JP2008518613A - タンパク質を高レベルで発現する宿主細胞の選定 - Google Patents

タンパク質を高レベルで発現する宿主細胞の選定 Download PDF

Info

Publication number
JP2008518613A
JP2008518613A JP2007539588A JP2007539588A JP2008518613A JP 2008518613 A JP2008518613 A JP 2008518613A JP 2007539588 A JP2007539588 A JP 2007539588A JP 2007539588 A JP2007539588 A JP 2007539588A JP 2008518613 A JP2008518613 A JP 2008518613A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
sequence
polypeptide
selectable marker
expression
interest
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2007539588A
Other languages
English (en)
Other versions
JP5291341B2 (ja
Inventor
ピーター オッテ アリー
ヨハネス マリア ファン ブロクランド ヘンリカス
ヘンドリクス ヤコブス ワクス セオドラス
ゲオルグ アントニウス ベルナルダス セワルト リカルド
Original Assignee
クロマジェニックス ベー ヴェー
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by クロマジェニックス ベー ヴェー filed Critical クロマジェニックス ベー ヴェー
Publication of JP2008518613A publication Critical patent/JP2008518613A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP5291341B2 publication Critical patent/JP5291341B2/ja
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/46—Vector systems having a special element relevant for transcription elements influencing chromatin structure, e.g. scaffold/matrix attachment region, methylation free island
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES
    • C12N2840/206—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES having multiple IRES

Abstract

【解決手段】タイトル: タンパク質を高レベルで発現する宿主細胞の選定。要約: 本発明はDNA分子を提供し、それは、i) 真核生物宿主細胞において機能的な選定可能マーカポリペプチドについて、及びii) 興味あるポリペプチドについてのものをコードする5種の多シストロンの転写単位を備え、興味あるポリペプチドが、翻訳惹起配列で選定可能な10種のマーカポリペプチドのものからは別のものを持つものであって、興味あるポリペプチドについてのコード配列が、前記多シストロンの転写単位における選定可能なマーカについてのコード配列からは下流にあり、及び選定可能なマーカの15種のポリペプチドについてコードする核酸配列が、選定可能なマーカの翻訳効率を真核生物宿主細胞において減少させる変異を備えることにおいて特徴付けられる。本発明はまた、興味あるポリペプチドを発現する宿主細胞を得るための方法を提供し、前記宿主細胞は20種の本発明にかかるDNA分子を備える。本発明は更に、興味あるポリペプチドの生産を提供するもので、それは、DNA分子を本発明に従って備える宿主細胞を培養する工程を含む。

Description

本発明は、分子生物学及び生物工学の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は、タンパク質を高レベルで発現する宿主細胞の選定を改善するための手段及び方法に関する。
タンパク質は、例として生物製剤のような、生物学及び生物工学における広い応用範囲のために、種々の宿主細胞において生産することができる。真核生物及び特に哺乳類の宿主細胞は、多くのタンパク質を発現させるこの目的のために、例としてかかるタンパク質がグリコシル化のような一定の翻訳後修飾を持つときに、好ましい。かかる生産のための方法は、十分に確立されており、及び概して宿主細胞における核酸(また‘導入遺伝子’と称する)で興味あるタンパク質を暗号化するものの発現を伴う。一般に、導入遺伝子は選定可能なマーカー(マーカ)遺伝子と一緒に前駆細胞中に導入され、細胞を選定可能なマーカ遺伝子の発現について選定し、及び興味あるタンパク質を高レベルに発現する1又はそれよりも多い種類のクローンが識別され、及び興味あるタンパク質の発現のために用いられる。
導入遺伝子の発現と関連する1種の問題は、それが予測不可能であることであり、それは、導入遺伝子が遺伝子サイレンシングのために不活性になる高い見込みがあり(McBurney(マクバーニ)等、2002年)、及び従って多くの宿主細胞クローンを、導入遺伝子の高い発現について試験しなければならないことによる。
比較的高レベルの望ましいタンパク質を発現する組換え宿主細胞を選定する方法が知られている。
1種の方法は、選定可能なマーカタンパク質を、それらのコード配列においてマーカの機能は弱められるが、破壊されない変異と共に用いることを記述する(例はWO(国際公開)01/32901号パンフレット)。理論的根拠は、選定条件を採用するときに高レベルの変異マーカ発現が求められ、及び従って高発現のマーカについての選定が達成され、それに付随して、更に興味ある遺伝子を高レベルで発現する宿主細胞が選定される。
別の方法は、プロモータ配列の制御下に選定マーカ遺伝子を使用し、それは、プロモータがその対応する野生種の活性レベルよりも実質的に低い活性を持つように変異される(US(米国)特許5,627,033号明細書)。
別の方法は、障害のあるコンセンサスKozak(コザック)配列を有するネオマイシンリン酸転移酵素のような、障害のある優先的な選定可能マーカ配列を用い、選抜すべきコロニの数を減少させ、及び優先的な選定可能マーカに共-リンク(co-linked)する興味ある遺伝子の発現レベルを増加させることを記述する(US特許5,648,267及び5,733,779)。その中の好適例では、興味ある遺伝子は(人工的な)イントロン内で優先的な選定可能マーカにおいて配置される。興味ある遺伝子及び優先的な選定可能マーカは異なる転写性カセットにおいて存在し、及び各々がそれ自身の真核生物性プロモータをこの方法において含む(US特許5,648,267及び5,733,779)。
別の方法は、選定可能な遺伝子内で自然には起きないイントロンを含む選定可能なマーカ遺伝子の原理を用い、そこでは、イントロンは宿主細胞においてスプライスされ得、選定可能なタンパク質を暗号化するmRNAを提供し、及びそこでは、イントロンが選定可能な遺伝子において、選定可能な遺伝子から産生される選定可能なタンパク質のレベルを宿主細胞において減少させる(欧州特許第0724639Bl)。
さらに別の方法では、DNA構築物を用い、それは、有効なスプライス供与体(ドナ)配列を備える5’スプライス供与体部位によって規定(画成)されるイントロン内に位置する選定可能な遺伝子を備え、前記スプライス供与体部位を持つmRNAのスプライスの効率が、約80-99%、及び3’スプライス受容体部位、及び3’スプライス受容体部位の下流の興味ある生成物を暗号化する生成物遺伝子、選定可能な遺伝子及び同じ転写調節領域によって制御される生産物遺伝子の間にある(US特許5,561,053)。
一定の方法では、ポリシストロンの発現ベクター(ベクタ)構築物を用いる。この原理を用いる初期の報告は、ポリシストロンの発現ベクタを記述し、それは望ましいタンパク質及び選定可能なタンパク質の双方をコードする配列を含み、それは、コード配列が同じプロモータによって支配され、及び翻訳停止及び開始信号コドンによって分けられる(US特許4,965,196)。US特許4,965,196における好適例では、選定可能なマーカは増幅可能な(amplifiable)DHFR遺伝子である。US特許4,965,196において記述されるシステムの特に好適な具体例では、選定可能なマーカをコードする配列は、望ましいポリペプチドをコードするものから下流にあり、選定可能なマーカによって形質転換される細胞について選定するのに設計される手法がまた、望ましいタンパク質の特に高められる生産について選定する。
多シストロン(multicistronic)の発現ベクタの概念に基づく更なる改善において、バイシストロンのベクタが、組換えタンパク質を発現する安定な哺乳類細胞株(cell lines)の迅速で及び有効な創製について記述された。これらのベクタは、興味あるタンパク質のための上流コード配列及び選定マーカの下流コード配列間の内部(配列内)リボソーム進入部位(an internal ribosome entry site)(IRES)を含む(Rees(レース)等、1996年)。かかるベクタは、商業上入手可能で、例としてClontech (クロンテック社)からのpIRESlベクタである(CLONTECHniques(クロンテクニーク)、1996年10月)。かかるベクタの宿主細胞への導入のための使用、下流のマーカタンパク質の十分な発現の選定、次いで多シストロンのmRNAの高い転写レベルについての自動的な選定、及び従って興味あるタンパク質の高い発現のより一層強く高められた確率が、そのようなベクタを用いることで予想される。
好ましくはかかる方法において、用いるIRESは、選定マーカ遺伝子の比較的低いレベルの翻訳を与えるIRESであり、更に興味あるタンパク質の高い発現レベルを有する宿主細胞についての選定の機会を、選定マーカタンパク質の発現についての選定によって改善する(例は国際公開WO03/106684参照)。
本発明は、高いレベルの興味あるタンパク質を発現する宿主細胞の選定についての改善した手段及び方法を提供することを狙う。
(発明の概要)
本発明は、高レベルの興味あるポリペプチドを発現する宿主細胞を選定するための新しくて、及び独特な概念を用い、この概念を、本明細書において、‘相互の相互依存性翻訳(reciprocal interdependent translation)’と称する。従来技術の取り組みに関して、外のレベル(extra level)の調節を用い、多シストロンの転写物からの翻訳生成物の量を微-調整(fine-tune)することが独特であり、それによって、選定可能なマーカポリペプチドの翻訳レベルを低め、それによって同じ多シストロンの転写ユニット(単位)(transcription unit)上でコードされる興味あるポリペプチドの翻訳のレベルを増加させ、即ち、興味あるポリペプチドの発現レベルを、直接的に、及びより一層多くか又はより一層少なく相互に、選定可能なマーカポリペプチドの発現レベルから依存させる(概略図について図13参照)。対照的に、興味あるポリペプチド及び選定可能なマーカポリペプチドについてのコード配列の間のIRESを用いる取組みは(例はRees等、1996年)、双方のポリペプチドの独立の翻訳を含み、その結果、それらの取組みにおいて、選定可能なマーカポリペプチドの翻訳効率の、興味あるポリペプチドをコードする配列のものについて及ぼされる直接的効果は存在しない。
1種の局面において、本発明はi) 真核生物宿主細胞において機能的な選定可能なマーカポリペプチドについて、及びii) 興味あるポリペプチドについてをコードする多シストロンの転写単位を備えるDNA分子を提供し、それは、興味あるポリペプチドが、翻訳惹起(translation initiation)配列(及び開始(start)コドン)で、選定可能なマーカポリペプチドのものからは分けられるものを持つものであって、興味あるポリペプチドについてのコード配列が、前記多シストロンの転写単位において選定可能なマーカポリペプチドについてのコード配列からは下流にあり、及び選定可能なマーカポリペプチドについてコードする核酸配列が、選定可能なマーカの翻訳効率を真核生物宿主細胞において減らす変異を備えることにおいて特徴付けられる。好ましくは、選定可能なマーカの翻訳惹起効率を減少させる。好適例では、減少した翻訳惹起効率は、選定可能なマーカポリペプチドの非-最適翻訳開始配列(a non-optimal translation start sequence)を持つことによってもたらされる。
その好適例では、選定可能なマーカポリペプチドについてのコード鎖における翻訳開始配列は、開始コドンを規定するATG配列を備え、前記ATG配列は翻訳惹起についての非-最適な情況(context)において存在する。これは、最適の情況におけるATG開始コドンと比較するとき、開始コドンとしてのこのATGの減少した使用をきたす。
より一層好ましい具体例では、選定可能なマーカポリペプチドについてのコード鎖における翻訳開始配列が、GTG、TTG、CTG、ATT、又はACG配列の1種のようなATG開始コドンとは異なる開始コドンを備え、その最初の2種が最も好ましい。かかる非-ATGの開始コドンは好ましくは、開始コドンとして非-ATG配列の比較的良好な認識を提供する配列によって隣接され、そうして、これらの開始コドンからの少なくとも若干(some、いくつか)のリボソーム開始翻訳、即ち翻訳開始配列が、好ましくは配列ACC[非-ATG開始コドン]G又はGCC[非-ATG開始コドン]Gを備える。
好適例では、選定可能なマーカポリペプチドを暗号化する配列は、コード鎖次いで選定可能なマーカポリペプチドの開始コドンからその停止コドンを暗号化する配列までについてコードする配列において、及び興味あるポリペプチドの前記停止コドン及び開始コドンの間の同じ鎖における任意の配列においてATG配列を持たない(それは、開始コドンが、好ましくはATGによって同じコード鎖において規定される)。
その一定の具体例では、フレームにおいて存在し、及び野生-種の選定可能なマーカポリペプチドについてコードする配列においてメチオニンをコードする任意のATG配列は、バリン、スレオニン、イソロイシン又はロイシンについてコードするように変異される。
好適例では、選定可能なマーカタンパク質は、抗生物質のような選定剤の致死的及び/又は生育-抑制的な効果に対して抵抗性を提供する。
好ましくは、興味あるポリペプチドのコード配列は最適な翻訳開始配列を備える。
本発明は更に、本発明に従うDNA分子を備える発現カセットを提供し、それは、発現カセットが更に、プロモータで、多シストロンの発現単位の上流の、及び多シストロンの発現単位の惹起転写について真核生物宿主細胞において機能的であるものを備え、及び前記発現カセットが更に、多シストロンの発現単位の下流の転写終結配列を備える。
その好適例では、かかる発現カセットは更に、マトリクス又は足場付着領域(a matrix or scaffold attachment region)(MAR/SAR)、インスレータ配列(絶縁体配列)(insulator sequence)、遍在性染色質開口要素(a ubiquitous chromatin opener element)(UCOE)、及び抗-リプレッサ配列(STAR)からなる群より選ばれる少なくとも1種の染色質制御要素を備える。抗-リプレッサ配列はこの局面で最も好ましく、及び好適例においては、前記抗-リプレッサ配列は: a) 配列番号1(SEQ.ID.NO.1)から配列番号66まで; b) 配列番号1から配列番号66までの任意のものの断片で、前記断片が抗-リプレッサ活性を持つもの; c) ヌクレオチド配列においてa)又はb)に対して少なくとも70%同一である配列であって前記配列が抗-リプレッサ活性を持つもの; 及びd) a)からc)までの任意のものの相補物(complement)からなる群より選ばれる。一定の好適例では、前記抗-リプレッサ配列は: STAR(スタア)67(配列番号66)、STAR7(配列番号7)、STAR9(配列番号9)、STAR17(配列番号17)、STAR27(配列番号27)、STAR29(配列番号29)、STAR43(配列番号43)、STAR44(配列番号44)、STAR45(配列番号45)、STAR47(配列番号47)、STAR61(配列番号61)、及びこれらのSTAR配列の機能的な断片又は誘導体からなる群より選ばれる。一定の具体例では、発現カセットは、STAR67、又はその機能的な断片又は誘導体を、多シストロンの遺伝子の発現を駆動する(drives)プロモータの上流に位置されて備える。一定の具体例では、多シストロンの遺伝子は、両側を少なくとも1種の抗-リプレッサ配列によって隣接される。一定の好適例では、発現カセットは、本発明に従って提供され、3’から5’までの順序において: 抗-リプレッサ配列A-抗-リプレッサ配列B-[プロモータ-本発明に従う多シストロンの転写単位(機能的な選定可能マーカタンパク質及びその下流の興味あるポリペプチドを暗号化する)-転写終結配列]-抗-リプレッサ配列Cを備え、そこでは、A、B及びCが同じ又は異なってよい。
一定の具体例では、興味あるポリペプチドは、多量体タンパク質の1部分、例えば、免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖である。
本発明はまた、機能的な選定可能マーカポリペプチドを暗号化する配列を備えるDNA分子を提供し、かかるDNA分子は機能的な選定可能マーカポリペプチドの翻訳効率を真核生物宿主細胞において減少させる変異を備えることにおいて特徴付けられる。好ましくは、かかるDNA分子は: i) 非-最適翻訳開始配列に次いで別の機能的な選定可能マーカのコード配列を持ち、及びii) 非-最適開始コドンの下流の選定可能なマーカポリペプチドを規定する配列のコード鎖においてATG配列に欠ける。
本発明はまた、本発明に従うDNA分子を備える宿主細胞を提供する。
本発明は更に、興味あるポリペプチドを発現する宿主細胞を産生するための方法を提供し、この方法は、次の工程: 複数の前駆宿主細胞中に、本発明に従う発現カセットを導入する工程、選定可能なマーカポリペプチドの発現を選定する条件下で、細胞を培養する工程、及び興味あるポリペプチドを生産する少なくとも1種の宿主細胞を選定する工程を備える。
更なる局面において、本発明は、興味あるポリペプチドを生産するための方法を提供し、その方法は、宿主細胞を培養する工程で前記宿主細胞が本発明に従う発現カセットを備える工程、及び興味あるポリペプチドを発現カセットから発現させる工程を備える。その好適例では、興味あるポリペプチドは更に、宿主細胞から及び/又は宿主細胞の培地から分離される。
さらなる局面では、本発明は、本発明に従うDNA分子の転写生成物の配列を持つRNA分子を提供する。
別の局面では、本発明は、機能的な選定可能マーカポリペプチドで、そのアミノ酸配列においてメチオニンを欠損するものを提供し、それは、ポリペプチドが本発明に従う一定のDNA分子からの発現によって得られ得るものである。
(発明の詳細な記載)
1種の局面では、本発明は、i) 真核生物宿主細胞において機能的な選定可能なマーカポリペプチドについて、及びii) 興味あるポリペプチドについてコードする多シストロン転写単位を備えるDNA分子を提供し、それは、興味あるポリペプチドが翻訳惹起配列で選定可能なマーカポリペプチドのものからは分けられるものを持つものであって、それは、興味あるポリペプチドについてのコード配列が、前記多シストロン転写単位において選定可能なマーカについてのコード配列からは下流にあり、及び選定可能なマーカポリペプチドについてコードする核酸配列が、選定可能なマーカの翻訳効率を真核生物宿主細胞において減少させる変異を備えることにおいて特徴付けられる。かかるDNA分子は、高レベルの興味あるポリペプチドを発現する真核生物宿主細胞を得るために、選定可能なマーカポリペプチドの発現についての選定によって、本発明に従って用いることができる。続いて又は同時に、興味あるポリペプチドを発現する1種又はそれよりも多い種類の宿主細胞(群)を識別することができ、及び更に高レベルの興味あるポリペプチドを発現させるために用いることができる。
用語“モノシストロンの遺伝子”は、1種のポリペプチドを暗号化するRNA分子を提供し得る遺伝子として規定される。“多シストロンの転写単位”はまた、多シストロンの遺伝子とも言われ、少なくとも2種のポリペプチドを暗号化するRNA分子を提供し得る遺伝子として規定される。用語“バイシストロンの遺伝子”は、2種のポリペプチドを暗号化するRNA分子を提供し得る遺伝子として規定される。したがって、バイシストロンの遺伝子は、多シストロンの遺伝子の定義内に包含される。“ポリペプチド”は、本明細書で用いるように、ペプチド結合によってリンクされる少なくとも5つのアミノ酸を備え、及び例として、タンパク質又はその、サブユニット(亜単位)のような、1部分であり得る。大抵は、用語のポリペプチド及びタンパク質は、本明細書で互換的に用いる。“遺伝子”又は“転写単位”は、本発明で用いるように、染色体DNA、cDNA、人工的なDNA、それらの組合せ、及び同様のものを備えることができる。数種(several、5又は6くらい)のシストロンを備える転写単位は単一のmRNAとして転写される。従来の技術において用いる取組みとは対照的に、本発明にかかる多シストロンの転写単位において、そのRNA上に存在する第2のコード領域(即ちそれは興味あるタンパク質についてのもの)の翻訳は、第2のコード領域の翻訳惹起(iniation、initiation)についての翻訳再惹起(reinitiation)の部位又は内部リボソーム進入部位の使用に依存していないが、むしろそれは、第1のコード領域(即ちそれは選定可能なマーカタンパク質についてのもの)の翻訳の効率に、より一層多くの又はより一層少ない相互性様式(reciprocal manner): 選定可能なマーカのより一層高い翻訳レベル、興味あるタンパク質のより一層低い翻訳レベル及びその逆も同様であるものにおいて依存する。
本発明に従う多シストロンの転写単位は好ましくは、選定可能なマーカポリペプチド及び興味あるポリペプチドについての5’から3’までをコードするバイシストロンの転写単位である。それ故、興味あるポリペプチドは選定可能なマーカポリペプチドについてのコード配列から下流で暗号化される。
同じ転写単位上でのより一層多くのコード配列を、興味ある(第1の)ポリペプチド、例は第2の選定可能なマーカポリペプチドについて又は興味ある第2のポリペプチドについてコードするものの下流で含むこともまた、可能である。興味ある第1のポリペプチドについてのコード配列の下流のかかる外の(余分な)コード配列は、次いで好ましくは翻訳再惹起部位又は内部リボソーム進入部位(IRES)を暗号化する配列によって先導され、また、興味ある第2のポリペプチド又は第2の選定マーカポリペプチドが翻訳され、この場合において、より一層早期の(earlier)2種のコード配列から独立である。かかる具体例では、例として多量体タンパク質のサブユニットについて、例は免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖で、興味ある第1及び第2のポリペプチドとして(任意の順序において)暗号化されるコード配列を持ち、単一の多シストロン発現単位内での多量体タンパク質のサブユニットについてコードすることが可能である。しかし、興味ある異なるポリペプチドの発現について分かれた転写単位が用いられるのがまた、これらが多量体タンパク質の部分を形成するときには好ましい(例として例13参照: 抗体の重鎖及び軽鎖で、各々が分かれた転写単位によって暗号化され、これらの発現単位の各々が本発明に従うバイシストロンの発現単位である)。
本発明のDNA分子は、2本鎖DNAの形態で、選定可能なマーカポリペプチド及び興味あるポリペプチドに関して、コード鎖及び非-コード鎖を持つもので存在することができ、コード鎖は、翻訳されるRNAと、Uの代わりにTが存在することを除き、同じ配列を有する鎖である。それ故、AUG開始コドンは、コード鎖においてATG配列によってコードされ、及びRNAにおいてAUG開始コドンに対応するこのATG配列を含む鎖は、DNAのコード鎖と称される。開始コドン又は翻訳惹起配列は、実際上RNA分子において存在するが、これらが、かかるRNA分子についてコードするDNA分子において等しく具体化されると考えることができ; それ故どこで本発明が開始コドン又は翻訳惹起配列を言及しようと、前記DNA分子のコード鎖においてUの代わりにTが存在するけれども、RNA配列と同じ配列を持つ対応するDNA分子が含まれる必要があり、及び明確に他で指定される以外は、逆も同様であることは明らかである。つまり、例として開始コドンはRNAにおけるAUG配列であるが、DNAのコード鎖における対応するATG配列もまた本発明においてはもちろんのこと開始コドンと称される。同じことは、配列をコードする‘インフレーム(枠内)’の参照のために用いられ、アミノ酸に翻訳されるが、またDNA分子のコード鎖において対応するトリヌクレオチド配列として解釈されるべきであるRNA分子におけるトリプレット(三重項)(3つの塩基)を意味する。
多シストロンの遺伝子によって暗号化される選定可能なマーカポリペプチド及び興味あるポリペプチドのそれぞれは、それら自身の翻訳惹起配列を持ち、及び従って各々はそれら自身の開始コドン(並びに停止コドン)を持ち、即ちそれらは分かれたオープンリーディングフレーム(読み枠)によって暗号化される。
用語“選定マーカ”又は“選定可能なマーカ”は、典型的に、遺伝子及び/又はタンパク質で、その存在が直接的にか又は間接的に細胞において検出することができ、例えば、選定剤を不活化し、及び宿主細胞をその薬剤の致死的又は生育-抑制的な効果から保護するポリペプチド(例は抗生物質耐性遺伝子及び/又はタンパク質)に言及するのに用いる。別の可能性は、前記選定マーカが蛍光又は色堆積物(例は緑色蛍光タンパク質(GFP)及び誘導体(例はd2EGFP)、ルシフェラーゼ、lacZ、アルカリホスファターゼ、等)を誘導することであり、それらを用い、色堆積物を誘導するポリペプチドを発現する細胞を、例ではGFPを発現する細胞を選定するのに蛍光標示式細胞分取器(fluorescence activated cell sorter)(FACS)を用いて、選定することができる。好ましくは本発明に従う選定可能なマーカポリペプチドは、選定剤の致死的及び/又は生育-抑制的な効果に対して抵抗性を提供する。選定可能なマーカポリペプチドは、本発明のDNAによって暗号化される。本発明に従う選定可能なマーカポリペプチドは真核生物宿主細胞において機能的でなければならず、及び従って真核生物宿主細胞において選定されることができる。この規準を満たす任意の選定可能なマーカポリペプチドは、原則上本発明に従って用いることができる。かかる選定可能なマーカポリペプチドはこの技術においてよく知られており、及び真核生物宿主細胞クローンが得られるとき、日常的に用いられ、及び数種の(5又は6つくらいの)例を本明細書において提供する。一定の具体例において、本発明のために用いる選定マーカはゼオシン(zeocin)である。他の具体例では、ブラストサイジンが用いられる。当業者は他の選定マーカ、例はネオマイシン、ピューロマイシン、ブレオマイシン、ハイグロマイシン等が入手でき、及び使用することができることを知る。他の具体例では、カナマイシンを用いる。更に他の具体例では、DHFRの遺伝子を選定可能なマーカとして用い、それをメトトレキサートによって選定することができ、特にメトトレキサートの濃度を増加させることによって、細胞をDHFRの遺伝子の増加したコピー(コピ)数について選定することができる。同様に、グルタミンシンターゼ(GS)遺伝子を用いることができ、それについての選定が不十分なGS(例はNS-0細胞)を持つ細胞において、グルタミンを伴わない媒体において培養することによって、又は代わりに、十分なGSを持つ細胞(例はCHO細胞)においてGS抑制剤、メチオニンスルホキシミン(methionine sulphoximine)(MSX)を添加することによって可能である。使用できる他の選定可能なマーカ遺伝子、及びそれらの選定剤は、例としてUS特許5,561,053の表1に記述されており; また、これらの検討について、Kaufman(カウフマン)のMethods in Enzymology(メソッズ・イン・エンザイモロジィ)、185:537-566(1990年)を参照。
2種の多シストロンの転写単位が本発明に従い単一の宿主細胞において選定されるとき、各々のものは、好ましくは異なる選定可能なマーカについてのコード配列を含み、双方の多シストロンの転写単位のための選定を可能にする。もちろん、双方の多シストロンの転写単位は単一の核酸分子上に存在してもよく、又は代わりに各々のものは分かれた核酸分子上に存在してもよい。
用語“選定”は、典型的に選定マーカ/選定可能なマーカ及び選定剤を用い、特定の遺伝的特性を有する宿主細胞(例は宿主細胞がそのゲノム中に統合される導入遺伝子を含むもの)を識別する処理として規定される。当業者にとって、選定マーカの非常に多くの組合せが可能であることは明らかである。特に有利な1種の抗生物質はゼオシンであり、それは、ゼオシン-抵抗性タンパク質(ゼオシン-R)が薬物に結合し、及びそれを無害にすることによって作用するからである。したがって、低レベルのゼオシン-Rの発現を有する細胞を殺す薬物の量を滴定するのが容易である一方、高い発現体(high-expressors)を存続させるようにする。普通に用いるすべての他の抗生物質-耐性タンパク質は酵素であり、及び従って触媒的に作用する(薬物と1:1でない)。それ故抗生物質のゼオシンは好ましい選定マーカである。しかし、本発明はまた他の選定マーカと共に働く。
本発明に従う選定可能なマーカポリペプチドは、本発明に従う核酸によって暗号化されるタンパク質であり、そのポリペプチドは、例として抗生物質のような選定剤に対して抵抗性を提供するので、検出することができる。それ故抗生物質を選定剤として用いるとき、DNAはポリペプチドを暗号化し、それは選定剤に対して抵抗性を与え、そのポリペプチドが選定可能なマーカポリペプチドである。かかる選定可能なマーカポリペプチドについてコードするDNA配列は既知であり、及び選定可能なマーカタンパク質を暗号化するDNAの野生-種配列の数種の例を、本明細書に提供する(図26-32)。選定可能なマーカの変異体又は誘導体がまた、本発明に従って適切に用いられ得、及び従って用語‘選定可能なマーカポリペプチド’の範囲内に包含されることは、選定可能なマーカタンパク質がまだ機能的である限り、明らかである。便宜上及び当業者によって一般に受け入れられるように、多くの出版物並びに本明細書において、選定剤に対しての抵抗性を暗号化する遺伝子及びタンパク質は、‘選定可能な薬剤(抵抗性)遺伝子’又は‘選定剤(抵抗性)タンパク質’とそれぞれ称されることが多く、正称が異なるかもしれないが、例はネオマイシンに対する(並びにG418及びカナマイシンに対して)抵抗性を与えるタンパク質についてコードする遺伝子が、ネオマイシン(抵抗性)(又はネオr)遺伝子と称されることが多く、一方で正称はアミノグリコシド3’-リン酸転移酵素遺伝子である。
本発明のために、選定可能なマーカポリペプチドの発現の低いレベルを持つのが有益であり、結果として、ストリンジェントな(厳密な)選定が可能である。本発明では、これは非-最適翻訳効率を伴う選定可能なマーカのコード配列の使用によってもたらされる。選定の際、それでもなお十分なレベルの選定可能なマーカポリペプチドを持つ細胞だけを選定し、これは、かかる細胞が多シストロンの転写単位の十分な転写及び選定可能なマーカポリペプチドの十分な転写を持たなければならないことを意味し、それは、多シストロンの転写単位が統合され、又は別の方法で宿主細胞において、この転写単位からの発現レベルが高い場所で存在する細胞についての選定を提供する。本発明によれば、興味あるポリペプチドの翻訳の、マーカの翻訳効率のものからの(より一層多い又はより一層少ない)相互的な相互依存性の性質は、興味あるポリペプチドの高い翻訳レベルを確かにする。この高いレベルの翻訳は、厳密な選定条件によって選定される高い転写レベル上に重ねられる(superimposed)(及び宿主細胞における強いプロモータの使用から起因し、多シストロンの転写単位の転写を駆動する)。
本発明に従うDNA分子は、興味あるポリペプチドについてのコード配列の上流の選定可能なマーカポリペプチドについてのコード配列を持ち、興味あるポリペプチド及び選定可能なマーカポリペプチドの相互的な相互依存性の翻訳を伴う多シストロンの転写について提供する。それ故多シストロンの転写単位は、5’から3’への方向に(DNAの転写される鎖及び得られる転写されるRNAの双方において)選定可能なマーカポリペプチドについてのコード配列及び興味あるポリペプチドを暗号化する配列を備える。
本発明に従い、多シストロンの遺伝子のコード領域は好ましくは、キャップ-依存性ORFから翻訳され、及び従って原則として選定可能なマーカポリペプチドはまた、大量に生産される。本発明に従って選定可能なマーカのシストロンのかかる高い翻訳を防ぐのに、選定可能なマーカポリペプチドについてコードする核酸配列は変異を備え(読み枠(ORF)内又はORFに先行する翻訳惹起配列において、又は双方において)、それは選定可能なマーカポリペプチドの翻訳効率を真核生物宿主細胞において減少させる。翻訳効率は、対応する野生-種配列のものよりも同じ細胞において低いべきであり、即ち変異は、細胞当りの時間単位当たりでより一層少ないポリペプチド、及び従ってより一層少ない選定可能なマーカを招くべきである。このことは当業者に既知の日常的方法を用いて検出することができる。例として抗生物質の選定の場合において、変異はかかる変異及び従って正常な翻訳効率を持たない配列で得られるものよりも少ない抵抗性を招き、その違いを正常な選定期間後に生存するコロニの数を定めることによって容易に検出することができ、それは翻訳効率を減少させる変異(translation efficiency decreasing mutation)が存在するときにより一層低い。当業者によく知られるように、発現レベルのマーカポリペプチドを指し示す多数のパラメータがあり、それらは、細胞にまだ抵抗性がある選定剤の最大濃度、所定の濃度で生存するコロニの数、選定剤の存在下での細胞の生育(growth、増殖)速度(倍加時間)、上記のものの組合せ、及び同様のもののようなものである。
特に好適な具体例では、翻訳効率を減少させる変異は翻訳惹起効率を減少させる変異である。
これは例えば、本発明に従って非-最適翻訳開始配列を伴う選定可能なマーカポリペプチドのコード配列を提供することによって確立することができる。
例えば、真核生物細胞における選定可能なマーカ遺伝子の翻訳惹起効率は、本発明に従って、開始コドン及び/又はヌクレオチドを位置-3から-1及び+4までにおいて(そこではATGの開始コドンのAがnt+1である)、例として対応するDNA配列のコード鎖において変異させることによって適切に減少させ、非-最適翻訳開始配列を提供することができる。翻訳開始配列はこの分野において‘コザック(Kozak)配列’と称されることが多く、及び最適なKozak配列はRCCATGGであり、開始コドンに下線が引かれ、Rはプリンであり、即ちA又はGである(Kozak M、1986年、1987年、1989年、1990年、1997年、2002年参照)。それ故開始コドンそれ自体の他に、その情況、特にヌクレオチド-3から-1及び+4が関連し、及び最適翻訳開始配列は、最適な開始コドン(即ちATG)を最適な情況において備える(即ち直接RCCによって先行され、及び直接Gによって続くATG)。非-最適翻訳開始配列は、本明細書において、真核生物細胞における少なくとも若干の検出可能な翻訳を与える任意の配列として規定し(検出可能なのは、選定マーカポリペプチドが検出可能だからである)、及びコンセンサス配列(共通配列)RCCATGG(開始コドンに下線を引く)を持っていない。リボソームによる翻訳は好ましくは、第1の開始コドンで始まり、それは、mRNAの5’-キャップからのスキャンのときに遭遇し(スキャン機構)、及び最適なKozak配列が存在するときに最も有効である(Kozak M、1986年、1987年、1989年、1990年、1997年、2002年参照)。しかし、事象の小さい割合において、非-最適翻訳惹起配列が認識され、及びリボソームによって用いられ、翻訳が始められる。本発明はこの原則を利用し、及び翻訳及び従って選定可能なマーカポリペプチドの発現の量を減少させ、及び更にその微-調整さえも可能にし、従ってそれを用いて選定システムの厳密性を増加させることができる。
本発明の第1の具体例において、選定可能なマーカポリペプチドのATG開始コドンは(DNAのコード鎖で、RNAの転写生成物において対応するAUG開始コドンについてコードするものにおいて)、無傷のままにされるが、-3から-1及び+4までの位置は変異され、それらは最適なKozakの配列をもはや満たさず、即ち配列TTTATGTを翻訳開始部位として提供することによる(ATG開始コドンに下線を引く)。位置-3から-1及び/又は+4までの開始コドンまわりの他の変異を、本発明の教示の使用による同様な結果を伴って用いることができることは明確であり、それは当業者によって日常的に及び容易に試験されるからである。この第1の具体例の考えは、ATG開始コドンを、翻訳惹起についての‘非-最適’情況において配置することである。
第2の及び好適な例では、選定可能なマーカポリペプチドのATG開始コドンそれ自体を変異させる。これは概して、第1の具体例よりも更に低いレベルの翻訳惹起を導く。第2の具体例でのATG開始コドンは、別のコドンに変異され、それは、若干の翻訳惹起を提供するのを報告され、例として、GTG、TTG、CTG、ATT、又はACGに対するものである(本明細書においてまとめて‘非-最適開始コドン’と称する)。好適例では、ATG開始コドンはGTG開始コドンに変異される。これは、更に低い発現レベルで、無傷であるが非-最適の情況においてのATG開始コドンでのものよりも低いもの(より一層低い翻訳)を提供する。さらに好ましくは、ATG開始コドンはTTG開始コドンにまで変異され、それは、より一層低い発現レベルの選定可能なマーカポリペプチドで、GTG開始コドンでのものよりも低いものを提供する(Kozak M、1986年、1987年、1989年、1990年、1997年、2002年; また本明細書における例9-13参照)。
第2の具体例について、即ち非-ATG開始コドンを用いる場合、かかる開始コドンについての最適な情況を提供するのが強く好まれ、即ち非-最適開始コドンが位置-3から-1までにおいてヌクレオチドRCCによって直接先行され、及びGのヌクレオチド(位置+4)によって直接続くのが好ましい。しかし、配列TTTGTGG(開始コドンに下線を引く)を用いることで、若干の惹起が少なくともインビトロ(試験管内)において観察されることが報告されており、それで強く好まれるが、非-最適な開始コドンについての最適な情況を提供することが絶対的に要求されなくてよい。
ポリペプチドについてのコード配列内のATG配列を、ATG開始コドンを除外して、‘内部ATGs’と称し、及びこれらがORFを伴うフレームにおいてあり、及び従ってメチオニンについてコードする場合、ポリペプチドにおいて得られるメチオニンは‘内部メチオニン’と称される。本発明に従い、選定可能なマーカポリペプチドについてコードするコード領域(次いで開始コドン、必ずしも開始コドンを含んでいないもの)が、好ましくはDNAのコード鎖で、興味あるポリペプチドの開始コドンまで(であるが含まない)において、任意のATG配列を欠くのが強く好まれる(明らかに、興味あるポリペプチドの開始コドンがおそらく、及び事実上好ましくはATG開始コドンであり得る)。これは、任意のそのようなATG配列を選定可能なマーカポリペプチドのコード配列内で、次いでその開始コドンを変異させることによって確立することができる(上記教示から明らかなように、選定可能なマーカポリペプチドそれ自体の開始コドンはATG配列でよいが、必ずしもそうである必要はない)。この目的のため、好ましくは遺伝コード(暗号)の縮重を用い、選定可能なマーカポリペプチドにおいて可能な限りアミノ酸の変異を避ける。それ故ATGが選定可能なマーカポリペプチドを暗号化するDNA配列のコード鎖において存在する場合には、そのATGが選定可能なマーカポリペプチドORFを伴うフレームにおいて存在してなく、及び従って選定可能なマーカポリペプチドにおける内部メチオニンについてコードせず、ATGは、得られるポリペプチドがその内部アミノ酸配列において変異を持たないように変異され得る。ATGが内部メチオニンについてコードするイン-フレームのコドンである場合には、そのコドンは変異され得、及び得られる変異したポリペプチドは、選定可能なマーカポリペプチドの活性について日常的に検査され得る。このようにして、変異を選ぶことができ、それは、変異された選定可能なマーカポリペプチドを導き、それはまだそのように活性である(量的な相違が存在してよいが、それらはほとんど関連せず、及び事実上本発明の目的のための、ほとんど活性のない変異体を持つことは更に有益であり得; 最低必要なものは選定可能なマーカポリペプチドがまだ、真核生物細胞において選定され得ることである)。アミノ酸のバリン、スレオニン、イソロイシン及びロイシンは、メチオニンに対して構造的に類似し、及び従ってこれらのアミノ酸の1種についてコードするコドンは良好な開始性候補(starting candidates)であり、開始コドンの後のコード配列内でメチオニンの代わりに試験される。もちろん本発明の教示を用いて、熟練者は他のアミノ酸をも内部メチオニンの代わりに、コーディングDNAの変異についての日常的な分子生物学の技術、及び選定可能なマーカポリペプチドの機能性についての日常的な試験を用いて試験することができる。DNAを変異させることについての日常的な分子生物学の技術の他に、現在、選定可能なマーカポリペプチドのORFについての十分な長さを持つDNA配列を、随意に合成することが可能であり(必要ならサブクローン化工程を用いて)、及びかかる合成DNA配列を今日では、種々の会社から商業上注文され得る。それ故、本発明の教示を用いて、当業者は、本発明に従う適正な配列で、選定可能なマーカポリペプチドを暗号化するものを設計し(翻訳惹起を減少させる変異を伴い、及び好ましくは内部ATGsを持たないもの)、及びこの合成される配列を持つことができ、及びDNA分子の暗号化した選定可能なマーカの機能性について、DNA分子を真核生物宿主細胞において導入することによって試験し、及び機能的な選定可能マーカポリペプチドの発現について試験することができる。かかる配列の商業上の入手可能性はまた、内部ATG配列に欠ける選定マーカコード配列についての不当な負担を伴わずに提供するのを実行可能にし、そこでは、選定マーカポリペプチドの野生-種のコード配列が数個(5又は6くらい)のかかる内部ATGsを備える。
任意の内部ATG配列を欠損する選定可能なマーカポリペプチドについてのコード配列を提供することによって、選定可能なマーカポリペプチドの(第1の、非-最適)翻訳開始配列をそれに続く内部ATGのトリヌクレオチドで通過するリボソームによっての不用意な翻訳惹起の機会を小さくし、その結果、リボソームが第1の最適な翻訳開始配列、即ち興味あるポリペプチドのものについてスキャンし続ける。
選定可能なマーカのコード配列からのすべての内部ATG配列を除去することは、大部分のリボソームがかかる内部ATG配列を翻訳惹起開始部位として用いない限り、必ずしも厳密には要求されないことは明らかであり、それは、例としてかかる内部ATGsが通常、翻訳惹起についての最適な情況においてないからである。しかしまた、非-最適な状況におけるATG配列でさえ、重要な翻訳惹起の事象を引き起こすという事実を考慮して(概して最適な情況における非-ATG開始コドンからのものよりも一層高い)、また、数個の内部ATG配列が選定可能なマーカのコード領域において存在する場合、これらの各々はそれらのATGsで翻訳を開始するリボソームの一部分(画分)を引くことができ、それらが興味あるポリペプチドを暗号化する下流の翻訳単位に届くのを防ぎ、及び従って興味あるポリペプチドのより一層少ない発現を招くことも明らかである。これは、なぜ選定可能なマーカポリペプチドを暗号化する配列を持つのが好ましいかの理由であり、その配列は内部ATG配列を含まない(フリー)。場合により、必要に応じ、興味あるポリペプチドを翻訳するリボソームの比率が、任意の非-最適な潜在能力の翻訳惹起部位を選定可能なマーカポリペプチドについてコードする配列内で変異することによって更に高められることさえ可能である。
明らかに、選定可能なマーカの停止コドン及び興味あるポリペプチドの開始コドンの間のコード鎖において存在する任意の配列は、それがATG配列、又は他の非-最適な潜在能力の翻訳開始コドンを備えないように、容易に設計することができる。
明らかに、本発明に従い、興味あるポリペプチドの翻訳開始配列が、最適な翻訳開始配列を備え、即ち共通配列RCCATGG(開始コドンに下線を引く)を持つことが強く好まれる。これは、興味あるポリペプチドの非常に有効な翻訳を招く。
これらの尺度の結果として、本発明にかかる相互的な相互依存性の翻訳機構を提供し: 多シストロンの転写単位を含むmRNAのキャップからのリボソームのスキャン、及び小割合のリボソームが第1の読み枠、即ち選定可能なマーカタンパク質を翻訳し、それはこれが翻訳効率を減少させる変異を備えるからであり、一方で、大部分のリボソームがこの読み枠を通過し、及び興味あるポリペプチドの最適な翻訳惹起部位で翻訳を開始し、低レベルの選定可能なマーカタンパク質及び高レベルの興味あるポリペプチドを招く。数個のレベルの減少する翻訳効率を導く異なる変異を伴うマーカのコード配列を提供することによって、選定の厳密性を増加させ、及び興味あるポリペプチドの発現レベルを相互的に高くし、その結果、微-調整が可能であり: 例として選定可能なマーカポリペプチドについてのTTG開始コドンを用い、非常に少ないリボソームだけがこの開始コドンから翻訳され、非常に低いレベルの選定可能なマーカタンパク質、及び従って高い厳密性の選定が招かれ、及び同時にほとんどすべてのリボソームが興味あるポリペプチドを翻訳する。
本明細書において、これを非常に頑強な(robust)選定システムにおいて用いることができることを例証し、非常に多くの割合のクローンを導き、それは必要に応じて、興味あるポリペプチドを高レベルで発現する。加えて、興味あるポリペプチドについて得られる発現レベルは、より一層大きな数のコロニが今までに知られる選定システムを用いて選別されるときに得られるものよりも著しく高いと思われる。
減少した翻訳惹起効率に加え、また選定可能なマーカポリペプチドの減少した翻訳伸長(elongation)効率を、例はそのコード配列を変異させることによって、その結果、それは必要に応じて更にマーカポリペプチドの翻訳レベルを減少させ、及び更により厳密な選定条件を可能にするために、宿主細胞の数個の非-好適コドンを備えるのが有益であり得る。一定の具体例において、本発明に従って翻訳効率を減少させる変異(変異群)の他に、選定可能なマーカポリペプチドは更に、選定可能なマーカポリペプチドの活性をその野生-種の対応物と比較して小さくする変異を備える。これを用い、選定の厳密性を更にそれ以上に高めることができる。非-制限的な例として、ゼオシン抵抗性のポリペプチドにおいて位置9でのプロリンを変異させ、例はThrに又はPheにまで、及びネオマイシン抵抗性のポリペプチドについてアミノ酸残基182又は261又は双方が更に変異されてもよい(例はWO01/32901参照)。
本発明のいくつかの具体例では、いわゆるスペーサ配列を選定可能なマーカポリペプチドの開始コドンを暗号化する配列の下流に配置し、そのスペーサ配列は好ましくは、開始コドンを有するフレームにおける配列であり、及び少数(few)のアミノ酸を暗号化し、及びそれは二次構造を含まず(Kozak、1990年)、及び配列ATGを含まない。かかるスペーサ配列を用い、選定可能なマーカポリペプチド(例はゼオシンについて、場合によりブラストサイジンについて)の二次構造がRNA(Kozak、1990年)において存在する場合に、更に翻訳惹起頻度を減少させ、及び従って本発明に従う選定システムの厳密性を増加させることができる。
本発明はまた、DNA分子を提供し、それは本発明に従う選定可能なマーカタンパク質を暗号化する配列を備え、そのDNA分子は、変異が設けられ、それは機能的な選定可能なマーカポリペプチドの翻訳効率を真核生物宿主細胞において減少させる。その好適例では、前記DNA分子は、コード鎖において: i)前記選定可能なマーカポリペプチドを暗号化する野生-種配列に比較して変異され、その配列ATGはコード領域それに次ぐ機能的な選択可能なマーカタンパク質の開始コドンから前記機能的な選定可能なマーカタンパク質の読み枠までで不存在であり; 及びii)機能的な選定可能なマーカポリペプチドの非-最適翻訳開始配列を持つ。特長i)及びii)は再び上記記載に従って設けられ得る。かかるDNA分子は、本発明に従う有用な中間生成物を包含する。これらの分子は、最初に調製し、真核生物宿主細胞中に導入し、及び機能性について(若干のマーカについてはこれが更に原核生物宿主細胞において可能である)、必要に応じ(半-)定量的様式において、選定可能なマーカポリペプチドのものを試験することができる。次いで、それらを更に用い、本発明に従うDNA分子を調製し、それは多シストロンの転写単位を備える。
本発明の好適な局面は、本発明に従うDNA分子を備える発現カセットを提供することであり、それは多シストロンの転写単位を持つ。かかる発現カセットは、興味ある配列を、例として宿主細胞において発現させるのに有用である。‘発現カセット’は、本明細書において用いるように、発現が望まれる配列に機能的にリンクするプロモータを少なくとも備える核酸配列である。好ましくは発現カセットは、更に転写終結及びポリアデニル化配列を含む。エンハンサ(増強物)のような他の調節性配列をも含むことができる。それ故本発明は発現カセットを提供し、それは、次の順序で: 5’-プロモータ-本発明に従う多シストロンの転写単位で選定可能なマーカポリペプチド及びその下流の興味あるポリペプチドをコードするもの-転写終結配列-3’を備える。プロモータは真核生物宿主細胞において機能化可能でなければならず、即ちそれは、多シストロンの転写単位の転写を駆動することができなければならない。発現カセットは、更に随意にこの技術で既知の他の要素、例はイントロンを備えるためのスプライス部位、及び同様のものを含むことができる。いくつかの具体例において、イントロンはプロモータの背後及び選定可能なマーカポリペプチドを暗号化する配列の前に存在する。
タンパク質を暗号化する核酸配列の発現を得るため、かかる発現を駆動することができる配列を、タンパク質を暗号化する核酸配列に機能的にリンクさせることができ、タンパク質を暗号化する組換え核酸分子を発現可能な形式において招くことができることが、この技術の熟練者にはよく知られている。本発明において、発現カセットは多シストロンの転写単位を備える。概してプロモータ配列は発現すべき配列の上流に配置する。大いに用いられる発現ベクタはこの技術において入手可能であり、例はInvitrogen(インビトロゲン社)のpcDNA及びpEFベクタシリーズ、BD Sciences(BDサイエンジーズ社)からのpMSCV及びpTK-Hyg、Stratagene(ストラタジーン社)からのpCMV-Script(スクリプト)、等であり、これらを用いて適切なプロモータ及び/又は転写終結配列、ポリA配列、及び同様のものを得ることができる。
興味あるポリペプチドを暗号化する配列が、暗号化ポリペプチドの転写及び翻訳を支配する配列に関連して適切に挿入される場合、得られる発現カセットは興味あるポリペプチドを生産するのに有用であり、発現ベクタと称する。発現を駆動する配列には、プロモータ、エンハンサ及び同様のもの、及びそれらの組合せが包含される。これらは、宿主細胞において機能し得るべきであり、それによって、それらに機能的にリンクする核酸配列の発現を駆動する。当業者は、種々のプロモータを用いて遺伝子の発現を宿主細胞において得ることができることに気付く。プロモータは、構成的であってよく又は調節することができ、及び種々の起源から、ウイルス、原核生物、又は真核生物の供給源、又は人工的に設計されたものを含めたものから得ることができる。興味ある核酸の発現は、自然のプロモータ又はその誘導体から、又は完全に異種のプロモータからのものでよい(Kaufman、2000年)。いくつかのよく知られ、及び大いに真核生物細胞において発現のために用いられるプロモータには、アデノウイルスのような、ウイルスから導かれるプロモータ、例はE1Aプロモータ、CMV最初期(immediate early、IE)プロモータ(本明細書においてCMVプロモータと称する)(例としてpcDNA、Invitrogenから得られ得る)のような、サイトメガロウイルス(CMV)から導かれるプロモータ、Simian(サル)ウイルス40(SV40)から導かれるプロモータ(Das(ダス)等、1985年)、及び同様のものが含まれる。適切なプロモータはまた、メタロチオネイン(methallothionein、metallothionein)(MT)プロモータ類、伸長因子(elongation factor)1α(EF-lα)プロモータ(Gill(ギル)等、2001年)、ユビキチンC又はUB6プロモータ(Gill等、2001年; Schorpp(ショルプ)等、1996年)、アクチンプロモータ、免疫グロブリンプロモータ、熱ショックプロモータ、及び同様のもののように、真核生物細胞から導くことができる。真核生物細胞における発現を得るための若干の好適なプロモータは、本発明において適切なプロモータであり、CMV-プロモータ、哺乳類EF1-アルファプロモータ、ユビキチンCプロモータのような哺乳類ユビキチンプロモータ、又はSV40プロモータ(例はpIRES、カタログ番号(cat.no.)631605、BD Sciencesから得られ得る)である。プロモータ機能及びプロモータの強度についての試験は、当業者にとって日常的な事項であり、及び概して例として、lacZ、ルシフェラーゼ、GFP、等のようなプロモータ配列の後の試験遺伝子をクローン化すること、及び試験遺伝子の発現についての試験が包含される。もちろん、プロモータは、それにおいて、配列の欠失、付加、変異によって変え、及び機能性について試験し、新しい、減弱した、又は改善したプロモータ配列を見出すことができる。本発明に従って、選んだ(of choice)真核生物細胞において高い転写レベルを与える強力なプロモータが好ましい。
一定の具体例では、本発明に従うDNA分子はベクタの部分で、例はプラスミドである。かかるベクタは、当業者によく知られる方法によって容易に操作することができ、及び例として原核生物及び/又は真核生物細胞において複製が可能であるように設計することができる。加えて、多くのベクタは、直接的に、又はそれからの分離した望ましい断片の形態において、真核生物細胞の形質転換のために用いることができ、及び全体において又は部分において、かかる細胞のゲノム中に統合され、望ましい核酸をそれらのゲノムにおいて備える安定な宿主細胞を招く。
慣習的な発現システムは、組換えプラスミド又は組換えウイルスゲノムの形態におけるDNA分子類である。プラスミド又はウイルスゲノムを(真核生物宿主の)細胞中に導入し、及び好ましくは、それらのゲノム中に、この技術で既知の方法によって統合する。好適例では、本発明はまた、これらの種類のDNA分子類を用い、その優れた導入遺伝子発現システムを送達する。本発明の好適例は、発現システムの送達のためのプラスミドDNAの使用である。プラスミドは多数の成分が含まれる: 慣習的な成分で、この技術において既知のもので、複製の開始点及び細菌細胞におけるプラスミドの繁殖(propagation)のための選定可能なマーカであり; 選定可能なマーカで、真核生物細胞において機能し、統合された導入遺伝子の発現システムを運ぶ宿主細胞を識別し、及び分離するもの; 興味あるタンパク質で、その高-レベルの転写が、真核細胞において機能的なプロモータによってもたらされるもの(例はヒトのサイトメガロウイルスの主要な最初期プロモータ/エンハンサ、pCMV(Boshart(ボッシャート)等、1985年); 及び興味ある導入遺伝子及び選定可能なマーカのためのウイルス転写ターミネータ類(例はSV40のポリアデニル化部位(Kaufman及びSharp(シャープ)、1982年)である。
用いるベクタはクローン化DNAのために適切なもので、及び興味ある核酸の転写のために用いることができる任意のベクタでよい。宿主細胞を用いるとき、ベクタが統合ベクタ(integrating vector)であるのが好ましい。代わりに、ベクタはエピソーム的な(episomally)複製性ベクタであってよい。
染色質の構造及び他の後成的な制御機構が真核生物細胞における導入遺伝子の発現に影響を及ぼすかもしれないことは広く理解されている(例はWhitelaw(ホワイトロー)等、2001年)。本発明に従う多シストロンの発現単位は、むしろ厳格な選定の統治(rigourous selection regime)を有する選定システムの部分を形成する。これは、概して選んだ宿主細胞における高い転写レベルを必要とする。厳格な選定の統治が存続する宿主細胞のクローンを知見する機会が増加するように、及び場合によっては、得られるクローンにおいて発現の安定性が増加するように、概して転写の予測性を増加させることが好ましい。したがって、好適例では、本発明に従う発現カセットは更に、少なくとも1種の染色質制御要素を備える。‘染色質制御要素’は、本明細書で用いるように、DNA配列類についての集合的な用語であり、それは、どういうわけか(somehow)染色質構造上、及びそれと共に発現レベル及び/又はそれらの近傍における導入遺伝子の発現の安定性の上での影響を(それらは‘イン・シス(in cis)’で機能し、及び従って導入遺伝子から好ましくは5kb内、より一層好ましくは2kb内、更により一層好ましくは1kb内である)真核生物細胞内に持つ。かかる要素は時々用いられ、望ましいレベルの導入遺伝子の発現を持つクローンの数を増加させる。機構は、それによってこれらの要素が働くが、異なるクラスのかかる要素について、及びその内側でさえも異なってよく、及びすべての種類のかかる要素について完全には知られていない。しかし、かかる要素が記述され、及び本発明の目的のために、染色質制御要素を、マトリクス又は足場付着領域(MARs/SARs)(例はPhi-Van(フィ-ファン)等、1990年; WO02/074969、WO2005/040377)、ベータ-グロビンのインスレータ要素(ニワトリのベータ-グロビン遺伝子座(locus)の5’HS4)のようなインスレータ(West(ウエスト)等、2002年)、scs、scs’、及び同様のもの(例はChung(チャン)等、1993年、1997年; Kellum(ケルム)及びSchedl(シェーデル)、1991年; WO94/23046、WO96/04390、WO01/02553、WO2004/027072)、遍在性染色質開口要素(opening element)(UCOE)(WO00/05393、WO02/24930、WO02/099089、WO02/099070)、及び抗-リプレッサ配列(また‘STAR’配列と称する)(Kwaks(クワクス)等、2003年; WO03/004704)からなる群より選ぶ。この発明で用いることができるMAR/SAR配列の非-制限的な例は、ニワトリのリゾチーム5’MAR(Phi-Van等、1990年)又はその断片で、例はWO02/074969)において記述されるようなB、K及びF領域; DNA配列で、少なくとも1種のベント(bent)DNA要素及び少なくとも1種のDNA結合タンパク質についての結合部位を備えるもので、好ましくは少なくとも10%のジヌクレオチドTA、及び/又は少なくとも12%のジヌクレオチドATを、WO2005/040377における配列番号(SEQ ID Nos)1から27までの配列を備える群から選ばれる配列のような、100の近接する塩基対のストレッチ(伸縮)上に含むもの、WO2005/040377における配列番号1から27までの任意のものの断片で、長さで少なくとも100のヌクレオチドであり、及びMAR活性を持つもの、配列で、ヌクレオチド配列においてWO2005/040377における配列番号1から27の任意のものと少なくとも70%同一であるか、又はそれらの断片で、及びMAR活性を持つものであり、そこでは、MAR活性は、核マトリクス/足場にインビトロで結合するか、及び/又はプロモータに操作可能に連結するコード配列の発現を変えることができるものとして規定され; WO 02/074969における配列番号1から5までの任意のもの、WO 02/074969における配列番号1から5までの任意のものの断片で、及びMAR活性を持つもの、配列で、ヌクレオチド配列においてWO 02/074969における配列番号1から5までの任意のものに対して少なくとも70%同一であるもの、又はその断片で、及びMAR活性を持つものから選ばれる配列; WO 2004/027072における配列番号1及び配列番号2、それらの機能的な断片、及びそれに少なくとも70%同一な配列から選ばれる配列である。本発明において用いることができるインスレータ配列の非-制限的な例は、WO 01/02553の配列番号lを備える配列である。本発明において用いることができるUCOEsの非-制限的な例はWO 02/24930の図2及び7に描写される配列、それらの機能的な断片及びそれらに少なくとも70%同一な配列である一方で、まだ活性を保持するもの; US 2005/181428の配列番号28を備える配列、それらの機能的な断片、及びそれらに少なくとも70%同一である配列である一方でまだ活性を保持する配列である。
好ましくは前記染色質制御要素は抗-リプレッサ配列であり、好ましくは: a) 配列番号1から配列番号66までの任意のもの; b) 配列番号1から配列番号66までの任意のものの断片で、前記断片が抗-リプレッサ活性を持つもの(‘機能的な断片’); c) ヌクレオチド配列においてa)又はb)に対して少なくとも70%同一である配列で、前記配列が抗-リプレッサ活性を持つもの(‘機能的な誘導体’); 及びd) a)からc)までの任意のものに対する相補物からなる群より選ばれる。好ましくは前記染色質制御要素は、STAR67(配列番号66)、STAR7(配列番号7)、STAR9(配列番号9)、STAR17(配列番号17)、STAR27(配列番号27)、STAR29(配列番号29)、STAR43(配列番号43)、STAR44(配列番号44)、STAR45(配列番号45)、STAR47(配列番号47)、STAR61(配列番号61)、又は前記STAR配列の機能的な断片又は誘導体からなる群より選ばれる。特に好ましい具体例において、前記STAR配列は、STAR配列67(配列番号66)又はそれらの機能的な断片又は誘導体である。一定の好適例では、STAR 67又はその機能的な断片又は誘導体を、多シストロンの転写単位の発現を駆動するプロモータの上流に位置させる。他の好適例では、本発明に従う発現カセットを、双方の側上で少なくとも1種の抗-リプレッサ配列によって隣接させる。
抗-リプレッサ活性を持つ配列は、本明細書において用いるようなもので、HPl又はHPC2タンパク質の抑圧的な効果に、これらのタンパク質がDNAに繋ぎ止められるときに、少なくとも部分において対抗し得る配列である。抗-リプレッサ活性を持つ配列(また時々、本明細書において抗-リプレッサ配列又は抗-リプレッサ要素と称する)で本発明にとって適切なものは、WO03/004704において開示されており、本明細書において参考として組み込み、及びそこで作られた(coined)“STAR”配列であった(配列を本明細書においてSTAR配列と称するときは、この配列は本発明に従い抗-リプレッサ活性を持つ)。非-制限的な例として、66種の抗-リプレッサ要素の配列は、名付けられたSTAR l-65(WO03/004704参照)及びSTAR67の配列であり、本明細書において配列番号1-65及び66として、それぞれ提示される。
本発明に従い、所定の抗-リプレッサ要素の機能的な断片又は誘導体は、それがまだ抗-リプレッサ活性を持つとき、前記抗-リプレッサ要素と等価と考えられる。かかる抗-リプレッサ活性の存在は、当業者によって、例として以下に記載するアッセイによって、容易に検査することができる。機能的な断片又は誘導体は、分子生物学の当業者によって、所定の抗-リプレッサ配列を用いた開始、及び欠失、付加、置換、逆転及び同様のものの作製により、容易に得ることができる(例はWO03/004704参照)。機能的な断片又は誘導体はまた、他の種からの相同分子種を備えることができ、それは、当業者によって既知の方法により既知の抗-リプレッサ配列を用いて見出すことができる(例はWO03/004704参照)。それ故本発明には、抗-リプレッサ配列の断片が包含され、そこでは前記断片はまだ抗-リプレッサ活性を持つ。本発明はまた、ヌクレオチド配列において、前記配列で抗-リプレッサ活性を持つもの、又はそれらの機能的な断片で抗-リプレッサ活性を持つものに対して少なくとも70%同一である配列を、これらの少なくとも70%同一である配列が本発明に従う抗-リプレッサ活性をまだ持つ限り、包含する。好ましくは前記配列は、参照する自然の配列又はその機能的な断片に対し、少なくとも80%同一、より一層好ましくは少なくとも90%同一及びまだ更に好ましくは少なくとも95%同一である。所定の配列の断片に関して、同一性の割合(percent identity)は、断片において見出される参照する自然の配列の部分に言及する。
本発明に従う抗-リプレッサ活性を持つ配列は、種々の方法、制限されないが、ヒトゲノムから、又は別の有機体のゲノムからのクローン化を含め、それらによって、又は例としてかかるゲノムから直接的に既知の抗-リプレッサ配列を、配列の知識を用いることによって、例はPCRによって増幅することにより得ることができ、又は部分において又は全体として化学的に合成することができる。
抗-リプレッサ活性を持つ配列、及びその機能的な断片又は誘導体を、本明細書においてそれらの配列によって構造的に規定し、及び加えて、機能的に抗-リプレッサ活性を持つ配列として規定し、それらは以下に記載するアッセイを用いて定めることができる。
本発明に従う抗-リプレッサ活性を持つ任意の配列は、少なくとも次の機能的なアッセイを生き残ることができるべきである(WO 03/004704、例1参照、参考として本明細書に組み込む)。
ヒトのU-2 OS細胞(ATCC HTB-96)は、pTet-Offのプラスミド(Clontech K1620-A)で、及びLexAのDNA結合ドメイン及びいずれかのHPl又はHPC2のコード領域を含むLexA-リプレッサの融合タンパク質を暗号化する核酸で(DNAに繋ぎ止められときに遺伝子発現を抑止するショウジョウバエ(Drosophila)のPolycomb(ポリコーム)群のタンパク質; アッセイはいずれかの融合タンパク質と共に働く)、Tet-Offの転写調節性システムの制御下に、安定に形質移入(トランスフェクト)される(Gossen(ゴッセン)及びBujard(ブハード)、1992年)。これらの細胞は、以下に抗-リプレッサ活性のアッセイについてのレポータ細胞と称する。レポータプラスミドは、ハイグロマイシン耐性を提供し、4つのLexAオペレータ部位及びSV40プロモータの間に位置するポリリンカ配列を含み、それはゼオシン耐性遺伝子を制御する。抗-リプレッサ活性について試験すべき配列は前記ポリリンカにおいてクローン化することができる。適切な、pSelectのようなレポータプラスミドの構築は、例1及びWO 00/004704の図1において記載する。レポータプラスミドをレポータ細胞中に形質移入し、及び細胞をハイグロマイシン選定の下で培養する(25μg/mL; レポータプラスミドの存在についての選定)及びテトラサイクリンの抑止(ドキシサイクリン、10ng/mL; LexA-リプレッサの融合タンパク質の発現を防ぐ)。これらの条件下での生育の1週間後、ドキシサイクリンの濃度を0.1ng/mLにまで減少させ、LexA-リプレッサ遺伝子を誘導し、及び2日後にゼオシンを250μg/mLまで添加する。細胞を5週間、コントロール(対照)培養物(空のレポータプラスミドで形質移入した、即ちポリリンカにおいてクローン化した抗-リプレッサ配列を欠く)がゼオシンによって殺されるまで培養する(このコントロールプラスミドでは、SV40プロモータはLexA-リプレッサ融合タンパク質によって抑止され、それはLexAの作動部位に繋ぎ止められ、かかる細胞においてゼオシン選定を生き残るのに不十分なゼオシン発現を招く)。配列は、本発明に従う抗-リプレッサ活性を持ち、もし前記配列がレポータプラスミドのポリリンカにおいてクローン化されるとき、レポータ細胞がゼオシン下に5週間の選定を生き残る。かかるコロニからの細胞はまだ、ゼオシンを含む新しい媒体上で、5週間のゼオシン選定後も繁殖するが、抗-リプレッサ配列を欠くレポータプラスミドで形質移入される細胞は、ゼオシンを含む新しい媒体上で繁殖することができない。5週間のゼオシン上での後このアッセイにおいてかかる生育を与えられ得ない任意の配列は、抗-リプレッサ活性を持つ配列、又は本発明に従うその機能的な断片又は機能的な誘導体として認定されない。例として他の既知の、Van der Vlag(ファン・デル・フラグ)等によって(2000 年)試験されるもののような染色質制御要素には、ショウジョウバエのscs(Kellum(ケルン)及びSchedl(シェデル)、1991年)、ニワトリのβ-グロビン遺伝子座の5’-HS4(Chung等、1993年、1997年)又はMatrix Attachment Regions(マトリックス付着領域)(MARs)(Phi-Van等、1990年)を含み、このアッセイを生き残れない。
加えて、抗-リプレッサ配列又はその機能的な断片又は誘導体が、レポータ遺伝子(例はルシフェラーゼ、GFP)をフランキング(隣接)するとき、U-2 OS又はCHOの細胞のゲノム中に統合され、前記レポータ遺伝子が、抗-リプレッサ配列によって隣接されないか、又はショウジョウバエのscsのようなより一層弱い抑止のブロッキング配列によって隣接されるときに比較して、レポータの過剰-発現をするクローン(reporter over-expressing clones)のより一層高い割合を与えるのが好ましい。これは、例として、pSDHベクタ、又は同様なベクタ類を用い、例1及びWO 03/004704の図2において記載するように、確認することができる。
抗-リプレッサ要素はタンパク質の生産についての3種の結果の少なくとも1種を持つことができる: (1)それらは、タンパク質を産業上許容可能なレベルで発現する宿主細胞株を識別する予測性を高める(それらは、隣接する異質(ヘテロ)染色質の能力を損ない、導入遺伝子を沈黙(サイレンス)させ、その結果、統合の位置が発現上のより一層少ない明白な効果を持つ); (2)それらは、増加されるタンパク質収量を伴う宿主細胞株を招く; 及び/又は(3)それらは、より一層安定なタンパク質の生産を延長される培養の間に見せる宿主細胞株を招く。
任意のSTAR配列を、本発明に従う発現カセットにおいて用いることができるが、次のSTAR配列が特に有用である: STAR67(SEQ.ID.NO.66)、STAR7(SEQ.ID.NO.7)、STAR9(SEQ.ID.NO.9)、STAR17(SEQ.ID.NO.17)、STAR27(SEQ.ID.NO.27)、STAR29(SEQ.ID.NO.29)、STAR43(SEQ.ID.NO.43)、STAR44(SEQ.ID.NO.44)、STAR45(SEQ.ID.NO.45)、STAR47(SEQ.ID.NO.47)、STAR61(SEQ.ID.No.61)、又はこれらのSTAR配列の機能的な断片又は誘導体。
一定の具体例では、前記抗-リプレッサ配列、好ましくはSTAR67は、前記プロモータの上流に配置し、好ましくは2kb未満が、抗-リプレッサ配列の3’端及びプロモータ配列の開始の間に存在する。好適例では、1kb未満、より一層好ましくは500未満のヌクレオチド(nt)、まだ更に好ましくは約200、100、50、又は30nt未満が、抗-リプレッサ配列の3’端及びプロモータ配列の開始の間に存在する。一定の好適例では、抗-リプレッサ配列は、プロモータの直接の上流にクローン化され、抗-リプレッサ配列の3’端及びプロモータ配列の開始の間に約0-20だけのntを招く。
多量体タンパク質の生産について、2種又はそれよりも多くの発現カセットを用いることができる。好ましくは双方の発現カセットは、本発明に従う多シストロンの発現カセットであり、各々が異なる選定可能なマーカタンパク質についてコードし、その結果、双方の発現カセットについての選定が可能である。この具体例は、良好な結果を与えること、例は抗体の重鎖及び軽鎖の発現についてものを証明した。双方の発現カセットが1種の核酸分子上に配置されてよく、又は双方が別の核酸分子上に存在してもよく、それらが宿主細胞中に導入される前でよいことは明らかである。それらを1種の核酸分子上に配置する利点は、2種の発現カセットが、宿主細胞中に導入されるとき、単一の予め定まる比率(例は1:1)において存在することである。一方で、2種の異なる核酸分子上に存在するとき、これは、それらを宿主細胞中に導入するときに、2種の発現カセットのモル比を変える可能性を許し、それは、好ましいモル比が1:1と異なる場合に、又は好ましいモル比が何であるかが前もって知られてないときに利点であるかもしれず、その結果、それらの変動及び経験的に最適なものを知見することは、熟練者によって容易に実行することができる。本発明に従い、好ましくは少なくとも1種の発現カセット、しかし、より一層好ましくはそれらの各々で、染色質制御要素、より一層好ましくは抗-リプレッサ配列を備える。
別の具体例では、多量体タンパク質の異なるサブユニット又は部分類が単一の発現カセット上に存在する。
発現カセットにおけるプロモータの上流に配置されるSTAR配列の存在に代えて、又はそれに加え、発現カセットの両側上にSTAR配列を提供することが極めて有利であると証明され、それは導入遺伝子を備える発現カセットが2種のSTAR配列によって隣接されるようなもので、それは一定の具体例において、互いに本質的に同一である。
本明細書において、プロモータの上流の第1の抗-リプレッサ要素及び2種の他の抗-リプレッサ配列によって隣接される発現カセットの組合せが、優れた結果を提供することを示す。
少なくとも若干の抗-リプレッサ配列が指向性(directional)であり得るので(WO 00/004704)、発現カセットに隣接する抗-リプレッサ配列は(抗-リプレッサA及びB)、互いに関して反対の方向において有利に配置されることがあり、これらの抗-リプレッサ配列のそれぞれの3’端が発現カセットに対して内側に面する(及び互いに対して)。それ故、好適例では、抗-リプレッサ要素の5’側はDNA/染色質に面し、その導入遺伝子上に及ぼす影響が前記抗-リプレッサ要素によって減少する。プロモータの上流の発現カセットにおける抗-リプレッサ配列について、3’端はプロモータに面する。抗-リプレッサ要素の配列表(リスト)(SEQ.ID.Nos.1-66)における配列は、特記されない限り、5’から3’までの方向において与える。
一定の具体例では、本発明に従う転写単位又は発現カセットを提供し、それらは更に: a) プロモータの上流の転写休止(transcription pause)(TRAP、トラップ)配列で、多シストロンの転写単位の転写を駆動するもので、前記TRAPは5’から3’までの方向においてあり; 又はb) TRAP配列で、興味あるポリペプチドの前記読み枠の下流で、及び好ましくは前記多シストロンの転写単位の転写終結配列の下流のもので、前記TRAPは3’から5’までの配向においてあり; 又はc) 双方のa)及びb)を備え; ここでは、TRAP配列は、一定の配列として機能的に規定され、それは、転写単位中に配置されるとき、TRAPの3’側上に存在する核酸における転写を、TRAPの5’側上での核酸において観察される転写のレベルと比較するときに減少したレベルを招く。TRAP配列の非-制限的な例は、転写終結及び/又はポリアデニル化信号である。TRAP配列の1種の非-制限的な例はSEQ.ID.NO.142において与えられる。他のTRAP配列の例、これらを見出す方法、及びそれらの使用はWO 2004/055215において記述される。
本発明に従う多シストロンの転写単位及び/又は発現カセットを備えるDNA分子は、核酸の発現を改善するために、好ましくは宿主細胞において用いることができる。用語“細胞”/“宿主細胞”及び“細胞株”/“宿主細胞株”は、それぞれ典型的に細胞及びその同種の集団として規定され、それは細胞培養においてこの技術における既知の方法によって維持することができ、及びそれは異種又は相同のタンパク質を発現する能力を持つ。
原核生物宿主細胞を用い、繁殖させ、及び/又は本発明のDNA分子を用いて、特に細菌のような、原核生物宿主細胞において複製し得るプラスミド上に存在するとき、遺伝子工学を実行することができる。
本発明に従う宿主細胞は、好ましくは真核生物細胞、より一層好ましくは哺乳類細胞で、齧歯動物の細胞又はヒト細胞又は異なる細胞間の融合体のようなものである。一定の非-制限的な具体例では、前記宿主細胞はU-2 OSの骨肉種、CHO(チャイニーズハムスタの卵巣)、HEK 293、HuNS-1骨髄腫、WERI-Rb-1網膜芽腫、BHK、Vero(ベロ)、非-分泌性(non-secreting)マウス骨髄腫Sp2/0-Ag 14、非-分泌性マウス骨髄腫NS0、NCI-H295R副腎癌腫(adrenal gland carcinomal)又はPER.C6(R)(商標)細胞である。本発明の一定の具体例では、宿主細胞は、少なくともElA、及び好ましくはアデノウイルスのElBをも発現する細胞である。非-制限的な例として、かかる細胞は、例としてヒト細胞から、例として腎臓(例: HEK 293細胞、Graham(グラハム)等、1977年参照)、肺(例はA549、例はWO 98/39411参照)又は網膜(例: HER細胞で、商標PER.C6(R)の下で販売され、US特許5,994,128参照)から、又は羊膜細胞(例はN52.E6、US特許6,558,948において記述する)から、及び同様に他の細胞から導くことができる。かかる細胞を得るための方法は、例としてUS特許5,994,128及びUS 6,558,948において記述される。本発明の目的のためのPER.C6細胞は、ECACC no(第)96022940号の下で受託されるような細胞の上流又は下流の継代物(passage)から、又は上流又は下流の継代物又は子孫からの細胞を意味し、即ちそれらの細胞の特徴を持つ。かかる細胞がタンパク質の高レベルでの発現をし得ることは以前に示した(例はWO 00/63403、及びJones(ジョーンズ)等、2003年)。他の好適例では、宿主細胞はCHO細胞、例として、CHO-K1、CHO-S、CHO-DG44、CHO-DUKXBll、及び同様のものである。一定の具体例では、前記CHO細胞はdhfr-の表現型を持つ。かかる真核生物宿主細胞は望ましいポリペプチドを発現することができ、及びその目的のために用いられることが多い。それらは、本発明のDNA分子を、好ましくは発現カセットの形態で、細胞中に導入することによって得ることができる。好ましくは発現カセットは、宿主細胞のゲノムにおいて統合され、それは種々の宿主細胞において異なる位置にあることができ、及び選定はクローンについて提供され、そこでは、導入遺伝子が適切な位置において統合され、望ましい特性を有する宿主細胞クローンが、発現レベル、安定性、生育特徴、及び同様のものに関して導かれる。代わりに、多シストロンの転写単位を標的にし、又は染色体領域中への統合について無作為に選定してよく、それは転写的に活性であり、例はゲノムにおいて存在するプロモータの後ろである。本発明にかかるDNAを含む細胞についての選定は、選定可能なマーカポリペプチドについての選定によって、当業者に既知の日常的な方法を用いて実行することができる。かかる多シストロンの転写単位がプロモータの後ろでゲノムにおいて統合されるとき、本発明に従う発現カセットは、インシトゥにおいて、即ち宿主細胞のゲノム内で生じさせることができる。
好ましくは宿主細胞は、安定なクローンからのものであり、それは当業者に既知の標準的な手法に従って選定し、及び繁殖させることができる。かかるクローンの培養物は、細胞が本発明にかかる多シストロンの転写単位を備える場合、興味あるポリペプチドを生産することができる。本発明に従う細胞は、好ましくは無血清媒体(serum-free medium)での浮遊培養において生育させることができる。
好適例では、本発明にかかる多シストロンの転写単位を備えるDNA分子は、好ましくは発現カセットの形態においてのもので、本発明に従って真核生物宿主細胞のゲノム中に統合される。これは多シストロンの転写単位の安定な遺産(inheritance)を提供する。
選定可能なマーカポリペプチドの存在についての選定で、及び従って発現についてのものは、細胞の初期の取得の間に実行することができ、及び安定なクローンが得られた後に全体で低められ、又は停止させることができる。しかしまた、選定剤を後期の段階の間に、連続的に、又は時折のみ、おそらく宿主細胞の初期の選定の間のものよりも低いレベルで適用することが可能である。
本発明に従う興味あるポリペプチドは、任意のタンパク質であってよく、及び単量体タンパク質又は多量体タンパク質(1の部分)であってよい。多量体タンパク質は少なくとも2種のポリペプチド鎖を備える。本発明に従う興味あるタンパク質の非-制限的な例は、酵素、ホルモン、免疫グロブリンの鎖、抗-癌性タンパク質のような治療上のタンパク質、第VIII因子のような血液凝固タンパク質、多-機能性タンパク質で、エリスロポエチンのようなもの、診断上のタンパク質、又はワクチン目的にとって有用なタンパク質又はその断片、当業者に既知のものすべてである。
一定の具体例では、本発明にかかる発現カセットは、免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖又は抗原結合の部分、その誘導体又は類似物(analogue)を暗号化する。好適例では、本発明に従うタンパク質の発現単位を提供し、そこでは、興味ある前記タンパク質が免疫グロブリンの重鎖である。更に別の好適例では、本発明に従うタンパク質の発現単位を提供し、そこでは興味ある前記タンパク質が免疫グロブリンの軽鎖である。これらの2種のタンパク質の発現単位が同じ(宿主)細胞内に存在するとき、多量体タンパク質及びより一層詳しくは、免疫グロブリンが組み立てられる。それ故一定の具体例では、興味あるタンパク質は、免疫グロブリンで、抗体のようなもので、それは多量体タンパク質である。好ましくはかかる抗体はヒト又はヒト化された抗体である。その一定の具体例では、それはIgG、IgA、又はIgMの抗体である。免疫グロブリンは、異なる発現カセット上、又は単一の発現カセット上の重鎖、及び軽鎖によって暗号化され得る。好ましくは重鎖及び軽鎖は、各々別の発現カセット上に存在し、各々はその独自のプロモータを持ち(それらは2種の発現カセットについて同じ又は異なり得)、各々は本発明に従う多シストロンの転写単位を備え、重鎖及び軽鎖は興味あるポリペプチドであり、及び好ましくは各々は異なる選定可能なマーカタンパク質についてコードし、その結果、双方の重鎖及び軽鎖の発現カセットについての選定は、発現カセットが真核生物細胞において導入され及び/又は存在するとき、実行することができる。
興味あるポリペプチドは、任意の供給源からのものでよく、及び一定の具体例では、哺乳類タンパク質、人工タンパク質(例は融合タンパク質又は変異したタンパク質)であり、及び好ましくはヒトタンパク質である。
明らかに、本発明の発現カセットの立体配置(configurations)はまた、最終目的が興味あるポリペプチドの生産でないが、RNAそれ自体、例として発現カセットからのRNAの増加した量の生産についてであるときに用いることができ、それは他の遺伝子を調節すること(例はRNAi、アンチセンスRNA)、遺伝子治療、インビトロでのタンパク質生産、等のために用いることができる。
1種の局面では、本発明は興味あるポリペプチドを発現する宿主細胞を生じさせるための方法を提供し、この方法は、次の工程を備える: a) 複数の前駆細胞中に本発明に従う発現カセットを導入する工程、及びb) 生じる細胞を選定可能なマーカポリペプチドの発現について選定する条件下に培養する工程、及びc) 興味あるポリペプチドを産生する少なくとも1の宿主細胞を選定する工程。この新しい方法は、非常に良好な結果を、得られるクローン対望ましいポリペプチドの高い発現を伴うクローンの比率に関して提供する。最も厳密な条件、即ち選定可能なマーカポリペプチドについての最も弱い翻訳効率を用い(最も弱い翻訳開始配列を用い)、はるかに少数のコロニを、既知の選定システムを伴うものよりも、同じ濃度の選定剤を用いて得、及び得られるクローンの比較的高い割合が、興味あるポリペプチドを高レベルで生産する。加えて、その発現の得られるレベルは、既知の選定システムを用いて更により一層多数のクローンを用いるとき、得られるものよりも高く見える。
選定システムは、それが導入遺伝子のコピ数の増幅を要求しないので、素早い(swift)ことが付加的な利点である。それ故、多シストロンの転写単位の低いコピ数を有する細胞は、既に高い発現レベルを提供する。導入遺伝子の高い導入遺伝子コピ数は、遺伝的な不安定及び反復-誘導沈黙(repeat-induced silencing)の傾向があり得る(例はKim(キム)等、1998年; McBurney等、2002年)。したがって、比較的低い導入遺伝子のコピ数を有する本発明の具体例の付加的な利点は、より一層低いコピ数が、組換えに対して、及び反復-誘導沈黙に対して、より一層少ない傾向しかないと予想され、及び従ってこの点でより一層少ない問題しか予想されず、それは、制限される数のコピの導入遺伝子を有する宿主細胞が、増幅システムを用いて得られる宿主細胞に比較されて用いられるときであり、そこでは、何百又は更に何千ものコピの選定可能なマーカ及び興味あるコード配列のタンパク質が細胞のゲノムにおいて存在するかもしれない。本発明は、高い発現レベルの例を、多シストロンの転写単位の選定システムを用いて提供し、一方で導入遺伝子のコピ数が比較的低く、即ち細胞当り30コピ未満で、又は更に細胞当り20コピ未満である。それ故本発明は、本発明に従う宿主細胞の発生を可能にし、それは、宿主細胞のゲノムにおいて、30コピ未満の多シストロンの転写単位、好ましくは25未満、より一層好ましくは20コピ未満を備え、一方同時に、興味あるポリペプチドの十分な発現レベルを商業上の目的のために、例は15よりも多く、好ましくは20よりも多くのpg/細胞/日の抗体を提供する。
比較的低いコピ数の多シストロンの転写単位及び高い発現レベルを持つクローンを得ることができるが、本発明にかかる選定システムはそれにもかかわらず、増幅方法と共に組み合わせ、一層更に発現レベルを改善することができる。これは、例として共-統合(co-integrated)のdhfr遺伝子のメトトレキサートを用いる増幅により、例として本発明にかかる多シストロンの転写単位と同じ核酸分子上にdhfrを配置することによって、又はdhfrが別のDNA分子上にあるときの共形質移入(cotransfection)によって成就することができる。
1種の局面では、本発明は興味あるポリペプチドを生産するための方法を提供し、この方法は、宿主細胞を培養する工程で前記宿主細胞が本発明に従う多シストロンの発現単位又は発現カセットを備えるDNA分子を含む工程、及び興味あるポリペプチドを興味あるポリペプチドについてのコード配列から発現させる工程を備える。
この局面についての宿主細胞は、真核生物宿主細胞、好ましくは哺乳類細胞、CHO細胞のようなもの、更に上述するものである。
細胞において発現される核酸の導入は、数種の方法の1種によって行うことができ、それ自体は当業者に既知であり、また導入する核酸の形式(format)に依存する。前記方法には、制限されないが、形質移入、感染、注入、形質転換、及び同様のものが包含される。興味あるポリペプチドを発現する適切な宿主細胞は、上述するような選定によって得ることができる。
一定の具体例では、選定剤が培養媒体において培養の間の時間の少なくとも部分で存在し、選定可能なマーカポリペプチドを発現する細胞について選定するのに十分な濃度、又はより一層低い濃度においてのいずれかである。好適例では、選定剤は、ポリペプチドが発現されるとき、もはや生産相(production phase)の間には培養媒体において存在しない。
細胞を培養することで、それが新陳代謝し、及び/又は生育し、及び/又は分裂し及び/又は興味ある組換えタンパク質を生産し得るようにされる。これは当業者によく知られる方法によって成就することができ、及び制限されないが、細胞に栄養素を提供することを包含する。これらの方法には、表面への付着性の生育、懸濁物における生育、又はその組合せが備わる。培養は、例としてディッシュ(皿)、ローラびん又は生物反応機(バイオリアクタ)において行え、バッチ、供給-バッチ(fed-batch)、かん流システムのような連続システム、及び同様なものを用いられる。細胞培養物を介する組換えタンパク質の大規模(連続)生産を達成するために、この技術において、懸濁物において生育することができる細胞を持つことが好ましく、及び動物-又はヒト-誘導血清又は動物-又はヒト-誘導血清成分の不存在下に培養することができる細胞を持つのが好ましい。
生育又は増加する細胞についての条件(例はTissue Culture(ティッシュ・カルチャ)、Academic Press(アカデミック・プレス社)、Kruse(クルーズ)及びPaterson(パターソン)、編集者(1973年))及び組換え生産物の発現についての条件は当業者に既知である。概して哺乳類細胞培養物の生産性を最大にするための原理、プロトコルズ、及び実用的技術は、Mammalian Cell Biotechnology(マンマリアン・セル・バイオテクノロジ): a Practical Approach(ア・プラクティカル・アプローチ)(M. Butler(バトラー)、ed.(編)、IRL Press(IRLプレス社)、1991年)に見出すことができる。
好適な具体例では、発現されるタンパク質は収集され(分離され)、細胞から又は培養媒体から又は双方からのいずれかである。それは、次いで更に既知の方法を用いて精製され、例はろ過、カラム・クロマトグラフィ、等であり、当業者に一般に既知の方法による。
本発明に従う選定方法は、染色質制御要素の不存在下に働くが、改善される結果は、多シストロンの発現単位がかかる要素を備えるときに得られる。本発明に従う選定方法は、本発明に従う発現カセットが、少なくとも1種の抗-リプレッサ配列を備え、それが用いられるときに、特に良好に働く。選定剤及び条件に依存して、一定の場合において、選定は、そのような厳密性で、抗-リプレッサ配列が存在しないならば、非常に少数のしか又は更にまったくの宿主細胞が選定を生き残らないようにされ得る。それ故新しい選定の方法及び抗-リプレッサ配列の組合せは、非常に魅力的な方法を提供し、そこで興味あるポリペプチドの高い発現の大いに改善される機会を伴う制限される数のコロニだけが得られ、一方同時に、得られるクローンは、抗-リプレッサ配列を有する発現カセットを備え、興味あるポリペプチドの安定な発現を提供し、即ちそれらは、沈黙か、又は慣習的な発現カセットよりも低くされる発現の他の機構のより一層少ない傾向しかない。
一定の具体例において、抗-リプレッサ配列が本発明に従う発現カセットにおいて存在しないとき、ほとんどのクローンが得られず、非常に厳密な選定が提供される。したがってまた、本明細書に開示する新しい選定システムは、抗-リプレッサ要素の部分を機能性について試験する可能性を提供し、それは、かかる配列の効果を、本発明にかかる発現カセットにおいて選定条件下に存在するときに分析することによる。この容易な選別は、これがほとんどの又は更に完全な黒又は白の相違(black and white difference)を多くの場合に提供し、従って抗-リプレッサ配列からの機能的な部分又は誘導体を識別するのに貢献することができる。既知の抗-リプレッサ配列が試験されるとき、このアッセイはそれらを更に特徴付けるのに用いることができる。既知の抗-リプレッサ配列の断片が試験されるとき、アッセイはかかる既知の抗-リプレッサ配列の機能的な断片を提供する。
この発明の実践は、特記されない限り、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、及び組換えDNAの慣習的な技術を採用し、これらはこの技術の熟練の内にある。例はSambrook(サンブルック)、Fritsch(フリッチェ)及びManiatis(マニアティス)のMolecular Cloning(モレキュラ・クローニング): A Laboratory Manual(ア・ラボラトリ・マニュアル)、第2版、1989年; Current Protocols in Molecular Biology(カレント・プロトコルズ・イン・モレキュラ・バイオロジ)、Ausubel(オーズベル) FM、等、編(eds)、1987年; the series Methods in Enzymology(ザ・シリーズ・メソッズ・イン・エンザイモロジ)(Academic Press, Inc.); PCR2 : A Practical Approach、MacPherson(マクファーソン) MJ、Hams(ハムス) BD、Taylor(テイラ) GR、編、1995年; Antibodies(アンティボディズ): A Laboratory Manual、Harlow(ハーロウ)及びLane(レーン)、編、1988年を参照。
本発明を、次の例において更に説明する。これらの例は本発明を決して制限するものではない。それらはただ本発明を明白にするのに役立つ。
(例)
例1-7は、種々の立体配置での及び種々の状況下でのSTAR67及び他のSTAR配列の試験を記載する。例8及び更なるものは、本発明にかかる新しい選定システムを記載する。
(例1: STAR67ベクタの構築)
新しい抗-リプレッサ(STAR)配列を、WO 03/004704において記述されるように遺伝子スクリーニング(genetic screen)を用いて分離し、及びこの新しい配列は作られたSTAR67であった。導入遺伝子の哺乳類細胞株における発現に及ぼすSTAR67の効果を試験した。本明細書で、本発明者等は種々の構築物の構築を記載する。
(材料及び方法)
3種のプラスミドを創作した(図1):
A) CMV-d2EGFP-ires-Zeo(CMVコントロール(Control))、
B) STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo(CMV-STAR67)、
C) STAR7-STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo-STAR7(CMV-STAR67 7/7)。
構築物Aの構築を下に記載する。プラスミドpd2EGFP(Clontech 6010-1)をリンカのBsiWI部位での挿入によって修飾し、pd2EGFP-リンクを生じさせた。リンカを、オリゴヌクレオチドのGTACGGATATCAGATCTTTAATTAAG(SEQ.ID.NO.67)及びGTACCTTAATTAAAGATCTGATAT(SEQ.ID.NO.68)をアニールすることによって作製し、PacI、BglII、及びEcoRVの制限酵素についての部位に導入した。これはSTAR要素の挿入のための多重クローニング部位(multiple cloning site)MCSIIを創作した。次いで、プライマのGATCAGATCTGGCGCGCCATTTAAATCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGG(SEQ.ID.NO.69)及び(AGGCGGATCCGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGG(SEQ.ID.NO.70)を用い、pd2EGFPからの0.37kbの領域を増幅し、それをpIRES(Clontech 6028-1)のBglII部位に挿入し、pIRES-stufを生じさせた。これはMCSIでのAscI及びSwaIの制限酵素のための部位を導入し、及び“詰込みフラグメント(断片)(stuffer fragment)”として振る舞い、STAR要素及び隣接プロモータの間の潜在的な干渉を避ける。pIRES-stufは、BglII及びFspIを用いて消化され、詰込み断片、CMVプロモータ、IRES要素(多重クローニング部位MCS A及びMCS Bによって隣接される)、及びSV40ポリアデニル化信号から構成されるDNA断片を遊離した(liberate)。この断片を、BamHI及びStuIでの消化によって生産されるpd2EGFP-リンクのベクタ骨格(backbone)と共に連結し、pIRES-リンクを生じさせた。
ゼオシン-耐性遺伝子の読み枠を、pIRESの下流のBamHI/NotI部位中に次のように挿入した: ゼオシン-耐性ORFをPCRによってプライマのGATCGGATCCTTCGAAATGGCCAAGTTGACCAGTGC(SEQ.ID.NO.71)及びAGGCGCGGCCGCAATTCTCAGTCCTGCTCCTC(SEQ.ID.NO.72)でプラスミドpCMV/zeo(Invitrogen、cat.no.V50120)からのものを用いて増幅し、BamHI及びNotIで消化し、及びBamHI/NotI-消化pIRES-リンクと共に連結して、pIRES-リンク-zeoを生じさせた。d2EGFPレポータORFを、pIRES-リンク-zeo中に、pd2EGFP(Clontech 6010-1)の、プライマのGATCGAATTCTCGCGAATGGTGAGCAAGCAGATCCTGAAG(SEQ.ID.NO.73)及びAGGCGAATTCACCGGTGTTTAAACTTACACCCACTCGTGCAGGCTGCCCAGG(SEQ.ID.NO.74)での増幅、及びEcoRI-消化d2EGFPカセットのEcoRI部位へのpIRES-リンク-zeoプラスミドにおける挿入によって導入した。これは構築物A、CMV-d2EGFP-IRES-Zeo(CMVコントロール)を創作した。
STAR67を、AscI部位においてCMVプロモータの上流にクローン化した(STAR67及びプロモータの間で残る約15nt)。これは、構築物B、STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo(CMV-STAR67)を創作した。
STAR67をまた、カセットの情況において試験し、そのカセットはまた、STAR7を含み、5’SalI及びXbaIの部位及び3’BglII及びPacIの部位において、指向的に(directionally)クローン化され、STAR7を伴う全体のカセットを隣接させた。これは構築物C(CMV-STAR67 7/7)である。
(例2: STAR67がCMV、EFlα及びUB6のプロモータからの発現レベルを、安定的に形質移入したCHO細胞において高める)
本発明者等は、CMV、EFlα及びUB6のプロモータに隣接するSTAR67の存在が、これらのプロモータの発現レベルにCHO細胞において影響を及ぼすかどうか試験した。構築物A及びB(図1)を例1において記載し、この目的のために用い、それぞれのプロモータについて修飾した:
1 CMV-d2EGFP-ires-Zeo(CMVコントロール)
2 STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo(CMV-STAR67)
3 EFlα-d2EGFP-ires-Zeo(EFlαコントロール)
4 STAR67-EFlα-d2EGFP-ires-Zeo(EFlα-STAR67)
5 UB6-d2EGFP-ires-Zeo(UB6コントロール)
6 STAR67-UB6-d2EGFP-ires-Zeo(UB6-STAR67)。
(材料及び方法)
UB6及びEFlαのプロモータを、CMVプロモータについて、図1において記載するプラスミドにおいて交換した。UB6プロモータを次のようにクローン化した。pd2EGFPプラスミドからのDNAの0.37kbの詰込み物(stuffer)を、PCRによって、例1において記載したように、SEQ.ID.Nos.69及び70によって識別されるプライマを用いて増幅した。得られるDNAの詰込み物を、pUB6/V5-His[Invitrogen V250-20]のBglII部位においてクローン化し、pUB6-stufを創作した。PUB6-stufから、AscI-SacIの断片を、CMV-d2EGFP-IRES-Zeo中にクローン化し、それからCMVプロモータを除去した。
EFlαプロモータを、PCRによって、鋳型としてのpEFlα/V5-His[Invitrogen V920-20]と共に、プライマのGATCGGCGCGCCATTTAAATCCGAAAAGTGCCACCTGACG(SEQ.ID.NO.79)及びAGGCGGGACCCCCTCACGACACCTGAAATGGAAG(SEQ.ID.NO.80)を用いて増幅した。PCRの断片を、CMV-d2EGFP-IRES-ZeoのAscI及びPpuMIの部位においてクローン化し、それからCMVプロモータを除去した。
チャイニーズハムスタの卵巣細胞株CHO-K1(ATCC CCL-61)を、HAMS-F12媒体+10%Fetal Calf Serum(ウシ胎仔血清)で2mMグルタミン、100U/mLペニシリン、及び100マイクログラム/mLストレプトマイシンを含むものにおいて、37℃/5%のCO2で培養した。細胞を、プラスミドで、リポフェクタミン(Lipofectamine)2000(Invitrogen)を用い、製造者によって記述されるように形質移入した。手短に、細胞を培養容器に播種し及び一昼夜70-90%の集密状態(コンフルエンス)にまで生育させた。リポフェクタミンの薬剤をプラスミドDNAと1マイクログラムにつき6マイクロリッタの比率で組み合わせ(例は10cmのペトリ皿について20マイクログラムのDNA及び120マイクロリッタのリポフェクタミン)、及び細胞に添加した。一昼夜のインキュベーション(温置)の後、形質移入の混合物を新鮮な媒体で置換し、及び形質移入した細胞を更に温置した。一昼夜の培養後、細胞をトリプシン処理し、及び新鮮な培養容器中に新鮮な媒体を用いて播種した。別の一昼夜の温置後、ゼオシンを50μg/mLの濃度まで添加し及び細胞を更に培養した。別の3日後、媒体を新鮮な媒体でゼオシンを含むもの(100μg/mL)によって置換し、及び更に培養した。個々のコロニが目に見えるようになったとき(形質移入後およそ10日)、媒体を除去し、及びゼオシンを伴わない新鮮な媒体で置換した。個々のクローンを分離し、及びゼオシンを伴わない媒体において24-ウェルのプレートに移し替えた。コロニの分離後1日で、ゼオシンを媒体に添加した。d2EGFPレポータ遺伝子の発現を、形質移入後およそ3週間評価した。コロニにおけるd2EGFPの発現レベルを2週の期間後に測定した。形質移入後の初期の2週後に、最初のd2EGFPの測定を実行したとき、コロニを、ゼオシン又は他の抗生物質を伴わない媒体において培養した。これを実験の残りについて続けた。
(結果)
図2は、構築物でCMVプロモータの上流にクローン化されるSTAR67を含むものが多数のCHOのコロニを招き、それらが、一層高いレベルのd2EGFPタンパク質を、STAR67を伴わない“空の(empty)”コントロール、CMVコントロールに比較して十分に発現することを示す。CMVコントロールのプラスミドで形質移入した10のコロニにおけるd2EGFP信号の平均は、形質移入後25日に測定するとき34であった。形質移入後60日で、これらの10のコロニにおけるd2EGFP信号の平均は13に減少し、発現が時間にわたって安定でないことを示す。比較では、STAR67-CMVのプラスミドで形質移入した10のコロニにおけるd2EGFP信号の平均は、形質移入後25日後に測定するとき42であり、及び60日後に測定して32であった。それ故形質移入後60日に、STAR67-包含(encompassing)CMV構築物は、安定に形質移入されたクローンにおけるレポータタンパク質の発現のレベルを駆動するファクタ2.5(2.5倍)高いCMVプロモータを運んだ。重要なことには、形質移入後の25日、最初の測定の後、選定圧力はゼオシンを伴わない媒体におけるコロニの培養によって除去された。それ故STAR67構築物を含むコロニは、選定圧力の不存在において時間にわたって、STAR67構築物を含んでいないコロニよりも安定である。
図3は、EFlα-プロモータの上流にクローン化されるSTAR67を含む構築物の形質移入が多数のCHOのコロニを招き、それらが、一層高いレベルのd2EGFPタンパク質を、STAR67を伴わない“空の”コントロール、EF1αコントロールに比べ、十分に発現することを示す。EFlαコントロールのプラスミドで形質移入した10のコロニにおけるd2EGFP信号の平均は、形質移入後25日に測定するとき31であった。形質移入後の60日に、これらの10のコロニのd2EGFP信号の平均は26であった。比較では、EF1α-STAR67プラスミドで形質移入した10のコロニにおけるd2EGFP信号の平均は、形質移入後25日後に測定するとき60であり、及び60日後に測定して76であった。それ故形質移入後の双方の25及び60日後に、STAR67-包含EFlα構築物が、安定に形質移入したクローンにおいてレポータタンパク質の発現レベルを駆動するファクタ2.9高いEF1αプロモータを運んだ。
図4は、UB6プロモータの上流にクローン化されるSTAR67を含む構築物の形質移入が多数のCHOのコロニを招き、それらが、一層高いレベルのd2EGFPタンパク質を、STAR67を伴わない“空の”コントロール、UB6コントロールに比べて、十分に発現することを示す。UB6コントロールのプラスミドで形質移入した10のコロニにおけるd2EGFP信号の平均は、形質移入後25日に測定するとき51であった。形質移入後60日に、これらの10のコロニにおけるd2EGFP信号の平均は29であり、発現が時間にわたって安定でないことを示した。比較では、UB6-STAR67プラスミドで形質移入した10のコロニにおけるd2EGFP信号の平均は、形質移入後25日後に測定するとき218であり、60日後に測定して224であった。それ故形質移入後の25日に、STAR67-包含UB6構築物は、安定に形質移入したクローンにおいてレポータタンパク質の発現レベルを駆動するファクタ4.3高いUB6プロモータを運んだ。60日後、このファクタは7.7であり、それはコントロールのコロニにおける発現の不安定性及びUB6-STAR67コロニにおける安定性のためである。重要なことには、形質移入後25日、最初の測定の後、選定圧力を、ゼオシンを伴わない媒体におけるコロニの培養によって除去した。それ故STAR67構築物を含むコロニは、選定圧力の不存在において時間にわたってSTAR67構築物を含まないコロニよりも安定である。
結論において、STAR67は3種の異なる、無関係なプロモータからの発現を増加させる。
(例3: STAR67がCMV、EFlα及びUB6のプロモータからの発現レベルを、安定に形質移入したPER.C6細胞において高める)
本発明者等は、CMV、EFlα及びUB6のプロモータの隣接するSTAR67の存在がこれらのプロモータのCHO以外の別の細胞、すなわちPER.C6細胞における発現レベルに影響を及ぼすかどうかを試験した。例1におけるような同じ構築物を用いた。
(材料及び方法)
(PER.C6細胞の形質移入、培養及び分析)
PER.C6.(R)細胞を、DMEM媒体+ピリドキシン+ 9%のFoetal Bovine Serum(ウシ胎児血清)(非加熱の不活化)、8.9mMのMgCl2、100U/mLペニシリン、及び100マイクログラムのストレプトマイシンにおいて37℃/10%CO2で培養した。細胞をプラスミドで、リポフェクタミン2000(Invitrogen)を用い、製造者によって記述されるように形質移入した。手短に、細胞を6-ウェルに播種し、及び一昼夜70-90%コンフルエンスに生育させた。リポフェクタミンの薬剤をプラスミドDNAと、3マイクログラムにつき15マイクロリッタの比率で組み合わせ(例は10cmのペトリ皿について20マイクログラムのDNA及び120マイクロリッタのリポフェクタミン)、及び25℃での30分の温置後に細胞に添加した。6-時間の温置後、形質移入の混合物を新鮮な媒体で置換し、及び形質移入した細胞を更に温置した。一昼夜の培養後、細胞をトリプシン処理し、及び新鮮なペトリ皿(90mm)中に、新鮮な媒体で、ゼオシンを100μg/mLの濃度にまで添加したもので播種し(1:15、1:30、1:60、1:120の希釈)及び細胞を更に培養した。コロニが目に見えるようになったとき、個々のクローンを掻爬によって分離し、及び24-ウェルプレートにゼオシンを伴う媒体において移した。〜70%のコンフルエンスまでに生育したとき、細胞を6-ウェルプレートに移した。安定なコロニは、d2EGFP信号がXL-MCL Beckman Coulter(ベックマン・クールタ)のフローサイトメータ上で定められる前に、6-ウェルプレートにおいて2週間拡がった。d2EGFP信号の中間値(mean)を、d2EGFP発現のレベルについての尺度として採取した。コロニを2週後の二回目について測定した。しかる後、コロニを更にゼオシンの不存在下に培養した。
(結果)
図5は、CMVプロモータの上流にクローン化されるSTAR67を含む構築物の形質移入が多数のPER.C6コロニを招き、それらが、一層高いレベルのd2EGFPタンパク質を、STAR67を伴わない“空の”コントロール、CMVコントロールに比べて十分に発現することを示す。CMVコントロールのプラスミドで形質移入した10のコロニにおけるd2EGFP信号の平均は、形質移入後30日に測定するとき37であった。形質移入後60日に、これらの10のコロニにおけるd2EGFP信号の平均は14にまで減少し、発現が時間にわたって安定でないことを示した。比較では、STAR67-CMVプラスミドで形質移入する10のコロニにおけるd2EGFP信号の平均は、形質移入後30日後に測定するとき101であり、及び60日に測定して45であった。それ故形質移入後の60日に、STAR67-包含CMV構築物は、安定に形質移入したクローンにおいてレポータタンパク質の発現レベルを駆動するファクタ3.2高いCMVプロモータを運んだ。
図6は、EFlα-プロモータの上流にクローン化されるSTAR67を含む構築物の形質移入が多数のPER.C6コロニを招き、これらが、一層高いレベルのd2EGFPタンパク質を、STAR67を伴わない“空の”コントロール、EF1αコントロールに比べ、十分に発現することを示す。EFlαコントロールのプラスミドで形質移入した10のコロニにおけるd2EGFP信号の平均は、形質移入後の30日に測定するとき5であった。形質移入後の60日に、これらの10のコロニにおけるd2EGFP信号の平均は6であった。比較では、EFlα-STAR67プラスミドで形質移入した10のコロニにおけるd2EGFP信号の平均は、形質移入後の30日後に測定するとき25であり、及び60日に測定して20であった。それ故形質移入後の30日及び60日後の双方に、STAR67-包含EFlα構築物は、安定に形質移入したクローンにおいてレポータタンパク質の発現レベルを駆動するファクタ4高いFE1αプロモータを運んだ。
図7は、UB6プロモータの上流にクローン化されるSTAR67を含む構築物の形質移入が多数のPER.C6コロニを招き、これらが、一層高いレベルのd2EGFPタンパク質を、STAR67を伴わない“空の”コントロール、UB6コントロールに比べ、十分に発現することを示す。UB6コントロールのプラスミドで形質移入した10のコロニにおけるd2EGFP信号の平均は、形質移入後30日に測定するとき4であった。形質移入後の60日に、これらの10のコロニにおけるd2EGFP信号の平均は2であった。比較では、UB6-STAR67プラスミドで形質移入した10のコロニにおけるd2EGFP信号の平均は、形質移入後30日後に測定するとき27であり、及び60日に測定して18であった。それ故形質移入後の30日及び60日後の双方で、STAR67-包含UB6構築物は、レポータタンパク質の発現レベルを、安定に形質移入したコロニにおいて駆動するファクタ7から9までの倍数高いUB6プロモータを運んだ。
それ故プロモータの上流にSTAR67を配置することは、十分により一層高いタンパク質の発現レベルを、STAR67-不足(less)の構築物と比べ、またPER.C6細胞において招く。それ故STAR67は、異なる、無関係な細胞の種類において機能する。
(例4: CHO細胞におけるSV40プロモータを高めるための他のSTAR要素と組み合わせたSTAR67の新しい立体配置。)
本発明者等は、SV40プロモータの隣接するSTAR67の存在が、このプロモータの発現レベルに、単独で又は別のSTAR要素との組合せでのいずれかで、この例のSTAR7において影響を及ぼすかどうかを試験した。この目的のために用いた構築物(図8参照)は次のとおりである:
1 SV40-d2EGFP-ires-Zeo(SV40コントロール)
2 STAR67-SV40-d2EGFP-ires-Zeo(SV40-STAR67)
3 STAR7-SV40-d2EGFP-ires-Zeo-STAR7(SV40-STAR7/7)
4 STAR7-STAR67-SV40-d2EGFP-ires-Zeo-STAR7(SV40-STAR67 7/7)
(材料及び方法)
SV40プロモータを、PCRによって、鋳型としてのpIRESと共に、プライマのTTGGTTGGGGCGCGCCGCAGCACCATGGCCTGAAATAACCTCTGAAAGAGG(SEQ.ID.NO.81)及びTTGGTTGGGAGCTCAAGCTTTTTGCAAAAGCCTAGGCCTCCAAAAAAGCCTCCTC(SEQ.ID.NO.82)を用いて増幅した。PCRの断片をCMV-d2EGFP-IRES-ZeoのAscI及びSacIの部位においてクローン化し、それからCMVプロモータを除去した。
CHO細胞を形質移入し、コロニを分離し、及び繁殖させ、及び例2におけるように分析した。
(結果)
図8は、SV40プロモータの上流にクローン化するSTAR67(SV40-STAR67)を含むか、又は全体の構築物に隣接するようにクローン化するSTAR7(SV40-STAR 7/7)を含む構築物の形質移入が、一層高いレベルのd2EGFPタンパク質を、STARsを伴わない“空の”コントロール(SV40コントロール)に比べ、十分に発現するCHOコロニを招かないことを示す。SV40コントロールのプラスミドで形質移入した18のコロニにおけるd2EGFP信号の平均は、形質移入後40日に測定するとき86であった。比較では、SV40-STAR67プラスミドで形質移入した18のコロニにおけるd2EGFP信号の平均は、形質移入後40日後に測定するとき82であり、及びSV40-STAR 7/7プラスミドで形質移入した18のコロニにおけるd2EGFP信号の平均は、40日後に測定するとき91であった。それ故CHO細胞におけるSV40プロモータ上に及ぼすこれらのSTAR要素の有意な効果は観察されなかった。
これらの細胞におけるSV40プロモータからの発現レベルが、既にまったく高く、及びCMVプロモータで観察されるものより更に大いに高く、それは非常に強いプロモータであると思われた。CHO細胞におけるSV40プロモータを用いるSTAR要素の不存在においてのこの高い背景(バックグラウンド)発現は、STAR67単独、又は導入遺伝子に隣接されるSTAR7の十分な効果がなぜ確認されなかったかを説明することができる。
しかし、SV40-STAR67 7/7プラスミドで形質移入した18のコロニにおけるd2EGFP信号の平均は、40日のコロニの後に測定するとき209であり、それは18のコントロールのコロニ(86)の平均よりもファクタ2.4高い。それ故STAR67要素を別のSTAR要素との組合せで用いるとき、これは多数の安定に形質移入したCHOコロニを招き、それは十分により一層高いd2EGFP発現レベルを示す。
したがって、この新しい立体配置(5’-STAR配列A-STAR配列C-プロモータ-興味あるタンパク質を暗号化する核酸-STAR配列B-3’で、そこでは、本例において、STAR配列A及びBがSTAR7であり、及びSTAR配列CがSTAR67である)のSTAR要素は、これまでに開示した立体配置におけるものよりも一層良好に機能すると思われる。
本発明者等は実験を行い、そこでは隣接するSTAR7要素を、隣接するSTAR6要素によって、又は隣接するSTAR4要素によって、SV40プロモータの上流のSTAR67との組合せにおいて(SV-40STAR67 6/6及びSV40-STAR67 4/4、それぞれで、上記と同じ命名を用い)置換し、及び優れた発現がまたこれらの組合せを用いて観察された。これは、隣接するSTAR7要素が実際に他のSTAR配列と交換され得、及びまだSTAR配列を有する発現カセットの新しい立体配置の改善が観察されることを証明する。
(例5: STAR67及びSTAR7の組合せがUB6-駆動抗体発現のレベルを、安定に形質移入したCHO細胞において高める。)
例4において、本発明者等はSTAR67及びSTAR7の組合せが、d2EGFPタンパク質の発現レベルをCHO細胞において高めることを示した。ここでは、本発明者等はSTAR67及びSTAR7の組合せが抗体の生産に用いることができるかどうかを試験した。本発明者等は、EpCAM分子に対する抗体(Huls(ハルス)等、1999年)を試験タンパク質として選び、及びUB6プロモータを用いた。
(材料及び方法)
(プラスミド)
重鎖のcDNA(HC-EpCAM)を、UB6プロモータを包含する構築物においてクローン化した。HC-EpCAMをゼオシン(Zeocin)耐性遺伝子にIRES配列によってつないだ。軽鎖のcDNA(LC-EpCAM)をまた、UB6プロモータを包含する構築物においてクローン化した。LC-EpCAMをピューロマイシン耐性遺伝子にIRES配列によってつないだ。一緒にこれらの2種のプラスミドはUB6(HC+LC)コントロールを表す(図9)。
STAR67及びSTAR7の効果を試験するために、STAR67を、双方のHC+LC構築物においてUB6プロモータの上流にクローン化した。STAR7を、全体のカセットに隣接するように双方の5’及び3’端でクローン化した(図9)。これらの2種のプラスミドはSTAR7-STAR67-UB6(HC+LC)STAR7を表す。
(CHO細胞の形質移入及び培養)
チャイニーズハムスタの卵巣細胞株CHO-K1(ATCC CCL-61)を形質移入し、及び例2におけるように、選定のためのゼオシン(100μg/mL)及びピューロマイシン(2.5μg/mL)を用いて培養した。形質移入後の1日に、ゼオシンを培養媒体に添加した。最初のコロニが目に見えるようになるとき(ゼオシンの添加後およそ7日)、培養媒体を除去し、及びピューロマイシンを含有する培養媒体で置換した。およそ7日後、コロニを分離し、及び24ウェルのプレートに、ゼオシンのみを含む培養媒体において移した。
(結果)
図9は、UB6プロモータの上流にクローン化されるSTAR67及び全体のカセットに隣接されるようクローン化される2のSTAR7要素を含む抗体構築物の形質移入が、多数のCHOのコロニを招き、それらが、一層高いレベルのEpCAM抗体を(抗-ヒトIgG抗体を用いるELISAによって測定する)、STAR67及びSTAR7を伴わない“空の”コントロール、UB6(HC+LC)コントロールに比べ、十分に発現することを示す。UB6(HC+LC)コントロールのプラスミドで形質移入した18のコロニにおけるEpCAM生産の平均は、形質移入後25日に測定するとき2.7pg/細胞/日であった。選定剤のゼオシン及びピューロマイシンを25日後に除去した。形質移入後45日に、これらの18のコロニにおけるEpCAM生産の平均は2.7pg/細胞/日であった。比較では、STAR7-STAR67-UB6(HC+LC)-STAR7プラスミドで形質移入した18のコロニにおけるEpCAM生産信号の平均は、形質移入の25日後に測定するとき6.7で、及び45日後に測定するとき、7.7pg/細胞/日であった。それ故形質移入後の双方の30日及び45日後に、STAR67/STAR7-包含UB6構築物が、安定に形質移入したCHOクローンにおいてEpCAMの発現レベルを駆動するファクタ2.5から2.9までの倍数でより一層高いUB6プロモータを運んだ。
それ故プロモータの上流のSTAR67及びカセットに隣接する2のSTAR7要素を配置することは、十分に、STAR67/STAR7-不足の構築物と比べて、より一層高いEpCAM抗体発現レベルをCHOにおいて招く。
(例6: STAR67がエンハンサブロッカ(増強物の遮断物)でないが、STAR6及びSTAR7がそうである)
その特性について試験するこれまでに既知のすべてのSTAR要素は、STAR6及びSTAR7を含み、エンハンサブロッカである(WO 03/004704、Kwaks等、2003年)。エンハンサブロッカの活性は強いエンハンサ及びプロモータの間にSTAR要素を配置することによって試験される。ここに、本発明者等はまた、STAR67がエンハンサブロッカであるどうか試験した。
(材料及び方法)
d2EGFP遺伝子を、プライマの TTGGTTGGTCATGAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTC(SEQ.ID.NO.75)及びATTCTCTAGACTACACATTGATCCTAGCAGAAGCAC(SEQ.ID.NO.76)を用いてPCR-増幅し、及びプラスミドのpGL3-プロモータ(Promega)中に、NcoI及びXbaIの制限部位を用いてクローン化し、ルシフェラーゼ遺伝子を置換して、プラスミドのpGL3-プロモータ-GFPを創作した。リンカ(オリゴのCGATATCTTGGAGATCTACTAGTGGCGCGCCTTGGGCTAGCT(SEQ.ID.NO.77)及びGATCAGCTAGCCCAAGGCGCGCCACTAGTAGATCTCCAAGATATCGAGCT(SEQ.ID.NO.78)をアニールすることによって創作する)を、SacI及びBglIIの部位においてクローン化し、多重クローン化部位を創作した。元のBglIIの部位は、リンカの連結により壊し、新しい独特のBglII部位をリンカDNA内に創作する。SV40-エンハンサを、プラスミドpGL3-ベーシック(Promega)からBsaBI及びBamHIを用いて切断し、及びpGL3-リンカ-プロモータ-GFP中に、EcoRV及びBglIIの部位を用いてクローン化し、プラスミドpGL3-エンハンサ-プロモータ-GFPを創作する。STAR40要素をSV40エンハンサの上流にKpnI及びSacIの部位を用いて配置し、上流配列上に及ぼすエンハンサの作用を妨げる。最後に、STAR要素6、7及び67を、SV40エンハンサ及びSV40の最小のプロモータの間において、SpeI及びAscIの制限部位を用いて配置した。
(CHO細胞の形質移入及び培養)
チャイニーズハムスタの卵巣細胞株CHO-K1(ATCC CCL-61)を、例2でのように形質移入した。形質移入後1日に、d2EGFPのレベルをEpics(エピクス)XLのフローサイトメータ(Beckman Coulter)上で測定する。
(結果)
図10は、STAR67がエンハンサブロッカではないが、STAR6及びSTAR7が同じアッセイにおいてエンハンサブロッカを振る舞うことを示す。STAR6、STAR7及びSTAR67を、d2EGFP遺伝子の上流のSV40エンハンサ及び最小のSV40-プロモータの間でクローン化した。STAR要素をエンハンサ及びプロモータの間でクローン化しないとき、強い転写活性化が起こった(適宜に100%に設定する)。STAR6又はSTAR7をエンハンサ及びプロモータの間に配置するとき、転写が背景レベルにまで落下し、STAR6及びSTAR7が有力なエンハンサブロッカであることを示す。対照的に、STAR67をエンハンサ及びプロモータの間でクローン化するとき、相対的転写レベルはまだコントロールの89%であり、STAR67が良好なエンハンサブロッカでなく、これが、STAR6及びSTAR7、並びに他のSTAR要素に比べて、以前に記述されるようであることを示した(WO 03/004704、Kwaks等、2003年)。
(例7: STAR67がUB6及びCMV-駆動される抗体発現レベルを、安定に形質移入したCHO細胞において高める。)
例5において、本発明者等は、STAR67及びSTAR7の組合せがEpCAM抗体の発現レベルをCHO細胞において、2種の別個のプラスミドの情況で高め、それが重鎖及び軽鎖を含んでいたことを示した。この例では、本発明者等は、STAR67が、EpCAM 抗体の生産について、双方の重鎖及び軽鎖を1種のプラスミド上に配置するときに、用いることができるかどうかを試験した。本発明者等は各選定可能なマーカについて同時選定を用いた。
(材料及び方法)
(プラスミド)
重鎖のcDNA(HC-EpCAM)はUB6プロモータの制御の下にあり、及びゼオシン耐性遺伝子に、IRES配列によってつながれる。軽鎖のcDNA(LC-EpCAM)はCMVプロモータの制御下にあり、及びピューロマイシン耐性遺伝子に、IRES配列によってつながれる。基本的に、これらは例5において用いる構築物である。これらの2種の発現カセットを、1種のプラスミドにおいて、2種の発現単位の転写が反対方向を持つような様式で配置した。コントロールのプラスミドにおいて、UB6及びCMVのプロモータを、500bpの詰込み物によって分けた(EpCAMコントロール)(図10)。別のプラスミドにおいて、STAR67をUB6及びCMVのプロモータの間に配置した(EpCAM STAR67)(図10)。
(CHO細胞の形質移入及び培養)
チャイニーズハムスタの卵巣細胞株CHO-K1(ATCC CCL-61)を形質移入し、及び例2におけるように、選定についてのゼオシン(100μg/mL)及びピューロマイシン(2.5μg/mL)を用いて培養した。例5では、双方の選定マーカについての連続した選定を用いた。対照的に、ここには、双方の選定剤は培養媒体において同時に存在した。形質移入後1日に、ゼオシン及びピューロマイシンを培養媒体に添加した。選定媒体はコロニが分離されるまで存在した(形質移入後およそ14日)。コロニを分離し、及び24-ウェルのプレートに移した後、細胞をゼオシン及びピューロマイシンの存在下に培養した。
(結果)
図11は、UB6及びCMVのプロモータの間でクローン化するSTAR67を含む抗体構築物の形質移入が多数のCHOコロニを招き、それらが、EpCAM抗体を発現することを示す(ELISAによって抗-ヒトIgG-抗体を用いて測定する)。EpCAM STAR67プラスミドで形質移入した19のコロニにおけるEpCAM生産の平均は、形質移入後25日に測定するとき9.8pg/細胞/日であった。
対照的に、驚くべきことにコロニはEpCAMコントロールのプラスミドでの形質移入で生き残らなかった。選定をゼオシン又はピューロマイシンのいずれか単独で実行するとき、EpCAMコントロールのコロニが生き残った。しかし、双方の重鎖及び軽鎖上での選定圧力を配置することによって選定圧力が増加するときに、これらの条件は、コロニで、形質移入したプラスミドにおいて存在するSTAR67を持つものだけを生き残らせることを可能にした。
結果はまた、STAR67の組込みが2種のプロモータ、UB6及びCMVのプロモータ上に及ぼす有利な効果を持ち、それらが1種のSTAR67要素の上流及び下流に配置されることを示す。これはSTAR67が二方向性(bi-directional)のやり方(fashion)において操作され得ることを示す。
EpCAMコントロール及びEpCAM STAR67プラスミドの間の違いは、選定圧力が高いときに、EpCAM STAR67の形質移入だけがコロニの確立を招くという意味で、黒-白である(is black-white、はっきりしている)。これは、STAR67における領域を識別するために、このプラスミドの立体配置を用いる機会を開け、それはこの効果を媒介するのに関与する。同様に、STAR67の重複する部分をUB6及びCMVのプロモータの間に配置し、EpCAM分子を駆動する。STAR67の部分が機能的なときに、コロニは、双方のゼオシン及びピューロマイシンが選定剤として同時に用いられるとき生き残る。STAR67の部分が機能的でないとき、コロニは同一の選定条件の下で生き残らない。
それ故プロモータの上流にSTAR67を配置することは、かなりより一層高いEpCAM抗体の発現レベルを、STAR-不足の構築物と比べて、CHOにおいて招く。
(例8: 内部メチオニンを伴わないゼオシン耐性遺伝子生成物の構築及び試験)
新しい選定システム開発の背後にある基本的な考えは、興味ある遺伝子の上流の耐性遺伝子を暗号化する遺伝子、及びこのバイシストロンのmRNAの発現を駆動する1種のプロモータを配置することである。バイシストロンのmRNAの翻訳は小さい割合の翻訳事象においてのみ、耐性遺伝子がタンパク質に翻訳され、及びほとんどの時間に、興味ある下流の遺伝子がタンパク質に翻訳されるようなものである。それ故上流の耐性遺伝子の翻訳効率は、興味ある下流の遺伝子の翻訳効率と比較して激しく妨害されなければならない。これを達成するため、3種の工程を本発明に従って採ることができる:
1) mRNA上の耐性遺伝子内で、好ましくは探索リボソーム(searching ribosome)が別のAUGと合わないべきであり、その理由は、任意の下流のAUGが翻訳開始コドンとして役立つことができ、第2の、興味ある下流の遺伝子のより一層低い翻訳効率を招くからである。それ故好ましくは、任意のAUGは、耐性遺伝子のmRNAにおいて、置換されなければならない。この場合において、AUGは機能的なコドンであり、それはメチオニンを暗号化し、このアミノ酸が異なるアミノ酸によって、例としてロイシンによって置換されなければならない(図12A及びB);
2) 耐性遺伝子の開始コドンは悪い情況を持たなければならず(非-最適翻訳開始配列の部分である); 即ちリボソームは翻訳をこの開始コドンでだけで限られた数の事象において始めなければならず、及び従ってほとんどの事象において、より一層良好で、より一層最適な開始コドンについて探索を続けられる(図12C-E)。3種の異なる厳密性を区別することができる: a) 正常なATG開始コドン、しかし、悪い情況(TTTATGT)(ATGmutと称される)において配置され(図12C)、b) 好ましくは最適な情況において配置されるとき、GTGは開始コドン(ACCGTGG)として役立つことができ(図12D)及びc) 好ましくは最適な情況において配置するとき、TTGは開始コドン(ACCTTGG)として役立つことができる(図12E)。最も厳密な翻訳条件はTTGコドンであり、次いでGTGコドンである(図12)。TTGを開始コドンとして有するZeo mRNAが最小のゼオシン耐性タンパク質を生産すると考えられ、及びそれ故最低の機能的なゼオシン耐性を細胞に運ぶ(図12、13)。
3) 好ましくは、興味ある下流の遺伝子の正常な開始コドン(ATG)は最適な翻訳情況を持つべきである(例はACCATGG)(図13A-D)。このワラント(保証)は、工程1及び2が採られた後、ほとんどの事象において、興味ある遺伝子の開始コドンがバイシストロンのmRNAの開始コドンとして機能する。
例8では、工程1を実行し、すなわちゼオシン耐性遺伝子において、1種の存在する内部メチオニンを別のアミノ酸によって置換する(図12B-E)。かかる変化の後、Zeo(ゼオ)タンパク質がまだゼオシン耐性を形質移入した細胞に与えることが重要である。アミノ酸がこのクリテリウム(criterium)(criteria、規準)を満たすことが予め既知でないので、3種の異なるアミノ酸が試みられた: ロイシン、スレオニン及びバリン。異なる構築物で、別個のアミノ酸を有するものは、むしろゼオシン耐性を形質移入した細胞にまだ与えることへのそれらの能力について試験された。
(材料及び方法)
(プラスミドの構築)
元のゼオの読み枠は、開始コドンの周りの次の配列を持つ: AAACCATGGCC(太字(ATG)の開始コドン; SEQ.ID.NO.83)。これは開始コドンであり、最適な翻訳の情況を有する(図12A)。最初に、ゼオの読み枠の開始コドンの最適な情況を、増幅を介して、プラスミドpCMV-zeo[Invitrogen V50120]から、プライマ対のZEOforward(フォワード)MUT(SEQ.ID.NO.84): GATCTCGCGATACAGGATTTATGTTGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTCCG及びZEO-WTreverse(リバース)(WT=野生種; SEQ.ID.NO.85)AGGCGAATTCAGTCCTGCTCCTCGGCと共に、鋳型としてpCMV-ZEO (Invitrogen; V50120)を用いて変化させた。増幅した生成物をNruI-EcoRIで切断し、及びpcDNA3中に連結し、pZEOATGmutをもたらした。
元のゼオの読み枠は、枠におけるATGを含み、メチオニンをアミノ酸位置94で暗号化する(124から)。この内部ATGは、メチオニンを位置94で暗号化し、それを、メチオニンがロイシン、スレオニン又はバリンにそれぞれ変化するように変えた:
1) メチオニンについての内部コドンをゼオの読み枠においてロイシンについてのコドンと置換するために(図12B)、ゼオの読み枠の部分を、プライマ対のZEOforwardMUT(SEQ.ID.NO.84)及びZEO-LEUreverse(SEQ.ID.NO.86): AGGCCCCGCCCCCACGGCTGCTCGCCGATCTCGGTCAAGGCCGGCを用いて増幅した。PCR生成物を、BamHI-BglIで切断し、及びpZEOATGmut中に連結した。これはpZEO(leu)を招いた。
メチオニンについての内部コドンを、セオの読み枠においてスレオニンについてのコドンと置換するために(示さないが、図12Bにおけるようなもの)、ゼオの読み枠の部分を、プライマ対のZEOforwardMUT(SEQ.ID.NO.84)及びZEO-THRreverse(SEQ.ID.NO.87): AGGCCCCGCCCCCACGGCTGCTCGCCGATCTCGGTGGTGGCCGGCを用いて増幅した。PCR生成物をBamHI-BglIで切断し、及びpZEOATGmut中に連結した。これはpZEO(thr)を招いた。
メチオニンについての内部コドンを、ゼオの読み枠においてバリンについてのコドンと置換するために(示していないが、図12Bにおけるようなもの)(GTG)、ゼオの読み枠の部分を、プライマ対のZEOforwardMUT(SEQ.ID.NO.84)及びZEO-VALreverse(SEQ.ID.NO.88): AGGCCCCGCCCCCACGGCTGCTCGCCGATCTCGGTCCACGCCGGを用いて増幅した。PCR生成物をBamHI-BglIで切断し、及びpZEOATGmut中に連結した。これはpZEO(val)を招いた。
(細胞の形質移入及び培養)
チャイニーズハムスタの卵巣細胞株CHO-K1(ATCC CCL-61)を、HAMS-F12媒体+10%ウシ胎仔血清で2mMグルタミン、100U/mLペニシリン、及び100マイクログラム/mLストレプトマイシンを含むものにおいて37℃/5%CO2で培養した。細胞をプラスミドで、リポフェクタミン2000(Invitrogen)を用い、製造者によって記述されるように形質移入した。手短に、細胞を培養容器に播種し、及び一昼夜70-90%コンフルエンスまでに生育させた。リポフェクタミン薬剤をプラスミドDNAと共に、1マイクログラムにつき6マイクロリッタの比率で組み合わせ(例は10cmペトリ皿について20マイクログラムのDNA及び120マイクロリッタのリポフェクタミン)、及び細胞に添加した。一昼夜の温置後、形質移入混合物を新鮮な媒体で置換し、及び形質移入した細胞を更に温置した。一昼夜の培養後、細胞をトリプシン処理し、及び新鮮な培養容器で、新鮮な媒体のゼオシン(100μg/mL)を含むものに播種した。個々のコロニが目に見えるようになるとき(形質移入後およそ10日)、コロニを計数した。
(結果)
4種のプラスミドをCHO-K1細胞に形質移入した、1) pZEO(WT)、2) pZEO(leu)、3) pZEO(thr)、及び4) pZEO(val)。細胞を100μg/mLゼオシン上で選定した。pZEO(leu)の形質移入は、コントロールpZEO(WT)と比べて等しい数のゼオシン耐性コロニを招いた。pZEO(thr)及びpZEO(val)はより一層少ないコロニを与えたが、相違は大きさの順序でなかった。それ故内部メチオニンの、ロイシン、スレオニン又はバリンへの変化が、すべてゼオシン耐性タンパク質を招き、それがまだ形質移入した細胞へゼオシン耐性を与えることができることが結論付けられた。むしろ適宜に、pZEO(leu)を、開始点として、ゼオの読み枠上の異なる開始コドンを創作するために選んだ。それ故、下の例において、開始並びに内部のメチオニンを、常にロイシンによって、ゼオシンについて、また他の選定可能なマーカ遺伝子についても、更なる例から明らかであるように、置換する。
(例9: 示差(differential)翻訳効率を有するゼオシン-d2EGFPのバイシストロンの構築物の創作及び試験)
少ない翻訳効率を有する変異させたゼオシン耐性mRNA、及び興味ある下流の遺伝子としてd2EGFP遺伝子を包含するバイシストロンのmRNAを創作するため、d2EGFP遺伝子の開始コドンを最初に最適化した(例8における工程3)。その後、ゼオシン耐性遺伝子の異なる変形(バージョン)を創作した。これらの変形間の相違は、それらが異なる開始コドンを持ち、別個の翻訳効率を有することである(例9における工程2、図12C-E)。これらの異なるゼオシン耐性遺伝子の変形を、修飾したd2EGFP遺伝子の上流にクローン化した(図13)。
(材料及び方法)
(プラスミドの創作)
d2EGFPレポータORFをpcDNA3中に導入した。このd2EGFPのcDNAの開始コドンの周りの配列はGAATTCATGGGであり(太字(ATG)の開始コドン; SEQ.ID.NO.89)、それは最適ではない。最初の工程として、d2EGFPを、pd2EGFP(Clontech 6010-1)から、プライマのd2EGFPforwardBamHI(SEQ.ID.NO.90): GATCGGATCCTATGAGGAATTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG及びd2EGFPreverseNotI(SEQ.ID.NO.91): AAGGAAAAAAGCGGCCGCCTACACATTGATCCTAGCAGAAGで増幅した。この生成物は今回最適の翻訳の情況を伴う開始コドンを含む(ACCATGG)。この創作したpd2EGFP及びその後に、ゼオの読み枠をpd2EGFP中に連結し、pZEO-d2EGFPを招いた。ここで、興味ある遺伝子の翻訳開始配列の最適化が(ここで: モデル遺伝子としてのEGFP)、本質的でないが、興味ある遺伝子に向けた翻訳開始の頻度をまだ更に歪ませるために好まれることが指摘される。
今回、3種のクラスの構築物を作製した:
1) 開始コドンとしてのATGでゼオ耐性遺伝子におけるもので、しかし、悪い情況における(TTTATGT)(示していないが、図13Bにおけるようなもの)及びスペーサ配列によって続く、最適のATGの代りのもの(図13A)。
スペーサ配列はATG配列の下流に配置する。ゼオシンにおいて(及びおそらくブラストサイジンにおいて)、RNAは二次構造が存在し、一過性に遅延するリボソームを生じさせる。このため、乏しい開始コドンが若干の場合において、悪い開始コドンであり、又は翻訳惹起についての非-最適状況におけるにもかかわらず、リボソームによって用いられ得る。これは翻訳の機会を増加させ、及びこの発明の場合において、従って選定についての厳密性をより一層低くさせる。この効果を減らすのに、及び従って更に翻訳惹起効率を減らすために、スペーサ配列を導入し、それは二次構造を含まない(Kozak、1990年)。それ故用語‘space(スペース)’を導入し、及びプラスミド及びプライマの名称において用い、かかるスペーサ配列の存在を指し示す。スペーサは惹起コドンの近隣(neighbourhoud、neighbourhood)から‘リボソーム遅延配列(delaying sequence)’を除去し、それと共にリボゾームに翻訳のより一層少ない頻度(translating less frequently)を開始させ、及び従って本発明に従う選定の厳密性を増加させる。スペーサはコード配列において若干の余分の(extra)アミノ酸を導入する。これは若干の場合において、双方のゼオシンのため及びブラストサイジンのために行われ、例から明らかである。概して次において、プラスミド及びプライマの命名はこれらのラインに沿っている: 選定可能なマーカポリペプチドの名称は略語によって称され(例はZeo(ゼオ)、Blas(ブラス)、等); 開始コドンが言及され(例はATG、GTG、TTG); この開始コドンが翻訳惹起のための非-最適な情況において配置されるとき、追加の“mut”が用いられ(これは通常ATG開始コドンについて行われるに過ぎず、それは非-最適な情況が非-ATG開始コドンと組み合わされることが通常、選定を可能にするのに十分な翻訳惹起を招かないからである); スペーサ配列が開始コドンの後ろで用いられるとき、追加の“space”が用いられる(これは通常Zeo又はBlasの選定可能なマーカについての“ATGmut”開始コドンのために行われる)。
Zeoの読み枠を、プライマ対のZEOforwardBamHI-ATGmut/space(SEQ.ID.NO.93): GATCGGATCCTTGGTTTATGTCGATCCAAAGACTGCCAAATCTAGATCCGAGATTTT CAGGAGCTAAGGAAGCTAAAGCCAAGTTGACCAGTGAAGTTC(そこでは下線を引く配列に続かれる配列がスペーサ配列を備える)、及びZEOWTreverse(SEQ.ID.NO.85)で増幅し、PCR生成物をEcoRI-BamHIで切断し、及びpd2EGF中に連結し、EcoRI-BamHIで切断し、pZEO-ATGmut/space-d2EGFPを創作した。
2) 開始コドンとしてのGTGでZeo耐性遺伝子におけるもので、ATG(図13C)の代りのもの。Zeoの読み枠を、プライマ対のZEOforwardBamHI-GTG(SEQ.ID.NO.94): GATCGGATCCACCGTGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTC及びZEOWTreverse(SEQ.ID.NO.85)で増幅し、PCR生成物をEcoRI-BamHIで切断し、及びpd2EGFP中に連結し、EcoRI-BamHIで切断し、pZEO-GTG-d2EGFPを創作した。
3) 開始コドンとしてのTTGでZeo耐性遺伝子においてのもので、ATG(図13D)の代りのもの。Zeoの読み枠を、プライマ対のZEOforwardBamHI-TTG: GATCGGATCCACCTTGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTC(SEQ.ID.NO.95)及びZEOWTreverse(SEQ.ID.NO.85)で増幅し、PCR生成物をEcoRI-BamHIで切断し、及びpd2EGFP中に連結し、EcoRI-BamHIで切断し、pZEO-TTG-d2EGFPを創作した。
(CHO細胞の形質移入、培養及び分析)
チャイニーズハムスタの卵巣細胞株CHO-K1(ATCC CCL-61)を、HAMS-F12媒体+10%ウシ胎仔血清で2mMグルタミン、100U/mLペニシリン、及び100マイクログラム/mLストレプトマイシンを含有するものにおいて37℃/5%のCO2で培養した。細胞をプラスミドで、リポフェクタミン2000(Invitrogen)を用いて製造者によって記述されるように形質移入した。手短に、細胞を培養容器に播種し、及び一昼夜70-90%コンフルエンスまで生育させた。リポフェクタミン薬剤をプラスミドDNAと、3マイクログラムにつき15マイクロリッタの比率で組み合わせ(例は10cmペトリ皿について20マイクログラムのDNA及び120マイクロリッタのリポフェクタミン)、及び30分の25℃での温置後に細胞に添加した。一昼夜の温置後、形質導入混合物を新鮮な媒体で置換し、及び形質移入した細胞を更に温置した。一昼夜の培養後、細胞をトリプシン処理し、及び新鮮な培養容器中に新鮮な媒体を用いて播種した。別の一昼夜の温置後、ゼオシンを50μg/mLの濃度まで添加し、及び細胞を更に培養した。別の3日の後、媒体を新鮮な媒体のゼオシン(100μg/mL)を含むもので置換し、及び更に培養した。個々のコロニが目に見えるようになるとき(形質移入後およそ10日)、媒体を除去し、及び新鮮な媒体のゼオシンを伴わないもので置換した。個々のクローンを分離し、及び24-ウェルのプレートにゼオシンを伴わない媒体において移した。コロニの分離後1日に、ゼオシンを媒体に添加した。d2EGFPレポータ遺伝子の発現を形質移入後およそ3週で評価した。コロニにおけるd2EGFPの発現レベルを2週の期間後に測定した。
(結果)
CHO-K1細胞を構築物で形質移入し、それは選定遺伝子として、ATGmut/space Zeo(図13B)、GTG Zeo(図13C)及びTTG Zeo(図13D)の遺伝子を含み、すべてをd2EGFPレポータ遺伝子の上流にクローン化した。これらの3種の構築物は、STAR要素を伴わず(コントロール)、又はCMVプロモータの上流のSTAR要素7及び67及びd2EGFP遺伝子(図14)から下流のSTAR７を伴った。図14は、双方のコントロール(STAR要素を伴わない)構築物でATGmut/space Zeo(A)及びGTG Zeo (B)を伴うものがd2EGFPタンパク質を発現するコロニを与えたことを示す。24のATGmut/space Zeoのコロニの平均d2EGFP発現レベルは46であり、及びGTG Zeoのコロニは75であった。GTG Zeoのコロニにおけるこのより一層高い平均発現レベルは、ATGmut/space(例8)と比べて、GTGのより一層高い厳密性を反映し得る。構築物へのSTAR要素7及び67の添加は、より一層高い平均d2EGFP発現レベルを持つコロニを招いた。ATGmut/space ZeoのSTAR7/67/7の構築物の形質移入は118の平均d2EGFPの発現レベルを有するコロニを招き、それはコントロール細胞における平均よりもファクタ2.6高い(46)。GTG Zeo構築物へのSTAR要素の添加は99の平均d2EGFP発現レベルを招き、それはコントロール細胞における平均よりもファクタ1.3高い(75)。
重大なことにコロニは、TTG Zeoの構築物を形質移入するとき、確立されなかった。しかし、TTG ZeoでSTARs 7及び67で隣接されるものを有する構築物は、6のコロニで576の平均d2EGFP発現レベルを有するものの確立を招いた(図14C)。このようにして、最も高い翻訳の厳密性はTTGの開始コドン(図12)によってもたらされ、最も高いd2EGFPの発現レベルを、図13において予測されるように屈する(yields)。結果はまた、TTG Zeo単独(STAR要素を伴わない)の厳密性が、少なくとも若干の実験において、コロニにとって生き残るのに高過ぎることを指し示す。しかし、より一層後の独立した実験において(下を参照)、若干のコロニがSTAR要素を伴わないこの構築物を用いて見出され、ゼオシン選定マーカにおけるTTG開始コドンを伴う選定システムの厳密性が必ずしも、STAR要素が存在しないときに、コロニの知見を排除しないこと、及び得られるコロニの数が実験の間で変動することがあることを指し示した。
本発明に従う厳密な選定システムとの組合せでのSTAR要素の使用が興味ある遺伝子の高い生産者を容易に識別することを可能にすることが結論付けられる。
(例10: より一層高い数のTTG Zeo STARコロニの確立及びIRES-Zeo構築物との比較。)
例9においての結果は、TTG Zeoが極端に厳密な翻訳効率を持ち、それがゼオシン耐性を細胞に運ぶのに高くてよいことを指し示す。形質移入は、若干のコロニが存在し、それが生き残るような高い発現レベルを持つかどうかの試験まで拡大された。実験を拡大することはまた、高い平均のTTG Zeo STARの7/67/7が、より一層多くのコロニを分析するときに、より一層高くなるかどうかの質問に対処することができる。
(材料及び方法)
CHO-K1細胞を構築物で形質移入し、それは選定マーカとしてTTG Zeo遺伝子を持ち、STAR要素7及び67を有するか、及び有しない(図15)。形質移入、選定、培養等は、例9におけるようであったが、例外として6倍多くの細胞、DNA及びリポフェクタミン2000を用いた。形質移入及び選定をペトリ皿において行った。
(結果)
図15Aは、TTG Zeo STAR 7/67/7の構築物での形質移入が560の平均d2EGFP信号を有する多くのコロニの発生を招いたことを示す。これは例9でのように高いが、例外として今回58のコロニを分析した。IRES配列の後に配置するゼオシン耐性遺伝子を有する構築物に比較するとき(図15B)、平均のd2EGFPの発現レベルは61であり、及びSTAR要素7及び67をかかる構築物に添加するとき、平均のd2EGFPの発現レベルは125で、コントロールよりファクタ2上であった(図15B)。TTG Zeo STAR 7/67/7のコロニの平均は、従ってSTAR-不足IRES-Zeoのコロニよりもファクタ9.2高く、及びSTAR 7/67/7 IRES Zeoのコロニよりもファクタ4.5高かった。
観察結果は、すべての発現をするコロニの曲線の形態がTTG Zeo STAR 7/67/7及びIRES-Zeo STAR 7/67/7の間で異なることである。最初の場合では(TTG Zeo)、曲線は平らになるが、第2の場合では(IRES-Zeo)、曲線はより一層‘指数関数的な’形状を持つ。TTG Zeoの曲線でのプラトは、細胞が最大のd2EGFPの発現レベルに達し、それを超えては、d2EGFPの発現レベルが有毒になり、及び細胞が死ぬことを指し示し得る。しかし、より一層後には、高い値がFACSの分析機の検出機の設定で検出し得る最大値に近かったと思われた。より一層後の実験において、FACSの分析機の設定を変化させ、より一層高い値の検出を可能にし、及び実際に若干の例において、ここで得られるものよりも高い値がより一層後の独立した実験において測定された(下を参照)。
形質移入のアップ-スケーリングのため、STAR-不足TTG Zeoの構築物を有する3種のコロニを採取することができる。これらのコロニのd2EGFPの発現レベルは、475、158及び43であった。最後のコロニは最初の測定の後すぐに死んだ。この結果は、TTG Zeoの構築物がゼオシン抵抗性を運ぶことができ、コロニを招き、それがまた若干の例において高い発現レベルを与えることができることを指し示す。それ故本発明に従う新しい選定方法は、発現カセットを用いて適用され得、それは染色質コントロール要素を含まないが、少なくとも1種のかかる要素、好ましくはSTAR要素を備える発現カセットを用いるのが明らかに好まれる。
結果は、STAR要素が本発明に従うより一層厳密な選定システムを、この例において例証するもののように可能にし、非常に高い平均タンパク質発現レベルを持つコロニの採取(picking)を招くことを指し示す。
(例11: 示差翻訳効率を有するブラストサイジン-d2EGFPのバイシストロンの構築物の創作及び試験。)
4種の内部ATGsがブラストサイジン耐性遺伝子において存在し、そのどれもメチオニンについてコードしない(図25A)。これらのATGsは除かれなければならないが(図25B)、それはATG開始コドン(又はその情況)が修飾されたとき、それらが開始コドンとして役立ち、及びこれはブラストサイジン耐性タンパク質に似ていないペプチドを招くからである。より一層重要なことに、これらのATGsはこの例において、実例としてd2EGFPによって表わされるように、興味ある遺伝子の有効な翻訳を妨げる。内部ATGsを削除するために、ブラストサイジン耐性タンパク質の読み枠を4種のプライマ対でまず増幅し、4種のブラストサイジン耐性タンパク質の断片を発生させた。プライマ対は:
A) BSDBamHIforward(SEQ.ID.NO.96): GATCGGATCCACCATGGCCAAGCCTTTGTCTCAAG
BSDL50reverse(SEQ.ID.NO.97):
GTAAAATGATATACGTTGACACCAG
B) BSDl50forward(SEQ.ID.NO.98):
CTGGTGTCAACGTATATCATTTTAC
BSD250reverse(SEQ.ID.NO.99):
GCCCTGTTCTCGTTTCCGATCGCG
C) BSD250forward(SEQ.ID.NO.100):
CGCGATCGGAAACGAGAACAGGGC
BSD350reverse(SEQ.ID.NO.101):
GCCGTCGGCTGTCCGTCACTGTCC
D) BSD350forward(SEQ.ID.NO.102):
GGACAGTGACGGACAGCCGACGGC
BSD399reverse(SEQ.ID.NO.103): GATCGAATTCTTAGCCCTCCCACACGTAACCAGAGGGC
であった。
断片AからDまでをアガロースゲルから分離し、及び互いに混合した。次に、プライマだけのBSDBamHIforward及びBSD399reverseを用い、完全な長さのブラストサイジン耐性タンパク質のcDNAを創作するが、すべての内部ATGsを置換した。再構成されたブラストサイジンを次いでEcoRI-BamHIで切断し、及びpZEO-GTG- d2EGFP中にクローン化し、EcoRI-BamHIで切断し(それはZeoを解放し)、pBSDmut-d2EGFPを招いた。全体のブラストサイジン耐性タンパク質の読み枠を配列決定し、すべてのATGsが置換されたことを確認した。
ブラストサイジン耐性タンパク質を暗号化するこの変異した遺伝子(Blas)を用い、三種のクラスの構築物を作製する(図25C-E):
1) 開始コドンとしてのATGだが、悪い情況におけるもので、及びスペーサ配列によって続かれる。pBSD-d2EGFPにおける変異したブラストサイジン耐性タンパク質の読み枠を、プライマのBSDforwardBamHIAvrll-ATGmut/spaceを(SEQ.ID.NO.104): GATCGGATCCTAGGTTGGTTTATGTCGATCCAAAGACTGCCAAATCTAGATCCGAGA TTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAGCCAAGCCTTTGTCTCAAGAAG、及びBSD399reverseEcoRIAvrII(SEQ.ID.NO.105): GATCGAATTCCCTAGGTTAGCCCTCCCACACGTAACCAGAGGGCを用いて増幅し、PCR生成物をBamHI-EcoRIで切断し、及びpZEO-GTG-d2EGFP中に連結し、EcoRI-BamHIで切断した。これはpBSD-ATGmut/space-d2EGFPを招く。
2) 開始コドンとしてのGTGでATGの代りのもの。pBSD-d2EGFPにおける変異したブラストサイジン耐性タンパク質の読み枠を、プライマのBSDforwardBamHIAvrII-GTG(SEQ.ID.NO.106): GATCGGATCCTAGGACCGTGGCCAAGCCTTTGTCTCAAGAAG及びBSD399reverseEcoRIAvrII(SEQ.ID.NO.105)を用いて増幅し、PCR生成物をBamHI-EcoRIで切断し、及びpZEO-GTG-d2EGFP中に連結し、EcoRI-BamHIで切断した。これはpBSD-GTG-d2EGFPを招く。
3) 開始コドンとしてのTTGでATGの代りのもの。pBSD-d2EGFPにおける変異したブラストサイジン読み枠を、プライマのBSDforwardBamHIAvrII-TTG(SEQ.ID.NO.107):
GATCGGATCCTAGGACCTTGGCCAAGCCTTTGTCTCAAGAAG及びBSD399reverseEcoRIAvrII(SEQ.ID.NO.105)を用いて増幅し、PCR生成物をBamHI-EcoRIで切断し、及びpZEO-GTG-d2EGFP中に連結し、EcoRI-BamHIで切断した。これはpBSD-TTG-d2EGFPを招く。
(結果)
CHO-K1細胞を構築物で形質移入し、それはGTG Blas(図16A)及びTTG Blas(図16B)の遺伝子を選定遺伝子として含み、すべてをd2EGFPレポータ遺伝子の上流にクローン化した。選定は20μg/mLのブラストサイジンにおいて起こした。2種の構築物は、STAR要素を伴わないか(コントロール)、又はCMVプロモータの上流のSTAR要素7及び67及びd2EGFP遺伝子から下流のSTAR7を伴っていた(図16)。図16は、双方のコントロール(STAR要素を伴わない)構築物でGTG Blas(A)及びTTG Blas(B)を伴うものがコロニを与え、それらがd2EGFPタンパク質を発現したことを示す。24のGTG Blasコロニの平均d2EGFP信号は14.0であり(図16A)、TTG Blasのコロニのものは81であった(図16B)。TTG Blasコロニにおけるこのより一層高い平均発現レベルは、TTGのより一層高い厳密性を、GTGと比べて反映するかもしれない(また例9も参照)。しかし、8のコロニしかより一層厳密なTTG条件の下で生き残らなかった。
構築物へのSTAR要素7及び67の添加は、より一層高い平均のd2EGFP発現レベルを持つコロニを招いた。GTG Blas STAR 7/67/7構築物の形質移入は、97.2の平均d2EGFPの発現レベルを有するコロニを招き(図16A)、それはコントロール細胞における平均(14.0)よりもファクタ6.9高い。TTG Blas構築物へのSTAR要素の添加は234.2の平均d2EGFP信号を招き(図16B)、それはコントロール細胞における平均(81)よりもファクタ2.9高い。しかし再び、8のコロニしか粗い選定条件のTTG Blasを生き残らず、一方で48のコロニがTTG Blas STAR 7/67/7で生き残ったことに注目すべきである。五種の最も高い値しか比較されないとき、五種の最も高いTTG Blasの平均は109.1であり、及び五種の最も高いTTG Blas STAR 7/67/7の平均は561.2で、それはファクタ5.1高い。
結果は、STAR要素がより一層厳密な選定システムを可能にし、非常に高い平均タンパク質発現レベルを持つコロニの採取を招くことを指し示す。それらはまた、この選定がゼオシン耐性タンパク質単独に制限されず、しかしまた、他の選定マーカポリペプチド、この場合にブラストサイジン耐性タンパク質を用いることができることを示す。
(例12: 新しい選定システムにおけるd2EGFP発現の安定性)
例10において記載するコロニを更に、数種の条件の下に培養し、延長した時間期間にわたるd2EGFP発現の安定性を評価した。
(結果)
図15AにおけるTTG Zeo STAR 7/67/7を含むコロニを、付加的な70日間、100μg/mLのゼオシンの存在下に培養した。図17において示すように、平均d2EGFP信号は35日後に560.2から105日後の677.2に上昇した。若干の稀なコロニを除き、すべてのコロニがより一層高いd2EGFP発現レベルを持った。
ゼオシンのレベルが20μg/mLのゼオシンにまで低下したとき、まだ35日後の560.2から105日後の604.5までへの、平均d2EGFP発現レベルにおける増加があった(図18)。
選定圧力が、培養媒体からのゼオシンの除去のために全然なかったとき、コロニのおよそ50%はモザイクになって、すなわち1種のコロニ内で非(non)-d2EGFP発現細胞が明白になった。これは元のレベルの50%より少ないものへのd2EGFP発現レベルの低下を招いた。信号が元の信号からの67%(少なくとも3分の1の減少)よりも少なくなった場合、コロニはd2EGFPの発現に関して不安定であると考えられた。57の元のコロニの27のコロニはこの規準に従って安定なままであった; 35日後のこれらのコロニの平均d2EGFP信号は(一方でまだ選定圧力の下である)425.6であり、一方65日後の選定圧力のない平均d2EGFP信号は290.0だった。105日後に測定するとき、27のコロニにおける平均信号は300.9だった。それ故初期の減少後、27のコロニにおける発現レベルはこの規準に従って安定なままであった(図19)。
6種のコロニを1ラウンドのサブ-クローン化にかけた。細胞を96-ウェルのプレートに撒き、各ウェルがおよそ0.3 の細胞を含むようにした。ゼオシンは媒体中に存在せず、その結果、開始から、サブクローンは選定圧力なしで生育した。各々の元のコロニの6種のサブクローンを無作為に分離し、及び分析まで6-ウェルのプレートにおいて生育させた。図23において、本発明者等は元のクローンの元の値を、図15Aにおいて既に示すように、サブクローンの1種と比較した。6種のクローンの1種(クローン25)において、サブクローンはd2EGFP信号を伴って元のクローンの範囲において存在しなかった。しかし、6種の場合中からの5種において、少なくとも1種で、サブクローンは親クローンと等しいd2EGFPの発現レベルを持った。これらの発現レベルを、選定圧力を用いずに50日後に定めた。本発明者等は、1ラウンドのサブクローン化が選定圧力の不存在下の高い発現について安定なままである高い数のコロニを得るのに十分であると結論付ける。これは同様の実験において確認された(示していない)。
本発明者等は、統合されるコピの数をTTG Zeo STAR7/67/7のコロニにおいて比較した。DNAをコロニがゼオシンの選定圧力下105日であったときに分離した(図17参照)。図24において示すように、2種の集団を区別することができた。図24において、切断を20種のコピで行い、及びR2値を計算し、及び示した。また、20種よりも高いコピを有するデータからのR2値を示す。100から800種までのd2EGFP信号の範囲において、高い程度のコピ数依存性が比較的高い0.5685のR2によって意味されるように、存在した(図24)。しかし、800種のd2EGFP信号のまわりで動揺する(fluctuate around)コロニの集団において、コピ数における高い変動は0.0328の低いR2を伴って意味されるように、観察された(図24)。一緒にデータは、新しい選定システムにおいて、TTG Zeo STAR7/67/7の構築物を含むコロニで、d2EGFPの発現に依存するコピ数が〜20コピまで存在することを示す。また、コピ数の依存性は、>20種のコピが存在するとき、失われるが、まだ、高い(>800)d2EGFP信号を有するコロニの実質的な比率は、30種のコピよりも多くを持たない(図24)。高いd2EGFPの発現及び比較的低いコピ数の間のこの組合せは(10及び30の間)、選定圧力を伴わない比較的安定なままのコロニを識別するために重要であるかもしれない。比較的低いコピ数を有し(約30よりも少ない、より一層好ましくは約20よりも少ない)、高い発現レベルを与えるクローンを持つことは利点であり、それはかかるクローンが遺伝的な不安定性に影響を受け難いと思われるからである。本発明の選定システムは、CHO細胞からを含め、かかるクローンを発生させることを可能にする。
(例13: 示差翻訳効率を有するゼオシン-ブラストサイジン-EpCAMのバイシストロンの構築物の創作及び試験。)
抗体の生産における選定システムの試験をするため、抗-EpCAM抗体(例5も参照)を例として採用した。
(結果)
プラスミドを創作し、その上では、双方の、重鎖(HC)及び軽鎖(LC)を配置し、各々は分かれた転写単位におけものであった(図20-22)。双方の鎖の発現をCMVプロモータによって駆動した。EpCAMの重鎖の上流にゼオシン耐性遺伝子を配置し、いずれもATGmut/space(図20)、GTG(図21)又はTTG(図22)を開始コドンとして有した(例9参照)。EpCAMの軽鎖の上流にブラストサイジン耐性遺伝子を配置し、いずれもATGmut/space(図20)、GTG(図21)又はTTG(図22)を開始コドンとして有した(例11参照)。2の種類の構築物を作製し、STAR要素を伴わない1種の構築物(コントロール)及びSTAR7及び67の要素の組合せを有する1種の構築物であった。STAR要素を次のように配置した: 各CMVプロモータの上流に(即ちHCを備える転写単位についての1種及びLCを備える転写単位についての1種)、STAR67を配置し、及び得られる構築物を5’及び3’のSTAR 7の要素で隣接させた(図20-22)。すべての構築物をCHO-K1細胞に形質移入し、及び100μg/mLゼオシン及び20μg/mLブラストサイジン上で選定した(同時に)。選定後、独立のコロニを分離し、及び連続する選定圧力下に繁殖させた(100μg/mLゼオシン及び20μg/mLブラストサイジンを用いる)。図20は、STAR7/67/7の組合せがEpCAM生産に有利な効果を持ったことを示す。ATGmut/space Zeo及びATGmut/space Blasは、STAR要素を含むか、又は含まないプラスミドで形成されるコロニの数に及ぼす効果を持たなかった。しかし、いずれかの24のコントロール対STAR7/67/7のコロニの平均EpCAM発現レベルは、コントロールにおける0.61pg/細胞/日からSTAR7/67/7構築物での3.44pg/細胞/日にまで及んだ(図20)。これはファクタ5.6の増加である。多くのコロニが0pg/細胞/日を有するATGmut/spaceのコントロールにおいて存在するので、また最も高い5種のコロニにおける平均EpCAM生産を比較した。コントロールのATGmut/spaceにおいて、これは3.0pg/細胞/日であり、対してATGmut/spaceのSTAR7/67/7の構
築物では7.8pg/細胞/日であり、ファクタ2.6の増加であった。
図21はまた、STAR7/67/7の組合せがEpCAM生産に及ぼす有利な効果を持ち、マーカにつてのGTG開始コドンを用いたことを示す。GTG Zeo及びGTG Blas STAR7/67/7の構築物を用い、およそ2倍より多くのコロニが形成された。また、いずれかの24のコントロール対STAR7/67/7のコロニの平均EpCAM発現レベルはコントロールにおける2.44pg/細胞/日からSTAR7/67/7構築物における6.51pg/細胞/日にまで及んだ(図21)。これはファクタ2.7の増加である。また、最も高い5種のコロニにおける平均EpCAM生産を比較した。コントロールGTGにおいて、これは5.7pg/細胞/日であり、対してGTG STAR7/67/7の構築物では13.0pg/細胞/日であり、ファクタ2.3の増加であった。また、選定マーカについてのGTG開始コドンによって媒介される平均EpCAM生産が、ATGmut/spaceの開始コドンでのものよりも十分に高かったことが注目される。
図22は、TTG Zeo及びTTG Blasコントロールの構築物を用い、コロニが形成されなかったことを例9に類似するようにして示す。STAR7/67/7 TTGの構築物を用い、コロニを形成した。STAR7/67/7 TTGコロニの平均EpCAM発現レベルは10.4pg/細胞/日であった(図22)。これは再度、開始コドンとしてのATGmut/space及びGTGを用いるものよりも高い(比較として図20、21参照)。最も高い5種のTTG STAR7/67/7のコロニにおける平均EpCAM生産は22.5pg/細胞/日であった。
結果は、選定システムがまた、2種の同時に生成するポリペプチドに、この場合、多量体タンパク質の2種のポリペプチド、カス・クオで(casu quo)、抗体に適用できることを示す。EpCAM生産はd2EGFPで得られる結果に密接に続く。開始コドンとしてのTTGはGTG開始コドンよりも厳密であり、それは次に、ATGmut/spaceよりも厳密である(図12及び13)。より一層高い厳密性はコロニの数の減少を招き、TTGコントロールの場合にはコロニを伴わず、それはSTAR要素を持たず、及びより一層高い厳密性の選定マーカが興味あるタンパク質のより一層高い発現につながる。
(例14: 示差翻訳効率を有する付加的なGTGゼオシン-d2EGFPのバイシストロンの構築物の創作及び試験。)
異なる変形のゼオシン耐性遺伝子で、変異した開始コドンを有するものを例8において記載した。記載するGTGコドンの他に(例8、図33A)、別個の翻訳効率を有する付加的に修飾する開始コドンが可能である。これらの異なるゼオシン耐性遺伝子の変形を創作し(図33)、及び例9においてのように修飾されるd2EGFP遺伝子の上流にクローン化した。
(材料及び方法)
(プラスミドの創作)
4種の付加的なGTG構築物を作製した:
1) 開始コドンとしてのGTGでZeo耐性遺伝子においてであるが(図33A)、スペーサ配列によって続けられる(図33B)。The mutspace-Zeoの読み枠を、プライマ対のGTGspaceBamHIF(SEQ.ID.NO.122): GAATTCGGATCCACCGTGGCGATCCAAAGACTGCCAAATCTAG及び(ここでは下線を引く配列に続く配列がスペーサ配列を備える)、及びZEOWTreverse(SEQ.ID.NO.85)で増幅し、PCR生成物をEcoRI-BamHIで切断し、及びpd2EGFP中に連結し、EcoRI-BamHIで切断し、pZEO-GTGspace-d2EGFPを創作した。
2) 開始コドンとしてのGTGでZeo耐性遺伝子においてであるが、悪い情況(TTTGTG)においてのもの(図33C)。Zeoの読み枠を、プライマ対のZEOTTTGTGBamHIF(SEQ.ID.NO.123):
GAATTCGGATCCTTTGTGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTCCG及びZEOWTreverse(SEQ.ID.NO.85)で増幅し、PCR生成物をEcoRI-BamHIで切断し、及びpd2EGFP中に連結し、EcoRI-BamHIで切断し、pZEO(leu)-TTTGTG-d2EGFPを創作した。
3) 開始コドンとしてのGTGでZeo耐性遺伝子におけるもので、ATG(図33A)の代りの、しかしPro9でのZeoの読み枠における付加的な変異を有し、それがスレオニン(Thr)で置換された(図33D)。Thr9の変異は、Zeoの読み枠を、プライマ対のZEOforwardGTG-Thr9(SEQ.ID.NO.124): AATTGGATCCACCGTGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTACCGTGCTC及びZEOWTreverse(SEQ.ID.NO.85)で増幅することによって導入し、PCR生成物をEcoRI-BamHIで切断し、及びpd2EGFP中に連結し、EcoRI-BamHIで切断し、pZEO-GTG-Thr9-d2EGFPを創作した。
4) 開始コドンとしてのGTGでZeo耐性遺伝子におけるもので、ATG(図33A)の代りの、しかしPro9でのZeoの読み枠における付加的な変異を有し、それがフェニルアラニン(Phe)で置換されたものを有する(図33E)。Phe9の変異は、Zeoの読み枠を、プライマ対のZEOforwardGTG-Phe9(SEQ.ID.NO.125): AATTGGATCCACCGTGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTTTCGTGCTC及びZEOWTreverse(SEQ.ID.NO.85)で増幅することによって導入し、PCR生成物をEcoRI-BamHIで切断し、及びpd2EGFP中に連結し、EcoRI-BamHIで切断し、pZEO-GTG-Phe9-d2EGFPを創作した。
(CHO細胞の形質移入、培養及び分析)
CHO-K1細胞の形質移入、培養及び分析を例8でのように実行した。
(結果)
CHO-K1細胞を構築物で形質移入し、それはGTG Zeo(図33A)、GTGspace Zeo(図33B)、TTT GTG Zeo(また称して: GTGmut Zeo)(図33C)、GTG Thr9 Zeo(leu)(図33D)及びGTG Phe9 Zeo(leu)(図33D)の遺伝子を選定遺伝子として含み、すべてをd2EGFPレポータ遺伝子の上流にクローン化した。これらの5種の構築物は、STAR要素を伴わない(コントロール)又はCMVプロモータの上流のSTAR要素7及び67及びd2EGFP遺伝子から下流のSTAR7を有した(図33)。図34は、STAR要素を伴わないコントロール構築物の、STAR要素を伴わないGTG Zeo構築物だけがd2EGFPタンパク質を発現するコロニを与えたことを示す。対照的に、すべての構築物でSTAR要素を含むものは、d2EGFPタンパク質を発現するコロニを与えた。11のGTG Zeoコントロールのコロニの中間値のd2EGFP蛍光性信号は20.3であり、13のGTG ZeoのコロニのSTAR7/67/7を有するものは104.9、24のGTG space Zeo 7/67/7のコロニのものは201.5、6のTTT GTG Zeo 7/67/7のコロニのものは310.5、22のGTG Thr9 Zeo 7/67/7のコロニのものは423、及び16のGTG Phe9 Zeoのコロニのものは550.2であった(図34)。
新しいGTGの変異のより一層高い厳密性は、より一層高い中間値の蛍光性信号と関連する(図34)。しかし、TTT GTG Zeo 7/67/7は、2種の高い発現をするコロニ及び少数の低く発現するコロニだけしか与えなかった。これは、この変異が厳密性のふちにあり、それはこれらの細胞が培養媒体に添加されるゼオシンの固定濃度に耐えることができるものであることを指し示すかもしれない。
Thr9及びPhe9の変異はZeoの変異体の翻訳効率に影響を及ぼさない。代りに、それらはゼオシン耐性タンパク質の機能性を、ゼオシン耐性タンパク質の二部分(two halves)の間の最適な相互作用を妨げることによって減少させる(Dumas(デュマス)等、1994年)。これは、ゼオシンに対する抵抗性を培養媒体において達成するため、より一層多くのタンパク質が生産されなければならないことを意味に含む。結果として、全体のカセットはより一層高いレベルで転写されなければならず、最終的により一層高いd2EGFP発現レベルを招く。
ゼオシン耐性のmRNAの記載する翻訳効率の使用が、より一層高い発現レベルのd2EGFPタンパク質で、これがSTAR要素との組合せにおけるものであるものを招くことが結論付けられる。
この例は更に、本発明にかかる選定システムの厳密性の微-調整を提供する可能性を実証し、興味あるタンパク質の最適な発現レベルを達成する。明らかに、当業者は、これらの及び他の可能性を本明細書に開示する概念内(例はゼオシンを位置9で他のアミノ酸に変異させ、又はそれを他の位置で変異させ; GTG又は他の開始コドンを、非-最適な翻訳惹起の情況において、ゼオシン又は他の選定マーカについて用い; 又は他の選定マーカを変異させ、それらの機能性を減少させ、例として変異をアミノ酸残基182又は261又は双方において持つネオマイシン耐性遺伝子についてコードする配列を用いること、例はWO 01/32901参照)、及び同様なもので組み合わせることができ、かかる微-調整を提供し、及び単純に試験することによって、選定マーカについての特長の適切な組み合わせを定め、興味あるポリペプチドの高められた発現を誘導する。
(例15: 示差翻訳効率を有する付加的なTTGゼオシン-d2EGFPのバイシストロンの構築物の創作及び試験。)
変異した開始コドンを有するゼオシン耐性遺伝子の異なる変形を例8において記載した。記載するTTGコドンの他に(図35A)、付加的に修飾した開始コドンで別個の翻訳効率を有するものが可能である。これらの異なるゼオシン耐性遺伝子の変形を創作し、及び修飾したd2EGFP遺伝子の上流にクローン化した(図35)。
(材料及び方法)
(プラスミドの創作)
3種の付加的なTTG構築物を作製した:
1) 開始コドンとしてのTTGでZeo耐性遺伝子においてであるが(図35A)、スペーサ配列によって続けられる(図35B)。Zeoの読み枠(スペーサ配列と共に)を、プライマ対のTTGspaceBamHIF(SEQ.ID.NO.126): GAATTCGGATCCACCTTGGCGATCCAAAGACTGCCAAATCTAG及びZEOWTreverse(SEQ.ID.NO.85)で増幅し、PCR生成物をEcoRI-BamHIで切断し、及びpd2EGFP中に連結し、EcoRI-BamHIで切断し、pZEO-TTGspace-d2EGFPを創作した。
2) 開始コドンとしてのTTGでZeo耐性遺伝子におけるもので、ATG(図35A)の代りの、しかしZeoの読み枠においてPro9で付加的な変異を有し、スレオニン(Thr)で置換されたものを有する(図35C)。Thr9の変異は、Zeoの読み枠を、プライマ対のZEOforwardTTG-Thr9(SEQ.ID.NO.127): AATTGGATCCACCTTGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTACCGTGCTC及びZEOWTreverse(SEQ.ID.NO.85)で増幅することによって導入し、PCR生成物をEcoRI-BamHIで切断し、及びpd2EGFP中に連結し、EcoRI-BamHIで切断し、pZEO-TTG-Thr9-d2EGFPを創作した。
3) 開始コドンとしてのTTGでZeo耐性遺伝子におけるもので、ATG(図35A)の代りの、しかしZeoの読み枠においてPro9で付加的な変異を有し、フェニルアラニン(Phe)で置換されたものを有する(図35D)。Phe9の変異は、Zeoの読み枠を、プライマ対のZEOforwardTTG-Phe9(SEQ.ID.NO.128): AATTGGATCCACCTTGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTTTCGTGCTC及びZEOWTreverse(SEQ.ID.NO.85)で増幅することによって導入し、PCR生成物をEcoRI-BamHIで切断し、及びpd2EGFP中に連結し、EcoRI-BamHIで切断し、pZEO-TTG-Phe9-d2EGFPを創作した。
(結果)
CHO-K1細胞を構築物で形質移入し、それはTTG Zeo(図35A)、TTGspace Zeo(図35B)、TTG Thr9 Zeo(図35C)及びTTG Phe9 Zeo(図35D)の遺伝子を選定遺伝子として含み、すべてをd2EGFPレポータ遺伝子の上流にクローン化した。これらの4種の構築物は、STAR要素を伴わないか(コントロール)、又はCMVプロモータの上流のSTAR要素7及び67及びd2EGFP遺伝子から下流のSTAR7を伴った(図35)。図36は、STAR要素を伴わないコントロール構築物のSTAR要素を伴わないTTG Zeo構築物だけがd2EGFPタンパク質を発現するコロニを与えたことを示す。対照的に、すべての構築物はSTAR要素を含み、d2EGFPタンパク質を発現するコロニを与えた。3のTTG Zeoコントロールのコロニの中間値のd2EGFPの蛍光性信号は26.8であり、24のTTG ZeoコロニでSTAR7/67/7を有するものは426.8、24のTTGspace Zeo 7/67/7のコロニのものは595.7、2のTTG Thr9 Zeo 7/67/7のコロニのものは712.1、及び3のTTG Phe9 Zeoのコロニのものは677.1であった(図36)。
新しいTTG変異のより一層高い厳密性は、より一層高い中間値の蛍光性信号と関連する(図36)。しかし、TTG Thr9 Zeo 7/67/7及びTTG Phe9 Zeo 7/67/7の構築物は、2種の高く発現するコロニの各々及び少数の低く発現するコロニだけを与えた。これは、これらの変異が厳密性のふちであり、それは、細胞が培養媒体に添加するゼオシンの固定濃度に耐えることができるものであることを指し示すかもしれない。
ゼオシン耐性のmRNAの記載する翻訳効率の使用が、より一層高い発現レベルのd2EGFPタンパク質で、これがSTAR要素との組合せにおいてのものであるものを招くことを結論付けられる。
(例16: 示差翻訳効率を有するピューロマイシン-d2EGFPのバイシストロンの構築物の創作及び試験。)
3の内部ATGsがピューロマイシン耐性遺伝子において存在し、その各々はメチオニンについてコードする(図28、図37A)。これらのATGsは除かれなければならず(図37B、C)、それはそれらがATG開始コドン(又はその情況)が修飾されるとき、開始コドンとして役立ち、及びこれがピューロマイシン耐性タンパク質に似てないペプチドを招くからである。より一層重要なことに、これらのATGsは興味ある遺伝子の有効な翻訳を、例証の目的のためのこの例におけるd2EGFPによって表わすように妨げる。メチオニンはゼオシン耐性タンパク質におけるように(例8)、ロイシンに変化された。しかし、ロイシンについてのTTGコドンの使用の代わりに(例として例8のゼオシンにおいて)、今回、ロイシンについてのCTGコドンを採択した(ヒトにおいて、ロイシンについてCTGコドンがTTGコドンよりもより一層多く用いられる)。内部ATGsを除くために、ピューロマイシン耐性タンパク質の読み枠を4種のプライマ対でまず増幅し、4種のピューロマイシン耐性タンパク質断片を生じさせる。プライマ対は次のものであった:
PURO BamHI F(SEQ.ID.NO.129): GATCGGATCCATGGTTACCGAGTACAAGCCCACGGT、
PURO300 R LEU(SEQ.ID.NO.130): CAGCCGGGAACCGCTCAACTCGGCCAGGCGCGGGC;及び
PURO300FLEU(SEQ.ID.NO.131): CGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGCTGGAAGGCCTC、
PURO600RLEU(SEQ.ID.NO.132): AAGCTTGAATTCAGGCACCGGGCTTGCGGGTCAGGCACCAGGTC。
これは2種のPCR生成物を生じさせ、ピューロマイシン耐性遺伝子の5’及び3’部分に対応する。2種の生成物を一緒に添加し、及びPURO BamHI F(SEQ.ID.NO.129)-PURO600RLEU(SEQ.ID.NO.132)で増幅した。得られるPCR生成物をBamHI-EcoRIで切断し、及び連結し、pCMV-ATGPURO(leu)を創作した。このクローンの配列決定は、すべての3種の内部ATGsが変換されたことを確認した。全体のピューロマイシンの読み枠を、次いでPUROBamHI TTGlF(SEQ.ID.NO.133): GAATTCGGATCCACCTTGGTTACCGAGTACAAGCCCACGGTG及び PURO600RLEU(SEQ.ID.NO.132)で増幅した。このプライマはTTG開始コドン直後に余分のコドン(GTT)を導入し、それは‘G’がヌクレオチド+4で最適な情況について導入され、及び従って2種より多くのヌクレオチドが導入され、リーディングフレームを保存するからである。
(結果)
CHO-K1細胞を構築物で形質移入し、それはTTG Puro(図38)の遺伝子を選定遺伝子として含み、d2EGFPレポータ遺伝子の上流にクローン化した。選定は10μg/mLピューロマイシン下であった。構築物は、STAR要素を伴わない(コントロール)か、又はCMVプロモータの上流のSTAR要素7及び67及びd2EGFP遺伝子から下流のSTAR7を伴った(図38)。図38は、24のTTG Puroコントロールのコロニの平均d2EGFPの蛍光性信号が37.9であり、24のTTG PuroのコロニでSTARs 7/67/7を有するものは75.5であったことを示す。さらに、5種の最も高い値の平均を取るとき、TTG Puroコントロールのコロニのd2EGFPの蛍光性信号は69.5であり、及びTTG PuroのコロニでSTARs 7/67/7を有するものは186.1で、d2EGFPの蛍光性信号のほとんど三倍(three-fold)増加であった。これは、ピューロマイシン耐性のmRNAの、記載し、修飾された翻訳効率が、より一層高い発現レベルのd2EGFPタンパク質で、これがSTAR要素と組合せにおいてものであるものを招くことを示す。
この実験はピューロマイシン耐性遺伝子を変異し、それからATG配列を除去し得、一方で機能性を維持することを実証する。さらに、本発明にかかる選定方法がまた、更に別の選定マーカ、ピューロマイシンと共に働くことが結論付けられる。
(例17: 示差翻訳効率を有するネオマイシン構築物の創作及び試験。)
16の内部ATGsがネオマイシン耐性遺伝子において存在し、その5がネオマイシンの読み枠においてメチオニンについてコードする(図31、図39A)。すべてのこれらの16のATGsは除かれなければならず(図39B、C)、それはATG開始コドン(又はその情況)が修飾されるとき、それらが開始コドンとして役立ち、及びこれがネオマイシン耐性タンパク質に似ていないペプチドを招き、及びこれが興味あるポリペプチドについてコードする下流の読み枠からの翻訳を、本発明にかかる転写単位において減少させるからである。内部ATGsを除くために、ネオマイシン耐性タンパク質の読み枠を商業上の提供者によって完全に合成し(GeneArt(ジーンアート)、独国)、そこでは、すべての内部コードATGs(Metについて)がそこでCTGsによって置換され(Leuについてコードする)、及び非-コードATGsが置換され、縮重したコドンを用い、及び従ってタンパク質配列において変異を招かず; ネオマイシンの合成される配列をSEQ.ID.NO.134において与える。ATGの開始コドンを、GTG(図39B)又はTTG図39C)で置換するため、合成したネオマイシン遺伝子を、プライマ対のNEO-F-HindIII(SEQ.ID.NO.136): GATCAAGCTTTTGGATCGGCCATTGAAACAAGACGGATTG及び
NEO EcoRI 800R(SEQ.ID.NO.137): AAGCTTGAATTCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGで増幅した。
(結果)
E.coli(大腸菌)細菌を用い、ネオマイシン耐性タンパク質でそれからすべてのATGsを除去したものの機能性を試験した。E.coli細菌を構築物で形質転換し、それはGTG Neo(図39B)又はTTG Neo(図39C)の遺伝子を選定遺伝子として含んだ。選定はカナマイシン上での細菌の増殖によって起こした。機能的なネオマイシン耐性遺伝子だけがカナマイシンに対する抵抗性を与えることができる。いずれかの修飾したNeo遺伝子での形質転換がE.coliのコロニの形成を招き、それから遺伝子を含むプラスミドを分離することができる。これは、ネオマイシン耐性のmRNAsの、記載し、修飾した翻訳効率、並びにNeoの読み枠からのすべてのATGsの除去が、機能的なネオマイシン耐性タンパク質の生産を招くことを示す。
変異したネオマイシン耐性遺伝子を本発明にかかる多シストロンの転写単位において組み込み、及びG418又はネオマイシンでの選定のために真核生物宿主細胞において用いる。
(例18: 示差翻訳効率を有するdhfr構築物の創作及び試験。)
8の内部ATGsがdhfr遺伝子において存在し、その6種はdhfrの読み枠においてメチオニンについてコードする(図29、図40A)。すべてのこれらのATGsは除かれなければならず(図40B、C)、それはATG開始コドン(又はその情況)が修飾されるとき、それらが開始コドンとして役立ち、及びこれがdhfrタンパク質に似てないペプチドを招き、及び興味あるポリペプチドについてコードする下流の読み枠からの翻訳が、本発明にかかる転写単位において減少するからである。内部ATGsを除くため、dhfrタンパク質の読み枠をネオマイシンについて上述するように、完全に合成した(SEQ.ID.NO.138)。ATG開始コドンをGTG(図40B)又はTTG(図40C)で置換するため、合成したDHFR遺伝子を、プライマのDHFR-F-HindIII(SEQ.ID.NO.140): GATCAAGCTTTTGTTCGACCATTGAACTGCATCGTC及び
DHFR-EcoRI-600-R(SEQ.ID.NO.141): AGCTTGAATTCTTAGTCTTTCTTCTCGTAGACTTCで増幅した。
(結果)
E.coli細菌を用い、dhfrタンパク質でそれからすべてのATGsを除去したものの機能性を試験した。E.coliを構築物で形質転換し、それはGTG dhfr(図40B)又はTTG dhfr(図40C)の遺伝子を含んだ。選定はトリメトプリム(Sigma(シグマ社)T7883-56)上での細菌の増殖によって起こした。機能的なdhfr遺伝子だけがトリメトプリムに対する抵抗性を与えることができる。いずれかの修飾したdhfr遺伝子での形質転換がE.coliのコロニの形成を招き、それから遺伝子を含むプラスミドを分離することができた。これは、dhfrのmRNAsの、記載し、修飾した翻訳効率、並びにdhfrの読み枠からのすべてのATGsの除去が、機能的なdhfrタンパク質の生産を招くことを示す。
変異したdhfr遺伝子を本発明にかかる多シストロンの転写単位において組み込み、及びメトトレキサートでの選定について真核生物宿主細胞において用いる。
(例20: PER.C6細胞での示差翻訳効率を有するゼオシン-及びブラストサイジンの構築物の試験。)
種々のゼオシン及びブラストサイジンの遺伝子で、変異した開始コドンを有し、すべてがd2EGFP遺伝子の上流にクローン化されたものを、PER.C6細胞株において試験した。
(結果)
GTGゼオシン及びGTGspaceゼオシン耐性遺伝子の修飾物(例14も参照; 図41)及びGTGブラストサイジン及びTTGブラストサイジン耐性遺伝子の修飾物(例11も参照; 図42)で、すべてがd2EGFP遺伝子の上流にクローン化されたものを、PER.C6細胞中に形質移入した。図41において示すように、双方のGTGゼオシン及びGTGspaceゼオシン遺伝子での形質移入は、d2EGFPを発現したコロニを招いた。20のGTG Zeoのコロニの平均d2EGFP蛍光性信号は63.8であり、一方20のGTGspace Zeoのコロニの平均d2EGFP信号は185であり、PER.C6細胞でも、GTGspace ZeoがGTG ZeoのmRNAのものよりも高い翻訳の厳密性を持つことを実証した。
図42において示すように、双方のGTGブラストサイジン及びTTGブラストサイジンの遺伝子での形質移入はd2EGFPを発現したコロニを招いた。20のGTGブラストサイジンのコロニの平均d2EGFP蛍光性信号は71.4であり、一方20のTTGブラストサイジンのコロニの平均d2EGFP蛍光性信号は135であり、PER.C6細胞でも、TTGブラストサイジンがGTGブラストサイジンのmRNAのものよりも高い翻訳厳密性を持つことを実証した。
この例は、本発明にかかる選定システムがまた、CHO細胞以外の他の細胞においても用いることができることを実証する。
(例21: TTGゼオシン-d2EGFPの構築物への転写休止信号の添加の試験。)
転写休止(TRAnscription Pause)(TRAP)配列は、少なくとも部分で、アンチセンスRNAの形成を妨げるか、又は少なくとも部分で、前記タンパク質の発現単位を入力する転写を妨げると考えられる(WO 2004/055215参照)。TRAP配列は転写単位中に配置されるとき、TRAPの3’側上に存在する核酸における転写の減少したレベルを招く配列として機能的に規定され、それはTRAPの5’側上に存在する核酸において観察される転写のレベルと比較されるときであり、及びTRAP配列の非-制限的な例は転写終結信号である。転写単位の入力のために、転写を妨げ、又はそれを減少させるように機能させるため、TRAPは転写単位の発現を駆動するプロモータの上流に配置されるべきであり、及びTRAPは5’から3’までの方向にあるべきである。アンチセンスRNAの少なくとも1部分の形成を妨げるために、TRAPは転写単位において読み枠の下流に位置付け、及び3’から5’までの方向で存在すべきである(すなわち、通常、転写単位において読み枠の後ろに存在する転写終結配列の正常な配向と反対の配向においてである)。5’から3’までの配向におけるプロモータの上流のTRAP及び3’から5’までの配向における読み枠の下流のTRAPの組合せが好ましい。TRAP配列のSTAR要素への添加は、導入遺伝子の発現に及ぼすSTAR要素の効果を改善する(WO 2004/055215参照)。ここで、本発明者等はTRAP配列のTTG Zeo耐性遺伝子の情況における効果を試験する。
(結果)
STAR7要素で隣接されるTTGゼオシン-d2EGFPカセット(図43)を、SPA/休止TRAP配列(WO 2004/055215参照); SEQ.ID.NO.142)の、双方の5’ STAR7の上流(5’から3’までの方向において)及び3’ STAR7の下流(3’から5’までの方向において)での添加によって修飾した。双方のSTAR 7/7及びTRAP-STAR 7/7-TRAPを含むベクタをCHO-K1に形質移入した。安定なコロニを分離し、及びd2EGFPの蛍光性の強度を測定した。図43において示すように、23のTTG Zeo STAR 7/7のコロニの平均d2EGFP蛍光性信号は455.1であり、一方23のTTG Zeo TRAP-STAR 7/7-TRAPのコロニの平均d2EGFP蛍光性信号は642.3であった。最も高い5種のTTG Zeo STAR 7/7のコロニにおける平均d2EGFP蛍光性信号は705.1であり、一方5のTTG Zeo TRAP-STAR 7/7-TRAPのコロニの平均d2EGFP蛍光性信号は784.7であった。
この結果は、TRAPsの添加がd2EGFPの蛍光性信号を最も高いコロニにおいて高めないが、高く発現するコロニの数において十分な増加があることを指し示す。5のTTG Zeo STAR 7/7のコロニだけが、600より上のd2EGFP信号を持つが、17のTTG Zeo TRAP-STAR 7/7-TRAPのコロニは600より上のd2EGFPの蛍光性信号を持った。
この実験において、各プラスミドの3μgDNAを形質移入した。しかし、形質移入の効率は似ていたが、TTG Zeo STAR 7/7のプラスミドを有するコロニの合計数は62であり、一方TTG Zeo TRAP-STAR 7/7-TRAPのプラスミドを有するコロニの合計数は116であり、ほとんど倍加であった。
本発明者等は、TRAP要素を、修飾したゼオシン耐性遺伝子翻訳コドンを有するSTAR含有プラスミドへ添加することが、十分により一層高いコロニの全体的な数を招き、及びより一層多くのコロニが最も高い発現レベルを有して存在することを結論付ける。
(例22: 発現のコピ-数依存性)
本発明者等は、統合したEpCAMのDNAのコピの数に関連してEpCAMの抗体の発現レベルを分析した。
(結果)
試験した構築物はTTG-Zeo-軽鎖(LC)-TTG-Blas-重鎖(HC)であり、双方の発現単位はCMVプロモータの制御下にあった(図44参照)。この構築物はSTAR 7及び67を含んだ(図44参照)。選定条件は、200μg/mLゼオシン及び20μg/mLブラストサイジンを培養媒体において用い、コントロールのコロニ(STARなし)が生き残らず、及びSTAR 7/67/7のコロニしか生き残らないようなものであった。
DNAを、コロニがゼオシン及びブラストサイジンの選定圧力下に60日あったときに分離した(図44参照)。R2値を計算し、及び示す。5から40までのpg/細胞/日のEpCAMの全体の範囲において、高い程度のコピ数の依存が、0.5978の比較的高いR2によって意味されるように存在した(図44)。データは、新しい選定システムにおいて、TTG Zeo-TTG Blas EpCAM STAR 7/67/7の構築物を含むコロニで、コピ数依存性EpCAMの発現が存在することを示す。
(例23: より一層高いEpCAMの発現のメトトレキサート誘導)
本発明者等は、EpCAM抗体の発現レベルを、メトトレキサート(MTX)を用いるクローンの温置後、分析した。この実験の目的は、STAR-含有構築物の増幅がより一層高いEpCAM発現を招くかどうかを定めることであった。MTXはdhfr遺伝子生成物の抑制を介して作用する。若干のCHO株でdhfr-欠損であるものを記載するが、CHO-K1はdhfr+である。したがって、培養媒体におけるMTXの比較的高い濃度が存在し、CHO-K1細胞において高めたMTXの濃度によって増幅について選定されなければならない。
(結果)
試験した構築物は、TTG-Zeo-重鎖(HC)-TTG-Blas-軽鎖(LC)で、双方の発現単位はCMVプロモータの制御下にあった。各CMVプロモータの上流に、STAR67を位置させ、及びSTAR7を用い、全体のカセットを隣接させた(またかかる構築物について例13、図22も参照)。この構築物を更に、HC及びLCのカセットの間に、第2のSTAR67の上流で、SV40-dhfrカセット(SV40プロモータの制御下のマウスdhfr遺伝子)を配置することによって修飾した(図45)。CHO-K1細胞を形質移入した。選定を100μg/mLゼオシン及び10μg/mLブラストサイジンで培養媒体において行った。コントロールのコロニ(STAR要素伴わない)は生き残れず、及びSTAR要素を含む構築物を有するコロニだけが生き残った。コロニを分離し、及びEpCAMの発現レベルを測定する前に繁殖させた。20及び35のpg/細胞/日の間で生産する6種のコロニを、100nMのMTXを含有する媒体に移した。この濃度を500nMに、1000nM及び最終的に2000nMに上げ、各ステップの間において2週の期間を有した。2000nMのMTX上での2週後にEpCAM濃度を測定した。図45において示すように、4種のコロニが高められたEpCAM生産を示した。コロニ13: 22から30まで; コロニ14: 28から42まで; コロニ17: 20から67まで及びコロニ19: 37から67までのpg/細胞/日であった。コロニ4及び16は高められたEpCAM発現を示さなかった。本発明者等は本発明にかかる選定システムで創作されるCHO-K1コロニの培養媒体へのメトトレキサートの添加が高められたタンパク質の発現を招くことを結論付ける。それ故本発明にかかるSTAR要素及び選定方法は、共に組み合わせることができ、及びタンパク質の発現レベルのMTX-誘導される増強(MTX-induced enhancement)と適合性がある。
(例24: 異なるプロモータの情況におけるTTG-Zeoの選定の操作)
本発明者等はd2EGFPの発現レベルを、TTG Zeo選定マーカ及び異なるプロモータの情況において分析した。本発明者等はSTAR要素の作用を、CMVエンハンサ/プロモータ、SV40エンハンサ/プロモータ及びCMVエンハンサ/β-アクチンプロモータの情況において比較した。
(結果)
図46において、本発明者等はプロモータを指し示し、それを本発明者等がTTG Zeo選定マーカの情況において試験した。試験したプラスミドは、指し示されたコントロールの構築物で、3種の異なるプロモータを有するもの、及びSTAR 7及びSTAR 67により5’端で、及びSTAR 7により3’端で隣接されるSTAR構築物からなる。構築物をCHO-K1細胞に形質移入し、及び選定を200μg/mLゼオシンで培養媒体において実行した。23までの独立のコロニを分離し、及びd2EGFPの発現レベルの分析前に繁殖させた。図46において示すように、STAR要素のCMVエンハンサ/プロモータ、SV40エンハンサ/プロモータ又はCMVエンハンサ/β-アクチンプロモータを有する構築物における組込みは、すべて、より一層高いd2EGFPの発現レベルを有するコロニの形成を、対応するコントロール構築物を有するものに比べて招いた。これは本発明にかかる選定システムが、STAR要素との組合せで、異なるプロモータの情況において、良好に作動することを示す。さらに、分析はCMV-駆動されるd2EGFP値の中間値がSV40-駆動されるd2EGFP値の中間値よりも十分に高かったことを示した(p<0.05)。対照的に、CMV-駆動されるd2EGFP値の中間値はCMV/βアクチン-駆動されるd2EGFP値と十分には異ならなかった(p=0.2)。
(例25: TTG-Zeo選定システムにおいて異なるSTAR要素の比較。)
本発明者等はd2EGFPの発現レベルを、CMV-プロモータ-TTG Zeoの選定マーカ及び53の異なるSTAR要素の情況において分析し、より一層多くの洞察を得、そこではSTAR要素がこの情況において最良の結果を与える。
(結果)
本発明者等は、CMVプロモータ-TTG Zeo-d2EGFPカセットまで、及びその下流の53のSTAR要素をクローン化した。次のSTAR要素をかかる構築物において試験した: STAR2-12、14、15、17-20、26-34、36、37、39、40、42-49、51、52、54、55、57-62、64、65、67。構築物をCHO-K1細胞に形質移入し、及び選定を200μg/mLゼオシンで培養媒体において実行した。24までの、独立のコロニを分離し、及びd2EGFPの発現レベルの分析前に繁殖させた。構築物におけるSTAR要素の組込みは、異なる程度の高められたd2EGFPの発現を、コントロールと比べて招いた。この実験においてのSTAR要素14、18及び55の組込みは、コントロール(STAR要素なし)に対し平均d2EGFP発現の増加を招かなかった。若干の構築物(STAR要素2、3、10、42、48及び49を有するもの)は、この実験において、少数のコロニに対してしか上昇を与えなかったが、すべての試験したSTAR要素は、14、18及び55を除き、コントロールについてのものよりも高い平均のd2EGFP発現レベルを招いた。若干のSTAR要素がより一層多くの細胞の種類に特異的な様式で振る舞うかもしれず、及びSTAR14、18及び55が他の細胞の種類において、他のプロモータ、他の選定マーカと共に、又はここで試験する特定の組の条件においてと異なる情況又は立体配置において、より一層良好に働くことが十分に可能であること注目すべきである。10種のSTAR要素、即ちSTAR要素7、9、17、27、29、43、44、45、47及び61の添加は、コントロールの平均d2EGFP発現レベルの5倍よりも高い平均d2EGFP発現レベルを誘導した。本発明者等は、コントロール及びSTAR要素を有する7種の構築物を、再形質転換し、及び実験を繰り返した。結果を図47において示す。構築物におけるSTAR要素の組込みは、コントロールに比べ、異なる程度の高められるd2EGFP発現を招いた(図47)。コントロールの構築物で形質移入したコロニにおける平均d2EGFP発現レベルは29であった。7種のSTARの構築物を有するコロニにおけるd2EGFPの発現レベルからの平均は151(STAR67)及び297(STAR29)の間に及んだ。これはコントロールのコロニにおける平均よりも5から10-倍高いファクタである。本発明者等は、a) STAR要素の大部分が遺伝子発現レベルに及ぼす陽性の効果を持ち、b) 異なるSTAR要素によって誘導される陽性の効果の程度において変動が存在し、及びc) 53種の試験したSTAR要素の内の10種が、コントロールに比較して、5-倍よりも高い平均d2EGFP発現レベルを誘導すること、及びSTAR要素が、コントロールと比較して、10-倍高い平均d2EGFP発現レベルを誘導することができることを結論付ける。
(例26: 本発明にかかる選定システムの情況における他の染色質制御要素)
ニワトリのβ-グロビンの遺伝子座の遺伝子座制御領域におけるHS4高感受性部位(Chung等、1997年)、マトリクス付着領域(MAR)(Stief(スティーフ)等、1989年)及び遍在性染色質開口要素(opening element)(UCOE)(Williams(ウィリアムス)等2005年)のようなDNA要素は、これらのDNA要素がベクタ中に組み込まれるとき、遺伝子の発現に及ぼす有利な効果を持つことが報告されている。本発明者等はこれらのDNA要素を本発明にかかる選定システムと組み合わせた。
(結果)
1.25kbのHS4要素を、CMVプロモータ、TTG Zeo及びd2EGFPを包含するカセット中に、3種の方法の連結工程によってクローン化し、2種のHS4要素のタンデムを有する構築物を入手した(Chung等、1997年)。この工程を、双方の5’及び3’のカセットで、CMVプロモータ、TTG Zeo及びd2EGFPを包含するものについて行った。2959bpの長いニワトリのリゾチームMAR(Stief等、1989年)を、CMVプロモータ、TTG Zeo及びd2EGFPを包含するカセットの5’及び3’でクローン化した。
2614bpの長いUCOE (Williams等、2005年)は、NotI-KpnIの断片で、ヒトのBACのクローン(RPl1-93D5)から切出され、ヌクレオチド29449から32063までに対応した。この断片をCMVプロモータの5’でクローン化した。
STAR構築物はCMVプロモータの5’でSTAR 7及びSTAR 67、及びカセットの3’でSTAR7を含んだ。これらの4種のl構築物、並びにコントロールの構築物で、染色質制御DNA要素を伴わないものを、CHO-K1細胞に形質移入した。選定は200μg/mLゼオシンで培養媒体において実行した。コロニを分離し、繁殖させ、及びd2EGFPの発現レベルを測定した。図48において示すように、構築物はすべてDNA要素を有し、d2EGFP発現コロニの形成を招いた。しかし、2xHS4要素及びUCOEの組込みは、コントロールのコロニと比較して、より一層高いd2EGFP発現レベルを表示するコロニの形成を招かなかった。対照的に、リゾチームMARの組込みはd2EGFPを十分により一層高く発現するコロニの形成を招いた。MAR含有構築物によって誘導される中間値の発現レベルはコントロールのコロニにおけるものより4-倍高かった。しかし、最良の結果は、構築物においてSTAR7及び67を組み込むことによって得られた。中間値のd2EGFPの発現レベルのほとんど10-倍の増加が、コントロールのコロニと比べて観察された。本発明者等は、MARsのような他の染色質制御DNAの要素が、本発明にかかる選定システムの情況において用いることができることを結論付ける。しかし、最良の結果はSTAR要素が染色質制御要素として用いられるときに得られた。
(図の記載)
(図1)
STAR要素のない、及びそれを有する転写単位の概略図である。
A) (5’から3’へ)、導入遺伝子(例えばd2EGFP遺伝子を暗号化する)、IRES、及びCMVプロモータの制御下の選定可能なマーカ(zeo、ゼオシン耐性を付与する)を含むバイシストロンの遺伝子。発現単位はその3’端にSV40転写ターミネータを持つ(t)。構築物の名称はCMV-d2EGFP-ires-Zeoである(CMVコントロール)。
B) Aにおけるような構築物であるが、今回STAR 67をCMVプロモータの上流にクローン化する。構築物の名称はSTAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeoである(CMV-STAR67)。
C) Bにおけるような構築物であるが、上流及び下流のSTAR7要素をクローン化し、全体の構築物に隣接させる。構築物の名称はSTAR7-STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo-STAR7である(CMV-STAR67 7/7)。
(図2)
STAR67がCMV駆動されるd2EGFPの発現をCHO細胞において改善する。
10種の独立の安定なコロニについてのd2EGFP信号の中間値を、示される構築物についてCHO細胞においてプロットする。A) CMVコントロール; B) STAR67-CMV. X(10): 10種のコロニの平均d2EGFP発現レベル。細部については例2を参照。
(図3)
STAR67がEFlα駆動されるd2EGFPの発現をCHO細胞において改善する。図2と同様であるが、今回EFlαプロモータを有する。A) EFlαコントロール; B) STAR67-EFlα。
(図4)
STAR67がUB6駆動されるd2EGFPの発現をCHO細胞において改善する。図2及び3と同様であるが、今回UB6プロモータを有する。A) UB6コントロール; B) STAR67-UB6。
(図5)
STAR67がCMV駆動されるd2EGFPの発現をPER.C6細胞において改善する。図2と同様であるが、今回PER.C6細胞における。A) CMVコントロール; B) STAR67-CMV。
(図6)
STAR67がEFlα駆動されるd2EGFPの発現をPER.C6細胞において改善する。図3と同様であるが、今回PER.C6細胞における。A) EFlαコントロール; B) STAR67-EFlα。
(図7)
STAR67がUB6駆動されるd2EGFPの発現をPER.C6細胞において改善する。図4と同様であるが、今回PER.C6細胞における。A) UB6コントロール; B) STAR67-UB6。
(図8)
STAR67がSV40駆動されるd2EGFPの発現をCHO-K1細胞において別のSTAR要素との組合せで改善する。図2と同様であるが、今回CHO細胞におけるSV40プロモータ、及び指し示される構築物を用いる。d2EGFP信号の中間値は18-20種の独立の安定なコロニについて形質移入後60日にプロットする。A) SV40コントロール、SV40-STAR67、SV40-STAR7/7; B) SV40コントロール及びSV40-STAR67 7/7。細部については例4を参照。
(図9)
STAR67がEpCAMの抗体のUB6駆動される発現レベルをCHO-K1細胞において改善する。細部については例5を参照。A) STAR要素を伴わない構築物; B) プロモータの上流のSTAR67及び隣接するSTAR7要素を有する構築物。抗-EpCAM抗体の濃度をpg/細胞/日として表示する。X(18): 18種のコロニの平均生産レベル。
(図10)
STAR67がエンハンサブロッカでないが、STAR6及び7がそうである。細部については例6を参照。
(図11)
STAR67がUB6及びCMV-駆動される抗体の発現レベルを、安定に形質移入したCHO細胞において高める。細部については例7を参照。A) 抗-EpCAMの重鎖(HC)及び軽鎖(LC)を含む単一のDNA分子で、各々をプロモータの後ろ、及び各々を異なる選定可能なマーカ遺伝子に連結する(同時選定を双方のマーカについて用いる): STAR要素のない構築物。コロニは見出されなかった; B) 2種のプロモータの間のSTAR67を有する同じ構築物。抗-EpCAM抗体の濃度をpg/細胞/日として表示する。X(19): 19種のコロニの平均生産レベル。
(図12)
本発明に従う選定マーカ遺伝子(ゼオシン耐性遺伝子)の使用の図式的な表示である。A. 野生-種ゼオシン耐性遺伝子で、その正常な翻訳惹起部位(ATG開始コドン)及び1種の内部ATGコドンで、それはメチオニンについてコードするものを持つ。B. 変異ゼオシン耐性遺伝子で、そこでは、内部ATGがロイシンについてのコドンに変異され; この変異体は機能的なゼオシン耐性遺伝子である。C. Bと同様であるが、変異した翻訳惹起部位を備え、そこではATG開始コドンの情況が変異され、翻訳惹起が減少される。D. Bと同様であるが、変異した開始コドン(GTG)を備える。E. Bと同様であるが、TTG開始コドンを有する。図C-Eの下での数字は、惹起の頻度(開始コドン下)及び‘スキャン-スルー’の頻度(コード配列下)の相対的量をリボソームによって図式的に指し示すが、半-定量的な様式においてのみであり、即ち、それらは、互いに比較する翻訳惹起の効率を指し示すが、質的な数字はまったく異なり得る: 数字は本発明を説明するのにだけ役立つ。細部については例8を参照。
(図13)
本発明に従う多シストロンの転写単位の図式的な表示であり、より一層多くの、又はより一層少ない相互的な相互依存性翻訳効率を有する。図12に関しての説明であるが、今回dEGFP遺伝子(ここでは興味ある遺伝子を例証する)を選定可能なマーカポリペプチドのコード配列の下流に配置した。ゼオシン耐性遺伝子は内部でMet→Leu変異を備える(図12B参照)。細部については例9を参照。
(図14)
本発明に従う選定システムの結果であり、STAR要素を有するか、又は有しないものである。A. ゼオシン耐性遺伝子でATG開始コドンを悪い情況において有する(この図式において“ATGmut”と称するが、悪い情況においてATGの後ろのスペーサ配列を含み、それで、文章において、概して“ATGmut/space”と称する。B. ゼオシン耐性遺伝子でGTG開始コドンを有するものである。C. ゼオシン耐性遺伝子でTTG開始コドンを有するものである。独立のコロニについてのd2EGFP信号が縦軸上に示される。細部については例9を参照。
(図15)
本発明に従う選定システムの結果であり、アップスケールド実験におけるもの(A)、及びIRESを用いる従来技術に従う選定システムとの比較である(B)。独立のコロニについてのd2EGFP信号を縦軸上に示す。細部については例10を参照。
(図16)
本発明に従う多シストロンの転写単位を有する選定システムの結果であり、選定可能なマーカとしてブラストサイジンを用いる。A. GTG開始コドンを備えるように変異されるブラストサイジン耐性遺伝子。B. TTG開始コドンを備えるように変異されるブラストサイジン耐性遺伝子。ブラストサイジン耐性遺伝子は更にすべての内部ATG配列を除去するように変異される。独立のコロニについてのd2EGFP信号を縦軸上に示す。細部については例11を参照。
(図17)
本発明に従う多シストロンの転写単位を有する数種のクローンの発現の安定性である(TTG開始コドンを有するゼオシンを含む)。選定圧力(100μg/mLゼオシン)が完全な実験の間に存在した。独立のコロニについてのd2EGFP信号を縦軸上に示す。細部については例12を参照。
(図18)
図17のようにであるが、ゼオシン濃度をクローンの確立後に20μg/mLにまで下げた。
(図19)
図17のようであるが、ゼオシンをクローンの確立後に培養媒体から不存在にした。
(図20)
本発明に従う多シストロンの転写単位を有する選定システムを用いる抗体(抗-EpCAM)の発現である。重鎖(HC)及び軽鎖(LC)はこの例において興味あるポリペプチドである。これらのそれぞれは、別の転写単位において存在し、それらは双方ともにこの例において単一の核酸分子上にある。HCは選定可能なマーカポリペプチドについてコードするゼオシン耐性遺伝子によって先行され、一方LCは選定可能なマーカポリペプチドについてコードするブラストサイジン耐性遺伝子によって先行される。双方の耐性遺伝子を変異させ、ATG開始コドンを非-最適な情況において備えさせる(図において“mutATG”であるが、スペーサ配列を含み、及び従って概して文章において“ATGmut/space”と称する)。各々の多シストロン転写単位はCMVプロモータの制御下にある。指し示すようなSTAR配列を有する構築物をSTAR配列を伴わない構築物と比較した。これらの構築物を宿主細胞中に導入したときに得られる抗体のレベルを、種々の独立なクローンについて縦軸上にpg/細胞/日において与える。細部については例13を参照。
(図21)
図20のようであるが、双方の選定マーカ遺伝子がGTG開始コドンを備えた。細部については例13を参照。
(図22)
図20のようであるが、双方の選定マーカ遺伝子がTTG開始コドンを備えた。細部については例13を参照。
(図23)
サブ-クローンにおける選定圧力の不存在下の発現の安定性である(選定圧力下にコロニを確立した後、若干のコロニであり、そこではゼオシンを含まない媒体においてサブ-クローン化した)。細部については例12を参照。
(図24)
本発明の具体例の発現レベルのコピ数依存性である。細部については例12を参照。
(図25)
図12のようであるが、ブラストサイジン耐性遺伝子についてのものである。この遺伝子における4種の内部ATG’sのどれも、メチオニンについてコードするフレーム中になく、及び従って遺伝コードの重複性を用い、これらのATG’sを、暗号化されるタンパク質の内部アミノ酸配列を変異させずに変異させた。
(図26)
野生-種のゼオシン耐性遺伝子のコード配列である(SEQ.ID.NO.108)。太字のATG’sのものはメチオニンについてコードする。最初の太字のATGは開始コドンである。
(図27)
野生-種のブラストサイジン耐性遺伝子のコード配列である(SEQ.ID.NO.110)。太字のATG’sのものはメチオニンについてコードする。最初の太字のATGは開始コドンである。配列において他のATG’sのものは下線を引かれ: これらの内部ATG’sのものはメチオニンについてコードせず、それはそれらがフレームにおいてないからである。
(図28)
野生-種のピューロマイシン耐性遺伝子のコード配列である(SEQ.ID.NO.112)。太字のATG’sのものはメチオニンについてコードする。最初の太字のATGは開始コドンである。
(図29)
野生-種のマウスDHFR遺伝子のコード配列である(SEQ.ID.NO.114)。太字のATG’sのものはメチオニンについてコードする。最初の太字のATGは開始コドンである。配列における他のATG’sのものは下線を引かれ: これらの内部ATG’sのものはメチオニンについてコードせず、それはそれらがフレームにおいてないからである。
(図30)
野生-種のハイグロマイシン耐性遺伝子のコード配列である(SEQ.ID.NO.116)。太字のATG’sのものはメチオニンについてコードする。最初の太字のATGは開始コドンである。配列における他のATG’sのものは下線を引かれ: これらの内部ATG’sのものはメチオニンについてコードせず、それはそれらがフレームにおいてないからである。
(図31)
野生-種のネオマイシン耐性遺伝子のコード配列である(SEQ.ID.NO.118)。太字のATG’sのものはメチオニンについてコードする。最初の太字のATGは開始コドンである。配列における他のATG’sのものは下線を引かれ: これらの内部ATG’sのものはメチオニンについてコードせず、それはそれらがフレームにおいてないからである。
(図32)
野生-種のヒトのグルタミン合成酵素(GS)遺伝子のコード配列である(SEQ.ID.NO.120)。太字のATG’sのものはメチオニンについてコードする。最初の太字のATGは開始コドンである。配列における他のATG’sのものは下線を引かれ: これらの内部ATG’sのものはメチオニンについてコードせず、それはそれらがフレームにおいてないからである。
(図33)
本発明に従うGTG開始コドンを有する若干の更に修飾したゼオシン耐性選定マーカ遺伝子の図式的な表示であり、選定の厳密性の更なる微-調整を可能にする。細部については例14を参照。
(図34)
さらに修飾したゼオシン耐性選定マーカ遺伝子を含む発現システムでの結果である。細部については例14を参照。点は個々のデータ点を指し示す; 線は平均発現レベルを指し示す; 用いた構築物(また図33参照)を、横軸上で指し示し(構築物の名称の終わりでの7/67/7の付加は、プロモータの上流のSTAR配列7及び67及び転写終結部位の下流のSTAR7の存在を指し示す)、及びグラフ上に図式的に描写し; 縦軸はd2EGFP信号を指し示す。
(図35)
本発明に従うTTG開始コドンを有する若干の更に修飾したゼオシン耐性選定マーカ遺伝子の図式的な表示であり、選定の厳密性の更なる微-調整を可能にする。細部については例15を参照。
(図36)
さらに修飾したゼオシン耐性選定マーカ遺伝子を含む発現システムでの結果である。細部については例15を参照。点は個々のデータ点を示す; 線は平均発現レベルを示す; 用いた構築物を横軸上で示し、及びグラフ上で図式的に描写し; 縦軸はd2EGFP信号を示す。
(図37)
図12のようであるが、ピューロマイシン耐性遺伝子についてのものである。すべての3種の内部ATG’sのものはメチオニンについてコードし(パネルA)、及びロイシンについてコードするCTG配列によって置換する(パネルB)。細部については例16を参照。
(図38)
ピューロマイシン耐性遺伝子を含み、TTG開始コドンを有し、及び内部ATGコドンを有さない発現構築物での結果である。細部については例16を参照。点は個々のデータ点を示す; 線は平均発現レベルを示す; 用いた構築物を横軸上で示し、及びグラフ上で図式的に描写し; 縦軸はd2EGFP信号を示す。
(図39)
図12のようであるが、ネオマイシン耐性遺伝子についてのものである。細部については例17を参照。A. 野生-種のネオマイシン耐性遺伝子; ATG配列を指し示し、メチオニンについてコードするATGsをATG上のMetによって指し示す。B. ATG配列を伴わないネオマイシン耐性遺伝子で、及びGTG開始コドンを有する。C. ATG配列を伴わないネオマイシン耐性遺伝子で、及びTTG開始コドンを有する。
(図40)
図12のようであるが、dhfr遺伝子についてのものである。細部については例18を参照。A. 野生-種のdhfr遺伝子; ATG配列を指し示し、メチオニンについてコードするATGsをATG上でMetによって指し示す。B. ATG配列を伴わないdhfr遺伝子で、及びGTG開始コドンを有する。C. ATG配列を伴わないdhfr遺伝子で、及びTTG開始コドンを有する。
(図41)
本発明に従う発現構築物(ゼオシン選定可能なマーカ)でのPER.C6細胞における結果である。細部については例20を参照。点は個々のデータ点を示す; 線は平均発現レベルを示す; 用いた構築物を横軸上で示し、及びグラフ上で図式的に描写し; 縦軸はd2EGFP信号を示す。
(図42)
本発明に従う発現構築物(ブラストサイジン選定可能なマーカ)でのPER.C6細胞における結果である。細部については例20を参照。点は個々のデータ点を示す; 線は平均発現レベルを示す; 用いた構築物を横軸上で示し、及びグラフ上で図式的に描写し; 縦軸はd2EGFP信号を示す。
(図43)
本発明に従う発現構築物で、更に転写休止(TRAP)配列を備えるものでの結果である。細部については例21を参照。点は個々のデータ点を示す; 線は平均発現レベルを示す; 用いた構築物を横軸上で示し、及びグラフ上で図式的に描写し; 縦軸はd2EGFP信号を示す。
(図44)
本発明に従う転写単位を用いる抗体の発現のコピ-数依存を示す。細部については例22を参照。
(図45)
本発明に従う発現構築物を含むコロニからの抗体発現であり、そこでは、発現構築物のコピ数をメトトレキサートによって増幅する。細部については例23を参照。白棒: ゼオシン及びブラストサイジンでの選定; 黒棒: ゼオシン、ブラストサイジン及びメトトレキサート(MTX)での選定。試験したコロニの数を横軸上で描写する。
(図46)
異なるプロモータでの結果である。細部については例24を参照。点は個々のデータ点を示す; 線は平均発現レベルを示す; 用いた構築物を横軸上で示し、及びグラフ上で図式的に描写し; 縦軸はd2EGFP信号を示す。
(図47)
異なるSTAR要素での結果である。細部については例25を参照。点は個々のデータ点を示す; 線は平均発現レベルを示す; 用いた構築物を横軸上で示し、及びグラフ上で図式的に描写し; 縦軸はd2EGFP信号を示す。
(図48)
他の染色質制御要素での結果である。細部については例26を参照。点は個々のデータ点を示す; 線は平均発現レベルを示す; 用いた構築物を横軸上で示し、及びグラフ上で図式的に描写し(黒三角は異なる試験された染色質制御要素を指し示す); 縦軸はd2EGFP信号を示す。
(参照)
(1) Boshart, M, Weber(ウェーバ), F, Jahn(ヤーン), G, Dorsch(ドルシュ)-Hasler(ハスラー), K, Fleckenstein(フレッケンシュタイン), B, 及びSchaffner(シャフナー), W. (1985) A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus(非常に強いエンハンサをヒトサイトメガロウイルスの最初期遺伝子の上流に位置付ける) Cell(セル) 41, 521-530.
(2) Chung JH, Whiteley(ホワイトレイ) M, 及びFelsenfeld(フェルセンフェルド) G. (1993) A 5’ element of the chicken beta-globin domain serves as an insulator in human erythroid cells and protects against position effect in Drosophila(ニワトリのベータ-グロビンドメインの5’要素はヒト赤血球細胞においてインスレータとして役立ち、及びショウジョウバエにおいて陽性効果に対して保護する). Cell 74: 505-514.
(3) Chung JH, Bell(ベル) AC, Felsenfeld G. (1997) . Characterization of the chicken beta-globin insulator(ニワトリのベータ-グロビンのインスレータの特徴付け). Proc Natl Acad Sci USA(プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ) 94: 575-580.
(4) Das, GC, Niyogi(ニヨギ), SK, 及びSalzman(ザルツマン), NP. (1985) SV40 promoters and their regulation(SV40プロモータ及びそれらの調節) Prog Nucleic Acid Res Mol Biol(プログレス・イン・ヌクレイック・アシッド・リサーチ・アンド・モレキュラ・バイオロジ) 32, 217-236.
(5) Dumas, P, Bergdoll(バーグドル), M., Cagnon(カニョン), C及びMasson(マソン) JM. 1994. Crystal structure and site-directed mutagenesis of a bleomycin resistance protein and their significance for drug sequestering(ブレオマイシン耐性タンパク質の結晶構造及び部位-特異的変異原性及び薬物捕捉についてのそれらの有意性). EMBO J(EMBOジャーナル) 13, 2483-2492.
(6) Gill DR, Smyth(スマイス) SE, Goddard(ゴダード) CA, Pringle(プリングル) IA, Higgins(ヒギンス) CF, Colledge(コルレッジ) WH, 及びHyde(ハイド) SC. (2001) Increased persistence of lung gene expression using plasmids containing the ubiquitin C or elongation factor lα promoter(ユビキチンC又は伸長因子1αのプロモータを含むプラスミドを用いる肺遺伝子発現の増加した持続性). Gene Therapy(ジーン・セラピ) 8: 1539-1546.
(7) Gossen M, 及びBujard H. (1992) Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters(哺乳類細胞における遺伝子発現のテトラサイクリン-反応性プロモータによるタイトコントロール). Proc Natl Acad Sci USA 89: 5547-5551.
(8) Graham FO, Smiley(スマイリー) J, Russell(ラッセル) W及びNairn(ネアン) R. (1977) . Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5(ヒトアデノウイルスタイプ5からのDNAにより形質転換したヒト細胞株の特徴). J. Gen. Virol(ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジ). 36, 59-72.
(9) Huls GA, Heijnen(ヘイジネン) IAFM, Cuomo(クオモ) ME, Koningsberger(コーニングスバーガー) JC, Wiegman(ウィーグマン) L, Boel(ボエル) E, van der Vuurst(ファン・デル・ビュルスト)-de Vries(ド・フリース) A-R, Loyson(ロアゾン) SAJ, Helfrich(ヘルフリック) W, van Berge Henegouwen(ファン・ベルゲ・ヘネゴベン) GP, van Meijer(ファン・メイヤ) M, de Kruif(ド・クライフ) J, Logtenberg(ロンテンバーグ) T. (1999) . A recombinant, fully human monoclonal antibody with antitumor activity constructed from phage-displayed antibody fragments(ファージ提示抗体断片から構築される抗腫瘍活性を有する、組換えの、十分なヒトの単クローン性抗体). Nat Biotechnol(ネイチャ・バイオテクノロジ). 17, 276-281.
(10) Jones D, Kroos(クルース) N, Anema(アネマ) R, Van Montfort(ファン・モンフォール) B, Vooys(フォーイス) A, Van Der Kraats(ファン・デル・クラーツ) S, Van Der Helm(ファン・デル・ヘルム) E, Smits(スミツ) S, Schouten(スハウテン) J, Brouwer(ブラウエル) K, Lagerwerf(ラガーウェルフ) F, Van Berkel(ファン・バークリ) P, Opstelten(オプステルテン) D-J, Logtenberg T, Bout(ブト) A (2003) High-level expression of recombinant IgG in the human cell line PER.C6(ヒト細胞株PER.C6における組換えIgGの高レベル発現). Biotechnol. Prog(バイオテクノロジ・プログレス). 19: 163-168.
(11) Kaufman, RJ. (2000) Overview of vector design for mammalian gene expression(哺乳類遺伝子発現についてのベクタ設計の概説) Mol Biotechnol(モレキュラ・バイオテクノロジ) 16, 151-160.
(12) Kaufman, RJ, 及びSharp, PA. (1982) Construction of a modular dihydrofolate reductase cDNA gene: analysis of signals utilized for efficient expression(モジュラージヒドロ葉酸還元酵素cDNA遺伝子の構築: 有効な発現に有用な信号の分析) Mol Cell Biol(モレキュラ・アンド・セルラ・バイオロジ) 2, 1304-1319.
(13) Kellum R, 及びSchedl P. (1991) A position-effect assay for boundaries of higher order chromosomal domains(より一層高い程度の染色体ドメインの境界についての位置-効果アッセイ). Cell 64: 941-950.
(14) Kim SJ, Kim Ns, Ryu(リュウ) CJ, Hong(ホン) HJ, Lee(リー) GM. 1998. Characterization of chimeric antibody producing CHO cells in the course of dihydrofolate reductase-mediated gene amplification and their stability in the absence of selective pressure(キメラ抗体産生CHO細胞のジヒドロ葉酸還元酵素-媒介遺伝子増幅の過程における特徴付け及び選定圧力の不存在下でのそれらの安定性). Biotechnol Bioeng(バイオテクノロジ・アンド・バイオエンジニアリング) 58: 73-84.
(15) Kozak M. (1986) Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes(点変異が、真核生物リボソームにより翻訳を調節するAUG惹起コドンを隣接する配列を規定する). Cell 44: 283-292.
(16) Kozak M. (1987) An analysis of 5’-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs(699種の脊椎動物伝令RNAsからの5’-非コード配列の分析). Nucleic Acids Res(ヌクレイック・アシッズ・リサーチ). 15: 8125-8148.
(17) Kozak M. (1989) Context effects and inefficient initiation at non-AUG codons in eucaryotic cell-free translation systems(真核生物細胞-フリー翻訳システムにおける非-AUGコドンでの情況効果及び非効率な惹起). Mol Cell Biol. 9: 5073-5080.
(18) Kozak M. (1990) Downstream secondary structure facilitates recognition of initiator codons by eukaryotic ribosomes(下流の二次的構造が真核生物リボソームによる惹起コドンの認識を促進する). Proc Natl Acad Sci USA 87:8301-8305.
(19) Kozak M. (1997) Recognition of AUG and alternative initiator codons is augmented by G in position +4 but is not generally affected by the nucleotides in positions +5 and +6(AUG及び代わりの惹起コドンの認識を位置+4でのGによって増大するが、概して位置+5及び+6でのヌクレオチドによって影響を受けない). EMBO J. 16: 2482-2492.
(20) Kozak M. (2002) Pushing the limits of the scanning mechanism for initiation of translation(翻訳の惹起についてのスキャン機構の制限のプッシング). Gene(ジーン) 299: 1-34.
(21) Kwaks TH, Barnett(バーネット) P, Hemrika(ヘムリカ) W, Siersma(シーアスマ) T, Sewalt(シューワルト) RG, Satijn(サティン) DP, Brons(ブロンス) JF, van Blokland(ファン・ブロックランド) R, Kwakman(クアクマン) P, Kruckeberg(クルッケバーグ) AL, Kelder(ケルダー) A, Otte(オッテ) AP. (2003) Identification of anti-repressor elements that confer high and stable protein production in mammalian cells(高く及び安定なタンパク質生産を哺乳類細胞において与える抗-リプレッサ要素の識別). Nat Biotechnol 21, 553-558. Erratum in(訂正): Nat Biotechnol 21, 822 (2003) .
(22) Phi-Van L, Von Kreis(フォン・クライス) JP, Ostertag(オスターターク) W, 及びStratling(ストラタリング) WH. (1990) The chicken lysozyme 5’ matrix attachment region increases transcription from a heterologous promoter in heterologous cells and dampens position effects on the expression of transfected genes(ニワトリのリゾチーム5’マトリクス付着領域が異種プロモータからの転写を異種細胞において増加させ、及び形質移入した遺伝子の発現上での位置効果を弱める). Mol. Cell. Biol. 10: 2302- 2307.
(23) McBurney, MW, Mai(マイ), T, Yang(ヤン), X, 及びJardine(ジャーディン), K. (2002) Evidence for repeat-induced gene silencing in cultured Mammalian cells: inactivation of tandem repeats of transfected genes(培養哺乳類細胞においてサイレンシングされる反復-誘導遺伝子についての証拠: 形質移入された遺伝子のタンデム反復の不活性化) Exp Cell Res(イクスペリメンタル・セル・リサーチ) 274, 1-8.
(24) Rees, S, Coote(クート), J, Stables(ステーブルズ), J, Goodson(グッドソン), S, Harris(ハリス), S, 及びLee, MG. (1996) Bicistronic vector for the creation of stable mammalian cell lines that predisposes all antibiotic-resistant cells to express recombinant protein(すべての抗生物質-耐性細胞に組換えタンパク質を発現させ易くする安定な哺乳類細胞株の創作のためのバイシストロンのベクタ) Biotechniques(バイオテクニックズ) 20, 102-104, 106, 108-110.
(25) Schorpp, M, Jager(イェーガ), R, Schellander(シェルアンデル), K, Schenkel(シェンケル), J, Wagner(ワーグナ), EF, Weiher(ワイヘル), H, 及びAngel(エンジェル), P. (1996) The human ubiquitin C promoter directs high ubiquitous expression of transgenes in mice(ヒトユビキチンCプロモータがマウスにおける導入遺伝子の高い遍在性発現を指向する) Nucleic Acids Res 24, 1787-8.
(26) Stief A, Winter(ウィンタ) DM, Stratling WH, Sippel(スピッペル) AE (1989) A nuclear DNA attachment element mediates elevated and position-independent gene activity(核DNA付着要素が高められた及び位置-非依存性遺伝子活性を媒介する). Nature(ネイチャ) 341: 343-345.
(27) Van der Vlag, J, den Blaauwen(デン・ブラウベン), JL, Sewalt, RG, van Driel(ドライエル), R, 及びOtte, AP. (2000) Transcriptional repression mediated by polycomb group proteins and other chromatin-associated repressors is selectively blocked by insulators(ポリコーム群タンパク質及び他の染色質-関連リプレッサにより媒介される転写抑止をインスレータによって選択的にブロックする) J Biol Chem(ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ) 275, 697-704.
(28) West AG, Gaszner(ガスナー) M, Felsenfeld G (2002) Insulators: many functions, many mechanisms(インスレータ: 多くの機能、多くの機構). Genes Dev(ジーンズ・アンド・デベロップメント). 16: 271-288.
(29) Whitelaw, E, Sutherland(サザーランド), H, Kearns(カーンズ), M, Morgan(モーガン), H, Weaving(ウィービング), L, 及びGarrick(ガリック), D. (2001) Epigenetic effects on transgene expression(導入遺伝子発現上の後成的効果) Methods Mol Biol(メソッズ・イン・モレキュラ・バイオロジ) 158, 351-68.
(30) Williams S, Mustoe(ムストエ) T, Mulcahy(ムルカイ) T, Griffiths(グリフィス) M, Simpson(シンプスン) D, Antoniou(アントニオウ) M, Ivine(イビン) A, Mountain(マウンテン) A, Crombie(クロンビー) R (2005) CpG-island fragments from the HNRPA2B1/CBX3 genomic locus reduce silencing and enhance transgene expression from the hCMV promoter/enhancer in mammalian cells(HNRPA2B1/CBX3ゲノムの遺伝子座からのCpG-島状断片がサイレンシングを減少させ、及びhCMVプロモータ/エンハンサからの導入遺伝子発現を哺乳類細胞において高める). BMC Biotechnol(BMCバイオテクノロジ). 5:17.
Figure 2008518613
転写単位の概略図である。 STAR67による改善を示す図である。 STAR67による改善を示す図である。 STAR67による改善を示す図である。 STAR67による改善を示す図である。 STAR67による改善を示す図である。 STAR67による改善を示す図である。 STAR67による改善を示す図である。 STAR67による改善を示す図である。 STAR67がエンハンサブロッカであるかを示す図である。 STAR67による改善を示す図である。 本発明に従う選定マーカ遺伝子の使用の図式的な表示である。 本発明に従う多シストロンの転写単位の図式的な表示である。 本発明に従う選定システムの結果を示す図である。 本発明に従う選定システムの結果を示す図である。 本発明に従う多シストロンの転写単位の選定結果の図である。 本発明に従う多シストロンの転写単位の発現安定性の図である。 図17と同様であるが部分的に変えたものを示す図である。 図17と同様であるが部分的に変えたものを示す図である。 本発明に従う多シストロンの転写単位の発現の図である。 図20と同様であるが部分的に変えたものを示す図である。 図20と同様であるが部分的に変えたものを示す図である。 サブ-クローンにおける選定圧力の不存在下の発現の図である。 本発明の具体例の発現レベルのコピ数依存性の図である。 図12と同様であるが部分的に変えたものを示す図である。 ゼオシン耐性遺伝子のコード配列の図である。 ブラストサイジン耐性遺伝子のコード配列の図である。 ピューロマイシン耐性遺伝子のコード配列の図である。 マウスDHFR遺伝子のコード配列の図である。 ハイグロマイシン耐性遺伝子のコード配列の図である。 ネオマイシン耐性遺伝子のコード配列の図である。 グルタミン合成酵素遺伝子のコード配列の図である。 本発明に従う若干の更に修飾した遺伝子の図式的な表示である。 さらに修飾した発現システムの結果の図である。 本発明に従う若干の更に修飾した遺伝子の図式的な表示である。 さらに修飾した発現システムでの結果の図である。 図12と同様であるが部分的に変えたものを示す図である。 ピューロマイシン耐性遺伝子を含む発現構築物での結果の図である。 図12と同様であるが部分的に変えたものを示す図である。 図12と同様であるが部分的に変えたものを示す図である。 本発明に従う発現構築物でのPER.C6細胞の結果の図である。 本発明に従う発現構築物でのPER.C6細胞の結果の図である。 本発明に従う発現構築物での結果の図である。 本発明に従う転写単位を用いる発現コピ数依存の図である。 本発明に従う発現構築物を含むコロニからの抗体発現の図である。 異なるプロモータでの結果の図である。 異なるSTAR要素での結果の図である。 他の染色質制御要素での結果の図である。

Claims (40)

  1. DNA分子であって、i) 真核生物宿主細胞において機能的な選定可能マーカーポリペプチドについて、及びii) 興味あるポリペプチドについてのものをコードする多シストロンの転写ユニットを備え、興味あるポリペプチドが、翻訳惹起配列で選定可能なマーカーポリペプチドのものからは別のものを持つものであり、
    興味あるポリペプチドについてのコード配列が、前記多シストロンの転写ユニットにおける選定可能なマーカーについてのコード配列からは下流にあり、
    及び選定可能なマーカーポリペプチドについてコードする核酸配列が、選定可能なマーカーの翻訳効率を真核生物宿主細胞において減少させる変異を備えることを特徴とする、DNA分子。
  2. 選定可能なマーカーポリペプチドについてコードする核酸配列が選定可能なマーカーの翻訳惹起効率を真核生物宿主細胞において減少させる変異を備える、請求項1のDNA分子。
  3. 選定可能なマーカーの翻訳効率を減少させる変異が選定可能なマーカーポリペプチドの非-最適翻訳開始配列をもたらす、請求項2のDNA分子。
  4. 選定可能なマーカーポリペプチドについてのコード鎖において得られる翻訳開始配列が:
    a) 翻訳惹起についての非-最適情況におけるATG開始コドン;
    b) GTG開始コドン;
    c) TTG開始コドン;
    d) CTG開始コドン;
    e) ATT開始コドン; 及び
    f) ACG開始コドン
    からなる群より選ばれる、請求項3のDNA分子。
  5. 選定可能なマーカーポリペプチドについてのコード鎖において得られる翻訳開始配列がGTG開始コドン又はTTG開始コドンを備える、請求項3のDNA分子。
  6. 選定可能なマーカーポリペプチドを暗号化する配列が、コード鎖次いで選定可能なマーカーポリペプチドの開始コドンに続き興味あるポリペプチドの開始コドンまでにおいてATG配列を持たない、先行請求項の何れか1項のDNA分子。
  7. 任意の配列のATGが、フレームにおいて存在し、及び野生種のマーカーポリペプチドについてコードする配列においてメチオニンについてコードするとき、バリン、スレオニン、イソロイシン又はロイシンについてコードするために変異される、先行請求項の何れか1項のDNA分子。
  8. 選定可能なマーカータンパク質が、選定剤の致死的又は生育-抑制的な効果に対する抵抗性を提供する、先行請求項の何れか1項のDNA分子。
  9. 前記選定剤が抗生物質である、請求項8のDNA分子。
  10. 前記選定剤が、ゼオシン、ピューロマイシン、ブラストサイジン、ハイグロマイシン、ネオマイシン、メトトレキサート、メチオニンスルホキシミン及びカナマイシンからなる群より選ばれる、請求項8又は9のDNA分子。
  11. 選定剤がゼオシンである、請求項10のDNA分子。
  12. 選定剤がブラストサイジンである、請求項10のDNA分子。
  13. 選定剤がピューロマイシンである、請求項10のDNA分子。
  14. 選定可能なマーカータンパク質がネオマイシン耐性遺伝子によって暗号化される、請求項8のDNA分子。
  15. 選定可能なマーカータンパク質がdhfr遺伝子によって暗号化される、請求項8のDNA分子。
  16. 選定可能なマーカーポリペプチドが更に、選定可能なマーカーポリペプチドの活性をその野生-種の対応物と比較して減少させる変異を備える、先行請求項の何れか1項のDNA分子。
  17. 選定可能なマーカーポリペプチドがゼオシン耐性ポリペプチドであり、そこで位置9でのプロリンを異なるアミノ酸に変化させる、請求項16のDNA分子。
  18. 興味あるポリペプチドのコード配列が最適な翻訳開始配列を備える、先行請求項の何れか1項のDNA分子。
  19. 発現カセットであって、先行請求項の何れか1項のDNA分子を備え、前記発現カセットが更に、プロモータで、前記多シストロンの発現ユニットの上流のもので、及び真核生物宿主細胞において多シストロンの発現ユニットの転写を惹起するのに機能的なものを備え、及び前記発現カセットが更に、多シストロンの発現ユニットの下流の転写終結配列を備える、発現カセット。
  20. さらに、少なくとも1の染色質制御要素で、マトリクス又は足場付着領域(MAR/SAR)、インスレータ配列、ユニバーサル染色質開口要素(a universal chromatin opening element)(UCOE)、及び抗-リプレッサ(STAR)配列からなる群より選ばれるものを備える、請求項19の発現カセット。
  21. 前記染色質制御要素が抗-リプレッサ配列である、請求項20の発現カセット。
  22. 前記抗-リプレッサ配列が:
    a) 配列番号1から配列番号66までの任意のもの;
    b) 配列番号1から配列番号66までの任意のものの断片で、前記断片が抗-リプレッサ活性を持つもの;
    c) ヌクレオチド配列においてa)又はb)に対して少なくとも70%同一である配列で、前記配列が抗-リプレッサ活性を持つもの; 及び
    d) a)からc)までの任意のものに対する相補物
    からなる群より選ばれる、請求項21の発現カセット。
  23. 前記発現カセットが:
    a) 配列番号66、
    b) a)の断片で抗-リプレッサ活性を持つもの;
    c) ヌクレオチド配列においてa)又はb)に対して少なくとも70%同一である配列で前記配列が抗-リプレッサ活性を持つもの、
    の1を備え、
    ここで、a)、b)又はc)が多シストロンの遺伝子の転写を駆動するプロモータの上流に位置する、請求項22の発現カセット。
  24. 前記多シストロンの遺伝子が、両側上で少なくとも1の抗-リプレッサ配列によって隣接される、請求項19〜23の何れか1項の発現カセット。
  25. 5’-抗-リプレッサ配列A-抗-リプレッサ配列B-プロモータ-多シストロンの遺伝子で機能的な選定可能マーカータンパク質及びその下流の興味あるポリペプチドを暗号化するもの-転写終結配列-抗-リプレッサ配列C-3’: を備え、
    そこで、抗-リプレッサ配列A及びCが、同じか又は異なってよく、及び:
    a) 配列番号1から配列番号65までの任意のもの;
    b) a)の配列の任意のものの断片で、前記断片が抗-リプレッサ活性を持つもの;
    c) ヌクレオチド配列においてa)又はb)に対して少なくとも70%同一である配列で前記配列が抗-リプレッサ活性を持つものからなる群より選ばれ、
    及びそこで、抗-リプレッサ配列Bが:
    i) 配列番号66、
    ii) i)の断片で抗-リプレッサ活性を持つもの; 及び
    iii) ヌクレオチド配列においてi)又はii)に対して少なくとも70%同一である配列で前記配列が抗-リプレッサ活性を持つものからなる群より選ばれる、請求項24の発現カセット。
  26. 抗-リプレッサ配列A及びCが:
    a) 配列番号7;
    b) a)の配列のものの断片で、前記断片が抗-リプレッサ活性を持つもの; 及び
    c) ヌクレオチド配列においてa)又はb)に対して少なくとも70%同一である配列で前記配列が抗-リプレッサ活性を持つものから選ばれる、請求項25の発現カセット。
  27. 興味あるポリペプチドが多量体タンパク質の部分である、請求項19〜26の何れか1項の発現カセット。
  28. 興味あるポリペプチドが免疫グロブリンの軽鎖又は免疫グロブリンの重鎖である、請求項27の発現カセット。
  29. さらに:
    a) 転写休止(TRAP)配列で、前記プロモータの上流の、及び5’から3’への方向にあるもの; 又は
    b) TRAP配列で、前記転写終結配列の下流の、及び3’から5’への配向にあるもの; 又は
    c) a)及びb)の双方;
    を備え;
    そこで、TRAP配列が、転写ユニット中に配置されるとき、TRAPの3’側上に存在する核酸において、TRAPの5’側上での核酸において観察される転写のレベルに比較するときに減少したレベルの転写をもたらす配列である、請求項19〜28の何れか1項の発現カセット。
  30. 前記TRAPが配列番号142である、請求項29の発現カセット。
  31. 機能的な選定可能マーカーポリペプチドを暗号化する配列を備えるDNA分子であって、前記DNA分子が:
    i) 非-最適翻訳開始配列それに次ぐその他の機能的な選定可能マーカーコード配列を持ち、及び
    ii) 非-最適開始コドンの下流の及び停止コドンまでの選定可能なマーカーポリペプチドを規定する配列のコード鎖において、ATG配列を欠くことを特徴とする、DNA分子。
  32. 宿主細胞であって、先行請求項の何れか1項に従うDNA分子又は発現カセットを備える、宿主細胞。
  33. 真核生物宿主細胞である、請求項32の宿主細胞。
  34. 哺乳類宿主細胞である、請求項33の宿主細胞。
  35. チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である、請求項34の宿主細胞。
  36. 興味あるポリペプチドを発現する宿主細胞を生じさせるための方法であって、次の工程:
    a) 複数の前駆細胞中に請求項1〜18の何れか1項のDNA分子又は請求項19〜30の何れか1項の発現カセットを導入する工程、及び
    b) 生じる細胞を選定可能なマーカーポリペプチドの発現について選定される条件下に培養する工程、及び
    c) 興味あるポリペプチドを産生する少なくとも1の宿主細胞を選定する工程
    を備える、方法。
  37. 興味あるポリペプチドを生産するための方法であって、宿主細胞を培養する工程で、前記宿主細胞が請求項19〜30の何れか1項の発現カセットを備える工程、及び興味あるポリペプチドを発現カセットから発現させる工程を備える、方法。
  38. さらに、興味あるポリペプチドを分離する工程を備える、請求項37の方法。
  39. RNA分子であって、請求項1〜31の何れか1項に従うDNA分子の転写生成物の配列を持つ、RNA分子。
  40. 選定可能なマーカーポリペプチドであって、請求項31のDNA分子によって暗号化され、そこで、選定可能なマーカーポリペプチドが、ゼオシン、ピューロマイシン、ブラストサイジン、ハイグロマイシン、ネオマイシン、メトトレキサート、メチオニンスルホキシミン、及びカナマイシンからなる群より選ばれる選定剤の致死的又は生育-抑制的な効果に対する抵抗性を、
    前記選定可能なマーカーポリペプチドが、第1のアミノ酸(配列番号111)としてメチオニンを持つブラストサイジン耐性タンパク質でないことを条件に、
    提供する、ポリペプチド。
JP2007539588A 2004-11-08 2005-11-07 タンパク質を高レベルで発現する宿主細胞の選定 Expired - Fee Related JP5291341B2 (ja)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US62630104P 2004-11-08 2004-11-08
US60/626,301 2004-11-08
EP04105593.0 2004-11-08
EP04105593 2004-11-08
US69661005P 2005-07-05 2005-07-05
US60/696,610 2005-07-05
PCT/EP2005/055794 WO2006048459A2 (en) 2004-11-08 2005-11-07 Selection of host cells expressing protein at high levels

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2008518613A true JP2008518613A (ja) 2008-06-05
JP5291341B2 JP5291341B2 (ja) 2013-09-18

Family

ID=36090897

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2007539588A Expired - Fee Related JP5291341B2 (ja) 2004-11-08 2005-11-07 タンパク質を高レベルで発現する宿主細胞の選定

Country Status (14)

Country Link
US (1) US20060141577A1 (ja)
EP (1) EP1809750B1 (ja)
JP (1) JP5291341B2 (ja)
KR (1) KR101271884B1 (ja)
AU (1) AU2005300503B2 (ja)
BR (1) BRPI0517380A (ja)
CA (1) CA2581422C (ja)
EA (1) EA010863B1 (ja)
HK (1) HK1101264A1 (ja)
IL (1) IL183035A0 (ja)
MX (1) MX2007004595A (ja)
NO (1) NO344469B1 (ja)
PL (1) PL1809750T3 (ja)
WO (1) WO2006048459A2 (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010074080A1 (ja) * 2008-12-22 2010-07-01 国立大学法人北海道大学 動物細胞を用いて外来遺伝子由来タンパク質を大量に生産するための発現ベクター、およびその利用
JP2015529457A (ja) * 2012-07-31 2015-10-08 バジル・エム・ハンタッシュＢａｓｉｌ Ｍ． ＨＡＮＴＡＳＨ Ｈｌａｇ改変された細胞および方法
WO2019225372A1 (ja) * 2018-05-24 2019-11-28 国立大学法人北海道大学 新規ベクターおよびその利用
WO2020036181A1 (ja) * 2018-08-13 2020-02-20 Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 細胞を単離又は同定する方法及び細胞集団

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5654442A (en) * 1989-11-14 1997-08-05 The Perkin-Elmer Corporation 4,7-dichlorofluorescein dyes as molecular probes
ES2373549T3 (es) * 2002-12-18 2012-02-06 Chromagenics B.V. Método para mejorar la producción de proteínas.
DE60312039T2 (de) 2002-12-20 2007-11-08 Chromagenics B.V. Mittel und methoden zur produktion eines proteins durch chromatin-öffner, die chromatin zugänglicher für transkriptionsfaktoren machen können
US20060172382A1 (en) 2004-11-08 2006-08-03 Chromagenics B.V. Selection of host cells expressing protein at high levels
US8999667B2 (en) 2004-11-08 2015-04-07 Chromagenics B.V. Selection of host cells expressing protein at high levels
US8039230B2 (en) 2004-11-08 2011-10-18 Chromagenics B.V. Selection of host cells expressing protein at high levels
US20060195935A1 (en) * 2004-11-08 2006-08-31 Chromagenics B.V. Selection of host cells expressing protein at high levels
RU2478709C2 (ru) 2005-07-21 2013-04-10 Эбботт Лэборетриз ЭКСПРЕССИЯ МНОЖЕСТВА ГЕНОВ, ВКЛЮЧАЯ sORF-КОНСТРУКЦИИ, И СПОСОБЫ ЭКСПРЕССИРОВАНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНА
EP1987150B1 (en) * 2006-02-21 2011-06-01 ChromaGenics B.V. Selection of host cells expressing protein at high levels
US7968700B2 (en) 2006-03-20 2011-06-28 Chromagenics B.V. Expression augmenting DNA fragments, use thereof, and methods for finding thereof
US20090239235A1 (en) * 2006-09-20 2009-09-24 Demaria Christine Facs- and Reporter Protein-Based System for High Throughput Development of Therapeutic Proteins
US20080274137A1 (en) * 2007-05-02 2008-11-06 Jean Christophe Francis Audonnet DNA plasmids having improved expression and stability
EP2258843B1 (en) 2008-02-27 2016-11-16 National University Corporation Hokkaido University Expression vector for mass production of foreign gene-derived protein using animal cell and use thereof
WO2010026443A1 (en) * 2008-09-08 2010-03-11 Cellectis Meganuclease variants cleaving a dna target sequence from a glutamine synthetase gene and uses thereof
US9284563B2 (en) 2009-06-15 2016-03-15 Cellagenics B.V. Stringent selectable markers
WO2011113841A1 (en) * 2010-03-16 2011-09-22 Robert Steinfeld Eukaryotic vector
CN103038352B (zh) 2010-06-15 2015-12-16 萨拉基尼克有限公司 用于增强基因表达的新型基因间元件
US9650630B2 (en) 2010-09-01 2017-05-16 Cellagenics B.V. Nucleic acid fragments from a ribosomal protein promoter for enhancing gene expression
MY181175A (en) 2014-11-04 2020-12-21 Janssen Vaccines & Prevention Bv Therapeutic hpv16 vaccines
SG10202001501QA (en) 2015-08-20 2020-04-29 Janssen Vaccines & Prevention Bv Therapeutic hpv18 vaccines
CA3001364A1 (en) 2015-10-09 2017-04-13 Genzyme Corporation Improved flare (flow cytometry attenuated reporter expression) technology for rapid bulk sorting
AU2017259259B2 (en) 2016-05-02 2020-11-19 Bavarian Nordic A/S Therapeutic HPV vaccine combinations
MX2019004013A (es) 2016-10-07 2019-08-14 Genzyme Corp Aislamiento temprano de celulas despues de la transfeccion (epic) para la produccion de productos biologicos.
US20220033845A1 (en) 2018-09-24 2022-02-03 Merck Sharp & Dohme Corp. Expression vectors for eukaryotic expression systems
KR20230109683A (ko) 2020-11-19 2023-07-20 젠자임 코포레이션 유세포 분석 감쇠 리포터 발현(플레어) 다중 리포터 시스템 및 이의 사용 방법

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05501054A (ja) * 1989-07-24 1993-03-04 セラジェン・インコーポレーテッド 内部翻訳開始の防止
US5256568A (en) * 1990-02-12 1993-10-26 Regeneron Phamaceuticals, Inc. Vectors and transformed most cells for recombinant protein production with reduced expression of selectable markers
US5627033A (en) * 1995-03-28 1997-05-06 Research & Diagnostics Systems, Inc. Mammalian expression vectors
WO2004055215A1 (en) * 2002-12-18 2004-07-01 Chromagenics B.V. A method for improving protein production
JP2004533262A (ja) * 2001-07-04 2004-11-04 クロマジェニックス ビー．ブイ． 遺伝子転写を調節する特性を含むｄｎａ配列及びそのようなｄｎａ配列を検出し且つ使用するための方法

Family Cites Families (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3700633A (en) * 1971-05-05 1972-10-24 Shell Oil Co Selectively hydrogenated block copolymers
US3821148A (en) * 1973-09-28 1974-06-28 Exxon Research Engineering Co Plasticized thermoplastic block copolymers
US4122134A (en) * 1974-02-13 1978-10-24 Sumitomo Chemical Company, Limited Method for producing transparent block copolymer resin
US3965830A (en) * 1974-12-05 1976-06-29 Usm Corporation Assembly for automatic bar tacking
US4267284A (en) * 1977-01-07 1981-05-12 Phillips Petroleum Company Tough, transparent articles from styrene polymers blended with certain block-random copolymers
US4965196A (en) 1983-01-19 1990-10-23 Genentech, Inc. Polycistronic expression vector construction
FR2569723B1 (fr) * 1984-08-31 1986-09-19 Centre Nat Rech Scient Application des antibiotiques de la famille des phleomycines a titre d'agent de selection dans le domaine du genie genetique
US4835200A (en) * 1986-12-19 1989-05-30 Shell Oil Company Color stable hot melt adhesive
US4882384A (en) * 1988-02-01 1989-11-21 Shell Oil Company Modified block copolymers
CA2104598C (en) 1991-03-29 2003-01-07 Justus B. Cohen Methods for selection of recombinant host cells expressing high levels of a desired protein
US6319707B1 (en) * 1991-08-12 2001-11-20 Fred Hutchinson Cancer Research Center Board Regents Of The University Of Washington Cap-independent multicistronic retroviral vectors
JP2686025B2 (ja) * 1992-08-25 1997-12-08 理化学研究所 ブラストサイジンｓデアミナーゼ遺伝子
US5648267A (en) 1992-11-13 1997-07-15 Idec Pharmaceuticals Corporation Impaired dominant selectable marker sequence and intronic insertion strategies for enhancement of expression of gene product and expression vector systems comprising same
DK0669986T3 (da) 1992-11-13 2003-07-28 Idec Pharma Corp Fuldstændigt inaktiverede kozac-sekvenser til ekspression i pattedyr
WO1994023046A1 (en) 1993-04-07 1994-10-13 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Dna sequence which acts as a chromatin insulator element to protect expressed genes from cis-acting regulatory sequences in mammalian cells
US5610053A (en) * 1993-04-07 1997-03-11 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services DNA sequence which acts as a chromatin insulator element to protect expressed genes from cis-acting regulatory sequences in mammalian cells
US5561053A (en) 1994-08-05 1996-10-01 Genentech, Inc. Method for selecting high-expressing host cells
US5994128A (en) 1995-06-15 1999-11-30 Introgene B.V. Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy
DE19523585A1 (de) * 1995-06-29 1997-01-02 Basf Ag Schlagzähe Formmasse aus Styrolpolymeren
US5773695A (en) * 1996-01-26 1998-06-30 North Carolina State University Plant nuclear scaffold attachment region and method for increasing gene expression in transgenic cells
DE19621688A1 (de) * 1996-05-30 1997-12-04 Basf Ag Transparente, nicht-blockende Folie
US6107477A (en) 1996-09-26 2000-08-22 Aurora Biosciences Corporation Non-optimal Kozaks sequences
CA2283253A1 (en) 1997-03-04 1998-09-11 Baxter International Inc. Adenovirus e1-complementing cell lines
US5888809A (en) * 1997-05-01 1999-03-30 Icos Corporation Hamster EF-1α transcriptional regulatory DNA
DE19832245A1 (de) 1998-07-17 2000-01-20 Heidelberger Druckmasch Ag Verfahren zum Bedienen von Geräten in der Reproduktionstechnik
WO2000005393A2 (en) 1998-07-21 2000-02-03 Cobra Therapeutics Limited A polynucleotide comprising a ubiquitous chromatin opening element (ucoe)
ES2375266T3 (es) 1998-07-21 2012-02-28 Millipore Corporation Un polinucleótido que comprende un elemento de apertura de cromatina ubicuo (ucoe).
EP1104490B8 (en) * 1998-08-14 2008-02-13 Chromagenics B.V. Method of detecting a dna sequence, a dna sequence, a method of making a dna construct and the use thereof
US6800457B2 (en) * 1998-09-22 2004-10-05 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors containing hot spot for increased recombinant protein expression in transfected cells
US6521419B1 (en) * 1998-09-22 2003-02-18 Kanakaraju Koduri Expression vectors containing hot spot for increased recombinant protein expression in transfected cells
AU1128400A (en) * 1998-10-22 2000-05-08 Medical College Of Georgia Institute, Inc. Long terminal repeat, enhancer, and insulator sequences for use in recombinant vectors
WO2000063403A2 (en) 1999-04-15 2000-10-26 Crucell Holland B.V. Recombinant protein production in a human cell using sequences encoding adenovirus e1 protein
US6391981B1 (en) * 1999-04-23 2002-05-21 Kraton Polymers Us Llc Increased throughput in the manufacture of anionic polymers by reduction in polymer cement viscosity through the addition of metal alkyls
JP2003504016A (ja) 1999-06-30 2003-02-04 アメリカ合衆国 遺伝子発現の制御のための特異的エンハンサー遮断活性を有する絶縁体としてのｄｎａ結合タンパク質および配列
DE60031419T2 (de) * 1999-08-25 2007-09-27 Immunex Corp., Thousand Oaks Zusammensetzungen und verfahren für verbesserte zellkultur
EP2278022A3 (en) 1999-11-01 2011-05-18 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Expression vectors, transfection systems, and method of use thereof
US6558948B1 (en) 1999-11-23 2003-05-06 Stefan Kochanek Permanent amniocytic cell line, its production and use for the production of gene transfer vectors
US6586205B1 (en) * 2000-02-11 2003-07-01 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 43239 a novel GPCR-like molecule and uses thereof
AU2001238178A1 (en) * 2000-02-11 2001-08-20 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Seven-transmembrane proteins/g-protein coupled receptors
EP2365076A1 (en) 2000-09-20 2011-09-14 Millipore Corporation Artificial ubiquitous chromatin opening elements (ucoe)
WO2002074969A2 (en) 2001-01-26 2002-09-26 University Of Lausanne Matrix attachment regions and methods for use thereof
US20020155540A1 (en) * 2001-02-14 2002-10-24 Malla Padidam Method to reduce transcriptional interference between tandem genes
FR2821855B1 (fr) * 2001-03-09 2004-04-02 Cayla Genes synthetiques et plasmides bacteriens depourvus de cpg
TWI377253B (en) * 2001-04-16 2012-11-21 Martek Biosciences Corp Product and process for transformation of thraustochytriales microorganisms
KR20040032105A (ko) 2001-06-04 2004-04-14 엠엘 래보러토리즈 피엘씨 재조합 단백질의 조성물 및 재조합 단백질의 고수준대규모 생산방법
US20040038304A1 (en) * 2002-03-28 2004-02-26 Gala Design, Inc. Antibody libraries
AU2003238719B2 (en) * 2002-06-14 2008-02-21 Chromagenics B.V. A method for simultaneous production of multiple proteins, vectors and cells for use therein
EP1513936A2 (en) * 2002-06-14 2005-03-16 Chromagenics B.V. Use of repression blocking sequences in methods for enhancing gene expression
EP1554389A2 (en) 2002-09-20 2005-07-20 Novo Nordisk A/S Method for making recombinant proteins
DE60312039T2 (de) * 2002-12-20 2007-11-08 Chromagenics B.V. Mittel und methoden zur produktion eines proteins durch chromatin-öffner, die chromatin zugänglicher für transkriptionsfaktoren machen können
SG147468A1 (en) 2003-10-24 2008-11-28 Selexis Sa High efficiency gene transfer and expression in mammalian cells by a multiple transfection procedure of matrix attachment region sequences
EA011747B1 (ru) * 2004-07-08 2009-06-30 Хромагеникс Б.В. Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты, обладающая антирепрессорной активностью, и способы ее применения
US8039230B2 (en) * 2004-11-08 2011-10-18 Chromagenics B.V. Selection of host cells expressing protein at high levels
US8999667B2 (en) * 2004-11-08 2015-04-07 Chromagenics B.V. Selection of host cells expressing protein at high levels
US20100136616A1 (en) * 2004-11-08 2010-06-03 Chromagenics B.V. Selection of Host Cells Expressing Protein at High Levels
US20060172382A1 (en) * 2004-11-08 2006-08-03 Chromagenics B.V. Selection of host cells expressing protein at high levels
US20060195935A1 (en) * 2004-11-08 2006-08-31 Chromagenics B.V. Selection of host cells expressing protein at high levels
US7968700B2 (en) * 2006-03-20 2011-06-28 Chromagenics B.V. Expression augmenting DNA fragments, use thereof, and methods for finding thereof

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05501054A (ja) * 1989-07-24 1993-03-04 セラジェン・インコーポレーテッド 内部翻訳開始の防止
US5256568A (en) * 1990-02-12 1993-10-26 Regeneron Phamaceuticals, Inc. Vectors and transformed most cells for recombinant protein production with reduced expression of selectable markers
US5627033A (en) * 1995-03-28 1997-05-06 Research & Diagnostics Systems, Inc. Mammalian expression vectors
JP2004533262A (ja) * 2001-07-04 2004-11-04 クロマジェニックス ビー．ブイ． 遺伝子転写を調節する特性を含むｄｎａ配列及びそのようなｄｎａ配列を検出し且つ使用するための方法
WO2004055215A1 (en) * 2002-12-18 2004-07-01 Chromagenics B.V. A method for improving protein production

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6011026782; Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｐｒｏｇ． Ｖｏｌ．　１６, 2000, ｐ．　７２４-７３５ *
JPN6011026784; Ｇｅｎｅ Ｖｏｌ．　１３３, 1993, ｐ．　２２３-２２５ *
JPN6011026787; Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ． Ｖｏｌ．　２６９，　Ｎｏ．　６, 1994, ｐ．　４４９７-４５０５ *
JPN6011026791; Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ． Ｖｏｌ．　７１，　Ｎｏ．　１０, 1997, ｐ．　７４４８-７４６０ *
JPN6011026793; Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ． Ｖｏｌ．　２７８，　Ｎｏ．　２０, 2003, ｐ．　１８０３７-１８０４４ *
JPN6011026795; Ｎａｔ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｖｏｌ．　２１, 2003, ｐ．　５５３-５５８ *
JPN6012029167; Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｖｏｌ．　２１, 1996, ｐ．　３９８-４０２ *
JPN6012029169; Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ． Ｖｏｌ．　９，　Ｎｏ．　１１, 1989, ｐ．　５０７３-５０８０ *
JPN6012029171; Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ． Ｖｏｌ．　６８，　Ｎｏ．　１, 1994, ｐ．　１７０-１７６ *

Cited By (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010074080A1 (ja) * 2008-12-22 2010-07-01 国立大学法人北海道大学 動物細胞を用いて外来遺伝子由来タンパク質を大量に生産するための発現ベクター、およびその利用
AU2009331326B2 (en) * 2008-12-22 2014-09-18 Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. Expression vector for producing protein derived from foreign gene in large quantity using animal cells, and use thereof
US9096878B2 (en) 2008-12-22 2015-08-04 National University Corporation Hokkaido University Expression vector for producing protein derived from foreign gene in large quantity using animal cells, and use thereof
JP7294838B2 (ja) 2012-07-31 2023-06-20 エイジエックス・セラピューティクス・インコーポレイテッド Ｈｌａ ｇ改変された細胞および方法
JP2018088929A (ja) * 2012-07-31 2018-06-14 バジル・エム・ハンタッシュＢａｓｉｌ Ｍ． ＨＡＮＴＡＳＨ Ｈｌａ ｇ改変された細胞および方法
JP2019088334A (ja) * 2012-07-31 2019-06-13 バジル・エム・ハンタッシュＢａｓｉｌ Ｍ． ＨＡＮＴＡＳＨ Ｈｌａ ｇ改変された細胞および方法
JP2021106601A (ja) * 2012-07-31 2021-07-29 エイジエックス・セラピューティクス・インコーポレイテッドＡｇｅＸ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． Ｈｌａ ｇ改変された細胞および方法
JP2015529457A (ja) * 2012-07-31 2015-10-08 バジル・エム・ハンタッシュＢａｓｉｌ Ｍ． ＨＡＮＴＡＳＨ Ｈｌａｇ改変された細胞および方法
JP7379410B2 (ja) 2012-07-31 2023-11-14 エイジエックス・セラピューティクス・インコーポレイテッド Ｈｌａ ｇ改変された細胞および方法
WO2019225372A1 (ja) * 2018-05-24 2019-11-28 国立大学法人北海道大学 新規ベクターおよびその利用
JPWO2019225372A1 (ja) * 2018-05-24 2021-06-10 国立大学法人北海道大学 新規ベクターおよびその利用
JP7264353B2 (ja) 2018-05-24 2023-04-25 国立大学法人北海道大学 新規ベクターおよびその利用
US11781146B2 (en) 2018-05-24 2023-10-10 National University Corporation Hokkaido University Vector including a translation-impaired dihydrofolate reductase gene cassette and ubiquitously acting chromatin opening element
WO2020036181A1 (ja) * 2018-08-13 2020-02-20 Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 細胞を単離又は同定する方法及び細胞集団
JPWO2020036181A1 (ja) * 2018-08-13 2021-08-10 Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 細胞を単離又は同定する方法及び細胞集団
JP7402453B2 (ja) 2018-08-13 2023-12-21 Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 細胞を単離又は同定する方法及び細胞集団

Also Published As

Publication number Publication date
WO2006048459A2 (en) 2006-05-11
EA010863B1 (ru) 2008-12-30
EP1809750A2 (en) 2007-07-25
MX2007004595A (es) 2007-08-15
IL183035A0 (en) 2007-09-20
AU2005300503A1 (en) 2006-05-11
NO20072845L (no) 2007-06-05
CA2581422A1 (en) 2006-05-11
BRPI0517380A (pt) 2008-10-07
NO344469B1 (no) 2019-12-30
HK1101264A1 (en) 2007-10-12
JP5291341B2 (ja) 2013-09-18
PL1809750T3 (pl) 2012-08-31
CA2581422C (en) 2012-05-22
KR20070090151A (ko) 2007-09-05
US20060141577A1 (en) 2006-06-29
KR101271884B1 (ko) 2013-06-05
AU2005300503B2 (en) 2010-12-16
EP1809750B1 (en) 2012-03-21
WO2006048459A3 (en) 2006-08-10
EA200701023A1 (ru) 2007-10-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5291341B2 (ja) タンパク質を高レベルで発現する宿主細胞の選定
US8771984B2 (en) Selection of host cells expressing protein at high levels
US9228004B2 (en) Selection of host cells expressing protein at high levels
CA2637271C (en) Selection of host cells expressing protein at high levels
US7825232B2 (en) Sequence for improving expression of nucleic acid
US8999667B2 (en) Selection of host cells expressing protein at high levels
EP1996705B1 (en) Expression augmenting dna fragments, use thereof, and methods for finding thereof
US20100136616A1 (en) Selection of Host Cells Expressing Protein at High Levels
EP1572994B1 (en) Means and methods for producing a protein through chromatin openers that are capable of rendering chromatin more accessible to transcription factors
AU2007217431B2 (en) Selection of host cells expressing protein at high levels
EP1763586B1 (en) Novel sequence for improving expression of nucleic acid

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20080902

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20110531

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20110815

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20110822

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20110930

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20120605

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20130604

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20130607

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 5291341

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees