JP2016537971A - 多能性幹細胞の培養 - Google Patents

Abstract

未分化状態で多能性幹細胞を培養し、維持する方法が提供されている。本方法はＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＡＭＰＫ及び／又はＢＭＰシグナル伝達の二重阻害剤、並びにＬＩＦを含む培地でその多能性幹細胞を培養する工程を含む。本方法により作製した細胞、細胞培養培地及び記載の方法を実施するためのキットも提供されている。【選択図】なし

Description

本発明は幹細胞に関する。特に、本発明は、未分化状態で多能性幹細胞を培養し維持する方法に関する。

胚性幹細胞（ＥＳＣ）は胚盤胞の内細胞塊（ＩＣＭ）に由来している。ＥＳＣは３タイプの胚葉及び成体からの潜在的にすべての細胞に分化することができる。

この多能特性は、こうした細胞を再生医療の分野において好ましいものにするものであり、初期胚発生を詳細に検討するための極めて貴重なツールとなる。ＥＳＣはこの特性を内細胞塊の多能性エピブラスト細胞と共有しているが、相違点も認められている。

生体内における発生によく似たヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の状態を備えていることは非常に有益であると思われるが、ｈＥＳＣの生体外培養条件が、多能性が一時的にしか存在しない胚盤胞の環境を再現する際にどれ程までに限定されるかは明らかではない。

マウスでは、多種類の細胞が多能性の要件を満たし、これらのはっきりと異なる細胞が異なる胚発生段階に対応していることが報告されている。

また、異なる多能性状態の因子を媒介とする分離がヒト細胞に成功裏に適用されており、多種類の多能性細胞間で原則相互変換可能であることが明らかになっている。

天然の多能性エピブラストにさらに酷似しているｈＥＳＣを得るためには、導入遺伝子を用いない方法が有利であると思われる。

そこで、本発明は、従来技術の欠点を改善し、より効率的に分化する多能性幹細胞状態を提供し、維持することを目的とする。

第一の態様において、未分化状態で多能性幹細胞を培養し、維持する方法であって、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＡＭＰＫ及び／又はＢＭＰシグナル伝達の二重阻害剤、並びにＬＩＦを含む培地でその多能性幹細胞を培養することを含む方法を提供する。

第二の態様において、本明細書に記載した方法により作製した多能性幹細胞を提供する。

第三の態様において、多能性幹細胞から系譜特異的細胞を生じさせる方法であって、ａ）本明細書に記載の方法に従って未分化状態で多能性幹細胞を培養する工程、ｂ）この未分化多能性幹細胞を単離する工程、及びｃ）この単離した多能性幹細胞を系譜特異的細胞に分化させるのに適した培養培地中でこの単離した未分化多能性幹細胞を培養する工程、を含む方法を提供する。

第四の態様において、未分化状態で多能性幹細胞を培養し、維持するための、本明細書に記載の方法で使用されるキットであって、記載したような培養培地及び使用説明書を含むキットを提供する。

定義
本明細書で用いている「培養培地」という語句は、幹細胞及び上記細胞諸系譜のいずれかの成長を支持するのに使用される液状物質のことをいう。一部の実施態様において本発明により使用する培養培地は、塩類、栄養素、ミネラル、ビタミン類、アミノ酸類、核酸類、サイトカイン類、成長因子類などのタンパク質及びホルモン類などの諸物質の組合せを含むことがある水基性の培地とすることができる。

本明細書で用いている「フィーダー細胞」という用語は、幹細胞をフィーダー細胞上で共培養した時に、又はこの多能性幹細胞をフィーダー細胞によって作られた馴化培地の存在下にマトリクス（例えば、細胞外マトリクス若しくは合成マトリクス）上で培養した時にこの幹細胞を増殖状態に維持するフィーダー細胞（例えば、線維芽細胞）のことをいう。このフィーダー細胞の支持は、培養中のフィーダー細胞群の構造（例えば、組織培養皿におけるフィーダー細胞群の培養により形成される三次元マトリクス）、フィーダー細胞の機能（例えば、フィーダー細胞による成長因子、栄養素及びホルモンの分泌、フィーダー細胞の成長速度、老化前のフィーダー細胞の増殖能）及び／又は幹細胞のフィーダー細胞層（単数又は複数）への付着に依存している。

本明細書で用いている「ラミニン」という用語は、通常は細胞外マトリクスの形成及び維持に関与している糖タンパク質のファミリーのいずれかのことをいう。ラミニンはα鎖、β鎖及びγ鎖から形成されるヘテロ三量体である。本開示の一部の態様では、各種ラミニンの断片、誘導体又は類似体、例えば、少なくとも一部分がラミニンα１鎖と少なくとも実質的に相同であるラミニン類、を用いることができる。

本明細書で用いている「コラーゲン」という用語は、全てのコラーゲン類並びに天然のものかどうかを問わず、任意の形態のコラーゲン、アテロコラーゲン、不溶性コラーゲン、コラーゲン線維、可溶性コラーゲン及び酸可溶性コラーゲンを意味するものとする。

本明細書で用いている「フィブロネクチン」という用語は、ジスルフィド結合した二量体糖タンパク質のことをいう（これは血漿及などの体液中に可溶型で存在し、疎性結合組織の細胞外マトリクスの主要成分の１つとして線維状に沈着している。これは、フィブロネクチン分子のモジュール構造化をもたらすＩ、ＩＩ及びＩＩＩ型同族体と称する３種の異なる構造モチーフからなり、この分子のいくつかの生物活性はそれぞれ特定のドメインに起因するものである。

本明細書で用いている「プロテオグリカン」という用語は、「ヒト分泌型プロテオグリカン」のことを意味し、プロテオグリカンのコアタンパク質に共有結合したグリコサミノグリカン鎖を含有するものと含有しないものがある。この用語は、ヒト分泌型プロテオグリカンのペプチド断片であって、そのペプチドコアタンパク質が生物学的（機能的又は構造的）活性を保持しているプロテオグリカンの部分断片といった天然のものよりも少ない数のアミノ酸を含むヒト分泌型プロテオグリカンのペプチド断片をも意味するものである。

本明細書で用いている「機能的」という用語は、天然の非組み換え型タンパク質と同様に特定の生物反応を誘導することができることである。構造的活性の一例は、天然の非組み換え型タンパク質をも認識する抗体に結合できることである。また、この用語は、生物学的（機能的又は構造的）活性を示す、天然型タンパク質又はその類似体の配列を１個以上の隣接アミノ酸と共に含む任意のペプチドをも含めるために用いている。

「機能的誘導体」は、非組み換え型タンパク質又は他の生体分子の生物学的活性と実質的に類似している生物学的活性（機能的又は構造的）に関係したものである。機能的誘導体は翻訳後の改変箇所を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。「機能的誘導体」という用語には、分子の「断片」、「変異体」、「類似体」、又は「化学的誘導体」を含めるものとする。

本明細書で用いている「断片」という用語は、上記分子の任意の変異体、例えば、そのペプチドコア、又は機能的であってもなくてもよいそのペプチドコアの変異体を指すものとする。

本明細書で用いている「変異体」という用語は、構造及び生物学的活性が上記分子全体又はその断片に実質的に類似している分子を指すものとする。従って、２種の分子が類似の活性を有する限り、これらの分子の一方の組成又は二次、三次若しくは四次構造が他方のそれと同一でなくても、或いはアミノ酸残基の配列が同一でなくても、これらは、その用語が本明細書で用いられているような変異体とみなす。

本明細書で用いている分子の「類似体」は、機能がその分子全体又はその断片に実質的に類似している分子のことを指すものとする。本明細書で用いている「分子」は、これが本来なら分子の一部ではない化学的部分を更に含む場合の別の分子の「化学的誘導体」という。このような部分は、分子の溶解性、吸収、生物学的半減期などを改善することができる。その他、こうした部分は、分子の毒性の低下、分子の望ましくない副作用の除去又は低減などをもたらすこともできる。このような効果を媒介することができる部分はレミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）のファーマシューティカル・サイエンシズ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（１９８０）に開示されている。このような部分を分子に連結させる手法は当該分野において周知である。

本明細書で用いている「エンタクチン」という用語は、ニドゲン−１（ＮＩＤ−１）を指すものとする。エンタクチンは、ＩＶ型コラーゲン、プロテオグリカン類（ヘパラン硫酸及びグリコサミノグリカン類）、ラミニン及びフィブロネクチンなどの他の成分と共に基底膜の一成分である。

本明細書で用いている「ヘパラン硫酸」とは、炭水化物類のグリコサミノグリカンファミリーの一員であり、構造上ヘパリンに極めて密接に関連している。いずれも可変的に硫酸化された繰り返し二糖類単位からなる。

本明細書で用いている「生体高分子」という用語は、単一の生体高分子又は２種以上の生体高分子の混合物のことを指す。「生体高分子類」は、多糖類（セルロース、澱粉など）を含むがこれに限定されるものではない天然の高分子並びに天然産物から合成された高分子類及び副産物の両者を表すのに用いている。

本明細書で用いているＲＮＡの塩基配列決定法とは、ＲＮＡ分子の配列を決定し、及び／又は試料中のＲＮＡ分子の量を定量するのに用いる技術のことをいう。ＲＮＡ分子としては、全ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又はＲＮＡ断片が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本明細書で用いている実時間ＰＣＲとは、アッセイシグナルをＰＣＲ反応の終点で検出する従来型のＰＣＲ法に対して、各ＰＣＲ増幅サイクル中の単位複製配列産生の指標としてＰＣＲアッセイから反応中に（即ち、「実時間」で）発せられるシグナルをモニターするのに用いられるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術のことをいう。

本明細書で用いている「ＭＥＫ阻害剤」とは、マイトジェン活性化蛋白質キナーゼ酵素ＭＥＫ１及び／又はＭＥＫ２を阻害する化学物質又は薬物である。

本明細書で用いているＧＳＫ３阻害剤とは、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３を阻害する化学物質又は薬物である。

本明細書で用いているＡＭＰＫ阻害剤とは、５’アデノシン一リン酸活性化蛋白質キナーゼを阻害する化学物質又は薬物である。

本明細書で用いているＢＭＰシグナル伝達阻害剤とは、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達を阻害する化学物質又は薬物である。

本明細書で用いている「ＬＩＦ」とは、白血病阻止因子のことをいう。

本明細書で用いている「系譜特異的細胞」という用語は、体細胞又はオルガノイド細胞とすることができる。別の実施態様では、この系譜特異的細胞は内胚葉系譜細胞とすることができる。別の実施態様では、この体細胞は、１種若しくは数種の体細胞系譜細胞又は完全に成熟した分化体細胞へ自己複製又は分化することができる委任前駆細胞とすることができる。

本明細書に例示的に記載されている本発明は、本明細書で具体的に開示されていないいかなる１つ又は複数の要素、或いは１つ又は複数の限定が存在しない限り適宜に実施することができる。従って、例えば、本明細書に記載されている「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」、「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（含有する）」などの用語は拡張的に、かつ、限定されることなく解釈されるべきである。さらに、本明細書で用いられている用語及び表現は、限定ではなく説明の用語として使用され、そのような用語及び表現の使用には、図示され説明された特徴のいかなる均等物又はそれらの部分も除外を意図するものではなく、当然のことながら、様々な修正が、特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲内で可能である。従って、本発明を好ましい実施態様及び任意選択の特徴により具体的に開示してきたが、本明細書に開示されている具体化された発明の修正及び変更を当業者は行使することができ、そのような修正及び変更は、本発明の範囲内にあると見なされることは理解されよう。

本明細書において、本発明を幅広く且つ一般的に説明してきた。一般的開示に含まれるより狭い種及び亜属集団の各々も、本発明の一部を形成する。これには、削除された材料が本明細書で具体的に挙げられているか否かに関係なく、その属由来の対象物を除くという条件又は消極的な限定で本発明の一般的説明が含まれる。

他の実施態様は、以下の特許請求の範囲及び限定されない実施例の範囲内にある。さらに、本発明の特徴又は態様がマーカッシュグループの用語で記載されている場合、当業者には当然のことながら、本発明は、マーカッシュグループの個々のメンバー又は下位グループのメンバーの用語でも記載される。

本発明は、詳細な説明を参照し、以下の限定されない実施例及び添付図面を合わせて考慮すれば、よりよく理解できよう。

図１は、ヒト多能性細胞状態を支持する新規培養条件に関する小分子スクリーニングの結果を示す図である。Ａ）は、新規多能性細胞状態を支持する培養条件を特定するために用いた小分子のリストである。これらの化学物質及びこれらが標的とするそれぞれの経路の名称が示されている。 Ｂ）は、多能性マーカＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４及びＴＲＡ−１−６０に関して各化学物質で処理したｈＥＳＣの染色結果を示す。ｈＥＳＣは、１：１２の割合で接種し、４日間、接種後４８時間に各化学物質で処理する。多能性マーカのレベルは、ＤＭＳＯで処理した対照細胞に比してほとんど不変のままである。目盛り尺は２００μｍを表す。 Ｃ）は、各化学物質で処理したｈＥＳＣにおける各多能性マーカの遺伝子発現量を示す。ＴＧＦβ阻害剤ＲｅｐＳＯＸ及びＡ８３−０１並びにＧＳＫ３β阻害剤ＢＩＯで処理したｈＥＳＣは、ＮＡＮＯＧ及びＰＯＵ５Ｆ１の下方制御を示す。 Ｄ）は、本研究で用いている小分子化合物の２４種の組合せを示したものである。 Ｅ）は、小分子の２４種の組合せで処理後のｈＥＳＣコロニーの形態を示す。目盛り尺は２００μｍを表す。 Ｆ）は、細胞を組合せ２２（ＰＤ０３／ＢＩＯ／ＤＯＲ）の各化学物質で処理し、フィーダー上で継代培養し、４日後採取して多能性マーカの発現を調べた結果を示す。ＰＤ０３又はＤＯＲで処理した細胞ではＮＡＮＯＧ及びＰＯＵ５Ｆ１の発現は同等の範囲に留まっている。ＮＡＮＯＧ及びＰＯＵ５Ｆ１はＢＩＯ処理細胞では下方制御された。系譜マーカの発現量についても分析した。ＰＤ０３処理細胞においてはＰＡＸ６転写産物が増加し、ＢＩＯで処理した細胞ではＴ及びＧＡＴＡ６の上方制御の増強が認められている。全ての値は独立した３実験の平均値±ｓ．ｄ．である。 Ｇ）は、変換時の３ｉＬ ｈＥＳＣ培養条件から各小分子又はＬＩＦを除去した結果を示す。ｈＥＳＣは、３ｉＬ ｈＥＳＣ条件を用い、上記３種の小分子のうちの１種又はＬＩＦを用いずに処理した。ｈＥＳＣコロニーがもはや維持できなくなった時に細胞を採取して発現を解析した。ＰＤ０３又はＬＩＦを用いずに培養した細胞は２継代後に採取したが、ＢＩＯ又はＤＯＲを用いずに培養した細胞は４継代後に採取した。小分子及びＬＩＦを除去すると、多能性遺伝子の発現が低下した。対照の３ｉＬ ｈＥＳＣに対して正規化することにより相対的発現量が得られている。全ての値は独立した３実験の平均値±ｓ．ｄ．である。 図２は、ｈＥＳＣの小分子処理による新規ＬＩＦ依存性ｈＥＳＣ状態の誘導を示す図である。Ａ）は、接種後４８時間における小分子の２４種の組合せによる処理を４日間行ったｈＥＳＣに関する多能性マーカＮＡＮＯＧ（上段）及びＰＯＵ５Ｆ１（下段）の発現量を示す。ＤＭＳＯで処理した対照試料に対する正規化により相対的発現量が得られている。全ての値は独立した３実験の平均値±ｓ．ｄ．である。 Ｂ）は、マウス線維芽細胞フィーダー上において化学物質の組合せ２１乃至２４で処理したｈＥＳＣの増殖を示す。組合せ２２で処理したｈＥＳＣのみが小さく密なコロニーを形成している。目盛り尺は２００μｍを表す。 Ｃ）は、組合せ２２で処理した細胞はヒトＬＩＦの存在下でのみ増殖することを示している。組合せ２２で処理した細胞は、ＬＩＦを用いて又は用いずに連続的に継代培養した。各継代（Ｐ１乃至Ｐ３）において、細胞は集密化時に固定し、ｈＥＳＣ特異的表面マーカＴＲＡ−１−６０で染色した。目盛り尺は２００μｍを表す。 Ｄ）は、ＬＩＦを用い、又は用いずに３ｉで培養したｈＥＳＣに関するＴＲＡ−１−６０陽性コロニー数を示す（Ｐ１乃至３）。全ての値は独立した３実験の平均値±ｓ．ｄ．である。 Ｅ）は、３ｉＬ ｈＥＳＣ及びｈＥＳＣの形態を示す。目盛り尺は２００μｍを表す。 Ｆ）は、３ｉＬ ｈＥＳＣが単一細胞として継代培養することができることを示している。３ｉＬ ｈＥＳＣ及びｈＥＳＣは、９６穴培養皿中にクローン密度で単一細胞として継代培養した。ＲＯＣＫ阻害剤（１μＭチアゾビビン）を用い、又は用いずに処理したｈＥＳＣを対照とした。この細胞は５日間維持し、固定してＯＣＴ４について染色した。全ての値は独立した３実験の平均値±ｓ．ｄ．である。 図３は、３ｉＬ ｈＥＳＣの自己複製がＬＩＦシグナル伝達に依存していることを示す図である。Ａ）は、３ｉＬ ｈＥＳＣを０．６μＭのＪａｋ阻害剤（ｉｎｈ）で処理した結果を示す。対照細胞はＤＭＳＯで処理した。細胞は１０日間の処理後固定し、多能性マーカＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４及びＴＲＡ−１−６０について染色した。 Ｂ）は、Ｊａｋ阻害剤を用いた、又は用いなかった場合の３ｉＬ ｈＥＳＣにおけるＴＲＡ−１−６０陽性コロニー数を示す。全ての値は独立した３実験の平均値±ｓ．ｄ．である。 Ｃ）は、Ｊａｋ阻害剤を用いた、又は用いなかった場合のｈＥＳＣにおける多能性遺伝子及びＬＩＦシグナル伝達反応性遺伝子の発現量を示す。全ての値は独立した３実験の平均値±ｓ．ｄ．である。 Ｄ）は、ｈＥＳＣにおけるＬＩＦシグナル伝達成分の発現を示す。ＳＴＡＴ３、ＬＩＦＲ、ＧＰ１３０及びハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨの平均Ｃｔ値が示されている。高いＣｔ値は、ｈＥＳＣにおけるＧＰ１３０の発現が乏しいことを示している。全ての値は独立した３実験の平均値±ｓ．ｄ．である。 Ｅ）は、ｈＥＳＣを３ｉで処理した場合のＧＰ１３０発現の誘導を示している。ＤＭＳＯで処理した対照試料に対する正規化により相対的発現量が得られた。全ての値は独立した３実験の平均値±ｓ．ｄ．である。 Ｆ）は、３ｉＬ ｈＥＳＣ及びｈＥＳＣにおけるＧＰ１３０の相対的発現量を示す。全ての値は独立した３実験の平均値±ｓ．ｄ．である。 Ｇ）は、ｈＥＳＣと比し、３ｉＬ ｈＥＳＣにおいてＧＰ１３０タンパク質が上方制御されることを示す。ＧＰ１３０に特異的な抗体を用いて３ｉＬ ｈＥＳＣ及びｈＥＳＣの全細胞抽出物におけるＧＰ１３０の存在を検出した。 Ｈ）は、３ｉＬ ｈＥＳＣではＬＩＦ処理したｈＥＳＣに比し、リン酸化ＳＴＡＴ３レベルがより高いことを示す。ｈＥＳＣ、１０ｎｇ／ｍｌのＬＩＦと培養したｈＥＳＣ及び３ｉＬ ｈＥＳＣの全抽出物を用いてそれぞれの培養条件におけるＳＴＡＴ３のリン酸化レベルを測定した。ＧＡＰＤＨタンパク質レベルを負荷対照とした。ＬＩＦを添加すると、３ｉＬ培養条件に比し、ＳＴＡＴ３リン酸化が弱いながら活性化されている。 Ｉ）は、３ｉ、３ｉＬ又はＬＩＦで４日間処理後のｈＥＳＣにおいてＳＴＡＴ３反応性遺伝子ＳＯＣＳ３及びＫＬＦ４が活性化されることを示す。全ての値は独立した３実験の平均値±ｓ．ｄ．である。 図４は、３ｉＬ培養の条件にとってシグナル伝達経路が重要であることを示す図である。Ａ）は、ＮＡＮＯＧ発現量が３ｉで処理したｈＥＳＣにおけるＬＩＦシグナル伝達に感受性があることを示す。ｈＥＳＣは、３ｉの存在下及び非存在下に培養し、漸増量のヒト組み換えＬＩＦで処理した。５日間の処理後、細胞を採取して発現解析を行った。多能性遺伝子ＮＡＮＯＧの量は、ＤＭＳＯで処理した対照ｈＥＳＣに比し、３ｉ小分子の存在下に投与量依存性にＬＩＦシグナル伝達に感受性を示している。 Ｂ）は、重要なｈＥＳＣシグナル伝達経路を阻害すると３ｉＬ ｈＥＳＣの分化が生じることを示している。３ｉＬ ｈＥＳＣは、ＴＧＦβシグナル伝達経路（Ａ８３−０１）、ＦＧＦシグナル伝達経路（ＰＤ１７３０７４）、ＰＩ３Ｋ経路（ＬＹ２９４００２）及びＥＧＦ経路（ＰＤ１５０３５）を阻害する化学物質で処理した。３ｉＬ ｈＥＳＣは１０日間かけて処理した後、多能性マーカについて染色した。３ｉＬ ｈＥＳＣのＴＧＦβ、ＦＧＦ及びＰＩ３Ｋ経路を阻害すると、３ｉＬ ｈＥＳＣの対照に比し、多能性マーカＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４及びＴＲＡ−１−６０の減少が生じる。目盛り尺は２００μｍを表す。 Ｃ）は、シグナル伝達経路阻害剤で処理した３ｉＬ ｈＥＳＣにおいて多能性遺伝子が下方制御されることを示している。全ての値は独立した３実験の平均値±ｓ．ｄ．である。 図５は、３ｉＬ ｈＥＳＣが多能性であることを示す図である。Ａ）は、多能性マーカＮＡＮＯＧ及びＯＣＴ４並びにｈＥＳＣ特異的細胞表面マーカＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１について３ｉＬ ｈＥＳＣ及びｈＥＳＣを染色した結果を示す。目盛り尺：２００μｍ。 Ｂ）は、ｈＥＳＣ及び３ｉＬ ｈＥＳＣにおける多能性関連遺伝子及びエピブラスト遺伝子の相対的な発現を示す。全ての値は独立した３実験の平均値±ｓ．ｄ．である。 Ｃ）は、ｈＥＳＣ及び３ｉＬ ｈＥＳＣにおけるＮＡＮＯＧ及びＯＣＴ４についてのタンパク質レベルのウエスタンブロット分析の結果を示す。ＮＡＮＯＧ遺伝子発現量の増加に対応して、３ｉＬ ｈＥＳＣにおけるＮＡＮＯＧタンパク質レベルは、ｈＥＳＣに比し、高い。 Ｄ）は、３ｉＬ ｈＥＳＣ及びｈＥＳＣにおける多能性マーカのＦＡＣＳ分析の結果、３ｉＬ ｈＥＳＣではＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１の発現量が増加することを示している。 Ｅ）は、３ｉＬ ｈＥＳＣが懸濁培養液中で胚様体（ＥＢ）を形成し、生体外で３胚葉及び栄養外胚葉に分化することを示している。懸濁液中２０日間培養し３ｉＬ ｈＥＳＣ由来胚様体（上段左パネル）及びゼラチンプレート上に平板培養した胚様体の接着及び拡張（上段右パネル）が示されている。３ｉＬ ｈＥＳＣは、外胚葉（ＰＡＸ６）、胚体内胚葉（ＳＯＸ１７）、中胚葉（ＧＡＴＡ４）及び栄養外胚葉（ｐ５７Ｋｉｐ２）に分化することができる。目盛り尺：２００μｍ。 Ｆ）は、３ｉＬ ｈＥＳＣが、ＳＣＩＤマウスに注射されると、奇形腫を形成することを示している。示されているのは、３種の胚性胚葉の全てを表す組織を含有する奇形腫切片である。目盛り尺：５０μｍ。 Ｇ）は、３ｉＬ ｈＥＳＣがｈＥＳＣよりも効率的に奇形腫を形成することを示している。３ｉＬ ｈＥＳＣにより形成された奇形腫の容積（左パネル）及びこの奇形腫の形成にかかった平均時間（右パネル）。各条件につき６回の反復実験の結果を示す。 Ｈ）は、３ｉＬ ｈＥＳＣが培養２ヶ月後に正常な核型を呈することを示している。 図６は、３ｉＬ培養条件が他のｈＥＳＣ細胞株及びｉＰＳＣの安定な培養を支持することを示す図である。Ａ）は、ｈＥＳ３ｈＥＳＣ及びｈＥＳ３由来３ｉＬ ｈＥＳＣの形態を示す。目盛り尺は２００μｍを表す。 Ｂ）は、多能性マーカＮＡＮＯＧ及びＯＣＴ４並びに細胞表面マーカＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１についてｈＥＳ３ｈＥＳＣ及びｈＥＳ３由来３ｉＬ ｈＥＳＣを染色した結果を示す。目盛り尺は２００μｍを表す。 Ｃ）は、ｈＥＳ３由来３ｉＬ ｈＥＳＣのＮＡＮＯＧ発現量がｈＥＳ３ｈＥＳＣに比し、高いことを示している。全ての値は独立した３実験の平均値±ｓ．ｄ．である。 Ｄ）は、ｈＥＳ３由来３ｉＬ ｈＥＳＣをＳＣＩＤマウスに注射すると、奇形腫が形成されることを示している。示されているのは、３種の胚性胚葉の全てを表す組織を含有する奇形腫切片である。目盛り尺は５０μｍを表す。 Ｅ）は、ｈＥＳ３由来３ｉＬ ｈＥＳＣが培養２ヶ月後に正常な核型を呈することを示している。 Ｆ）は、ｈＥＳ３由来３ｉＬ ｈＥＳＣにおけるエピブラスト特異的遺伝子（ヤン（Ｙａｎ）他、２０１３年）の発現量を示す。エピブラスト特異的遺伝子は、ｈＥＳＣに比し、３ｉＬ ｈＥＳＣでは上方制御される。全ての値は独立した３実験の平均値±ｓ．ｄ．である。 Ｇ）は、ｈＥＳ２ｈＥＳＣ及びｈＥＳ２由来３ｉＬ ｈＥＳＣの形態を示す。目盛り尺は２００μｍを表す。 Ｈ）は、多能性マーカＮＡＮＯＧ及びＯＣＴ４並びに細胞表面マーカＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１についてｈＥＳ２ｈＥＳＣ及びｈＥＳ２由来３ｉＬ ｈＥＳＣを染色した結果を示す。目盛り尺は２００μｍを表す。 Ｉ）は、ｈＥＳ２由来３ｉＬ ｈＥＳＣのＮＡＮＯＧ発現量がｈＥＳ２ｈＥＳＣに比し、高いことを示している。全ての値は独立した３実験の平均値±ｓ．ｄ．である。 Ｊ）は、ｈＥＳ２由来３ｉＬ ｈＥＳＣをＳＣＩＤマウスに注射すると、奇形腫が形成されることを示している。示されているのは、３種の胚性胚葉の全てを表す組織を含有する奇形腫切片である。目盛り尺は５０μｍを表す。 Ｋ）は、ｈＥＳ２由来３ｉＬ ｈＥＳＣが培養２ヶ月後に正常な核型を呈することを示している。 Ｌ）は、ｈＥＳ２由来３ｉＬ ｈＥＳＣにおけるエピブラスト特異的遺伝子の発現量を示す。エピブラスト特異的遺伝子は、ｈＥＳＣに比し、３ｉＬ ｈＥＳＣでは上方制御されている。全ての値は独立した３実験の平均値±ｓ．ｄ．である。 Ｍ）は、ヒトＭＲＣ５線維芽細胞に山中の４種のリプログラミング因子（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びＭＹＣ）並びにｐＭＸ−ＧＦＰを用いてレトロウイルスにより形質導入したグラフを示す。３週間後、細胞を標準培地又は３ｉ＋ＬＩＦ培地で処理した。１週間の処理後、ＴＲＡ−１−６０コロニー数をカウントした。 Ｎ）は、３ｉＬ処理（Ｍ参照）によりＴＲＡ−１−６０陽性で同時にＧＦＰ陰性のコロニー数が増加したことから、３ｉＬ処理後、質の高いｉＰＳＣコロニーが得られたことを示している。 Ｏ）は、３ｉＬ条件で培養したｉＰＳＣにおいてウイルス性導入遺伝子の下方制御の増大が認められる定量的ＰＣＲデータを示す。全ての値は独立した３実験の平均値±ｓ．ｄ．である。 Ｐ）は、３ｉＬ 培養条件で６継代後のこれまでに特性化されたヒトｉＰＳＣの形態を示す。目盛り尺は２００μｍを表す。 Ｑ）は、多能性マーカＮＡＮＯＧ及びＯＣＴ４並びに細胞表面マーカＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１についてヒトｉＰＳＣ及び６継代にわたって３ｉＬ条件で培養した同細胞を染色した結果を示す。目盛り尺は２００μｍを表す。 Ｒ）は、３ｉＬ ｈｉＰＳＣにおけるエピブラスト特異的遺伝子の発現量を示す。エピブラスト特異的遺伝子は、ｉＰＳＣに比し、３ｉＬ ｈｉＰＳＣでは上方制御されている。全ての値は独立した３実験の平均値±ｓ．ｄ．である。 図７は、３ｉＬ ｈＥＳＣのトランスクリプトームが生体内着床前エピブラストと類似していることを示す図である。Ａ）は、ｈＥＳＣ及び３ｉＬ ｈＥＳＣにおけるＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＴＢＸ３、ＤＰＰＡ３及びＧＡＰＤＨの正規化されたＲＮＡ−Ｓｅｑリード数を示す。黒線は３回の反復実験の平均値を示し、個々の反復実験値はそれぞれ灰色の陰影で示されている（覆われている）。リード数は全ての繰り返し実験についてマッピングされたリードの数によって正規化した。座標はヒトゲノムバージョンｈｇ１９に対するものである。 Ｂ）は、着床前胚における３ｉＬ特異的遺伝子の発現のｈＥＳＣ特異的遺伝子の発現との比較を示す。示されているのは対応のないｔ−検定による検定統計量であり、正の値は３ｉＬ 特異的遺伝子がｈＥＳＣ特異的遺伝子よりも高い発現を示し、負の値の場合はその逆である。有意差（多重検定により調整されたｐ値＜０．０５）は＊で表されている。データはテスト前の試料及び遺伝子ごとに正規化された。 Ｃ）は、３ｉＬ ｈＥＳＣとｈＥＳＣとの間で発現が異なる遺伝子に関する着床前胚盤胞及びｈＥＳＣからの単一細胞遺伝子発現を示すヒートマップである。このセットの遺伝子において階層的クラスタ分析法によりクラスタ分析を行った。遺伝子は胚盤胞とｈＥＳＣとの間の平均発現量の倍率変化によって分類されている（黒から白への目盛り尺）。発現が異なる遺伝子（３ｉＬ ｈＥＳＣ対ｈＥＳＣ）は黒線による印がついている。 Ｄ）は、遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）の結果を示す。遺伝子は３ｉＬ ｈＥＳＣとｈＥＳＣとの間の発現量の倍率変化に従ってランク付けされる。示されているのは、ｈＥＳＣ及びヒトエピブラストで発現が異なる遺伝子についての濃縮である。３ｉＬ ｈＥＳＣで発現の増大を示す遺伝子はエピブラスト特異的遺伝子のセットで濃縮される（点線、ウイルコクソンの順位和検定；ｐ値＝１．０３ｅ−４８）のに対し、従来型ｈＥＳＣで発現の増大を示す遺伝子はヒトエピブラストに比しｈＥＳＣで発現の増大を示す遺伝子のセットで濃縮される（実線ｐ値＝１．６１ｅ−２０）。 Ｅ）は、３ｉＬ ｈＥＳＣ、ｈＥＳＣ、ヒト着床前エピブラスト（単一細胞データからの平均）、０継代目のｈＥＳＣ（単一細胞データからの平均）、１０継代目のｈＥＳＣ（単一細胞データからの平均）におけるｈＥＳＣ特異的遺伝子及び３ｉＬ ｈＥＳＣ特異的遺伝子の正規化された発現を示す。ｐ値は対応のあるｔ−検定を用いて計算した。遺伝子数は、３ｉＬ ｈＥＳＣ及びｈＥＳＣにおいて発現が異なり、発現が前もって得られている遺伝子に対応する。 Ｆ）は、ｈＥＳＣに比して３ｉＬ ｈＥＳＣで上方制御されるエピブラスト特異的遺伝子の実時間ｑＰＣＲ検証の結果を示す。全ての値は独立した３実験の平均値±ｓ．ｄ．である。 図８は、３ｉＬ培養ｈＥＳＣにおける天然エピブラストマーカ及びＧＡＴＡ６の発現を示す図である。Ａ）は、ｈＥＳＣに比し３ｉＬ ｈＥＳＣにおいて発現の増大を示す遺伝子とｈＥＳＣに比しエピブラスト細胞において発現の増大を示す遺伝子との重複を示したものである。有意度のスコアはフィッシャーの直接確率検定を用いて求めた。 Ｂ）は、ｈＥＳＣに比し３ｉＬ ｈＥＳＣにおいて発現の低下を示す遺伝子とｈＥＳＣに比しエピブラスト細胞において発現の増大を示す遺伝子との重複を示したものである。有意度のスコアはフィッシャーの直接確率検定を用いて求めた。 Ｃ）は、ｈＥＳＣに比し３ｉＬ ｈＥＳＣにおいて発現の低下を示す遺伝子とｈＥＳＣに比しエピブラスト細胞において発現の低下を示す遺伝子との重複を示したものである。有意度のスコアはフィッシャーの直接確率検定を用いて求めた。 Ｄ）は、ｈＥＳＣに比し３ｉＬ ｈＥＳＣにおいて発現の増大を示す遺伝子とｈＥＳＣに比しエピブラスト細胞において発現の低下を示す遺伝子との重複を示したものである。有意度のスコアはフィッシャーの直接確率検定を用いて求めた。 Ｅ）は、ｈＥＳＣ及び３ｉＬ ｈＥＳＣの単一細胞遺伝子発現分析の結果を示す。ＰＯＵ５Ｆ１の発現量はｈＥＳＣと３ｉＬ ｈＥＳＣとの間で同等である。３ｉＬ ｈＥＳＣではＮＡＮＯＧをはじめとするエピブラスト遺伝子の発現が増大しており、これらのデータから３ｉＬ ｈＥＳＣではこれらの遺伝子が共発現していることが明らかである。分化遺伝子はｈＥＳＣ及び３ｉＬ ｈＥＳＣの両者で低く、同程度の量で発現されている。 Ｆ）は、ｈＥＳＣ及び３ｉＬ ｈＥＳＣにおける正規化されたＲＮＡ−Ｓｅｑリード数を示すＧＡＴＡ６のゲノム遺伝子座を示す。黒線は３回の生物学的反復実験の平均値を示し、個々の反復実験値はそれぞれ灰色の陰影で示されている（覆われている）。リード数は全ての繰り返し実験についてマッピングされたリードの数によって正規化した。座標はヒトゲノムバージョンｈｇ１９に対するものである。 Ｇ）は、３ｉＬ ｈＥＳＣ及びｈＥＳＣにおけるｈＥＳＣ特異的遺伝子についての対数変換ＦＰＫＭ値を示す。有意性は対応のあるウイルコクソン検定により求めた。 Ｈ）は、外胚葉、内胚葉及び中胚葉に関連する遺伝子の定量的ＰＣＲ検証の結果を示すものである。全ての値は独立した３実験の平均値±ｓ．ｄ．である。 Ｉ）は、３ｉＬ ｈＥＳＣにおけるＧＡＴＡ６発現の定量的ＰＣＲ検証の結果を示すものである。全ての値は独立した３実験の平均値±ｓ．ｄ．である。 Ｊ）は、３ｉＬ ｈＥＳＣ及びｈＥＳＣにおけるＧＡＴＡ６のタンパク質レベルを示すものである。β−アクチンを負荷対照とした。 Ｋ）は、ＧＡＴＡ６及びＮＡＮＯＧの免疫蛍光共染色により３ｉＬ ｈＥＳＣにおけるこれら２タンパク質の共発現が明らかにされることを示している。目盛り尺は２００μｍを表す。 Ｌ）は、３ｉＬ ｈＥＳＣ及びｈＥＳＣにおけるＮＡＮＯＧ及びＧＡＴＡ６の共発現のＦＡＣＳ分析の結果を示す。アイソタイプ対照は二次抗体のみで染色されている。 Ｍ）は、３ｉＬ ｈＥＳＣ及びｈＥＳＣにおけるＯＣＴ４及びＧＡＴＡ６の共発現のＦＡＣＳ分析の結果を示す。アイソタイプ対照は二次抗体のみで染色されている。 Ｎ）は、３ｉＬ ｈＥＳＣ及びｈＥＳＣにおけるＴＲＡ−１−６０及びＧＡＴＡ６の共発現のＦＡＣＳ分析の結果を示す。アイソタイプ対照は第二抗体のみで染色されている。 Ｏ）は、３ｉＬ ｈＥＳＣ及びｈＥＳＣにおけるＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧの結合プロフィールを示したものである。リード数はマッピングされたリードの全数によって正規化した。 図９は、３ｉＬ ｈＥＳＣの系統的エピゲノム情報解析の結果を示す図である。Ａ）は、ｈＥＳＣに比し３ｉＬ ｈＥＳＣにおいてプロモータにＨ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ａｃ及びＨ３Ｋ２７ｍｅ３の増加（点線）又は減少（実線）を示す遺伝子の濃縮を示すＧＳＥＡプロットを示すものである。遺伝子はカフディフ（ｃｕｆｆｄｉｆｆ）検定統計量によって順序付けられている。３ｉＬ ｈＥＳＣにおいて発現の増大を示す遺伝子は、Ｈ３Ｋ２７ａｃの増大（ウイルコクソンの順位和検定ｐ値＝８．８３ｅ−２６３）、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３の増大（ｐ値＝２．４ｅ−６９））及びＨ３Ｋ２７ｍｅ３の減少（ｐ値＝４．９０ｅ−９２）を示す遺伝子のセットにおいて濃縮されている。３ｉＬ ｈＥＳＣにおいて発現の低下を示す遺伝子は、Ｈ３Ｋ２７ａｃの減少（ｐ値＜１．０ｅ−３００）、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３の減少（ｐ値＝３．３８ｅ−１９３））及びＨ３Ｋ２７ｍｅ３の増大（ｐ値＝１．４４ｅ−１２）を示す遺伝子のセットにおいて濃縮されている。 Ｂ）は、ＤＥＳｅｑ２を用いて評価された、発現の異なる遺伝子のプロモータにおけるヒストン修飾についての正規化されたリード数の倍率変化を示す。遺伝子はカフディフ検定統計量によってランク付けされており、遺伝子ごとに正規化されている。 は、０継代目のｈＥＳＣ特異的遺伝子及びエピブラスト特異的遺伝子のプロモータ（転写開始部位（ＴＳＳ））におけるヒストン修飾についての正規化されたリード数の倍率変化を示す。有意性はウイルコクソンの順位和検定を用いて評価された。 Ｄ）は、３ｉＬ ｈＥＳＣ及びｈＥＳＣにおけるＨ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ａｃ及びＨ３Ｋ２７ｍｅ３のＣｈＩＰ−Ｓｅｑプロフィールを示す。強調表示された領域は、観察されたヒストンメチル化プロフィールの変化を表す。ＴＢＸ３、ＺＮＦ６００、ＫＬＦ５及びＨＯＸＢクラスタの場合、強調表示された領域は、３ｉＬ ｈＥＳＣにおけるＨ３Ｋ２７ａｃの増加及び／又はＨ３Ｋ２７ｍｅ３の減少を示す遺伝子座を表示した。Ｃ１９ｏｒｆ６６及びＯＬＦＭ２の場合、強調表示された領域は、３ｉＬ ｈＥＳＣにおけるＨ３Ｋ２７ａｃの減少及び／又はＨ３Ｋ２７ｍｅ３の増加を示す遺伝子座を表示した。リード数はマッピングされたリードの全数によって正規化した。 図１０は、胚盤胞細胞及びｈＥＳＣにおける選択された天然のエピブラストマーカの発現を示す図である。Ａ）は、胚盤胞、Ｐ０（０継代目）のｈＥＳＣ及びＰ１０（１０継代目）のｈＥＳＣにおける３ｉＬ ｈＥＳＣのＨ３Ｋ２７ａｃ増加（ＴＢＸ３、ＫＬＦ５及びＺＮＦ６００）を示す遺伝子並びに３ｉＬ ｈＥＳＣのＨ３Ｋ２７ｍｅ３増加（Ｃ１９ｏｒｆ６６及びＯＬＦＭ２）を示す遺伝子についての平均ＦＰＫＭ値を示す。 図１１は、３ｉＬ ｈＥＳＣにおける新規ＮＡＮＯＧ及びＯＣＴ４結合部位を示す図である。Ａ）は、３ｉＬ特異的ＮＡＮＯＧ結合事象がもとのままのＮＡＮＯＧ結合事象よりも最も近い遺伝子に対して有意により遠位にあることを示している。有意性はウイルコクソンの順位和検定を用いて評価された。ｐ値＝１．１９ｅ^−１６６。 Ｂ）は、３ｉＬ ｈＥＳＣ及びｈＥＳＣにおけるＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ及びＳＴＡＴ３の結合プロフィールを示したものである。強調表示された領域は、３ｉＬ ｈＥＳＣにおけるＮＡＮＯＧ結合の増加を示す遺伝子座を表示した。リード数はマッピングされたリードの全数によって正規化した。 図１２は、３ｉＬ ｈＥＳＣにおける多能性転写ネットワークのリモデリングを示す図である。Ａ）は、すぐ近くに結合するＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４又はｐ３００の増加（点線）又は減少（実線）を示す遺伝子の濃縮を示すＧＳＥＡプロットを示すものである。遺伝子はカフディフ（ｃｕｆｆｄｉｆｆ）検定統計量によって順序付けられている。３ｉＬ ｈＥＳＣにおいて発現の増大を示す遺伝子は、ＮＡＮＯＧ結合（ウイルコクソンの順位和検定ｐ値＝３．９７ｅ−３８）、ＯＣＴ４結合（ｐ値＝４．４３ｅ−１１）及びｐ３００結合（ｐ値＝８．８１ｅ−２４）の増加を示す遺伝子のセットにおいて濃縮されている。３ｉＬ ｈＥＳＣにおいて発現の減少を示す遺伝子は、ＮＡＮＯＧ結合の減少（ｐ値＝７．１６ｅ−０６）及びＯＣＴ４結合の減少（ｐ値＝５．５ｅ−０８）を示す遺伝子のセットにおいて濃縮されている。 Ｂ）は、３ｉＬ ｈＥＳＣ及びｈＥＳＣにおけるＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ及びＳＴＡＴ３の結合プロフィールを示したものである。強調表示された領域は、３ｉＬ ｈＥＳＣにおけるＯＣＴ４及び／又はＮＡＮＯＧの増加を示す遺伝子座を表示した。リード数はマッピングされたリードの全数によって正規化した。 Ｃ）は、３ｉＬ ｈＥＳＣにおける転写回路の再構成を示す。３ｉＬ誘導回路は、３ｉＬ ｈＥＳＣにおいて上方制御され、天然のエピブラストにおいて発現される遺伝子、特にＴＢＸ３、ＤＰＰＡ３及びＫＬＦ５を含む。ＰＯＵ５Ｆ１及びＳＯＸ２などの遺伝子からなるコアの多能性回路ネットワークは、依然として新しいネットワークの一部であり、３ｉＬネットワークは再構成されるが置き換えられるものではないことを強調している。また、ＳＴＡＴ３はこのネットワークの遺伝子に結合する（示された矢印は有意度スコア＞１５０でピークに達する）ことから、外部シグナル伝達ネットワークが転写ネットワークと協働して３ｉＬ ｈＥＳＣにおける天然のエピブラストの特徴を誘導する可能性があることが示唆される。 Ｄ）は、３ｉＬが天然の着床前エピブラスト状態によりよく似ているＬＩＦ依存性ｈＥＳＣ状態を支持することを示している。各小円は転写因子又は細胞型特異的因子を表している。円間の実線又は点線は異なる多能性状態を調節する際のこれらの因子間の相互作用を示している。明から暗への灰色の勾配は、３ｉＬ ｈＥＳＣ及びｈＥＳＣのヒト胚盤胞の多能性エピブラスト細胞への近接を表している。 図１３は、３ｉＬ ｈＥＳＣにおける発生遺伝子の誘導が３ｉＬ ｈＥＳＣの分化を増強することを示す図である。Ａ）は、３ｉＬ ｈＥＳＣにおける胚体外系譜遺伝子の上方制御を示す。初期栄養膜マーカＣＤＸ２及びＢＭＰ４並びに胚盤葉下層マーカＧＡＴＡ４及びＧＡＴＡ６の発現は、ｈＥＳＣに比し３ｉＬ ｈＥＳＣでは上方制御された。全ての値は独立した３実験の平均値±ｓ．ｄ．である（ｎ＝３）。 Ｂ）は、３ｉＬ ｈＥＳＣにおける内胚葉系中胚葉遺伝子の上方制御を示す。内胚葉系中胚葉マーカＴ、ＭＩＸＬ１及びＥＯＭＥＳの発現は、ｈＥＳＣに比し、３ｉＬ ｈＥＳＣでは上方制御された。全ての値は独立した３実験の平均値±ｓ．ｄ．である（ｎ＝３）。 Ｃ）は、３ｉＬ ｈＥＳＣがアクチビンＡ及びＩＤＥ−１処理で内胚葉系譜に沿って効率的に分化することを示している。３ｉＬ ｈＥＳＣ及びｈＥＳＣを、マトリゲル被覆皿に同様の密度で接種し、アクチビンＡ及びＩＤＥ−１で処理して内胚葉系譜に向けて分化させた。これらの細胞は、処理の５日目に固定し、胚体内胚葉マーカＳＯＸ１７及びＦＯＸＡ２について染色した。ＳＯＸ１７及びＦＯＸＡ２陽性細胞のクラスタは検出された３ｉＬ ｈＥＳＣ試料であったが、ｈＥＳＣ試料ではこれらのマーカについて陽性に染色される細胞はほとんどなかった。 Ｄ）は、アクチビンＡ及びＩＤＥ−１で処理されたｈＥＳＣ試料に比して３ｉＬ ｈＥＳＣ試料では内胚葉マーカがより強く誘導されることを示している。内胚葉マーカＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ４Ａ及びＣＸＣＲ４の遺伝子発現は、ｈＥＳＣ試料に比して３ｉＬ ｈＥＳＣ試料では極めて高度に上方制御された。全ての値は独立した３実験の平均値±ｓ．ｄ．である（ｎ＝３）。 Ｅ）は、３ｉＬ ｈＥＳＣ及びｈＥＳＣがアクチビンＡ／ＦＧＦ２／ＢＭＰ４処理で内胚葉系譜に沿って効率的に分化することを示している。内胚葉系譜に向けて分化させためにマトリゲル被覆皿に同様の密度で接種し、アクチビンＡ／ＦＧＦ２／ＢＭＰ４で処理した３ｉＬ ｈＥＳＣ及びｈＥＳＣ。これらの細胞は、処理の５日目に固定し、胚体内胚葉マーカＳＯＸ１７及びＦＯＸＡ２について染色した。ｈＥＳＣ試料中の細胞に比し、３ｉＬ ｈＥＳＣ試料ではより多くの細胞がより多くの量のＦＯＸＡ２を発現している。 Ｆ）は、アクチビンＡ／ＦＧＦ２／ＢＭＰ４で処理したｈＥＳＣ試料に比し、３ｉＬ ｈＥＳＣ試料では内胚葉マーカがより強く誘導されることを示している。内胚葉マーカＦＯＸＡ２、ＨＮＦ４Ａ及びＣＸＣＲ４の遺伝子発現は、ｈＥＳＣ試料に比して３ｉＬ ｈＥＳＣ試料では極めて高度に上方制御された。全ての値は独立した３実験の平均値±ｓ．ｄ．である（ｎ＝３）。

第一の態様において、本発明は、未分化状態で多能性幹細胞を培養し、維持する方法であって、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＡＭＰＫ及び／又はＢＭＰシグナル伝達の二重阻害剤、並びにＬＩＦを含む培地でその多能性幹細胞を培養する工程を含む方法に関係している。

一実施態様において、上記多能性幹細胞は人工多能性幹細胞である。

別の実施態様において、上記培地は馴化培地である。

別の実施態様において、この培地はフィーダー細胞を含むことができる。別の実施態様において、この培地はフィーダー細胞を含まないものとすることができる。

上記多能性幹細胞はマトリクス上で培養することができる。このマトリクスは基底膜マトリクスとすることができる。一実施態様において、このマトリクスは、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、ヘパラン硫酸、合成生体高分子又は合成ペプチドの１種以上を含む細胞外マトリクスとすることができる。

この多能性幹細胞は胚性幹細胞とすることができる。この胚性幹細胞はヒトのものであることが好ましい。しかしながら、他の種からの幹細胞が適している場合があることも理解されたい。例えば、マウス胚性幹細胞又は霊長類の胚性幹細胞が適している場合もある。

本明細書に記載した方法は、未分化状態で多能性幹細胞をさらに継代する工程を含むことができる。

ＭＥＫ阻害剤は、トラメチニブ（ＧＳＫ１１２０２１２）、セルメチニブ、ビニメチニブ即ちＭＥＫ１６２、ＰＤ−０３２５９０１、コビメチニブ即ちＸＬ５１８、ＣＩ−１０４０、ＰＤ９８０５９、ＰＤ１８４３５２、Ｕ０１２６又はこれら既存の化合物の任意の誘導体からなる群から選ぶことができる。

このＭＥＫ阻害剤は、約０．１乃至５μＭ、約０．２乃至４μＭ、約０．３乃至３μＭ、約０．４乃至２μＭ及び約０．５乃至１μＭの濃度とすることができる。一実施態様において、このＭＥＫ阻害剤は、約０．５乃至１μＭの濃度とすることができる。

ＧＳＫ３阻害剤は、６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）、ＣＨＩＲ−９９０２１、ＳＢ２１６７６３、ＣＨＩＲ−９８０１４、ＴＷＳ１１９、ＩＭ−１２、１−アザケンパウロン、ＡＲ−Ａ０１４４１８、ＳＢ４１５２８６、ＡＺＤ１０８０、ＡＺＤ２８５８、インジルビン及びこれらの化合物の任意の誘導体から選ぶことができる。

このＧＳＫ３阻害剤は、約０．５乃至５μＭ、約０．７５乃至４μＭ、約０．８乃至３μＭ、約０．８５乃至２μＭ、約０．９乃至２μＭ、約０．９５乃至２μＭ、約１乃至２μＭ及び約１．５乃至２μＭの濃度とすることができる。一実施態様において、このＧＳＫ３阻害剤は、約１乃至２μＭの濃度とすることができる。

ＢＭＰ４シグナル伝達及びＡＭＰＫ阻害剤は、６−［４−（２−ピペリジン−１−イルエトキシ）フェニル−３−ピリジン−４−イルピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン（ドルソモルフィン）、ＬＤＮ−１９３１８９、ＬＤＮ２１２８５４、Ｋ０２２８８、Ａ−７６９６６２、アカデシン、フェンホルミン及びこれらの化合物の任意の誘導体から選ぶことができる。

このＢＭＰ４シグナル伝達及びＡＭＰＫ阻害剤は、約０．５μＭ、約１μＭ、約１．２５μＭ、約１．５μＭ、約１．７５μＭ及び約２μＭの濃度とすることができる。一実施態様において、このＡＭＰＫ阻害剤は、約２μＭの濃度とすることができる。

ＬＩＦは約１乃至２０ｎｇ／ｍｌ、約２乃至２０ｎｇ／ｍｌ、約２乃至１８ｎｇ／ｍｌ、約３乃至１６ｎｇ／ｍｌ、約４乃至１４ｎｇ／ｍｌ、約５乃至１２ｎｇ／ｍｌ、約６乃至１０ｎｇ／ｍｌ、約７乃至１０ｎｇ／ｍｌ、約８乃至１０ｎｇ／ｍｌの濃度とすることができる。一実施態様において、このＬＩＦは約８乃至１０ｎｇ／ｍｌの濃度とすることができる。

ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＡＭＰＫ及び／又はＢＭＰシグナル伝達の二重阻害剤、並びにＬＩＦを含む上記の培地は、さらに後成的修飾剤、例えば、後成的阻害剤を含むことができる。後成的阻害剤としては、ＤＮＡメチル基転移酵素阻害剤及びヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤、例えば、ＲＧ１０８、ＢＩＸ、ＤＮＺＥＰ、バルプロ酸、酪酸ナトリウム及び５−アザ−２’−デオキシシチジンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

別の態様において、本明細書に記載した方法によって作製された多能性幹細胞が提供される。この本明細書に記載した方法によって作製された多能性幹細胞は、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ−１−６０、ＯＣＴ４、ＴＲＡ−１−８１、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、ＰＲＤＭ１４及びＺＦＰ４２からなる群から選ばれる少なくとも１種の多能性マーカを発現することができる。別の実施態様において、本明細書に記載した多能性幹細胞は、ＤＰＰＡ３、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５、ＴＢＸ３、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＡＨＮＡＫ、ＡＲＲＢ１、ＣＬＥＣ４Ｄ、ＧＧＴ５、ＩＬ６Ｒ、ＬＩＭＣＨ１、ＭＦＡＰ３Ｌ、ＳＬＣ２５Ａ１６、ＳＭＹＤ２、ＳＯＡＴ１及びＺＮＦ６００からなる群から選ばれる少なくとも１種のエピブラスト様遺伝子発現マーカを発現することができる。

別の実施態様において、本明細書に記載した多能性幹細胞は、ＣＤＸ２、ＢＭＰ４、ＧＡＴＡ４及びＧＡＴＡ６からなる群から選ばれる少なくとも１種の胚体外マーカを発現することができる。

別の実施態様において、本明細書に記載した多能性幹細胞は、Ｔ、ＥＯＭＥＳ又はＭＩＸＬ１から選ばれる少なくとも１種の内胚葉系中胚葉マーカを発現することができる。

本明細書に記載した多能性幹細胞は、本明細書に記載の方法に従って培養されなかった細胞に比して発現量が増加した少なくとも１種のマーカを含むことができる。

この少なくとも１種のマーカの発現量は、ＲＮＡ配列決定法又は実時間ＰＣＲ法によって測定することができる。

一実施態様において、この少なくとも１種のマーカの発現量は、本明細書に記載の方法に従って培養されなかった細胞に対して少なくとも約１．５乃至５倍増加させることができる。

一実施態様において、この少なくとも１種のマーカはＮＡＮＯＧであり、その発現量は本明細書に記載の方法に従って培養されなかった細胞に対して１．５乃至２倍増加させることができる。

一実施態様において、内胚葉、神経又は中胚葉細胞への、本明細書に記載した多能性幹細胞の分化は、本明細書に記載の方法に従って培養されなかった細胞の分化に比して増強される。

一実施態様において、未分化状態で多能性幹細胞を培養し、維持するための培養培地であって、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＡＭＰＫ阻害剤及びＬＩＦを含む前記培養培地も提供する。

別の態様において、多能性幹細胞から系譜特異的細胞を生じさせる方法であって、ａ）本明細書に記載の方法に従って未分化状態で多能性幹細胞を培養する工程、ｂ）この未分化多能性幹細胞を単離する工程及びｃ）この単離した多能性幹細胞を系譜特異的な細胞に分化させるのに適した培養培地においてこの単離した未分化多能性幹細胞を培養する工程を含む方法も提供する。

一実施態様において、この系譜特異的な細胞は体細胞又はオルガノイド細胞とすることができる。別の実施態様において、この系譜特異的な細胞は内胚葉系譜細胞とすることができる。

別の実施態様において、上記体細胞は、１種若しくは数種の体細胞系譜細胞又は完全に成熟した分化体細胞へ自己複製又は分化することができる委任前駆細胞とすることができる。

別の態様において、未分化状態で多能性幹細胞を培養し、維持するための、本明細書に記載した方法において用いられるキットであって、本明細書に記載した培養培地及び使用説明書を含むキットを提供する。

実験の項
材料及び方法
細胞培養
本研究にはｈＥＳＣ Ｈ１株（ＷＡ−０１、２８継代目）を使用した。ＴｅＳＲ１（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ステムセルテクノロジーズ））におけるｈＥＳＣのルーチン培養のために、細胞をマトリゲル（ＢＤ）上でフィーダー無しで培養した。細胞培地は毎日交換した。ｈＥＳＣは、１ｍｇ／ｍｌのディスパーゼ（ステムセルテクノロジー）と共に５乃至７日毎に継代培養した。３ｉＬ ｈＥＳＣ培養培地は、ＴｅＳＲ１中１μＭのＰＤ０３２５９０１（Ｓｉｇｍａ（シグマ））、２μＭのＢＩＯ（シグマ）、２μＭのドルソモルフィン（シグマ）及び１０ｎｇ／ｍｌのヒトＬＩＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（ミリポア））を含む。３ｉＬ培地は新規に調製し、２週間を超えることなく４℃で保存する。３ｉＬ条件での処理のため、ＴｅＳＲ１中で培養したｈＥＳＣを接種後４８時間に３ｉＬで処理する。その後、細胞をマイトマイシンＣ不活化マウス線維芽細胞上で継代培養する。細胞はＴｒｙｐＬＥ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ライフテクノロジーズ））を用いて単一細胞に分離する。３ｉＬ培地は毎日新しくし、細胞を集密化時に継代培養する。ＲＯＣＫ阻害剤チアゾビビンを最終濃度１μＭで加えて最初の数継代の間の細胞の生存を増強する。全ての実験に用いる３ｉＬ ｈＥＳＣは、新しい培養条件に十分に順化させるために少なくとも１０継代にわたって培養した。

小分子化合物処理
ｈＥＳＣをディスパーゼで分離し、接種後４８時間に処理を開始する。単一化学処理及び組み合わせ化学処理のために、以下の小分子を以下の最終濃度で用いた：０．５μＭのＡ８３−０１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ（ステムジェント））、２μＭのＢＩＯ（シグマ）、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１（ステムジェント）、２μＭのドルソモルフィン（シグマ）、８μＭのホルスコリン（ステムジェント）、２μＭのＩＤＥ−１（ステムジェント）、０．５μＭのＰＤ１５３０３５（シグマ）、１μＭのＰＤ１７３０７４（シグマ）、１μＭのＰＤ０３２５９０１（シグマ）、５μＭのピフィスリン−α（シグマ）及び１μＭのレプソックス（シグマ）。全ての小分子はＤＭＳＯ中で再構成される。ＰＩ３Ｋ経路阻害のために、ＬＹ２９４００２（シグマ）を１０μＭの最終濃度で用いた。

ＲＮＡ抽出、逆転写、定量的実時間ＰＣＲ及びＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）プレパレーション
発現分析のために、クロロホルムと共にトリゾール試薬（インビトロジェン）を用いて全ＲＮＡを抽出し、イソプロパノールで沈殿させた。沈殿させたＲＮＡを４℃１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心した。このＲＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄し、次いでＤＥＰＣ処理した水（ＡＭＢＩＯＮ（アンビオン））で元に戻した。ＤＮアーゼＩ（アンビオン）を用いてＤＮＡ夾雑物を３７℃で３０分間消化した。ＤＮアーゼＩ酵素を７０℃で１０分間加熱不活化する。ナノドロップ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（サーモサイエンティフィック））を用いてＲＮＡ濃度を測定した。５００ｎｇのＲＮＡを用いてスーパースクリプトＩＩキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（インビトロジェン））による各逆転写反応を行い、その後の定量分析のためのｃＤＮＡを作製した。ＡＢＩプリズム７９００配列検出システムを用いてＳＹＢＲグリーンマスターミックス（ＫＡＰＡ）により定量的実時間ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析を行った。ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリ調製のために、全ＲＮＡをさらにカラム（ピュアリンクＲＮＡミニキット、アンビオン）により精製した。メーカーの（ＴｒｕＳｅｑＲＮＡ試料調製キットｖ２、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（イルミナ））に従って４μｇの全ＲＮＡを用いてＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリを調製した。手短に言えば、ポリＴオリゴ付着磁気ビーズによる精製を２回繰り返してｍＲＮＡを得た。次に、このｍＲＮＡを断片化して第１及び第２鎖ｃＤＮＡ合成に付した後、末端修復、アデニル化、アダプタを結合させ、最後に１５サイクルのＰＣＲにかけた。試料を多重化し、シングルリード７６ｂｐ（ハイセック２０００、イルミナ）を塩基配列を決定した。

クロマチン免疫沈降
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）をこれまでに報告されている方法（カーワッキ−ネイシウス（Ｋａｒｗａｃｋｉ−Ｎｅｉｓｉｕｓ）ほか、２０１３年）により実施した。簡単に述べると、細胞を１％ホルムアルデヒドを用い１０分間室温で固定した後、グリシンを最終濃度０．２Ｍまで添加してホルムアルデヒドを不活化した。細胞溶解液を超音波処理し、ＯＣＴ４（ａｂｃａｍ ａｂｌ９８５７）、Ｎａｎｏｇ（Ｒ＆Ｄ ＡＦ１９９７）、ＳＴＡＴ３（セルシグナリング（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）９１４５）、ｐ３００（サンタ・クルス（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）ｓｃ５８５）、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３（ミリポア０４−７４５）、Ｈ３Ｋ２７ａｃ（ａｂｅａｍ ａｂ４７２９）又はＨ３Ｋ２７ｍｅ３（ミリポア、０７−４４９）に対する抗体と結合させたプロテインＧ・ダイナル・マグネチック・ビーズを用い、クロマチン抽出物を４℃で一夜免疫沈降させた。ＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）ＣｈＩＰ−Ｓｅｑライブラリ・キット（ＮＥＢバイオラボ）を用い、メーカーの使用説明書に従ってクロマチン免疫沈降塩基配列決定（ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ）ライブラリを作製し、ハイセック２０００システム（イルミナ）により塩基配列を決定した。

単一細胞遺伝子発現解析
単一細胞遺伝子発現に引き続いて、バイオマーク・システム・アドバンスト・デベロップメント・プロトコル４１で低ＲＯＸのＳｓｏＦａｓｔエバグリーン・スーパーミックスを用い、単一細胞遺伝子発現データを収集した。簡単に述べると、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ＢＤバイオサイエンス））を用いて逆転写特異的標的増幅溶液（ライフ・テクノロジーズ）を入れた９６穴ＰＣＲプレートにｈＥＳＣ及び３ｉＬ培養ｈＥＳＣをそのまま分取した。逆転写、２０サイクル・プレ増幅及びエキソヌクレアーゼ１（ＮＥＢ）処理を行った後、プレ増幅産物を７倍希釈した。増幅単一細胞試料は、バイオマーク・システム（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ（フルイディグム））で４８×４８ダイナミック・アレイを用い、低ＲＯＸの２×ＳｓｏＦａｓｔエバグリーン・スーパーミックス（Ｂｉｏ−Ｒａｄ（バイオ−ラド））及び各ｑＰＣＲプライマを用いて解析した。バイオマーク実時間ＰＣＲ解析ソフトウェア（フルイディグム）を用いて閾値交差（Ｃｔ）値を計算した。

生体外分化
胚様体形成を介した自発的分化を起こさせるために、３ｉＬ ｈＥＳＣをＴｒｙｐＬＥにより分離し、低接着の１０ｃｍ皿中で懸濁培養した。２乃至３週間後、胚様体をゼラチン被覆プレートに移し、さらに６日間培養した。成長因子により分化を誘導するために、細胞をマトリゲル上に接種し、種々の系譜に沿った分化を起こさせるための以下のそれぞれの培地で処理した：胚体内胚葉分化のための、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを含有する２％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）含有ＲＰＭＩアドバンスト培地（ＧＩＢＣＯ）、中胚葉分化のための、１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４及び４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含有する２０％ＫＳＲ（ＧＩＢＣＯ）含有Ｆ１２ ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）、栄養外胚葉分化のための、１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４及び１μＭのＰＤ０３２５９０１を含有する２０％ＫＳＲ（ＧＩＢＣＯ）含有Ｆ１２ ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）並びに神経外胚葉分化のための、１０μＭのＳＢ４３１５４２及び２μＭのドルソモルフィンを含有する０．５×Ｎ２及びＢ２７サプリメントが補充された神経用基礎培地。

奇形腫の形成
標準培地中で培養したｈＥＳＣ又は３ｉＬ ｈＥＳＣをＴｒｙｐ１Ｅで分離し、３０％マトリゲル／Ｆ１２ ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）中１×１０^７細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。Ｒｏｃｋ阻害剤チアゾビビン（ステムジェント）を標準培地中のｈＥＳＣ培養物に０．５μＭの最終濃度で加えた。この細胞懸濁液２００μｌをアベルチンで麻酔したＳＣＩＤマウスの背側側腹に注射した。６乃至８週間後に奇形腫が形成されたので、これを外科的に切り取り、ブーアン液で固定し、パラフィンで包埋した。これを切片にし、マロリー４色染色法で分析した。

ウエスタンブロット分析
プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｍｅｒｃｋ（メルク））を補充した溶解緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０μＭのＺｎＣｌ、０．５％のノニデットＰ−４０、５％のグリセロール）を用いてｈＥＳＣを溶解した。タンパク質濃度はブラッドフォードアッセイキット（バイオラド）で測定した。５０μｇの細胞溶解液を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離し、二フッ化ポリビニリデン膜（ミリポア）に移した。０．１％トウィーン２０含有ＰＢＳ（０．１％ＰＢＳＴ）に溶解した５％スキムミルクでこの膜をブロックした。ブロック後、ブロットを抗ＯＣＴ４（アブカム）、抗ＮＡＮＯＧ（Ｒ＆Ｄ）、ＧＰ１３０（サンタ・クルス）、抗ＳＴＡＴ３（セルシグナリング）、抗ホスホＴｙｒ７０５ ＳＴＡＴ３（セルシグナリング）又は抗ＧＡＰＤＨ（サンタ・クルス）一次抗体と共に一夜インキュベートした後、０．１％ＰＢＳＴで洗浄し、それぞれセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗ウサギＩｇＧ（サンタ・クルス）又はＨＲＰ結合抗ヤギＩｇＧ（サンタ・クルス）と共にインキュベートした。ＰＢＳＴで洗浄後、ウエスタンブロッティングルミノール試薬（サンタ・クルス）を用いてシグナルを検出した。

免疫蛍光染色
ｈＥＳＣ又は分化培養物をパラホルムアルデヒドの４％ＰＢＳ溶液で固定した。１％トリトンＸ−１００／ＰＢＳで３０分間透過化処理した後、以下に対する一次抗体を用いて免疫染色を行った：ＮＡＮＯＧ（Ｒ＆Ｄシステム）、ＯＣＴ４（アブカム）、ＴＲＡ−１−６０（サンタ・クルス）、ＴＲＡ−１−８１（サンタ・クルス）、ＰＡＸ６（Ｃｏｖａｎｃｅ（コバンス））、ＧＡＴＡ４（サンタ・クルス）、ＳＯＸ１７（アブカム）又はｐ５７ｋｉｐ２（Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ（ネオマーカーズ））。二次抗体として、アレクサフルオール４８８／５４６抗マウスＩｇＭ、アレクサフルオール４８８／５４６抗ヤギＩｇＧ及びアレクサフルオール４８８／５４６抗マウスもしくは抗ウサギＩｇＧ（インビトロジェン）を用いた。核の染色にはＤＡＰＩ又はヘキスト（インビトロジェン）を用いた。

免疫染色細胞のフローサイトメトリー分析
３ｉＬ又は標準培地で培養した細胞を採取し、８０％エタノールで一夜固定した。氷上でトリトンＸ−１００の０．５％ＰＢＳ溶液２００μｌに１０分間かけて細胞を溶解した。その後、細胞を１％ＢＳＡでブロックし、氷上でＴＲＡ−１−６０（サンタ・クルス）、ＴＲＡ−１−８１（サンタ・クルス）、ＮＡＮＯＧ（Ｒ＆Ｄ）又はＯＣＴ４（アブカム）に対する抗体により２時間かけて染色した。細胞は二次抗体による染色の前後で３回洗浄した。アイソタイプ対照として二次抗体による染色のみを行った。細胞の分析はＢＤ ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーターシステムを用いて実施した。収集したデータはＦｌｏｗＪｏ ｖｘにより分析した。

染色体分析
細胞をコルセミドで処理して核分裂を停止させ、標準的低張処理及びメタノール：酢酸（３：１）固定して採取した。標準的空気乾燥法によりスライドを作製し、Ｇ−バンド染色体分析を行った。

バイオインフォマティクス分析
パラメータ−ｂ２−極センシティブを有するＴｏｐＨａｔ２バージョン２．０．９を用いてＲＮＡ−Ｓｅｑリードをヒトゲノムアセンブリｈｇ１９にマッピングし、さらにエンセンブル（ＧＲＣｈ３７．６９）からのトランスクリプトームアノテーションを有する−ＧＴＦオプションを使用した。カフディフ（ｃｕｆｆｄｉｆｆ）バージョン２．１．１を用いて差次的発現を評価した。カフディフ検定統計量を用いて遺伝子をランク付けし、遺伝子セット濃縮分析を行った。オプション−ｂ、−−マルチ・リード・コレクト、−ｇを有するカフリンクス・バージョン２．１．１を用いて各試料の発現データを評価し、リピートマスカーアノテーションを用いてｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ及びｓｒｐＲＮＡ遺伝子をマスクした。着床前ヒト胚からの単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑ発現データを３ｉＬ及びＴｅｓｒ ＲＮＡ−Ｓｅｑデータと合わせてダウンロードした後、クオンタイル正規化した。全ての試料の全ての遺伝子についての発現値をさらに各遺伝子の発現の合計値で除した。図４Ｂについての平均発現量の差はｍｕｌｔｔｅｓｔパッケージを用いて計算し、検定統計量はｔ−テストからのものであり、ｐ値は多重検定補正している。図４Ｃの遺伝子は、さらに遺伝子及び試料のサブセットに関して正規化した。特定のゲノム遺伝子座におけるＲＮＡ−Ｓｅｑデータの可視化のために、リードをマップしたリードの数によって正規化した。

Ｂｏｗｔｉｅ（０．１２．５）を用いてｈｇ１９基準ゲノムに対してＣＨＩＰ−Ｓｅｑリードをマッピングし、ＭＡＣＳ（１．４．０）を用いてピーク呼び出しを行った。ピークは最も近いＴＳＳと関連付けられた。リードは、現在アノテーションされている（Ｅｎｓｅｍｂｌ ｖｅｒｓｉｏｎ ６９（エンセンブル バージョン６９）、総数：１９，９７８）全てのコーディング遺伝子について転写開始部位周辺の４ｋｂウインドウ内でカウントした。ＴＳＳが多数ある場合、最大数のＰｏｌＩＩ ＣｈＩＰ−Ｓｅｑリードを有するＴＳＳのみを、これがｈＥＳＣにおけるそれぞれの遺伝子の主要なＴＳＳであると仮定して、選んだ。ヒストン修飾及び転写因子占有状態の対数倍の変化をＤＥＳｅｑ２を用いて計算した。３ｉＬ ｈＥＳＣとｈＥＳＣとの間で最大倍率変化を有するトップ１０００の遺伝子座を用いてＣｈＩＰ−ＳｅｑデータについてのＧＳＥＡプロットを作成した。標準設定値を用い、Ｒにおいてボックスプロットを作出した。全てのバイオインフォマティクス分析はＲバージョン３．０及びバイオコンダクタバージョン２．１２を用いて実施した。

受託番号
ＲＮＡ−Ｓｅｑ及びＣｈＩＰ−Ｓｅｑデータは、アレイエクスプレスデータベース（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ａｒｒａｙｅｘｐｒｅｓｓ）において受託番号Ｅ−ＭＴＡＢ−２０３１（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）、Ｅ−ＭＴＡＢ−２０４１（ヒストン修飾）、ＭＴＡＢ−２０４２（ＳＴＡＴ３）及びＥ−ＭＴＡＢ−２０４４（ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ｐ３００、インプツト・コントロール）で利用可能である。

実施例１
小分子同士の組み合わせは特有なｈＥＳＣの状態を誘導する
生体内の着床前エピブラスト状態により近い可能性のある代替的なｈＥＳＣ状態を誘導するために、８つのシグナル伝達経路を標的とする１１種の小分子を用いてＮＡＮＯＧの発現を増加させる条件をスクリーニングした（図１Ａ）。ＮＡＮＯＧは、着床前胚の内細胞塊中の胚盤葉下層からの多能性エピブラストの分離において決定論的マーカとして使える。マウス胚盤胞におけるＮＡＮＯＧのレベルは着床時に減少し、ＮＡＮＯＧレベルが多能性の種々の状態を反映することが示唆される。また、ＮＡＮＯＧの発現はｈＥＳＣに比し、ヒト天然の着床前エピブラストにおいて強化される。まず、これらの阻害剤の影響を個々に調べた。これらの小分子の多くにより処理した細胞はｈＥＳＣマーカについては染色陽性であったが、形態の変化を示さず、ＮＡＮＯＧ転写産物の上方制御も誘導しなかった（図１Ｂ乃至Ｃ）。従って、その後、これらの分子の組み合わせを用いた（図１Ｄ）。個々の分子の使用の場合と対照的に、数種の組み合わせによる処理の結果、ｈＥＳＣの形態及びＮＡＮＯＧの上方制御はいずれも変化を示した（図２Ａ、図１Ｅ）。特に、組み合わせ２１、２２、２３及び２４はＮＡＮＯＧ転写産物の１．５乃至２．０倍の増加を誘導した。ＰＯＵ５Ｆ１レベルは、これらの組み合わせでは概して不変であり（図２Ａ）、この細胞が依然として多能性であることが示唆された。

次に、化学物質の組み合わせ２１乃至２４を調べてこれらがｈＥＳＣの自己複製を安定的に支持することができるかを明らかにした。しかしながら、上記条件の中３条件について増殖の強い阻害が認められたので、最初の継代後に生存するコロニーはほとんど無かった。組み合わせ２２（本明細書で３ｉと称するＰＤ０３／ＢＩＯ／ＤＯＲ）で処理したｈＥＳＣのみが、マウス線維芽細胞フィーダー上に小さく密なコロニーを形成することができた（図２Ｂ）。しかしながら、コロニー数はその後の各継代で減少したことから、自己複製は阻害されることが分かる（図２Ｃ乃至Ｄ）。これらの細胞の形態がマウス胚幹細胞（ｍＥＳＣ）の形態に類似しているので、ｍＥＳＣの自己複製を促進するシグナル伝達経路の活性化が細胞の生存を改善することができるかどうかを調べた。ＬＩＦシグナル伝達は、ｍＥＳＣ、ＩＣＭ及びマウス多能性諸状態間の変換の維持における重要なシグナル伝達経路である。驚くべきことに、ＬＩＦを添加すると、３ｉ ｈＥＳＣの自己複製の阻害が救われ、これらの細胞は３０継代を超えて安定的に増殖することが可能となった（図２Ｃ乃至Ｄ）。これらの３ｉ＋ＬＩＦ処理ｈＥＳＣ（本明細書では３ｉＬ ｈＥＳＣと称する）は、ＴｅＳＲ１培地で培養したｈＥＳＣ（本明細書ではｈＥＳＣと称する）に比し、より小さくてより密なコロニーを形成する（図２Ｅ）。ｈＥＳＣとは対照的に、３ｉＬ ｈＥＳＣはＲＯＣＫ阻害剤を添加しなくても単一細胞としてこの継代を生き延びることができる（図２Ｆ）。上記３種の阻害剤の組み合わせ使用は、３ｉＬ ｈＥＳＣの状態を維持するのに重要である。というのは、個々の化学物質を培地から除くとこの細胞を維持することができないからである（図１Ｇ）。要するに、３種の阻害剤及びＬＩＦを適用すると、従来のｈＥＳＣと異なるｈＥＳＣの効率的な増殖が可能となる。

実施例２
３ｉＬ ｈＥＳＣにおける活動性ＬＩＦシグナル伝達
ＬＩＦシグナル伝達に依存しない従来型のｈＥＳＣと対照的に、ＬＩＦは３ｉＬ ｈＥＳＣの自己複製に不可欠であるように思われる。３ｉＬ ｈＥＳＣにおけるＬＩＦの役割をさらに調べるために、ＬＩＦシグナル伝達経路を標的とするＪａｋ阻害剤（ｉｎｈ）を用いた。３ｉＬ ｈＥＳＣをＪａｋ阻害剤で処理すると、多能性マーカ発現の減少及びコロニー数の強い減少が誘導された（図３Ａ乃至Ｂ）。ＮＡＮＯＧ及びＬＩＦシグナル伝達感受性遺伝子ＫＬＦ４及びＳＯＣＳの遺伝子発現は低下した（図３Ｃ）。これらの結果から、さらに、ＬＩＦシグナル伝達はｈＥＳＣの維持に必要とされることが分かる。

ＬＩＦシグナル伝達はｈＥＳＣにおいて誘導することができる。しかしながら、３ｉＬ ｈＥＳＣとは対照的に、ＬＩＦはｈＥＳＣの自己複製に不可欠ではない。ＬＩＦの必要性のこの相違の原因を調べるために、両細胞状態におけるＬＩＦシグナル伝達活性を比較した。ｈＥＳＣでは、ＬＩＦ活性に不可欠な補助受容体であるＧＰ１３０の転写産物は、ＬＩＦシグナル伝達経路の他の成分に比し、発現が不十分である（図３Ｄ）。ｈＥＳＣの３ｉによる短時間処理及びｈＥＳＣの３ｉＬにおける安定的な培養は、いずれもＧＰ１３０転写産物（図３Ｅ乃至Ｆ）及びタンパク質レベル（図３Ｇ）の上方制御をもたらし、これらの細胞はＬＩＦシグナル伝達に対してより感受性になっていることがわかった。それに対応して、リン酸化ＳＴＡＴ３のレベルもＬＩＦ単独と共に培養したｈＥＳＣに比し、３ｉＬ ｈＥＳＣにおいて有意により高く（図３Ｈ）、ＬＩＦシグナル伝達は３ｉＬ ｈＥＳＣにおいてより活動性であることが示唆された。また、既知のＳＴＡＴ３の標的ＳＯＣＳ３及びＫＬＦ４の発現量は、ＬＩＦ単独に比し、３ｉ＋ＬＩＦで処理したｈＥＳＣでは増加した（図３Ｉ）。興味深いことに、ＮＡＮＯＧ発現量は、３ｉ処理下にＬＩＦを用量依存性に添加していくと増加したことから、ＮＡＮＯＧはＬＩＦシグナル伝達の直接の標的であることが示唆された（図４Ａ）。これらの結果から、３ｉ処理はｈＥＳＣの自己複製を支持できないであろうが、ＬＩＦシグナル伝達に高度に感受性であるｈＥＳＣ状態を誘導することが分かる。ＬＩＦシグナル伝達の向上は、３ｉ培養条件下の多能性細胞状態の維持に不可欠になる。

次に、ｈＥＳＣにおいて重要な他のシグナル伝達経路も３ｉＬ ｈＥＳＣにおいて役割を果たしているのかどうかを調べた。ＦＧＦ、ＰＩ３Ｋ及びアクチビンシグナル伝達経路はｈＥＳＣの維持に重要な役割を果たしていることが報告されている。これら３つのシグナル伝達経路の、さらには陰性対照としてｈＥＳＣで役割を果たしていないと報告されているＥＧＦシグナル伝達のそれぞれの小分子阻害剤で３ｉＬ ｈＥＳＣを処理した。ＦＧＦ、ＰＩ３Ｋ及びアクチビンシグナル伝達経路を阻害すると、１０日間の処理後に多能性マーカの減少が生じた（図４Ｂ乃至Ｃ）。この結果は、やはり他のシグナル伝達経路がＬＩＦシグナル伝達経路と共に作用して特有の３ｉＬ ｈＥＳＣ状態を支持することが必要とされることを示唆している。

実施例３
３ｉＬ ｈＥＳＣは多能性の特質を呈する
次に、こうした３ｉＬ ｈＥＳＣが実際に多能性であるかどうかを明らかにする特性評価を行った。この細胞は多能性マーカＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１について染色陽性であった（図５Ａ）。これらの多能性マーカの転写産物のレベルは３ｉＬ ｈＥＳＣと未処理ｈＥＳＣとの間で同等のままであった（図５Ｂ）。３ｉＬ ｈＥＳＣは２倍より高いＮＡＮＯＧ発現量を維持した（図５Ｂ）が、これはタンパク質レベルでも反映された（図５Ｃ）。興味深いことに、３ｉＬ ｈＥＳＣにおいてＤＰＰＡ３及びＴＢＸ３をはじめとするエピブラスト特異的遺伝子の上方制御が認められた（図５Ｂ）。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析から、３ｉＬ ｈＥＳＣはＯＣＴ４を発現したのは明らかであり、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１レベルが著しく増加していることが分かる（図５Ｄ）。

次に、３ｉＬ ｈＥＳＣが全ての生殖系譜細胞に分化することができるかを調べた。３ｉＬ ｈＥＳＣは、胚体外系譜及び３つの胚葉全ての細胞に分化することができる大きな胚様体を形成する（図５Ｅ）。また、生体内では、３ｉＬ ｈＥＳＣは、免疫不全マウスに注射したときに、３種の生殖系譜全ての組織を生じた（図５Ｆ）。興味深いことに、この３ｉＬ ｈＥＳＣは、ｈＥＳＣよりもより短時間でより大きな容量の奇形腫を生じた（図５Ｇ）。重要なことには、３ｉＬ ｈＥＳＣは、３ｉＬ条件で２ヶ月間培養した後に正常な核型を維持していた（図５Ｈ）。これらの結果から、３ｉＬ ｈＥＳＣは実際に多能性であることが分かる。３ｉＬ ｈＥＳＣ状態がＨ１ｈＥＳＣに特有のものではないことを確認するために、３ｉ＋ＬＩＦ小分子組み合わせを他の２種のヒトｈＥＳＣ細胞株ｈＥＳ２及びｈＥＳ３に対して試験した（図６Ａ乃至Ｌ）。奇形腫における再現可能な形態変化、マーカ発現の誘導及び３種の胚葉の全てに分化する能力が認められた。次に、３ｉＬ条件が人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の維持を可能にするかどうかを明らかにするために試験した。この細胞を３週間のウイルス誘導後に３ｉＬ条件で処理した。その結果、ｉＰＳＣの全コロニー数の増加は認められなかった（図６Ｍ）が、こうしたｉＰＳＣコロニーにおけるウイルスサイレンシングの有意な改善が認められ（図６Ｎ乃至Ｏ）、真のｉＰＳＣコロニーの数の増加が示唆された。また、ｉＰＳＣコロニーは３ｉＬ条件で安定的に培養することができる（図６Ｐ乃至Ｒ）。以上のデータから、３ｉＬによる別個の細胞状態の誘導は種々のヒト多能性細胞にまたがって達成可能であることが裏付けられる。

実施例４
３ｉＬ ｈＥＳＣのトランスクリプトームは天然の着床前エピブラストと類似している
以上の結果は３ｉＬ ｈＥＳＣがｈＥＳＣと異なることを示している。これらの違いを特徴付けるために、３ｉＬ ｈＥＳＣ及びｈＥＳＣのトランスクリプトームをＲＮＡ−Ｓｅｑを用いて比較した。３ｉＬ ｈＥＳＣとｈＥＳＣとの間で発現量の有意な変化を示す最初の遺伝子、さらには３ｉＬ ｈＥＳＣ特異的（３ｉＬ ｈＥＳＣで発現が増加する）及びｈＥＳＣ特異的（３ｉＬ ｈＥＳＣで発現が減少する）遺伝子、が特定された。表１は３ｉＬ ｈＥＳＣ特異的遺伝子のリストを示す。

３ｉＬ ｈＥＳＣ特異的遺伝子としてはＮＡＮＯＧ、ＤＰＰＡ３、ＫＬＦ４及びＴＢＸ３が挙げられ（図７Ａ）、初期の観察結果を裏付けている。３ｉＬ ｈＥＳＣが生体内多能性細胞と類似しているかどうかを調べるために、３ｉＬ ｈＥＳＣ発現データをヒト着床前胚及び０及び１０継代目の胚盤胞由来の初代ｈＥＳＣからの単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑデータと比較した。驚くべきことに、３ｉＬ ｈＥＳＣ特異的遺伝子はｈＥＳＣ特異的遺伝子におけるよりも着床前胚盤胞細胞において有意に高い発現を示すことが分かった（図７Ｂ）。これに対して、ｈＥＳＣ特異的遺伝子は、胚盤胞からの初代ｈＥＳＣ成長において３ｉＬ ｈＥＳＣ特異的遺伝子よりも高い発現を示す（図７Ｂ）。重要なことには、３ｉＬ ｈＥＳＣ特異的及びｈＥＳＣ特異的遺伝子のセットは、単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑデータに基づいて着床前胚盤胞細胞からｈＥＳＣを区別するのに十分である（図７Ｃ）。プロファイルされた胚盤胞のＩＣＭは多能性エピブラスト（ＥＰＩ）の細胞及び原始内胚葉（ＰＥ）の細胞からなる。胚盤胞のエピブラスト細胞は特に興味深いので、推定上のＥＰＩ特異的遺伝子の発現を３ｉＬ ｈＥＳＣにおいて評価した。ｈＥＳＣに比しＥＰＩ細胞でより高い量で発現される遺伝子（エピブラスト特異的遺伝子）は３ｉＬ ｈＥＳＣにおいて有意に濃縮される（図７Ｄ乃至Ｅ、図８Ａ乃至Ｄ）。３ｉＬ ｈＥＳＣにおけるこうしたエピブラスト特異的遺伝子の発現の増大は更に定量的ＰＣＲによって裏付けられる（図７Ｆ）。単一細胞ＰＣＲデータは、多能性遺伝子及びエピブラスト遺伝子が実際に共発現され、不均一な細胞集団の所産ではないことを裏付けている（図８Ｅ）。従って、３ｉＬ処理は、ヒト着床前胚からの多能性細胞により酷似する細胞状態に向けてｈＥＳＣの変換を誘導する。

実施例５
３ｉＬ ｈＥＳＣにおけるＧＡＴＡ６及びＮＡＮＯＧの共発現
胚盤胞及び３ｉＬ ｈＥＳＣにおいて発現され、従来型のｈＥＳＣでは発現されない遺伝子の１つはＧＡＴＡ６である（図８Ｆ）。ＧＡＴＡ６はリプログミング時にＯＣＴ４に取って代わることができると報告されており、初期着床前胚において発現される。ＧＡＴＡ６は原始内胚葉及び中胚葉の分化にも関与しているので、我々は、ＧＡＴＡ６の発現が自発的分化によって引き起こされるという可能性を排除したいと思った。多能性関連遺伝子の発現を調べると、こうした遺伝子が３ｉＬ ｈＥＳＣ及びｈＥＳＣにおいて同様な発現量を示すことが分かった（図８Ｇ）。また、定量的ＰＣＲによる検証は、分化関連遺伝子が３ｉＬ ｈＥＳＣにおいて上方制御されないことを裏付けている（図８Ｈ）。３ｉＬ ｈＥＳＣにおけるＧＡＴＡ６の発現については更に定量的ＰＣＲによって確認され、更にタンパク質レベルがウエスタンブロット分析によって確認された（図８Ｉ乃至Ｊ）。ＧＡＴＡ６及びＮＡＮＯＧの共免疫染色により３ｉＬ ｈＥＳＣにおいてこれら２種のタンパク質の共発現が明らかにされている（図８Ｋ）。この結果を更に裏付けるために、フローサイトメトリー分析を行った結果、５０％を著しく超える３ｉＬ ｈＥＳＣがｈＥＳＣの５％未満に比しＮＡＮＯＧ及びＧＡＴＡ６のいずれをも発現することが分かった（図８Ｌ）。また、ＧＡＴＡ６はＯＣＴ４及びＴＲＡ−１−６０と共発現される（図８Ｍ乃至Ｎ）。これらの結果から、ＧＡＴＡ６の発現は分化又は多能性の喪失によって引き起こされず、むしろ３ｉＬ ｈＥＳＣの特異的性質を反映している。ＮＡＮＯＧ及びＧＡＴＡ６は胚盤葉下層からの多能性エピブラストの分離の前に胚盤胞のＩＣＭ内の細胞で共発現される。これらの結果は、３ｉＬ ｈＥＳＣがこうしたＮＡＮＯＧ及びＧＡＴＡ６共発現細胞に類似している可能性があることを示唆している。従って、３ｉＬ ｈＥＳＣは、多能性におけるＧＡＴＡ６及び他の初期胚発生遺伝子の役割を研究するためのモデルとなりえよう。

実施例６
３ｉＬ ｈＥＳＣにおける着床前エピブラスト関連遺伝子の抑制解除
３ｉＬ ｈＥＳＣの遺伝子発現プロフィールが後成的遺伝風景の同時変化によって安定化されるかどうかを調べるために、活性（Ｈ３Ｋ２７ａｃ、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３）及び抑制性（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）クロマチンと関連するヒストン修飾のゲノムレベルのプロフィールを作成した。全ての遺伝子について、３ｉＬ ｈＥＳＣとｈＥＳＣとの間のそれぞれのヒストンマークの標準化倍率変化値を計算した。実際、遺伝子発現の変化はプロモータにおけるヒストン修飾の広範囲な変化において反映されていることが分かった（図９Ａ乃至Ｂ）。３ｉＬ ｈＥＳＣにおいて発現の増大を示す遺伝子は活性ヒストン修飾Ｈ３Ｋ２７ａｃ（ｐ値＝８．８３ｅ−２６３）及びＨ３Ｋ４ｍｅ３（ｐ値＝２．３８ｅ−６９）の増加並びに通常発生遺伝子と関連づけられる抑制的マークであるＨ３Ｋ２７ｍｅ３（ｐ値＝４．９０ｅ−９２）の減少を示す遺伝子のセットにおいて有意に濃縮される（図９Ｂ）。驚くべきことに、天然の着床前エピブラスト及び生体外ｈＥＳＣにおいて発現の異なる遺伝子のプロモータを調べたところ、エピブラスト特異的遺伝子においてＨ３Ｋ２７ｍｅ３の減少が生じることが分かった（図９Ｃ）。従って、ＴＢＸ３、ＫＬＦ５、ＺＮＦ６００及びＨＯＸＢクラスタなど、胚盤胞からのｈＥＳＣの誘導時に抑制されている遺伝子（図９Ｄ、図１０）は３ｉＬ ｈＥＳＣにおいて再活性化を示す。以上を総合すると、これらのデータから、３ｉＬ ｈＥＳＣは着床前胚形成のエピジェネティックスを研究するための優れたモデルを提供する特異な状態にあることが分かる。

実施例７
３ｉＬ ｈＥＳＣにおける調節回路の再構成
多能性を制御する遺伝子調節ネットワークをＥＳＣにおいて研究し、胚幹細胞の独自性の調節について基本的な洞察が得られた。遺伝子発現及び後成的修飾に関するこうした分析結果から、３ｉＬ ｈＥＳＣは従来型のｈＥＳＣとは異なる多能性状態を示していることが示唆される。転写調節ネットワークが両細胞状態間で変化しているかどうかを調べるために、主要な多能性調節因子ＮＡＮＯＧ及びＯＣＴ４並びに一般的なエンハンサ結合タンパク質Ｐ３００のゲノムレベルの結合マップを作成した。ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ及びＰ３００の全ての結合部位について、３ｉＬ ｈＥＳＣ特異的及びｈＥＳＣ特異的結合事象を特定するための３ｉＬ ｈＥＳＣ及び従来型ｈＥＳＣ間の結合の差を計算した。驚くべきことに、何千という結合事象がこれら２つの多能性状態間で変化し、調節ネットワークが実際に再構成されることが分かった（図１１Ａ、図１２Ａ、Ｂ及びＣ）。ネットワークの再構成を支持することとして、転写因子結合の差はそれらの標的遺伝子の発現の差と有意に関連付けられることが分かった（図１２Ａ）。

３ｉＬ ｈＥＳＣが従来型ｈＥＳＣでは抑制されているエピブラスト特異的遺伝子の後成的及び転写的再活性化を示すことから、３ｉＬ ｈＥＳＣを用いてがヒト着床前発生において活性でありうる新規エンハンサを特定することができるか調べた。確かに、遠位エンハンサにおけるＮＡＮＯＧ占有率の増加はエピブラスト特異的遺伝子の上方制御と有意に関連付けられることが分かった（図１２Ｂ）（フィッシャー検定、ｐ値＝５．４６ｅ−１３、図１２Ｂ及びＣ）。天然の着床前エピブラストにおいて発現され、新規の結合部位、即ち結合部位の増加を示す遺伝子としては、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＤＰＰＡ３、ＫＬＦ５、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＴＢＸ３、ＺＮＦ６００及びＬＡＭＢ１が挙げられる（図１２Ｂ及びＣ、図１１Ｂ）。興味深いことに、これらの遺伝子の一部の近くにはＳＴＡＴ３結合が検出され（図１２Ｂ及びＣ）、ＬＩＦシグナル伝達は３ｉＬ細胞における中核的な多能性ネットワークと統合される可能性があることが示唆された（図１２Ｂ及びＣ）。

本研究では、３種の小分子による組み合わせ処理により特異なｈＥＳＣ状態がうまく誘導されることが示されている。こうした３ｉＬ ｈＥＳＣは自己複製するのにＬＩＦを必要とし、天然のヒト胚盤胞細胞の中の多能性エピブラスト細胞と発現パターンの特性を共有している。ヒト着床前胚及びｈＥＳＣの単一細胞分析では両者の間に有意な差異があることが明らかにされている。本研究の新規３ｉＬ ｈＥＳＣ状態は、これら生体内及び生体外の多能性状態間のギャップを縮めるものである（図１２Ｄ）。３ｉＬ ｈＥＳＣと天然の着床前エピブラスト細胞とのこの類似性は、多能性を規定する分子経路を把握する際に将来の研究の足場となる。

ｈＥＳＣは、ＬＩＦを初めとする種々の外部シグナル伝達因子を用いた多くの化学的限定条件で維持されている。これまでのＬＩＦ依存性ｈＥＳＣはｍＥＳＣの天然状態と類似性を示している。これに対して、同様にＬＩＦ依存性である３ｉＬ ｈＥＳＣは、天然の着床前エピブラスト細胞の多能性状態と類似性を示す。ＳＴＡＴ３結合部位は、ＬＩＦシグナル伝達が中核的転写ネットワークと協働して３ｉＬ ｈＥＳＣの発現パターン特性に寄与する可能性があることを示唆する回路の再構成において認められた。ＬＩＦシグナル伝達は生体外でのヒト胚盤胞の形成を増強すると報告されている。しかしながら、ＬＩＦシグナル伝達が胚盤胞の多能性細胞においてどのように役割を果たしているのかは依然として不明である。それ故に、３ｉＬ ｈＥＳＣにおけるＬＩＦの役割を詳細に分析することにより、ＬＩＦシグナル伝達が胚盤胞の発生にどのように寄与しているのかについて理解を深めることができよう。

３ｉＬ ｈＥＳＣの特質の１つは、一部が系譜指定因子の役目をなすと考えられている、初期ヒト胚形成において発現される一群の遺伝子の上方制御である。これについての一例が、マウス及びヒト胚の両者の初期ＩＣＭにおいて発現されるＧＡＴＡ６である。興味深いことに、ＧＡＴＡ３、ＧＡＴＡ４及びＧＡＴＡ６は、リプログラミング時にＯＣＴ４に取って代わることができたことにより、多能性における系譜指定因子の役割が示された。ＧＡＴＡ６の遺伝子座はＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ及びＳＴＡＴ３によって制約されているが、３ｉＬ ｈＥＳＣにおけるＧＡＴＡ６の役割はまだ検討されていない。３ｉＬ ｈＥＳＣでは、ＧＡＴＡ６は中核的多能性関連転写因子との相互作用を介する多能性ネットワークの一成分でありえよう。或いは、ＧＡＴＡ６は系譜特異的分化時に誘導される遺伝子を指し示すことができよう。従って、３ｉＬ ｈＥＳＣは多能性関連転写因子と系譜指定因子との相互作用を理解するための代表的な例として用いることができるかもしれない。

３ｉＬがｈＥＳＣにおいて広範囲な転写的及び後成的変化を誘発することは示されたが、この変換のメカニズムは完全には理解されていない。本研究からのデータから、３ｉＬは、ｈＥＳＣにおけるＬＩＦシグナル伝達の活性化の律速因子の１つと思われるＧＰ１３０の発現を誘導することができることが分かる。また、３ｉＬは、細胞内シグナル伝達の調節を介して、新しい部位を創出することにより多能性関連転写因子の結合を変えることができることも考えられる。事実、多くの新しい結合部位が３ｉＬ ｈＥＳＣにおいて生じ、これらは発現の変化と有意に関連付けられることが認められた（図１２Ａ乃至Ｃ）。従って、３ｉ及びＬＩＦによる処理に対応した調節ネットワークの再構成はそうした細胞状態の変換に関与していると思われる。

調節ゲノム研究にはヒト胚用に利用できない多数の細胞が必要とされることから、３ｉＬ ｈＥＳＣは胚盤胞における多能性の遺伝子調節を研究するためのシステムとして役立ち得る。クロマチン標識及び転写因子結合部位のＣｈＩＰ−ｓｅｑプロファイリングを用いて、ヒト胚盤胞で発現されるが、ｈＥＳＣで抑制されている遺伝子のこれまでに知られていない多くのエンハンサを特定した結果、３ｉＬ ｈＥＳＣは本研究を行う前には理解し難かった機能について洞察をもたらすことが分かった。遺伝子調節以外に、後成的特性も３ｉＬ ｈＥＳＣとｈＥＳＣとでは異なっている。例えば、ヒト着床前胚からの細胞において発現される遺伝子の広範囲な抑制解除が認められ、ＤＮＭＴ３Ｌなどの数種の後成的調節因子の発現が異なることが分かった。ＤＮＭＴ３Ｌは、初期胚発生時の重要なプロセスの１つであるＤＮＡメチル化を調節している。３ｉＬ ｈＥＳＣは、こうした後成的経路及び多能性の調節におけるその役割を研究するためのモデル系として役立たせることができる。

結論として、ｈＥＳＣを３ｉＬで処理すると、従来型のｈＥＳＣと後成的、転写的及び形態的に異なる多能性状態が誘発されることが分かる。３ｉＬ ｈＥＳＣにおける調節回路の再構成は天然の着床前エピブラスト様発現パターン特性を支持することが論証される。３ｉＬ ｈＥＳＣのより天然の状態は新しい機会を与える。従って、３ｉＬ ｈＥＳＣを研究することによりヒト細胞の多能性への我々の理解を見直し、広げる多くの可能性がもたらされる。

実施例８
３ｉＬ ｈＥＳＣにおける発生遺伝子の誘導は３ｉＬ ｈＥＳＣの分化を増強する
３ｉＬ ｈＥＳＣにおいて胚体外系譜指定因子ＣＤＸ２、ＧＡＴＡ４及びＧＡＴＡ６並びに内胚葉系中胚葉マーカＴ及びＭＩＸＬの強い上方制御が認められた（図１３Ａ及び１３Ｂ）。同時に、多能性関連遺伝子は３ｉＬ ｈＥＳＣ及びｈＥＳＣにおいて同様な発現量を示し（図８Ｇ）、これは分化又は多能性の喪失によるものではなく、むしろ３ｉＬ ｈＥＳＣの特異的性質を反映したものであることが分かる。

発生遺伝子の発現が増大するにもかかわらず多能性状態が維持されることは驚くべきことである。こうした発生遺伝子の発現が生物学的に細胞をプライミングして分化させることができるかを明らかにするための研究をおこなった。この仮説を検証するために、２種の内胚葉分化プロトコルを用いて、３ｉＬ ｈＥＳＣの内胚葉分化効率をｈＥＳＣと比較した。最初のプロトコルでは、小分子阻害剤ＩＤＥ−１及びアクチビンＡを用いてｈＥＳＣを分化させた。３ｉＬ ｈＥＳＣを用いた場合、ｈＥＳＣから分化した細胞に比し、内胚葉マーカＳＯＸ１７及びＦＯＸＡ２について陽性に染色される細胞がより多く認められた（図１３Ｃ）。これに対応して、３ｉＬ ｈＥＳＣから分化した細胞においては内胚葉遺伝子ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ４Ａ及びＣＸＣＲ４がより強く上方制御される（図１３Ｄ）。次に、第２の分化プロトコルを用いて、３ｉＬ ｈＥＳＣ及びｈＥＳＣから分化した多くの細胞において内胚葉前駆細胞マーカＳＯＸ１７の発現の強い誘導が認められた（図１３Ｅ）。しかしながら、３ｉＬ ｈＥＳＣを用いた場合、より多くの細胞が内胚葉前駆細胞マーカＦＯＸＡ２について陽性に染色された（図１３Ｅ）。また、３ｉＬ ｈＥＳＣから分化した細胞において内胚葉遺伝子ＨＮＦ４Ａ及びＣＸＣＲ４がより強く上方制御されている（図１３Ｆ）。従って、３ｉＬ ｈＥＳＣは内胚葉系譜に向かってより容易に分化するように思われる。

Claims (30)

1. 未分化状態で多能性幹細胞を培養し、維持する方法であって、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＡＭＰＫ及び／又はＢＭＰシグナル伝達の二重阻害剤、並びにＬＩＦを含む培地で前記多能性幹細胞を培養する工程を含む方法。
2. 前記培地が順化培地である、請求項１に記載の方法。
3. 前記培地がフィーダー細胞を含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記培地がフィーダー細胞を含まない、請求項１に記載の方法。
5. 前記多能性幹細胞がマトリクス上で培養される、請求項１に記載の方法。
6. 前記マトリクスが基底膜マトリクスである、請求項５に記載の方法。
7. 前記マトリクスがラミニン、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、ヘパラン硫酸又は合成生体高分子の１種以上を含む細胞外マトリクスである、請求項５に記載の方法。
8. 前記多能性幹細胞が胚性幹細胞である、請求項１に記載の方法。
9. 前記胚性幹細胞がヒトのものである、請求項８に記載の方法。
10. 未分化状態で前記多能性幹細胞を継代する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
11. 前記ＭＥＫ阻害剤が０．５乃至１μＭの濃度である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記ＧＳＫ３阻害剤が１乃至２μＭの濃度である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記ＡＭＰＫ及び／又はＢＭＰシグナル伝達の二重阻害剤が２μＭの濃度である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記ＬＩＦが８乃至１０ｎｇ／ｍｌの濃度である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法により作製した多能性幹細胞。
16. 前記細胞がＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ−１−６０、ＯＣＴ４及びＴＲＡ−１−８１からなる群から選ばれる少なくとも１種の多能性マーカを発現する、請求項１５に記載の多能性幹細胞。
17. 前記細胞がＤＰＰＡ３、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５及びＴＢＸ３からなる群から選ばれる少なくとも１種のエピブラスト様遺伝子発現マーカを発現する、請求項１５に記載の多能性幹細胞。
18. 前記細胞がＣＤＸ２、ＢＭＰ４、ＧＡＴＡ４及びＧＡＴＡ６からなる群から選ばれる少なくとも１種の胚体外マーカを発現する、請求項１５に記載の多能性幹細胞。
19. 前記細胞がＴ又はＭＩＸＬ１から選ばれる少なくとも１種の内胚葉系中胚葉マーカを発現する、請求項１５に記載の多能性幹細胞。
20. 少なくとも１種のマーカの発現量が請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法に従って培養されなかった細胞に比して増加する、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の多能性幹細胞。
21. 前記少なくとも１種のマーカの発現量がＲＮＡ配列決定法又は実時間ＰＣＲ法によって測定される、請求項２０に記載の多能性幹細胞。
22. 前記少なくとも１種のマーカの発現量が請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法に従って培養されなかった細胞に対して少なくとも１．５乃至５倍増加する、請求項２０〜２１のいずれか一項に記載の多能性幹細胞。
23. 前記少なくとも１種のマーカがＮＡＮＯＧであり、発現量が請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法に従って培養されなかった細胞に対して１．５乃至２倍増加する、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の多能性幹細胞。
24. 内胚葉、神経又は中胚葉細胞への前記細胞の分化が請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法に従って培養されなかった細胞の分化に比して増強される、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の多能性幹細胞。
25. 未分化状態で多能性幹細胞を培養し、維持するための培養培地であって、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＡＭＰＫ及び／又はＢＭＰシグナル伝達の二重阻害剤、並びにＬＩＦを含む前記培養培地。
26. 多能性幹細胞から系譜特異的細胞を生じさせる方法であって、
    ａ）請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法に従って未分化状態で多能性幹細胞を培養する工程、
    ｂ）前記未分化多能性幹細胞を単離する工程及び
    ｃ）前記単離した多能性幹細胞を系譜特異的な細胞に分化させるのに適した培養培地において前記単離した未分化多能性幹細胞を培養する工程
    を含む方法。
27. 前記系譜特異的細胞が体細胞又はオルガノイド細胞である、請求項２６に記載の方法。
28. 前記系譜特異的細胞が内胚葉系譜細胞である、請求項２７に記載の方法。
29. 前記体細胞が１種若しくは数種の体細胞系譜細胞又は完全に成熟した分化体細胞へ自己複製又は分化することができる委任前駆細胞である、請求項２７に記載の方法。
30. 未分化状態で多能性幹細胞を培養し、維持するための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法において用いられるキットであって、請求項２４に記載の培養培地及び使用説明書を含むキット。
    
    

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