JP2008528470A - キナーゼ阻害剤としての４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩 - Google Patents

キナーゼ阻害剤としての４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩 Download PDF

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Abstract

本発明は、４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩およびその結晶を提供し、この塩はメタンスルホン酸および酢酸ならびにそれらの混合物から選択される酸により形成される。また、４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの塩の新規な使用、４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドおよびその塩の製造方法、ならびに新規な化学中間体も提供される。

Description

本発明は、化合物４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩およびその結晶形、該化合物およびその酸付加塩の製造方法、それらの方法に用いるための新規な化学中間体、ならびに該化合物およびその酸付加塩の治療的使用に関する。本発明はまた、４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドおよびその類似体の新規な治療的使用に関する。
化合物４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドおよびその塩酸酸付加塩は、本発明者らの先願である国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００３１７９号（公開番号ＷＯ２００５／０１２２５６）に、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫキナーゼ）およびグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ３）の阻害剤であるとして開示されている。
タンパク質キナーゼは、細胞内の多様なシグナル伝達プロセスの制御に関与する、構造的に関連した大きな酵素ファミリーを構成する(Hardie, G. and Hanks, S. (1995) The Protein Kinase Facts Book. I and II, Academic Press, San Diego, CA)。これらのキナーゼは、それらがリン酸化する基質（例えば、タンパク質チロシン、タンパク質セリン／トレオニン、脂質など）によりファミリーに分類され得る。これらのキナーゼファミリーの各々に一般的に対応する配列モチーフが同定されている（例えば、Hanks, S. K., Hunter, T., FASEBJ., 9:576-596 (1995); Knighton, et al., Science, 253:407-414 (1991); Hiles, et al., Cell, 70:419-429 (1992); Kunz, et al., Cell, 73:585-596 (1993); Garcia-Bustos, et al., EMBO J., 13:2352-2361 (1994)）。
タンパク質キナーゼは、それらの調節機構により特徴付けることができる。これらの機構には、例えば、自己リン酸化、他のキナーゼによるトランスリン酸化、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−脂質相互作用、およびタンパク質−ポリヌクレオチド相互作用がある。個々のタンパク質キナーゼは、１を超える機構により調節され得る。
キナーゼは、限定されるものではないが、リン酸基を標的タンパク質に付加することにより、増殖、分化、アポトーシス、運動性、転写、翻訳および他のシグナル伝達プロセスをはじめとする多くの異なる細胞プロセスを調節する。これらのリン酸化事象は、標的タンパク質の生物機能を調節または調整することができる分子のオン／オフスイッチとしての働きをする。標的タンパク質のリン酸化は、種々の細胞外シグナル（ホルモン、神経伝達物質、増殖および分化因子など）、細胞周期事象、環境ストレスまたは栄養ストレスなどに応答して起こる。適切なタンパク質キナーゼは、シグナル伝達経路において、例えば、代謝性酵素、調節タンパク質、受容体、細胞骨格タンパク質、イオンチャネルもしくはポンプ、または転写因子を（直接または間接的に）活性化または不活性化する働きをする。タンパク質リン酸化の制御欠陥による細胞内シグナル伝達の不全が、例えば、炎症、癌、アレルギー／喘息、免疫系の疾病および症状、中枢神経系の疾病および症状、ならびに脈管形成をはじめとする多くの疾病に関連づけられている。
サイクリン依存性キナーゼ
真核細胞分裂のプロセスは、Ｇ１、Ｓ、Ｇ２およびＭと呼ばれる一連の連続する段階に大別することができる。細胞周期の種々の段階の適正な進行は、サイクリン依存性キナーゼ（ｃｄｋ）として知られているタンパク質ファミリーおよびサイクリンと呼ばれるそれらの同族タンパク質パートナーの多様なセットの空間的・時間的調節に決定的に依存していることが示されている。ｃｄｋは、配列依存的に種々のポリペプチドのリン酸化において基質としてＡＴＰを利用することができるｃｄｃ２（ｃｄｋ１としても知られている）相同セリン−トレオニンキナーゼタンパク質である。サイクリンは、特定のｃｄｋパートナータンパク質への結合およびそれに対する選択性の規定に使用される「サイクリンボックス」と呼ばれる約１００アミノ酸を含む相同領域によって特徴付けられるタンパク質ファミリーである。
細胞周期を通じて種々のｃｄｋおよびサイクリンの発現レベル、分解率および活性化レベルが調節されることで、ｃｄｋが酵素的に活性である一連のｃｄｋ／サイクリン複合体の循環形成がもたらされる。これらの複合体の形成により、個々の細胞周期チェックポイントを介する経路が制御され、それにより細胞分裂のプロセスが継続し得る。ある細胞周期チェックポイントで必須の生化学的基準を満足しない、すなわち、必要とするｃｄｋ／サイクリン複合体を形成することができないと、細胞周期の停止および／または細胞アポトーシスがもたらされることがある。癌において見られる異常な細胞増殖は、多くの場合、適正な細胞周期制御の欠如に起因し得る。従って、ｃｄｋ酵素活性の阻害により、異常に分裂する細胞が、それらの分裂の停止および／または死滅を生じ得る手段が提供される。ｃｄｋ、およびｃｄｋ複合体、ならびに細胞周期に介在するそれらの重要な役割の多様性により、定義された生化学的根拠に基づいて選択される広範囲の可能性ある治療標的が提供される。
細胞周期のＧ１期からＳ期への進行は、Ｄ型およびＥ型サイクリンのメンバーとの会合を介して、主としてｃｄｋ２、ｃｄｋ３、ｃｄｋ４およびｃｄｋ６により調節される。Ｇ１限界点においてＧ１期からＳ期への移行にはｃｄｋ２／サイクリンＥ複合体が重要であることから、Ｄ型サイクリンは、Ｇ１限界点を超えるのに役立つと思われる。続いて、Ｓ期を経てＧ２期へ入るには、ｃｄｋ２／サイクリンＡ複合体が必要であると思われる。有糸分裂と、それを引き起こすＧ２期からＭ期への移行はどちらも、ｃｄｋ１とＡ型およびＢ型サイクリンの複合体により調製される。
Ｇ１期では、網膜芽細胞腫タンパク質（Ｒｂ）およびｐ１３０のような関連のポケットタンパク質がｃｄｋ（２、４、および６）／サイクリン複合体の基質となる。Ｇ１からの進行は、１つには、ｃｄｋ（４／６）／サイクリン−Ｄ複合体によるＲｂおよびｐ１３０の高リン酸化、および従って不活性化により助長される。Ｒｂおよびｐ１３０の高リン酸化により、Ｅ２Ｆなどの転写因子の放出、および従って、Ｇ１からの進行、さらにはＳ期に入るために必要なサイクリンＥ遺伝子などの遺伝子の発現が起こる。サイクリンＥの発現により、Ｒｂのさらなるリン酸化を介してＥ２Ｆレベルを増幅または維持するｃｄｋ２／サイクリンＥ複合体の形成が促進される。また、このｃｄｋ２／サイクリンＥ複合体は、ヒストン生合成に関連づけられているＮＰＡＴなどの、ＤＮＡ複製に必要な他のタンパク質もリン酸化する。また、Ｇ１の進行およびＧ１／Ｓ移行は、ｃｄｋ２／サイクリンＥ経路に送り込まれるマイトジェン刺激Ｍｙｃ経路を介しても調節される。また、ｃｄｋ２は、ｐ２１レベルのｐ５３調節を介して、ｐ５３が介在するＤＮＡ損傷応答経路にも接続される。ｐ２１は、ｃｄｋ２／サイクリンＥのタンパク質阻害剤であり、従って、Ｇ１／Ｓ移行を遮断または遅延することができる。従って、ｃｄｋ２／サイクリンＥ複合体は、Ｒｂ、Ｍｙｃおよびｐ５３経路からの生化学的刺激がある程度統合される点を表す可能性がある。従って、ｃｄｋ２および／またはｃｄｋ２／サイクリンＥ複合体は、異常に分裂する細胞において細胞周期を停止させる、または細胞周期の制御を回復させるべく設計される治療の良い標的となる。
細胞周期におけるｃｄｋ３の厳密な役割は明らかになっていない。同族サイクリンパートナーはまだ同定されていないが、優勢なネガティブ型のｃｄｋ３がＧ１における細胞を遅延させ、このことは、ｃｄｋ３がＧ１／Ｓ移行を調節する役割を有することを示唆している。
ほとんどのｃｄｋが細胞周期の調節に関連づけられているが、ｃｄｋファミリーの特定のメンバーが、他の生化学的プロセスに関与している証拠がある。これは、適正な神経発達に必要であり、かつ、Ｔａｕ、ＮＵＤＥ−１、シナプシン１、ＤＡＲＰＰ３２およびＭｕｎｃ１８／シンタキシン１Ａ複合体などのいくつかの神経タンパク質のリン酸化にも関連づけられているｃｄｋ５によって例示される。神経ｃｄｋ５は、通常、ｐ３５／ｐ３９タンパク質への結合により活性化される。しかしながら、ｃｄｋ５活性は、ｐ３５の末端切断型であるｐ２５の結合により脱調節され得る。ｐ３５からｐ２５への変換および続いてのｃｄｋ５活性の脱調節は、虚血、興奮毒性およびβ−アミロイドペプチドにより誘導することができる。その結果、ｐ２５は、アルツハイマー病などの神経変性疾患の病因に関連づけられており、従って、これらの疾病に対する治療標的として注目される。
ｃｄｋ７は、ｃｄｃ２ＣＡＫ活性を有し、かつ、サイクリンＨに結合する核タンパク質である。ｃｄｋ７は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）活性を有するＴＦＩＩＨ転写複合体の成分として同定されている。これは、Ｔａｔが介在する生化学経路を介したＨＩＶ−１転写の調節と関連づけられている。ｃｄｋ８はサイクリンＣと結合し、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのＣＴＤのリン酸化に関連づけられている。同様に、ｃｄｋ９／サイクリン−Ｔ１複合体（Ｐ−ＴＥＦｂ複合体）は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの伸張制御に関連づけられている。また、ＰＴＥＦ−ｂは、サイクリンＴ１との相互作用を介したウイルス性トランス活性化因子ＴａｔによるＨＩＶ−１ゲノムの転写の活性化に必要とされる。従って、ｃｄｋ７、ｃｄｋ８、ｃｄｋ９およびＰ−ＴＥＦｂ複合体は、抗ウイルス治療の可能性のある標的となる。
分子レベルで、ｃｄｋ／サイクリン複合体活性の介在には、一連の促進および阻害的リン酸化または脱リン酸化の事象が必要である。ｃｄｋのリン酸化は、ｃｄｋ活性化キナーゼ群（ＣＡＫ）および／またはｗｅｅ１、Ｍｙｔ１およびＭｉｋ１などのキナーゼによって行われる。脱リン酸化は、ｃｄｃ２５（ａおよびｃ）、ｐｐ２ａまたはＫＡＰなどのホスファターゼによって行われる。
ｃｄｋ／サイクリン複合体活性は、さらに、Ｋｉｐ／ＣｉｐファミリーまたはＩＮＫファミリーという、内因性の細胞タンパク性阻害剤の２つのファミリーにより調節され得る。ＩＮＫタンパク質は、ｃｄｋ４およびｃｄｋ６と特異的に結合する。ｐ１６ｉｎｋ４（ＭＴＳ１としても知られている）は、多数の原発性癌において突然変異または欠失されている、可能性のある腫瘍抑制遺伝子である。Ｋｉｐ／Ｃｉｐファミリーは、ｐ２１Ｃｉｐ１，Ｗａｆ１、ｐ２７Ｋｉｐ１およびｐ５７ｋｉｐ２などのタンパク質を含む。上記したように、ｐ２１はｐ５３により誘導され、ｃｄｋ２／サイクリン（Ｅ／Ａ）およびｃｄｋ４／サイクリン（Ｄ１／Ｄ２／Ｄ３）複合体を不活性化することができる。乳癌、結腸癌および前立腺癌においては、典型的に低いレベルのｐ２７発現が見られている。逆に、固形癌におけるサイクリンＥの過剰発現は、患者の予後の悪さと相関があることが示されている。サイクリンＤ１の過剰発現は、食道癌、乳癌、扁平上皮癌および非小細胞性肺癌と関連づけられている。
増殖細胞において細胞周期を統括および駆動する上でのｃｄｋおよびそれらの関連タンパク質の中枢的役割については上記で概要を述べた。ｃｄｋが重要な役割を果たす生化学的経路のいくつかについても記載してきた。従って、全般的にｃｄｋまたは特定のｃｄｋを標的とした治療薬を用いた、癌などの増殖性疾患の処置に向けた単剤療法の開発は、極めて望ましい可能性がある。ｃｄｋ阻害剤は、とりわけウイルス感染、自己免疫疾患および神経変性疾患などの他の症状を処置するのにも使用できると考えられる。また、ｃｄｋ標的治療も、既存または新しい治療薬との併用療法に用いた場合に、上記の疾病の処置において臨床的利益をもたらし得る。ｃｄｋ標的抗癌療法は、ＤＮＡと直接相互作用せず、従って、二次腫瘍の発達の危険性を軽減するはずであることから、現行の多くの抗腫瘍剤に優る利点を持つ可能性がある。
グリコーゲンシンターゼキナーゼ
グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ３）は、ヒトにおいて偏在発現する２つのイソ型（ＧＳＫ３αとＧＳＫ３β）として生じるセリン−トレオニンキナーゼである。ＧＳＫ３は胚発達、タンパク質合成、細胞増殖、細胞分化、微小管動力学、細胞運動および細胞アポトーシスに役割を有するとされている。このようなＧＳＫ３は糖尿病、癌、アルツハイマー病、卒中、癲癇、運動神経性疾患および／または頭部外傷などの病態の進行に関連づけられている。系統発生的にＧＳＫ３はサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）に最も近い。
ＧＳＫ３により認識されるコンセンサスペプチド基質配列は（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）−Ｘ−Ｘ−Ｘ−（ｐＳｅｒ／ｐＴｈｒ）であり、ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり（（ｎ＋１）、（ｎ＋２）、（ｎ＋３）番）、ｐＳｅｒおよびｐＴｈｒはそれぞれホスホ−セリンおよびホスホ−トレオニンである（ｎ＋４）。ＧＳＫ３は最初のセリン、または（ｎ）番のトレオニンをリン酸化する。（ｎ＋４）番のホスホ−セリン、またはホスホ−トレオニンは、最大基質ターンオーバーを得るためにＧＳＫ３をプライミングするのに必要であると思われる。ＧＳＫ３αのＳｅｒ２１におけるリン酸化、またはＧＳＫ３βのＳｅｒ９におけるリン酸化は、ＧＳＫ３の阻害をもたらす。突然変異誘発およびペプチド競合研究は、ＧＳＫ３のリン酸化されたＮ末端が、自己阻害機構を介してホスホ−ペプチド基質（Ｓ／ＴＸＸＸｐＳ／ｐＴ）と競合し得るというモデルを導いた。また、ＧＳＫ３αおよびＧＳＫβがそれぞれチロシン２７９および２１６のリン酸化により敏感に認識され得るということを示唆するデータもある。これらの残基のＰｈｅへの突然変異により、in vivoキナーゼ活性の低下が起こった。ＧＳＫ３βのＸ線結晶構造はＧＳＫ３の活性化および調節のあらゆる局面に光を当てる助けとなった。
ＧＳＫ３は哺乳類インスリン応答経路の一部をなし、グリコーゲンシンターゼをリン酸化することで、これを不活性化することができる。ＧＳＫ３の阻害によるグリコーゲンシンターゼ活性のアップレギュレーションおよびそれによるグリコーゲン合成はＩＩ型、すなわち、身体の組織がインスリン刺激に耐性となる状態である非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）に対処する、可能性ある手段であると考えられてきた。肝組織、脂肪組織または筋肉組織における細胞のインスリン応答は、細胞外インスリン受容体に結合するインスリンにより誘発される。これがリン酸化をもたらし、次に、インスリン受容体基質（ＩＲＳ）タンパク質の原形質膜への動員が起こる。これらのＩＲＳタンパク質がさらにリン酸化されれば、原形質膜へのホスホイノシチド−３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の動員が始まり、そこでは、第二のメッセンジャーであるホスファチジルイノシチル３，４，５−３リン酸（ＰＩＰ３）の放出が可能である。これは３−ホスホイノシチド依存性タンパク質キナーゼ１（ＰＤＫ１）とタンパク質キナーゼＢ（ＰＫＢまたはＡｋｔ）の膜への同時局在を助け、そこで、ＰＤＫ１はＰＫＢを活性化する。ＰＫＢはリン酸化され、それによってそれぞれＳｅｒ９またはｓｅｒ２１のリン酸化によりＧＳＫ３αおよび／またはＧＳＫβを阻害することができる。このＧＳＫ３の阻害は、次に、グリコーゲンシンターゼ活性のアップレギュレーションを誘発する。従って、ＧＳＫ３を阻害することができる治療薬は、インスリン刺激に対して見られるものと同様の細胞応答を誘導し得る可能性がある。ＧＳＫ３のさらなるin vivo基質として、真核生物タンパク質合成開始因子２Ｂ（ｅＩＦ２Ｂ）がある。ｅＩＦ２Ｂはリン酸化によって不活性化され、従って、タンパク質の生合成を抑制することができる。従って、例えば、「ラパマイシンの哺乳類標的」タンパク質（ｍＴＯＲ）の不活性化によるＧＳＫ３の阻害はタンパク質生合成をアップレギュレートすることができる。最後に、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ活性化タンパク質キナーゼ１（ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１またはＲＳＫ）などのキナーゼによるＧＳＫ３のリン酸化によるマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路を介したＧＳＫ３活性の調節の証拠がいくつかある。これらのデータは、ＧＳＫ３活性が有糸分裂促進刺激、インスリン刺激および／またはアミノ酸刺激によって調節され得ることを示唆する。
また、ＧＳＫ３βが脊椎動物Ｗｎｔシグナル伝達経路の重要な成分であることも示されている。この生化学経路は、正常な胚発達に重要であり、正常組織における細胞増殖を調節することが示されている。ＧＳＫ３はＷｎｔ刺激に応答して阻害されるようになる。これにより、アキシン、腺腫様多発結腸ポリープ（ＡＰＣ）遺伝子産物およびβ−カテニンなどのＧＳＫ３基質の脱リン酸化をもたらし得る。Ｗｎｔ経路の調節の異常は多くの癌に関連している。ＡＰＣおよび／またはβ−カテニンの突然変異は結腸直腸癌および他の腫瘍に共通している。また、β−カテニンは細胞接着に重要であることも示されている。従って、ＧＳＫ３もまたある程度まで細胞接着プロセスを調節し得る。すでに記載した生化学経路とは別に、サイクリン−Ｄ１のリン酸化を介した細胞分裂の調節、ｃ−Ｊｕｎ、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質α（Ｃ／ＥＢＰα）、ｃ−Ｍｙｃなどの転写因子および／または活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴｃ）、熱ショック因子−１（ＨＳＦ−１）およびｃ−ＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）などの他の基質のリン酸化にＧＳＫ３を関連づけるデータもある。また、ＧＳＫ３は、組織特異的ではあるが、細胞アポトーシスの調節にも役割を果たしていると思われる。プロアポトーシス機構を介した細胞アポトーシスの調節におけるＧＳＫ３の役割は、神経アポトーシスが起こり得る医学的状態に特に関連がある可能性がある。これらの例としては、頭部外傷、卒中、癲癇、アルツハイマー病、および運動神経性疾患、進行性の核上麻痺、皮質基底核変性症、およびピック病がある。in vitroにおいては、ＧＳＫ３は微小管関連タンパク質Ｔａｕを高リン酸化することができることが示されている。Ｔａｕの高リン酸化はその微小管との正常な結合を妨害し、細胞内Ｔａｕ微細線維の形成ももたらし得る。これらの微細線維の進行的な蓄積は、ついには神経の機能不全および変性をもたらすと考えられている。従って、ＧＳＫ３の阻害によるＴａｕリン酸化の阻害は、神経変性作用を制限し、かつ／または防ぐ手段となり得る。
びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）
細胞周期の進行は負の細胞周期レギュレーターであるサイクリン、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）、およびＣＤＫ阻害剤（ＣＤＫｉ）の作用の組合せによって調節される。ｐ２７ＫＩＰ１は細胞周期調節の鍵となるＣＤＫｉであり、Ｇ１／Ｓ移行にはその分解が必要とされる。増殖中のリンパ球ではｐ２７ＫＩＰ１の発現が見られないにもかかわらず、いくつかの急速進行性Ｂ細胞リンパ腫は、変則的なｐ２７ＫＩＰ１染色を示すことが報告されている。この種のリンパ腫では異常に高いｐ２７ＫＩＰ１発現が見られた。これらの知見が臨床上適当であるかどうかの分析では、単変量解析と多変量解析の双方で、この種の腫瘍における高レベルのｐ２７ＫＩＰ１発現が予後の悪さのマーカーとなることが示された。これらの結果は、臨床的意味の悪いびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）において異常なｐ２７ＫＩＰ１発現が見られることを示し、このことはこの変則的なｐ２７ＫＩＰ１タンパク質が他の細胞周期レギュレータータンパク質との相互作用を介して非機能性となり得ることを示唆している(Br. J. Cancer. 1999 Jul;80(9): 1427-34）。ｐ２７ＫＩＰ１はびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫で異常な発現を示し、悪い臨床結果と関連している。Saez A, Sanchez E, Sanchez-Beato M, Cruz MA, Chacon I, Munoz E, Camacho FI, Martinez-Montero JC, Mollejo M, Garcia JF, Piris MA. Department of Pathology, Virgen de Ia Salud Hospital, Toledo, Span。
慢性リンパ性白血病
Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）は西半球で最も多い白血病であり、毎年およそ１０，０００の新たな症例が診断されている(Parker SL, Tong T, Bolden S, Wingo PA: Cancer statistics, 1997. Ca. Cancer. J. Clin. 47:5, (1997))。他の形態の白血病に比べ、ＣＬＬの予後は全体的に良好であり、最も進行した病期の患者でも３年生存率は中間的な値である。
従来用いられているアルキル化剤に基づく療法に比べ、症候性ＣＬＬ患者に対する初期療法としてフルダラビンを付加するとより高い完全奏功率（３％に対して２７％）と無進行生存期間をもたらした。治療後に完全臨床奏功率を得ることはＣＬＬにおける生存率を向上させる第一段階であるが、大多数の患者は完全緩解が得られないか、またはフルダラビンに応答することができない。さらに、フルダラビンで処置した全てのＣＬＬ患者がやがて再発に至り、その単剤としての役割は全く一時的なものとなる(Rai KR, Peterson B, Elias L, Shepherd L, Hines J, Nelson D, Cheson B, Kolitz J, Schiffer CA: A randomized comparison of fludarabine and chlorambucil for patients with previously untreated chronic lymphocytuc leukemia, A CALGB SWOG, CTG/NCI-C and ECOG Inter-Group Study. Blood 88:141a, 1996 (abstr 552, suppl 1))。従って、この疾病の治療法にさらなる進展が実現されるとすれば、フルダラビンの細胞傷害性を補足し、内在性のＣＬＬ薬剤耐性因子によって誘導される耐性を排除する新規な作用機序を有する新規薬剤を同定することが必要である。
最も包括的に研究されている、ＣＬＬ患者の不十分な治療応答と生存率の悪さの一様な推定因子は、点突然変異または染色体１７ｐ１３の欠失を特徴とするような異常なＰ５３機能である。実際、異常なｐ５３機能を有するＣＬＬ患者に関する複数の単一施設症例系統においてアルキル化剤またはプリン類似体のいずれかによる療法に対する応答は実証されたことがない。ＣＬＬにおけるｐ５３突然変異に関連する薬剤耐性を克服する能力を有する治療薬を導入することは、この疾病の処置に大きな進展をもたらす可能性がある。
サイクリン依存性キナーゼの阻害剤であるフラボピリドールおよびＣＹＣ ２０２は、in vitroにおいてＢ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）由来の悪性細胞のアポトーシスを誘導する。
フラボピリドール暴露はカスパーゼ３活性の刺激、ならびにＢ−ＣＬＬにおいて過剰発現される、細胞周期の負のレギュレーターｐ２７（ｋｉｐ１）のカスパーゼ依存性切断をもたらす(Blood. 1998 Nov 15; 92(10):3804-16 Flavopiridol induces apoptosis in chronic lymphocytic leukemia cells via activation of caspase-3 without evidence of bcl-2 modulation or dependence on functional p53. Byrd JC, Shinn C, Waselenko JK, Fuchs EJ, Lehman TA, Nguyen PL, Flinn IW, Diehl LF, Sausville E, Grever MR)。
先行技術
Du PontのＷＯ０２／３４７２１は、サイクリン依存性キナーゼの阻害剤としてのある種のインデノ［１，２−ｃ］ピラゾール−４−オンを開示している。
Bristol Myers SquibbのＷＯ０１／８１３４８は、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤としての５−チオ−、スルフィニル−およびスルホニルピラゾロ［３，４−ｂ］−ピリジンの使用を記載している。
Bristol Myers SquibbのＷＯ００／６２７７８もまた、ある種のタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤を開示している。
CyclacelのＷＯ０１／７２７４５Ａ１は、２−置換４−ヘテロアリール−ピリミジンおよびそれらの製造方法、それらを含有する医薬組成物、ならびにサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）の阻害剤としてのそれらの使用、およびゆえに癌、白血病、乾癬などの増殖性疾患の処置におけるそれらの使用を記載している。
AgouronのＷＯ９９／２１８４５は、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、およびＣＤＫ６などのサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）を阻害するための４−アミノチアゾール誘導体を記載している。この発明はまた、そのような化合物を含有する医薬組成物の治療的使用または予防的使用、ならびにそのような化合物の有効量を投与することによる悪性腫瘍および他の疾患の処置方法にも向けられる。
AgouronのＷＯ０１／５３２７４は、ＣＤＫキナーゼ阻害剤としての、Ｎ含有複素環式基と結合したアミド置換ベンゼン環を含み得るある種の化合物を開示している。
ＷＯ０１／９８２９０(Pharmacia & Upjohn)は、タンパク質キナーゼ阻害剤としての、ある種の３−アミノカルボニル−２−カルボキサミドチオフェン誘導体を開示している。
AgouronのＷＯ０１／５３２６８およびＷＯ０１／０２３６９は、サイクリン依存性キナーゼまたはチロシンキナーゼなどのタンパク質キナーゼの阻害により細胞増殖を媒介する、または阻害する化合物を開示している。これらAgouronの化合物はインダゾール環の３位と直接またはＣＨ＝ＣＨもしくはＣＨ＝Ｎ基を介して結合したアリールまたはヘテロアリール環を有する。
ＷＯ００／３９１０８およびＷＯ０２／００６５１（双方ともDu Pont Pharmaceuticals）は、トリプシン様セリンプロテアーゼ酵素、特にＸａ因子およびトロンビンの阻害剤である複素環式化合物を記載している。これらの化合物は抗凝固薬として、または血栓塞栓性疾患の予防に有用であると述べられている。
ＵＳ２００２／００９１１１６（Zhuら）、ＷＯ０１／１９７９８およびＷＯ０１／６４６４２は各々、Ｘａ因子の阻害剤としての複素環式化合物の多様な群を開示している。いくつかの１−置換ピラゾールカルボキサミドを開示し例示している。
米国特許第６，１２７，３８２号、ＷＯ０１／７０６６８、ＷＯ００／６８１９１、ＷＯ９７／４８６７２、ＷＯ９７／１９０５２およびＷＯ９７／１９０６２（全てAllerganに対するもの）は各々、癌を含む種々の過増殖性疾患の処置に用いるための、レチノイド様活性を有する化合物を記載している。
ＷＯ０２／０７０５１０(Bayer)は、心血管疾患の処置に用いるための、ある種のアミノ−ジカルボン酸化合物を記載している。この文書では、全般的にピラゾールが記載されているが、ピラゾールの具体例は示されていない。
ＷＯ９７／０３０７１(Knoll AG)は、中枢神経系疾患の処置に用いるための、ある種のヘテロシクリル−カルボキサミド誘導体を開示している。複素環式基の例として全般的にピラゾールが記載されているが、具体的なピラゾール化合物は開示も例示もされていない。
ＷＯ９７／４００１７(Novo Nordisk)は、タンパク質チロシンホスファターゼのモジュレーターである化合物を記載している。
ＷＯ０３／０２０２１７(Univ. Connecticut)は、神経症状を処置するためのカンナビノイド受容体モジュレーターとしての、ある種のピラゾール３−カルボキサミドを記載している。この明細書（第１５頁）には、これらの化合物が癌の化学療法に使用可能であると述べられているが、これらの化合物が抗癌剤として活性があるかどうか、またはこれらの化合物が他の目的で投与されるかどうかは明示されていない。
ＷＯ０１／５８８６９(Bristol Myers Squibb)は、とりわけ、様々な疾病を処置するために使用可能であるカンナビノイド受容体モジュレーターを開示している。意図される主要な使用は呼吸器系疾患の処置であるが、癌の処置も挙げられている。
ＷＯ０１／０２３８５(Aventis Crop Science)は、殺真菌薬としての１−（キノリン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール誘導体を開示している。合成中間体として、１−非置換ピラゾールが開示されている。
ＷＯ２００４／０３９７９５(Fujisawa)は、アポリポタンパク質Ｂ分泌の阻害剤としての、１−置換ピラゾール基を含むアミドを開示している。これらの化合物は高脂血症のような症状を処置するのに有用であると述べられている。
ＷＯ２００４／０００３１８(Cellular Genomics)は、キナーゼモジュレーターとしての種々のアミノ置換単環を開示している。例示されている化合物にはピラゾールはない。
本発明は、とりわけ、化合物４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩、およびその酸付加塩の結晶形、特に、メタンスルホン酸塩および酢酸塩を提供する。
本発明はまた、当該化合物、その酸付加塩およびその結晶形を製造するための新規な方法、ならびにそれらの方法で用いるための新規な化学中間体も提供する。
本発明はさらに、当該化合物およびその酸付加塩の治療的使用、ならびに４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの類似体の新規な治療的使用を提供する。
よって、第１の態様において、本発明は、４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩（この塩は塩酸塩以外である）を提供する。
塩が誘導される４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの遊離塩基は式（Ｉ）：
Figure 2008528470
 （Ｉ）
を有する。
式（Ｉ）の化合物は、本願では、その化学名により、または便宜上、「当該化合物」、「式（Ｉ）の化合物」または「本発明の化合物」と呼ぶ。これらの同義語は各々、上記の式（Ｉ）で示され、化学名４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの化合物を指す。
本願が関わる塩は、４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩である。「塩」および「酸付加塩」という用語は、本願においては互換的に用いられ、その複数形も同様である。本明細書において「塩」とは、特に断りのない限り酸付加塩を指す。
化合物４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドおよびその酸付加塩という場合には、それらの範囲内にその全ての溶媒和物、互変異性体および同位体、ならびに文脈上適当であれば、Ｎ−オキシド、他のイオン形およびプロドラッグを含む。
酸付加塩は、酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸（例えば、Ｌ−アスコルビン酸）、アスパラギン酸（例えば、Ｌ−アスパラギン酸）、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、樟脳酸（例えば、（＋）樟脳酸）、カプリン酸、カプリル酸、炭酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデカン酸、ドデシル硫酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチジン酸、グルコヘプトン酸、Ｄ−グルコン酸、グルクロン酸（例えば、Ｄ−グルクロン酸）、グルタミン酸（例えば、Ｌ−グルタミン酸）、α−オキソグルタル酸、グリコール酸、馬尿酸、イセチオン酸、イソ酪酸、乳酸（例えば、（＋）−Ｌ−乳酸および（±）−ＤＬ−乳酸）、ラクトビオン酸、ラウリルスルホン酸、マレイン酸、リンゴ酸、（−）−Ｌ−リンゴ酸、マロン酸、メタンスルホン酸、粘液酸、ナフタレンスルホン酸（例えば、ナフタレン−２−スルホン酸）、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、ニコチン酸、オレイン酸、オロチン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、リン酸、プロピオン酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸（例えば、（＋）−Ｌ−酒石酸）、チオシアン酸、トルエンスルホン酸（例えば、ｐ−トルエンスルホン酸）、吉草酸およびキナホ酸(xinafoic acid)からなる群から選択される酸により形成される塩から選択され得る。
酸付加塩の１つのサブグループとしては、酢酸、アジピン酸、アスコルビン酸（例えば、Ｌ−アスコルビン酸）、アスパラギン酸（例えば、Ｌ−アスパラギン酸）、カプロン酸、炭酸、クエン酸、ドデカン酸、フマル酸、ガラクタル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸（例えば、Ｄ−グルコン酸）、グルクロン酸（例えば、Ｄ−グルクロン酸）、グルタミン酸（例えば、Ｌ−グルタミン酸）、グリコール酸、馬尿酸、乳酸（例えば、（＋）−Ｌ−乳酸および（±）−ＤＬ−乳酸）、マレイン酸、パルミチン酸、リン酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸（例えば、（＋）−Ｌ−酒石酸）およびチオシアン酸からなる群から選択される酸により形成される塩を含む。
より詳しくは、これらの塩は、メタンスルホン酸および酢酸、およびそれらの混合物から選択される酸により形成された酸付加塩である。
一実施形態では、この塩は、メタンスルホン酸により形成された酸付加塩である。
もう１つの実施形態では、この塩は、酢酸により形成された酸付加塩である。
便宜上、メタンスルホン酸および酢酸により形成されたこれらの塩は、本明細書ではそれぞれメタンスルホン酸塩、またはメシル酸塩および酢酸塩と呼ぶ。
固体状態において、本発明の塩は、結晶性または非晶質またはその混合物であり得る。
一実施形態では、これらの塩は非晶質である。
非晶質固体において、結晶形に通常存在する三次元構造は存在せず、非晶質形における分子の互いの相対的な位置は本質的にランダムである（例えば、Hancock et al. J. Pharm. Sci. (1997), 86, 1参照）。
もう１つの実施形態では、これらの塩は実質的に結晶性であり、すなわち、５０％〜１００％結晶性であり、より詳しくは少なくとも５０％結晶性、または少なくとも６０％結晶性、または少なくとも７０％結晶性、または少なくとも８０％結晶性、または少なくとも９０％結晶性、または少なくとも９５％結晶性、または少なくとも９８％結晶性、または少なくとも９９％結晶性、または少なくとも９９．５％結晶性、または少なくとも９９．９％結晶性、例えば１００％結晶性であり得る。
さらなる実施形態では、これらの塩は、５０％〜１００％結晶性である塩、少なくとも５０％結晶性である塩、少なくとも６０％結晶性である塩、少なくとも７０％結晶性である塩、少なくとも８０％結晶性である塩、少なくとも９０％結晶性である塩、少なくとも９５％結晶性である塩、少なくとも９８％結晶性である塩、少なくとも９９％結晶性である塩、少なくとも９９．５％結晶性である塩、および少なくとも９９．９％結晶性、例えば１００％結晶性である塩からなる群から選択される。
より好ましくは、これらの塩は、９５％〜１００％結晶性、例えば少なくとも９８％結晶性、または少なくとも９９％結晶性、または少なくとも９９．５％結晶性、または少なくとも９９．６％結晶性、または少なくとも９９．７％結晶性、または少なくとも９９．８％結晶性、または少なくとも９９．９％結晶性、例えば１００％結晶性である塩であり得る（またはそれらからなる群から選択され得る）。
実質的に結晶性の塩の一例として、メタンスルホン酸により形成された結晶性塩がある。
実質的に結晶性の塩の別の例として、酢酸により形成された結晶性塩がある。
本発明の塩は、固体状態において、溶媒和（例えば、水和）型であっても非溶媒和（例えば、無水）型であってもよい。
一実施形態では、これらの塩は非溶媒和（例えば、無水）型である。非溶媒和型の塩の一例として、本明細書で定義されるメタンスルホン酸により形成された結晶性塩がある。
本明細書において「無水」とは、塩（例えば、塩の結晶）の上部または内部に水がいくらか存在する可能性を排除するものではない。例えば、塩（例えば、塩の結晶）の表面にいくらかの水が存在していてもよく、あるいは塩本体（例えば、結晶）の内部に微量存在していてもよい。典型的には、無水形は、化合物１分子当たり０．４分子未満の水しか含まず、より好ましくは、化合物１分子当たり０．１分子未満の水しか含まず、例えば、０分子の水である。
もう１つの実施形態では、これらの塩は溶媒和型である。これらの塩が水和型である場合、それらは例えば３分子までの結晶水、より一般的には２分子までの水、例えば、１分子の水または２分子の水を含むことができる。また、存在する水分子の数が１より少ない、あるいはそうでなければ整数でない、非化学量論的水和物も形成され得る。例えば、存在する水が１分子未満である場合、例えば、化合物１分子当たり０．５、または０．６、または０．７、または０．８、または０．９分子の水が存在し得る。
他の溶媒和物としては、エタノレートおよびイソプロパノレートなどのアルコレートが挙げられる。
本発明の塩は、親化合物である４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドから、Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P. Heinrich Stahl (Editor), Camille G. Wermuth (Editor), ISBN: 3-90639-026-8, Hardcover, 388 pages, August 2002に記載の方法などの通常の化学法によって合成することができる。一般に、このような塩は、親化合物である４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドと適当な酸を水中、または有機溶媒中、または両者の混合物中で反応させることにより製造することができ、一般には、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルなどの非水性媒体が用いられる。
別の態様では、本発明は、４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩を製造する方法であって、溶媒（典型的には、有機溶媒）または溶媒混合物中で４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミド遊離塩基の溶液を形成させること、およびその溶液を酸で処理して酸付加塩の沈殿を形成させることを含む方法を提供する。
この酸は、遊離塩基が溶解される溶媒と混和性の溶媒中の溶液として加えることができる。この遊離塩基がまず溶解される溶媒は、その酸付加塩が不溶である溶媒であってもよい。あるいは、この遊離塩基がまず溶解される溶媒は、その酸付加塩が少なくとも部分的に溶解する溶媒であってもよく、塩が溶液から沈殿するように、その酸付加塩の溶解度が実質的に低い異なる溶媒が添加される。
酸付加塩を形成させる別法では、揮発酸と場合により補助溶媒を含む溶媒に４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミド遊離塩基を溶解させ、それにより揮発酸による酸付加塩の溶液を形成し、得られた溶液を濃縮または蒸発させて塩を単離することを含む。このようにして製造可能な酸付加塩の一例として、酢酸塩がある。
別の態様では、本発明は、本明細書で定義される４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩を形成させる方法であって、式（Ｘ）：
Figure 2008528470
 （Ｘ）
の化合物を有機溶媒中、塩酸以外の、本明細書で定義される有機酸または無機酸で処理してｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基を除去し、その有機酸または無機酸による４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩を形成させ、場合により、このようにして形成された酸付加塩を単離することを含む方法を提供する。
この塩は典型的には、塩が形成された際にその有機溶媒から沈殿し、従って、例えば濾過などによって溶液から固体を分離することにより単離することができる。
本発明のある塩形態は、当業者に周知の方法により、遊離塩基へと、また、場合により別の塩形態へと変換することができる。例えば、遊離塩基は、塩溶液を、アミン固定相を含むカラム（例えば、Ｓｔｒａｔａ−ＮＨ２カラム）に通すことにより形成させることができる。あるいは、塩の水溶液を重炭酸ナトリウムで処理して塩を分解し、遊離塩基を沈殿させることができる。次に、前記または本明細書の他所に記載の方法の１つにより、この遊離塩基を別の酸と合わせればよい。
酸付加塩などの塩は、対応する遊離塩基に優るいくつかの利点を有する。例えば、これらの塩は、遊離塩基に優る次のような利点の１以上を享受する：
・溶解度が高いので、静脈投与（例えば、点滴による）により良好であること、
・安定性がより良いこと（例えば、保存寿命の向上）、
・熱安定性がより良いこと、
・塩基性が弱いので、静脈投与により良いこと、
・製造上の利点があること、
・より良い物理化学特性を有すること、
・抗癌活性が向上すること、および
・治療指数が向上すること。
メタンスルホン酸塩形態は、高温および高い相対湿度条件で安定性が良く、非吸湿性（本明細書で定義される）であり、多型および水和物の形成がなく、かつ、水性条件下で安定であるために特に有利である。さらに、このメタンスルホン酸塩形態は、他の塩よりも、優れた水溶性を有し、良好な物理化学的特性（高融点など）を有する。
本明細書において「安定な」または「安定性」とは、化学安定性および固体（物理的）安定性を含む。「化学安定性」は、化合物が単離形態で、または例えば、本明細書に記載の医薬上許容される担体、希釈剤またはアジュバントと混合して提供される製剤の形態で、通常の保存条件下、ほとんど、または全く化学分解または分解なく保存できることを意味する。「固体安定性」は、化合物が単離された固体形態、または例えば、本明細書に記載の医薬上許容される担体、希釈剤またはアジュバントと混合して提供される固体製剤の形態で、通常の保存条件下、ほとんど、または全く固体の変質（例えば、水和、脱水、溶媒和(solvatisation)、脱溶媒和(desolvatisation)、結晶化、再結晶化または固体相転移）なく保存できることを意味する。
本明細書において「非吸湿性の」および「非吸湿性」および関連の用語は、高い相対湿度、例えば、９０％の相対湿度の条件に曝された際に５重量％未満（それらの固有の重量に対して）の水しか吸収せず、かつ／または高湿度条件で結晶形に変化をきたさず、かつ／または高い相対湿度条件で結晶本体に水（内部水）を吸収しない物質を指す。
液体（例えば、水性）医薬組成物の製造に用いるために好ましい塩は、所与の液体担体（例えば、水）中の溶解度が１５ｍｇ／液体担体（例えば、水）ｍｌを超える、より典型的には２０ｍｇ／ｍｌを超える、好ましくは２５ｍｇ／ｍｌを超える、より好ましくは３０ｍｇ／ｍｌを超える酸付加塩（本明細書で定義されるメシル酸塩および酢酸塩およびそれらの混合物）である。
別の態様では、−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩（本明細書で定義されるメシル酸塩および酢酸塩およびそれらの混合物、好ましくはメシル酸塩など）を、１５ｍｇ／ｍｌを超える、典型的には２０ｍｇ／ｍｌを超える、好ましくは２５ｍｇ／ｍｌを超える、より好ましくは３０ｍｇ／ｍｌを超える濃度で含有する水溶液を含む医薬組成物を提供する。
好ましい実施形態では、該医薬組成物は、酢酸塩またはメタンスルホン酸塩またはそれらの混合物から選択される４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩を、１５ｍｇ／ｍｌを超える、典型的には２０ｍｇ／ｍｌを超える、好ましくは２５ｍｇ／ｍｌを超える、より好ましくは３０ｍｇ／ｍｌを超える濃度で含有する水溶液を含む。
別の態様では、本発明は、４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩（本明細書で定義されるメシル酸塩および酢酸塩およびそれらの混合物）の水溶液を提供し、その水溶液のｐＨは２〜１２、例えば２〜９、より詳しくは４〜７である。
上記で定義された水溶液において、酸付加塩は本明細書に記載のいずれの塩であってもよいが、好ましい一実施形態では、本明細書で定義されるメシル酸塩または酢酸塩、特にメシル酸塩である。
本発明はまた、１以上の対イオンと場合により１以上のさらなる対イオンとともにプロトン型の４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの水溶液も提供する。一実施形態では、これらの対イオンの１つは、メタンスルホン酸および酢酸から選択される。もう１つの実施形態では、これらの対イオンの１つは、酢酸塩などの本明細書に記載の調剤バッファーからのものである。さらなる実施形態では、塩素イオン（例えば、生理食塩水に由来するもの）などの１以上のさらなる対イオンが存在し得る。
よって、本発明は、メタンスルホン酸イオンおよび酢酸イオンから選択される１以上の対イオンおよび場合により塩素イオンなどの１以上のさらなる対イオンとともにプロトン型の４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの水溶液を提供する。
１個を超える対イオンが存在する場合、プロトン型の４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの水溶液は、対イオンの混合物、例えば、メタンスルホン酸対イオンと酢酸対イオンの混合物と場合により塩素イオンなどの１以上のさらなる対イオンを含む可能性がある。
よって、本発明は、メタンスルホン酸イオンおよび酢酸イオンから選択される１以上の対イオンと、場合により塩素イオンなどの１以上のさらなる対イオン、およびそれらの混合物とともに、プロトン型の４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの水溶液を提供する。
これらの水溶液は、とりわけ、メシル酸塩を酢酸イオンの溶液（例えば、酢酸バッファー）に溶解させることにより、または酢酸塩をメシル酸イオンの溶液に溶解させることにより形成させることができる。メシル酸イオンおよび酢酸イオンは溶液中に、メシル酸イオン：酢酸イオン１０：１未満、例えば１０：１〜１：１０、より好ましくは８：１未満、または７：１未満、または６：１未満、または５：１未満、または４：１未満、または３：１未満、または２：１未満、または１：１未満、より詳しくは１：１〜１：１０の比で存在し得る。一実施形態では、メシル酸イオンおよび酢酸イオンは溶液中に、メシル酸イオン：酢酸イオン１：１〜１：１０、例えば１：１〜１：８、または１：１〜１：７、または１：１〜１：６、または１：１〜１：５、例えば約１：４．８の比で存在する。
これらの塩の水溶液は緩衝されていてもされていなくてもよいが、一実施形態では緩衝されている。
メタンスルホン酸により形成された酸付加塩の場合、好ましいバッファーは、酢酸と酢酸ナトリウムからなる、例えば、ｐＨ約４．６の溶液のバッファーである。このｐＨにおいて酢酸バッファーでは、メタンスルホン酸塩の溶解度は約３５ｍｇ／ｍｌである。
本発明の塩は典型的には医薬上許容される塩であり、医薬上許容される塩の例は、Berge et al., 1977, “Pharmaceutically acceptable salts”, J. Pharm. Sci., Vol. 66, pp. 1-19に述べられている。しかしながら、医薬上許容されない塩も中間形態として製造されてよく、これらはその後医薬上許容される塩へと変換することができる。従って、このような医薬上許容されない塩の形態も本発明の一部をなす。
化合物４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドはまた、Ｎ−オキシドを形成し得る。Ｎ−オキシドは、対応するアミンを過酸化水素または過酸（例えば、ペルオキシカルボン酸）などの酸化剤で処理することにより形成させることができる（例えば、Advanced Organic Chemistry, by Jerry March, 4th Edition, Wiley Interscience, pages参照）。より詳しくは、Ｎ−オキシドは、L. W. Deadyの手順(Syn. Comm. 1977, 7, 509-514)により製造することができ、ここでは、アミン化合物が、例えば、ジクロロメタンなどの不活性溶媒中、ｍ−クロロペルオキシ安息香酸（ＭＣＰＢＡ）と反応される。
本発明の酸付加塩が誘導される化合物４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの塩はいくつかの異なる互変異性形で存在してもよく、本願において化合物という場合には、このような全ての形態を含む。
より詳しくは、本発明の酸付加塩において、４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドのピラゾール環は、以下の２つの互変異性形ＡおよびＢで存在し得る。簡略化のため、本願の式はＡ型のみを示すが、これらの式はやはり双方の互変異性形を包含するものとみなされる。
Figure 2008528470
さらに、本発明の酸付加塩に関して、４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドおよびその塩という場合には、１以上の同位体置換を有する変形も含み、特定の元素を指す場合には、その範囲内にその元素の全ての同位体を含む。例えば、水素という場合には、その範囲内に１Ｈ、２Ｈ（Ｄ）、および３Ｈ（Ｔ）を含む。同様に、炭素および酸素という場合には、それらの範囲内にそれぞれ１２Ｃ、１３Ｃおよび１４Ｃと１６Ｏおよび１８Ｏを含む。
これらの同位体は放射性であっても非放射性であってもよい。本発明の一実施形態では、これらの化合物は、非放射性同位体を含む。このような化合物は治療的使用に好ましい。しかしながら、別の実施形態では、この化合物は１以上の放射性同位体を含んでもよい。このような放射性同位体を含む化合物は診断関連で有用であり得る。
また、４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩（例えば、メシル酸塩）という場合には、そのいずれの多型、溶媒和物（例えば、水和物）、複合体（例えば、シクロデキストリンなどの化合物との包接複合体もしくは包接体、または金属との錯体）も包含する。
４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩の結晶構造
上記のように、４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩は非晶質であっても実質的に結晶性であってもよい。ある特定の実施形態では、これらの塩は実質的に結晶性であり、「実質的に結晶性」とは上記で定義された意味を有する。特に、４−（２，６−ジクロロベンゾイル−アミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドのメシル酸塩および酢酸塩は実質的に結晶性である。
本明細書に記載の結晶およびそれらの結晶構造は、本発明のさらなる態様をなす。
結晶およびそれらの結晶構造は、単結晶Ｘ線結晶学、Ｘ線粉末回折（ＸＲＰＤ）、示差走査熱分析法（ＤＳＣ）および赤外線分光法、例えば、フーリエ変換赤外線分光法（ＦＴＩＲ）を含むいくつかの技術を用いて特徴付けることができる。種々の湿度条件下での結晶の挙動は、重量測定蒸気吸収試験、また、ＸＲＰＤにより分析することができる。
化合物の結晶構造の決定は、本明細書に、また、Fundamentals of Crystallography, C. Giacovazzo, H. L. Monaco, D. Viterbo, F. Scordari, G. Gilli, G. Zanotti and M. Catti, (International Union of Crystallography/Oxford University Press, 1992 ISBN 0-19-855578-4 (p/b), 0-19-85579-2 (h/b))に記載されているものなどの常法に従って実施可能なＸ線結晶学により行うことができる。この技術は、単結晶のＸ線回折の分析および解釈を含む。
４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドのメタンスルホン酸塩の結晶構造は、Ｘ線結晶学によって決定された（下記実施例２参照）。
表２は、４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドメシル酸塩の結晶の座標データを、Crystallographic Information File（ＣＩＦ）形式で示したものである（Hall, Allen and Brown, Acta Cryst. (1991). A47, 655-685; http://www.iucr.ac.uk/iucr-top/cif/home.html参照）。ＰＤＢファイル形式などの別のファイル形式（例えば、EBI Macromolecular Structure Database(Hinxton, UK）と一致する形式）も使用可能であり、他の当業者によれば好ましい。しかし、これらの表の座標を提供または操作するための別のファイル形式の使用も本発明の範囲内にあることは明らかである。メシル酸塩の結晶構造は図１および２に示されている。
Ｘ線結晶学研究から、このメシル酸塩はＰｂｃａ（＃６１）などの斜方晶系空間群に属す結晶構造を有し、９３Ｋにおいてａ＝８．９０（１０）、ｂ＝１２．４４（１０）、ｃ＝３８．４９（４）Å、α＝β＝γ＝９０°の結晶格子パラメーターを有することが判明した。
よって、もう１つの実施形態では、本発明は、
結晶性であり、かつ、
（ａ）図１および２で示される結晶構造を有し；かつ／または
（ｂ）本明細書の実施例２の座標で定義される結晶構造を有し；かつ／または
（ｃ）９３Ｋにおいてａ＝８．９０（１０）、ｂ＝１２．４４（１０）、ｃ＝３８．４９（４）Å、α＝β＝γ＝９０°の結晶格子パラメーターを有し；かつ／または
（ｄ）Ｐｂｃａ（＃６１）などの斜方晶系空間群に属す結晶構造を有する、
４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドのメタンスルホン酸塩を提供する。
あるいは、化合物の結晶構造は、Ｘ線粉末回折（ＸＲＰＤ）の固体技術により分析することもできる。ＸＲＰＤは、本明細書（実施例６参照）、およびIntroduction to X-ray Powder Diffraction, Ron Jenkins and Robert L. Snyder (John Wiley & Sons, New York, 1996)に記載のものなどの常法に従って行うことができる。ＸＲＰＤ回折図に所定のピーク（ランダムバックグラウンドノイズに対して）が存在することで、その化合物がある結晶度を有することが示される。
化合物のＸ線粉末図は、Ｘ線回折スペクトルの回折角（２θ）と面間距離（ｄ）パラメーターにより特徴付けられる。これらには、ブラッグの方程式ｎλ＝２ｄ Ｓｉｎ θ（式中、ｎ＝１；λ＝用いる陰極の波長；ｄ＝面間距離；およびθ＝回折角）の関係がある。ここで、面間距離、回折角および全体図は、データの特徴付けによるＸ線粉末回折における結晶の同定に重要である。相対強度は、結晶成長の方向、粒径および測定条件によって異なることがあるため、厳密な解釈ができない。さらに、回折角は通常、２θ±０．２°の範囲で一致するものを意味する。ピークは主要ピークを意味し、上述のもの以外の回折角で、媒体よりも大きくないピークを含む。
４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酢酸塩とメタンスルホン酸塩の双方がＸＲＰＤにより特徴付けられた。
４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドメタンスルホン酸塩は、実質的に図３で示されるＸ線粉末回折像を有する。
４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミド酢酸塩は、実質的に図４で示されるＸ線粉末回折像を有する。
各場合において、粉末Ｘ線回折像は、回折角（２θ）、面間距離（ｄ）および相対強度に関して表される。
よって、もう１つの実施形態では、本発明は、表Ａで示される回折角（２θ）における主要ピークの存在および面間距離（ｄ）により特徴付けられるＸ線粉末回折像を有する、４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの、実質的に結晶性のメタンスルホン酸塩を提供する。
Figure 2008528470
Ｘ線粉末回折像は好ましくは、表Ｂで示される回折角（２θ）におけるさらなるピークの存在および面間距離（ｄ）によりさらに特徴付けられる。
Figure 2008528470
Ｘ線粉末回折像はまた、表Ｃで示される回折角（２θ）におけるピークの存在および面間距離（ｄ）、および好ましくは強度により特徴付けることもできる。
Figure 2008528470
本発明はさらに、図３で示されるＸ線粉末回折像と同じ回折角においてピークを示す、４−（２，６−ジクロロベンゾイル−アミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの実質的に結晶性のメタンスルホン酸塩を提供する。好ましくは、これらのピークは図３のピークと同じ相対強度を有する。
好ましい実施形態では、本発明は、実質的に図３で示されるＸ線粉末回折像を有する、４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの実質的に結晶性のメタンスルホン酸塩を提供する。
本発明はまた、図４で示されるＸ線粉末回折像と同じ回折角においてピークを示す、４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの実質的に結晶性の酢酸塩も提供する。好ましくは、これらのピークは、図４のピークと同じ相対強度を有する。
好ましい実施形態では、本発明は、実質的に図４で示されるＸ線粉末回折像を有する、４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの実質的に結晶性の酢酸塩を提供する。
本発明の結晶性酸付加塩はまた、示差走査熱分析（ＤＳＣ）により特徴付けることもできる。
メシル酸塩は、ＤＳＣにより分析したところ、化合物の分解により３７９．８℃にピークを示す。
よって、別の態様において、本発明は、無水であり、かつ、ＤＳＣを行った際に３７９〜３８０℃、例えば、３７９．８℃において吸熱ピークを示す、４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドのメシル酸塩を提供する。
酢酸塩は、ＤＳＣにより分析したところ、酢酸の損失により２３１．５０℃におけるピークと、化合物の分解により２９２．８８℃におけるピークを示す。低温にピークが存在しないことで、この酢酸塩は無水であることが示される。
よって、別の態様において、本発明は、無水であり、かつ、ＤＳＣを行った際に２３１〜２３２℃（例えば、２３１．５０℃）および２９２〜２９３℃（例えば、２９２．８８℃）において発熱ピークを示す、４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酢酸塩を提供する。
４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩が実質的に結晶性である場合、１つの単結晶形が優勢となり得るが、他の結晶形も微量、好ましくは、無視できる量で存在し得る。
好ましい実施形態では、本発明は、酸付加塩の単結晶形と、５重量％以下の酸付加塩の他の結晶形を含有する、４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの、実質的に結晶性の酸付加塩（例えば、本明細書で定義されるメシル酸塩または酢酸塩）を提供する。
好ましくは、この単結晶形には、４重量％未満、または３重量％未満、または２重量％未満の他の結晶形が伴い、特に、約１重量％以下の他の結晶形を含む。より好ましくは、この単結晶形には、０．９重量％未満、または０．８重量％未満、または０．７重量％未満、または０．６重量％未満、または０．５重量％未満、または０．４重量％未満、または０．３重量％未満、または０．２重量％未満、または０．１重量％未満、または０．０５重量％未満、または０．０１重量％未満の他の結晶形、例えば、０重量％の他の結晶形が伴う。
実質的に結晶性の酸付加塩は好ましくは、例えば、塩を再結晶させるかそれ以外の方法で精製するために用いる残留有機溶媒、または水などの他の溶媒を実質的に含まない。
よって、一実施形態では、４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩（例えば、メタンスルホン酸塩または酢酸塩）の結晶は、１０重量％未満の残留溶媒（例えば、水または有機溶媒）、例えば、５重量％未満の残留溶媒、例えば、４重量％未満、または３重量％未満、または２重量％未満、または１重量％未満、または０．５重量％未満の溶媒しか含まない結晶である。
一実施形態では、これらの結晶性酸付加塩（例えば、メタンスルホン酸塩または酢酸塩）は無水であり、「無水」とは、前記で定義された意味を有する。
メタンスルホン酸塩は、高い相対湿度条件下でいくらかの表面水を吸収するが、このような条件下で結晶構造に変化をきたさない安定な無水結晶形で存在し得る。
高湿度条件下での本発明の酸付加塩の挙動は、例えば実施例７に記載されるような、標準的な重量測定蒸気吸収（ＧＶＳ）法により分析することができる。
本発明の酸付加塩は、さらに赤外線分光法、例えば、ＦＴＩＲにより特徴付けることができる。
メタンスルホン酸塩の赤外線スペクトル（ＫＢｒディスク法）は、３２３３、３００２、２８２９、１６７９、１６３２、１５６０、１４３０、１１９８、１０３７、９０９および７８４ｃｍ−１に特徴的なピークを含む。
よって、さらなる実施形態において、本発明は、ＫＢｒディスク法を用いて分析した場合に３２３３、３００２、２８２９、１６７９、１６３２、１５６０、１４３０、１１９８、１０３７、９０９および７８４ｃｍ−１に特徴的なピークを含む赤外線スペクトルを示す、４−（２，６−ジクロロベンゾイル−アミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの（好ましくは、実質的に結晶性の）メタンスルホン酸塩を提供する。
全段から明らかなように、本発明の酸付加塩は、いくつかの異なる物理化学的パラメーターにより特徴付けることができる。よって、好ましい実施形態において、本発明は、結晶性であり、かつ、次のパラメーター、すなわち、該塩が、
（ａ）図１および２で示される結晶構造を有すること；および／または
（ｂ）本明細書の実施例２の座標で定義される結晶構造を有すること；および／または
（ｃ）９３Ｋにおいてａ＝８．９０（１０）、ｂ＝１２．４４（１０）、ｃ＝３８．４９（４）Å、α＝β＝γ＝９０°の結晶格子パラメーターを有すること；および／または
（ｄ）Ｐｂｃａ（＃６１）などの斜方晶系空間群に属す結晶構造を有すること；および／または
（ｅ）表Ａ、場合により表Ｂ、で示される回折角（２θ）における主要ピークの存在と面間距離（ｄ）により特徴付けられるＸ線粉末回折像（例えば、このＸ線粉末回折像は、本明細書の表Ｃで示される回折角（２θ）における主要ピークの存在、面間距離（ｄ）および強度により特徴付けられる）を有すること；および／または
（ｆ）図３で示されるＸ線粉末回折像の場合と同じ回折角においてピークを示す（好ましくは、このピークは図３のピークと同じ相対強度を有する）こと；および／または
（ｇ）実質的に図３で示されるＸ線粉末回折像を有すること；および／または
（ｈ）無水であり、かつ、ＤＳＣを行った際に３７９〜３８０℃、例えば、３７９．８℃において吸熱ピークを示すこと；および／または
（ｉ）ＫＢｒディスク法を用いて分析した場合に、３２３３、３００２、２８２９、１６７９、１６３２、１５６０、１４３０、１１９８、１０３７、９０９および７８４ｃｍ−１において特徴的なピークを含む赤外線スペクトルを示すこと
うちいずれか１以上（組合せは問わない）または全てにより特徴付けられる、４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドメシル酸塩のメタンスルホン酸塩を提供する。
４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの製造方法
本発明者らの先願第ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００３１７９号（ＷＯ２００５／０１２２５６）の実施例２３７には、４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドが、
（ｉ）ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中、１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）の存在下で、４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸と４−アミノ−１−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−ピペリジンを反応させてＮ−Ｂｏｃ保護型の４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドを得ること、および
（ｉｉ）このＢｏｃ保護基を塩酸処理により除去すること
を含む一連のステップにより製造できることが開示されている。
今般、アミド結合の形成を促進するためにＥＤＣおよびＨＯＢｔを用いる代わりに、４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸の酸塩化物を、そのピペリジン窒素が保護されている４−アミノピペリジンと反応させ得ることが分かった。
よって、別の態様において、本発明は、４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドまたはその塩を製造する方法であって、式（ＸＩ）：
Figure 2008528470
 （ＸＩ）
の化合物と式（ＸＩＩ）：
Figure 2008528470
 （ＸＩＩ）
（式中、ＰＧはアミン保護基である）を、有機溶媒中、トリエチルアミンなどの非干渉塩基の存在下で反応させて、式（ＸＩＩＩ）：
Figure 2008528470
 （ＸＩＩＩ）
の化合物を得、その後、この保護基ＰＧを除去して４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドまたはその塩を得ること、および場合によりその塩を再結晶させて結晶形、例えば、本明細書で定義される酸付加塩の結晶形を得ることを含む方法を提供する。
アミン保護基ＰＧは、上記の方法で用いる条件下でアミン基の保護に用いるために知られているいずれの保護基であってもよい。保護基の例ならびに官能基を保護および脱保護する方法は、Protective Groups in Organic Synthesis (T. Green and P. Wuts; 3rd Edition; John Wiley and Sons, 1999)に見出すことができる。よって、例えば、ピペリジン環窒素は、アミド（ＮＣＯ−Ｒ）またはウレタン（ＮＣＯ−ＯＲ）として、例えば、メチルアミド（ＮＣＯ−ＣＨ３）、ベンジルオキシアミド（ＮＣＯ−ＯＣＨ２Ｃ６Ｈ５，−ＮＨ−Ｃｂｚ）、ｔｅｒｔ−ブトキシアミド（−ＮＣＯ−ＯＣ（ＣＨ３）３，Ｎ−Ｂｏｃ）、２−ビフェニル−２−プロポキシアミド（ＮＣＯ−ＯＣ（ＣＨ３）２Ｃ６Ｈ４Ｃ６Ｈ５，Ｎ−Ｂｐｏｃ）、９−フルオレニルメトキシアミド（Ｎ−Ｆｍｏｃ）、６−ニトロベラトリルオキシアミド（Ｎ−Ｎｖｏｃ）、２−トリメチルシリルエチルオキシアミド（Ｎ−Ｔｅｏｃ）、２，２，２−トリクロロエチルオキシアミド（Ｎ−Ｔｒｏｃ）、アリルオキシアミド（Ｎ−Ａｌｌｏｃ）、または２−（フェニルスルホニル）エチルオキシアミド（−Ｎ−Ｐｓｅｃ）として保護することができる。アミンの他の保護基としては、トルエンスルホニル（トシル）およびメタンスルホニル（メシル）基、ならびにパラ−メトキシベンジル（ＰＭＢ）基などのベンジル基が挙げられる。好ましいアミン保護基はウレタン（ＮＣＯ−ＯＲ）、例えば、ベンジルオキシアミド（ＮＣＯ−ＯＣＨ２Ｃ６Ｈ５，−ＮＨ−Ｃｂｚ）、またはｔｅｒｔ−ブトキシアミド（−ＮＣＯ−ＯＣ（ＣＨ３）３，Ｎ−Ｂｏｃ）、アリルオキシアミド（Ｎ−Ａｌｌｏｃ）またはパラ−メトキシベンジル（ＰＭＢ）基である。特に好ましい保護基ＰＧは、酸性条件下で除去可能なｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルである。
保護基ＰＧが酸性条件下で除去可能なものである場合、保護基ＰＧを除去するために選択される酸は、特定の塩形態で４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドを提供するように選択することができる。よって、例えば、保護基がＢｏｃ基である場合、塩酸を用いてＢｏｃ保護基を開裂させ、４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの塩酸塩を提供することができる。あるいは、また、より好ましくは、メタンスルホン酸を用いてＢｏｃ基を開裂させ、４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドのメタンスルホン酸塩を生成することができる。
本発明はまた、本明細書で定義された条件下で式（ＸＩ）の化合物と式（ＸＩＩ）の化合物を反応させることにより、式（ＸＩＩＩ）の中間体を製造する方法も提供する。
本発明はさらに、それ自体式（ＸＩ）の新規な化学中間体を提供する。
別の態様において、本発明は、４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドまたはその塩を製造する方法であって、
（ｉ）式（ＸＩＶ）：
Figure 2008528470
 （ＸＩＶ）
の化合物と塩化チオニルを、非プロトン性有機溶媒中、場合により加熱しながら反応させること；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の生成物と式（ＸＩＩ）の化合物を、トリエチルアミンなどの非干渉塩基の存在下、場合により加熱しながら反応させて、式（ＸＩＩＩ）の化合物を得ること；および
（ｉｉｉ）式（ＸＩＩＩ）の化合物から保護基ＰＧを除去して４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドまたはその塩を得ること；および場合により、
（ｉｖ）その塩を再結晶させて結晶形、例えば、本明細書で定義される結晶形を得ること
を含む方法を提供する。
ステップ（ｉ）では、塩化チオニルとの反応は、例えば、８０〜１００℃の範囲の温度まで加熱しながら実施することができる。ステップ（ｉ）が実施される溶媒は非プロトン性有機溶媒であり、例えば、トルエンなどの芳香族炭化水素溶媒であり得る。ステップ（ｉ）において、例えば出発材料（ＸＩＶ）の消失により判断されるように、反応が完了した後、例えば減圧下で蒸発させることにより有機溶媒を除去して残渣を得、これをさらに例えば共沸乾燥により乾燥させて残渣を得ることができる。次に、この残渣をステップ（ｉｉ）において式（ＸＩＩ）の化合物と反応させればよい。
ステップ（ｉｉ）では、非干渉塩基を用いる。本明細書において「非干渉塩基」とは、酸（ＸＩＩＩ）または酸塩化物（ＸＩ）とアミドを形成しない、トリエチルアミンなどの塩基を意味する。
ステップ（ｉｉ）は典型的には穏和な加熱、例えば、約５５℃まで、より典型的には５０℃までの温度、例えば、４５℃〜５０℃の範囲の温度で実施される。
ステップ（ｉｉ）では、反応は、テトラヒドロフランなどの極性非プロトン性溶媒中で実施することができる。
ステップ（ｉｉｉ）では、保護基は、好ましくは、酸処理（この酸は、４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの所望の塩、例えば、メタンスルホン酸塩を生じるように選択される）により除去可能なＢｏｃ基などのものである。
ステップ（ｉｉｉ）の後、生成物を再結晶させ（例えば、溶媒として２−プロパノールを使用）、純度を高めて結晶形を得ることができる。
保護基ＰＧがｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基である場合、任意の再結晶工程は含めずに、この方法のステップ（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）からの全体の収率は８５％を超える。さらに、この方法は、比較的単純かつ安価な試薬および溶媒を使用し、クロマトグラフィーの必要はなく、簡単な再結晶および溶媒洗浄技術だけを用いて９９％を超える純度の生成物が得られるという点で有利である。
４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドおよびその塩の再結晶の方法は、当業者に周知の方法によって実施することができる（例えば、P. Heinrich Stahl (Editor), Camille G. Wermuth (Editor), ISBN: 3-90639-026-8, Handbook of Pharmaceutical Salt: Properties, Selection, and Use, Chapter 8, Publisher Wiley-VCH参照）。有機反応から得られた生成物は、反応混合物から直接単離した場合、純粋であることはほとんどない。化合物（またはその塩）が固体である場合、好適な溶媒からの再結晶により、精製および／または結晶化させることができる。良好な再結晶化溶媒は、高温下では、精製される物質のある程度の量を溶解させ、低温ではその物質を少量しか溶解させてはならない。良好な結晶化溶媒は、低温で不純物を容易に溶かすか、または全く溶かさなくともよい。最後に、この溶媒は精製された生成物から容易に除去されなければならない。これは通常、この溶媒は比較的低融点を有することを意味し、当業者ならば、特定の物質に対する再結晶化溶媒を知っているか、またはその情報が得られない場合は、数種の溶媒を試験することができる。良好な収量の精製生成物を得るには、全ての不純物を溶かす最少量の温溶媒を用いる。実際には、必要量の３〜５％増の溶媒が用いられ、従って、この溶液は飽和していない。不純化合物が、その溶媒に不溶な不純物を含む場合には、次にこれを、濾過の後、その溶液を結晶化させることにより除去することができる。さらに、不純化合物がその化合物には本来含まれない微量の有色物質を含む場合には、この温溶液に少量の脱色活性炭を加え、それを濾過した後、結晶化させることにより除去することができる。通常、結晶化は、溶液を冷却すると自然に起こる。そうでなければ、溶液を室温以下に冷却するか、または純粋な物質の単結晶（種結晶）を加えることにより結晶化を誘導することができる。再結晶化はまた、貧溶媒を用いることで実施し、かつ／またはその収率を至適化することができる。この場合、化合物を高温の適当な溶媒に溶解し、濾過した後、必要な化合物の溶解度が低い付加的溶媒を加えて結晶化を補助する。その後、これらの結晶は、典型的には真空濾過を用いて単離し、洗浄した後、例えば、炉内で、または脱水(desiccation)により乾燥させる。
場合によっては、再結晶化の後も微量のＢｏｃ保護４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドが残留し、本発明の酸付加塩を水、例えば、緩衝溶液に溶解させた際にこれらが沈殿を形成することがある。従って、これらの酸付加塩の水溶液は、例えば、０．５μｍフィルター、または０．４μｍフィルター、または０．３μｍフィルター、またはより好ましくは、０．２μｍフィルターなどのマイクロフィルターで濾過してこのような沈殿を除去することができる。
濾過の代わりとして（または濾過に加えて）、この塩の水溶液を、酸、典型的には、その塩が形成されたものと同じ酸（例えば、メシル酸塩の場合にはメタンスルホン酸）の存在下で加熱してもよい。このさらなる酸処理の結果、残留しているＢｏｃ保護４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドが加水分解され、所望の塩に変換される。
また、下記の実施例で示される溶媒−水性抽出またはクロマトグラフィーも、残留しているＢｏｃ保護化合物の沈殿を除去する、または沈殿の形成を防ぐために使用可能である。
生物活性
化合物４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドおよびその塩は、サイクリン依存性キナーゼの阻害剤である。例えば、これらの化合物は、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＣＤＫ６およびＣＤＫ９、特に、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５およびＣＤＫ９、より詳しくは、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４およびＣＤＫ９から選択されるサイクリン依存性キナーゼの阻害剤である。これらの化合物はまた、ＣＤＫ８およびＣＤＫ１１の阻害剤でもある。
４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドおよびその塩はまた、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ−３）に対する活性も有する。
ＣＤＫおよびグリコーゲンシンターゼキナーゼを調節または阻害するそれらの活性の結果として、４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドおよびその塩は異常に分裂する細胞の細胞周期を停止させる、またはその制御を回復させる手段を提供するのに有用であると期待される。よって、これらの化合物は癌などの増殖性疾患の処置または予防に有用であるものと考えられる。また、これらの化合物は、例えば、ウイルス感染、ＩＩ型またはインスリン依存性真性糖尿病、自己免疫疾患、頭部外傷、脳卒中、癲癇、アルツハイマー病などの神経変性疾患、運動神経疾患、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症およびピック病、例えば、自己免疫疾患および神経変性疾患などの症状の処置に有用であるとも考えられる。
本発明の塩が有用であると考えられる病態および症状の１つのサブグループは、ウイルス感染、自己免疫疾患および神経変性疾患からなる。
ＣＤＫは、細胞周期、アポトーシス、転写、分化およびＣＮＳ機能を調節する役割を果たす。従って、ＣＤＫ阻害剤は、増殖、アポトーシスまたは分化に障害がある、癌などの疾病の処置に有用であり得る。特に、ＲＢ＋ｖｅ腫瘍は、特にＣＤＫ阻害剤に感受性であり得る。ＲＢ−ｖｅ腫瘍もまた、ＣＤＫ阻害剤に感受性があり得る。
阻害できる癌の例としては、限定されるものではないが、癌腫、例えば、膀胱癌、乳癌、結腸癌（例えば、直腸腺癌および直腸腺腫のような結腸直腸癌）、腎臓癌、表皮癌、肝臓癌、肺癌、例えば、腺癌、小細胞性肺癌および非小細胞性肺癌、食道癌、胆嚢癌、卵巣癌、膵臓癌、例えば、外分泌膵臓癌、胃癌、子宮頚癌、甲状腺癌、前立腺癌または皮膚癌、例えば、扁平上皮癌；リンパ系の造血系腫瘍、例えば、白血病、急性リンパ性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリーセルリンパ腫またはバーケットリンパ腫；骨髄系の造血系腫瘍、例えば、急性および慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群または骨髄球性白血病；甲状腺瀘胞癌；間葉由来の腫瘍、例えば、線維肉腫または横紋筋肉種；中枢または末梢神経系の腫瘍、例えば、星状細胞腫、神経芽細胞種、神経膠腫または神経鞘腫；黒色腫；精上皮種；奇形癌；骨肉種；色素性乾皮症；角化棘細胞種；甲状腺濾胞癌；またはカポジ肉腫が挙げられる。
これらの癌は、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６およびＣＤＫ９から選択される１以上のサイクリン依存性キナーゼ、例えば、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４およびＣＤＫ９から選択される１以上のＣＤＫキナーゼ、例えば、ＣＤＫ１および／またはＣＤＫ２の阻害に感受性のある癌であり得る。
ある特定の癌がサイクリン依存性キナーゼによる阻害に感受性があるものであるかどうかは、下記の実施例で示される細胞増殖アッセイの手段によるか、または「診断の方法」の標題で示される方法により判定することができる。
ＣＤＫはまた、アポトーシス、増殖、分化および転写においても役割を果たすことが知られており、従って、ＣＤＫ阻害剤は、癌以外の以下の疾病の処置にも有用である：ウイルス感染、例えば、ヘルペスウィルス、ポックスウィルス、エプスタイン−バーウィルス、シンドビスウィルス、アデノウィルス、ＨＩＶ、ＨＰＶ、ＨＣＶおよびＨＣＭＶ；ＨＩＶ感染個体におけるＡＩＤＳ発現の予防；慢性炎症性疾患、例えば、全身性紅斑性狼瘡、自己免疫介在糸球体腎炎、慢性関節リウマチ、乾癬、炎症性腸疾患および自己免疫性糖尿病；心血管系疾患、例えば、心肥大、再狭窄、アテローム性動脈硬化症；神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病、ＡＩＤＳ関連痴呆、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、脊髄性筋萎縮および小脳変性症；糸球体腎炎；骨髄異形成症候群、虚血傷害関連心筋梗塞、卒中および再灌流障害、不整脈、アテローム性動脈硬化症、毒素誘発またはアルコール関連肝疾患、血液疾患、例えば、慢性貧血および再生不良性貧血；筋骨格系の変性疾患、例えば、骨粗鬆症および関節炎、アスピリン感受性鼻副鼻腔炎、嚢胞性線維症、多発性硬化症、腎疾患および癌性疼痛。
また、いくつかのサイクリン依存性キナーゼ阻害剤は、他の抗癌剤と組み合わせて使用できることが分かった。例えば、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤フラボピリドールが、併用療法において他の抗癌剤とともに使用されてきた。
従って、異常細胞増殖を含む疾病または状態を処置するための本発明の医薬組成物、使用または方法において、一実施態様では、異常細胞増殖を含む疾病または状態は癌である。
癌の一群には、ヒト乳癌（例えば、原発性乳房腫瘍、リンパ節転移陰性乳癌、浸潤性乳管癌、非類内膜性乳癌）、およびマントル細胞リンパ腫が含まれる。さらに、他の癌として、結腸直腸癌および子宮内膜癌がある。
癌の別のサブセットには、リンパ系の造血系腫瘍、例えば、白血病、慢性リンパ性白血病、マントル細胞リンパ腫およびＢ細胞リンパ腫（びまん性大Ｂ細胞リンパ腫）が含まれる。
１つの特定の癌は、慢性リンパ性白血病である。
別の特定の癌は、マントル細胞リンパ腫である。
もう１つの特定の癌は、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫である。
癌のさらなるサブセットには、乳癌、卵巣癌、結腸癌、前立腺癌、食道癌、扁平上皮癌、および非小細胞肺癌が含まれる。
本発明の酸付加塩の、サイクリン依存性キナーゼおよびグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３としての活性は下記の実施例で示されるアッセイを用いて測定することができ、示される活性のレベルはＩＣ５０値として定義することができる。
よって、例えば、本発明の酸付加塩は癌を緩和する、またはその罹患率を軽減するのに有用であると考えられる。
本発明はまた、とりわけ、
・サイクリン依存性キナーゼまたはグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３が介在する病態または状態の予防または処置に用いるための、塩酸塩以外の４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩、
・哺乳類において腫瘍増殖を阻害するのに用いるための、塩酸塩以外の４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩、
・腫瘍細胞（例えば、哺乳類における）の増殖を阻害するのに用いるための、塩酸塩以外の４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩、
・サイクリン依存性キナーゼまたはグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３が介在する病態または状態を予防または処置する方法であって、それを必要とする対象に、塩酸塩以外の４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩を投与することを含む方法、
・哺乳類（例えば、ヒト）において腫瘍増殖を阻害する方法であって、その哺乳類（例えば、ヒト）に、有効に腫瘍増殖を阻害する量の、塩酸塩以外の４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの付加塩を投与することを含む方法、
・腫瘍細胞（例えば、ヒトなどの哺乳類に存在する腫瘍細胞）の増殖を阻害する方法であって、その腫瘍細胞を、有効に腫瘍細胞の増殖を阻害する量の、塩酸塩以外の４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩と接触させることを含む方法、
・サイクリン依存性キナーゼまたはグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３が介在する病態または状態を緩和する、またはその罹患率を軽減する方法であって、それを必要とする対象に、塩酸塩以外の４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩を投与することを含む方法、
・哺乳類において異常な細胞増殖を含む、または異常な細胞増殖から起こる疾病または状態を処置する方法であって、その哺乳類に、塩酸塩以外の４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩を、異常な細胞増殖を阻害するのに有効な量で投与することを含む方法、
・哺乳類において異常な細胞増殖を含む、または異常な細胞増殖から起こる疾病または状態を緩和する、またはその罹患率を軽減する方法であって、その哺乳類に、塩酸塩以外の４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩を、異常な細胞増殖を阻害するのに有効な量で投与することを含む方法、
・哺乳類において異常な細胞増殖を含む、または異常な細胞増殖から起こる疾病または状態を処置する方法であって、その哺乳類に、塩酸塩以外の４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩を、ｃｄｋキナーゼ（ｃｄｋ１もしくはｃｄｋ２）活性またはグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３活性を阻害するのに有効量で投与することを含む方法、
・哺乳類において異常な細胞増殖を含む、または異常な細胞増殖から起こる疾病または状態を緩和する、またはその罹患率を軽減する方法であって、その哺乳類に、塩酸塩以外の４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩を、ｃｄｋキナーゼ（ｃｄｋ１もしくはｃｄｋ２）活性またはグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３活性を阻害するのに有効量で投与することを含む方法、
・サイクリン依存性キナーゼまたはグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３を阻害する方法であって、そのキナーゼを、塩酸塩以外の４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩と接触させることを含む方法、
・塩酸塩以外の４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩を用い、サイクリン依存性キナーゼまたはグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３の活性を阻害することにより、細胞プロセス（例えば、細胞分裂）を調節する方法、
・本明細書に記載の疾病の予防または処置のための、塩酸塩以外の４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩、
・本明細書に記載のいずれか１以上の使用を目的とした薬剤の製造のための、塩酸塩以外の４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩の使用、
・塩酸塩以外の４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩と医薬上許容される担体とを含む医薬組成物、
・塩酸塩以外の４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩（該塩の水に対する溶解度は、１５ｍｇ／ｍｌを超える、典型的には２０ｍｇ／ｍｌを超える、好ましくは２５ｍｇ／ｍｌを超える、より好ましくは３０ｍｇ／ｍｌを超える）を含む、水溶液の形態で投与するための医薬組成物、
・薬剤に用いるための、塩酸塩以外の４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩、
・上記に示された、また、本明細書の他所に示されるいずれかの使用および方法のための、塩酸塩以外の４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩、
・サイクリン依存性キナーゼが介在する病態または状態を診断および処置する方法であって、（ｉ）患者が罹患している、または罹患する可能性のある疾病または状態が、サイクリン依存性キナーゼに対して活性を有する化合物による処置に感受性があるものであるかどうかを判定するために患者をスクリーニングすること、および（ｉｉ）患者の疾病または状態にそのような感受性があることが示された場合、その後、塩酸塩以外の４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩を患者に投与することを含む方法、
・スクリーニングされ、サイクリン依存性キナーゼに対して活性を有する化合物による処置に感受性があると考えられる疾病または状態に罹患している、または罹患するリスクがあると判定された患者における病態または状態の処置または予防を目的とした薬剤の製造のための、塩酸塩以外の４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩の使用
を提供する。
本発明の上記態様における酸付加塩は、本明細書に記載されるいずれの塩であってもよく、特に、メタンスルホン酸塩および酢酸塩およびそれらの混合物、最も好ましくは、メタンスルホン酸塩であり得る。
Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病およびびまん性大Ｂ細胞リンパ腫の処置
本発明はまた、本発明者らの先願ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００３１７９（ＷＯ２００５／０１２２５６）（その内容は出典明示により本明細書の一部とされる）に開示されている化合物の新たな使用（すなわち、Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病およびびまん性大Ｂ細胞リンパ腫の処置）も提供する。
より詳しくは、本発明は、Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病またはびまん性大Ｂ細胞リンパ腫の処置用の薬剤の製造のための、ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００３１７９（ＷＯ２００５／０１２２５６）で定義されている式（Ｉ０）：
Figure 2008528470
 （Ｉ０）
（式中、Ｒ２、Ｒ３、ＸおよびＹはＰＣＴ／ＧＢ２００４／００３１７９（ＷＯ２００５／０１２２５６に定義されている通りである）の化合物ならびにそのサブグループ、実施形態および実施例の使用を提供する。
また、そのような処置を必要とする患者に、本明細書で、また、ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００３１７９（ＷＯ２００５／０１２２５６）で定義される式（Ｉ０）の化合物を投与することにより、Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病およびびまん性大Ｂ細胞リンパ腫を処置する方法も提供される。
式（Ｉ０）の特定の化合物として、ＷＯ２００５／０１２２５６の１７頁の式（Ｉｂ）、６６頁の式（ＩＩ）、７２頁の式（ＩＶ）、７４頁の式（ＩＶａ）、７６頁の式（Ｖａ）、７７頁の式（Ｖｂ）、７８頁の式（ＶＩａ）、および７９頁の式（ＶＩｂ）で定義される化合物、７９頁に挙げられている化合物、およびＷＯ２００５／０１２２５６の実施例の節に例示されている化合物がある。
式（Ｉ０）の好ましい化合物は、４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドおよびその塩（例えば、酸付加塩）、溶媒和物、互変異性体またはＮ−オキシドである。
一実施形態では、この塩は塩酸塩であり得る。塩酸塩は、本発明者らの先願ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００３１７９（その内容は４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドに関するものであり、出典明示により本明細書の一部とされる）の実施例１５０または実施例２３７に記載されているように製造することができる。ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００３１７９（ＷＯ２００５／０１２２５６）の実施例２３７は、本願に実施例１１として含められている。
よって、本発明のこの態様によれば、
・Ｂ細胞リンパ腫の処置に用いるための、ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００３１７９（ＷＯ２００５／０１２２５６）で定義されている式（Ｉ０）の化合物、そのサブグループ、実施形態および例（式中、Ｒ２、Ｒ３、ＸおよびＹはＰＣＴ／ＧＢ２００４／００３１７９（ＷＯ２００５／０１２２５６）に定義されている通りである）、ならびにその付加塩（例えば、塩酸塩）、
・慢性リンパ性白血病の処置に用いるための、ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００３１７９（ＷＯ２００５／０１２２５６）で定義されている式（Ｉ０）の化合物、そのサブグループ、実施形態および例（式中、Ｒ２、Ｒ３、ＸおよびＹはＰＣＴ／ＧＢ２００４／００３１７９に定義されている通りである）、ならびにその酸付加塩（例えば、塩酸塩）、
・びまん性大Ｂ細胞リンパ腫の処置に用いるための、ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００３１７９（ＷＯ２００５／０１２２５６）で定義されている式（Ｉ０）の化合物、そのサブグループ、実施形態および例（式中、Ｒ２、Ｒ３、ＸおよびＹはＰＣＴ／ＧＢ２００４／００３１７９に定義されている通りである）、ならびにその酸付加塩（例えば、塩酸塩）
が提供される。
さらなる態様において、本発明は、Ｂ細胞リンパ腫の処置に用いるための、４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドまたはその塩（例えば、酸付加塩）、溶媒和物、互変異性体またはＮ−オキシドを提供する。
本発明はさらに、慢性リンパ性白血病の処置に用いるための、４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドまたはその塩（例えば、酸付加塩）、溶媒和物、互変異性体またはＮ−オキシドを提供する。
本発明はさらに、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫の処置に用いるための、４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドまたはその塩（例えば、酸付加塩）、溶媒和物、互変異性体またはＮ−オキシドを提供する。
Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫および慢性リンパ性白血病の処置においては、４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの遊離塩基が使用可能であり、より好ましくは、酸付加塩が使用可能である。この酸付加塩は本発明者らの先願ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００３１７９（ＷＯ２００５／０１２２５６）で開示されている塩酸塩であってもよいし、あるいは本明細書で開示されている塩の１つ、例えば、メタンスルホン酸および酢酸による塩であってもよい。
また、そのような処置を必要とする患者に、４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドまたはその酸付加塩を投与することにより、Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫および慢性リンパ性白血病を処置する方法も提供される。
医薬製剤
本明細書で定義される化合物（例えば、式（Ｉ０）の化合物または４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドまたはメシル酸塩などのその酸付加塩）は単独で投与することもできるが、当該化合物またはその塩を、１以上の医薬上許容される担体、アジュバント、賦形剤、希釈剤、増量剤、緩衝剤、安定剤、保存剤、滑沢剤または当業者に周知の他の物質とともに含む医薬組成物（例えば、製剤）として提供するのが好ましい。これらの組成物はまた、他の治療薬または予防薬、例えば、化学療法に付随する副作用のいくつかを軽減または緩和する薬剤も含み得る。このような薬剤の特定の例としては、制吐薬、ならびに化学療法関連の好中球減少症を防止する、またはその期間を短縮し、かつ、赤血球または白血球のレベルの低下から起こる合併症を防止する薬剤、例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、および顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を含む。
よって、本発明はさらに、上記で定義された医薬組成物、および本明細書で定義される４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミド（特に、メシル酸塩）を、１以上の医薬上許容される担体、賦形剤、バッファー、アジュバント、安定剤または本明細書で定義される他の物質と混合することを含む、医薬組成物の製造方法を提供する。
本明細書において「医薬上許容される」とは、適切な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題点もしくは懸念なく、被験体（例えば、ヒト）の組織との接触に用いるのに好適であり、妥当な利益／リスク比で釣り合いがとれた化合物、物質、組成物および／または投与形を意味する。担体、賦形剤などの各々はまた、その製剤の他の成分と適合するという点で「許容される」ものでなければならない。
医薬組成物は、経口投与、非経口投与、局所投与、鼻腔内投与、点眼投与、点耳投与、直腸投与、膣内投与または経皮投与に好適ないずれの形態であってもよい。組成物が非経口投与を意図したものである場合、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与用に処方してもよいし、あるいは注射、注入または他の送達手段により標的臓器または組織に直接送達できるように処方してもよい。この送達は、ボーラス注射、短時間注入または長時間注入によるものであってもよく、受動送達によるものでも好適な注入ポンプの利用を介したものであってもよい。
非経口投与に適した医薬製剤としては、抗酸化剤、バッファー、制菌剤、補助溶媒、有機溶媒混合物、シクロデキストリン複合体形成剤、乳化剤（エマルション製剤を形成および安定化させるため）、リポソームを形成させるためのリポソーム成分、高分子ゲルを形成させるためのゲル化ポリマー、凍結乾燥保護剤、およびとりわけ有効成分を可溶型で安定化させ、製剤を意図したレシピエントの血液と等張にするためのそれらの組合せを含み得る水性および非水性の無菌注射溶液が挙げられる。非経口投与用の医薬製剤はまた、沈殿防止剤および増粘剤(R. G. Strickly, Solubilizing Excipients in oral and injectable formulations, Pharmaceutical Research, Vol 21(2) 2004, p 201-230)を含み得る水性および非水性の無菌懸濁液の形態をとってもよい。
イオン化可能な薬剤分子は、薬物のｐＫａが製剤のｐＨ値と十分かけ離れている場合、ｐＨ調整により所望の濃度まで可溶化することができる。静脈内投与および筋肉内投与のための許容範囲はｐＨ２〜１２であるが、皮下投与では許容範囲はｐＨ２．７〜９．０である。溶液のｐＨは、薬剤の塩形態が塩酸か水酸化ナトリウムなどの強酸／強塩基により、あるいは限定されるものではないがグリシン、クエン酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩、ヒスチジン、リン酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、または炭酸塩から形成された緩衝溶液を含む緩衝剤の溶液により制御される。
注射製剤においては、水溶液と水溶性有機溶媒／界面活性剤（すなわち、補助溶媒）の組合せが使用される場合が多い。注射製剤に用いられる水溶性有機溶媒および界面活性剤としては、限定されるものではないが、プロピレングリコール、エタノール、ポリエチレングリコール３００、ポリエチレングリコール４００、グリセリン、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ；ファルマソルブ(Pharmasolve)）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ソルトール(Solutol) ＨＳ１５、クレモホール(Cremophor)ＥＬ、クレモホールＲＨ ６０、およびポリソルベート８０が挙げられる。このような製剤は、常にというわけではないが、通常は、注射前に希釈することができる。
プロピレングリコール、ＰＥＧ ３００、エタノール、クレモホールＥＬ、クレモホールＲＨ ６０、およびポリソルベート８０は、市販の注射製剤に用いられる完全に有機性の水混和性の溶媒および界面活性剤であり、互いに組み合わせて使用することができる。結果として得られる有機製剤は、通常、静脈内ボーラスまたは静脈内注入による投与前に少なくとも２倍希釈される。
あるいは、シクロデキストリンとの分子複合体の形成により高い水溶性を達成することもできる。
リポソームは、外側の脂質二重膜と内側の水性核からなり、全体の径が１００μｍ未満の、閉じられた球形小胞である。疎水性のレベルに応じ、ある程度の疎水性薬剤をリポソーム内に封入または取り込ませた場合、このような薬剤はリポソームにより可溶化され得る。また、疎水性薬剤も、その薬剤を脂質二重膜の一体部分となるようにすると、リポソームにより可溶化することができ、この場合、疎水性薬剤を脂質二重層の脂質部分に溶解させる。典型的なリポソーム製剤は、約５〜２０ｍｇ／ｍｌのリン脂質、等張剤、ｐＨ５〜８バッファー、および場合によりコレステロールを含む水を含有する。
これらの製剤は単回用量または多回用量容器、例えば、密閉アンプルおよびバイアルで提供することができ、使用直前に無菌液体担体、例えば注射水を添加するだけの凍結乾燥（リオフィライズ）状態で保存することもできる。
該医薬製剤は、本明細書で定義される式（Ｉ０）もしくは（Ｉ）の化合物またはその塩をリオフィライジングさせることにより製造することができる。リオフィライゼーションとは、組成物を凍結乾燥させる手法を指す。よって、凍結乾燥とリオフィライゼーションは本明細書では同義語として用いられる。典型的な方法としては、化合物を可溶化し、得られた製剤を明澄化し、濾過除菌し、リオフィライゼーションに適当な容器（例えば、バイアル）へ無菌的に移す。バイアルの場合、リオストッパー(lyo-stopper)で部分的に蓋をする。この製剤を冷却して凍結させ、標準的な条件下でリオフィライゼーションを行った後、湿気を遮断して安定な乾燥した凍結乾燥製剤とすることができる。この組成物は典型的には残留含水率が低く、例えば、凍結乾燥品の重量に対して５重量％未満、例えば１重量％未満である。
リオフィライゼーション製剤は、他の賦形剤、例えば、増粘剤、分散剤、バッファー、抗酸化剤、保存剤、および張力調整剤を含んでもよい。典型的なバッファーとしては、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、およびグリシンが挙げられる。抗酸化剤の例としては、アスコルビン酸、重亜硫酸ナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウム、モノチオグリセロール、チオ尿素、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシルアニソール、およびエチレンジアミン四酢酸塩が挙げられる。保存剤としては、安息香酸およびその塩、ソルビン酸およびその塩、パラ−ヒドロキシ安息香酸のアルキルエステル、フェノール、クロロブタノール、ベンジルアルコール、チメロサール、塩化ベンザルコニウムおよび塩化セチルピリジニウムが挙げられる。上記バッファーならびにデキストロースおよび塩化ナトリウムは、必要であれば張力調整のためにも使用可能である。
増量剤は一般に、リオフィライゼーション技術において、プロセスを補助し、かつ／または凍結乾燥塊に嵩および／または機械的強度を持たせるために用いられる。増量剤は、当該化合物またはその塩とともに凍結乾燥させた際に物理的に安定な凍結乾燥塊、より適した凍結乾燥過程、および迅速かつ完全な再構成を提供する遊離型の水溶性の固体粒状希釈剤を意味する。増量剤は溶液を等張とするためにも使用可能である。
水溶性増量剤は、リオフィライゼーションに典型的に用いられるいずれの医薬上許容される不活性の固体物質であってもよい。このような増量剤としては、グルコース、マルトース、スクロースおよびラクトースなどの糖類；ソルビトールまたはマンニトールなどの多価アルコール；グリシンなどのアミノ酸；ポリビニルピロリジンなどのポリマー；およびデキストランなどの多糖類が挙げられる。
有効化合物の重量に対する増量剤の重量比は、典型的には約１〜約５の範囲内、例えば約１〜約３、例えば約１〜２の範囲内である。
あるいは、増量剤は、好適なバイアル内で濃縮および密閉され得る溶液の形態で提供することもできる。投与形の無菌化は、濾過によってもよいし、あるいは調剤工程の適当な段階でバイアルおよびそれらの内容物をオートクレーブにかけることによってもよい。供給される製剤は、例えば、好適な無菌点滴パックでの希釈など、さらなる希釈および調製が必要な場合もある。
即時調合注射溶液および懸濁液は無菌粉末、顆粒および錠剤から調製してもよい。
本発明の１つの好ましい実施形態では、医薬組成物は、例えば注射または注入によるなどの静脈内投与に好適な形態である。
非経口注射用の本発明の医薬組成物はまた、医薬上許容される無菌の水性または非水性溶液、分散液、懸濁液またはエマルション、ならびに使用直前に無菌注射溶液または分散液に再構成するための無菌粉末を含み得る。好適な水性および非水性担体、希釈剤、溶媒またはビヒクルの例としては、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、カルボキシメチルセルロースおよびそれらの好適な混合物、植物油（オリーブ油など）、ならびにオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが挙げられる。適当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用におより、分散液の場合には必要な粒径の維持により、および界面活性剤の使用により維持することができる。
本発明の組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントを含んでもよい。微生物作用の回避は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、およびフェノールソルビン酸などを含めることで確保することができる。また、糖類および塩化ナトリウムなどの等張剤を含めるのが望ましい場合もある。注射医薬形の吸収の延長は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤を含めることによりもたらすことができる。
化合物が水性媒体中で安定でないか、または水性媒体中での溶解度が低い場合、有機溶媒中の濃縮物として調剤することができる。この濃縮物は、後に、水性系でより低濃度に希釈することができ、投与中の短時間の間は十分安定であり得る。よって、別の態様において、そのまま投与することもできるし、あるいはより一般には投与前に好適な静脈賦形剤（生理食塩水、デキストロース；緩衝または非緩衝）で希釈することができる、もっぱら１種類以上の有機溶媒からなる非水性溶液を含む医薬組成物が提供される(Solubilizing excipients in oral and injectable formulations, Pharmaceutical Research, 21(2), 2004, p201-230)。溶媒および界面活性剤の例としては、プロピレングリコール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、エタノール、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ，ファルマソルブ）、グリセリン、クレモホールＥＬ、クレモホールＲＨ ６０およびポリソルベートが挙げられる。特定の非水性溶液は、７０〜８０％のプロピレングリコールと２０〜３０％のエタノールからなる。ある特定の非水性溶液は、７０％のプロピレングリコールと３０％のエタノールからなる。別のものとしては、８０％のプロピレングリコールと２０％のエタノールからなる。通常、これらの溶媒は組み合わせて使用され、通常、静脈内ボーラスまたは静脈内注入前に少なくとも２倍希釈される。ボーラス静脈製剤に関する典型量は、グリセリン、プロピレングリコール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００が約５０％、エタノールが約２０％である。静脈内注入製剤に関する典型量は、グリセリンが約１５％、ＤＭＡが３％、プロピレングリコール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００およびエタノールが約１０％である。
本発明の１つの好ましい実施形態では、医薬組成物は、例えば注射または注入による静脈内投与に好適な形態である。静脈内投与では、この溶液はそのまま投与することもできるし、あるいは投与前に点滴バッグ（０．９％生理食塩水または５％デキストロースなどの医薬上許容される賦形剤を含有する）へ注入することもできる。
もう１つの好ましい実施形態では、医薬組成物は、皮下投与に好適な形態である。
経口投与に好適な医薬投与形としては、錠剤、カプセル剤、カプレット、丸剤、トローチ剤、シロップ剤、液剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤および懸濁剤、舌下錠、カシェ剤またはパッチ剤およびバッカルパッチ剤が挙げられる。
式（Ｉ０）もしくは（Ｉ）の化合物またはその酸付加塩（Ｉ）を含有する医薬組成物は、公知の方法に従って処方することができる（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, USA参照）。
ＷＯ２００５／０１２２５６に定義されている式（Ｉ０）化合物およびその部分式の化合物は、そこに記載されているように、また、本願に記載されるように調剤することができる。
従って、錠剤組成物は、単位用量の有効化合物を、不活性希釈剤または担体、例えば、糖または糖アルコール、例えば、ラクトース、スクロース、ソルビトールまたはマンニトール；および／または非糖由来希釈剤、例えば、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、炭酸カルシウムまたはセルロースもしくはその誘導体、例えば、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびデンプン、例えば、コーンスターチとともに含有できる。また、錠剤は、標準的な成分、例えば、結合剤および造粒剤、例えば、ポリビニルピロリドン、崩壊剤（例えば、膨潤性架橋ポリマー、例えば、架橋カルボキシメチルセルロース）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸塩）、保存剤（例えば、パラベン）、酸化防止剤（例えば、ＢＨＴ）、緩衝剤（例えば、リン酸緩衝液またはクエン酸緩衝液）、および発泡剤、例えば、クエン酸塩／重炭酸塩混合物を含有してもよい。このような賦形剤は周知のものであり、ここでは詳細に説明する必要はない。
カプセル剤は、硬質ゼラチン種であっても軟質ゼラチン種であってもよく、固体、半固体または液体状の有効成分を含有することができる。ゼラチンカプセルは、動物ゼラチンまたはその合成もしくは植物由来の等価物から形成できる。
固形投与形（例えば、錠剤、カプセル剤など）はコーティングを施しても施さなくともよいが、典型的には例えば、保護フィルムコーティング（例えば、ワックスまたはワニス）または放出制御コーティングを施す。コーティング（例えば、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（商標）型ポリマー）は、胃腸管内の所望の位置で有効成分が放出されるように設計することができる。従って、コーティングは、胃腸管内の特定のｐＨ条件下で分解して、選択的に胃または回腸もしくは十二指腸において化合物を放出するように選択することができる。
コーティングの代わりまたはコーティングに加えて、例えば、胃腸管において酸度またはアルカリ度が変化する条件下で化合物を選択的に放出するようにすることができる放出制御剤、例えば、放出遅延剤を含む固相マトリックス中に薬物を提供してもよい。あるいは、マトリックス材料または放出遅延コーティングは、その投与形が胃腸管を通過するにつれて実質的に連続的に浸食される浸食性ポリマー（例えば、無水マレイン酸ポリマー）の形態をとることができる。さらなる別法としては、有効化合物を、化合物の放出の浸透圧制御を与える送達系に処方することもできる。浸透圧放出および他の遅延放出もしくは徐放性製剤は当業者に周知の方法に従って製造することができる。
これらの医薬製剤は単一のパッケージ、通常はブリスターパック中に全コースの処置薬を含んだ「患者パック」として患者に提供することができる。患者パックは、薬剤師がバルク供給から患者分の医薬を分配する従来の処方箋調剤に優る利点があり、患者は患者パックに入っている、患者の処方箋調剤では見ることができない添付文書をいつでも見ることができる。添付文書を封入しておけば、医師の指示に対する患者の応諾が改善されることが示されている。
局所使用のための組成物としては、軟膏、クリーム、スプレー、パッチ剤、ゲル剤、液滴および挿入物（例えば、眼内挿入物）が挙げられる。このような組成物は、公知の方法に従って処方することができる。
非経口投与用の組成物は、一般には無菌水性もしくは油性溶液または微細懸濁液として提供されるか、あるいは、注射用無菌水で即座に構成できる微細無菌粉末の形態で提供してもよい。
直腸投与または膣内投与用の製剤の例としては、ペッサリーおよび坐薬が挙げられ、これらは、例えば、有効化合物を含有する付形成形材またはワックス材から形成することができる。
吸入投与用組成物は、吸入可能な粉末組成物または液状もしくは粉末スプレーの形態をとってもよく、粉末吸入装置またはエアゾールディスペンシング装置を用いた標準的な形態で投与することができる。このような装置は、周知である。吸入投与用の粉末製剤は、一般には有効化合物を、ラクトースなどの不活性固体粉末希釈剤とともに含む。
式（Ｉ０）もしくは（Ｉ）の化合物またはその酸付加塩は、一般的に単位投与形で提供され、それ自体、一般には所望のレベルの生物活性を得るのに十分な化合物を含有する。例えば、製剤は、１ｎｇ〜２ｇの有効成分、例えば、１ｎｇ〜２ｍｇの有効成分を含有し得る。この範囲内での化合物の特定の部分範囲は、０．１ｍｇ〜２ｇの有効成分（より一般には１０ｍｇ〜１ｇ、例えば、５０ｍｇ〜５００ｍｇ）、または１ｍｇ〜２０ｍｇ（例えば、１ｍｇ〜１０ｍｇ、例えば、０．１ｍｇ〜２ｍｇの有効成分）である。
有効化合物は、それを必要とする患者（例えば、ヒトまたは動物患者）に、所望の治療効果を達成するのに十分な量で投与する。
処置方法
４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドおよびその酸付加塩、特に、そのメシル酸塩、酢酸塩および塩酸塩（より詳しくは、メシル酸塩および酢酸塩、ならびにそれらの混合物）、または本明細書で定義される式（Ｉ０）の化合物は、サイクリン依存性キナーゼおよびグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３が介在する一連の病態または状態の予防または処置に有用であると考えられる。このような病態および症状の例としては、上記で示したものがある。
この化合物およびその塩は、一般的にこのような投与を必要とする被験者、例えば、ヒトまたは動物患者、好ましくはヒトに投与する。
この化合物およびその塩は、一般に治療的または予防的に有用であって、かつ、一般的に無毒な量で投与される。しかしながら、一定の状況（例えば、生命をおびやかす疾病においては）当該化合物またはその塩を投与するメリットは、有毒作用または副作用の欠点に優り、このような場合では、当該化合物またはその塩を、一定の毒性と関連する量で投与することが望ましいと考えられる。
本明細書で定義される化合物またはその塩は有益な治療効果を維持するために長期にわたって投与してもよいし、あるいは短期間だけ投与してもよい。あるいは、それらは拍動的または連続的に投与してもよい。
本明細書で定義される化合物またはその塩の一般的な一日量は、体重１ｋｇ当たり１００ｐｇ〜１００ｍｇ、より典型的には体重１ｋｇ当たり１０ｎｇ〜１５ｍｇ（例えば、１０ｎｇ〜１０ｍｇ、より典型的には体重１ｋｇ当たり１ｍｇ〜体重１ｋｇ当たり２０ｍｇ、例えば、体重１ｋｇ当たり１ｍｇ〜１０ｍｇ）であり得るが、必要に応じてより高い用量またはより低い用量を投与してもよい。当該化合物またはその塩は毎日投与することもできるし、あるいは例えば２日、または３日、または４日、または５日、または６日、または７日、または１０日、または１４日、または２１日、または２８日おきに反復投与することもできる。
６０ｋｇの人に対する用量の一例として、本明細書で定義される、例えば、化合物４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの遊離塩基を開始用量４．５〜１０．８ｍｇ／６０ｋｇ／日（７５〜１８０μｇ／ｋｇ／日に相当）、その後、有効用量４４〜９７ｍｇ／６０ｋｇ／日（０．７〜１．６ｍｇ／ｋｇ／日に相当）または有効用量７２〜２７４ｍｇ／６０ｋｇ／日（１．２〜４．６ｍｇ／ｋｇ／日に相当）で投与することを含むが、必要に応じてより高い用量またはより低い用量を投与してもよい。このｍｇ／ｋｇ用量は所与の体重に比例した尺度となる。
メシル酸塩の用量の一例は、開始用量５．６〜１３．５ｍｇ／６０ｋｇ／日（９３〜２２５μｇ／ｋｇ／日／人に相当）、その後、有効用量５５〜１２２ｍｇ／６０ｋｇ／日（０．９〜２．０ｍｇ／ｋｇ／日／人に相当）または有効用量９０〜３４５ｍｇ／６０ｋｇ／日（１．５〜５．８ｍｇ／ｋｇ／日／人に相当）であるが、必要に応じてより高い用量またはより低い用量を投与してもよい。結局のところ、投与される化合物の量および用いる組成物のタイプは、処置する疾病の性質または生理学的条件と見合うものであり、医師の裁量による。
ある特定の投与計画では、患者に毎日１時間、最大１０日間、特に、１週間に最大５日間、当該化合物またはその塩の注入を施し、この処置を２〜４週間といった所望の期間、特に３週間おきに繰り返す。
より詳しくは、患者に、５日間毎日１時間、当該化合物またはその塩の注入を施し、この処置を３週間おきに繰り返す。
別の特定の投与計画では、患者に３０〜１時間かけて注入を施した後、可変の時間、例えば、１〜５時間、例えば、３時間注入を維持する。
さらなる特定の投与計画では、患者に１２時間〜５日間の期間持続的注入を施し、特に、２４時間〜７２時間持続的注入を施す。
例えば慢性リンパ性白血病の処置に使用可能な別の投与計画では、患者に、３、４または５週間、６〜８日間隔で６回以内繰り返す、２〜６時間（より典型的には３〜５時間）注入を施す。この計画の好ましい実施形態では、患者に、４週間、毎週１回、６回以内の１時間の注入を施す。
しかしながら、結局のところ、投与される化合物の量および用いる組成物のタイプは、処置する疾病の性質または生理学的条件と見合うものであり、医師の裁量による。
当該化合物またはその塩は、単一の治療薬として投与してもよいし、または特定の病態、例えば、例えば上記で定義した癌などの新生物性疾患を処置するための１種以上の他の化合物の併用療法で投与してもよい。本発明の化合物とともに投与（同時であれ、異なる時間間隔であれ）できる他の治療薬または療法の例としては、限定されるものではないが、トポイソメラーゼ阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗薬、ＤＮＡ結合剤、微小管阻害剤（チューブリン標的化剤）、モノクローナル抗体およびシグナル変換阻害剤が挙げられ、特定の例としては、シスプラチン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、イリノテカン、フルダラビン、５ＦＵ、タキサン類、マイトマイシンＣ、および放射線療法が挙げられる。
当該化合物またはその塩および併用療法において投与される別の治療薬は、個々に異なる用量計画で、また、異なる経路で投与してもよい。よって、例えば、塩形態の４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミド（例えば、メシル酸塩および酢酸塩、ならびにそれらの混合物）は溶液として非経口経路により投与し、別の治療薬は経口投与してもよい。
式（Ｉ０）もしくは（Ｉ）の化合物またはその酸付加塩を１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の他の治療薬（好ましくは、１つまたは２つ、より好ましくは、１つ）との併用療法で投与する場合、これらの化合物は同時投与しても逐次投与してもよい。逐次投与する場合、それらは短時間間隔で（例えば、５〜１０分）投与してもよいし、長時間間隔で（例えば、１、２、３、４時間またはそれ以上おいて、または必要であればいっそう長時間おいて）投与してもよく、厳密な投与計画はその治療薬の特性に見合ったものである。
式（Ｉ０）もしくは（Ｉ）の化合物またはその酸付加塩はまた、放射線療法、光線力学療法、遺伝子療法のような非化学療法処置；外科術および食事制限と組み合わせて投与してもよい。
別の化学療法薬との併用療法で用いるため、式（Ｉ０）もしくは（Ｉ）の化合物またはその酸付加塩と１つ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上の他の治療薬を例えば２つ、３つ、４つまたはそれ以上の治療薬を含有する投与形に一緒に処方することができる。別法として、個々の治療薬を個別に処方し、場合によってそれらの使用説明書を添えて、キットの形態で一緒に提供してもよい。
当業者ならば、共通の一般知識によって用いる投与計画および併用療法を了解している。
診断方法
式（Ｉ０）もしくは（Ｉ）の化合物またはその酸付加塩の投与前に、患者が罹患している、または罹患する可能性のある疾病または状態が、サイクリン依存性キナーゼに対して活性を有する化合物での処置に感受性があるものかどうかを判定するために患者をスクリーニングすることができる。例えば、患者から採取した生体サンプルを分析し、その患者が罹患している、または罹患する可能性のある癌などの症状または疾病が、ＣＤＫの過剰な活性化または正常なＣＤＫ活性への経路の増感をもたらす遺伝的異常または異常なタンパク質発現を特徴とするものかどうかを判定することができる。ＣＤＫ２シグナルの活性化または増感をもたらすこのような異常の例としては、サイクリンＥのアップレギュレーション(Harwell RM, Mull BB, Porter DC, Keyomarsi K.; J Biol Chem. 2004 Mar 26;279(13):12695-705)、またはｐ２１もしくはｐ２７の欠損、またはＣＤＣ４変異体の存在(Rajagopalan H, Jallepalli PV, Rago C, Velculescu VE, Kinzler KW, Vogelstein B, Lengauer C.; Nature. 2004 Mar 4;428(6978):77-81)が挙げられる。ＣＤＣ４の突然変異体、またはサイクリンＥのアップレギュレーション、特に過剰発現、またはｐ２１もしくはｐ２７の欠損を伴う腫瘍は特にＣＤＫ阻害剤に感受性であり得る。本明細書においてアップレギュレーションとは、遺伝子増幅（すなわち、複数の遺伝子コピー）を含む発現の上昇または過剰発現、ならびに転写作用による発現の増強、ならびに突然変異による活性化を含む機能亢進および活性化が含まれる。
従って、この患者に、サイクリンＥのアップレギュレーション、またはｐ２１もしくはｐ２７の欠損、またはＣＤＣ４変異体の存在に特徴的なマーカーを検出するための診断試験を行えばよい。診断にはスクリーニングも含まれる。マーカーとしては、例えば、ＣＤＣ４の突然変異を同定するためのＤＮＡ組成の尺度をはじめとする遺伝マーカーを含む。また、マーカーとしては、酵素活性、酵素レベル、酵素の状態（例えば、リン酸化されているかいないか）および上述のタンパク質のｍＲＮＡレベルをはじめ、サイクリンＥのアップレギュレーションに特徴的なマーカーを含む。サイクリンＥのアップレギュレーション、またはｐ２１もしくはｐ２７の欠損を伴う腫瘍は特にＣＤＫ阻害剤に感受性であり得る。腫瘍は、処置前に、サイクリンＥのアップレギュレーション、またはｐ２１もしくはｐ２７の欠損に関して優先的にスクリーニングすることができる。
よって、患者に対して、サイクリンＥのアップレギュレーション、またはｐ２１もしくはｐ２７の欠損に特徴的なマーカーを検出するための診断試験を行えばよい。
これらの診断試験は一般に、腫瘍生検サンプル、血液サンプル（解離させた腫瘍細胞の単離および富化）、糞便生検、痰、染色体分析、胸膜液、腹水、または尿から選択される生体サンプルに対して行う。
ヒト結腸直腸癌および子宮内膜癌(Spruck et al, Cancer Res. 2002 Aug 15;62(16):4535-9)において、ＣＤＣ４に突然変異（Ｆｂｗ７またはArchipelagoとしても知られる）が存在することが判明した(Rajagopalan et al (Nature. 2004 Mar 4;428(6978):77-81))。ＣＤＣ４に突然変異を有する個体を確認することは、その患者がＣＤＫ阻害剤による処置に特に好適であることを意味し得る。処置前に、腫瘍をＣＤＣ４変異体の存在に関して優先的にスクリーニングすることができる。このスクリーニング方法は典型的には、直接配列決定、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ分析、または突然変異特異的抗体を含む。
突然変異およびタンパク質のアップレギュレーションの同定および分析の方法は当業者に周知である。スクリーニング方法としては、限定されるものではないが、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）またはin situハイブリダイゼーションなどの標準的な方法が挙げられる。
ＲＴ−ＰＣＲによるスクリーニングでは、腫瘍におけるｍＲＮＡのレベルは、そのｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーを作出した後、そのｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅することにより評価する。ＰＣＲ増幅の方法、プライマーの選択、および増幅条件は当業者に公知である。核酸の操作およびＰＣＲは、例えば、Ausubel, F. M. et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, 2004, John Wiley & Sons Inc.、またはInnis, M. A. et-al., eds. PCR Protocols: a guide to methods and applications, 1990, Academic Press, San Diegoに記載のような標準的な方法により行う。核酸技術を含む反応および操作はまた、Sambrook et al., 2001, 3rd Ed, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている。あるいは、ＲＴ−ＰＣＲ用の市販のキット（例えば、Roche Molecular biochemicals）、または米国特許第４，６６６，８２８号；同第４，６８３，２０２号；同第４，８０１，５３１号；同第５，１９２，６５９号；同第５，２７２，０５７号；同第５，８８２，８６４号および同第６，２１８，５２９号に示されている方法が使用でき、出典明示により本明細書の一部とされる。
ｍＲＮＡの発現を評価するためのin situハイブリダイゼーション技術の例として、蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）がある（Angerer, 1987 Meth. Enzymol., 152:649参照）。
一般に、in situハイブリダイゼーションは以下の主要工程を含む：（１）分析する組織の固定；（２）標的核酸の接近性を高めるため、また、非特異的結合を軽減するためのサンプルのプレハイブリダイゼーション処理；（３）その核酸混合物と生体構造または組織中の核酸とのハイブリダイゼーション；（４）ハイブリダイゼーションで結合しなかった核酸断片を除去するためのハイブリダイゼーション後洗浄；および（５）ハイブリダイズした核酸断片の検出。このような適用で用いるプローブは一般に、例えば放射性同位元素または蛍光リポーターで標識される。好ましいプローブは、ストリンジェント条件下で標的核酸との特異的ハイブリダイゼーションを可能とするに十分な長さ、例えば、約５０、１００、または２００ヌクレオチド〜約１０００以上のヌクレオチドである。ＦＩＳＨを行うための標準的な方法は、Ausubel, F. M. et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, 2004, John Wiley & Sons Inc and Fluorescence In Situ Hybridization: Technical Overview by John M. S. Bartlett in Molecular Diagnosis of Cancer, Methods and Protocols, 2nd ed.; ISBN: 1-59259-760-2; March 2004, pps. 077-088; Series :Methods in Molecular Medicineに記載されている。
あるいは、これらのｍＲＮＡから発現されたタンパク質産物を、腫瘍サンプルの免疫組織化学、マイクロタイタープレートを用いる固相イムノアッセイ、ウエスタンブロット法、二次元ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリーおよび特定のタンパク質を検出するための当技術分野で公知の他の方法により評価してもよい。検出方法には、部位特異的抗体の使用が含まれる。当業者ならば、サイクリンＥのアップレギュレーション、またはｐ２１もしくはｐ２７の欠損の検出、またはＣＤＣ４変異体の検出のためのこのような周知の技術は全て本発明の場合にも適用可能であることが分かるであろう。
よって、これらの技術は全て、本発明の化合物による処置に特に好適な腫瘍を同定するためにも使用可能である。
ＣＤＣ４の突然変異、またはサイクリンＥのアップレギュレーション、特に過剰発現、またはｐ２１もしくはｐ２７の欠失を伴う腫瘍は、ＣＤＫ阻害剤に特に感受性がある可能性がある。腫瘍は処置前に、サイクリンＥのアップレギュレーション、特に過剰発現に関して(Harwell RM, Mull BB, Porter DC, Keyomarsi K.; J Biol Chem. 2004 Mar 26;279(13):12695-705)、またはｐ２１もしくはｐ２７の欠失、またはＣＤＣ４変異体に関して(Rajagopalan H, Jallepalli PV, Rago C, Velculescu VE, Kinzler KW, Vogelstein B, Lengauer C.; Nature. 2004 Mar 4;428(6978):77-81)優先的にスクリーニングすることができる。
マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）を有する患者は、本明細書で概略を示した診断試験を用い、本発明の化合物による処置に対して選択することができる。ＭＣＬは、ＣＤ５およびＣＤ２０の同時発現、急速進行性および難治性の臨床経過、および頻繁なｔ（１１；１４）（ｑ１３；ｑ３２）の転座を伴う小型〜中型のリンパ球の増殖を特徴とする非ホジキンリンパ腫の明瞭な臨床病理態である。マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）に見られるサイクリンＤ１ ｍＲＮＡの過剰発現が重要な診断マーカーとなる。Yatabe et al (Blood. 2000 Apr 1;95(7):2253-61)は、ＭＣＬの標準的な判定基準の１つとしてサイクリンＤ１陽性を含めるべきこと、およびこの新たな判定基準に基づいてこの難病の革新的療法を探索すべきであることを提案している。Jones et al (J MoI Diagn. 2004 May;6(2):84-9)は、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）の診断の助けとなるよう、サイクリンＤ１（ＣＣＮＤ１）発現のリアルタイム定量的逆転写ＰＣＲアッセイを開発した。Howe et al (Clin Chem. 2004 Jan;50(1):80-7)は、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いてサイクリンＤ１ ｍＲＮＡの発現を評価し、ＣＤ１９ ｍＲＮＡに対してノーマライズしたサイクリンＤ１ ｍＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲが血液、骨髄および組織におけるＭＣＬの診断に使用することができることを見出した。あるいは、乳癌患者は上記で概略を示した診断試験を用い、ＣＤＫ阻害剤による処置に対して選択することができる。腫瘍細胞は共通してサイクリンＥを過剰発現し、乳癌でもサイクリンＥが過剰発現することが示されている(Harwell et al, Cancer Res, 2000, 60, 481-489)。従って、乳癌は特に本明細書で提供されるＣＤＫ阻害剤で処置可能である。
抗真菌性用途
さらなる態様において、本発明は、塩酸塩以外の４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩の抗真菌剤としての使用を提供する。
４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩（塩酸塩以外）は、動物医薬（例えば、ヒトなどの哺乳類の処置）、または植物の処置（例えば、農業および園芸）、または抗真菌剤全般、例えば、保存剤および殺菌剤として使用可能である。
一実施形態では、本発明は、ヒトなどの哺乳類における真菌感染の予防または処置に使用される、塩酸塩以外の４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩を提供する。
また、塩酸塩以外の４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩の、ヒトなどの哺乳類における真菌感染の予防または処置に使用される薬剤の製造のための使用も提供される。
例えば、本発明の酸付加塩は、生物のなかでもとりわけ、カンジダ属(Candida)種、白癬菌属(Trichophyton)種、小胞子菌属(Microsporum)種または表皮糸状菌属(Epidermophyton)種により生じる局所的真菌感染、またはカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)により生じる粘膜感染（例えば、鵞口瘡および膣カンジダ症）に罹患しているか、またはその感染のリスクのあるヒト患者に投与することができる。また、本発明の酸付加塩は、例えば、カンジダ・アルビカンス、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、アスペルギルス・フラーブス(Aspergillus flavus)、アスペルギルス・フミガタス(Aspergillus fumigatus)、コクシジオデス(Coccidiodies)、パラコクシジオイデス(Paracoccidioides)、ヒストプラスマ(Histoplasma)またはブラストミセス(Blastomyces)により生じる全身性真菌感染の処置または予防のために投与することもできる。
別の態様において、本発明は、塩酸塩以外の４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩を農学的に許容される希釈剤または担体とともに含む、農業（園芸を含む）用途の抗真菌組成物を提供する。
本発明はさらに、真菌感染を有する動物（ヒトなどの哺乳類を含む）、植物または種子の処置方法であって、前記動物、植物もしくは種子、または前記植物もしくは種子の存在場所を、有効量の塩酸塩以外の４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩で処置することを含む方法を提供する。
また、本発明は、植物または種子における真菌感染の処置方法であって、前記植物または種子を、抗真菌的に有効な量の、塩酸塩以外の４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩を含有する抗真菌組成物で処置することを含む方法を提供する。
ディファレンシャルスクリーニングアッセイを使用して、非ヒトＣＤＫ酵素に対する本発明の酸付加塩の特異性を判定することができる。真核生物病原体のＣＤＫ酵素に対して特異的に作用する塩を、抗真菌剤または抗寄生虫剤として使用することができる。カンジダＣＤＫキナーゼの阻害剤であるＣＫＳＩは、カンジダ症の処置に使用することができる。抗真菌剤は、上記で定義した種類の感染、または衰弱した患者や免疫抑制患者、例えば、白血病およびリンパ腫を有する患者、免疫抑制療法を受けている者、ならびに糖尿病またはＡＩＤＳなど、疾病素因条件を有する患者において一般的に発生する日和見感染症に対して、またさらには非免疫抑制患者に対しても使用することができる。
当技術分野で記載されているアッセイを使用して、真菌症、例えば、カンジダ症、アスペルギルス症、ムコール症、ブラストミセス症、ゲオトリクム症、クリプトコックス症、クロモブラストミセス症、コクシジオイデス症(coccidiodomycosis)、分生胞子症(conidiosporosis)、ヒストプラスマ症、マズラ菌症、リノスポリジウム症、ノカイジオシス(nocaidiosis）、パラアクチノミセス症、ペニシリウム症、モニリア症(monoliasis)またはスポロトリクス症に関与する少なくとも１種類の真菌を抑制する上での適性をスクリーニングすることができる。ディファレンシャルスクリーニングアッセイを使用して、アスペルギルス・フミガタス(Aspergillus fumigatus)、黄色コウジ菌(Aspergillus flavus)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)またはアスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)などの酵母からクローニングしたＣＤＫ遺伝子を利用することにより、アスペルギルス症の処置において治療的価値を有し得る抗真菌剤を同定することができ、あるいは、真菌感染症がムコンニコシスである場合には、ＣＤＫアッセイは、リゾプス・アルヒズス(Rhizopus arrhizus)、リゾプス・オリザエ(Rhizopus oryzae)、アブシディア・コリムビフェラ(Absidia corymbifera)、アブシディア・ラモサ(Absidia ramosa)またはムコルプシルス(Mucorpusillus)などの酵母に由来するものであり得る。他のＣＤＫ酵素の供給源としては、病原体ニューモシスティス・カリニ(Pneumocystis carinii)が挙げられる。
例として、本発明の酸付加塩の抗真菌活性のin vitro評価は、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定することにより行うことができ、この最小発育阻止濃度は、好適な培地において特定の微生物の増殖が起こらない試験化合物の濃度である。実際には、各々試験化合物を特定の濃度で配合した一連の寒天プレートに、例えば、カンジダ・アルビカンスの標準培養物を接種した後、各プレートを３７℃で適当な期間インキュベートする。次に、これらのプレートを、真菌の増殖の有無について試験し、適切なＭＩＣ値を記録する。あるいは、液体培養物において濁度アッセイを行うこともでき、このアッセイの一例を示すプロトコールは下記の実施例に示されている。
これらの酸付加塩のin vivo評価は、真菌、例えば、カンジダ・アルビカンスまたはアスペルギルス・フラーブス菌株を接種したマウスに、一連の用量レベルで、腹腔内または静脈内注射によるか、または経口投与により行うことができる。これらの塩の活性は、処置マウス群と非処置マウス群において真菌感染の増殖をモニタリングすることにより（組織学によるか、または感染からの真菌の回復により）評価することができる。この活性は、化合物が、感染の致死作用に対して５０％防御を示す用量レベル（ＰＤ５０）として測定することができる。
ヒト抗菌用途のためには、塩酸塩以外の４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩は単独で投与してもよいし、または意図する投与経路および標準的な薬務に従って選択される医薬担体と混合して投与してもよい。従って、例えば、この塩は、上記の「医薬製剤」と題する節で記載した処方により、経口投与、非経口投与、静脈内投与、筋肉内投与または皮下投与することができる。
ヒト患者に対する経口および非経口投与の場合には、当該塩の一日用量レベルは、とりわけ、経口または非経口経路のいずれかで投与した際の該塩の有効性に応じて０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ（分割投与）であってよい。該塩の錠剤またはカプセル剤は、例えば、有効化合物５ｍｇ〜５ｇを含有すればよく、これは必要に応じて一回で、または２回以上に分けて投与できる。いずれの場合でも、医師が個々の患者に最適な実際の用量（有効量）を決定し、それは個々の患者の年齢、体重および応答によって異なる。
あるいは、当該塩を、坐剤またはペッサリーの形態で投与してもよいし、またはローション剤、液剤、クリーム、軟膏または粉剤の形態で局所適用してもよい。例えば、これらを、ポリエチレングリコールまたは流動パラフィンの水性エマルションからなるクリームに配合することができ、または１〜１０％の濃度で、白蝋または白色軟質パラフィン基剤からなる軟膏に、必要に応じて安定剤および保存剤とともに配合することができる。
上記の治療用途の他、このようなディファレンシャルスクリーニングアッセイにより開発された抗真菌剤は、例えば、食品の保存剤、家畜の体重増加を促進するための飼料サプリメント、または非生物の処理、例えば、診療器具および診療室を消毒するための殺菌製剤に使用することができる。同様に、哺乳類ＣＤＫおよび昆虫ＣＤＫ、例えば、ショウジョウバエＣＤＫ５遺伝子(Hellmich et al. (1994) FEBS Lett 356:317-21)の阻害を並列比較することにより、本明細書の化合物から、ヒト／哺乳類と昆虫酵素を識別する阻害剤を選択することができる。従って、本発明は、ショウジョウバエのような昆虫の防除に使用するなど、殺虫剤における本発明の塩の使用および配合を明確に意図するものである。
さらに別の実施形態では、哺乳類酵素よりも植物ＣＤＫに対しての阻害特異性に基づいて一定の対象塩を選択することができる。例えば、植物ＣＤＫは、１以上のヒト酵素を用いたディファレンシャルスクリーンに配置して、植物酵素の阻害に対して最大の選択性を示す化合物を選択することができる。従って、本発明は、枯れ葉剤などの形態におけるような農業用途の対象塩の製剤を特に意図するものである。
農業および園芸目的では、本発明の塩は、特定の使用および意図する目的に応じて処方した組成物の形態で使用することができる。従って、当該塩は、粉剤または顆粒剤、種子粉衣、水溶液、分散液または乳剤、浸漬剤、噴霧剤、エアゾール剤またはスモークの形態で適用することができる。また、組成物は、分散性粉剤、顆粒剤または粒剤の形態で供給してもよいし、または使用前に希釈する濃縮物の形態で供給してしてもよい。このような組成物は、農業および園芸において知られ、かつ、許容される通常の担体、希釈剤または補助剤などを含有してもよく、これらは、常法に従って製造することができる。また、これらの組成物は、他の有効成分、例えば、除草活性もしくは殺虫活性を有する化合物またはさらなる殺真菌剤を配合してもよい。当該塩および組成物は多数の方法で適用でき、例えば、植物の葉、茎、枝、種子もしくは根または土壌や他の育成媒体に直接適用することができ、これらは病害を根絶するためのみならず、植物または種子を攻撃から予防的に保護するためにも使用できる。例えば、これらの組成物は、有効成分を、０．０１〜１重量％含有することができる。圃場使用では、有効成分の適用率はおそらく５０〜５０００ｇ／ヘクタールである。
また、本発明は、塩酸塩以外の４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩を、木材腐朽菌の防除および植物が生育する土壌、苗床、または潅漑用水の処理に使用することも意図する。また、本発明は、貯蔵穀物および植物体ではない他の場所に真菌が蔓延するのを防ぐことを目的とした塩酸塩以外の４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩の使用も意図する。
図面の簡単な説明
図１ 単結晶Ｘ線回折試験により決定された４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドメタンスルホン酸塩の三次元構造を示す。
図２ ４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドメタンスルホン酸塩のＸ線回折試験により得られた構造のグラフである。
図３ ４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドメタンスルホン酸塩のＸ線粉末回折図である。
図４ ４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミド酢酸塩のＸ線粉末回折図である。
図５ ４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酢酸塩のＤＳＣスキャンである。
以下、下記実施例に記載する特定の実施形態により本発明を説明するが、これに限定されるものではない。
実施例１
４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドのメタンスルホン酸塩およびその結晶の合成
４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドのメタンスルホン酸塩は、下記のスキームで示される合成経路により製造することができる。
Figure 2008528470
ステージ１：４−ニトロ−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸メチルエステルの製造
Figure 2008528470
 デジタル温度計とスターラーを備えた２０Ｌ容の反応容器に４−ニトロ−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸（１．１１７Ｋｇ，７．１１ｍｏｌ，１重量）とメタノール（８．９５０Ｌ，８容量）を投入した。この反応混合物を窒素下で攪拌し、０〜５℃に冷却し、塩化チオニル（０．５８１Ｌ，８．０ｍｏｌ，０．５２容量）を１８０分かけて加え、得られた混合物を温め、１８〜２２℃で一晩攪拌したところ、１Ｈ ＮＭＲ分析（ｄ６−ＤＭＳＯ）は反応が完了したことを示した。この反応混合物を減圧下、４０〜４５℃で濃縮し、残渣をトルエンで処理し、減圧下、４０〜４５℃で再び濃縮し（３×２．２５０Ｌ，３×２容量）、４−ニトロ−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸メチルエステルを灰白色固体として得た（１．２１０Ｋｇ，９９．５％）。
ステージ２：４−アミノ−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸メチルエステルの製造
Figure 2008528470
 デジタル温度計とスターラーを備えた２０Ｌ容の反応容器に、窒素下、パラジウム／炭素（１０％含水ペースト，０．１７０Ｋｇ，０．１４重量）を投入した。分液容器で、エタノール（１２．１０Ｌ，１０容量）中、４−ニトロ−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸メチルエステル（１．２１０Ｋｇ，７．０７ｍｏｌ，１重量）のスラリーを３０〜３５℃に温めて溶解させ、この溶液を窒素下、触媒に加えた。一連の窒素−水素パージの後、水素を導入し、１Ｈ ＮＭＲ分析（ｄ６−ＤＭＳＯ）により反応の完了が示されるまで（５〜１０時間）、この反応混合物を２８〜３０℃で維持した。パージサイクルの後、反応混合物を窒素下で濾過し、この液体を減圧下で濃縮し、４−アミノ−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸メチルエステルを得た（０．９８７Ｋｇ，９８．９％）。
ステージ３：４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸メチルエステルの製造
Figure 2008528470
 窒素下、１，４−ジオキサン（８．９０Ｌ，９容量）中、４−アミノ−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸メチルエステル（０．６３４Ｋｇ，４．４９ｍｏｌ，１重量）の溶液をトリエチルアミン（０．７６１Ｌ，５．４６ｍｏｌ，１．２容量）、次いで、塩化２，６−ジクロロベンゾイル（０．７１０Ｌ，４．９６ｍｏｌ，０．７２容量）で、内部温度が２０〜２５℃の範囲に維持されるように処理した。残留している塩化２，６−ジクロロベンゾイルを１，４−ジオキサン（０．９９０Ｌ，１容量）のライン洗浄で洗浄し、ＴＬＣ分析（溶出剤：酢酸エチル：ヘプタン３：１；Ｒｆ（アミン）０．２５，Ｒｆ（生成物）０．６５）のより完了が確認されるまで（１６時間）、この反応混合物を１８〜２５℃で攪拌した。反応混合物を濾過し、濾過ケークを１，４−ジオキサン（２×０．９９０Ｌ，２×１容量）で洗浄し、合わせた濾液（赤色）をさらなる単離を行わずにステージ４に進めた。
ステージ４：４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸の製造
Figure 2008528470
 水（６．０５Ｌ）中、水酸化ナトリウム（０．４８４Ｋｇ，１２．１ｍｏｌ）の溶液に、ステージ３のエステル溶液（１．０９９Ｋｇ，６．００Ｌ中３．５０ｍｏｌ）を一度に投入した。この反応混合物を、ＴＬＣ分析（溶出剤：酢酸エチル：ヘプタン３：１；Ｒｆ（エステル）０．６５，Ｒｆ（ステージ４）ベースライン）により完了が確認されるまで、２０〜２５℃で攪拌した。この反応混合物を減圧下、４５〜５０℃で濃縮し、油性残渣を水（９．９０Ｌ）で希釈し、温度が３０℃以下に維持されるように濃塩酸でｐＨ１まで酸性化した。生じた沈殿を濾取し、水（５．００Ｌ）で洗浄し、フィルター上で吸引乾燥させ（pulled dry)、その後、ヘプタン（５．００Ｌ）で洗浄した。この濾過ケークを２０Ｌ容のロータリーエバポレーターフラスコに投入し、トルエン（２×４．５０Ｌ）との共沸により完全に乾燥させ、４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸を黄色固体として得た（１．０４４Ｋｇ，約９９．５％）。
ステージ５：４−｛［４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボニル］アミノ｝ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルの製造
Figure 2008528470
 ステージ４の生成物（１．０重量）とトルエン（１０．０容量）を、機械的攪拌装置、滴下漏斗および温度計を備えた適当な大きさのフランジフラスコに投入した。これらの内容物を窒素下、１６〜２５℃で攪拌し、塩化チオニル（０．３容量）をゆっくり加えた。次に、これらの内容物を８０〜１００℃に加熱し、この温度で、１Ｈ ＮＭＲにより反応が完了したと判断されるまで攪拌した。この段階で内容物が粘稠となり過ぎて攪拌できない場合には、トルエンを追加してもよい（１０容量まで）。完了したところで、混合物を４０〜５０℃の間に冷却し、その後、真空下、４５〜５０℃で濃縮乾燥させた。次に、この残渣をトルエン（３×２．０容量）とともに共沸乾燥させた。
単離された固体を適当な大きさのフラスコに移し、テトラヒドロフラン（５．０容量）を投入した。これらの内容物を窒素下、１６〜２５℃で攪拌し、トリエチルアミン（０．５１２容量）を加えた。分液フラスコに４−アミノ−ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（０．７０４重量）およびテトラヒドロフラン（５．０容量）を投入した。これらの内容物を完全に溶解するまで振盪し、次に、この溶液を、温度を１６〜３０℃の間に維持しながら、反応フラスコに投入した。その後、この反応混合物を４５〜５０℃の間に加熱し、１Ｈ ＮＭＲにより完了したと判断されるまで内容物を攪拌した。次に、これらの内容物を１６〜２５℃に冷却し、水（５．０容量）を投入した。混合ヘプタン（０．５容量）を加え、これらの内容物を１０分以内攪拌し、層を分離した。次に、水相をテトラヒドロフラン：混合ヘプタン（９：１），３×５．０容量］で抽出した。有機相を合わせ、水（２．５容量）で洗浄した後、真空下、４０〜４５℃で濃縮した。残渣をトルエン（３×５．０容量）とともに共沸させて濃縮乾固させ、ステージ５の粗生成物を得た。
次に、この固体を適当な大きさのフラスコに移し、メタノール：トルエン［（２．５：９７．５），５．０容量］を加え、このスラリーを窒素下で３〜１８時間攪拌した。これらの内容物を濾過し、濾過ケークをトルエン（２×０．７容量）で洗浄した後、固体を真空下、４０〜５０℃で乾燥させ、４−｛［４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボニル］アミノ｝ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを灰白色固体として得た。
ステージ４の生成物２バッチ（１バッチ当たり０．８３１Ｋｇ）をこのようにして処理し、計２．３６６Ｋｇ（収率８８．６％）の４−｛［４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボニル］アミノ｝ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを得た。
ステージ６：４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドメタンスルホン酸塩の製造
Figure 2008528470
 ステージ５の生成物（１．０重量）と１，４−ジオキサン（３０．０容量）を、機械的攪拌装置、滴下漏斗および温度計を備えた適当な大きさのフランジフラスコに投入した。これらの内容物を窒素下で攪拌し、８０〜９０℃の間に加熱した。メタンスルホン酸（０．５４容量）を３０〜６０分かけて加えた後、内容物を９５〜１０５℃に加熱し、この温度範囲で、１Ｈ ＮＭＲにより反応が完了したと判断されるまで攪拌した。完了したところで、内容物を２０〜３０℃の間に冷却し、生じた沈殿を濾取した。濾過ケークを２−プロパノール（２×２．０容量）で洗浄し、３〜２４時間、吸引濾過(pulled dry)し、粗４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドメタンスルホン酸塩を流動状の灰白色固体として得た（８０．０〜１２０．０％ｗ／ｗ、不純物または溶質に関して補正はしていない）。
ステージ５の生成物数バッチをこのようにして処理したが、各バッチの出発材料および生成物の量の詳細は表１に示されている。
Figure 2008528470
ステージ６ａ：４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドメタンスルホン酸塩の再結晶化
ステージ６の生成物を、ステージ５のＢｏｃ保護生成物の残留レベルが０．２５％を超えないようにするため、再結晶させた。ステージ６の生成物４バッチを次のプロトコールを用いて再結晶させた。
ステージ６の粗生成物と２−プロパノール（１０．０容量）を、機械的攪拌装置、滴下漏斗および温度計を備えた適当な大きさのフランジフラスコに投入した。これらの内容物を窒素下で攪拌し、７５〜８５℃の間に加熱した。次に、この内容物に、透明な溶液が得られるまで水（２．５容量まで）を投入した。その後、これらの内容物を４０〜６０℃の間に冷却し、反応容量が約５０％に減るまで真空下、４０〜５０℃で濃縮した。このフラスコに２−プロパノール（３．０容量）を投入し、およそ３．０容量の溶媒が除去されるまで、内容物を４０〜５０℃で濃縮した。次に、このプロセスを、２−プロパノール（２×３．０容量）を用いてさらに２回繰り返し、含水率を確認した。その後、得られたスラリーを０〜５℃の間に冷却し、この温度で１〜２時間攪拌した。これらの内容物を濾過し、濾過ケークを２−プロパノール（２×１．０容量）で洗浄した後、フィルター上で２４時間まで吸引濾過(pulled dry)した。この固体を乾燥トレーに移し、真空下、４５〜５０℃で一定重量となるまで乾燥させ、４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドメタンスルホン酸塩を灰白色固体として得た（６０．０〜１００．０％ｗ／ｗ）。
４バッチの再結晶から、８５．６％〜９０．４％範囲の収率が得られ、再結晶生成物の純度は９９．２９％〜９９．３９％の範囲であった。２回目の再結晶では、純度はいっそう高まった。
この経路によって製造された４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドメタンスルホン酸塩の融点（ＤＳＣによる）は３７９．８℃であった。
メタンスルホン酸塩の赤外線スペクトル（ＫＢｒディスク法）は、３２３３、３００２、２８２９、１６７９、１６３２、１５６０、１４３０、１１９８、１０３７、９０９および７８４ｃｍ−１に特徴的なピークを含んでいた。
特定の理論に縛られるものではないが、これらの赤外線ピークは次のように塩の構造成分に割り当てられると考えられる。
Figure 2008528470
ステージ５の残留Ｂｏｃ保護生成物の除去
場合によっては、メタンスルホン酸塩を酢酸バッファーに溶かした際に、残留している微量のＢｏｃ保護遊離塩基からなる沈殿が見られることがある。この沈殿の除去または沈殿形成の防止のために、下記で示すようにいくつかの技術を用いることができる。
（ａ）濾過
２００ｍＭの酢酸バッファー中、メタンスルホン酸塩の混合物を、無菌ニードルを用い、バイアルから２０ｍｌ容の使い捨てシリンジに抜き取った後、このシリンジに臨床級の０．２μｍフィルター（Sartorius Minisart無菌使い捨てフィルターユニット）を取り付けた。シリンジのプランジャーをゆっくり押し、濾液を清浄な透明ガラスバイアルに回収した。このバイアルの内容物を、粒状物質を含まない無色透明のメタンスルホン酸塩溶液であった。
（ｂ）水性酸中での加熱
水（１０容量）中、メタンスルホン酸塩とメタンスルホン酸（０．４当量）の混合物を１００℃で４時間加熱した後、６０℃まで冷却した。ＴＬＣによる分析は、メタンスルホン酸塩が単一成分として存在していたことを示す。２−プロパノール（１０容量）を加え、混合物を４０℃まで冷却した。この混合物をおよそ１０容量となるまで真空下で減量した後。２−プロパノール（１０容量）を追加し、混合物を再び１０容量になるまで減量した。このサイクルをさらに３回繰り返した。この混合物を氷浴中で冷却し、生じた固体を濾取し、２−プロパノール（５容量）で洗浄し、真空乾燥させ、メタンスルホン酸塩を白色〜灰白色の固体として得た。
（ｃ）有機−水相抽出
水（１０容量）中、メタンスルホン酸塩とメタンスルホン酸（０．４当量）の混合物を１００℃で３時間加熱した後、周囲温度まで冷却した。この混合物にＴＨＦ−ヘプタン（９：１，１０容量）を加え、得られた混合物を激しく攪拌して溶液を得た。層に分け、水相をＴＨＦ−ヘプタン（９：１，２×１０容量）、次いで酢酸エチル（２×１０容量）で洗浄した。この水相に２−プロパノール（１０容量）を加え、この溶液をおよそ５容量となるまで真空下で減量し、その後、２−プロパノール（１０容量）を追加し、この混合物を再び５容量となるまで減量した。このサイクルをさらに３回繰り返した。生じた固体を濾取し、２−プロパノール（５容量）で洗浄し、真空乾燥させ、メタンスルホン酸塩を白色〜灰白色の固体として得た。
（ｄ）クロマトグラフィー
クロマトグラフィー技術を使用すれば、メタンスルホン酸塩から非極性不純物を除去するための経路が得られる。逆相法の使用が特に有用であると考えられる。
実施例２
Ｘ線回折による４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドメタンスルホン酸塩の結晶構造の決定
化合物４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドメタンスルホン酸塩は、実施例１に記載のように製造した。回折実験に用いた結晶は、水溶液から２−プロパノールによる沈殿によって得られた、寸法０．０５×０．０８×０．１４ｍｍ３の無色のプレートであった。結晶学的データは、９３Ｋにて、Ｒｉｇａｋｕ回転電極ＲＵ３ＨＲからのＣｕＫα照射（λ＝１．５４１８Å）、オスミックブルー共焦光学系およびＲｉｇａｋｕ Ｊｕｐｉｔｅｒ ＣＣＤデテクターを用いて収集した。検出器から結晶までの距離を６７ｍｍとし、２θ＝１５および９０°での２回のωスキャンで画像を収集した。データ収集はＣｒｙｓｔａｌＣｌｅａｒソフトウエアで制御し、画像はＤｔｒｅｋにより処理および尺度化した。吸収係数が高いため（μ＝４．０１ｍｍ−１）、データは４次フーリエ吸収補正を用いて補正しなければならなかった。結晶は斜方晶系空間群Ｐｂｃａ（＃６１）に属し、９３Ｋにおける結晶格子パラメーターは、ａ＝８．９０（１０）、ｂ＝１２．４４（１０）、ｃ＝３８．４９（４）Å、α＝β＝γ＝９０°であることが分かった。括弧の中の数字は偏差（ｓ．ｕ．，標準不確かさ）を表す。
上記の結晶および結晶構造は、本発明のさらなる態様をなす。
結晶構造はＳＨＥＬＸＳ−９７に装備されている直接的方法を用いて明らかにした。ＳＨＥＬＸＬ−９７による２７１の結晶学的パラメーターの精密化には、解像度範囲２０〜０．９Å（２．３＜θ＜５８．８７）で計２７１０の固有反射の強度データを用いた。最終的な統計学的パラメーターは、ｗＲ２＝０．２１１５（全データ）、Ｒ１＝０．０８６９（Ｉ＞２σ（Ｉ）のデータ）および適合度(goodness of fit)Ｓ＝１．２６４であった。
１分子のプロトン化遊離塩基と１個のメシル酸陰イオンがこの非対称単位に見つかった。この非対称単位の原子組成はＣ１７Ｈ２１Ｃｌ２Ｎ５Ｏ５Ｓであり、結晶密度の計算値は１．４９ｍｇ／ｍ３であった。水素原子は幾何学的基盤に生成されたが、ヘテロ原子と結合した水素原子の位置は、Ｆｏ−Ｆｃ差地図を調べることにより確認された。水素原子の位置および温度パラメーターは、対応する非水素原子に乗るように狭められた。非水素原子の熱の動きは非等方性熱因子によりモデル化した（図１参照）。
この結晶構造は、１つの分子内水素結合（Ｎ１５Ｈ．．．Ｏ７ ２．６９０Å）と５つの分子間水素結合を含む（充填図の図２参照）。これらのうち３つは、プロトン化ピペリジン窒素と２つのメシル酸陰イオンとを連結している。１つのメシル酸陰イオンは単一の水素結合Ｎ１２Ｈ１２Ａ．．．Ｏ２Ｍ ２．７７１Åにより連結され、もう１つのメシル酸陰イオンは、Ｎ１２Ｈ１２Ｂ．．．Ｏ１Ｍ ２．８６４ÅとＮ１２Ｈ１２Ｂ．．．Ｏ２Ｍ ３．０５７Åの相互作用を有する二叉水素結合に関与している。残りのメシル酸酸素Ｏ３Ｍは、水素結合Ｎ８Ｈ８．．．Ｏ３Ｍ ２．９２８Åに関与している。隣のプロトン化遊離塩基分子は、水素結合Ｎ１５Ｈ１５．．．Ｏ７ ２．８７６Åにより、ならびに比較的長い接触であるＮ１５Ｈ１５．．．Ｎ２ ３．５６２Åとフェニル環およびピラゾール環のスタッキングにより、ともに連結されている。これらの相互作用はｂ軸に沿って無限に増える。結晶充填は、２層のプロトン化遊離塩基陽イオンとの荷電水素結合の広範囲のネットワークにより挟まれたメシル酸陰イオンの２Ｄ層（ａｂ面に）を含む。これらの稠密な２Ｄサンドイッチ層は、フェニル環のスタッキングとＣｌ２．．．Ｃ１８ ３．３４１Åの塩素．．．フェニル相互作用の包含により、ｃ軸に沿ってともに連結されている。
Ｘ線回折試験により作成された構造のグラフを図２に示す。
４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドメタンスルホン酸塩の構造を構成する原子座標は表２に示されている。
表２
空間群: Pbca
93Ｋにてa、bおよびcを有するユニットセル（5% s.u.）:
a= 8.9
b=12.4
c=38.5
α=β=γ=90

cif形式での座標:

loop_
_atom_site_label
_atom_site_type_symbol
_atom_site_fract_x
_atom_site_fract_y
_atom_site_fract_z
_atom_site_U_iso_or_equiv
_atom_site_adp_type
_atom_site_occupancy
_atom_site_symmetry_multiplicity
_atom_site_calc_flag
_atom_site_refinement_flags
_atom_site_disorder_assembly
_atom_site_disorder_group
S1M S 0.13517(17) 0.18539(13) 0.03193(5) 0.0286(5) Uani 1 1 d . . .
O1M O 0.1193(5) 0.2208(3) -0.00409(14) 0.0326(13) Uani 1 1 d . . .
O2M O 0.1551(5) 0.0681(3) 0.03330(13) 0.0331(13) Uani 1 1 d . . .
O3M O 0.0151(5) 0.2217(4) 0.05453(14) 0.0368(13) Uani 1 1 d . . .
C4M C 0.3036(8) 0.2420(6) 0.0475(2) 0.0355(19) Uani 1 1 d . . .
H4M1 H 0.3855 0.2197 0.0329 0.053 Uiso 1 1 calc R . .
H4M2 H 0.3212 0.2181 0.0708 0.053 Uiso 1 1 calc R . .
H4M3 H 0.2959 0.3189 0.0471 0.053 Uiso 1 1 calc R . .
Cl1 Cl 0.26158(17) 0.18137(12) 0.34133(5) 0.0325(5) Uani 1 1 d . . .
Cl2 Cl 0.75698(19) 0.16766(13) 0.26161(5) 0.0366(6) Uani 1 1 d . . .
N1 N 0.6277(6) -0.2419(4) 0.34903(16) 0.0276(14) Uani 1 1 d . . .
H1 H 0.5932 -0.3064 0.3484 0.033 Uiso 1 1 calc R . .
N2 N 0.7505(5) -0.2150(4) 0.36663(16) 0.0286(15) Uani 1 1 d . . .
C3 C 0.7635(7) -0.1082(5) 0.36163(19) 0.0265(17) Uani 1 1 d . . .
C4 C 0.6453(7) -0.0708(5) 0.34039(18) 0.0211(16) Uani 1 1 d . . .
C5 C 0.5616(7) -0.1594(5) 0.3322(2) 0.0277(18) Uani 1 1 d . . .
H5 H 0.4770 -0.1623 0.3181 0.033 Uiso 1 1 calc R . .
C6 C 0.8878(7) -0.0454(5) 0.3760(2) 0.0269(17) Uani 1 1 d . . .
O7 O 0.9037(5) 0.0506(3) 0.36722(14) 0.0368(13) Uani 1 1 d . . .
N8 N 0.9821(6) -0.0939(4) 0.39821(15) 0.0267(14) Uani 1 1 d . . .
H8 H 0.9626 -0.1584 0.4048 0.032 Uiso 1 1 calc R . .
C9 C 1.1147(7) -0.0417(5) 0.41139(19) 0.0253(17) Uani 1 1 d . . .
H9 H 1.1272 0.0261 0.3987 0.030 Uiso 1 1 calc R . .
C10 C 1.1019(8) -0.0148(5) 0.4502(2) 0.0330(18) Uani 1 1 d . . .
H10A H 1.0156 0.0315 0.4540 0.040 Uiso 1 1 calc R . .
H10B H 1.0866 -0.0804 0.4633 0.040 Uiso 1 1 calc R . .
C11 C 1.2429(7) 0.0412(5) 0.4630(2) 0.0349(19) Uani 1 1 d . . .
H11A H 1.2533 0.1102 0.4515 0.042 Uiso 1 1 calc R . .
H11B H 1.2355 0.0538 0.4878 0.042 Uiso 1 1 calc R . .
N12 N 1.3784(6) -0.0279(4) 0.45532(16) 0.0258(14) Uani 1 1 d . . .
H12A H 1.4618 0.0069 0.4623 0.031 Uiso 1 1 calc R . .
H12B H 1.3716 -0.0892 0.4676 0.031 Uiso 1 1 calc R . .
C13 C 1.3929(7) -0.0546(6) 0.4181(2) 0.0314(18) Uani 1 1 d . . .
H13A H 1.4790 -0.1013 0.4147 0.038 Uiso 1 1 calc R . .
H13B H 1.4098 0.0107 0.4049 0.038 Uiso 1 1 calc R . .
C14 C 1.2538(7) -0.1097(6) 0.4049(2) 0.0356(19) Uani 1 1 d . . .
H14A H 1.2425 -0.1785 0.4165 0.043 Uiso 1 1 calc R . .
H14B H 1.2639 -0.1231 0.3802 0.043 Uiso 1 1 calc R . .
15 N 0.6215(5) 0.0371(4) 0.33108(16) 0.0256(14) Uani 1 1 d . . .
H15 H 0.6768 0.0852 0.3408 0.031 Uiso 1 1 calc R . .
C16 C 0.5183(7) 0.0697(5) 0.30805(18) 0.0213(15) Uani 1 1 d . . .
O17 O 0.4336(5) 0.0082(3) 0.29260(13) 0.0309(12) Uani 1 1 d . . .
C18 C 0.5120(6) 0.1890(5) 0.30170(17) 0.0195(15) Uani 1 1 d . . .
C19 C 0.3923(7) 0.2486(5) 0.31620(19) 0.0252(16) Uani 1 1 d . . .
C20 C 0.3785(7) 0.3569(5) 0.30904(19) 0.0267(17) Uani 1 1 d . . .
H20 H 0.2991 0.3957 0.3185 0.032 Uiso 1 1 calc R . .
C21 C 0.4814(7) 0.4078(5) 0.28805(19) 0.0270(17) Uani 1 1 d . . .
H21 H 0.4708 0.4808 0.2834 0.032 Uiso 1 1 calc R . .
C22 C 0.6005(7) 0.3518(5) 0.27375(19) 0.0294(18) Uani 1 1 d . . .
H22 H 0.6702 0.3865 0.2597 0.035 Uiso 1 1 calc R . .
C23 C 0.6142(7) 0.2425(5) 0.2807(2) 0.0286(17) Uani 1 1 d . . .
実施例３
４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドメタンスルホン酸塩の溶解度の決定
ｐＨ値１〜１１の範囲の水溶液における、実施例１の４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドメタンスルホン酸塩の溶解度を下記のようにして調べた。
標準塩酸を水酸化ナトリウム希釈溶液で所望のｐＨとなるように滴定することにより、溶液を調製した。調製した溶液のｐＨは１〜１１の範囲であった。次に、これらの溶液を用いて４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドメタンスルホン酸塩の溶解度を評価した。
各実験において、１５０ｍｇのメタンスルホン酸塩を５ｍｌ容の透明なバイアルに計り取り、所定のｐＨの溶液３〜４ｍｌを加えた。次に、この溶液混合物を（ｉ）周囲温度および（ｉｉ）４℃で平均３時間攪拌した。各場合とも、その後、この溶液を０．２２μｍ ＰＶＤＦフィルターで濾過し、得られた透明な溶液のｐＨを記録し、その溶液のメタンスルホン酸塩含量を、ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計と塩の標準溶液を用いて評価した。
得られた溶解度データを表３および４に示す。これらのデータは、溶解度がｐＨおよび温度に依存することを示す。最良の溶解度はｐＨ４〜７の間で得られた。ｐＨ＞７およびｐＨ＜３では、最初の時点ではより高い溶解度が得られたが、周囲温度で放置した際に塩の沈殿が見られた。
Figure 2008528470
Figure 2008528470
実施例４
緩衝溶液中での４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドメタンスルホン酸塩の溶解度の測定
様々な緩衝系での実施例１のメシル酸塩の溶解度の検討を、周囲温度および４℃で行った。第一の実験組では、選択したバッファーは、２００ｍＭコハク酸バッファーｐＨ５．５、クエン酸バッファーｐＨ５．５、およびトリス／マレイン酸バッファーｐＨ５．５、６．５および７．５であった。用いた第二のバッファー組には、２００ｍＭ酢酸バッファーｐＨ４．６、グリシン／メタンスルホン酸バッファーｐＨ４．６およびグリシンバッファーｐＨ５．５を含んだ。
バッファーの調製
マレイン酸、トリス、水酸化ナトリウムバッファー溶液
このバッファーは、水１リットルにマレイン酸２３．６２ｇとトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン２４．２ｇを溶かすことにより調製した。一定量（５０ｍｌ）のこの溶液を０．２Ｍ水酸化ナトリウム溶液で目的のｐＨまで滴定し、水で２００ｍｌとした。ｐＨ５．５、６．５および７．５の０．２Ｍバッファーの溶液を調製した。
コハク酸、水酸化ナトリウムバッファー溶液
このバッファーは、水１リットルにコハク酸２３．６２ｇを溶かすことにより調製した。一定量（５０ｍｌ）のこの溶液を０．２Ｍ水酸化ナトリウム溶液で目的のｐＨまで滴定し、水で２００ｍｌとした。ｐＨ５．５の０．２Ｍバッファー溶液を調製した。
クエン酸、クエン酸ナトリウムバッファー溶液
このバッファーは、水１リットルにクエン酸４２．０２ｇを溶かすことにより調製した。一定量（５０ｍｌ）のこの溶液を０．２Ｍクエン酸三ナトリウム溶液（水１リットル中５８．８２ｇ）で目的のｐＨまで滴定し、水で２００ｍｌとした。ｐＨ５．５の０．２Ｍバッファー溶液を調製した。
酢酸ナトリウム、酢酸バッファー
このバッファーは、水２００ｍｌに酢酸ナトリウム４．４４ｇを溶かすことにより調製した。一定量（５０ｍｌ）のこの溶液を０．２０Ｍ酢酸溶液（水２００ｍｌ中１．３ｍｌ）で目的のｐＨまで滴定し、水で２００ｍｌとした。ｐＨ４．６の０．２０Ｍ酢酸バッファー溶液を調製した。
グリシン溶液
このバッファーは、水２００ｍｌにグリシン３．０１ｇを溶かすことにより調製した。ｐＨ４．９の０．２０Ｍグリシン溶液を調製した。
バッファー中でのメタンスルホン酸塩溶解度試験
各ｐＨおよびバッファー系で、周囲温度と４℃の２種類の試験を行った。各試験では、バッファー溶液４．０ｍｌに、公称２２０ｍｇのメシル酸塩を加え、溶液混合物を攪拌した。３時間後に攪拌を止め、溶液をＰＶＤＦ０．２２μｍメンブランフィルターで濾過し、サンプル希釈剤で希釈し、ＨＰＬＣによりメシル酸塩含量を評価した。この試験では、各サンプルのメシル酸塩含量は、その度ごとの一点較正を用いて算出した。
結果を表５および６に示す。
Figure 2008528470
Figure 2008528470
これらの結果から、酢酸バッファー中でのメシル酸塩の溶解度は３２〜３７ｍｇ／ｍｌの間にあることが分かった。この酢酸緩衝塩溶液に、１２１℃１５分のオートクレーブ処理、次いで４０℃、５５℃または７５℃で１０〜１２日間のさらなる加熱を行った。溶液のｐＨおよび４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドメタンスルホン酸塩は、これらの試験条件下で安定であることが分かった。この酢酸緩衝塩溶液に対して凍結−解凍安定性試験を行ったところ、４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドまたはその塩の沈殿は起こらず、溶液ｐＨおよび４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドメタンスルホン酸塩は、これらの試験条件下で安定であることが分かった。
実施例５
４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドメタンスルホン酸塩の安定性の決定
実施例１のメタンスルホン酸塩のサンプルを、温度４０℃、相対湿度７５％の密閉容器内の密閉バッグ中で６ヶ月間保存した。１か月、３か月および６か月の時点で、塩の純度または物理的状態に変化が起こるかどうかを調べるために種々の試験を行った。これらの試験は次の通りである。
（ａ）塩の色および物理的外観の視覚検査
（ｂ）フーリエ変換赤外線（ＦＴＩＲ）分光法−参照標準スペクトルの比較
（ｃ）示差走査熱分析（ＤＳＣ）による融点の測定
（ｄ）比色試薬ＡＫＸを用いた比色法による含水率の測定
（ｅ）ＨＰＬＣによる不純物の分析
試験結果を表７に示す。分かるように、塩の色および外観は６か月間変わらず（試験（ａ））、赤外線スペクトル（試験（ｂ））は、この期間変化が無いことを示した。試験（ｃ）では、融点に低下が見られないことから塩の分解が起こっていないことを示し、このことは、０時点でサンプル中に存在していた不純物で試験期間中に濃度が高まったものは無かったことを示すＨＰＬＣによっても裏付けられた。
よって、これらの安定性試験は、このメタンスルホン酸塩が長期間、安定性を有することを証明した。
実施例６
４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドメタンスルホン酸塩に対するＸ線粉末回折試験
実施例１で製造されたメシル酸塩のＸ線粉末回折（ＸＲＰＤ）分析を、回転ステージと可変温度ステージを備えたＢｒｕｋｅｒ Ｄ５００回折計にて行った。照射源は密閉銅管（Ｃｕ Ｋα照射：１．５４０６Å）とし、電圧および電流を４０ｋＶおよび４０ｍＡに設定した。使用検出器は、シンチレーションカウンターであった。ＸＲＰＤ分析は、Ｄｉｆｆｒａｃ Ｐｌｕｓ ＸＲＤ Ｃｏｍｍａｎｄｅｒソフトウエアｖ２．３．１を用いて行った。
塩サンプル約１０ｍｇをサンプルホルダーへ軽くプレスした後、軽くならして平坦面とすることでサンプルを準備した。
回折図は、２θ ３°〜４０°の範囲で、ステップサイズ０．００１°、ステップ時間１秒として収集した。
メシル酸塩の回折図を図３に示す。
Figure 2008528470
Figure 2008528470
凡例 nd＝検出されず
実施例７
４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドメタンスルホン酸塩の種々の相対湿度の作用に関する試験
（ｉ）種々の湿度条件下でメシル酸塩の挙動を調べるため、重量測定蒸気吸収（ＧＶＳ）試験を行った。これらの試験に用いたメシル酸塩は、次の方法により塩酸塩から作製した（実施例１１参照）。
塩酸塩をＭｅＯＨに取り、Ｓｔｒａｔａ−ＮＨ２カラムに通し、ＭｅＯＨで溶出させた。生成物を含有する画分を真空下で減量し、４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミド遊離塩基を得た。ＭｅＯＨ中、この遊離塩基の混合物に、ＭｓＯＨ（水中７０％）を加え、この混合物を周囲温度で１４時間攪拌した後、トルエン（×３）と共沸させながら真空下で減量した。残渣をアセトンを用いたトリチュレーションにより精製し、真空炉で乾燥させ、メシル酸塩を得た。
上記の方法により調製したメシル酸塩のサンプルを、Ｈｉｄｅｎ ＩＧＡＳｏｒｐ水分吸収分析装置実行ＣＦＲＳｏｒｐソフトウエアにかけた。サンプルサイズは一般に１０ｍｇとした。水分吸収−脱水等温線が下表に示されるように実行した。
Figure 2008528470
メシル酸塩サンプル１２．９２ｍｇを用い、２回のサイクルを行った。得られたＧＶＳ等温線は、この塩が、相対湿度０％〜９０％の範囲でおよそ４重量％の水を取り込んだことを示した。塩が８０％を超える相対湿度に曝されない限り、水分の取り込みは２．６重量％未満である。重要なこととしては、吸収段階に取り込まれた水は脱水段階で失われ、このことは水の取り込みが表面作用であることを示す。
（ｉｉ）別の試験で、上記で調製したメシル酸塩約１０ｍｇを、表面積が大きくなるようにスライドガラス上に平らにプレスし、飽和塩化ナトリウム水溶液の入ったデシケーター内に入れた。次に、これを４０℃に保持したインキュベーターに入れ、およそ７５％の相対湿度とした。このサンプルを８日目と１８日目に取り出し、その時点でのサンプルのＸＲＰＤプロフィールを、試験開始前のその塩のＸＲＰＤプロフィールと比較した。これらのＸＲＰＤプロフィールに変換は見られなかった。ＨＰＬＣ分析によれば、試験期間中、塩の分解は起こらなかったことが示された。
上記の試験（ｉ）および（ｉｉ）は、メシル酸塩は高湿度条件に曝された場合にいくらか水分を取り込むが、取り込まれた水分は相対湿度が低下するにつれ失われ、塩の結晶構造には変化が見られないことを示す。従って、このメシル酸塩は安定な無水塩である。
実施例８
４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミド酢酸塩の製造
Figure 2008528470
 周囲温度で攪拌した水（５００ｍｌ）中、４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミド塩酸塩（２０．６ｇ，５０ｍｍｏｌ）の溶液に重炭酸ナトリウム（４．５ｇ，５３．５ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を１時間攪拌し、生じた固体を濾取し、トルエン（×３）と共沸させながら真空乾燥させ、４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの対応する遊離塩基を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ10.20 (s, 1H), 8.30 (s, 1H), 8.25 (d, 1H), 7.60 - 7.50 (m, 3H), 3.70 (m, 1H), 3.00 (d, 2H), 2.50 (m, 2H), 1.70 (d, 2H), 1.50 (m, 2H).
周囲温度下、メタノール（１５０ｍｌ）中、４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミド（１０．０ｇ，２６．２ｍｍｏｌ）の攪拌懸濁液に、氷酢酸（１５ｍｌ，２６２ｍｍｏｌ）を加えた。１時間後、透明な溶液が得られ、トルエン（×２）と共沸させながら真空下で減量した。次に、残渣をアセトニトリル（２×１００ｍｌ）でトリチュレートし、固体を真空乾燥させ、４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミド酢酸塩（１０．３ｇ）を白色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ10.20 (s, 1H), 8.40 (d, 1H), 8.35 (s, 1H), 7.60 - 7.50 (m, 3H), 3.85 (m, 1H), 3.00 (d, 2H), 2.60 (t, 2H), 1.85 (s, 3H), 1.70 (d, 2H), 1.55 (m, 2H)
実施例９
４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミド酢酸塩に対する示差走査熱分析
実施例８の酢酸塩に対して、５０ポジションのオートサンプラーを備えたＴＡ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｑ１０００を用い、ＤＳＣ試験を行った。エネルギーおよび温度較正標準としてインジウムを用いた。
サンプルを１０℃／分の速度で１０℃〜２３０℃の間に加熱した。サンプルには３０ｍｌ／分の窒素パージを保った。サンプルサイズとしては１ｍｇ〜３ｍｇの間を用い、全てのサンプルを湿度から密閉されたパン内でクリンプした。この酢酸塩のＤＳＣスキャンを図５に示す。ＤＳＣ図形は２３１．５℃に変化を示し、これは酢酸の消失、次いで、遊離塩基への変換によるものである。この固体をさらに加熱すると、２９２．９℃で分解／融解が起こる。
実施例１０
４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミド酢酸塩に対するＸ線粉末回折試験
実施例８の酢酸塩のＸ線粉末回折（ＸＲＰＤ）分析を、実施例６に記載の方法に従い、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄ５００回折計にて行った。
この酢酸塩の回折図を図４に示す。
実施例１１
４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミド塩酸塩の製造
１１Ａ．４−ニトロ−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸メチルエステルの合成
Figure 2008528470
 周囲温度下、メタノール（１００ｍｌ）中、４−ニトロ−３−ピラゾールカルボン酸（５．６８ｇ，３６．２ｍｍｏｌ）の混合物に、塩化チオニル（２．９０ｍｌ，３９．８ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、この混合物を４８時間攪拌した。この混合物を真空下で減量し、トルエンと共沸させることで乾燥させ、４−ニトロ−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸メチルエステルを得た。
１１Ｂ．４−アミノ−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸メチルエステルの合成
Figure 2008528470
 ＥｔＯＨ（１５０ｍｌ）中、４−ニトロ−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸メチルエステル（３４．６ｍｍｏｌ）および１０％Ｐｄ／Ｃ（６５０ｍｇ）の混合物を水素雰囲気下で２０時間攪拌した。この混合物をセライトプラグで濾過し、真空下で減量し、トルエンと共沸させることで乾燥させ、４−アミノ−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸メチルエステルを得た。
１１Ｃ．４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸
ジオキサン（５０ｍｌ）中、４−アミノ−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸メチルエステル（５ｇ；３５．５ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（５．９５ｍｌ；４２．６ｍｍｏｌ）の溶液に塩化２，６−ジクロロベンゾイル（８．２ｇ；３９．０５ｍｍｏｌ）を注意深く加えた後、室温で５時間攪拌した。この反応混合物を濾過し、濾液をメタノール（５０ｍｌ）および２Ｍ水酸化ナトリウム溶液（１００ｍｌ）で処理し、５０℃で４時間加熱した後、蒸発させた。この残渣に水１００ｍｌを加えた後、濃塩酸で酸性化した。固体を濾取し、水（１００ｍｌ）で洗浄し、吸引乾燥させ、１０．０５ｇの４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸を薄紫固体として得た。
１１Ｄ．４−｛［４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボニル］−アミノ｝−ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
ＤＭＦ（７５ｍｌ）中、４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸（６．５ｇ，２１．６ｍｍｏｌ）、４−アミノ−１−ＢＯＣ−ピペリジン（４．７６ｇ，２３．８ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（５．０ｇ，２５．９ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ（３．５ｇ，２５．９ｍｍｏｌ）の混合物を室温で２０時間攪拌した。この反応混合物を真空下で減量し、残渣を酢酸エチル（１００ｍｌ）と飽和重炭酸ナトリウム水溶液（１００ｍｌ）とで分液した。有機層をブラインで洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、真空下で減量した。この残渣を５％ＭｅＯＨ−ＤＣＭ（〜３０ｍｌ）に取った。不溶性物質を濾取し、ＤＣＭで洗浄し、真空乾燥させ、４−｛［４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボニル］−アミノ｝−ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（５．３８ｇ）を白色固体として得た。この濾液を真空下で減量し、残渣を、勾配溶出１：２ＥｔＯＡｃ／ヘキサン〜ＥｔＯＡｃを用いるカラムクロマトグラフィーにより精製し、さらなる４−｛［４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボニル］−アミノ｝−ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２．５４ｇ）を白色固体として得た。
１１Ｅ．４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミド
ＭｅＯＨ（５０ｍｌ）およびＥｔＯＡｃ（５０ｍｌ）中、４−｛［４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボニル］−アミノ｝−ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（７．９ｇ）の溶液を飽和ＨＣｌ−ＥｔＯＡｃ（４０ｍｌ）で処理した後、室温で一晩攪拌した。この生成物はメタノールが存在するために結晶化しなかったことから、反応混合物を蒸発させ、残渣をＥｔＯＡｃでトリチュレートした。得られた灰白色固体を濾取し、ＥｔＯＡｃで洗浄し、焼結物上で吸引乾燥させ、６．３ｇの４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドを塩酸塩として得た(LC/MS: Rt 5.89, [M+H]+ 382 / 384)。
生物活性
実施例１２
活性化ＣＤＫ２／サイクリンＡキナーゼ阻害活性（ＩＣ５０）の測定
次のプロトコールを用いてＣＤＫ２キナーゼ阻害活性を測定することができる。
活性化ＣＤＫ２／サイクリンＡ(Brown et al, Nat. Cell Biol., 1, pp438-443, 1999; Lowe, E.D., et al Biochemistry, 41, pp15625-15634, 2002)を、２．５倍濃度のアッセイバッファー（５０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．２、６２．５ｍＭ β−グリセロホスフェート、１２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、３７．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１１２．５ｍＭ ＡＴＰ、２．５ｍＭ ＤＴＴ、２．５ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、０．２５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）で１２５ｐＭに希釈し、１０μｌを、１０μｌのヒストン基質混合物（６０μｌのウシヒストンＨ１（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５ｍｇ／ｍｌ）、９４０μｌのＨ２Ｏ、３５μＣｉγ３３Ｐ−ＡＴＰ）と混合し、９６ウェルプレートに、ＤＭＳＯ中種々の希釈率（２．５％まで）の試験化合物５μｌとともに９６ウェルプレートに添加する。反応を２〜４時間行った後、過剰量のオルトリン酸（２％、５μｌ）により停止させる。ヒストンＨ１に組み込まれていないγ３３Ｐ−ＡＴＰを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＭＡＰＨフィルタープレートでリン酸化ヒストンＨ１から分離する。ＭＡＰＨプレートのウェルを、０．５％オルトリン酸で湿らせた後、反応物をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ真空濾過装置でウェルから濾過する。濾過後、残留物を、２００μｌの０．５％オルトリン酸で２回洗浄する。フィルターが乾燥したところで、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ２０シンチラント２０μｌを添加した後、Ｐａｃｋａｒｄ Ｔｏｐｃｏｕｎｔで３０秒間カウントする。
ＣＤＫ２活性の阻害率（％）を算出し、プロットして、ＣＤＫ２活性の５０％を阻害するのに必要な試験化合物の濃度（ＩＣ５０）を求める。
上記のＣＤＫ２アッセイにおいて、化合物４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドのＩＣ５０値は、０．１μＭ未満である。
実施例１３
活性化ＣＤＫ１／サイクリンＢキナーゼ阻害活性（ＩＣ５０）の測定
ＣＤＫ１／サイクリンＢアッセイは、ＣＤＫ１／サイクリンＢ（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を用い、この酵素を６．２５ｎＭに希釈すること以外は上記ＣＤＫ２／サイクリンＡと同じである。
上記のＣＤＫ１アッセイにおいて、化合物４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドのＩＣ５０値は、０．１μＭ未満である。
実施例１４
ＧＳＫ３−Ｂキナーゼ阻害活性アッセイ
ＧＳＫ３−β（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を、２５ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７．０ ０、２５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．００２５％Ｂｒｉｊ−３５、１．２５％グリセロール、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０２５％β−メルカプトエタノール、３７．５ｍＭ ＡＴＰで７．５ｎＭに希釈し、１０μｌを基質混合物１０μｌと混合する。ＧＳＫ３−βの基質混合物は、３５μＣｉγ３３Ｐ−ＡＴＰを含む水１ｍｌ中、１２．５μＭのホスホ−グリコーゲンシンターゼペプチド−２（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）である。酵素と基質を、ＤＭＳＯ中種々の希釈率（２．５％まで）の試験化合物５μｌとともに９６ウェルプレートに添加する。反応を３時間（ＧＳＫ３−β）行った後、過剰量のオルトリン酸（２％、５μｌ）により停止させる。濾過手順は上記の活性化ＣＤＫ２／サイクリンＡアッセイの場合と同様である。
上記のＧＳＫ３−Ｂアッセイにおいて、化合物４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドのＩＣ５０値は、０．１μＭ未満である。
実施例１５
抗増殖活性
化合物の抗増殖活性は、いくつかの細胞系統において細胞増殖を阻害する化合物の能力を測定することにより判定することができる。細胞増殖の阻害は、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅアッセイ(Nociari, M. M, Shalev, A., Benias, P., Russo, C. Journal of Immunological Methods 1998, 213, 157-167)を用いて測定した。この方法は、生存細胞がレサズリンをその蛍光産物レソルフィンへと還元する能力に基づくものである。各増殖アッセイでは、細胞を９６ウェルプレートで平板培養し、１６時間回復させた後、さらに７２時間、阻害化合物を添加する。インキュベーション期間が終了したところで、１０％（ｖ／ｖ）のＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅを添加し、さらに６時間インキュベートした後、５３５ｎＭ ｅｘ／５９０ｎＭ ｅｍで蛍光産物を測定する。非増殖細胞のアッセイの場合には、細胞を９６時間密集状態で維持した後、さらに７２時間、阻害化合物を添加する。上記のようにＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅアッセイにより生存細胞の数を判定する。細胞系統は全てＥＣＡＣＣ(European Collection of cell Cultures)から入手することができる。
このアッセイを用い、４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドのメタンスルホン酸塩は、ＨＣＴ−１１６細胞系統においてＩＣ５０値が０．１１であることが分かった。
医薬製剤
実施例１６
（ｉ）錠剤製剤
本明細書で定義される式（Ｉ０）もしくは（Ｉ）の化合物またはその酸付加塩を含有する錠剤組成物は、化合物またはその塩５０ｍｇと、希釈剤としてのラクトース（ＢＰ）１９７ｍｇ、滑沢剤としてのステアリン酸マグネシウム３ｍｇとを混合し、公知の方法で打錠することにより製造される。
（ｉｉ）カプセル剤処方
カプセル剤は、本明細書で定義される式（Ｉ０）もしくは（Ｉ）の化合物またはその酸付加塩１００ｍｇとラクトース１００ｍｇを混合し、得られた混合物を標準的な不透明硬カプセルに充填することにより製造される。
（ｉｉｉ）注射製剤Ｉ
注射による投与のための非経口組成物は、式（Ｉ０）または（Ｉ）の化合物（例えば、塩の形態）を、１０％プロピレングリコールを含有する水に、有効化合物の濃度が１．５重量％となるように溶解させることにより作製することができる。その後、この溶液を濾過除菌し、アンプルに充填し、密閉する。
（ｉｖ）注射製剤ＩＩ
注射用非経口組成物は、式（Ｉ０）または（Ｉ）の化合物（例えば、塩の形態）（２ｍｇ／ｍｌ）およびマンニトール（５０ｍｇ／ｍｌ）を水に溶解させ、この溶液を濾過除菌し、密閉可能な１ｍｌ容のバイアルまたはアンプルに充填することにより作製される。
ｖ）注射製剤ＩＩＩ
注射または注入による静脈送達用製剤は、式（Ｉ０）または（Ｉ）の化合物（例えば、塩の形態）を水に２０ｍｇ／ｍｌで溶解させることにより作製することができる。次に、このバイアルを密閉し、オートクレーブにより滅菌する。
ｖｉ）注射製剤ＩＶ
注射または注入による静脈送達用製剤は、式（Ｉ０）または（Ｉ）の化合物（例えば、塩の形態）を、バッファーを含む水（例えば、０．２Ｍ酢酸塩 ｐＨ４．６）に２０ｍｇ／ｍｌで溶解させることにより作製することができる。次に、このバイアルを密閉し、オートクレーブにより滅菌する。
（ｖｉｉ）皮下注射製剤
皮下投与用組成物は、本明細書で定義される式（Ｉ０）もしくは（Ｉ）の化合物またはその酸付加塩を、濃度が５ｍｇ／ｍｌとなるように、医薬級トウモロコシ油と混合することにより作製される。この組成物を滅菌し、好適な容器に充填する。
ｖｉｉｉ）凍結乾燥製剤
本明細書で定義される式（Ｉ０）もしくは（Ｉ）またはその酸付加塩の調剤したアリコートを５０ｍｌ容のバイアルに入れ、凍結乾燥した。凍結乾燥では、これらの組成物を一段階凍結プロトコール（−４５℃）を用いて凍結させる。アニーリングのために−１０℃まで昇温した後、−４５℃まで引き下げて凍結させ、その後、＋２５℃で約３４００分間一次乾燥し、次いで、温度が５０℃になれば、追加工程で二次乾燥を行う。一次乾燥および二次乾燥中の圧力は、８０ミリトルに設定する。
（ｉｘ）静脈投与用濃縮物
４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドメタンスルホン酸塩を濃度２０ｍｇ／ｍｌで０．２Ｍ酢酸ナトリウム／酢酸バッファー ｐＨ４．６に溶解させることにより、水性緩衝溶液を作製する。
この緩衝溶液を、濾過して粒状物質を除去しつつ容器（第１種ガラスバイアルなど）に充填し、次にこれを密閉し（例えば、Ｆｌｏｒｏｔｅｃ栓による）、固定する（例えば、アルミクランプによる）。化合物および製剤が十分安定であれば、その製剤は１２１℃で適切な時間オートクレーブにかけることで滅菌する。製剤がオートクレーブにかけられるほど安定でない場合には、好適なフィルターを用いて除菌し、無菌条件下で滅菌バイアルに充填することができる。静脈投与では、その溶液をそのまま投与することもできるし、あるいは投与前に点滴バッグ（０．９％生理食塩水または５％デキストロースなどの医薬上許容される賦形剤を含有する）に注入することもできる。
実施例１７
抗真菌活性の測定
４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの塩の抗真菌活性は、次のプロトコールを用いて測定することができる。
当該塩を、カンジダ・パラプシローシス(Candida parpsilosis)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)−ＡＴＣＣ３６０８２およびクリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)を含む真菌パネルに対して試験する。試験生物は、４℃、Ｓａｂｏｕｒａｈｄ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ａｇａｒの傾斜培地で維持する。０．０５Ｍモルホリンプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）を含むアミノ酸(Difco, Detroit, Mich.)ｐＨ７．０を含有する酵母−窒素基本ブロス（ＹＮＢ）中、回転ドラムにて、２７℃で一晩、酵母を増殖させることにより、各生物の単一体懸濁液を調製する。次に、この懸濁液を遠心分離し、０．８５％ＮａＣｌで２回洗浄した後、洗浄した細胞懸濁液を４秒間超音波処理する(Branson Sonifier, model 350, Danbury, Conn.)。単一体出芽胞子を血球計算器でカウントし、０．８５％ＮａＣｌで所望の濃度に調整する。
試験化合物の活性は、ブロス微量希釈法の改良法を用いて測定する。試験化合物をＤＭＳＯに希釈して１．０ｍｇ／ｍｌ比とした後、ＭＯＰＳを含むＹＮＢブロス（ｐＨ７．０）で６４μｇ／ｍｌに希釈し（対照としてフルコナゾールを使用）、各化合物の使用液を調製する。９６ウェルプレートを用い、ウェル１およびウェル３〜１２はＹＮＢブロスを用いて調製し、化合物溶液の１０倍希釈液をウェル２〜１１（濃度範囲は６４〜０．１２５μｇ／ｍｌ）に調製する。ウェル１は、無菌対照および分光光度アッセイのブランクとして用いる。ウェル１２は増殖対照として用いる。このマイクロタイタープレートのウェル２〜１１に各々１０μｌを接種する（最終接種量は、生物１０４／ｍｌである）。接種したプレートを、３５℃で４８時間インキュベートする。ＩＣ５０値は、プレートをボルテックスミキサー(Vorte-Genie 2 Mixer, Scientific Industries, Inc., Bolemia, N.Y.)で２分間攪拌した後、４２０ｎｍで吸光度を測定することにより(Automatic Microplate Reader, DuPont Instruments, Wilmington, Del.) 、分光光度法で測定する。ＩＣ５０終点は、対照ウェルと比較して増殖の約５０％（またはそれ以上）の減少を示す最低薬剤濃度として定義される。濁度アッセイによれば、これは、ウェルにおける濁度が対照の５０％未満となる最低薬剤濃度（ＩＣ５０）として定義される。最小細胞溶解濃度（ＭＣＣ）は、９６ウェルプレートの総てのウェルをＳａｂｏｕｒａｈｄ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ａｇａｒ（ＳＤＡ）プレートで継代培養し、３５℃で１〜２日間インキュベートした後、生存率を確認することにより測定する。
実施例１８
in vivo完全植物体真菌感染防除の生物学的評価のプロトコール
４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの塩をアセトンに溶解させ、順次連続アセトン希釈して一連の所望の濃度を得た。病原体に応じて、９倍量の０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（商標）水溶液または０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（商標）を添加することにより最終処理量を得る。
次に、これらの組成物を使用して、以下のプロトコールを用い、トマト胴枯れ病（ファイトフィソラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans)）に対する本発明の化合物の活性を試験する。トマト（品種Ｒｕｔｇｅｒｓ）を、種子から、ソイルレスピート系の用土混合物で、苗が１０〜２０ｃｍの高さになるまで生育させる。次に、これらの植物に、試験化合物を１００ｐｐｍの割合で噴霧する。２４時間後、試験植物にファイトフィソラ・インフェスタンスの水性胞子嚢懸濁液を噴霧して接種し、デューチャンバー内で一晩保持する。次に、これらの植物を温室に移し、未処理対照植物に病害が発生するまで維持する。
また、同様のプロトコールを使用して、コムギ赤さび病(Puccinia)、コムギうどんこ病(Ervsiphe vraminis)、コムギ（品種Ｍｏｎｏｎ）、コムギ葉枯病(Septoria tritici)およびコムギふ枯病(Leptosphaeria nodorum)の防除における本発明の化合物の活性を試験する。
実施例１９
４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの遊離塩基および塩の溶解度の測定のための一般プロトコール
４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの種々の塩の溶解度は、次のプロトコールにより測定することができる。
手順
８ｍｌ容のバイアルに遊離塩基（５０ｍｇ，０．１３１ｍｍｏｌ）と水（０．５ｍｌ）を加える。このバイアルに適当な酸（１当量，０．１３１ｍｍｏｌ）を加え、バイアルを周囲温度で１４〜１６時間振盪する。その後、バイアルを目視検査する。均質な溶液が得られていれば、試験を終了し、このようにして形成された塩は１００ｍｇ／ｍｌを超える溶解度を有すると結論付けることができる。
固体が残っていれば、さらに０．５ｍｌの水を加え、バイアルを６時間振盪する。この段階で均質な溶液が形成されれば、塩の溶解度は５０ｍｇ／ｍｌを超えると結論付けることができる。
この際に固体が残っていれば、さらに１ｍｌの水を加え、バイアルを周囲温度で振盪する。この結果、均質な溶液が得られれば、溶解度は２５ｍｇ／ｍｌを超えると結論付けることができる。固体がまだ残っていれば、塩の溶解度は２５ｍｇ／ｍｌ未満であると結論付けることができる。
本発明の塩形態は、遊離塩基に優る、次のうち１以上の利点を示す。
・溶解度が高いので、静脈投与（例えば、点滴による）により良好であること、
・安定性がより良いこと（例えば、保存寿命の向上）、
・熱安定性がより良いこと、
・塩基性が弱いので、静脈投与により良いこと、
・製造上の利点があること、
・より良い物理化学特性を有すること、
・抗癌活性が向上すること、および
・治療指数が向上すること。
均等
上記の実施例は、本発明を説明する目的で記載したものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。上記に記載し、また、実施例で示す本発明の特定の実施形態に対して、本発明の原理から逸脱することなく、数多くの改変および変更をなし得ることが容易に分かるであろう。このような改変および変更は総て本願に含まれるものとする。
単結晶Ｘ線回折試験により決定された４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドメタンスルホン酸塩の三次元構造を示す。 ４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドメタンスルホン酸塩のＸ線回折試験により得られた構造のグラフである。 ４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドメタンスルホン酸塩のＸ線粉末回折図である。 ４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミド酢酸塩のＸ線粉末回折図である。 ４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酢酸塩のＤＳＣスキャンである。

Claims (77)

  1. メタンスルホン酸および酢酸ならびにそれらの混合物から選択される酸を用いて形成された４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩。
  2. メタンスルホン酸により形成された酸付加塩である、請求項１に記載の酸付加塩。
  3. 酢酸により形成された酸付加塩である、請求項１に記載の酸付加塩。
  4. 結晶性である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の酸付加塩。
  5. 結晶性であり、かつ、
    （ａ）図１および２で示される結晶構造を有し；かつ／または
    （ｂ）本明細書の実施例２の座標で定義される結晶構造を有し；かつ／または
    （ｃ）９３Ｋにおいてａ＝８．９０（１０）、ｂ＝１２．４４（１０）、ｃ＝３８．４９（４）Å、α＝β＝γ＝９０°の結晶格子パラメーターを有し；かつ／または
    （ｄ）Ｐｂｃａ（＃６１）などの斜方晶系空間群に属す結晶構造を有する、
    請求項２に記載の酸付加塩。
  6. 塩酸塩以外である、４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩。
  7. 酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸（例えば、Ｌ−アスコルビン酸）、アスパラギン酸（例えば、Ｌ−アスパラギン酸）、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、樟脳酸（例えば、（＋）樟脳酸）、カプリン酸、カプリル酸、炭酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデカン酸、ドデシル硫酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチジン酸、グルコヘプトン酸、Ｄ−グルコン酸、グルクロン酸（例えば、Ｄ−グルクロン酸）、グルタミン酸（例えば、Ｌ−グルタミン酸）、α−オキソグルタル酸、グリコール酸、馬尿酸、イセチオン酸、イソ酪酸、乳酸（例えば、（＋）−Ｌ−乳酸および（±）−ＤＬ−乳酸）、ラクトビオン酸、ラウリルスルホン酸、マレイン酸、リンゴ酸、（−）−Ｌ−リンゴ酸、マロン酸、メタンスルホン酸、粘液酸、ナフタレンスルホン酸（例えば、ナフタレン−２−スルホン酸）、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、ニコチン酸、オレイン酸、オロチン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、リン酸、プロピオン酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸（例えば、（＋）−Ｌ−酒石酸）、チオシアン酸、トルエンスルホン酸（例えば、ｐ−トルエンスルホン酸）、吉草酸およびキナホ酸(xinafoic acid)からなる群から選択される酸により形成された塩である、請求項６に記載の酸付加塩。
  8. 結晶性である、請求項６または請求項７に記載の酸付加塩。
  9. 非晶質である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の酸付加塩。
  10. 無水である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の酸付加塩。
  11. 表Ａ、場合により表Ｂ、で示される回折角（２θ）における主要ピークの存在と面間距離（ｄ）により特徴付けられるＸ線粉末回折像（例えば、このＸ線粉末回折像は、本明細書の表Ｃで示される回折角（２θ）における主要ピークの存在、面間距離（ｄ）および強度により特徴付けられる）を有する、４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの実質的に結晶性のメタンスルホン酸塩。
  12. 図３で示されるＸ線粉末回折像の場合と同じ回折角においてピークを示す（好ましくは、このピークは図３のピークと同じ相対強度を有する）、請求項１１に記載の４−（２，６−ジクロロベンゾイル−アミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの実質的に結晶性のメタンスルホン酸塩。
  13. 実質的に図３で示されるＸ線粉末回折像を有する、請求項１２に記載の４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの実質的に結晶性のメタンスルホン酸塩。
  14. 図４に示されるＸ線粉末回折像の場合と同じ回折角においてピークを示すＸ線粉末回折像を有する、４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの実質的に結晶性の酢酸塩。
  15. 前記ピークが図４のピークと同じ相対強度を有する、請求項１４に記載の４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの実質的に結晶性の酢酸塩。
  16. 実質的に図４で示されるＸ線粉末回折像を有する、請求項１５に記載の４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの実質的に結晶性の酢酸塩。
  17. 無水であり、かつ、ＤＳＣを行った際に３７９〜３８０℃、例えば、３７９．８℃において吸熱ピークを示す、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドのメシル酸塩。
  18. 無水であり、かつ、ＤＳＣを行った際に２３１〜２３２℃（例えば、２３１．５０℃）および２９２〜２９３℃（例えば、２９２．８８℃）において発熱ピークを示す、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酢酸塩。
  19. 酸付加塩の単結晶形と５重量％以下の酸付加塩のなんらかの他の結晶形を含有する、４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの実質的に結晶性の酸付加塩（例えば、請求項１〜１８のいずれか一項で定義されたメシル酸塩または酢酸塩）。
  20. 単結晶形に４重量％未満、または３重量％未満、または２重量％未満の他の結晶形が伴い、特に、約１重量％以下の他の結晶形を含む、実質的に結晶性の酸付加塩。
  21. 実質的に結晶性の、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の酸付加塩であって、この４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩（例えば、メタンスルホン酸塩または酢酸塩）の結晶が、１０重量％未満の残留溶媒（例えば、水または有機溶媒）、例えば、５重量％未満の残留溶媒、例えば、４重量％未満、または３重量％未満、または２重量％未満、または１重量％未満、または０．５重量％未満の溶媒を含む結晶である、酸付加塩。
  22. 単結晶形に０．９重量％未満、または０．８重量％未満、または０．７重量％未満、または０．６重量％未満、または０．５重量％未満、または０．４重量％未満、または０．３重量％未満、または０．２重量％未満、または０．１重量％未満、または０．０５重量％未満、または０．０１重量％未満の他の結晶形、例えば、０重量％の他の結晶形が伴う、請求項２１に記載の酸付加塩。
  23. ＫＢｒディスク法を用いて分析した場合に、３２３３、３００２、２８２９、１６７９、１６３２、１５６０、１４３０、１１９８、１０３７、９０９および７８４ｃｍ−１において特徴的なピークを含む赤外線スペクトルを示し、好ましくは、実質的に結晶性である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の４−（２，６−ジクロロベンゾイル−アミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドのメタンスルホン酸塩。
  24. 結晶性であり、かつ、次のパラメーター、すなわち、該塩が、
    （ａ）図１および２で示される結晶構造を有すること；および／または
    （ｂ）本明細書の実施例２の座標で定義される結晶構造を有すること；および／または
    （ｃ）９３Ｋにおいてａ＝８．９０（１０）、ｂ＝１２．４４（１０）、ｃ＝３８．４９（４）Å、α＝β＝γ＝９０°の結晶格子パラメーターを有すること；および／または
    （ｄ）Ｐｂｃａ（＃６１）などの斜方晶系空間群に属す結晶構造を有すること；および／または
    （ｅ）表Ａ、場合により表Ｂ、で示される回折角（２θ）における主要ピークの存在と面間距離（ｄ）により特徴付けられるＸ線粉末回折像（例えば、このＸ線粉末回折像は、本明細書の表Ｃで示される回折角（２θ）における主要ピークの存在、面間距離（ｄ）および強度により特徴付けられる）を有すること；および／または
    （ｆ）図３で示されるＸ線粉末回折像の場合と同じ回折角においてピークを示す（好ましくは、このピークは図３のピークと同じ相対強度を有する）こと；および／または
    （ｇ）実質的に図３で示されるＸ線粉末回折像を有すること；および／または
    （ｈ）無水であり、かつ、ＤＳＣを行った際に３７９〜３８０℃、例えば、３７９．８℃において吸熱ピークを示すこと；および／または
    （ｉ）ＫＢｒディスク法を用いて分析した場合に、３２３３、３００２、２８２９、１６７９、１６３２、１５６０、１４３０、１１９８、１０３７、９０９および７８４ｃｍ−１において特徴的なピークを含む赤外線スペクトルを示すこと
    のうちいずれか１以上（組合せは問わない）または全てにより特徴付けられる、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドメシル酸塩のメタンスルホン酸塩。
  25. 請求項１〜２４のいずれか一項で定義された４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩を製造する方法であって、溶媒（典型的には、有機溶媒）または溶媒混合物中で４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミド遊離塩基の溶液を形成させること、およびその溶液を酸で処理して酸付加塩の沈殿を形成させることを含む、方法。
  26. 前記酸付加塩が請求項１〜５のいずれか一項で定義された、請求項２０に記載の方法。
  27. 請求項１〜２４のいずれか一項で定義された４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩を製造する方法であって、揮発酸と場合により補助溶媒を含む溶媒に４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミド遊離塩基を溶解させ、それにより揮発酸による酸付加塩の溶液を形成し、次いで、その溶液を濃縮または蒸発させて塩を単離することを含む、方法。
  28. 前記酸付加塩が酢酸により形成される塩である、請求項２７に記載の方法。
  29. 請求項１〜２４のいずれか一項で定義された４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩を形成させる方法であって、式（Ｘ）：
    Figure 2008528470
     （Ｘ）
    の化合物を有機溶媒中、塩酸以外の有機酸または無機酸で処理してｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基を除去し、その有機酸または無機酸による４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩を形成させ、その後、場合により、このようにして形成された酸付加塩を単離し、場合により、その酸付加塩を再結晶させて結晶形、例えば、請求項１〜２９のいずれか一項で定義された酸付加塩の結晶形を得ることを含む、方法。
  30. 水に対する溶解度が１５ｍｇ／ｍｌ、より典型的には２０ｍｇ／ｍｌを超える、好ましくは２５ｍｇ／ｍｌを超える、より好ましくは３０ｍｇ／ｍｌを超える塩である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の酸付加塩。
  31. １５ｍｇ／ｍｌを超える、典型的には２０ｍｇ／ｍｌを超える、好ましくは２５ｍｇ／ｍｌを超える、より好ましくは３０ｍｇ／ｍｌを超える濃度で、請求項１〜２４のいずれか一項で定義された４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩を含有する水溶液を含む、医薬組成物。
  32. 水溶液のｐＨが２〜１２、例えば２〜９、より詳しくは４〜７である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩の水溶液。
  33. 緩衝されている、請求項３２に記載の水溶液。
  34. 前記酸付加塩がメタンスルホン酸により形成された塩であり、バッファーが、例えば溶液ｐＨ約４．６で、酢酸と酢酸ナトリウムからなるバッファーである、請求項３３に記載の水溶液。
  35. ４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドまたはその塩を製造する方法であって、式（ＸＩ）：
    Figure 2008528470
     （ＸＩ）
    の化合物と式（ＸＩＩ）：
    Figure 2008528470
     （ＸＩＩ）
    （式中、ＰＧはアミン保護基である）を、有機溶媒中、トリエチルアミンなどの非干渉塩基の存在下で反応させて、式（ＸＩＩＩ）：
    Figure 2008528470
     （ＸＩＩＩ）
    の化合物を得、その後、この保護基ＰＧを除去して４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドまたはその塩を得ること、および場合によりこのようにして形成された塩を再結晶させて結晶形、例えば、請求項１〜３４のいずれか一項で定義された酸付加塩の結晶形を得ることを含む、方法。
  36. 前記保護基ＰＧがｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルであり、その保護基の除去が酸を用いて実施される、請求項３１に記載の方法。
  37. 前記酸が請求項１、２、３、６および７のいずれか一項で定義された酸である、請求項３６に記載の方法。
  38. 請求項３５で定義された式（ＸＩ）の化合物と式（ＸＩＩ）の化合物を反応させることにより、式（ＸＩＩＩ）の化学中間体を製造する方法。
  39. 請求項３５で定義された式（ＸＩ）の新規な化学中間体。
  40. ４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドまたはその塩を製造する方法であって、
    （ｉ）式（ＸＩＶ）：
    Figure 2008528470
     （ＸＩＶ）
    の化合物と塩化チオニルを、非プロトン性有機溶媒中、場合により加熱しながら反応させること；
    （ｉｉ）ステップ（ｉ）の生成物と式（ＸＩＩ）の化合物を、トリエチルアミンなどの非干渉塩基の存在下、場合により加熱しながら反応させて、式（ＸＩＩＩ）の化合物を得ること；および
    （ｉｉｉ）式（ＸＩＩＩ）の化合物から保護基ＰＧを除去して４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドまたはその塩を得ること；および場合により、
    （ｉｖ）その塩を再結晶させて結晶形、例えば、請求項１〜３９のいずれか一項で定義された結晶形を得ること
    を含む、方法。
  41. ステップ（ｉ）において、塩化チオニルとの反応が８０〜１００℃の範囲の温度まで加熱しながら実施される、請求項４０に記載の方法。
  42. ステップ（ｉ）が実施される溶媒が、トルエンなどの芳香族炭化水素溶媒である、請求項４０または請求項４１に記載の方法。
  43. ステップ（ｉｉ）が約５５℃、より典型的には５０℃までの温度、例えば４５℃〜５０℃の範囲の温度まで加熱しながら実施される、請求項４０〜４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. ステップ（ｉｉ）において、反応がテトラヒドロフラン中で実施される、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. ステップ（ｉｉｉ）において、保護基が酸処理により除去できるものであり、その酸が、４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの所望の塩が得られるように選択される、請求項４０〜４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記保護基がｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基である、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記酸が請求項１、２、３、６および７のいずれか一項で定義された酸である、請求項４５または請求項４６に記載の方法。
  48. サイクリン依存性キナーゼまたはグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３が介在する病態または状態の予防または処置に用いるための、請求項１〜２４のいずれか一項で定義された４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの塩。
  49. サイクリン依存性キナーゼまたはグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３が介在する病態または状態を予防または処置する方法であって、それを必要とする対象に、請求項１〜２４のいずれか一項で定義された４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの塩を投与することを含む、方法。
  50. サイクリン依存性キナーゼまたはグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３が介在する病態または状態を緩和する、またはその罹患率を軽減する方法であって、それを必要とする対象に、請求項１〜２４のいずれか一項で定義された４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの塩を投与することを含む、方法。
  51. 哺乳類において異常な細胞増殖を含む、または異常な細胞増殖から起こる疾病または状態を処置する方法であって、その哺乳類に、請求項１〜２４のいずれか一項で定義された４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの塩を、異常な細胞増殖を阻害するのに有効な量で投与することを含む、方法。
  52. 哺乳類において異常な細胞増殖を含む、または異常な細胞増殖から起こる疾病または状態を緩和する、またはその罹患率を軽減する方法であって、その哺乳類に、請求項１〜２４のいずれか一項で定義された４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの塩を、異常な細胞増殖を阻害するのに有効な量で投与することを含む、方法。
  53. 哺乳類において異常な細胞増殖を含む、または異常な細胞増殖から起こる疾病または状態を処置する方法であって、その哺乳類に、請求項１〜２４のいずれか一項で定義された４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの塩を、ｃｄｋキナーゼ（ｃｄｋ１もしくはｃｄｋ２など）活性またはグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３活性を阻害するのに有効な量で投与することを含む、方法。
  54. 哺乳類において異常な細胞増殖を含む、または異常な細胞増殖から起こる疾病または状態を緩和する、またはその罹患率を軽減する方法であって、その哺乳類に、請求項１〜２４のいずれか一項で定義された４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの塩を、ｃｄｋキナーゼ（ｃｄｋ１もしくはｃｄｋ２など）活性またはグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３活性を阻害するのに有効な量で投与することを含む、方法。
  55. サイクリン依存性キナーゼまたはグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３を阻害する方法であって、そのキナーゼを、請求項１〜２４のいずれか一項で定義された４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの塩と接触させることを含む、方法。
  56. 請求項１〜２４のいずれか一項で定義された４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの塩を用い、サイクリン依存性キナーゼまたはグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３の活性を阻害することにより、細胞プロセス（例えば、細胞分裂）を調節する方法。
  57. 本明細書に記載の病態の予防または処置に用いるための、請求項１〜２４のいずれか一項で定義された４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの塩。
  58. 本明細書で定義されるいずれか１以上の使用を目的とした薬剤の製造のための、請求項１〜２４のいずれか一項で定義された４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの塩の使用。
  59. 請求項１〜２４のいずれか一項で定義された４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの塩と医薬上許容される担体とを含む、医薬組成物。
  60. 薬剤に用いるための、請求項１〜２４のいずれか一項で定義された４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの塩。
  61. 前記で示した、また、明細書の他所に示されるいずれかの使用および方法のための、請求項１〜２４のいずれか一項で定義された４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの塩。
  62. Ｂ細胞リンパ腫の処置に用いるための、４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドまたはその酸付加塩（例えば、塩酸塩または請求項１〜２４のいずれか一項で定義された塩）。
  63. 慢性リンパ性白血病の処置に用いるための、４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドまたはその酸付加塩（例えば、塩酸塩または請求項１〜２４のいずれか一項で定義された塩）。
  64. びまん性大Ｂ細胞リンパ腫の処置に用いるための、４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドまたはその酸付加塩（例えば、塩酸塩または請求項１〜２４のいずれか一項で定義された塩）。
  65. Ｂ細胞リンパ腫の処置に用いるための、請求項１〜２４のいずれか一項で定義された４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩。
  66. 慢性リンパ性白血病の処置に用いるための、請求項１〜２４のいずれか一項で定義された４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩。
  67. びまん性大Ｂ細胞リンパの処置に用いるための、請求項１〜２４のいずれか一項で定義された４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩。
  68. Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病またはびまん性大Ｂ細胞リンパ腫の処置を目的とした薬剤の製造のための、ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００３１７９で定義されている式（Ｉ０）：
    Figure 2008528470
     （Ｉ０）
    （式中、Ｒ２、Ｒ３、ＸおよびＹはＰＣＴ／ＧＢ２００４／００３１７９で定義されている通りである）の化合物、ならびにそのサブグループ、実施形態および例の使用。
  69. Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫または慢性リンパ性白血病を処置する方法であって、そのような処置を必要とする患者に、治療上有効な量の、請求項６８で定義された式（Ｉ０）の化合物を投与することを含む、方法。
  70. 前記式（Ｉ０）の化合物が４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドおよびその塩（例えば、酸付加塩）、溶媒和物、互変異性体またはＮ−オキシドである、請求項６３に記載の使用または請求項６９に記載の方法。
  71. 前記塩が塩酸塩である、請求項７０に記載の使用または方法。
  72. サイクリン依存性キナーゼが介在する病態または状態を診断および処置する方法であって、（ｉ）患者が罹患している、または罹患する可能性のある疾病または状態が、サイクリン依存性キナーゼに対して活性を有する化合物による処置に感受性があるものであるかどうかを判定するために患者をスクリーニングすること、および（ｉｉ）患者の疾病または状態にそのような感受性があることが示された場合、その後、請求項１〜２４のいずれか一項で定義された４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの塩を患者に投与することを含む、方法。
  73. スクリーニングされ、サイクリン依存性キナーゼに対して活性を有する化合物による処置に感受性があると考えられる疾病または状態に罹患している、または罹患するリスクがあると判定された患者における病態または状態の処置または予防を目的とした薬剤の製造のための、請求項１〜２４のいずれか一項で定義された４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの塩の使用。
  74. 哺乳類において腫瘍増殖を阻害するのに用いるための、請求項１〜２４のいずれか一項で定義された４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩。
  75. （例えば、哺乳類における）腫瘍細胞の増殖を阻害するのに用いるための、請求項１〜２４のいずれか一項で定義された４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩。
  76. 哺乳類（例えば、ヒト）において腫瘍増殖を阻害する方法であって、その哺乳類（例えば、ヒト）に、有効に腫瘍増殖を阻害する量の請求項１〜２４のいずれか一項で定義された４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの付加塩を投与することを含む、方法。
  77. 腫瘍細胞（例えば、ヒトなどの哺乳類に存在する腫瘍細胞）の増殖を阻害する方法であって、その腫瘍細胞を、有効に腫瘍細胞の増殖を阻害する量の請求項１〜２４のいずれか一項で定義された４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドの酸付加塩と接触させることを含む、方法。
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