280 нм УФ, а элюат, содержащий конъюгат, собирают в объеме < 4 ОК. Стадию пост-элюирования проводят с > 3 ОК элюирующего буферного раствора в таких же условиях для отделения побочного и/или немодифицированного гРУШ от основного продукта.
В заключение, очищенный конъюгат концентрируют с помощью ультра-/диафильтрации (УФ/ДФ), используя мембрану, сделанную из регенерированной целлюлозы с отсеканием молекулярной массы 30 кДа (88 см2, МПНроге).
Конъюгат, полученный с использованием этой методики, исследовали аналитическими методами путем измерения общего белка, хромогенной активности РУШ и определением степени полисиалирования с помощью измерения содержания ПСК (анализ с резорцином). Для данного конъюгата рассчитаны удельная активность > 50% и степень ПСК > 5,0.
Метод 3:
В реакционный буферный раствор (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) перенесли 50 мг гРУШ и разбавили его до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавили 50кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и ΝαΙΟ4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию связывания провели в течение 2 ч в темноте при осторожном встряхивании и при комнатной температуре. Далее реакцию остановили цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ. Потом проводимость реакционной смеси повысили до 130 мСм/см добавлением буферного раствора, содержащего ацетат аммония (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, 8 М ацетата аммония, рН 6,9) и смесь нанесли на колонку, заполненную 80 мл фенилсефарозы РР (СЕ НеаННсаге, РапПеИ, СТ), предварительно уравновешенную раствором 50 мМ Гэпэс, 2,5 М ацетата аммония, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, 0,01% Твина 80, рН 6,9. Далее конъюгат элюировали раствором 50 мМ Гэпэс, 5 мМ хлорида кальция, рН 7,5. Наконец, содержащие ПСК-гРУШ фракции собрали и подвергли УФ/ДФ с использованием мембраны на 30 кДа, сделанной из регенерированной целлюлозы (88 см2, МНИроге). Полученный препарат был исследован аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и хромогенной активности РУШ. Для конъюгата ПСК-гРУШ определили удельную активность > 70% по сравнению с активностью нативного гРУШ.
Способ 4:
мг рекомбинантного фактора УШ (гРУШ), полученного в процессе производства ЛЭУЛТЕ в 50 мМ буферном растворе Гэпэс (50 мМ ГЭПЭС, ~350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, 0,1% полисорбата 80, рН 7,4), растворили в реакционном буферном растворе (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) для достижения конечной концентрации белка 1,0 +/- 0,25 мг/мл. Потом рН раствора скорректировали до 6,0 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора НС1.
Далее добавили реагент аминооксиполисиаловую кислоту (ПСК-ОМН2) в 50-кратном молярном избытке к этому раствору гРУШ при осторожном перемешивании в течение максимального периода времени (1) 15 мин. Потом в течение 15 мин добавили водный раствор м-толуидина (50 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. В заключение, добавили 40 мМ водный раствор перйодата натрия до получения концентрации 400 мкМ.
Реакционную смесь инкубировали в течение 120 +/- 10 мин в темноте при температуре (Т) Т = +22 +/-2°С при осторожном встряхивании. Потом реакцию останавили добавлением в реакционную смесь водного раствора Ь-цистеина (1М) до получения конечной концентрации в реакционной смеси 10 мМ и инкубацией в течение 60 +/- 5 мин.
Полученный конъюгат ПСК-гРУШ очистили методом хроматографии с гидрофобными взаимодействиями (ХГВ), используя смолу низкого замещения фенилсефарозы РР (СЕ НеаИЪсаге), упакованную в колонку, произведенную СЕ НеаЕНсаге с толщиной слоя (П) 15 см и конечным объемом колонки (ОК) 81 мл.
- 54 028186
В реакционную смесь внесли ацетат аммония добавлением 50 мМ буферного раствора Гэпэс, содержащего 350 мМ хлорида натрия, 8 М ацетата аммония, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,9. Два объема реакционной смеси перемешали с 1 объемом буферной системы, содержащей ацетат аммония, а значение рН раствора скорректировали до рН 6,9 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора ΝαΟΗ. Эту смесь нанесли на колонку для ХГВ при скорости потока 1 см/мин с последующей стадией промывки, используя > 3 ОК уравновешивающего буферного раствора (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 2,5 М ацетата аммония, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,9).
Для удаления побочных продуктов реакции и антихаотропной соли провели вторую стадию промывки > 5 ОК промывочного буферного раствора 1 (50 мМ Гэпэс, 3 М хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,9) в режиме восходящего потока при скорости потока 2 см/мин. Потом провели элюирование очищенного конъюгата гРУШ в режиме нисходящего потока, используя ступенчатый градиент из 40% промывочного буферного раствора 2 (50 мМ Гэпэс, 1,5 М хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,9) и 60% элюирующего буферного раствора (20 мМ Гэпэс, 5 мМ хлорида кальция, рН 7,5) при скорости потока 1 см/мин. Процесс элюирования конъюгата ПСК-гРУШ отслеживали при 280 нм УФ, а элюат, содержавший конъюгат, собрали в объеме < 4 ОК. Стадию пост-элюирования провели с > 3 ОК элюирующего буферного раствора в таких же условиях для отделения побочного и/или немодифицированного гРУШ от основного продукта.
В заключение, очищенный конъюгат сконцентрировали с помощью ультра-/диафильтрации (УФ/ДФ), используя мембрану, сделанную из регенерированной целлюлозы с отсеканием молекулярной массы 30 кДа (88 см2, МПНроге).
Конъюгаты, полученные с использованием этой методики, исследовали аналитическими методами путем измерения общего белка, хромогенной активности РУШ и определением степени полисиалирования с помощью измерения содержания ПСК (анализ с резорцином).
Данные анализа (среднее из 6 последовательных серий):
Технологический выход (метод Брэдфорда): 58,9%
Технологический выход (хром. акт. РУШ): 46,4%
Удельная активность: (хром. акт. РУШ / мг белка): 4148 МЕ/мг
Удельная активность (% исходного вещества): 79,9%
Степень содержания ПСК (моль/моль): 8,1
Пример 13. ПЭГилирование гРУШ с использованием реагента аминоокси-ПЭГ и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора
Способ 1:
гРУШ ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии 8ипЬпдЫ® СА от компании NΟΡ ШОР Согр., Токуо, .Гараи). 14,7 мг гРУШ растворяют в 7,0 мл гистидинового буферного раствора, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ №С1, 5 мМ СаС12). Потом добавляют 296 мкл водного раствора перйодата натрия (5 мМ) и реакционную смесь инкубируют в течение 1 ч в темноте при 4°С при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Далее смесь подвергли УФ/ДФ с применением центрифужных фильтрационных устройств Ущакрш 15К 10 кДа для удаления избытка перйодата, гасителя реакции и их побочных продуктов.
Концентрат (10,9 мл), содержащий окисленный гРУШ, смешивают с 2,94 мл водного раствора мтолуидина (50 мМ) и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Потом добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до получения 5-кратного молярного избытка реагента. Эту смесь инкубировали в течение 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ -гРУШ очищают ионообменной хроматографией на О-сефарозе РР. Конъюгат в концентрации 1,5 мг белка/мл геля наносят на колонку, уравновешенную 50 мМ буферным раствором Гэпэс, рН 7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Полученный конъюгат элюируют 50 мМ буферным раствором Гэпэс, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ хлоридом натрия, рН 7,4 и потом подвергают УФ/ДФ, используя мембрану на 30 кДа (50 см2, МПЬроге). Полученный препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и хромогенной активности РУШ. Предполагается, что конъюгат ПЭГ-гРУШ продемонстрирует удельную активность > 70% по сравнению с определенной активностью нативного гРУШ.
Способ 2:
гРУШ ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реагента является реагент серии 8ипЬпд1и® СА от компании NΟΡ ШОР Согр., Токуо, .Гараи). Исходную навеску или концентрацию гРУШ растворяют или переносят в реакционный буферный раствор (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 1,0 +/- 0,25 мг/мл. Потом рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора НС1. Далее в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор периодата натрия до получения концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления выпол- 55 028186 няют в течение 30 +/- 5 мин при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С. Потом реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь водного раствора Ь-цистеина (1М) в пределах 15 мин при Т = +22 +/- 2°С до получения конечной концентрации 10 мМ и инкубацией в течение 60 +/- 5 мин.
Окисленный гРУШ дополнительно очищают методом анионообменной хроматографии на носителе ΕΜΌ ТМАЕ (М) (Мегск). Полученную смесь разбавляют Буферным раствором А (20 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 6,5) до получения проводимости 5 мСм/см. Этот раствор наносят на колонку для ИОХ (толщина слоя: 5,4 см) с объемом колонки 10 мл, используя скорость потока 1,5 см/мин. Далее колонку промывают (скорость потока: 1,5 см/мин) 5 ОК смеси 92:8 (мас./мас.) Буферного раствора А и Буферного раствора В (20 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, 1,0 М №С1, рН 7,0). Потом окисленный гРУШ элююруют смесью 50:50 (мас./мас.) Буферного раствора А и Буферного раствора В, с последующей стадией постэлюирования 5 ОК Буферного раствора В. Стадии элюирования проводятся с использованием скорости потока 1,0 см/мин.
Далее к элюату, содержащему очищенный окисленный гРУШ, добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке при осторожном перемешивании в течение максимального периода времени (ΐ) 15 мин. Потом в течение 15 мин добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют в течение 120 +/- 10 мин в темноте при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПЭГ -гРУШ очищают методом хроматографии с гидрофобными взаимодействиями (ХГВ), используя смолу низкого замещения фенилсефарозы РР (ОЕ НеаКЪсаге), упакованную в колонку, произведенную ОЕ НеаЙНсаге с толщиной слоя (Н) 15 см и конечным объемом колонки (ОК) 81 мл.
В реакционную смесь вносят ацетат аммония добавлением 50 мМ буферного раствора Гэпэс, содержащего 350 мМ хлорида натрия, 8 М ацетата аммония, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,9. Два объема реакционной смеси перемешивают с 1 объемом буферной системы, содержащей ацетат аммония, а значение рН раствора корректируют до рН 6,9 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора №ГОН. Эту смесь наносят на колонку для ХГВ при скорости потока 1 см/мин с последующей стадией промывки, используя > 3 ОК уравновешивающего буферного раствора (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 2,5 М ацетата аммония, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,9).
Для удаления побочных продуктов реакции и антихаотропной соли проводят вторую стадию промывки > 5 ОК промывочного буферного раствора 1 (50 мМ Гэпэс, 3 М хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,9) в режиме восходящего потока при скорости потока 2 см/мин. Потом проводят элюирование очищенного конъюгата гРУШ в режиме нисходящего потока, используя ступенчатый градиент из 40% промывочного буферного раствора 2 (50 мМ Гэпэс, 1,5 М хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,9) и 60 % элюирующего буферного раствора (20 мМ Гэпэс, 5 мМ хлорида кальция, рН 7,5) при скорости потока 1 см/мин. Процесс элюирования конъюгата ПЭГ-гРУШ отслеживают при 280 нм УФ, а элюат, содержащий конъюгат, собирают в объеме < 4 ОК. Стадию пост-элюирования проводят с > 3 ОК элюирующего буферного раствора в таких же условиях для отделения побочного и/или немодифицированного гРУШ от основного продукта.
В заключение, очищенный конъюгат концентрируют с помощью ультра-/диафильтрации (УФ/ДФ), используя мембрану, сделанную из регенерированной целлюлозы с отсеканием молекулярной массы 30 кДа (МПйроге).
Конъюгат, полученный с использованием этой методики, исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка и биологической активности в соотвестствии с методами, известными в этой области.
Метод 3:
гРУШ ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии БипЬпдЫ® СА от компании NОР (ΝΟΕ Согр., Токуо, 1арап). 7,84 мг гРУШ, растворенного в 6 мл буферного раствора Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) смешивают с 314 мкл водного раствора перйодата натрия (10 мМ) и 1,57 мл водного раствора м-толуидина (50 мМ). Далее добавляют аминооксиреагент до получения 20-кратного молярного избытка реагента. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ -гРУШ очищают ионообменной хроматографией на О-сефарозе РР. Конъюгат в концентрации 1,5 мг белка/мл геля наносят на колонку, предварительно уравновешенную 50 мМ буферным раствором Гэпэс, рН 7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Полученный конъюгат элюируют 50 мМ буферным раствором Гэпэс, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ хлоридом натрия, рН 7,4 и потом подвергают УФ/ДФ, используя мембрану на 30 кДа (88 см2 , МПйроге). Аналитическое исследование полученного конъюгата с помощью хромогенного анализа РУШ и определения общего белка (метод Брэдфорда) показывает удельную активность > 60% по сравнению с исходным веществом гРУШ.
- 56 028186
Способ 4:
гРУШ ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реагента является реагент серии БипЪггдЬ!® СА от компании ΝΟΡ (ΝΟΡ Согр., Токуо, 1арап). Исходную концентрацию или навеску гРУШ переносят или растворяют в буферном растворе Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 2 мг гРУШ /мл. Далее в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор перйодата натрия до получения конечной концентрации 100 мкМ с последующим добавлением 50 мМ водного раствора м-толуидина до достижения конечной концентрации 10 мМ в течение периода времени 30 мин. Потом добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описан выше) до получения 20-кратного молярного избытка. После коррекции рН до значения 6,0 смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора Ь-цистеина до получения конечной концентрации 10 мМ.
Свободный гРУШ удаляют с помощью ионообменной хроматографии (ИОХ). Реакционную смесь разбавили подходящим количеством Буферного раствора А (50 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 7,5) для коррекции проводимости растворов и значения рН перед нанесением на колонку НгРгер ОРР 16/10 объемом 20 мл (ОБ НеаПЬсаге, РапПеИ, СТ), предварительно уравновешенную Буферным раствором А. Потом колонку элюировали Буферным раствором В (50 мМ Гэпэс, 1 М №С1, 5 мМ СаС12, рН 7,5). Свободный гРУШ элюировали ступенчатым градиентом, используя 25% Буферного раствора В, что привело к проводимости полученной фракции и конъюгате в пределах 12-25 мСм/см при использовании ступенчатого градиента с 50% Буферного раствора В, что приводит к проводимости фракции конъюгата в пределах 2745 мСм/см. Далее повышают проводимость содержащей конъюгат фракции Буферным раствором С (50 мМ Гэпэс, 5 М №С1, 5 мМ СаС12, рН 6,9, при использовании антихаотропных солей, например, ацетата аммония, сульфата аммония и т.п.) и фракции наносят на колонку НгРгер Вн1у1 РР 16/10 объемом 20 мл (ОЕ НеаЬЬсате, РакЛеИ, СТ или сравнимый носитель для ХГВ) предварительно уравновешенную Буферным раствором Ό (50 мМ Гэпэс, 3 М №С1, 5 мМ СаС12, рН 6,9). Свободный ПЭГ-реагент вымыли Буферным раствором Ό в количестве 5 ОК. Далее конъюгат элюировали 100% Буферным раствором Е (50 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 7,4). Содержащие конъюгат фракции концентрируют с помощью УФ/ДФ, используя мембрану на 10 кДа, сделанную из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсекания 10 кДа, МгШроге). Заключительная стадия диафильтрации выполняется против буферного раствора Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 7,5).
Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (методики Брэдфорда и БХК) и биологической активности в соответствии с известными методами.
Пример 14. Полисиалирование тРУПа с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора
Способ 1:
Исходную концентрацию или навеску рекамбинантного фактора У11а (тРУПа) переносят или растворяют в реакционном буферном растворе (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 1,0 +/- 0,25 мг/мл. Потом рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора ΝΟΗ. Далее в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор периодата натрия до получения концентрации 50 мкМ. Реакцию окисления выполняют в течение 30 +/- 5 мин при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С. Потом реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь водного раствора Ь-цистеина (1 М) в пределах 15 мин при Т = +22 +/- 2°С до получения конечной концентрации 10 мМ и инкубацией в течение 60 +/- 5 мин.
Окисленный тРУПа дополнительно очищают методом анионообменной хроматографии на носителе ЕМИ ТМАЕ (М) (Мегск). Полученную смесь разбавляют Буферным раствором А (20 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 6,5) до получения проводимости 5 мСм/см. Этот раствор наносят на колонку для ИОХ (толщина слоя: 5,4 см) с объемом колонки 10 мл, используя скорость потока 1,5 см/мин. Далее колонку промывают (скорость потока: 1,5 см/мин) 5 ОК смеси 92:8 (мас./мас.) Буферного раствора А и Буферного раствора В (20 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, 1,0 М №С1, рН 7,0). Потом окисленный тРУПа элююруют смесью 50:50 (мас./мас.) Буферного раствора А и Буферного раствора В, с последующей стадией постэлюирования 5 ОК Буферного раствора В. Стадии элюирования проводятся ч использованием скорости потока 1,0 см/мин.
Далее к элюату, содержащему очищенный окисленный тРУПа, добавляют реагент аминооксиполисиаловую кислоту ПСΚ-ΟNΗ2) в 50-кратном молярном избытке при осторожном перемешивании в течение максимального периода времени (ΐ) 15 мин. Потом в течение 15 мин добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют в течение 120 +/- 10 мин в темноте при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПСК-тРУПа очищают методом хроматографии с гидрофобными взаимодействиями (ХГВ), используя смолу низкого замещения фенилсефарозы РР (ОЕ НеаЬЬсате), упакованную в колонку, произведенную ОЕ НеаЙНсаге с толщиной слоя (Ь) 15 см и конечным объемом колонки (ОК) 81 мл.
- 57 028186
В реакционную смесь вносят ацетат аммония добавлением 50 мМ буферного раствора Гэпэс, содержащего 350 мМ хлорида натрия, 8 М ацетата аммония, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,9. Два объема реакционной смеси перемешивают с 1 объемом буферной системы, содержащей ацетат аммония, а значение рН раствора корректируют до рН 6,9 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора ЫаОН. Эту смесь наносят на колонку для ХГВ при скорости потока 1 см/мин с последующей стадией промывки, используя > 3 ОК уравновешивающего буферного раствора (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 2,5 М ацетата аммония, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,9).
Для удаления побочных продуктов реакции и антихаотропной соли проводят вторую стадию промывки > 5 ОК промывочного буферного раствора 1 (50 мМ Гэпэс, 3 М хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,9) в режиме восходящего потока при скорости потока 2 см/мин. Потом проводят элюирование очищенного конъюгата гРУПа в режиме нисходящего потока, используя ступенчатый градиент из 40% промывочного буферного раствора 2 (50 мМ Гэпэс, 1,5 М хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,9) и 60% элюирующего буферного раствора (20 мМ Гэпэс, 5 мМ хлорида кальция, рН 7,5) при скорости потока 1 см/мин. Процесс элюирования конъюгата ПСК-гРУПа отслеживают при 280 нм УФ, а элюат, содержащий конъюгат, собирают в объеме < 4 ОК. Стадию пост-элюирования проводят с > 3 ОК элюирующего буферного раствора в таких же условиях для отделения побочного и/или немодифицированного гРУПа от основного продукта.
В заключение, очищенный конъюгат концентрируют с помощью ультра-/диафильтрации (УФ/ДФ), используя мембрану, сделанную из регенерированной целлюлозы, с подходящим порогом отсекания молекулярной массы (например, ПОММ 10 кДа, 88 см2, МПНроге).
Конъюгат, полученный с использованием этой методики, исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка, биологической активности и определением степени полисиалирования с помощью измерения содержания ПСК (анализ с резорцином).
Способ 2:
Исходную навеску или концентрацию гРУПа растворяют или переносят в реакционный буферный раствор (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 1,0 +/- 0,25 мг/мл. Потом рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора ЫаОН.
Далее к этому раствору гРУПа добавляют реагент аминооксиполисиаловую кислоту (ПСК-ОЫН2) в 50-кратном молярном избытке при осторожном перемешивании в течение максимального периода времени (!) 15 мин. Потом в течение 15 мин добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Наконец, добавляют 40 мМ водный раствор перйодата натрия до получения концентрации 150 мкМ.
Реакционную смесь инкубируют в течение 120 +/- 10 мин в темноте при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С при осторожном встряхивании. Потом реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь водного раствора Ь-цистеина (1М) до получения конечной концентрации в реакционной смеси 10 мМ и инкубацией в течение 60 +/- 5 мин.
Полученный конъюгат ПСК-гРУПа очищают методом хроматографии с гидрофобными взаимодействиями (ХГВ), используя смолу низкого замещения фенилсефарозы РР (СЕ НеаННсаге), упакованную в колонку, произведенную СЕ НеаННсаге с толщиной слоя (Н) 15 см и конечным объемом колонки (ОК) 81 мл.
В реакционную смесь вносят ацетат аммония добавлением 50 мМ буферного раствора Гэпэс, содержащего 350 мМ хлорида натрия, 8 М ацетата аммония, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,9. Два объема реакционной смеси перемешивают с 1 объемом буферной системы, содержащей ацетат аммония, а значение рН раствора корректируют до рН 6,9 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора ЫаОН. Эту смесь наносят на колонку для ХГВ при скорости потока 1 см/мин с последующей стадией промывки, используя > 3 ОК уравновешивающего буферного раствора (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 2,5 М ацетата аммония, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,9).
Для удаления побочных продуктов реакции и антихаотропной соли проводят вторую стадию промывки > 5 ОК промывочного буферного раствора 1 (50 мМ Гэпэс, 3 М хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,9) в режиме восходящего потока при скорости потока 2 см/мин. Потом проводят элюирование очищенного конъюгата гРУПа в режиме нисходящего потока, используя ступенчатый градиент из 40% промывочного буферного раствора 2 (50 мМ Гэпэс, 1,5 М хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,9) и 60% элюирующего буферного раствора (20 мМ Гэпэс, 5 мМ хлорида кальция, рН 7,5) при скорости потока 1 см/мин. Процесс элюирования конъюгата ПСК-гРУПа отслеживают при 280 нм УФ, а элюат, содержащий конъюгат, собирали в объеме < 4 ОК. Стадию пост-элюирования проводят с > 3 ОК элюирующего буферного раствора в таких же условиях для отделения побочного и/или немодифицированного гРУПа от основного продукта.
В заключение, очищенный конъюгат концентрируют с помощью ультра-/диафильтрации (УФ/ДФ), используя мембрану, сделанную из регенерированной целлюлозы (МПНроге).
Конъюгаты, полученные с использованием этой методики, исследуют аналитическими методами
- 58 028186 путем измерения общего белка, биологической активности в соотвествии с методами, известными в этой области, и определением степени полисиалирования с помощью измерения содержания ПСК (анализ с резорцином).
Пример 15. ПЭГилирование гРК с использованием реагента аминоокси-ПЭГ и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора
Способ 1:
гРК ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии διιΐ'Λπ§1ιΙ® СА от компании NОР (ΝΟΕ Согр., Το1<\Ό, 1араи). Исходную навеску или концентрацию гЕК растворяют или переносят в реакционный буферный раствор (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 1,0 +/- 0,25 мг/мл. Потом рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора НС1. Далее в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор перйодата натрия до получения концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления выполняют в течение 30 +/- 5 мин при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С. Потом реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь водного раствора Ь-цистеина (1 М) в пределах 15 мин при Т = +22 +/- 2°С до получения конечной концентрации 10 мМ и инкубацией в течение 60 +/-5 мин.
Окисленный гРУШ дополнительно очищают методом анионообменной хроматографии на носителе ΕΜΌ ΤΜΑΕ (Μ) (Μе^ск). Полученную смесь разбавляют Буферным раствором А (20 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 6,5) до получения проводимости 5 мСм/см. Этот раствор наносят на колонку для ИОХ (толщина слоя: 5,4 см) с объемом колонки 10 мл, используя скорость потока 1,5 см/мин. Далее колонку промывают (скорость потока: 1,5 см/мин) 5 ОК смеси 92:8 (мас./мас.) Буферного раствора А и Буферного раствора В (20 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, 1,0 М №С1, рН 7,0). Потом окисленный гРК элююруют смесью 50:50 (мас./мас.) Буферного раствора А и Буферного раствора В, с последующей стадией пост-элюирования 5 ОК Буферного раствора В. Стадии элюирования проводятся с использованием скорости потока 1,0 см/мин.
Далее к элюату, содержащему очищенный окисленный тРК, добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке при осторожном перемешивании в течение максимального периода времени (ί) 15 мин. Потом в течение 15 мин добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют в течение 120 +/- 10 мин в темноте при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПЭГ -ГРК очищают методом хроматографии с гидрофобными взаимодействиями (ХГВ), используя смолу низкого замещения фенилсефарозы РР (СЕ НеаЬЬсаге), упакованную в колонку, произведенную СЕ НеаИЬсаге с толщиной слоя (Ь) 15 см и конечным объемом колонки (ОК) 81 мл.
В реакционную смесь вносят ацетат аммония добавлением 50 мМ буферного раствора Гэпэс, содержащего 350 мМ хлорида натрия, 8 М ацетата аммония, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,9. Два объема реакционной смеси перемешивают с 1 объемом буферной системы, содержащей ацетат аммония, а значение рН раствора корректируют до рН 6,9 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора Ν;·ιΟΗ. Эту смесь наносят на колонку для ХГВ при скорости потока 1 см/мин с последующей стадией промывки, используя > 3 ОК уравновешивающего буферного раствора (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 2,5 М ацетата аммония, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,9).
Для удаления побочных продуктов реакции и антихаотропной соли проводят вторую стадию промывки > 5 ОК промывочного буферного раствора 1 (50 мМ Гэпэс, 3 М хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,9) в режиме восходящего потока при скорости потока 2 см/мин. Потом проводят элюирование очищенного конъюгата тРК в режиме нисходящего потока, используя ступенчатый градиент из 40% промывочного буферного раствора 2 (50 мМ Гэпэс, 1,5 М хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,9) и 60% элюирующего буферного раствора (20 мМ Гэпэс, 5 мМ хлорида кальция, рН 7,5) при скорости потока 1 см/мин. Процесс элюирования конъюгата ПЭГ -ГРК отслеживают при 280 нм УФ, а элюат, содержащий конъюгат, собирают в объеме < 4 ОК. Стадию пост-элюирования проводят с > 3 ОК элюирующего буферного раствора в таких же условиях для отделения побочного и/или немодифицированного тРК от основного продукта.
В заключение, очищенный конъюгат концентрируют с помощью ультра-/диафильтрации (УФ/ДФ), используя мембрану, сделанную из регенерированной целлюлозы с отсеканием молекулярной массы 10 кДа (88 см2, Μ^Шρο^е).
Конъюгат, полученный с использованием этой методики, исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка и биологической активности в соотвестствии с методами, известными в этой области.
Способ 2:
тРК ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реагента является реагент серии διιΐ'Λπ§1ιΙ® СА от компании NΟР ^ОР Согр., Щкуо, .Гараи).
- 59 028186
Исходную концентрацию или навеску гРбХ переносят или растворяют в буферном растворе Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 2 мг гРбХ /мл. Далее в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор перйодата натрия до получения конечной концентрации 100 мкМ с последующим добавлением 50 мМ водного раствора мтолуидина до достижения конечной концентрации 10 мМ в течение периода времени 30 мин. Потом добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описан выше) до получения 20-кратного молярного избытка реагента. После коррекции рН до значения 6,0 смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора Ь-цистеина до получения конечной концентрации 10 мМ.
Свободный гР1Х удаляют с помощью ионообменной хроматографии (ИОХ). Реакционную смесь разбавили подходящим количеством Буферного раствора А (50 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 7,5) для коррекции проводимости растворов и значения рН перед нанесением на колонку ШРтер ОРР 16/10 объемом 20 мл (ОЕ НеаНйсате, Рабгйе1б, СТ), предварительно уравновешенную Буферным раствором А. Потом колонку элюировали Буферным раствором В (50 мМ Гэпэс, 1 М №С1, 5 мМ СаС12, рН 7,5). Свободный гР1Х элюировали ступенчатым градиентом, используя 25% Буферного раствора В, что приводит к проводимости полученной фракции и конъюгате в пределах 12-25 мСм/см при использовании ступенчатого градиента с 50% Буферного раствора В, что приводит к проводимости фракции конъюгата в пределах 2745 мСм/см. Далее повышают проводимость содержащей конъюгат фракции Буферным раствором С (50 мМ Гэпэс, 5 М №С1, 5 мМ СаС12, рН 6,9, при использовании антихаотропных солей, например, ацетата аммония и т.п.) и фракции наносят на колонку ШРгер Вн1у1 РР 16/10 объемом 20 мл (ОЕ НеаНйсате, РаНйе1б, СТ или сравнимый носитель для ХГВ), предварительно уравновешенную Буферным раствором Ό (50 мМ Гэпэс, 3 М №С1, 5 мМ СаС12, рН 6,9). Свободный реагент аминоокси-ПЭГ вымыли Буферным раствором Ό в количестве 5 ОК. Далее конъюгат элюировали 100% Буферным раствором Е (50 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 7,4). Содержащие конъюгат фракции концентрируют с помощью УФ/ДФ, используя мембрану на 10 кДа, сделанную из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсекания 10 кДа, МбШроге). Заключительная стадия диафильтрации выполняется против буферного раствора Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 7,5).
Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (методики Брэдфорда и БХК) и биологической активности в соответствии с известными методами.
Пример 16. ПЭГилирование гРУбба с использованием реагента аминоокси-ПЭГ и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора
Способ 1:
гРУбба ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реагента является реагент серии διιΐ'Λ^ΙιΙ® СА от компании ΝΟΡ (ΝΟΡ Согр., Токуо, баран). Исходную навеску или концентрацию тРУбба растворяют или переносят в реакционный буферный раствор (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 1,0 +/- 0,25 мг/мл. Потом рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора №ОН. Далее в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор перйодата натрия до получения концентрации 50 мкМ. Реакцию окисления выполняют в течение 30 +/- 5 мин при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С. Потом реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь водного раствора Ь-цистеина (1 М) в пределах 15 мин при Т = +22 +/2°С до получения конечной концентрации 10 мМ и инкубацией в течение 60 +/- 5 мин.
Окисленный гРУбба дополнительно очищают методом анионообменной хроматографии на носителе ΕΜΌ ТМАЕ (М) (Мегск). Полученную смесь разбавляют Буферным раствором А (20 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 6,5) до получения проводимости 5 мСм/см. Этот раствор наносят на колонку для ИОХ (толщина слоя: 5,4 см) с объемом колонки 10 мл, используя скорость потока 1,5 см/мин. Далее колонку промывают (скорость потока: 1,5 см/мин) 5 ОК смеси 92:8 (мас./мас.) Буферного раствора А и Буферного раствора В (20 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, 1,0 М №С1, рН 7,0).
Потом окисленный гРУбба элююруют смесью 50:50 (мас./мас.) Буферного раствора А и Буферного раствора В, с последующей стадией пост-элюирования 5 ОК Буферного раствора В. Стадии элюирования проводятся ч использованием скорости потока 1,0 см/мин.
Далее к элюату, содержащему очищенный окисленный гРУбба, добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке при осторожном перемешивании в течение максимального периода времени (I) 15 мин. Потом в течение 15 мин добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют в течение 120 +/- 10 мин в темноте при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПЭГ -гРУбба очищают методом хроматографии с гидрофобными взаимодействиями (ХГВ), используя смолу низкого замещения фенилсефарозы РР (ОЕ НеаНйсате), упакованную в колонку, произведенную ОЕ НеаНйсате с толщиной слоя (й) 15 см и конечным объемом колонки (ОК) 81 мл.
- 60 028186
В реакционную смесь вносят ацетат аммония добавлением 50 мМ буферного раствора Гэпэс, содержащего 350 мМ хлорида натрия, 8 М ацетата аммония, 5 мМ хлорид кальция, рН 6,9. Два объема реакционной смеси перемешивают с 1 объемом буферной системы, содержащей ацетат аммония, а значение рН раствора корректируют до рН 6,9 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора Ν;·ι0Η. Эту смесь наносят на колонку для ХГВ при скорости потока 1 см/мин с последующей стадией промывки, используя > 3 ОК уравновешивающего буферного раствора (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 2,5 М ацетата аммония, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,9).
Для удаления побочных продуктов реакции и антихаотропной соли проводят вторую стадию промывки > 5 ОК промывочного буферного раствора 1 (50 мМ Гэпэс, 3 М хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,9) в режиме восходящего потока при скорости потока 2 см/мин. Потом проводят элюирование очищенного конъюгата гРУПа в режиме нисходящего потока, используя ступенчатый градиент из 40% промывочного буферного раствора 2 (50 мМ Гэпэс, 1,5 М хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,9) и 60% элюирующего буферного раствора (20 мМ Гэпэс, 5 мМ хлорида кальция, рН 7,5) при скорости потока 1 см/мин. Процесс элюирования конъюгата ПЭГ-гРУПа отслеживают при 280 нм УФ, а элюат, содержащий конъюгат, собирают в объеме < 4 ОК. Стадию пост-элюирования проводят с > 3 ОК элюирующего буферного раствора в таких же условиях для отделения побочного и/или немодифицированного гРУПа от основного продукта.
В заключение, очищенный конъюгат концентрируют с помощью ультра-/диафильтрации (УФ/ДФ), используя мембрану, сделанную из регенерированной целлюлозы с отсеканием молекулярной массы 10 кДа (МПЛроге).
Конъюгат, полученный с использованием этой методики, исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка и биологической активности в соотвестствии с методами, известными в этой области.
Способ 2:
гРУПа ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии ЗипЬпдЫ® СА от компании N0Р (Ν0Ε Согр., Токуо, 1арап). Исходную концентрацию или навеску гРУПа переносят или растворяют в буферном растворе Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 2 мг гРУПа /мл. Далее в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор перйодата натрия до получения конечной концентрации 100 мкМ с последующим добавлением 50 мМ водного раствора м-толуидина до достижения конечной концентрации 10 мМ в течение периода времени 30 мин. Потом добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описан выше) до получения 20-кратного молярного избытка реагента. После коррекции рН до значения 6,0 смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора Ьцистеина до получения конечной концентрации 10 мМ.
Свободный гРУПа удаляют с помощью ионообменной хроматографии (ИОХ). Реакционную смесь разбавили подходящим количеством Буферного раствора А (50 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 7,5) для коррекции проводимости растворов и значения рН перед нанесением на колонку ШРгер ОРР 16/10 объемом 20 мл (ОЕ НеаЛЬсаге, Ра1гйе1П, СТ), предварительно уравновешенную Буферным раствором А. Потом колонку элюировали Буферным раствором В (50 мМ Гэпэс, 1 М ИаС1, 5 мМ СаС12, рН 7,5). Свободный гРУПа элюировали ступенчатым градиентом, используя 25 % Буферного раствора В, что привело к проводимости полученной фракции и конъюгате в пределах 12-25 мСм/см при использовании ступенчатого градиента с 50% Буферного раствора В, что приводит к проводимости фракции конъюгата в пределах 2745 мСм/см. Далее повышают проводимость содержащей конъюгат фракции Буферным раствором С (50 мМ Гэпэс, 5 М ИаС1, 5 мМ СаС12, рН 6,9, при использовании антихаотропных солей, например ацетата аммония) и фракции наносят на колонку ШРгер Ви1у1 РР 16/10 объемом 20 мл (ОЕ НеаЛЬсаге, Ра1гйе1П, СТ или сравнимый носитель для ХГВ), предварительно уравновешенную Буферным раствором Ό (50 мМ Гэпэс, 3 М ИаС1, 5 мМ СаС12, рН 6,9). Свободный ПЭГ-реагент вымыли Буферным раствором Ό в количестве 5 ОК. Далее конъюгат элюировали 100 % Буферным раствором Е (50 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 7,4). Содержащие конъюгат фракции концентрируют с помощью УФ/ДФ, используя мембрану на 10 кДа, сделанную из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсекания 10 кДа, МПЛроге). Заключительная стадия диафильтрации выполняется против буферного раствора Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 7,5).
Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (методики Брэдфорда и БХК) и биологической активности в соответствии с известными методами.
Пример 17. Полисиалирование гРК в присутствии о-аминобензойной кислоты
Способ 1:
8,2 мг гРК растворяют в 4,0 мл гистидинового буферного раствора, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ ИаС1, 5 мМ СаС12). Потом добавляют 82 мкл водного раствора перйодата натрия (5 мМ) и реакционную смесь инкубируют в течение 1 ч в темноте при 4°С при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 4 мкл 1 М водного раствора цис- 61 028186 теина. Далее смесь подвергают УФ/ДФ с применением центрифужных фильтрационных устройств У1ν;·ΐ5ρίπ 6 10 кДа для удаления избытка перйодата, гасителя реакции и их побочных продуктов.
Концентрат (6,5 мл), содержащий окисленный гР1Х, смешивают с 1,64 мл водного раствора оаминобензойной кислоты (50 мМ) и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Потом добавляют реагент аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) до получения 5-кратного молярного избытка реагента. Эту смесь инкубировали в течение 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
Дальнейшую очистку конъюгата проводят, как описано в данном документе.
Способ 2:
Приготовили раствор 1 мг гР1Х в 0,65 мл буферного раствора фосфата натрия, рН 6,0, содержащий 5-кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше). Потом в качестве нуклеофильного катализатора добавили 333 мкл водного раствора о-аминобензойной кислоты (30 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Далее добавили 20 мкл водного раствора №1О4 (5 мМ) до обеспечения конечной концентрации 100 мкМ. Процесс связывания проводили в течение 2 ч в темноте при осторожном перемешивании при комнатной температуре и остановили реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 мкл водного раствора цистеина (1 М). Дальнейшую очистку конъюгата проводят, как описано в данном документе.
Пример 18. Полисиалирование ЭПО с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора
Способ 1:
Исходную концентрацию эритропоэтина (ЭПО) переносят в реакционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) и разбавляют его до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют №1О4 до получения конечной концентрации 200 мкМ. Проводят окисление при КТ в течение 30 мин в темноте при осторожном встряхивании. Потом реакцию останавливают цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ.
После этого раствор подвергают УФ/ДФ с использованием центрифужных фильтрационных устройств Угуа5р1п для удаления избытка перйодата, гасителя и их побочных продуктов или, в качестве альтернативы, переносят на колонку для ИОХ объемом 20 мл (Мегск ЕМО ТМАЕ (М)), которая уравновешивается Буферным раствором А (20 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 7,0). Колонку уравновешивают 5 ОК Буферного раствора А. Окисленный ЭПО элюируют Буферным раствором В (20 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, 1 М №С1, рН 7,0). Собирают фракции, содержащие ЭПО. Определяют содержание белка (Кумасси, метод Брэдфорда), корректируют его до 1 мг/мл с помощью реакционного буферного раствора и корректируют рН до 6,0 добавлением по каплям 0,5 М НС1.
Добавляют 50-кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию связывания проводят в течение 2 ч в темноте при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Избыток реагента аминоокси-ПСК удаляют с помощью ХГВ. Проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буферного раствора, содержащего ацетат аммония (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, 8 М ацетата аммония, рН 6,9) и смесь наносят на колонку, заполненную 80 мл фенилсефарозы РР (ОЕ НеаИЬсаге, Ра1гйе1б, СТ), предварительно уравновешенную раствором 50 мМ Гэпэс, 2,5 М ацетата аммония, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,9. Далее конъюгат элюируют 50 мМ буферным раствором Гэпэс с рН 7,5, содержащим 5 мМ СаС12. Наконец, содержащие ПСК-ЭПО фракции собирают и подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (ПОММ 10 кДа, 50 см2, ΜΠ^οι^. После этого препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения способ 1 выполняется следующим образом.
мг ЭПО растворяют в 5 мл гистидинового буферного раствора, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ №С1). Потом добавляют 100 мкл водного раствора перйодата натрия (5 мМ) и реакционную смесь инкубируют в течение 1 ч в темноте при 4°С при осторожном перемешивании, и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 50 мкл 1 М водного раствора цистеина. Далее смесь подвергают УФ/ДФ с применением центрифужных фильтрационных устройств Угуа5р1п 15Р 10 кДа для удаления избытка перйодата, гасителя реакции и их побочных продуктов.
Концентрат (приблиз. 7 мл), содержащий окисленный ЭПО, смешивают с 2 мл водного раствора мтолуидина (50 мМ) и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Потом добавляют реагент аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) до получения 5-кратного молярного избытка реагента. Эту смесь инкубируют в течение 2,5 ч при КТ в темноте при осторожном перемешивании.
Свободный ЭПО удаляют с помощью анионообменной хроматографии (АОХ). Реакционную смесь разбавляют 20 мл Буферного раствора А (50 мМ Гэпэс, рН 7,5) и наносят на колонку Н1Ргер ОРТ 16/10 объемом 20 мл (ОЕ Неа1!Ьсаге, Ра1гйе1б, СТ), предварительно уравновешенную Буферным раствором А. Потом колонку элюируют Буферным раствором В (50 мМ Гэпэс, 1 М №С1, рН 7,5). Свободный ЭПО элюируют промыванием колонки 25% Буферным раствором В, а конъюгат - 50% Буферным раствором В.
- 62 028186
Проводимость содержащих конъюгат фракций впоследствии повышают до ~190 мСм/см Буферным раствором С (50 мМ Гэпэс, 5 М №С1, рН 6,9) и наносят на колонку ШРгер Ви1у1 РР 16/10 объемом 20 мл (СЕ РаиНеИ, СТ) предварительно уравновешенную Буферным раствором Ό (50 мМ Гэпэс, 3
М №С1, рН 6,9). Свободный реагент ПСК вымывают Буферным раствором Ό в количестве 5 ОК. Далее конъюгат элюируют 100% Буферным раствором Е (50 мМ Гэпэс, рН 7,4). Содержащие конъюгат фракции концентрируют с помощью УФ/ДФ, используя мембрану на 10 кДа, сделанную из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсекания 10 кДа/М^11^ρο^е). Конечную стадию диафильтрации проводят против гистидинового буферного раствора с рН 7,2, содержащего 150 мМ №С1. Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области. Для конъюгата ПСК-ЭПО определили удельную активность > 50% по сравнению с активностью нативного ЭПО. Конъюгат дополнительно исследовали аналитическими методами с помощью эксклюзионной ВЭЖХ, используя систему ВЭЖХ ЛдПеп! 1200, оборудованную колонкой 51юбе\ К\У 803 в описаных ранее условиях (ΚοΡιιΌι е! а1., ТгапзГшюп 2006; 46:1959-77). Показано, что полученный препарат не содержит свободного ЭПО.
Способ 2:
ЭПО переносят или растворяют в реакционном буферном растворе (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 1,0 +/0,25 мг/мл. Потом рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора ΗΟ. Далее в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор перйодата натрия до получения концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления выполняют в течение 30 +/- 5 мин при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С. Потом реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь водного раствора Ь-цистеина (1 М) в пределах 15 мин при Т = +22 +/- 2°С до получения конечной концентрации 10 мМ и инкубацией в течение 60 +/-5 мин.
Окисленный ЭПО дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие окисленный ЭПО фракции элюата собирают и используют в реакции конъюгации.
К элюату, содержащему очищенный окисленный ЭПО, добавляют реагент аминооксиполисиаловую кислоту (ПСК-ΟNΗ2) в 50-кратном молярном избытке при осторожном перемешивании в течение максимального периода времени (ΐ) 15 мин. Потом в течение 15 мин добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют в течение 120 +/- 10 мин при рН 6,0 в темноте при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С при осторожном встряхивании (концентрация белка: 1 мг/мл).
Полученный конъюгат ПСК-ЭПО дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие конъюгат ПСК-ЭПО фракции собирают и концентрируют с помощью ультра-/диафильтрации (УФ/ДФ), используя мембрану, сделанную из регенерированной целлюлозы, с подходящим порогом отсекания молекулярной массы (М^11^ρο^е).
Конъюгат, полученный с использованием этой методики, исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка, биологической активности и определением степени полисиалирования с помощью измерения содержания ПСК (анализ с резорцином).
Способ 3:
Эритропоэтин (ЭПО) переносят в реакционный буферный раствор (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) и разбавляют его до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и NаIΟ4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию связывания проводят в течение 2 ч в темноте при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Далее реакцию останавливают цистеином (концентрация цистеина: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ. Потом проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буферного раствора, содержащего ацетат аммония (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, 8 М ацетата аммония, рН 6,9) и смесь наносят на колонку, заполненную фенилсефарозой РР (СЕ ^:1161::11^ РаиПеИ, СТ), предварительно уравновешенную раствором 50 мМ Гэпэс, 2,5 М ацетата аммония, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, 0,01% Твина 80, рН 6,9. Далее конъюгат элюируют раствором 50 мМ Гэпэс, 5 мМ хлорида кальция, рН 7,5. Наконец, содержащие ПСК-ЭПО фракции собирают и подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (ПОММ 10 кДа, 88 см2, ΜίΠίροΐΌ). Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения способ 3 выполняется следующим образом. 10 мг ЭПО растворяют в 8 мл гистидинового буферного раствора, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ №С1). Потом добавляют 200 мкл водного раствора перйодата натрия (5 мМ) и 2 мл водного раствора мтолуидина (50 мМ). Далее добавляют реагент аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) до получения 5-кратного молярного избытка реагента. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной
- 63 028186 температуре добавлением 100 мкл 1 М водного раствора цистеина.
Свободный ЭПО удаляют с помощью анионообменной хроматографии (АОХ). Реакционную смесь разбавляют 20 мл Буферного раствора А (50 мМ Гэпэс, рН 7,5) и наносят на колонку Н1Ргер ОРР 16/10 объемом 20 мл (СЕ НеаННсаге, РаИПеШ СТ), предварительно уравновешенную Буферным раствором А. Потом колонку элюируют Буферным раствором В (50 мМ Гэпэс, 1 М №С1, рН 7,5). Свободный ЭПО элюируют промыванием колонки 25% Буферным раствором В, а конъюгат - 50% Буферным раствором В. Проводимость содержащих конъюгат фракций впоследствии повышают до ~190 мСм/см Буферным раствором С (50 мМ Гэпэс, 5 М №С1, рН 6,9) и наносят на колонку ШРгер Ви1у1 РР 16/10 объемом 20 мл (СЕ НеаННсаге, Р;нгПе1П, СТ) предварительно уравновешенную Буферным раствором Ό (50 мМ Гэпэс, 3 М №С1, рН 6,9). Свободный реагент ПСК вымывают Буферным раствором Ό в количестве 5 ОК.
Далее конъюгат элюируют 100% Буферным раствором Е (50 мМ Гэпэс, рН 7,4). Содержащие конъюгат фракции концентрируют с помощью УФ/ДФ, используя мембрану на 10 кДа, сделанную из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсекания 10 кДа, МПИроге). Конечную стадию диафильтрации проводят против гистидинового буферного раствора с рН 7,2, содержащего 150 мМ №С1. Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области. Для конъюгата ПСК-ЭПО определили удельную активность > 50% по сравнению с активностью нативного ЭПО. Конъюгат дополнительно исследовали аналитическими методами с помощью эксклюзионной ВЭЖХ, используя систему ВЭЖХ АдйеШ 1200, оборудованную колонкой 8Нойех К\У 803 в описаных ранее условиях (Ко1апсН е1 а1., Тгапк£икюп 2006; 46:1959-77). Показано, что полученный препарат не содержит свободного ЭПО.
Способ 4:
ЭПО растворяют или переносят в реакционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 1,0 +/- 0,25 мг/мл. Потом рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора НС1.
Далее к этому раствору ЭПО добавляют реагент аминоокси-полисиаловую кислоту (ПСК-ОNН2) в 50-кратном молярном избытке при осторожном перемешивании в течение максимального периода времени (ΐ) 15 мин. Потом в течение 15 мин добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Наконец, добавляют 40 мМ водный раствор перйодата натрия до получения концентрации 400 мкМ.
Реакционную смесь инкубируют в течение 120 +/- 10 мин в темноте при температуре (Т) Т = +22 +/2°С при осторожном встряхивании. Потом реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь водного раствора Ь-цистеина (1 М) до получения конечной концентрации в реакционной смеси 10 мМ и инкубацией в течение 60 +/- 5 мин.
Полученный конъюгат ПСК-ЭПО очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие ПСК-ЭПО фракции элюата собирают и концентрируют ультра-/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (ПОММ 10 кДа, 88 см2, МПИроге).
Конъюгаты, полученные с использованием этой методики, исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка, биологической активности в соотвествии с методами, известными в этой области, и определением степени полисиалирования с помощью измерения содержания ПСК (анализ с резорцином).
Пример 19. Полисиалирование Апд-2 с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора
Способ 1:
Исходную концентрацию ангиопоэтина-2 (Апд-2) переносят в реакционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) и разбавляют его до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют КаЮ( до получения конечной концентрации 200 мкМ. Проводят окисление при КТ в течение 30 мин в темноте при осторожном встряхивании. Потом реакцию останавливают цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ.
После этого раствор подвергают УФ/ДФ с использованием центрифужных фильтрационных устройств Ущакрш для удаления избытка перйодата, гасителя и побочных продуктов или, в качестве альтернативы, переносят на колонку для ИОХ объемом 20 мл (Мегск ЕМИ ТМАЕ (М)), которая уравновешивается Буферным раствором А (20 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 7,0). Колонку уравновешивают 5 ОК Буферного раствора А. Окисленный Апд-2 элюируют Буферным раствором В (20 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, 1М №С1, рН 7,0). Собирают фракции, содержащие Апд-2. Определяют содержание белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и корректируют его до 1 мг/мл с помощью реакционного буферного раствора и корректируют рН до 6,0 добавлением по каплям 0,5 М НС1.
Добавляют 50-кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию связывания проводят в течение 2 ч в темноте при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Избыток аминооксиреагента удаляют с помощью ХГВ. Проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буферного раствора, содержащего ацетат аммония (50 мМ Гэ- 64 028186 пэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, 8 М ацетата аммония, рН 6,9) и смесь наносят на колонку, заполненную 80 мл фенилсефарозы РР (СЕ НеаНЬсаге, Ра1гйе1П, СТ), предварительно уравновешенную раствором 50 мМ Гэпэс, 2,5 М ацетата аммония, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,9. Далее конъюгат элюируют 50 мМ буферным раствором Гэпэс с рН 7,5, содержащим 5 мМ СаС12. Наконец, содержащие ПСК-Апд-2 фракции собирают и подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (МПНроге). После этого препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения способ 1 выполняется следующим образом. Ангиопоэтин-2 (Ап§-2) переносят в реакционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) и разбавляют его до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют Ыа1О4 до получения конечной концентрации 200 мкМ. Проводят окисление при КТ в течение 30 мин в темноте при осторожном встряхивании. Потом реакцию останавливают цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ.
После этого раствор подвергают УФ/ДФ с применением центрифужных фильтрационных устройств Утуазрт для удаления избытка перйодата, гасителя реакции и их побочных продуктов.
Добавляют 50-кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию связывания проводят в течение 2 ч в темноте при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Избыток аминоокси реагента удаляют с помощью ионообменной хроматографии. Содержащие конъюгат ПСК-Апд-2 фракции элюата собирают и подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (МПНроге). После этого препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
Способ 2:
Апд-2 переносят или растворяют в реакционном буферном растворе (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 1,0 +/0,25 мг/мл. Потом рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора НС1. Далее в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор перйодата натрия до получения концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления выполняют в течение 30 +/- 5 мин при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С. Потом реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь водного раствора Ь-цистеина (1 М) в пределах 15 мин при Т = +22 +/- 2°С до получения конечной концентрации 10 мМ и инкубацией в течение 60 +/-5 мин.
Окисленный Апд-2 дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие окисленный Апд-2 фракции элюата собирают и используют в реакции конъюгации.
К элюату, содержащему очищенный окисленный Апд-2, добавляют реагент аминооксиполисиаловую кислоту (ПСК-ОКН2) в 50-кратном молярном избытке при осторожном перемешивании в течение максимального периода времени (ΐ) 15 мин. Потом в течение 15 мин добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют в течение 120 +/- 10 мин при рН 6,0 в темноте при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С при осторожном встряхивании (концентрация белка: 1 мг/мл).
Полученный конъюгат ПСК-Ап§-2 дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии.
Содержащие конъюгат ПСК-Апд-2 фракции собирают и концентрируют с помощью ультра-/диафильтрации (УФ/ДФ), используя мембрану, сделанную из регенерированной целлюлозы, с подходящим порогом отсекания молекулярной массы (МПНроге).
Конъюгат, полученный с использованием этой методики, исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка, биологической активности и определением степени полисиалирования с помощью измерения содержания ПСК (анализ с резорцином).
Способ 3:
Ангиопоэтин-2 (Ап§-2) переносят в реакционный буферный раствор (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) и разбавляют его до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и №ПО4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию связывания проводят в течение 2 ч в темноте при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Далее реакцию останавливают цистеином (концентрация цистеина: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ. Потом проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буферного раствора, содержащего ацетат аммония (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, 8 М ацетата аммония, рН 6,9) и смесь наносят на колонку, заполненную фенилсефарозой РР (СЕ НеаНЬсаге, Ра1гйе1П, СТ), предварительно уравновешенную раствором 50 мМ Гэпэс, 2,5 М ацетата аммония, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, 0,01% Твина 80,
- 65 028186 рН 6,9. Далее конъюгат элюируют раствором 50 мМ Гэпэс, 5 мМ хлорида кальция, рН 7,5. Наконец, содержащие ПСК-Апд-2 фракции собирают и подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (МППроге). Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения способ 3 выполняется следующим образом. Ангиопоэтин-2 (Апд-2) переносят в реакционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) и разбавляют его до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением м-толуидина в качестве нуклеоф ильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и Ν;·ιΙΟ4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию связывания проводят в течение 2 ч в темноте при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Далее реакцию останавливают цистеином (концентрация цистеина: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ и конъюгат очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие ПСК-Апд-2 фракции элюата собирают и подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (МППроге). Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
Способ 4:
Апд-2 растворяют или переносят в реакционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 1,0 +/0,25 мг/мл. Потом рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора НС1.
Далее к этому раствору Апд-2 добавляют реагент аминооксиполисиаловую кислоту (ПСК-ОИН2) в 50-кратном молярном избытке при осторожном перемешивании в течение максимального периода времени (1) 15 минут. Потом в течение 15 минут добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Наконец, добавляют 40 мМ водный раствор перйодата натрия до получения концентрации 400 мкМ.
Реакционную смесь инкубируют в течение 120 +/- 10 мин в темноте при температуре (Т) Т = +22 +/2°С при осторожном встряхивании. Потом реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь водного раствора Ь-цистеина (1 М) до получения конечной концентрации в реакционной смеси 10 мМ и инкубацией в течение 60 +/- 5 мин.
Полученный конъюгат ПСК-Апд-2 очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие ПСК-Апд-2 фракции элюата собирают и концентрируют ультра-/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (МППроге).
Конъюгаты, полученные с использованием этой методики, исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка, биологической активности в соотвествии с методами, известными в этой области, и определением степени полисиалирования с помощью измерения содержания ПСК (анализ с резорцином).
Пример 20. Полисиалирование ФРЭС с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора
Способ 1:
Исходную концентрацию фактора роста эндотелия сосудов (ФРЭС) переносят в реакционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) и разбавляют его до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют №ПО4 до получения конечной концентрации 200 мкМ. Проводят окисление при КТ в течение 30 мин в темноте при осторожном встряхивании. Потом реакцию останавливают цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ.
После этого раствор подвергают УФ/ДФ с использованием центрифужных фильтрационных устройств УАакрш для удаления избытка перйодата, гасителя и их побочных продуктов или, в качестве альтернативы, переносят на колонку для ИОХ объемом 20 мл (Мегск ЕМИ ТМАЕ (М)), которая уравновешивается Буферным раствором А (20 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 7,0). Колонку уравновешивают 5 ОК Буферного раствора А. Окисленный ФРЭС элюируют Буферным раствором В (20 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, 1М №С1, рН 7,0). Собирают фракции, содержащие ФРЭС. Определяют содержание белка (Кумасси, метод Брэдфорда), корректируют его до 1 мг/мл с помощью реакционного буферного раствора и корректируют рН до 6,0 добавлением по каплям 0,5 М №ОН.
Добавляют 50-кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию связывания проводят в течение 2 ч в темноте при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Избыток аминоокси реагента удаляют с помощью ХГВ. Проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буферного раствора, содержащего ацетат аммония (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, 8 М ацетата аммония, рН 6,9) и смесь наносят на колонку, заполненную 80 мл фенилсефарозы РР (СЕ НеаППсаге, Ра1гйе1П, СТ), предварительно уравновешенную раствором 50 мМ Гэпэс, 2,5 М ацетата аммония, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида каль- 66 028186 ция, рН 6,9. Далее конъюгат элюируют 50 мМ буферным раствором Гэпэс с рН 7,5, содержащим 5 мМ СаС12. Наконец, содержащие ПСК-ФРЭС фракции собирают и подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (МГШроге). После этого препарат исследуютаналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения способ 1 выполняется следующим образом. Фактор роста эндотелия сосудов (ФРЭС) переносят в реакционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) и разбавляют его до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют NаIΟ4 до получения конечной концентрации 200 мкМ. Проводят окисление при КТ в течение 30 мин в темноте при осторожном встряхивании. Потом реакцию останавливают цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ.
После этого раствор подвергают УФ/ДФ с применением центрифужных фильтрационных устройств УАакрш для удаления избытка перйодата, гасителя реакции и их побочных продуктов.
Добавляют 50-кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию связывания проводят в течение 2 ч в темноте при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Избыток аминоокси реагента удаляют с помощью ионообменной хроматографии. Содержащие ПСК-ФРЭС фракции элюата собирают и подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (МПНроге). После этого препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
Способ 2:
ФРЭС переносят или растворяют в реакционном буферном растворе (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 1,0 +/0,25 мг/мл. Потом рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора НС1. Далее в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор перйодата натрия до получения концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления выполняют в течение 30 +/- 5 мин при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С. Потом реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь водного раствора Ь-цистеина (1 М) в пределах 15 минут при Т = +22 +/- 2°С до получения конечной концентрации 10 мМ и инкубацией в течение 60 +/-5 мин.
Окисленный ФРЭС дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие окисленный ФРЭС фракции элюата собирают и используют в реакции конъюгации.
К элюату, содержащему очищенный окисленный ФРЭС, добавляют реагент аминооксиполисиаловую кислоту (ПСК-ΟNН2) в 50-кратном молярном избытке при осторожном перемешивании в течение максимального периода времени (Г) 15 мин. Потом в течение 15 мин добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют в течение 120 +/- 10 мин при рН 6,0 в темноте при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С при осторожном встряхивании (концентрация белка: 1 мг/мл).
Полученный конъюгат ПСК-ФРЭС дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие конъюгат ПСК-ФРЭС фракции собирают и концентрируют с помощью ультра/диафильтрации (УФ/ДФ), используя мембрану, сделанную из регенерированной целлюлозы, с подходящим порогом отсекания молекулярной массы (МПНроге).
Конъюгат, полученный с использованием этой методики, исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка, биологической активности и определением степени полисиалирования с помощью измерения содержания ПСК (анализ с резорцином).
Способ 3:
Фактор роста эндотелия сосудов (ФРЭС) переносят в реакционный буферный раствор (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) и разбавляют его до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и Ν;·ιΙΟ4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию связывания проводят в течение 2 ч в темноте при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Далее реакцию останавливают цистеином (концентрация цистеина: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ. Потом проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буферного раствора, содержащего ацетат аммония (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, 8 М ацетата аммония, рН 6,9) и смесь наносят на колонку, заполненную фенилсефарозой РР (ОЕ НеаНЬсаге, РапПеИ, СТ), предварительно уравновешенную раствором 50 мМ Гэпэс, 2,5 М ацетата аммония, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, 0,01 % Твина 80, рН 6,9. Далее конъюгат элюируют раствором 50 мМ Гэпэс, 5 мМ хлорида кальция, рН 7,5. Наконец, содержащие ПСК-ФРЭС фракции собирают и подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (МПНроге). Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с
- 67 028186 методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения способ 3 выполняется следующим образом. Фактор роста эндотелия сосудов (ФРЭС) переносят в реакционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) и разбавляют его до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и №Ю4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию связывания проводят в течение 2 ч в темноте при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Далее реакцию останавливают цистеином (концентрация цистеина: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ и конъюгат очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие ПСК-ФРЭС фракции элюата собирают и подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (МППроге). Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
Способ 4:
ФРЭС растворяют или переносят в реакционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 1,0 +/0,25 мг/мл. Потом рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора НС1.
Далее к этому раствору ФРЭС добавляют реагент аминоокси-полисиаловую кислоту (ПСК-ОNН2) в 50-кратном молярном избытке при осторожном перемешивании в течение максимального периода времени (!) 15 мин. Потом в течение 15 мин добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Наконец, добавляют 40 мМ водный раствор перйодата натрия до получения концентрации 400 мкМ.
Реакционную смесь инкубируют в течение 120 +/- 10 мин в темноте при температуре (Т) Т = +22 +/2°С при осторожном встряхивании. Потом реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь водного раствора Ь-цистеина (1 М) до получения конечной концентрации в реакционной смеси 10 мМ и инкубацией в течение 60 +/- 5 мин.
Полученный конъюгат ПСК-ФРЭС очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие ПСК-ФРЭС фракции элюата собирают и концентрируют ультра-/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (МППроге).
Конъюгаты, полученные с использованием этой методики, исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка, биологической активности в соотвествии с методами, известными в этой области, и определением степени полисиалирования с помощью измерения содержания ПСК (анализ с резорцином).
Пример 21. Полисиалирование ЭФР с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора
Способ 1:
Исходную концентрацию эпидермального фактора роста (ЭФР) переносят в реакционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) и разбавляют его до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют NаIО4 до получения конечной концентрации 200 мкМ. Проводят окисление при КТ в течение 30 мин в темноте при осторожном встряхивании. Потом реакцию останавливают цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ.
После этого раствор подвергают УФ/ДФ с использованием центрифужных фильтрационных устройств УКазрш для удаления избытка перйодата, гасителя и их побочных продуктов или, в качестве альтернативы, переносят на колонку для ИОХ объемом 20 мл (Мегск ЕМБ ТМАЕ (М)), которая уравновешивается Буферным раствором А (20 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 7,0). Колонку уравновешивают 5 ОК Буферного раствора А. Окисленный ЭФР элюируют Буферным раствором В (20 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, 1 М №С1, рН 7,0). Собирают фракции, содержащие ЭФР. Определяют содержание белка (Кумасси, метод Брэдфорда), корректируют его до 1 мг/мл с помощью реакционного буферного раствора и корректируют рН до 6,0 добавлением по каплям 0,5 М НС1.
Добавляют 50-кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию связывания проводят в течение 2 ч в темноте при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Избыток аминоокси реагента удаляют с помощью ХГВ. Проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буферного раствора, содержащего ацетат аммония (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, 8 М ацетата аммония, рН 6,9) и смесь наносят на колонку, заполненную 80 мл фенилсефарозы РР (СЕ НеаППсаге, Ра1гйе1й, СТ), предварительно уравновешенную раствором 50 мМ Гэпэс, 2,5 М ацетата аммония, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,9. Далее конъюгат элюируют 50 мМ буферным раствором Гэпэс с рН 7,5, содержащим 5 мМ СаС12. Наконец, содержащие ПСК-ЭФР фракции собирают и подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (МППроге). После этого препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и биологической актив- 68 028186 ности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения способ 1 выполняется следующим образом. Эпидермальный фактор роста (ЭФР) переносят в реакционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) и разбавляют его до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют NаIΟ4 до получения конечной концентрации 200 мкМ. Проводят окисление при КТ в течение 30 мин в темноте при осторожном встряхивании. Потом реакцию останавливают цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ.
После этого раствор подвергают УФ/ДФ с применением центрифужных фильтрационных устройств УШакрш для удаления избытка перйодата, гасителя реакции и их побочных продуктов.
Добавляют 50-кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию связывания проводят в течение 2 ч в темноте при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Избыток аминоокси реагента удаляют с помощью ионообменной хроматографии. Содержащие ПСК-ЭФР фракции элюата собирают и подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (МИйроге). После этого препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
Способ 2:
ЭФР переносят или растворяют в реакционном буферном растворе (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 1,0 +/0,25 мг/мл. Потом рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора НС1. Далее в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор перйодата натрия до получения концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления выполняют в течение 30 +/- 5 мин при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С. Потом реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь водного раствора Ь-цистеина (1 М) в пределах 15 мин при Т = +22 +/- 2°С до получения конечной концентрации 10 мМ и инкубацией в течение 60 +/-5 мин.
Окисленный ЭФР дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие окисленный ЭФР фракции элюата собирают и используют в реакции конъюгации.
К элюату, содержащему очищенный окисленный ЭФР, добавляют реагент аминооксиполисиаловую кислоту (ПСК-ОИН2) в 50-кратном молярном избытке при осторожном перемешивании в течение максимального периода времени (ΐ) 15 мин.
Потом в течение 15 мин добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют в течение 120 +/- 10 мин при рН 6,0 в темноте при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С при осторожном встряхивании (концентрация белка: 1 мг/мл).
Полученный конъюгат ПСК-ЭФР дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие конъюгат ПСК-ЭФР фракции собирают и концентрируют с помощью ультра-/диафильтрации (УФ/ДФ), используя мембрану, сделанную из регенерированной целлюлозы, с подходящим порогом отсекания молекулярной массы (МгШроге).
Конъюгат, полученный с использованием этой методики, исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка, биологической активности и определением степени полисиалирования с помощью измерения содержания ПСК (анализ с резорцином).
Способ 3:
Эпидермальный фактор роста (ЭФР) переносят в реакционный буферный раствор (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) и разбавляют его до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и ΝηΙΟ4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию связывания проводят в течение 2 ч в темноте при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Далее реакцию останавливают цистеином (концентрация цистеина: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ. Потом проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буферного раствора, содержащего ацетат аммония (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, 8 М ацетата аммония, рН 6,9) и смесь наносят на колонку, заполненную фенилсефарозой РР (ОЕ НеаНЪсаге, РшгПеШ, СТ), предварительно уравновешенную раствором 50 мМ Гэпэс, 2,5 М ацетата аммония, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, 0,01% Твина 80, рН 6,9. Далее конъюгат элюируют раствором 50 мМ Гэпэс, 5 мМ хлорида кальция, рН 7,5. Наконец, содержащие ПСК-ЭФР фракции собирают и подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (МПНроге). Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения способ 3 выполняется следующим образом. Эпидермальный фактор роста (ЭФР) переносят в реакционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) и разбавляют его до получения концентра- 69 028186 ции белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и ΝηΙΟ4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию связывания проводят в течение 2 ч в темноте при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Далее реакцию останавливают цистеином (концентрация цистеина: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ и конъюгат очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие конъюгат фракции элюата собирают и подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (МПйроге). Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
Способ 4:
ЭФР растворяют или переносят в реакционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 1,0 +/- 0,25 мг/мл. Потом рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора НС1.
Далее к этому раствору ЭФР добавляют реагент аминооксиполисиаловую кислоту (ПСК-ОМН2) в 50-кратном молярном избытке при осторожном перемешивании в течение максимального периода времени (ΐ) 15 мин. Потом в течение 15 мин добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Наконец, добавляют 40 мМ водный раствор перйодата натрия до получения концентрации 400 мкМ.
Реакционную смесь инкубируют в течение 120 +/- 10 мин в темноте при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С при осторожном встряхивании. Потом реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь водного раствора Ь-цистеина (1 М) до получения конечной концентрации в реакционной смеси 10 мМ и инкубацией в течение 60 +/- 5 мин.
Полученный конъюгат ЭФР очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие ПСКЭФР фракции элюата собирают и концентрируют ультра-/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (МПйроге).
Конъюгаты, полученные с использованием этой методики, исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка, биологической активности в соотвествии с методами, известными в этой области, и определением степени полисиалирования с помощью измерения содержания ПСК (анализ с резорцином).
Пример 22. Полисиалирование ФРН с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора
Способ 1:
Исходную концентрацию фактора роста нервов (ФРН) переносят в реакционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) и разбавляют его до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют NаIΟ4 до получения конечной концентрации 200 мкМ. Проводят окисление при КТ в течение 30 мин в темноте при осторожном встряхивании. Потом реакцию останавливают цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ.
После этого раствор подвергают УФ/ДФ с использованием центрифужных фильтрационных устройств УАакрш для удаления избытка перйодата, гасителя и их побочных продуктов или, в качестве альтернативы, переносят на колонку для ИОХ объемом 20 мл (Мегск ЕМЭ ТМАЕ (М)), которая уравновешивается Буферным раствором А (20 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 7,0). Колонку уравновешивают 5 ОК Буферного раствора А. Окисленный ФРН элюируют Буферным раствором В (20 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, 1 М №С1, рН 7,0). Собирают фракции, содержащие ФРН. Определяют содержание белка (Кумасси, метод Брэдфорда), корректируют его до 1 мг/мл с помощью реакционного буферного раствора и корректируют рН до 6,0 добавлением по каплям 0,5 М НС1.
Добавляют 50-кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию связывания проводят в течение 2 ч в темноте при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Избыток аминоокси реагента удаляют с помощью ХГВ. Проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буферного раствора, содержащего ацетат аммония (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, 8 М ацетата аммония, рН 6,9) и смесь наносят на колонку, заполненную 80 мл фенилсефарозы РР (ОЕ НеаИНсаге, ЕапПе1д, СТ), предварительно уравновешенную раствором 50 мМ Гэпэс, 2,5 М ацетата аммония, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,9. Далее конъюгат элюируют 50 мМ буферным раствором Гэпэс с рН 7,5, содержащим 5 мМ СаС12. Наконец, содержащие ПСК-ФРН фракции собирают и подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (МПйроге). После этого препаратисследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения способ 1 выполняется следующим образом. Фактор роста нервов (ФРН) переносят в реакционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) и разбавляют его до получения концентрации белка
- 70 028186 мг/мл. К этому раствору добавляют Ыа1О4 до получения конечной концентрации 200 мкМ. Проводят окисление при КТ в течение 30 мин в темноте при осторожном встряхивании. Потом реакцию останавливают цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ.
После этого раствор подвергают УФ/ДФ с применением центрифужных фильтрационных устройств Укакрш для удаления избытка перйодата, гасителя реакции и их побочных продуктов.
Добавляют 50-кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию связывания проводят в течение 2 ч в темноте при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Избыток аминооксиреагента удаляют с помощью ионообменной хроматографии. Содержащие ПСК-ФРН фракции элюата собирают и подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (МПНроге). После этого препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
Способ 2:
ФРН переносят или растворяют в реакционном буферном растворе (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 1,0 +/0,25 мг/мл. Потом рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора НС1. Далее в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор перйодата натрия до получения концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления выполняют в течение 30 +/- 5 мин при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С. Потом реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь водного раствора Ь-цистеина (1 М) в пределах 15 мин при Т = +22 +/- 2°С до получения конечной концентрации 10 мМ и инкубацией в течение 60 +/-5 мин.
Окисленный ФРН дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие окисленный ФРН фракции элюата собирают и используют в реакции конъюгации.
К элюату, содержащему очищенный окисленный ФРН, добавляют реагент аминооксиполисиаловую кислоту (ПСК-ОЫН2) в 50-кратном молярном избытке при осторожном перемешивании в течение максимального периода времени (!) 15 мин. Потом в течение 15 мин добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют в течение 120 +/- 10 мин при рН 6,0 в темноте при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С при осторожном встряхивании (концентрация белка: 1 мг/мл).
Полученный конъюгат ПСК-ФРН дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие конъюгат ПСК-ФРН фракции собирают и концентрируют с помощью ультра/диафильтрации (УФ/ДФ), используя мембрану, сделанную из регенерированной целлюлозы, с подходящим порогом отсекания молекулярной массы (МПНроге).
Конъюгат, полученный с использованием этой методики, исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка, биологической активности и определением степени полисиалирования с помощью измерения содержания ПСК (анализ с резорцином).
Способ 3:
Фактор роста нервов (ФРН) переносят в реакционный буферный раствор (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) и разбавляют его до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и Ыа1О4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию связывания проводят в течение 2 ч в темноте при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Далее реакцию останавливают цистеином (концентрация цистеина: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ. Потом проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буферного раствора, содержащего ацетат аммония (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, 8 М ацетата аммония, рН 6,9) и смесь наносят на колонку, заполненную фенилсефарозой РР (СЕ НеаННсаге, РаНйе1б, СТ), предварительно уравновешенную раствором 50 мМ Гэпэс, 2,5 М ацетата аммония, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, 0,01% Твина 80, рН 6,9. Далее конъюгат элюируют раствором 50 мМ Гэпэс, 5 мМ хлорида кальция, рН 7,5. Наконец, содержащие ПСК-ФРН фракции собирают и подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (МПНроге). Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения способ 3 выполняется следующим образом. Фактор роста нервов (ФРН) переносят в реакционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) и разбавляют его до получения концентрации белка мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и Ыа1О4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию связывания проводят в течение чв темноте при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Далее реакцию останавливают
- 71 028186 цистеином (концентрация цистеина: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ, и конъюгат очищают методом ионообменной хроматографии. Потом содержащие ПСК-ФРН фракции элюата собирают и подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (МПЪроге). Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
Способ 4:
ФРН растворяют или переносят в реакционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 1,0 +/- 0,25 мг/мл. Потом рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора НС1.
Далее к этому раствору ФРН добавляют реагент аминоокси-полисиаловую кислоту (ПСК-ΟNН2) в 50-кратном молярном избытке при осторожном перемешивании в течение максимального периода времени (!) 15 мин. Потом в течение 15 мин добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Наконец, добавляют 40 мМ водный раствор перйодата натрия до получения концентрации 400 мкМ.
Реакционную смесь инкубируют в течение 120 +/- 10 мин в темноте при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С при осторожном встряхивании. Потом реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь водного раствора Ь-цистеина (1 М) до получения конечной концентрации в реакционной смеси 10 мМ и инкубацией в течение 60 +/- 5 мин.
Полученный конъюгат ФРН очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие ПСКФРН фракции элюата собирают и концентрируют ультра-/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (МПНроге).
Конъюгаты, полученные с использованием этой методики, исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка, биологической активности в соотвествии с методами, известными в этой области, и определением степени полисиалирования с помощью измерения содержания ПСК (анализ с резорцином).
Пример 23. Полисиалирование ГРЧ с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора
Способ 1:
В данном документе описано, что аминокислотную последовательность гормона роста человека (ГРЧ) сначала модифицируют для внедрения по меньшей мере одного сайта гликозилирования. После очистки ГРЧ гликозилируют ίη уПго в соответствии с известными в этой области способами.
Исходную концентрацию гормона роста человека (ГРЧ) переносят в реакционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) и разбавляют его до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют Ν;·ιΙΟ4 до получения конечной концентрации 200 мкМ. Проводят окисление при КТ в течение 30 мин в темноте при осторожном встряхивании. Потом реакцию останавливают цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ.
После этого раствор подвергают УФ/ДФ с использованием центрифужных фильтрационных устройств Ууакрш для удаления избытка перйодата, гасителя и их побочных продуктов или, в качестве альтернативы, переносят на колонку для ИОХ объемом 20 мл (Мегск ЕМО ТМАЕ (М)), которая уравновешивается Буферным раствором А (20 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 7,0). Колонку уравновешивают 5 ОК Буферного раствора А. Окисленный ГРЧ элюируют Буферным раствором В (20 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, 1М №С1, рН 7,0). Собирают фракции, содержащие ГРЧ. Определяют содержание белка (Кумасси, метод Брэдфорда), корректируют его до 1 мг/мл с помощью реакционного буферного раствора и корректируют рН до 6,0 добавлением по каплям 0,5 М НС1.
Добавляют 50-кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию связывания проводят в течение 2 ч в темноте при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Избыток аминоокси реагента удаляют с помощью ХГВ. Проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буферного раствора, содержащего ацетат аммония (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, 8 М ацетата аммония, рН 6,9) и смесь наносят на колонку, заполненную 80 мл фенилсефарозы РР (СЕ НеаИЬсаге, РшгПеИ, СТ), предварительно уравновешенную раствором 50 мМ Гэпэс, 2,5 М ацетата аммония, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,9. Далее конъюгат элюируют 50 мМ буферным раствором Гэпэс с рН 7,5, содержащим 5 мМ СаС12. Наконец, содержащие ПСК-ГРЧ фракции собирают и подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (МлШроге). После этого препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения способ 1 выполняется следующим образом. В данном документе описано, что аминокислотную последовательность гормона роста человека (ГРЧ) сначала модифицируют для внедрения по меньшей мере одного сайта гликозилирования. После очистки ГРЧ гликозилируют ίη уПго в соответствии с известными в этой области способами. ГРЧ переносят в ре- 72 028186 акционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) и разбавляют его до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют NаIΟ4 до получения конечной концентрации 200 мкМ. Проводят окисление при КТ в течение 30 мин в темноте при осторожном встряхивании. Потом реакцию останавливают цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ.
После этого раствор подвергают УФ/ДФ с применением центрифужных фильтрационных устройств УЛакрш для удаления избытка перйодата, гасителя реакции и их побочных продуктов.
Добавляют 50-кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию связывания проводят в течение 2 ч в темноте при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Избыток аминоокси реагента удаляют с помощью ионообменной хроматографии. Содержащие ПСК-ГРЧ фракции элюата собирают и подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (Μ^11^ρο^е). После этого препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
Способ 2:
В данном документе описано, что аминокислотную последовательность гормона роста человека (ГРЧ) сначала модифицируют для внедрения по меньшей мере одного сайта гликозилирования. После очистки ГРЧ гликозилируют ίη νίΐΐΌ в соответствии с известными в этой области способами.
ГРЧ переносят или растворяют в реакционном буферном растворе (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 1,0 +/- 0,25 мг/мл. Потом рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора НС1. Далее в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор перйодата натрия до получения концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления выполняют в течение 30 +/- 5 мин при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С. Потом реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь водного раствора Ь-цистеина (1 М) в пределах 15 мин при Т = +22 +/- 2°С до получения конечной концентрации 10 мМ и инкубацией в течение 60 +/-5 мин.
Окисленный ГРЧ дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие окисленный ГРЧ фракции элюата собирают и используют в реакции конъюгации.
К элюату, содержащему очищенный окисленный ГРЧ, добавляют реагент аминооксиполисиаловую кислоту (ПСК-ОМН2) в 50-кратном молярном избытке при осторожном перемешивании в течение максимального периода времени (ί) 15 мин. Потом в течение 15 мин добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют в течение 120 +/- 10 мин при рН 6,0 в темноте при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С при осторожном встряхивании (концентрация белка: 1 мг/мл).
Полученный конъюгат ПСК-ГРЧ дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие конъюгат ПСК-ГРЧ фракции собирают и концентрируют с помощью ультра/диафильтрации (УФ/ДФ), используя мембрану, сделанную из регенерированной целлюлозы, с подходящим порогом отсекания молекулярной массы (^Ч1111роге).
Конъюгат, полученный с использованием этой методики, исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка, биологической активности и определением степени полисиалирования с помощью измерения содержания ПСК (анализ с резорцином).
Способ 3:
В данном документе описано, что аминокислотную последовательность гормона роста человека (ГРЧ) сначала модифицируют для внедрения по меньшей мере одного сайта гликозилирования. После очистки ГРЧ гликозилируют ίη νίΐΐΌ в соответствии с известными в этой области способами.
Гормон роста человека (ГРЧ) переносят в реакционный буферный раствор (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) и разбавляют его до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и ШО) (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию связывания проводят в течение 2 ч в темноте при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Далее реакцию останавливают цистеином (концентрация цистеина: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ. Потом проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буферного раствора, содержащего ацетат аммония (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, 8 М ацетата аммония, рН 6,9) и смесь наносят на колонку, заполненную фенилсефарозой РР (СЕ НеаИЬсаге, РаюйеМ, СТ), предварительно уравновешенную раствором 50 мМ Гэпэс, 2,5 М ацетата аммония, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, 0,01% Твина 80, рН 6,9. Далее конъюгат элюируют раствором 50 мМ Гэпэс, 5 мМ хлорида кальция, рН 7,5. Наконец, содержащие ПСК-ГРЧ фракции собирают и подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (Μ^11^ρο^е). Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с метода- 73 028186 ми, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения способ 3 выполняется следующим образом. В данном документе описано, что аминокислотную последовательность гормона роста человека (ГРЧ) сначала модифицируют для внедрения по меньшей мере одного сайта гликозилирования. После очистки ГРЧ гликозилируют ίη уйго в соответствии с известными в этой области способами. ГРЧ переносят в реакционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) и разбавляют его до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением мтолуидина в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и ЫаЮ4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию связывания проводят в течение 2 ч в темноте при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Далее реакцию останавливают цистеином (концентрация цистеина: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ и конъюгат очищают методом ионообменной хроматографии. Потом содержащие ПСК-ГРЧ фракции элюата собирают и подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (МПЛроге). Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
Способ 4:
В данном документе описано, что аминокислотную последовательность гормона роста человека (ГРЧ) сначала модифицируют для внедрения по меньшей мере одного сайта гликозилирования. После очистки ГРЧ гликозилируют ίη уЛго в соответствии с известными в этой области способами.
ГРЧ растворяют или переносят в реакционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 1,0 +/- 0,25 мг/мл. Потом рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора НС1.
Далее к этому раствору ГРЧ добавляют реагент аминоокси-полисиаловую кислоту (ПСК-0МН2) в 50-кратном молярном избытке при осторожном перемешивании в течение максимального периода времени (ΐ) 15 мин. Потом в течение 15 мин добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Наконец, добавляют 40 мМ водный раствор перйодата натрия до получения концентрации 400 мкМ.
Реакционную смесь инкубируют в течение 120 +/- 10 мин в темноте при температуре (Т) Т = +22 +/-2°С при осторожном встряхивании. Потом реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь водного раствора Ь-цистеина (1 М) до получения конечной концентрации в реакционной смеси 10 мМ и инкубацией в течение 60 +/- 5 мин.
Полученный конъюгат ГРЧ очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие ПСКГРЧ фракции элюата собирают и концентрируют ультра-/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (МПЛроге).
Конъюгаты, полученные с использованием этой методики, исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка, биологической активности в соотвествии с методами, известными в этой области, и определением степени полисиалирования с помощью измерения содержания ПСК (анализ с резорцином).
Пример 24. Полисиалирование ФНО-альфа с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора
Исходную концентрацию фактора некроза опухолей альфа (ФНО-альфа) переносят в реакционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) и разбавляют его до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют ЫаЮ4 до получения конечной концентрации 200 мкМ. Проводят окисление при КТ в течение 30 мин в темноте при осторожном встряхивании. Потом реакцию останавливают цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ.
После этого раствор подвергают УФ/ДФ с использованием центрифужных фильтрационных устройств Угуакрш для удаления избытка перйодата, гасителя и их побочных продуктов или, в качестве альтернативы, переносят на колонку для ИОХ объемом 20 мл (Мегск ΕΜΌ ТМАЕ (М)), которая уравновешивается Буферным раствором А (20 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 7,0). Колонку уравновешивают 5 ОК Буферного раствора А. Окисленный ФНО-альфа элюируют Буферным раствором В (20 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, 1 М ЫаС1, рН 7,0). Собирают фракции, содержащие ФНО-альфа. Определяют содержание белка (Кумасси, метод Брэдфорда), корректируют его до 1 мг/мл с помощью реакционного буферного раствора и корректируют рН до 6,0 добавлением по каплям 0,5 М НС1.
Добавляют 50-кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию связывания проводят в течение 2 ч в темноте при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Избыток аминоокси реагента удаляют с помощью ХГВ. Проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буферного раствора, содержащего ацетат аммония (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, 8 М ацетата аммония, рН 6,9) и смесь наносят на колонку, заполненную 80 мл фенилсефарозы РР (ОЕ НеаЛЬсаге, Ра1гйе1П, СТ), предварительно уравно- 74 028186 вешенную раствором 50 мМ Гэпэс, 2,5 М ацетата аммония, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,9. Далее конъюгат элюируют 50 мМ буферным раствором Гэпэс с рН 7,5, содержащим 5 мМ СаС12. Наконец, содержащие ПСК-ФНО-альфа фракции собирают и подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (МПЬроге). После этого препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения способ 1 выполняется следующим образом. Фактор некроза опухолей альфа (ФНО-альфа) переносят в реакционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) и разбавляют его до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют №ιΙΟ( до получения конечной концентрации 200 мкМ. Проводят окисление при КТ в течение 30 мин в темноте при осторожном встряхивании. Потом реакцию останавливают цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ.
После этого раствор подвергают УФ/ДФ с применением центрифужных фильтрационных устройств УАакрш для удаления избытка перйодата, гасителя реакции и их побочных продуктов. Добавляют 50кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию связывания проводят в течение 2 ч в темноте при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Избыток аминоокси реагента удаляют с помощью ионообменной хроматографии. Содержащие ПСК-ФНО-альфа фракции элюата собирают и подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (МППроге). После этого препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
Способ 2:
ФНО-альфа переносят или растворяют в реакционном буферном растворе (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 1,0 +/- 0,25 мг/мл. Потом рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора НС1. Далее в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор перйодата натрия до получения концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления выполняют в течение 30 +/- 5 мин при температуре (Т) Т = +22 +/2°С. Потом реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь водного раствора Ь-цистеина (1 М) в пределах 15 мин при Т = +22 +/- 2°С до получения конечной концентрации 10 мМ и инкубацией в течение 60 +/-5 мин.
Окисленный ФНО-альфа дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие окисленный ФНО-альфа фракции элюата собирают и используют в реакции конъюгации.
К элюату, содержащему очищенный окисленный ФНО-альфа, добавляют реагент аминооксиполисиаловую кислоту (ПСК-ΟNΗ2) в 50-кратном молярном избытке при осторожном перемешивании в течение максимального периода времени (ΐ) 15 мин. Потом в течение 15 мин добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют в течение 120 +/- 10 мин при рН 6,0 в темноте при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С при осторожном встряхивании (концентрация белка: 1 мг/мл).
Полученный конъюгат ПСК-ФНО-альфа дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие конъюгат ПСК-ФНО-альфа фракции собирают и концентрируют с помощью ультра-/диафильтрации (УФ/ДФ), используя мембрану, сделанную из регенерированной целлюлозы, с подходящим порогом отсекания молекулярной массы (МППроге).
Конъюгат, полученный с использованием этой методики, исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка, биологической активности и определением степени полисиалирования с помощью измерения содержания ПСК (анализ с резорцином).
Способ 3:
Фактор некроза опухолей альфа (ФНО-альфа) переносят в реакционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) и разбавляют его до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и №ιΙΟ( (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию связывания проводят в течение 2 ч в темноте при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Далее реакцию останавливают цистеином (концентрация цистеина: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ. Потом проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буферного раствора, содержащего ацетат аммония (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, 8 М ацетата аммония, рН 6,9) и смесь наносят на колонку, заполненную фенилсефарозой РР (ОЕ НеаИЬсаге, РаийеМ, СТ), предварительно уравновешенную раствором 50 мМ Гэпэс, 2,5 М ацетата аммония, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, 0,01% Твина 80, рН 6,9. Далее конъюгат элюируют раствором 50 мМ Гэпэс, 5 мМ хлорида кальция, рН 7,5. Наконец, содержащие ПСК-ФНО-альфа фракции собирают и подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (МППроге). Препарат исследуют
- 75 028186 аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения способ 3 выполняется следующим образом. Фактор некроза опухолей альфа (ФНО-альфа) переносят в реакционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) и разбавляют его до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и NабΟ4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию связывания проводят в течение 2 ч в темноте при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Далее реакцию останавливают цистеином (концентрация цистеина: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ и конъюгат очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие ПСК-ФНО-альфа фракции элюата собирают и подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (МППроге). Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
Способ 4:
ФНО-альфа растворяют или переносят в реакционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 1,0 +/- 0,25 мг/мл. Потом рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора НС1.
Далее к этому раствору ФНО-альфа добавляют реагент аминоокси-полисиаловую кислоту (ПСКΟΝ42) в 50-кратном молярном избытке при осторожном перемешивании в течение максимального периода времени (ΐ) 15 мин. Потом в течение 15 мин добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Наконец, добавляют 40 мМ водный раствор перйодата натрия до получения концентрации 400 мкМ.
Реакционную смесь инкубируют в течение 120 +/- 10 мин в темноте при температуре (Т) Т = +22 +/2°С при осторожном встряхивании. Потом реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь водного раствора Ь-цистеина (1 М) до получения конечной концентрации в реакционной смеси 10 мМ и инкубацией в течение 60 +/- 5 мин.
Полученный конъюгат ФНО-альфа очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие ПСК-ФНО-альфа фракции элюата собирают и концентрируют ультра-/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (МППроге).
Конъюгаты, полученные с использованием этой методики, исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка, биологической активности в соотвествии с методами, известными в этой области, и определением степени полисиалирования с помощью измерения содержания ПСК (анализ с резорцином).
Пример 25. Полисиалирование инсулина с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора
Способ 1:
В данном документе описано, что аминокислотную последовательность инсулина сначала модифицируют для внедрения по меньшей мере одного сайта гликозилирования. После очистки инсулин гликозилируют 1п уПго в соответствии с известными в этой области способами. Исходную концентрацию инсулина переносят в реакционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) и разбавляют его до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют №ПО.-| до получения конечной концентрации 200 мкМ. Проводят окисление при КТ в течение 30 мин в темноте при осторожном встряхивании. Потом реакцию останавливают цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ.
После этого раствор подвергают УФ/ДФ с использованием центрифужных фильтрационных устройств У1уа8рш для удаления избытка перйодата, гасителя и их побочных продуктов или, в качестве альтернативы, переносят на колонку для ИОХ объемом 20 мл (Мегск ЕМО ТМАЕ (М)), которая уравновешивается Буферным раствором А (20 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 7,0). Колонку уравновешивают 5 ОК Буферного раствора А. Окисленный инсулин элюируют Буферным раствором В (20 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, 1М №С1, рН 7,0). Собирают фракции, содержащие инсулин. Определяют содержание белка (Кумасси, метод Брэдфорда), корректируют его до 1 мг/мл с помощью реакционного буферного раствора и корректируют до рН 6,0 добавлением по каплям 0,5 М НС1.
Добавляют 50-кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию связывания проводят в течение 2 ч в темноте при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Избыток аминоокси реагента удаляют с помощью ХГВ. Проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буферного раствора, содержащего ацетат аммония (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, 8 М ацетата аммония, рН 6,9) и смесь наносят на колонку, заполненную 80 мл фенилсефарозы РР (ОЕ НеаЛйсаге, Ра1гйе1б, СТ), предварительно уравновешенную раствором 50 мМ Гэпэс, 2,5 М ацетата аммония, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида каль- 76 028186 ция, рН 6,9. Далее конъюгат элюируют 50 мМ буферным раствором Гэпэс с рН 7,5, содержащим 5 мМ СаС12. Наконец, содержащие ПСК-инсулин фракции собирают и подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (М^11^рο^е). После этого препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения способ 1 выполняется следующим образом. В данном документе описано, что аминокислотную последовательность инсулина сначала модифицируют для внедрения по меньшей мере одного сайта гликозилирования. После очистки инсулин гликозилируют ш νίίΓο в соответствии с известными в этой области способами. Инсулин переносят в реакционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) и разбавляют его до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют №1О4 до получения конечной концентрации 200 мкМ. Проводят окисление при КТ в течение 30 мин в темноте при осторожном встряхивании. Потом реакцию останавливают цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ.
После этого раствор подвергают УФ/ДФ с применением центрифужных фильтрационных устройств У1уа5ри1 для удаления избытка перйодата, гасителя реакции и их побочных продуктов.
Добавляют 50-кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию связывания проводят в течение 2 ч в темноте при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Избыток аминоокси реагента удаляют с помощью ионообменной хроматографии. Содержащие ПСК-инсулин фракции элюата собирают и подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (М^11^рο^е). После этого препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
Способ 2:
В данном документе описано, что аминокислотную последовательность инсулина сначала модифицируют для внедрения по меньшей мере одного сайта гликозилирования. После очистки инсулин гликозилируют ш νί!Γο в соответствии с известными в этой области способами.
Инсулин переносят или растворяют в реакционном буферном растворе (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 1,0 +/- 0,25 мг/мл. Потом рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора НС1. Далее в течение 10 минут добавляют 40 мМ водный раствор перйодата натрия до получения концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления выполняют в течение 30 +/- 5 мин при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С. Потом реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь водного раствора Ь-цистеина (1 М) в пределах 15 мин при Т = +22 +/- 2°С до получения конечной концентрации 10 мМ и инкубацией в течение 60 +/-5 мин.
Окисленный инсулин дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие окисленный инсулин фракции элюата собирают и используют в реакции конъюгации.
К элюату, содержащему очищенный окисленный инсулин, добавляют реагент аминооксиполисиаловую кислоту (ПСК-ΟNН2) в 50-кратном молярном избытке при осторожном перемешивании в течение максимального периода времени (!) 15 мин. Потом в течение 15 мин добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют в течение 120 +/- 10 мин при рН 6,0 в темноте при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С при осторожном встряхивании (концентрация белка: 1 мг/мл).
Полученный конъюгат ПСК-инсулина дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие конъюгат ПСК-инсулина фракции собирают и концентрируют с помощью ультра/диафильтрации (УФ/ДФ), используя мембрану, сделанную из регенерированной целлюлозы, с подходящим порогом отсекания молекулярной массы (М^I1^рο^е).
Конъюгат, полученный с использованием этой методики, исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка, биологической активности и определением степени полисиалирования с помощью измерения содержания ПСК (анализ с резорцином).
Способ 3:
В данном документе описано, что аминокислотную последовательность инсулина сначала модифицируют для внедрения по меньшей мере одного сайта гликозилирования. После очистки инсулин гликозилируют ш νί!Γο в соответствии с известными в этой области способами.
Инсулин переносят в реакционный буферный раствор (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) и разбавляют его до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и №1О4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию связывания проводят в течение 2 ч в темноте при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Далее реакцию останавливают цистеином (концентрация цистеина: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ. Потом проводимость реакционной смеси коррек- 77 028186 тируют добавлением буферного раствора, содержащего ацетат аммония (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, 8 М ацетата аммония, рН 6,9) и смесь наносят на колонку, заполненную фенилсефарозой РР (СЕ ЫеаНЬсаге, РаиНеИ, СТ), предварительно уравновешенную раствором 50 мМ Гэпэс, 2,5 М ацетата аммония, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, 0,01% Твина 80, рН 6,9. Далее конъюгат элюируют раствором 50 мМ Гэпэс, 5 мМ хлорида кальция, рН 7,5. Наконец, содержащие ПСК-инсулин фракции собирают и подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы ^ΠΗροι^). Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения способ 3 выполняется следующим образом. В данном документе описано, что аминокислотную последовательность инсулина сначала модифицируют для внедрения по меньшей мере одного сайта гликозилирования. После очистки инсулин гликозилируют ш νίίΓο в соответствии с известными в этой области способами.
Инсулин переносят в реакционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) и разбавляют его до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и NаIΟ4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию связывания проводят в течение 2 ч в темноте при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Далее реакцию останавливают цистеином (концентрация цистеина: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ и конъюгат очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие ПСК-инсулин фракции элюата собирают и подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы ^ΠΗροι^). Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
Способ 4:
В данном документе описано, что аминокислотную последовательность инсулина сначала модифицируют для внедрения по меньшей мере одного сайта гликозилирования. После очистки инсулин гликозилируют ш νίΐΓο в соответствии с известными в этой области способами.
Инсулин растворяют или переносят в реакционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 1,0 +/0,25 мг/мл. Потом рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора ΗΟ.
Далее к этому раствору инсулина добавляют реагент аминоокси-полисиаловую кислоту (ПСКΟΝΗ2) в 50-кратном молярном избытке при осторожном перемешивании в течение максимального периода времени (ΐ) 15 мин. Потом в течение 15 мин добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Наконец, добавляют 40 мМ водный раствор перйодата натрия до получения концентрации 400 мкМ.
Реакционную смесь инкубируют в течение 120 +/- 10 мин в темноте при температуре (Т) Т = +22 +/2°С при осторожном встряхивании. Потом реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь водного раствора Ь-цистеина (1 М) до получения конечной концентрации в реакционной смеси 10 мМ и инкубацией в течение 60 +/- 5 мин.
Полученный конъюгат инсулина очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие ПСК-инсулин фракции элюата собирают и концентрируют ультра-/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (МиЕрсте).
Конъюгаты, полученные с использованием этой методики, исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка, биологической активности в соотвествии с методами, известными в этой области, и определением степени полисиалирования с помощью измерения содержания ПСК (анализ с резорцином).
Пример 26. Полисиалирование интерферона-альфа с использованием аминоокси-ПСК и мтолуидина в качестве нуклеофильного катализатора
Способ 1:
Исходную концентрацию интерферона-альфа переносят в реакционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) и разбавляют его до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют №Ю4 до получения конечной концентрации 200 мкМ. Проводят окисление при КТ в течение 30 мин в темноте при осторожном встряхивании. Потом реакцию останавливают цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ.
После этого раствор подвергают УФ/ДФ с использованием центрифужных фильтрационных устройств Уща8рш для удаления избытка перйодата, гасителя и их побочных продуктов или, в качестве альтернативы, переносят на колонку для ИОХ объемом 20 мл (Мегск ЕМО ТМАЕ (М)), которая уравновешивается Буферным раствором А (20 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 7,0). Колонку уравновешивают 5 ОК Буферного раствора А. Окисленный интерферон-альфа элюируют Буферным раствором В (20 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, 1 М №С1, рН 7,0). Собирают фракции, содержащие интерферон-альфа. Определяют содержание белка (Кумасси, метод Брэдфорда), корректируют его до 1 мг/мл с помощью реакционного буфер- 78 028186 ного раствора и корректируют рН до 6,0 добавлением по каплям 0,5 М НС1.
Добавляют 50-кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию связывания проводят в течение 2 ч в темноте при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Избыток аминоокси реагента удаляют с помощью ХГВ. Проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буферного раствора, содержащего ацетат аммония (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, 8 М ацетата аммония, рН 6,9) и смесь наносят на колонку, заполненную 80 мл фенилсефарозы РР (СЕ НеаННсаге, РаНПеШ СТ), предварительно уравновешенную раствором 50 мМ Гэпэс, 2,5 М ацетата аммония, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,9. Далее конъюгат элюируют 50 мМ буферным раствором Гэпэс с рН 7,5, содержащим 5 мМ СаС12. Наконец, содержащие ПСК-интерферон-альфа фракции собирают и подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (МПИроге). После этого препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения способ 1 выполняется следующим образом. Интерферон-альфа переносят в реакционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) и разбавляют его до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют КаЮ( до получения конечной концентрации 200 мкМ. Проводят окисление при КТ в течение 30 мин в темноте при осторожном встряхивании. Потом реакцию останавливают цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ.
После этого раствор подвергают УФ/ДФ с применением центрифужных фильтрационных устройств Ущакрш для удаления избытка перйодата, гасителя реакции и их побочных продуктов.
Добавляют 50-кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию связывания проводят в течение 2 ч в темноте при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Избыток аминоокси реагента удаляют с помощью ионообменной хроматографии. Содержащие ПСК-интерферон-альфа фракции элюата собирают и подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (МПИроге). После этого препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
Способ 2:
Интерферон-альфа переносят или растворяют в реакционном буферном растворе (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 1,0 +/- 0,25 мг/мл. Потом рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора НС1. Далее в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор перйодата натрия до получения концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления выполняют в течение 30 +/- 5 мин при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С. Потом реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь водного раствора Ьцистеина (1 М) в пределах 15 мин при Т = +22 +/- 2°С до получения конечной концентрации 10 мМ и инкубацией в течение 60 +/-5 мин.
Окисленный интерферон-альфа дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие окисленный интерферон-альфа фракции элюата собирают и используют в реакции конъюгации.
К элюату, содержащему очищенный окисленный интерферон-гамма, добавляют реагент аминооксиполисиаловую кислоту (ПСК-ОNН2) в 50-кратном молярном избытке при осторожном перемешивании в течение максимального периода времени (ΐ) 15 мин. Потом в течение 15 мин добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют в течение 120 +/- 10 мин при рН 0,6 в темноте при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С при осторожном встряхивании (концентрация белка: 1 мг/мл).
Полученный конъюгат ПСК-интерферона-альфа дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие конъюгат ПСК-интерферона-альфа фракции собирают и концентрируют с помощью ультра-/диафильтрации (УФ/ДФ), используя мембрану, сделанную из регенерированной целлюлозы, с подходящим порогом отсекания молекулярной массы (МПИроге).
Способ 3:
Интерферон-альфа переносят в реакционный буферный раствор (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) и разбавляют его до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и NаIО4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию связывания проводят в течение 2 ч в темноте при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Далее реакцию останавливают цистеином (концентрация цистеина: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ. Потом проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буферного раствора, содержащего ацетат аммония (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хло- 79 028186 рида натрия, 5 мМ хлорида кальция, 8 М ацетата аммония, рН 6,9) и смесь наносят на колонку, заполненную фенилсефарозой РР (СЕ Неа1!Псаге, Ра1гйе1й, СТ), предварительно уравновешенную раствором 50 мМ Гэпэс, 2,5 М ацетата аммония, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, 0,01% Твина 80, рН 6,9. Далее конъюгат элюируют раствором 50 мМ Гэпэс, 5 мМ хлорида кальция, рН 7,5. Наконец, содержащие ПСК-интерферон-альфа фракции собирают и подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (МППроге). Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения способ 3 выполняется следующим образом. Интерферон-альфа переносят в реакционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) и разбавляют его до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и ШЮ) (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию связывания проводят в течение 2 ч в темноте при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Далее реакцию останавливают цистеином (концентрация цистеина: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ и конъюгат очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие ПСК-интерферон-альфа фракции элюата собирают и подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (МППроге). Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
Способ 4:
Интерферон-альфа растворяют или переносят в реакционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 1,0 +/- 0,25 мг/мл. Потом рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора НС1.
Далее к этому раствору интерферона-альфа добавляют реагент аминооксиполисиаловую кислоту (ПСК-ОNН2) в 50-кратном молярном избытке при осторожном перемешивании в течение максимального периода времени (!) 15 мин. Потом в течение 15 мин добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Наконец, добавляют 40 мМ водный раствор перйодата натрия до получения концентрации 400 мкМ.
Реакционную смесь инкубируют в течение 120 +/- 10 мин в темноте при температуре (Т) Т = +22 +/2°С при осторожном встряхивании. Потом реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь водного раствора Ь-цистеина (1 М) до получения конечной концентрации в реакционной смеси 10 мМ и инкубацией в течение 60 +/- 5 мин.
Полученный конъюгат интерферона-альфа очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие ПСК-интерферон-альфа фракции элюата собирают и концентрируют ультра-/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (МППроге).
Конъюгаты, полученные с использованием этой методики, исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка, биологической активности в соотвествии с методами, известными в этой области, и определением степени полисиалирования с помощью измерения содержания ПСК (анализ с резорцином).
Пример 27. Полисиалирование интерферона-гамма с использованием аминоокси-ПСК и мтолуидина в качестве нуклеофильного катализатора
Способ 1:
мг интерферона-гамма растворяют в 5 мл гистидинового буферного раствора, рН 6,0 (20 мМ Ьгистидина, 150 мМ №С1). Потом добавляют 100 мкл водного раствора перйодата натрия (5 мМ) и реакционную смесь инкубируют в течение 1 ч в темноте при 4°С при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 50 мкл 1 М водного раствора цистеина. Далее смесь подвергают УФ/ДФ с применением центрифужных фильтрационных устройств Ууазрш 15К 10 кДа для удаления избытка перйодата, гасителя реакции и их побочных продуктов.
Концентрат (приблиз. 7 мл), содержащий окисленный интерферон-гамма, смешивают с 2 мл водного раствора м-толуидина (50 мМ) и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Потом добавляют реагент аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) до получения 5-кратного молярного избытка реагента. Эту смесь инкубируют в течение 2,5 ч при КТ в темноте при осторожном перемешивании.
Свободный интерферон-гамма удаляют с помощью катионообменной хроматографии (КОХ). Реакционную смесь разбавляют 20 мл Буферного раствора А (50 мМ Гэпэс, рН 6,5) и наносят на колонку ШРгер 8РРР 16/10 объемом 20 мл (СЕ НеаППсаге, Ра1гйе1й, СТ) предварительно уравновешенную Буферным раствором А. Потом колонку элюируют Буферным раствором В (50 мМ Гэпэс, 1 М №С1, рН 6,5). Свободный интерферон-гамма элюируют промыванием колонки 25% Буферным раствором В, а конъюгат - 50% Буферным раствором В. Проводимость содержащих конъюгат фракций впоследствии повыша- 80 028186 ют до ~190 мСм/см Буферным раствором С (50 мМ Гэпэс, 5 М ЫаС1, рН 6,9) и наносят на колонку ШРгер Ви1у1 РР 16/10 объемом 20 мл (СЕ НеаНЬсаге, РаППеИ, СТ) предварительно уравновешенную Буферным раствором Ό (50 мМ Гэпэс, 3 М ЫаС1, рН 6,9). Свободный реагент ПСК вымывают Буферным раствором Ό в количестве 5 ОК. Далее конъюгат элюируют 100% Буферным раствором Е (50 мМ Гэпэс, рН 6,9). Содержащие конъюгат фракции концентрируют с помощью УФ/ДФ, используя мембрану на 10 кДа, сделанную из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсекания 10 кДа, МПНроге). Конечную стадию диафильтрации проводят против гистидинового буферного раствора с рН 6,9, содержащего 150 мМ ЫаС1. Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области. Для конъюгата ПСКинтерферон-гамма определили удельную активность > 50% по сравнению с активностью нативного интерферона-гамма. Конъюгат дополнительно исследовали аналитическими методами с помощью эксклюзионной ВЭЖХ, используя систему ВЭЖХ АдПеШ 1200, оборудованную колонкой 8ЬоПе\ Κν 803 в описаных ранее условиях (Ко1апсЬ е1 а1, Тгапк&кюп 2006;46:1959-77). Показано, что полученный препарат не содержит свободного интерферона-гамма.
Способ 2:
мг интерферона-гамма растворяют в 8 мл гистидинового буферного раствора, рН 6,0 (20 мМ Ьгистидина, 150 мМ ЫаС1). Потом добавляют 200 мкл водного раствора перйодата натрия (5 мМ) и 2 мл водного раствора м-толуидина (50 мМ). Далее добавляют реагент аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) до получения 5-кратного молярного избытка реагента. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 100 мкл 1 М водного раствора цистеина.
Свободный интерферон-гамма удаляют с помощью катионообменной хроматографии (КОХ). Реакционную смесь разбавляют 20 мл Буферного раствора А (50 мМ Гэпэс, рН 6,5) и наносят на колонку ШРгер 8РРР 16/10 объемом 20 мл (СЕ НеаНЬсаге, Раийе1П, СТ) предварительно уравновешенную Буферным раствором А. Потом колонку элюируют Буферным раствором В (50 мМ Гэпэс, 1 М ЫаС1, рН 6,5). Свободный интерферон-гамма элюируют промыванием колонки 25% Буферным раствором В, а конъюгат - 50% Буферным раствором В. Проводимость содержащих конъюгат фракций впоследствии повышают до ~ 190 мСм/см Буферным раствором С (50 мМ Гэпэс, 5 М ЫаС1, рН 6,9) и наносят на колонку Н1Ргер Ви1у1 РР 16/10 объемом 20 мл (СЕ НеаНЬсаге, РаийеМ, СТ) предварительно уравновешенную Буферным раствором Ό (50 мМ Гэпэс, 3 М ЫаС1, рН 6,9). Свободный реагент ПСК вымывают Буферным раствором Ό в количестве 5 ОК. Далее конъюгат элюируют 100% Буферным раствором Е (50 мМ Гэпэс, рН 6,9). Содержащие конъюгат фракции концентрируют с помощью УФ/ДФ, используя мембрану на 10 кДа, сделанную из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсекания 10 кДа / МПНроге). Конечную стадию диафильтрации проводят против гистидинового буферного раствора с рН 6,9, содержащего 150 ММ ЫаС1. Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области. Для конъюгата ПСК-интерферон-гамма определили удельную активность > 50% по сравнению с активностью нативного интерферона-гамма. Конъюгат дополнительно исследовали аналитическими методами с помощью эксклюзионной ВЭЖХ, используя систему ВЭЖХ АдПеШ 1200, оборудованную колонкой 8ЬоПе\ Κν 803 в описаных ранее условиях (Ко1апсЬ е1 а1, ТгапкГикюп 2006; 46:1959-77). Показано, что полученный препарат не содержит свободного интерферона-гамма.
Способ 3:
мг интерферона-гамма растворяют в 8 мл гистидинового буферного раствора, рН 6,0 (20 мМ Ьгистидина, 150 мМ ЫаС1). Потом добавляют 200 мкл водного раствора перйодата натрия (5 мМ) и 2 мл водного раствора м-толуидина (50 мМ). Далее добавляют реагент аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) до получения 5-кратного молярного избытка реагента. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 100 мкл 1 М водного раствора цистеина.
Свободный интерферон-гамма удаляют с помощью катионообменной хроматографии (КОХ). Реакционную смесь разбавляют 20 мл Буферного раствора А (50 мМ Гэпэс, рН 6,5) и наносят на колонку ШРгер 8РРР 16/10 объемом 20 мл (СЕ НеаНЬсаге, Раийе1П, СТ) предварительно уравновешенную Буферным раствором А. Потом колонку элюируют Буферным раствором В (50 мМ Гэпэс, 1 М ЫаС1, рН 6,5). Свободный интерферон-гамма элюируют промыванием колонки 25 % Буферным раствором В, а конъюгат - 50% Буферным раствором В. Проводимость содержащих конъюгат фракций впоследствии повышают до ~ 190 мСм/см Буферным раствором С (50 мМ Гэпэс, 5 М ЫаС1, рН 6,9) и наносят на колонку Н1Ргер Ви1у1 РР 16/10 объемом 20 мл (СЕ НеаНЬсаге, РаийеМ, СТ) предварительно уравновешенную Буферным раствором Ό (50 мМ Гэпэс, 3 М ЫаС1, рН 6,9). Свободный реагент ПСК вымывают Буферным раствором Ό в количестве 5 ОК. Далее конъюгат элюируют 100% Буферным раствором Е (50 мМ Гэпэс, рН 6,9). Содержащие конъюгат фракции концентрируют с помощью УФ/ДФ, используя мембрану на 10 кДа, сделанную из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсекания 10 кДа/МНйроге). Конечную стадию диафильтрации проводят против гистидинового буферного раствора с рН 6,9, содержащего 150 мМ ЫаС1.
- 81 028186
Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области. Для конъюгата ПСКинтерферон-гамма определили удельную активность >50% по сравнению с активностью нативного интерферона-гамма. Конъюгат дополнительно исследовали аналитическими методами с помощью эксклюзионной ВЭЖХ, используя систему ВЭЖХ ЛдПеШ 1200, оборудованную колонкой 8ПоПех Κν 803 в описаных ранее условиях (Ко1апсП е1 а1., ТгапШыоп 2006;46:1959-77). Показано, что полученный препарат не содержит свободного интерферона-гамма.
Способ 4:
Интерферон-гамма растворяют или переносят в реакционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 1,0 +/- 0,25 мг/мл. Потом рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора НС1.
Далее к этому раствору интерферона-гамма добавляют реагент аминооксиполисиаловую кислоту (ПСК-ОИЩ) в 50-кратном молярном избытке при осторожном перемешивании в течение максимального периода времени (ΐ) 15 мин. Потом в течение 15 мин добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Наконец, добавляют 40 мМ водный раствор перйодата натрия до получения концентрации 400 мкМ.
Реакционную смесь инкубируют в течение 120 +/- 10 мин в темноте при температуре (Т) Т = +22 +/2°С при осторожном встряхивании. Потом реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь водного раствора Ь-цистеина (1 М) до получения конечной концентрации в реакционной смеси 10 мМ и инкубацией в течение 60 +/- 5 мин.
Полученный конъюгат интерферона-гамма очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие ПСК-интерферон-гамма фракции элюата собирают и концентрируют ультра-/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (МППроге).
Конъюгаты, полученные с использованием этой методики, исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка, биологической активности в соотвествии с методами, известными в этой области, и определением степени полисиалирования с помощью измерения содержания ПСК (анализ с резорцином).
Пример 28. Полисиалирование Г-КСФ с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора
Способ 1:
Исходную концентрацию гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) переносят в реакционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) и разбавляют его до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют №НО4 до получения конечной концентрации 200 мкМ. Проводят окисление при КТ в течение 30 мин в темноте при осторожном встряхивании. Потом реакцию останавливают цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ.
После этого раствор подвергают УФ/ДФ с использованием центрифужных фильтрационных устройств УАакрт для удаления избытка перйодата, гасителя и их побочных продуктов или, в качестве альтернативы, переносят на колонку для ИОХ объемом 20 мл (Мегск ЕМИ ТМАЕ (М)), которая уравновешивается Буферным раствором А (20 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 7,0). Колонку уравновешивают 5 ОК Буферного раствора А. Окисленный Г-КСФ элюируют Буферным раствором В (20 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, 1 М №С1, рН 7,0). Собирают фракции, содержащие Г-КСФ. Определяют содержание белка (Кумасси, метод Брэдфорда), корректируют его до 1 мг/мл с помощью реакционного буферного раствора и корректируют рН до 6,0 добавлением по каплям 0,5 М НС1.
Добавляют 50-кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию связывания проводят в течение 2 ч в темноте при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Избыток аминооксиреагента удаляют с помощью ХГВ. Проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буферного раствора, содержащего ацетат аммония (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, 8 М ацетата аммония, рН 6,9) и смесь наносят на колонку, заполненную 80 мл фенилсефарозы РР (СЕ НеаППсаге, Ра1гйе1П, СТ), предварительно уравновешенную раствором 50 мМ Гэпэс, 2,5 М ацетата аммония, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,9. Далее конъюгат элюируют 50 мМ буферным раствором Гэпэс с рН 7,5, содержащим 5 мМ СаС12. Наконец, содержащие ПСК-Г-КСФ фракции собирают и подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (МППроге). После этого препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения способ 1 выполняется следующим образом. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ) переносят в реакционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) и разбавляют его до
- 82 028186 получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют NаIΟ4 до получения конечной концентрации 200 мкМ. Проводят окисление при КТ в течение 30 мин в темноте при осторожном встряхивании. Потом реакцию останавливают цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ.
После этого раствор подвергают УФ/ДФ с применением центрифужных фильтрационных устройств УАакрш для удаления избытка перйодата, гасителя реакции и их побочных продуктов. Добавляют 50кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию связывания проводят в течение 2 ч в темноте при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Избыток аминоокси реагента удаляют с помощью ионообменной хроматографии. Содержащие ПСК-Г-КСФ фракции элюата собирают и подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (МПНроге). После этого препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
Способ 2:
Г-КСФ переносят или растворяют в реакционном буферном растворе (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 1,0 +/0,25 мг/мл. Потом рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора НС1. Далее в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор перйодата натрия до получения концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления выполняют в течение 30 +/- 5 мин при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С. Потом реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь водного раствора Ь-цистеина (1 М) в пределах 15 мин при Т = +22 +/- 2°С до получения конечной концентрации 10 мМ и инкубацией в течение 60 +/-5 мин.
Окисленный Г-КСФ дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие окисленный Г-КСФ фракции элюата собирают и используют в реакции конъюгации.
К элюату, содержащему очищенный окисленный Г-КСФ, добавляют реагент аминооксиполисиаловую кислоту (ПСК-ОИН2) в 50-кратном молярном избытке при осторожном перемешивании в течение максимального периода времени (Г) 15 мин. Потом в течение 15 мин добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют в течение 120 +/- 10 мин при рН 6,0 в темноте при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С при осторожном встряхивании (концентрация белка: 1 мг/мл).
Полученный конъюгат ПСК-Г-КСФ дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие конъюгат ПСК-Г-КСФ фракции собирают и концентрируют с помощью ультра/диафильтрации (УФ/ДФ), используя мембрану, сделанную из регенерированной целлюлозы, с подходящим порогом отсекания молекулярной массы (МПНроге).
Конъюгат, полученный с использованием этой методики, исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка, биологической активности и определением степени полисиалирования с помощью измерения содержания ПСК (анализ с резорцином).
Способ 3:
Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ) переносят в реакционный буферный раствор (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) и разбавляют его до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и Ν;ΠΟ4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию связывания проводят в течение 2 ч в темноте при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Далее реакцию останавливают цистеином (концентрация цистеина: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ. Потом проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буферного раствора, содержащего ацетат аммония (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, 8 М ацетата аммония, рН 6,9) и смесь наносят на колонку, заполненную фенилсефарозой РР (ОЕ НеаНЬсаге, РапйеМ, СТ), предварительно уравновешенную раствором 50 мМ Гэпэс, 2,5 М ацетата аммония, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, 0,01% Твина 80, рН 6,9. Далее конъюгат элюируют раствором 50 мМ Гэпэс, 5 мМ хлорида кальция, рН 7,5. Наконец, содержащие ПСК-Г-КСФ фракции собирают и подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (МПНроге). Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения способ 3 выполняется следующим образом. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ) переносят в реакционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) и разбавляют его до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реагента аминооксиПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и Ν;ΠΟ4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию свя- 83 028186 зывания проводят в течение 2 ч в темноте при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Далее реакцию останавливают цистеином (концентрация цистеина: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ и конъюгат очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие ПСК-Г-КСФ фракции элюата собирают и подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (Мккроге). Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
Способ 4:
Г-КСФ растворяют или переносят в реакционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 1,0 +/0,25 мг/мл. Потом рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора НС1.
Далее к этому раствору Г-КСФ добавляют реагент аминоокси-полисиаловую кислоту (ПСК-ОМН2) в 50-кратном молярном избытке при осторожном перемешивании в течение максимального периода времени (ΐ) 15 мин. Потом в течение 15 мин добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Наконец, добавляют 40 мМ водный раствор перйодата натрия до получения концентрации 400 мкМ.
Реакционную смесь инкубируют в течение 120 +/- 10 мин в темноте при температуре (Т) Т = +22 +/2°С при осторожном встряхивании. Потом реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь водного раствора Ь-цистеина (1 М) до получения конечной концентрации в реакционной смеси 10 мМ и инкубацией в течение 60 +/- 5 мин.
Полученный конъюгат Г-КСФ очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие ПСК-Г-КСФ фракции элюата собирают и концентрируют ультра-/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (Мккроге).
Конъюгаты, полученные с использованием этой методики, исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка, биологической активности в соотвествии с методами, известными в этой области, и определением степени полисиалирования с помощью измерения содержания ПСК (анализ с резорцином).
Пример 29. Полисиалирование белка Хумира с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора
Способ 1:
Исходную концентрацию белка Хумира переносят в реакционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) и разбавляют его до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют ΝηΙΟ4 до получения конечной концентрации 200 мкМ. Проводят окисление при КТ в течение 30 мин в темноте при осторожном встряхивании. Потом реакцию останавливают цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ.
После этого раствор подвергают УФ/ДФ с использованием центрифужных фильтрационных устройств УШакрш для удаления избытка перйодата, гасителя и их побочных продуктов или, в качестве альтернативы, переносят на колонку для ИОХ объемом 20 мл (Мегск ЕМЬ ТМАЕ (М)), которая уравновешивается Буферным раствором А (20 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 7,0). Колонку уравновешивают 5 ОК Буферного раствора А. Окисленный белок Хумира элюируют Буферным раствором В (20 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, 1 М №С1, рН 7,0). Собирают фракции, содержащие белок Хумира. Определяют содержание белка (Кумасси, метод Брэдфорда), корректируют его до 1 мг/мл с помощью реакционного буферного раствора и корректируют рН до 6,0 добавлением по каплям 0,5 М НС1.
Добавляют 50-кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию связывания проводят в течение 2 ч в темноте при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Избыток аминоокси реагента удаляют с помощью ХГВ. Проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буферного раствора, содержащего ацетат аммония (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, 8 М ацетата аммония, рН 6,9) и смесь наносят на колонку, заполненную 80 мл фенилсефарозы РР (ОЕ Неакксаге, РаиНеИ, СТ), предварительно уравновешенную раствором 50 мМ Гэпэс, 2,5 М ацетата аммония, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,9. Далее конъюгат элюируют 50 мМ буферным раствором Гэпэс с рН 7,5, содержащим 5 мМ СаС12. Наконец, содержащие ПСК-белок Хумира фракции собирают и подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (МПИроге). После этого препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения Способ 1 выполняется следующим образом. Белок Хумира переносят в реакционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) и разбавляют его до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют №·ιΙΟ4 до получения конечной концентрации 200 мкМ. Проводят окисление при КТ в течение 30 мин в темноте при осторожном встряхивании. Потом реакцию останавливают цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ.
После этого раствор подвергают УФ/ДФ с применением центрифужных фильтрационных устройств
- 84 028186
Ущакрш для удаления избытка перйодата, гасителя реакции и их побочных продуктов. Добавляют 50кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию связывания проводят в течение 2 ч в темноте при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Избыток аминооксиреагента удаляют с помощью ионообменной хроматографии.Содержащие ПСК-белок Хумира фракции элюата собирают и подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (Мййроге). После этого препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
Способ 2:
Белок Хумира переносят или растворяют в реакционном буферном растворе (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 1,0 +/- 0,25 мг/мл. Потом рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора НС1. Далее в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор перйодата натрия до получения концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления выполняют в течение 30 +/- 5 мин при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С. Потом реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь водного раствора Ьцистеина (1 М) в пределах 15 мин при Т = +22 +/- 2°С до получения конечной концентрации 10 мМ и инкубацией в течение 60 +/-5 мин.
Окисленный белок Хумира дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие окисленный белок Хумира фракции элюата собирают и используют в реакции конъюгации.
К элюату, содержащему очищенный окисленный белок Хумира, добавляют реагент аминооксиполисиаловую кислоту (ПСК-ОПН2) в 50-кратном молярном избытке при осторожном перемешивании в течение максимального периода времени (ΐ) 15 мин. Потом в течение 15 мин добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют в течение 120 +/- 10 мин при рН 6,0 в темноте при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С при осторожном встряхивании (концентрация белка: 1 мг/мл).
Полученный конъюгат ПСК-белок Хумира дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие конъюгат ПСК-белок Хумира фракции собирают и концентрируют с помощью ультра-/диафильтрации (УФ/ДФ), используя мембрану, сделанную из регенерированной целлюлозы, с подходящим порогом отсекания молекулярной массы (МПйроге).
Конъюгат, полученный с использованием этой методики, исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка, биологической активности и определением степени полисиалирования с помощью измерения содержания ПСК (анализ с резорцином).
Способ 3:
Белок Хумира переносят в реакционный буферный раствор (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) и разбавляют его до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и ШО) (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию связывания проводят в течение 2 ч в темноте при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Далее реакцию останавливают цистеином (концентрация цистеина: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ. Потом проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буферного раствора, содержащего ацетат аммония (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, 8 М ацетата аммония, рН 6,9) и смесь наносят на колонку, заполненную фенилсефарозой РР (ОЕ НеаКНсаге, Ра1гйе14, СТ), предварительно уравновешенную раствором 50 мМ Гэпэс, 2,5 М ацетата аммония, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, 0,01% Твина 80, рН 6,9. Далее конъюгат элюируют раствором 50 мМ Гэпэс, 5 мМ хлорида кальция, рН 7,5. Наконец, содержащие ПСК-белок Хумира фракции собирают и подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (МПйроге). Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения способ 3 выполняется следующим образом. Белок Хумира переносят в реакционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) и разбавляют его до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением м-толуидина в качестве нуклеоф ильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и ПаГОд (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию связывания проводят в течение 2 ч в темноте при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Далее реакцию останавливают цистеином (концентрация цистеина: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ и конъюгат очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие ПСК-белок Хумира фракции элюата собирают и подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (МПНроге). Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активно- 85 028186 сти в соответствии с методами, известными в этой области.
Способ 4:
Белок Хумира растворяют или переносят в реакционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 1,0 +/- 0,25 мг/мл. Потом рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора НС1.
Далее к этому раствору белка Хумира добавляют реагент аминоокси-полисиаловую кислоту (ПСКОЫН2) в 50-кратном молярном избытке при осторожном перемешивании в течение максимального периода времени (!) 15 мин. Потом в течение 15 мин добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Наконец, добавляют 40 мМ водный раствор перйодата натрия до получения концентрации 400 мкМ.
Реакционную смесь инкубируют в течение 120 +/- 10 мин в темноте при температуре (Т) Т = +22 +/2°С при осторожном встряхивании. Потом реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь водного раствора Ь-цистеина (1 М) до получения конечной концентрации в реакционной смеси 10 мМ и инкубацией в течение 60 +/- 5 мин.
Полученный конъюгат белка Хумира очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие ПСК-белок Хумира фракции элюата собирают и концентрируют ультра-/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (МПНроге).
Конъюгаты, полученные с использованием этой методики, исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка, биологической активности в соотвествии с методами, известными в этой области, и определением степени полисиалирования с помощью измерения содержания ПСК (анализ с резорцином).
Пример 30. Полисиалирование белка Пролиа с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора
Способ 1:
Исходную концентрацию белка Пролиа переносят в реакционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) и разбавляют его до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют Ыа1О4 до получения конечной концентрации 200 мкМ. Проводят окисление при КТ в течение 30 мин в темноте при осторожном встряхивании. Потом реакцию останавливают цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ.
После этого раствор подвергают УФ/ДФ с использованием центрифужных фильтрационных устройств Угуаярт для удаления избытка перйодата, гасителя и их побочных продуктов или, в качестве альтернативы, переносят на колонку для ИОХ объемом 20 мл (Мегск ЕМО ТМАЕ (М)), которая уравновешивается Буферным раствором А (20 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 7,0). Колонку уравновешивают 5 ОК Буферного раствора А. Окисленный белок Пролиа элюируют Буферным раствором В (20 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, 1 М ЫаС1, рН 7,0). Собирают фракции, содержащие белок Пролиа. Определяют содержание белка (Кумасси, метод Брэдфорда), корректируют его до 1 мг/мл с помощью реакционного буферного раствора и корректируют рН до 6,0 добавлением по каплям 0,5 М НС1.
Добавляют 50-кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением м-толуидина в качестве нуклеоф ильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию связывания проводят в течение 2 ч в темноте при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Избыток аминоокси реагента удаляют с помощью ХГВ. Проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буферного раствора, содержащего ацетат аммония (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, 8 М ацетата аммония, рН 6,9) и смесь наносят на колонку, заполненную 80 мл фенилсефарозы РР (СЕ НеаННсаге, Ра1гйе1б, СТ), предварительно уравновешенную раствором 50 мМ Гэпэс, 2,5 М ацетата аммония, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,9. Далее конъюгат элюируют 50 мМ буферным раствором Гэпэс с рН 7,5, содержащим 5 мМ СаС12. Наконец, содержащие ПСК-белок Пролиа фракции собирают и подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (МПНроге). После этого препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения способ 1 выполняется следующим образом. 10 мг белка Пролиа растворяют в 5 мл гистидинового буферного раствора, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ ЫаС1). Потом добавляют 100 мкл водного раствора перйодата натрия (5 мМ) и реакционную смесь инкубируют в течение 1 ч в темноте при 4°С при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 50 мкл 1 М водного раствора цистеина. Далее смесь подвергают УФ/ДФ с применением центрифужных фильтрационных устройств Угуакрш 15К 10 кДа для удаления избытка перйодата, гасителя реакции и их побочных продуктов.
Концентрат (приблиз. 7 мл), содержащий окисленный белок Пролиа, смешивают с 2 мл водного раствора м-толуидина (50 мМ) и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Потом добавляют реагент аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) до получения 5-кратного молярного из- 86 028186 бытка реагента. Эту смесь инкубируют в течение 2,5 ч при КТ в темноте при осторожном перемешивании.
Свободный белок Пролиа удаляют с помощью катионообменной хроматографии (КОХ). Реакционную смесь разбавляют 20 мл Буферного раствора А (50 мМ Гэпэс, рН 6,5) и наносят на колонку ШРгер 8РРР 16/10 объемом 20 мл (СЕ НеаИЬсаге, РаИНеИ, СТ) предварительно уравновешенную Буферным раствором А. Потом колонку элюируют Буферным раствором В (50 мМ Гэпэс, 1 М №С1, рН 6,5). Свободный белок Пролиа элюируют промыванием колонки 25 % Буферным раствором В, а конъюгат - 50% Буферным раствором В. Проводимость содержащих конъюгат фракций впоследствии повышают до ~190 мСм/см Буферным раствором С (50 мМ Гэпэс, 5 М №С1, рН 6,9) и наносят на колонку ШРгер Ви!у1 РР 16/10 объемом 20 мл (СЕ НеаИЬсаге, Ра1гйе1й, СТ) предварительно уравновешенную Буферным раствором Ό (50 мМ Гэпэс, 3 М №С1, рН 6,9). Свободный реагент ПСК вымывают Буферным раствором Ό в количестве 5 ОК. Далее конъюгат элюируют 100% Буферным раствором Е (50 мМ Гэпэс, рН 6,9). Содержащие конъюгат фракции концентрируют с помощью УФ/ДФ, используя мембрану на 10 кДа, сделанную из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсекания 10 кДа, МНПроге). Конечную стадию диафильтрации проводят против гистидинового буферного раствора с рН 6,9, содержащего 150 мМ №С1. Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области. Для конъюгата ПСКбелок Пролиа определили удельную активность > 50% по сравнению с активностью нативного белка Пролиа. Конъюгат дополнительно исследовали аналитическими методами с помощью эксклюзионной ВЭЖХ, используя систему ВЭЖХ ЛдПеШ 1200, оборудованную колонкой 8Ьойех К\У 803 в описаных ранее условиях (Ко1апсЬ е! а1, Т^аηδίи8^οη 2006; 46:1959-77). Показано, что полученный препарат не содержит свободного белка Пролиа.
Способ 2:
Белок Пролиа переносят или растворяют в реакционном буферном растворе (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 1,0 +/- 0,25 мг/мл. Потом рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора НС1. Далее в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор перйодата натрия до получения концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления выполняют в течение 30 +/- 5 мин при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С. Потом реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь водного раствора Ьцистеина (1 М) в пределах 15 мин при Т = +22 +/- 2°С до получения конечной концентрации 10 мМ и инкубацией в течение 60 +/-5 мин.
Окисленный белок Пролиа дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие окисленный белок Пролиа фракции элюата собирают и используют в реакции конъюгации.
К элюату, содержащему очищенный окисленный белок Пролиа, добавляют реагент аминооксиполисиаловую кислоту (ПСК-ΟNН2) в 50-кратном молярном избытке при осторожном перемешивании в течение максимального периода времени (!) 15 мин. Потом в течение 15 мин добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют в течение 120 +/- 10 мин при рН 6,0 в темноте при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С при осторожном встряхивании (концентрация белка: 1 мг/мл).
Полученный конъюгат ПСК-белок Пролиа дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Фракции, содержащие конъюгат белка Пролиа, собирают и концентрируют с помощью ультра-/диафильтрации (УФ/ДФ), используя мембрану, сделанную из регенерированной целлюлозы, с подходящим порогом отсекания молекулярной массы (МПИроге).
Конъюгат, полученный с использованием этой методики, исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка, биологической активности и определением степени полисиалирования с помощью измерения содержания ПСК (анализ с резорцином).
Способ 3:
Белок Пролиа переносят в реакционный буферный раствор (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) и разбавляют его до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) с последующим добавлением м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и Ν;·ιΙΟ.·ι (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию связывания проводят в течение 2 ч в темноте при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Далее реакцию останавливают цистеином (концентрация цистеина: 10 мМ) в течение 60 мин при КТ. Потом проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буферного раствора, содержащего ацетат аммония (50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, 8 М ацетата аммония, рН 6,9) и смесь наносят на колонку, заполненную фенилсефарозой РР (СЕ НеаИЬсаге, Ра1гйе1й, СТ), предварительно уравновешенную раствором 50 мМ Гэпэс, 2,5 М ацетата аммония, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, 0,01% Твина 80, рН 6,9. Далее конъюгат элюируют раствором 50 мМ Гэпэс, 5 мМ хлорида кальция, рН 7,5. Наконец, содержащие ПСК-белок Пролиа фракции собирают и подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы (МППроге). Препарат исследуют аналитическими методами путем измере- 87 028186 ния общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения способ 3 выполняется следующим образом. 10 мг белка Пролиа растворяют в 8 мл гистидинового буферного раствора, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ №С1). Потом добавляют 200 мкл водного раствора перйодата натрия (5 мМ) и 2 мл водного раствора м-толуидина (50 мМ). Далее добавляют реагент аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) до получения 5-кратного молярного избытка реагента. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 100 мкл 1 М водного раствора цистеина.
Свободный белок Пролиа удаляют с помощью катионообменной хроматографии (КОХ). Реакционную смесь разбавляют 20 мл Буферного раствора А (50 мМ Гэпэс, рН 6,5) и наносят на колонку ЩГгер δΡРР 16/10 объемом 20 мл (СЕ НеаИЬсаге, РаййеЫ, СТ) предварительно уравновешенную Буферным раствором А. Потом колонку элюируют Буферным раствором В (50 мМ Гэпэс, 1 М №С1, рН 6,5). Свободный белок Пролиа элюируют промыванием колонки 25% Буферным раствором В, а конъюгат - 50% Буферным раствором В. Проводимость содержащих конъюгат фракций впоследствии повышают до ~190 мСм/см Буферным раствором С (50 мМ Гэпэс, 5 М №С1, рН 6,9) и наносят на колонку Н|Ггер Βиίу1 РР 16/10 объемом 20 мл (СЕ НеаИЬсаге, РшгПеИ, СТ) предварительно уравновешенную Буферным раствором Ό (50 мМ Гэпэс, 3 М №С1, рН 6,9). Свободный реагент ПСК вымывают Буферным раствором Ό в количестве 5 ОК. Далее конъюгат элюируют 100% Буферным раствором Е (50 мМ Гэпэс, рН 6,9). Содержащие конъюгат фракции концентрируют с помощью УФ/ДФ, используя мембрану на 10 кДа, сделанную из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсекания 10 кДа/Μ^11^ρο^е). Конечную стадию диафильтрации проводят против гистидинового буферного раствора с рН 6,9, содержащего 150 мМ №С1. Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области. Для конъюгата ПСКбелок Пролиа определили удельную активность > 50% по сравнению с активностью нативного белка Пролиа. Конъюгат дополнительно исследовали аналитическими методами с помощью эксклюзионной ВЭЖХ, используя систему ВЭЖХ ЛдЬей 1200, оборудованную колонкой δЬοάеx К\У 803 в описаных ранее условиях (Ко1апсЬ е1 а1, Τ^аη5ίи5^οη 2006; 46:1959-77). Показано, что полученный препарат не содержит свободного белка Пролиа.
Способ 4:
Белок Пролиа растворяют или переносят в реакционный буферный раствор (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 1,0 +/- 0,25 мг/мл. Потом рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора НС1.
Далее к этому раствору белка Пролиа добавляют реагент аминооксиполисиаловую кислоту (ПСКОМН2) в 50-кратном молярном избытке при осторожном перемешивании в течение максимального периода времени (ί) 15 мин. Потом в течение 15 мин добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Наконец, добавляют 40 мМ водный раствор перйодата натрия до получения концентрации 400 мкМ.
Реакционную смесь инкубируют в течение 120 +/- 10 мин в темноте при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С при осторожном встряхивании. Потом реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь водного раствора Ь-цистеина (1 Μ) до получения конечной концентрации в реакционной смеси 10 мМ и инкубацией в течение 60 +/- 5 мин.
Полученный конъюгат белка Пролиа очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие ПСК-белок Пролиа фракции элюата собирают и концентрируют ультра-/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, сделанной из регенерированной целлюлозы ^ПИроге).
Конъюгаты, полученные с использованием этой методики, исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка, биологической активности в соотвествии с методами, известными в этой области, и определением степени полисиалирования с помощью измерения содержания ПСК (анализ с резорцином).
Пример 31. Полисиалирование других терапевтических белков
Реакции полисиалирования, которые проводят в присутствии альтернативных нуклеофильных катализаторов подобных м-толуидину или о-аминобензойной кислоте, как описано в данном документе, могут быть распространены на другие терапевтические белки. К примеру, в разных аспектах данного изобретения описанные выше в данном документе реакции полисиалирования или ПЭГилирования с ПСК-аминооксии или ПЭГ-аминооксии реагентами повторяют с терапевтическими белками, такими как те белки, которые описаны в данном документе.
- 88 028186
Пример 32. ПЭГилирование ЭПО с использованием реагента аминоокси-ПЭГ и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора
Способ 1:
Эритропоэтин (ЭПО) ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии §ипЬПдЙ® СА от компании Ν0Ε (Ы0Р Согр., Токуо, .Гараи). ЭПО растворяют в 7,0 мл гистидинового буферного раствора, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 ММ ЫаС1, 5 мМ СаС12). Потом добавляют водный раствор перйодата натрия (5 мМ) и реакционную смесь инкубируют в течение 1 ч в темноте при 4°С при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Далее смесь подвергают УФ/ДФ с применением центрифужных фильтрационных устройств Ущакрш для удаления избытка перйодата, гасителя реакции и их побочных продуктов.
После этого содержащий окисленный ЭПО концентрат смешивают с водным раствором мтолуидина (50 мМ) и инкубируют смесь в течение 30 мин при комнатной температуре. Потом добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до получения 5-кратного молярного избытка реагента. Эту смесь инкубируют в течение 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-ЭПО очищают ионообменной хроматографией (например, на О-сефарозе РР). К примеру, конъюгат в концентрации 1,5 мг белка/мл геля наносят на колонку, уравновешенную 50 мМ буферным раствором Гэпэс, рН 7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Полученный конъюгат элюируют 50 мМ буферным раствором Гэпэс, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ хлоридом натрия, рН 7,4 и потом подвергают УФ/ДФ, используя мембрану с подходящим порогом отсекания ММ. После этого препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения способ 1 выполняется следующим образом. ЭПО ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии §ипЬп§Ь1® СА от компании Ν0Ε (Ы0Р Согр., Токуо, Гараи). 10 мг ЭПО растворяют в 5 мл гистидинового буферного раствора, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ ЫаС1). Потом добавляют 100 мкл водного раствора перйодата натрия (5 мМ) и реакционную смесь инкубируют в течение 1 ч в темноте при 4°С при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 50 мкл 1 М водного раствора цистеина. Далее смесь подвергают УФ/ДФ с применением центрифужных фильтрационных устройств Ущакрт 15К 10 кДа для удаления избытка перйодата, гасителя реакции и их побочных продуктов.
Концентрат (приблиз. 7 мл), содержащий окисленный ЭПО, смешивают с 2 мл водного раствора мтолуидина (50 мМ) и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Потом добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описан выше) до получения 5-кратного молярного избытка реагента. Эту смесь инкубируют в течение 2,5 ч при КТ в темноте при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-ЭПО очищают ионообменной хроматографией на О-сефарозе РР. Реакционную смесь разбавляют 20 мл Буферного раствора А (50 мМ Гэпэс, рН 7,5) и наносят на колонку НГРгер ОРР 16/10 объемом 20 мл (ОЕ НеаЛЬсаге, РаЛГГе1П, СТ) предварительно уравновешенную Буферным раствором А. Потом колонку элюируют Буферным раствором В (50 мМ Гэпэс, 1 М ЫаС1, рН 7,5). Свободный ЭПО элюируют промыванием колонки 25% Буферным раствором В, а конъюгат - 50% Буферным раствором В. Содержащие конъюгат фракции концентрируют с помощью УФ/ДФ, используя мембрану на 10 кДа, сделанную из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсекания 10 кДа / МПЛроге). Конечную стадию диафильтрации проводят против гистидинового буферного раствора с рН 7,2, содержащего 150 мМ ЫаС1. Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области. Для конъюгата ПЭГ-ЭПО определили удельную активность > 50% по сравнению с активностью нативного ЭПО. Конъюгат дополнительно исследовали аналитическими методами с помощью эксклюзионной ВЭЖХ, используя систему ВЭЖХ АдПей 1200, оборудованную колонкой §ЬоПех Κν 803 в описаных ранее условиях (Ко1апсЬ еГ а1, ТгаизГикюп 2006; 46:1959-77). Показано, что полученный препарат не содержит свободного ЭПО.
Способ 2:
ЭПО ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии §ипЬг1§Ь1® СА от компании Ν0Ε (Ы0Р Согр., Токуо, .Гарап).
ЭПО переносят или растворяют в реакционном буферном растворе (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 1,0 +/0,25 мг/мл. Потом рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора НС1. Далее в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор перйодата натрия до получения концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления выполняют в течение 30 +/- 5 мин при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С.
- 89 028186
Потом реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь водного раствора Ь-цистеина (1 М) в пределах 15 мин при Т = +22 +/- 2°С до получения конечной концентрации 10 мМ и инкубацией в течение 60 +/-5 мин.
Окисленный ЭПО дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие окисленный ЭПО фракции элюата собирают и используют в реакции конъюгации.
К элюату, содержащему очищенный окисленный ЭПО, добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке при осторожном перемешивании в течение максимального периода времени (ΐ) 15 мин. Потом в течение 15 мин добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют в течение 120 +/- 10 мин в темноте при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПЭГ-ЭПО дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Фракции, содержащие конъюгат ПЭГ-ЭПО, собирают и концентрируют с помощью ультра-/диафильтрации (УФ/ДФ), используя мембрану, сделанную из регенерированной целлюлозы, с подходящим порогом отсекания молекулярной массы (МППроге).
Конъюгат, полученный с использованием этой методики, исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка и биологической активности в соотвестствии с методами, известными в этой области.
Способ 3:
ЭПО ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии δиηЪ^^дйΐ® СА от компании NΟΡ (ΝΟΕ Согр., Токуо, барап). ЭПО растворяют в буферном растворе Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0), смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и водным раствором м-толуидина (50 мМ). Далее добавляют аминоокси реагент до получения 20-кратного молярного избытка реагента. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-ЭПО очищают ионообменной хроматографией на О-сефарозе РР. Конъюгат в концентрации 1,5 мг белка/мл геля наносят на колонку, предварительно уравновешенную 50 мМ буферным раствором Гэпэс, рН 7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Полученный конъюгат элюируют 50 мМ буферным раствором Гэпэс, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ хлоридом натрия, рН 7,4 и потом подвергают УФ/ДФ, используя мембрану. Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения Способ 3 выполняется следующим образом. ЭПО ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии διιΐ'Λ^ΙιΙ® СА от компании NΟΡ (NΟΡ Согр., Токуо, барап). 10 мг ЭПО растворяют в ~8 мл гистидинового буферного раствора, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ №С1). Потом добавляют 200 мкл водного раствора перйодата натрия (5 мМ) и 2 мл водного раствора м-толуидина (50 мМ). Далее добавляют реагент аминоокси-ПЭГс ММ 20 кДа (описан выше) до получения 5-кратного молярного избытка реагента. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 100 мкл 1 М водного раствора цистеина.
Наконец, конъюгат ПЭГ-ЭПО очищают ионообменной хроматографией на О-сефарозе РР. Реакционную смесь разбавляют 20 мл Буферного раствора А (50 мМ Гэпэс, рН 7,5) и наносят на колонку ШРгер ОРР 16/10 объемом 20 мл (ОЕ НеаНйсате, РаНйе1б, СТ) предварительно уравновешенную Буферным раствором А. Потом колонку элюируют Буферным раствором В (50 мМ Гэпэс, 1 М №С1, рН 7,5). Свободный ЭПО элюируют промыванием колонки 25% Буферным раствором В, а конъюгат - 50% Буферным раствором В. Содержащие конъюгат фракции концентрируют с помощью УФ/ДФ, используя мембрану на 10 кДа, сделанную из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсекания 10 кДа/МПНроге). Конечную стадию диафильтрации проводят против гистидинового буферного раствора с рН 7,2, содержащего 150 мМ №С1. Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области. Для конъюгата ПЭГ-ЭПО определили удельную активность > 50% по сравнению с активностью нативного ЭПО. Конъюгат дополнительно исследовали аналитическими методами с помощью эксклюзионной ВЭЖХ, используя систему ВЭЖХ АдПеШ 1200, оборудованную колонкой δйοбеx Κν 803 в описаных ранее условиях (Ко1апсй еΐ а1., Тгап8би8юп 2006; 46:1959-77). Показано, что полученный препарат не содержит свободного ЭПО.
Способ 4:
ЭПО ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии διιΐ'Λ^ΙιΙ® СА от компании NΟΡ (NΟΡ Согр., Токуо, барап). Исходную концентрацию или навеску ЭПО переносят или
- 90 028186 растворяют в буферном растворе Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 2 мг ЭПО/мл. Далее в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор перйодата натрия до получения конечной концентрации 100 мкМ с последующим добавлением 50 мМ водного раствора м-толуидина до достижения конечной концентрации 10 мМ в течение периода времени 30 мин. Потом добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описан выше) до получения 20-кратного молярного избытка реагента. После коррекции рН до значения 6,0 смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора Ьцистеина до получения конечной концентрации 10 мМ.
Конъюгат ПЭГ-ЭПО очищают с помощью ионообменной хроматографии (ИОХ). Содержащие конъюгат фракции элюата концентрируют с помощью УФ/ДФ, используя мембрану на 10 кДа, сделанную из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсекания 10 кДа / МППроге). Заключительная стадия диафильтрации выполняется против буферного раствора Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 7,5).
Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (методики Брэдфорда и БХК) и биологической активности в соответствии с известными методами.
Пример 33. ПЭГилирование Апд-2 с использованием реагента аминоокси-ПЭГ и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора
Способ 1:
Апд-2 ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии БипЪПдЙ® СА от компании NΟΡ (ΝΟΕ Согр., Токуо, 1арап). Ап§-2 растворяют в 7,0 мл гистидинового буферного раствора, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 ММ №С1, 5 мМ СаС12). Потом добавляют водный раствор перйодата натрия (5 мМ) и реакционную смесь инкубируют в течение 1 часа в темноте при 4°С при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Далее смесь подвергают УФ/ДФ с применением центрифужных фильтрационных устройств Ущакрш для удаления избытка перйодата, гасителя реакции и их побочных продуктов.
После этого концентрат, содержащий окисленный Апд-2, смешивают с водным раствором мтолуидина (50 мМ) и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Потом добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до получения 5-кратного молярного избытка реагента. Эту смесь инкубируют в течение 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-Апд-2 очищают ионообменной хроматографией (например, на Р-сефарозе РР). К примеру, конъюгат в концентрации 1,5 мг белка/мл геля наносят на колонку, уравновешенную 50 мМ буферным раствором Гэпэс, рН 7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Полученный конъюгат элюируют 50 мМ буферным раствором Гэпэс, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ хлоридом натрия, рН 7,4 и потом подвергают УФ/ДФ, используя мембрану с подходящим порогом отсекания ММ. После этого препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения способ 1 выполняется следующим образом. Апд-2 ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии БипЪПдЙ® СА от компании NΟΡ (NΟΡ Согр., Токуо, 1арап). Ап§-2 растворяют в 7,0 мл гистидинового буферного раствора, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 ММ №С1, 5 мМ СаС12). Потом добавляют водный раствор перйодата натрия (5 мМ) и реакционную смесь инкубируют в течение 1 ч в темноте при 4°С при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Далее смесь подвергают УФ/ДФ с применением центрифужных фильтрационных устройств Ущакрш для удаления избытка перйодата, гасителя реакции и их побочных продуктов.
После этого концентрат, содержащий окисленный Апд-2, смешивают с водным раствором мтолуидина (50 мМ) и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Потом добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до получения 5-кратного молярного избытка реагента. Эту смесь инкубируют в течение 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-Апд-2 очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие конъюгат фракции элюата собирают и потом подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны с подходящим порогом отсекания ММ. После этого препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
Способ 2:
Апд-2 ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии БипЪПдЙ® СА от компании NΟΡ (NΟΡ Согр., Токуо, 1арап).
Апд-2 переносят или растворяют в реакционном буферном растворе (например, 50 мМ Гэпэс, 350
- 91 028186 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 1,0 +/0,25 мг/мл. Потом рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора НС1. Далее в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор перйодата натрия до получения концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления выполняют в течение 30 +/- 5 мин при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С. Потом реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь водного раствора Ь-цистеина (1 М) в пределах 15 мин при Т = +22 +/- 2°С до получения конечной концентрации 10 мМ и инкубацией в течение 60 +/-5 мин.
Окисленный Апд-2 дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие окисленный Апд-2 фракции элюата собирают и используют в реакции конъюгации.
К элюату, содержащему очищенный окисленный Апд-2, добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке при осторожном перемешивании в течение максимального периода времени (!) 15 мин. Потом в течение 15 мин добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют в течение 120 +/- 10 мин в темноте при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПЭГ-Апд-2 дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие конъюгат ПЭГ-Апд-2 фракции собирают и концентрируют с помощью ультра/диафильтрации (УФ/ДФ), используя мембрану, сделанную из регенерированной целлюлозы, с подходящим порогом отсекания молекулярной массы (МПЬроге).
Конъюгат, полученный с использованием этой методики, исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка и биологической активности в соотвестствии с методами, известными в этой области.
Способ 3:
Апд-2 ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии διιΐ'Λπ§1ιΙ® СА от компании NΟР ЩОР Согр., Тοкуο, 1арап). Апд-2 растворяют в буферном растворе Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0), смешивают с водным раствором перйодата натрия (10 мМ) и водным раствором м-толуидина (50 мМ). Далее добавляют аминооксиреагент до получения 20-кратного молярного избытка реагента. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-Апд-2 очищают методом ионообменной хроматографии на О-сефарозе РР. Конъюгат в концентрации 1,5 мг белка/мл геля наносят на колонку, предварительно уравновешенную 50 мМ буферным раствором Гэпэс, рН 7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Полученный конъюгат элюируют 50 мМ буферным раствором Гэпэс, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ хлоридом натрия, рН 7,4 и потом подвергают УФ/ДФ, используя мембрану. Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения способ 3 выполняется следующим образом. Апд-2 ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии διιΐ'Λπ§1ιΙ® СА от компании NΟР ЩОР Согр., Тοкуο, 1арап). Апд-2 растворяют в буферном растворе Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0), смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и водным раствором м-толуидина (50 мМ). Далее добавляют аминоокси реагент до получения 20кратного молярного избытка реагента. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-Апд-2 очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие конъюгат фракции элюата собирают и затем подвергают УФ/ДФ. Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
Способ 4:
Апд-2 ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии δиηЬ^^дЬ!® СА от компании NΟР ЩОР Согр., Токуо, 1арап). Исходную концентрацию или навеску Апд-2 переносят или растворяют в буферном растворе Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 2 мг Апд-2/мл. Далее в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор перйодата натрия до получения конечной концентрации 100 мкМ с последующим добавлением 50 мМ водного раствора м-толуидина до достижения конечной концентрации 10 мМ в течение периода времени 30 минут. Потом добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описан выше) до получения 20-кратного молярного избытка реагента. После коррекции рН до значения 6,0 смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и останав- 92 028186 ливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора Ьцистеина до получения конечной концентрации 10 мМ.
Конъюгат и ПЭГ-Апд-2 очищают с помощью ионообменной хроматографии (ИОХ). Содержащие конъюгат фракции элюата концентрируют с помощью УФ/ДФ, используя мембрану на 10 кДа, сделанную из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсекания 10 кДа / МПИроге). Заключительная стадия диафильтрации выполняется против буферного раствора Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 7,5).
Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (методики Брэдфорда и БХК) и биологической активности в соответствии с известными методами.
Далее свободный Апд-2 удаляют с помощью ионообменной хроматографии (ИОХ). Содержащие конъюгат фракции элюата концентрируют с помощью УФ/ДФ.
Пример 34. ПЭГилирование ФРЭС с использованием реагента аминоокси-ПЭГ и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора
Способ 1:
ФРЭС ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии 8ипЬпдИ1® СА от компании NОΡ ^ОР Согр., Токуо, .Гараи). ФРЭС растворяют в 7,0 мл гистидинового буферного раствора, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ №С1, 5 мМ СаС12). Потом добавляют водный раствор перйодата натрия (5 мМ) и реакционную смесь инкубируют в течение 1 ч в темноте при 4°С при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Далее смесь подвергают УФ/ДФ с применением центрифужных фильтрационных устройств Ущакрш для удаления избытка перйодата, гасителя реакции и их побочных продуктов.
После этого концентрат, содержащий окисленный ФРЭС, смешивают с водным раствором мтолуидина (50 мМ) и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Потом добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до получения 5-кратного молярного избытка реагента. Эту смесь инкубируют в течение 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-ФРЭС очищают ионообменной хроматографией (например, на О-сефарозе РР). К примеру, конъюгат в концентрации 1,5 мг белка/мл геля наносят на колонку, уравновешенную 50 мМ буферным раствором Гэпэс, рН 7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Полученный конъюгат элюируют 50 мМ буферным раствором Гэпэс, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ хлоридом натрия, рН 7,4 и потом подвергают УФ/ДФ, используя мембрану с подходящим порогом отсекания ММ. После этого препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения способ 1 выполняется следующим образом. ФРЭС ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии 8ипЬпдИ1® СА от компании NОΡ ^ОР Согр., Токуо, 1арап). ФРЭС растворяют в 7,0 мл гистидинового буферного раствора, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ №С1, 5 мМ СаС12). Потом добавляют водный раствор перйодата натрия (5 мМ) и реакционную смесь инкубируют в течение 1 ч в темноте при 4°С при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Далее смесь подвергают УФ/ДФ с применением центрифужных фильтрационных устройств Укакрт для удаления избытка перйодата, гасителя реакции и их побочных продуктов.
После этого концентрат, содержащий окисленный ФРЭС, смешивают с водным раствором мтолуидина (50 мМ) и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Потом добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до получения 5-кратного молярного избытка реагента. Эту смесь инкубируют в течение 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
В заключение, конъюгат ПЭГ-ФРЭС очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие конъюгат фракции элюата собирают и потом подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны с подходящим порогом отсекания ММ. После этого препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
Способ 2:
ФРЭС ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии 8ипЬпдИ1® СА от компании NОΡ ^ОР Согр., Токуо, 1арап). ФРЭС переносят или растворяют в реакционном буферном растворе (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 1,0 +/- 0,25 мг/мл. Потом рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора НС1. Далее в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор перйодата натрия до получения концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления выполняют в течение 30 +/5 мин при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С. Потом реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь водного раствора Ь-цистеина (1 М) в пределах 15 мин при Т = +22 +/- 2°С до получения конечной
- 93 028186 концентрации 10 мМ и инкубацией в течение 60 +/- 5 мин.
Окисленный ФРЭС дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие окисленный ФРЭС фракции элюата собирают и используют в реакции конъюгации.
К элюату, содержащему очищенный окисленный ФРЭС, добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке при осторожном перемешивании в течение максимального периода времени (ΐ) 15 мин. Потом в течение 15 мин добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют в течение 120 +/- 10 мин в темноте при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПЭГ-ФРЭС дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие конъюгат ПЭГ-ФРЭС фракции собирают и концентрируют с помощью ультра-/диафильтрации (УФ/ДФ), используя мембрану, сделанную из регенерированной целлюлозы, с подходящим порогом отсекания молекулярной массы (М^11^ροгс).
Конъюгат, полученный с использованием этой методики, исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка и биологической активности в соотвестствии с методами, известными в этой области.
Способ 3:
ФРЭС ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реагента является реагент серии БипЬпдШ® СА от компании NΟΡ (NΟΡ Согр., Тοкуο, 1арап). ФРЭС растворяют в буферном растворе Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0), смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и водным раствором м-толуидина (50 мМ). Далее добавляют аминоокси реагент до получения 20-кратного молярного избытка реагента. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-ФРЭС очищают ионообменной хроматографией на Ц-сефарозе РР. Конъюгат в концентрации 1,5 мг белка/мл геля наносят на колонку, предварительно уравновешенную 50 мМ буферным раствором Гэпэс, рН 7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Полученный конъюгат элюируют 50 мМ буферным раствором Гэпэс, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ хлоридом натрия, рН 7,4 и потом подвергают УФ/ДФ, используя мембрану. Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения способ 3 выполняется следующим образом. ФРЭС ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реагента является реагент серии БипЬпдШ® СА от компании NΟΡ (NΟΡ Согр., Тοкуο, 1арап). ФРЭС растворяют в буферном растворе Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0), смешивают с водным раствором перйодата натрия (10 мМ) и водным раствором м-толуидина (50 мМ). Далее добавляют аминооксиреагент до получения 20кратного молярного избытка реагента. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-ФРЭС очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие конъюгат фракции элюата собирают и потом подвергают УФ/ДФ. Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
Способ 4:
ФРЭС ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реагента является реагент серии БипЬпдШ® СА от компании NΟΡ (NΟΡ Сюгр., Тοкуο, 1арап). Исходную концентрацию или навеску ФРЭС переносят или растворяют в буферном растворе Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 2 мг ФРЭС/мл. Далее в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор перйодата натрия до получения конечной концентрации 100 мкМ с последующим добавлением 50 мМ водного раствора м-толуидина до достижения конечной концентрации 10 мМ в течение периода времени 30 мин. Потом добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описан выше) до получения 20-кратного молярного избытка реагента. После коррекции рН до значения 6,0 смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора Ьцистеина до получения конечной концентрации 10 мМ.
Конъюгат ПЭГ-ФРЭС очищают с помощью ионообменной хроматографии (ИОХ). Содержащие конъюгат фракции элюата концентрируют с помощью УФ/ДФ, используя мембрану на 10 кДа, сделанную из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсекания 10 кДа / М^11^ρο^е). Заключительная стадия диафильтрации выполняется против буферного раствора Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 7,5).
- 94 028186
Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (методики Брэдфорда и БХК) и биологической активности в соответствии с известными методами.
Пример 35. ПЭГилирование ЭФР с использованием реагента аминоокси-ПЭГ и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора
Способ 1:
ЭФР ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реагента является реагент серии БипЬпдШ® СА от компании NОР (ΝΟΕ Согр., Токуо, 1арап). ЭФР растворяют в 7,0 мл гистидинового буферного раствора, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 ММ №С1, 5 мМ СаС12). Потом добавляют водный раствор перйодата натрия (5 мМ) и реакционную смесь инкубируют в течение 1 ч в темноте при 4°С при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Далее смесь подвергают УФ/ДФ с применением центрифужных фильтрационных устройств УКазрш для удаления избытка перйодата, гасителя реакции и их побочных продуктов.
После этого концентрат, содержащий окисленный ЭФР, смешивают с водным раствором мтолуидина (50 мМ) и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Потом добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до получения 5-кратного молярного избытка реагента. Эту смесь инкубируют в течение 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-ЭФР очищают ионообменной хроматографией (например, на Ц-сефарозе РР). К примеру, конъюгат в концентрации 1,5 мг белка/мл геля наносят на колонку, уравновешенную 50 мМ буферным раствором Гэпэс, рН 7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Полученный конъюгат элюируют 50 мМ буферным раствором Гэпэс, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ хлоридом натрия, рН 7,4 и потом подвергают УФ/ДФ, используя мембрану с подходящим порогом отсекания ММ. После этого препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения способ 1 выполняется следующим образом. ЭФР ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии 8ипЬпд1ц® СА от компании NΟР (ΝΟΕ Согр., Токуо, .Гараи). ЭФР растворяют в 7,0 мл гистидинового буферного раствора, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 ММ №С1, 5 мМ СаС12). Потом добавляют водный раствор перйодата натрия (5 мМ) и реакционную смесь инкубируют в течение 1 ч в темноте при 4°С при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Далее смесь подвергают УФ/ДФ с применением центрифужных фильтрационных устройств Ууазрш для удаления избытка перйодата, гасителя реакции и их побочных продуктов.
После этого концентрат, содержащий окисленный ЭФР, смешивают с водным раствором мтолуидина (50 мМ) и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Потом добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до получения 5-кратного молярного избытка реагента. Эту смесь инкубируют в течение 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-ЭФР очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие конъюгат фракции элюата собирают и потом подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны с подходящим порогом отсекания ММ. После этого препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
Способ 2:
ЭФР ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии (ЗипЬпдЬ!® СА от компании NΟР (ΝΟΕ Согр., Токуо, 1арап). ЭФР переносят или растворяют в реакционном буферном растворе (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 1,0 +/- 0,25 мг/мл. Потом рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора НС1. Далее в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор перйодата натрия до получения концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления выполняют в течение 30 +/- 5 мин при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С. Потом реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь водного раствора Ь-цистеина (1 М) в пределах 15 мин при Т = +22 +/- 2°С до получения конечной концентрации 10 мМ и инкубацией в течение 60 +/- 5 мин.
Окисленный ЭФР дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие окисленный ЭФР фракции элюата собирают и используют в реакции конъюгации.
К элюату, содержащему очищенный окисленный ФРН, добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке при осторожном перемешивании в течение максимального периода времени (!) 15 мин. Потом в течение 15 мин добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют в течение 120 +/- 10 мин в темноте при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С при осторожном встряхивании.
- 95 028186
Полученный конъюгат ПЭГ-ЭФР дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие конъюгат ПЭГ-ЭФР фракции собирают и концентрируют с помощью ультра-/диафильтрации (УФ/ДФ), используя мембрану, сделанную из регенерированной целлюлозы, с подходящим порогом отсекания молекулярной массы (МПНроге).
Конъюгат, полученный с использованием этой методики, исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка и биологической активности в соотвестствии с методами, известными в этой области.
Способ 3:
ЭФР ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реагента является реагент серии §ипЬг1§ЬГ® СА от компании NΟΡ (NΟΡ Согр., Токуо, 1арап). ЭФР растворяют в буферном растворе Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0), смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и водным раствором м-толуидина (50 мМ). Далее добавляют аминооксиреагент до получения 20-кратного молярного избытка реагента. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-ЭФР очищают методом ионообменной хроматографии на О-сефарозе РР. Конъюгат в концентрации 1,5 мг белка/мл геля наносят на колонку, предварительно уравновешенную 50 мМ буферным раствором Гэпэс, рН 7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Полученный конъюгат элюируют 50 мМ буферным раствором Гэпэс, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ хлоридом натрия, рН 7,4 и потом подвергают УФ/ДФ, используя мембрану. Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения способ 3 выполняется следующим образом. ЭФР ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии ЗипЬпдЬГ® СА от компании NΟΡ (NΟΡ Согр., Токуо, 1арап). ЭФР растворяют в буферном растворе Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0), смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и водным раствором м-толуидина (50 мМ). Далее добавляют аминоокси реагент до получения 20кратного молярного избытка реагента. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-ЭФР очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие конъюгат фракции элюата собирают и потом подвергают УФ/ДФ. Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
Способ 4:
ЭФР ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии ЗипЬпдЫ® СА от компании NΟΡ (NΟΡ Согр., Токуо, 1арап). Исходную концентрацию или навеску ЭФР переносят или растворяют в буферном растворе Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 2 мг ЭФР/мл. Далее в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор перйодата натрия до получения конечной концентрации 100 мкМ с последующим добавлением 50 мМ водного раствора м-толуидина до достижения конечной концентрации 10 мМ в течение периода времени 30 мин. Потом добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описан выше) до получения 20-кратного молярного избытка реагента. После коррекции рН до значения 6,0 смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора Ьцистеина до получения конечной концентрации 10 мМ.
Конъюгат ПЭГ-ЭФР очищают с помощью ионообменной хроматографии (ИОХ). Содержащие конъюгат фракции элюата концентрируют с помощью УФ/ДФ, используя мембрану на 10 кДа, сделанную из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсекания 10 кДа / МПНроге). Заключительная стадия диафильтрации выполняется против буферного раствора Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 7,5).
Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (методики Брэдфорда и БХК) и биологической активности в соответствии с известными методами.
Пример 36. ПЭГилирование ФРН с использованием реагента аминоокси-ПЭГ и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора
Способ 1:
ФРН ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии ЗипЬпдЫ® СА от компании NΟΡ (NΟΡ Согр., Токуо, 1арап). ФРН растворяют в 7,0 мл гистидинового буферного раствора,
- 96 028186 рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 ММ №С1, 5 мМ СаС12). Потом добавляют водный раствор перйодата натрия (5 мМ) и реакционную смесь инкубируют в течение 1 ч в темноте при 4°С при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Далее смесь подвергают УФ/ДФ с применением центрифужных фильтрационных устройств Ущакрш для удаления избытка перйодата, гасителя реакции и их побочных продуктов.
После этого концентрат, содержащий окисленный ФРН, смешивают с водным раствором мтолуидина (50 мМ) и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Потом добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до получения 5-кратного молярного избытка реагента. Эту смесь инкубируют в течение 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-ФРН очищают ионообменной хроматографией (например, на О-сефарозе РР). К примеру, конъюгат в концентрации 1,5 мг белка/мл геля наносят на колонку, уравновешенную 50 мМ буферным раствором Гэпэс, рН 7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Полученный конъюгат элюируют 50 мМ буферным раствором Гэпэс, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ хлоридом натрия, рН 7,4 и потом подвергают УФ/ДФ, используя мембрану с подходящим порогом отсекания ММ. После этого препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения способ 1 выполняется следующим образом. ФРН ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии 8ипЬг1§П1® СА от компании NΟР ЩОР Согр., Токуо, 1арап). ФРН растворяют в 7,0 мл гистидинового буферного раствора, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 ММ №С1, 5 мМ СаС12). Потом добавляют водный раствор перйодата натрия (5 мМ) и реакционную смесь инкубируют в течение 1 ч в темноте при 4°С при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Далее смесь подвергают УФ/ДФ с применением центрифужных фильтрационных устройств Ущакрш для удаления избытка перйодата, гасителя реакции и их побочных продуктов.
После этого концентрат, содержащий окисленный ФРН, смешивают с водным раствором мтолуидина (50 мМ) и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Потом добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до получения 5-кратного молярного избытка реагента. Эту смесь инкубируют в течение 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
В заключение, конъюгат ПЭГ-ФРН очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие конъюгат фракции элюата собирают и потом подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны с подходящим порогом отсекания ММ. После этого препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
Способ 2:
ФРН ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии 8ипЬг1§П1® СА от компании NΟР ЩОР Согр., Токуо, 1арап). ФРН переносят или растворяют в реакционном буферном растворе (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 1,0 +/- 0,25 мг/мл. Потом рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора НС1. Далее в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор перйодата натрия до получения концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления выполняют в течение 30 +/- 5 мин при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С. Потом реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь водного раствора Ь-цистеина (1 М) в пределах 15 мин при Т = +22 +/- 2°С до получения конечной концентрации 10 мМ и инкубацией в течение 60 +/- 5 мин.
Окисленный ФРН дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие окисленный ФРН фракции элюата собирают и используют для реакции конъюгации.
К элюату, содержащему очищенный окисленный ФРН, добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке при осторожном перемешивании в течение максимального периода времени (ΐ) 15 мин. Потом в течение 15 мин добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют в течение 120 +/- 10 мин в темноте при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПЭГ-ФРН дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие конъюгат ПЭГ-ФРН фракции собирают и концентрируют с помощью ультра-/диафильтрации (УФ/ДФ), используя мембрану, сделанную из регенерированной целлюлозы, с подходящим порогом отсекания молекулярной массы (МгШроге).
Конъюгат, полученный с использованием этой методики, исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка и биологической активности в соотвестствии с методами, известными в этой области.
- 97 028186
Способ 3:
ФРН ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии БипЬпдЫ® СА от компании ΝΟΕ (ΝΟΕ Согр., Токуо, 1арап). ФРН растворяют в буферном растворе Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0), смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и водным раствором м-толуидина (50 мМ). Далее добавляют аминоокси реагент до получения 20-кратного молярного избытка реагента. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ -ФРН очищают ионообменной хроматографией на О-сефарозе РР. Конъюгат в концентрации 1,5 мг белка/мл геля наносят на колонку, предварительно уравновешенную 50 мМ буферным раствором Гэпэс, рН 7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Полученный конъюгат элюируют 50 мМ буферным раствором Гэпэс, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ хлоридом натрия, рН 7,4 и потом подвергают УФ/ДФ, используя мембрану. Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения способ 3 выполняется следующим образом. ФРН ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии БипЬпдШ® СА от компании ΝΟΓ (ΝΟΓ Согр., Токуо, 1арап). ФРН растворяют в буферном растворе Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0), смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и водным раствором м-толуидина (50 мМ). Далее добавляют аминоокси реагент до получения 20кратного молярного избытка реагента. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-ФРН очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие конъюгат фракции собирают и потом подвергают УФ/ДФ. Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
Способ 4:
ФРН ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реагента является реагент серии БипЬпдШ® СА от компании ΝΟΓ (ΝΟΓ Согр., Токуо, 1арап). Исходную концентрацию или навеску ФРН переносят или растворяют в буферном растворе Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 2 мг ФРН/мл. Далее в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор перйодата натрия до получения конечной концентрации 100 мкМ с последующим добавлением 50 мМ водного раствора м-толуидина до достижения конечной концентрации 10 мМ в течение периода времени 30 минут. Потом добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описан выше) до получения 20-кратного молярного избытка реагента. После коррекции рН до значения 6,0 смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора Ьцистеина до получения конечной концентрации 10 мМ.
Конъюгат ПЭГ-ФРН очищают с помощью ионообменной хроматографии (ИОХ). Содержащие конъюгат фракции элюата концентрируют с помощью УФ/ДФ, используя мембрану на 10 кДа, сделанную из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсекания 10 кДа / МИРроге). Заключительная стадия диафильтрации выполняется против буферного раствора Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 7,5).
Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (методики Брэдфорда и БХК) и биологической активности в соответствии с известными методами.
Пример 37. ПЭГилирование ГРЧ с использованием реагента аминоокси-ПЭГ и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора
Способ 1:
В данном документе описано, что аминокислотную последовательность гормона роста человека (ГРЧ) сначала модифицируют для внедренияпо меньшей мере одного сайта гликозилирования. После очистки ГРЧ гликозилируют ίη νίΙΐΌ в соответствии с известными в этой области способами.
ГРЧ ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии ЗипЬпдЫ®® СА от компании ΝΟΕ (ΝΟΕ Согр., Токуо, 1арап). ГРЧ растворяют в 7,0 мл гистидинового буферного раствора, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 ММ ЫаС1, 5 мМ СаС12). Потом добавляют водный раствор перйодата натрия (5 мМ) и реакционную смесь инкубируют в течение 1 ч в темноте при 4°С при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Далее смесь подвергают УФ/ДФ с применением центрифужных фильтраци- 98 028186 онных устройств УАакрш для удаления избытка перйодата, гасителя реакции и их побочных продуктов.
После этого концентрат, содержащий окисленный ГРЧ, смешивают с водным раствором мтолуидина (50 мМ) и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Потом добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до получения 5-кратного молярного избытка реагента. Эту смесь инкубируют в течение 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-ГРЧ очищают ионообменной хроматографией (например, на 0-сефарозе РР). К примеру, конъюгат в концентрации 1,5 мг белка/мл геля наносят на колонку, уравновешенную 50 мМ буферным раствором Гэпэс, рН 7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Полученный конъюгат элюируют 50 мМ буферным раствором Гэпэс, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ хлоридом натрия, рН 7,4 и потом подвергают УФ/ДФ, используя мембрану с подходящим порогом отсекания ММ. После этого препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения способ 1 выполняется следующим образом. В данном документе описано, что аминокислотную последовательность гормона роста человека (ГРЧ) сначала модифицируют для внедрения по меньшей мере одного сайта гликозилирования. После очистки ГРЧ гликозилируют ίη νίΐΐΌ в соответствии с известными в этой области способами.
ГРЧ ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии БипЬпдЫ® СА от компании NΟР ^ОР Согр., Токуо, 1арап). ГРЧ растворяют в 7,0 мл гистидинового буферного раствора, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 ММ №С1, 5 мМ СаС12). Потом добавляют водный раствор перйодата натрия (5 мМ) и реакционную смесь инкубируют в течение 1 ч в темноте при 4°С при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Далее смесь подвергают УФ/ДФ с применением центрифужных фильтрационных устройств УАакрш для удаления избытка перйодата, гасителя реакции и их побочных продуктов.
После этого концентрат, содержащий окисленный ГРЧ, смешивают с водным раствором мтолуидина (50 мМ) и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Потом добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до получения 5-кратного молярного избытка реагента. Эту смесь инкубируют в течение 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
В заключение, конъюгат ПЭГ-ГРЧ очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие конъюгат фракции элюата собирают и потом подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны с подходящим порогом отсекания ММ. После этого препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
Способ 2:
В данном документе описано, что аминокислотную последовательность гормона роста человека (ГРЧ) сначала модифицируют для внедрения по меньшей мере одного сайта гликозилирования. После очистки ГРЧ гликозилируют ίη νίΐΐΌ в соответствии с известными в этой области способами.
ГРЧ ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии БипЬпдЫ® СА от компании NΟР ^ОР Согр., Токуо, 1арап). ГРЧ переносят или растворяют в реакционном буферном растворе (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 1,0 +/- 0,25 мг/мл. Потом рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора НС1. Далее в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор перйодата натрия до получения концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления выполняют в течение 30 +/- 5 мин при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С. Потом реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь водного раствора Ь-цистеина (1 М) в пределах 15 мин при Т = +22 +/- 2°С до получения конечной концентрации 10 мМ и инкубацией в течение 60 +/- 5 мин.
Окисленный ГРЧ дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие окисленный ГРЧ фракции элюата собирают и используют в реакции конъюгации.
К элюату, содержащему очищенный окисленный ГРЧ, добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке при осторожном перемешивании в течение максимального периода времени (ΐ) 15 мин. Потом в течение 15 мин добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют в течение 120 +/- 10 мин в темноте при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПЭГ-ГРЧ дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие конъюгат ПЭГ-ФРН фракции собирают и концентрируют с помощью ультра-/диафильтрации (УФ/ДФ), используя мембрану, сделанную из регенерированной целлюлозы, с подходящим порогом отсекания молекулярной массы (МППроге).
Конъюгат, полученный с использованием этой методики, исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка и биологической активности в соотвестствии с методами, известными в этой области.
- 99 028186
Способ 3:
В данном документе описано, что аминокислотную последовательность гормона роста человека (ГРЧ) сначала модифицируют для внедрения по меньшей мере одного сайта гликозилирования. После очистки ГРЧ гликозилируют ш У'Пго в соответствии с известными в этой области способами.
ГРЧ ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии ЗипЬпдЫ® СА от компании ЫОР (ЫОР Согр., Токуо, 1арап). ГРЧ растворяют в буферном растворе Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0), смешивают с водным раствором перйодата натрия (10 мМ) и водным раствором м-толуидина (50 мМ). Далее добавляют аминоокси реагент до получения 20кратного молярного избытка реагента. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-ГРЧ очищают методом ионообменной хроматографии на О-сефарозе РР. Конъюгат в концентрации 1,5 мг белка/мл геля наносят на колонку, предварительно уравновешенную 50 мМ буферным раствором Гэпэс, рН 7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Полученный конъюгат элюируют 50 мМ буферным раствором Гэпэс, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ хлоридом натрия, рН 7,4 и потом подвергают УФ/ДФ, используя мембрану. Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения Способ 3 выполняется следующим образом. В данном документе описано, что аминокислотную последовательность гормона роста человека (ГРЧ) сначала модифицируют для внедрения по меньшей мере одного сайта гликозилирования. После очистки ГРЧ гликозилируют ш νίϋΌ в соответствии с известными в этой области способами. ГРЧ ПЭГ илируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии §ипЬН§Н!® СА от компании ЫОР (ЫОР Согр., Токуо, 1арап). ГРЧ растворяют в буферном растворе Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0), смешивают с водным раствором перйодата натрия (10 мМ) и водным раствором м-толуидина (50 мМ). Далее добавляют аминоокси реагент до получения 20-кратного молярного избытка реагента. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-ГРЧ очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие конъюгат фракции собирают и потом подвергают УФ/ДФ. Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
Способ 4:
В данном документе описано, что аминокислотную последовательность гормона роста человека (ГРЧ) сначала модифицируют для внедрения по меньшей мере одного сайта гликозилирования. После очистки ГРЧ гликозилируют ш νίϋΌ в соответствии с известными в этой области способами.
ГРЧ ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реагента является реагент серии ЗипЬпдЫ® СА от компании ЫОР (ЫОР Согр., Токуо, 1арап). Исходную концентрацию или навеску ГРЧ переносят или растворяют в буферном растворе Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 2 мг ГРЧ/мл. Далее в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор перйодата натрия до получения конечной концентрации 100 мкМ с последующим добавлением 50 мМ водного раствора м-толуидина до достижения конечной концентрации 10 мМ в течение периода времени 30 мин. Потом добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описан выше) до получения 20-кратного молярного избытка реагента. После коррекции рН до значения 6,0 смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора Ь-цистеина до получения конечной концентрации 10 мМ.
Конъюгат ПЭГ-ГРЧ очищают с помощью ионообменной хроматографии (ИОХ). Содержащие конъюгат фракции элюата концентрируют с помощью УФ/ДФ, используя мембрану на 10 кДа, сделанную из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсекания 10 кДа / МПНроге). Заключительная стадия диафильтрации выполняется против буферного раствора Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 7,5).
Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (методики Брэдфорда и БХК) и биологической активности в соответствии с известными методами.
Пример 38. ПЭГилирование ФНО-альфа с использованием реагента аминоокси-ПЭГ и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора
Способ 1:
ФНО-альфа ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа,
- 100 028186 содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реагента является реагент серии διιΐ'Λπ§1ιΙ® СА от компании NΟР ^ОР Согр., Щкуо, 1аран). ФНО-альфа растворяют в 7,0 мл гистидинового буферного раствора, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ №С1, 5 мМ СаС12). Потом добавляют водный раствор перйодата натрия (5 мМ) и реакционную смесь инкубируют в течение 1 ч в темноте при 4°С при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Далее смесь подвергают УФ/ДФ с применением центрифужных фильтрационных устройств УЛакрш для удаления избытка перйодата, гасителя реакции и их побочных продуктов.
После этого концентрат, содержащий окисленный ФНО-альфа, смешивают с водным раствором мтолуидина (50 мМ) и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Потом добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до получения 5-кратного молярного избытка реагента. Эту смесь инкубируют в течение 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-ФНО-альфа очищают ионообменной хроматографией (например, на Рсефарозе РР). К примеру, конъюгат в концентрации 1,5 мг белка/мл геля наносят на колонку, уравновешенную 50 мМ буферным раствором Гэпэс, рН 7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Полученный конъюгат элюируют 50 мМ буферным раствором Гэпэс, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ хлоридом натрия, рН
7,4 и потом подвергают УФ/ДФ, используя мембрану с подходящим порогом отсекания ММ. После этого препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения способ 1 выполняется следующим образом. ФНО-альфа ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии διιΐ'Λπ§1ιΙ® СА от компании NΟР ^ОР Согр., Щкуо, 1аран). ФНО-альфа растворяют в 7,0 мл гистидинового буферного раствора, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ №С1, 5 мМ СаС12). Потом добавляют водный раствор перйодата натрия (5 мМ) и реакционную смесь инкубируют в течение 1 ч в темноте при 4°С при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Далее смесь подвергают УФ/ДФ с применением центрифужных фильтрационных устройств УЛакрш для удаления избытка перйодата, гасителя реакции и их побочных продуктов.
После этого концентрат, содержащий окисленный ФНО-альфа, смешивают с водным раствором мтолуидина (50 мМ) и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Потом добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до получения 5-кратного молярного избытка реагента. Эту смесь инкубируют в течение 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-ФНО-альфа очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие конъюгат фракции элюата собирают и потом подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны с подходящим порогом отсекания ММ. После этого препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
Способ 2:
ФНО-альфа ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реагента является реагент серии ВилЬНдИ® СА от компании NΟР АОР Согр., Щкуо, 1аран). ФНО-альфа переносят или растворяют в реакционном буферном растворе (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 1,0 +/- 0,25 мг/мл. Потом рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора НС1. Далее в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор перйодата натрия до получения концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления выполняют в течение 30 +/5 мин при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С. Потом реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь водного раствора Ь-цистеина (1 М) в пределах 15 мин при Т = +22 +/- 2°С до получения конечной концентрации 10 мМ и инкубацией в течение 60 +/-5 мин.
Окисленный ФНО-альфа дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие окисленный ФНО-альфа фракции элюата собирают и используют в реакции конъюгации.
К элюату, содержащему очищенный окисленный ФНО-альфа, добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке при осторожном перемешивании в течение максимального периода времени (ί) 15 мин. Потом в течение 15 мин добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют в течение 120 +/- 10 мин в темноте при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПЭГ-ФНО-альфа дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие конъюгат ПЭГ-ФНО-альфа фракции собирают и концентрируют с помощью ультра-/диафильтрации (УФ/ДФ), используя мембрану, сделанную из регенерированной целлюлозы, с подходящим порогом отсекания молекулярной массы (Μ^11^ρο^е).
Конъюгат, полученный с использованием этой методики, исследуют аналитическими методами пу- 101 028186 тем измерения общего белка и биологической активности в соотвестствии с методами, известными в этой области.
Способ 3:
ФНО-альфа ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии 8ипЪг1§Ь!® СА от компании NΟР (ΝΟΕ Согр., Токуо, .Гараи). ФНО-альфа растворяют в буферном растворе Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0), смешивают с водным раствором перйодата натрия (10 мМ) и водным раствором м-толуидина (50 мМ). Далее добавляют аминоокси реагент до получения 20-кратного молярного избытка реагента. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-ФНО-альфа очищают ионообменной хроматографией на О-сефарозе РР. Конъюгат в концентрации 1,5 мг белка/мл геля наносят на колонку, предварительно уравновешенную 50 мМ буферным раствором Гэпэс, рН 7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Полученный конъюгат элюируют 50 мМ буферным раствором Гэпэс, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ хлоридом натрия, рН 7,4 и потом подвергают УФ/ДФ, используя мембрану. Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения способ 3 выполняется следующим образом. ФНО-альфа ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии 8ипЪг1§Ь!® СА от компании NΟР (NΟР Согр., Токуо, .Гараи). ФНО-альфа растворяют в буферном растворе Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0), смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и водным раствором м-толуидина (50 мМ). Далее добавляют аминооксиреагент до получения 20-кратного молярного избытка реагента. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-ФНО-альфа очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие конъюгат фракции собирают и потом подвергают УФ/ДФ. Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
Способ 4:
ФНО-альфа ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии 8ипЪг1§Ь!® СА от компании NΟР (NΟР Согр., Токуо, Ларам). Исходную концентрацию или навеску ФНО-альфа переносят или растворяют в буферном растворе Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 2 мг ФНО-альфа/мл. Далее в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор перйодата натрия до получения конечной концентрации 100 мкМ с последующим добавлением 50 мМ водного раствора м-толуидина до достижения конечной концентрации 10 мМ в течение периода времени 30 мин. Потом добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описан выше) до получения 20-кратного молярного избытка реагента. После коррекции рН до значения 6,0 смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора Ь-цистеина до получения конечной концентрации 10 мМ.
Конъюгат ПЭГ-ФНО-альфа очищают с помощью ионообменной хроматографии (ИОХ). Содержащие конъюгат фракции элюата концентрируют с помощью УФ/ДФ, используя мембрану на 10 кДа, сделанную из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсекания 10 кДа / МППроге). Заключительная стадия диафильтрации выполняется против буферного раствора Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 7,5).
Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (методики Брэдфорда и БХК) и биологической активности в соответствии с известными методами.
Пример 39. ПЭГилирование инсулина с использованием реагента аминоокси-ПЭГ и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора
Способ 1:
В данном документе описано, что аминокислотную последовательность инсулина сначала модифицируют для внедрения по меньшей мере одного сайта гликозилирования. После очистки инсулин гликозилируют ίη уПго в соответствии с известными в этой области способами. Инсулин ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии 8ипЪг1§Ь!® СА от компании NΟР (NΟР Согр., Токуо, .Таран). Инсулин растворяют в 7,0 мл гистидинового буферного раствора, рН 6,0 (20 мМ Ьгистидина, 150 мМ №С1, 5 мМ СаС12). Потом добавляют водный раствор перйодата натрия (5 мМ) и реакционную смесь инкубируют в течение 1 ч в темноте при 4°С при осторожном перемешивании и оста- 102 028186 навливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Далее смесь подвергают УФ/ДФ с применением центрифужных фильтрационных устройств Угуазрш для удаления избытка перйодата, гасителя реакции и их побочных продуктов.
После этого концентрат, содержащий окисленный инсулин, смешивают с водным раствором мтолуидина (50 мМ) и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Потом добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до получения 5-кратного молярного избытка реагента. Эту смесь инкубируют в течение 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-инсулина очищают ионообменной хроматографией (например, на 0сефарозе РР). К примеру, конъюгат в концентрации 1,5 мг белка/мл геля наносят на колонку, уравновешенную 50 мМ буферным раствором Гэпэс, рН 7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Полученный конъюгат элюируют 50 мМ буферным раствором Гэпэс, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ хлоридом натрия, рН
7,4 и потом подвергают УФ/ДФ, используя мембрану с подходящим порогом отсекания ММ. После этого препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения способ 1 выполняется следующим образом. В данном документе описано, что аминокислотную последовательность инсулина сначала модифицируют для внедрения по меньшей мере одного сайта гликозилирования. После очистки инсулин гликозилируют ш У11го в соответствии с известными в этой области способами. Инсулин ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии §ипЬп§Ы® СА от компании ЫОР (ЫОР Согр., Токуо, 1арап). Инсулин растворяют в 7,0 мл гистидинового буферного раствора, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 ММ ЫаС1, 5 мМ СаС12). Потом добавляют водный раствор перйодата натрия (5 мМ) и реакционную смесь инкубируют в течение 1 ч в темноте при 4°С при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Далее смесь подвергают УФ/ДФ с применением центрифужных фильтрационных устройств УАакрш для удаления избытка перйодата, гасителя реакции и их побочных продуктов.
После этого концентрат, содержащий окисленный инсулин, смешивают с водным раствором мтолуидина (50 мМ) и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Потом добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до получения 5-кратного молярного избытка реагента. Эту смесь инкубируют в течение 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-инсулина очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие конъюгат фракции элюата собирают и потом подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны с подходящим порогом отсекания ММ. После этого препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
Способ 2:
В данном документе описано, что аминокислотную последовательность инсулина сначала модифицируют для внедрения по меньшей мере одного сайта гликозилирования. После очистки инсулин гликозилируют ш уНго в соответствии с известными в этой области способами.
Инсулин ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии §ипЬпдЬ1® СА от компании ЫОР (ЫОР Согр., Токуо, 1арап). Инсулин переносят или растворяют в реакционном буферном растворе (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 1,0 +/- 0,25 мг/мл. Потом рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора НС1. Далее в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор перйодата натрия до получения концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления выполняют в течение 30 +/5 мин при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С. Потом реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь водного раствора Ь-цистеина (1 М) в пределах 15 мин при Т = +22 +/- 2°С до получения конечной концентрации 10 мМ и инкубацией в течение 60 +/-5 мин.
Окисленный инсулин дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие окисленный инсулин фракции элюата собирают и используют в реакции конъюгации.
К элюату, содержащему очищенный окисленный инсулин, добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке при осторожном перемешивании в течение максимального периода времени (ΐ) 15 мин. Потом в течение 15 мин добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют в течение 120 +/- 10 мин в темноте при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПЭГ-инсулина дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие конъюгат ПЭГ-инсулина фракции собирают и концентрируют с помощью ультра-/диафильтрации (УФ/ДФ), используя мембрану, сделанную из регенерированной целлюлозы, с подходящим порогом отсекания молекулярной массы (МПНроге).
Конъюгат, полученный с использованием этой методики, исследуют аналитическими методами пу- 103 028186 тем измерения общего белка и биологической активности в соотвестствии с методами, известными в этой области.
Способ 3:
В данном документе описано, что аминокислотную последовательность инсулина сначала модифицируют для внедрения по меньшей мере одного сайта гликозилирования. После очистки инсулин гликозилируют ш νί!Γο в соответствии с известными в этой области способами.
Инсулин ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реагента является реагент серии διιΐ'Λπ§1ιΙ®® СА от компании ЫОР (ЫОР Согр., Токуо, 1арап). Инсулин растворяют в буферном растворе Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0), смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и водным раствором м-толуидина (50 мМ). Далее добавляют аминоокси реагент до получения 20-кратного молярного избытка реагента. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и останввливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-инсулина очищают ионообменной хроматографией на О-сефарозе РР. Конъюгат в концентрации 1,5 мг белка/мл геля наносят на колонку, предварительно уравновешенную 50 мМ буферным раствором Гэпэс, рН 7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Полученный конъюгат элюируют 50 мМ буферным раствором Гэпэс, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ хлоридом натрия, рН 7,4 и потом подвергают УФ/ДФ, используя мембрану. Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения способ 3 выполняется следующим образом. В данном документе описано, что аминокислотную последовательность инсулина сначала модифицируют для внедрения по меньшей мере одного сайта гликозилирования. После очистки инсулин гликозилируют ш νίίΓο в соответствии с известными в этой области способами. Инсулин ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реагента является реагент серии διιιΛπβΙιΙ®® СА от компании ЫОР (ЫОР Согр., Токуо, 1арап). Инсулин растворяют в буферном растворе Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0), смешивают с водным раствором перйодата натрия (10 мМ) и водным раствором мтолуидина (50 мМ). Далее добавляют аминооксиреагент до получения 20-кратного молярного избытка реагента. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат инсулина очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие конъюгат фракции собирают и потом подвергают УФ/ДФ. Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
Способ 4:
В данном документе описано, что аминокислотную последовательность инсулина сначала модифицируют для внедрения по меньшей мере одного сайта гликозилирования. После очистки инсулин гликозилируют ш νί!Γο в соответствии с известными в этой области способами.
Инсулин ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реагента является реагент серии διιΐ'Λπ§1ιΙ®® СА от компании ЫОР (ЫОР Согр., Токуо, 1арап). Исходную концентрацию или навеску инсулина переносят или растворяют в буферном растворе Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 2 мг инсулина/мл. Далее в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор перйодата натрия до получения конечной концентрации 100 мкМ с последующим добавлением 50 мМ водного раствора м-толуидина до достижения конечной концентрации 10 мМ в течение периода времени 30 мин. Потом добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описан выше) до получения 20-кратного молярного избытка реагента. После коррекции рН до значения 6,0 смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора Ь-цистеина до получения конечной концентрации 10 мМ.
Конъюгат ПЭГ-инсулина очищают с помощью ионообменной хроматографии (ИОХ). Содержащие конъюгат фракции элюата концентрируют с помощью УФ/ДФ, используя мембрану на 10 кДа, сделанную из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсекания 10 кДа/МЬНроге). Заключительная стадия диафильтрации выполняется против буферного раствора Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 7,5).
Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (методики Брэдфорда и БХК) и биологической активности в соответствии с известными методами.
- 104 028186
Пример 40. ПЭГилирование интерферона-альфа с использованием реагента аминоокси-ПЭГ и мтолуидина в качестве нуклеофильного катализатора
Способ 1:
Интерферон-альфа ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии §ипЬпдЙ® СА от компании Ν0Ε (Ы0Р Согр., Токуо, .Гарап). Интерферон-альфа растворяют в 7,0 мл гистидинового буферного раствора, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ ЫаС1, 5 мМ СаС12). Потом добавляют водный раствор перйодата натрия (5 мМ) и реакционную смесь инкубируют в течение 1 ч в темноте при 4°С при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Далее смесь подвергают УФ/ДФ с применением центрифужных фильтрационных устройств Ущакрт для удаления избытка перйодата, гасителя реакции и их побочных продуктов.
После этого концентрат, содержащий окисленный интерферон-альфа, смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Потом добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до получения 5-кратного молярного избытка реагента. Эту смесь инкубируют в течение 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-интерферона-альфа очищают ионообменной хроматографией (например, на 0-сефарозе РР). К примеру, конъюгат в концентрации 1,5 мг белка/мл геля наносят на колонку, уравновешенную 50 мМ буферным раствором Гэпэс, рН 7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Полученный конъюгат элюируют 50 мМ буферным раствором Гэпэс, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ хлоридом натрия, рН
7,4 и потом подвергают УФ/ДФ, используя мембрану с подходящим порогом отсекания ММ. После этого препаратисследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения способ 1 выполняется следующим образом. Интерферон-альфа ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии 8ипЬпд1и® СА от компании Ν0Ε (Ы0Р Согр., Токуо, Гарап). Интерферон-альфа растворяют в 7,0 мл гистидинового буферного раствора, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ ЫаС1, 5 мМ СаС12). Потом добавляют водный раствор перйодата натрия (5 мМ) и реакционную смесь инкубируют в течение 1 ч в темноте при 4°С при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Далее смесь подвергают УФ/ДФ с применением центрифужных фильтрационных устройств Ущакрт для удаления избытка перйодата, гасителя реакции и их побочных продуктов.
После этого концентрат, содержащий окисленный интерферон-альфа, смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Потом добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до получения 5-кратного молярного избытка реагента. Эту смесь инкубируют в течение 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-интерферона-альфа очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие конъюгат фракции собирают и потом подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны с подходящим порогом отсекания ММ. После этого препаратисследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
Способ 2:
Интерферон-альфа ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии §ипЬпдЫ® СА от компании Ν0Ε (Ы0Р Согр., Токуо, Гарап). Интерферон-альфа переносят или растворяют в реакционном буферном растворе (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 1,0 +/- 0,25 мг/мл. Потом рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора НС1. Далее в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор перйодата натрия до получения концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления выполняют в течение 30 +/- 5 мин при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С. Потом реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь водного раствора Ь-цистеина (1 М) в пределах 15 мин при Т = +22 +/- 2°С до получения конечной концентрации 10 мМ и инкубацией в течение 60 +/-5 мин.
Окисленный интерферон-альфа дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие окисленный интерферон-альфа фракции элюата собирают и используют в реакции конъюгации.
К элюату, содержащему очищенный окисленный интерферон-альфа, добавляют реагент аминооксиПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке при осторожном перемешивании в течение максимального периода времени (ΐ) 15 мин. Потом в течение 15 мин добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют в течение 120 +/- 10 мин в темноте при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С при осторожном встряхивании.
- 105 028186
Полученный конъюгат ПЭГ-интерферона-альфа дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие конъюгат ПЭГ-интерферона-альфа фракции собирают и концентрируют с помощью ультра-/диафильтрации (УФ/ДФ), используя мембрану, сделанную из регенерированной целлюлозы, с подходящим порогом отсекания молекулярной массы (МППроге).
Конъюгат, полученный с использованием этой методики, исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка и биологической активности в соотвестствии с методами, известными в этой области.
Способ 3:
Интерферон-альфа ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии διιπЪпдШ® СА от компании NΟΡ (NΟΡ Согр., Токуо, барап). Интерферон-альфа растворяют в буферном растворе Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0), смешивают с водным раствором перйодата натрия (10 мМ) и водным раствором м-толуидина (50 мМ). Далее добавляют аминоокси реагент до получения 20-кратного молярного избытка реагента. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-интерферона-альфа очищают ионообменной хроматографией на Рсефарозе РР. Конъюгат в концентрации 1,5 мг белка/мл геля наносят на колонку, предварительно уравновешенную 50 мМ буферным раствором Гэпэс, рН 7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Полученный конъюгат элюируют 50 мМ буферным раствором Гэпэс, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ хлоридом натрия, рН
7,4 и потом подвергают УФ/ДФ, используя мембрану. Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения способ 3 выполняется следующим образом. Интерферон-альфа ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реагента является реагент серии δиηЪ^^дйΐ® СА от компании NΟΡ (NΟΡ Согр., Токуо, барап). Интерферон-альфа растворяют в буферном растворе Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0), смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и водным раствором м-толуидина (50 мМ). Далее добавляют аминооксиреагент до получения 20-кратного молярного избытка реагента. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-интерферона-альфа очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие конъюгат фракции собирают и потом подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны. Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
Способ 4:
Интерферон-альфа ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии διιπЪпдЫ® СА от компании NΟΡ (NΟΡ Согр., Токуо, барап). Исходную концентрацию или навеску интерферона-альфа переносят или растворяют в буферном растворе Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 2 мг интерферона-альфа/мл. Далее в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор перйодата натрия до получения конечной концентрации 100 мкМ с последующим добавлением 50 мМ водного раствора м-толуидина до достижения конечной концентрации 10 мМ в течение периода времени 30 мин. Потом добавляют реагент аминооксиПЭГ с ММ 20 кДа (описан выше) до получения 20-кратного молярного избытка реагента. После коррекции рН до значения 6,0 смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора Ь-цистеина до получения конечной концентрации 10 мМ.
Конъюгат ПЭГ-интерферона-альфа очищают с помощью ионообменной хроматографии (ИОХ). Содержащие конъюгат фракции элюата концентрируют с помощью УФ/ДФ, используя мембрану на 10 кДа, сделанную из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсекания 10 кДа / МППроге). Заключительная стадия диафильтрации выполняется против буферного раствора Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 7,5).
Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (методики Брэдфорда и БХК) и биологической активности в соответствии с известными методами.
Пример 41. ПЭГилирование интерферона-гамма с использованием реагента аминоокси-ПЭГ и мтолуидина в качестве нуклеофильного катализатора
Способ 1:
Интерферон-гамма ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии διιπЪпдЫ® СА от компании NΟΡ (NΟΡ Согр., Токуо, барап). 10 мг интерферона-гамма растворяют в 5 мл
- 106 028186 гистидинового буферного раствора, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ №С1). Потом добавляют 100 мкл водного раствора перйодата натрия (5 мМ) и реакционную смесь инкубируют в течение 1 ч в темноте при 4°С при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 50 мкл 1 М водного раствора цистеина. Далее смесь подвергают УФ/ДФ с применением центрифужных фильтрационных устройств Угуаврт 15К 10 кДа для удаления избытка перйодата, гасителя реакции и их побочных продуктов.
Концентрат (приблиз. 7 мл), содержащий окисленный интерферон-гамма, смешивают с 2 мл водного раствора м-толуидина (50 мМ) и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Потом добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описан выше) до получения 5-кратного молярного избытка реагента. Эту смесь инкубируют в течение 2,5 ч при КТ в темноте при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-интерферона-гамма очищают ионообменной хроматографией на 8Рсефарозе РР. Реакционную смесь разбавляют 20 мл Буферного раствора А (50 мМ Гэпэс, рН 6,5) и наносят на колонку №Ргер 8РРР 16/10 объемом 20 мл (ОЕ НеаИЬсаге, Ра1гйе1П, СТ) предварительно уравновешенную Буферным раствором А. Потом колонку элюируют Буферным раствором В (50 мМ Гэпэс, 1 М №С1, рН 6,5). Свободный интерферон-гамма элюируют промыванием колонки 25 % Буферным раствором В, а конъюгат - 50% Буферным раствором В. Содержащие конъюгат фракции концентрируют с помощью УФ/ДФ, используя мембрану на 10 кДа, сделанную из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсекания 10 кДа/МПНроге). Конечную стадию диафильтрации проводят против гистидинового буферного раствора с рН 6,9, содержащего 150 мМ №С1. Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области. Для конъюгата ПЭГ-интерферон-гамма определили удельную активность > 50% по сравнению с активностью нативного интерферона-гамма. Конъюгат дополнительно исследовали аналитическими методами с помощью эксклюзионной ВЭЖХ, используя систему ВЭЖХ А§Пеп1 1200, оборудованную колонкой 8ЬоПех Κν 803 в описаных ранее условиях (Ко1апсЬ е1 а1, ТгапхГи5юп 2006;46:1959-77). Показано, что полученный препарат не содержит свободного интерферона-гамма.
Способ 2:
Интерферон-гамма ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии 8ипЪпдЫ® СА от компании NΟΡ (NΟΡ Согр., Токуо, 1арап). Интерферон-гамма переносят или растворяют в реакционном буферном растворе (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 1,0 +/- 0,25 мг/мл. Потом рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора НС1. Далее в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор перйодата натрия до получения концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления выполняют в течение 30 +/- 5 мин при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С. Потом реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь водного раствора Ь-цистеина (1 М) в пределах 15 мин при Т = +22 +/- 2°С до получения конечной концентрации 10 мМ и инкубацией в течение 60 +/-5 мин.
Окисленный интерферон-гамма дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие окисленный интерферон-гамма фракции элюата собирают и используют для реакции конъюгации.
К элюату, содержащему очищенный окисленный интерферон-гамма, добавляют реагент аминооксиПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке при осторожном перемешивании в течение максимального периода времени (ΐ) 15 мин. Потом в течение 15 мин добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют в течение 120 +/- 10 мин в темноте при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПЭГ-интерферона-гамма дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие конъюгат ПЭГ-интерферона-гамма фракции собирают и концентрируют с помощью ультра-/диафильтрации (УФ/ДФ), используя мембрану, сделанную из регенерированной целлюлозы, с подходящим порогом отсекания молекулярной массы (МППроге).
Конъюгат, полученный с использованием этой методики, исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка и биологической активности в соотвестствии с методами, известными в этой области.
Способ 3:
Интерферон-гамма ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии 8ипЬпдЫ® СА от компании NΟΡ (NΟΡ Согр., Токуо, 1арап). 10 мг интерферон-гамма растворяют в ~8 мл гистидинового буферного раствора, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ №С1). Потом добавляют 200 мкл водного раствора перйодата натрия (5 мМ) и 2 мл водного раствора м-толуидина (50 мМ). Далее добавляют реагент аминоокси-ПЭГс ММ 20 кДа (описан выше) до получения 5-кратного молярного избытка реагента. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 100
- 107 028186 мкл 1 М водного раствора цистеина.
Наконец, конъюгат ПЭГ-интерферона-гамма очищают ионообменной хроматографией на 8Рсефарозе РР. Реакционную смесь разбавляют 20 мл Буферного раствора А (50 мМ Гэпэс, рН 6,5) и наносят на колонку ШРгер 8РРР 16/10 объемом 20 мл (СЕ ШаИксаю, Ра1гйе16, СТ) предварительно уравновешенную Буферным раствором А. Потом колонку элюируют Буферным раствором В (50 мМ Гэпэс, 1 М №С1, ρΗ 6,5). Свободный интерферон-гамма элюируют промыванием колонки 25% Буферным раствором В, а конъюгат - 50% Буферным раствором В. Содержащие конъюгат фракции концентрируют с помощью УФ/ДФ, используя мембрану на 10 кДа, сделанную из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсекания 10 кДа/ М^11^ρο^е). Конечную стадию диафильтрации проводят против гистидинового буферного раствора с рН 6,9, содержащего 150 мМ №С1. Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с известными в этой области методами. Для конъюгата ПЭГ-интерферон-гамма определили удельную активность > 50% по сравнению с активностью нативного интерферона-гамма. Конъюгат дополнительно исследовали аналитическими методами с помощью эксклюзионной ВЭЖХ, используя систему ВЭЖХ АдПеп1 1200, оборудованную колонкой 5>1юбе\ К\У 803 в описаных ранее условиях (Ι<ο1ηΓ®1ι еΐ а1., ТгапзГи8юп 2006; 46:1959-77). Показано, что полученный препарат не содержит свободного интерферона-гамма.
Способ 4:
Интерферон-гамма ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии §ипЬпдЫ® СА от компании NΟΡ (NΟΡ Согр., Тοкуο, 1арап). Исходную концентрацию или навеску интерферона-гамма переносят или растворяют в буферном растворе Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 2 мг интерферонагамма/мл. Далее в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор перйодата натрия до получения конечной концентрации 100 мкМ с последующим добавлением 50 мМ водного раствора м-толуидина до достижения конечной концентрации 10 мМ в течение периода времени 30 мин. Потом добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описан выше) до получения 20-кратного молярного избытка реагента. После коррекции рН до значения 6,0 смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора Ь-цистеина до получения конечной концентрации 10 мМ.
Конъюгат ПЭГ-интерферона-гамма очищают с помощью ионообменной хроматографии (ИОХ). Содержащие конъюгат фракции элюата концентрируют с помощью УФ/ДФ, используя мембрану на 10 кДа, сделанную из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсекания 10 кДа/М^11^ρο^е). Заключительная стадия диафильтрации выполняется против буферного раствора Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 7,5).
Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (методики Брэдфорда и БХК) и биологической активности в соответствии с известными методами.
Пример 42. ПЭГилирование Г-КСФ с использованием реагента аминоокси-ПЭГ и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора
Способ 1:
Г-КСФ ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реагента является реагент серии 8ипЬпд1и® СА от компании NΟΡ (NΟΡ Согр., Тοкуο, 1арап). Г-КСФ растворяют в 7,0 мл гистидинового буферного раствора, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ №С1, 5 мМ СаС12). Потом добавляют водный раствор перйодата натрия (5 мМ) и реакционную смесь инкубируют в течение 1 ч в темноте при 4°С при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Далее смесь подвергают УФ/ДФ с применением центрифужных фильтрационных устройств Ущазрт для удаления избытка перйодата, гасителя реакции и их побочных продуктов.
После этого концентрат, содержащий окисленный Г-КСФ, смешивают с водным раствором мтолуидина (50 мМ) и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Потом добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до получения 5-кратного молярного избытка реагента. Эту смесь инкубируют в течение 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-Г-КСФ очищают ионообменной хроматографией (например, на Цсефарозе РР). К примеру, конъюгат в концентрации 1,5 мг белка/мл геля наносят на колонку, уравновешенную 50 мМ буферным раствором Гэпэс, рН 7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Полученный конъюгат элюируют 50 мМ буферным раствором Гэпэс, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ хлоридом натрия, рН
7,4 и потом подвергают УФ/ДФ, используя мембрану с подходящим порогом отсекания ММ. После этого препаратисследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения Способ 1 выполняется следующим образом. ГКСФ ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержаще- 108 028186 го аминооксигруппу. Примером этого типа реагента является реагент серии 8ипЬпдН1® СА от компании NОΡ ^ОР Согр., Токуо, 1арап). Г-КСФ растворяют в 7,0 мл гистидинового буферного раствора, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ №С1, 5 мМ СаС12). Потом добавляют водный раствор перйодата натрия (5 мМ) и реакционную смесь инкубируют в течение 1 ч в темноте при 4°С при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Далее смесь подвергают УФ/ДФ с применением центрифужных фильтрационных устройств Ущакрш для удаления избытка перйодата, гасителя реакции и их побочных продуктов.
После этого концентрат, содержащий окисленный Г-КСФ, смешивают с водным раствором мтолуидина (50 мМ) и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Потом добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до получения 5-кратного молярного избытка реагента. Эту смесь инкубируют в течение 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
В заключение, конъюгат ПЭГ-Г-КСФ очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие конъюгат фракции элюата собирают и потом подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны с подходящим порогом отсекания ММ. После этого препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
Способ 2:
Г-КСФ ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии 8ипЬпдИ1® СА от компании NОΡ ^ОР Согр., Токуо, .Гараи). Г-КСФ переносят или растворяют в реакционном буферном растворе (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 1,0 +/- 0,25 мг/мл. Потом рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора НС1. Далее в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор перйодата натрия до получения концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления выполняют в течение 30 +/5 мин при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С. Потом реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь водного раствора Ь-цистеина (1 М) в пределах 15 мин при Т = +22 +/- 2°С до получения конечной концентрации 10 мМ и инкубацией в течение 60 +/-5 мин.
Окисленный Г-КСФ дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие окисленный Г-КСФ фракции элюата собирают и используют в реакции конъюгации.
К элюату, содержащему очищенный окисленный Г-КСФ, добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке при осторожном перемешивании в течение максимального периода времени (ΐ) 15 минут. Потом в течение 15 минут добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют в течение 120 +/- 10 мин в темноте при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПЭГ-Г-КСФ дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие конъюгат ПЭГ-Г-КСФ фракции собирают и концентрируют с помощью ультра/диафильтрации (УФ/ДФ), используя мембрану, сделанную из регенерированной целлюлозы, с подходящим порогом отсекания молекулярной массы (МПИроге).
Способ 3:
Г-КСФ ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии 8ипЬг1дЙ® СА от компании NОΡ ^ОР Согр., Токуо, 1арап). Г-КСФ растворяют в буферном растворе Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0), смешивают с водным раствором перйодата натрия (10 мМ) и водным раствором м-толуидина (50 мМ). Далее добавляют аминоокси реагент до получения 20-кратного молярного избытка реагента. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ -Г-КСФ очищают ионообменной хроматографией на О-сефарозе РР. Конъюгат в концентрации 1,5 мг белка/мл геля наносят на колонку, предварительно уравновешенную 50 мМ буферным раствором Гэпэс, рН 7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Полученный конъюгат элюируют 50 мМ буферным раствором Гэпэс, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ хлоридом натрия, рН 7,4 и потом подвергают УФ/ДФ, используя мембрану. Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения способ 3 выполняется следующим образом. ГКСФ ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии 8ипЬг1дЫ® СА от компании NОΡ ^ОР Согр., Токуо, 1арап). Г-КСФ растворяют в буферном растворе Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0), смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и водным раствором м-толуидина (50 мМ). Далее добавляют аминоокси реагент до получения 20кратного молярного избытка реагента. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной темпе- 109 028186 ратуре при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-Г-КСФ очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие конъюгат фракции элюата собирают и потом подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны. Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
Способ 4:
Г-КСФ ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реагента является реагент серии ЗипЬпдШ® СА от компании NΟΡ (NΟΡ Согр., Токуо, 1арап). Исходную концентрацию или навеску Г-КСФ переносят или растворяют в буферном растворе Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 2 мг Г-КСФ/мл. Далее в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор перйодата натрия до получения конечной концентрации 100 мкМ с последующим добавлением 50 мМ водного раствора м-толуидина до достижения конечной концентрации 10 мМ в течение периода времени 30 мин. Потом добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описан выше) до получения 20-кратного молярного избытка реагента. После коррекции рН до значения 6,0 смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора Ьцистеина до получения конечной концентрации 10 мМ.
Конъюгат Г-КСФ очищают с помощью ионообменной хроматографии (ИОХ). Содержащие конъюгат фракции элюата концентрируют с помощью УФ/ДФ, используя мембрану на 10 кДа, сделанную из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсекания 10 кДа / МПНроге). Заключительная стадия диафильтрации выполняется против буферного раствора Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 7,5).
Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (методики Брэдфорда и БХК) и биологической активности в соответствии с известными методами.
Пример 43. ПЭГилирование белка Хумира с использованием реагента аминоокси-ПЭГ и мтолуидина в качестве нуклеофильного катализатора
Способ 1:
Белок Хумира ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии §ипЬг1§Ь1® СА от компании NΟΡ (NΟΡ Согр., Токуо, 1арап). Белок Хумира растворяют в 7,0 мл гистидинового буферного раствора, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ ЫаС1, 5 мМ СаС12). Потом добавляют водный раствор перйодата натрия (5 мМ) и реакционную смесь инкубируют в течение 1 ч в темноте при 4°С при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Далее смесь подвергают УФ/ДФ с применением центрифужных фильтрационных устройств УАакрш для удаления избытка перйодата, гасителя реакции и их побочных продуктов.
После этого концентрат, содержащий окисленный белок Хумира, смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Потом добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до получения 5-кратного молярного избытка реагента. Эту смесь инкубируют в течение 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-белка Хумира очищают ионообменной хроматографией (например, на Рсефарозе РР). К примеру, конъюгат в концентрации 1,5 мг белка/мл геля наносят на колонку, уравновешенную 50 мМ буферным раствором Гэпэс, рН 7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Полученный конъюгат элюируют 50 мМ буферным раствором Гэпэс, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ хлоридом натрия, рН
7,4 и потом подвергают УФ/ДФ, используя мембрану с подходящим порогом отсекания ММ. После этого препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения способ 1 выполняется следующим образом. Белок Хумира ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реагента является реагент серии ЗипЬпдЫ® СА от компании NΟΡ (NΟΡ Согр., Токуо, 1арап). Белок Хумира растворяют в 7,0 мл гистидинового буферного раствора, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ ЫаС1, 5 мМ СаС12). Потом добавляют водный раствор перйодата натрия (5 мМ) и реакционную смесь инкубируют в течение 1 ч в темноте при 4°С при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Далее смесь подвергают УФ/ДФ с применением центрифужных фильтрационных устройств УАакрш для удаления избытка перйодата, гасителя реакции и их побочных продуктов.
После этого концентрат, содержащий окисленный белок Хумира, смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Потом добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до получения 5-кратного молярного избытка реагента. Эту смесь
- 110 028186 инкубируют в течение 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-белка Хумира очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие конъюгат фракции элюата собирают и потом подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны с подходящим порогом отсекания ММ. После этого препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
Способ 2:
Белок Хумира ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии БипЬпдШ® СА от компании NΟР (ΝΟΕ Согр., Токуо, 1арап). Белок Хумира переносят или растворяют в реакционном буферном растворе (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 1,0 +/- 0,25 мг/мл. Потом рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора НС1. Далее в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор перйодата натрия до получения концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления выполняют в течение 30 +/- 5 мин при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С. Потом реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь водного раствора Ь-цистеина (1 М) в пределах 15 минут при Т = +22 +/- 2°С до получения конечной концентрации 10 мМ и инкубацией в течение 60 +/-5 мин.
Окисленный белок Хумира дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие окисленный белок Хумира фракции элюата собирают и используют в реакции конъюгации.
К элюату, содержащему очищенный окисленный белок Хумира, добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке при осторожном перемешивании в течение максимального периода времени (!) 15 минут. Потом в течение 15 мин добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют в течение 120 +/- 10 мин в темноте при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПЭГ-белка Хумира дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Фракции, содержащие конъюгат ПЭГ-белка Хумира, собирают и концентрируют с помощью ультра-/диафильтрации (УФ/ДФ), используя мембрану, сделанную из регенерированной целлюлозы, с подходящим порогом отсекания молекулярной массы (МППроге).
Способ 3:
Белок Хумира ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии §ипЬпдЬ!® СА от компании NΟР (ΝΟΕ Согр., Токуо, 1арап). Белок Хумира растворяют в буферном растворе Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0), смешивают с водным раствором перйодата натрия (10 мМ) и водным раствором м-толуидина (50 мМ). Далее добавляют аминоокси реагент до получения 20-кратного молярного избытка реагента. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-белка Хумира очищают методом ионообменной хроматографии на Цсефарозе РР. Конъюгат в концентрации 1,5 мг белка/мл геля наносят на колонку, предварительно уравновешенную 50 мМ буферным раствором Гэпэс, рН 7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Полученный конъюгат элюируют 50 мМ буферным раствором Гэпэс, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ хлоридом натрия, рН
7,4 и потом подвергают УФ/ДФ, используя мембрану. Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения способ 3 выполняется следующим образом. Белок Хумира ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии §ипЬпдЬ!® СА от компании NΟР (NΟР Согр., Токуо, 1арап). Белок Хумира растворяют в буферном растворе Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0), смешивают с водным раствором перйодата натрия (10 мМ) и водным раствором м-толуидина (50 мМ). Далее добавляют аминоокси реагент до получения 20-кратного молярного избытка реагента. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-белка Хумира очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие конъюгат фракции собирают и потом подвергают УФ/ДФ с использованием мембраны. Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
Способ 4:
Белок Хумира ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии §ипЬпдЬ!® СА от компании NΟР (NΟР Согр., Токуо, 1арап). Исходную концентрацию или навеску белка Хумира
- 111 028186 переносят или растворяют в буферном растворе Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 2 мг белка Хумира/мл. Далее в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор перйодата натрия до получения конечной концентрации 100 мкМ с последующим добавлением 50 мМ водного раствора м-толуидина до достижения конечной концентрации 10 мМ в течение периода времени 30 мин. Потом добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описан выше) до получения 20-кратного молярного избытка реагента. После коррекции рН до значения 6,0 смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора Ь-цистеина до получения конечной концентрации 10 мМ.
Конъюгат белка Хумира очищают с помощью ионообменной хроматографии (ИОХ). Содержащие конъюгат фракции элюата концентрируют с помощью УФ/ДФ, используя мембрану на 10 кДа, сделанную из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсекания 10 кДа/МПНроге). Заключительная стадия диафильтрации выполняется против буферного раствора Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 7,5).
Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (методики Брэдфорда и БХК) и биологической активности в соответствии с известными методами.
Пример 44. ПЭГилирование белка Пролиа с использованием реагента аминоокси-ПЭГ и мтолуидина в качестве нуклеофильного катализатора
Способ 1:
Белок Пролиа ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реагента является реагент серии 8ипЬг1§П1® СА от компании NΟР ЩОР Согр., Токуо, 1арап). Белок Пролиа растворяют в 7,0 мл гистидинового буферного раствора, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ №С1, 5 мМ СаС12). Потом добавляют водный раствор перйодата натрия (5 мМ) и реакционную смесь инкубируют в течение 1 ч в темноте при 4°С при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Далее смесь подвергают УФ/ДФ с применением центрифужных фильтрационных устройств Ущакрш для удаления избытка перйодата, гасителя реакции и их побочных продуктов.
После этого концентрат, содержащий окисленный белок Пролиа, смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Потом добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до получения 5-кратного молярного избытка реагента. Эту смесь инкубируют в течение 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-белка Пролиа очищают ионообменной хроматографией (например, на Рсефарозе РР). К примеру, конъюгат в концентрации 1,5 мг белка/мл геля наносят на колонку, уравновешенную 50 мМ буферным раствором Гэпэс, рН 7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Полученный конъюгат элюируют 50 мМ буферным раствором Гэпэс, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ хлоридом натрия, рН
7,4 и потом подвергают УФ/ДФ, используя мембрану с подходящим порогом отсекания ММ. После этого препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (Кумасси, метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения способ 1 выполняется следующим образом. Белок Пролиа ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реагента является реагент серии 8ипЬг1§П1® СА от компании NΟР ЩОР Согр., Токуо, 1арап). 10 мг гР1Х растворяют в 5 мл гистидинового буферного раствора, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ №С1). Потом добавляют 100 мкл водного раствора перйодата натрия (5 мМ) и реакционную смесь инкубируют в течение 1 ч в темноте при 4°С при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 50 мкл 1 М водного раствора цистеина. Далее смесь подвергают УФ/ДФ с применением центрифужных фильтрационных устройств Ущакрш 15К 10 кДа для удаления избытка перйодата, гасителя реакции и их побочных продуктов.
Концентрат (приблиз. 7 мл), содержащий окисленный белок Пролиа, смешивают с 2 мл водного раствора м-толуидина (50 мМ) и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Потом добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описан выше) до получения 5-кратного молярного избытка реагента. Эту смесь инкубируют в течение 2,5 ч при КТ в темноте при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-белка Пролиа очищают ионообменной хроматографией на 8Р-сефарозе РР. Реакционную смесь разбавляют 20 мл Буферного раствора А (50 мМ Гэпэс, рН 6,5) и наносят на колонку ШРгер 8РРР 16/10 объемом 20 мл (СЕ НеаППсаге, РшгПеИ, СТ) предварительно уравновешенную Буферным раствором А. Потом колонку элюируют Буферным раствором В (50 мМ Гэпэс, 1 М №С1, рН 6,5). Свободный белок Пролиа элюируют промыванием колонки 25% Буферным раствором В, а конъюгат 50% Буферным раствором В. Содержащие конъюгат фракции концентрируют с помощью УФ/ДФ, используя мембрану на 10 кДа, сделанную из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсекания 10 кДа / МППроге). Конечную стадию диафильтрации проводят против гистидинового буферного раствора с
- 112 028186 рН 6,9, содержащего 150 мМ ЫаС1. Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области. Для конъюгата ПЭГ-белка Пролиа определили удельную активность > 50% по сравнению с активностью нативного белка Пролиа. Конъюгат дополнительно исследовали аналитическими методами с помощью эксклюзионной ВЭЖХ, используя систему ВЭЖХ АдПеШ 1200, оборудованную колонкой 8Ьойех Κ\ν 803 в описаных ранее условиях (Ко1апсЬ еΐ а1., ТгапкГикюп 2006;46:1959-77). Показано, что полученный препарат не содержит свободного белка Пролиа.
Способ 2:
Белок Пролиа ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии БипЬпдШ®® СА от компании ΝΟΕ (ΝΟΕ Согр., Токуо, 1арап). Белок Пролиа переносят или растворяют в реакционном буферном растворе (например, 50 мМ Гэпэс, 350 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 1,0 +/- 0,25 мг/мл. Потом рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5 н. водного раствора НС1. Далее в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор перйодата натрия до получения концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления выполняют в течение 30 +/- 5 мин при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С. Потом реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь водного раствора Ь-цистеина (1 М) в пределах 15 мин при Т = +22 +/- 2°С до получения конечной концентрации 10 мМ и инкубацией в течение 60 +/-5 мин.
Окисленный белок Пролиа дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Содержащие окисленный белок Хумира фракции элюата собирают и используют в реакции конъюгации.
К элюату, содержащему очищенный окисленный белок Пролиа, добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке при осторожном перемешивании в течение максимального периода времени (ΐ) 15 мин. Потом в течение 15 мин добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) до достижения конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют в течение 120 +/- 10 мин в темноте при температуре (Т) Т = +22 +/- 2°С при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПЭГ-белка Пролиа дополнительно очищают методом ионообменной хроматографии. Фракции, содержащие конъюгат ПЭГ-белка Пролиа, собирают и концентрируют с помощью ультра-/диафильтрации (УФ/ДФ), используя мембрану, сделанную из регенерированной целлюлозы, с подходящим порогом отсекания молекулярной массы (МИРроге).
Способ 3:
Белок Пролиа ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии БипЬпдШ®® СА от компании ΝΟΕ (ΝΟΕ Согр., Токуо, 1арап). ЭПО растворяют в буферном растворе Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0), смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и водным раствором м-толуидина (50 мМ). Далее добавляют аминооксиреагент до получения 20-кратного молярного избытка реагента. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-белка Пролиа очищают ионообменной хроматографией на О-сефарозе РР. Конъюгат в концентрации 1,5 мг белка/мл геля наносят на колонку, предварительно уравновешенную 50 мМ буферным раствором Гэпэс, рН 7,4, содержащим 5 мМ СаС12. Полученный конъюгат элюируют 50 мМ буферным раствором Гэпэс, содержащим 5 мМ СаС12 и 500 мМ хлоридом натрия, рН 7,4 и потом подвергают УФ/ДФ, используя мембрану. Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области.
В альтернативном варианте реализации изобретения способ 3 выполняется следующим образом.
Белок Пролиа ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии БипЬпдШ®® СА от компании ΝΟΕ (ΝΟΕ Согр., Токуо, 1арап). 10 мг белка Пролиа растворяют в ~8 мл гистидинового буферного раствора, рН 6,0 (20 мМ Ь-гистидина, 150 мМ ЫаС1). Потом добавляют 200 мкл водного раствора перйодата натрия (5 мМ) и 2 мл водного раствора м-толуидина (50 мМ). Далее добавляют реагент аминоокси-ПЭГс ММ 20 кДа (описан выше) до получения 5-кратного молярного избытка реагента. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 100 мкл 1 М водного раствора цистеина.
Наконец, конъюгат ПЭГ-белка Пролиа очищают ионообменной хроматографией на 8Р-сефарозе РР. Реакционную смесь разбавляют 20 мл Буферного раствора А (50 мМ Гэпэс, рН 6,5) и наносят на колонку ШРгер §РРР 16/10 объемом 20 мл (ОЕ Неакксаге, РакПеИ, СТ) предварительно уравновешенную Буферным раствором А. Потом колонку элюируют Буферным раствором В (50 мМ Гэпэс, 1 М ЫаС1, рН 6,5). Свободный белок Пролиа элюируют промыванием колонки 25% Буферным раствором В, а конъюгат 50% Буферным раствором В. Содержащие конъюгат фракции концентрируют с помощью УФ/ДФ, ис- 113 028186 пользуя мембрану на 10 кДа, сделанную из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсекания 10 кДа / МППроге). Конечную стадию диафильтрации проводят против гистидинового буферного раствора с рН 6,9, содержащего 150 мМ №С1. Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (метод Брэдфорда) и биологической активности в соответствии с методами, известными в этой области. Для конъюгата ПЭГ-белка Пролиа определили удельную активность > 50% по сравнению с активностью нативного белка Пролиа. Конъюгат дополнительно исследовали аналитическими методами с помощью эксклюзионной ВЭЖХ, используя систему ВЭЖХ АдПеШ 1200, оборудованную колонкой ЗНодех Κ\ν 803 в описаных ранее условиях (Ко1аг1сН еΐ а1., ТгшъГишоп 2006;46:1959-77). Показано, что полученный препарат не содержит свободного белка Пролиа.
Способ 4:
Белок Пролиа ПЭГилируют путем использования линейного реагента ПЭГилирования массой 20 кДа, содержащего аминоокси группу. Примером этого типа реагента является реагент серии ЗипЬпдНШ® СА от компании NΟР ^ОР Согр., Токуо, 1арап). Исходную концентрацию или навеску белка Хумира переносят или растворяют в буферном растворе Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида кальция, рН 6,0) до достижения конечной концентрации белка 2 мг белка Пролиа/мл. Далее в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор перйодата натрия до получения конечной концентрации 100 мкМ с последующим добавлением 50 мМ водного раствора м-толуидина до достижения конечной концентрации 10 мМ в течение периода времени 30 мин. Потом добавляют реагент аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описан выше) до получения 20-кратного молярного избытка реагента. После коррекции рН до значения 6,0 смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании и останавливают реакцию в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора Ь-цистеина до получения конечной концентрации 10 мМ.
Конъюгат белка Пролиа очищают с помощью ионообменной хроматографии (ИОХ). Содержащие конъюгат фракции элюата концентрируют с помощью УФ/ДФ, используя мембрану на 10 кДа, сделанную из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсекания 10 кДа/МПйроге). Заключительная стадия диафильтрации выполняется против буферного раствора Гэпэс (50 мМ Гэпэс, 5 мМ СаС12, рН 7,5).
Препарат исследуют аналитическими методами путем измерения общего белка (методики Брэдфорда и БХК) и биологической активности в соответствии с известными методами.
Пример 45. ПЭГилирование терапевтического белка с использованием разветвленного ПЭГ
ПЭГилирование терапевтического белка данного изобретения может быть распространено на разветвленный или линейный реагент ПЭГилирования, который получен из альдегида и подходящего линкера, содержащего активную аминооксигруппу.
Пример 46. Связывание диаминооксилинкера с нативной ПСК
В этом примере описываются методики получения реагентов аминоокси-ПСК с использованием нативной ПСК (т.е. без предварительного окисления), которые потом могут применяться для химической модификации терапевтических белков.
a) Связывание при температуре окружающей среды
52,2 мг нативной ПСК (ММ = 20 кДа), полученной из 8егит 1пз111и1е о£ Ιπάίη (Рипе, 1пд1а), растворили в 1,05 мл 50 мМ фосфатного буферного раствора с рН 6,0. Потом в реакционную смесь по каплям добавили 10,3 мг 3-оксапентан-1,5-диоксиамина (линкерная молекула). Реакцию повели при инкубации в течение 2 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
b) Связывание при повышенной температуре
52,2 мг нативной ПСК (ММ = 20 кДа), полученной из 8егцт 1пз111и1е о£ Ιπάί;·ι (Рипе, 1пд1а), растворили в 1,05 мл 50 мМ фосфатного буферного раствора с рН 6,0. Потом в реакционную смесь по каплям добавили 10,3 мг 3-оксапентан-1,5-диоксиамина (линкерная молекула). Реакцию повели при инкубации в течение 2 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании. Потом температуру повысили до 32-37°С и реакционную смесь инкубировали в течение следующих 14 ч.
c) Связывание при повышенной температуре и увеличенном избытке линкера
52,2 мг нативной ПСК (ММ = 20 кДа), полученной из 8егит 1пз111и1е о£ 1пд1а (Рипе, 1пд1а), растворили в 1,05 мл 50 мМ фосфатного буферного раствора с рН 6,0. Потом в реакционную смесь по каплям добавили 10,3 мг 3-оксапентан-1,5-диоксиамина (линкерная молекула). Реакцию повели при инкубации в течение 2 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании. Потом в реакцию по каплям добавили 26,3 мг 3-оксапентан-1,5-диоксиамина, температуру повысили до 32-37°С и реакционную смесь инкубировали в течение следующих 14 ч.
д) Очистка производных ПСК
После завершения инкубации реакционные смеси, полученные в пунктах а-с, очистили с помощью расширенного диализа. Для этого образцы реакционных смесей перенесли в кассеты для диализа 5>Пде-АЬу/ег (0-5-3 мл, ПОММ 3,5 кДа, рег. целлюлоза, Р1егсе) и диализировали против 10 мМ фосфатного буферного раствора рН 8,0 согласно следующей схеме:
ч против 500 мл буферного раствора при комнатной температуре ч против 500 мл буферного раствора при комнатной температуре
- 114 028186 ч против 500 мл буферного раствора при 4°С ч против 50 мл концентрирующего раствора для диализа ЗНбе-А-Ьу/ег при комнатной температуре для концентрирования до исходного объема образца.
Таким образом, получен очищенный аминоокси-ПСК реагент пригодный для использования в реакции конъюгации белков в соответствии, например, с примерами 11, 12, 14 и 17-31, описанными выше. Подобным образом, любой из описанных в данном документе водорастворимых полимеров может быть связан с аминооксилинкером, как описано в этом примере, и потом конъюгирован с белком, как изложено выше в примерах.
Препарат исследовали аналитическими методами путем измерения общей ПСК (анализ с резорцином) и общего количества аминоокси групп (анализ с ТНБС) для определения степени модификации. Для препарата (а) была определена степень модификации (МО), равная 0,35, для препарата (Ь) МО=0,54 и для препарата (с)МЭ = 0,58. Более того была измерена полидисперсность, а также содержание свободного 3оксапентан-1,5-диоксиамина. Для всех препаратов полидисперность была меньше чем 1,15, а содержание свободного линкера было меньше чем 0,15 мол.% концентрации ПСК.
Для модифицированной ПСК методом 13С-ЯМР спектроскопии на восстанавливающем конце была определена следующая структура:
Пример 47. Получение аминоокси-ПСК при 4°С с применением стадии хроматографической очистки
Во время подробного аналитического исследования реагента аминоокси-ПСК, полученного при комнатной температуре, при исследованиях ЯМР (см., например, предварительную заявку США № 61/647814, включенную в данный документ в полном объеме посредством ссылки), выявлено, что дериватизация окисленной ПСК диаминооксилинкером состоит из двух отличных реакций: быстрой реакции альдегидной группы на невосстанавливающем конце ПСК и медленной реакции альдегидной группы (в форме гемикеталя) на восстанавливающем конце ПСК. Последняя реакция может рассматриваться как нежелательная побочная реакция, которую необходимо избегать при получении реагента.
Поэтому процесс приготовления реагента аминоокси-ПСК оптимизировали, как описано в данном примере. Если процесс проводят при комнатной температуре, то в значительной степени может реагировать только восстанавливающий конец. Поэтому процесс скорректировали и провели при 2-8°С. При проведении всего процесса (химической реакции и очистки реагента ПСК методом ИОХ) при 2-8°С, протекание побочной реакции на восстанавливающем конце ПСК было значительно снижено.
Следовательно, изменение этого процесса приводит к получению реагента лучшего качества. Методика
1290 мг окисленной ПСК (ММ = 20 кДа), полученной из 8егит 1п8!йи!е о! 1пб1а (Рипе, 1пб1а), растворили в 25 мл 50 мМ фосфатного буферного раствора с рН 6,0 (Буферный раствор А). Потом к реакционной смеси добавили 209 мг 3-оксапентан-1,5-диоксиамина и инкубировали в течение 1 ч при 2-8°С при осторожном помешивании в темноте.
После инкубации смесь подвергли стадии неспецифической анионообменной хроматографии с применением геля для хроматографии Ргас!оде1 ЕМО ЭЕЛЕ 650-М (размер колонки: ХК26/135), которую провели в холодной комнате при температуре 2-8°С. Реакционную смесь разбавили 110 мл предварительно охлажденного Буферного раствора А и нанесли на ДЭАЭ-колонку, предварительно уравновешенную Буферным раствором А при скорости потока 1 см/мин. Потом колонку промыли 20 ОК Буферного раствора В (20 мМ Гэпэс, рН 6,0) для удаления свободного 3-оксапентан-1,5-диоксиамина при скорости потока 2 см/мин. Реагент аминоокси-ПСК потом элюировали со ступенчатым градиентом, содержащим 67% Буферного раствора В и 43% Буферного раствора С (20 мМ Гэпэс, 1М ЫаС1, рН 7,5). Элюат сконцентрировали с помощью УФ/ДФ с применением мембраны с порогом 5 кДа, сделанной из полиэфирсульфона (50 см2, МПНроге). Препарат исследовали аналитическими методами путем измерения общей ПСК (анализ с резорцином) и общего количества аминоокси групп (анализ с ТНБС) для определения степени модификации. В конечном препарате концентрация ПСК составила 46,0 мг/мл, а степень модификации - 83,5%. Кроме того, определили значение полидисперсности, равное 1,131. В дополнение была измерена концентрация свободного 3-оксапентан-1,5-диоксиамина, равная 0,22 мкг/мл (0,07 мол.% ПСК).
Таким образом, получен очищенный аминоокси-ПСК реагент пригодный для использования в реакции конъюгации в соответствии с примерами 11, 12, 14 и 17-31, описанными выше.

Claims (31)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ конъюгации водорастворимого полимера с окисленным углеводным компонентом терапевтического белка, включающий осуществление контакта окисленного углеводного компонента с активированным водорастворимым полимером в условиях, которые допускают конъюгацию;
    причем указанный водорастворимый полимер содержит активную аминооксигруппу и представляет собой полисиаловую кислоту (ПСК);
    при этом ПСК, содержащую активную аминооксигруппу, получают способом, включающим:
    a) инкубирование раствора, содержащего окисленную ПСК с аминооксилинкером, содержащим активную аминооксигруппу, в условиях, которые допускают образование стабильной оксимной связи между окисленной ПСК и активированным аминооксилинкером, причем указанные условия включают период времени между 1 мин и 24 ч, температуру между 2 и 8°С; присутствие или отсутствие света и наличие или отсутствие перемешивания; благодаря чему образуется ПСК, содержащая активную аминооксигруппу; и
    b) очистку ПСК, содержащей активную аминооксигруппу, способом, выбранным из группы, состоящей из хроматографии, фильтрации, диализа и осаждения при температуре между 2 и 8°С;
    причем указанный углеводный компонент окисляют путем инкубации с буферным раствором, содержащим окисляющий агент, выбранный из группы, состоящей из перйодата натрия ЩаЮ4), тетраацетата свинца ^^ΟΑ^.^ и перрутената калия (КΚиΟ4);
    при этом образуется оксимная связь между окисленным углеводным компонентом и активной аминооксигруппой водорастворимого полимера;
    при этом образование оксимной связи катализируется м-толуидином.
  2. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что раствор, содержащий окисленную ПСК и аминооксилинкер, содержащий активную аминооксигруппу, инкубируют при 4°С в течение 1 ч в отсутствие света и при перемешивании.
  3. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что ПСК, содержащая активную аминооксигруппу, очищают анионообменной хроматографией при температуре 4°С.
  4. 4. Способ по п.3, отличающийся тем, что ПСК окисляют путем инкубации с Ν;ιΙΟ(.
  5. 5. Способ конъюгации ПСК с окисленным углеводным компонентом терапевтического белка, включающий осуществление контакта окисленного углеводного компонента с активированной ПСК в условиях, которые допускают конъюгацию;
    при этом ПСК, содержащую активную аминооксигруппу, получают способом, включающим:
    a) инкубирование раствора, содержащего ПСК с аминооксилинкером, содержащим активную аминооксигруппу, в условиях, которые допускают образование стабильной оксимной связи между ПСК и активированным аминооксилинкером, где указанные условия включают инкубирование при 22°С в течение 2 ч в отсутствие света и при перемешивании; причем способ дополнительно включает стадию повышения температуры раствора до температуры между 32 и 37°С и инкубирования в течение дополнительных 12-24 ч, благодаря чему образуется водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу;
    b) очистку ПСК, содержащей активную аминооксигруппу, способом, выбранным из хроматографии, фильтрации, диализа и осаждения;
    причем указанный углеводный компонент окисляют путем инкубации с буферным раствором, содержащим окисляющий агент, выбранный из группы, состоящей из перйодата натрия ЩаЮ4), тетраацетата свинца (РЪ^АсЦ) и перрутената калия (КΚиΟ4);
    при этом образуется оксимная связь между окисленным углеводным компонентом и активной аминооксигруппой ПСК;
    при этом образование оксимной связи катализируется м-толуидином.
  6. 6. Способ по п.5, включающий дополнительную стадию добавления дополнительного количества аминооксилинкера, содержащего активную аминооксигруппу, непосредственно перед повышением температуры.
  7. 7. Способ по п.5 или 6, отличающийся тем, что ПСК, содержащую активную аминооксигруппу, очищают способом, выбранным из диализа, ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) и хроматографии при температуре 22°С.
  8. 8. Способ по п.7, дополнительно включающий стадию очистки ПСК, содержащей активную аминооксигруппу, способом, выбранным из диализа, УФ/ДФ или хроматографии при 4°С.
  9. 9. Способ по п.1 или 5, отличающийся тем, что терапевтический белок выбирают из группы, состоящей из Фактора 1Х (Р1Х), Фактора УШ (РУШ), Фактора У11а (РУНа), Фактора фон Виллебранда (У^Р), Фактора РУ (РУ), Фактора Х (РХ), Фактора Х1 (РХ1), Фактора Х11 (РХ11), тромбина (Р11), белка С, белка 8, 1РА, РА1-1, тканевого фактора (ТФ), протеазы АЭАМТ8 13, ИЛ-1 альфа, ИЛ-1 бета, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-11, колониестимулирующего фактора-1 (КСФ-1), М-КСФ, ФСК, ГМ-КСФ, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ), ЭПО, интерферона-альфа (ИФН-альфа), консенсусного интерферона, ИФН-бета, ИФН-гамма, ИФН-омега, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-9, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-13,
    - 116 028186
    ИЛ-14, ИЛ-15, ИЛ-16, ИЛ-17, ИЛ-18, ИЛ-19, ИЛ-20, ИЛ-21, ИЛ-22, ИЛ-23, ИЛ-24, ИЛ-31, ИЛ-32 альфа, ИЛ-33, тромбопоэтина (ТПО), Αη§-1, Αη§-2, Αη§-4, Αη§-Υ, ангиопоэтинподобного полипептида 1 (ΛNСΡΤ^1), ангиопоэтинподобного полипептида 2 (ЛNСΡΤ^2), ангиопоэтинподобного полипептида 3 (ЛNСΡΤ^3), ангиопоэтинподобного полипептида 4 (ЛNСΡΤ^4), ангиопоэтинподобного полипептида 5 (ЛNСΡΤ^5), ангиопоэтинподобного полипептида 6 (ЛNСΡΤ^6), ангиопоэтинподобного полипептида 7 (ЛNСΡΤ^7), витронектина, фактора роста эндотелия сосудов (ФРЭС), ангиогенина, активина А, активина В, активина С, костного морфогенетического белка-1, костного морфогенетического белка-2, костного морфогенетического белка-3, костного морфогенетического белка-4, костного морфогенетического белка-5, костного морфогенетического белка-6, костного морфогенетического белка-7, костного морфогенетического белка-8, костного морфогенетического белка-9, костного морфогенетического белка-10, костного морфогенетического белка-11, костного морфогенетического белка-12, костного морфогенетического белка-13, костного морфогенетического белка-14, костного морфогенетического белка-15, рецептора К костного морфогенетического белка, рецептора ΣΒ костного морфогенетического белка, рецептора II костного морфогенетического белка, нейротрофического фактора головного мозга, кардиотрофина1, цилиарного нейротрофического фактора, рецептора цилиарного нейротрофического фактора, белка крипто, криптического белка, индуцируемого цитокинами хемотаксического фактора 1 нейтрофилов, индуцируемого цитокинами хемотаксического фактора 2α нейтрофилов, индуцируемого цитокинами хемотаксического фактора 2β нейтрофилов, эндотелиального клеточного фактора роста β, эндотелина 1, эпидермального фактора роста, эпигена, эпирегулина, аттрактанта нейтрофилов эпителиального происхождения, фактора роста фибробластов 4, фактора роста фибробластов 5, фактора роста фибробластов 6, фактора роста фибробластов 7, фактора роста фибробластов 8, фактора роста фибробластов 8Ь, фактора роста фибробластов 8с, фактора роста фибробластов 9, фактора роста фибробластов 10, фактора роста фибробластов 11, фактора роста фибробластов 12, фактора роста фибробластов 13, фактора роста фибробластов 16, фактора роста фибробластов 17, фактора роста фибробластов 19, фактора роста фибробластов 20, фактора роста фибробластов 21, кислого фактора роста фибробластов, основного фактора роста фибробластов, рецептора α1 нейротрофического фактора глиальной клеточной линии, рецептора α2 нейротрофического фактора глиальной клеточной линии, связанного с ростом белка, связанного с ростом белка α, связанного с ростом белка β, связанного с ростом белка γ, связывающего гепарин эпидермального фактора роста, фактора роста гепатоцитов, рецептора фактора роста гепатоцитов, фактора роста, полученного из гепатомы, инсулиноподобного фактора роста I, рецептора инсулиноподобного фактора роста, инсулиноподобного фактора роста II, белка, связывающего инсулиноподобный фактор роста, фактора роста кератиноцитов, ингибирующего лейкемию фактора, рецептора α ингибирующего лейкемию фактора, фактора роста нервов, рецептора фактора роста нервов, нейропоэтина, нейротрофина-3, нейротрофина-4, онкостатина М ^δΜ), плацентарного фактора роста, плацентарного фактора роста 2, тромбоцитарного фактора роста эндотелиальных клеток, тромбоцитарного фактора роста, цепи А тромбоцитарного фактора роста, тромбоцитарного фактора роста АА, тромбоцитарного фактора роста АВ, цепи В тромбоцитарного фактора роста, тромбоцитарного фактора роста ВВ, рецептора α тромбоцитарного фактора роста, рецептора β тромбоцитарного фактора роста, стимулирующего фактора роста предшественников В-клеток, фактора стволовых клеток (ФСК), рецептора фактора стволовых клеток, ФНО, ФНО0, ФНО1, ФНО2, трансформирующего фактора роста α, трансформирующего фактора роста β, трансформирующего фактора роста β1, трансформирующего фактора роста β1.2, трансформирующего фактора роста β2, трансформирующего фактора роста β3, трансформирующего фактора роста β5, латентного трансформирующего фактора роста β1, белка I, связывающего трансформирующий фактор роста β, белка II, связывающего трансформирующий фактор роста β, белка III, связывающего трансформирующий фактор роста β, тимусного стромального лимфопоэтина (ТСЛП), рецептора I типа фактора некроза опухолей, рецептора II типа фактора некроза опухолей, рецептора активатора плазмогена урокиназного типа, активирующего белка фосфолипазы (ΡυΡ), инсулина, лектина рицина, пролактина, хорионического гонадотропина, фолликулостимулирующего гормона, тиреостимулирующего гормона, тканевого активатора плазминогена, ГдС, ГдЕ, ΓβΜ, и ГдЭ, α-галактозидазы, β-галактозидазы, ДНКазы, фетуина, лютеинизирующего гормона, эстрогена, инсулина, альбумина, липопротеинов, фетопротеина, трансферрина, тромбопоэтина, урокиназы, интегрина, тромбина, лептина, Хумиры (адалимумаба), Пролиа (деносумаба), Энбрела (этанерсепта) и белка из табл. 1 или их биологически активного фрагмента.
  10. 10. Способ по п.9, отличающийся тем, что раствор, содержащий исходную концентрацию терапевтического белка между 0,3 и 3,0 мг/мл, доводят до значения рН между 5,0 и 8,0 перед осуществлением контакта с активированной ПСК.
  11. 11. Способ по п.9, отличающийся тем, что терапевтический белок приводят в контакт с активированной ПСК, взятой в избыточной концентрации, при этом избыточная концентрация находится в диапазоне между 1-молярным и 300-молярным избыточным количеством.
  12. 12. Способ по п.9, отличающийся тем, что м-толуидин добавляют в количестве, обеспечивающем конечную концентрацию между 1,0 и 50 мМ м-толуидина, в условиях, включающих период времени между 0,1 и 30 мин, температуру между 2 и 37°С, присутствие или отсутствие света и наличие или отсутст- 117 028186 вие перемешивания.
  13. 13. Способ по п.9, отличающийся тем, что окисляющий агент добавляют в количестве, обеспечивающем конечную концентрацию между 50 и 1000 мкМ, в условиях, включающих период времени между 0,1 и 120 мин, температуру между 2 и 37°С, присутствие или отсутствие света и наличие или отсутствие перемешивания.
  14. 14. Способ по п.9, отличающийся тем, что конъюгацию ПСК с окисленным углеводным компонентом терапевтического белка останавливают добавлением останавливающего агента, выбранного из группы, состоящей из Ь-цистеина, метионина, глутатиона, глицерина, метабисульфита натрия (Ма^2О5), триптофана, тирозина, гистидина или его производных, крезола, имидазола и их комбинаций; причем останавливающий агент добавляют в количестве, обеспечивающем получение конечной концентрации между 1 и 100 мМ, в условиях, включающих период времени между 5 и 120 мин, температуру между 2 и 37°С, присутствие или отсутствие света и наличие или отсутствие перемешивания.
  15. 15. Способ по п.9, включающий:
    a) первую стадию, включающую доведение значения рН раствора, содержащего терапевтический белок, до значения рН между 5,0 и 8,0, при этом концентрация терапевтического белка находится в диапазоне между 0,3 и 3,0 мг/мл;
    b) вторую стадию, включающую окисление одного или более углеводов на терапевтическом белке, при этом окисляющий агент добавляют к раствору на первой стадии с обеспечением конечной концентрации между 50 и 1000 мкМ, в условиях, включающих период времени между 0,1 и 120 мин, температуру между 2 и 37°С, присутствие или отсутствие света и наличие или отсутствие перемешивания;
    c) третью стадию, включающую осуществление контакта терапевтического белка с активированной ПСК, взятой в избыточной концентрации, при этом избыточная концентрация находится в диапазоне между 1-молярным избытком и 300-молярным избытком, в условиях, включающих период времени между 0,5 и 24 ч, температуру между 2 и 37°С, присутствие и отсутствие света и наличие или отсутствие перемешивания;
    б) четвертую стадию, включающую добавление м-толуидина к раствору с третьей стадии, при этом м-толуидин добавляют с обеспечением конечной концентрации между 1 и 50 мМ в условиях, включающих период времени между 0,1 и 30 мин, температуру между 2 и 37°С; присутствие или отсутствие света и наличие или отсутствие перемешивания;
    е) пятую стадию, на которой терапевтический белок инкубируют с активированной ПСК и мтолуидином в условиях, которые допускают конъюгацию активированной ПСК с одним или более окисленным углеводом на терапевтическом белке, где указанные условия включают период времени между 0,5 и 24 ч, температуру между 2 и 37°С, присутствие и отсутствие света и наличие или отсутствие перемешивания; и
    Г) шестую стадию, на которой конъюгацию ПСК с одним или более окисленным углеводом на терапевтическом белке на пятой стадии останавливают добавлением останавливающего агента, выбранного из группы, состоящей из Ь-цистеина, метионина, глутатиона, глицерина, Ыа^2О5 (метабисульфита натрия), триптофана, тирозина, гистидина или его производных, крезола, имидазола и их комбинаций; причем останавливающий агент добавляют с обеспечением конечной концентрации между 1 и 100 мМ, в условиях, включающих период времени между 5 и 120 мин, температуру между 2 и 37°С, присутствие или отсутствие света и наличие или отсутствие перемешивания.
  16. 16. Способ по п.9, включающий:
    a) первую стадию, включающую доведение значения рН раствора, содержащего терапевтический белок, до значения рН, которое составляет 6,0, где исходная концентрация терапевтического белка составляет 1 мг/мл;
    b) вторую стадию, включающую окисление одного или более углеводов на терапевтическом белке, при этом окисляющий агент добавляют к раствору на первой стадии с обеспечением конечной концентрации 400 мкМ, в условиях, включающих период времени 10 мин, температуру 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания;
    c) третью стадию, включающую осуществление контакта терапевтического белка с активированной ПСК, взятой в избыточной концентрации, при этом избыточная концентрация составляет 50-молярный избыток, в условиях, включающих период времени 15 мин, температуру 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания;
    б) четвертую стадию, включающую добавление м-толуидина к раствору с третьей стадии, при этом м-толуидин добавляют с обеспечением конечной концентрации 10 мМ, в условиях, включающих период времени 15 мин, температуру 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания;
    е) пятую стадию, на которой терапевтический белок инкубируют с активированной ПСК и мтолуидином в условиях, которые допускают конъюгацию активированной ПСК с одним или более окисленными углеводами на терапевтическом белке, где указанные условия включают период времени 2 ч, температуру 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания;
    Г) шестую стадию, на которой конъюгацию ПСК с одним или более окисленными углеводами на те- 118 028186 рапевтическом белке на пятой стадии останавливают добавлением Ь-цистеина, причем Ь-цистеин добавляют с получением конечной концентрации 10 мМ в условиях, включающих период времени 60 мин, температуру 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания.
  17. 17. Способ по п.9, отличающийся тем, что ПСК содержит 10-300 звеньев мономера сиаловой кислоты.
  18. 18. Способ по п.15, отличающийся тем, что терапевтический белок является РбХ.
  19. 19. Способ по п.15, отличающийся тем, что терапевтический белок является РУбба.
  20. 20. Способ по п.15, отличающийся тем, что терапевтический белок является РУббб.
  21. 21. Способ по п.15, отличающийся тем, что окисляющий агент является перйодатом натрия ЩаЮ4).
  22. 22. Способ по п.9, отличающийся тем, что ПСК включает активированный аминооксилинкер, выбранный из группы, состоящей из:
    а) 3-оксапентан-1,5-диоксиаминного линкера формулы
    Ъ) 3,6,9-триоксаундекан-1,11-диоксиаминного линкера формулы
    с) 3,6,9,12,15-пентаоксагептадекан-1,17-диоксиаминного линкера формулы в котором ПСК окисляют путем инкубации с окисляющим агентом для образования концевой альдегидной группы на невосстанавливающем конце ПСК.
  23. 23. Способ по п.22, отличающийся тем, что аминооксилинкер является 3-оксапентан-1,5диоксиамином.
  24. 24. Способ по п.15, отличающийся тем, что нуклеофильный катализатор используют в концентрации между 1 и 50 мМ.
  25. 25. Способ по п.24, отличающийся тем, что м-толуидин присутствует в реакции конъюгации в концентрации 10 мМ.
  26. 26. Способ по п.15, дополнительно включающий стадию очистки конъюгированного терапевтического белка.
  27. 27. Способ по п.26, отличающийся тем, что конъюгированный терапевтический белок очищают способом, выбранным из группы, состоящей из хроматографии, фильтрации и осаждения.
  28. 28. Способ по п.9, отличающийся тем, что конъюгированный терапевтический белок очищают посредством хроматографии, антихаотропную соль используют на стадии загрузки и на стадии промывки; причем способ включает одну и более стадий промывки, на которых направление потока задают в восходящем направлении, скорость потока при этом находится в диапазоне между 0,2 и 6,7 см/мин, и одну и более стадий элюирования, на которых направление потока выбрано нисходящим, скорость потока при этом находится в диапазоне между 0,2 и 6,7 см/мин; причем способ дополнительно включает концентрирование конъюгированного терапевтического белка путем ультра/диафильтрации (УФ/ДФ).
  29. 29. Модифицированный терапевтический белок, полученный способом по п.15.
  30. 30. Способ по п.9, где ПСК-аминооксиреагент с аминооксигруппой получают способом, включающим:
    a) инкубирование раствора, содержащего окисленную ПСК с аминооксилинкером, содержащим активную аминооксигруппу, в условиях, которые допускают образование стабильной оксимной связи между окисленной ПСК и активированным аминооксилинкером, указанные условия включают период времени 1 ч, температуру 4°С, отсутствие света и наличие перемешивания; благодаря чему образуется ПСК, содержащая активную аминооксигруппу; и
    b) очистку ПСК, содержащей активную аминооксигруппу, методом анионообменной хроматографии при температуре 4°С;
    причем указанный активированный аминооксилинкер представляет собой 3-оксапентан-1,5диоксиаминный линкер формулы
    Н2Г+ ,О ΝΗ-, 2 —' О 2 в результате чего образуется оксимная связь между ПСК и аминооксилинкером.
  31. 31. Способ по п.9, где ПСК-аминоокси реагент с аминооксигруппой получают способом, включающим:
    а) инкубирование раствора, содержащего неокисленную ПСК с аминооксилинкером, содержащим активную аминооксигруппу, в условиях, которые допускают образование стабильной оксимной связи между неокисленной ПСК и активированным аминооксилинкером, причем указанные условия включают инкубирование при 22°С в течение 2 ч в отсутствие света и при перемешивании; причем способ дополнительно включает стадию повышения температуры раствора до температуры между 32 и 37°С и инкубирования в течение дополнительных 12-24 ч; благодаря чему образуется ПСК, содержащая активную
    - 119 028186 аминооксигруппу; и
    Ь) очистку ПСК, содержащей активную аминооксигруппу, с помощью диализа при температуре 22°С;
    при этом указанный активированный аминооксилинкер представляет собой 3-оксапентан-1,5диоксиаминный линкер формулы в результате чего образуется оксимная связь между неокисленной ПСК и аминооксилинкером.
EA201492115A 2012-05-16 2013-05-16 Способ конъюгации водорастворимого полимера с терапевтическим белком (варианты) и полученный модифицированный белок EA028186B9 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261647814P 2012-05-16 2012-05-16
US13/488,043 US8809501B2 (en) 2009-07-27 2012-06-04 Nucleophilic catalysts for oxime linkage
PCT/US2013/041280 WO2013173543A1 (en) 2012-05-16 2013-05-16 Nucleophilic catalysts for oxime linkage

Publications (3)

Publication Number Publication Date
EA201492115A1 EA201492115A1 (ru) 2015-05-29
EA028186B1 true EA028186B1 (ru) 2017-10-31
EA028186B9 EA028186B9 (ru) 2018-05-31

Family

ID=48579473

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201790935A EA035506B1 (ru) 2012-05-16 2013-05-16 Способ конъюгации (варианты), модифицированный терапевтический белок и способ получения водорастворимого полимера (варианты)
EA201492115A EA028186B9 (ru) 2012-05-16 2013-05-16 Способ конъюгации водорастворимого полимера с терапевтическим белком (варианты) и полученный модифицированный белок

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201790935A EA035506B1 (ru) 2012-05-16 2013-05-16 Способ конъюгации (варианты), модифицированный терапевтический белок и способ получения водорастворимого полимера (варианты)

Country Status (13)

Country Link
EP (3) EP4019049A1 (ru)
JP (5) JP6195611B2 (ru)
KR (4) KR102287040B1 (ru)
CN (2) CN109620963B (ru)
AU (1) AU2013204754C1 (ru)
BR (1) BR112014028636B1 (ru)
CA (1) CA2873756C (ru)
EA (2) EA035506B1 (ru)
HK (1) HK1209024A1 (ru)
MX (1) MX360594B (ru)
NZ (4) NZ701945A (ru)
SG (3) SG11201407597XA (ru)
WO (2) WO2013173557A1 (ru)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2013204754C1 (en) * 2012-05-16 2018-10-11 Takeda Pharmaceutical Company Limited Nucleophilic Catalysts for Oxime Linkage
CN117860868A (zh) * 2016-11-14 2024-04-12 诺华股份有限公司 用于治疗软骨损伤和关节炎的方法和组合物
JP7002036B2 (ja) * 2016-11-17 2022-01-20 パナソニックＩｐマネジメント株式会社 膜電極接合体および固体酸化物形燃料電池
WO2018112669A1 (en) * 2016-12-23 2018-06-28 Realist Pharma, Inc. Ganglioside carbohydrate structures and uses thereof
CN108503901B (zh) * 2018-04-17 2020-07-07 哈尔滨工业大学 一种抗菌普鲁兰多糖/壳聚糖复合食品包装膜的制备方法
AU2020210630A1 (en) 2019-01-23 2021-08-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Treatment of ophthalmic conditions with angiopoietin-like 7 (ANGPTL7) inhibitors
US11845989B2 (en) 2019-01-23 2023-12-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Treatment of ophthalmic conditions with angiopoietin-like 7 (ANGPTL7) inhibitors
US11865134B2 (en) 2021-02-26 2024-01-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Treatment of inflammation with glucocorticoids and angiopoietin-like 7 (ANGPTL7) inhibitors

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994028024A1 (en) * 1993-06-01 1994-12-08 Enzon, Inc. Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity
WO2005014024A2 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of a polymer and a protein linked by an oxime linking group
WO2008025856A2 (en) * 2006-09-01 2008-03-06 Novo Nordisk Health Care Ag Modified glycoproteins
WO2010131015A1 (en) * 2009-05-15 2010-11-18 Almac Sciences (Scotland) Limited Method of labelling interferons with peg
WO2011012850A2 (en) * 2009-07-27 2011-02-03 Lipoxen Technologies Limited Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
WO2011017055A2 (en) * 2009-07-27 2011-02-10 Baxter International Inc. Blood coagulation protein conjugates
WO2012016131A1 (en) * 2010-07-30 2012-02-02 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS54113492A (en) 1978-02-24 1979-09-05 Sanyo Chem Ind Ltd Preparation of glucoprotein derivative
US4356170A (en) 1981-05-27 1982-10-26 Canadian Patents & Development Ltd. Immunogenic polysaccharide-protein conjugates
US4757006A (en) 1983-10-28 1988-07-12 Genetics Institute, Inc. Human factor VIII:C gene and recombinant methods for production
US5250421A (en) 1986-01-03 1993-10-05 Genetics Institute, Inc. Method for producing factor VIII:C-type proteins
US5198349A (en) 1986-01-03 1993-03-30 Genetics Institute, Inc. Method for producing factor VIII:C and analogs
JPH0387173A (ja) 1987-09-10 1991-04-11 Teijin Ltd ヒト活性化天然型ファクター８ｃの製造方法及びそれに用いる形質転換体
US5846951A (en) 1991-06-06 1998-12-08 The School Of Pharmacy, University Of London Pharmaceutical compositions
DE69329795T2 (de) 1992-10-02 2001-07-05 Genetics Inst Zusammensetzung, welche den koagulationsfaktor viii beinhaltet; verfahren zu deren herstellung und die benutzung eines oberflächenaktiven stoffes als stabilisator
NZ250375A (en) * 1992-12-09 1995-07-26 Ortho Pharma Corp Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives
US5621039A (en) 1993-06-08 1997-04-15 Hallahan; Terrence W. Factor IX- polymeric conjugates
WO1996040662A2 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Cellpro, Incorporated Aminooxy-containing linker compounds and their application in conjugates
US6531298B2 (en) 1997-07-21 2003-03-11 The University Of North Carolina At Chapel Hill Factor IX antihemophilic factor with increased clotting activity
US7074878B1 (en) 1999-12-10 2006-07-11 Harris J Milton Hydrolytically degradable polymers and hydrogels made therefrom
US6413507B1 (en) 1999-12-23 2002-07-02 Shearwater Corporation Hydrolytically degradable carbamate derivatives of poly (ethylene glycol)
WO2001087922A2 (en) 2000-05-16 2001-11-22 Lipoxen Technologies Limited Derivatisation of proteins in aqueous solution
US7265084B2 (en) 2001-10-10 2007-09-04 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US7026440B2 (en) 2001-11-07 2006-04-11 Nektar Therapeutics Al, Corporation Branched polymers and their conjugates
WO2004024761A1 (en) 2002-09-11 2004-03-25 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Hasylated polypeptides, especially hasylated erythropoietin
EP1681303B1 (en) 2002-09-11 2013-09-04 Fresenius Kabi Deutschland GmbH HASylated polypeptides, especially HASylated erythropoietin
CA2521784C (en) 2003-04-08 2012-03-27 Yeda Research And Development Co. Ltd. Reversible pegylated drugs
JP4674702B2 (ja) 2003-04-09 2011-04-20 バイオジェネリクス エージー グリコペギレ−ション法およびその方法により生成されたタンパク質／ペプチド
RU2333223C2 (ru) 2003-08-12 2008-09-10 Лайпоксен Текнолоджиз Лимитед Альдегидные производные сиаловой кислоты, способы их получения, конъюгаты альдегидных производных сиаловой кислоты и фармацевтическая композиция на их основе
US8633157B2 (en) 2003-11-24 2014-01-21 Novo Nordisk A/S Glycopegylated erythropoietin
US20060040856A1 (en) 2003-12-03 2006-02-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor IX
WO2005055946A2 (en) 2003-12-03 2005-06-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
EP3184551A1 (en) 2004-08-12 2017-06-28 Lipoxen Technologies Limited Sialic acid derivatives
EP1799249A2 (en) 2004-09-10 2007-06-27 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated interferon alpha
JP5022231B2 (ja) 2004-12-27 2012-09-12 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド ポリマー−フォンビルブラント因子結合体
EP1896082B1 (en) 2005-06-16 2012-12-26 Nektar Therapeutics Conjugates having a degradable linkage and polymeric reagents useful in preparing such conjugates
US7645860B2 (en) 2006-03-31 2010-01-12 Baxter Healthcare S.A. Factor VIII polymer conjugates
US8637007B2 (en) 2006-12-15 2014-01-28 Baxter International Inc. Factor VIIa-polysialic acid conjugate having prolonged in vivo half-life
KR101560541B1 (ko) * 2012-04-13 2015-10-19 아우토리브 디벨롭먼트 아베 에어백 모듈과 스티어링 휠의 조립체
AU2013204754C1 (en) * 2012-05-16 2018-10-11 Takeda Pharmaceutical Company Limited Nucleophilic Catalysts for Oxime Linkage

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994028024A1 (en) * 1993-06-01 1994-12-08 Enzon, Inc. Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity
WO2005014024A2 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of a polymer and a protein linked by an oxime linking group
WO2008025856A2 (en) * 2006-09-01 2008-03-06 Novo Nordisk Health Care Ag Modified glycoproteins
WO2010131015A1 (en) * 2009-05-15 2010-11-18 Almac Sciences (Scotland) Limited Method of labelling interferons with peg
WO2011012850A2 (en) * 2009-07-27 2011-02-03 Lipoxen Technologies Limited Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
WO2011017055A2 (en) * 2009-07-27 2011-02-10 Baxter International Inc. Blood coagulation protein conjugates
WO2012016131A1 (en) * 2010-07-30 2012-02-02 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANOUK DIRKSEN, DAWSON PHILIP E.: "Rapid Oxime and Hydrazone Ligations with Aromatic Aldehydes for Biomolecular Labeling", BIOCONJUGATE CHEMISTRY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 19, no. 12, 17 December 2008 (2008-12-17), pages 2543 - 2548, XP055011724, ISSN: 10431802, DOI: 10.1021/bc800310p *
DIRKSEN A, HACKENG T M, DAWSON P E: "Nucleophilic catalysis of oxime ligation.", ANGEWANDTE CHEMIE INTERNATIONAL EDITION, VERLAG CHEMIE, vol. 45, no. 45, 20 November 2006 (2006-11-20), pages 7581 - 7584, XP002605858, ISSN: 1433-7851, DOI: 10.1002/ANIE.200602877 *
EUGENE H. CORDES, WILLIAM P. JENCKS: "Nucleophilic Catalysis of Semicarbazone Formation by Anilines", JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, US, vol. 84, no. 5, 1 March 1962 (1962-03-01), US, pages 826 - 831, XP008145178, ISSN: 0002-7863, DOI: 10.1021/ja00864a030 *
MIKKEL B. THYGESEN, MUNCH HENRIK, SAUER J�RGEN, CLÓ EMILIANO, J�RGENSEN MALENE R., HINDSGAUL OLE, JENSEN KNUD J.: "Nucleophilic Catalysis of Carbohydrate Oxime Formation by Anilines", THE JOURNAL OF ORGANIC CHEMISTRY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY �ETC.|, vol. 75, no. 5, 5 March 2010 (2010-03-05), pages 1752 - 1755, XP055011729, ISSN: 00223263, DOI: 10.1021/jo902425v *

Also Published As

Publication number Publication date
KR102287040B1 (ko) 2021-08-09
JP2019089810A (ja) 2019-06-13
EP2849795B1 (en) 2022-04-06
JP7014844B2 (ja) 2022-02-01
EA028186B9 (ru) 2018-05-31
EA035506B1 (ru) 2020-06-25
JP7304402B2 (ja) 2023-07-06
NZ738846A (en) 2019-05-31
JP2017145260A (ja) 2017-08-24
EA201492115A1 (ru) 2015-05-29
SG11201407597XA (en) 2014-12-30
KR20210041629A (ko) 2021-04-15
EP4019049A1 (en) 2022-06-29
KR102110622B1 (ko) 2020-05-14
EP2849795A1 (en) 2015-03-25
CN104487095B (zh) 2018-12-07
NZ701945A (en) 2016-10-28
KR20150008192A (ko) 2015-01-21
NZ724828A (en) 2018-02-23
WO2013173557A1 (en) 2013-11-21
JP6195611B2 (ja) 2017-09-13
CN104487095A (zh) 2015-04-01
CN109620963A (zh) 2019-04-16
WO2013173543A1 (en) 2013-11-21
CA2873756A1 (en) 2013-11-21
KR20210099187A (ko) 2021-08-11
MX2014013919A (es) 2015-06-05
KR102326360B1 (ko) 2021-11-15
JP2015520163A (ja) 2015-07-16
JP6711935B2 (ja) 2020-06-17
AU2013204754C1 (en) 2018-10-11
CA2873756C (en) 2022-08-16
KR102237306B1 (ko) 2021-04-08
CN109620963B (zh) 2022-10-28
SG10201911328QA (en) 2020-01-30
JP6560712B2 (ja) 2019-08-14
JP2020111599A (ja) 2020-07-27
BR112014028636A2 (ru) 2017-08-15
EA201790935A1 (ru) 2017-12-29
NZ738844A (en) 2018-12-21
KR20200053636A (ko) 2020-05-18
AU2013204754B2 (en) 2015-11-05
JP2022034075A (ja) 2022-03-02
MX360594B (es) 2018-11-09
EP2849794A1 (en) 2015-03-25
SG10201701780RA (en) 2017-04-27
HK1209024A1 (en) 2016-03-24
BR112014028636B1 (pt) 2022-09-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA028186B1 (ru) Способ конъюгации водорастворимого полимера с терапевтическим белком (варианты) и полученный модифицированный белок
US20210163527A1 (en) Nucleophilic catalysts for oxime linkage
US11564992B2 (en) Nucleophilic catalysts for oxime linkage
AU2011282571C1 (en) Nucleophilic catalysts for oxime linkage
EA032056B1 (ru) Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты, способы получения конъюгата терапевтического белка и производного жирной кислоты (варианты)
US20130310546A1 (en) Nucleophilic catalysts for oxime linkage and use of nmr analyses of the same
AU2017276255B2 (en) Nucleophilic Catalysts for Oxime Linkage
EA044273B1 (ru) Способ конъюгирования водорастворимого полимера с терапевтическим белком

Legal Events

Date Code Title Description
TH4A Publication of the corrected specification to eurasian patent
PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KG TJ TM