CN1065864C - 富含糖苷配基异黄酮植物蛋白乳清, 乳清蛋白及其制备方法 - Google Patents

富含糖苷配基异黄酮植物蛋白乳清, 乳清蛋白及其制备方法 Download PDF

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Abstract

富含糖苷配基异黄酮植物蛋白乳清，乳清蛋白及制备和回收它们的方法。富含糖苷配基异黄酮植物蛋白血清可如下得到：用足够量的β-葡苷酶或酯酶或酸处理含葡糖苷配基异黄酮的乳清从而将至少大部分葡糖苷配基异黄酮转变为糖苷配基物，由此得到富含糖苷配基乳清。富含糖苷配基乳清蛋白可通过回收蛋白得到。

Description

富含糖苷配基异黄酮植物蛋白乳清，乳清蛋白及其制备方法
此发明涉及制备富含糖苷配基异黄酮植物蛋白乳清，乳清蛋白，其是通过将含有蛋白和异黄酮类的植物蛋白乳清与一种或多种β-葡糖苷酶或酸反应，从而将大体上全部葡糖苷配糖基异黄酮转化为糖苷配基物，由此制备出富含糖苷配基蛋白。富含糖苷配基乳清蛋白亦可从异黄酮富含蛋白中回收蛋白质而获得。本专利申请是美国专利申请序号No．28／135，192，于1993，10，12提出的部分继续申请。
异黄酮存在于各种豆科植物，其包括植物蛋白物质如大豆。这些化合物包括黄豆苷，6-OAc黄豆苷，6”-OMal黄豆苷，黄豆苷原，染料木苷，6”-OAc染料木苷，6”-OMal染料木苷，染料木苷原，大豆异黄酮，6”-OAc大豆异黄酮，6”-OMal大豆异黄酮，大豆异黄酮原，鹰嘴豆芽素A7-羟基-4’-甲氧异黄酮和拟雌内酯。通常上述化合物天然存在于苦味的大豆，及商业产品的生产过程(如分离物或浓缩物)。问题焦点是除去这些物质。例如常规制备大豆蛋白分离物的方法是将豆片在碱性水溶液介质中被萃取，大部分异黄酮溶于萃取液，而其余溶于豆片中，排掉的豆片经蛋白酸沉淀而形成分离物。留在酸沉淀蛋白分离物中的残量异黄酮经彻底冲洗而分离。
近来发现在植物蛋白(如大豆)中的异黄酮可抑制人体癌细胞的生长。例如胸腺及前列腺的癌细胞，其记载在下面文献中：Genistein Inhibition of the Growth of Human Breast Cancer Cells，lndepcndenccfrom Estrogen Receptors and the Multi-Drug Rcsistance Gene” by Peterson andBarncs，Biochemical and Biophysical Rcsearch，Communications．Vol．179，No．1，pp，661-667，August 30，1991；“Genistein and Biochanin A Inhibit the Growth ofHuman Prostatc Canccr Cclls but not Epidcrmal Growth Factor Rcccptor TyrosincAuto-phosphorylation” by Peterson and Barnes，The Prostate，Vol．22，pp．335-345(1993)；and“Soybeans Inhibit Mammary Tumors in Models of Breast Canccr” byBarncs，ct al．Mutagcns and Carcinogcns in the Dict，pp．239-253 (1990)．
上述异黄酮是以在下式7位上连有葡萄糖分子的葡糖苷或葡糖苷配糖基形式存在的。一些葡糖苷配糖基，如6”-OAc染料木苷含与葡萄糖分子六位相连的乙酸硝基。而包括葡糖苷所有的异黄酮令人感兴趣之处是医药价值。最有价值的异黄酮是不带葡萄糖分子的糖苷配基。异黄酮类的水溶性与葡糖苷配糖基或葡糖苷不同，从分类上看这些异黄酮是黄豆苷原，染料木苷原、大豆异黄酮原。这些糖苷配基具有如下通式：
其中R1，R2，R3和R4选自H．，OH和OCH3。因此本发明涉及的是富含糖苷配基物的植物蛋。
本领域中已知有许多将葡糖苷配糖基异黄酮转化成糖苷配基异黄酮的方法。例如日本专利申请258669 Obataetal中记载的该方法仅能达到中等转化，因而不十分理想，特别是在大规模商业生产中。另外许多已知方法(如669申请)只讲到了如何从蛋白物质中分离异黄酮类物质，而未描述如何制备富含糖苷配基异黄酮蛋白。因此需要一种方法使大多数葡糖苷配糖基异黄酮转化葡糖苷配基异基酮，并生产富含糖苷配基异黄酮和其蛋白。
因此，本发明的目的在于提供富含糖苷配基异黄酮蛋白及其生产方法。本发明其它目的如下详述。
本发明提供了一种富含糖苷配基异黄酮植物蛋白的生产方法。该方法包括获取包括葡糖苷配基异黄酮的植物蛋白，然后在足够的时间，温度和PH值条件下，葡糖苷配糖基异黄酮与足量的一种或多种β-葡糖苷酶反应，使至少大部分葡糖苷配糖基异黄酮转化成糖苷配基异黄酮，从而制备出富含糖苷配基异黄酮蛋白。本发明还提供了通过加补充β-葡糖苷酶制备糖苷配基异黄酮的方法，本发明还提供了用一或多种酸处理制备糖苷配基异黄酮的方法。另外本发明还提供了富含糖苷配基异黄酮蛋白和其产物。此外本发明也提供了以相对高的比例，从植物蛋白材料中回收异黄酮的方法。
虽然此发明是针对大豆产品且方法具体适用于制备来自大豆物料的富含糖苷配基异黄酮，但是对于含有异黄酮的各类植物蛋白资源均可利用此方法。例如植物蛋白源包括豆类或大豆类物质。“大豆物质”在这里指大豆类及大豆类衍生物。
优选实施方案中的起始物是大豆片。大豆片油脂经溶剂萃取而脱去。用蛋白物质等电位点让PH值的水性萃取液萃取大豆片，优选PH值范围大约是6．0至10．0，更优选PH值范围大约是6．7至9．7。若想提高水性萃取液的PH值，可采用包括氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化钙这些常用碱性试剂。理想的异黄酮类化合物通常溶于水性萃取液中。为了最大限度从萃取液回收这些化合物，萃取液与大豆片的重量比应控制在一定的比率，以便使大豆片中固有的异黄酮类物质尽可能多地溶于萃取液。
蛋白质和异黄酮的萃取可由几种方法进行，这包括萃取液与大豆片重量比为8∶1至16∶1的豆片逆向萃取，初萃取液用于萃取大豆片并得到蛋白和异黄酮的水溶性萃取液。二步萃取法可如下进行，在第一步中，萃取液与大豆片重量比为10∶1，第二步豆片萃取中，配制新的萃取液，其与大豆片重量比为6∶1。两步的萃取液与大豆片的合并重量比不应超过16∶1。
然后将含有异黄酮的蛋白萃取液PH值调至该蛋白等电位点以上，以便沉淀该蛋白。不通过加可食酸如：醋酸、硫酸、磷酸、盐酸或任何适用的试剂将PH调节到该蛋白的等电点附近。豆类蛋白的等电位点PH值一般为4．4至4．6。
蛋白物质以凝乳状沉淀，并可从水性提取液中分离出来，而余下的起始物萃取液被作为起始物的植物蛋白源乳清。为使大部分溶于乳清中的异黄酮并获得较高的回收率，需额外洗涤沉淀蛋白以完全回收异黄酮。
乳清中葡糖苷配糖基异黄酮可通过与酶或酸反应转化为糖苷配基异黄酮。乳清中的葡糖苷配糖基异黄酮在该反应中与足量的一种或多种β-葡糖苷酶反应，使其至少大部分并优选大体上全部葡糖苷配糖基形式的异黄酮转化成糖苷配基异黄酮。β-葡糖苷酶可天然存在于豆类物质或微生物生长过程中，这类酶称之“残留”酶。而加入乳清的酶，称之“补充”酶。一般情况下，若乳清中“残留”酶的量不足以使葡糖苷配糖基转化成糖苷配基物，加入“补充酶”是十分必要的。进行异黄酮转化所需酶的量是由多种因素决定的，它包括酶的种类，酶的浓度分布、PH值以及酶的活性。只要酶的浓度足够，无论是通过“残留”酶或“补充酶”还是二者兼有，在足够的时间、温度及适宜的PH值下含溶解的异黄酮的乳清就可与β-葡糖苷酶反应，使乳清中至少大部分并优选大体上所有葡糖苷配糖基异黄酮转化为糖苷配基异黄酮。
较好的“补充酶”(β-葡糖苷酶类)包括生物果胶酶100L和300L，生物果胶酶OK70L，乳糖酶F，内酯酶(Lactozyme)。乳糖酶F可由Amano International Enzyme Co．Inc．P．O．Box．1000．Troy，UA 22974提供。其适宜的PH值范围为4-6。Laczyme可由NoVo Industrie，Enzyme Division，NoVo Alle，DK 2880Bagsuaerd，Denmark提供，其适宜的PH值为7左右。生物果胶酶100L和300L以及OK 70L可由Quest International，Sarasota，Flonida提供。“补充酶”以足够量加入可使至少大部分并优选大体上全部乳清中的葡糖苷配糖基异黄酮转化成糖苷配基物，因此加入补充酶是十分必要的。酶的加入量为乳清固体(干品)重量的0．5至5％。
另一类可作为“补充酶”的是酯酶，这类酯酶已被应用在实际中，它可通过从异黄酮共轭体中除去乙酸酯和丙二酸酯基团使乙酸酯和丙二酸酯共轭体转变成葡糖苷配糖基异黄酮。而在最优选实施方案中，使用了β-葡糖苷酶和酯酶。
较好的具体实施方法优选为一步法，并达到了非常高的异黄酮转化率(从葡糖苷配糖基异黄酮转化成糖苷配基异黄酮)。该方法时间较短，并操作容易，经济易行。术语“一步”反应法在此指反应过程的确定参数保持不变，这些参数包括PH值和温度。
非常高的转化率是指至少大部分且优选大体上全部乳清中的葡糖苷配糖基异黄酮转化成糖苷配基异黄酮。术语“至少大部分”指葡糖苷配糖基异黄酮转化为糖苷配基异黄酮的转化率至少为50％，术语“大体上全部”指葡糖苷配糖基异黄酮转化为糖苷配基异黄酮的转化率至少为80％，最优选指至少为90％。
虽然不希望与任何具体的理论相关，但确信这里所述方法达到的令人惊奇且出人意料的高转化率是来自一步反应法期间的方法参数的组合。优选反应系统的PH值保持稳定或大约从4至8，最优选的PH值是在一步反应法中，与异黄酮共轭物反应前使酶最具活性的PH值，乳清的PH一般被调节到(与酶反应前)酶最具活性时的PH范围。反应过程的温度保持稳定或优选大约从40℃到60℃，最优选为60℃，通过一步法使大体上全部葡糖苷配糖基异黄酮转变为糖苷配基物所需的反应时间大约是2小时至24小时，有时可能大于24小时，如48小时。
实现本发明目的的另一途径即从葡糖苷配糖基异黄酮转化成糖苷配基异黄酮的另一替代方法为：乳清与一种或多种可食酸在一定的PH值、时间、温度条件下充分反应，从而使至少大部分并大体上所有葡糖苷配基异黄酮转化为糖苷配基异黄酮。这还希望蛋白不溶，从而使蛋白能从剩余的乳清中分离出，该过程的PH值优选大约为1．0至2．0，温度一般为80℃至90℃或更高，时间一般为30至180或更长。葡糖苷配基异黄酮向糖苷配基异黄酮的转化也可在更高PH值条件下进行。有效反应也可在PH值为4．5的条件下进行，但该反应应较慢且所需时间更长。例如在PH值为4．5下，需要温度为50℃反应时间为24小时左右。
下面将讨论从葡糖苷配糖基异黄酮到糖苷配基异黄酮的转化。液体乳清可根据需要不干燥或除去蛋白而被采用，或者通过浓缩蛋白中糖苷配基异黄酮来回收乳清蛋白，因为糖苷配基异黄酮比葡糖苷配基异黄酮更不易溶。回收富含糖苷配基异黄酮的乳清蛋白可用常规步骤如脱水，加热凝结和超声波过滤来完成，所得富含乳清蛋白可通过脱水，干燥等步骤，制备出干燥的富含糖苷配基异黄酮乳清蛋白。例如按照优选实施方案，富含糖苷配基异黄酮植物乳清蛋白中含有2．6至8．7毫克／克的染料木苷源(干品)和2．5至6．0毫克／克的黄豆苷原(干品)。
本发明还提供了以高比例从植物蛋白物料如大豆回收乳清和乳清蛋白中异黄酮的方法。回收率基于起始植物蛋白物质中各类异黄酮总含量为至少50％，优选65％，更优选80％。虽然不希望与任何具体理论有关，但确信这里所述转化反应得到的高回收率与所述的各种反应条件有关。在加工的具体阶段通过将具有较强溶解性和葡糖苷配糖基异黄酮转化为溶解性较弱的糖苷配基异黄酮，可在终产物中回收到高含量的于进料中的异黄酮类物质。
下列实例将进一步论述，但其对于本发明具有非限制性。
实验
样品为喷雾干燥乳清的16％水悬浮液是由0．02N磷酸缓冲液(PH=7)制备的，并于45℃加和不加酶制剂培育0．3和24小时。样品中加入的补充酶是0．4重量％生物果胶酶100L。测定样品中异黄酮类物质的含量，异黄酮百分比分布见下面表1所示：
表1
样品 染料木苷％ 6”-OMal-染料木苷％   6”-OAc-染料木苷％ 染料木苷原％ 黄豆苷％ 6-OMal-黄豆苷％ 6-OAc-黄豆苷％ 黄豆苷原％ 大豆异黄酮％ 6”-OMal-大豆异黄酮％ 大豆异黄酮原％
    未加酶t=0t=3t=24加入生物果胶酶100Lt=3t=24 4651544819 4440363812 10000 98101470 4748544415 6466306315 33216 5661266 4650605555 3832333321 141881324
未加酶的样品经24小时培养后其糖苷配基异黄酮含量较低，例如染料木苷原为10％，大豆苷原：6％，大豆异黄酮原：8％。而加入补充酶的样品，其回收率明显增高，例如染料木苷原和大豆苷原分别达到70％和66％。各类异黄酮的含量是依据各类异黄酮物质总量计算而得。
另一实验中，乳清样品调至PH值为7，在45℃培育24小时，培育24小时后，一半样品被加入足量的补充酶(β-葡糖-苷酶)：生物果胶酶100L，另一半样品未加酶，全部样品在45℃再培育22小时。样品在时间为0，5，24，46小时进行分析。实验中样品中异黄酮的含量如表2A，表2B如下所示：
表2A总结了样品中未加入补充的β-葡糖苷酶各类异黄酮物质的含量，表2B说明了样品未加酶培育24小时后，加入足量的生物果胶酶100L再培育22小时，样品中各类异黄酮类物质的分布。因此表2B中的时间是从加入补充酶时开始计算，例如表2B中t=0小时实指样品未加酶培育24小时后，表2B中t=22小时实指样品未加酶培育24小时后，加入补充酶培育22小时。
表2A
表2A
样品 染料木苷％ 6”-OMal-染料木苷％   6”-OAc-染料木苷％ 染料木苷原％ 黄豆苷％ 6-OMal-黄豆苷％ 6-OAc-黄豆苷％ 黄豆苷原％ 大豆异黄酮％ 6”-OMal-大豆异黄酮％ 大豆异黄酮原％
  乳清pH=7温度45℃未加入酶t=0t=5小时t=24小时t=46小时 115116 70675646 0000 19273745 7690 71695950 0000 17273242 27000 63726657 10293463
表2B
样品  染料木苷％   6”-OMal-染料木苷％   6”-OAc-染料木苷％  染料木苷原％  黄豆苷％   6-OMal-黄豆苷％     6-OAc-黄豆苷％  黄豆苷原％  大豆异黄酮％   6”-OMal-大豆异黄酮％  大豆异黄酮原％
     乳清pH=7，温度45℃加入生物果胶酶100L0.2克酶/100g乳清t=0t-22小时 110 300 00 31100 00 500 00 32100 00 6514 3481
表2A的数据显示由于样品中“残留”酶的量不充足，在培育24、46小时后，样品中黄豆苷原染料木苷原、大豆异黄酮原的含量均小于50％。表2B的数据表明，由于加入“补充酶”，染料木苷原和黄豆苷原的转化率达到100％，大豆异黄酮原为87％。
另一系列实验中乳清样品的PH调至4．5，加入补充酶：乳糖酶F，酶的加入量为0．02克／100克乳清，在温度为52℃时培养，样品在0，1．5，5，17小时被检测。表3显示了在实验过程中各类异黄酮物质的变化与分布。
表3
表3
样品 染料木苷％ 6”-OMal-染料木苷％   6”-OAc-染料木苷％ 染料木苷原％ 黄豆苷％ 6-OMal-黄豆苷％ 6-OAc-黄豆苷％ 黄豆苷原％ 大豆异黄酮％ 6”-OMal-大豆异黄酮 大豆异黄酮原％
乳清pH=4.5温度52℃加入乳糖酶F(0.02g酶/100g乳清)t=0t=1.51小时t=5.0小时t-17小时 11.69.96.59.0 68.864.176.147.8 0000 19.426.019.443.2 19.57.07.77.5 71.268.243.852.4 0000 19.326.824.510.3 15.1000 73.257.353.242.5 9.742.747.057.5
表3中的数据说明了样品培育17小时后，大豆异黄酮原的转化率。
在另一实验中乳清样品经高压灭菌破坏残余酶和污染的微生物，PH值调至4．5。样品分为二组，酶的加入如下：第一组样品：每100g初始乳清加入0．1g补充酶。第二组样品：每100g初始乳清加入0．001g补充酶(酶按1∶100稀释)。乳清样品在40℃和60℃培育23小时。“补充酶”：生物果胶酶300L由Quest International提供。样品在时间为0，1，2，4，6，23小时进行分析。分析所有样品中黄酮类物质的含量。实验中异黄酮类物质的分布如表4所示。在PH值为4．5，温度为60℃条件下，加入0．1克酶／100g乳清，培育23小时后，生物果胶酶300L使异黄酮共轭体转化为糖苷配基物，其中染料木苷原为90％，黄豆苷原为86％，大豆异黄酮原为60％。而用生物果胶酶300L且在60℃培育1小时后，也产生相当程度的转化，其中染料木苷原为70％，黄豆苷原为62％，大豆异黄酮原为44％。因此转化率和0-1g酶制剂／100g乳清的剂量在40℃和60℃都是有效的。补充酶的剂量以100高倍稀释时(0．001g酶／100g初始乳清)，其反应过程并非减慢100倍。
表4中数据阐明了本发明方法得到的转化率。
表4
表4
样品 染料木苷％ 6”-OMal-染料木苷％ 6”-OAc-染料木苷％ 染料木苷原％ 黄豆苷％ 6-OMal-黄豆苷％   6-OAc-黄豆苷％ 黄豆苷原％ 大豆异黄酮％ 6”-OMal-大豆异黄酮％ 大豆异黄酮原％
0.1克生物果胶酶300L温度：40℃t=0t=1小时t=2小时t=4小时t=6小时t=23小时0.1克生物果胶酶300L温度：60℃t=0t=1小时t=2小时t=4小时t=6小时t=23小时 4523148644575558 2826252217628242015113 000000000000 275161707490277076808390 452214996457611910 2727262421827252217144 655430843200 224655666866226268737786 403716373734403234323031 28272623221520242210178 333736404251334444515360
表4(续)
样品 染料木苷％ 6”-OMal-染料木苷％ 6”-OAc-染料木苷％ 染料木苷原％ 黄豆苷％ 6-OMal-黄豆苷％   6-OAc-黄豆苷％ 黄豆苷原％ 大豆异黄酮％ 6”-OMal-大豆异黄酮％ 大豆异黄酮原％
0.001克生物果胶酶300L温度：40℃t=0t=1小时t=2小时t=4小时t=6小时t=23小时0.001克生物果胶酶300L温度：60℃t=0t=1小时t=2小时t=4小时t=6小时t=23小时 454140353114653429242631 282726272521282725242012 000000000000 273234384565274046523657 454038332812453428242130 272727272422272726242775 466665666665 222729344162223440465053 403640413941404138394047 282927242520282626242115 333533333739333336373060
在另一系列实验中，乳清样品调至PH值为7-8，加入0．05g乳糖酶F或内酯酶／5g初始乳清(重量比为5％的酶估计以2％固体形式存在于初始乳清中)，样品于40℃和60℃进行培育。样品在加酶前(t=0)和在靶温度下经24小时培育后，取样以备含量测定之用。酶制剂的制备如下。对照物为未加酶的样品培育物。对所有样品进行异黄酮类物质含量的检测。用乳糖酶F或内酯酶经24小时培育后，乳清中异黄酮百分含量分布的变化如下表5所示。样品在加酶前未经灭菌。加入的酶在微生物污染体生长过程中未受到任何方式的抑制。
表5
表5
样品 染料木苷％ 6”-OMal-染料木苷％ 6”-OAc-染料木苷％ 染料木苷原％ 黄豆苷％ 6-OM al-黄豆苷 6-OAc-黄豆苷 黄豆苷原％ 大豆异黄酮％ 6”-OMal-大豆异黄酮％ 大豆异黄酮原％
 t=0pH=7.0温度40℃时间24小时未加酶乳糖酶F内酯酶pH=7.0温度60℃时间24小时未加酶乳糖酶F内酯酶    1010584113     63463652152417     0000000     27446040706579    1010686145     66516357283026     1000000     23395035665669     9400000     50623166182017     41526956827195
表5(续)
样品 染料木苷％ 6”-OMal-染料木苷％ 6”-OAc-染料木苷％ 染料木苷原％ 黄豆苷％ 6-OMal-黄豆苷％   6-OAc-黄豆苷％ 黄豆苷原％ 大豆异黄酮％ 6”-OMal-大豆异黄酮％ 大豆异黄酮原％
pH=8.0温度40℃时间24小时未加酶乳糖酶F内酯酶pH=3.0温度60℃时间24小时未加酶乳糖酶F内酯酶 978289 4042498227 000000 435142906983 8784113 534954202814 000000 394438766184 800000 25104211187 679058897393
从表5可以看出：在PH为7，经过24小时培育，且培育温度从40℃增加至60℃，则染料木苷原的转化率从40％增加到79％。同样在培育温度为60℃经24小时培育后，且在更高PH值如7-8染料木苷原的转化率从79％增加到93％。
在另一系列实验中，研完了从大豆物质中获得的乳清蛋白中染料木苷原和黄豆苷原的回收率。通过测定在乳清蛋白中染料木苷原(或黄豆苷原)的量得到回收百分比，该量是以豆类初始物中各种形式的染料木苷原(或黄豆苷原)总和的含量为依据。在32℃，用1000g水萃取100克脱脂豆片15分钟。匀浆的PH值为6．7，萃取液与豆片量为10∶1，匀浆被离心5分钟以除去悬浮的豆片。在32℃除去的豆片用600g水二次萃取5分钟，萃取液与豆片的比为6∶1。离心5分钟从第二提取液分出悬浮的豆片。合并第一、二次水性萃取液。合并的萃取液加入盐酸调节PH值为4．5，从而从豆类乳清中沉淀出蛋白质，豆类乳清经喷雾干燥，然后再悬浮于水中成20％固体浓度。乳清浆PH被调至PH为4．5，并使温度保持在50℃，加入占乳清固体重量1％的具有β-葡糖苷酶活性的乳糖酶F。在50℃反应20小时，以使葡糖苷配糖基异黄酮充分转化为糖苷配基物。随后，乳清浆在95％时被加热1分钟以使乳清蛋白不溶。含有糖苷配基异黄酮的不溶性乳清蛋白经离心而被回收。乳清蛋白中染料木苷原的回收率为81％，该量是以起始豆类物质(脱脂豆片中各种形式的染料木苷和染料木苷原总和的含量为依据。同样在乳清蛋白中黄豆苷原的回收率为69％。
定量分析豆类作物中异黄酮含量方法如下：异黄酮是从0．75g样品(喷雾干燥或碾成细粉)与50ml甲醇：水(80∶20)混合得到的豆类产品提取的。在室温下，该混合物用轨道振荡器振摇2小时进行萃取。2小时后用what man No．42滤纸过滤除去剩下的不溶物料。取滤液5ml，用4毫升水和1毫升甲醇稀释。
用Backman C18反相柱通过高效液相色谱对提取的异黄酮类化合物进行分离。将异黄酮注射到柱中并用溶剂梯度洗脱，起始为：甲醇88％，水10％和冰乙酸2％。最后为：甲醇98％和冰乙酸2％。流速0．4毫升／分钟。清楚地分出所有异黄酮且为：黄豆苷，6-OAc黄豆苷，6-OMal黄豆苷，黄豆苷原，染料木苷，6-OAc染料木苷，6-OMal染料木苷，染料木苷原，大豆异黄酮及其衍生物和大豆异黄酮原。紫外吸收峰位于262nm。峰的定性由质谱完成。定量分析由标准品与样品对照完成。标准品(染料木苷，染料木苷原，黄豆苷，黄豆苷原)由Indofine Chemical Company，Sommerville，NJ，购买。响应因子(积分面积／浓度)是依据上述各种化合物计算而得，并用于未知样品的定量。对于共轭体型化合物无标准品提供，其响应因子是由其母体分子的响应因子，根据共轭体的分子量修正而得出的。如大豆异黄酮的响应因子是由染料木苷的响应因子与大豆异黄酮的分子量修正而得出。
此方法提供了每个异黄酮类物质的定量。为计算方便，如果所有的共轭形式转化为其对应的非共轭形式，则可计算得出总染料木苷原，总黄豆苷原和总大豆异黄酮原且代表了这些化合物的聚集重量。其总含量也可直接用酸水解转化共轭形式来测量这些总量。
当然应明白前述仅是本发明优选实施方案且其各种改变或变化在不违背所附权利要求书精神和范围下可做出，权利要求书是基于专利法原则起草的。

Claims (31)

1．制备富含糖苷配基异黄酮植物蛋白乳清方法，其包括：
(a)获得含有葡糖苷配糖基异黄酮的植物蛋白乳清；和
(b)将葡糖苷配糖基异黄酮与至少一种β-葡糖苷酶和酯酶反应，使乳清中至少大部分葡糖苷配糖基异黄酮类物质充分转化为糖苷配基异黄酮类物质，从而制备出富含糖苷配基异黄酮乳清。
2．权利要求1的方法，其包括：
(a)获得一种含有葡糖苷配糖基异黄酮类物质和残余酶，其为至少一种β-葡糖苷酶和酯酶，的植物蛋白乳清，和
(b)将葡糖苷配糖基异黄酮类物质与酶反应，使乳清中至少大部分葡糖苷配糖基异黄酮类物质充分转化为糖苷配基异黄酮类物质，从而制备出富含糖苷配基异黄酮乳清。
3．权利要求1的方法，其包括：
(a)获得一种含有葡糖苷配糖基异黄酮类物质的植物蛋白乳清；
(b)加入补充酶，其为至少是一种β-葡糖酶和酯酶，至乳清中使乳清中酶的总含量充足，以便使乳清中至少大部分葡糖苷配糖基异黄酮类物质充分完全转化成糖苷配基异黄酮类物质，和
(c)葡糖苷配糖基异黄酮类物质与酶反应，使乳清中至少大部分葡糖苷配糖基异黄酮类物质充分转化为糖苷配基异黄酮类物质，从而制备出富含糖苷配基异黄酮乳清。
4．权利要求1，2或3的方法，其中(b)中反应时间范围是2小时至48小时。
5．权利要求4的方法，其中(b)中反应时间范围是24小时。
6．权利要求1，2或3的方法，其中(b)中反应温度范围是40℃至60℃。
7．权利要求6的方法，其中所述的温度范围是60℃。
8．权利要求1，2或3的方法，其中(b)中反应的pH值范围是4至8。
9．权利要求8的方法，其中所述的pH值范围是4．5。
10．权利要求1，2或3的方法，其中(b)中反应的时间范围是24小时，温度60℃，pH值4．5。
11．权利要求1，2或3的方法，其还包括：
从乳清中回收蛋白物质，以提供富含糖苷配基乳清蛋白。
12．权利要求11的方法，其中所述的乳清蛋白包括大豆类乳清。
13．权利要求1的方法，其中所述的乳清蛋白是经过至少超声波过滤，加热凝结和脱水之一回收的。
14．权利要求2或3的方法，其中所述乳清蛋白材料是通过超声过滤回收的。
15．权利要求11的方法，其中所述的乳清蛋白是通过加热乳清，使蛋白不溶并从乳清中分离出不溶性蛋白来回收的。
16．权利要求15的方法，其中反应的pH值是1至2。
17．权利要求15的方法，其中反应的温度至少80℃并保持至少30分钟。
18．权利要求15的方法，其中所述的不溶性蛋白是通过离心从乳清中分离得到的。
19．权利要求15的方法，其中所述的不溶性蛋白是通过脱水得到的。
20．权利要求1，2或3的方法，其中至少80％所有葡糖苷配糖基异黄酮类物质都被转化成糖苷配基异黄酮类物质。
21．由权利要求1，2或3的方法制备的富含糖苷配基异黄酮乳清。
22．由权利要求11的方法制备的权利要求21的富含糖苷配基异黄酮乳清蛋白。
23．权利要求22的富含糖苷配基异黄酮植物乳清蛋白，其中染料木苷原的干品含量是2．6至8．7毫克／克，黄豆苷原的含量是2．5至6．0毫克／克。
24．权利要求1，2和3任一要求的方法，其包括：
(a)获得含有异黄酮类物质的植物蛋白乳清，
(b)将异黄酮类物质与酶反应，使至少大部分乳清中的异黄酮类物质充分转化成基本不溶的异黄酮类物质，由此制备出富含异黄酮乳清；和
(c)从乳清回收蛋白物质以提供乳清蛋白，该乳清蛋白含至少50％含在植物蛋白物料中的异黄酮类物质。
25．权利要求24的方法，其中所述乳清蛋白含至少65％含在植物蛋白物料中的异黄酮。
26．权利要求24的方法，其中所述乳清蛋白含至少80％含在植物蛋白物料中的异黄酮。
27．权利要求24的方法，其中所述植物蛋白物质包含大豆类作物。
28．权利要求24的方法，其中所述的酶选自β-葡糖苷酶和酯酶。
29．权利要求24方法得到的乳清蛋白。
30．由权利要求25的方法得到的权利要求29的乳清蛋白。
31．由权利要求26的方法得到的权利要求29的乳清蛋白。
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