JP5703020B2 - タンパク質を選択的に修飾するための組成物と方法 - Google Patents

タンパク質を選択的に修飾するための組成物と方法 Download PDF

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Description

本発明は一般にタンパク質に性質改変基を導入する新規方法に関する。特に、本発明はリジン残基の誘導体化、並びに改善された薬理特性を有する成長ホルモンの新規コンジュゲート、及びその調製及び治療における使用のための方法に関する。
タンパク質の性質を変化させるためにタンパク質に基をコンジュゲートすることによってタンパク質の性質及び特性を修飾することはよく知られている。実際、２０年以上前に、米国特許第４１７９３３７号は、ポリエチレンもしくはポリプロピレングリコールにコンジュゲートさせたタンパク質を教示している。一般に、かかるコンジュゲーションには、コンジュゲート基中の他の官能基と反応するある官能基がタンパク質中に必要となる。典型的には、アミノ基、例えばＮ末端アミノ基又はリジン中のεアミノ基は適切なアシル化試薬と併用されて使用されている。コンジュゲーション反応を制御すること、すなわちどこにコンジュゲートする化合物を結合させるかを制御し、幾つのコンジュゲート基を結合させるかを制御することがしばしば望まれたり要求さえされる。これはしばしば特異性又は選択性と呼ばれる。
しかしながら、選択的化学反応のレパートリーは非常に限られている。ある代替法は、組換え法によって、独特の反応性を有する特別の非天然アミノ酸を導入し、ついで更なる誘導体化にこの反応性を利用することである。ある代替法は、修飾されるタンパク質の構造的及び機能的特徴を認識する酵素を使用することである。この例は、成長ホルモン中のＧｌｎ残基を選択的に修飾するために微生物トランスグルタミナーゼ（ｍＴＧａｓｅ）を使用することである。すなわち、トランスグルタミナーゼはタンパク質を交差結合させるために食品産業と特に酪農産業において使用されている。他の文献は、生理学的に活性なタンパク質の性質を変えるためのトランスグルタミナーゼの使用を開示している。例えば、トランスグルタミナーゼの存在下で、少なくとも一のＧｌｎとアミン官能化ＰＥＧないしは類似のリガンドを含んでなるタンパク質間の直接反応を開示する欧州特許出願公開第９５０６６５号、欧州特許出願公開第７８５２７６号及びＳａｔｏ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．，５４，４８７−５０４（２００２）を参照のこと；また、トランスグルタミナーゼによる脂肪酸とのβ−ラクトグロブリンの直接的なコンジュゲーションを開示するＢｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔｔ．２３，１３６７−１３７２（２００１）を参照のこと。トランスグルタミナーゼによって触媒される反応は、図１に示されるように、グルタミン残基の第１級アミドが反応混合物中に存在する第１級アミンから第２級アミドに転換されるアミド基転移反応である。
しかしながら、タンパク質の選択的誘導体化は非常に難しい仕事である；アシル化によるタンパク質中のリジンの誘導体化は更により本来的な非選択的プロセスである。よって、現在のところ、リジン残基の選択的誘導体化に対する効率的な方法が存在しない。従って、興味あるタンパク質又はポリペプチド中においてリジンのようなアミノ酸残基を選択的に誘導体化する方法に対して早急の必要性がある。
ＴＧａｓｅによって触媒された一般反応を示す。 「逆ＴＧａｓｅ」としても知られる本発明の一般反応を示す。 実施例１に記載されたヒト成長ホルモンの修飾を示す。 ＴＧａｓｅ媒介アミノ基転移の機構を詳細に示す。
本発明は、一般的な化学的方法を使用しながら、補助タンパク質を介してより選択的な形で標的タンパク質に性質改変基を導入する方法を提供することによって、これらの必要性に対処する。一般に、該方法は次のように記載することができる：第一に、補助タンパク質と性質改変基の間の活性化された複合体を形成する；第二に、改変基を、一般的な方法によって達成できるよりも更により選択的な形で活性化された複合体から修飾されるタンパク質に移し、それによって「修飾されたタンパク質」を得る。しかして、ここで使用される「修飾されたタンパク質」は本発明の方法によって選択的に修飾されたタンパク質又はポリペプチドを意味する。
すなわち、本発明は、性質改変基を持つ少なくとも２つのリジンを含むタンパク質のトランスグルタミナーゼ触媒反応を含む方法に関する。性質改変基は式Ｒ１−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｒ２のグルタミン−グリシン含有タンパク質である。すなわち、このプロセスにおいて、活性化されたアシル複合体は、性質改変基を結合させるために性質改変基中のグルタミン残基をＴＧａｓｅと反応させることによって形成される。好ましい実施態様では、性質改変基は、図２に示されるような標的タンパク質中においてアシル化によってリジン残基に移される。一実施態様では、Ｒ１及びＲ２は所望される置換基であり、その少なくとも一つは更なる修飾に対して適した化学基を含む。よって、本発明は、標的タンパク質内でリジン残基を選択的に修飾するために「逆」ＴＧａｓｅ反応を含む。
ここで使用される場合、「ポリペプチド」なる用語は、天然に産生されるにせよ合成によって産生されるにせよ、ペプチド結合により結合したアミノ酸残基のポリマーを意味する。約１０未満のアミノ酸残基のポリペプチドは一般に「ペプチド」と呼ばれる。「ペプチド」なる用語は、ペプチド結合によって結合された二又はそれ以上のアミノ酸の配列を示すものであり、該アミノ酸は天然でも非天然でもよい。該用語は、ポリペプチド及びタンパク質なる用語を包含し、これは、共有的相互作用、例えばシステイン架橋、又は非共有的相互作用によって一緒に保持される二又はそれ以上のペプチドからなりうる。「タンパク質」は一又は複数のポリペプチド鎖を含む巨大分子である。タンパク質はまた糖鎖（炭水化物）基のような非ペプチド性成分を含みうる。糖鎖及び他の非ペプチド性置換基は、そこでタンパク質が産生される細胞によってタンパク質に付加され得、細胞の型によって変わる。タンパク質はここではそのアミノ酸骨格構造によって定義される；糖鎖基のような置換基は一般には特定されないが、それでも存在している場合がある。非宿主ＤＮＡ分子によってコードされるタンパク質又はポリペプチドは「異種」タンパク質又はポリペプチドである。「単離されたポリペプチド」は、糖鎖、脂質、又は天然のポリペプチドに付随する他のタンパク質様不純物のような汚染細胞性成分を本質的に含まないポリペプチドである。典型的には、単離されたポリペプチドの調製物は、高度に精製された形態で、つまり少なくとも約８０％の純度、少なくとも約９０％の純度、少なくとも約９５％の純度、約９５％より多い純度、例えば９６％、９７％、又は９８％又はそれ以上の純度、あるいは９９％の純度よりも高い純度で、ポリペプチドを含む。特定のタンパク質兆尾生物が単離されたポリペプチドを含んでいることを示すための一方法は、タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動と該ゲルのクマシーブリリアントブルー染色後の単一バンドの出現による。しかしながら、「単離された」なる用語は、他の物理的形態、例えば二量体あるいはグリコシル化又は誘導体化形態で同じポリペプチドが存在することを排除しない。「アミノ末端」及び「カルボキシル末端」なる用語はここではポリペプチド内の位置を示すために使用される。文脈から許される場合、これらの用語はポリペプチドの特定の配列又は部分を参照して近接又は相対位置を示すために使用される。例えば、ポリペプチド内の参照配列にカルボキシル末端が位置するある配列は参照配列のカルボキシル末端に近接して位置しているが、完全なポリペプチドのカルボキシル末端に必ずしもあるものではない。
本発明の補助タンパク質
本発明の一態様は、補助タンパク質を使用して標的タンパク質を選択的に修飾する方法に関する。好ましい実施態様では、補助タンパク質はトランスグルタミナーゼのような酵素である。トランスグルタミナーゼ（ここでは「ＴＧａｓｅ」とも交換可能に称される）はまたタンパク質−グルタミン−γ−グルタミルトランスフェラーゼとしても知られ、図１に示されるように、タンパク質又はタンパク質鎖中のグルタミン（Ｇｌｎ）残基のγ−カルボキシアミド基とリジン（Ｌｙｓ）残基又は様々なアルキルアミンのε−アミノ基の間のアシル転移反応を触媒する。ＴＧａｓｅは、様々な分子形態で、様々な動物組織、血液細胞、血漿等中に広く見出される。この酵素は、ε−（γ−グルタミル）リジン−イソタンパク質結合を介する架橋反応を介する架橋反応、及び血液凝固の最後の過程でのフィブリン分子の架橋を触媒し、また表皮細胞の角質化、精液の凝固、創傷組織の治癒等に関係していることが見出されている。トランスグルタミナーゼはＧｌｎ残基に対して非常に高い基質特異性を有しているので、タンパク質中のあるＧｌｎ残基だけがアルキルアミンで修飾されうる可能性がある。例えば、末端糖単位を有するアルキルアミンが、モルモットの肝臓由来のトランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を使用して、βカゼインのそのあるＧｌｎ残基に導入された（Ｙａｎ，Ｓ．Ｃ．Ｂ．等，（１９８４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２３，３７５９−３７６５）。更に、低分子量スペルミン誘導体が、血漿中に見出されるトランスグルタミナーゼである血液凝固第ＸＩＩＩ因子（第ＸＩＩＩ因子）を使用して、アポリポタンパク質ＢのそのＧｌｎ残基中に導入された（Ｃｏｃｕｚｚｉ，Ｅ．等，（１９９０），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２６５，７０７−７１３）。
本発明の方法に使用されるトランスグルタミナーゼは、特に限定のない様々な起源、例えば様々な動物組織、血漿成分、及び微生物から得ることができる。有用なトランスグルタミナーゼの例には、微生物トランスグルタミナーゼ、例えばストレプトマイセス・モバレンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ）、ストレプトマイセス・シンナモネウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｍ）及びストレプトマイセス・グリセオカルネウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｃａｒｎｅｕｍ）由来のもの（全て出典明示によりここに援用される米国特許第５１５６９５６号に開示）、及びストレプトマイセス・ラベンデユラエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ）（出典明示によりここに援用される米国特許第５２５２４６９号に開示）及びストレプトマイセス・ラダカヌム（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌａｄａｋａｎｕｍ）（出典明示によりここに援用されるＪＰ２００３１９９５６９）が含まれる。以前の属であるストレプトバーチシリウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）のメンバーは、現在はストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属［Ｋａｅｍｐｆｅｒ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３７，１８３１−１８９２，１９９１］に含まれることに注意すべきである。他の有用な微生物トランスグルタミナーゼは、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（出典明示によりここに援用される米国特許第５７３１１８３号に開示されている）から単離されたもの、及び様々な変形菌（Ｍｙｘｏｍｙｃｅｔｅｓ）から単離されたものである。有用な微生物トランスグルタミナーゼの他の例は、双方とも出典明示によりここに援用される国際公開第９６／０６９３１号（例えば、バチルス・ライディクス（Ｂａｃｉｌｕｓ ｌｙｄｉｃｕｓ由来のトランスグルタミナーゼ）及び国際公開第９６／２２３６６号に開示されるものである。有用な非微生物トランスグルタミナーゼには、モルモット肝臓トランスグルタミナーゼ、及びカレイ類Ｐａｇｒｕｓ ｍａｊｏｒ（マダイ）（出典明示によりここに援用される欧州特許第０５５５６４９号に開示される）及び日本のカキＣｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｇｉｇａｓ（エゾガキ）（出典明示によりここに援用される米国特許第５７３６３５６号に開示される）のような種々の海洋性資源由来のトランスグルタミナーゼが含まれる。
よって、好ましい実施態様では、本発明の方法で使用されるＴＧａｓｅは微生物トランスグルタミナーゼである。より好ましい実施態様では、ＴＧａｓｅはストレプトマイセス・モバレンス由来である。他の実施態様では、ＴＧａｓｅは天然のＴＧａｓｅと少なくとも８０％の配列相同性を有している変異体ＴＧａｓｅである。
性質改変基
本発明の性質改変基は、一般式：Ｒ１−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｒ２のグルタミン含有タンパク質を包含する。より好ましい実施態様では、性質改変基が式：
Figure 0005703020
を有している。
好ましい実施態様では、Ｒ１は、
Figure 0005703020
である。
他の実施態様では、Ｒ１がＣＢｚであり；Ｒ２が、Ｈ、プロパルギル又は４−アミノベンジルから選択され；ＹがＯＨ又は＝Ｏであり；ＸがＣＨ２ＯＨ又はＯＨである。
更に他の実施態様では、Ｒ１はＣＢｚであり；Ｒ２がＨであり；ＹがＯＨであり；ＸがＣＨ２ＯＨである。
また他の実施態様では、Ｒ１がＣＢｚであり；Ｒ２が４−アミノベンジルであり；Ｙが＝Ｏであり；ＸがＯＨである。
他の実施態様では、Ｒ１がＣＢｚであり；Ｒ２がプロパルギルであり；Ｙが＝Ｏであり；ＸがＯＨである。
よって、本発明の好ましい性質改変基（又は基質）は、
Figure 0005703020
からなる群から選択される。
発明の方法
本発明の標的タンパク質（つまり、興味のあるタンパク質）を修飾する必要性は幾らでもある理由から生じ得、これはまた本発明の方法に従って選択的に修飾されうる化合物の種類に反映される。
一般に、本発明の方法は、式Ｒ１−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｒ２のグルタミン及びグリシン含有ペプチドとの少なくとも二のリジンを含むタンパク質のトランスグルタミナーゼ触媒反応を含む。該方法は次の工程からなる：（ａ）式Ｒ１−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｒ２の化合物のペプチド合成による調製と当該分野で知られている精製；（ｂ）場合によっては有機溶媒、洗浄剤又は他の修飾因子を含んでいてもよい、水性バッファー中での少なくとも一のリジン、好ましくは一より多いリジンを含む標的タンパク質との過剰のこの化合物Ｒ１−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｒ２の混合；（ｃ）触媒量のトランスグルタミナーゼ、好ましくはストレプトマイセス・モバレンス由来の微生物トランスグルタミナーゼのこの混合物への添加（反応は所望の時間の間進行せしめられる）；（ｄ）場合によってはＴＧａｓｅ阻害剤を混合物に添加することができる；（ｅ）該混合物に、典型的には限外濾過又はダイアフィルトレーション及びクロマトグラフィー（イオン交換、サイズ排除、疎水性相互作用等）のような単位操作を含む精製プロセスを施す。このようにして、選択的に修飾されたタンパク質が得られる。該タンパク質は、クロマトグラフィー、電気泳動、ペプチドマッピング及び質量分析を含む標準的なタンパク質分析方法によって特徴付けされる。場合によっては、工程（ｂ）又は（ｃ）に続いて、修飾されたタンパク質を、Ｒ１又はＲ２の官能基によって更に修飾することができる。
すなわち、ＴＧａｓｅ媒介アミド基転移の機構の一部として、分子間チオエステルが、ＴＧａｓｅの活性部位のＣｙｓとＧｌｎ−基質間の反応によって形成される（図４参照）。「アミド基転移」なる用語は、グルタミンの側鎖中の窒素が他の化合物の窒素、特に他の窒素含有求核試薬の窒素と交換される反応を示すものである。この中間体は活性化Ｇｌｎ残基とみなすことができ、活性種はＴＧａｓｅ−チオエステルであり、これがアミン、例えばタンパク質リジン残基と反応する。反応の選択性は、１）Ｌｙｓ担持タンパク質基質と相互作用しながらのＴＧａｓｅ−チオエステルの剪断立体バルク、及び２）ＴＧａｓｅ−チオエステルとＬｙｓ−担持タンパク質基質間のより定まった非共有的相互作用の結果である。この直接の結果は、活性化アシル基を担持するタンパク質Ａｃｙｌ−Ｘ−タンパク質（ここで、Ｘはタンパク質−リジンアミンによる求核攻撃に対してアシル基を活性化させる原子又は基である）が本発明に含められることである。
よって、例えば治療用タンパク質の生物学的利用能を改変するために溶解度を増加（又は減少）させることのように、タンパク質の物理化学的性質を改変することが望ましい場合がある。他の実施態様では、例えばアルブミンのような血漿タンパク質に結合するか、又は腎臓を通しての排出を防止又は遅延させるためにタンパク質のサイズを増加させる化合物を血漿タンパク質に結合させることによってクリアランス速度を改変することが望ましい場合がある。コンジュゲーションはまた例えばインビボタンパク分解のような加水分解に対するタンパク質の感受性を改変し特に減少させうる。他の実施態様では、タンパク質の分析を容易にするために標識をコンジュゲートさせることが望ましい場合がある。かかる標識の例には、放射性同位元素、蛍光マーカー及び酵素基質が含まれる。また別の実施態様では、化合物はタンパク質の単離を容易にするためにタンパク質にコンジュゲートされる。例えば、特定のカラム材料に対して特異的な親和性を有する化合物をタンパク質にコンジュゲートさせうる。また例えばタンパク質の一又は複数の免疫原性エピトープを隠し、マスクし又は覆い隠すようにタンパク質をコンジュゲートさせることによって、タンパク質の免疫原性を改変することが望ましい場合がある。名詞としての「コンジュゲート」なる用語は、修飾されたペプチド、すなわち、上記ペプチドの性質を改変するためにそれと結合した部分を有するペプチドを示すことを意図するものである。動詞としては、その用語は、上記ペプチドの性質を改変するためにペプチドにある部分を結合させる方法を示すことを意図するものである。
一実施態様では、本発明は標的化合物又はタンパク質の薬理学的性質を改善する方法を提供する。改善は対応する未修飾タンパク質に対するものである。かかる薬理学的性質の例には、機能的インビボ半減期、免疫原性、腎臓濾過、プロテアーゼ保護及びアルブミン結合が含まれる。
「機能的インビボ半減期」なる用語は、その通常の意味、すなわち、タンパク質又は修飾されたタンパク質の生物学的活性の５０％が、体／標的器官中に存在している時間、又はタンパク質又は修飾されたタンパク質の活性がその最初の値の５０％である時間で、使用される。機能的インビボ半減期を決定する代わりに、「インビボ血漿半減期」、すなわち、除去される前に、修飾されたタンパク質の５０％が血漿又は血流中を循環している時間を測定してもよい。血漿半減期の測定は、しばしば機能的半減期を測定するよりも簡単で、血漿半減期の大きさは、通常、機能的インビボ半減期の大きさの良好な目安となる。血漿半減期の代替用語には、血清半減期、循環半減期（circulating half-life）、循環性半減期（circulatory half-life）、血清クリアランス、血漿クリアランス、及びクリアランス半減期が含まれる。
機能的インビボ半減期又は血漿半減期に関連して使用される「増加した」なる用語は、修飾されたタンパク質の関連半減期が、比較条件下で測定された未修飾（親）タンパク質のものに対して統計的に有意に増加したことを示すために使用される。例えば関連半減期は、少なくとも約２５％、例えば少なくとも約５０％、例えば少なくとも約１００％、１５０％、２００％、２５０％、又は５００％増加しうる。一実施態様では、本発明の化合物は、親タンパク質の半減期に対し、少なくとも約５時間、好ましくは少なくとも約２４時間、より好ましくは少なくとも約７２時間、最も好ましくは少なくとも約７日間の半減期の増加を示す。
インビボ血漿半減期の測定は、文献に記載されているような多くの方法により実施することができる。インビボ血漿半減期の増加は、クリアランス（ＣＬ）の減少、又は平均滞留時間（ＭＲＴ）の増加として定量されうる。適切なアッセイにより測定して親タンパク質のＣＬの７０％未満、例えば５０％未満、例えば２０％未満、例えば１０％未満までＣＬが低下した本発明の修飾されたタンパク質は、増加したインビボ血漿半減期を有していると言える。適切なアッセイにおいて親タンパク質のＭＲＴの１３０％以上、例えば１５０％、例えば２００％以上、例えば５００％以上まで、ＭＲＴが増加した本発明の修飾されたタンパク質は、増加したインビボ血漿半減期を有していると言える。クリアランス及び平均滞留時間は、適切な試験動物を使用し、標準的な薬物動態学的研究において評価することができる。与えられたタンパク質に対して適切な試験動物を選択することは当業者の技量の範囲内である。もちろん、ヒトでの試験が最終試験となる。典型的には、一例として、マウス、ラット、イヌ、サル又はブタに興味ある化合物の注射がなされる。注射される量は試験動物に依存する。続いて、ＣＬ及びＭＲＴの評価のために必要に応じて１から５日の期間をあけて、血液サンプルを採取する。血液サンプルは、簡便にはＥＬＩＳＡ技術により分析する。
化合物の「免疫原性」なる用語は、ヒトに投与された場合、体液性、細胞性又はその双方の如何にかかわらず、有害な免疫反応を誘発する化合物の能力を意味する。任意のヒト亜母集団においては、特定の投与されたタンパク質に対して感受性を示す個体が存在し得る。免疫原性は、当該分野で知られている一般的な方法を使用し、感受性の個体における成長ホルモン抗体及び／又は成長ホルモン反応性Ｔ細胞の存在を定量することにより測定されうる。一実施態様では、本発明の修飾されたタンパク質は、親タンパク質のその個体に対する免疫原性に対して、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２５％、より好ましくは少なくとも約４０％、最も好ましくは少なくとも約５０％の感受性の個体における免疫原性の低下を示す。
ここで使用される「プロテアーゼ保護」又は「プロテアーゼ保護された」なる用語は、本発明の修飾されたタンパク質が、親タンパク質よりも、血漿ペプチダーゼ又はプロテアーゼに対してより耐性があることを示すものである。血漿中に存在するプロテアーゼ及びペプチダーゼ酵素は、循環タンパク質の分解に関与していることが知られている。
例えばジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）による分解に対するタンパク質の耐性は、次の分解アッセイにより測定される：１００μＬの０．１Ｍのトリエチルアミン−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．４中において、タンパク質のアリコート（５ｎｍｏｌ）を、５ｍＵの酵素活性に相当する１μＬの精製ジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶと共に３７℃で１０−１８０分インキュベートする。１０％のトリフルオロ酢酸５μＬを添加して、酵素反応を終結させ、タンパク質分解産物を分離し、ＨＰＬＣ分析を使用して定量する。この分析を実施するための一方法は次の通りである：混合物をＶｙｄａｃ Ｃ１８ワイドポア（ｗｉｄｅｐｏｒｅ）（３０ｎｍ孔、５μｍの粒子）２５０×４．６ｍｍのカラムに充填し、Ｓｉｅｇｅｌ等，Ｒｅｇｕｌ．Ｐｅｐｔ．７９，９３−１０２（１９９９）及びＭｅｎｔｌｅｉｎ等，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１４，８２９−３５（１９９３）に従って、０．１％のトリフルオロ酢酸中アセトニトリルの線形段階的勾配（３分間は０％のアセトニトリル、１７分間は０−２４％のアセトニトリル、１分間は２４−４８％のアセトニトリル）で１ｍｌ／分の流量で溶出させる。タンパク質とその分解産物を、２２０ｎｍ（タンパク質結合）又は２８０ｎｍ（芳香族アミノ酸）の吸光度によりモニターでき、標準のものとの関連でそれらのピーク面積を積分することにより定量する。ジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶによるタンパク質の加水分解速度は、加水分解されるタンパク質が１０％未満になるインキュベート時間で推定される。一実施態様では、修飾されたタンパク質の加水分解速度は、親タンパク質のものの７０％未満、例えば４０％未満、例えば１０％未満である。
哺乳動物種の循環血液中において最も豊富なタンパク質成分は血清アルブミンで、これは通常、全血１００ｍＬ中、約３から４．５グラムの濃度で存在している。血清アルブミンは約７００００ダルトンの血液タンパク質であり、循環系において、幾つかの重要な機能を有している。それは、血液中に見出される様々な有機分子のトランスポーターとして、血液を通して脂肪酸及びビリルビンのような様々な代謝産物の主要なトランスポーターとして、またその豊富さのため、循環血液の浸透圧調節因子として機能する。血清アルブミンは１週間以上の半減期を有しており、タンパク質の血漿半減期を増加させるための一アプローチは、血清アルブミンに結合する基をタンパク質にコンジュゲートさせることであった。アルブミン結合特性は、出典明示によりここに援用されるＪ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ，４３，２０００，１９８６−１９９２に記載されているようにして決定されうる。
一態様では、本発明の修飾されたタンパク質は、Ｒ１及び／又はＲ２の更なる誘導体化によって更に修飾されうる。すなわち、Ｒ１及び／又はＲ２は更なる修飾に適した化学基を含みうる。かかる修飾は、デンドリマー、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、分岐状ＰＥＧ、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン・無水マレイン酸コポリマー、ポリスチレン・無水マレイン酸コポリマー、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン；血清タンパク質結合リガンド、例えばアルブミンに結合する化合物、例えば脂肪酸、Ｃ５−Ｃ２４脂肪酸、脂肪族二酸（例えばＣ５−Ｃ２４）、レセプター（例えばアシアロ糖タンパク質レセプター及びマンノースレセプター）への結合からグリカンを阻害する構造（例えば、シアル酸誘導体又は模倣体（mimetics））、生理学的条件下で荷電性を変化させる部分を含む低有機分子、例えばカルボン酸又はアミン、又はより小さいアルキル置換基（例えばＣ１−Ｃ５アルキル）のようなグリカン特異的認識を防止する中性置換基、低分子有機荷電基（例えばＣ１−Ｃ２５）で、一又は複数のカルボン酸、アミンスルホン酸、ホスホン酸、又はその組合せを含みうるもの；低分子中性親水性分子（例えばＣ１−Ｃ２５）、例えばシクロデキストリン、又は場合によっては分岐でありうるポリエチレン鎖；２−４０ＫＤａの平均分子量を持つポリエチレングリコール；７００から２００００Ｄａの範囲、より好ましくは７００−１００００Ｄａの間の正確な分子量を持つデンドリマーのような良好に定まった精密ポリマー；及び実質的に非免疫原性のポリペプチド、例えばアルブミン又は抗体又はＦｃドメインを含んでいてもよい抗体の一部からなる群から選択される化学基のコンジュゲーションを含みうる。
一実施態様では、本発明の修飾されたタンパク質はＰＥＧ化される。「ＰＥＧ」なる用語は、約１００から約１００００００Ｄａの分子量のポリエチレングリセロール（その類似体を含む）を示すことを意図しており、ここで、例えば末端ＯＨ基はアルコキシ基、例えばメトキシ基、エトキシ基又はプロポキシ基で置き換えられているものである。特に、末端ＯＨ基がメトキシで置き換えられているＰＥＧは、ｍＰＥＧと称される。
「ｍＰＥＧ」（より適切には「ｍＰＥＧイル」）なる用語は、次の構造：
Figure 0005703020
（上式中、ｍは１より大きい整数である）
の多分散又は単分散基を意味する。よって、ｍが９０であるｍＰＥＧは、３９９１Ｄａ、すなわち約４ｋＤａの分子量を有する。同様に、２０ｋＤａの平均分子量を有するｍＰＥＧは、４５３の平均ｍを有する。ｍＰＥＧを生産するプロセスのために、これらの分子は多くの場合、所定の分子量分布を有している。この分布は多分散度により記述される。
ここで使用される「多分散度」なる用語は、高分子化学の分野で知られている重量平均分子量と数平均分子量の比率を意味する（例えば「Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ」，Ｊ．Ａ．Ｎａｉｒｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｕｔａｈ，２００３を参照）。多分散度は１以上の数であり、ゲル浸透クロマトグラフィーデータから概算されうる。多分散度が１である場合、生成物は単分散であり、よって単一の分子量を有する化合物からなる。多分散度が１を越える場合、それは、そのポリマーの多分散性の測定値、すなわち異なった分子量のポリマーの分布がどの程度広い範囲であるかということである。
例えば「ｍＰＥＧ２００００」の式中、化合物名又は分子構造における使用は、ｍＰＥＧが多分散であり、約２０ｋＤａの分子量を有しているｍＰＥＧ残基を示している。
多分散度は、ＰＥＧ又はｍＰＥＧの分子量と共に典型的には増加する。２０ｋＤａのＰＥＧ、特に２０ｋＤａのｍＰＥＧを参照すると、１．０６以下、例えば１．０５以下、例えば１．０４以下、例えば１．０３以下、例えば１．０２〜１．０３の多分散度を有する化合物（又は実際には化合物の混合物）を示すことが意図される。３０ｋＤａのＰＥＧ、特に３０ｋＤａのｍＰＥＧを参照すると、１．０６以下、例えば１．０５以下、例えば１．０４以下、例えば１．０３以下、例えば１．０２〜１．０３の多分散度を有する化合物（又は実際には化合物の混合物）を示すことが意図される。４０ｋＤａのＰＥＧ、特に４０ｋＤａのｍＰＥＧを参照すると、１．０６以下、例えば１．０５以下、例えば１．０４以下、例えば１．０３以下、例えば１．０２〜１．０３の多分散度を有する化合物（又は実際には化合物の混合物）を示すことが意図される。
Ｒ１及び／又はＲ２基の更なる誘導体化を通して修飾されたタンパク質にコンジュゲートされたＰＥＧ又はｍＰＥＧは、任意の分子量のものでありうる。特に、分子量は、５００から１００００００Ｄａ、例えば５００から５０００００Ｄａ、例えば５００から１０００００Ｄａ、例えば５００から６００００Ｄａ、例えば１０００から４００００Ｄａ、例えば５０００から４００００Ｄａでありうる。特に、１００００Ｄａから４００００Ｄａ、例えば２００００Ｄａから４００００Ｄａ、例えば２００００から３００００Ｄａ又は３００００から４００００Ｄａの分子量のＰＥＧを使用することができる。１００００、２００００、３００００又は４００００Ｄａの分子量のＰＥＧ又はｍＰＥＧを特に挙げることができる。
一実施態様では、Ｒ１及び／又はＲ２は、例えばアルブミンのような、血漿タンパク質に結合することが知られている一又は複数の部分を含む。化合物のアルブミンへの結合能は、出典明示によりここに援用されるＪ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ，４３，２０００，１９８６−１９９２に記載されているようにして決定することができる。本文脈において、化合物は、Ｒｕ／Ｄａが０．０５以上、例えば０．１０以上、例えば０．１２以上又は更には０．１５以上である場合、アルブミンに結合すると定義される。
本発明の他の実施態様では、アルブミン結合部分はタンパク質、例えば４０未満のアミノ酸残基を含むタンパク質である。アルブミン結合部分である多くの小タンパク質が、出典明示によりここに援用されるＪ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７７，３８（２００２）３５０３５−３５０４３に開示される。
上で検討されたように、性質改変基の直接のコンジュゲーションは知られている（例えば、アミン官能化ＰＥＧ又はＴＧａｓｅの使用によってＧｌｎ残基を介してＧｌｎ含有タンパク質にコンジュゲートされた脂肪酸）。しかしながら、かかるコンジュゲーションは治療用タンパク質のような標的化合物を誘導体化する場合に必要とされる特異性をしばしば欠く場合がある。更に、例えばＥＰ９５０６６５、ＥＰ７８５２７６、Ｓａｔｏ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．，５４，４５９−４７６，２００２及びＷａｄａ，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔｔ．，２３，１３６７−１３７２，２００１に開示された例から、反応が進行するためにはタンパク質にコンジュゲートされるための有意に過剰な量（１００−１０００倍まで）の化合物を必要とすることが明らかである。かかる過剰量は技術的又は大きな規模での反応の有用性に対して制約となる。例えば、小さい多分散度のｍＰＥＧは非常に高価であり、大過剰の必要性は実施を阻害する。更に、例えばＰＥＧ１０ｋＤａ又はＰＥＧ２０ｋＤａのような大きな部分のコンジュゲーションの場合、１００−１０００倍のオーダーの過剰な試薬は、かかる化合物の分子量のために実行可能ではない。また大量のＰＥＧが存在するとタンパク質、つまり修飾されるタンパク質とトランスグルタミナーゼの双方を沈殿させる可能性があることもよく知られている。これに対して、本発明は、酵素工程において大過剰で必要とされる反応物が、大過剰においてさせ容易に取り扱いができる低分子であるという効果を奏する。第二工程において形成される結合を適切に選択すると、例えばオキシム形成が略等モル量のアミン及びケト官能性のときに起こるので、大過剰量は必要とされない。
本発明の標的化合物
本発明の標的化合物は好ましくはタンパク質である。すなわち、タンパク質は本発明の方法に係るトランスグルタミナーゼの基質でなければならない。一態様では、標的化合物は少なくとも一つのＬｙｓ残基、好ましくは少なくとも二つのＬｙｓ残基を含む。標的化合物がトランスグルタミナーゼ基質自体ではない場合、タンパク質をトランスグルタミナーゼの基質にするためにタンパク質に一又は複数のＧｌｎ又はＬｙｓ残基、特にＬｙｓ残基を挿入することができる。原理的には、かかるＧｌｎ又はＬｙｓ残基は配列の任意の位置に挿入できるが、タンパク質の生理学的、例えば治療的活性が、タンパク質が例えば治療的介入においてもはや有用ではない程度までは影響されない位置に挿入されるのが好ましい。タンパク質へのアミノ酸残基の挿入は、例えば翻訳後化学修飾又はトランスジェニック技術のような当業者に知られた標準的技術によってもたらされうる。
例えば酵素、タンパク質ホルモン、増殖因子、抗体、サイトカイン、レセプター、リンホカイン及びワクチン抗原のようなトランスグルタミナーゼに対して基質である任意の標的化合物又はタンパク質は本発明の方法によって修飾され得、治療用タンパク質、例えばインスリン、グルカゴン様タンパク質１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様タンパク質２（ＧＬＰ−２）、成長ホルモン、サイトカイン、トレフォイルファクタータンパク質（ＴＦＦ）、プロテインメラノコルチンレセプター修飾因子及び第ＶＩＩ因子化合物を特に挙げることができる。よって、本発明の標的化合物は、例えばｈＧＨ、プロラクチン又は任意の他のサイトカイン；インスリン、ＧＬＰ１又は任意の他のタンパク質ホルモン；抗体又はそれから誘導される断片；活性化第ＶＩＩ因子、活性化第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、又は任意の他の凝固因子を含む。
改変基のより選択的な導入から恩恵を受けるかかる一タンパク質は成長ホルモンである。成長ホルモン（ＧＨ）又はソマトトロピン（ＳＴＨ）は、ヒト及び他の動物における成長及び細胞再生を刺激するタンパク質ホルモンである。それは、脳下垂体前葉の側方翼内の成長ホルモン分泌細胞によって合成され、保存され、分泌される１９１アミノ酸の一本鎖ポリペプチドホルモンである。すなわち、ヒト成長ホルモンの遺伝子は、染色体１７のｑ２２−２４領域に局在化し、ヒト絨毛性乳腺刺激ホルモン（ｈＣＳ、胎盤性ラクトゲンとしても知られる）遺伝子に密接に関連している。ＧＨ、ヒト絨毛性乳腺刺激ホルモン（ｈＣＳ）、及びプロラクチン（ＰＲＬ）は、成長促進及び乳腺刺激性活性を有する相同ホルモンのグループである。
上に述べたように、ヒト成長ホルモンの主要なアイソフォームは、１９１のアミノ酸（配列番号１及び２）及び約２２０００ダルトンの分子量のタンパク質である。その構造はＧＨレセプターとの機能的相互作用に必要な４つのヘリックスを含む。ＧＨはプロラクチン及び絨毛性乳腺刺激ホルモンに構造的にまた見かけ上進化的に相同である。異なった種由来の成長ホルモン間の顕著な構造的類似性にもかかわらず、ヒト及び霊長類の成長ホルモンのみがヒトにおいて有意な効果を有する。ヒトＧＨのスプライシングバリアントを配列番号３に示す。またＢｏｇｕｓｚｅｗｓｋｉ等．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８３（８）：２８７８−２８８５（１９９８）を参照のこと。
「成長ホルモン化合物」なる用語は、一又は複数のアミノ酸残基が欠失され、及び／又は天然又は非天然の他のアミノ酸残基によって置換されたヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、及び／又は天然又は非天然のアミノ酸残基の付加を含むｈＧＨ、及び／又は少なくとも一つの有機置換基が一又は複数の有機置換基に結合しているｈＧＨを示すものである。１９１の天然アミノ酸配列（ソマトロピン）と１９２のアミノ酸Ｎ末端メチオニン種（ソマトレム）を特に挙げることができる。
本発明において利用可能な成長ホルモン化合物の他の例には、出典明示によりここに援用される国際公開第９２／０９６９０号（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）に開示された、グループとしてアミノ酸第１７２，１７４，１７６及び１７８番が次のアミノ酸群（Ｒ，Ｓ，Ｆ，Ｒ）；（Ｒ，Ａ，Ｙ，Ｒ），（Ｋ，Ｔ，Ｙ，Ｋ）；（Ｒ，Ｓ，Ｙ，Ｒ）；（Ｋ，Ａ，Ｙ，Ｒ）；（Ｒ，Ｆ，Ｆ，Ｒ）；（Ｋ，Ｑ，Ｙ，Ｒ）；（Ｒ，Ｔ，Ｙ，Ｈ）；（Ｑ，Ｒ，Ｙ，Ｒ）；（Ｋ，Ｋ，Ｙ，Ｋ）；（Ｒ，Ｓ，Ｆ，Ｓ）又は（Ｋ，Ｓ，Ｎ，Ｒ）の一つによって置換されているものが含まれる。
本発明において利用可能な成長ホルモン化合物の他の例には、出典明示によりここに援用される米国特許第６００４９３１号（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）に開示された、次の置換Ｇ１２０Ｒ、Ｇ１２０Ｋ、Ｇ１２０Ｙ、Ｇ１２０Ｆ及びＧ１２０Ｅを持つｈＧＨが含まれる。
本発明において利用可能な成長ホルモン化合物の他の例には、出典明示によりここに援用される米国特許第６１４３５２３号（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）に開示された、次の置換セットＲ１６７Ｎ、Ｄ１７１Ｓ、Ｅ１７４Ｓ、Ｆ１７６Ｙ及びＩ１７９Ｔ；Ｒ１７６Ｅ、Ｄ１７１Ｓ、Ｅ１７４Ｓ及びＦ１７６Ｙ；Ｆ１０Ａ、Ｍ１４Ｗ、Ｈ１８Ｄ及びＨ２１Ｎ；Ｆ１０Ａ、Ｍ１４Ｗ、Ｈ１８Ｄ、Ｈ２１Ｎ、Ｒ１６７Ｎ、Ｄ１７１Ｓ、Ｅ１７４Ｓ、Ｆ１７６Ｙ、Ｉ１７９Ｔ；Ｆ１０Ａ、Ｍ１４Ｗ、Ｈ１８Ｄ、Ｈ２１Ｎ、Ｒ１６７Ｎ、Ｄ１７１Ａ、Ｅ１７４Ｓ、Ｆ１７６Ｙ、Ｉ１７９Ｔ；Ｆ１０Ｈ、Ｍ１４Ｇ、Ｈ１８Ｎ及びＨ２１Ｎ；Ｆ１０Ａ、Ｍ１４Ｗ、Ｈ１８Ｄ、Ｈ２１Ｎ、Ｒ１６７Ｎ、Ｄ１７１Ａ、Ｔ１７５Ｔ及びＩ１７９Ｔ；及びＦ１０Ｉ、Ｍ１４Ｑ、Ｈ１８Ｅ、Ｒ１６７Ｎ、Ｄ１７１Ｓ及びＩ１７９Ｔを持つｈＧＨが含まれる。
本発明において利用可能な成長ホルモン化合物の他の例には、出典明示によりここに援用される米国特許第６１３６５３６号（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）に開示された次の置換セット Ｈ１８Ａ、Ｑ２２Ａ、Ｆ２５Ａ、Ｄ２６Ａ、Ｑ２９Ａ、Ｅ６５Ａ、Ｋ１６８Ａ、Ｅ１７４Ａ及びＧ１２０Ｋを持つｈＧＨが含まれる。
本発明において利用可能な成長ホルモン化合物の他の例には、出典明示によりここに援用される米国特許第６０５７２９２号（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）に開示された次の置換セットＨ１８Ｄ、Ｈ２１Ｎ、Ｒ１６７Ｎ、Ｋ１６８Ａ、Ｄ１７１Ｓ、Ｋ１７２Ｒ、Ｅ１７４Ｓ、Ｉ１７９Ｔを持ち、ここでＧ１２０が更にＲ、Ｋ、Ｗ、Ｙ、Ｆ又はＥの何れかで置換されているｈＧＨが含まれる。
本発明において利用可能な成長ホルモン化合物の他の例には、出典明示によりここに援用される米国特許第５８４９５３５号（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）に開示された次の置換セットＨ１８Ｄ、Ｈ２１Ｎ、Ｒ１６７Ｎ、Ｋ１６８Ａ、Ｄ１７１Ｓ、Ｋ１７２Ｒ、Ｅ１７４Ｓ及びＩ１７９Ｔを持つｈＧＨが含まれる。
本発明において利用可能な成長ホルモン化合物の他の例には、出典明示によりここに援用される国際公開第９７／１１１７８号（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）に開示された次の置換セットＨ１８Ｄ、Ｈ２１Ｄ、Ｒ１６７Ｎ、Ｋ１６８Ａ、Ｄ１７１Ｓ、Ｋ１７２Ｒ、Ｅ１７４Ｓ及びＩ１７９Ｔ；及びＨ１８Ａ、Ｑ２２Ａ、Ｆ２５Ａ、Ｄ２６Ａ、Ｑ２９Ａ、Ｅ６５Ａ、Ｋ１６８Ａ及びＥ１７４Ａを持つｈＧＨが含まれる。
本発明において利用可能な成長ホルモン化合物の他の例には、出典明示によりここに援用される国際公開第９０／０４７８８号（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）に開示された次の置換セットＫ１６８Ａ及びＥ１７４Ａ；Ｒ１７８Ｎ及びＩ１７９Ｍ；Ｋ１７２Ａ及びＦ１７６Ａ；及びＨ５４Ｆ、Ｓ５６Ｅ、Ｌ５８Ｉ、Ｅ６２Ｓ、Ｄ６３Ｎ及びＱ６６Ｅを持つｈＧＨが含まれる。
本発明の方法がｈＧＨを含む標的化合物について実施される場合、反応は、Ｌｙｓ６４、Ｌｙｓ６７、Ｌｙｓ９６、Ｌｙｓ１４１、Ｌｙｓ１６６、Ｌｙｓ１７１、Ｌｙｓ１８４、Ｌｙｓ１９４及びＬｙｓ１９８から選択される少なくとも一つのＬｙｓｍｐ選択的修飾を生じる。好ましい実施態様では、主として、配列番号２の一つの単一リジンＬｙｓ１７１が修飾される。
他の実施態様では、少なくとも二つのＬｙｓが修飾される。
また他の実施態様では、Ｌｙｓ１７１が一つの性質改変基で修飾され、第二のＬｙｓはここに開示された第二の異なった性質改変基で修飾される。
本発明の方法から恩恵を受けうる他のタンパク質はインスリン、特にヒトインスリンである。本文脈において、「ヒトインスリン」なる用語は天然に生産されるインスリン又は組換え的に生産されるインスリンを意味する。組換えヒトインスリンは任意の適切な宿主細胞で生産することができ、例えば宿主細胞は細菌、真菌（酵母菌を含む）、昆虫、動物又は植物細胞でありうる。多くのインスリン化合物が文献に開示されており、それらもまた本発明の方法において有用である。「インスリン化合物」（と関連する表現）は、一又は複数のアミノ酸が欠失され、及び／又は非コード化アミノ酸を含む他のアミノ酸によって置換されたヒトインスリン、及び／又は更なるアミノ酸、つまり５１を超えるアミノ酸を含むヒトインスリン、及び／又は少なくとも一の有機置換基がアミノ酸の一又は複数に結合しているヒトインスリンを意味する。
本発明によって提供される方法において特に利用できるインスリン化合物の開示として次の特許文献を挙げることができる。
出典明示によりここに援用される国際公開第９７／３１０２２号（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）は、Ｂ鎖のＮ末端アミノ酸のアミノ基及び／又はＬｙｓＢ２９のεアミノ基が親油性置換基を含むカルボン酸を有している遅延性活性プロファイルを有するインスリン化合物を開示している。特に挙げることができるものは、ＮεＢ２９−（ＣＯ−（ＣＨ２）１４−ＣＯＯＨ）ヒトインスリン；ＮεＢ２９−（ＣＯ−（ＣＨ２）１６−ＣＯＯＨ）ヒトインスリン；ＮεＢ２９−（ＣＯ−（ＣＨ２）１８−ＣＯＯＨ）ヒトインスリン；ＮεＢ２９−（ＣＯ−（ＣＨ２）２０−ＣＯＯＨ）；ＮεＢ２９−（ＣＯ−（ＣＨ２）２２−ＣＯＯＨ）ヒトインスリン；ＮεＢ２９−（ＣＯ−（ＣＨ２）１４−ＣＯＯＨ）ＡｓｐＢ２８−ヒトインスリン；ＮεＢ２９−（ＣＯ−（ＣＨ２）１６−ＣＯＯＨ）ＡｓｐＢ２８−ヒトインスリン；ＮεＢ２９−（ＣＯ−（ＣＨ２）１８−ＣＯＯＨ）ＡｓｐＢ２８−ヒトインスリン；ＮεＢ２９−（ＣＯ−（ＣＨ２）２０−ＣＯＯＨ）ＡｓｐＢ２８−ヒトインスリン；ＮεＢ２９−（ＣＯ−（ＣＨ２）２２−ＣＯＯＨ）ＡｓｐＢ２８−ヒトインスリン；ＮεＢ３０−（ＣＯ−（ＣＨ２）１４−ＣＯＯＨ）ＴｈｒＢ２９ＬｙｓＢ３０−ヒトインスリン；ＮεＢ３０−（ＣＯ−（ＣＨ２）１６−ＣＯＯＨ）ＴｈｒＢ２９ＬｙｓＢ３０−ヒトインスリン；ＮεＢ３０−（ＣＯ−（ＣＨ２）１８−ＣＯＯＨ）ＴｈｒＢ２９ＬｙｓＢ３０−ヒトインスリン；ＮεＢ３０−（ＣＯ−（ＣＨ２）２０−ＣＯＯＨ）ＴｈｒＢ２９ＬｙｓＢ３０−ヒトインスリン；ＮεＢ３０−（ＣＯ−（ＣＨ２）２２−ＣＯＯＨ）ＴｈｒＢ２９ＬｙｓＢ３０−ヒトインスリン；ＮεＢ２８−（ＣＯ−（ＣＨ２）１４−ＣＯＯＨ）ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン；ＮεＢ２８−（ＣＯ−（ＣＨ２）１６−ＣＯＯＨ）ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン；ＮεＢ２８−（ＣＯ−（ＣＨ２）１８−ＣＯＯＨ）ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン；ＮεＢ２８−（ＣＯ−（ＣＨ２）２０−ＣＯＯＨ）ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン；ＮεＢ２８−（ＣＯ−（ＣＨ２）２２−ＣＯＯＨ）ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン；ＮεＢ２９−（ＣＯ−（ＣＨ２）１４−ＣＯＯＨ）ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；ＮεＢ２９−（ＣＯ−（ＣＨ２）１６−ＣＯＯＨ）ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；ＮεＢ２９−（ＣＯ−（ＣＨ２）１８−ＣＯＯＨ）ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；ＮεＢ２９−（ＣＯ−（ＣＨ２）２０−ＣＯＯＨ）ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；及びＮεＢ２９−（ＣＯ−（ＣＨ２）２２ＣＯＯＨ）ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンである。
出典明示によりここに援用されるＷＯ９６／２９３４４（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）は、Ｂ鎖のＮ末端アミノ酸のアミノ基が、結合した１２から４０の炭素原子を有する親油性置換基を有するか、又はＢ鎖のＣ末端アミノ酸のカルボン酸基が、結合した１２から４０の炭素原子を有する親油性置換基を有している遅延性活性プロファイルを有するインスリン化合物を開示している。
出典明示によりここに援用される国際公開第９５／０７９３１号（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）は、ＬｙｓＢ２９のεアミノ基が親油性置換基を有している遅延性活性プロファイルを有するインスリン化合物を開示している。特に挙げることができるものは、ＮεＢ２９−トリデカノイルｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイルｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイルｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイルｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイルＧｌｙＡ２１ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイルＧｌｙＡ２１ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイルＧｌｙＡ２１ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイルＧｌｙＡ２１ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイルＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイルＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイルＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイルＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイルＡｌａＡ２１ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイルＡｌａＡ２１ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイルＡｌａＡ２１ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイルＡｌａＡ２１ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイルＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイルＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイルＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイルＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイルＧｌｎＢ３ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイルＧｌｎＢ３ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイルＧｌｎＢ３ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイルＧｌｎＢ３ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイルＧｌｙＡ２１ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイルＧｌｙＡ２１ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイルＧｌｙＡ２１ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイルＧｌｙＡ２１ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイルＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイルＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイルＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイルＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイルＡｌａＡ２１ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイルＡｌａＡ２１ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイルＡｌａＡ２１ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイルＡｌａＡ２１ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイルＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイルＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイルＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイルＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイルＧｌｎＢ３ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイルＧｌｎＢ３ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイルＧｌｎＢ３ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイルＧｌｎＢ３ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイルＧｌｕＢ３０ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイルＧｌｕＢ３０ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイルＧｌｕＢ３０ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイルＧｌｕＢ３０ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイルＧｌｙＡ２１ＧｌｕＢ３０ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイルＧｌｙＡ２１ＧｌｕＢ３０ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイルＧｌｙＡ２１ＧｌｕＢ３０ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイルＧｌｙＡ２１ＧｌｕＢ３０ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイルＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイルＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイルＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイルＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイルＡｌａＡ２１ＧｌｕＢ３０ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイルＡｌａＡ２１ＧｌｕＢ３０ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイルＡｌａＡ２１ＧｌｕＢ３０ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイルＡｌａＡ２１ＧｌｕＢ３０ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイルＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイルＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイルＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイルＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイルＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイルＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイルＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０ヒトインスリン及びＮεＢ２９−ドデカノイルＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０ヒトインスリンである。
出典明示によりここに援用される国際公開第９７／０２０４３号（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）は、インスリン予防投与に有用なホルモン的に不活性のインスリン化合物を開示しており、特にそのようなヒトインスリンのアナログは、ｄｅｓＡ１ヒトインスリン；ｄｅｓ（Ａ１−Ａ２）ヒトインスリン；ｄｅｓ（Ａ１−Ａ３）ヒトインスリン；ｄｅｓＡ２１ヒトインスリン；ｄｅｓ（Ｂ１−Ｂ５）ヒトインスリン；ｄｅｓ（Ｂ１−Ｂ６）ヒトインスリン；ｄｅｓ（Ｂ２３−Ｂ３０）ヒトインスリン；ｄｅｓ（Ｂ２４−Ｂ３０）ヒトインスリン；ｄｅｓ（Ｂ２５−Ｂ３０）ヒトインスリン；ＧｌｙＡ２ヒトインスリン；ＡｌａＡ２ヒトインスリン；ＮｌεＡ２ヒトインスリン；ＴｈｒＡ２ヒトインスリン；ＰｒｏＡ２ヒトインスリン；Ｄ−アロＩｌεＡ２ヒトインスリン；ＮｖａＡ３ヒトインスリン；ＮｌεＡ３ヒトインスリン；ＬｅｕＡ３ヒトインスリン；ＶａｌＡ２，ＩｌεＡ３ヒトインスリン；ＡｂｕＡ２，ＡｂｕＡ３ヒトインスリン；ＧｌｙＡ２，ＧｌｙＡ３ヒトインスリン；Ｄ−ＣｙｓＡ６ヒトインスリン；Ｄ−ＣｙｓＡ６，Ｄ−ＣｙｓＡ１１ヒトインスリン；ＳｅｒＡ６，ＳｅｒＡ１１，ｄｅｓ（Ａ８−Ａ１０）ヒトインスリン；Ｄ−ＣｙｓＡ７ヒトインスリン；Ｄ−ＣｙｓＡ１１ヒトインスリン；ＬｅｕＡ１９ヒトインスリン；ＧｌｙＢ６ヒトインスリン；ＧｌｕＢ１２ヒトインスリン；ＡｓｎＢ１２ヒトインスリン；ＰｈｅＢ１２ヒトインスリン；Ｄ−ＡｌａＢ１２ヒトインスリン；及びＡｓｐＢ２５ヒトインスリンから選択され、本発明の方法において利用できる。
出典明示によりここに援用される国際公開第９２／１５６１１号（Ｎｏｖｏ ｎｏｒｄｉｓｋ）は、インスリンレセプター結合プロセスにおいて速い会合速度定数を有し、Ａ１３位にチロシンを、及び／又はＢ１７位にフェニルアラニン、トリプトファン又はチロシンを含むことによって特徴付けられるヒトインスリンアナログを開示している。特に、かかるアナログは、ＴｙｒＡ１３ヒトインスリン、ＰｈｅＢ１７ヒトインスリン、ＴｒｐＢ１７ヒトインスリン、ＴｙｒＢ１７ヒトインスリン、ＴｙｒＡ１３，ＰｈｅＢ１７ヒトインスリン、ＴｙｒＡ１３，ＴｒｐＢ１７ヒトインスリン、ＴｙｒＡ１３，ＴｙｒＢ１７ヒトインスリン、ＰｈｅＡ１３，ＰｈｅＢ１７ヒトインスリン、ＰｈｅＡ１３，ＴｒｐＢ１７ヒトインスリン、ＰｈｅＡ１３，ＴｙｒＢ１７ヒトインスリン、ＴｒｐＡ１３，ＰｈｅＢ１７ヒトインスリン、ＴｒｐＡ１３，ＴｒｐＢ１７ヒトインスリン及びＴｒｐＡ１３，ＴｙｒＢ１７ヒトインスリンから選択される。
出典明示によりここに援用される国際公開第９２／００３２２号（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）は、特定の組織を標的とすることができ、インスリン分子のＡ１３位及び／又はＢ１７位にロイシンとは異なる天然に生じるアミノ酸残基を有し、及び／又はインスリン分子のＢ１８位にバリンとは異なる天然に生じるアミノ酸残基を有することを特徴とするヒトインスリンのアナログを開示している。特に、かかるアナログは、ＡｌａＢ１７ヒトインスリン、ＡｌａＢ１８ヒトインスリン、ＡｓｎＡ１３ヒトインスリン、ＡｓｎＡ１３，ＡｌａＢ１７ヒトインスリン、ＡｓｎＡ１３，ＡｓｐＢ１７ヒトインスリン、ＡｓｎＡ１３，ＧｌｕＢ１７ヒトインスリン、ＡｓｎＢ１８ヒトインスリン、ＡｓｐＡ１３ヒトインスリン、ＡｓｐＡ１３，ＡｌａＢ１７ヒトインスリン、ＡｓｐＡ１３，ＡｓｐＢ１７ヒトインスリン、ＡｓｐＡ１３，ＧｌｕＢ１７ヒトインスリン、ＡｓｐＢ１８ヒトインスリン、ＧｌｎＡ１３ヒトインスリン、ＧｌｎＡ１３，ＡｌａＢ１７ヒトインスリン、ＧｌｎＡ１３，ＡｓｐＢ１７ヒトインスリン、ＧｌｎＢ１８ヒトインスリン、ＧｌｕＡ１３ヒトインスリン、ＧｌｕＡ１３，ＡｌａＢ１７ヒトインスリン、ＧｌｕＡ１３，ＡｓｐＢ１７ヒトインスリン、ＧｌｕＡ１３，ＧｌｕＢ１７ヒトインスリン、ＧｌｕＢ１８ヒトインスリン、ＧｌｙＡ１３ヒトインスリン、ＧｌｙＡ１３，ＡｌａＢ１７ヒトインスリン、ＧｌｙＡ１３，ＡｓｎＢ１７ヒトインスリン、ＧｌｙＡ１３，ＡｓｐＢ１７ヒトインスリン、ＧｌｙＡ１３，ＧｌｕＢ１７ヒトインスリン、ＧｌｙＢ１８ヒトインスリン、ＳｅｒＡ１３ヒトインスリン、ＳｅｒＡ１３，ＧｌｎＡ１７，ＧｌｕＢ１０，ＧｌｎＢ１７−ｄｅｓ（ＴｈｒＢ３０）ヒトインスリン、ＳｅｒＡ１３，ＡｌａＢ１７ヒトインスリン、ＳｅｒＡ１３，ＡｓｎＢ１７ヒトインスリン、ＳｅｒＡ１３，ＡｓｐＢ１７ヒトインスリン、ＳｅｒＡ１３，ＧｌｎＢ１７ヒトインスリン、ＳｅｒＡ１３，ＧｌｕＢ１７ヒトインスリン、ＳｅｒＡ１３，ＴｈｒＢ１７ヒトインスリン、ＳｅｒＢ１４，ＡｓｐＢ１７ヒトインスリン、ＳｅｒＢ１８ヒトインスリン、ＴｈｒＡ１３ヒトインスリン又はＴｈｒＢ１８ヒトインスリンから選択される。
出典明示によりここに援用される国際公開第９０／０１０３８号（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）は、高い生物学的活性を有し、Ｈｉｓ又はＴｙｒによって置換されたＰｈｅＢ２５を有し、Ａ４、Ａ８、Ａ１７、Ａ２１、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１２、Ｂ１３、Ｂ２１、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８及びＢ３０位の一又は複数に置換を有し、なくてもよいＢ３０位にアミノ酸残基を有することによって特徴付けられるヒトインスリンのアナログを開示している。特に、かかるアナログはＴｙｒＢ２５ヒトインスリン、ＴｙｒＢ２５，ＡｓｐＢ２８ヒトインスリン、ＨｉｓＢ２５ヒトインスリン、ＨｉｓＢ２５，ＡｓｐＢ２８ヒトインスリン、ＴｙｒＢ２５ヒトインスリン−Ｂ３０−アミド及びＨｉｓＢ２５ヒトインスリン−Ｂ３０−アミドから選択される。
国際公開第８６／０５４９６号（Ｎｏｒｄｉｓｋ Ｇｅｎｔｏｆｔｅ）は、遅延性作用を有し、ブロックされたＢ３０カルボキシル基を有し、Ａ４、Ａ１７、Ａ２１、Ｂ１３及びＢ２１位のアミノ酸残基に一から四のブロックされたカルボキシル基を有することを特徴とするヒトインスリンのアナログを開示している。特に、かかるアナログは、インスリン−Ｂ３０−オクチルエステル、インスリン−Ｂ３０−ドデシルアミド、インスリン−Ｂ３０−ヘキサデシルアミド、インスリン−（Ｂ２１，Ｂ３０）−ジメチルエステル、インスリン−（Ｂ１７，Ｂ３０）−ジメチルエステル、インスリン−（Ａ４，Ｂ３０）ジアミド、インスリン−Ａ１７アミド−Ｂ３０−オクチルエステル、インスリン−（Ａ４，Ｂ１３）−ジアミド−Ｂ３０−ヘキシルアミド、インスリン−（Ａ４，Ａ１７，Ｂ２１，Ｂ３０）−テトラアミド、インスリン−（Ａ１７，Ｂ３０）−ジアミド、Ａ４−Ａｌａ−インスリン−Ｂ３０−アミド及びＢ３０−Ｌｅｕ−インスリン−（Ａ４，Ｂ３０）−ジアミドから選択される。
出典明示によりここに援用される国際公開第８６／０５４９７号（Ｎｏｒｄｉｓｋ Ｇｅｎｔｏｆｔｅ）は、Ａ４、Ａ１７、Ｂ１３及びＢ２１位の４つアミノ酸残基の一又は複数が非荷電側鎖を含んでいるインスリン化合物を開示している。特に挙げることができるものは、ヒトインスリンＡ１７−Ｇｌｎ、ヒトインスリンＡ４−Ｇｌｎ、ブタインスリンＢ２１−Ｇｌｎ、ヒトインスリンＢ１３−Ｇｌｎ、ヒトインスリン（Ａ１７，Ｂ２１）−Ｇｌｎ、ヒトインスリンＡ４−Ａｌａ、ヒトインスリンＢ２１−Ｔｈｒ、ヒトインスリンＢ１３−Ｖａｌ、ヒトインスリン−Ｔｈｒ−Ａ１７−Ｇｌｎ、ヒトインスリンＢ２１−メチルエステル及びヒトインスリンＡ１７−メチルエステルである。
出典明示によりここに援用される国際公開第９２／００３２１号（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）は、Ｂ鎖のＮ末端に正電荷が導入された延長された活性を有するインスリン化合物を開示している。特に挙げることができるものは、ＡｒｇＢ５，ＳｅｒＡ２１，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＡｒｇＢ５，ＰｒｏＢ６，ＳｅｒＡ２１，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＡｒｇＢ５，ＧｌｙＡ２１，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＡｒｇＢ５，ＰｒｏＢ６，ＧｌｙＡ２１，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＡｒｇＢ２，ＳｅｒＡ２１，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＡｒｇＢ２，ＰｒｏＢ３，ＳｅｒＡ２１，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＡｒｇＢ２，ＧｌｙＡ２１，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＡｒｇＢ２，ＰｒｏＢ３，ＧｌｙＡ２１，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＡｒｇＢ２，ＡｒｇＢ３，ＳｅｒＡ２１，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＡｒｇＢ２，ＡｒｇＢ３，ＳｅｒＡ２１ヒトインスリン、ＡｒｇＢ４，ＰｒｏＢ５，ＳｅｒＡ２１，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＡｒｇＢ４，ＡｒｇＢ５，ＰｒｏＢ６，ＧｌｙＡ２１，ＴｈｒＢ３０ヒトインスリン、ＡｒｇＢ３，ＧｌｙＡ２１，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＡｒｇＢ３，ＳｅｒＡ２１，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＡｒｇＢ４，ＧｌｙＡ２１，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＡｒｇＢ４，ＳｅｒＡ２１，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン及びＡｒｇＢ１，ＰｒｏＢ２，ＧｌｙＡ２１，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリンである。
出典明示によりここに援用される国際公開第９０／０７５２２号（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）は、Ｂ２８位に正荷電アミノ酸残基、つまりＬｙｓ又はＡｒｇがある溶液中で低会合能を示すインスリン化合物を開示している。特に挙げることができるものは、ｄｅｓ［ＰｈｅＢ２５］−ヒトインスリン、ｄｅｓ［ＴｙｒＢ２６］−ヒトインスリン、ｄｅｓ［ＴｈｒＢ２７］−ヒトインスリン、ｄｅｓ［ＰｒｏＢ２８］−ヒトインスリン、ｄｅｓ［ＰｈｅＢ２５］−ブタインスリン、ｄｅｓ［ＰｒｏＢ２８］−ブタインスリン、ｄｅｓ［ＰｒｏＢ２８］−ウサギインスリン、ｄｅｓ［ＰｈｅＢ２５］，ｄｅｓ［ＴｈｒＢ３０］−ヒトインスリン、ｄｅｓ［ＴｙｒＢ２６］，ｄｅｓ［ＴｈｒＢ３０］−ヒトインスリン、［ＳｅｒＡ２１］−ｄｅｓ［ＰｒｏＢ２８］−ヒトインスリン、［ＧｌｙＡ２１］−ｄｅｓ［ＰｒｏＢ２８］−ヒトインスリン、［ＧｌｙＡ２１］−ｄｅｓ［ＰｈｅＢ２５］−ヒトインスリン、［ＡｓｐＡ２１］−ｄｅｓ［ＰｈｅＢ２５］−ヒトインスリン、［ＨｉｓＢ２５］−ｄｅｓ［ＴｙｒＢ２６］，ｄｅｓ［ＴｈｒＢ３０］−ヒトインスリン、［ＡｓｎＢ２５］−ｄｅｓ［ＴｙｒＢ２６］，ｄｅｓ［ＴｈｒＢ３０］−ヒトインスリン、［ＡｓｐＡ２１］−ｄｅｓ［ＰｈｅＢ２５］，ｄｅｓ［ＴｈｒＢ３０］−ヒトインスリン、［ＡｓｐＢ２８］−ｄｅｓ［ＰｈｅＢ２５］−ヒトインスリン、［ＡｓｐＢ３］−ｄｅｓ［ＰｈｅＢ２５］−ヒトインスリン、［ＬｙｓＢ２８］−ヒトインスリン、［ＬｙｓＢ２８，ＴｈｒＢ２９］−ヒトインスリン及び［ＡｒｇＢ２８］−ｄｅｓ［ＬｙｓＢ２９］−ヒトインスリンである。
出典明示によりここに援用される国際公開第９０／１１２９０号（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）は、延長された活性を有するインスリン化合物を開示している。特に挙げることができるものは、［ＡｒｇＡ０］−ヒトインスリン−（Ｂ３０−アミド），［ＡｒｇＡ０，ＧｌｎＢ１３］−ヒトインスリン−（Ｂ３０−アミド），［ＡｒｇＡ０，ＧｌｎＡ４，ＡｓｐＡ２１］−ヒトインスリン−（Ｂ３０−アミド），［ＡｒｇＡ０，ＳｅｒＡ２１］−ヒトインスリン−（Ｂ３０−アミド）及び［ＡｒｇＡ０，ＡｒｇＢ２７］−ｄｅｓ［ＴｈｒＢ３０］−ヒトインスリンである。
出典明示によりここに援用される国際公開第９０／１０６４５号（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）は、グリコシル化されたインスリンを開示している。特に挙げることができるものは、Ｐｈｅ（Ｂ１）グルコースヒトインスリン、Ｐｈｅ（Ｂ１）マンノースヒトインスリン、Ｇｌｙ（Ａ１）マンノースヒトインスリン、Ｌｙｓ（Ｂ２９）マンノースヒトインスリン、Ｐｈｅ（Ｂ１）ガラクトースヒトインスリン、Ｇｌｙ（Ａ１）ガラクトースヒトインスリン、Ｌｙｓ（Ｂ２９）ガラクトースヒトインスリン、Ｐｈｅ（Ｂ１）マルトースヒトインスリン、Ｐｈｅ（Ｂ１）ラクトースヒトインスリン、Ｇｌｙ（Ａ１）グルコースヒトインスリン、Ｇｌｙ（Ａ１）マルトースヒトインスリン、Ｇｌｙ（Ａ１）ラクトースヒトインスリン、Ｌｙｓ（Ｂ２９）グルコースヒトインスリン、Ｌｙｓ（Ｂ２９）マルトースヒトインスリン、Ｌｙｓ（Ｂ２９）ラクトースヒトインスリン、Ｇｌｙ（Ａ１），Ｐｈｅ（Ｂ１）ジグルコースヒトインスリン、Ｇｌｙ（Ａ１），Ｌｙｓ（Ｂ２９）ジグルコースヒトインスリン、Ｐｈｅ（Ｂ１），Ｌｙｓ（Ｂ２９）ジグルコースヒトインスリン、Ｐｈｅ（Ｂ１）イソマルトースヒトインスリン、Ｇｌｙ（Ａ１）イソマルトースヒトインスリン、Ｌｙｓ（Ｂ２９）イソマルトースヒトインスリン、Ｐｈｅ（Ｂ１）マルトトリオースヒトインスリン、Ｇｌｙ（Ａ１）マルトトリオースヒトインスリン、Ｌｙｓ（Ｂ２９）マルトトリオースヒトインスリン、Ｇｌｙ（Ａ１），Ｐｈｅ（Ｂ１）ジマルトースヒトインスリン、Ｇｌｙ（Ａ１），Ｌｙｓ（Ｂ２９）ジマルトースヒトインスリン、Ｐｈｅ（Ｂ１），Ｌｙｓ（Ｂ２９）ジマルトースヒトインスリン、Ｇｌｙ（Ａ１），Ｐｈｅ（Ｂ１）ジラクトースヒトインスリン、Ｇｌｙ（Ａ１），Ｌｙｓ（Ｂ２９）ジラクトースヒトインスリン、Ｐｈｅ（Ｂ１），Ｌｙｓ（Ｂ２９）ジラクトースヒトインスリン、Ｇｌｙ（Ａ１），Ｐｈｅ（Ｂ１）ジマルトトリオースヒトインスリン、Ｇｌｙ（Ａ１），Ｌｙｓ（Ｂ２９）ジマルトトリオースヒトインスリン、Ｐｈｅ（Ｂ１），Ｌｙｓ（Ｂ２９）ジマルトトリオースヒトインスリン、Ｐｈｅ（Ｂ１），Ｇｌｙ（Ａ１）ジマンノースヒトインスリン、Ｐｈｅ（Ｂ１），Ｌｙｓ（Ｂ２９）ジマンノースヒトインスリン、Ｇｌｙ（Ａ１），Ｌｙｓ（Ｂ２９）ジマンノースヒトインスリン、Ｐｈｅ（Ｂ１），Ｇｌｙ（Ａ１）ジガラクトースヒトインスリン、Ｐｈｅ（Ｂ１），Ｌｙｓ（Ｂ２９）ジガラクトースヒトインスリン、Ｇｌｙ（Ａ１），Ｌｙｓ（Ｂ２９）ジガラクトースヒトインスリン、Ｐｈｅ（Ｂ１），Ｇｌｙ（Ａ１）ジイソマルトースヒトインスリン、Ｐｈｅ（Ｂ１），Ｌｙｓ（Ｂ２９）ジイソマルトースヒトインスリン、Ｇｌｙ（Ａ１），Ｌｙｓ（Ｂ２９）ジイソマルトースヒトインスリン、Ｐｈｅ（Ｂ１）グルコース［ＡｓｐＢ１０］ヒトインスリン及びＧｌｙ（Ａ１），Ｐｈｅ（Ｂ１）ジグルコース［ＡｓｐＢ１０］ヒトインスリンである。
出典明示によりここに援用される国際公開第８８／０６５９９９号（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）は、Ａｎｓ２１Ａが他のアミノ酸残基で置換されている安定化されたインスリン化合物を開示している。特に挙げることができるものは、ＧｌｙＡ２１ヒトインスリン、ＡｌａＡ２１ヒトインスリン、ＳｅｒＡ２１ヒトインスリン、ＴｈｒＡ２１ヒトインスリン及びｈＳｅｒＡ２１ヒトインスリンである。
出典明示によりここに援用される欧州特許出願公開第２５４５１６号（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）は、塩基性アミノ酸残基が中性アミノ酸残基によって置換された延長された作用を有するインスリン化合物を開示している。特に挙げることができるものは、
ＧｌｙＡ２１，ＬｙｓＢ２７，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＳｅｒＡ２１，ＬｙｓＢ２７，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＴｈｒＡ２１，ＬｙｓＢ２７，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＡｌａＢ２１，ＬｙｓＢ２７，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＨｉｓＡ２１，ＬｙｓＢ２７，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＡｓｐＢ２１，ＬｙｓＢ２７，ＴｈｒＢ３０−ＮＮ２ヒトＩｎｓｕｌｉｎ，ＧｌｙＡ２１，ＡｒｇＢ２１，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＳｅｒＡ２１，ＡｒｇＢ２７，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＴｈｒＡ２１，ＡｒｇＢ２７，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＡｌａＢ２１，ＡｒｇＢ２７，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＨｉｓＡ２１，ＡｒｇＢ２７，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＡｓｐＢ２１，ＡｒｇＢ２７，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＧｌｎＢ１３，ＧｌｙＡ２１，ＡｒｇＢ２７，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＧｌｎＢ１３，ＳｅｒＡ２１，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＧｌｎＢ１３，ＳｅｒＡ２１，ＡｒｇＢ２７，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＧｌｎＢ１３，ＴｈｒＡ２１，ＡｒｇＢ２７，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＧｌｎＢ１３，ＡｌａＡ２１，ＡｒｇＢ２７，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＧｌｎＢ１３，ＨｉｓＡ２１，ＡｒｇＢ２７，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＧｌｎＢ１３，ＡｓｐＡ２１，ＡｒｇＢ２７，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＧｌｎＢ１３，ＧｌｙＡ２１，ＬｙｓＢ２７，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＧｌｎＢ１３，ＳｅｒＡ２１，ＬｙｓＢ２７，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＧｌｎＢ１３，ＴｈｒＡ２１，ＬｙｓＢ２７，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＧｌｎＢ１３，ＡｌａＡ２１，ＬｙｓＢ２７，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＧｌｎＢ１３，ＨｉｓＡ２１，ＬｙｓＢ２７，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＧｌｎＢ１３，ＡｓｐＡ２１，ＬｙｓＢ２７，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＡｓｎＡ２１，ＬｙｓＢ２７ヒトインスリン、ＳｅｒＡ２１，ＬｙｓＢ２７ヒトインスリン、ＴｈｒＡ２１，ＬｙｓＢ２７ヒトインスリン、ＡｌａＡ２１，ＬｙｓＢ２７ヒトインスリン、ＨｉｓＡ２１，ＬｙｓＢ２７ヒトインスリン、ＡｓｐＡ２１，ＬｙｓＢ２７ヒトインスリン、ＧｌｙＡ２１，ＬｙｓＢ２７ヒトインスリン、ＡｓｎＡ２１，ＡｒｇＢ２７ヒトインスリン、ＳｅｒＡ２１，ＡｒｇＢ２７ヒトインスリン、ＴｈｒＡ２１，ＡｒｇＢ２７ヒトインスリン、ＡｌａＡ２１，ＡｒｇＢ２７ヒトインスリン、ＨｉｓＡ２１，ＡｒｇＢ２７ヒトインスリン、ＡｓｐＡ２１，ＡｒｇＢ２７ヒトインスリン、ＧｌｙＡ２１，ＡｒｇＢ２７ヒトインスリン、ＧｌｎＡ１７，ＡｓｎＡ２１，ＡｒｇＢ２７ヒトインスリン、ＧｌｎＡ１７，ＳｅｒＡ２１，ＡｒｇＢ２７ヒトインスリン、ＧｌｎＡ１７，ＴｈｒＡ２１，ＡｒｇＢ２７ヒトインスリン、ＧｌｎＡ１７，ＡｌａＡ２１，ＡｒｇＢ２７ヒトインスリン、ＧｌｎＡ１７，ＨｉｓＡ２１，ＡｒｇＢ２７ヒトインスリン、ＧｌｎＡ１７，ＡｓｐＡ２１，ＡｒｇＢ２７ヒトインスリン、ＧｌｎＡ１７，ＧｌｙＡ２１，ＡｒｇＢ２７ヒトインスリン、ＧｌｎＡ１７，ＡｓｎＡ２１，ＧｌｎＢ１３ヒトインスリン、ＧｌｎＡ１７，ＳｅｒＡ２１，ＧｌｎＢ１３ヒトインスリン、ＧｌｎＡ１７，ＴｈｒＡ２１，ＧｌｎＢ１３ヒトインスリン、ＧｌｎＡ１７，ＡｌａＡ２１，ＧｌｎＢ１３ヒトインスリン、ＧｌｎＡ１７，ＨｉｓＡ２１，ＧｌｎＢ１３ヒトインスリン、ＧｌｎＡ１７，ＡｓｐＡ２１，ＧｌｎＢ１３ヒトインスリン、ＧｌｎＡ１７，ＧｌｙＡ２１，ＧｌｎＢ１３ヒトインスリン、ＡｒｇＡ２７，ＡｓｎＡ２１，ＧｌｎＢ１３ヒトインスリン、ＡｒｇＡ２７，ＳｅｒＡ２１，ＧｌｎＢ１３ヒトインスリン、ＡｒｇＡ２７，ＴｈｒＡ２１，ＧｌｎＢ１３ヒトインスリン、ＡｒｇＡ２７，ＡｌａＡ２１，ＧｌｎＢ１３ヒトインスリン、ＡｒｇＡ２７，ＨｉｓＡ２１，ＧｌｎＢ１３ヒトインスリン、ＡｒｇＡ２７，ＡｓｐＡ２１，ＧｌｎＢ１３ヒトインスリン、ＡｒｇＡ２７，ＧｌｙＡ２１，ＧｌｎＢ１３ヒトインスリン、ＧｌｎＡ１７，ＡｓｎＡ２１，ＬｙｓＢ２７ヒトインスリン、ＧｌｎＡ１７，ＳｅｒＡ２１，ＬｙｓＢ２７ヒトインスリン、ＧｌｎＡ１７，ＴｈｒＡ２１，ＬｙｓＢ２７ヒトインスリン、ＧｌｎＡ１７，ＡｌａＡ２１，ＬｙｓＢ２７ヒトインスリン、ＧｌｎＡ１７，ＨｉｓＡ２１，ＬｙｓＢ２７ヒトインスリン、ＧｌｎＡ１７，ＡｓｐＡ２１，ＬｙｓＢ２７ヒトインスリン、ＧｌｎＡ１７，ＧｌｙＡ２１，ＬｙｓＢ２７ヒトインスリン、ＧｌｎＢ１３，ＡｓｎＡ２１，ＬｙｓＢ２７ヒトインスリン、ＧｌｎＢ１３，ＳｅｒＡ２１，ＬｙｓＢ２７ヒトインスリン、ＧｌｎＢ１３，ＴｈｒＡ２１，ＬｙｓＢ２７ヒトインスリン、ＧｌｎＢ１３，ＡｌａＡ２１，ＬｙｓＢ２７ヒトインスリン、ＧｌｎＢ１３，ＨｉｓＡ２１，ＬｙｓＢ２７ヒトインスリン、ＧｌｎＢ１３，ＡｓｐＡ２１，ＬｙｓＢ２７ヒトインスリン、及びＧｌｎＢ１３，ＧｌｙＡ２１，ＬｙｓＢ２７ヒトインスリンである。
出典明示によりここに援用される欧州特許出願公開第２１４８２６号（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）は速効性インスリン化合物を開示している。
出典明示によりここに援用される欧州特許出願公開第１９４８６４号（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）は、塩基性アミノ酸残基が中性アミノ酸残基によって置換された延長された作用を有するインスリン化合物を開示している。特に挙げることができるものは、ＧｌｎＡ１７，ＡｒｇＢ２７，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＧｌｎＡ１７，ＧｌｎＢ１３，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＧｌｎＡ１７，ＬｙｓＢ２７，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＧｌｎＡ１７，ＬｙｓＢ２７−ＮＨ２ヒトインスリン、ＧｌｎＡ１７，ＧｌｎＡ１７，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＧｌｎＢ１３，ＡｒｇＢ２７，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＧｌｎＢ１３，ＬｙｓＢ２７，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＧｌｎＢ１３，ＬｙｓＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＧｌｎＢ１３，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＡｒｇＢ２７，ＡｒｇＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＡｒｇＢ２７，ＬｙｓＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＡｒｇＢ２７，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＬｙｓＢ２７，ＡｒｇＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＬｙｓＢ２７，ＬｙｓＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＬｙｓＢ２７，ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＬｙｓＢ２９−ＮＨ２，ｄｅｓ−（Ｂ３０）ヒトインスリン、ＴｈｒＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＬｙｓＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＬｙｓＢ３０（Ｌａｕ）−ＮＨ２ヒトインスリン、ＬｙｓＢ３０，ＡｒｇＢ３１−ＮＨ２ヒトインスリン、ＬｙｓＢ３０，ＬｙｓＢ３１−ＮＨ２ヒトインスリン、ＡｒｇＢ３０−ＮＨ２ヒトインスリン、ＡｒｇＢ３０，ＡｒｇＢ３１−ＮＨ２ヒトインスリン、及びＡｒｇＢ３０，ＬｙｓＢ３１−ＮＨ２ヒトインスリンである。
出典明示によりここに援用される米国特許第３５２８９６０号（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）は、インスリン分子の一、二又は三の第１級アミノ基がカルボキシアロイル基を有しているＮ−カルボキシアロイルインスリン化合物を開示している。
出典明示によりここに援用される英国特許第１４９２９９７号（Ｎａｔ．Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．Ｃｏｒｐ．）は低血糖効果の改善されたプロファイルを有するカルバミル置換をＮεＢ２９に持つインスリン化合物を開示している。
出典明示によりここに援用される特開平１−２５４６９９号公報（Ｋｏｄａｍａ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）は、アルカノイル基がＰｈｅＢ１のアミノ基又はＬｙｓＢ２９のεアミノ基又はこれらの双方に結合しているインスリン化合物を開示している。
出典明示によりここに援用される特開昭５７−０６７５４８号公報（Ｓｈｉｏｎｏｇｉ）は、Ｂ３０位が、ヌクレオチドトリプレットによって必ずしもコードされ得ない少なくとも５つの炭素原子を有するアミノ酸を有するインスリン化合物を開示している。
出典明示によりここに援用される国際公開第０３／０５３３３９号（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）は、インスリン化合物を開示している。Ｎ末端のＡ鎖が２つのアミノ酸残基Ａ−１及びＡ０だけ延長され、Ｂ鎖のＮ末端が２つのアミノ酸残基Ｂ−１及びＢ０だけ延長され、Ｂ２８、Ｂ２９及びＢ３９位のアミノ酸残基が置換され、Ｂ２８又はＢ２９位のＬｙｓのεアミノ基が正に荷電したアミノ酸のαカルボキシル基に共有的に結合されてＬｙｓ−Ｎε−アミノ酸誘導体が形成される。特に挙げることができるものは、Ａ−１及びＢ−１が共に存在せず、Ａ０がＡｒｇを表し、Ｂ０がＡｒｇを表すか又は存在しない該アナログである。
ｉ）Ｂ２８位がＡｓｐ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、又はＡｌａであり、Ｂ２９位がＬｙｓ又はＰｒｏであるアナログ；及びｉｉ）ｄｅｓ（Ｂ２８−Ｂ３０）、ｄｅｓ（Ｂ２７）又はｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリンからなる群から選択されるインスリン化合物をまた本発明の方法に利用することができ、特にＢ２８位がＡｓｐ又はＬｙｓであり、Ｂ２９位がＬｙｓ又はＰｒｏであるインスリン化合物である。
他の利用可能なインスリン化合物は、Ｂ２９−Ｎε−ミリストイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、Ｂ２９−Ｎε−パルミトイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、Ｂ２９−Ｎε−ミリストイルヒトインスリン、Ｂ２９−Ｎε−パルミトイルヒトインスリン、Ｂ２８−Ｎε−ミリストイルＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ヒトインスリン、Ｂ２８−Ｎε−パルミトイルＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ヒトインスリン、Ｂ３０−Ｎε−ミリストイル−ＴｈｒＢ２９ＬｙｓＢ３０ヒトインスリン、Ｂ３０−Ｎε−パルミトイル−ＴｈｒＢ２９ＬｙｓＢ３０ヒトインスリン、Ｂ２９−Ｎε−（Ｎ−パルミトイル−γ−グルタミル）−ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、Ｂ２９−Ｎε−（Ｎ−リトコリル−γ−グルタミル）−ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、Ｂ２９−Ｎε−（ω−カルボキシへプタデカノイル）−ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、Ｂ２９−Ｎε−（ω−カルボキシへプタデカノイル）ヒトインスリン及びＢ２９−Ｎε−ミリストイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリンからなる群から選択される。
本発明の方法から恩恵を受けうる他のタンパク質ＧＬＰ−１である。本発明の方法において利用できるＧＬＰ−１の例は、ヒトＧＬＰ−１及びＧＬＰ−１化合物を含む。ヒトＧＬＰ−１は、とりわけ回腸遠位部、膵臓及び脳内のＬ細胞中で合成されるプレプログルカゴン由来の３７アミノ酸残基のタンパク質である。ＧＬＰ−１はグルコース代謝及び消化管分泌及び代謝において調節機能を有する重要な消化管ホルモンである。ＧＬＰ−１（７−３６）−アミド、ＧＬＰ−１（７−３７）及びＧＬＰ−２を生じるプレプログルカゴンのプロセシングは主としてＬ細胞中で起こる断片ＧＬＰ−１（７−３６）−アミド及びＧＬＰ−１（７−３７）は共にグルコース依存性インスリン分泌性薬剤である。過去数十年においてＧＬＰ−１の多くの構造アナログがヒーラ・モンスターリザード（アメリカドクトカゲ及びメキシコドクトカゲ）の毒から単離されている。エキセンディン−４はメキシコドクトカゲの毒から単離された３９アミノ酸残基のタンパク質であり、このタンパク質はＧＬＰ−１と５２％の相同性を共有する。エキセンディン−４は、インスリン放出を刺激し、イヌに注射された場合に血中ブドウ糖量の低下を確実にすることが示されている強力なＧＬＰ−１レセプターアゴニストである。ＧＬＰ−１（１−３７）及びエキセンディン−４（１−３９）のグループ及びそのある種の断片、アナログ及び誘導体（ここではＧＬＰ−１化合物と命名される）は強力なインスリン分泌性剤であり、それらは全て本発明の方法で利用可能である。ＧＬＰ−１（１−３７）のインスリン分泌性断片は、配列全体をＧＬＰ−１（１−３７）の配列に見出すことができ、少なくとも一つの末端アミノ酸が欠失されているインスリン分泌性タンパク質である。ＧＬＰ−１（１−３７）のインスリン分泌性断片の例は、ＧＬＰ−１（１−３７）の１−６位のアミノ酸残基が欠失されたＧＬＰ−１（７−３７）、及びＧＬＰ−１（１−３７）の１−６及び３７位のアミノ酸残基が欠失されたＧＬＰ−１（７−３６）である。エキセンディン−４（１−３９）のインスリン分泌性断片の例は、エキセンディン−４（１−３８）及びエキセンディン−４（１−３１）である。ある化合物のインスリン分泌性特性は、当該分野でよく知られているインビボ又はインビトロアッセイによって決定することができる。例えば、化合物が動物に投与され、経時的にインスリン濃度がモニターされうる。ＧＬＰ−１（１−３７）及びエキセンディン−４（１−３９）のインスリン分泌性アナログは、アミノ酸残基の一又は複数が他のアミノ酸残基と交換され、及び／又は一又は複数のアミノ酸残基が欠失され、及び／又は一又は複数のアミノ酸残基が付加され、但し、上記アナログの何れもインスリン分泌性であるか又はインスリン分泌性化合物のプロドラッグである各分子を意味する。ＧＬＰ−１（１−３７）のインスリン分泌性アナログの例は、例えば８位のアラニンがメチオニンに置換され、１から６位のアミノ酸残基が欠失されたＭεｔ８−ＧＬＰ−１（７−３７）、及び３４位のバリンがアルギニンに置換され、１から６位のアミノ酸残基が欠失されたＡｒｇ３４−ＧＬＰ−１（７−３７）である。エキセンディン−４（１−３９）のインスリン分泌性アナログの例は、２及び３位のアミノ酸残基がセリン及びアスパラギン酸でそれぞれ置き換えられているＳｅｒ２Ａｓｐ３−エキセンディン−４（１−３９）である（この特定のアナログは当該分野でまたエキセンディン−３としても知られている）。ＧＬＰ−１（１−３７）、エキセンディン−４（１−３９）及びそのアナログのインスリン分泌性誘導体は、当業者がこれらのペプチドの誘導体である、すなわち親ペプチドには存在していない少なくとも一置換基を有しているが、但し該誘導体はインスリン分泌性であるか又はインスリン分泌性化合物のプロドラッグであると考えるものである。置換基の例は、アミド、炭水化物、アルキル基及び親油性置換基である。ＧＬＰ−１（１−３７）、エキセンディン−４（１−３９）及びそのアナログのインスリン分泌性誘導体の例は、ＧＬＰ−１（７−３６）−アミド、Ａｒｇ３４，Ｌｙｓ２６（Ｎε−（ｇ−Ｇｌｕ（Ｎα−ヘキサデカノイル）））−ＧＬＰ−１（７−３７）及びＴｙｒ３１−エキセンディン−４（１−３１）−アミドである。ＧＬＰ−１（１−３７）、エキセンディン−４（１−３９）、そのインスリン分泌性断片、そのインスリン分泌性アナログ及びそのインスリン分泌性誘導体の更なる例は、全てが出典明示によりここに援用される国際公開第９８／０８８７１号、国際公開第９９／４３７０６号、米国特許第５４２４２８６号及び国際公開第００／０９６６６号に記載されている。
本発明の方法から恩恵を受けうる他のタンパク質はＧＬＰ−２である。
ＧＬＰ−２及びＧＬＰ−２化合物はまた本発明によって提供される方法によって修飾されうる。本文脈において、ＧＬＰ−２化合物は、好ましくは１μＭ以下、例えば１００ｎＭ以下の親和定数（ＫＤ）又は効力（ＥＣ５０）でＧＬＰ−２レセプターに結合する。「ＧＬＰ−２化合物」なる用語は、一又は複数のアミノ酸残基が欠失され、及び／又は天然又は非天然の他のアミノ酸残基によって置換されたヒトＧＬＰ−２、及び／又は更なるアミノ酸残基を含むヒトＧＬＰ−２、及び／又はアミノ酸残基の一又は複数に少なくとも一つの有機置換基が結合しているヒトＧＬＰ−２を示すものである。特に、アミノ酸配列が３３の連続したアミノ酸の任意の配列においてヒトＧＬＰ−２のアミノ酸配列の６０％を超えるタンパク質が考慮される。また４つまでのアミノ酸がアミノ酸配列から欠失される場合に、アミノ酸配列が３７の連続したアミノ酸の任意の配列においてヒトＧＬＰ−２のアミノ酸配列の６０％を超えるタンパク質が考慮される。また２つまでのアミノ酸がそのアミノ酸配列に付加される場合に、アミノ酸配列が３１の連続したアミノ酸の任意の配列においてＧＬＰ−２のアミノ酸配列の６０％を超えるタンパク質が考慮される。「ＧＬＰ化合物」なる用語はまた一個体から他の個体へと存在し発生する天然の対立遺伝子変異を含む。また、グリコシル化又は他の翻訳後修飾の度合い及び位置は、選択される宿主細胞及び宿主細胞の環境の性質に応じて変わりうる。
本発明によって使用することができる候補ＧＬＰ−２化合物には、出典明示により全てがここに援用される国際公開第９６／３２４１４号、国際公開第９７／３９０３１号、国際公開第９８／０３５４７号、国際公開第９６／２９３４２号、国際公開第９７／３１９４３号、国際公開第９８／０８８７２号に記載されたＧＬＰ−２化合物が含まれる。
特に、次のＧＬＰ−２化合物を本発明の方法において利用できる。Ａ２Ｇ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｓ５Ｋ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｓ７Ｋ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｄ８Ｋ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｅ９Ｋ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｍ１０Ｋ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｎ１１Ｋ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｔ１２Ｋ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｉ１３Ｋ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｌ１４Ｋ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｄ１５Ｋ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｎ１６Ｋ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｌ１７Ｋ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ａ１８Ｋ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｄ２１Ｋ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｎ２４Ｋ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｑ２８Ｋ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｓ５Ｋ／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｓ７Ｋ／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｄ８Ｋ／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｅ９Ｋ／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｍ１０Ｋ／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｎ１１Ｋ／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｔ１２Ｋ／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｉ１３Ｋ／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｌ１４Ｋ／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｄ１５Ｋ／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｎ１６Ｋ／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｌ１７Ｋ／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ａ１８Ｋ／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｄ２１Ｋ／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｎ２４Ｋ／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｑ２８Ｋ／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｋ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｄ３Ｅ／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｄ３Ｅ／Ｓ５Ｋ／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｄ３Ｅ／Ｓ７Ｋ／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｄ３Ｅ／Ｄ８Ｋ／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｄ３Ｅ／Ｅ９Ｋ／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｄ３Ｅ／Ｍ１０Ｋ／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｄ３Ｅ／Ｎ１１Ｋ／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｄ３Ｅ／Ｔ１２Ｋ／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｄ３Ｅ／Ｉ１３Ｋ／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｄ３Ｅ／Ｌ１４Ｋ／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｄ３Ｅ／Ｄ１５Ｋ／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｄ３Ｅ／Ｎ１６Ｋ／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｄ３Ｅ／Ａ１８Ｋ／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｄ３Ｅ／Ｄ２１Ｋ／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｄ３Ｅ／Ｎ２４Ｋ／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；及びＤ３Ｅ／Ｑ２８Ｋ／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）。
ＧＬＰ−２タンパク質にただ一つの親油性置換基が結合したＧＬＰ−２誘導体もまた本発明の方法において利用することができ、例えば親油性置換基が４から４０の炭素原子、例えば８から２５の炭素原子、例えば１２から２０の炭素原子を有するＧＬＰ−２誘導体である。
次のリストは、本発明の方法において特に利用できるＧＬＰ−２誘導体を含む：
Ｓ５Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｓ７Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ８Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｅ９Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｍ１０Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｎ１１Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｔ１２Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｉ１３Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１４Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ１５Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｎ１６Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（３−（オクタノイルアミノ）プロピオニル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（３−（ノナノイルアミノ）プロピオニル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（３−（デカノイルアミノ）プロピオニル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（３−（ウンデカノイルアミノ）プロピオニル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（３−（ドデカノイルアミノ）プロピオニル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（３−（トリデカノイルアミノ）プロピオニル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（３−（テトラデカノイルアミノ）プロピオニル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（３−（ペンタデカノイルアミノ）プロピオニル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（３−（ヘプタデカノイルアミノ）プロピオニル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（３−（オクタデカノイルアミノ）プロピオニル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（３−（ノナデカノイルアミノ）プロピオニル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（３−（エイコサノイルアミノ）プロピオニル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（オクタノイルアミノ）ブタノイル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（ノナノイルアミノ）ブタノイル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（デカノイルアミノ）ブタノイル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（ウンデカノイルアミノ）ブタノイル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（ドデカノイルアミノ）ブタノイル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（トリデカノイルアミノ）ブタノイル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（テトラデカノイルアミノ）ブタノイル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（ペンタデカノイルアミノ）ブタノイル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（ヘキサデカノイルアミノ）ブタノイル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（ヘプタデカノイルアミノ）ブタノイル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（オクタデカノイルアミノ）ブタノイル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（ノナデカノイルアミノ）ブタノイル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（エイコサノイルアミノ）ブタノイル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（４−（オクタノイルアミノ）ブタノイル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（４−（ノナノイルアミノ）ブタノイル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（４−（デカノイルアミノ）ブタノイル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（４−（ウンデカノイルアミノ）ブタノイル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（４−（ドデカノイルアミノ）ブタノイル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（４−（トリデカノイルアミノ）ブタノイル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（４−（テトラデカノイルアミノ）ブタノイル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（４−（ペンタデカノイルアミノ）ブタノイル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（４−（ヘキサデカノイルアミノ）ブタノイル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（４−（ヘプタデカノイルアミノ）ブタノイル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（４−（オクタデカノイルアミノ）ブタノイル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（４−（ノナデカノイルアミノ）ブタノイル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（４−（エイコサノイルアミノ）ブタノイル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ａ１８Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ２１Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｎ２４Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｑ２８Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｓ５Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｓ７Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ８Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｅ９Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｍ１０Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｎ１１Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｔ１２Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｉ１３Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１４Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ１５Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｎ１６Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（３−（オクタノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（３−（ノナノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（３−（デカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（３−（ウンデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（３−（ドデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（３−（トリデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（３−（テトラデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（３−（ペンタデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（３−（ヘプタデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（３−（オクタデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（３−（ノナデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（３−（エイコサノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（オクタノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（ノナノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（デカノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（ウンデカノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（ドデカノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（トリデカノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（テトラデカノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（ペンタデカノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（ヘキサデカノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（ヘプタデカノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（オクタデカノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（ノナデカノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（エイコサノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（４−（オクタノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（４−（ノナノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（４−（デカノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（４−（ウンデカノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（４−（ドデカノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（４−（トリデカノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（４−（テトラデカノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（４−（ペンタデカノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（４−（ヘキサデカノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（４−（ヘプタデカノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（４−（オクタデカノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（４−（ノナデカノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌ１７Ｋ（４−（エイコサノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ａ１８Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ２１Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｎ２４Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｑ２８Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｓ５Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｓ７Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｄ８Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｅ９Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｍ１０Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｎ１１Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｔ１２Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｉ１３Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１４Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｄ１５Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｎ１６Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ（３−（オクタノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ（３−（ノナノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ（３−（デカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ（３−（ウンデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ（３−（ドデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ（３−（トリデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ（３−（テトラデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ（３−（ペンタデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ（３−（ヘプタデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ（３−（オクタデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ（３−（ノナデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ（３−（エイコサノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ（（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（オクタノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ（（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（ノナノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ（（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（デカノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ（（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（ウンデカノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ（（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（ドデカノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ（（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（トリデカノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ（（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（テトラデカノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ（（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（ペンタデカノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ（（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（ヘキサデカノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ（（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（ヘプタデカノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ（（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（オクタデカノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ（（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（ノナデカノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ（（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（エイコサノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ（４−（オクタノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ（４−（ノナノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ（４−（デカノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ（４−（ウンデカノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ（４−（ドデカノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ（４−（トリデカノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ（４−（テトラデカノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ（４−（ペンタデカノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ（４−（ヘキサデカノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ（４−（ヘプタデカノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ（４−（オクタデカノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ（４−（ノナデカノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｌ１７Ｋ（４−（エイコサノイルアミノ）ブタノイル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ａ１８Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｄ２１Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｄ３Ｅ／Ｎ２４Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）；及び
Ｄ３Ｅ／Ｑ２８Ｋ（３−（ヘキサデカノイルアミノ）プロピオニル）／Ｋ３０Ｒ／Ｄ３３Ｅ−ＧＬＰ−２（１−３３）。
本発明の方法から恩恵を受けうる他のタンパク質は第ＶＩＩ因子である。本発明の方法において利用可能な第ＶＩＩ因子化合物は、野生型第ＶＩＩ因子（つまり、米国特許第４７８４９５０号に開示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド）、並びに野生型第ＶＩＩ因子に対して実質的に同じか改善された生物学的活性を示す第ＶＩＩ因子の変異体、第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド並びに第ＶＩＩ因子誘導体及び第ＶＩＩ因子コンジュゲートを包含する。「第ＶＩＩ因子化合物」なる用語は、その未切断（チモーゲン）形態の第ＶＩＩ因子ポリペプチド、並びにそのそれぞれの生物活性形態を生じるようにタンパク分解的にプロセシングされたもの（これは第ＶＩＩａ因子と命名されうる）を包含するものである。典型的には、第ＶＩＩ因子は残基１５２及び１５３の間で切断されて第ＶＩＩａ因子を生じる。かかる第ＶＩＩ因子の変異体は、安定性、リン脂質結合性、改変された特異的活性等を含み、ヒト第ＶＩＩ因子に対して異なった性質を示しうる。
ここで使用される場合、「第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド」は、第ＶＩＩａ因子の生物学的活性が野生型第ＶＩＩａ因子の活性に対して実質的に改変され又は低減されている変異体を含むポリペプチドを包含する。これらのポリペプチドには、限定するものではないが、ポリペプチドの生物活性を変更し又は乱す特異的なアミノ酸配列改変が導入されている第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩａ因子が含まれる。
ここで使用される「第ＶＩＩ因子誘導体」なる用語は、野生型第ＶＩＩ因子、野生型第ＶＩＩ因子及び第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドに対して実質的に同じか改善された生物学的活性を示す第ＶＩＩ因子の変異体を示すものであり、親タンパク質の一又は複数のアミノ酸が、例えばアルキル化、グリコシル化、ＰＥＧ化、アシル化、エステル形成又はアミド形成等、化学的修飾されている。限定されるものではないが、これにはＰＥＧ化されたヒト第ＶＩＩａ因子、システイン−ＰＥＧ化ヒト第ＶＩＩａ因子及びその変異体が含まれる。
「ＰＥＧ化ヒト第ＶＩＩａ因子」なる用語は、ヒト第ＶＩＩａ因子ポリペプチドに修飾されたＰＥＧ分子を有するヒト第ＶＩＩａ因子を意味する。ＰＥＧ分子が、第ＶＩＩａ因子ポリペプチドの任意のアミノ酸残基又は糖鎖部分を含む第ＶＩＩａ因子ポリペプチドの任意の部分に付加できることが理解されなければならない。「システイン−ＰＥＧ化ヒト第ＶＩＩａ因子」なる用語は、ヒト第ＶＩＩａ因子に導入されたシステインのスルフヒドリル基に結合するＰＥＧ分子を有する第ＶＩＩａ因子を意味する。
血液凝固における第ＶＩＩａ因子の生物学的活性は、（ｉ）組織因子（ＴＦ）に結合し、（ｉｉ）第ＩＸ因子又は第Ｘ因子のタンパク分解性切断を触媒して活性化された第ＩＸ又はＸ因子（それぞれ第ＩＸａ又はＸａ因子）を生産するその能力から誘導される。本発明の目的のために、第ＶＩＩａ因子の生物学的活性は、例えば米国特許第５９９７８６４号に記載されているように、第ＶＩＩ因子欠損血漿及びトロンボプラスチンを使用して調製物の血液凝固を促進する能力を測定することによって定量化されうる。このアッセイにおいて、生物学的活性は、コントロール試料に対する凝固時間の減少として表され、１単位／ｍｌの第ＶＩＩ因子活性を含むプール化ヒト血清標準との比較により、「第ＶＩＩ因子単位」に転換される。あるいは、第ＶＩＩａ因子の生物学的活性は、（ｉ）脂質膜に包埋されたＴＦ及び第Ｘ因子を含む系における第ＶＩＩａ因子の第Ｘａ因子生産能の測定（Ｐｅｒｓｓｏｎ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１９９１９−１９９２４，１９９７）；（ｉｉ）水性の系における第Ｘ因子の加水分解の測定；（ｉｉｉ）表面プラズモン共鳴に基づく機器を用いたそのＴＦへの物理的な結合の測定（Ｐｅｒｓｓｏｎ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ．４１３：３５９−３６３，１９９７）及び（ｉｖ）合成基質の加水分解の測定によって、定量化されうる。
野生型第ＶＩＩａ因子に対して実質的に同じか又は改善された生物活性を有する第ＶＩＩ因子変異体は、上述のような凝固アッセイ、タンパク質分解アッセイ、又はＴＦ結合アッセイの一又は複数で試験した場合に、同じ細胞型で生産された第ＶＩＩａ因子の特異的活性の少なくとも約２５％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましくは少なくとも約９０％を示すものを包含する。野生型第ＶＩＩａ因子に対して実質的に低減した生物活性を有する第ＶＩＩ因子変異体は、上述のような凝固アッセイ、タンパク質分解アッセイ、又はＴＦ結合アッセイの一又は複数で試験した場合に、同じ細胞型で生産された野生型第ＶＩＩａ因子の特異的活性の約２５％未満、好ましくは約１０％未満、より好ましくは約５％未満、最も好ましくは約１％未満を示すものを包含する。限定するものではないが、野生型第ＶＩＩ因子に対して実質的に改変された生物活性を有する第ＶＩＩ因子変異体には、ＴＦ独立性第Ｘ因子タンパク分解活性を示す第ＶＩＩ因子変異体及びＴＦに結合するが第Ｘ因子を切断しないものが含まれる。
野生型第ＶＩＩ因子と実質的に同じかより良好な生物活性を示すにせよ、あるいは野生型第ＶＩＩ因子に対して実質的に改変されているか減少した生物活性を示すにせよ、第ＶＩＩ因子の変異体には、限定するものではないが、野生型第ＶＩＩ因子の配列とは一又は複数のアミノ酸の挿入、欠失、又は置換が異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。
ここで使用される「変異体」又は「変異体群」なる用語は、その親タンパク質の一又は複数のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されており、及び／又はその親タンパク質の一又は複数のアミノ酸が欠失されており、及び／又は一又は複数のアミノ酸がタンパク質に挿入されており、及び／又は一又は複数のアミノ酸が親タンパク質に付加されている野生型ＶＩＩ因子の配列を有するＶＩＩ因子を示すことを意図している。かかる付加は親タンパク質のＮ末端又はＣ末端の何れか又は双方において生じうる。この定義内の「変異体」又は「変異体群」はその活性化型においてＦＶＩＩ活性を尚も有している。一実施態様では、変異体は野生型ＶＩＩ因子の配列と７０％同一である。一実施態様では、変異体は野生型ＶＩＩ因子の配列と８０％同一である。他の実施態様では、変異体は野生型ＶＩＩ因子の配列と９０％同一である。更なる実施態様では、変異体は野生型ＶＩＩ因子の配列と９５％同一である。
第ＶＩＩ因子変異体の非限定的例には、Ｓ５２Ａ−ＦＶＩＩａ、Ｓ６０Ａ−ＦＶＩＩａ（Ｌｉｎｏ等，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３５２：１８２−１９２，１９９８）；米国特許第５５８０５６０号に開示されている増加したタンパク分解安定性を示すＦＶＩＩａ変異体；残基２９０と２９１の間、又は残基３１５と３１６の間が、タンパク分解的に切断された第ＶＩＩａ因子（Ｍｏｌｌｅｒｕｐ等，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．４８：５０１−５０５，１９９５）；第ＶＩＩａ因子の酸化型（Ｋｏｒｎｆεｌｔ等，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３６３：４３−５４，１９９９）；ＰＣＴ／ＤＫ０２／００１８９に開示されているＦＶＩＩ変異体；国際公開第０２／３８１６２号に開示されている増加したタンパク分解安定性を示すＦＶＩＩ変異体（Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；国際公開第９９／２０７６７号（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）に開示された修飾されたＧｌａ−ドメインを有し、亢進された膜結合性を示すＦＶＩＩ変異体；及び国際公開第０１／５８９３５号（Ｍａｘｙｇｅｎ ＡｐＳ）に開示されたＦＶＩＩ変異体が含まれる（文献の全てが出典明示によりここに援用される）。
特に挙げることができるものは、野生型ＦＶＩＩａと比較して増加した生物活性を有するＦＶＩＩ変異体で、国際公開第０１／８３７２５号、国際公開第０２／２２７７６号、国際公開第０２／０７７２１８号、ＰＣＴ／ＤＫ０２／００６３５、デンマーク特許出願第ＰＡ２００２０１４２３号、デンマーク特許出願第ＰＡ２００１０１６２７号；国際公開第０２／３８１６２号（Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）に開示されたＦＶＩＩ変異体；及びＪＰ２００１０６１４７９（Ｃｈｅｍｏ−Ｓｅｒｏ−Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｒｅｓ Ｉｎｓｔ．）に開示された亢進活性を有するＦＶＩＩａ変異体を含む（文献の全てが出典明示によりここに援用される）。
野生型第ＶＩＩ因子に対して実質的に減少した又は改変された生物活性を有する第ＶＩＩ因子変異体の例は、Ｒ１５２Ｅ−ＦＶＩＩａ（Ｗｉｌｄｇｏｏｓｅ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ２９：３４１３−３４２０，１９９０）、Ｓ３４４Ａ−ＦＶＩＩａ（Ｋａｚａｍａ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：６６−７２，１９９５）、ＦＦＲ−ＦＶＩＩａ（Ｈｏｌｓｔ等，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｅｎｄｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１５：５１５−５２０，１９９８）、及びＧｌａドメインを欠く第ＶＩＩａ因子（Ｎｉｃｏｌａｉｓｅｎ等，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ．３１７：２４５−２４９，１９９３）を含む（文献の全てが出典明示によりここに援用される）。
第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの変異体の例には、野生型第ＶＩＩ因子、Ｌ３０５Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｍ３０６Ｄ／Ｄ３０９Ｓ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｉ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｐ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ１５７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｋ−ＦＶＩＩ、及びＳ３３６Ｇ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３１６Ｈ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３１６Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｓ３１４Ｅ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８
Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｓ５２Ａ−第ＶＩＩ因子、Ｓ６０Ａ−第ＶＩＩ因子；Ｒ１５２Ｅ−第ＶＩＩ因子、Ｓ３４４Ａ−第ＶＩＩ因子、Ｇｌａドメインを欠く第ＶＩＩａ因子；及びＰ１１Ｑ／Ｋ３３Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｔ１０６Ｎ−ＦＶＩＩ、Ｋ１４３Ｎ／Ｎ１４５Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｖ２５３Ｎ−ＦＶＩＩ、Ｒ２９０Ｎ／Ａ２９２Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｇ２９１Ｎ−ＦＶＩＩ、Ｒ３１５Ｎ／Ｖ３１７Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｋ１４３Ｎ／Ｎ１４５Ｔ／Ｒ３１５Ｎ／Ｖ３１７Ｔ−ＦＶＩＩ；及び２３３Ｔｈｒから２４０Ａｓｎのアミノ酸配列に置換、付加又は欠失を有するＦＶＩＩ、３０４Ａｒｇから３２９Ｃｙｓのアミノ酸配列に置換、付加又は欠失を有するＦＶＩＩが含まれる。
本発明の方法から恩恵を受けうる他のタンパク質はＩＬ−１９である。本発明の方法において利用可能なＩＬ−１９の特定の例は、出典明示によりここに援用される国際公開第９８／０８８７０号（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）に開示されたものを含む。特に挙げることができるものは、国際公開第９８／０８８７０号に配列番号２として開示されたタンパク質である。
本発明の方法から恩恵を受けうる他のタンパク質はＩＬ−２０である。利用可能なＩＬ−２０の特定の例は、出典明示によりここに援用される国際公開第９９／２７１０３号（ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ）に開示されたものを含む。本文脈において、ＩＬ−２０は、ＩＬ−２０自体とその断片、並びにＩＬ−２０又はその断片と少なくとも９０％同一であるポリペプチドを示すものである。本発明の方法において特に利用可能なタンパク質には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４及び配列番号３５として国際公開第９９／２７１０３号に開示されているものが含まれる。
本発明の方法から恩恵を受けうるまた別のタンパク質はＩＬ−２１である。本発明の方法において利用可能なＩＬ−２１の例は、出典明示によりここに援用される国際公開第００／５３７６１号（ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ）に開示されたものを含む。特に挙げることができるものは、国際公開第００／５３７６１号に配列番号２として開示されたタンパク質である。
本発明の方法から恩恵を受けうるまた別のタンパク質はＴＴＦである。ＴＴＦタンパク質は主として胃腸管に付随して見出されるタンパク質のファミリーである。特に挙げることができるものは、ヒト、マウス、及びラットから知られている乳癌関連ｐＳ２タンパク質（ＴＦＦ−１）、ヒト、ブタ、ラット、及びマウスから知られている鎮痙性ポリペプチド（ＴＦＦ−２）、及びヒト、ラット及びマウスから知られている腸トレフォイル因子（ＴＦＦ−３）である。
本発明の方法において利用できるＴＦＦファミリーの他のタンパク質には、出典明示によりここに援用される国際公開第０２／４６２２６号（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）に開示されたものが含まれる。特に挙げることができるものは、アミノ酸Ｃｙｓ６−Ｃｙｓ１０４、Ｃｙｓ８−Ｃｙｓ３５、Ｃｙｓ１９−Ｃｙｓ３４、Ｃｙｓ２９−Ｃｙｓ４６、Ｃｙｓ５８−Ｃｙｓ８４、Ｃｙｓ６８−Ｃｙｓ８３、及びＣｙｓ７８−Ｃｙｓ９５間にジスルフィド結合を含み、糖残基及びオリゴ糖から独立して選択される部分ＸがＡｓｎ１５に共有的に結合されている国際公開第０２／４６２２６号の配列番号１に開示されたアミノ酸を有するＴＦＦ２タンパク質であるＴＦＦ−２タンパク質である。
ＴＦＦファミリーの他のタンパク質には、出典明示によりここに援用される国際公開第９６／０６８６１号（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）に開示されたもののようなＴＦＦ−１及びＴＦＦ−３二量体が含まれる。
幾つかのメラノコルチンレセプターが知られており、本発明の方法に対して利用可能なタンパク質として、食欲抑制効果を有することが知られているペプチド性メラノコルチン−４レセプターアゴニストが挙げられる。特に挙げることができるものは、全てが出典明示によりここに援用される次の特許文献に開示されたタンパク質である：米国特許第６０５４５５６号（Ｈｒｕｂｙ）、国際公開第００／０５２６３号（Ｗｉｌｌｉａｍ Ｈａｒｖｅｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、国際公開第００／３５９５２号（Ｍｅｌａｃｕｒｅ）、国際公開第００／３５９５２号（Ｍｅｌａｃｕｒｅ）、国際公開第００／５８３６１号（Ｐｒｏｃｔｅｒ ＆ Ｇａｍｂｌｅ）、国際公開第０１／５２８８０号（Ｍｅｒｃｋ）、国際公開第０２／２６７７４号（Ｐｒｏｃｔｅｒ ＆ Ｇａｍｂｌｅ）、国際公開第０３／０６６２０号（Ｐａｌａｔｉｎ）、国際公開第９８／２７１１３号（Ｒｕｄｏｌｆ Ｍａｇｎｕｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）及び国際公開第９９／２１５７１号（Ｔｒｅｇａ）。
本発明の方法において利用可能な他のタンパク質は、ＡＣＴＨ、コルチコトロピン放出因子、アンジオテンシン、カルシトニン、インスリン及びその断面及びアナログ、グルカゴン、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、エンテロガストリン、ガストリン、テトラガストリン、ペンタガストリン、ウロガストリン、上皮増殖因子、セクレチン、神経増殖因子、サイロトロピン放出ホルモン、ソマトスタチン、成長ホルモン放出ホルモン、ソマトメジン、副甲状腺ホルモン、トロンボポエチン、エリスロポエチン、視床下部放出因子、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン、エンドルフィン、エンケファリン、バソプレッシン、オキシトシン、オピオイド及びそれらのアナログ、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ及びリボヌクレアーゼを含む。
本発明の方法によって修飾されるタンパク質は、天然源（例えば植物、動物又は微生物、例えば酵母、細菌、真菌又はウイルス）から単離されうるか、又はそれらは合成されうる。天然源からのタンパク質はまたトランスジェニック源、例えばタンパク質を発現するかタンパク質の発現を増加させるように遺伝的に改変された供給源を含み、ここで、上記タンパク質はそれが天然に存在するという意味では「天然」であり、又はそれがヒトの介入のためにのみ存在しているという意味では「非天然」でありうる。天然源から単離されるタンパク質に、本発明のコンジュゲーション前に合成的修飾を施してもよい。
薬学的組成物
本発明はまたここに開示される方法の何れかによって修飾されたタンパク質を含有する薬学的組成物に関する。一態様では、かかる薬学的組成物は、例えば１０−１０ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌのような、１０−１５ｍｇ／ｍｌから２００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する成長ホルモン（ＧＨ）のような修飾されたタンパク質を含有し、該組成物は２．０から１０．０のｐＨを有する。該組成物はバッファー系、保存料、等張剤、キレート剤、安定剤及び界面活性剤を更に含みうる。本発明の一実施態様では、薬学的組成物は、水性組成物、すなわち水を含んでなる組成物である。かかる組成物は典型的には溶液又は懸濁液である。本発明の更なる実施態様では、薬学的組成物は水溶液である。「水性組成物」なる用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む組成物として定義される。同様に、「水溶液」なる用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む溶液として定義され、「水性懸濁液」なる用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む懸濁液として定義される。
別の実施態様では、薬学的組成物は凍結乾燥組成物であって、医師もしくは患者が使用前に溶媒及び／又は希釈剤を添加する組成物である。
別の実施態様では、薬学的組成物は、事前の溶解なしに使える状態にある乾燥組成物（例えば凍結乾燥又はスプレードライ）である。
更なる態様では、本発明は、修飾されたタンパク質、例えば修飾されたＧＨタンパク質の水溶液及びバッファーを含む薬学的組成物であって、前記修飾されたタンパク質、例えば修飾されたＧＨタンパク質は０．１−１００ｍｇ／ｍｌもしくはそれ以上の濃度で存在し、約２．０から約１０．０のｐＨを有する製薬学的組成物に関する。
本発明の別の実施態様では、組成物のｐＨは、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９及び１０．０からなるリストから選択される。
本発明の更なる実施態様では、バッファーは、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸塩、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、及びトリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、コハク酸塩、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸、又はそれらの混合物からなる群から選択されうる。これら特定のバッファーの各一が本発明の別の実施態様を構成する。
本発明の更なる実施態様では、組成物は薬学的に許容可能な保存料を更に含有する。本発明の更なる実施態様では、保存料は、フェノール、ｏ−クレゾール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル、２−フェノキシエタノール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ブチル、２−フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、及びチメロサール、ブロノポール、安息香酸、イミド尿素、クロロヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチル、塩化ベンゼトニウム、クロロフェネシン（３ｐ−クロルフェノキシプロパン−１，２−ジオール）又はそれらの混合物からなる群から選択されうる。本発明の更なる実施態様では、保存料は、０．１ｍｇ／ｍｌから２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。本発明の更なる実施態様では、保存料は、０．１ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。本発明の更なる実施態様では、保存料は、５ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。本発明の更なる実施態様では、保存料は、１０ｍｇ／ｍｌから２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。これら特定の保存料の各一が本発明の別の実施態様を構成する。薬学的組成物中における保存料の使用は当業者によく知られている。簡便には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０版，２０００が参照される。
本発明の更なる実施態様では、組成物は等張剤を更に含有する。本発明の更なる実施態様では、等張剤は、塩（例えば塩化ナトリウム）、糖又は糖アルコール、アミノ酸（例えばＬ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン）、アルジトール（例えばグリセロール（グリセリン）、１，２−プロパンジオール（プロピレングリコール）、１，３−プロパンジオール、１，３−ブタンジオール）、ポリエチレングリコール（例えばＰＥＧ４００）、又はそれらの混合物からなる群から選択されうる。例えばフルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性デンブン、ヒドロキシエチルデンプン、カルボキシメチルセルロース−Ｎａを含む単糖類、二糖類、又は多糖類、又は水溶性グルカン類のような任意の糖を使用することができる。一実施態様では、糖添加剤はスクロースである。糖アルコールは少なくとも一つの−ＯＨ基を有するＣ４−Ｃ８炭化水素として定義され、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、ズルシトール、キシリトール、アラビトールを含む。一実施態様では、糖アルコール添加剤はマンニトールである。上述の糖類又は糖アルコールは個々に又は組み合わせて使用することができる。糖又は糖アルコールが液体調製物中で可溶性であり、本発明の方法を使用して達成される安定化効果に悪影響を及ぼさない限り、使用される量に決まった制限はない。一実施態様では、糖又は糖アルコール濃度は約１ｍｇ／ｍｌと約１５０ｍｇ／ｍｌの間である。本発明の更なる実施態様では、等張剤は１ｍｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。本発明の更なる実施態様では、等張剤は１ｍｇ／ｍｌから７ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。本発明の更なる実施態様では、等張剤は８ｍｇ／ｍｌから２４ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。本発明の更なる実施態様では、等張剤は２５ｍｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。これらの特定の等張剤の各一は本発明の別の実施態様を構成する。薬学的組成物中における等張剤の使用は当業者によく知られている。簡便には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０版，２０００が参照される。
本明細書において、「薬学的に許容可能な塩」なる用語は、患者に有害ではない塩を示すものである。かかる塩には、薬学的に許容可能な酸付加塩、薬学的に許容可能な金属塩、アンモニウム及びアルキル化アンモニウム塩が含まれる。酸付加塩には、無機酸並びに有機酸の塩が含まれる。適切な無機酸の代表例には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸、硫酸、硝酸等が含まれる。適切な有機酸の代表例には、蟻酸、酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、安息香酸、ケイ皮酸、クエン酸、フマル酸、グリコール酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、シュウ酸、ピクリン酸、ピルビン酸、サリチル酸、コハク酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、酒石酸、アスコルビン酸、パモン酸、ビスメチレンサリチル酸、エタンジスルホン酸、グルコン酸、シトラコン酸、アスパラギン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ＥＤＴＡ、グリコール酸、ｐ−アミノ安息香酸、グルタミン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等が含まれる。薬学的に許容可能な無機もしくは有機酸付加塩の更なる例には、出典明示によりここに援用されるＪ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６，２（１９７７）に列挙された薬学的に許容可能な塩が含まれる。金属塩の例には、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム塩等が含まれる。アンモニウム及びアルキル化アンモニウム塩の例には、アンモニウウム、メチルアンモニウム、ジメチルアンモニウム、トリメチルアンモニウム、エチルアンモニウム、ヒドロキシエチルアンモニウム、ジエチルアンモニウム、ブチルアンモニウム、テトラメチルアンモニウム塩等々が含まれる。
本発明の更なる実施態様では、組成物はキレート剤を更に含有する。本発明の更なる実施態様では、キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸、及びアスパラギン酸の塩、及びそれらの混合物から選択されうる。本発明の更なる実施態様では、キレート剤は０．１ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。本発明の更なる実施態様では、キレート剤は０．１ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。本発明の更なる実施態様では、キレート剤は２ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。これらの特定のキレート剤の各一が本発明の別の実施態様を構成する。薬学的組成物中におけるキレート剤の使用は当業者によく知られている。簡便には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０版，２０００が参照される。
本発明の更なる実施態様では、組成物は安定剤を更に含有する。薬学的組成物中における安定剤の使用は当業者によく知られている。簡便には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０版，２０００が参照される。
より詳細には、本発明の組成物は、液体薬学的製剤として貯蔵中に凝集体形成を示すおそれのあるタンパク質がその治療的に活性な成分に含まれる安定化された液体薬学的組成物である。「凝集体形成」とは、可溶性のままでありうるオリゴマーか、溶液から沈殿する大きな目視できる凝集体の形成を生じるタンパク質分子間の物理的相互作用のことである。「貯蔵中」とは、ひとたび調製された液体医薬組成物又は組成物が直ぐには患者に投与されないことを意図する。むしろ調製後に、液体形態、凍結状態、又は液体形態もしくは患者への投与に適した他の形態へ後で再構成するための乾燥形態の何れかで貯蔵のために包装される。「乾燥形態」とは、液体医薬組成物又は組成物が、フリーズドライ（つまり凍結乾燥；例えばＷｉｌｌｉａｍｓ及びＰｏｌｌｉ（１９８４）Ｊ．Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．３８：４８−５９）、スプレードライ（Ｍａｓｔｅｒｓ（１９９１），Ｓｐｒａｙ−Ｄｒｙｉｎｇ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（５版；Ｌｏｎｇｍａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ，Ｅｓｓｅｚ，Ｕ．Ｋ．），ｐｐ．４９１−６７６；Ｂｒｏａｄｈｅａｄ等（１９９２）Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌ．Ｉｎｄ．Ｐｈａｒｍ．１８：１１６９−１２０６；及びＭｕｍｅｎｔｈａｌｅｒ等（１９９４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１１：１２−２０を参照）又はエアードライ（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ及びＣｒｏｗｅ（１９８８）Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ ２５：４５９−４７０；及びＲｏｓｅｒ（１９９１）Ｂｉｏｐｈａｒｍ．４：４７−５３）の何れかによって乾燥されていることを意図する。液体医薬組成物の貯蔵中におけるタンパク質による凝集体形成はそのタンパク質の生物学的活性に悪影響を及ぼし得、薬学的組成物の治療効果を損なわしめる。更に、凝集体形成は、そのタンパク質含有薬学的組成物を、注入系を使用して投与する場合、チューブ、膜、又はポンプの詰まりのような他の問題を生じうる。
本発明の薬学的組成物は組成物の貯蔵の間におけるタンパク質の凝集体形成を減少させるのに十分な量のアミノ酸塩基を更に含みうる。「アミノ酸塩基」とは、アミノ酸又はアミノ酸の組合せのことであり、任意の与えられたアミノ酸はその遊離塩基形態又はその塩形態で存在する。アミノ酸の組合せが使用される場合、アミノ酸の全てがその遊離塩基形態で存在し得、全てはその塩形態で存在し得、あるいは幾つかがその遊離塩基形態で存在し得る一方、他のものはその塩形態で存在する。一実施態様では、本発明の組成物を調製する際に使用するアミノ酸は、アルギニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸のような荷電側鎖を担持しているものである。特定のアミノ酸（例えばメチオニン、ヒスチジン、イミダゾール、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン及びそれらの混合物）の任意の立体異性体（つまりＬ、Ｄ、又はその混合体）又はこれら立体異性体の組み合わせは、特定のアミノ酸がその遊離塩基形態又はその塩形態の何れかで存在している限り、本発明の薬学的組成物中に存在しうる。一実施態様では、アミノ酸のＬ立体異性体が使用される。一実施態様では、Ｌ立体異性体が使用される。本発明の組成物はまたこれらのアミノ酸のアナログと共に製剤化されうる。「アミノ酸アナログ」とは、本発明の液体薬学的組成物の貯蔵中にタンパク質による凝集体形成を減少させるという所望の効果をもたらす天然に生じるアミノ酸の誘導体のことである。適切なアルギニンアナログには、例えばアミノグアニジン、オルニチン及びＮ−モノエチルＬ−アルギニンが含まれ、適切なメチオニンアナログには、エチオニン及びブチオニンが含まれ、適切なシステインアナログにはＳ−メチル−Ｌシステインが含まれる。他のアミノ酸の場合と同様に、アミノ酸アナログはその遊離の塩基形態又はその塩形態で組成物中に導入される。本発明の更なる実施態様では、アミノ酸又はアミノ酸アナログは、タンパク質の凝集を防止又は遅延させるのに十分な濃度で使用される。
本発明の更なる実施態様では、治療剤として作用するタンパク質が酸化を受けやすい少なくとも一のメチオニン残基を含むタンパク質である場合、メチオニン（又は他の含硫アミノ酸又はアミノ酸アナログ）を添加してメチオニン残基がメチオニンスルホキシドへ酸化するのを阻害することができる。「阻害する」とは、メチオニンが酸化された種の経時的な蓄積の最小化のことである。メチオニンの酸化を阻害することはタンパク質をその正しい分子形態に、より維持することとなる。メチオニンの任意の立体異性体（Ｌ又はＤ異性体）又はその組み合わせを使用することができる。添加される量は、メチオニンスルホキシドの量が規制機関に受け入れられるようにメチオニン残基の酸化を阻害するのに十分な量でなければならない。典型的には、これは、組成物が約１０％以下から約３０％以下のメチオニンスルホキシドしか含まないことを意味する。一般に、これは、メチオニン残基に加えられるメチオニンの比が約１：１から約１０００：１、例えば１０：１から約１００：１の範囲であるようにメチオニンを添加することによって達成することができる。
本発明の更なる実施態様では、組成物は高分子量ポリマー又は低分子化合物の群から選択される安定剤を更に含有する。本発明の更なる実施態様では、安定剤はポリエチレングリコール（例えばＰＥＧ３３５０）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、カルボキシ／ヒドロキシセルロース又はその誘導体（例えばＨＰＣ、ＨＰＣ−ＳＬ、ＨＰＣ−Ｌ及びＨＰＭＣ）、シクロデキストリン、モノチオグリセロール、チオグリコール酸及び２−メチルチオエタノールのような硫黄含有物質、及び異なった塩（例えば塩化ナトリウム）から選択される。これらの特定の安定剤の各一が本発明の他の実施態様を構成する。
薬学的組成物はまたその中の治療的に活性なタンパク質の安定性を更に向上させる更なる安定剤を含有しうる。本発明にとって特に興味がある安定剤には、限定するものではないが、メチオニンの酸化からタンパク質を保護するメチオニン及びＥＤＴＡと、凍結融解又は機械的せん断に伴う凝集からタンパク質を保護する非イオン性界面活性剤が含まれる。
本発明の更なる実施態様では、組成物は界面活性剤を更に含有する。本発明の更なる実施態様では、界面活性剤は、洗浄剤、エトキシル化ヒマシ油、ポリグリコール化グリセリド、アセチル化モノグリセリド、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシプロピレン・ポリオキシエチレンブロックポリマー（例えばプルロニック（登録商標）Ｆ６８、ポロキサマー１８８及び４０７、トリトンＸ−１００のようなポロキサマー類）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン及びポリエチレン誘導体、例えばアルキル化及びアルコキシル化誘導体（トゥイーン類、例えばＴｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−４０、Ｔｗｅｅｎ−８０及びＢｒｉｊ−３５）、そのモノグリセリド又はそのエトキシル化誘導体、ジグリセリド又はそのポリオキシエチレン誘導体、アルコール、グリセロール、レクチン及びリン脂質（例えばホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ジホスファチジルグリセロール及びスフィンゴミエリン）、リン脂質誘導体（例えばジパルミトイルホスファチジン酸）及びリゾリン脂質誘導体（例えばパルミトイルリゾホスファチジル−Ｌ−セリン及びエタノールアミン、コリン、セリンもしくはスレオニンの１−アシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェートエステル）並びにリゾホスファチジル及びホスファチジルコリンのアルキル、アルコキシル（アルキルエステル）、アルコキシ（アルキルエーテル）誘導体、例えばリゾホスファチジルコリンのラウロイル及びミリストイル誘導体、ジパルミトイルホスファチジルコリン、及び極性頭部基、つまり、コリン、エタノールアミン、ホスファチジン酸、セリン、スレオニン、グリセロール、イノシトール、正荷電ＤＯＤＡＣ、ＤＯＴＭＡ、ＤＣＰ、ＢＩＳＨＯＰ、リゾホスファチジルセリン及びリゾホスファチジルスレオニンの修飾体、及びグリセロリン脂質（例えばケファリン）、グリセロ糖脂質（例えばガラクトピラノシド）、スフィンゴ糖脂質（例えばセラミド、ガングリオシド）、ドデシルホスホコリン、ニワトリ卵白リゾレシチン、フシジン酸誘導体（例えばタウロ−ジヒドロフシジン酸ナトリウム等々）、長鎖脂肪酸及びその塩Ｃ６−Ｃ１２（例えばオレイン酸及びカプリル酸）、アシルカルニチン及び誘導体、リジン、アルギニン又はヒスチジンのＮα−アシル化誘導体、又はリジンもしくはアルギニンの側鎖アシル化誘導体、リジン、アルギニン又はヒスチジンと中性又は酸性アミノ酸の任意の組合せを含むジペプチドのＮα−アシル化誘導体、中性アミノ酸と二つの荷電アミノ酸の任意の組合せを含むトリペプチドのＮα−アシル化誘導体、ＤＳＳ（ドキュセート・ナトリウム、ＣＡＳ登録番号［５７７−１１−７］）、ドキュセート・カルシウム、ＣＡＳ登録番号［１２８−４９−４］、ドキュセート・カリウム、ＣＡＳ登録番号［７４９１−０９−０］、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム又はラウリル硫酸ナトリウム）、カプリル酸ナトリウム、コール酸又はその誘導体、胆汁酸及びその塩及びグリシンもしくはタウリンコンジュゲート、ウルソデオキシコール酸、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、Ｎ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、アニオン性（アルキル−アリール−スルホネート）一価界面活性剤、両性イオン性界面活性剤（例えばＮ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホネート類、３−コールアミド−１−プロピルジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホネート、カチオン性界面活性剤（第４級アンモニウム塩基）（例えば臭化セチル−トリメチルアンモニウム、塩化セチルピリジニウム）、非イオン性界面活性剤（例えばドデシルβ−Ｄ−グルコピラノシド）、エチレンジアミンへプロピレンオキシド及びエチレンオキシドを連続添加して誘導される四官能性ブロックコポリマーであるポロキサミン（例えばテトロニックス（Ｔｅｔｒｏｎｉｃ’ｓ））から選択することができ、あるいは該界面活性剤はイミダゾリン誘導体又はその混合物の群から選択されうる。これらの特定の界面活性剤の各一が本発明の別の実施態様を構成する。
薬学的組成物における界面活性剤の使用は当業者によく知られている。簡便には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０版，２０００が参照される。
その他の成分が本発明の薬学的組成物中に存在することもありうる。そのような更なる成分には、湿潤剤、乳化剤、抗酸化剤、充填剤、張度調節剤、キレート剤、金属イオン、油性媒体、タンパク質（例えばヒト血清アルブミン、ゼラチン又はタンパク質）及び双性イオン（例えばベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リジン、ヒスチジンのようなアミノ酸）が含まれる。そのような更なる成分は、当然ながら、本発明の医薬組成物の全体の安定性に悪影響を及ぼしてはならない。
本発明の修飾されたタンパク質、例えば修飾されたＧＨタンパク質を含む薬学的組成物は、そのような治療を必要とする患者の幾つかの部位に投与され得、例えば局所的部位、例えば皮膚及び粘膜部位、吸収をバイパスする部位、例えば動脈、静脈、心臓への投与、及び吸収を含む部位、例えば皮膚、皮下、筋肉又は腹部への投与である。
本発明に係る薬学的組成物の投与は、幾つかの投与経路、例えば舌、舌下、頬、口、経口、胃及び腸、鼻、肺を介して、例えば細気管支及び肺胞又はそれらを組合せたもの、表皮、真皮、経皮、膣、直腸、眼を介して、例えば結膜、尿管、及び非経口を介して、そのような治療を必要としている患者に投与されうる。
本発明の組成物は、幾つかの投薬形態、例えば溶液、懸濁液、エマルション、マイクロエマルション、多相エマルション、フォーム、膏薬、ペースト、プラスター、軟膏、錠剤、コート錠剤、リンス、カプセル、例えば硬質ゼラチンカプセル及び軟質ゼラチンカプセル、坐薬、直腸用カプセル、ドロップ、ゲル、スプレー、パウダー、エアゾール、吸入剤、点眼剤、眼軟膏、眼用リンス、膣用ペッサリー、膣用リング、膣用軟膏、注射液、インサイツ形質転換溶液、例えばインサイツゲル化、インサイツ硬化、インサイツ沈殿、インサイツ結晶化のもの、輸液、及び移植片として投与されうる。
本発明の組成物は、修飾されたＧＨタンパク質の安定性を更に高め、生物学的利用能を増加させ、溶解度を高め、副作用を低減させ、当業者によく知られている時間療法を達成し、また患者のコンプライアンスを高め、又はそれらの任意の組合せのために、例えば共有的、疎水的及び静電気的相互作用を介して、薬剤担体、薬剤デリバリー系及び先端薬剤デリバリー系に更に配合され、又は結合されうる。担体、薬剤デリバリー系及び先進薬剤デリバリー系の例には、限定されるものではないが、ポリマー、例えばセルロース及び誘導体、多糖類、例えばデキストランと誘導体、デンプンと誘導体、ポリ（ビニルアルコール）、アクリレート及びメタクリレートポリマー、ポリ乳酸及びポリグリコール酸及びそれらのブロックコポリマー、ポリエチレングリコール、担体タンパク質、例えばアルブミン、ゲル、例えばサーモゲル化系、例えば当業者によく知られているブロックコポリマー系、ミセル、リポソーム、ミクロスフィア、ナノ粒子、液晶及びそれらの分散液、脂質−水系における相挙動の当業者によく知られているＬ２相とそのディスパージョン、ポリマーミセル、多相エマルション、自己乳化、自己−マイクロ乳化、シクロデキストリン及びその誘導体、及びデンドリマーが含まれる。
本発明の組成物は、全ての装置が当業者によく知られたものである例えば定量吸入器、乾燥パウダー吸入器及びネブライザーを使用し、修飾されたＧＨタンパク質のような修飾されたタンパク質を肺に投与するための固形物、半固形物、パウダー及び溶液の組成物に有用である。
本発明の組成物は、制御された徐放性、持続性、遅延及び持続放出薬物デリバリー系の組成物に特に有用である。より詳細には、限定されるものではないが、組成物は、当業者によく知られている非経口用の制御放出及び徐放系（双方の系は、投与回数を何倍も低下させる）組成物に有用である。更により好ましくは、皮下投与される制御放出及び徐放系である。本発明の範囲を限定するものではないが、有用な制御放出系及び組成物の有用な例は、ヒドロゲル、油性ゲル、液晶、ポリマーミセル、ミクロスフィア、ナノ粒子である。
本発明の組成物に有用な徐放系の製造方法は、限定されるものではないが、結晶化、凝縮、共結晶化、沈殿、共沈殿、乳化、分散、高圧ホモジナイズ、カプセル化、噴霧乾燥、マイクロカプセル化、コアセルベーション、相分離、ミクロスフィアを製造するための溶媒蒸発、押出及び超臨界プロセスを含む。一般的には、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ（Ｗｉｓｅ，Ｄ．Ｌ．編Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０００）及びＤｒｕｇ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｖｏｌ．９９：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（ＭａｃＮａｌｌｙ，Ｅ．Ｊ．編Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０００）が参照される。
非経口投与は、シリンジ、場合によってはペン状シリンジによる皮下、筋肉内、腹膜内又は静脈内注射によって実施することができる。あるいは、非経口投与は輸液ポンプにより実施することができる。更なる選択肢は、鼻用又は肺用スプレーの形態で修飾されたタンパク質、例えば修飾されたＧＨタンパク質を投与するための溶液又は懸濁液であってもよい組成物にある。更なる選択肢としては、本発明の修飾された修飾されたタンパク質、例えば修飾されたＧＨタンパク質を含む薬学的組成物を、例えば針のない注射、又はイオン導入パッチであってよいパッチによる経皮投与、又は頬等の経粘膜投与用に適合させることもできる。
「安定化された組成物」なる用語は、物理的な安定性が増し、化学的な安定性が増し、又は物理的及び化学的安定性が増した組成物を意味する。ここで使用されるタンパク質組成物の「物理的安定性」という用語は、熱機械的ストレスへのタンパク質の暴露及び／又は疎水性表面及び界面のような不安定化している界面及び表面との相互作用の結果としてのタンパク質の生物学的に不活性な及び／又は不溶性の凝集体を形成するタンパク質の傾向を意味する。タンパク質水性組成物の物理的安定性は、適切な容器（例えばカートリッジ又はバイアル）中に満たした組成物を機械的／物理的ストレス（例えば攪拌）に様々な時間の間、異なった温度で暴露した後に視覚検査及び／又は濁度測定によって評価される。組成物の視覚検査は暗い背景中において鋭く集光された光下で実施される。組成物の濁りは例えば濁度を０から３の尺度（濁りを示さない組成物が視覚スコア０に相当し、昼光で可視できる濁りを示す組成物は視覚スコア３に相当する）でランク付けすることにより特徴付けされる。組成物は、昼光下で可視できる濁りを示す場合にタンパク質凝集に対して物理的に不安定であると分類される。あるいは、組成物の濁りは当業者によく知られている簡単な濁度測定によって評価することができる。タンパク質水性組成物の物理的安定性はタンパク質の立体構造状態の分光学的薬剤又はプローブを使用してまた評価することができる。プローブは好ましくはタンパク質の非天然配座異性体に優先的に結合する小分子である。タンパク質構造の小分子分光学的プローブの一例はチオフラビンＴである。チオフラビンＴはアミロイド線維の検出に広く使用されている蛍光染料である。線維と、おそらくは他のタンパク質立体配置もまた存在すると、チオフラビンＴは約４５０ｎｍで新たな励起極大を引き起こし、線維タンパク質形態に結合したとき約４８２ｎｍで増強した発光を生じる。未結合のチオフラビンＴは本質的にはその波長で非蛍光である。
天然から非天然状態までのタンパク質構造における変化のプローブとして、他の小分子を使用することができる。例えば、タンパク質の露出した疎水性パッチに優先的に結合する「疎水性パッチ」プローブである。疎水性パッチは、一般には、その天然状態のタンパク質の３次構造内に埋められているが、タンパク質がアンフォールドされ又は変性が始まると、露出するようになる。これらの小分子の分光学的プローブは、芳香族の疎水性染料、例えばアントラセン、アクリジン、フェナントロリン等である。他の分光学的プローブは金属−アミノ酸錯体、例えば疎水性アミノ酸、例えばフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、及びバリン等のコバルト金属錯体である。
ここで使用されるタンパク質組成物の「化学的安定性」なる用語は、天然タンパク質構造と比較して潜在的に少ない生物学的効力及び／又は潜在的に増加した免疫原性を持つ化学的変性産物の形成に至るタンパク質構造中の化学共有結合変化を意味する。天然タンパク質のタイプと性質及びタンパク質がさらされる環境に応じて、様々な化学的変性産物が形成されうる。最も可能性が高いことは化学的変性は完全には避けることができないことであり、当業者にはよく知られているように、化学的変性産物の量の増加がタンパク質組成物の貯蔵や使用中にしばしば見られる。殆どのタンパク質は、脱アミド化を受ける傾向があり、これはグルタミニル又はアスパラギニル残基の側鎖アミド基が加水分解されて遊離のカルボン酸を形成するプロセスである。他の変性経路は、アミド基転移及び／又はジスルフィド相互作用を通して二以上のタンパク質分子が互いに共有結合し、共有結合した二量体、オリゴマー及び多量体変性産物の形成に至る高分子量転換産物の形成を含む（Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ａｈｅｒｎ．Ｔ．Ｊ．＆ Ｍａｎｎｉｎｇ Ｍ．Ｃ．，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９２）。（例えばメチオニン残基の）酸化は化学的変性の他の変形例として挙げることができる。タンパク質組成物の化学的安定性は、異なった環境条件への暴露後に様々な時点において化学的変性産物の量を測定することによって評価することができる（変性産物の形成は例えば温度上昇によってしばしば加速され得る）。それぞれ個々の変性産物の量は、様々なクロマトグラフィー法（例えばＳＥＣ−ＨＰＬＣ及び／又はＲＰ−ＨＰＬＣ）を使用して分子サイズ及び／又は電荷に応じて変性産物を分離することにより決定されることが多い。
よって、上に概説したように、「安定化された組成物」とは増加した物理的安定性、増加した化学的安定性、又は増加した物理的及び化学的安定性を有する組成物を意味する。一般に、組成物は、有効期限に達するまで（推奨された使用及び貯蔵条件に応じて）使用及び貯蔵中に安定でなければならない。
本発明の一実施態様では、修飾されたＧＨタンパク質を含有する医薬組成物は、６週間を越える使用の間、また３年を越える貯蔵の間、安定している。
本発明の他の実施態様では、修飾されたＧＨタンパク質を含有する医薬組成物は、４週間を越える使用の間、また３年を越える貯蔵の間、安定している。
本発明の更なる実施態様では、修飾されたＧＨタンパク質を含有する医薬組成物は、４週間を越える使用の間、また２年を越える貯蔵の間、安定している。
本発明のまた更なる実施態様では、修飾されたＧＨタンパク質を含有する医薬組成物は、２週間を越える使用の間、また２年を越える貯蔵の間、安定している。
未修飾タンパク質が治療用タンパク質である場合、本発明は本発明の修飾されたタンパク質の治療における使用、特に上記修飾されたタンパク質を含む薬学的組成物にも関する。
よって、ここで使用される場合、「治療」及び「治療する」なる用語は、疾患又は疾病等の病状に抗することを目的として、患者を管理し世話することを意味する。本用語には、兆候又は合併症を軽減し、疾患、疾病又は病状の進行を遅延させ、兆候及び合併症を軽減又は緩和し、及び／又は疾患、疾病又は病状を治癒又は除去し、並びに病状を防止するための活性化合物の投与等、患者が患っている病状に対するあらゆる範囲の治療を含むことを意図しており、ここで防止とは、疾患、病状又は疾病に抗することを目的として、患者を管理し世話することと理解され、兆候又は合併症の発症を防止する活性化合物を投与することが含まれる。治療される患者は、好ましくは哺乳動物、特にヒトであるが、さらにイヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ及びブタ等の動物を含んでもよい。しかし、治癒療法及び予防（再発防止）療法は、本発明の別の態様を表すことが認識されなければならない。
ここで使用される本発明の修飾されたタンパク質の「治療的有効量」は、与えられた疾患とその合併症の臨床症状を治癒し、軽減し又は部分的に抑止するのに十分な量を意味する。これを達成するのに十分な量は「治療的有効量」として定義される。各目的のための有効量は疾患又は傷害の重症度並びに患者の体重、性別、年齢及び一般的状態に依存する。適した用量の決定は常套的な実験を使用し、値のマトリックスを構築しマトリックス中の異なった点を試験することによりなすことができることが理解され、これは全て熟練した医師又は獣医の技量の範囲にある。
よって、本発明は治療において使用するための本発明に係る修飾されたタンパク質を提供する。
しかして、典型的な非経口投与量は、投与当たり１０〜９ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。典型的な投与量は、投与当たり約０．００００００１から約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。正確な投与量は、例えば効能、医薬、投与頻度及び方式、性別、年齢及び治療される患者の一般的病状、治療される疾患又は病状の性質及び重篤度、治療の所望される効果及び当業者には明らかな他の要因に依存するであろう。典型的な投薬頻度は、毎日２回、毎日１回、隔日、週２回、週１回又はさらに長い投与間隔とされる。本発明の化合物の半減期は対応する非コンジュゲート成長ホルモンと比較すると長いため、長い投与間隔、例えば週２回、週１回、又はそれ以上の長い投与間隔の投薬計画が、本発明の特定の実施態様である。以下に記載される多くの疾患が、同時に投与されるか連続的に投与される一を超える医薬を治療に用いて治療される。従って、以下に記載される疾患の一つの処置のための治療方法において、該疾患の治療に通常使用される一又は複数の他の治療的に活性な化合物との併用で本発明の修飾されたタンパク質を使用することは本発明の範囲である。同様に、上述の疾患の一つの治療に通常使用される他の治療的に活性な化合物との併用で、該疾患の医薬の製造において、本発明の修飾されたタンパク質を使用することもまた本発明の範囲である。
インスリンは糖尿病を治療し又は予防するために使用され、よって一実施態様では、本発明は、１型又は２型糖尿病を治療する方法であって、治療的に有効な量の本発明に係るインスリン又はインスリン化合物コンジュゲートをそれを必要とする患者に投与することを含む方法を提供する。よって、一実施態様では、本発明は、１型又は２型糖尿病の治療に使用される医薬の製造における本発明に係る修飾されたインスリンの使用を提供する。
ＧＬＰ−１は、高血糖症、２型糖尿病、耐糖能異常、１型糖尿病、肥満症、高血圧、シンドロームＸ、脂質異常症、β細胞アポトーシス、β細胞欠乏、炎症性腸症候群、胃腸障害、認知障害、例えば認識促進、神経保護、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈性心臓病及び他の循環器疾患の治療に使用することができる。一実施態様では、本発明は、よって上記疾患の治療方法であって、本発明に係るＧＬＰ−１又はＧＬＰ−１化合物コンジュゲートの治療的に有効な量をそれを必要とする患者に投与することを含む方法を提供する。よって、他の実施態様では、本発明は上述の疾患の治療に使用される医薬の製造における本発明に係るＧＬＰ−１又はＧＬＰ−１化合物コンジュゲートの使用を提供する。
ＧＬＰ−２は、腸管中の栄養分の吸収不良に至る腸管不全の治療に使用することができ、特にＧＬＰ−２は、小腸症候群、炎症性腸症候群、クローン病、コラーゲン形成大腸炎、放射線性大腸炎を含む大腸炎、照射後萎縮症、非熱帯性（グルテン不耐性）及び熱帯性スプルー，血管閉塞又は外傷後の損傷した組織、旅行者下痢症、脱水症、菌血症、敗血症、神経性無食欲症、化学療法後の損傷した組織、未熟児、強皮症、萎縮性胃炎、切除術後の萎縮性胃炎及びヘリコバクターピロリ菌胃炎を含む胃炎、潰瘍、腸炎、結膜嚢、リンパ管閉塞、血管疾患及び移植片対宿主、外科施術後の治癒、照射後の萎縮及び化学療法、及び骨粗鬆症の治療に使用することができる。従って、上記疾患を治療する方法であって、それを必要とする患者に本発明に係る治療的有効量のＧＬＰ−２又はＧＬＰ−２化合物コンジュゲートを投与することを含む方法を提供することが本発明の目的である。よって、他の実施態様では、本発明は、上述の疾患の治療に使用される医薬の製造における本発明に係るＧＬＰ−２又はＧＬＰ−２化合物コンジュゲートの使用を提供する。
本発明の化合物はまた成長ホルモン活性を奏し、循環成長ホルモン量の増加から恩恵を受ける疾患又は状態の治療にこれを使用できる。かかる疾患又は状態には、成長ホルモン欠損症（ＧＨＤ）；ターナー症候群；プラダーウィリ症候群（ＰＷＳ）；ヌーナン症候群；ダウン症候群；慢性腎臓病、若年性関節リウマチ；嚢胞性線維症、ＨＡＡＲＴ治療を受けた小児のＨＩＶ感染（ＨＩＶ／ＨＡＬＳ小児）；ＳＧＡで出生した低身長小児；ＳＧＡ以外の極少低出生時体重（ＶＬＢＷ）で出生した低身長症；骨格形成異常；軟骨低形成症；軟骨形成不全；特発性低身長（ＩＳＳ）；成人のＧＨＤ；脛骨、腓骨、大腿、上腕、橈骨、尺骨、鎖骨、中手、中足、及び指等、長骨又は内部の骨折；頭蓋骨、手の基部、及び足の基部等、海綿様骨の中又はその骨折；例えば手、膝又は肩等の腱又は靱帯の手術後の患者；仮骨延長術を受けるか又は受けた患者；人工股関節置換手術又は円板置換手術、半月板修復、脊椎固定術、又は膝、臀部、肩、肘、手首又は顎等の補綴固定術後の患者；例えばネイル、スクリュー及びプレートのような骨接合術材料が固定されている患者；骨折の変形癒合又は偽関節を有する患者；例えば脛骨又は第一趾からの骨切り術後の患者；移植片植え込み後の患者；外傷又は関節炎に起因する膝の関節軟骨変性；ターナー症候群を患っている患者の骨粗鬆症；男性における骨粗鬆症、慢性透析の成人患者（ＡＰＣＤ）；ＡＰＣＤにおける栄養不良関連循環器疾患；ＡＰＣＤにおける悪液質の逆流；ＡＰＣＤにおける癌；ＡＰＣＤにおける慢性的閉塞性肺疾患；ＡＰＣＤにおけるＨＩＶ；ＡＰＣＤの高齢者；ＡＰＣＤにおける慢性的な肝臓病、ＡＰＣＤにおける疲労症候群；クローン病；肝機能障害；ＨＩＶ感染した男性；短腸症候群；中心性肥満；ＨＩＶ関連リポジストロフィー症候群（ＨＡＬＳ）：男性不妊；待機的大手術後の患者、アルコール／薬物解毒又は神経的トラウマ；加齢；虚弱な高齢者；骨関節炎；衝撃的な損傷を受けた軟骨；勃起不全；繊維筋痛；記憶障害；鬱病；外傷性脳損傷；くも膜下出血；極低出生体重；メタボリックシンドローム；グルココルチコイドミオパシー；又は小児のグルココルチコイド治療による低身長症が含まれる。成長ホルモンはまた筋肉組織、神経組織又は創傷の治癒の促進；損傷した組織への血流の促進又は改善；又は損傷した組織における感染速度の低減のために使用されており、該方法は式Ｉの化合物の治療的有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む。よって、本発明は、これらの疾患又は状態を治療する方法であって、本発明に係る治療的有効量の成長ホルモン又は成長ホルモン化合物コンジュゲートをそれを必要とする患者に投与することを含む方法を提供する。
典型的には、投与される修飾された成長ホルモンの量は１０−７−１０−３ｇ／ｋｇ体重、例えば１０−６−１０−４ｇ／ｋｇ体重、例えば１０−５−１０−４ｇ／ｋｇ体重の範囲である。
他の実施態様では、本発明は上述の疾患又は状態の治療に使用される医薬の製造における成長ホルモン又は成長ホルモン化合物コンジュゲートの使用を提供する。
サイトカインは免疫系に関与する多くの疾患の病因に関係している。特に、ＩＬ−２０ は乾癬及びその治療に関与しており、Ｉ−２１が癌に関与し、該疾患の治療となりうることが述べられている。一実施態様では、本発明は、本発明に係る治療的有効量のＩＬ−２０コンジュゲートを投与することを含む乾癬の治療方法を提供する。他の実施態様では、本発明は乾癬の治療に使用される医薬の製造における本発明のＩＬ−２０コンジュゲートの使用に関する。
他の実施態様では、本発明は、癌を治療する方法であって、治療的有効量の本発明のＩＬ−２１コンジュゲートをそれを必要とする患者に投与することを含む方法に関する。
他の実施態様では、本発明は癌の治療において使用される医薬の製造における本発明のＩＬ−２１コンジュゲートの使用に関する。
ＴＴＦタンパク質は、患者における粘液層の粘度を増加させるため、例えば唾液分泌の増加が放射線療法によって引き起こされる場合、唾液の分泌を減少させるため、抗コリン薬での治療又はシェーグレン症候群の治療のため、アレルギー性鼻炎、外傷、ショック、大手術、腎臓又は肝臓疾患に二次的なストレス誘発性胃潰瘍の治療のため、ＮＳＡＩＤ、例えばアスピリン、ステロイド、又はアルコールでの治療のために使用することができる。ＴＴＦタンパク質はまたクローン病、潰瘍性大腸炎、角結膜炎、慢性膀胱感染症、腸管膀胱炎、乳頭腫及び膀胱癌を治療するために使用することができる。一実施態様では、本発明は上述の疾患又は状態の治療の治療方法であって、それを必要とする被験患者に本発明に係る治療的有効量のＴＴＦコンジュゲートを投与することを含む方法に関する。
他の実施態様では、本発明は上述の疾患又は状態の治療のための医薬の製造における本発明のＴＴＦコンジュゲートの使用に関する。
メラノコルチンレセプター修飾因子、特にメラノコルチン４レセプターアゴニストは肥満症及び関連疾患の治療と予防に関連している。一実施態様では、本発明は、耐糖能障害（ＩＧＴ）の非インスリン要求性２型糖尿病への進行を予防又は遅延させ、非インスリン要求性２型糖尿病のインスリン要求性糖尿病への進行を予防又は遅延させ、肥満症を治療し、食欲を調節するための方法を提供する。メラノコルチン４レセプターアゴニストは、アテローム性動脈硬化症、高血圧症、糖尿病、２型糖尿病、耐糖能障害（ＩＧＴ）、脂質異常症、冠状動脈性心臓病、胆嚢疾患、胆石、骨関節炎、癌、性機能障害及び早死にのリスクから選択される疾患の治療に関連している。一実施態様では、本発明は、よって上述の疾患又は状態の治療の治療方法であって、それを必要とする患者に本発明に係る治療的有効量のメラノコルチン４レセプターアゴニストコンジュゲートを投与することを含む方法を提供する。
更に他の実施態様では、本発明は上述の疾患又は状態の治療のための医薬の製造における本発明のメラノコルチン４レセプターアゴニストコンジュゲートの使用に関する。
第ＶＩＩ因子は、凝固に関連する疾患の治療に関係しており、特に生物活性な第ＶＩＩ因子化合物は、血友病、第ＶＩＩＩ因子及び第ＩＸ因子に対するインヒビターを持つ血友病、血小板減少症の患者、血小板症の患者、例えばグランツマン血小板無力症血小板放出欠陥及び貯蔵プール欠乏症、フォンヴィルブラント病の患者、肝臓疾患及び外傷又は手術に関連している出血問題を有する患者の治療に関連している。生物学的に不活性な第ＶＩＩ因子化合物は、過凝固状態の患者、例えば敗血症、深部静脈血栓症の患者、心筋梗塞又は脳血栓、肺塞栓のリスクのある患者、急性冠状動脈症候群の患者、冠状動脈心臓事象のある患者、血管形成術を受けた患者に対する心臓事象及び再狭窄の予防、末梢血管疾患及び急性呼吸促迫症候群の患者の治療に関連している。一実施態様では、本発明はよって上述の疾患又は状態の治療のための方法であって、本発明に係る第ＶＩＩ因子化合物コンジュゲートの治療的有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む方法を提供する。
他の実施態様では、本発明は上述の疾患又は状態の治療に使用される医薬の製造における本発明に係る第ＶＩＩ因子化合物コンジュゲートの使用を提供する。
多くの疾患が、治療において、同時投与か又は連続投与の形で一種を超える医薬を使用して治療される。よって、上述した疾患を治療する治療方法において、上記疾患の治療に通常使用される一又は複数の他の治療用活性化合物と組合せて、本発明の修飾されたタンパク質を使用することは本発明の範囲にある。同様に、上述した疾患の治療に通常使用される他の治療用活性化合物と組合せて、前記疾患用の医薬の製造において、本発明の修飾されたタンパク質を使用することもまた本発明の範囲にある。
上で検討したように、本発明の方法に係る治療用の修飾されたタンパク質は治療に使用することができ、これがまた本発明の一実施態様である。
他の実施態様では、本発明は診断における本発明の修飾されたタンパク質の使用を提供する。
ここに引用された刊行物、特許出願及び特許を含む全ての文献は、各文献が、出典明示により個々にかつ特に援用され、その全内容がここに記載されているかの如く、その全体が出典明示によりその全内容がここに援用される（法律により許容される最大範囲）。
全ての表題及び副題は、ここでは便宜的に使用され、決して本発明を限定するものと解すべきではない。
ここに提供される任意かつ全ての例、又は例示的言語（例えば「等」）の使用は、単に本発明をより明らかにすることを意図しており、特に実施態様化されていない限り、本発明の範囲に限定をもたらすものではない。明細書中の如何なる語句も実施態様化していない要素が本発明の実施に必須であることを示しているものと解すべきではない。
ここでの特許文献の引用及び援用は単に便宜上なされているもので、そのような特許文献の有効性、特許性、及び／又は権利行使性についての見解を反映させるものではない。
本発明は、本明細書に添付する実施態様において記載される主題事項の全ての変形物及び均等物を、準拠法によって許される範囲を限度として含む。
本発明を次の非限定的実施例によって更に例証する。
実施例で使用したＴＧａｓｅは、米国特許第５１５６９５６号によるストレプトバーチシリウム・モバレンス由来の微生物トランスグルタミナーゼである。
実施例はまた次の一般的な方法を含む：
キャピラリー電気泳動
キャピラリー電気泳動をＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの３ＤＣＥシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して実施した。データ収集及びシグナル処理は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ３ＤＣＥ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎを使用して実施した。キャピラリーは、６４．５ｃｍ（有効長５６．０ｃｍ）、５０μｍ内径のＡｇｉｌｅｎｔ製「Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｌｉｇｈｔ Ｐａｔｈ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ」であった。２００ｎｍでＵＶ検出を行った（１６ｎｍＢｗ、基準３８０ｎｍ及び５０ｎｍＢｗ）。流通用電解質は５０ｍＭのリン酸バッファーｐＨ７．０である（方法Ａ）。キャピラリーは、０．１ＭのＮａＯＨにて３分間、ついでミリＱ水にて２分間、そして電解質にて３分間調整した。各操作の後、ミリＱ水にて２分間、ついでリン酸にて２分間、そしてミリＱ水にて２分間、キャピラリーを洗い流した。４．０秒間、５０ｍｂａｒで水力学的注入を行った。電圧は＋２５ｋＶであった。キャピラリーの温度は３０℃とし、操作時間は１０．５分とした。
Ｍａｌｄｉ−Ｔｏｆ質量分析
分子量は、Ａｕｔｏｆｌｅｘ Ｍａｌｄｉ−Ｔｏｆ装置（Ｂｒｕｋｅｒ）を用いて決定した。試料は、マトリックスとしてアルファ−シアノ−４−ヒドロキシ−ケイ皮酸を使用して調製した。
ＲＰ−ＨＰＬＣ
ＲＰ−ＨＰＬＣ分析は、Ｖｙｄａｃ ２１８ＴＰ５４ ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ ５ｍｍ Ｃ−１８シリカカラム（Ｔｈｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｇｒｏｕｐ，Ｈｅｓｐｅｒｉａ）を使用してＡｇｉｌｅｎｔ １１００システムで実施した。検出は２１４ｎｍ、２５４ｎｍ、２８０ｎｍ及び３０１ｎｍでＵＶによった。カラムは０．１％トリフルオロ酢酸／Ｈ２Ｏを用いて平衡にし、試料は０．１％トリフルオロ酢酸／Ｈ２Ｏに対して０から９０％アセトニトリルの適切な勾配によって溶離させた。
ＬＣ−ＭＳ
ＬＣ−ＭＳ分析は、２つのＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｓｅｒｉｅｓ ２００マイクロポンプ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｓｅｒｉｅｓ２００オートサンプラー、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７８５Ａ ＵＶ検出器及びＳｅｄｅｘ ７５蒸発光散乱検出器を装備したＰＥ−Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ １００又は１５０質量分析計で行った。Ｗａｔｅｒｓ Ｘｔｅｒｒａ ３．０ｍｍ×５０ｍｍ ５ｍ Ｃ−１８シリカカラムを室温で１．５ｍｌ／分にて溶離させた。それを５％のアセトニトリル／０．１％のトリフルオロ酢酸／Ｈ２Ｏで平衡化し、５％のアセトニトリル／０．１％のトリフルオロ酢酸／Ｈ２Ｏで１．０分間、ついで９０％のアセトニトリル／０．１％のトリフルオロ酢酸／Ｈ２Ｏの線形勾配で７分間溶離させた。検出は２１４ｎｍでのＵＶ検出及び蒸発光散乱法によった。カラム溶離物の画分を、ＰＥ−Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ１００質量分析計のイオンスプレー界面に導入した。操作中、質量範囲３００−２０００ａｍｕを２秒毎にスキャンした。
タンパク質の定量
タンパク質濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ−１０００ ＵＶ−分光光度計を使用して２８０ｎｍの吸光度を測定することによって推定した。
誘導体化部位の決定のための酵素的ペプチドマッピング
ペプチドマッピングは、還元されアルキル化されたタンパク質のＡｓｐ−Ｎ消化を使用して実施した。先ず、標準的な手順に従って、タンパク質をＤＴＴ（ジチオスレイトール）及びヨードアセトアミドで処理した。アルキル化産物を、ＨＰＬＣを使用して精製した。ついで、アルキル化精製産物を、１：１００の酵素：基質比でエンドプロテアーゼＡｓｐ−Ｎ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を用いて一晩消化させた。Ｃ−１８カラム及び標準的なトリフルオロ酢酸／アセトニトリルバッファー系を使用して消化物をＨＰＬＣ分離した。得られたペプチドマップを未誘導体化ｈＧＨのものと比較し、異なった保持時間の画分を集め、Ｍａｌｄｉ−ｔｏｆ質量分析を使用して更に分析した。
ＳＤＳ ｐａｇｅ
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動は、ＮｕＰＡＧＥ４％−１２％ビス−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＮＰ０３２１ＢＯＸ）を用いて行った。ゲルは、銀染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＬＣ６１００）もしくはクーマシー染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＬＣ６０６５）し、関係する場合はＰＥＧについても、Ｍ．Ｍ．Ｋｕｒｆｕｒｓｔ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００（２），２４４−２４８（１９９２）に記載のように、ヨウ化バリウムを用いて染色した。
プロテインクロマトグラフィー
プロテインクロマトグラフィーをＡｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒクロマトグラフィー系及びＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ製のカラムで実施した。アニオン交換をＱ−セファロースＨＰ２６／１０カラムを使用して実施した。出発バッファーは２０ｍＭのトリエタノールアミンバッファーｐＨ８．５であり、溶離バッファーは出発バッファー＋０．２ＭのＮａＣｌであった。化合物は典型的には１５カラム体積にわたって０−７５％の勾配の溶離バッファーで溶離させた。脱塩及びバッファー交換は、ＨｉＰｒｅｐ２６／１０カラムを使用して実施した。
実施例１
修飾された成長ホルモン（化合物１）の調製
Figure 0005703020
図２に示されたように、２０ｍＭのトリエタノールアミンバッファーｐＨ８．５を調製する。（ＴＥＡ−バッファー）；（ａ）２０ｍｇのｈＧＨをＴＥＡ−バッファー（０．５ｍｌ）に溶解させ、（ｂ）６８ｍｇのＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＯＨをＴＥＡ−バッファー（１ｍｌ）に溶解させ；（ｃ）２００ｍｇのＡｋｔｉｖａ ＷＭ ＴＧａｓｅ調製物（〜０．５％のＴＧａｓｅタンパク質を含む）をＴＥＡ−バッファー（１ｍＬ）に溶解させる。（Ａ）と（Ｂ）を混合し、１０μｌ（Ｃ）を加える。室温で１９時間後、主産物をイオン交換クロマトグラフィーによって分離し、ペプチドマッピングと配列解析が、生成物がＬｙｓ１４５において選択的に誘導体化されていることを示す。
実施例２
Ｎ−カルボニルオキシベンジル−グルタミニル−グリシル−（４−アミノ−フェニルアラニン）［Ｚ−ＧＬＮ−ＧＬＹ−（４−アミノ−ＰＨＥ）−ＯＨ］，化合物２の調製
Figure 0005703020
樹脂への第一アミノ酸の結合：塩化２−クロロトリチル樹脂（Ｐｅｐｃｈｅｍ，２ｇ，１．５ｍｍｏｌ／ｇ）に、ＤＣＭ（１６ｍｌ）とジイソプロピルエチルアミン（７８０μｌ）の混合物に溶解させたＦｍｏｃ−（４−Ｂｏｃ−アミノ−Ｐｈｅ）−ＯＨ（Ｆｌｕｋａ，２．２６ｇ，４．５ｍｍｏｌ）を添加した。そのスラリーを５分間攪拌した後、ジイソプロピルエチルアミン（１５４０μｌ）を加えた。攪拌を１時間継続した後、メタノール（５ｍｌ）を加え、攪拌を更に１５分継続した。その樹脂から液を抜き、水をジクロロメタン（ＤＣＭ）（６×３０ｍｌ）とついでＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（６×３０ｍｌ）で洗浄した。
Ｆｍｏｃ基の除去： 樹脂にＮＭＰ（２０ｍｌ）中の２０％のピペリジンを加え、１５分反応させた。樹脂を液抜きし、ＮＭＰ（２０ｍｌ）中の２０％のピペリジンで１時間再び処理した。樹脂を液抜きし、ＮＭＰ（６×３０ｍｌ）で洗浄した。Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＯＨのカップリング： 樹脂にＮＭＰ中のＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ，１．５２ｇ，４．５ｍｍｏｌ）及びヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ，０．６１ｇ，４．５ｍｍｏｌ）の溶液と続いてジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（７００μｌ，４．５ｍｍｏｌ）を加えた。一晩の反応後、樹脂を液抜きし、ＮＭＰ（６×３０ｍｌ）と、ついでＤＣＭ（６×３０ｍｌ）で洗浄した。
固体担体からの切断： 樹脂を液抜きしてバルクＤＣＭを除いた。これを、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（１２．６ｍｌ）、水（０．６ｍｌ）、ＤＣＭ（５．８ｍｌ）及びトリイソプロピルシラン（０．８ｍｌ）の混合物で処理した。１時間の反応後、樹脂を１５分以内にゆっくりとジエチルエーテル（１００ｍｌ）中に濾過し、これを更に３０分撹拌した。得られた沈殿物を遠心分離によって回収し、ジエチルエーテルで３回洗浄した。固形物を真空で一晩乾燥させた。１Ｈ−ＮＭＲ及びＬＣ−ＭＳによれば、生成物は純度が高く均質であった。
実施例３
Ｚ−ＧＬＮ（ｈＧＨ）−ＧＬＹ−（４−アミノ−ＰＨＥ）−ＯＨ，化合物３を得るためのＺ−ＧＬＮ−ＧＬＹ−（４−アミノ−ＰＨＥ）−ＯＨ（化合物２）でのｈＧＨのアミノ基転移
Figure 0005703020
３種の溶液を調製する：１）１ｍｌの２０ｎＭのトリエタノールアミンバッファーｐＨ８．５に溶解させたｈＧＨ（４０ｍｇ，１．８μｍｏｌ）；２）２ｍｌの２０ｎＭのトリエタノールアミンバッファーｐＨ８．５に溶解させ、１０％トリエタノールアミン溶液（２．４ｍｌ）を使用してｐＨを８．１５に調節したＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−（４−アミノ−Ｐｈｅ）−ＯＨ（２０２ｍｇ，４１２μｍｏｌ）；３）トランスグルタミナーゼＡｃｔｉｖａ ＷＭ（味の素）（マルトデキストリンとの固形混合物中に１％，３６ｍｇ，９ｎｍｏｌ）を１ｍｌの２０ｎＭのトリエタノールアミンバッファーｐＨ８．５に溶解させた。
溶液１及び２を混合し、この混合物に１１１μｌの溶液３を加えた；ｐＨは８．２、容量は５．５ｍｌであった。反応をＣＥによってモニターした。室温で５時間後、ＣＥによる分析は、アミノ基転移産物への約７０％の転換率を示す増加した移動時間を持つ新規生成物の存在を示した。反応混合物に１０ｍＭの水性Ｎ−エチルマレイミド（３００μｌ）を加え、それを５℃で一晩保存した。その混合物を１５ｍｌのＨｉＰｒｅｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填し、トリエタノールアミンバッファーｐＨ８．５を使用して溶離させ、低分子量物質及び塩を除去した。関連した画分をプール化したところ、回収はＵＶ吸収測定に基づき３６．６ｍｇのタンパク質であった。
実施例４
化合物４を得るためのＺ−ＧＬＮ（ｈＧＨ）−ＧＬＹ−（４−ＡＭＩＮＯ−ＰＨＥ）−ＯＨ（化合物３）のＰＥＧ化
Figure 0005703020
実施例３に従って調製したアミノ基転移ｈＧＨの溶液に、氷酢酸（１ｍｌ）と水（１ｍｌ）の混合物を添加した。ｐＨは測定すると２であり、つづいて１ＭのＮａＯＨ（１ｍｌ）を使用して３．３に調節した。この溶液に、トリエタノールアミンバッファーｐＨ８．５（１．２ｍｌ）と水（１．２ｍｌ）の混合物に溶解させたＰＥＧ−アルデヒド４０ｋＤａ（１２０ｍｇ，３μｍｏｌ）を加えた。それを１時間の間反応させた後、７０μｌの水（１ｍｌ）中ＮａＣＮＢＨ３（７．１ｍｇ，８μｍｏｌ）の溶液を加えた。反応を一晩継続した。還元型ＳＤＳ・ＰＡＧＥによる分析で、予想された分子量の生成物の存在が示された。その混合物を実施例３のようなＨｉＰｒｅｐカラムで脱塩し、２０ｍｌの水で希釈した２０ｍｌとして関連したプール化画分を回収した。この混合物をＱ−セファロースＨＰ２６／１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。出発バッファーはトリエタノールアミンバッファーｐＨ８．５であった。生成物を、１５カラム体積でトリエタノールアミンバッファーｐＨ８．５中の０−７５％の０．２ＭのＮａＣｌとつづいて５カラム体積でトリエタノールアミンバッファーｐＨ８．５中の７５−１００％の０．２ＭのＮａＣｌの勾配を使用して溶離させた。
ペプチドマッピング解析と配列解析により、化合物４はＬｙｓ１４５位が選択的に修飾されたｈＧＨであったことが確認された。
実施例５
Ｎ−カルボニルオキシベンジル−グルタミニル−グリシン−２，３−ジヒドロキシプロパン−１−アミド，化合物５の調製
Figure 0005703020
トリエチルアミン（０．４１ｍｌ）とのＤＭＦ（２０ｍｌ）中のＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ，１ｇ，２．９６ｍｍｏｌ）の溶液を窒素雰囲気下で調製し、＜２０℃まで冷却させた。ＤＭＦ（４ｍｌ）に溶解させたクロロギ酸イソブチル（４０７μｌ，０．４２ｇ，３．１ｍｍｏｌ）を、３分かけて攪拌溶液に滴下して加えた。攪拌を冷えたまま更に５０分継続した後、トリエチルアミン（０．４１ｍｌ）を含む（Ｒ）−３−アミノ−１，２−プロパンジオール（０．２７ｇ，２．９６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍｌ）懸濁液を添加した。冷却浴を除去し、溶液を室温までゆっくりと達するようにした。攪拌を更に１６時間継続した後、反応混合物を真空乾固させて粗生成物（１．９ｇ）を残し、これを逆相ＨＰＬＣによって精製した。生成物は１Ｈ−ＮＭＲ及びＬＣ−ＭＳによれば純度が高く均質であった。
実施例６
Ｎ−カルボニルオキシベンジル−グルタミニル−グリシル−プロパルギルグリシン，化合物６の調製
Figure 0005703020
この化合物は、樹脂に結合させられる第一アミノ酸としてＦｍｏｃ−（４−Ｂｏｃ−アミノ−Ｐｈｅ）−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−プロパルギルグリシンを使用して化合物２（実施例２）と同様にして調製した。
本発明のある特徴をここに例証し記載したが、多くの修正、置換、変化、及び均等物が当業者には理解できるであろう。従って、添付の実施態様がそのような修正及び変化を本発明の真の要旨内のものとして包含するものであることが理解されなければならない。
実施例７
Ｚ−ＧＬＮ（ｈＧＨ）−ＧＬＹ−２，３−ジヒドロキシプロパン−１−アミド，化合物７を得るためのＺ−ＧＬＮ−ＧＬＹ−２，３−ジヒドロキシプロパン−１−アミド（化合物５）のでのｈＧＨのアミノ基転移
Figure 0005703020
手順は実施例３のものと同一であった。２５時間の期間後、出発材料（ｈＧＨ）の６５％が、ＣＥ分析によって定量して、所望の生成物７に転換された。
実施例８
Ｚ−ＧＬＮ（ｈＧＨ）−ＧＬＹ−プロパルギルグリシン−ＯＨ，化合物８を得るためのＺ−ＧＬＮ−ＧＬＹ−プロパルギルグリシン−ＯＨ（化合物６）でのｈＧＨのアミノ基転移
Figure 0005703020
手順は実施例３のものと同一であった。２２時間の期間後、出発材料（ｈＧＨ）の５９％が、ＣＥ分析によって定量して、所望の生成物８に転換された。
配列
配列番号：１
ヒト成長ホルモンポリヌクレオチド
atggctacag gctcccggac gtccctgctc ctggcttttg gcctgctctg cctgccctgg
cttcaagagg gcagtgcctt cccaaccatt cccttatcca ggctttttga caacgctatg
ctccgcgccc atcgtctgca ccagctggcc tttgacacct accaggagtt tgaagaagcc
tatatcccaa aggaacagaa gtattcattc ctgcagaacc cccagacctc cctctgtttc
tcagagtcta ttccgacacc ctccaacagg gaggaaacac aacagaaatc caacctagag
ctgctccgca tctccctgct gctcatccag tcgtggctgg agcccgtgca gttcctcagg
agtgtcttcg ccaacagcct ggtgtacggc gcctctgaca gcaacgtcta tgacctccta
aaggacctag aggaaggcat ccaaacgctg atggggaggc tggaagatgg cagcccccgg
actgggcaga tcttcaagca gacctacagc aagttcgaca caaactcaca caacgatgac
gcactactca agaactacgg gctgctctac tgcttcagga aggacatgga caaggtcgag
acattcctgc gcatcgtgca gtgccgctct gtggagggca gctgtggctt ctag

配列番号２
ヒト成長ホルモンポリペプチド
matgsrtsll lafgllclpw lqegsafpti plsrlfdnam lrahrlhqla fdtyqefeea
yipkeqkysf lqnpqtslcf sesiptpsnr eetqqksnle llrisllliq swlepvqflr
svfanslvyg asdsnvydll kdleegiqtlmgrledgspr tgqifkqtys kfdtnshndd
allknyglly cfrkdmdkve tflrivqcrs vegscgf

配列番号３
MAAGSRTSLLLAFGLLCLSWLQEGSAFPTIPLSRLFDNAMLRARRLYQLAYDTYQEFNPQ
TSLCFSESIPTPSNRVKTQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQLLRSVFANSLVYGASDSN
VYRHLKDLEEGIQTLMWRLEDGSPRTGQIFNQSYSKFDTKSHNDDALLKNYGLLYCFRKD
MDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF

Claims (11)

  1. 成長ホルモンをトランスグルタミナーゼ及び次の式：
    Figure 0005703020
    ［ここで、Ｒ１がカルボベンジルオキシ基（ＰｈＣＨ ２ ＯＣ＝Ｏ）であり；Ｒ２がＨ、プロパルギル又は４−アミノベンジルから選択され；ＹがＯＨ又は＝Ｏであり；ＸがＣＨ ２ ＯＨ又はＯＨである］
    を有する性質改変基と接触させることを含む、成長ホルモンのリジン残基の部位選択的修飾方法。
  2. トランスグルタミナーゼがストレプトマイセス・モバレンス由来の微生物トランスグルタミナーゼである請求項１に記載の方法。
  3. トランスグルタミナーゼが、ストレプトマイセス・モバレンス由来の微生物トランスグルタミナーゼに対して９０％以上の配列同一性を有し、トランスグルタミナーゼ活性を有する変異体である請求項２に記載の方法。
  4. 性質改変基が
    Figure 0005703020
    から選択される請求項１に記載の方法。
  5. 成長ホルモンがヒト成長ホルモンである請求項１に記載の方法。
  6. ヒト成長ホルモンがリジン１４５で修飾される請求項１に記載の方法。
  7. ヒト成長ホルモンがリジン１４５で修飾され、ついでヒト成長ホルモンと比較してコンジュゲートのインビボ半減期を延長する延長基に結合される請求項６に記載の方法。
  8. 延長基が親水性ポリマーである請求項７に記載の方法。
  9. 延長基がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である請求項７に記載の方法。
  10. 延長基がアルブミンに可逆的に結合する部分を含む請求項７に記載の方法。
  11. 延長基は脂肪酸残基又は脂肪二酸残基を含む請求項７に記載の方法。
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