JP2009531054A - キナーゼインヒビターを含む培養培地およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)GSK3のインヒビター;および
(2)MEKのインヒビター、
を含む培地中で該細胞を維持する工程を含む。
(1)GSK3のインヒビター;
(2)MEKのインヒビター;および
(3)FGFレセプターのアンタゴニスト、
を含む培地中で該細胞を維持する工程を含む。
必要に応じてフィーダー上で、培養物中でES細胞を多能性状態に維持する工程;
少なくとも1回該ES細胞を継代する工程;
該培地から血清または血清抽出物を除去しそして(存在する場合)該フィーダーを除去して、該培地がフィーダー、血清および血清抽出物を含まないようにする工程;および
続いて、GSK3のインヒビター、MEKインヒビターおよび必要に応じてFGFRアンタゴニストの存在下でES細胞を多能性状態に維持する工程。
選択マーカーをコードする構築物でES細胞をトランスフェクトする工程;
該ES細胞をプレートする工程;
MEKインヒビター、GSK3インヒビターおよび必要に応じてFGFRアンタゴニストの存在下で該ES細胞を培養する工程;および
該選択マーカーを発現する細胞を選択する工程、
を含む。
基本培地;
MEKインヒビター;
GSK3インヒビター;および
鉄トランスポーター;
を含み、ここで、該培地は、必要に応じて、血清および血清抽出物を含まない。
(1)胚盤胞を得る工程;
(2)MEKインヒビター、GSK3インヒビターおよび必要に応じてFGFレセプターのアンタゴニストの存在下で該胚盤胞を培養して、内部細胞塊を得る工程;
(3)該内部細胞塊を解離する工程;
(4)該解離した内部細胞塊から1または複数の細胞を単離する工程;および
(5)該単離した1または複数の細胞を、MEKインヒビター、GSK3インヒビターおよび必要に応じてFGFレセプターのアンタゴニストの存在下で培養する工程、
を含む。
必要に応じてフィーダー上で、培養物中でES細胞を多能性状態に維持する工程;
少なくとも1回該ES細胞を継代する工程;
培地から(存在する場合)血清または血清抽出物を除去しそして(存在する場合)該フィーダーを除去して、該培地がフィーダー、血清および血清抽出物を含まないようにする工程;および
続いて、MEKインヒビターおよびFGFレセプターのインヒビターの存在下でES細胞を多能性状態に維持する工程。
選択マーカーをコードする構築物でES細胞をトランスフェクトする工程;
該ES細胞をプレートする工程;
MEKインヒビターおよびFGFレセプターアンタゴニストの存在下で該ES細胞を培養する工程、および
該選択マーカーを発現する細胞を選択する工程、
を含む。
基本培地;
MEKインヒビター;
FGFレセプターのアンタゴニスト;および
鉄トランスポーター、
を含む。
(1)胚盤胞を得る工程;
(2)MEKインヒビターおよびFGFレセプターのアンタゴニストの存在下で該胚盤胞を培養して、内部細胞塊を得る工程;
(3)該内部細胞塊を解離する工程;
(4)該解離した内部細胞塊から1または複数の細胞を単離する工程;および
(5)該単離した1または複数の細胞を、MEKインヒビターおよびFGFレセプターのアンタゴニストの存在下で培養する工程、
を含む。
マウスおよびヒトES細胞を、特に明記のない限りN2B27培地を用いて、そしてGSK−3βインヒビターであるCHIR99021、AR−AO144−18、SB216763およびSB415286、ならびにMEKインヒビターであるPD184352の存在下または不在下で、種々の条件下で増殖させた。
N2 100×ストック溶液。10mlについて:1mlのインスリン(最終濃度2.5mg/ml)を1mlのアポトランスフェリン(最終濃度10mg/ml)、0.67mlのBSA(最終濃度5mg/ml)、33μlのプロゲステロン(最終濃度2μg/ml)、100μlのプトレシン(最終濃度1.6mg/ml)、10μlの亜セレン酸ナトリウム(最終濃度3μM)および7.187mlのDMEM/F12と混合する。4℃で貯蔵し、そして1カ月以内に使用する。
無血清培地中では、MEKインヒビター+GSK−3βインヒビターは、(1)N2B27培地、および(2)完全限定培地(DMEM/F12−N2)の両方で、マウスES細胞の自己再生を維持するのに十分であった(データは示さず)。ES細胞の自己再生は、MEKインヒビター、GSK−3βインヒビターおよびLIFを含む培地中でさらに改善された(データは示さず)。
PD184352(MEKのインヒビター)がES細胞中のNanogのレベルを増加させることが示された(データは示さず)。さらに、PD184352で処理されたNanog−/−ES細胞がES細胞の自己再生の増強を示さなくなることが示された。実際、これらの細胞は分化した(データは示さず)。これにより、PD184352によるES自己再生表現型の増強がNanogによって仲介されることが立証された。
ヒトES細胞を、GSK−3インヒビターであるCHIR99021およびMEKインヒビターであるPD184352を追加した培地で培養した。
マウスES細胞を、GSK−3インヒビターであるCHIR99021およびMEKインヒビターであるPD184352を追加した培地で培養した。
マウスおよびヒトES細胞を、CHIR99021、PD184352およびSU5402を含む培地で増殖させ、該培地は以下のように調製した:
DMEM/F12−N2培地の調製
100mlのDMEM/F12(Gibco 42400-010)に対して、1mlのN2 100×ストック溶液を添加する。DMEM/F12培地中のN2の各構成成分の最終濃度は:
インスリン 25μg/ml
プトレシン 16μg/ml
トランスフェリン 100μg/ml
亜セレン酸ナトリウム 30nM
プロゲステロン 6ng/ml
BSA 50μg/ml
である。
100mlのNeurobasal培地(Gibco 21103-049)に対して、2mlのB27(Gibco 17504-044)および1〜2M L−グルタミン(TC保存 1:100)を添加する。
DMEM/F12−N2培地をNeurobasal/B27培地と1:1の比で混合する。この培地を、すべての化合物の希釈および細胞の増殖に用いた。
マウスES細胞を、FGFレセプターのインヒビターおよびMEKインヒビターの存在下で培養した。選択的薬理学的インヒビターSU5402およびPD184352を、それぞれFGFレセプターチロシンキナーゼの阻害およびMEK1/2を経たErk1/2の活性化の阻害のために用いた。発明者らは、どちらのインヒビターの添加も、BMP4を供給することなく、LIFを含むN2B27培地中で強固にES細胞を増殖させるに十分であることを見出した(データは示さず)。未分化の培養物は、これらの条件において、多能性マーカーOct4、NanogおよびRex1の発現を保持しながら継続的に継代され得る。LIF+BMPで維持された培養物中よりもId遺伝子の発現がはるかに低いにも関わらず、神経への運命づけは生じていない。
発明者らは、2i培地中におけるES細胞の増殖の減少は、pErkの下流のRskによる阻害的リン酸化の解放の結果生じるグリコーゲン合成酵素キナーゼ3(GSK−3)活性の増加によるものであり得ると結論づけた。CHIR99021は、GSK−3の十分に特徴づけられた高選択性小分子インヒビターであり、これはGSK−3活性を完全にブロックする濃度でサイクリン依存性キナーゼ(CDK)と交差反応しない。発明者らは、血清存在下の培養物に添加した場合、CHIR99021(3μM)は、LIFの存在下であっても、実際に分化を促進することを見出した。無血清のN2B27培地中では、分化応答は減少し、そしていくつかのコロニーは、数日間、形態的に未分化であるように見える。しかし、継代した後、未分化細胞は生き残らない。同様の結果が、広く用いられる他の2つのGSK−3インヒビターであるSB216763およびSB415286でも、(どちらもES細胞にいくぶん有毒のようであったが)得られた。
培養処方物が十分にES細胞の自己再生を持続させるかに関する厳密な試験は、個々の細胞による未分化コロニーの形成である。単一細胞の堆積の後、N2B27+3i中のコロニー形成率は25%(98/384)であり、LIF+BMP(11%、23/192)よりも高い(データは示さず)。これらのコロニーはOct4−GFPを発現し、そして未分化ES細胞として継代可能である。したがって、MEKインヒビター、FGFレセプターのインヒビターおよびGSK3インヒビターを含む培地は、単一細胞に由来する未分化ES細胞コロニーの形成を持続させることが可能である。
発明者らは、3iが、胚から直接新たなES細胞を誘導する十分な能力を有したのか、あるいは確立した系の適応を反映したのかを検討した。許容的な129系統からの胚盤胞を、ゼラチンコートされたプラスチック上のN2B27+3i中に直接プレートし、5日間培養した。続く内部細胞塊の解離および再プレートの後、12個の胚のうち7個からES細胞コロニーが得られた。これらのうち3個を増殖させ、胚盤胞に注入した。すべてにおいて、キメリズムおよび生殖系列遺伝が高い比率で得られた(表2)。続いて、発明者らは、C57BL/6および非許容的なCBAおよびMF1系統から複数のES細胞を誘導し、3iが胚盤葉上層細胞からES細胞への移行を容易にすることを示した。発明者らは、3iが、発生能を選択または損失させることなく、外因性のLIFおよびBMP/血清の要求からES細胞を解放すると結論付ける。
Claims (71)
- MEKインヒビターおよびGSK3インヒビターを含む、培養培地。
- FGFレセプターのアンタゴニストをさらに含む、請求項1に記載の培養培地。
- 前記MEKインヒビターが、MEK1インヒビターである、請求項1または2に記載の培養培地。
- 前記MEKインヒビターが、PD184352およびPD98059から選択される、前記いずれかの請求項に記載の培養培地。
- 前記GSK3インヒビターが、GSK−3βのインヒビターである、前記いずれかの請求項に記載の培養培地。
- 前記GSK3インヒビターが、cdc2および/またはerk2よりもGSK3に対して選択性である、前記いずれかの請求項に記載の培養培地。
- 前記GSK3インヒビターが、cdc2よりもGSK3に対して少なくとも100倍選択性である、請求項6に記載の培養培地。
- 前記GSK3インヒビターが、cdc2よりもGSK3に対して少なくとも200倍選択性である、請求項6に記載の培養培地。
- 前記GSK3インヒビターが、CHIR99021である、前記いずれかの請求項に記載の培養培地。
- gp130アゴニストをさらに含む、前記いずれかの請求項に記載の培養培地。
- 前記gp130アゴニストが、LIF、CNTF、カルジオトロフィン、オンコスタチンM、IL−6+sIL−6レセプターまたはハイパーIL−6である、請求項10に記載の培養培地。
- 前記gp130アゴニストが、(a)LIF、(b)sIL−6RおよびIL−6、または(c)ハイパーIL−6である、請求項10に記載の培養培地。
- 前記FGFレセプターアンタゴニストが、FGFR1のアンタゴニストである、請求項2から12のいずれかに記載の培養培地。
- SU5402を含む、請求項13に記載の培養培地。
- PD173074を含む、請求項13に記載の培養培地。
- アポトーシスのインヒビターを含む、前記いずれかの請求項に記載の培養培地。
- N2培地および/またはB27培地を含む、前記いずれかの請求項に記載の培養培地。
- PD184352、CHIR99021およびSU5402を含む、前記いずれかの請求項に記載の培養培地。
- 前記いずれかの請求項に記載の、ヒトES培養培地。
- 請求項1から18のいずれかに記載の、マウスES細胞培養培地。
- 多能性細胞のための培養培地の製造におけるMEKインヒビターおよびGSK3インヒビターの使用。
- 多能性細胞のための培養培地の製造におけるMEKインヒビター、GSK3インヒビターおよびFGFレセプターのアンタゴニストの使用。
- 前記培地が、マウスES細胞の培養のためである、請求項21または22に記載の使用。
- 前記培地が、ヒトES細胞の培養のためである、請求項21または22に記載の使用。
- 前記培地が、ラット多能性細胞の培養のためである、請求項21または22に記載の使用。
- 自己再生を促進するための多能性細胞の培養方法であって、請求項1から18のいずれかに記載の培地中で該細胞を維持する工程を含む、方法。
- 前記培地が、血清を含まないおよび血清抽出物を含まない、請求項26に記載の方法。
- 前記細胞が、マウス細胞である、請求項26または27に記載の方法。
- 前記細胞が、ヒト細胞である、請求項26または27に記載の方法。
- 前記細胞が、ラット細胞である、請求項26または27に記載の方法。
- ES細胞の培養方法であって、以下の工程:
必要に応じてフィーダー上で、培養物中でES細胞を多能性状態に維持する工程;
少なくとも1回該ES細胞を継代する工程;
培地から(存在する場合)血清または血清抽出物を除去しそして(存在する場合)該フィーダーを除去し、該培地がフィーダー、血清および血清抽出物を含まないようにする工程;および
続いて、MEKインヒビターおよびGSK3インヒビターの存在下でES細胞を多能性状態に維持する工程、
を含む、方法。 - 前記細胞が、MEKインヒビター、GSKインヒビターおよびgp130下流シグナリング経路のアクチベーターの存在下で多能性状態に維持される、請求項31に記載の培養方法。
- 前記細胞が、MEKインヒビター、GSKインヒビターおよびFGFレセプターアンタゴニストの存在下で多能性状態に維持される、請求項31に記載の方法。
- 前記細胞が、マウス細胞である、請求項31から33のいずれかに記載の方法。
- 前記細胞が、ヒト細胞である、請求項31から33のいずれかに記載の方法。
- ES細胞のトランスフェクトされた集団を得る方法であって、
選択マーカーをコードする構築物でES細胞をトランスフェクトする工程;
該ES細胞をプレートする工程;
MEKインヒビターおよびGSK3インヒビターの存在下で該ES細胞を培養する工程;および
該選択マーカーを発現する細胞を選択する工程、
を含む、方法。 - 前記ES細胞が、MEKインヒビター、GSKインヒビターおよびgp130下流シグナリング経路のアクチベーターの存在下で培養される、請求項36に記載の方法。
- 前記ES細胞が、MEKインヒビター、GSKインヒビターおよびFGFレセプターアンタゴニストの存在下で培養される、請求項36に記載の方法。
- 前記細胞が、マウス細胞である、請求項36から38のいずれかに記載の方法。
- 前記細胞が、ヒト細胞である、請求項36から38のいずれかに記載の方法。
- 血清および血清抽出物を含まず、そして
基本培地;
MEKインヒビター;
GSK3インヒビター;および
鉄トランスポーター、
を含む、細胞培養培地。 - gp130下流シグナリング経路のアクチベーターをさらに含む、請求項41に記載の培養培地。
- FGFレセプターのアンタゴニストをさらに含む、請求項41または42に記載の培養培地。
- インスリン、アルブミンおよびトランスフェリンをさらに含む、請求項41から43のいずれかに記載の培養培地。
- アポトーシスのインヒビターをさらに含む、請求項41から44のいずれかに記載の培養培地。
- 胚盤胞から多能性細胞を誘導する方法であって、
(1)胚盤胞を得る工程;
(2)MEKインヒビターおよびGSK3インヒビターの存在下で該胚盤胞を培養して、内部細胞塊を得る工程;
(3)該内部細胞塊を解離する工程;
(4)該解離した内部細胞塊から1または複数の細胞を単離する工程;および
(5)該単離した1または複数の細胞を、MEKインヒビターおよびGSK3インヒビターの存在下で培養する工程、
を含む、方法。 - 前記単離した1または複数の細胞が、gp130下流シグナリングのアクチベーター、MEKインヒビターおよびGSK3インヒビターの存在下で培養される、請求項46に記載の方法。
- 前記単離した1または複数の細胞が、FGFレセプターのアンタゴニスト、MEKインヒビターおよびGSK3インヒビターの存在下で培養される、請求項46に記載の方法。
- 前記胚盤胞をLIF中で、2〜4日の期間に亘って培養する工程を含む、請求項46から48のいずれかに記載の方法。
- 第1の容器および第2の容器を含むキットであって、該第1の容器がGSK3インヒビターを含み、そして該第2の容器がMEKインヒビターを含む、キット。
- FGFレセプターのアンタゴニストを含む第3の容器をさらに含む、請求項50に記載のキット。
- 前記GSK3インヒビター、前記MEKインヒビターおよび前記FGFRアンタゴニストが、請求項3から9または13から15に定義される通りである、請求項37に記載のキット。
- gp130下流シグナリングのアクチベーターを含むさらなる容器を含む、請求項50から52のいずれかに記載のキット。
- 前記gp130アゴニストが、(a)LIF、(b)sIL−6RおよびIL−6、または(c)ハイパーIL−6である、請求項53に記載のキット。
- 多能性幹細胞の自己再生の促進におけるMEKインヒビターおよびGSK3インヒビターの使用。
- 多能性幹細胞の自己再生の促進におけるMEKインヒビター、GSK3インヒビターおよびFGFレセプターのアンタゴニストの使用。
- 幹細胞集団を増殖させる方法であって、MEKインヒビターおよびGSK3インヒビターの存在下で幹細胞を培養する工程を含む、方法。
- 幹細胞集団を増殖させる方法であって、MEKインヒビター、GSK3インヒビターおよびFGFレセプターのアンタゴニストの存在下で幹細胞を培養する工程を含む、方法。
- Nanogを発現している多能性幹細胞の自己再生の促進におけるMEKインヒビターおよびGSK3インヒビターの使用。
- Nanogを発現している多能性幹細胞の自己再生の促進におけるMEKインヒビター、GSK3インヒビターおよびFGFレセプターのアンタゴニストの使用。
- MEKインヒビターおよびFGFレセプターのアンタゴニストを含む、培養培地。
- 多能性細胞のための培養培地の製造におけるMEKインヒビターおよびFGFレセプターのアンタゴニストの使用。
- 自己再生を促進するための多能性細胞の培養方法であって、MEKインヒビターおよびFGFレセプターのアンタゴニストを含む培地中で該細胞を維持する工程を含む、方法。
- ES細胞の培養方法であって、以下の工程:
必要に応じてフィーダー上で、培養物中でES細胞を多能性状態に維持する工程;
少なくとも1回該ES細胞を継代する工程;
培地から(存在する場合)血清または血清抽出物を除去しそして(存在する場合)該フィーダーを除去し、該培地がフィーダー、血清および血清抽出物を含まないようにする工程;および
続いて、MEKインヒビターおよびFGFレセプターのインヒビターの存在下でES細胞を多能性状態に維持する工程、
を含む、方法。 - ES細胞のトランスフェクトされた集団を得る方法であって、
選択マーカーをコードする構築物でES細胞をトランスフェクトする工程;
該ES細胞をプレートする工程;
MEKインヒビターおよびFGFレセプターアンタゴニストの存在下で該ES細胞を培養する工程;および
該選択マーカーを発現する細胞を選択する工程、
を含む、方法。 - 血清および血清抽出物を含まず、そして
基本培地;
MEKインヒビター;
FGFレセプターのアンタゴニスト;および
鉄トランスポーター、
を含む、細胞培養培地。 - 胚盤胞から多能性細胞を誘導する方法であって、
(1)胚盤胞を得る工程;
(2)MEKインヒビターおよびFGFレセプターのアンタゴニストの存在下で該胚盤胞を培養して、内部細胞塊を得る工程;
(3)該内部細胞塊を解離する工程;
(4)該解離した内部細胞塊から1または複数の細胞を単離する工程;および
(5)該単離した1または複数の細胞を、MEKインヒビターおよびFGFレセプターのアンタゴニストの存在下で培養する工程、
を含む、方法。 - 第1の容器および第2の容器を含むキットであって、該第1の容器がMEKインヒビターを含み、そして該第2の容器がFGFレセプターのアンタゴニストを含み、
該キットが、本明細書に記載される他の容器および/または構成成分もまた含み得る、キット。 - 多能性幹細胞の自己再生の促進におけるMEKインヒビターおよびFGFレセプターのアンタゴニストの使用。
- Nanogを発現している多能性幹細胞の自己再生の促進におけるMEKインヒビターおよびFGFレセプターのアンタゴニストの使用。
- 幹細胞集団を増殖させる方法であって、MEKインヒビターおよびFGFレセプターのアンタゴニストの存在下で幹細胞を培養する工程を含む、方法。
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