JP2010148525A - マルトース産生アルファアミラーゼ変異体 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】マルトース産生アルファアミラーゼのアミノ酸配列が修飾された変異体。
【選択図】図1
Description
i)構造的配位の評価に基づき、前記の特性の変化に関係する、前記マルトース産生アルファアミラーゼの少なくとも1つのアミノ酸残基又は少なくとも1つの構造的領域を同定するために、前記マルトース産生アルファアミラーゼの構造を解析し;
ii)前記の親と比較して、前記の特性を変えるために、アミノ酸残基又はi)において同定される構造的な部分において修飾された、前記マルトース産生アルファアミラーゼの変異体を構築し;そして
iii)前記の生じたマルトース産生アルファアミラーゼ変異体を前記特性について試験する、
ことを含んで成る。
前記マルトース産生アルファアミラーゼはEC3.2.1.133に分類される酵素である。酵素活性は基質の非還元末端を必要とせず、そして主な酵素活性はマルトース及び長鎖マルトデキストリンへのアミロペクチン及びアミロースの分解を引き起こす。アミロース及びアミロペクチンをアルファ配置においてマルトースに加水分解することが可能であり、そしてマルトトリオース及びシクロデキストリンを加水分解することもまた可能である。
i)Novamylに対する三次元構造の相同性、
ii)配列番号1に対して少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%又は90%、例えば95%又は98%の同一性を有するアミノ酸配列、
iii)配列番号1に記載のDNA配列又はバチルスの菌株NCIB11837に宿されるNovamylをコードするDNA配列にハイブリダイズするDNA配列;
iv)付表1に位置を示した、Asn77からの主鎖のカルボニル原子、Glu102からの側鎖の原子OE2及びOE1、Asp79からの側鎖の原子OD1、Asp76からの側鎖の原子OD1、及びGlu101からの側鎖の原子OE1、並びに水分子WAT V21、原子OW0に相当する配位を含んで成るカルシウム結合部位;
v)配列番号1に示すアミノ酸配列の残基191〜195に等しい位置における、Pro−Ala−Gly−Phe−Serに相当する5個のアミノ酸の配列;そして
上述のi)で言及される構造の相同性は、他の配列の相同性、疎水性クラスター解析に基づき、あるいはreverse threading (Huber, T ; Torda, AE,PROTEIN SCIENCE Vol.7, No.1 pp.142〜149 (1998)) により、そしてこれらの方法のいずれかによってNovamylと同じ三次構造を持つことが予想され、ここで前記の三次構造は全体のフォールディング又は更に好ましくはドメインDを含み、そして最も好ましくはドメインEを含むドメインA,B、及びCのフォールディングを言及する。あるいは、Novamylとマルトース産生アルファアミラーゼとの間の構造の配列合わせは、等しい位置を同定するために使用することができる。
上述のv)で言及した“等しい位置”は当業界で知られている方法を用いる、アミノ酸若しくはDNA配列の配列合わせ又は構造の相同性に基づいている。
マルトース産生アルファアミラーゼの三次元構造
Novamylを本発明の基礎を形成する三次元構造を解明するために使用した。
同形置換法を用いる2,2Åの分離での、Novamylの解決された結晶構造の構造配置を、付表1に記載した標準的なPDB形式(Protein Data Bank, Brookhaven National Laboratory, Brookhaven, CT)に与える。付表1が本出願の一部を形成することが理解される。付表1の文脈において、以下の略語を使用する:CAはカルシウムイオン又はポリペプチド主鎖のアルファ炭素原子を意味し、WATは水又はカルシウムを意味し、MALはマルトースを意味し、HEXは基質類似体の炭水化物単位を意味し、そしてSULは硫酸イオンを意味する。
前記マルトース産生アルファアミラーゼの構造は、A,B,C,D及びEに整理される5つの球状ドメインから構成される。前記ドメインは、ドメインAが残基1〜132及び204〜403、ドメインBが残基133〜203、ドメインCが残基404〜496、ドメインDが残基497〜579、そしてドメインEの残基580〜686であるとして定義され、ここで前記の番号付けは配列番号1のアミノ酸配列を言及する。
ドメインA
ドメインAは最大のドメインであり、そして前記酵素の表面における割れ目の底で空間的に配置される、3つのアミノ酸残基D329,D228及びE256のクラスターを含んで成る活性部位を含む。ドメインAの構造は、構造が知られている前記のαアミラーゼと共通の、全体の折りたたみを示し、すなわち8個の中心のベータストランド(1〜8と番号を付けた)を有する(ベータ/アルファ)の8個のバレル(barrel)及び8個の側面に位置するα−ヘリックスの構造である。前記のβ−バレルは引用書のMcGregorによって定義される。前記のベータストランド1のC末端の端はループ1と表わされるループによって、ヘリックス1に連結し、そして同一のパターンが他のループで見出されるが、前記ループはサイズのいくつかの変化を示し、そしていくつかは極めて長いことがある。
対照的に、ベータストランド及びアルファヘリックスに連結するループは、CGTアーゼの知られている構造から、高い値の変化を示す。これらのループは、前記活性部位の構造的な前後関係を構成し、そして前記の基質に接触する大部分が、これらのループ内に位置する残基の間で見出される。基質特異性、基質結合、pH活性プロファイル、基質開裂パターンなどの様な特徴の識別は、特異的なアミノ酸、及びこれらのループ内でそれらが占める位置によって決定される。Novamylにおいて、ドメインAは2つのカルシウム結合部位を含み、この1つはCGTアーゼにおけるカルシウム結合部位と相同性があり;他方はNovamylに独特である。前記のカルシウム結合部位の構造は、下文の“カルシウム結合部位”の項目において更に議論される。
ドメインB
ドメインBは、前記の(ベータ/アルファ)の8個のバレルのループ3としても言及され、配列番号1に示すアミノ酸配列のアミノ酸残基133〜203を含んで成る。前記の構造はCGTアーゼ内のドメインBの構造に、部分的に相同であり、最も目立つ差異は、CGTアーゼに見られない、配列番号1に示すアミノ酸配列における191〜195位に相当する5個のアミノ酸挿入の存在である。この挿入は前記活性部位の近くに、及び基質との接触の近くに、空間的に位置する。
ドメインC
NovamylのドメインCは、配列番号1に示すアミノ酸配列のアミノ酸残基404〜496を含んで成る。ドメインCは自身の背後を折りたたむ、単一の8個のストランドシート構造を形成する、β−ストランドの全体から構成され、そしてその結果β−サンドイッチ構造として記述されることがある。前記β−シートの一部分はドメインAの界面を形成する。
カルシウム結合部位
前記のマルトース産生アルファアミラーゼの構造は、3つのカルシウム結合部位を示し;それはカルシウムイオンが前記の構造内に存在することが見出されているということである。知られているファミリーの13の構造の多くと共通して、付表1の1つのカルシウムイオン、WAT693は、ドメインAとBとの間に位置する。このカルシウムイオンは、Glu184及びHis232の主鎖のカルボニル原子、Asp198の側鎖の原子OD2及びOD1、Asn131の側鎖のOD1、並びに3つの水分子WAT V1,WAT V5及びWAT V8によって配位する。
基質結合部位
ドメインA及びBの前後における、上文で議論したループの一部は、それぞれ基質の相互作用及び活性部位との特定の注目がある。特に、ドメインAにおける、ループ1内の残基37〜45、ループ5内の残基261〜266、ループ7内の残基327〜330及びループ8内の残基370〜376であり;ドメインBにおける、ループ3内の残基135〜145、ループ3内の残基173〜180及び188〜196であり、ここで残基の位置は配列番号1のアミノ酸配列中のアミノ酸に相当する。
44,89,90,92,93,127,129,132,135,177,178,188,191,194,196,226,228,229,230,231,232,256,258〜261,288,328,329,371,372,373,376、及び690。
90,92,93,129,132,177,188,189,190,191,196,226,228,229,231,232,256,258,259,260,261,328,329,372,376、及び690。
Novamyl(登録商標)の相同性構築
Novamyl(登録商標)の構造は、本明細書の付表1に開示した構造上に構築されたモデルであった。他のマルトース産生アルファアミラーゼの構造を相似的に構築することができる。
第1の観点において、本発明は親マルトース産生アルファアミラーゼの変異体の構築方法に関し、ここで前記変異体は前記の親α−アミラーゼと比較して、少なくとも1つの変化した特徴を有し、この方法は:
i)構造又は機能の考察に基づき、前記の親マルトース産生アルファアミラーゼの前記の特徴の変化に最適であることが決定される、前記α−アミラーゼの少なくとも1つのアミノ酸又は構造的領域を同定するための前記のマルトース産生アルファアミラーゼの構造解析;
ii)前記の親と比較して、i)において同定されたアミノ酸残基又は構造的な領域において修飾され、前記の特徴を変化させるために修飾された、マルトース産生アルファアミラーゼの変異体の構築;及び
iii)前記特徴のための、生じた変異体の試験、
を含んで成る。
構造領域のアミノ酸残基の修飾は、典型的に問題の親ペプチドをコードするDNA配列の適当な修飾によって達成される。前記の修飾は、アミノ酸残基又は構造部分の置換、欠失又は挿入であることができる。
本発明の変異体は、本明細書に記載の修飾に加えて、更なる修飾を含んで成ることができる。前記変異体は、配列番号1と70%以上、好ましくは80%以上、特に90%以上、とりわけ95%以上、例えば98%以上の同一性を有するアミノ酸を有する。
変化したpH依存活性プロファイルを有するマルトース産生アルファアミラーゼ
pH依存活性プロファイルは、前記のマルトース産生アルファアミラーゼの活性部位の10Å以内の残基のpKa を変化させることによって変化することができる。前記の活性部位のpKa の変化は、例えば与えられるアミノ酸残基のアミノ酸側鎖の官能基と、その近辺との間の静電的相互作用又は疎水性相互作用を変化させることによって達成される。より高いpHにおいて、より高い活性を得るために、負電荷の残基が水素を提供する酸の近くに位置するのに対し、正電荷の残基が求核性の酸の近くに位置することで、低いpHでのより高い活性が引き起こされるだろう。また、前記のpKa の減少は水の接近しやすさの減少又は周囲の疎水性の増大によって得ることができる。
i)前記親マルトース産生アルファアミラーゼの三次元構造における、マルトース産生アルファアミラーゼの活性部位の残基から15Å、特に活性部位の残基から10Å以内のアミノ酸残基の同定であって、活性部位の残基との静電的又は疎水性的相互作用に関わることが予期される前記アミノ酸残基の同定;
ii)前記の構造における、活性部位の残基の静電的及び/又は疎水性的環境を変化させるアミノ酸残基による、前記のアミノ酸残基の置換、及び前記構造におけるアミノ酸残基の適応の評価、
iii)アミノ酸の置換が前記構造内に適応されたことを確認するまでの、循環的な、段階i)及び/又はii)の任意な繰り返し、
iv)段階i)及びii)、並びに任意にiii)から生じるマルトース産生アルファアミラーゼ変異体の構築、並びに前記変異体のpH依存酵素活性の試験。
D127,V129,F188,A229,Y258,V281,F284,T288,N327,M330,G370,N371、及びD372、
L71,S72,V74,L75,L78,T80,L81,G83,T84,D85,N86,T87,G88,Y89,H90,G91,T94,R95,D 96,F 97,I174,S 175,N176,D178,D179,R180,Y181,E182,A183,Q184,K186,N187,F188,T189,D190,A192,G193,F194,S195,L196。
変化した安定性を有するマルトース産生アルファアミラーゼ変異体
向上した安定性(典型的に増大した安定性)を有する変異体を、カルシウム結合の安定化、プロリンによる置換、別のアミノ酸によるヒスチジンの置換、ドメイン間ジスルフィド結合の導入、脱アミド化部位の除去、水素結合の接触の変化、より大きな側鎖の基を有する1又は複数のアミノ酸による、内部構造の穴の充填、電荷分布の変化、ヘリックスのキャッピング、あるいは塩橋の導入によって得ることができる。
カルシウム結合
本発明は、親マルトース産生アルファアミラーゼの変異体を提供し、これは変化したカルシウム(Ca2+)結合の安定性により、変化した安定性を有する。前記の酵素変異体は変化した熱安定性又はpH依存安定性を有することができ、あるいはそれは低濃度のカルシウムイオンの存在下でのマルトース産生アルファアミラーゼ活性を有することができる。現在、カルシウムイオンから10Å以内に位置するアミノ酸残基が関与し、あるいは前記酵素のCa2+結合能力にとって重要であることが信じられている。
16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,35,36,40,46,47,48,49,50,51,52,53,54,56,73,74,75,76,77,78,79,80,81,87,88,89,91,93,94,95,96,99,100,101,102,103,104,105,109,129,130,131,132,133,134,145,150,167,168,169,170,171,172,174,177,180,181,182,183,184,185,186,187,188,189,196,197,198,199,200,201,202,206,210,228,229,230,231,232,233,234,235,237,378、及び637。
i)構造又は機能の考察から、至適でないカルシウムイオンの相互作用の原因であることが決定される前記α−アミラーゼの三次元構造のモデルにおける、マルトース産生アルファアミラーゼのCa2+結合部位から10Å以内のアミノ酸残基の同定;
ii)前記アミノ酸残基が、構造又は機能の考察から、変化したCa2+結合親和性を確立するために重要であることが決定される別のアミノ酸残基と置換される変異体の構築;及び
iii)生じたマルトース産生アルファアミラーゼ変異体の、Ca2+結合の試験、
を含んで成る。
a)前記のマルトース産生アルファアミラーゼの構造から同定した様な、カルシウムイオンとアミノ酸残基との間の向上した相互作用を得るため。例えば、問題のアミノ酸残基が周囲の溶媒にさらされているならば、前記アミノ酸残基とカルシウムイオンとの間の相互作用を安定化させるために、溶媒からの前記アミノ酸残基の遮へいを増大することは有利であることができる。このことは、前記アミノ酸、又は前記の遮へいに寄与する前記のアミノ酸残基の近傍のアミノ酸残基を、より大きな側鎖の基を有するか又は向上した遮へい効果を生む他の状態のアミノ酸残基で置換することによって達成することができる。
d)アミノ酸残基にカルシウムを配位させることにより、水を置換するため。
好ましい態様において、前記の親マルトース産生アルファアミラーゼと比較したときに、変化したCa2+結合を有するマルトース産生アルファアミラーゼの変異体は、配列番号1に記載のアミノ酸配列の1又は複数の以下の残基に相当するアミノ酸残基の置換を含んで成る;
D17,A30,S32,R95,H103,N131,Q201,I174、及び/又はH169、
V74,L75,L78,T80,L81,T87,G88,Y89,H90,G91,T94,R95,D96,F97,Y167,F168,H169,H170,N171,G172,D173,I174,S175,N176,D178,D179,R180,Y181,E182,A183,Q184,K186,N187,F188,T189。
同様の置換を、他のマルトース産生アルファアミラーゼの等しい位置において導入することができる。特定の注目がある修飾は、本明細書に開示した他の修飾のいずれかと、1又は複数の上述したものとの組合わせのいずれかである。
他の置換
前記酵素の向上した安定性を有する変異体は、新規のドメイン間及びドメイン内の接触の存在又は導入を向上することによって達成することができる。その様な向上した安定性は、以下に記載する修飾によって達成することができる。
G236+S583,G618+R272,T252+V433及び/又はA348+V487。
G236C+S583C,G618C+R272C,T252C+V433C及び/又はA348C+V487C。
本発明の別の好ましい態様は前記の親と比較したときに向上した安定性及び変化したドメイン間相互作用を有する親マルトース産生アルファアミラーゼの変異体に関し、ここで前記変異体は配列番号1の位置の、少なくとも1つの以下の組合わせに相当する位置の置換を含んで成る:
i)F143,F194,L78;
ii)A341,A348,L398,I415,T439,L464,L465;
iii)L557;
iv)S240,L268;
v)Q208,L628;
vi)F427,Q500,N507,M508,S573;及び
vii)I510,V620。
i)F143Y,F194Y,L78Y/F/W/E/Q;
ii)A341S/D/N,A348V/I/L,L398E/Q/N/D,I415E/Q,T439D/E/Q/N,L464D/E,L465D/E/N/Q/R/K;
iii)L557Q/E/N/D;
iv)S240D/E/N/Q,L268D/E/N/Q/R/K;
v)Q208D/E/Q,L628E/Q/N/D;
vi)F427E/Q/R/K/Y,Q500Y,N507Q/E/D,M508K/R/E/Q,S573D/E/N/Q;及び/又は
vii)I510D/E/N/Q/S,V620D/E/N/Q。
N106,N320及びQ624。
N106R,N320E/D及び/又はQ624E。
本発明の別の態様は、向上した安定性を有する親マルトース産生アルファアミラーゼの変異体に関し、そしてここで、前記変異体は配列番号1の少なくとも1つの以下の組合わせに相当する位置の置換を含んで成る:
K40,V74,S141,T142,F188,N234,K249,D261,D261,L268,V279,N342,G397,A403,K425,S442,S479,S493,T494,S495,A496,S497,A498,Q500,K520,A555及びN595。
V74P,S141P,N234P,K249P,L268P,V279P,N342P,G397P,A403P,S442P,S479P,S493P,T494P,S495P,A496P,S497P,A498P,Q500P、及び/又はA555P。
同様に、前記の親マルトース産生アルファアミラーゼに存在する1又は複数のヒスチジン残基が、非ヒスチジン残基、例えばY,V,I,L,F,M,E,Q,N、又はDで置換されることは好ましいことがある。従って、別の好ましい態様において、前記のマルトース産生アルファアミラーゼの変異体は、配列番号1に記載のアミノ酸配列の1又は複数の以下の残基に相当するアミノ酸残基の置換を含んで成る:
H103,H220、及びH344。
H013Y/V/I/L/F/Y,H220Y/L/M、及びH344E/Q/N/D/Y。
Q13,N26,N77,N86,N99,Q119,N120,N131,N152,N171,N176,N187,Q201,N203,N234,Q247,N266,N275,N276,N280,N287,Q299,N320,N327,N342,Q365,N371,N375,N401,N436,N454,N468,N474,Q500,N507,N513,Q526,N575,Q581,N621,Q624及びN664。
I16,L35,M45,P73,D76,D79,A192,I100,A148,A163+G172,L268,V281,D285,L321,F297,N305,K316,S573,A341,M378,A381,F389,A483,A486,I510,A564,F586,K589,F636,K645,A629、及び/又はT681。
上述した目的のいずれかを達成するための、マルトース産生アルファアミラーゼ変異体を正確に構築する前に、前記の予期されるアミノ酸修飾が前記マルトース産生アルファアミラーゼ構造内に、例えば前記の親マルトース産生アルファアミラーゼの三次元構造内に適応されることができるかどうかを評価することは都合がよい。
変化した熱安定性及び/又は変化した温度依存活性プロファイルを有するマルトース産生アルファアミラーゼ変異体
本発明は更に、変化した熱安定性又は温度依存活性プロファイルを有する変異体を得るための、1又は複数のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入により生じる、親マルトース産生アルファアミラーゼの変異体に関する。
i)前記ポリペプチドの三次元構造における、前記の親マルトース産生アルファアミラーゼの、内部の穴又は割れ目の同定;
ii)前記の構造における、段階i)で同定した穴又は割れ目の近傍の1又は複数のアミノ酸残基の、構造又は機能の考察から疎水性相互作用を増大させ、そして前記の穴又は割れ目のサイズを埋めるか又は減少させることが決定される別のアミノ酸残基による置換;そして
iii)段階ii)から生じる前記の親マルトース産生アルファアミラーゼの変異体の構築並びに前記変異体の熱安定性及び/又は温度依存活性の試験、
を含んで成る。
前記の穴又は割れ目が、前記の穴又は割れ目を囲むアミノ酸残基によって同定され、そして前記のアミノ酸残基の修飾が、前記の穴又は割れ目のサイズを埋めるか又は減少させるのに重要であることは理解されるだろう。好ましくは、前記の修飾は、より大きなアミノ酸残基、すなわち、より大きな側鎖のかさを有するものによる置換である。例えば、全てのアミノ酸がGlyよりも大きいのに対し、Tyr及びTrpはPheより大きい。以下に言及される特定のアミノ酸残基は、結晶構造において問題の穴又は割れ目の側面に位置することが見出されたものである。
L75と組合わせたL217(例えば、L75F/Yと組合わせたL217F/Y)、
変化した開裂パターンを有するマルトース産生アルファアミラーゼ変異体
本発明の目的の1つは、マルトース産生アルファアミラーゼの分解特性を変化させることである。従って、Novamylは澱粉を加水分解して、支配的にマルトース(G2)及び少量のグルコース(G1)を形成するが、事実上それ以上のオリゴ糖(G3+)は形成しない。例えば、より多くの量のより大きなオリゴ糖、例えばマルトトリオース(G3)、マルトテトラオース(G4)及びマルトペンタオース(G5)を形成するために、この開裂パターンを変化させることは望ましいことがある。
i)前記の三次元構造のモデルにおける、前記マルトース産生アルファアミラーゼの基質結合領域、例えば“基質結合部位”と題した上述の項目において定義した、基質結合部位から4Åの範囲内の同定;
ii)構造又は機能の考察から、変化した基質の開裂パターンを起こすことが信じられている別のアミノ酸による、前記の親の開裂パターンの原因であると信じられている、i)で定義した割れ目の基質結合領域の、前記のモデルにおける1若しくは複数のアミノ酸残基の置換、又は前記の基質に好ましい相互作用を導入することが予想される基質結合領域の1若しくは複数のアミノ酸残基の欠失、又は前記の基質に好ましい相互作用を導入することが予想される基質結合領域への1若しくは複数のアミノ酸残基の付加;並びに
iii)段階ii)から生じるマルトース産生アルファアミラーゼ変異体の構築、及び前記変異体の基質開裂パターンの試験。
V281及び/又はA629。
好ましい態様において、前記変異体は:V281Q及び/又はA629N/D/E/Qに相当する修飾を含んで成る。
澱粉の凝集及び/又はパンの劣化を減少させる能力が向上したマルトース産生アルファアミラーゼ変異体
本発明は、澱粉の凝集及び/又はパンの劣化を減少させる能力が向上したマルトース産生アルファアミラーゼ変異体を提供する。好ましい変異体は、配列番号1の以下のアミノ酸残基に相当する、1又は複数の位置での置換を含んで成る:
A30,K40,N115,T142,F188,T189,P191,A192,G193,F194,S195,D261,N327,K425,K520及びN595。
A30D,K40R,N115D,T142A,F188L,T189Y,Δ(191−195),D261G,D261G,N327S,K425E,K520R及びN595I。
カルシウムイオンから10Å以内の残基の決定
付表1の配位はINS(登録商標)IGHTプログラム(BIOSYM Technologies)で読み込まれる。空間的な配位を、原子間の結合を示すことで提示する。前記イオンを、水分子と同様に提示する。部分集合を作製するためのプログラムパッケージの一部を、コマンドZONEを用いて前記構造におけるカルシウムイオンの周辺の10Åの部分集合を作製するために使用した。カルシウムイオンから指定の10Åの距離以内の原子を有するとして定義される全ての残基は、コマンドLIST MOLECULEを用いることによって編集され、そして列挙される。配位ファイルにおいて、“VAT CA”の名前を前記のイオンに与えることで、“VAT CA”と称される全ての原子の周りの10Åの空間が編集される。この方法で同定される特定の残基は、更に上文の“カルシウム結合”と題した項目において与えられる。
穴の決定
付表1に記載の構造的な配位を有するNovamylの解決した構造は、多くの内部の割れ目及び穴を明らかにした。その様な穴を解析するとき、通常Connollyプログラムが使用される(Lee, B. and Richards, F. M. (1971) J. Mol. Biol. 55 : 379 〜400)。前記プログラムは、前記タンパク質の外部及び内部の面を探索するために、半径を有するプローブを使用する。この方法において観察できる最も小さい割れ目は、プローブ半径を有する。
アミノ酸修飾のための命名
変異を定義するために本明細書で使用した命名は、本質的に国際公開第92/05249号に記載されている。従って、F188Hは、アミノ酸H(His)による、188位のアミノ酸F(Phe)の置換を示す。V129S/T/G/Vは、S,T,G又はVによるV129の置換を示す。Δ(191−195)又はΔ(191−195)は、191−195位のアミノ酸の欠失を示す。192−A−193は、192と193のアミノ酸の間のAの挿入を示す。
ポリペプチド配列の同一性
本発明の目的のため、同一性の値を、Needleman, S. B and wunsch, C. D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-45 に記載の方法に従い適当に決定することができ、ここでポリペプチド配列の比較のために以下の設定を用いる:3.0のGAPクリエイション ペナルティー(creation penalty)及び0.1のGAPエクステンション ペナルティー(extension penalty)。GCGプログラムパッケージ(Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)において提供されるGAPの様な知られているコンピュータープログラムによって、前記の決定を行うことができる。
ハイブリダイゼーション
核酸プローブと相同性のDNA又はRNA配列との間のハイブリダイゼーションを決定するための適当な実験条件は、5×SSC(塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム、Sambrook, et al., 1989) 中で10分間ハイブリダイズするための、前記のDNAフラグメント又はRNAを含むフィルターの予備浸漬、並びに5×SSC、5×デンハルト溶液(Sambrook, et al., 1989) 、0.5%SDS及び100μg/mlの変性音波処理サケ精子DNA(Sambrook, et al., 1989) の溶液中でのプレハイブリダイゼーション、続くランダムプライミング(Feinberg, A. P. and Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132 : 6〜13) した、32P−dCTP標識(比活性>1×109 cpm /μg)プローブを含む前記溶液中での、約45℃、12時間のハイブリダイゼーションを含む。次に前記フィルターを少なくとも55℃(低い厳密さ)、好ましくは少なくとも60℃(中間の厳密さ)、更に好ましくは少なくとも65℃(中間の/高い厳密さ)、更に好ましくは少なくとも70℃(高い厳密さ)、より更に好ましくは少なくとも75℃(非常に高い厳密さ)で、2×SSC、0.5%SDS中で30分間、2回洗浄した。
マルトース産生アルファアミラーゼの変異体の製造方法
Novamyl様ポリペプチドをコードするDNA配列のクローニング
親マルトース産生アルファアミラーゼをコードする前記DNA配列は、問題のマルトース産生アルファアミラーゼを産生する細胞又は微生物のいずれかから単離することができ、これには当業界で公知の様々な方法、例えば、バチルスの菌株NCIB11837を用いる。
一度、マルトース産生アルファアミラーゼをコードするDNA配列が単離され、そして修飾のための所望の部位が同定されたならば、合成オリゴヌクレオチドを用いて修飾を導入することができる。これらのオリゴヌクレオチドは前記の所望の修飾部に隣接するヌクレオチド配列を含み; 変異体ヌクレオチドはオリゴヌクレオチドの合成の間に挿入される。具体的な方法において、マルトース産生アルファアミラーゼをコードする配列を架橋する、DNAの一本鎖のギャップが、前記のマルトース産生アルファアミラーゼ遺伝子を有するベクターにおいて作製される。次に、前記の所望の修飾を生む合成ヌクレオチドが、前記の一本鎖DNAの相同性部分にアニールされる。次に残っているギャップをDNAポリメラーゼI(クレノウ断片)で埋め、そして前記のコンストラクトをT4リガーゼを用いてライゲーションする。この方法の具体的な例は、Morinaga et al. (1984)に記載である。米国特許第4,760,025号は、カセットのわずかな改変を行うことによる、複数の修飾をコードするオリゴヌクレオチドの導入を開示している。しかしながら、より多くの変化がある修飾を、前記のMorinagaの方法によって同時に導入することができるのは、様々な長さの多数のオリゴヌクレオチドを導入することができるからである。
無作為変異導入法
無作為変異導入法は、問題の示されたアミノ酸配列に翻訳される遺伝子の少なくとも3つの部分、又は前記の全遺伝子内で、局所的若しくは領域特異的、いずれかの無作為変異導入法で適当に行われる。
上述したものに関して、本発明の更なる観点は親Novamyl様α−アミラーゼの変異体の製造方法に関し、ここで前記変異体は、前記の親と比較して、低pH及び低カルシウム濃度で、増大した安定性を示し、前記方法は:
(a)無作為変異導入法への前記Novamyl様α−アミラーゼをコードするDNA配列の適用、
(b)宿主細胞における、段階(a)で得られる変異DNA配列の発現、及び
(c)前記の親Novamyl様α−アミラーゼと比較して、変化した特性を有するNovamyl様α−アミラーゼ変異体を発現する宿主細胞のスクリーニング、
を含んで成る。
例えば、前記の無作為変異導入法は、適当な物理的又は化学的変異導入剤の使用によって、適当なオリゴヌクレオチドの使用によって、又は変異を生むPCRに前記のDNAをかけることによって行うことができる。更に、前記の無作為変更導入法は、これらの変異導入剤のいずれかの組合わせの使用によって行うことができる。前記の変異導入剤は、例えば転移、転換、転化、混合、欠失、及び/又は挿入を含むものであることができる。
E.コリ(coli) (Fowler et al., Molec. Gen. Genet., 133, 1974, pp179〜191)、S.セレビシアエ(セレビシアエ)又は他の微生物のいずれかの変異誘発菌株を、前記マルトース産生アルファアミラーゼをコードするDNAの、前記の無作為変異導入法のために使用することができ、これは、例えば前記親酵素を含むプラスミドが前記の変異誘発菌株に形質転換させること、前記プラスミドと共に前記の変異誘発菌株を生育すること、及び前記の変異誘発菌株から変異したプラスミドを単離することによる。前記の変異したプラスミドは、続けて発現生物に形質転換させることができる。
局所的無作為変異導入法
前記の無作為変異導入法は、問題の親マルトース産生アルファアミラーゼの一部に、有利に集中することができる。これは、例えば以下のときに有利であることができ、それは前記の酵素のある領域が前記の酵素の与えられた特性に特に重要であると同定されたとき、及び修飾が向上した特性を有する変異体を生じることが予期されるときである。その様な領域は、通常前記の親酵素の三次構造が解明され、そして前記酵素の機能に関与しているとき、同定することができる。
残基:領域:
16〜33、35〜36、40:16〜40
46〜54、56:46〜56
73〜81:73〜81
87〜89、91、93〜96、99〜105、109:87〜109
129〜134、(145、150):129〜134
167〜172、174、177、180〜189:167〜189
196〜202、206〜210:196〜210
228〜235、237:228〜237
378
637
向上した基質の結合、すなわち向上した炭水化物の種類、例えばアミロース又はアミロペクチンの結合を、以下の修飾を有するマルトース産生アルファアミラーゼによって達成するために(ここで修飾は、例えばより高い基質特異性及び/又は、例えば基質の開裂、すなわち加水分解に関する、より高い特異性である)、配列番号1に示すアミノ酸配列の以下の領域の位置のコドンを、領域特異的変異導入法によって、修飾のために特に適当に標的にすることができることは明らかである:
70〜97、127〜143、174〜198、226〜233、255〜270、282〜292、324〜331、370〜376。
熱安定性を向上するために、以下の領域を標的にすることができる:70〜109、167〜200。
前記の無作為変異導入法は、以下の段階によって行うことができる。
1.前記酵素の修飾のための、注目の領域の選択
2.前記の選択領域の、変異部位及び非変異部位の決定
3.例えば前記の所望の安定性及び/又は構築されるべき変異体の性能に関する、実行されるべき変異の種類の決定
4.構造的に無理のない変異の選択
5.段階4に関する、段階3によって選択された残基の調整。
7.必要な場合の、遺伝子コードのリアリズムへの所望の残基の調整(例えば前記の遺伝子コードから生じる制約を考慮に入れることであり、例えば終止コドンの導入を避けるためである):当業者は、いくつかのコドンの組合わせを慣行において使用できず、そして適応することが必要であろうことを認識するだろう。
9.前記プライマーの使用による無作為変異導入法の実行
10.前記の所望の向上した特性のスクリーニングによる、生じるα−アミラーゼ変異体の選択。
段階6における使用のための適当なドープアルゴリズムは、当業界で公知である。その様なアルゴリズムの1つは、Tomandl, D. et al., 1997, Journal of Computer-Aided Molecular Design 11 : 29〜38に記載されている。別のアルゴリズムはDOPEである(Jersen, LJ, Andersen, KV, Svendsen, A, and Kretzschmar, T (1998) Nucleic Acids Research 26 : 697〜702)。
注目の変異体の構築は、前記変異体の産生に誘導的である条件下の、前記変異体をコードするDNA配列を含んで成る微生物の培養、及びそれに続く、生じた培養液からの前記変異体の任意な回収によって達成される。これを以下に、更に詳細に記述する。
前記ベクターはまた、選択マーカー、例えば宿主細胞の欠損を補完する生成物の遺伝子、例えばB.ズブチリス又はB.リチェニホルミス由来のdal遺伝子、あるいは抗生物質耐性、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール又はテトラサイクリン耐性を与えるものを含んで成ることができる。更に、前記ベクターはアスペルギルス選択マーカー、例えばamdS,argB,niaD及びsC、ハイグロマイシン耐性を引き起こすマーカーを含んで成ることができ、あるいは前記選択を共同形質転換によって、例えば国際公開第91/17243号に記載の様に達成することができる。
培養において、本発明の酵素を製造することができる微生物の宿主細胞の例は、グラム陽性細菌、例えばバチルスの菌株、例えばB.ズブチリス、B.リチェニホルミス、B.レンタス、B.ブレビス、B.ステアロサーモファラス、B.アルカロフィラス、B.アミロリクエファシエンス、B.コアグランス、B.サーキュランス、B.ラウツス、B.メガテリウム又はB.サーリンジエンシス、あるいはストレプトマイセス・リビダンス(lividans)又はストレプトマイセス・ムリヌス(murinus)、あるいはグラム陰性細菌、例えばE.コリである。前記細菌の形質転換は、例えば、プロトプラスト形質転換か、又は本質的に知られている方法におけるコンピテント細胞を用いることによって果たすことができる。
前記細胞を培養するために使用する培地は、問題の宿主細胞の成育、及び本発明のマルトース産生アルファアミラーゼ変異体の発現の獲得に適当な、従来の培地のいずれかであることができる。適当な培地は商業的提供者から入手可能であり、そして公表された方法(例えばAmerican Type Culture Collectionのカタログに記載されている)に従い調製することができる。
上述した方法のいずれかによって製造したマルトース産生アルファアミラーゼを、精製の前又は後のいずれかに、スクリーニングアッセイにおいてアミロース分解活性の試験を行うことができ、これは前記変異体の澱粉を分解する能力を測定する。本発明の、上述した無作為変異導入法の段階10におけるスクリーニングは、以下の方法に基づくフィルターアッセイの使用によって都合よく行うことができる:注目の変異したマルトース産生アルファアミラーゼを発現することができる微生物を、適当な培地で、及び前記酵素の分泌のための適当な条件下でインキュベートし、ここで前記の培地は2枚のフィルターによって覆われ、これは低いタンパク質結合能を示す第2のフィルターの下に据えられたタンパク質結合フィルターを含んで成る。前記微生物は、第2の、上側のフィルター上で成育する。インキュベーションに続いて、微生物から分泌された酵素を含んで成る、底側のタンパク質結合フィルターを、前記微生物を含んで成る第2のフィルターから分離する。次に、前記のタンパク質結合フィルターを所望の酵素活性のスクリーニングにかけ、そして第2のフィルター上に存在する、相当する微生物のコロニーを同定する。前記酵素活性の結合のために使用した第1のフィルターは、タンパク質結合フィルターのいずれか、例えばナイロン又はニトロセルロースであることができる。前記の発現生物のコロニーを有する第2のフィルターは、タンパク質に結合する親和性を持たないか、又は低い親和性を持つフィルターのいずれか、例えば酢酸セルロース若しくはDurapore(登録商標)であることができる。
マルトース産生アルファアミラーゼ変異体の基質特異性の評価における、別の重要なパラメーターは、その様な酵素がエキソグリコシラーゼβ−アミラーゼによって徹底的に処理された澱粉を分解することができる度合であることができる。前記の親マルトース産生アルファアミラーゼによって生まれるパターンと異なる、その様な基質上での分解のパターンを示す変異体のスクリーニングのために、以下のアッセイを行う:β−限界デキストリンをMcllvane緩衝液(48.5mMクエン酸及び193mMリン酸ナトリウム、pH5.0)中の25mlの1%アミロペクチンを24μg/mlβ−アミラーゼと30℃で一晩インキュベートすることによって調製する。加水分解されないアミロペクチン(すなわちβ−限界デキストリン)を、1体積の98%エタノールで沈澱させ、水の中で洗浄し、そして再溶解する。1mlのβ−限界デキストリンを、18μlの酵素(2.2mg/ml)及び100μlの0:2Mクエン酸−リン酸pH5.0と、30℃で2時間インキュベーションし、そして上述した様にHPLCによって解析する。β−限界デキストリンの全加水分解を、2MのHCl中、95℃で行う。還元末端の濃度を当業界で知られている方法によって測定する。
熱又はグアニジン塩酸の様な変性剤にさらすことによるマルトース産生アルファアミラーゼの変性は、蛍光の減少を伴い、そしてカルシウムイオンの損失は変性を引き起こす。従って、カルシウムへのマルトース産生アルファアミラーゼ変異体の親和性を、蛍光測定によって測定することができ、これは異なる濃度のカルシウム(例えば1mM〜100mMの範囲)又はEGTA(例えば1〜1000mMの範囲)と一緒の、充分に長い時間(例えば55℃で22時間)での、緩衝液(例えば50mM HEPES,pH7)中の前記変異体(例えば10mg/mlの濃度)のインキュベーションの前及び後に行う。
F=〔Ca〕/(Kdiss+〔Ca〕)(aN −bN log(〔Ca〕))+Kdiss/(Kdiss+〔Ca〕)(au −bu log(〔Ca〕))
ここで、aN は前記酵素の天然(未変性)の蛍光であり、bN はカルシウム濃度(実験的に観測したもの)の対数への一次従属性であり、au は変性形態の蛍光であり、そしてbu はカルシウム濃度の対数への、au の一次従属性である。Kdissは以下の平行過程の、見かけのカルシウム結合定数である:
Kdiss
N−Ca<<U+Ca(N=天然の酵素;U=変性酵素)
事実、変性は極度にゆっくりと進行し、そして不可逆性である。変性の速度はカルシウム濃度に依存し、そしてその様な、与えられる酵素の依存性は、前記酵素のカルシウム結合親和性の測定を提供する。反応条件(例えば55℃で22時間)の標準的な組合わせを定義することによって、異なるマルトース産生アルファアミラーゼ変異体のためのKdissの、意味のある比較を行うことができる。
本発明のマルトース産生アルファアミラーゼ変異体は価値のある特性を有しており、これを様々な工業的適用において有利に使用することができる。特に、前記酵素は、澱粉を基にした食品、例えばベーキング工業で一般的なものの、退行、及びそれに従う劣化の遅延又は維持のための潜在的適用を見出す。
本発明の使用による前記の澱粉画分の修飾が、パン製品のかさの増大、及び器官感覚受容性の質、例えば風味、口当たり、美味しさ、香味及びパンの皮の色の向上をもたらすことが信じられている。
本発明の酵素変異体はまた、洗濯、皿洗い及び固い表面の清掃用洗剤の成分としての工業用適用性を見出す。いくつかの変異体は直鎖オリゴ糖の製造方法、又は澱粉からの甘味料及びエタノールの製造、並びに/あるいは織物のデサイジングのために特に有用である。澱粉の液化及び/又は糖化方法を含む、従来の澱粉変換方法は、例えば米国特許第3,912,590号及び欧州特許公開第252,730号及び第63,909号に記載されている。
MANUにおけるマルトース産生アルファアミラーゼの決定
1マルトース産生アルファアミラーゼNovoユニット(MANU)は、スタンダードのもと1分当たり1μmol のマルトトリオースを開裂する酵素量である。前記のスタンダードの条件は、10mg/mlのマルトトリオース、37℃、pH5.0、30分の反応時間である。
例
例1:変化したpH依存活性を有するNovamylの変異体の構築
Novamylを、本明細書でpLBei010として表されるプラスミドから、バチルス・ズブチリスにおいて発現させる。このプラスミドはamyMを含み、ここでamyMの発現はそれ自身のプロモーターによって方向づけられ、そして、例えばDSM11837の菌株に含まれる、Novamylをコードする完全な遺伝子を含む。前記プラスミドはプラスミドpUB110由来の複製起点、ori及び選択目的のためのカナマイシン耐性マーカーを含む。pLBei010を図1に示す。
Novamylの部位指定変異導入体を、本質的にKamman等によって記述されているメガプライマー法(1989)によって構築した。簡単に言うと、変異オリゴヌクレオチドプライマーを、予備的なPCR産物を作製するためにPCR反応中で適当な反対のDNA鎖エンド(end)プライマーと一緒に使用する。次に、この産物をメガプライマーとして、二本鎖DNA産物を作製するために、別の反対のDNA鎖エンドプライマーと一緒に使用する。前記の最終PCR反応産物を、標準的なクローニング法によって、pLBei010プラスミドの相当するDNAフラグメントを置換するために、常用通りに使用した。バチルス・ズブチリスの菌株SHa273、apr- ,npr- ,amyE- ,amyR2- であり、当業界で知られている方法によって調製したバチルス・ズブチリスの誘導体168に変異体を直接形質転換させた。
変異体配列(5’→3’)
F188H:配列番号3
F188E:配列番号4
F284E:配列番号5
F284D:配列番号6
F284K:配列番号7
H327D:配列番号8
変異体配列(3’→5’)
T288K:配列番号9
T288R:配列番号10
F284,T288及びN327のアスペラギン酸変異体を、エンドプライマーとしてプライマーA189(配列番号11)及びB649(配列番号12)を用いて得た。
所望の修飾を有するPCR産物を精製し、適当な酵素で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離し、抽出し、グリコーゲンの存在下、エタノール沈澱し、H2 O中で再懸濁し、前記と同一の酵素で消化したpLBei010にライゲーションし、そしてバチルス・ズブチリスのSHa273を形質転換させた。形質転換体を、コロニーPCRでサイズ、並びに制限酵素消化によって特定の制限部位の挿入又は除去を調べた。ポジティブなコロニーを、当業界で知られているDNA配列決定法で確かめた。
前記のB.ズブチリスSHa273変異体クローンをLB−カナマイシン(10μg/ml)−澱粉プレート上で、37℃で一晩成育させた。前記プレートからのコロニーを10mlのルリア液中で再懸濁した。前記懸濁液の6分の1ずつを、500mlの振盪フラスコ中に接腫し、これは100mlのPS−1培地、大豆半分/ショ糖を基にした培地、最終濃度10μg/mlのカナマイシン及び100μlの5M NaOHを含む。接腫の前に、pHをNaOHによって、7.5に調整した。前記培養液を270〜300rpm の振盪により、30℃で5日間インキュベートした。
前記培地由来の大きな粒子を、親和性クロマトグラフィーの前に凝結によって除去した。陽イオン性凝結剤としてSuperfloc C521 (American Cyanmide Company)を使用し、陰イオン性凝結剤としてSuperfloc A130 (American Cyanmide Company)を使用した。
分子量972.86g/mol (Fluka28705)の100mgのα−シクロデキストリンを、20mlの結合緩衝液(0.5M Na2 CO3 pH11)に溶解した。10mlのDSVアガロース(ジビニルスルホン活性化したアガロース(Kem−En−Tec)のMini−Leak,Medium 10〜20mmol/l)を脱イオン水で入念に洗浄し、次に吸込みによって乾燥させ、そしてα−シクロデキストリン溶液に移した。混合液を周囲温度で24時間撹拌した後、ゲルを脱イオン水、それに続き0.5M KHCO3 で洗浄した。前記のゲルをブロッキング緩衝液(20ml 0.5M KHCO3 +1mlメルカプトエタノール)に移し、周囲温度で2時間撹拌し、続いて脱イオン水で洗浄した。
前記変異体を、Pharmacia FPLCシステムを用いる親和性クロマトグラフィーによって精製した。0.04体積のpH5,1M酢酸ナトリウムを、pHを調整するために、凝結によって得られた前記濾液に加え、そしてCaCl2 を最終濃度10-10 Mになるまで加えた。前記溶液を濾過し、そして脱気した。Pharmacia XK16カラムを10mlの固定化α−シクロデキストリンを用いて調製し、次に平衡化緩衝液(pH5の25mM酢酸ナトリウム)中、約10倍のカラム体積で洗浄することによって平衡化した。洗浄液中でもはやタンパク質が検出されなくなるまで、前記の平衡化緩衝液で続けて洗浄されるXK16カラムに、前記の濾液をかけた。非特異的材料を溶出するために、 0.5 M NaClを含む平衡緩衝液で洗浄し、続けてカラム体積の2〜3倍の前記平衡化緩衝液でもう1度洗浄した。全ての洗浄を10ml/分の流速を用いて行った。特異的に結合した材料を2%α−シクロデキストリン/前記洗浄緩衝液の溶液を用いて溶出し、そして5ml/分の流速を用いて、Pharmaciaの液体クロマトグラフィーコレクターLCC−500 Plusを用いて回収した。
上述の例において調製した変異体を、以下の様々なpH値で活性を試験した。
マルトトリオース又はアミロペクチンから遊離されるグルコースのための比色グルコースオキシダーゼ−ペルオキシダーゼアッセイを、前記酵素変異体のpH活性プロファイルを決定するために使用した(グルコース/GOD−Perid(登録商標)法、Boehringer Mannheim, Indianapolis IN) 。25mMのクエン酸−リン酸緩衝液中、2,2.5,3,3.5,4,4.5,5,5.5,6,6.5,7,7.5,8及び8.6のpH値で、活性をアッセイした。前記緩衝液のpHをNaOHを用いて調整し、そして酵素をpH5,25mMのクエン酸−リン酸中で希釈した。測定を、平均値を得るために2回1組で行った。全ての値は、最も高いレベルの活性が見られるpHに関する。
例3:変異体の熱安定性
80℃でのインキュベーション
いくつかのNovamyl変異体の熱安定性を、80℃及びpH4.3で水溶液をインキュベートし、そして様々な時間で残留アミラーゼ活性を測定することによって試験した。前記親酵素、Novamylを比較のために含めた。結果を、最初の活性のパーセントにおいて、様々な時間での残留活性として表わす。
カルシウムとの85℃でのインキュベーション
前記Novamyl変異体S32Eを、85℃での1mM Ca++との15分間のインキュベーションによって試験した。前記変異体は48%の残留活性を示し、一方前記親酵素(Novamyl)は同じ条件で32%の残留活性を示した。
更に、pH4.3又は5.5でのDSC(示差走査熱量測定)によって、いくつかのNovamyl変異体の熱安定性を試験した。再び、前記親アミラーゼを比較のために含めた。結果を変性温度(Tm)として表わす:
例4:変異体の比活性
pH5.0及び60℃でのファデバス板(phadebas Tablet)への作用の後、比色分析によってアミラーゼ活性を決定した。Novamylに関する、2つのNovamyl変異体の結果は以下の様であった:
例5:凝集の阻害
凝集を阻害するNovamyl及びNovamyl変異体の効率を、以下の様に決定した:
選択したpH(3.7,4.3又は5.5)での、730mgの50%(w/w)アミロペクチンスラリーを、20μlの酵素試料と混合し、そして前記混合物を、封をしたアンプル中、40℃で1時間インキュベートし、続けて前記試料をゼラチン化するために100℃で1時間インキュベートした。前記アミロペクチンを再結晶化させるために、次に前記試料を室温で7日間熟成した。酵素無しのコントロールを含めた。
例6:変異体の抗劣化効果
パンを、欧州のストレート生地法(Straight Dough method)によって、あるいは酵素の添加有り又は無しの酸性の生地から製造し、そして焼きパンを、増大効果を防ぐために、ふたのある平鍋で焼いた。前記のパンを2時間冷やし、そして質感を解析した。次に、残っている焼きパンを、プラスチックバッグに包み、そして1,4及び7日後の質感解析のために室温で保存した。
Novamyl変異体(T142A+N327S+K425E+K520R+N595I)を、0〜2mgの酵素/kg小麦粉の範囲内の投与量で試験し、そして前記の親酵素(Novamyl)を比較のために使用した。
等しい投与量で、前記変異体が2時間及び1日後に、前記親酵素よりもより良い弾力性(P3/P2)を与えることを前記の結果は示した。1〜2mg/kgの投与量で、前記変異体が、同じ投与量の前記の親酵素よりも有意に柔かいパンの中身(より低い固さ、P1)を与えることを、7日後の結果は示している。従って、前記変異体は7日間の保存期間中、より良い抗劣化作用を有する。
Novamyl変異体(F188L+D261G+T288P)を酸性生地において試験し、そして前記の親酵素(Novamyl)を比較のために使用した。以下の結果を7日後の固さ(P1)、4及び7日後の弾力性(P3/P2)並びに7日後の凝集から得た。
澱粉の加水分解における開裂パターンを、2つの変異体及び前記親酵素、Novamylと比較した。
以下の結果は各オリゴ糖(G1〜G8)の重量%を示し、これは50℃で、pH5.0の50mM酢酸ナトリウム、1mM CaCl2 、を用いる1%(w/v)澱粉溶液中での24時間のインキュベーション後に形したものである。前記のオリゴ糖をHPLCを用いて同定し、そして定量した。
参考文献
Claims (32)
- 親マルトース産生アルファアミラーゼ変異体の製造方法であって、
a)前記の親アルファアミラーゼの三次元構造を産み出すための、付表において表わされる配列番号1の三次元構造上での前記親アルファアミラーゼのモデリング;
b)段階a)において得られる三次元構造における前記の親の少なくとも1つの構造的部分の同定であって、前記の構造的部分における変化が前記の変化した特性を生むことを予測する同定;
c)前記の構造的部分に相当する位置での1又は複数のアミノ酸の欠失、挿入、又は置換をコードする核酸を産生するための、前記の親アルファアミラーゼをコードする核酸の修飾;及び
d)前記の変異体アルファアミラーゼを産生するための、宿主細胞における、前記の修飾された核酸の発現、
を含んで成る前記方法
(ここで前記変異体はアルファアミラーゼの酵素活性を有し、そして前記の親と比較して、変化した特性を少なくとも1つ有する)。 - 前記の変化した特性がpH依存活性、熱安定性、基質開裂パターン、開裂の比活性、トランスグリコシル化、澱粉の凝集を減少させる能力、パンの劣化を減少させる能力、基質特異性、基質との結合又はカルシウムとの結合である、請求項1に記載の方法。
- 親マルトース産生アルファアミラーゼの変異体の構築方法であって;
a)前記の親の三次元構造における前記親アミラーゼの活性部位の残基から、15Å (特に10Å)以内にあり、そして活性部位の残基と静電性又は疎水性の相互作用に関与するアミノ酸残基の同定;
b)活性部位の残基の静電性及び/又は疎水性の環境を変化させ、そして前記構造において適応できる、別のアミノ酸残基による前記アミノ酸残基の置換;
c)循環的な、段階a)及びb)の任意な繰り返し;
d)b)以外の、1又は複数の位置でのアミノ酸残基の挿入、欠失又は置換のうちの、いずれかの変化の任意な作製;
e)段階a)〜d)から生じる前記変異体の調製;
f)前記変異体のpH依存活性の試験;及び
g)循環的な、段階a)〜f)の任意な繰り返し;及び
h)前記の親アミラーゼと比較して、変化したpH依存活性を有する変異体の選択、
を含んで成る方法。 - 親マルトース産生アルファアミラーゼの変異体の構築方法であって;
a)前記の親の三次元構造における内部の穴又は割れ目の同定;
b)前記の穴又は割れ目に近いアミノ酸残基の別のアミノ酸残基による置換であって、前記の疎水性相互作用を増大させ、そして/あるいは前記の穴若しくは割れ目のサイズを大きくし、又は減少させる置換;
c)循環的な、段階a)及びb)の任意な繰り返し;
d)b)以外の、1又は複数の位置でのアミノ酸残基の挿入、欠失又は置換のうちの、いずれかの変化の任意な作製;
e)段階a)〜d)から生じる前記変異体の調製;
f)前記変異体の熱安定性の試験;及び
g)循環的な、段階a)〜f)の任意な繰り返し;及び
h)前記の親アミラーゼと比較して、増大した熱安定性を有する変異体の選択、
を含んで成る方法。 - 前記のアミノ酸残基の置換が前記の疎水性相互作用の増大、プロリンによる置換、別のアミノ酸によるヒスチジンの置換、カルシウム結合の安定化、ドメイン間のジスルフィド結合の導入、脱アミド化部位の除去、水素結合の接触の変化、より大きな側鎖の基を有するアミノ酸による内部構造の穴の充填、ドメイン間の相互作用の導入、電荷分布の変化、ヘリックスのキャッピング、又は塩橋の導入をもたらす、請求項4に記載の方法。
- 親マルトース産生アルファアミラーゼの変異体の構築方法であって:
a)前記アミラーゼの三次元構造におけるカルシウム結合部位から、10Å以内のアミノ酸残基の同定;
b)カルシウムイオンとの相互作用を向上するための、別のアミノ酸による前記アミノ酸の置換;
c)循環的な、段階a)及びb)の任意な繰り返し;
d)b)以外の、1又は複数の位置でのアミノ酸残基の挿入、欠失又は置換のうちの、いずれかの変化の任意な作製;
e)段階a)〜d)から生じる前記変異体の調製;
f)前記変異体の熱安定性の試験;及び
g)循環的な、段階a)〜f)の任意な繰り返し;及び
h)前記の親アミラーゼと比較して、増大した熱安定性を有する変異体の選択、
を含んで成る方法。 - 親マルトース産生アルファアミラーゼの変異体の構築方法であって:
a)前記の親アミラーゼの三次元構造のモデルにおける、基質結合領域の同定;
b)アミノ酸の置換、欠失又は挿入による、基質結合領域の修飾;
c)循環的な、段階b)の任意な繰り返し;及び
d)b)以外の、1又は複数の位置でのアミノ酸残基の挿入、欠失又は置換のうちの、いずれかの変化の任意な作製;
e)段階a)〜d)から生じる前記変異体の調製;
f)前記変異体の基質開裂パターンの試験;及び
g)循環的な、段階a)〜f)の任意な繰り返し;及び
h)前記の親アミラーゼと比較して、変化した基質開裂パターンを有する変異体の選択、
を含んで成る方法。 - マルトース産生アルファアミラーゼ変異体の産生方法であって;
a)請求項2〜7のいずれか1項に記載の方法による前記変異体の構築;
b)前記変異体をコードするDNA配列による、微生物の形質転換;
c)前記変異体の産生にとって誘導的な条件下での、前記の形質転換した微生物の培養;及び
d)生じた培養液からの前記変異体の任意な回収;
を含んで成る方法。 - a)マルトース産生アルファアミラーゼ活性を有し;
b)配列番号1と少なくとも70%の同一性を有し;
c)D127,V129,F188,A229,Y258,V281,F284,T288,N327,M330,G370,N371、及び/又はD372に相当する位置で、配列番号1と比較されるアミノ酸修飾を含んで成り;そして
d)配列番号1のポリペプチドと比較して、変化したpH依存活性を有する、
ポリペプチド。 - 前記修飾がD127N/L,V129S/T/G/V,F188E/K/H,A229S/T/G/V,Y258E/D/K/R/F/N,V281L/T,F284K/H/D/E/Y,T288E/K/R,N327D,M330L/F/I/D/E/K,G370N,N371D/E/G/K、及び/又はD372N/Vに相当する置換を含んで成る請求項9に記載のポリペプチド。
- 前記修飾がK40,V74,H103,S141,T142,F188,H220,N234,K249,D261,L268,V279,N342,H344,G397,A403,K425,S442,S479,S493,T494,S495,A496,S497,A498,Q500,K520,A555及び/又はN595に相当する位置で;好ましくはK40R,V74P,H103Y/V/I/L/F/Y,S141P,T142A,F188I/L,H220Y/L/M,N234P,K249P,D261G,L268P,V279P,N342P,H344E/Q/N/D/Y,G397P,A403P,K425E,S442P,S479P,S493P,T494P,S495P,A496P,S497P,A498P,Q500P,K520R,A555P及び/又はN595Iに相当する置換を含んで成る、請求項11に記載のポリペプチド。
- 前記修飾が、カルシウム配位を向上する様な、D17,N28,P29,A30,S32,Y33,G34,R95,H103,N131,H169,I174及び/又はQ201に相当する位置で、好ましくはD17Q/E,A30D/M/L/A/V/I/E/Q,S32D/E/N/Q,R95M/L/A/V/I/E/Q,H103Y/N/Q/D/E,N131D,H169N/D/E/Q,I174E/Q,Q201Eに相当する置換を含んで成る、請求項11又は12に記載のポリペプチド。
- 前記修飾が1又は複数のドメイン間のジスルフィド結合を導入する様な、好ましくはG236C+S583C,G618C+R272C、及び/又はA348C+V487Cに相当する置換を含んで成る、請求項11〜15のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記の内部の穴又は割れ目を埋める様なL51,L75,L78,G88,G91,T94,V114,I125,V126,T134,G157,L217,S235,G236,V254,V279,V281,L286,V289,I290,V308,L321,I325,D326,L343,F349,S353,I359,I405,L448,Q449,L452,I470,G509,V515,S583,G625,L627,L628及び/又はA670に相当する位置での置換、好ましくは
- 前記の修飾が、塩橋を形成する様な、N106,N320及びQ624に相当する位置での置換、好ましくはN106R,N320E/D及び/又はQ624Eに相当する置換を含んで成る、請求項11〜17のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記修飾が、電荷分布を変える様な、K244及び/又はK316に相当する位置での置換、好ましくはK244S及び/又はK316G/N/Dに相当する置換を含んで成る、請求項11〜18のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記修飾が、前記結合部位を変える様な、V281及び/又はA629に相当する位置での置換、好ましくはV281Q及び/又はA629N/D/E/Qに相当する置換を含んで成る、請求項11〜19のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- a)マルトース産生アルファアミラーゼ活性を有し;
b)配列番号1に対して少なくとも70%の同一性を有し;
c)P191,A192,G193,F194及び/又はS195に相当する位置で、配列番号1と比較されるアミノ酸修飾を含んで成り;そして
d)配列番号1のポリペプチドよりも、高いアミラーゼ比活性を有する、
ポリペプチド。 - 前記修飾が欠失、好ましくは欠失Δ(191〜195)を含んで成る、請求項22に記載のポリペプチド。
- 前記修飾が挿入、好ましくは192−A−193を含んで成る、請求項22に記載のポリペプチド。
- a)マルトース産生アルファアミラーゼ活性を有し;
b)配列番号1に対して少なくとも70%の同一性を有し;
c)A30,K40,N115,T142,F188,T189,P191,A192,G193,F194,S195,D261,T288,N327,K425,K520及び/又はN595に相当する位置で、配列番号1と比較されるアミノ酸修飾を含んで成り;そして
d)配列番号1のポリペプチドより、澱粉の凝集及び/又はパンの劣化を減少させる高い能力を有する、
ポリペプチド。 - 前記修飾が、A30D,K40R,N115D,T142A,F188L,T189Y,Δ(191〜195),D261G,T288P,N327S,K425E,K520R及び/又はN595Iを含んで成る、請求項26に記載のポリペプチド。
- 適当な発現宿主において、前記変異体の発現を方向づける、1又は複数の調節配列に好ましくは作用可能に連結した、請求項9〜26のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列。
- 請求項27に記載の核酸配列、プロモーター、並びに転写及び翻訳終結シグナルを含んで成り、そして好ましくは更に選択マーカーを含んで成る組換え発現ベクター。
- 請求項27に記載の核酸配列又は請求項28に記載のベクターを含んで成る、形質転換される宿主細胞。
- a)前記変異体の発現を誘導する条件下で、請求項29に記載の形質転換した宿主細胞の培養;及び
b)前記変異体の回収、
を含んで成る、請求項9〜26のいずれか1項に記載のポリペプチドを製造する方法。 - 請求項9〜26のいずれか1項に記載のポリペプチド、又は請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法によって製造した変異体を、パンの劣化を遅らせるのに効果的である量において、生地に加えることを含んで成る、生地又は前記の生地から製造した焼いた産物の製造方法。
- 前記変異体が、小麦粉のkg当たり0.1〜5mg、好ましくは0.5〜2mg/kgの量において加えられる請求項31に記載の方法。
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EP1644495A1 (en) * | 2003-07-01 | 2006-04-12 | Novozymes A/S | Cgtase variants |
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US8143048B2 (en) * | 2003-07-07 | 2012-03-27 | Danisco A/S | Exo-specific amylase polypeptides, nucleic acids encoding those polypeptides and uses thereof |
AU2004267142B2 (en) * | 2003-08-22 | 2010-07-22 | Novozymes A/S | Fungal alpha-amylase variants |
ES2340390T3 (es) | 2003-10-28 | 2010-06-02 | Novozymes North America, Inc. | Enzimas hibridas. |
ES2648900T3 (es) * | 2004-07-07 | 2018-01-08 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Variantes de exoamilasa |
WO2006012902A2 (en) | 2004-08-02 | 2006-02-09 | Novozymes A/S | Creation of diversity in polypeptides |
EP2151494A3 (en) | 2004-08-02 | 2011-04-13 | Novozymes A/S | Maltogenic alpha-amylase variants |
ES2399341T3 (es) * | 2004-09-24 | 2013-03-27 | Novozymes A/S | Método para preparar un producto a base de masa |
EP2365068B1 (en) | 2004-12-22 | 2017-03-01 | Novozymes A/S | Enzymes for starch processing |
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US8030050B2 (en) * | 2005-07-07 | 2011-10-04 | Danisco A/S | Modified amylases from Pseudomonas species |
US20070141693A1 (en) * | 2005-07-07 | 2007-06-21 | Berg Casper T | Polypeptide |
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WO2007148224A2 (en) * | 2006-06-19 | 2007-12-27 | Danisco A/S | Polypeptide |
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DK2132316T3 (da) * | 2007-03-23 | 2015-06-22 | Danisco Us Inc | Forøget amylaseproduktion ved n-terminal addition til modent amylaseprotein |
US9296995B2 (en) * | 2007-03-26 | 2016-03-29 | De Staat Der Nederlanden, Vert. Door De Minister Van Vws | Vaccines against Bordetella pertussis based on LPS glycosyltransferase mutants |
CN101668863B (zh) | 2007-04-24 | 2014-12-03 | 诺维信北美公司 | 使经预处理的含木质纤维素的材料解毒 |
DK2527430T3 (en) * | 2007-06-07 | 2015-04-13 | Novozymes As | A process for preparing a dough-based product |
ES2425596T3 (es) | 2007-09-03 | 2013-10-16 | Novozymes A/S | Detoxificación y reciclaje de soluciones de lavado utilizadas en el pretratamiento de materiales con contenido de lignocelulosa |
RU2526516C2 (ru) * | 2008-02-04 | 2014-08-20 | ДАНИСКО ЮЭс ИНК. | Варианты альфа-амилазы ts-23 с измененными свойствами |
EP2103219A1 (en) | 2008-03-10 | 2009-09-23 | Novozymes A/S | Dough with fructan and fructan-degrading enzyme |
EP2364363A2 (en) | 2008-06-23 | 2011-09-14 | Novozymes A/S | Processes for producing fermentation products |
ES2480265T3 (es) | 2008-09-30 | 2014-07-25 | Novozymes North America, Inc. | Mejora de la hidrólisis enzimática de material que contiene lignocelulosa pretratado con granos secos de destilería |
US20110195149A1 (en) | 2008-10-15 | 2011-08-11 | Novozymes A/S | Brewing process |
ES2526867T3 (es) | 2008-11-20 | 2015-01-16 | Novozymes Inc. | Polipéptido que tiene actividad potenciadora amilolítica y polinucleótidos que codifican el mismo |
WO2010078391A2 (en) | 2008-12-30 | 2010-07-08 | Novozymes North America, Inc. | Improvement of enzymatic hydrolysis of pretreated lignocellulose-containing material with dissolved air flotation sludge |
WO2010078392A2 (en) | 2008-12-31 | 2010-07-08 | Novozymes North America, Inc. | Processes of producing fermentation products |
MX2012000322A (es) | 2009-07-17 | 2012-02-08 | Novozymes As | Metodo de analisis del decaimiento de la celulosa en la hidrolisis del material celulosico. |
CN102665425A (zh) | 2009-09-30 | 2012-09-12 | 诺维信公司 | 馒头制备方法和馒头改进组合物 |
EP2499227B1 (en) | 2009-11-13 | 2015-04-08 | Novozymes A/S | A brewing method |
CA2782154C (en) | 2009-11-30 | 2018-10-16 | Novozymes A/S | Polypeptides having glucoamylase activity and polynucleotides encoding same |
ES2534066T3 (es) | 2009-11-30 | 2015-04-17 | Novozymes A/S | Polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa y polinucleótidos que codifican los mismos |
CA2782036C (en) | 2009-12-01 | 2019-01-15 | Novozymes A/S | Polypeptides having glucoamylase activity and polynucleotides encoding same |
WO2011087836A2 (en) | 2009-12-22 | 2011-07-21 | Novozymes A/S | Pullulanase variants and uses thereof |
WO2011100161A1 (en) | 2010-02-09 | 2011-08-18 | Novozymes North America, Inc. | Addition of alpha - glucosidase and cobalt for producing fermentation products from starch |
EP3070171B1 (en) | 2010-03-30 | 2018-06-13 | Novozymes A/S | Process for enhancing by-products from fermentation processes |
MX338068B (es) | 2010-04-14 | 2016-04-01 | Novozymes As | Polipeptidos que tienen actividad de glucoamilasa y polinucleotidos que codifican los mismos. |
DK2579727T3 (en) | 2010-06-11 | 2018-11-26 | Novozymes As | Enzymatic milk correction |
DK2595487T3 (en) | 2010-07-21 | 2019-01-07 | Novozymes As | PROCEDURE FOR PREPARING A BAKED PRODUCT WITH INCREASED AROMASTABILITY WITH CATALASE AND PHOSPHOLIPASE |
CN103140586A (zh) | 2010-08-02 | 2013-06-05 | 诺维信北美公司 | 产生发酵产物的方法 |
EP2638154B1 (en) | 2010-11-08 | 2016-09-14 | Novozymes A/S | Polypeptides having glucoamylase activity and polynucleotides encoding same |
US9309505B2 (en) | 2010-11-08 | 2016-04-12 | Novozymes North America, Inc. | Polypeptides having glucoamylase activity and polynucleotides encoding same |
BR112013012357A2 (pt) | 2010-11-19 | 2016-10-11 | Novozymes North America Inc | processos de produzir um produto de fermentação, de produzir um açúcar, de produzir uma dextrina e de produzir sacarose, e, composição |
ES2673940T3 (es) | 2010-12-22 | 2018-06-26 | Novozymes North America, Inc. | Proceso para producir productos de fermentación a partir de materiales que contienen almidón |
EP2673368B1 (en) | 2011-02-07 | 2014-12-24 | Novozymes North America, Inc. | Process for liquefying starch in the presence of pyridoxamine |
EP2486799A1 (en) | 2011-02-14 | 2012-08-15 | DSM IP Assets B.V. | Method to produce cake with lipolytic enzyme and alpha-amylase |
WO2012130969A1 (en) | 2011-03-29 | 2012-10-04 | Novozymes A/S | Process for production of a baked product |
EA201490216A1 (ru) | 2011-07-06 | 2014-07-30 | Новозимс А/С | Варианты альфа-амилазы и кодирующие их полинуклеотиды |
WO2013007821A1 (en) * | 2011-07-14 | 2013-01-17 | Dsm Ip Assets B.V. | Screening method |
US20140147895A1 (en) | 2011-07-22 | 2014-05-29 | Novozymes A/S | Processes for Pretreating Cellulosic Material and Improving Hydrolysis Thereof |
CN103764836A (zh) | 2011-08-12 | 2014-04-30 | 诺维信公司 | 通过添加锰降低培养物粘度 |
CA2846690A1 (en) | 2011-08-26 | 2013-03-07 | Novozymes A/S | Polypeptides having glucoamylase activity and polynucleotides encoding same |
IN2014CN02469A (ja) | 2011-09-06 | 2015-06-19 | Novozymes As | |
MX351762B (es) | 2011-10-11 | 2017-10-26 | Novozymes As | Variantes de glucoamilasas y polinucleotidos que las codifican. |
IN2014CN03467A (ja) | 2011-10-11 | 2015-10-16 | Novozymes North America Inc | |
IN2014CN04905A (ja) | 2011-12-02 | 2015-09-18 | Novozymes As | |
EP2794899A1 (en) | 2011-12-21 | 2014-10-29 | Novozymes, Inc. | Methods for determining the degradation of a biomass material |
EP2620496B1 (en) | 2012-01-30 | 2015-06-03 | DSM IP Assets B.V. | Alpha-amylase |
ES2935920T3 (es) | 2012-03-30 | 2023-03-13 | Novozymes North America Inc | Procesos de elaboración de productos de fermentación |
US9856498B2 (en) | 2012-03-30 | 2018-01-02 | Novozymes A/S | Processes of producing fermentation products |
EP2847316A1 (en) | 2012-05-11 | 2015-03-18 | Novozymes A/S | A brewing method |
EP2866582B1 (en) * | 2012-06-27 | 2018-11-14 | Novozymes A/S | Rice cooking method |
US20150203807A1 (en) | 2012-07-06 | 2015-07-23 | Novozymes A/S | Inactivation of a production strain using a fatty acid |
CN104540394A (zh) | 2012-08-17 | 2015-04-22 | 诺维信公司 | 热稳定天冬酰胺酶变体以及对其进行编码的多核苷酸 |
EP2914611B1 (en) | 2012-11-01 | 2018-08-29 | Novozymes A/S | Method for removal of dna |
CA2902996A1 (en) | 2013-03-01 | 2014-09-04 | Dsm Ip Assets B.V. | Alpha-amylase variants |
US9301533B2 (en) | 2013-03-01 | 2016-04-05 | Dsm Ip Assets B.V. | Alpha-amylase variants |
CN105007744A (zh) * | 2013-03-01 | 2015-10-28 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | α-淀粉酶和G4-形成淀粉酶的组合 |
DK3372680T3 (da) | 2013-04-30 | 2021-01-11 | Novozymes As | Glucoamylasevarianter og polynukleotider, som koder for dem |
WO2014177541A2 (en) | 2013-04-30 | 2014-11-06 | Novozymes A/S | Glucoamylase variants and polynucleotides encoding same |
EP2997143A1 (en) * | 2013-05-17 | 2016-03-23 | Novozymes A/S | Polypeptides having alpha amylase activity |
CN105492603B (zh) | 2013-05-29 | 2022-06-03 | 丹尼斯科美国公司 | 新型金属蛋白酶 |
WO2014194032A1 (en) | 2013-05-29 | 2014-12-04 | Danisco Us Inc. | Novel metalloproteases |
EP3260538B1 (en) | 2013-05-29 | 2021-04-14 | Danisco US Inc. | Novel metalloproteases |
JP6367930B2 (ja) | 2013-05-29 | 2018-08-01 | ダニスコ・ユーエス・インク | 新規メタロプロテアーゼ |
DK3022300T3 (en) | 2013-07-17 | 2018-10-22 | Novozymes As | : Pullulan chimeras and polynucleotides encoding them |
EP3063282B1 (en) | 2013-09-11 | 2020-03-25 | Novozymes A/S | Processes for producing fermentation products |
ES2723948T3 (es) | 2013-12-13 | 2019-09-04 | Danisco Us Inc | Serina proteasas procedentes de especies de Bacillus |
CN106029881B (zh) | 2013-12-13 | 2023-01-10 | 丹尼斯科美国公司 | 吉氏芽孢杆菌-进化枝的丝氨酸蛋白酶 |
KR20160099629A (ko) | 2013-12-16 | 2016-08-22 | 이 아이 듀폰 디 네모아 앤드 캄파니 | 점도 조절제로서의 폴리 알파-1,3-글루칸 에테르의 사용 |
US9957334B2 (en) | 2013-12-18 | 2018-05-01 | E I Du Pont De Nemours And Company | Cationic poly alpha-1,3-glucan ethers |
DK3097192T3 (en) | 2014-01-22 | 2018-11-19 | Novozymes As | PULLULANASE VARIATIONS AND POLYNUCLEOTIDES CODING THEM |
EP3105256A1 (en) | 2014-02-14 | 2016-12-21 | E. I. du Pont de Nemours and Company | Poly-alpha-1,3-1,6-glucans for viscosity modification |
CN106132997A (zh) | 2014-03-11 | 2016-11-16 | 纳幕尔杜邦公司 | 作为洗涤剂助洗剂的氧化的聚α‑1,3‑葡聚糖 |
JP6585698B2 (ja) | 2014-03-21 | 2019-10-02 | ダニスコ・ユーエス・インク | バチルス(Bacillus)種のセリンプロテアーゼ |
EP3129478B1 (en) | 2014-04-10 | 2019-03-27 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same |
EP3158043B1 (en) | 2014-06-19 | 2021-03-10 | Nutrition & Biosciences USA 4, Inc. | Compositions containing one or more poly alpha-1,3-glucan ether compounds |
US9714403B2 (en) | 2014-06-19 | 2017-07-25 | E I Du Pont De Nemours And Company | Compositions containing one or more poly alpha-1,3-glucan ether compounds |
DK3207129T3 (da) | 2014-10-17 | 2020-02-24 | Danisco Us Inc | Serinproteaser af bacillus-arten |
ES2743515T3 (es) | 2014-10-23 | 2020-02-19 | Novozymes As | Variantes de glucoamilasa y polinucleótidos que codifican las mismas |
EP3212782B1 (en) | 2014-10-27 | 2019-04-17 | Danisco US Inc. | Serine proteases |
US20170335306A1 (en) | 2014-10-27 | 2017-11-23 | Danisco Us Inc. | Serine proteases |
EP3212783A1 (en) | 2014-10-27 | 2017-09-06 | Danisco US Inc. | Serine proteases |
CN107148472A (zh) | 2014-10-27 | 2017-09-08 | 丹尼斯科美国公司 | 芽孢杆菌属物种的丝氨酸蛋白酶 |
WO2016069552A1 (en) | 2014-10-27 | 2016-05-06 | Danisco Us Inc. | Serine proteases |
AU2015369965B2 (en) | 2014-12-23 | 2020-01-30 | Nutrition & Biosciences USA 4, Inc. | Enzymatically produced cellulose |
CN104531636B (zh) * | 2015-01-19 | 2017-02-22 | 江南大学 | 一种麦芽糖淀粉酶的突变体及其制备方法 |
EP4219704A3 (en) | 2015-05-13 | 2023-08-23 | Danisco US Inc | Aprl-clade protease variants and uses thereof |
WO2016201044A1 (en) | 2015-06-09 | 2016-12-15 | Danisco Us Inc | Osmotic burst encapsulates |
WO2016201069A1 (en) | 2015-06-09 | 2016-12-15 | Danisco Us Inc | Low-density enzyme-containing particles |
WO2016201040A1 (en) | 2015-06-09 | 2016-12-15 | Danisco Us Inc. | Water-triggered enzyme suspension |
WO2016205755A1 (en) | 2015-06-17 | 2016-12-22 | Danisco Us Inc. | Bacillus gibsonii-clade serine proteases |
CN109072208A (zh) | 2015-11-05 | 2018-12-21 | 丹尼斯科美国公司 | 类芽孢杆菌属物种甘露聚糖酶 |
CN108603183B (zh) | 2015-11-05 | 2023-11-03 | 丹尼斯科美国公司 | 类芽孢杆菌属物种和芽孢杆菌属物种甘露聚糖酶 |
US10822574B2 (en) | 2015-11-13 | 2020-11-03 | Dupont Industrial Biosciences Usa, Llc | Glucan fiber compositions for use in laundry care and fabric care |
US10844324B2 (en) | 2015-11-13 | 2020-11-24 | Dupont Industrial Biosciences Usa, Llc | Glucan fiber compositions for use in laundry care and fabric care |
EP3374488B1 (en) | 2015-11-13 | 2020-10-14 | DuPont Industrial Biosciences USA, LLC | Glucan fiber compositions for use in laundry care and fabric care |
EP3901257A1 (en) | 2015-12-09 | 2021-10-27 | Danisco US Inc. | Alpha-amylase combinatorial variants |
BR112018012020A2 (pt) | 2015-12-18 | 2018-12-04 | Danisco Us Inc | polipeptídeos com atividade de endoglucanase e usos dos mesmos |
WO2017112533A1 (en) | 2015-12-22 | 2017-06-29 | Novozymes A/S | Process of extracting oil from thin stillage |
WO2017192692A1 (en) | 2016-05-03 | 2017-11-09 | Danisco Us Inc | Protease variants and uses thereof |
US20190136218A1 (en) | 2016-05-05 | 2019-05-09 | Danisco Us Inc | Protease variants and uses thereof |
JP2019523645A (ja) | 2016-05-31 | 2019-08-29 | ダニスコ・ユーエス・インク | プロテアーゼ変異体およびその使用 |
CA3027745A1 (en) | 2016-06-17 | 2017-12-21 | Danisco Us Inc. | Protease variants and uses thereof |
AU2017295412B2 (en) | 2016-07-15 | 2022-02-03 | Novozymes A/S | Improving the rollability of flat breads |
US20190264138A1 (en) | 2016-11-07 | 2019-08-29 | Danisco Us Inc. | Laundry detergent composition |
CN110312795A (zh) | 2016-12-21 | 2019-10-08 | 丹尼斯科美国公司 | 蛋白酶变体及其用途 |
CN110312794B (zh) | 2016-12-21 | 2024-04-12 | 丹尼斯科美国公司 | 吉氏芽孢杆菌进化枝丝氨酸蛋白酶 |
BR112019012559A2 (pt) | 2016-12-21 | 2019-11-26 | Dsm Ip Assets Bv | variantes de enzima lipolítica |
WO2018114912A1 (en) | 2016-12-21 | 2018-06-28 | Dsm Ip Assets B.V. | Lipolytic enzyme variants |
EP3559222A1 (en) | 2016-12-21 | 2019-10-30 | DSM IP Assets B.V. | Lipolytic enzyme variants |
WO2018114938A1 (en) | 2016-12-21 | 2018-06-28 | Dsm Ip Assets B.V. | Lipolytic enzyme variants |
CA3051770A1 (en) | 2017-02-20 | 2018-08-23 | Novozymes A/S | Lipolytic enzyme for use in baking |
US11866713B2 (en) | 2017-02-24 | 2024-01-09 | Danisco Us Inc. | Compositions and methods for increased protein production in bacillus licheniformis |
BR112019019106A2 (pt) * | 2017-03-13 | 2020-08-11 | Lallemand Hungary Liquidity Management Llc | enzimas heterólogas associadas a célula para alimento e/ou ração |
EP3583210B1 (en) | 2017-03-15 | 2021-07-07 | Danisco US Inc. | Trypsin-like serine proteases and uses thereof |
US20200040283A1 (en) | 2017-03-31 | 2020-02-06 | Danisco Us Inc | Delayed release enzyme formulations for bleach-containing detergents |
CA3065425C (en) | 2017-06-22 | 2023-11-07 | Novozymes A/S | Dough relaxation using gamma glutamyl transpeptidase |
WO2019006077A1 (en) | 2017-06-30 | 2019-01-03 | Danisco Us Inc | PARTICLES CONTAINING LOW AGGLOMERATION ENZYME |
EP3655537A1 (en) | 2017-08-23 | 2020-05-27 | Danisco US Inc. | Methods and compositions for efficient genetic modifications of bacillus licheniformis strains |
CN111132553A (zh) * | 2017-08-29 | 2020-05-08 | 诺维信公司 | 表达抗老化/保鲜淀粉酶的面包酵母 |
CN111094576A (zh) | 2017-09-13 | 2020-05-01 | 丹尼斯科美国公司 | 用于增加芽胞杆菌属中蛋白质产生的经修饰的5′-非翻译区(utr)序列 |
CN111164214A (zh) | 2017-09-15 | 2020-05-15 | 诺维信公司 | 用于改进动物饲料营养质量的酶共混物和方法 |
CA3075907A1 (en) | 2017-10-23 | 2019-05-02 | Novozymes A/S | Processes for reducing lactic acid in a biofuel fermentation system |
WO2019089898A1 (en) | 2017-11-02 | 2019-05-09 | Danisco Us Inc | Freezing point depressed solid matrix compositions for melt granulation of enzymes |
EP3717643A1 (en) | 2017-11-29 | 2020-10-07 | Danisco US Inc. | Subtilisin variants having improved stability |
MX2020006518A (es) | 2017-12-21 | 2020-10-28 | Danisco Us Inc | Gránulos de fusión en caliente, que contienen enzimas, que comprenden un desecante termotolerante. |
EP3735478B1 (en) | 2018-01-03 | 2023-08-16 | Danisco US Inc. | Mutant and genetically modified bacillus cells and methods thereof for increased protein production |
MX2020008302A (es) | 2018-02-08 | 2020-10-14 | Danisco Us Inc | Partículas de matriz de cera térmicamente resistentes para encapsulación de enzimas. |
CN108486080B (zh) * | 2018-04-04 | 2020-06-09 | 江南大学 | 一种环糊精葡萄糖基转移酶及其制备方法 |
BR112020020252A2 (pt) | 2018-04-05 | 2021-01-19 | Dsm Ip Assets B.V. | Variante de alfa-amilase maltogênica |
US11937609B2 (en) * | 2018-04-19 | 2024-03-26 | Novozymes A/S | Process for improving freshness of flat breads involving combination of maltogenic alpha amylase variants |
CN108841801A (zh) * | 2018-05-29 | 2018-11-20 | 江南大学 | 一种筛选酶中与酶活力相关的氨基酸残基的方法 |
EP3810785A2 (en) | 2018-05-31 | 2021-04-28 | Novozymes A/S | Processes for enhancing yeast growth and productivity |
CA3101914A1 (en) | 2018-06-04 | 2019-12-12 | Novozymes A/S | Solid enzymatic article for use in baking |
MX2020013319A (es) | 2018-06-12 | 2021-02-22 | Novozymes As | Menos azúcar añadido en productos horneados. |
WO2019245705A1 (en) | 2018-06-19 | 2019-12-26 | Danisco Us Inc | Subtilisin variants |
US20210214703A1 (en) | 2018-06-19 | 2021-07-15 | Danisco Us Inc | Subtilisin variants |
US20210269833A1 (en) | 2018-07-11 | 2021-09-02 | Novozymes A/S | Processes for producing fermentation products |
EP3844255A1 (en) | 2018-08-30 | 2021-07-07 | Danisco US Inc. | Enzyme-containing granules |
CN113166682A (zh) | 2018-09-27 | 2021-07-23 | 丹尼斯科美国公司 | 用于医疗器械清洁的组合物 |
EP3887515A1 (en) | 2018-11-28 | 2021-10-06 | Danisco US Inc. | Subtilisin variants having improved stability |
WO2020160126A1 (en) | 2019-01-31 | 2020-08-06 | Novozymes A/S | Polypeptides having xylanase activity and use thereof for improving the nutritional quality of animal feed |
CN114174504A (zh) | 2019-05-24 | 2022-03-11 | 丹尼斯科美国公司 | 枯草杆菌蛋白酶变体和使用方法 |
CN110074386A (zh) * | 2019-05-30 | 2019-08-02 | 武汉轻工大学 | 一种抗老化挤压面筋及其制备方法 |
EP3980517A1 (en) | 2019-06-06 | 2022-04-13 | Danisco US Inc. | Methods and compositions for cleaning |
BR112022002203A2 (pt) | 2019-08-05 | 2022-09-06 | Novozymes As | Misturas de enzimas e processos para produção de um ingrediente alimentar com alto teor de proteína a partir de um subproduto de vinhaça completa |
EP4031560A1 (en) | 2019-08-14 | 2022-07-27 | Danisco US Inc | Compositions and methods for increased protein production in bacillus licheniformis |
WO2021096857A1 (en) | 2019-11-11 | 2021-05-20 | Danisco Us Inc | Compositions and methods for enhanced protein production in bacillus cells |
EP4072295A1 (en) | 2019-12-09 | 2022-10-19 | Novozymes A/S | Baking additive |
AR120775A1 (es) | 2019-12-16 | 2022-03-16 | Novozymes As | Procesos para obtener productos de fermentación |
US20230340442A1 (en) | 2020-01-15 | 2023-10-26 | Danisco Us Inc. | Compositions and methods for enhanced protein production in bacillus licheniformis |
CN113558081A (zh) | 2020-04-29 | 2021-10-29 | 诺维信公司 | 一种酶法减少烘焙产品中油脂使用量的方法 |
EP4204553A1 (en) | 2020-08-27 | 2023-07-05 | Danisco US Inc. | Enzymes and enzyme compositions for cleaning |
MX2023004789A (es) | 2020-11-02 | 2023-05-09 | Novozymes As | Productos horneados y precocidos con variantes amiloglucosidasas y glucan 1,4-alfa-glucosidasa (amg) termoestables. |
US20240117275A1 (en) | 2021-01-29 | 2024-04-11 | Danisco Us Inc. | Compositions for cleaning and methods related thereto |
WO2022178432A1 (en) | 2021-02-22 | 2022-08-25 | Danisco Us Inc. | Methods and compositions for producing proteins of interest in pigment deficient bacillus cells |
CN117616120A (zh) | 2021-06-30 | 2024-02-27 | 丹尼斯科美国公司 | 变体脂肪酶及其用途 |
WO2023023644A1 (en) | 2021-08-20 | 2023-02-23 | Danisco Us Inc. | Polynucleotides encoding novel nucleases, compositions thereof and methods thereof for eliminating dna from protein preparations |
CN117916354A (zh) | 2021-09-03 | 2024-04-19 | 丹尼斯科美国公司 | 用于清洁的衣物洗涤组合物 |
WO2023039270A2 (en) | 2021-09-13 | 2023-03-16 | Danisco Us Inc. | Bioactive-containing granules |
WO2023114936A2 (en) | 2021-12-16 | 2023-06-22 | Danisco Us Inc. | Subtilisin variants and methods of use |
WO2023114939A2 (en) | 2021-12-16 | 2023-06-22 | Danisco Us Inc. | Subtilisin variants and methods of use |
WO2023114932A2 (en) | 2021-12-16 | 2023-06-22 | Danisco Us Inc. | Subtilisin variants and methods of use |
WO2023168234A1 (en) | 2022-03-01 | 2023-09-07 | Danisco Us Inc. | Enzymes and enzyme compositions for cleaning |
WO2023187753A1 (en) * | 2022-04-01 | 2023-10-05 | Danstar Ferment Ag | N-terminus engineering of intracellular polypeptides expressed in recombinant eukaryotic host cells |
WO2023250301A1 (en) | 2022-06-21 | 2023-12-28 | Danisco Us Inc. | Methods and compositions for cleaning comprising a polypeptide having thermolysin activity |
WO2024050343A1 (en) | 2022-09-02 | 2024-03-07 | Danisco Us Inc. | Subtilisin variants and methods related thereto |
WO2024050346A1 (en) | 2022-09-02 | 2024-03-07 | Danisco Us Inc. | Detergent compositions and methods related thereto |
WO2024050339A1 (en) | 2022-09-02 | 2024-03-07 | Danisco Us Inc. | Mannanase variants and methods of use |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1996023874A1 (en) * | 1995-02-03 | 1996-08-08 | Novo Nordisk A/S | A method of designing alpha-amylase mutants with predetermined properties |
WO1997041213A1 (en) * | 1996-04-30 | 1997-11-06 | Novo Nordisk A/S | α-AMYLASE MUTANTS |
WO1997043424A1 (en) * | 1996-05-14 | 1997-11-20 | Genencor International, Inc. | MODIFIED α-AMYLASES HAVING ALTERED CALCIUM BINDING PROPERTIES |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3912590A (en) | 1973-01-03 | 1975-10-14 | Novo Industri As | Procedure for liquefying starch |
JPS57174089A (en) | 1981-04-20 | 1982-10-26 | Novo Industri As | Chain dividing enzyme product |
DK135983D0 (da) | 1983-03-25 | 1983-03-25 | Novo Industri As | Maltogen amylaseenzymprodukt og fremgangsmade til dets fremstilling og anvendelse |
US4760025A (en) | 1984-05-29 | 1988-07-26 | Genencor, Inc. | Modified enzymes and methods for making same |
US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
DK122686D0 (da) | 1986-03-17 | 1986-03-17 | Novo Industri As | Fremstilling af proteiner |
ATE80657T1 (de) | 1986-07-09 | 1992-10-15 | Novo Nordisk As | Mischungen von alpha-amylase zur verfluessigung von staerke. |
WO1989003421A1 (en) | 1987-10-15 | 1989-04-20 | Novo Industri A/S | Thermostable cyclodextrin glycosyl transferase, its production and use |
DE69107455T3 (de) | 1990-05-09 | 2004-09-23 | Novozymes A/S | Eine ein endoglucanase enzym enthaltende zellulasezubereitung. |
KR930702514A (ko) | 1990-09-13 | 1993-09-09 | 안네 제케르 | 리파제 변체 |
ATE311439T1 (de) | 1995-04-21 | 2005-12-15 | Novozymes As | Varianten der cyclomaltodextrin- glucanotransferase |
EP0887061A1 (en) * | 1997-06-28 | 1998-12-30 | The Procter & Gamble Company | Faecal collector |
-
1999
- 1999-02-26 NZ NZ505820A patent/NZ505820A/xx not_active IP Right Cessation
- 1999-02-26 WO PCT/DK1999/000088 patent/WO1999043794A1/en active IP Right Grant
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- 1999-02-26 EP EP10181883.9A patent/EP2305799B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-26 TR TR2000/02498T patent/TR200002498T2/xx unknown
- 1999-08-31 US US09/386,607 patent/US6162628A/en not_active Expired - Lifetime
-
2010
- 2010-04-01 JP JP2010085577A patent/JP5174077B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1996023874A1 (en) * | 1995-02-03 | 1996-08-08 | Novo Nordisk A/S | A method of designing alpha-amylase mutants with predetermined properties |
WO1997041213A1 (en) * | 1996-04-30 | 1997-11-06 | Novo Nordisk A/S | α-AMYLASE MUTANTS |
WO1997043424A1 (en) * | 1996-05-14 | 1997-11-20 | Genencor International, Inc. | MODIFIED α-AMYLASES HAVING ALTERED CALCIUM BINDING PROPERTIES |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
JPN6009018241; FEMS Microbiology Letters Vol.56, 1988, p.53-60 * |
JPN6009018243; Protein Engineering Vol.3, No.3, 1990, p.181-191 * |
JPN6009018244; Biochem. J. Vol.280, 1991, p.51-55 * |
JPN6009018246; Plant Molecular Biology Vol.25, 1994, p.141-157 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2305799A2 (en) | 2011-04-06 |
CN1292028B (zh) | 2013-08-14 |
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NZ505820A (en) | 2002-10-25 |
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CA2759907A1 (en) | 1999-09-02 |
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US6162628A (en) | 2000-12-19 |
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