JP2008535503A5

JP2008535503A5 -

Info

Publication number: JP2008535503A5
Application number: JP2008505719A
Authority: JP
Filing date: 2006-04-14
Publication date: 2011-03-17

Description

もう一つの実施形態において、上記方法は、上記ステップのほか、以下のステップを更に含むことができる。即ち、N2添加物、B27添加物、ラミニン(Laminin)及びニコチンアミドを含有する培地中で、上記増加したインシュリンを生成するための前駆体細胞をインキュベートして、インシュリン生成細胞に発育させるステップを更に含むことができる。また、上記培地はN2添加物（1:100， Gibcoから購入可能）、B27添加物（1:50， Gibcoから購入可能）、1 μg/mlのラミニン、10 ng/mlのbFGF、インシュリン-トランスフェリン-セレニウム-A（1:100， Gibcoから購入可能）及び10 mmol/Lのニコチンアミドを含有するDMEM/F12又はCDM培地である。

培養システムは、化学上の組成成分が確定された培地である（CDM：50%IMDM (Gibco)、50%F12 (Gibco)、モノチオグリセリン(sigma)450umol/L、インシュリン-トランスフェリン-セレニウム-A (ITS、Gibco)、アルブミンフラグメントV (Sigma) 5mg/ml）。簡単に説明すると、hES細胞をCDMに引き入れて分化した。次いで、ActivinAとRAを利用してhES細胞から膵前駆体細胞への分化を誘導した。続いて、 mES誘導方法において説明した膵島培養条件を利用して、hESの膵β細胞を更に成熟させた。

分化を行うために、実験は以下のように設計した。
第1ステップ、hES細胞を1% Matrigel (B&D Biosciences)によってカバーされた組織ペトリ皿(Nunc)に移行(passage)した。次いで、改良されたCDM（11）により上述の培地を代わった。上記改良されたCDM（11）は、50% IMDM (Gibco)と50% F12 NUT-MIX (Gibco)を含有し、インシュリン-トランスフェリン-セレニウム-A (1:100、Gibco)、450μMモノチオグリセリン(sigma)及び5mg/mlアルブミンフラグメントV (Sigma)が添加されている。二日後、50 ng/mlActivinA (Sigma) を含有するCDM培地に上述の細胞を4日誘導した。
第2ステップ,ActivinAを4日誘導した後、細胞を10^-6 M RA（Sigma）を含有するCDMに移動して更に4日誘導した。
第3ステップ、培地をCDMから改良された膵島成熟培地(12)に変換した。上記膵島成熟培地(12)の組成は、次のとおりである。DMEM/F12 (Gibco)、インシュリン-トランスフェリン-セレニウム-A(1:100、Gibco)、2mg/mlアルブミンフラグメントV (Sigma),及び10 ng/ml bFGFである。細胞を上記培地に3日培養した後、DMEM/F12 (Gibco)、インシュリン-トランスフェリン-セレニウム-A (1:100、Gibco),2 mg/mlアルブミンフラグメント V (Sigma) 及び10 mM ニコチンアミド(Sigma)を含有する培地に引き入れ2日培養した。次いで、0.5 mg/mlの分散酵素(dispase、Gibco)を利用して上述の細胞を消化し、これを低付着ペトリ皿で5日放置することで、懸濁液を形成して膵島の成熟を完成した。

Claims

細胞の培地を収容する培養容器をMatrigel（登録商標）でカバーするステップ、
上記細胞の培地において胚性幹細胞を培養して胚様体を形成するステップ、
ActivinAと共に上記胚様体をインキュベートするステップ、及び
上記胚様体を、インシュリンを生成するための前駆体細胞に発育させるようにRAと共にインキュベートするステップ、
をこの順に含む胚性幹細胞からインシュリン産生細胞を分化誘導する方法。
上記胚性幹細胞が鼠由来の細胞である場合、上記培地は10%ウシ胎児血清を含有するDMEMであり、上記胚性幹細胞が人由来の細胞である場合、上記培地はCDMであることを特徴とする、請求項１記載の胚性幹細胞からインシュリン産生細胞を分化誘導する方法。
上記Activin Aの濃度が約50-300ng/ml培地であり、上記RAの濃度が約1×10⁻⁷-1×10⁻⁵mol/L培地であることを特徴とする、請求項１記載の胚性幹細胞からインシュリン産生細胞を分化誘導する方法。
培地中の上記Matrigel（登録商標）の質量百分率が約1%であることを特徴とする、請求項１記載の胚性幹細胞からインシュリン産生細胞を分化誘導する方法。
上記胚様体をActivinAとともに20時間から4日間インキュベートした後、ActivinAを含有していない培地中で6時間から8時間培養し、次いで、RAと共に20時間から4日インキュベートして、インシュリンを生成するための前駆体細胞に発育させることを特徴とする、請求項４記載の胚性幹細胞からインシュリン産生細胞を分化誘導する方法。
上記ステップにより取得されたインシュリンを生成するための前駆体細胞を、成熟因子を含有する培地中でインキュベートして、インシュリンを生成するための前駆体細胞を増加するステップを更に含み、前記成熟因子がMatrigel（登録商標）、ニコチンアミドおよび塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）からなる群より選択されることを特徴とする、請求項５記載の胚性幹細胞からインシュリン産生細胞を分化誘導する方法。
上記成熟因子がbFGFであることを特徴とする、請求項６記載の胚性幹細胞からインシュリン産生細胞を分化誘導する方法。
上記bFGFの濃度が8-12ng/mlであることを特徴とする、請求項７記載の胚性幹細胞からインシュリン産生細胞を分化誘導する方法。
N2添加物、B27添加物、ラミニン及びニコチンアミドを含有する培地中で、上記増加されたインシュリンを生成するための前駆体細胞をインキュベートして、インシュリン生成細胞に発育させるステップを更に含むことを特徴とする、請求項８記載の胚性幹細胞からインシュリン産生細胞を分化誘導する方法。
上記培地が、N2添加物、B27添加物、1 μg/mlのラミニン、10 ng/mlのbFGF、インシュリン-トランスフェリン-セレニウム-A（1:100）及び10 mmol/Lのニコチンアミドを含有するDMEM/F12又はCDMであることを特徴とする、請求項９記載の胚性幹細胞からインシュリン産生細胞を分化誘導する方法。
ActivinAとRAを含む、胚性幹細胞からインシュリン産生細胞を分化誘導するためのキット。
Matrigel（登録商標）を更に含むことを特徴とする、請求項１１記載のキット。
血清を更に含むことを特徴とする、請求項１２記載のキット。