JP2009501529A - 食料および飲料の風味を増強する酵素組成物 - Google Patents

食料および飲料の風味を増強する酵素組成物 Download PDF

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Abstract

本発明は、食料および飲料製品の栄養価および／または風味を増強するのに有用な酵素組成物を提供する。本発明はまた、栄養および／または風味プロファイルが増強された食料および飲料製品を生産する方法も提供する。
【選択図】図３

Description

本発明は、食料および飲料製品の栄養価および／または風味を増強するのに有用な酵素組成物を提供する。本発明はまた、栄養および／または風味プロファイルが増強された食料および飲料製品を生産する方法も提供する。
関連出願の相互参照
本出願は、2005年７月15日付け米国仮特許出願番号60/699,368号、および2006年６月23日付け米国仮特許出願番号60/815,337号に対する35 U.S.C. §119(e)に基づく優先権を主張する。これらの文献は、その全文を参照として本明細書に組み込むものとする。
本発明の背景についての以下の記述は、読み手が本発明を理解するのを助けるために提供するにすぎず、本発明に対する先行技術を記載するものまたは構成するものとして容認するわけではない。
グリコン（「グリコシド」とも呼ばれる）は、アグリコン（aglycone）（アグリコン（aglycons）とも呼ばれる）と称する非サッカライド部分に結合したサッカライドとして便宜上考えられる分子である。グリコンは自然界に広く存在しており、その多くは生理学的に有益である。
例えば、イソフラボングリコン（IFG）として知られるグリコンのサブセットは、アグリコンとしてイソフラボンを含んでいる。一部のイソフラボンは、抗酸化剤活性を有し、反応性酸素種（例えば、一重項酸素）、スーパーオキシド、ヒドロキシルラジカルなどのようなフリーラジカルの損傷作用から細胞を保護する働きをすることが明らかにされている。高レベルの反応性酸素種は、酸化的ストレスを招くことがわかっており、このような酸化的ストレスは、パーキンソン病およびアルツハイマー病のような疾患、アテローム硬化症のような心血管病、ならびにある種の癌の悪化に関連している。従って、多くのイソフラボンアグリコンは、癌、アテローム硬化症、骨粗鬆症、更年期障害、加齢に関係した疾病などの疾患の予防および症状緩和効果、ならびに血中コレステロールの低下をもたらす。
一般に、グリコンは、それ自体では生理学的活性を発揮せず、このような活性は、むしろグリコンの酵素による加水分解（例えば、糖切断）から生じたアグリコンによるものである。従って、生理学的利益を達成するためには、アグリコンを遊離させる必要があると考えられる。さらに、イソフラボンやフラボノイドのような遊離アグリコンは、生理学的過程で自然に加水分解される同等のグリコンと比べて、バイオアベイラビリィティの増加、より速い吸収、より高い効率とともに、より高い生物活性を生じさせる。
多くの食料および飲料は、前述したような生理学的利益を生じさせるアグリコンをもたらすグリコンを含んでいる。さらに、一部のアグリコンを遊離することにより、風味の増強、すなわち、快い香気の増強、味の増強、またはその両方が達成される。こうした更なる利益は、必要なグリコンを含む食品および飲料の製造において、商業的に極めて重要である。このような製品の風味の増強により、製品の不快な面を軽減または隠蔽し、望ましい味もしくは香気またはその両方を強化することができる。その上、有利な生理学的効果と関連したアグリコンの遊離により、栄養、栄養補助または治療価値の向上といった、さらなる利点がもたらされる。このことは、グリコンをその有益なアグリコン形態に効果的または効率的に加水分解しない（例えば、消化系が有益なグリコンを効果的または効率的に加水分解するのに必要な酵素活性を欠失している）集団または特定の被検者（ヒトまたは動物被検者を含む）に対して特に有益となりうる。
グリコンをアグリコンに変換する技法は当分野で周知である。通常の技法は、グリコンの酵素切断によりアグリコンを取得することを含む。特に、グルコシダーゼは所望の変換を達成するが、この方法にはいくつかの問題点がある。この方法は複数のステップを要し、しばしば有害な副産物を発生したり、さらなる分解を引き起こしたりするため、全体として非効率的な化学的方法である。従って、単一の効率的なステップでアグリコンを遊離させることが望ましい。
加えて、食料および飲料はすべてが同様のグリコンプロファイルを示すわけではない。実際に、食料または飲料をただ１種の酵素（グルコシダーゼなど）と接触させても、風味増強アグリコンの能力を十分に利用することはできない。その結果、グリコシド切断によって、一部のアグリコンの放出または部分的放出が起こり、他のアグリコンは放出されないまま残っていると考えられる。従って、１つの便利なステップで広範なグリコンプロファイルを有する食料および飲料の風味を増強することが望ましいだろう。
発明の概要
本発明は、ある実施形態において、酵素組成物を含む、または該組成物で処理した食料および飲料組成物、ならびに、このような食料および飲料組成物を製造する方法を提供することにより、前記およびその他の要求を満たすものである。
一態様によれば、本発明は、（ｉ）グリコンを含む食料または飲料と、（ii）グルコシダーゼ活性、β-グリコシダーゼ活性、プロテアーゼ活性、リパーゼ活性、アミラーゼ活性、グルコアミラーゼ活性、キシラナーゼ活性、およびペクチナーゼ活性のうち１以上を含む酵素活性プロファイルを示す酵素組成物と、を含む食料または飲料組成物を提供する。具体的実施形態では、上記食料または飲料組成物は、上記酵素組成物を含まない同等の組成物と比べて、アグリコン含量の増加および／または風味の増強を呈する。
一実施形態では、酵素組成物の酵素活性プロファイルは、約40〜約70ｕ／ｇのグルコシダーゼ活性；約0.3〜約0.9ｕ／ｇのβ-グリコシダーゼ活性；約4,000〜約8,000ｕ／ｇのプロテアーゼ活性；約300〜約500ｕ／ｇのリパーゼ活性；約160,000〜約190,000ｕ／ｇのアミラーゼ活性；約24,000〜約28,000ｕ／ｇのグルコアミラーゼ活性；約11,000〜約14,000ｕ／ｇのキシラナーゼ活性；および約40〜約120ｕ／ｇのペクチナーゼ活性のうち１以上を含む。一実施形態では、酵素組成物は、グルコシダーゼ、β-グリコシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、キシラナーゼ、およびペクチナーゼからなる群より選択される１以上の酵素を含む。別の実施形態では、酵素組成物はプロテアーゼMを含む。
別の態様によれば、本発明は、グルコシダーゼ活性、β-グリコシダーゼ活性、プロテアーゼ活性、リパーゼ活性、アミラーゼ活性、グルコアミラーゼ活性、キシラナーゼ活性、およびペクチナーゼ活性のうち１以上を含む酵素活性プロファイルを示す酵素組成物と、グリコン含有食料または飲料を接触させる方法により製造された食料または飲料組成物を提供する。具体的実施形態では、上記食料または飲料組成物は、上記酵素組成物を含まない同等の組成物と比べて、アグリコン含量の増加および／または風味の増強を呈する。一実施形態では、酵素組成物は、グルコシダーゼ、β-グリコシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、キシラナーゼ、およびペクチナーゼからなる群より選択される１以上の酵素を含む。別の実施形態では、酵素組成物はプロテアーゼMを含む。
別の態様によれば、本発明は、食料または飲料の風味を増強する方法であって、グルコシダーゼ活性、β-グリコシダーゼ活性、プロテアーゼ活性、リパーゼ活性、アミラーゼ活性、グルコアミラーゼ活性、キシラナーゼ活性、およびペクチナーゼ活性のうち１以上を含む酵素活性プロファイルを示す酵素組成物と、食料または飲料を接触させることを含む、上記方法を提供する。一実施形態では、酵素組成物は、グルコシダーゼ、β-グリコシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、キシラナーゼ、およびペクチナーゼからなる群より選択される１以上の酵素を含む。別の実施形態では、酵素組成物はプロテアーゼMを含む。
別の態様によれば、本発明は、食料または飲料のアグリコン含量を増加する方法であって、グルコシダーゼ活性、β-グリコシダーゼ活性、プロテアーゼ活性、リパーゼ活性、アミラーゼ活性、グルコアミラーゼ活性、キシラナーゼ活性、およびペクチナーゼ活性のうち１以上を含む酵素活性プロファイルを示す酵素組成物と、グリコン含有食料または飲料を接触させることを含む、上記方法を提供する。一実施形態では、酵素組成物は、グルコシダーゼ、β-グリコシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、キシラナーゼ、およびペクチナーゼからなる群より選択される１以上の酵素を含む。別の実施形態では、酵素組成物はプロテアーゼMを含む。
別の態様によれば、本発明は、グルタミナーゼ、β-グリコシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、キシラナーゼ、およびペクチナーゼのうち１以上を含む酵素組成物を提供する。具体的実施形態では、上記組成物は、酵素RP-1、デミナーゼおよびグルタミナーゼのうち１以上をさらに含む。別の具体的実施形態では、上記組成物は、約0.3〜約0.9ｕ／ｇのβ-グリコシダーゼ活性；約4,000〜約8,000ｕ／ｇのプロテアーゼ活性；約300〜約500ｕ／ｇのリパーゼ活性；約160,000〜約190,000ｕ／ｇのアミラーゼ活性；約24,000〜約28,000ｕ／ｇのグルコアミラーゼ活性；約11,000〜約14,000ｕ／ｇのキシラナーゼ活性；および約40〜約120ｕ／ｇのペクチナーゼ活性のうち１以上を含んでなる酵素活性プロファイルを含む。
別の態様によれば、本発明は、風味増強量の、β-グリコシダーゼ活性、プロテアーゼ活性、リパーゼ活性、アミラーゼ活性、グルコアミラーゼ活性、キシラナーゼ活性、およびペクチナーゼ活性のうち１以上を含む酵素活性プロファイルを有する酵素組成物を含む、食料または飲料製品を提供する。一実施形態では、上記酵素活性プロファイルは、さらに、グルタミナーゼ活性を含む。一実施形態では、酵素組成物は、β-グリコシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、キシラナーゼ、およびペクチナーゼからなる群より選択される１以上の酵素を含む。別の実施形態では、酵素組成物はプロテアーゼMを含む。
別の態様によれば、本発明は、風味プロファイルが増強した食料または飲料製品を生産する方法であって、風味増強量の、β-グリコシダーゼ活性、プロテアーゼ活性、リパーゼ活性、アミラーゼ活性、グルコアミラーゼ活性、キシラナーゼ活性、およびペクチナーゼ活性のうち１以上を含む酵素活性プロファイルを有する酵素組成物と、上記食料または飲料製品を接触させることにより、上記食料または飲料製品の風味プロファイルを増強するステップを含む、上記方法を提供する。一実施形態では、酵素組成物は、β-グリコシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、キシラナーゼ、およびペクチナーゼからなる群より選択される１以上の酵素を含む。別の実施形態では、酵素組成物はプロテアーゼMを含む。一具体的実施形態では、上記方法はさらに、接触ステップの後、上記酵素組成物を不活性化するのに十分な時間および温度で、上記食料または飲料製品を加熱するステップをさらに含む。本発明はまた、この方法により得られる食料または飲料製品も提供する。
詳細な説明
本発明は、食料および飲料の栄養価および／または風味（例えば、味および／または香気）を増強するのに有用な酵素組成物を提供する。一実施形態によれば、酵素組成物を含む、または該組成物で処理した食料または飲料は、処理されていない同等の食料または飲料と比較して、増強した風味を呈する。別の実施形態によれば、酵素組成物を含む、または該組成物で処理した食料または飲料は、処理されていない同等の食料または飲料と比較して、アグリコン含量の増加を示す。
以下に記載するように、また本出願全体を通して、いくつかの定義を用いてここに本発明を説明する。
本明細書で用いる単数形「１つの」（a, an）および「上記、該、その」（the）は、特に断らない限り、複数形も包含する。
本明細書で用いる用語「アグリコン」は、グリコシドからサッカライドを形式的に除去することにより、グリコン（「グリコシド」としても知られる）から得られる化合物を意味する。グリコンのアグリコンは自然界のいたる所に存在している。アグリコンの例として、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：植物の揮発性化合物、例えば、リナロール、ゲラニオール、シトロネラール、フェネチルアルコール、シトロネロール、ジャスモン、リモネン、テルピネン、シトラール、ネロール、ピネン、ボルネオール、テルピネオール、ジャスモン酸メチル、ヘキサノール、ヘキセノール、ヘキサナール、ヘキセナール、バニリン、ベンズアルデヒド、オイゲノール、サリチル酸メチル、リナロールオキシド、ベンジルアルコール、およびボミフォミトール；植物の色素、例えば、アリザリン、プルプリン、アントシアニジン（ペラゴニジン、シアニジン、デルフィニジン、ペオニジン、ペツニジン、およびマルビニジンなど）；ならびに、フラボノイド、例えば、ナリルチン、ナリンゲニン、ヘスペレチン、ネオヘスペレチン、ジオスメチン、ケルセチン、カンフェロール、ミリセチン、イソラムネチン、およびシリンゲニンなど。本明細書に記載した化合物以外に、多種の化合物がグリコンのアグリコンとして存在するか、あるいは、グリコンのアグリコンになりうる。
本明細書で用いる「食料製品」、「食品」または「食料」、および「飲料製品」または「飲料」は、基本的な食料または飲料成分だけではなく、１以上の基本成分を含む半加工および完全加工の製品をも包含する。従って、食品の例として、限定するものではないが、食肉、乳製品、油、甘味料、豆果、野菜および野菜製品、果物および果物製品、香辛料、穀類、堅果および種子製品、大豆および大豆製品、ならびにこれらの組合せからなる製品が挙げられる。飲料製品の例としては、コーヒー、茶、ミルクおよびクリームをベースとする飲料、アルコール飲料（例えば、ワインおよびビール）、果物および野菜ジュース（例えば、リンゴジュース、チェリージュース、ザクロジュース、ブドウジュース、クランベリージュース、カンキツ類のジュース、例えば、レモンジュース（例：レモネード）、オレンジジュース、グレープフルーツジュース、ならびにこれら飲料いずれかの混合物が挙げられる。
Ｉ．酵素組成物
本発明は、多種多様な食料および飲料の栄養価および／または風味（例えば、味および／または香気）プロファイルの増強に有用な、酵素活性の特定の組合せを含む酵素活性プロファイルを有する組成物（酵素の混合物を含む組成物、ならびに、複数の酵素活性を呈示する酵素産生生物から得られる組成物など）を提供する。こうしたことは、個々の酵素の個別の適用により得ることは不可能であるか、あまり実用的ではない。
本明細書で用いる用語「酵素活性プロファイル」とは、所与の酵素組成物により呈示される酵素活性を意味する。「酵素活性」とは、名称を挙げた酵素の活性を意味する。従って、例えば、グルタミナーゼ活性を含む酵素活性プロファイルを有する組成物は、グルタミナーゼの活性を呈示する。本明細書に記載するように、酵素組成物は、複数の様々な酵素活性を呈示しうるが、これらの酵素活性は、当分野において周知で、以下に記載する通常のアッセイにより確認することができる。
本発明の酵素組成物の酵素活性は、処理しようとする食料または飲料、および処理した製品の所望の特性に応じて変わりうる。例えば、ある実施形態では、酵素組成物は、１以上の下記酵素を含有することができる（または下記酵素の１以上の活性を呈示することができる）；グルタミナーゼ、β-グリコシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、キシラナーゼ、ペクチナーゼ、5’リボヌクレアーゼ（RP-I）およびデアミナーゼ。上に挙げた酵素の具体的組成物の例として、限定するものではないが、β-グリコシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、キシラナーゼ、およびペクチナーゼを含む組成物；グルタミナーゼおよびβ-グリコシダーゼを含む組成物；グルタミナーゼ、β-グリコシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、キシラナーゼ、およびペクチナーゼを含む組成物；グルタミナーゼ、β-グリコシダーゼ、および酵素RP-1を含む組成物；グルタミナーゼ、β-グリコシダーゼ、およびデアミナーゼを含む組成物；グルタミナーゼ、β-グリコシダーゼ、デミアーゼ、および酵素RP-1を含む組成物；ならびにRP-1だけを（すなわち、唯一の酵素成分として）含む組成物が挙げられる。
別の実施形態では、酵素組成物は、例えば、グルコシダーゼ活性、β-グリコシダーゼ活性、プロテアーゼ活性、リパーゼ活性、アミラーゼ活性、グルコアミラーゼ活性、キシラナーゼ活性、およびペクチナーゼ活性のうち１以上を含む酵素活性プロファイルを呈示する。一具体的実施形態では、上記酵素組成物はプロテアーゼMを含んでもよい。
酵素および酵素活性に関する以下の説明は、読み手による具体的実施形態の理解を助けることを目的とするものであって、本発明の範囲を制限する意図はない。
グルタミナーゼ：
前述したように、いくつかの組成物は、グルタミナーゼまたはグルタミナーゼ活性を含みうる。グルタミナーゼは、グルタミンを、周知の風味促進剤であるグルタミン酸に変換することができる。
プロテアーゼ：
いくつかの組成物は、プロテアーゼまたはプロテアーゼ活性を含みうる。プロテアーゼは、タンパク質のアミノ酸間のペプチド結合を破壊する酵素である。現在、次の６クラスのプロテアーゼが存在する：セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ（例：プラスメプシン）、メタロプロテアーゼ、ならびにグルタミン酸プロテアーゼ。
リパーゼ：
いくつかの組成物は、リパーゼまたはリパーゼ活性を含みうる。リパーゼは、水不溶性脂質基質におけるエステル結合の加水分解を触媒する水溶性酵素である。ほとんどのリパーゼは、脂質基質のグリセロール骨格上の特定位置で作用する。
アミラーゼ：
いくつかの組成物は、アミラーゼまたはアミラーゼ活性を含みうる。アミラーゼは、サッカリダーゼ（すなわち多糖類を切断することができる酵素）として分類される消化酵素である。
グルコアミラーゼ：
いくつかの組成物は、グルコアミラーゼまたはグルコアミラーゼ活性を含みうる。グルコアミラーゼ（アミログルコシダーゼとしても知られる）は、グルコースポリマー構造を分解する酵素である。グルコアミラーゼは工業的糖化工程（デンプンの酵素的変換およびアルコールの製造の両方）で用いられる。
キシラーゼ：
いくつかの組成物は、キシラーゼまたはキシラーゼ活性を含みうる。キシラーゼは、線状多糖β-1,4-キシランをキシロースに分解し、従って、植物の細胞壁の主成分であるヘミセルロースを分解する。
ペクチナーゼ：
いくつかの組成物は、ペクチナーゼまたはペクチナーゼ活性を含みうる。ペクチナーゼは、植物の細胞壁に存在する多糖基質であるペクチンを分解する酵素の一般名である。最も多く研究され、広く用いられている市販のペクチナーゼの１つに、ポリガラクツロナーゼがある。
RP-1およびデアミナーゼ：
その他の実施形態には、１以上の別の酵素（例えば、RP-1およびデアミナーゼ）を含む組成物を提供するものがある。RP-1はRNAをCMP、UMP、AMP、およびGMPに分解する。デアミナーゼはAMPをIMPに変換する。GMPおよびIMPは風味促進剤であることを認識すべきである。従って、いくつかの実施形態では、本発明の組成物はRP-1とデアミナーゼの両方を含む。別の実施形態では、本組成物はRP-1を含むが、デアミナーゼは含まない。
グルコシダーゼ：
いくつかの組成物は、グルコシダーゼまたはグルコシダーゼ活性を含みうる。グルコシダーゼは、グルコシド（グリコン、その糖成分はグルコースである）の加水分解を触媒する酵素として分類される。
β-グリコシダーゼ：
いくつかの組成物は、β-グリコシダーゼまたはβ-グリコシダーゼ活性を含みうる。β-グリコシダーゼは、アグリコンとしてフィトエストロゲン、ポリフェノール、イソフラボン、ビオカニンA、フォルモノネチン、クメストロール、およびリグナンのような化合物を含むグリコンに作用する。特に、β-グリコシダーゼは、アグリコンとしてイソフラボンを含むグリコンに極めて効率的に作用することができる。従って、一実施形態では、イソフラボングリコンが、例えば、ダイズイン、ゲニスチン、もしくはグリシチン、またはこれらのアセチル誘導体、スクシニル誘導体、もしくはマロニル誘導体である場合に、本組成物を使用するのが有利である。
β-グリコシダーゼは一般に、糖鎖ヒドロラーゼとして分類される。しかし、これは、通常のα-およびβ-グリコシダーゼとは異なる特性を示す。β-グリコシダーゼは、１種または２種以上の糖（これらは、糖鎖のヒドロキシル基を介して、糖以外の化合物に結合している）からなる線状または枝分れ糖鎖を有するグリコシドに作用する。β-グリコシダーゼは基質の2’-位置を認識してこれを切断し、これにより、対応する二糖およびアグリコンが形成される。
サッカライドの任意の組合せは、β-グリコシダーゼを含む組成物の適切な基質として認識される。サッカライドの組合せは二糖構造を示すことができる。
本発明で用いるβ-グリコシダーゼは、ペニシリウム・マルチカラー（Penicillium multicolor）から商業的量を得ることができる。この酵素はまた、例えばWO 00/18931に記載されているものなど、当分野で周知の通常の手順により、β-グリコシダーゼを産生する微生物から取得し、精製することもできる。
プロテアーゼM：
いくつかの組成物はプロテアーゼMを含みうる。プロテアーゼMは、コウジ菌（Aspergillus oryzae）により産生される酸性タンパク質分解酵素調製物であり、ダイズ、コメおよびカゼインのような食品を加水分解するのに用いる。プロテアーゼMはさらに特性決定されており、プロテアーゼ活性以外にも、プロテアーゼMはグルコシダーゼ活性、β-グリコシダーゼ活性、リパーゼ活性、アミラーゼ活性、グルコアミラーゼ活性、キシラナーゼ活性、およびペクチナーゼ活性を示すことがわかっている。例えば、プロテアーゼMは、約40〜約70ｕ／ｇのグルコシダーゼ活性；約0.3〜約0.9ｕ／ｇのβ-グリコシダーゼ活性；約4,000〜約8,000ｕ／ｇのプロテアーゼ活性；約300〜約500ｕ／ｇのリパーゼ活性；約160,000〜約190,000ｕ／ｇのアミラーゼ活性；約24,000〜約28,000ｕ／ｇのグルコアミラーゼ活性；約11,000〜約14,000ｕ／ｇのキシラナーゼ活性；および約40〜約120ｕ／ｇのペクチナーゼ活性を示すことがわかっている。さらに、プロテアーゼMは、以下に説明するように、β-グリコシダーゼ酵素の活性とは明確に区別される、特定のグリコンに対する活性を呈示する。
様々な糖基質に対するプロテアーゼMおよびβ-グリコシダーゼ活性の相対活性を評価した。試験には、様々な糖に結合したニトロフェニル基を含む基質のパネルを用いた。以下の表Ａは、各基質に対してプロテアーゼMが有する相対活性（プロテアーゼMが最大活性を示した基質について任意に選択した100活性「単位」との相対活性）と、各基質に対してβ-グリコシダーゼが有する相対活性（β-グリコシダーゼが最大活性を示した基質について任意に選択した100活性「単位」との相対活性）を示す。表Ａからわかるように、プロテアーゼMは、β-グリコシダーゼとは異なる活性プロファイルおよび異なる相対基質活性を呈示する。
Figure 2009501529
本発明はまた、プロテアーゼMのそれと類似した酵素活性プロファイルを示す酵素組成物も含む。例えば、グルコシダーゼ活性、β-グリコシダーゼ活性、プロテアーゼ活性、リパーゼ活性、アミラーゼ活性、グルコアミラーゼ活性、キシラナーゼ活性、およびペクチナーゼ活性のうち１以上を示す酵素組成物も想定され、プロテアーゼMのそれと同等のレベルで１以上の上記活性を示す組成物も含まれる。一実施形態では、酵素組成物は、約40〜約70ｕ／ｇのグルコシダーゼ活性；約0.3〜約0.9ｕ／ｇのβ-グリコシダーゼ活性；約4,000〜約8,000ｕ／ｇのプロテアーゼ活性；約300〜約500ｕ／ｇのリパーゼ活性；約160,000〜約190,000ｕ／ｇのアミラーゼ活性；約24,000〜約28,000ｕ／ｇのグルコアミラーゼ活性；約11,000〜約14,000ｕ／ｇのキシラナーゼ活性；および約40〜約120ｕ／ｇのペクチナーゼ活性のうち１以上を含む活性プロファイルを示す。具体的実施形態では、酵素組成物は、約40〜約70ｕ／ｇのグルコシダーゼ活性；約0.3〜約0.9ｕ／ｇのβ-グリコシダーゼ活性；約4,000〜約8,000ｕ／ｇのプロテアーゼ活性；約300〜約500ｕ／ｇのリパーゼ活性；約160,000〜約190,000ｕ／ｇのアミラーゼ活性；約24,000〜約28,000ｕ／ｇのグルコアミラーゼ活性；約11,000〜約14,000ｕ／ｇのキシラナーゼ活性；および約40〜約120ｕ／ｇのペクチナーゼ活性の各々を含む活性プロファイルを示す。このような組成物の具体的な非制限的例の１つは、約0.6ｕ／ｇのβ-グリコシダーゼ活性；約6,500ｕ／ｇのプロテアーゼ活性；約400ｕ／ｇのリパーゼ活性；約175,000ｕ／ｇのアミラーゼ活性；約26,000ｕ／ｇのグルコアミラーゼ活性；約12,500ｕ／ｇのキシラナーゼ活性；および約80ｕ／ｇのペクチナーゼ活性を含む酵素活性プロファイルを有する。
本発明の酵素組成物は、多数の方法のいずれにより調製してもよい。例えば、個々の酵素を組み合わせて、所望の酵素活性プロファイルを有する所望の酵素組成物を得ることができる。限定するものではないが、例えば、酵素組成物は、グルコシダーゼ酵素、β-グリコシダーゼ酵素、プロテアーゼ酵素、リパーゼ酵素、アミラーゼ酵素、グルコアミラーゼ酵素、キシラナーゼ酵素、およびペクチナーゼ酵素のうち１以上を含みうる。
これに加え、またはこれに代わり、本組成物は、天然に酵素を産生する微生物、または１以上の酵素を産生するように遺伝的に改変された微生物から、当分野で周知の方法により得ることもできる、例えば、プロテアーゼM（グルコシダーゼ活性、β-グリコシダーゼ活性、プロテアーゼ活性、リパーゼ活性、アミラーゼ活性、グルコアミラーゼ活性、キシラナーゼ活性、およびペクチナーゼ活性を示す）は、当分野で周知の方法により、コウジ菌から取得し、使用前に希釈または濃縮する。プロテアーゼMの生産方法の一例を以下に概略する。
プロテアーゼMの生産流れ
アンプル
↓
斜面培養
↓
シード発酵
↓
固形発酵
↓
抽出
↓
フィルタープレスを用いたろ過
↓
超フィルターを用いた濃縮
↓
エタノールを用いた沈殿
↓
遠心分離
↓
真空乾燥
↓
粉砕、篩い分け、混合
↓
希釈剤を用いたプロテアーゼ活性の調節
↓
混合、篩い分け
↓
製品
この生産流れの例ではプロテアーゼMを取り上げているが、当業者には、同様の生産流れを用いて、他の微生物から好適な酵素調製物を取得できることは理解されよう。
既述したように、当分野で周知の方法により、形質転換またはトランスフェクションした細胞から酵素および酵素調製物を得ることも可能である。例えば、所望の酵素をコードする核酸配列を発現ベクターに挿入し、これを用いて、酵素の生産のための宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションする。次に、当分野で周知の方法により、上記宿主細胞から酵素を得ることができる。
ほかにも、多数の酵素が市販されている。例えば、プロテアーゼMの典型的な市販品（イリノイ州エルギンのAmano Enzyme USA, Co., Ltd.から販売）は、pH3.0で5,500ｕ／g以上のプロテアーゼ活性を有する。この市販品を所与の濃度で用いてもよいし、あるいは、市販品を希釈または濃縮して用いてもよい。
本発明の組成物における所与の酵素または酵素活性の量は、組成物の所望の効果に応じて変動し、当分野で周知の様々な方法により決定または測定することができる。組成物に存在する酵素の量は、モル量またはモル比（例えば、酵素のナノモル数またはマイクロモル数）、重量または重量比（酵素のマイクログラム数またはナノグラム数）、あるいは活性量または活性比（例えば、酵素または酵素活性の「単位」／酵素の重量またはモル）で表示することができる。具体的実施形態では、組成物は、一定の酵素活性のβ-グリコシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、キシラナーゼ、およびペクチナーゼを含みうる。
従って、例えば、本組成物は、約40〜約70ｕ／ｇのグルコシダーゼ活性；約0.3〜約0.9ｕ／ｇのβ-グリコシダーゼ活性；約4,000〜約8,000ｕ／ｇのプロテアーゼ活性；約300〜約500ｕ／ｇのリパーゼ活性；約160,000〜約190,000ｕ／ｇのアミラーゼ活性；約24,000〜約28,000ｕ／ｇのグルコアミラーゼ活性；約11,000〜約14,000ｕ／ｇのキシラナーゼ活性；および約40〜約120ｕ／ｇのペクチナーゼ活性のうち１以上を含む酵素活性プロファイルを含みうる。好適な組成物の具体的な一例は、約0.6ｕ／ｇのβ-グリコシダーゼ活性；約6,500ｕ／ｇのプロテアーゼ活性；約400ｕ／ｇのリパーゼ活性；約175,000ｕ／ｇのアミラーゼ活性；約26,000ｕ／ｇのグルコアミラーゼ活性；約12,500ｕ／ｇのキシラナーゼ活性；および約80ｕ／ｇのペクチナーゼ活性を含む活性プロファイルを有する。当分野で周知の通常の酵素アッセイを用いて、酵素活性を決定することができる。これらの酵素量は例にすぎず、上記以外の量の酵素を含む組成物も想定される。
その他の成分：
本明細書で記載した組成物は一般に、添加剤を含有しておらず、含有する必要もない。しかし、実施形態によっては、１以上のバッファーを組成物に添加するものもある。バッファーの使用は必要ではないが、pH感受性酵素を安定化するのに役立つことがある。バッファーの例として、限定するものではないが、酢酸バッファーおよびリン酸バッファーが挙げられる。酢酸バッファーの濃度例は、約10 mM〜約100 mMであり、これにより約４〜約６のpHが得られ、またリン酸バッファーの濃度例は、約10 mM〜約100 mMで、これにより約６〜約８のpHが得られる。
II．食料および飲料製品
本発明の他の実施形態は、本発明の酵素組成物を含む、または該組成物で処理した食料および飲料製品を包含する。
多くの食料および飲料は、生理学的に有益なアグリコンをもたらすグリコンを含む。以下の特定の実施形態および例では、本発明の有用性および多様性を示すために、具体的な食料および飲料を挙げているが、本発明は、これらの食料および飲料に限定されるわけではなく、むしろ、本発明はあらゆる食料および飲料を包含することを理解すべきである。
いくつかの実施形態では、食品は、野菜または野菜製品である。これに関する野菜の例として、ニンニク、アスパラガス、コショウ、マッシュルームが挙げられる。１つの具体的実施形態では、野菜はニンニクである。
いくつかの実施形態では、食品は、果物または果物製品である。一実施形態では、果物はトマトまたはトマト製品である。トマト製品の例として、限定するものではないが、トマトピューレ；トマトペースト；トマトベースのソース；トマトベースのジュース；調味料、例えば、ケチャップ、サルサおよびピカンティソース；ならびにトマト含有スープが挙げられる。
その他の実施形態は飲料製品に関する。本明細書で用いる「飲料製品」という用語は、ヒトの経口摂取に適したあらゆる液体組成物、ならびにこのような液体組成物の濃縮形態を意味する。好適な飲料として、限定するものではないが、コーヒー、茶、フルーツジュースおよび野菜ジュース、アルコール飲料、ならびにこれらの混合物からなる、またはこれらを含む製品が挙げられる。一実施形態では、飲料は茶である。茶は、例えば、茶の葉から新しくいれたものでもよいし、粉末またはシロップ形態から調製したもの（「インスタント茶」）でもよい。従って、茶には、濃縮形態の茶、例えば、粉末状のミックス茶も含まれる。
別の実施形態では、飲料はフルーツジュースである。フルーツジュースの具体例として、限定するものではないが、リンゴ、ザクロ、ブドウ、オレンジ、グレープフルーツ、チェリー、ブルーベリーおよびクランベリージュース、ならびにこれらジュースの混合物が挙げられる。フルーツジュースは、新鮮なもの、加工（例えば、低温殺菌）したもの、または粉末もしくはシロップから調製したもののいずれでもよい。酵素で処理する場合、フルーツジュースによっては、着色した沈殿物を形成するものもある。沈殿物が必ずしもフルーツジュースの風味に影響するわけではないが、フルーツジュースの見た目や口当たりを損なう可能性がある。本発明の酵素組成物を用いると、このような沈殿物の形成を解消するか、または少なくとも最小限に止めることによって、消費者へのフルーツジュースの印象を高めながら、フルーツジュースの風味を増強することができる。
さらに別の実施形態は、アルコール飲料となる飲料を提供する。アルコール飲料は、この種のあらゆる飲料、例えば、ワインまたはビールである。一実施形態では、アルコール飲料はワインである。
いくつかの実施形態では、酵素組成物は、製品の風味を増強するのに十分な量で食料または飲料製品に含有させる。添加しようとする組成物の厳密な量は、食料および飲料製品、ならびに用いる酵素組成物の濃度または活性に応じて変動しうる。製品の風味として、限定するものではないが、製品の味および香気特性が挙げられる。増強された風味は、通常の手段、例えば、専門的または非専門的な食味検査員により評価することができる。
別の実施形態では、酵素組成物は、酵素組成物で処理していない、または該組成物と接触させていない同じ食料または飲料と比較して、食料または飲料製品のアグリコン含量を高めるのに十分な量で食料または飲料製品に含有させる。酵素処理前および処理後の食料または飲料に存在するアグリコンのレベルは、経験的に決定することができ、また通常の手段、例えば常用の化学分析（例：HPLCなど）により測定することができる。
一般に、本発明の酵素組成物（例えば、グルタミナーゼ、β-グリコシダーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、キシラナーゼ、ペクチナーゼ、RPI、デアミナーゼ、およびグルコシダーゼのうち１以上含む、または、これら酵素活性のうち１以上を示す組成物）は、約３％（w/v）、約２％（w/v）、約１％（w/v）までの濃度で含有させてよい。用いることのできる具体的濃度は、約0.01％（w/v）、約0.02％（w/v）、約0.025％（w/v）、約0.04％（w/v）、約0.05％（w/v）、約0.06％（w/v）、約0.08％（w/v）、または約0.10％（w/v）、例えば、0.01％（w/v）、0.02％（w/v）、0.025％（w/v）、0.04％（w/v）、0.05％（w/v）、0.06％（w/v）、0.08％（w/v）、もしくは0.10％（w/v）である。これらの量は例にすぎず、上記とは異なる量の酵素組成物を含む食料および飲料製品も考慮される。
III．風味および／または栄養を増強した食料または飲料製品の製造方法
別の実施形態は、食料または飲料製品の製造方法に関する。これらの実施形態において、上記方法は、風味増強量の本発明の酵素組成物と、あるいは、該酵素組成物で処理していない同じ食料または飲料製品と比較して、食料または飲料製品のアグリコン含量を高めるのに有効な量の酵素組成物と、食料または飲料製品を接触させることを含む。別の実施形態は、この方法により製造される食料または飲料製品である。
いくつかの実施形態では、酵素組成物を非希釈形態で食料または飲料と単純に接触させるが、これは、例えば、酵素組成物を上記製品中に混合またはブレンドするか、あるいは、上記製品に該組成物を噴霧することにより実施する。これに関して、本明細書に記載する方法では、食料および飲料製品の製造に他の要件を課すことはほとんどない。実施形態によっては、前述のように、１以上のバッファーを組成物と一緒に添加する場合もあるが、これは一般に必要ではない。
別の実施形態では、例えば、食料または飲料製品の製造工程中に、酵素組成物を食料または飲料製品の１以上の原料成分に添加することができる。
いくつかの実施形態では、本方法は、追加および連続ステップとして、本明細書に記載の組成物中の酵素を不活性化させることを含み、得られた食料または飲料製品を該組成物に存在する１以上の酵素（または酵素活性）を不活性化させるのに十分な時間加熱する。このような加工後の不活性化を達成するのに必要な温度および時間は一定ではなく、所与の食料または飲料製品について経験的に決定することができる。温度は、例えば、約70℃〜約90℃の範囲でよい。また、時間は、例えば、約５〜約60分、または約５〜約30分の範囲でよい。いずれの場合でも、時間および温度は、酵素活性が所望の程度に低下または消失し、しかも、不活性化ステップによって所望の食料または飲料製品が劣化しない、または損なわれないように選択する。これらの実施形態は、１以上の酵素の不活性化により、製品の保存および／または輸送時などに起こりうる酵素作用の持続を阻止することができるため、有利であると考えられる。このような酵素活性が持続すると、望ましくない風味が発生し、その蓄積を招く恐れがある。
以下の実施例は、本発明を説明するために記載する。しかし、本発明は、これら実施例に記載した具体的条件または詳細事項に限定されないことを理解すべきである。本明細書に引用する、公に入手可能な文献（米国特許を含む）はすべて、本明細書に完全に記載されているのと同様に、その全文を参照として組み込むものとする。
実施例１： クランベリージュースのHPLC分析
未処理のクランベリージュースのHPLC（高性能液体クロマトグラフィー）分析により、ピークのパターンが明らかにされ、各ピークはジュースに存在する特定のグリコン（フラバノイド）またはアグリコンによるものである（図１および２、左側パネル）。クランベリージュースの酸加水分解により、グリコン含量が減少するのに対し、アグリコン含量は増加する（特徴的なHPLCピークからも明らかである）（図１および２、右側パネル）。酸加水分解を次のように実施した：HClを添加して最終濃度0.6Mとした。サンプルをボルテックス混合した後、90℃〜95℃で１時間インキュベートした。次に、サンプルを7,500 RPMで５分遠心分離し、HPCLにより分析した。
実施例２： プロテアーゼMまたはβ-グリコシダーゼによるクランベリージュースの処理、およびHPLC分析
図３に示すように、プロテアーゼM（0.1％（w/v）プロテアーゼMを用いて、50℃で３時間処理）は、クランベリージュースのグリコン１および３に作用し、対応するアグリコン１および３を含む産物をもたらす。対照的に、図４に示すように、β-グリコシダーゼ（0.1％（w/v）β-グリコシダーゼを用いて、50℃で３時間処理）は、クランベリージュースのグリコン２と、ミリセチンおよびケルセチンに対応するグリコンに作用し、対応するアグリコン２を含む産物と、ミリセチンおよびケルセチンの沈殿物をもたらす。
クランベリージュースのグリコン／アグリコンプロファイルに対するプロテアーゼMの作用は、特に有利となりうる。例えば、処理ジュースのアグリコンレベルの増加は、フラバノイドのバイオアベイラビリティの増加に相当し、処理ジュースの抗酸化能力の増大と直接相関している。他の食料および飲料をプロテアーゼMで処理することにより、同様の利点を得ることができる。
図５に示すように、プロテアーゼMで処理したクランベリージュースは、その色を保持し、未処理クランベリージュース（対照）と比較して増強した風味を示す。対照的に、β-グリコシダーゼで処理したクランベリージュースは、着色した沈殿物が生じ（その結果、ジュースの退色が起こる）、未処理クランベリージュースと比較して味が変質していることがわかった。クランベリージュースは、0.02、0.04、0.06、0.08および0.1％w/vの用量のプロテアーゼMまたはβ-グリコシダーゼで処理し、50℃で３時間後に結果を観察した。他の食料および飲料をプロテアーゼMで処理することにより、同様の利点を得ることができる。
実施例３： プロテアーゼMによるクランベリージュースの処理、および食味検査
0.1％w/vのプロテアーゼMを用いて、50℃で３時間様々な市販のクランベリージュース製品を処理し、冷蔵庫で冷却した後、食味検査に用いた。５人の食味検査員を用いたが、報告された結果は全員一致している。以下の表１に示すように、プロテアーゼMで処理した製品は、未処理ジュースに比べて風味が増強していることがわかった。特に、プロテアーゼMで処理した製品は、酸味が少なく、より甘い風味を有することがわかった。これらの同じ結果が、150人の様々な食味検査員からも得られた。プロテアーゼMで処理したクランベリージュースの増強した風味特性は特に有利である。例えば、プロテアーゼMで処理したクランベリージュース製品は、砂糖（またはその他の甘味料、例えば、他のさらに甘いジュースなど）の添加が少なくてすみ、しかも味がよいままであるか、より許容可能なレベルの酸味でありうる。このような製品は、糖摂取を制限しているか、またはカロリーを制限している被検者に対し、明らかな利益をもたらすと考えられる。他の食料および飲料をプロテアーゼMで処理することにより、同様の効果が得られる。
Figure 2009501529
従って、これらの結果から、プロテアーゼM処理により、クランベリージュースの苦味が除去されることがわかる。さらに、アグリコンの形成は退色または沈殿を招かない。加えて、プロテアーゼM処理後のアグリコンレベルの上昇により、ジュースの抗酸化能力が増加し、保護作用のあるフラボノイドのバイオアベイラビリィティが高まる。
実施例４： 処理したブドウ、チェリーおよびブルーベリージュースのHPLC分析
ブドウ、チェリーおよびブルーベリージュースのアリコートを実施例１に記載するような酸加水分解に付し、実施例２に記載のようにβグリコシダーゼで処理するか、または実施例２に記載のようにプロテアーゼMで処理した。未処理ジュース（対照）を処理サンプルと比較するクロマトグラフを図６〜８に示す。すべてのケースにおいて、未処理サンプルに比べ、処理サンプルでグリコンピークが減少し、また、処理ジュースサンプルではグリコンピークがアグリコンピークに変換される。
実施例５： プロテアーゼMによる各種ジュースの処理、および食味検査
0.1％w/vのプロテアーゼMを用いて、50℃で３時間、様々な市販のジュース製品（野菜、グレープフルーツ、オレンジおよびリンゴジュース）を処理し、食味検査に用いた。以下の表２に示すように、プロテアーゼM処理製品は、未処理ジュースに比べ、風味が増強していることがわかった。特に、プロテアーゼMは、トマトジュース製品の風味を増強し、グレープフルーツジュース製品の苦味を減じ、オレンジジュース製品の風味を増強するとともに、リンゴジュース製品の甘さおよびリンゴ風味を高めることがわかった。他の食料および飲料をプロテアーゼMで処理することにより、同様の効果が得られる。
Figure 2009501529
実施例６： プロテアーゼMまたはβ-グリコシダーゼによる各種ジュースの処理、および食味検査
実施例２に記載のように、水（対照）、0.1％w/wプロテアーゼM、もしくは0.1％w/wβ-グリコシダーゼのいずれかで各種ジュースを処理した。ジュースを冷蔵庫で冷却した後、食味した。
結果を以下の表３に示す。ほとんどのケースで、検査員は、酵素調製物で処理した後のジュースの風味が違うこと、また、プロテアーゼM処理後の風味が好ましい場合もあれば、β-グリコシダーゼ処理後の風味が好ましい場合もあることを報告している。例えば、いくつかのケースで、β-グリコシダーゼにより「フローラル」（花のような）香気が生成されたが、これは、茶、ワインもしくはその他の食料および飲料に好ましいと考えられる。
Figure 2009501529
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実施例７： トマトペーストの酵素処理
調製：トマトペースト（200.40ｇ、40％溶解固体）を600mlの水と入念に混合して、溶解固体（ds）を約10％にした。得られた混合物の初期pHは4.36で、約50mlの1M NaOHでpH 6.01に調整した。３つの200mlアリコート（Ａ、ＢおよびＣ）を別個の滅菌フラスコに注いだ。サンプルＢおよびＣを冷却キャビネットに保存した。
各々1.00ｇの（１）β-グリコシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、キシラナーゼ、およびペクチナーゼの混合物；（２）グルタミナーゼF100；ならびに（３）β-グリコシダーゼを10 mlの水に溶解することにより、酵素溶液を調製した。
フラスコＡに2.0mlの溶液（１）および2.0mlの溶液（２）（各々0.1％w/w用量）を投入した。次に、サンプルを50℃および300 rpmで３時間インキュベートした。インキュベーション終了後、混合物のpHを1M HClで4.45に調整し、混合物を70℃浴に１時間配置することにより、酵素を不活性化した。
サンプルＢに2.0mlのグルタミナーゼ（溶液（２））と2.0mlのβ-グリコシダーゼ（溶液（３））（各々0.1％w/w用量）を投入した。対照として、サンプルＣを4.0mlの水で処理した。両サンプルを60℃および300 rpmで３時間インキュベートした。インキュベーション終了後、前記と同様にサンプルを処理することによりpHを調整し、前記のように酵素を不活性化した。
食味検査：すべてのサンプルを50℃浴で少なくとも15分保温した後、サンプルを希釈せずに食味検査した。サンプルには４人の検査員を割り当てた；その全員が、他に比べ、サンプルＡはトマト風味が強く、サンプルＢは口当たりがあると感じた。サンプルを約２週間凍結し、解凍した後、70℃で15分保温した。第２グループの検査員は、トマト風味が増強されたサンプルＡの方を好んだ。
実施例８： ニンニクの酵素処理
調製：市販のニンニク（Fieda’s Elephant Garlic）数個の皮をむき、ナイフで細かく刻んだ後、クリーム状のペーストが形成されるまで、フードプロセッサーで処理した。３部のニンニクペースト50.0ｇを計量して、Ａ、ＢおよびＣのラベルを貼った滅菌フラスコに投入した。サンプルＢおよびＣは一時的に冷却キャビネットに保存した。各々1.00ｇのグルタミナーゼF100；β-グリコシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、キシラナーゼ、およびペクチナーゼを含む酵素組成物；ならびにβ-グリコシダーゼを計量し、実施例１に記載したように溶解させた。
サンプルＡに、0.25mlのグルタミナーゼ溶液と0.25mlの酵素組成物溶液を投入するが、その際、両酵素の用量は0.05％w/wであった。混合物を50℃および300 rpmで３時間インキュベートした。インキュベーション終了時に、混合物を70℃浴に１時間配置することにより、酵素を不活性化した。0.25mlのβ-グリコシダーゼ溶液と0.25mlのグルタミナーゼ溶液（各々0.05％w/w用量）でサンプルＢを処理した。対照として、0.5mlの水をサンプルＣに添加した。サンプルＢおよびＣを60℃および300 rpmで３時間インキュベートした後、70℃浴に１時間配置することにより酵素を不活性化した。
食味検査：実施例１と同様に処理した個別のニンニクサンプル（サンプルＡ、ＢおよびＣ）と一緒に、パスタソース（Prego（登録商標）Traditional）の瓶を保温した。パスタソースとニンニクサンプルの両方を少なくとも15分保温した。処理したニンニクサンプル（2.00ｇ）を50mLのパスタソースに添加した。こうして得られたニンニクおよびソースサンプルを混合し、４人の検査員に提供した。検査員全員が、サンプルＡおよびＢはＣより強いニンニク味を有するということで一致した。少なくとも１人の検査員により、サンプルＡは最も味が強いとみなされ；サンプルＢは、辛味が強いと感じられた。
実施例９： マッシュルームの酵素処理
機械的手段（Cusinart Mini-Prep Blender（登録商標））を用いて、マッシュルーム（Monterey Clean N Ready Slice Mushrooms（登録商標））を刻んだ。２部の刻んだマッシュルーム100ｇを計量して、ラベルＡおよびＢの滅菌フラスコに別々に導入した。対照として、サンプルＡに１mLの水を添加した。サンプルＢには、１mLの酵素RP-1（濃度は、0.01％w/w用量の場合、0.1ｇ／mlであった）を添加した。マッシュルームと酵素混合物を振盪して混合し、それ以上振盪せずに、70℃浴で３時間インキュベートした後、80℃浴に移して２時間配置することにより、酵素を不活性化した。食味検査の前に、処理マッシュルームを冷却キャビネットで保存した；サンプルは温めずに、食味検査に供した。４人のうち３人の検査員は、対照より、風味が増したとして処理サンプルの方を好んだ。
実施例10： 酵素混合物による食料および飲料製品の酵素処理、および食味検査
以下の表４に挙げた様々な食料および飲料製品をプロテアーゼMで処理した。また、表４には、処理製品の味および物理的特性も示す。
Ａ．固体および半固体製品
実施例７および８に記載した手順と同様に固体および半固体製品を処理した。0.01、0.025、0.05および0.1％w/vの濃度のプロテアーゼM組成物を用いて製品サンプルを調製した。対照サンプルは酵素組成物を含んでいなかった。
Ｂ．飲料製品
以下の手順に従い、飲料製品をプロテアーゼM酵素組成物で処理した。
500ｇアリコートの飲料製品を計量して、別個の滅菌フラスコに投入した。水溶液としてのプロテアーゼM組成物（100 mg／mL）のアリコートを各フラスコに添加したが、その際、用いた組成物の濃度は0.01、0.025、0.05、0.75および0.1％w/vであった。各フラスコを振盪して混合し、50℃および165 rpmで３時間インキュベートした。次に、飲料製品を70℃で１時間加熱することにより、酵素を不活性化させた。各サンプルを試験管中で遠心分離し、回収した沈殿物を乾燥させた後に計量した。
残った飲料製品は、食味検査するまで、冷蔵庫で冷却した。
Ｃ．食味検査
以下の表４に記載した食料および飲料製品の味を３〜５人により評価したが、各々が１回の食味検査で、３つ以下のサンプルを検査した。１サンプルは対照または未処理サンプルで、他の２つのサンプルは酵素（プロテアーゼM）で処理した。検査員には水を提供し、サンプル食味後に残った味を取り除いた。ほとんどのサンプルはそのまま食味したが、ニンニクはトマトペースト（50ml当たり２ｇ）に添加して食味した。ジュースは冷蔵庫で冷却してから食味し、トマトペーストは酵素の熱不活性化直後に温かいまま食味した。
味は、全員（またはわずか１人の反対者）が明らかに味の増強を認めた場合、増強したとみなした。増強の特徴づけは、食味検査員の意見が全員一致したものである。
Figure 2009501529
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実施例11： フルーツジュースの酵素処理後の味および退色の評価
この実施例の目的は、プロテアーゼMで処理した後、着色フルーツジュースの味および退色を評価することである。一般に、25mLアリコートのフルーツジュース（クランベリージュース、クランベリーとリンゴジュースの混合物、クランベリーと紅茶の混合物、およびブドウジュース）を、空の重さを量った滅菌遠心管にピペットで移した。以下に記載するように、この手順を各用量レベルにつき３回実施した。
（ａ）プロテアーゼM（100 mg／ｍL）、（ｂ）β-グリコシダーゼ（100 mg／ｍL）、または（ｃ）酵素なし（対照）のアリコートを各遠心管に添加し、各酵素溶液の濃度を0.01、0.025、0.05、0.075、および0.1％w/vとした。各遠心管を振盪して混合した後、50℃および165 rpmで３時間インキュベートした。
次に、飲料を70℃で１時間加熱することにより、酵素を不活性化した。各サンプルを9,700 rpmで10分遠心分離した。上清を流して除去し、遠心管を注意深く乾燥させた後、計量して、沈殿した着色物質の重さを量った。
各サンプルからの乾燥沈殿物の重量を用いて、フルーツジュースの各サンプルからの退色の程度を評価した。SigmaStat（登録商標）（Systat Software, Inc.、カリフォルニア州ポイントリッチモンド）を用いて、データを分析した。前記の手順に従って、各サンプルからの上清を食味した。
図９〜12は、各種フルーツジュースの３つのサンプルについての退色および味データを示す。プロテアーゼM混合物で処理したフルーツジュースは、対照およびβ-グリコシダーゼで処理したフルーツジュースサンプルと比較して、退色が最も少なく、しかも味の増強は最大であった。
上記表４の結果と、図９〜12に示す結果から、クランベリージュースは、プロテアーゼMを含む酵素組成物で処理すると、甘くなると感じることが多いことがわかる。特定の理論に束縛されるわけではないが、プロテアーゼM組成物は、クランベリージュースのような苦いフルーツジュース中の甘い風味を暴露して、甘いジュースの総合的な効果を与えると考えられる。隠蔽された甘い風味は、天然の糖か、ジュースに添加された糖のいずれかから生じると考えられる。これは、本発明に従い処理したジュースに添加する糖の量を少なくする一方で、同じレベルの甘さを維持できるため、重要である。
本明細書に記載した代表的実施形態を参照にしながら、本発明を広範に開示し、説明してきた。当業者は、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、本発明に様々な変更を加えられることを認識するであろう。
クランベリージュースの高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）分析のクロマトグラフを示す図である。左側パネルは、酸加水分解前のグリコンピークを示し；右側パネルは、酸加水分解により低下したグリコンピークを示す。 クランベリージュースの高性能液体クロマトグラフィー分析のクロマトグラフを示す図である。左側パネルは、酸加水分解前のアグリコンピークを示し；右側パネルは、酸加水分解により上昇したアグリコンピークを示す。 プロテアーゼMでの処理前（左側パネル）および処理後（右側パネル）のクランベリージュースの高性能液体クロマトグラフィー分析のクロマトグラフを示す図である。 β-グリコシダーゼでの処理前（左側パネル）および処理後（右側パネル）のクランベリージュースの高性能液体クロマトグラフィー分析のクロマトグラフを示す図である。 未処理ジュース（対照；白丸）と比較して、様々な用量のプロテアーゼM（黒丸）またはβ-グリコシダーゼ（白四角）で処理した100％クランベリージュースの退色およびその味の評価を示す図である。各酵素または酵素混合物での味特性は、未処理ジュースと比較して、改善された味または変質した味のいずれかとして示される。 酸加水分解前（左側パネル）および後（右側パネル）のブドウジュースの高性能液体クロマトグラフィー分析のクロマトグラフを示す図である。 酸加水分解前（左側パネル）および後（右側パネル）のブドウジュースの高性能液体クロマトグラフィー分析のクロマトグラフを示す図である。 β-グリコシダーゼ処理前（左側パネル）および後（右側パネル）のブドウジュースの高性能液体クロマトグラフィー分析のクロマトグラフを示す図である。 プロテアーゼM処理前（左側パネル）および後（右側パネル）のブドウジュースの高性能液体クロマトグラフィー分析のクロマトグラフを示す図である。 酸加水分解前（左側パネル）および後（右側パネル）のチェリージュースの高性能液体クロマトグラフィー分析のクロマトグラフを示す図である。 酸加水分解前（左側パネル）および後（右側パネル）のチェリージュースの高性能液体クロマトグラフィー分析のクロマトグラフを示す図である。 β-グリコシダーゼ処理前（左側パネル）および後（右側パネル）のチェリージュースの高性能液体クロマトグラフィー分析のクロマトグラフを示す図である。 プロテアーゼM処理前（左側パネル）および後（右側パネル）のチェリージュースの高性能液体クロマトグラフィー分析のクロマトグラフを示す図である。 酸加水分解前（左側パネル）および後（右側パネル）のブルーベリージュースの高性能液体クロマトグラフィー分析のクロマトグラフを示す図である。 酸加水分解前（左側パネル）および後（右側パネル）のブルーベリージュースの高性能液体クロマトグラフィー分析のクロマトグラフを示す図である。 β-グリコシダーゼ処理前（左側パネル）および後（右側パネル）のブルーベリージュースの高性能液体クロマトグラフィー分析のクロマトグラフを示す図である。 プロテアーゼM処理前（左側パネル）および後（右側パネル）のブルーベリージュースの高性能液体クロマトグラフィー分析のクロマトグラフを示す図である。 未処理ジュース（対照；白丸）と比較して、プロテアーゼM（黒丸）およびβ-グリコシダーゼ（黒四角）を含む、様々な用量の酵素組成物で処理した100％クランベリージュースの退色およびその味の評価を示す図である。各酵素または酵素混合物での味特性は、未処理ジュースと比較して、増強されたもの（＋）、または変質したもの（−）のいずれかとして示される。着色沈殿物の統計的有意性についてデータをさらに分析したが、その際、＊は対照と比較してＰ＜0.001を、そして**は、酵素組成物の値と比較したβ-グリコシダーゼの値についてＰ＜0.001をそれぞれ示す。 未処理ジュース（対照；白丸）と比較して、プロテアーゼM（黒丸）およびβ-グリコシダーゼ（黒四角）を含む、様々な用量の酵素組成物で処理したクランベリーおよびリンゴジュース混合物の退色およびその味の評価を示す図である。記号＋、−、＊および**は、図９について定義したのと同じ意味である。 未処理ジュース（対照；白丸）と比較して、プロテアーゼM（黒丸）およびβ-グリコシダーゼ（黒四角）を含む、様々な用量の酵素組成物で処理したクランベリーおよび紅茶混合物の退色およびその味の評価を示す図である。記号＋、−、＊および**は、図９について定義したのと同じ意味である。 未処理ジュース（対照；白丸）と比較して、プロテアーゼM（黒丸）およびβ-グリコシダーゼ（黒四角）を含む、様々な用量の酵素組成物で処理したブドウジュースの退色およびその味の評価を示す図である。記号＋、−、＊および**は、図９についてすでに定義したのと同じ意味である。

Claims (28)

  1. （ｉ）グリコンを含む食料または飲料と、（ii）グルコシダーゼ活性、β-グリコシダーゼ活性、プロテアーゼ活性、リパーゼ活性、アミラーゼ活性、グルコアミラーゼ活性、キシラナーゼ活性、およびペクチナーゼ活性を含む酵素活性プロファイルを有する酵素組成物とを含む食料または飲料組成物であって、上記酵素組成物を含まない同等の組成物に比べ、アグリコン含量の増加および／または風味の増強を示す、上記食料または飲料組成物。
  2. 前記酵素活性プロファイルが、
    約40〜約70ｕ／ｇのグルコシダーゼ活性；
    約0.3〜約0.9ｕ／ｇのβ-グリコシダーゼ活性；
    約4,000〜約8,000ｕ／ｇのプロテアーゼ活性；
    約300〜約500ｕ／ｇのリパーゼ活性；
    約160,000〜約190,000ｕ／ｇのアミラーゼ活性；
    約24,000〜約28,000ｕ／ｇのグルコアミラーゼ活性；
    約11,000〜約14,000ｕ／ｇのキシラナーゼ活性；および
    約40〜約120ｕ／ｇのペクチナーゼ活性；
    のうち１以上を含む、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記酵素組成物が、グルコシダーゼ、β-グリコシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、キシラナーゼ、およびペクチナーゼからなる群より選択される１以上の酵素を含む、請求項１に記載の組成物。
  4. 前記酵素組成物がプロテアーゼMを含む、請求項１に記載の組成物。
  5. 前記飲料組成物が、フルーツジュース、茶、アルコール飲料、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
  6. 前記飲料組成物がフルーツジュースであり、該フルーツジュースはクランベリー、チェリー、リンゴ、トマト、オレンジ、グレープフルーツ、ラズベリー、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項５に記載の組成物。
  7. グルコシダーゼ活性、β-グリコシダーゼ活性、プロテアーゼ活性、リパーゼ活性、アミラーゼ活性、グルコアミラーゼ活性、キシラナーゼ活性、およびペクチナーゼ活性を含む酵素活性プロファイルを有する酵素組成物と、グリコン含有食料または飲料を接触させることを含む方法により製造される食料または飲料組成物であって、上記酵素組成物を含まない同等の組成物に比べ、アグリコン含量の増加および／または風味の増強を示す、上記食料または飲料組成物。
  8. 前記酵素組成物が、グルコシダーゼ、β-グリコシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、キシラナーゼ、およびペクチナーゼからなる群より選択される１以上の酵素を含む、請求項７に記載の方法。
  9. 前記酵素組成物がプロテアーゼMを含む、請求項７に記載の方法。
  10. グルコシダーゼ活性、β-グリコシダーゼ活性、プロテアーゼ活性、リパーゼ活性、アミラーゼ活性、グルコアミラーゼ活性、キシラナーゼ活性、およびペクチナーゼ活性を含む酵素活性プロファイルを有する酵素組成物と、食料または飲料を接触させることを含む、食料または飲料の風味を増強する方法。
  11. 前記酵素組成物が、グルコシダーゼ、β-グリコシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、キシラナーゼ、およびペクチナーゼからなる群より選択される１以上の酵素を含む、請求項10に記載の方法。
  12. 前記酵素組成物がプロテアーゼMを含む、請求項10に記載の方法。
  13. グルコシダーゼ活性、β-グリコシダーゼ活性、プロテアーゼ活性、リパーゼ活性、アミラーゼ活性、グルコアミラーゼ活性、キシラナーゼ活性、およびペクチナーゼ活性を含む酵素活性プロファイルを有する酵素組成物と、グリコン含有食料または飲料を接触させることを含む、食料または飲料のアグリコン含量を増加する方法。
  14. 前記酵素組成物が、グルコシダーゼ、β-グリコシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、キシラナーゼ、およびペクチナーゼからなる群より選択される１以上の酵素を含む、請求項13に記載の方法。
  15. 前記酵素組成物がプロテアーゼMを含む、請求項13に記載の方法。
  16. グルタミナーゼ、β-グリコシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、キシラナーゼ、およびペクチナーゼを含む酵素組成物。
  17. 前記組成物が１以上のバッファーをさらに含む、請求項16に記載の組成物。
  18. 前記組成物が酵素RP-1、デアミナーゼおよびグルタミナーゼのうち１以上をさらに含む、請求項16に記載の組成物。
  19. 約0.3〜約0.9ｕ／ｇのβ-グリコシダーゼ活性；
    約4,000〜約8,000ｕ／ｇのプロテアーゼ活性；
    約300〜約500ｕ／ｇのリパーゼ活性；
    約160,000〜約190,000ｕ／ｇのアミラーゼ活性；
    約24,000〜約28,000ｕ／ｇのグルコアミラーゼ活性；
    約11,000〜約14,000ｕ／ｇのキシラナーゼ活性；および
    約40〜約120ｕ／ｇのペクチナーゼ活性
    のうち１以上を含む酵素活性プロファイルを有する、請求項16に記載の組成物。
  20. 風味増強量の、β-グリコシダーゼ活性、プロテアーゼ活性、リパーゼ活性、アミラーゼ活性、グルコアミラーゼ活性、キシラナーゼ活性、およびペクチナーゼ活性を含む酵素活性プロファイルを有する酵素組成物を含む、食料または飲料製品。
  21. 前記酵素活性プロファイルがさらにグルタミナーゼ活性を含む、請求項20に記載の製品。
  22. 前記酵素組成物が、β-グリコシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、キシラナーゼ、およびペクチナーゼからなる群より選択される１以上の酵素を含む、請求項20に記載の製品。
  23. 前記酵素組成物がプロテアーゼMを含む、請求項20に記載の製品。
  24. 風味増強量の、β-グリコシダーゼ活性、プロテアーゼ活性、リパーゼ活性、アミラーゼ活性、グルコアミラーゼ活性、キシラナーゼ活性、およびペクチナーゼ活性を含む酵素活性プロファイルを有する酵素組成物と、食料または飲料を接触させるステップを含む、風味プロファイルが増強した食料または飲料製品を生産する方法。
  25. 前記接触ステップ後に、前記酵素組成物を不活性化するのに十分な時間および温度で前記食料または飲料製品を加熱するステップをさらに含む、請求項24に記載の方法。
  26. 前記酵素組成物が、β-グリコシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、キシラナーゼ、およびペクチナーゼからなる群より選択される１以上の酵素を含む、請求項24に記載の方法。
  27. 前記酵素組成物がプロテアーゼMを含む、請求項24に記載の方法。
  28. 請求項24に記載の方法により得られる食料または飲料製品。
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