JP2008519603A - A群連鎖球菌属を検出するための組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】特に、きわめて低いレベルのA群連鎖球菌属核酸を検出するための増幅プライマー及びハイブリダイゼーションプローブとして有用なオリゴヌクレオチドを記載する。
【選択図】図1
Description
本出願は、2004年11月9日に出願された米国仮特許出願No.60/626,438に基づく優先権を主張する。この先行出願の開示内容全体を本明細書に援用する。
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関する。より具体的には、本発明はA群連鎖球菌属(Group A streptococci(GAS))を検出するための診断アッセイに関する。
本発明の第1の観点は、化膿連鎖球菌核酸を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイプローブに関する。このハイブリダイゼーションアッセイプローブは、標的相補的塩基配列、及び場合により、検出すべき核酸に対して相補的でない1以上の塩基配列を含む、プローブ配列を含む。標的相補的塩基配列は、配列番号3の配列に含まれる13〜22個の連続塩基又はその相補配列を含み、RNA及びDNAの同等物並びにヌクレオチド類似体が存在してもよい。一般に、ハイブリダイゼーションアッセイプローブは最高30塩基の長さであってもよい。好ましい態様において、プローブ配列は検出すべき核酸に対して相補的でない1以上の任意塩基配列を含む。より好ましくは、ハイブリダイゼーションアッセイプローブは検出可能な標識を含む。例えば、プローブは発蛍光団部分及び消光体部分を含むことができる。そのような場合、ハイブリダイゼーションアッセイプローブは分子ビーコン(molecular beacon)でもよい。分子ビーコンの例としては、配列番号23、配列番号24及び配列番号25からなる群から選択される標的相補的塩基配列があげられる。他の好ましい態様では、プローブ配列は、検出すべき核酸に対して相補的でない1以上の任意塩基配列を含まない。より好ましくは、このハイブリダイゼーションアッセイプローブは検出可能な標識を含む。検出可能な標識は、化学発光性標識及び蛍光標識でもよい。プローブの例としては、配列番号19、配列番号20及び配列番号21からなる群から選択される標的相補的塩基配列があげられる。
本発明の目的に関して以下の用語の意味は、そうではないことを本明細書に明記しない限り下記のとおりである。
「標的核酸」又は「標的」は、標的核酸配列を含む核酸を意味する。一般に、増幅すべき標的核酸配列は、向かいあって配置された2つのプライマーの間に位置し、各プライマーに対して完全に相補的な標的核酸部分を含むことになる。
本明細書に、血液、血漿、血清若しくは他の体液又は組織等の生物試料中のGAS核酸を選択的に検出するための組成物、方法及びキットを開示する。本発明のプライマー、プローブ及び方法は診断に使用できる。
本発明には、生物試料中のGAS核酸を検出するのに特に有用な組成物(プライマー及びプローブ)、方法及びキットが含まれる。当該用途に適切なオリゴヌクレオチド配列を設計するために、まず既知のGAS核酸配列を比較して、診断アッセイにおいて細菌ゲノムの標的として使用できる候補領域を同定した。これらの比較の結果、図1に模式的に示すプライマー及びプローブを用いる検出のための標的として、GASゲノム3つの異なる領域(配列番号1〜3)を選択した。増幅及び増幅した配列の検出に用いるのに適切な合成オリゴヌクレオチドを設計するための出発点として、比較した配列間で比較的変異が少ない配列部分を選択した。
本発明に関して有用な増幅方法としては、転写介在増幅(TMA)、核酸配列ベース増幅(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification、NASBA)、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、鎖置換増幅(Strand Displacement Amplification、SDA)、並びに自己複製ポリヌクレオチド分子と複製酵素、例えばMDV−I RNA及びQ−ベータ酵素を用いる増幅法があげられる。これら種々の増幅法を実施する方法は、各々米国特許第5,399,491号;公開欧州特許出願第0525882号;米国特許第4,965,188号;米国特許第5,455,166号;米国特許第5,472,840号;及びLizardi et al., BioTechnology 6:1197(1988)中に記載されている。核酸増幅反応の実施方法を記載したこれらの文献の開示内容を本明細書に援用する。
前記のように、「プライマー」は、核酸増幅反応に関与できる、場合により修飾されたオリゴヌクレオチドを表わす。好ましいプライマーには、鋳型核酸にハイブリダイズすることができ、かつDNAポリメラーゼ活性により延長される3’末端がある。プライマーの5’側領域は標的核酸に対して相補的でなくてもよい。5’側−非相補領域にプロモーター配列が含まれる場合を「プロモーター−プライマー」という。当業者であれば、プライマーとして機能できるいかなるオリゴヌクレオチド(すなわち、3’末端が標的配列に特異的にハイブリダイズし、かつDNAポリメラーゼ活性により延長されるようなオリゴヌクレオチド)をも5’側にプロモーター配列を含有させてプロモーター−プライマーとして機能できるように修飾できることを認識できるであろう。また、いかなるプロモーター−プライマーも、プロモーター配列を除去することにより修飾又はプロモーター配列なしで合成しても、依然としてプライマーとして機能できる。
特異的核酸ハイブリダイゼーションをモニターするのに使用できるいかなる標識系及び検出系も、本質的に本発明に使用できる。有用な標識群としては、放射性標識、酵素、ハプテン、結合オリゴヌクレオチド、化学発光性分子、蛍光性部分(単独で又は「消光体」部分と組み合わせて)、及び電気的検出法に適用できるレドックス活性部分があげられる。好ましい化学発光性分子としては、Arnoldらの米国特許第5,283,174号に開示される均一保護アッセイに用いられる系及びWoodheadらの米国特許第5,656,207号に開示される多数の標的を単一反応で定量するアッセイに用いられる系のアクリジニウムエステルがあげられる。これらの特許文献に含まれる開示内容を本明細書に援用する。好ましい電気的な標識法及び検出法は、米国特許第5,591,578号及び第5,770,369号並びにWO98/57158号に開示されており、当該開示内容を本明細書に援用する。本発明の標識として有用なレドックス活性部分としては、Cd、Mg、Cu、Co、Pd、Zn、Fe及びRu等の遷移金属があげられる。
本発明のプローブはポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド類似体を含み、場合によりそれに共有結合した検出可能な標識を保有する。プローブのヌクレオシド又はヌクレオシド類似体には窒素複素環塩基又は塩基類似体が含まれ、本ヌクレオシドが例えばホスホジエステル結合により互いに連結してポリヌクレオチドを形成している。したがって、プローブは一般的なリボ核酸(RNA)及び/又はデオキシリボ核酸(DNA)を含むことができるし、これらの分子の化学的類似体をも含むことができる。プローブ主鎖は当該技術分野で既知の様々な結合から構成できるが、これには1以上の糖−ホスホジエステル結合、ロックされた核酸(LNA)結合、ペプチド−核酸結合(「ペプチド核酸」という場合もある;Hyldig−Nielsenら、WO95/32305に記載)、ホスホロチオエート結合、メチルホスホナート結合、又はその組み合わせがあげられる。プローブの糖部分は、リボース若しくはデオキシリボース、又は2’−O−メチルリボース及び2’ハライド置換体(例えば2’−F)等の既知の置換基がある類似化合物でもよい。窒素塩基は、一般的な塩基(G、A、C、T、U)、その既知の類似体(例えばイノシン、すなわち「I」;The Biochemistry of the Nucleic Acids5-36, Adams et al.著,第11版,1992を参照)、プリン塩基又はピリミジン塩基の既知の誘導体(例えばN4−メチルデオキシグアノシン、デアザ−又はアザ−プリン類及びデアザ−又はアザ−ピリミジン類、5又は6位に置換基があるピリミジン塩基、2、6又は8位に改変又は置換した置換基があるプリン塩基、2−アミノ−6−メチルアミノプリン、O6−メチルグアニン、4−チオ−ピリミジン類、4−アミノ−ピリミジン類、4−ジメチルヒドラジン−ピリミジン類、及びO4−アルキル−ピリミジン(Cook、WO93/13121号を参照)、並びにポリマー中1以上の残基の代わりに主鎖に非窒素塩基が含まれる「非塩基」残基(Arnoldら、米国特許第5,585,481号を参照)でもよい。プローブはRNA及びDNA中の一般的な糖、塩基及び結合のみを含んでもよく、あるいは一般的な成分と置換体の両方を含んでもよい(例えば、メトキシ主鎖により結合した一般的な塩基、又は一般的な塩基及び1以上の塩基類似体を含む核酸)。
目的とする特性をもつ増幅プライマー及びプローブの設計に有用な指針を以下に記載する。GAS核酸の増幅及び探査に最適な部位は、約200塩基の連続配列内に各々約20塩基以上の長さの3つのGASゲノム保存領域である。1以上のプロモーター−プライマーを含む一組のプライマーについてみられる増幅度は、オリゴヌクレオチドがそれらの相補配列にハイブリダイズする能力、及びそれらが酵素により延長される能力を含む、幾つかの要因に依存する。ハイブリダイゼーション反応の程度及び特異性は多数の要因により影響されるので、それらの要因の操作が個々のオリゴヌクレオチド(標的に対して完全に相補的であっても、そうでなくても)の厳密な感度及び特異性を決定するであろう。アッセイ条件を変えたことに対する影響は当業者に既知であり、Hoganらの米国特許第5,840,488号に記載されており、その開示内容を本明細書に援用する。
増幅反応を行うのに有用なプライマーは、標的結合に関与せず、かつ増幅又は検出の操作に実質的に影響を与える可能性がなく、外来配列の存在を挿入するために、種々の長さであってよい。例えば、本発明の増幅反応を行うのに有用なプロモーター−プライマーには、GAS標的核酸にハイブリダイズするための少なくとも最小限の配列、及びその最小限の配列の上流に位置するプロモーター配列がある。しかし、増幅反応におけるプライマーの有用性を妨げずに、標的結合配列とプロモーター配列の間に配列を挿入してプライマーの長さを変えることができる。さらに、増幅プライマー及びプローブの長さは、目的とする相補配列をハイブリダイズするための最小限の必須要件にオリゴヌクレオチドの配列が適合する限り、任意に選択できる。
本発明の他の側面は、GAS核酸を検出するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用できるオリゴヌクレオチドに関する。GAS核酸中に存在する標的核酸配列を増幅する方法は、アンプリコンを検出するための任意の工程をさらに含んでもよい。この検出方法には、標的核酸配列又はその相補配列に緊縮ハイブリダイゼーション条件下で優先的にハイブリダイズすることにより検出に対して安定なプローブ:標的二本鎖を形成するハイブリダイゼーションアッセイプローブと被験試料とを接触させる工程が含まれる。次いで、被験試料中のGAS核酸の存在又は不存在の指標として、このハイブリッドが被験試料中に存在するかを判定する工程がある。これには、プローブ:標的二本鎖の検出があげられ、好ましくは均一系アッセイ系があげられる。
本発明の好ましい方法を後記の実施例により記載及び説明する。図1はGAS核酸の標的領域(濃い水平の実線で示す)を検出するために使用できる1つの系を模式的に示す。この系は、少なくとも3つのオリゴヌクレオチド(より短い実線で示す)を含む;1つのT7プロモーター−プライマー:これには、GAS配列に標的領域において特異的にハイブリダイズする配列、及びT7プロモーター配列(「P」)(二本鎖である場合にはT7 RNAポリメラーゼに対する機能性プロモーターとして作用する)を含まれる;1つの非T7プライマー:これには、T7プロモーター−プライマーを用いて標的領域配列から作成された第1鎖cDNAに特異的にハイブリダイズする配列が含まれる;並びに1つの標識プローブ:これにはこれら2つのプライマーを用いて増幅した標的領域の一部に特異的にハイブリダイズする配列が含まれる。
本発明には、細菌の核酸鋳型を用いてポリヌクレオチド増幅反応を行うためのキットも含まれる。ある好ましいキットとしては、標的相補的塩基配列を含有するハイブリダイゼーションアッセイプローブを含み、場合により、検出すべき標的を増幅するためのプライマー又は他の補助オリゴヌクレオチドがあげられる。他の好ましいキットとしては、インビトロ増幅反応において標的核酸を増幅するために使用できる一対のオリゴヌクレオチドプライマーがあげられる。キットの例としては、増幅すべきGAS核酸配列の対向鎖に対して相補的な第1及び第2増幅オリゴヌクレオチドがあげられる。キットはさらに、1以上のオリゴヌクレオチド検出プローブを含むことができる。本発明によるさらに他のキットは、増幅の前にGAS鋳型核酸を他の種から精製するための捕捉オリゴヌクレオチドをさらに含むことができる。
GAS核酸を検出するためのオリゴヌクレオチド
AE標識オリゴヌクレオチド
標準的実験法により、2’−OMeヌクレオチド類似体を用いてAE標識した合成オリゴヌクレオチドを製造した。AE標識した合成オリゴヌクレオチドの配列を表3に示す。
合成分子ビーコンを、2’−OMeヌクレオチド類似体を用いて標準的実験法により製造した。合成分子ビーコンの配列を表4に示す。
実施例2
増幅プライマーの同定
精製リボソームRNAを、プライマー対のセットを用いる増幅反応でGAS標的核酸源として用いた。開示内容が本明細書に援用される米国特許第5,399,491号の記載に本質的に従ってTMA反応を行った。種々のプライマー組み合わせについて、0又は50フェムトグラムのGAS rRNAを用いて増幅反応を実施した。水又は標的rRNAを、3pmol/反応のT7プライマー及び15pmol/反応の非T7プライマーを含有する増幅試薬(最終濃度:50mM TrisHCl(pH8.2〜8.5),35mM KCl,4mM GTP,4mM ATP,4mM UTP,4mM CTP,1mM dATP,1mM dTTP,1mM dCTP,1mM dGTP,20mM MgCl2,20mM N−アセチル−L−システイン及び5%(w/v)グリセロール)に添加した。混合物(15μl)を60℃で10分間インキュベートして42℃に5分間冷却した。M−MLV逆転写酵素及びT7 RNAポリメラーゼの混合物5μlを反応物に添加して渦撹拌した。次いで反応物を42℃で1時間インキュベートし、AE標識オリゴヌクレオチドを含有するプローブ試薬20μlを添加した。次いで反応物を60℃で15分間インキュベートして50μlの選択試薬を添加し、60℃で10分間インキュベートした。
アンプリコン産生のリアルタイムモニタリング
3’側−消光体に結合した制御ポアガラス(CPG)及び5’側−発蛍光団で標識したホスホルアミダイトを用いた標準固相ホスファイトトリエステル化学反応により、Perkin -Elmer(カリフォルニア州フォスター・シティー)EXPEDITEモデル8909自動合成装置でGASアンプリコンに対する結合特異性がある分子ビーコンを合成した。分子ビーコンの構築のため発蛍光団としてフルオレセインを用い、消光体としてDABCYLを用いた。分子ビーコンは全て2’−0Meヌクレオチド類似体を用いて構築した。CPG試薬及びホスホルアミダイト試薬はGlen Research Corporation(バージニア州スターリング)から購入した。合成後、濃水酸化アンモニウム(30%)で60℃2時間処理してプローブを脱保護し、固体支持体マトリックスから解離させた。次いで、当業者に慣用の標準法を用いてポリアクリルアミドゲル電気泳動後、HPLCでプローブを精製した。
Claims (16)
- 化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)核酸を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイプローブであって:
標的相補的塩基配列、及び場合により、検出すべき核酸に対して相補的でない1以上の塩基配列を含む、プローブ配列を含み、
ここで、前記標的相補的塩基配列は、配列番号3の配列に含まれる13〜22個の連続塩基又はその相補配列を含み、RNA及びDNAの同等物並びにヌクレオチド類似体が存在してもよく、
ここで、前記ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、最高30塩基の長さであり、化膿連鎖球菌由来の核酸にハイブリダイズする他の塩基配列を含まない、前記ハイブリダイゼーションアッセイプローブ。 - プローブ配列が前記の検出すべき核酸に対して相補的でない1以上の任意塩基配列を含む、請求項1のハイブリダイゼーションアッセイプローブ。
- さらに、検出可能な標識を含む、請求項2のハイブリダイゼーションアッセイプローブ。
- さらに発蛍光団部分及び消光体部分を含み、ハイブリダイゼーションアッセイプローブが分子ビーコンである、請求項2のハイブリダイゼーションアッセイプローブ。
- 標的相補的塩基配列が、配列番号23、配列番号24及び配列番号25からなる群から選択される、請求項4のハイブリダイゼーションアッセイプローブ。
- プローブ配列が検出すべき核酸に対して相補的でない1以上の任意塩基配列を含まない、請求項1のハイブリダイゼーションアッセイプローブ。
- さらに、検出可能な標識を含む、請求項6のハイブリダイゼーションアッセイプローブ。
- 検出可能な標識が化学発光性標識及び蛍光標識からなる群から選択される、請求項7のハイブリダイゼーションアッセイプローブ。
- 標的相補的塩基配列が、配列番号19、配列番号20及び配列番号21からなる群から選択される、請求項8のハイブリダイゼーションアッセイプローブ。
- 生物試料中に存在する可能性のある化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)核酸配列を増幅するためのキットであって:
3’末端標的相補的配列、及び、場合により、増幅すべき化膿連鎖球菌核酸配列に対して相補的でない第1プライマー上流配列を含む、第1プライマーであって、第1プライマーの3’末端標的相補的配列は、配列番号2の配列に含まれる20個の連続塩基を含み、RNA及びDNAの同等物並びにヌクレオチド類似体が存在してもよく;並びに
3’末端標的相補的配列、及び、場合により、増幅すべき化膿連鎖球菌核酸配列に対して相補的でない第2プライマー上流配列を含む、第2プライマーであって、第2プライマーの3’末端標的相補的配列は、配列番号1の配列に含まれる26個の連続塩基を含み、RNA及びDNAの同等物並びにヌクレオチド類似体が存在してもよい;
を含む、前記キット。 - 第1プライマー及び第2プライマーの長さが各々最高60塩基である、請求項10のキット。
- 第1プライマーの3’末端標的相補的配列及び第2プライマーの3’末端標的相補的配列の長さが各々最高33塩基である、請求項10のキット。
- 第2プライマーの3’末端標的相補的配列の長さが最高28塩基である、請求項12のキット。
- 第1プライマーが第1プライマー上流配列を含む、請求項13のキット。
- 第1プライマー上流配列がT7 RNAポリメラーゼに対するプロモーター配列を含む、請求項14のキット。
- 第1プライマーの3’末端標的相補的配列が、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12及び配列番号13からなる群から選択され、第2プライマーの3’末端標的相補的配列が、配列番号4、配列番号5、配列番号6及び配列番号7からなる群から選択される、請求項13のキット。
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