NO344469B1

NO344469B1 - Seksjon av vertsceller som uttrykker høye nivåer av proteiner

Info

Publication number: NO344469B1
Application number: NO20072845A
Authority: NO
Inventors: Arie Pieter Otte; Theodorus Hendrikus Jacobus Kwaks; Richard George Antonius Bernardus Sewalt; Henricus Johannes Maria Van Blokland
Original assignee: Chromagenics Bv
Priority date: 2004-11-08
Filing date: 2007-06-05
Publication date: 2019-12-30
Also published as: KR20070090151A; JP2008518613A; WO2006048459A3; CA2581422C; EP1809750B1; BRPI0517380A; MX2007004595A; EA010863B1; WO2006048459A2; CA2581422A1; IL183035A0; HK1101264A1; JP5291341B2; EP1809750A2; PL1809750T3; AU2005300503B2; NO20072845L; EA200701023A1; KR101271884B1; AU2005300503A1

Description

Oppfinnelsen angår feltet molekylærbiologi og bioteknologi. Mer sepesifikt, relaterer den foreliggende oppfinnelsen seg til midler og metoder for å forbedre utvelgelsen av vertsceller som uttrykker proteiner i store mengder med DNA-molekyler omfattende en multisistronisk transkripsjonsenhet som koder for: i) et selekterbart markørpolypeptid som er funksjonelt i en eukaryot vertscelle, og for ii) et polypeptid av interesse, der polypeptidet av interesse har en translasjonsinitieringssekvens som er separat fra den for det selekterbare markørpolypeptidet, hvor DNA-molekylet har de egenskaper som er angitt i krav 1.

Proteiner kan bli produsert i forskjellige vertsceller og omfatter en rekke applikasjoner innen biologi og bioteknologi, f.eks. som biofarmasøytiske preparater. Eukaryote og i særdeleshet mammalske vertsceller er foretrukket for et slikt formål å kunne uttrykke mange proteiner, f.eks. når slike proteiner har visse posttranslasjonelle modifikasjoner, slik som glykosylering. Metoder for slik produksjon er godt etablerte og omfatter generelt ekspresjonen i en vertscelle av en nukleinsyre (også referert til som et ”transgen”) som koder for proteinet av interesse. Generelt kan det sies at transgenet blir, sammen med en selektabel markør, introdusert inn i vertsceller, og vertscellene blir så selektert for ekspresjon av det selektable markørgenet, og en eller flere kloner som uttrykker proteinet av interesse i store mengder blir identifisert og anvendt for ekspresjon av proteinet av interesse.

Et problem som er assosiert med ekspresjonen av transgenet, er at det er uforutsigbart, noe som stammer fra sannsynligheten for at transgenet vil bli inaktivert på grunn av ”silencing” (McBurney et al., 2002), og derfor må mange kloner bli testet for høy ekspresjon av transgenet.

Metoder for å selektere rekombinante vertsceller som uttrykker relativt høye mengder av ønskede proteiner, er kjent.

En metode beskriver bruken av selektable markørproteiner med mutasjoner i deres kodende sekvens som minker, men ikke ødelegger funksjonen til markøren (f.eks. WO 01/32901). Rasjonalet er at høye nivåer av ekspresjonen til den muterte markøren er påkrevd når betingelser for seleksjon blir anvendt, og at man derfor også oppnår en høy ekspresjon av markøren samtidig som man selekterer for vertsceller som samtidig skal uttrykke genet av interesse på høyt nivå.

En annen metode anvender et markørgen for seleksjon som er under kontroll av en promotorsekvens som er blitt mutert slik at promotoren oppviser et aktivitetsnivå vesentlig lavere enn sin korresponderende villtype (US patent 5,627,033).

En annen metode beskriver bruken av blokkerte dominante selektable markørsekvenser, slike som neomycin fosfotransferase med en blokkert konsensus Kozak-sekvens, for å senke antallet av kolonier som skal screenes og for å øke ekspresjonsnivået til genet av interesse, som er linked til den dominante selektable markøren (US patenter 5,648,267 and 5,733,779). I foretrukne varianter av oppfinnelsen som er beskrevet i teksten, blir genet av interesse plassert i et (kunstig) intron i den dominante selektable markøren. Genet av interesse og den den dominante selektable markøren befinner seg i forskjellige kassetter for transkripsjon og hver av dem inneholder sin egen eukaryote promotor i denne metoden (US patenter 5,648,267 og 5,733,779).

En annen metode anvender seg av prinsippet om et selektabelt markørgen som inneholder et intron som ikke naturlig opptrer i det selektable genet, hvori intronet er kapabelt til å bli spleiset i en vertscelle for å skaffe til veie mRNA som koder for et selektabelt protein hvori intronet i det selektable genet reduserer nivået til det selektable proteinet produsert fra det selektable genet i vertscellen (EP 0724639 B1).

I nok en annen metode benytter man seg av DNA-konstrukter som omfatter et selektabelt gen som er posisjonert inne i et intron definert ved hjelp av et 5’-spleisedonorsete som består av en effektiv spleisedonorsekvens på en slik måte at effektiviteten av spleisingen av det fremkomne mRNA-molekylet, som inneholder nevnte spleisedonorsete, ligger på mellom 80-99%, og et 3’-spleiseakseptorsete og et produktgen som koder for et produkt av interesse nedstrøms for det 3’-merkede spleiseakseptorsetet, og der det selektable genet og produktgenet blir kontrollert av den samme regionen for transkripsjonell regulering (US patent 5,561,053).

I visse metoder benyttes konstrukter av polysistroniske ekspresjonsvektorer. En tidlig rapport over bruken av dette prinsippet beskriver en polysistronisk ekspresjonsvektor som inneholder sekvenser som koder for både det ønskede proteinet og et selektabelt protein, hvis kodende sekvenser blir styrt av den samme promotoren og er separert ved hjelp av kodoner for translasjonsstopp og startsignal (US patent 4,965,196). I foretrukne varianter av den foreliggende oppfinnelsen i US patent 4,965,196, er den selektable markøren det amplifiserbare DHFR-genet. I en særskilt foretrukket variant av systemet som er beskrevet i US patent 4,965,196, befinner sekvensen som koder for den selektable markøren seg nedstrøms for den som koder for det ønskede polypeptidet, slik at prosedyrer som er designet for å selektere for cellene som er transformert ved hjelp av den selektable markøren også vil selektere for en spsielt høy produksjon av det ønskede proteinet.

I WO 03/106684 A2 og WO 2004/056986 A2 er det beskrevet vektorer for seleksjon av vertsceller som uttrykker polypeptider på høyt nivå. Slike vektorer omfatter en multisistronisk transkripsjonsenhet som koder for minst et selekterbart markørpolypeptid i en eukaryot vertscelle og for et polypeptid av interesse, samt et internt sete for å øke ekspresjonen av polypeptidet av interesse. Her hemmes en effektiv translaswjon av seleksjonsmarkøren, men samtidig må en tilstrekkelig mengde translateres for å kunne velge de vertscellene som uttrykker høy aktivitet av polypeptidet av interesse.

I videre forbedringer av den foreliggende oppfinnelsen, basert på konseptet om multisistroniske ekspresjonsvektorer, har bisistroniske vektorer blitt beskrevet for rask og effektiv dannels av stabile mammalske cellelinjer som uttrykket rekombinant protein. Disse vektorene inneholder et internt sete for ribosomer (IRES) mellom den oppstrømsbeliggende kodende sekvensen for proteinet av interesse og den nedstrøms beliggende kodende sekvensne for den selektable markøren (Rees et al., 1996). Slike vektorer er kommersielt tilgjengelige, som f.eks. pI-RES1-vektorene fra Clontech (CLONTECHniques, oktober 1996). Ved å bruke slike vektorer for introduksjon inn i vertsceller, vil seleksjon av tilstrekkelig ekspresjon av det nedstrøms plasserte markørproteinet automatisk selektere for høye nivåer av transkripsjon av det multisistroniske mRNA-molekylet, og på den måten vil man bli forespeilet en kraftig økt sannsynlighet for en høy ekspresjon av proteinet av interesse, ved å avbenytte slike vektorer.

Fortrinnsvis, i slike metoder, vil den avbenyttede IRES være en IRES som gir et relativt lavt nivå for translasjon av det selektable markørgenet, for videre å kunne forbedre sjansene til å selektere for vertsceller med et høyt ekspresjonsnivå av proteinet av interesse ved å selektere for ekspresjon av det selektable markørproteinet (se f.eks. den internasjonale publikasjonen WO 03/106684 og WO 2004/056986).

Den foreliggende oppfinnelsen har som mål å skaffe til veie forbedrede midler og metoder for seleksjon av vertsceller som uttrykker høye nivåer av proteinet av interesse.

Oppsummering av oppfinnelen

Den foreliggende oppfinnelsen benytter seg av et nytt og unikt konsept for seleksjon av vertsceller som uttrykker høye nivåer av polypeptider av interesse, hvori konseptet som det er referert til i teksten kalles ”resiprok uavhengig translasjon”. Det er unikt hva gjelder tidligere kjente problemstillinger i fagfeltet, i det at et ekstra nivå av regulering er anvendt for å fininnstille mengden av translaterte produkter fra et multisistronisk transkript, hvorved nivået for translasjon til et selektabelt markørpolypeptid blir senket, for på den måten å øke nivået av translasjon av det ønskede polypeptidet som er kodet for på den samme enheten av det multisistroniske transkriptet, dvs. at nivået for ekspresjon av polypeptidet av interesse er direkte og mer eller mindre resiprokt avhengig av ekspresjonsnivået til det polypeptidet som tjener som den selektable markøren (se Figur 13 for en skjematisk oversikt). I kontrast til dette involverer tilnærminger som anvender IRES posisjonert mellom den kodende sekvensen for polypeptidet av interesse og det selektable markørpolypeptidet (f.eks. Rees et al., 1996), uavhengig translasjon av begge polypeptidene, slik at det i de tilnærmingene ikke er noen direkte effekt av effektiviteten for translasjon av det selektable markørpolypeptidet på translasjonen av sekvensen som koder for polypeptidet av interesse.

I et aspekt av den foreliggende oppfinnelsen skaffes til veie et DNA-molekyl som omfatter en multisistronisk transkripsjonsenhet som koder for i) et selektabelt markørpolypeptid som er funksjonelt uttrykt i en eukaryot vertscelle og for ii) et polypeptid av interesse, hvorav polypeptidet av interesse oppviser en sekvens for initiering av translasjon (og startkodon) separert fra tilsvarende for det selektable markørpolypeptidet, karakterisert ved at den kodende sekvensen for polypeptidet av interesse befinner seg nedstrøms for den kodende sekvensen for den selektable markøren i nevnte multisistroniske enhet for transkripsjon, og i at nukleinsyresekvensen som koder for det selektable markørpolypeptidet består av en mutasjon som senker effektiviteten for translasjon til den selektable markøren i en eukaryot vertscelle hvor DNA-molekylet har de særtrekk som fremgår av krav 1. Fortrinnsvis er den initielle effektiviteten for translasjon redusert. I en foretrukket variant av oppfinnelsen blir den reduserte initielle translasjonseffektiviteten forår saket av at man har en ikke-optimal startsekvens for translasjon av det selektable markørpolypeptidet.

I foretrukne implementeringer av den foreliggende oppfinnelsen, består startsekvensen for translasjon i den kodende tråden for det selektable markørpolypeptidet av en ATG-sekvens som definerer et startkodon, og nevnte ATG-sekvens befinner seg i en ikke-optimal kontekst for initiering av translasjon. Dette resulterer i en redusert bruk av denne ATG-tripletten som startkodon, når man sammenligner med et ATG-startkodon i en optimal sammenheng.

I en mer foretrukket variant av den foreliggende oppfinnelsen består startsekvensen for translasjon i den kodende tråden for det selektable markørpeptidet av et startkodon som er forskjellig fra et ATG-startkodon, slike som ett med sekvensene GTG, TTG, CTG, ATT, eller ACG, hvorav de første to av disse utgjør de mest foretrukne. Slike ikke-ATG-startkodoner er fortrinnsvis flankert av sekvenser som sørger for relativt god gjenkjennelse av de ikke-ATG-sekvensene som startkodoner, slik at minst noen ribosomer starter translasjon fra disse startkodonene, dvs. at sekvensene for start av translasjon fortrinnsvis består av sekvensen ACC[ikke-ATG-startkodon]G eller GCC[ikke-ATG-startkodon]G.

I foretrukne varianter av oppfinnelsen har sekvensen som koder for det selektable markørpolypeptidet ingen ATG-sekvens i den kodende tråden etterfulgt av sekvensen som koder for startkodonet til det selektable markørpolypeptidet opp til sekvensen som koder for stoppkodonet for dette, og ikke i noen sekvenser i den samme tråden mellom nevnte stoppkodon og startkodonet for polypeptidet av interesse (der startkodonet fortrinnsvis er definert som en ATG-triplett i den samme kodende tråden).

I visse implementeringer av oppfinnelsen har enhver ATG-sekvens som er til stede i rammen som koder for metionin i sekvensen som koder for det villtyperelaterte selektable markørpolypeptidet, blitt mutert til å kode for valin, treonin, isoleucin eller leucin.

I foretrukne utgaver av oppfinnelsen sørger det selektable markørproteinet for resistens mot dødelige og/eller veksthemmende effeketer av et selekterende agens, slik som et antibiotikum.

Fortrinnsvis består den kodende sekvensen til polypeptidet av interesse av en optimal sekvens for translasjonsstart.

Oppfinnelsen skaffer videre til veie ekspresjonskassetter som består av et DNA-molekyl, i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelsen som angitt ovenfor, der ekspresjonskassettene videre består av en promotor oppstrøms for den multisistroniske ekspresjonsenheten og som er funksjonell i en eukaryot vertscelle for å initiere transkeipsjon av den multisistroniske ekspresjonsenheten, og der nevnte ekspresjonskassetter videre omfatter en sekvens for terminering av transkripsjon beliggende nedstrøms for den multisistroniske ekspresjonsenheten.

I foretrukne varianter av oppfinnelsen består slike ekspresjonskassetter videre av minst et kromatinkontrollerende element valgt fra gruppen som består av en matriks- eller stillastilknyttet region (MAR/SAR), en isolasjonssekvens, et allestedsnærværende element for åpning av kromatin (UCOE) og en anti-repressorsekvens. Anti-repressorsekvenser er mest foretrukket i denne sammenhengen, og i foretrukne utgaver av oppfinnelsen er nevnte anti-repressorsekvenser selektert fra gruppen som består av: a) en hvilken som helst av SEQ. ID. NO. 1 gjennom SEQ. ID. NO. 66; b) fragmenter av en hvilken som helst av SEQ. ID. NO. 1 gjennom SEQ. ID. NO. 66, hvori nevnte fragmenter oppviser anti-repressoraktivitet; c) sekvenser som er minst 70% identiske i nukleotidsekvens med a) eller b), hvori nevnte sekvenser oppviser anti-repressoraktivitet; og d) komplementet til en hvilken som helst av a) til c). I visse foretrukne utgaver av oppfinnelsen er nevnte anti-repressorsekvenser valgt fra gruppen som består av: STAR67 (SEQ. ID. NO. 66), STAR7 (SEQ. ID. NO. 7), STAR9 (SEQ. ID. NO. 9), STAR17 (SEQ. ID. NO. 17), STAR27 (SEQ. ID. NO. 27), STAR29 (SEQ. ID. NO. 29), STAR43 (SEQ. ID. NO. 43), STAR44 (SEQ. ID. NO. 44), STAR45 (SEQ. ID. NO. 45), STAR47 (SEQ. ID. NO. 47), STAR61 (SEQ. ID. NO. 61), og funksjonelle fragmenter eller derivater av disse STAR-sekvensene. I visse implementeringer av oppfinnelsen består ekspresjonskassetten av STAR67 eller et funksjonelt fragment av denne, posisjonert oppstrøms for promotoren som driver ekpresjonen av det multisistroniske genet. I visse varianter er det multisistroniske genet flankert på begge sider av minst en anti-repressorsekvens. I visse utgaver av oppfinnelsen er det fremskaffet ekspresjonskassetter, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, der kassettene består av følgende, i rekkefølgen 5’- to 3’-merket ende: anti-repressorsekvens A – anti-repressorsekvens B – [promotor – multisistronisk transkripsjonsenhet i overensstemmelse med oppfinnelsen (som koder for det funksjonelle se lektable markørproteinet og nedstrøms for dette, polypeptidet av interesse) – sekvenser for terminering av transkripsjon] – anti-repressorsekvens C, hvori A, B og C kan være like eller forskjellige.

I visse utgaver av oppfinnelsen er polypeptidet av interesse en del av det multisistroniske proteinet, f.eks. en tung eller lett kjede fra et immunoglobulin.

Oppfinnelsen skaffer også til veie DNA-molekyler som består av sekvenser som koder for et funksjonelt markørpolypeptid, karakterisert ved at slike DNA-molekyler omfatter en mutasjon som reduserer effektiviteten av translasjonen til det funksjonelle selektable markørpolypeptidet i en eukaryot vertscelle. Fortrinnsvis, har et slikt DNA-molekyl: i) en ikke-optimal startsekvens etterfulgt av en på annen måte funksjonell selektabel kodende sekvens for markøren, og ii) mangler ATG-sekvenser i den kodende tråden til sekvensen som definerer det selektable markørpolypeptidet nedstrøms beliggende for det ikke-optimale starkodonet.

Oppfinnelsen skaffer også til veie vertsceller som består av DNA-molekyler, i samsvar med den foreliggende oppfinnelsen.

Oppfinnelsen fremskaffer videre metoder for å generere vertsceller som uttrykker et polypeptid av interesse, der metodene består av trinn, slike som: introduksjon inn i en majoritet av forløpervertsceller av en ekspresjonskassett, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, dyrking av cellen under betingelser som selekterer for det selektable markørpolypeptidet, og seleksjon av minst en vertscelle som produserer polypetidet av interesse.

I et videre aspekt fremskaffer oppfinnelsen metoder for å produsere et polypeptid av interesse, der metodene omfatter dyrking av en vertscelle, hvorav nevnte vertscelle består av en ekspresjonskassett, i henhold til oppfinnelsen, og ekspresjon av polypeptidet av interesse fra ekspresjonskassetten. I foretrukne implementeringer av oppfinnelsen blir polypeptidet av interesse videre isolert fra vertscellen og/eller fra vertcellens dyrkningsmedium.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

I et aspekt, skaffer den foreliggende oppfinnelsen til veie et DNA-molekyl som består av en enhet for multisistronisk transkripsjon, som koder for i) et selektabelt markørpolypeptid som er funksjonelt i en eukaryot vertscelle, og for ii) et polypeptid av interesse, der polypeptidet av interesse besitter en sekvens for initiering av translasjon, som er separat fra den for det selektable markørpolypeptidet, karakterisert ved at den kodende sekvensen for polypeptidet av interesse befinner seg nedstrøms for den kodende sekvensen for den selektable markøren i nevnte multisistroniske transkripsjonsenhet, og der nukleinsyresekvensen som koder for det selektable markørpolypeptidet består av en mutasjon som reduserer translasjonseffektiviteten for den selektable markøren i en eukaryot vertscelle. Et slikt DNA-molekyl kan anvendes, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, for å oppnå eukaryote vertsceller som uttrykker høye nivåer av poplypeptidet av interesse ved å selektere for ekspresjonen av det selektable markørpolypeptidet. Deretter eller samtidig, kan en eller flere vertsceller som uttrykker polypeptidet av interesse bli identifisert og videre anvendt for å uttrykke høye nivåer av polypeptidet av interesse.

Betegnelsen "monosistronisk gen" er definert som et gen som er i stand til å fremskaffe et RNA-molekyl som koder for et polypeptid. En “multisistronisk transkripsjonsenhet”, også referert til som et mulstisistronisk gen, er definert som et gen som er i stand til å skaffe til veie et RNA-molekyl som koder for minst to polypeptider. Termen "bisistronisk gen" er definert som et gen som er i stand til å skaffe til veie et RNA-molekyl som koder for to polypeptider. Et bisistronisk gen er derfor favnet innenfor definisjonen av et multisistronisk gen. Et “polypeptid”, som anvendt i teksten, består av minst fem aminosyrer knyttet sammen ved hjelp av peptidbindinger, og kan f.eks. være et protein eller en del av et protein, slik som en subenhet av dette. For det meste blir begrepene polypeptid og protein benyttet om hverandre i teksten. Et “gen” eller en “transkripsjonsenhet”, som anvendt i beskrivelsen av den foreliggende oppfinnelsen, kan bestå av kromosomalt DNA, cDNA, kunstig DNA, kombinasjoner av disse og lignende. Transkripsjonsenheter som består av flere sistroner blir transkribert som et enkeltstående mRNA. I kontrast til tilnærminger som ble anvendt med basis i tidligere fagforståelse er translasjonen, i de multisistroniske transkripsjonsenhetene til den foreliggende oppfinnelsen, av den andre kodende regionen (dvs. den som relaterer til proteinet av interesse) til stede på det RNA og ikke avhengig av bruken av seter for reinitiering av translasjon eller interne ribosomale inngangsseter for translasjon av den andre kodende regionen, men heller avhengig av effektiviteten av translasjonen av den første kodende regionen (dvs. den for det selektable markørproteinet) på en mer eller mindre resiprok måte: jo høyere translasjonsnivået til den selektable markøren er, jo lavere blir transkripsjonsnivået til proteinet av interesse, og vice versa.

En multisistronisk enhet for transkripsjon, i samsvar med den foreliggende oppfinnelsen, er fortrinnsvis en bisistronisk transkripsjonsenhet som koder fra 5’- til 3’-ende for et selektabelt markørpolypeptid og et peptid av interesse. På denne måten blir polypeptidet av interesse kodet nedstrøms for den kodende sekvensen for det selektable markørpolypeptidet.

Det er også mulig å inkludere flere kodende sekvenser på den samme transkripsjonsenheten nedstrøms for (det første) polypeptidet av interesse, f.eks. kodende for et andre selektabelt markørpolypeptid eller for et andre polypeptid av interesse. En slik ekstra kodende sekvens nedstrøms for den kodende sekvensen for det første polypeptidet av interesse er dermed fortrinnsvis plassert foran en sekvens som koder for et reinitieringssete for translasjon eller et internt ribosomalt inngangssete (IRES), slik at også det andre polypeptidet av interesse eller det andre seleksjonsmarkørpolypeptidet blir translatert, i dette tilfellet uavhengig av de tidligere to kodende sekvensene. I en slik utgave av oppfinnelsn er det f.eks. mulig å få den kodende sekvensen for subenheter til et multimert protein, f.eks. en tung og en lett kjede tilhørende et immunoglobulin, kodet for som et første og et andre polypeptid av interesse (i en hvilken som helst rekkefølge), til å kode for subenheter tilhørende et multimert protein innenfor en multisistronisk ekspresjonsenhet. Det er imidlertid foretrukket å avbenytte separate transkripsjonsenheter for å uttrykke forskjellige polypeptider av interesse, også når disse danner deler av et multimert protein (se anslagsvis Eksempel 13: den tunge og den lette kjeden til et antistoff er hver for seg kodet for av separate transkripsjonsenheter, der hver av disse ekspresjonsenhetene er en bisistronisk ekspresjonsenhet, i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelsen).

DNA-molekylet til den foreliggende oppfinnelsen kan være til stede i form av et dobbelttrådig DNA-molekyl som, med referanse til det selektable markørproteinet og polypeptidet av interesse, har en kodende tråd og en ikke-kodende tråd, hvorav den kodende tråden er den tråden som har samme sekvens som det translaterte RNA, med det unntak at T er til stede i stedet for U. På denne måten blir et AUG-startkodon kodet for i den kodende tråden av en ATG-sekvens, og den tråden som inneholder denne ATG-sekvensen som korresponderer til AUG-startkodonet i RNA-molekylet er referert til som den kodende tråden av DNA. Det vil være helt klart at startkodoner og translasjonelle initieringssekvenser faktisk presenteres i et RNA-molekyl, men at disse kan bli betraktet likt inkorporert i et DNA-molekyl som koder for et slikt RNA-molekyl; således er, hvor den foreliggende oppfinnelsen refererer til et startkodon eller en sekvens for initiering av translasjon, og det korresponderende DNA-molekylet har den samme sekvensen som RNA-sekvensen, men besitter T i stedet for U i den kodende tråden av nevnte DNA-molekyl, ment å bli inkludert, og vice versa, med unntak av hvor man eksplisitt angir på en annen måte. Med andre ord er et startkodon f.eks. en AUG-sekvens i RNA, men den korresponderende ATG-sekvensen i den kodende tråden til DNA er referert til som startkodon, så vel som i den foreliggende oppfinnelsen. Det samme er anvendt når det refereres til “in frame” (“i ramme”) kodende sekvenser, noe som skal bety tripletter (3 baser) i RNA-molekylet som blir translatert i en aminosyre, men også bety eller tolkes som den korresponderende trinukleotidsekvensen i den kodende tråden av DNA-molekylet.

Det selektable markørpolypeptidet og polypeptidet av interesse som kodes for av det multisistroniske genet, besitter sine egne sekvenser for initiering av translasjon, og derfor har hver av dem sine egne startkodoner (så vel som stoppkodoner), dvs. de blir kodet for av separate åpne leserammer.

Begrepet "seleksjonsmarkør” eller “selektabel markør" er typisk anvendt for å referere til et gen og/eller protein hvis tilstedeværelse kan bli detektert direkte eller indirekte i en celle, f.eks. et polypeptid som inaktiverer et selekterende agens og beskytter cellen mot agensets dødelige eller veksthemmende effekter (f.eks. et resistensgen og/eller -protein mot antibiotika). En annen mulighet er at nevnte seleksjonsmarkør induserer fluorescens eller en deponering av farge (f.eks. grønt fluorescerende protein (GFP) og derivater av dette (f.eks. d2EGFP), luciferase, lacZ, alkalisk fosfatase, etc.), som kan avbenyttes for seleksjon av celler som uttrykker polypeptid-induserende deponering av farge, f.eks. ved å benytte seg av en fluorescens-aktivert cellesorterer (FACS) for å selektere celler som uttrykker GFP. Fortrinnsvis sørger det selektable markørpolypeptidet, i samsvar med den foreliggende oppfinnelsen, for resistens mot dødelige og/eller veksthemmende effekter fra et selekterende agens. Det selektable markørpolypeptidet blir kodet for av DNA-molekylene som beskrevet i den foreliggende oppfinnelsen. Det selektable markørpolypeptidet, i overensstemmelse med oppfinnelsen, må være funksjonelt virkende i en eukaryot vertscelle, og på en slik måte være i stand til å kunne bli selektert for i eukaryote vertsceller. Et hvilket som helst selektabelt markørpolypeptid som oppfyller dette kriterium kan i prinsippet bli anvendt, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen. Slike selektable markørpeptider er godt kjent i fagfeltet og blir rutinemessig benyttet når man skal oppnå kloner fra eukaryote vertsceller, og mangfoldige eksempler er fremsatt i teksten. I visse varianter av oppfinnelsen er den avbenyttede seleksjonsmarkøren zeocin. I andre utgaver er blasticidin benyttet. En fagperson vil vite at andre seleksjonsmarkører er tilgjengelige og kan anvendes, f.eks. neomycin, puromycin, bleomycin, hygromycin, etc. I andre varianter av oppfinnelsen blir kanamycin anvendt. I nok en utgave blir DHFR-genet benyttet som en selektabel markør, som kan bli selektert for ved hjelp av metotreksat, særskilt ved å øke konsentrasjonen av metotreksat kan celler bli selektert for økt kopitall av DHFR-genet. På samme måte kan glutaminsyntetase (GS) genet bli anvendt, for hvilket seleksjon er mulig i celler som oppviser utilstrekkelig GS-aktivitet (f.eks. NS-0 celler) ved å dyrke i medier uten glutamin, eller alternativt i celler som oppviser tilstrekkelig GS-aktivitet (f.eks. CHO-celler) ved å tilsette en inhibitor til GS, metionin sulfoksimin (MSX). Andre selektable markørgener som kan komme til anvendelse sammen med deres selekterende agenser er f.eks. beskrevet i Tabell 1 i US patent 5,561,053; se også Kaufman, Methods in Enzymology, 185:537-566 (1990), for en oversikt over disse.

Når to multisistroniske transkripsjonsenheter skal selekteres for i en enkelt vertscelle, i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelsen, inneholder hver av dem fortrinnsvis den kodende sekvensen for en annen seleksjonsmarkør, for derved å tillate seleksjon for begge enhetene hva gjelder multisistronisk transkripsjon. Selvfølgelig kan begge de multisistroniske transkripsjonsenhetene være til stede på et enkeltstående nukleinsyremolekyl eller alternativt kan hver av dem være til stede på separate nukleinsyremolekyler.

Begrepet "seleksjon" er typisk definert som den prosessen der man benytter en seleksjonsmarkør eller en selektabel markør og et selekterende agens for å kunne identifisere vertsceller med spesifikke genetiske egenskaper (f.eks. at vertsceller inneholder et transgen som er integrert inne i dere genom). Det burde være klart for en person som er utdannet i faget at utallige kombinasjoner av seleksjonsmarkører er mulig å benytte. Et antibiotikum som er særskilt fordelaktig er zeocin, fordi zeocinresistensproteinet (zeocin-R) virker ved å binde seg til medikamentet og ufarliggjøre det. Derfor er det nødvendig å titrere seg frem til den mengden av medikament som dreper celler med et lavt nivå av zeocin-R-ekspresjon, mens man tillater cellene som uttrykker høye nivåer å overleve. Alle andre antibiotikaresistensproteiner i vanlig avbenyttelse er enzymer og agerer defor katalytisk (dvs. ikke i et 1:1-forhold med medikamentet). Således er antibiotikumet zeocin en foretrukket seleksjonsmarkør. Imidlertid kan også den foreliggende oppfinnelsen fungere med andre seleksjonsmarkører.

Et selektabelt markørpolypeptid, i samsvar med den foreliggende oppfinnelsen, er det proteinet som er kodet for av nukleinsyren som er beskrevet i oppfinnelsen, og der polypeptidet kan bli detektert, f.eks. fordi det sørger for resistens ovefor et selekterende agens, slik som et antibiotikum. På denne måten koder, når man benytter et antibiotikum som selekterende agens, DNA for polypeptidet som overfører resistens overfor det selekterende agenset, hvis polypeptid er det selektable markørpolypeptidet. DNA-sekvenser som koder for slike selektable markørpolypeptider er kjent, og utallige eksempler på villtypesekvenser av DNA som koder for markørproteiner er skaffet til veie i teksten (Figurene 26-32). Det turde være klart at mutanter eller derivater av selektable markører også kan finne en passende anvendelse, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, og er derfor inkludert innefor rammen av begrepet “selektable markørpolypeptider”, så lenge som det selektable markørproteinet fortsatt er funksjonelt.

Av bekvemmelighetshensyn, og som generelt akseptert av en fagperson, er ofte genet og proteinet som koder for resistens overfor et selekterende agens, i mange publikasjone og i denne teksten, referert til som det “selektable agens (resistens) genet” eller ”seleksjonsagens (resistens) genet”, respektive, selv om de offisielle navnene kan være forskjellige, f.eks. for genet som koder for proteinet som inngir resistens overfor neomycin (så vel som overfor G418 og kanamycin) som ofte refererer til som neomycin (resistens) (eller neor) genet, mens det offisielle navnet er aminoglykosid- 3’-fosfotransferasegenet.

For den foreliggende oppfinnelsen er det fordelaktig å ha lave nivåer av ekspresjon av det selektable markørpolypeptidet, slik at stringent seleksjon blir muliggjort. I den foreliggende oppfinnelsen blir dette bibrakt ved avbenyttelse av en selektabel markørs kodende sekvens med en ikke-optimal effektivitet for translasjon. Under seleksjon vil bare celler som ikke desto mindre oppviser tilstrekkelige nivåer av det selektable markørpolypeptidet bli selektert, noe som betyr at slike celler må ha en tilstrekkelig transkripsjon av den multisistroniske transkripsjonsenheten og tilstrekkelig translasjon av det selektable markørpolypeptidet, som gjør det mulig å selektere for celler der den multisistroniske transkripsjonsenheten er blitt integrert eller på annen måte er til stede i vertscellene i en posisjon hvor ekspresjon fra denne transkripsjonsenheten er høy. I overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelsen sikrer den (mer eller mindre) resiprokt avhengige egenskapen som innebærer translasjon av polypeptidet av interesse fra tilsvarende for translasjonseffektivitet for markøren, høye translasjonsnivåer av polypeptidet av interesse. Dette høye nivået av translasjon er lagt ovenpå de høye transkripsjonsnivåene selektert for av de stringente seleksjonsbetingelsene (og er et resultat av bruken av en sterk promotor i vertscellene for å drive transkripsjon av den multisistroniske transkripsjonsenheten).

DNA-molekylene, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, oppviser den kodende sekvensen for det selektable markørpolypeptidet oppstrøms for den kodende sekvensen for polypeptidet av interesse, for å sørge for et multisistronisk transkript med resiprokt koblet translasjon av polypeptidet av interesse og det selektable markørpolypeptidet. På denne måten består den multisistroniske transkripsjonsenheten i 5’-enden og i retning 3’-enden (både i den transkriberte tråden av DNA og i det resulterende transkriberte RNA-molekylet) av den kodende sekvensen for det selektable markørpolypeptidet og polypeptidet av interesse.

I overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelsen blir de kodende regionene til det multisistroniske genet fortrinnsvis translatert fra cap-avhengige ORF, og derfor vil det selektable markørpolypeptidet i prinisippet også ble produsert i rikelige mengder. For å hindre slik høy translasjon av det selektable markørsistronet, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, består nukleinsyresekvensen som koder for det selektable markørpolypeptidet av en mutasjon (innenfor den åpne lesrammen (ORF) eller i sekvensen for initiering av translasjon som ligger forut for ORF, eller i begge) som senker effektiviteten for translasjonen av det selektable markørpolypeptidet i eukaryote vertsceller. Effektiviteten for translasjon skulle være lavere enn det som gjelder for den korresponderende villtypesekvensen i samme celle, dvs. at mutasjonen resulterer i mindre polypeptid per celle per tidsenhet og på denne måten mindre selektabelt markørpolypeptid. Dette kan bli detektert ved å benytte rutinemessige metoder kjent for en person som har dyktiggjort seg i faget. For eksempel, i tilfellet av seleksjon ved bruk av antibiotika, vil mutasjonen resultere i mindre resistens enn det som blir observert med sekvenser som ikke har slike mutasjoner og derfor normal effektivitet for translasjon, hvis forskjell lett kan detekteres ved å bestemme antallet av overlevende kolonier etter en normal seleksjonsperiode, og som vil bli lavere når mutasjon som bibringer en begrenset translasjonseffektivitet er til stede. Som velkjent for en person som har utdannet seg i faget, forefinnes det et stort antall av parametere som indikerer ekspresjonsnivået til markørpolypeptidet, slik som maksimal konsentrasjon av et selekterende agens overfor hvilket cellene forblir resistente, antall overlevende kolonier ved en gitt konsentrasjon, veksthastighet (doblingstid) av celler i nærvær av det selekterende agenset, kombinasjoner av faktorene som er beskrevet ovenfor og lignende.

I en særskilt foretrukket variant av oppfinnelsen, er mutasjonen som senker effektiviteten for translasjon, en mutasjon som minsker effektiviteten for initiering av translasjon.

Dette kan f.eks. etableres, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, ved å utstyre det selektable markørpolypeptidets kodende sekvens med en ikke-optimal sekvens for transasjonsstart.

For eksempel kan den initielle effektiviteten for translasjon av det selektable markørgenet i eukaryote celler være passende redusert, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, ved å mutere startkodonet og/eller nukelotidene i posisjon –3 til –1 og 4 (hvor A’en til ATG-startkodonet er nt 1), f.eks. i den kodende tråden til den korresponderende DNA-sekvensen, for å kunne skaffe til veie en ikke-optimal sekvens for translasjonsstart. En sekvens for translasjonsstart er ofte referert til i fagfeltet som “Kozak-sekvens”, og en optimal Kozak-sekvens er RCCATGG, der startkodonet er understreket, og hvor R er et purin, dvs. A eller G (se Kozak M, 1986, 1987, 1989, 1990, 1997, 2002). Således og ved siden av startkodonet i seg selv og konteksten av dette, er særskilt nukleotidene –3 til –1 og 4 relevante, og en optimal startsekvens for translasjon består derfor av et optimalt starkodon (dvs. ATG) i en optimal konstekst (dvs. at ATG kommer direkte etter RCC og blir direkte etterfulgt av G). En ikke-optimal sekvens for translasjonsstart er definert i teksten som en hvilken som helst sekvens som gir minst en detektabel translasjon i en eukaryot celle (detektabel fordi markørpolypeptidet for seleksjon er detektabelt) og som ikke har konsensussekvensen RCCATGG (startkodonet er understreket). Translasjon på ribosomet starter fortrinnsvis ved det første startkodonet det påtreffer når det scannes fra 5’-cap enden av mRNA-molekylet (scannemekanismen), og det er mest effektivt når en optimal Kozaksekvens er til stede (se Kozak M, 1986, 1987, 1989, 1990, 1997, 2002). Imidlertid blir, for en liten prosent av tilfellene, den ikke-optimale sekvensne for initiering av translasjon gjenkjent og benyttet av ribosomet for å starte translasjon. Den foreliggende oppfinnelsen gjør bruk av dette prinsippet og tillater senkning og til og med finjustering av mengden av translasjon og dermed ekspresjon av det selektable markørpolypeptidet, som derfor kan bli brukt for å øke stringensen i seleksjonssystemet.

I en første utgave av oppfinnelsen er ATG-startkodonet til det selektable markørpolypeptidet (i den kodende tråden av DNA, som koder for det korresponderende AUG-startkodonet i RNA-transkripsjons-produktet) etterlatt intakt, men posisjonene ved –3 til –1 og 4 er mutert slik at de ikke lenger oppfyller kravet til den optimale Kozak-sekvensen, ved f.eks. å skaffe til veie sekvensen TTTATGT som startsete for translasjon (ATG-startkodonet er understreket). Det turde være klart at andre mutasjoner rundt startkodonet i posisjonene –3 to –1 og/eller 4 kan bli benyttet med et lignende resultat ved å anvende teorien/læren som fremsettes i den foreliggende oppfinnelsen, og som rutinemessig kan testes av en hvilken som helst person som har utdannet seg i faget. Ideen med denne første varianten av oppfinnelsen er at ATG-startkodonet er plassert i en ”ikke-optimal” kontekst for initiering av translasjon.

I en andre foretrukket implementering av oppfinnelsen er selve ATG-startkodonet for det selektable markørpolypeptidet mutert. Dette vil generelt lede til enda lavere nivåer av translasjonsinitiering enn i den første utgaven av oppfinnelsen. ATG-startkodonet i den andre utgaven er mutert for å bli et annet kodon, som har blitt rapportert til å sørge for en viss initiering av translasjon, som f.eks. til GTG, TTG, CTG, ATT, eller ACG (kollektivt referert til i teksten som ”ikke-optimale startkodoner”). I foretrukne varianter av oppfinnelsen er ATG-startkodonet mutert for å danne et GTG-startkodon. Dette sørger for enda lavere ekspresjonsnivåer (lavere translasjon) enn med ATG-startkodonet intakt, men i en ikke-optimal sammenheng. Mer foretrukket er ATG-startkodonet mutert til å danne et TTG-startkodon, som sørger for et enda lavere ekspresjonsnivå av det selektable markørpolypeptidet enn med GTG-startkodonet (Kozak M, 1986, 1987, 1989, 1990, 1997, 2002; se også Eksemplene 9-13 i teksten).

For den andre varianten av oppfinnelsen, dvs. der hvor et ikke-ATG-startkodon blir applisert, er det sterkt foretrukket å sørge for en optimal kontekst for et slikt startkodon, dvs. at det ikke-optimale startkodonet fortrinnsvis befinner seg direkte bak nukleotider som RCC i posisjonene –3 til –1 og direkte etterfulgt av et G-nukleotid (posisjon 4). Imidlertid har det blitt rapportert at ved å avbenytte sekvensen TTTGTGG (startkodonet er understreket), kan man observere en viss initiering, i det minste in vitro, så selv om det er sterkt å foretrekke, så er det ikke absolutt påkrevd å fremskaffe en optimal sammenheng for de ikke-optimale startkodonene.

ATG-sekvenser innenfor den kodende sekvensen for et polypeptid, men som ekskluderer ATG-startkodonet, er referert til som “interne ATGs”, og hvis disse befinner seg inne i rammen sammen med ORF og derfor koder for metionin, er det resulterende metioninet i polypeptidet referert til som et “internt metionin”. Det er sterkt foretrukket, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, at den kodende regionen (som etterfølger startkodonet, men som ikke nødvendigvis inkluderer startkodonet) som koder for det selektable markørpolypeptidet fortrinnsvis er fritt for enhver ATG-sekvens i den kodende tråden av DNA, opp til (men ikke inklusive) startkodonet til polypeptidet av interesse (tydeligvis kan startkodonet til polypeptidet av interesse være, og foretrukket er faktisk et ATG-startkodon). Dette kan etableres ved å mutere enhver slik ATG-sekvens innenfor den kodende sekvensen til det selektable markørpolypeptidet, som følger etter startkodonet av denne (som det fremgår av teorien/læren som er beskrevet ovenfor, kan startkodonet til det selektable markørpolypeptidet selv være en ATG-sekvens, men ikke slik nødvendigvis). I denne hensikt blir fortrinnsvis degenerasjonen av den genetiske kode avbenyttet for å unngå muterte aminosyrer i det selektable markørpolypeptidet ethvert sted hvor dette er mulig. Følgelig, hvor enn en ATG-triplett befinner seg i den kodende tråden av DNA-sekvensen som koder for det selektable markørpolypeptidet, og hvis ATG ikke er i ramme med det selektable markørpolypeptidet ORF og derfor ikke koder for et internt metionin i det selektable markørpolypeptidet, kan ATG muteres slik at det resulterende polypeptidet ikke har noen mutasjoner i sin interne aminosyresekvens. Når ATG-tripletten er et “i ramme” kodon som koder for et internt metionin, kan kodonet muteres og det resulterende polypeptidet kan rutinemessig sjekkes for aktivitet som forventet av et selektabelt markørpolypeptid. På denne måten kan man velge hvilke som fører til et mutert selektabelt markørpolypeptid som fortsatt er aktivt som sådan (kvantitative forskjeller kan eksistere, men disse er mindre relevante, og det kan faktisk være en fordel å ha mindre aktive varianter i den foreliggende oppfinnelsen; minstekravet er at det selektable markørpolypeptidet fortsatt kan bli selektert for i eukaryote celler). Aminosyrene valin, treonin, isoleucin og leucin er strukturelt lik metionin og derfor er kodoner som koder for en av disse aminosyrene gode startkandidater som kan testes i stedet for metionin innenfor den kodende sekvensen etter startkodonet. Selvfølgelig kan, ved å benytte seg av teorien/læren som ligger implisitt i den foreliggende oppfinnelsen, den dyktige fagpersonen teste også andre aminosyrer på plassen til de interne metioninene, ved avbenyttelse av rutinemessige molekylærbiologiske teknikker for mutasjon av kodende DNA, samt rutinetesting for funksjonalitet av det selektable markørpolypeptidet. I tillegg til rutinemessige molekylærbiologiske teknikker for mutering av DNA, er det for tiden også mulig etter ønske å syntetisere (hvis påkrevd ved å benytte trinn for subkloning) DNA-sekvenser som har tilstrekkelige lengder for en ORF til et selektabelt markørpolypeptid, og slike syntetiske DNA-sekvenser kan nå til dags bestilles kommersielt fra forskjellige firmaer. Således kan en person som har dyktiggjort seg i faget, avbenytte teorien/læren som ligger implisitt i den foreliggende oppfinnelsen, for å danne passende sekvenser, i henhold til oppfinnelsen, og som koder for et selektabelt markørpolypeptid (med en mutasjon som senker initiering av translasjonen, og som fortrinnsvis ikke har noen interne ATG’er), og få denne sekvensen syntetisert og DNA-molekylet testet for funksjonalitet hva gjelder den kodede selektable markøren ved å introdusere DNA-molekylet i eukaryote vertsceller og analysere for ekspresjon av funksjonaliteten av det selektable markørpolypeptidet. Den kommersielle tilgjengeligheten av slike sekvenser gjør det også mulig å sørge for, uten utilbørlig byrde for å fremskaffe seleksjonsmarkør for kodende sekvenser som mangler interne ATG-sekvenser, hvor villtypens kodende sekvenser tilhørende det selektable markørpolypeptidet består av flere slike interne ATG-tripletter.

Ved å sørge for at en kodende sekvens for et selektabelt markørpolypeptid mangler enhver intern ATG-sekvens, minsker sjansene for utilsiktet initiering av translasjon på ribosomer som passerer den (første, ikke-optimale) sekvensen for translasjonsstart tilhørende det selektbale markørpolypeptidet ved en påfølgende intern ATP-triplett, slik at ribosomene vil fortsette å scanne for den første optimale translasjonsstartsekvensen, dvs. det som gjelder for polypeptidet av interesse.

Det burde være klart at det ikke nødvendigvis er strengt påkrevd å fjerne alle interne ATG-sekvenser fra den kodende sekvensen til den selektable markøren, så lenge som den store majoriteten av ribosomer ikke vil bruke interne ATG-sekvenser som startsete for initiering av translasjon, f.eks. fordi slike interne ATG-tripletter vanligvis ikke befinner seg i en optimal sammenheng for initiering av translasjon. Imidlertid, også i lys av det faktum at til og med en ATG-sekvens i en ikke-optimal kontekst gir opphav til betydelige nivåer av initiering av translasjon (generelt mye høyere enn fra et ikke ATG-startkodon i en optimal sammenheng), vil det være klart at hvis mange interne ATG-sekvenser er til stede i den kodende regionen av den selektable markøren, kan hver av disse subtrahere en fraksjon for translasjonsstart på ribosomene ved hver av disse ATG-triplettene, i det de hindrer dem fra å nå de nedstrømsplasserte translasjonsenhetene som koder for polypeptidet av interesse, og på den måten resulterer i en lavere ekspresjon av polypeptidet av interesse. Dette er grunnen til at det er foretrukket å ha en sekvens som koder for det selektable markørpolypeptidet, hvis sekvens er fri for interne ATG-sekvenser. Hvis det er ønskelig, så finnes det muligheter for at mengden av ribosomer som translaterer polypeptidet av interesse til og med kan bli videre hevet ved hjelp av mutasjoner av ethvert ikke-optimale potensielle sete for initiering av translasjon innenfor sekvensen som koder for det selektable markørpolypeptidet.

Det turde være klart at enhver sekvens som er til stede i den kodende tråden mellom stoppkodonet til den selektable markøren og startkodonet til polypeptidet av interesse lett kan formgis på en slik måte at den ikke består av ATG-sekvenser eller andre ikke-optimale potensielle startkodoner for translasjon.

Det turde også være klart at det er sterkt foretrukket, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, at sekvensen for translasjonsstart til polypeptidet av interesse består av en optimal sekvens for translasjonsstart, dvs. som oppviser konsensussekvensen RCCATGG (startkodonet er understreket). Dette vil resultere i en svært effektiv translasjon av polypeptidet av interesse.

Som en konsekvens av disse tiltakene blir den resiproke gjensidige translasjonsmekanismen til oppfinnelsen skaffet til veie: ribosomer scanner fra cap-enden av mRNA-molekylet som inneholder den multisistroniske transkripsjonsenheten, og en liten prosentandel av ribosomene vil translatere den første åpne leserammen, dvs. det selektable markørproteinet, siden det er blitt utstyrt med en mutasjon som senker effektiviteten av translasjonen, mens den store majoriteten av ribosomene vil passere denne åpne leserammen og begynne translasjon ved det optimale setet for initiering av translasjon der polypeptidet av interesse befinner seg, noe som resulterer i lave nivåer av det selektable markørproteinet og høye nivåer av polypeptidet av interesse. Ved å utstyre den kodende sekvensen til markøren med forskjellige mutasjoner som leder til multuple nivåer av redusert effektivitet for translasjon, blir stringensen for seleksjon forøkt og ekspresjonsnivået for polypeptidet av interesse vil resiprokt øke, slik at fininnstilling er muliggjort: f.eks. vil, ved bruk av et TTG-startkodon for seleksjonsmarkørpolypeptidet, bare noen særdeles få ribosomer translatere fra dette startkodonet, noe som resulterer i svært lave nivåer av det selektable markørproteinet, og på denne måten en høy stringens for seleksjonen og ved samme tid vil nesten alle ribosomene translatere proteinet av interesse.

Det er demonstrert i teksten at dette kan benyttes i et svært så robust system for seleksjon, noe som leder til en svært stor prosentandel av kloner som uttrykker polypeptidet av interesse i store mengder, slik som ønskelig er. I tillegg synes ekspresjonsnivåene som oppnås for polypeptidet av interesse å være signifikant høyere enn de som oppnås når et enda større antall av koloniene blir screenet ved å benytte seleksjonssystemer som inntil nå er velkjente.

I tillegg til en redusert effektivitet for initiering av translasjon, kunne det være fordelaktig også å sørge for redusert effektivitet for translasjonsrelatert elongering av det selektable markørpolypeptidet, f.eks. ved å mutere den kodende sekvensen av dette, slik at det består av flerfoldige ikke-foretrukne kodoner i vertscellen, i den hensikt å videre redusere nivået for translasjon til markørpolypeptidet og samtidig tillate mer stringente seleksjonsbetingelser, hvis dette er ønskelig. I visse varianter av den foreliggende oppfinnelsen, og med tilleg av mutasjon(er) som øker effektiviteten av translasjonen, i samsvar med den foreliggende oppfinnelsen, består det selektable markørpolypeptidet videre av en mutasjon som reduserer aktiviteten til det selektable markørpolypeptidet sammenlignet med dent villtypemotstykke. Dette kan anvendes for å øke stringensen til seleksjonen enda sterkere. Som ikke-begrensende eksempler kan prolin i posisjon 9 i zeocin-resistenspolypeptidet muteres, f.eks. til treonin eller fenylalanin, og for neomycinresistenspolypeptidet kan aminosyrerestene nummer 182 eller 261 eller begge muteres videre (se f.eks. WO 01/32901).

I noen varianter av den foreliggende oppfinnelsen blir en såkalt “spacer”-sekvens plassert nedstrøms for sekvensen som koder for startkodonet til det selektable markørpolypeptidet, der spacersekvensen fortrinnsvis er en sekvens i ramme med startkodonet og som koder for noen få aminosyrer, og som ikke representerer noen sekundærstruktur (Kozak, 1990), og som ikke inneholder noen ATG-sekvens. Slike spacersekvenser kan anvendes for videre å senke frekvensen for initiering av translasjon hvis en sekundærstruktur er til stede i RNA-molekylet (Kozak, 1990) som koder for det selektable markørpolypeptidet (f.eks. for zeocin, muligens også for blasticidin), og på den måten øke stringensen til seleksjonssystemet, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen.

Oppfinnelsen skaffer også til veie et DNA-molekyl som består av sekvensen som koder for det selektable markørproteinet, i henhold til oppfinnelsn, der DNA-molekylet her blitt utstyrt med en mutasjon som senker translasjonseffektiviteten til det funksjonelle markørpolypeptidet i en eukaryot vertscelle. I foretrukne vari anter av oppfinnelsen, har nevnte DNA-molekyl i den kodende tråden: i) blitt mutert sammenlignet med villtypesekvensen som koder for nevnte selektable markørpolypeotid, slik at sekvensen ATG er fraværende fra den kodende regionen etterfølgende startkodonet til det funksjonelt selektable markørproteinet opp til stoppkodonet tihørende det nevnte selektable markørproteinets åpne leseramme; og ii) har en ikke-optimal sekvens for translasjonsstart til det funksjonelt selektable markørpolypeptidet. Særtrekk i) og ii) kan igjen bli skaffet til veie, i henhold til beskrivelsen ovenfor. Slike DNA-molekyler favner et nyttig intermediærprodukt, i henhold til oppfinnelsen. Disse molekylene kan bli preparert først, introdusert inn i eukaryote vertsceller og testet for funksjonalitet (for noen markører er dette til og med mulig i prokaryote vertsceller), hvis ønskelig på en (semi-) kvantitativ måte, med det selektable markørpolypeptidet. De kan deretter videre bli benyttet for å preparere et DNA-molekyl, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, bestående av den multisistroniske transkripsjonsenheten.

Det er et foretrukket aspekt ved oppfinnelsen å skaffe til veie en ekspresjonskassett som består av DNA-molekylet, i henhold til oppfinnelsen, og som besitter den multisistroniske transkripsjonsenheten som angitt i krav 7. En slik ekspresjonskassett er anvendelig til å uttrykke sekvenser av interesse, f.eks. i vertsceller. En ”ekspresjonskassett”, som anvendt i teksten, er en nukleinsyresekvens som består av minst en promotor som er funksjonelt koblet til en sekvens hvis ekspresjon er ønsket. Fortrinnsvis inneholder en ekspresjonskassett transkripsjonsterminerings- og polyadenyleringssekvenser. Andre regulatoriske sekvenser, slike som forsterkere, kan også inkluderes. På denne måten skaffer den foreliggende oppfinnelsen til veie en ekspresjonskassett som består av, i følgende rangering: 5’-ende-promotor – multisistronisk transkripsjonsenhet, i henhold til oppfinnelsen, kodende for et selektabelt markørpolypeptid og nedstrøms for dette, et polypeptid av interesse – termineringssekvens for transkripsjon – 3’-ende. Promotoren må være i stand til å fungere i en eukaryot vertscelle, dvs. den må evne å drive transkripsjonen av den multisistroniske transkripsjonsenheten. Ekspresjonskassetten kan om ønskelig videre inneholde andre elementer some er kjent i fagfeltet, f.eks. spleiseseter som omfatter introner, og lignende. I noen varianter av oppfinnelsn er et intron til stede bak promotoren og foran sekvensen som koder for det selektable markørpolypeptidet.

For å oppnå ekspresjon av nukleinsyresekvenser som koder for et protein er det velkjent, for dem som har dyktiggjort seg i faget, at sekvenser som er i stand til å drive en slik ekspresjon, kan være funksjonelt koblet til nukleinsyresekvensen som koder for proteinet, noe som resulterer i rekombinante nukleinsyremolekyler som koder for et protein i et uttrykkbart format. I den foreliggende oppfinnelsen består ekspresjonskasetten av en multisistronisk transkripsjonsenhet. Generelt kan man bemerke at promotorsekvensen er plassert oppstrøms for sekvensen som skulle kunne bli uttrykt. Mange og ofte anvendte slike ekspresjonsvektorer er tilgjengelige i fagfeltet, f.eks. pcDNA- og pEF-vektor-seriene fra Invitrogen, pMSCV og pTK-Hyg fra BD Sciences, pCMV-Script fra Stratagene etc., som kan komme til anvendelse for å oppnå passende promotorer og/eller sekvenser for terminering av transkripsjon, polyA-sekvenser og lignende.

Hvor sekvensene som koder for polypeptidet av interesse blir korrekt innsatt med referanse til sekvenser som styrer transkripsjonen og translasjonen av det kodede popypeptidet, er den resulterende ekspresjonskassetten anvendelig for å produsere polypeptidet av interesse, referert til som ekspresjon. Sekvenser som driver ekspresjon kan inkludere promotorer, forsterkere og lignende, og kombinasjoner derav. Disse skulle være kapable til å funksjonere i vertscellen, for derved å drive ekspresjonen av nukleinsyresekvensene som er fullt og helt koblet til dem. Personen som har dyktiggjort seg i faget er klar over at forskjellige promotorer kan avbenyttes for å oppnå ekspresjon av et gen i en vertscelle. Promotorer kan være konstitutive eller regulerte, og kan oppnås fra forskjellige kilder, inklusive vira, prokaryote eller eukaryote kilder, eller designet på kunstig vis. Ekspresjon av nukleinsyrer av interesse kan komme via den naturlige promotoren eller et derivat av denne, eller fra en fullstendig heterolog promotor (Kaufman, 2000). Noen velkjente og mye brukte promotorer for ekspresjon i eukaryote celler omfatter promotorer som er avledet fra vira, slike som adenovirus, f.eks. E1A-promotoren, promotorer som opphavelig kommer fra cytomegalovirus (CMV), slik som CMV ”immediate early” (IE) promotoren (referert til i teksten som CMV-promotoren) (som kan oppnås f.eks. fra pcDNA, Invitrogen), promotorer avledet fra Simian Virus 40 (SV40) (Das et al, 1985), og lignende. Passende promotorer kan også avledes fra eukaryote celler, slik som metallotionein (MT)-promotorer, elongeringsfaktor 1 α (EF-1 α)-promotoren (Gill et al., 2001), ubiquitin C eller UB6-promotoren (Gill et al., 2001; Schorpp et al., 1996), actin-promotoren, en immunoglobulin-promotor, ”heat shock”-promotorer, og lignende. Noen foretrukne promotorer for å oppnå ekspresjon i eukaryote celler, som er passende promotorer i den foreliggende oppfinnelsen, er CMV-promotoren, en mammalsk EF1-alfapromotor, en mammalsk ubiquitin-promotor slik som en ubiquitin C-promotor, eller en SV40-promotor (f.eks. mulig å få tak i fra pIRES, cat. no. 631605, BD Sciences). Testing for promotorfunksjon og styrken til en promotor handler om rutinen for en person som har utdannet seg i faget, og kan generelt f.eks. omfatte kloning av et testgen slik som lacZ, luciferase, GFP, etc. bak promotorsekvensen, og testing for ekspresjon av testgenet. Selvfølgelig kan promotorer endres ved hjelp av delesjon, addisjon og mutasjon av deler av slike sekvenser, og deretter testes for funksjonalitet for å finne nye, svekkede eller forbedrede promotorsekvenser. I overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelsen, foretrekker man sterke promotorer som gir høye transkripsjonsnivåer i de eukaryote cellene man har valgt.

I visse utgaver av oppfinnelsen er et DNA-molekyl, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen en del av en vektor, f.eks. et plasmid. Slike vektorer kan med letthet bli manipulert ved hjelp av metoder som er godt kjent for fagmannen, og kan f.eks. bli designet til å være i stand til replikere i prokaryote og/eller eukaryote celler. I tillegg kan mange vektorer direkte eller i form av isolerte ønskede fragmenter derfra, bli benyttet til å transformere eukaryote celler, og som vil la seg integrere i sin helhet eller delvis inn i genomet til slike celler, noe som resulterer i stabile vertsceller som består av den ønskede nukleinsyren inkorporert i sitt genom.

Konvensjonelle ekspresjonssystemer er DNA-molekyler som innehar form av et rekombinant plasmid eller et rekombinant viralt genom. Plasmidgenomet eller det virale genomet blir introdusert inn i (eukaryote verts-) celler og fortrinnsvis integrert inn i deres genomer via metoder some er kjent i fagfeltet. I foretrukne utgaver benytter den foreliggende oppfinnelsen disse typene av DNA-molekyler for å avlevere sitt forbedrede transgene ekspresjonssystem. En foretrukket variant av oppfinnelsen er bruken av plasmid-DNA for levering av ekspresjonssystemet. Et plasmid inneholder et visst antall komponenter: konvensjonelle komponenter kjent i fagfeltet er et replikasjonsorigo og en selektabel markør for propagering av plasmidet i en bakteriecelle; en selektabel markør som fungerer i eukaryote celler for å kunne identifisere og isolere vertscellen som bærer et integrert transgent ekspresjonssystem; proteinet av interesse, hvis høynivåbaserte transkripsjon blir sørget for av en promotor som er funksjonell i eukaryote celler (f.eks. det humane cytomegalovirus ”major immediate early” promotor/enhancer, pCMV (Boshart et al., 1985); og virale transkripsjonelle terminatorer (f.eks. SV40-polyadenyleringssetet) (Kaufman & Sharp, 1982) for transgenet av interesse og den selektable markøren.

Den anvendte vektoren kan være en hvilken som helst vektor som er passende for kloning av DNA og den kan anvendes for transkripsjon av en nukleinsyre av interesse. Når vertscellen blir benyttet, er det foretrukket at vektoren er en integrerende vektor. Alternativt kan vektoren være en episomalt replikerende vektor.

Det er generelt forstått at kromatinstruktur og andre epigenetiske kontrollmekanismer kan influere ekspresjonen av transgener i eukayote celler (f.eks. Whitelaw et al., 2001). De multisistroniske ekspresjonsenhetene, i samsvar med oppfinnelsen, danner en del av et seleksjonssystem med et nokså strengt seleksjonsregime. Dette krever generelt høye transkripsjonsnivåer i den valgte vertscellen. For å øke sjansen for å finne kloner hos vertscellen som overlever det strenge seleksjonsregimet, og muligens dermed øker stabiliteten for ekspresjonen i de oppnådde klonene, vil det generelt bli foretrukket å øke forutsigbarheten til transkripsjonen. Derfor består, i foretrukne varianter av den foreliggende oppfinnelsen, en ekspresjonskassett videre av minst ett kromatinkontrollerende element. Et “kromatinkontrollerende element”, som beskrevet i teksten, er et kollektivt begrep for DNA-sekvenser som på en eller annen måte har en effekt på kromatinstrukturen og derved på ekspresjonsnivået og/eller på stabiliteten av ekspresjonen av transgener i deres nærmiljø (de fungerer “in cis” og er dermed fortrinnsvis plassert innenfor 5 kb, mer foretrukket innenfor 2 kb og enda mer foretrukket innenfor 1 kb fra transgenet) inne i eukaryote celler. Slike elementer har av og til blitt anvendt for å øke antallet av kloner som har ønskede nivåer av transgenekspresjon. Mekanismen via hvilken disse elementene fungerer skiller seg fra hverandre både mellom og innenfor klasser av slike elementer, og de er ikke fullstendig kjent for alle typer av slike elementer. Imidlertid har slike elementer blitt beskrevet, og hva angår den foreliggende oppfinnelsen er kromatinkontrollerende elementer valgt fra gruppen som består av matriks- eller stillasbindende regioner (MARs/SARs) (f.eks. Phi-Van et al., 1990; WO 02/ 074969, WO 2005/040377), isolatorer (West et al., 2002) slike som betaglobin isolatorelementet enden av HS4 tilhørende betaglobin-locus i kylling), scs, scs’, og lignende (f.eks. Chung et al., 1993, 1997; Kellum and Schedl, 1991; WO 94/23046, WO 96/04390, WO 01/02553, WO 2004/027072), et universelt kromatinåpnende element (UCOE) (WO 00/05393, WO 02/24930, WO 02/ 099089, WO 02/099070), og anti-repressorsekvenser (også referert til som “STAR”-sekvenser) (Kwaks et al., 2003; WO 03/004704). Ikke-begrensende eksempler på MAR/SAR-sekvenser som skulle kunne bli benyttet i den foreliggende oppfinnelsen er kyllingderivert lysosym 5’-MAR (Phi-Van et al., 1990) eller fragmenter av dette, f.eks. B-, K- og F-regionene som beskrevet i WO 02/074969); DNA-sekvenser som består av minst ett bøyd DNA-element og minst ett bindende sete for et DNA-bindende protein, fortrinnsvis inneholdende minst 10% av dinukleotidet TA, og/eller minst 12% av dinukleotidet AT over en strekning på 100 sammenhengende basepar, slik som en sekvens selektert fra gruppen som består av sekvensene SEQ ID Nos 1 til 27 i WO 2005/040377, fragmenter av en hvilken som helst av SEQ ID Nos 1 til 27 i WO 2005/040377, som er minst 100 nukleotider lange og som oppviser MAR-aktivitet, sekvenser som er minst 70% identiske i nukleotidsekvens med en hvilken som helst av SEQ ID Nos 1 til 27 i WO 2005/040377 eller fragmenter av disse, og som oppviser MAR-aktivitet, hvori MAR-aktiviteten er definert til å være i stand til å binde seg til nukleære matriser/stillaser in vitro og/eller kunne forandre ekspresjonen av kodende sekvenser som er operabelt knyttet til en promotor; sekvenser som er valgt fra en hvilken som helst av SEQ ID NO: 1 til 5 i WO 02/074969, fragmenter av en hvilken som helst av SEQ ID NO: 1 til 5 i WO 02/074969 og som oppviser MAR-aktivitet, sekvenser som er minst 70% identiske i nukleotidsekvens med en hvilken som helst av SEQ ID NO: 1 til 5 i WO 02/074969 eller fragmenter av disse, som også oppviser MAR-aktivitet; sekvenser som er valgt fra SEQ ID NO: 1 og SEQ ID N0: 2 i WO 2004/027072, funksjonelle fragmenter av disse og sekvenser som dertil er minst 70% identiske. Et ikke-begrensende eksempel på isolatorsekvenser som kunne komme til anvendelse i den foreliggende oppfinnelsen, er en sekvens som består av SEQ ID NO:1 i WO 01/02553. Ikkebegrensende eksempler på UCOEs som kunne benyttes i den foreliggende oppfinnelsen er sekvenser som er avbildet i Figurene 2 og 7 i WO 02/24930, funksjonelle fragmenter av disse og sekvenser som dertil er minst 70% identiske, mens de fortsatt bibeholder aktivitet; sekvenser som omfatter SEQ ID NO: 28 i US 2005/181428, funksjonelle fragmenter av denne og sekvenser som dertil er minst 70% identiske, mens de fortsatt bibeholder sin aktivitet.

Fortsatt er nevnte kromatinkontrollerende element en anti-repressorsekvens, fortrinnsvis valgt fra gruppen som består av: a) en hvilken som helst av SEQ. ID. NO. 1 gjennom SEQ. ID. NO. 66; b) fragmenter av en hvilken som helst av SEQ. ID. NO. 1 gjennom SEQ. ID. NO. 66, hvori nevnte fragmenter oppviser antirepressoraktivitet (“funksjonelle fragmenter”); c) sekvenser som er minst 70% identiske i nukleotidsekvens med a) eller b) hvori nevnte sekvenser oppviser antirepressoraktivitet (“funksjonelle derivater”); og d) komplementet til en hvilken som helst av a) til c). Fortrinnsvis er nevnte kontrollelement valgt fra gruppen som består av STAR67 (SEQ. ID. NO. 66), STAR7 (SEQ. ID. NO. 7), STAR9 (SEQ. ID. NO. 9), STAR17 (SEQ. ID. NO. 17), STAR27 (SEQ. ID. NO. 27), STAR29 (SEQ.

ID. NO. 29), STAR43 (SEQ. ID. NO. 43), STAR44 (SEQ. ID. NO. 44), STAR45 (SEQ. ID. NO. 45), STAR47 (SEQ. ID. NO. 47), STAR61 (SEQ. ID. NO. 61), eller et funksjonelt fragment eller derivat av nevnte STAR-sekvenser. I en særskilt foretrukket variant av oppfinnelsen er nevnte STAR-sekvens STAR 67 (SEQ. ID. NO. 66) eller et funksjonelt fragment eller derivat av denne. I visse foretrukne utgaver er STAR 67 eller et funksjonelt fragment eller derivat av denne posisjonert oppstrøms for en promotor som driver ekspresjonen av den multisistroniske transkripsjonsenheten. I andre foretrukne implementeringer av oppfinnelsen er ekspresjonskassetten, i henhold til oppfinnelsen, flankert på begge sider av minst en anti-repressorsekvens.

Sekvenser som oppviser anti-repressor-aktivitet, som beskrevet i teksten, er sekvenser som er i stand til, i det minste delvis, å kunne motvirke den repressive effekten av HP1- eller HPC2-proteinene når disse proteinene er bundet til DNA. Sekvenser som oppviser anti-repressoraktivitet (av og til også referert til som anti-repressorelementer i teksten) som passer for den foreliggende oppfinnelsen, er blit fremlagt i WO 03/004704, og ble benevnt som “STAR”-sekvenser i denne (uansett hvor en sekvens er referert til som en STAR-sekvens, oppviser denne sekvensen anti-repressoraktivitet, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen). Som et ikke-begrensende eksempel er sekvensene til 66 anti-repressorelementer kalt STAR1-65 (se WO 03/004704) og STAR67 presentert i teksten som SEQ. ID. NOs. 1-65 og 66, respektive.

I henhold til den foreliggende oppfinnelsen er et funksjonelt fragment eller derivat av et gitt anti-repressorelement betraktet som ekvivalent med nevnte antirepressorelement, når det fortsatt oppviser anti-repressoraktivitet. Tilstedeværelsen av slik anti-repressoraktivitet kan lett bli sjekket for av en person som har utdannet seg i faget, f.eks. ved hjelp av assayet som er beskrevet nedenfor. Funksjonelle fragmenter eller derivater kan lett produseres av en person som har dyktiggjort seg i faget molekyklærbiologi, ved å starte med en gitt anti-repressorsekvens for deretter å lage delesjoner, addisjoner, substitusjoner, inversjoner og lignende (se f.eks. WO 03/004704). Et funksjonelt fragment eller derivat består også av ortologer fra andre arter, som kan frembringes ved å benytte kjente antirepressorsekvenser ved hjelp av metoder som er kjent for fagmannen (se f.eks. WO 03/004704). På denne måten favner den foreliggende oppfinnelsen fragmenter av anti-repressorsekvensene, hvori nevnte fragmenter fortsatt oppviser antirepressoraktivitet. Oppfinnelsen favner også sekvenser som er minst 70% identiske i nukleotidsekvens med nevnte sekvenser som oppviser anti-repressoraktivitet eller til funksjonelle fragmenter av disse som oppviser anti-repressoraktivitet, så lenge som disse sekvensene er minst 70% identiske og fortsatt oppviser anti-repressoraktivitet, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen. Fortrinnsvis er nevnte sekvenser minst 80% identiske, mer foretrukket minst 90% identiske og enda mer foretrukket minst 95% identiske med opphavelige referansesekvenser eller funksjonelle fragmenter av disse. For fragmenter av en gitt sekvens refererer foreliggende identitet til den delen av den opphavelige referansesekvensen som forefinnes i fragmentet.

Sekvenser som oppviser anti-repressoraktivitet, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, kan oppnås via forskjellige metoder, inklusive kloning fra det humane genomet eller fra genomet til en annen organisme, eller ved hjelp av f.eks. å amplifisere kjente anti-repressorsekvenser direkte fra et slikt genom ved å benytte kjennskap til deres sekvenser, for eksenpel ved avbenyttelse av PCR, eller de kan fullt og helt eller delvis bli syntetisert kjemisk.

Sekvenser som oppviser anti-repressoraktivitet, samt funksjonelle fragmenter eller derivater av disse, er strukturelt definert i teksten via sine sekvenser og i tillegg er de funksjonelt definert som sekvenser som oppviser anti-repressorakivitet, som kan bestemmes ved hjelp av assayet som er beskrevet nedenfor.

En hvilken som helst sekvens som oppviser anti-repressoraktivitet, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, skulle i det minste være kapabel til å overleve følgende funksjonelle assay (se WO 03/004704, Eksempel 1).

Humane U-2 OS-celler (ATCC HTB-96) blir stabilt transfektert med pTet-Offplasmidet (Clontech K1620-A) og med nukleinsyren som koder for et LexA-repressorfusjonsprotein som inneholder det LexA DNA-bindende domenet og den kodende regionen for enten HP1 eller HPC2 (Drosophila Polycomb gruppeproteiner som undertrykker genekspresjon når de er bundet til DNA; assayet fungerer med hvert av fusjonsproteinene) under kontroll av det Tet-Off-inneholdende transkripsjonsregulatoriske systemet (Gossen and Bujard, 1992). Disse cellene er referert til nedenfor som reportercellene for anti-repressoraktivitetsassayet. Et reporterplasmid som sørger for hygromycinresistens, inneholder en polylinkersekvens som er posisjonert mellom fire LexA operatorseter og SV40-promotoren som kontrollerer zeocinresistensgenet. Sekvensen som skal testes for antirepressoraktivitet kan bli klonet inn i nevnte polylinker. Konstruksjon av et passende reporterplasmid, slik som pSelect, er beskrevet i Eksempel 1 og Figur 1 i WO 00/004704. Reporterplasmidet blir transfektert inn i reportercellene, og cellenne blir dyrket under hygromycinseleksjon (25 µg/ml; seleksjon for tilstedeværelse av reporterplasmidet) og tetrasyklin-repression (doxysyklin, 10 ng/ml; hindrer ekspresjon av LexA-repressor fusjonsproteinet). Etter 1 uke med vekst under disse betingelsene blir doxysyklinkonsentrajonen redusert til 0,1 ng/ml for å indusere LexA-repressorgenet, og etter 2 dager blir zeocin tilsatt i en konsentrasjon på 250 µg/ml. Cellene blir dyrket i 5 uker inntil kontrollkulturene (transfektert med tomt reporterplasmid, dvs. at det mangler en klonet anti-repressor sekvens i polylinkeren) blir avlivet ved hjelp av zeocinet (i dette kontrollplasmidet er SV40-promotoren undertrykt ved hjelp av LexA-repressor fusjonsproteinet som er bundet til LexA operasjonssetene, noe som resulterer i utilstrekkelig zeocinekspresjon i slike celler for at de skal kunne overleve zeocinseleksjonen). Hvis en sekvens som oppviser anti-repressoraktivitet, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, når nevnte sekvens blir klonet inn i polylinkeren til reporterplasmidet, overlever reportercellene seleksjon i 5 uker under zeocin. Celler fra slike kolonier kan fortsatt bli rendyrket på i et nytt medium som inneholder zeocin etter de 5 ukene med zeocinseleksjon, mens celler som er transfektert med reporterplasmid mangler anti-repressorsekvenser og kan ikke rendyrkes i et nytt medium som inneholder zeocin. Enhver sekvens som ikke er kapabel til å overdra eller bibringe slik vekst etter 5 uker eksponert for zeocin i dette assayet, kvalifiserer ikke som en sekvens som oppviser anti-repressoraktivitet, eller som funksjonelt fragment eller funksjonelt derivat av denne, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen. Som eksempler på kjente kromatinkontrollerende elementer, slike som de som er testet av Van der Vlag et al. (2000), inklusive Drosophila scs (Kellum og Schedl, 1991), 5’-HS4 fra β-globin-locus hos kylling (Chung et al., 1993, 1997) eller Matrix Attachment Regions (MARs) (Phi-Van et al., 1990), overlever ikke i dette assayet.

I tillegg er det foretrukket at anti-repressorsekvensen eller det funksjonelle fragmentet eller derivatet av denne overfører en høyere fraksjon av reporter-overuttrykkende kloner når det flankerer et reportergen (f.eks. luciferase, GFP) som er integrert inn i genomet til U-2 OS- eller CHO-celler, sammenlignet med når nevnte reportergen er flankert av anti-repressorsekvenser, eller flankert av svakere represjonsblokkerende sekvenser slik som Drosophila scs. Dette kan verifiseres ved å benytte f.eks. pSDH-vektoren, eller lignende vektorer, som beskrevet i Eksempel 1 og Figur 2 i WO 03/004704.

Anti-repressorelementer kan føre til minst en av tre konsekvenser for produksjon av et protein: (1) de øker forutsigbarheten i det å identifisere vertscellelinjer som uttrykker et protein på industrielle akseptable nivåer (de forstyrrer evnen til tilstøtende heterokromatin til å dempe transgenet, slik at integreringsposisjonen har en mindre inngripende effekt på ekspresjonen); (2) de resulterer i vertscellelinjer med økt proteinutbytte; og/eller (3) de resulterer i vertscellelinjer som oppviser en mer stabil produksjon av proteinproduksjon gjennom langvarig dyrking.

En hvilken som helst STAR-sekvens kan komme til anvendelse i ekspresjonskassetten, i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelsen, men følgende STAR-sekvenser er spesielt anvendelige: STAR67 (SEQ. ID. NO. 66), STAR7 (SEQ. ID. NO. 7), STAR9 (SEQ. ID. NO. 9), STAR17 (SEQ. ID. NO. 17), STAR27 (SEQ. ID. NO. 27), STAR29 (SEQ. ID. NO. 29), STAR43 (SEQ. ID. NO. 43), STAR44 (SEQ. ID. NO. 44), STAR45 (SEQ. ID. NO. 45), STAR47 (SEQ. ID. NO. 47), STAR61 (SEQ. ID. NO. 61), eller funksjonelle fragmenter eller derivater av disse STAR-sekvensene.

I visse varianter er nevnte anti-repressorsekvens, fortrinnsvis STAR67, plassert oppstrøms for nevnte promotor, fortrinnsvis slik at mindre enn 2 kb er til stede mellom 3’-enden av anti-repressorsekvensen og starten på promotorsekvense. I foretrukne utgaver av oppfinnelsen vil mindre enn 1 kb, mer foretrukket mindre enn 500 nukleotider (nt), enda mer foretrukket rundt 200, 100, 50, eller 30 nt være til stede mellom 3’-enden av anti-repressorsekvensen og starten av promotorsekvensen. I visse foretrukne varianter av oppfinnelsen er anti-repressorsekvensen klonet direkte oppstrøms for promotoren, noe som resulterer i bare rundt 0-20 nt mellom 3’-enden av anti-repressorsekvensen og starten på promotorsekvensen.

For produksjonen av multimere proteiner kan to eller flere ekspresjonskassetter benyttes. Fortrinnsvis er begge kassettene multisistroniske ekpresjonskassetter, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, der hver av dem koder for et ulikt selektabelt markørprotein, slik at seleksjon for begge ekspresjonskassettene er mulig. Denne varianten av oppfinnelsen ha vist seg å gi gode resultater, f.eks. når det gjelder ekspresjon av tunge og lette kjeder tilhørende antistoffer. Det turde være klart at begge ekspresjonskassettene kan plasseres på ett nukleinsyremolekyl eller begge kan være til stede på hvert sitt separate nukleinsyremolekyl, før de blir introdusert inn i vertsceller. En fordel med å plassere dem på ett nukleinsyremolekyl er at de to ekspresjonskassettene er til stede i en en enkel forut bestemt ratio (f.eks. 1:1) når de blir introdusert inn i vertsceller. På den annen side, når de er til stede på to forskjellige nukleinsyremolekyler tillater dette muligheten for å variere ratio mellom de to ekspresjonskassettene når de blir introdusert inn i vertsceller, noe som kan være en fordel hvis den fortrukne molare ratio skal være forskjellig fra 1:1, eller når det på forhånd er ukjent hva den foretrukne molare ratio er, slik at en variasjon av denne og en empirisk titrering av et optimum av samme lett kan utføres av en person som har utdannet seg i faget. I henhold til oppfinnelsen består fortrinnsvis minst en av ekspresjonskassettene, men mer foretrukket hver av dem av et kromatinkontrollerende element, mer foretrukket en anti-repressorsekvens.

I en annen utgave av oppfinnelsen er de forskjellige subenhetene eller delene til et multimert protein til stede på en enkeltstående ekspresjonskassett.

I stedet for eller i tillegg til nærværet av en STAR-sekvens plassert oppstrøms for en promoter i en ekspresjonskassett, er det blitt bevist som særdeles fordelaktig å sørge for en STAR-sekvens på begge sider av en ekspresjonskassett, slik at ekspresjonskassetten som består av transgenet er flankert av to STAR-sekvenser, som i visse varianter av oppfinnelsen er essensielt identiske med hverandre.

Det er blitt vist, som beskrevet i teksten, at kombinasjonen av et første antirepressorelement oppstrøms for en promotor og som flankerer ekspresjonskassetten med to andre anti-repressorsekvenser sørger for uovertrufne resultater.

Siden i det minste noen anti-repressorsekvenser kan være bidireksjonale (WO 00/004704), kan anti-repressorsekvenser som flankerer ekspresjonskassetten (anti-repressor A og B) med fordel bli plassert i motsatt retning av heverandre, slik at 3’-enden av hver av disse anti-repressorsekvensene vender innover mot ekspresjonskassetten (og mot hverandre). På denne måten, i foretrukne varianter av oppfinnelsen, vender 5’-siden til et anti-repressorelement mot DNA/kromatinet for hvilke innflytelsen på transgenet skal minskes ved hjelp av nevnte antirepressorelement. For en anti-repressorsekvens som befinner seg oppstrøms for en promotor i en ekspresjonskassett, vender 3’-enden mot promotoren. Sekvensene tilhørende anti-repressorelementene i listen over (SEQ. ID. NOs. 1-66) er gitt i 5’- til 3’-retning, med mindre annet er indikert.

I visse varianter består transkripsjonsenheter eller ekspresjonskassetter, i henhold til oppfinnelsen, videre av: a) en pausesekvens for transkripsjon (TRAP) oppstrøms for promotoren som driver transkripsjonen av den multisistroniske transkripsjonsenheten, der nevnte TRAP befinner seg i en 5’- til 3’-retning; eller b) en TRAP-sekvens nedstrøms for nevnte åpne leseramme tilhørende polypeptidet av interesse og fortrinnsvis nedstrøms for sekvensen for terminering av transkripsjon av nevnte multisistroniske enhet, der nevnte TRAP befinnner seg i en 3’- til 5’-orientering; eller c) både a) og b); hvori en TRAP-sekvens er funksjonelt definert som en sekvens som, når den blir plassert inn i en transkripsjonsenhet, resulterer i et redusert nivå av transkripsjon i den nukleinsyren som er til stede på 3’- siden av TRAP når man sammenligner med nivået for transkripsjon observert i nukleinsyren på 5’-siden av TRAP. Ikke-begrensende eksempler på TRAP-sekvenser er signaler for transkripsjons-terminering og/eller for polyadenylering. Ett ikke-begrensende eksempel på en TRAP-sekvens er gitt i SEQ. ID. NO. 142. Eksempler på andre TRAP-sekvenser, metoder for å finne disse, samt bruken av dem er beskrevet i WO 2004/055215.

DNA-molekyler som består av multisistroniske transkripsjonsenheter og/eller ekspresjonskassetter, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, kan anvendes for å forbedre ekspresjon av nukleinsyrer, fortrinnsvis i vertsceller. Begrepene "celle"/"vertscelle" og "cellelinje"/"vertscellelinje" er respektive typisk definert som en celle og en homogen populasjon avledet fra denne, som kan vedlikeholdes i cellekultur ved hjelp av metoder kjent for fagmannen, og som har evnen til å uttrykke heterologe eller homologe proteiner.

Prokaryote vertsceller kan anvendes for å propagere og/eller utføre genetisk ingeniørkunst med DNA-molekyler, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, særskilt når de er til stede på plasmider som er i stand til å replikere i prokaryote vertsceller, slike som bakterier.

En vertscelle, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, er fortrinnsvis en eukaryot celle, mer foretrukket en mammalsk celle, slik som en celle fra en gnager eller en human celle eller en fusjon mellom forskjellige celler. I visse ikkebegrensende varianter av oppfinnelsen, er nevnte celle en U-2 OS osteosarcomcelle, en CHO (”Chinese hamster ovary”)-celle, en HEK 293-celle, en HuNS-1 myeloma-celle, en WERI-Rb-1 retino-blastoma-celle, en BHK-celle, en Vero-celle, en ikke-sekreterende mus myeloma Sp2/0-Ag 14-celle, en ikke-sekreterende musemyeloma NS0-celle, en NCI-H295R-celle fra et binyrecarcinom eller en PER.C6®-celle. I visse utgaver av den foreliggende oppfinnelsen er en vertscelle en celle som uttrykker i det minste E1A, og fortrinnsvis også E1B, tilhørende et adenovirus. Som ikke-begrensende eksempler kan slike celler avledes fra f.eks. humane celler, f.eks. fra en nyre (eksempel: HEK 293-celler, se Graham et al., 1977), lunge (f.eks. A549, se f.eks. WO 98/39411) eller retina (eksempel: HER-celler som er markedsført under varemerket PER.C6®, se US patent 5,994,128), eller fra amniocytter (f.eks. N52.E6, beskrevet i US patent 6,558,948), og på samme måte fra andre celler. Metoder for å oppnå slike celler er beskrevet f.eks. i US patenter 5,994,128 og 6,558,948. PER.C6-celler som dekker formålet ved den foreliggende oppfinnelsen betyr celler fra en oppstrøms eller nedstrøms passasje eller nedstammende celle fra en oppstrøms eller nedstrøms passasje av celler som deponert under ECACC no. 96022940, dvs. som oppviser egenskaper tilsvarende slike celler. Det har tidligere blitt vist at slike celler er kapable til å uttrykke proteiner på høye nivåer (f.eks. WO 00/63403, og Jones et al., 2003). I andre foretrukne varianter av oppfinnelsen er vertscellene CHO-celler, f.eks. av typen CHO-K1, CHO-S, CHO-DG44, CHO-DUKXB11, og lignende. I visse implementeringer av oppfinnelsen har nevnte CHO-celler en dhfr- fenotype.

Slike eukaryote vertsceller kan uttrykke ønskede polypeptider, og blir ofte anvendt i den hensikten. De kan oppnås ved introduksjon av et DNA-molekyl, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, fortrinnsvis i form av en ekspresjonskassett, inn i celler. Fortrinnsvis blir ekspresjonskassetten integrert inn i genomet til vertscellene, og kan befinne seg i forskjellige posisjoner i forskjellige vertsceller, og seleksjon vil sørge for en klon hvor transgenet er integrert inn i en passende posisjon, noe som leder til en vertscelleklon med ønskede egenskaper hva gjelder ekspresjonsnivå, stabilitet, vekstkarakteristika og lignende. Alternativt kan den multisistroniske transkripsjonsenheten bli målsøkt eller tilfeldig selektert for integrasjon inn i en kromosomal region som er transkripsjonelt aktiv, f.eks. bak en promotor som er til stede i genomet. Seleksjon for celler som inneholder DNA-molekylet, i henhold til oppfinnelsen, kan utføres ved å selektere for det selektable markørpolypeptidet, i det man benytter rutinemessige metoder som er kjent for en person som har utdannet seg i faget. Når en slik multisistronisk transkripsjonsenhet blir integrert bak en promotor i genomet, kan en ekspresjonskassett, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, bli dannet in situ, dvs. innenfor genomet til vertscellene.

Fortrinnsvis stammer vertscellene fra en stabil klon som kan bli selektert og propagert i henhold til standard prosedyrer som er kjent for den som har dyktiggjort seg i faget. En kultur av en slik klon er i stand til å produsere et polypeptid av interesse, hvis cellene omfatter den multisistroniske transkripsjonsenheten som beskrevet i oppfinnelsen. Cellene, i henhold til oppfinnelsen er i stand til å vokse i suspensjonskultur i et serumfritt medium.

I foretrukne varianter av oppfinnelsen, blir DNA-molekylet som omfatter den multisistroniske transkripsjonsenheten som angitt i oppfinnelsen, fortrinnsvis i form av en ekspresjonskassett, integrert inn i genomet til den eukaryote vertscellen, i henhold til oppfinnelsen. Dette vil sørge for stabil nedarving av den multisistroniske transkripsjonsenheten.

Seleksjon for tilstedeværelse av det selektable markørpolypeptidet, og på den måten for ekspresjon, kan utføres under den initielle oppnåelsen av cellene, og kan senkes eller stoppes alt i alt etter at stabile kloner er blitt oppnådd. Det er imidlertid også mulig å anvende det selekterende agenset i løpet av de senere stadiene kontinuerlig, eller av og til, og muligens da i lavere konsentrasjoner under den initielle seleksjonen av vertscellene.

Et polypeptid av interesse, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, kan være et hvilket som helst protein, og kan være et monomerisk protein eller (del av) et multimerisk protein. Et multimerisk protein består av minst to proteinkjeder. Ikke-begrensende eksempler på slike proteiner av interesse er enzymer, hormoner, immunoglobulinkjeder, terapeutiske proteiner lik anti-kreftproteiner, blodkoagulerende protein slik som Faktor VIII, multi-funksjonelle proteiner, slik som erythropoietin, diagnostiske proteiner eller proteiner eller fragmenter av disse som er anvendelige for vaksineringsformål, hvorav alle er kjent for en person som har dyktiggjort seg i faget.

I visse varianter av oppfinnelsen koder en ekspresjonskassett for et immunoglobulins tunge eller lette kjede eller en antigenbindende del, et derivat og/eller en analog av disse. I en foretrukket utgave er det fremskaffet en proteinuttrykkende enhet, i henhold den foreliggende oppfinnelsen, hvori nevnte protein av interesse er en tungkjede tilhørende et immunoglobulin. I nok en annen foretrukket variant fremskaffes en preoteinuttrykkende enhet, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, hvori nevnte protein av interesse er et immunoglobulins lette kjede. Når disse to proteinuttrykkende enhetene er til stede i samme (verts) celle, blir et multimerisk protein og mer spesifikt et immunoglobulin satt sammen. På denne måten, dvs. i visse varianter av oppfinnelsen, er proteinet av interesse et immunoglobulin, slik som et antistoff, som er et multimerisk protein. Fortrinnsvis er et slikt antistoff et humant eller humanisert antistoff. I visse varianter av oppfinnelsen, er det et IgG, IgA, eller IgM antistoff. Et immunoglobulin kan bli kodet for av de tunge og lette kjedene på forskjellige ekspresjonskassetter, eller på en enkeltstående ekspresjonskassett. Fortrinnsvis er den tunge og lette kjeden hver for seg til stede på en separat ekspresjonskassett, der hver av dem har sin egen promotor (som kan være den samme eller forskjellige for de to ekspresjonskassettene), der hver av dem består av en multisistronisk transkripsjonsenhet, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, hvor den tunge og lette kjeden utgjør polypeptidet av interesse, og fortrinnsvis vil hver av dem kode for et forskjellig selektabelt markørprotein, slik at seleksjonen for både den tunge og lette kjedens ekspresjonskassetter kan utføres når ekspresjonskassettene blir introdusert og/eller presentert i en eukaryot vertscelle.

Polypeptidet av interesse kan opphavelig være fra enhver kilde, og i visse varianter av oppfinnelsen er det et mammalsk protein, et kunstig protein (f.eks. et fusjonsprotein eller mutert protein), og fortrinnsvis er det et humant protein.

Tydeligvis kan konfigurasjonene av ekspresjonskassettene til den foreliggende oppfinnelsen også kunne anvendes når det endelige målet ikke er å produsere polypeptidet av interesse, men RNA-molekylet i seg selv, f.eks. for å produsere økte mengder av RNA fra en ekspresjonskassett, som formålstjenlig kan brukes for å regulere andre gener (f.eks. RNAi, antisens-RNA), genterapi, in vitro proteinproduksjon etc.

I ett aspekt skaffer den foreliggende oppfinnelsen til veie en metode for å generere en vertscelle som uttrykker et polypeptid av interesse, der metoden består av trinn som: a) å introdusere inn i en majoritet av forløperceller en ekspresjonskassett, i henhold til oppfinnelsen, og b) å dyrke de genererte cellene under betingelser som selekterer for ekspresjon av det selektable markørpolypeptidet, og c) å selektere minst en vertscelle som produserer polypeptidet av interesse. Denne nye metoden sørger for et svært godt resultat hva gjelder ratio av oppnådde kloner versus kloner med et høyt uttrykk av det ønskede polypeptidet. Ved å benytte de mest stringente betingelsene, dvs. den svakeste effektiviteten for translasjon for det selektable markørpolypeptidet (ved avbenyttelse av den svakeste sekvensen for translasjonsstart), kan man oppnå langt færre kolonier ved å benytte den samme konsentrasjonen av selekterende agens enn med kjente seleksjonssystemer, og en relativt høy prosentandel av de oppnådde klonene produserer polypeptidet av interesse i store mengder. I tillegg viser de oppnådde nivåene av ekspresjon seg å være høyere enn de som oppnås når til og med et stort antall av kloner anvendes på de kjente formene av seleksjon.

Det er ytterligere en fordel at seleksjonssystemet er hurtig fordi det ikke krever amplifikasjon av høye kopitall av transgenet. Således sørger allerede cellene med lavt kopitall av de multisistroniske transkripsjonsenhetene for høye ekspresjonsnivåer. Høye transgenrelaterte kopitall kan være utsatt for genetisk labilitet og repetisjons-indusert deaktivering (f.eks. Kim et al., 1998; McBurney et al., 2002). Derfor betyr varianter av den foreliggende oppfinnelsen på en ytterligere fordel med relativt lave transgenrelaterte kopitall fordi lavere kopitall er forventet å være mindre utsatt for rekombinasjon og repetisjonsindusert deaktivering, og derfor er færre problemer med hensyn til dette forventet når man bruker vertsceller med et begrenset antall kopier av transgenet sammenlignet med vertscellene som er oppnådd ved å bruke et amplifikasjonssystem hvor hundreder eller til og med tusener av kopier av den selektable markørens og proteinet av interesses kodende sekvens kan være til stede i genomet til cellen. Den foreliggende oppfinnelsen skaffer til veie eksempler på høye ekspresjonsnivåer, ved avbenyttelse av den multisistroniske transkripsjonsenhetens seleksjonssystem, mens kopitallet av transgenet er relativt lavt, dvs. mindre enn 30 kopier per celle, eller enda lavere enn 20 kopier per celle. Således tillater den foreliggende oppfinnelsen dannelse av vertsceller, i samsvar med oppfinnelsen, der vertscellene inneholder mindre enn 30 kopier av den multisistroniske transkripsjonsenheten i genomet sitt, fortrinnsvis mindre enn 25, mer foretrukket mindre enn 20 kopier, mens det samtidig sørges for tilstrekkelige ekspresjonsnivåer av polypeptidet av interesse for kommersielle formål, f.eks. mer enn 15, fortrinnsvis mer enn 20 pg/celle/dag av et antistoff.

Mens kloner som oppviser relativt lavt kopitall av de multisistroniske transkripsjonsenhetene og høye ekspresjonsnivåer kan oppnås, kan seleksjonssystemet til oppfinnelsen ikke desto mindre bli kombinert med metoder for amplifikasjon for å forbedre ekspresjonsnivåene enda mer. Dette kan f.eks. oppnås ved amplifikasjon av et ko-integrert dhfr-gen ved hjelp av metotreksat, f.eks. ved å plassere dhfr på det samme nukleinsyre-molekylet som den multisistroniske transkripsjonsenheten til oppfinnelsen, eller ved å ko-transfektere når dhfr befinner seg på et separat DNA-molekyl.

I ett aspekt sørger oppfinnelsen for en metode for å produsere et polypeptid av interesse, der metoden består av å dyrke en vertscelle, hvorav nevnte vertscelle omfatter et DNA-molekyl som består av en multisistronisk ekspresjonsenhet eller en ekspresjonskassett, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, og som uttrykker polypeptidet av interesse fra den kodende sekvensen for polypeptidet av interesse.

Vertscellen for dette aspektet er en eukaryot vertscelle, fortrinnsvis en mammalsk celle, slik som en CHO-celle med egenskaper som beskrevet ovenfor.

Introduksjon av en nukleinsyre som er ment å skulle uttrykkes i en celle, kan bli utført ved hjelp av flere metoder, som som sådan er kjent for en person som har utdannet seg i faget, og som også er avhengig av formatet til nukleinsyrene som skal introduseres. Nevnte metoder inkluderer transfeksjon, infeksjon, injeksjon, transformasjon og lignende. Passende vertsceller som kan uttrykke polypeptidet av interesse kan oppnås via seleksjon, som beskrevet ovenfor.

I visse varianter av oppfinnelsen er det selekterende agens til stede i dyrkningsmediet, i det minste en del av tiden under dyrkingen, enten i tilstrekkelige konsentrasjoner for å kunne selektere for celler som uttrykker det selektable markørpolypeptidet, eller i lavere konsentrasjoner. I foretrukne varianter av oppfinnelsen er det selekterende agenset ikke lenger til stede i dykningsmediet under produksjonsfasen når polypeptidet blir uttrykt.

Dyrking av en celle blir utført for å gjøre det mulig for den å metabolisere, og/eller vokse og/eller dele seg og/eller produsere rekombinante proteiner av interesse. Dette kan oppnås ved hjelp av metoder som er godt kjent for fagmannen, og inkluderer å sørge for næringsmidler til cellen. Metodene omfatter vekst på overflater, vekst i suspensjon, eller kombinasjoner av begge. Dyrking kan f.eks. bli utført i skåler, i spinnerflasker eller i bioreaktorer, ved avbenyttelse av batchsystemer, mate-batchsystemer eller kontinuerlige systemer slik som perfusjonssystemer og lignende. I den hensikt å oppnå storskala-(kontinuerlig) produksjon av rekombinante proteiner via cellekultur, er det foretrukket blant fagpersoner å bruke celler som er kapable til å vokse i suspensjon, og det er foretrukket å bruke celler som er i stand til å kunne dyrkes i fravær av dyre- og humanderivert serum eller dyre- eller humanderiverte serumkomponenter.

Betingelser for å dyrke eller multiplisere celler (se f.eks. Tissue Culture, Academic Press, Kruse og Paterson, red. (1973)) og betingelser for ekspresjon av rekombinante produkter er kjent for den som har dyktiggjort seg i faget. Generelt kan man si at prinsipper, protokoller og praktiske teknikker for maksimering av produktiviteten til mammalske celler i kultur kan finnes i Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach (M. Butler, red., IRL Press, 1991).

I foretrukne varianter av oppfinnelsen blir det uttrykte proteinet samlet opp (isolert), enten fra cellene eller fra dyrkningsmediet eller fra begge. Det kan deretter bli videre renset ved å bruke kjente metoder, f.eks. via filtrering, kolonnekromatografi etc., dvs. metoder som er kjent for den som har dyktiggjort seg i faget.

Seleksjonsmetoden, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, fungerer i fravær av av kromatinkontrollerende elementer, men forbedrede resultater blir oppnådd når de multisistroniske ekpresjonsenhetene blir skaffet til veie med slike elementer inkludert. Seleksjonsmetoden, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, fungerer godt når en ekspresjonskassett, i henhold til oppfinnelsen, som består av minst en anti-repressorsekvens blir anvendt. Avhengig av det selekterende agenset og betingelsene kan seleksjonen i visse tilfeller gjøres så stringent at bare noen få eller til og med ingen vertsceller overlever seleksjonen, med mindre anti-repressorsekvenser er til stede. På denne måten sørger kombinasjonen av den nye seleksjonsmetoden og anti-repressorsekvensene for en svært attraktiv metode for å oppnå bare begrensede antall av kolonier med sterkt forbedrede sjanser for høy ekspresjon av polypeptidet av interesse deri, mens det til samme tid sørges for kloner som omfatter ekspresjonskassettene med anti-repressorsekvenser som garanterer stabil ekspresjon av polypeptidet av interesse, dvs. de er mindre utsatt for deaktivering eller andre mekanismer som innebærer lavere ekspresjon enn konvensjonelle ekspresjonskassetter.

I visse varianter av oppfinnelsen blir nesten ingen kloner oppnådd når ingen antirepressorsekvens er til stede i ekspresjonskassetten, i henhold til oppfinnelsen, som sørger for en svært stringent seleksjon. Det nye seleksjonssystemet som er fremsatt i teksten, skaffer derfor også til veie muligheten for å teste deler av antirepressorelementer for funksjonalitet, ved å analysere effektene av slike sekvenser når de er til stede i ekspresjonskassetter, som beskrevet i oppfinnelsen, under selekterende betingelser. Denne enkle screeningen, som sørger for en nesten eller til og med svart-og-hvit forskjell i mange tilfeller, kan derfor bidra til å identifisere funksjonelle deler eller derivater av anti-repressorsekvenser. Når kjente anti-repressorsekvenser blir testet, kan dette assayet bli benyttet til å karakterisere dem videre. Når fragmenter av kjente anti-repressorsekvenser blir testet, vil assayet skaffe til veie funksjonelle fragmenter av slike kjente anti-repressorsekvenser.

Praktiseringe av denne oppfinnelsen vil ta i bruk, dersom det ikke er indikert på annen måte, konvensjonelle teknikker innenfor immunologi, molekylærbiologi, mikrobiologi, cellebiologi og rekombinant DNA , som alle befinner seg innenfor fagfeltet. Se f.eks. Sambrook, Fritsch og Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel FM, et al., red., 1987; serien Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR2: A Practical Approach, MacPherson MJ, Hams BD, Taylor GR, redaktører, 1995; Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow og Lane, red., 1988.

Oppfinnelsen er videre forklart i de påfølgende eksemplene. Eksemplene tjener til å klargjøre oppfinnelsen.

Eksempler

Ekseplene 1-7 beskriver testingen av STAR67- og andre STAR-sekvenser i forskjellige konfigurasjoner og under forskjellige omstendigheter. Eksemplene 8 og videre beskriver det nye seleksjonssystemet, som angitt i den foreliggende oppfinnelsen.

Eksempel 1: Konstruksjon av STAR67-vektorer

En ny anti-repressor- (STAR)-sekvens ble isolert ved å bruke en genetisk screening som beskrevet i WO 03/004704, og denne nye sekvensen ble gitt navnet STAR67. Effektene av STAR67 på ekspresjon av transgener i mammalske cellerlinjer ble testet. Her beskriver vi konstruksjonen av de forskjellige konstruktene.

Materialer og Metoder

Tre plasmider ble dannet (Figur 1):

A) CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV Kontroll),

B) STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV-STAR67),

C) STAR7-STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo-STAR7 (CMV-STAR67 7/7)

Konstruksjonen av konstrukt A er beskrevet nedenfor. Plasmid pd2EGFP (Clontech 6010-1) ble modifisert ved innsetting av en linker ved BsiWI-setet og ga som resultat pd2EGFP-link. Linkeren som ble dannet (via en PCR-reaksjon) ved å koble med oligonukleotidene GTACGGATATCAGATCTTTAATTAAG (SEQ. ID. NO. 67) og GTACCTTAATTAAAGATCTGATAT (SEQ. ID. NO. 68) introduserte seter for PacI-, BglII-, og EcoRV- restriksjons-endonukleasene. Dette skapte det multiple kloningssetet MCSII for innsetting av STAR-elementer. Primerne GATCA-GATCTGGCGCGCCATTTAAATCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGG (SEQ. ID. NO.

69) og (AGGCGGATCCGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGG (SEQ. ID. NO.

70) ble benyttet for å amplifisere en region på 0,37 kb fra pd2EGFP, som ble innsatt i BglII-setet til pIRES (Clontech 6028-1) for å gi pIRES-stuf. Dette introduserte seter for AscI- og SwaI-restriksjonsendonukleaser ved MCSI, og agerer som et “stufferfragment” for å unngå potensiell interferens mellom STAR-elementene og de tilstøtende promotorene. pIRES-stuf ble spaltet med BglII og FspI for å frigjøre et DNA-fragment som besto av stufferfragmentet, CMV-promotoren, IRES-elementet (flankert av de multiple kloningssetene MCS A og MCS B), og SV40 polyadenyleringssignalet. Dette fragmentet ble ligert med vektorstammen til pd2EGFP-link produsert ved fspalting med BamHI og StuI, til å gi pIRES-link.

Den åpne leserammen til zeocin-resistensgenet ble satt inn i BamHI/NotI-setene nedstrøms for pIRES som følger: zeocin-resistens ORF ble amplifisert ved hjelp av PCR med primerne GATCGGATCCTTCGAAATGGCCAAGTTGACCAGTGC (SEQ. ID. NO. 71) og AGGCGCGGCCGCAATTCTCAGTCCTGCTCCTC (SEQ. ID. NO. 72) fra plasmid pCMV/zeo (Invitrogen, cat. no. V50120), fordøyd med BamHI og NotI, og ligert med BamHI/NotI-fordøyd pIRES-link til å gi pIRES-link-zeo. d2EGFP reporter ORF ble introdusert inn i pIRES-link-zeo ved amplifikasjon av pd2EGFP (Clontech 6010-1) med primerne GATCGAATTCTCGCGAAT-GGTGAGCAAGCAGATCCTGAAG (SEQ. ID. NO. 73) og AGGCGAATTCAC-CGGTGTTTAAACTTACACCCACTCGTGCAGGCTGCCCAGG (SEQ. ID. NO. 74), og innsetting av EcoRI-spaltet d2EGFP kassett inn i EcoRI-setet i pIRES-link-zeoplasmidet. Dette dannet konstrukt A, CMV-d2EGFP-IRES-Zeo (CMV Kontroll).

STAR67 ble klonet oppstrøms for CMV-promotoren, i AscI-setet (rundt 15 nt sto tilbake mellom STAR67 og promotoren). Dette dannet konstrukt B, STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV-STAR67).

STAR67 ble også testet i konteksten med en kassett som også inneholder STAR7, klonet direksjonelt inn i 5’- SalI- og XbaI-setene og 3’- BglII- og PacI-setene for å flankere hele kassetten med STAR7. Dette er konstrukt C (CMV-STAR67 7/7).

Eksempel 2: STAR67 øker ekspresjonsnivået fra CMV-, EF1α- og UB6-promotorene i stabilt transfekterte CHO-celler

Vi testet hvorvidt nærværet av STAR67 tilstøtende CMV-, EF1 α- og UB6-promotorer influerer ekspresjonsnivået av disse promotorene i CHO-celler.

Konstruktene A and B (Figur 1) beskrevet i Eksempel 1 er benyttet for dette formålet, modifisert for de respektive promotorene:

1 CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV Kontroll)

2 STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV-STAR67)

3 EF1 α-d2EGFP-ires-Zeo (EF1 α Kontroll)

4 STAR67-EF1 α-d2EGFP-ires-Zeo (EF1 α-STAR67)

5 UB6-d2EGFP-ires-Zeo (UB6 Kontroll)

6 STAR67-UB6-d2EGFP-ires-Zeo (UB6-STAR67).

Materialer og Metoder

UB6- og EF1 α-promotorene ble byttet ut med CMV-promotoren i plasmidet som er beskrevet i Figur 1. UB6-promotoren ble klonet som følger: Et stuffer-DNA på 0,37 kb fra pd2EGFP-plasmidet ble amplifisert ved hjelp av PCR, som beskrevet i Eksempel 1 ved å benytte primere identifisert av SEQ. ID. NOs. 69 og 70. Den resulterende DNA-stuffer ble klonet inn i BglII-setet til pUB6/V5-His [Invitrogen V250-20], noe som dannet pUB6-stuf. Fra pUB6-stuf ble AscI-SacI-fragmentet klonet inn i CMV-d2EGFP-IRES-Zeo, fra hvilken CMV-promotoren ble fjernet.

EF1 α-promotoren ble amplifisert ved hjelp av PCR med pEF1 α/V5-His [Invitrogen V920-20] som templat, ved avbenyttelse av primerne GATCGGCGCGC-CATTTAAATCCGAAAAGTGCCACCTGACG (SEQ. ID. NO. 79) og AGGCGGGACCCCCTCACGACACCTGAAATGGAAG (SEQ. ID. NO. 80). PCR-fragmentet ble klonet inn i AscI- og PpuMI-setene til CMV-d2EGFP-IRES-Zeo, fra hvilken CMV-promotoren ble fjernet.

Chinese Hamster Ovary cellelinjen CHO-K1 (ATCC CCL-61) ble dyrket i HAMS-F12 medium 10% Føtalt Kalveserum inneholdende 2 mM glutamin, 100 U/ml penicillin, og 100 mikrogram/ml streptomycin ved 37°C/5% CO2. Celler ble transfektert med plasmider ved avbenyttelse av Lipofectamine 2000 (Invitrogen) som beskrevet av produsenten. Kort oppsummert ble cellene sådd ut i kulturflasker og dyrket over natten til 70-90% konfluens. Lipofectamine-reagenset ble kombinert med plasmid-DNA i et forhold på 6 mikroliter per mikrogram (f.eks. for en 10 cm Petriskål, 20 mikrogram DNA and 120 mikroliter Lipofectamine) og tilsatt til cellene. Etter en inkubasjon over natten ble transfeksjonsblandingen erstattet med friskt medium, og de transfekterte cellene ble inkubert videre. Etter dyrking over natten ble cellene trypsinert og sådd ut i nye kulturflasker med friskt medium. Etter ytterligere en inkubasjon over natten ble zeocin tilsatt i en konsentrasjon på 50 μg/ml og cellene ble dyrket videre. Etter nye tre dager ble mediet erstattet med friskt medium inneholdende zeocin (100 μg/ml) og dyrket videre. Når individuelle kolonier ble synlige (omtrent ti dager etter transfeksjon) ble mediet fjernet og erstattet med friskt medium uten zeocin. Individuelle kloner ble isolert og overført til 24-brønners plater i medium uten zeocin. En dag etter isolasjonen av kolonier ble zeocin tilsatt til mediet. Ekspresjon av d2EGFP-reportergenet ble vurdert omtrent 3 uker etter transfeksjon. Nivåene av d2EGFP-ekspresjon i koloniene ble målt etter en periode på to uker. Etter de initielle to ukene etter transfeksjon da de første d2EGFP-målingene ble utført, ble koloniene dyrket i medium uten zeocin eller andre antibiotika. Dette vedvarte gjennom resten av eksperimentet.

Resultater

Figur 2 viser at transfeksjon av konstruktet som inneholder STAR67 klonet oppstrøms for CMV-promotoren, resulterte i et antall CHO-kolonier som uttrykker siginifikant høyere nivåer av d2EGFP-proteinet sammenlignet med den ”tomme” kontrollen uten STAR67, CMV Kontroll. Gjennomsnittet for d2EGFP-signalet i de 10 koloniene som ble transfektert med CMV Kontrollplasmidet var 34, når man målte 25 dager etter transfeksjon. 60 dager etter transfeksjon var gjennomsnittet for d2EGFP- signalet i disse 10 koloniene redusert til 13, noe som indikerte at ekspresjonen ikke var stabil over tid. Til sammenligning var det gjennomsnittlige d2EGFP-signalet i de 10 koloniene som ble transfektert med STAR67-CMV-plasmidet 42 når man målte etter 25 dager og 32 når man målte 60 dager etter transfeksjon. På denne måten, 60 dager etter transfeksjon, bibrakte et STAR67-inneholdende CMV-konstrukt en faktor på 2,5 ganger høyere CMV-promotordrevet ekspresjonsnivå av reporterproteinet i stabilt transfekterte kloner. Av viktighet er det at seleksjonstrykket, 25 dager etter transfeksjon og etter den første målingen, ble fjernet ved å dyrke koloniene i medium uten zeocin. På denne måten er koloniene som inneholder STAR67-konstruktet mer stabilt over tid i fravær av seleksjonstrykk enn kolonier som ikke inneholder et STAR67-konstrukt.

Figur 3 viser at transfeksjon med konstruktet som inneholder STAR67 klonet oppstrøms for EF1 α-promotoren resulterer i et antall av CHO-kolonier som uttrykker signifikant høyere nivåer av d2EGFP-protein, sammenslignet med den ”tomme” kontrollen uten STAR67, EF1 α Kontroll. Gjennomsnittet av d2EGFP-signalet i de 10 koloniene som ble transfektert med EF1 α Kontroll-plasmid var 31, da man målte 25 dager etter transfeksjon. 60 dager etter transfeksjon var det gjennomsnittlige d2EGFP-signalet i disse 10 koloniene 26. Til sammenligning var gjennomsnittet for d2EGFP-signalet i de 10 koloniene som ble transfektert med EF1 α-STAR67-plasmid 60 da man målte etter 25 dager og 76 da man målte 60 dager etter transfeksjon. På denne måten, både 25 og 60 dager etter transfeksjon, bibrakte det STAR67-inneholdende EF1 α-konstruktet en faktor på 2,9 ganger høyere EF1 α-promotordrevet ekspresjonsnivå av reporterproteinet i stabilt transfekterte kloner.

Figur 4 viser at transfeksjon med konstruktet som inneholder STAR67 klonet oppstrøms for UB6-promotoren ga et antall av CHO-kolonier som uttrykker signifikant høyere nivåer av d2EGFP-proteinet, sammenlignet med den ”tomme” kontrollen uten STAR67, UB6 Kontroll. Gjennomsnittet av d2EGFP-signalet i de 10 koloniene som ble transfektert med UB6 Kontrollplasmidet var 51, da man målte 25 dager etter transfeksjon. 60 dager etter transfeksjon var gjennomsnittet av d2EGFP-signalet i disse 10 koloniene 29, noe som indikerer at ekspresjonen ikke var stabil over tid. Til sammenligning var det gjennomsnittlige d2EGFP-signalet i de 10 klonene som bletransfektert med UB6-STAR67 plasmidet 218 da man målte etter 25 dager og 224 målt 60 dager etter transfeksjon. På denne måten, 25 dager etter transfeksjon, bibrakte et STAR67-inneholdende UB6-konstrukt en faktor på 4,3 ganger høyere UB6-promotordrevet ekspresjonsnivå av reporterproteinet i stabilt transfekterte kloner. Etter 60 dager var denne faktoren 7,7, på grunn av labilitet av ekspresjonen i kontrollkoloniene og stabilitet i UB6-STAR67-koloniene. Viktig å bemerke er at 25 dager etter transfeksjon , dvs. etter første måling ble seleksjonstrykket fjernet ved å dyrke koloniene i medium uten zeocin. Således er koloniene som inneholder STAR67-konstruktet mer stabilt over tid i fravær av seleksjonstrykk enn kolonier som ikke inneholder et STAR67-konstrukt.

Som konklusjon kan man si at STAR67 øker ekspresjonen fra tre forskjellige, ikke-relaterte promotorer.

Eksempel 3: STAR67 øker ekspresjonsnivået fra CMV-, EF1α- og UB6-promotorene i stabilt transfekterte PER.C6-celler

Vi testet hvorvidt nærværet av STAR67 ved siden av CMV-, EF1 α- og and UB6-promotorene påvirker ekspresjonsnivået av disse promotorene i en annen celletype enn CHO-celler, nemlig humane PER.C6-celler. De samme konstruktene som i Eksempel 1 ble avbenyttet.

Materialer og Metoder

Transfeksjon, dyrking og analyse av PER.C6-celler

PER.C6®-celler ble dyrket i DMEM-medium pyridoxin 9% Føtalt Bovin Serum (Ikke-Varmeinaktivert), 8,9 mM MgCl2100 U/ml penicillin, og 100 mikrogram/ml streptomycin ved 37 ºC/10% CO2. Cellene ble transfektert med plasmider ved avbenyttelse av Lipofectamine 2000 (Invitrogen) som beskrevet av tilvirkeren. Kort oppsummert ble cellene sådd ut i 6-brønners plater og dyrket over natten til 70-90% konfluens. Lipofectamine-reagenset ble kombinert med plasmid-DNA i et forhold på 15 mikroliter per 3 mikrogram (f.eks. for en 10 cm Petri-skål, 20 mikrogram DNA and 120 mikroliter Lipofectamine) og tilsatt etter 30 minutters inkubasjon ved 250C til cellene. Etter en 6-timers inkubasjon ble transfeksjonsblandingen erstattet med friskt medium og de transfekterte cellene ble videre inkubert. Etter dyrking over natten ble cellene tryprsinert og sådd ut (1:15, 1:30, 1:60, 1:120 fortynninger) i nye Petri-skåler (90 mm) med friskt medium inneholdende zeocin tilsatt i en konsentrasjon på 100 μg/ml og cellene ble dyrket videre. Da koloniene ble synlige, ble individuelle kloner isolert ved skraping og overført til 24-brønners plater i medium med zeocin. Da de hadde vokst til ~70% konfluens ble cellene overført til 6-brønners plater. Stabile kolonier ble ekspandert i løpet av 2 uker i 6-brønners plater før d2EGFP-signalet ble bestemt i et XL-MCL Beckman Coulter flow-cytometer. Gjennomsnittet av d2EGFP-signalet ble tatt som et mål på nivået av d2EGFP-ekspresjon. Koloniene ble målt en andre gang etter 2 uker. Deretter ble koloniene videre dyrket i fravær av zeocin.

Resultater

Figur 5 viser at transfeksjon av konstruktet som inneholder STAR67 klonet oppstrøms for CMV-promotoren resulterer i et antall av PER.C6-kolonier som uttrykker signifikant høyere nivåer av d2EGFP-protein, sammenlignet med den ”tomme” kontrollen uten STAR67, CMV-Kontroll. Gjennomsnittet av d2EGFP-signalet i 10 kolonier som ble transfektert med CMV-Kontrollplasmid var 37, da man målte 30 dager etter transfeksjon. 60 dager etter transfeksjon var det gjennomsnittlige d2EGFP-signalet i disse 10 koloniene redusert til 14, noe som indikerte at ekspre sjonen ikke var stabil over tid. Til sammenligning var det gjennomsnittlige d2EGFP-signalet i de 10 koloniene som ble transfektert med STAR67-CMV-plasmidet 101 da man målte 30 dager og 45 da man målte 60 dager etter transfeksjonen. Således, 60 dager etter transfeksjon, bibrakte et STAR67-inneholdende CMV-konstrukt en faktor på 3,2 ganger høyere CMV-promotordrevet ekspresjonsnivå av reporterproteinet i stabilt transfekterte kloner.

Figur 6 viser at transfeksjon med konstruktet som inneholder STAR67 klonet oppstrøms for EF1 α-promotoren, resulterte i et antall av PER.C6-kolonier som uttrykker signifikant høyere nivå av d2EGFP-protein, sammenlignet med den ”tomme” kontrollen uten STAR67, EF1 α Kontroll. Gjennomsnittet av d2EGFP-signalet i de 10 koloniene som ble transfektert med EF1 α Kontroll-plasmidet var 5, da man målte 30 dager etter transfeksjonen. 60 dager etter transfeksjon var gjennomsnittet av d2EGFP-signalet i disse 10 koloniene 6. Til sammenligning var gjennomsnittet av d2EGFP-signalet i de 10 koloniene som ble transfektert med EF1 α-STAR67 plasmidet 25 da man målte 30 dager etter og 20 da man målte 60 dager etter transfeksjon. På denne måten, både 30 dager etter og 60 dager etter transfeksjon, bibrakte et STAR67-inneholdende EF1 α-konstrukt en faktor på 4,0 høyere EF1 α-promotor-drevet ekspresjonsnivå for reporterproteinet i stabilt transfekterte kloner.

Figur 7 viser at transfeksjon av konstruktet som inneholder STAR67 klonet oppstrøms for UB6-promotoren resulterer i et antall av PER.C6-kolonier som uttrykker signifikant høyere nivåer av d2EGFP-proteiner, sammenlignet med den ”tomme” kontrollen uten STAR67, UB6-Kontroll. Gjennomsnittet av d2EGFP-signalet i de 10 koloniene som ble transfektert med UB6-Kontrollplasmidet var 4, da man målte 30 dager etter transfeksjon. 60 dager etter transfeksjon var gjennomsnittet av d2EGFP-signalet i disse 10 koloniene 2. Til sammenligning var gjennomsnittet av d2EGFP-signalet i de 10 koloniene som ble transfektert med UB6-STAR67 plasmidet 27 da man målte etter 30 dager og 18 da man målte 60 dager etter transfeksjon. På denne måten, både 30 og 60 dager etter transfeksjon, bibrakte et STAR67-inneholdende UB6-konstrukt en faktor på 7 til 9 ganger høyere UB6-promotordrevet ekspresjonsnivå av reporterproteinet i stabilt transfekterte kloner.

Således kunne man se at en plassering av STAR67 oppstrøms for promotoren også i PER.C6-celler resulterte i signifikant høyere nivåer av proteinekspresjon sammenlignet med STAR67-frie konstrukter. Således fungerer STAR67 i forskjellige, ikke-beslektede celletyper.

Eksempel 4: Nye konfigurasjoner av STAR67 kombinert med andre STAR-elementer for å stimulere SV40-promotoren i CHO-celler

Vi testet hvorvidt nærværet av STAR67 ved siden av SV40-promotoren påvirker ekspresjonsnivået av denne promotoren, enten alene eller i kombinasjon med et annet STAR-element, i dett eksemplet STAR7. Konstruktene som ble benyttet i denne sammenhengen (se Figur 8), er:

1 SV40-d2EGFP-ires-Zeo (SV40 Kontroll)

2 STAR67-SV40-d2EGFP-ires-Zeo (SV40-STAR67)

3 STAR7-SV40-d2EGFP-ires-Zeo-STAR7 (SV40-STAR7/7)

4 STAR7- STAR67-SV40--d2EGFP-ires-Zeo-STAR7 (SV40-STAR67 7/7)

Materialer og Metoder

SV40-promoteren ble amplifisert ved hjelp av PCR med pIRES som templat ved avbenyttelse av primerne TTGGTTGGGGCGCGCCGCAGCACCATGGCCTGAAATAAC-CTCTGAAAGAGG (SEQ. ID. NO. 81) og TTGGTTGGGAGCT-CAAGCTTTTTGCAAAAGCCTAGGCCTCCAAAAAAGCCTCCTC (SEQ. ID. NO. 82). PCR-fragmentet ble klonet inn i AscI- og SacI-setene til CMV-d2EGFP-IRES-Zeo, fra hvilken CMV-promotoren ble fjernet.

CHO-cellene ble transfektert, kolonier ble isolert og propagert og analysert som i Eksempel 2.

Resultater

Figur 8 viser at transfeksjon av konstruktet som enten inneholder STAR67 klonet oppstrøms for SV40-promotoren (SV40-STAR67) eller STAR 7 klonet for å flankere hele konstruktet (SV40-STAR 7/7) ikke resulterte i noen CHO-kolonier som uttrykte signifikant høyere nivåer av d2EGFP-protein, sammenlignet med den ”tomme” kontrollen uten STARs (SV40 Kontroll). Gjennomsnittet av d2EGFP-signalet i de 18 koloniene som ble transfektert med SV40 Kontroll-plasmid var 86, da man målte 40 dager etter transfeksjon. Til sammenligning var gjennomsnittet av d2EGFP-signalet i de 18 koloniene som ble transfektert med SV40-STAR67-plasmidet 82 da man målte etter 40 dager og gjennomsnittet av d2EGFP-signalet i de 18 klonene som ble transfektert med SV40-STAR 7/7-plasmidet var 91 da man målte etter 40 dager. På denne måten observerte man ikke noen signifikant effekt av disse STAR-elementene på SV40-promotoren i CHO-celler.

Det viser seg at ekspresjonsnivåene fra SV40-promotoren i disse cellene er allerede ganske høye, og enda høyere enn de som er observert med CMV-promotoren, som var betraktet å være en svært sterk promotor. Denne høye bakgrunnsekspresjonen i fravær av et STAR-element som benytter SV40-promotoren i CHO-celler, kan forklare hvorfor man ikke kunne observere noen signifikant effekt av STAR67 alene eller av STAR7 som flankerte transgenet.

Imidlertid var det gjennomsnittlige d2EGFP-signalet i de 18 koloniene som ble transfektert med SV40-STAR67 7/7-plasmidet 209 da man målte koloniene 40 dager etter transfeksjon, noe som bibringer en faktor på 2,4 ganger høyere enn gjennomsnittet for de 18 kontrollkoloniene (antall = 86). På denne måten, når STAR67-elementet blir benyttet i kombinasjon med et annet STAR-element, resulterer dette i et antall stabile transfekterte CHO-kolonier som oppviser signifikant høyere nivåer av d2EGFP-ekspresjon.

Derfor synes det som om, i denne nye konfigurasjonen STAR sekvens A – STAR sekvens C - promotor – nukleinsyre, som koder for et protein av interesse – STAR sekvens B – 3’, hvori det foreliggende ekemplet inmpliserer STAR-sekvensene A og B som STAR7 og STAR-sekvens C som STAR67) at STAR-elementene fungerer enda bedre enn hittil avslørte konfigurasjoner.

Vi har utført eksperimenter i hvilke de flankerende STAR7-elementene ble erstattet med flankerende STAR6-elementer eller av flankerende STAR4-elementer, i kombinasjon med STAR67 oppstrøms for SV40-promotoren (SV40-STAR67 6/6 og SV40-STAR67 4/4, respektive, ved avbenyttelse av den samme nomenklaturen som ovenfor), og observerte forbedret ekspresjon også med disse kombinasjonene. Dette beviser at de flankerende STAR7-elementene virkelig kan erstattes med andre STAR-sekvenser og fortsatt bibeholde forbedringen av den nye konfigurasjonen av ekspresjonskassetten med de nye STAR-sekvensene.

Eksempel 5: En kombinasjon av STAR67 og STAR7 øker UB6-drevete ekspresjonsnivåer i stabilt transfekterte CHO-celler

I Eksempel 4 viste vi at kombinasjonen av STAR67 og STAR7 økte ekspresjonsnivåene av d2EGFP-proteinet i CHO-celler. Her testet vi hvorvidt kombinasjonen av STAR67 og STAR7 kunne anvendes for å produsere et antistoff. Vi valgte et antistoff mot EpCAM-molekylet (Huls et al., 1999) som testprotein og anvendte UB6-promotoren.

Materialer og Metoder

Plasmider

Den tunge kjedens cDNA (HC-EpCAM) ble klonet inn i et konstrukt som favner UB6-promotoren. HC-EpCAM ble koblet til zeocin-resistensgenet via en IRES-sekvens. Den lette kjedens cDNA (LC-EpCAM) ble også klonet inn i et konstrukt som favnet UB6-promotoren. LC-EpCAM ble koblet til puromycin-resistensgenet via en IRES-sekvens. Sammen representerte disse to plasmidene UB6 (HC+LC) Kontroll (Figur 9).

For å teste effektene av STAR67 og STAR7, ble STAR67 klonet inn i begge HC+LC konstruktene oppstrøms for UB6-promotorene. STAR7 ble klonet til å flankere hele kassetten, både i 5’- og 3’-enden (Figur 9). Disse to plasmidene representerte STAR7-STAR67-UB6 (HC+LC) STAR7.

Transfeksjon og dyrking av CHO-celler

Chinese Hamster Ovary cellelinjen CHO-K1 (ATCC CCL-61) ble transfektert og dyrket som i Eksempel 2, ved å bruke zeocin (100 µg/ml) and puromycin (2,5 µg/ml) for seleksjon. En dag etter transfeksjonen ble zeocin tilsatt til dyrkningsmediet. Da koloniene først ble synlige (omtrent 7 dager etter tilførselen av zeocin) ble dyrkningsmediet fjernet og erstattet med dyrkningsmedium som inneholdt puromycin. Etter omtrent 7 dager ble kolonier isolert og overført til 24-brønners plater i dyskningsmedium som inneholdt bare zeocin.

Resultater

Figur 9 viser at transfeksjon av antistoffkonstrukter som inneholder STAR67 klonet oppstrøms for UB6-promotoren og to STAR7-elementer klonet til å flankere hele kassetten resulterer i et antall av CHO-kolonier som uttrykker signifikant høyere nivåer av EpCAM-antistoffet (målt ved hjelp av ELISA ved avbenyttelse av et anti-humant IgG antistoff) sammenlignet med den ”tomme” kontrollen uten STAR67 og STAR7, UB6 (HC+LC) Kontroll. Den gjennomsnittlige EpCAM-produksjonen i de 18 koloniene som ble transfektert med UB6 (HC+LC) Kontrollplasmid var 2,7 pg/celle/dag, da man målte 25 dager etter transfeksjon. Seleksjonsagensene zeocin og puromycin ble fjernet etter 25 dager. 45 dager etter transfeksjon var gjennomsnittet for EpCAM-produksjonen i de 18 koloniene 2,7 pg/celle/dag. Til sammenligning var gjennomsnittet for signalet for EpCAMproduksjon i de 18 koloniene som ble transfektert med STAR7-STAR67-UB6 (HC+LC)-STAR7 plasmidet 6,7 da man målte etter 25 dager og 7,7 pg/celle/dag da man målte 45 dager etter transfeksjon. Således bibrakte, både 30 og 45 dager etter transfeksjon, et STAR67/STAR7-inneholdende UB6-konstrukt en faktor på 2,5 til 2,9 høyere UB6-promotordrevet EpCAM-ekspresjon i stabilt transfekterte CHO-kloner.

På denne måten resulterte plasseringen av STAR67 oppstrøms for promotoren og to STAR7-elementer for å flankere kassettene i signifikant høyere EpCAM-antistoff-ekspresjonsnivåer i CHO, sammenlignet med STAR67/STAR7-frie konstrukter.

Eksempel 6: STAR67 er ikke en forsterker-blokkerer, mens STAR6 og STAR7 er det

Alle hittil kjente STAR-elementer som ble testet for den angitte egenskapen, inklusive STAR6 og STAR7, er forsterker-blokkerere (WO 03/004704, Kwaks et al., 2003). Forsterker-blokkereraktivitet blir testet ved å plassere et STAR-element mellom en sterk forsterker og en promotor. Her testet vi hvorvidt også STAR67 er en forsterker-blokkerer.

Materialer og Metoder

d2EGFP-genet ble PCR-amplifisert ved avbenyttelse av primerne TTGGTTGGTCATGAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTC (SEQ.ID.NO. 75) og ATTCTCTAGACTACACATTGATCCTAGCAGAAGCAC (SEQ.ID.NO. 76) og klonet inn i plasmid pGL3-promotoren (Promega) ved å bruke NcoI- og XbaI-restriksjonssetene for å plassere Luciferasegenet til å danne plasmid pGL3-promotor-GFP. En linker (dannet ved å sammenføye oligosekvensene CGATATCTTGGAGATCTAC-TAGTGGCGCGCCTTGGGCTAGCT (SEQ.ID.NO. 77) og GATCAGCTAGCCCAAGG-CGCGCCACTAGTAGATCTCCAAGATATCGAGCT (SEQ.ID.NO. 78)), ble klonet inn i SacI- og BglII-seter for å danne multiple kloningsseter. Det originale BglII-setet ble ødelagt ved å ligere linkeren, noe som skapte et nytt unikt BglII-sete inne i linker-DNA-molekylet. SV40-forsterkerne ble kuttet ut fra plasmidet pGL3-basic (Promega) ved avbenyttelse av BsaBI og BamHI og klonet inn i pGL3-linkerpromotor-GFP ved å bruke EcoRV- og BglII-setene som danner plasmid pGL3-forsterker-promotor-GFP. STAR40-elementet ble plassert oppstrøms for SV40-forsterkeren ved å anvende KpnI- og SacI-setene for å hindre at forsterkeren agerte på sekvenser som befant seg oppstrøms. Til slutt ble STAR-elementene 6, 7 og 67 plassert mellom SV40-enhanceren og SV40-minimal-promotor ved å bruke SpeI- og AscI- restriksjonssetene.

Transfeksjon og dyrking av CHO-celler

Chinese Hamster Ovary cellelinje CHO-K1 (ATCC CCL-61) blir transfektert som i Eksempel 2. En dag etter transfeksjonen ble d2EGFP-nivåene målt i et Epics XL flow-cytometer (Beckman Coulter).

Resultater

Figur 10 viser at STAR67 ikke er en forsterker-blokkerer, mens STAR6 og STAR7 agerer som forsterker-blokkerere i det samme assayet. STAR6, STAR7 og STAR67 ble klonet mellom SV40-forsterkeren og en minimal SV40-promotor oppstrøms for d2EGFP-genet. Da ingen STAR-elementer ble klonet mellom forsterker og promoter, inntrådte en sterk transkripsjonell aktivering (tilfeldig satt til 100%). Da STAR6 eller STAR7 ble plassert mellom forsterkeren og promotoren falt transkripsjonen til bakgrunnsverdi, noe som indikerte at STAR6 og STAR7 er potente forsterker-blokkerere. Som kontrast, da STAR67 ble klonet mellom forsterkeren og promotoren, var transkripsjonen fortsatt 80% av kontrollen, noe som indikerer at STAR67 ikke er en god forsterker-blokkerer, dette i kontrast til STAR6 og STAR 7, så vel som andre STAR-elementer, som tidligere beskrevet (WO 03/004704, Kwaks et al., 2003).

Eksempel 7: STAR67 øker UB6- og CMV-drevne nivåer av antistoffekspresjon i stabilt transfekterte CHO-celler

I Eksempel 5 viste vi at kombinasjonen av STAR67 og STAR7 økte ekspresjonsnivået av EpCAM-antistoffet i CHO-celler, innenfor konteksten med to distinkte plasmider som inneholdt den tunge og den lette kjeden. I dette eksemplet testet vi hvorvidt STAR67 kunne anvendes for å produsere EpCAM-antistoffet, siden både de tunge og lette kjedene er plassert på ett plasmid. Vi brukte simultan seleksjon for selektable markører.

Materialer og Metoder

Plasmider

Den tunge kjedens cDNA (HC-EpCAM) er under kontroll av UB6-promotoren og koblet til zeocin-resisten-genet via en IRES-sekvens. Den lette kjedens cDNA (LC-EpCAM) er under kontroll av CMV-promoteren og koblet til puromycinresistensgenet via en IRES-sekvens. Disse konstruktene er i utgangspunktet brukt i Eksempel 5. Disse to ekspresjonskassettene ble plassert på ett plasmid, på en slik måte at transkripsjon av de to ekspresjonsenhetene hadde motsatte retninger. For å kontrollere plasmidet, ble UB6- og CMV-promotorene adskilt ved hjelp av en stuffer på 500 bp (EpCAM Kontroll) (Figur 10). I et annet plasmid ble STAR67 plassert mellom UB6- og CMV-promotoren (EpCAM STAR67) (Figur 10).

Transfeksjon av og dyrking av CHO-celler

Chinese Hamster Ovary cellelinjen CHO-K1 (ATCC CCL-61) ble transfektert og dyrket som i Eksempel 2, ved å benytte zeocin (100 µg/ml) og puromycin (2,5 µg/ml) for seleksjon. I Eksempel 5, ble etterfølgende seleksjon for begge markørene anvendt. I kontrast til dette var begge seleksjonsagensene her til stede i dyrkningsmediet samtidig. En dag etter transfeksjon ble zeocin og puromycin tilsatt til dyrkningsmediet. Seleksjonsmediet var til stede inntil koloniene ble isolert (omtrent 14 dager etter transfeksjon). Etter at koloniene ble isolert og overført til 24-brønners plater, ble cellene dyrket i nærvær av zeocin og puromycin.

Resultater

Figur 11 viser at transfeksjon av antistoffkonstruktet som inneholder STAR67 klonet mellom UB6- og CMV-promotorene resulterte i et antall av CHO-kolonier som uttrykker EpCAM-antistoffet (målt ved hjelp av ELISA ved avbenyttelse av et antihumant IgG-antistoff). Gjennomsnittet for EpCAM-produksjon i de 19 koloniene som ble transfektert med EpCAM STAR67-plasmidet var 9,8 pg/celle/dag, da man målte 25 dager etter transfeksjon.

I kontrast til dette og også til forundring overlevde ikke noen kolonier transfeksjon med EpCAM Kontrollplasmidet. Da seleksjon ble utført med enten zeocin eller puromycin, overlevde EpCAM Kontroll koloniene. Imidlertid tillot, da seleksjonstrykket ble økt på både den tunge og lette kjeden, disse betingelsene bare kolonier å overleve som hadde STAR67 til stede i det transfekterte plasmidet.

Resultatene viser også at inkorporering av STAR67 bibringer en fordelaktig effekt på to promotorer, UB6- og CMV-promotorene, som er plassert oppstrøms og nedstrøms for et STAR67-element. Dette indikerer at STAR67 kan virke på en bidireksjonell måte.

Forskjellen mellom EpCAM-kontroll- og EpCAM-STAR67- plasmidene er svart-oghvit i den forstand at bare transfeksjon av EpCAM-STAR67 resulterer i etablering av kolonier, og så når seleksjonstrykket er høyt. Dette åpner for en mulighet til å anvende denne plasmid-konfigurasjonen for å identifisere den regionen i STAR67 som er ansvarlig for å mediere denne effekten. Mindre, overlappende deler av STAR67 ble plassert mellom UB6- og CMV-promotorene som driver EpCAM-molekylet. Når en del av STAR67 er funksjonell, vil kolonier overleve når både zeocin or puromycin simultant blir benyttet som selekterende agenser. Når en del av STAR67 ikke er funksjonell, vil ingen kolonier overleve under identiske seleksjonsbetingelser.

Ved å plassere STAR67 oppstrøms for promotoren på denne måten, resulterte det i signifikant høyere ekspresjon av EpCAM-antistoffnivået i CHO-celler, sammenlignet med STAR-frie konstrukter.

Eksempel 8: Konstruksjon og testing av et zeocin-resistensgen produkt uten internt metionin

Den grunnleggende ideen bak utviklingen av et nytt seleksjonssystem er å plassere genet som koder for resistens oppstrøms for genet av interesse og en promotor som driver ekspresjonen av dette bisistroniske mRNA-molekylet. Translasjonen av det bisistroniske mRNA er slik at resistensgenet forekommer i bare en liten prosentandel av de translasjonelle hendelsene, mens det nedstrøms posisjonerte genet av interesse i mesteparten av hendelsene vil bli translatert over i protein. På denne måten vil translasjonseffektiviteten til det oppstrøms beliggende resistensgenet bli alvorlig forstyrret sammenlignet med translasjonseffektiviteten til det nedstøms beliggende genet av interesse. For å oppnå dette, kan man ty til tre trinn, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen:

1) Innenfor resistensgenet på mRNA, burde det søkende ribosomet fortrinnsvis ikke støte på nok en AUG-triplett, siden envher nedstøms beliggende AUG-triplett kan tjene som et startkodon for translasjon, noe som resulterer i lavere translasjonseffektivitet for det andre, nedstøms beliggende genet av interesse. Således og fortrinnsvis vil enhver AUG-sekvens i resistensgenets mRNA måtte erstattes. I tilfelle denne AUG-sekvensen er et funksjonell kodon som koder for metionin, vil denne aminosyren måtte erstattes av en annen aminosyre, f.eks. av et leucinmolekyl (Figur 12A og B);

2) Startkodonet til resistens-genet må være plassert i en ugunstig kontekst (være en del av en ikke-optimal sekvens for translasjonsstart); dvs. at ribosomer må starte translasjonen ved dette startkodonet i et begrenset antall hendelser, for således i de fleste tilfellene å fortsette å søke etter et bedre, mer optimalt startkodon (Figur 12C-E). Tre forskjellige stringenser kan man skille mellom: a) det normale ATG startkodonet, men plassert i en ugunstig kontekst (TTTATGT) (kalt ATGmut) (Figur 12C), b) fortrinnsvis når det er plassert i en optimal kontekst, kan GTG tjene som startkodon (ACCGTGG) (Figur 12D) og c) fortrinnsvis når det er plassert i en optimal kontekset, kan TTG tjene som startkodon (AC-CTTGG) (Figur 12E). Den mest stringente translasjonsbetingelsen er TTG-kodonet, etterfulgt av GTG-kodonet (Figur 12). Zeocin-mRNA med et TTG som startkodon er forventet å produsere den laveste mengden av zeocin-resistense proteinet og vil således overbringe den laveste funksjonelle zeocin-resistensen til cellene (Figurene 12 og 13).

3) Fortrinnsvis burde det normale startkodonet (ATG) til det nedstrøms beliggende genet av interesse befinne seg i en optimal translasjonskontekst (f.eks. ACCATGG)(Figur 13A-D). Dette krever at, etter trinnene 1 og 2 har blitt iverksatt, vil i de fleste tilfellene genet av interesse fungere som startkodon for det bisistroniske mRNA-molekylet.

I eksempel 8, er trinn 1 utført, dvs. at det i zeocin-resistes-genet er erstattet et internt methinon med en annen aminosyre (Figur 12B-E). Det er viktig at, etter en slik utskiftning, zeocin-proteinet fortsatt bibringer zeocin-resistens til de transfekterte cellene. Siden det ikke er kjent på forhånd hvilken aminosyre som oppfyller dette kriteriet, har man forsøkt tre forskjellige amnosyrer: leucin, threonin og valin. De forskjellige konstruktene med distinkte aminosyrer har så blitt testet for sin evne til fortsatt å bibringe zeocin-resistens til de transfekterte cellene.

Materialer og Metoder

Konstruksjon av plasmidene

Den opphavelige zeocinets åpne leseramme har følgende sekvense rundt startkodonet: AAACCATGGCC (startkodonet uthevet; SEQ. ID. NO. 83). Dette er et startkodon i en optimal translasjonell kontekst (Figur 12A). Først ble den gunstige konteksten til startkodonet for zeocinets åpne leseramme forandret gjennom amplifikasjon fra plasmidet pCMV-zeo [Invitrogen V50120], med primer-parene ZEO-forward-MUT (SEQ. ID. NO. 84):

GATCTCGCGATACAGGATTTATGTTGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTCCG

og ZEO-WT-reverse (WT = villtype; SEQ. ID. NO. 85):

AGGCGAATTCAGTCCTGCTCCTCGGC, ved å benytte pCMV-ZEO (Invitrogen;

V50120) som templat. Det identifiserte produktet ble kuttet med NruI-EcoRI og ligert inn i pcDNA3, noe som resulterte i pZEOATGmut.

Den opphavelige zeocintilhørende åpne leserammen inneholder en “in-frame” ATG-triplett som koder for metionin i aminosyreposisjon 94 (av i alt 124). Dette interne ATG, som koder for metionin i posisjon 94, ble endret på en slik måte at metioninet ble forandret til leucin, treonin eller valin, respektive:

1) For å erstatte det interne kodonet for metionin i zeocinets åpne leseramme med kodonet for leucin (Figur 12B), ble en del av zeocinets åpne leseramme amplifisert ved bruk av primer-paret ZEO- forward-MUT (SEQ. ID. NO. 84) og ZEO-LEU-reverse (SEQ. ID. NO. 86):

AGGCCCCGCCCCCACGGCTGCTCGCCGATCTCGGTCAAGGCCGGC. PCR-produktet ble kuttet med BamHI-BglI og ligert inn i pZEOATGmut. Dette resulterte i pZEO(leu).

For å erstatte det interne kodonet for metionin i zeocinets åpne leseramme med et kodon for treonin (ikke vist, men som i Figur 12B), ble en del av zeocinets åpne leseramme amplifisert ved å benytte primer-paret ZEO-forward-MUT (SEQ. ID. NO. 84) og ZEO-TH-reverse (SEQ. ID. NO. 87):

AGGCCCCGCCCCCACGGCTGCTCGCCGATCTCGGTGGTGGCCGGC. PCR-produktet ble kuttet med BamHI-BglI og ligert inn i pZEOATGmut. Dette resulterte i pZEO(thr).

For å erstatte det interne kodonet for metionin i zeocinets åpne leseramme med et kodon for valin (ikke vist, men som i Figur 12B), ble en del av zeocinets åpne leseramme amplifisert ved å benytte primer-paret ZEO-forward-MUT (SEQ. ID. NO. 84) og ZEO-VAL-reverse (SEQ. ID. NO. 88): AGGCCCCGCCCCCACGG-CTGCTCGCCGATCTCGGTCCACGCCGG. PCR-produktet ble kuttet med BamHI-BglI og ligert inn i pZEOATGmut. Dette resulterte i pZEO(val).

Transfeksjon og dyrking av celler

Chinese Hamster Ovary cellelinjen CHO-K1 (ATCC CCL-61) ble dyrket i HAMS-F12 medium 10% Føtalt Kalveserum inneholdende 2 mM glutamin, 100 U/ml penicillin, and 100 mikrogram/ml streptomycin ved 37°C/5% CO2. Celler ble transfektert med plasmidene ved avbenyttelse av Lipofectamine 2000 (Invitrogen) som beskrevet av fabrikanten. Kort fortalt ble cellene sådd ut i vekstflasker og dyrket oven natten til 70-90% konfluens. Lipofectamine-reagenset ble kombinert med plasmid-DNA i en ratio på 6 mikroliter per mikrogram (f.eks. for en 10 cm Petriskål, 20 mikrogram DNA og 120 mikroliter Lipofectamine) og tilsatt til cellene. Etter en over natt inkubasjon ble transfeksjonsblandingen erstattet med friskt medium, og de transfekterte cellene ble inkubert videre. Etter dyrking over natten ble cellene trypsinert og sådd over i nye kulturflasker med friskt medium inneholdende zeocin (100 μg/ml). Da individuelle kolonier ble synlige (omtrent ti dager etter transfeksjon) ble koloniene telt opp.

Resultater

Fire plasmider ble transfektert over i CHO-K1-celler, 1) pZEO(WT), 2) pZEO(leu), 3) pZEO(thr), og 4) pZEO(val). Cellene ble selektert med 100 μg/ml zeocin.

Transfeksjon av pZEO(leu) resulterte i likt antall zeocin-resistente kolonier sammenlignet med kontroll pZEO (WT). pZEO(thr) og pZEO(val) ga færre kolonier, men forskjellen var ikke eksponentielt lavere. Derfor ble det konkludert med at endringer av det interne metioninet til leucin, treonin eller valin alle resulterte i et zeocin-resistens-protein som fortsatt var i stand til å bibringe zeocinresistens til de transfekterte cellene. Snarere tilfeldig, ble pZEO(leu) valgt som startpunkt for å skape de forskjellige startkodonene på zeocinets åpne leseramme. På denne måten er, i eksemplene nedenfor, startmetioninet så vel som det interne metioninet i zeocin alltid erstattet med leucin, men også for andre selektable markørgener, noe som klart fremgår av ytterligere eksempler.

Eksempel 9: Produksjon og testing av zeocin-d2EGFP bisistroniske konstrukter med varierende translasjonell effektivitet

For å danne et bisistronisk mRNA-molekyl som favner et mutert zeocin-resistensmRNA med lavere translasjonell effiktivitet, og d2EGFP-genet som nedstrøms beliggende gen av interesse, ble startkodonet for d2EGFP-genet først optimalisert (trinn 3 i eksempel 8). Etter det ble de forskjellige versjonene av zeocinresistensgenet dannet. Forskjellenen mellom disse versjonene er at de har forskjellige startkodoner, med distinkt translasjonell efektivitet (trinn 2 i Eksempel 9, Figur 12C-E). Disse forskjellige versjonene av zeocin-resistensgenet ble klonet oppstrøms for det modifiserte d2EGFP-genet (Figur 13).

Materialer og Metoder

Dannelsen av plasmider

d2EGFP-reporter ORF ble introdusert inn i pcDNA3. Sekvensen rundt startkodonet til dette d2EGFP cDNA-molekylet er GAATTCATGGG (startkodon uthevet; SEQ. ID. NO. 89), som ikke er optimal. Som et første trinn ble d2EGFP amplifisert fra pd2EGFP (Clontech 6010-1) med primerne d2EGFP-forward-BamHI (SEQ. ID. NO.

90):

GATCGGATCCTATGAGGAATTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG

og d2EGFP-reverse-NotI (SEQ. ID. NO. 91):

AAGGAAAAAAGCGGCCGCCTACACATTGATCCTAGCAGAAG. Dette produktet inneholder nå et startkodon med en optimal translasjonell kontekst (ACCATGG). Dette skapte pd2EGFP og deretter ble zeocinets åpne leseramme ligert inn i pd2EGFP, noe som resulterte i pZEO-d2EGFP. Det er her understreket at en optimalisering av den translasjonelle startsekvensen til genet av interesse (her: EGFP som et modellgen) ikke er essensiell men foretrukket i den hensikt å vri den translasjonelle initieringsfrekvensen enda mer mot genet av interesse.

Nå ble tre klasser av konstrukter dannet:

1) ATG som startkodon i zeocin-resistensgenet, men i en ugunstig kontekst (TTTATGT) (ikke vist, men som i Figur 13B) og etterfulgt av en spacersekvens i stedet for den optimale ATG-tripletten (Figur 13A). Spacersekvensen ble plassert nedstrøms for ATG-sekvensen. I zeocin- (og mulignes i blasticidin-) RNA, foreligger det en sekundærstruktur, noe som forårsaker at ribosomet temporært blir forsinket. På grunn av dette kan et dårlig startkodon i noen tilfeller anvendes av ribosomet, på tross av at det er et dårlig startkodon eller fordi det befinner seg i en ugunstig kontekst for translasjonell initiering. Dette leder til at sjansen for translasjon øker og, i tilfellet av den foreliggende oppfinnelsen, gjør stringensen for seleksjon lavere. For å redusere denne effekten, og på den måten senke den translasjonelle effektiviteten, blir en spacersekvens introdusert som ikke inneholder sekundærstruktur (Kozak, 1990). Således blir begrepet “space” introdusert og anvendt i plasmidet og primernavnene for å indikere tilstedeværelsen av en slik spacersekvens. Spaceren fjerner den ”ribosomforsinkendesekvensen” fra omgivelsene til initierings-kodonet, for derved å forårsake at ribosomet starter translasjonen mindre hyppig. Og på den måten øker stringensen for seleksjon, i hehold til den foreliggende oppfinnelsen. Spaceren introduserer noen ekstra aminosyrer i den kodende sekvensen. Dette har blir gjort i noen tilfeller for både zeocin og for blasticidin, noe som vil fremgå tydelig fra eksemplene.

Nomenklaturen til plasmidene og primerne vil generelt følge de nedenfor beskrevne linjene: navnet til det selektable markørpolypeptidet er referert til med en forkortelse (f.eks. Zeo, Blas, etc.); startkodonet er nevnt (f.eks. ATG, GTG, TTG); når startkodonet er plassert i en ikke-optimal kontekst for initiering av translasjon, blir tillegget “mut” benyttet (dette er vanligvis gjort bare for ATG-startkodonene, fordi kombinasjone av en ikke-optimal kontekst med et ikke-ATG startkodon vanligvis ikke resulterer i tilstrekkelig translasjonell initiering til å tillate seleksjon); når en spacer blir brukt bak startkodonet blir tillegget “space” benyttet (dette blir vanligvis gjort for ”ATGmut” startkodonene for Zeo- eller Blasselektbale markører).

Zeo’s åpne leseramme ble amplifisert med primer-paret ZEO-forward-BamHI-ATGmut/space (SEQ. ID. NO. 93):

GATCGGATCCTTGGTTTATGTCGATCCAAAGACTGCCAAATCTAGATCCGA-GATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAGCCAAGTTGACCAGTGAAGTTC (hvori den følgende sekvensen som følger etter den understrekede sekvensen består av spacersekvensen), og ZEO-WT-reverse (SEQ. ID. NO. 85), PCR-produktet ble kuttet med EcoRI-BamHI, og ligert inn i pd2EGF, kuttet med EcoRI-BamHI, i det pZEO-ATGmut/space-d2EGFP ble dannet.

2) GTG som startkodon i Zeo-resistensgenet i stedet for ATG (Figur 13C). Zeo’s åpne leseramme ble amplifisert med primer-paret ZEO-forward-BamHI-GTG (SEQ. ID. NO. 94): GATCGGATCCACCGTGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTC og ZEO-WT-reverse (SEQ. ID. NO. 85), PCR-produktet ble kuttet med EcoRI-BamHI, og ligert inn i pd2EGFP, kuttet med EcoRI-BamHI, som til slutt dannet pZEO-GTG-d2EGFP.

3) TTG som startkodon i Zeo-resistensgenet i stedet for ATG (Figur 13D). Zeo’s åpne leseramme ble amplifisert med primer-paret ZEO-forward-BamHI-TTG:

GATCGGATCCACCTTGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTC (SEQ. ID. NO. 95) og ZEO-WT-reverse (SEQ. ID. NO. 85), PCR-produkte ble kuttet med EcoRI-BamHI, og ligert inn i pd2EGFP, kuttet med EcoRI-BamHI, som til slutt dannet pZEO-TTG-d2EGFP.

Transfeksjon, dyrking og analyse av CHO-celler

Chinese Hamster Ovary cellelinjen CHO-K1 (ATCC CCL-61) ble dyrket i HAMS-F12 medium 10% Føtalt Kalveserum inneholdende 2 mM glutamin, 100 U/ml penicillin, og 100 mikrogram/ml streptomycin ved 37°C/5% CO2. Celler ble tranfektert med plasmidene ved avbenyttelse av Lipofectamine 2000 (Invitrogen) som beskrevet av tilvirkeren. Kort beskrevet ble celler sådd ut i dyrkningsflasker og dyrket over natt til 70-90% konfluens. Lipofectamine-reagenset ble kombinert med plasmid-DNA i en ratio på 15 mikroliter per 3 mikrogram (f.eks. for en 10 cm Petri-skål, 20 mikrogram DNA og 120 mikroliter Lipofectamine) og tilsatt til cellene etter 30 minutters inkubasjon ved 250C. Etter en over natt inkubasjon ble transfeksjonsblandingen erstattet med friskt medium, og de transfekterte cellene ble videre inkubert. Etter nok en over natt dyrking, ble cellene trypsinert og sådd ut i nye dyrkningsflasker med friskt medium. Etter en ny over natt inkubasjon ble zeocin tilsatt i en konsentrasjon på 50 μg/ml og cellene ble dyrket videre. Etter enda tre dager ble mediet erstattet med friskt medium som inneholdt zeocin (100 μg/ml) og dyrket videre. Da individuelle kloner ble synlige (omtrent ti dager etter transfeksjon) ble mediet fjernet og erstattet med friskt medium uten zeocin. Individuelle kloner ble isolert og overført til 24-brønners plater i medium uten zeocin. En dag etter isolasjon av koloniene, ble zeocin tilsatt til mediet. Ekspresjon av d2EGFP-reportergenet ble bedømt omtrent 3 uker etter transfeksjonen. Nivåene for d2EGFP-ekspresjon i kolonier ble målt etter en periode på to uker.

Resultater

CHO-K1 celler ble transfektert med konstrukter som inneholder ATGmut/space Zeo (Figur 13B), GTG Zeo (Figur 13C) and TTG Zeo (Figur 13D) genene som seleksjonsgener, hvorav alle var blitt klonet oppstrøms for d2EGFP-reportergenet. Disse tre konstruktene var uten STAR-elementer (Kontroll) eller med STAR-elementene 7 og 67 oppstrøms for CMV-promotoren og STAR 7 nedstrøms for d2EGFP-genet (Figur 14). Figur 14 viser at både kontroll- (uten STAR-elementer) konstruktene med ATGmut/space Zeo (A) og GTG Zeo (B) ga kolonier som uttrykte d2EGFP-protein. Det gjennomsnittlige d2EGFP-ekspresjonsnivået for 24 ATGmut/space Zeo-kolonier var 46 og for GTG Zeo-koloniene 75. Dette høyere gjennomsnittlige ekspresjonsnivået i GTG Zeo-koloniene kan reflektere den høyere stringensen til GTG, sammenlignet med ATGmut/space (Eksempel 8). Addisjonen av STAR-elementene 7 og 67 til konstruktene resulterte i kolonier som oppviste høyere gjennomsnittlige d2EGFP-ekspresjonsnivåer. Transfeksjon av AT-Gmut/space Zeo STAR 7/67/7 konstruktet resulterte i kolonier med et gjennomsnittlig d2EGFP-ekspresjonsnivå lik 118, som er en faktor på 2,6 høyere enn gjennomsnittet i kontrollcellene (46). Tilføringen av STAR-elementer til GTG Zeokonstruktet resulterte i et gjennomsnittlig ekspresjonsnivå for d2EGFP på 99, som er en faktor på 1,3 ganger høyere enn gjennomsnittet for kontrollcellene (75).

Det som er viktig er at ingen kolonier ble etablert da TTG Zeo-konstruktet ble transfektert. Imidlertid resulterte konstruktet med TTG Zeo, flankert av STARs 7 og 67 i etableringen av 6 kolonier med et gjennomsnittlig d2EGFP-ekspresjonsnivå på 576 (Figur 14C). Således ble den høyeste translasjonsstringensen fremkalt ved hjelp av startkodon TTG (Figur 12) og ga som utbytte det høyeste d2EGFP-ekspresjonsnivået, som forutsagt i Figur 13. Resultatene indikerte også at stringensen bibrakt av TTG Zeo alene (uten STAR-elementer) er i det minste i noen eksperimenter for høy for at koloniene skal overleve. Imidlertid ble, i senere uavhengige eksperimenter (se nedenfor), noen kolonier funnet med dette konstruktet uten STAR-elementer, noe som indikerte at stringensen til seleksjonssystemet med TTG startkodonet i zeocin-selseksjonsmarkøren ikke nødvendigivs utelukker funn av kolonier når ikke noen STAR-elementer er til stede, og at antallet kolonier oppnådd kan variere mellom eksperimenter.

Det er konkludert at bruken av STAR-elementer i kombinasjon med det stringente seleksjonssystemet, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, tillater hurtig å kunne identifisere storpordusenter av genet av interesse.

Eksempel 10: Etablering av et høyere antall av TTG Zeo STAR kolonier og sammenligning med et IRES-Zeo konstrukt

Resultatene i Eksempel 9 indikerte at TTG Zeo oppviser en ekstrem stringens for translasjonseffektivitet, som kan være for høy til å bibringe zeocin-resistens til cellene. Transfeksjone ble skalert opp for å teste hvorvidt det ville bli noen kolonier som har slike høye ekspresjonsnivåer at de overlever. Oppskalering av eksperimentet kunne også adressere spørsmålet hvorvidt det høye gjennomsnittet for TTG Zeo STAR 7/67/7 kunne bli enda høyere når flere kolonier ble analysert.

Materialer og Metoder

CHO-K1-celler ble transfektert med konstrukter som har TTG Zeo-genet som seleksjonsmarkør, med og uten STAR-elementene 7 og 67 (Figur 15). Transfeksjoner, seleksjon, dyrking etc. ble utført som i Eksempel 9, med unntak av at 6 ganger flere celler, DNA og Lipofectamine 2000 ble benyttet. Transfeksjonene og seleksjon ble utført i Petriskåler.

Resultater

Figur 15A viser at transfeksjon med med TTG Zeo STAR 7/67/7-konstruktet resulterte i dannelsen av mange kolonier med et gjennomsnittlig d2EGFP-signal på 560. Dette er så høyt som i Eksempel 9, med unntak av at man nå analyserte 58 kolonier. Når man sammenlignet med konstruktet som inneholdt zeocin-resistensgenet plassert bak en IRES-sekvens (Figur 15B), var det gjennomsnittlige d2EGFP-ekspresjonsnivået 61, og når STAR-elementene 7 og 67 ble lagt til et slikt konstrukt, var det gjennomsnittlige d2EGFP-ekspresjonsnivået 125, en faktor på 2 over kontrollen (Figur 15B). Gjennomsnittet for TTG Zeo STAR 7/67/7-koloniene var derfor en faktor på 9,2 høyere enn for de STAR-frie IRES-Zeokoloniene og en faktor på 4,5 høyere enn for STAR7/67/7 IRES Zeo-koloniene.

En observasjon er at formen på kurven til alle de uttrykkende koloniene skiller seg fra hverandre i forhold til TTG Zeo STAR7/67/7 og IRES-Zeo STAR 7/67/7. I det første tilfellet (TTG Zeo) flater kurven ut, mens det i det andre tilfellet (IRESZeo) har kurven en mer ”eksponensiell” form. Platået i TTG Zeo-kurven kunne indikere at cellene har nådd et maksimalt ekspresjonsnivå for d2EGFP, over hvilket d2EGFP-ekspresjonsnivået blir toksisk og cellene dør. Imidlertid viste det seg senere at høye verdier var nær de maksimumsverdier som kunne bli detektert med instillingene til detektoren i en FACS-analysator. I senere eksperimenter aksepterte man at innstillingene for FACS-analysatoren ble endret for å kunne tillate deteksjon av høyere verdier, og faktisk ble i noen tilfeller høyere verdier oppnådd her når de ble målt i senere uavhengige eksperimenter (se nedenfor).

Som et resultat av oppskalering av transfeksjonene kunne man plukke tre kolonier med det STAR-frie TTG Zeo konstruktet. Ekspresjonsnivåene for d2EGFP til disse koloniene var 475, 158 og 43, respektive. Den siste kolonien døde like etter den første målingen. Dette resultatet indikerer at TTG Zeo-konstruktet kan overføre zeocin-resistens, noe som resulterer i kolonier som også kan gi høye ekspresjonsnivåer i noen tilfeller. På denne måten kan den nye seleksjonsmåten, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, bli applisert med ekspresjonskassetter som ikke inneholder noen kromatinkontrollerende elementer, selv om det helt klart er foretrukket å anvende ekspresjonskassetter som består av minst ett slikt element, fortrinnsvis et STAR-element.

Resultatene indikerer at STAR-elementene tillater et mer stringent seleksjonssystem, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, slik som eksemplifisert i dette eksemplet, noe som resulterer i at man kan plukke kolonier som har et svært høyt gjennomsnittlig ekspresjonsnivå for protein.

Eksempel 11: Dannelse og testing av Blasticidin-d2EGFP bisistroniske konstrukter med forskjellige translasjonseffektiviteter

Det fines fire interne ATG-tripletter i blasticidin-resistensgenet, hvorav ingen koder for et metionin (Figur 25A). Disse ATG-sekvensene må likevel elimineres (Figur 25B), siden de vil tjene som startkodoner når ATG-startkodonet (eller konteksten av dette) har blitt modifisert, og dette vil resultere i peptider som ikke ligner blasticidin-resistensproteinet. Viktigere er det at disse ATG-triplettene vil hindre effektiv translasjon av genet av interesse, her representert av d2EGFP i dette eksemplet med illustrasjonsformål. For å eliminere de interne ATG-triplettene ble blasticidin-resistensproteinets åpne leseramme amplifisert med 4 primer-par, noe som skapte 4 fragmenter av blasticidin-resistens-proteinet. Primer-parene var som følger:

A) BSDBamHI-forward (SEQ. ID. NO. 96): GATCGGATCCACCATGG CCAAGCCTTTGTCTCAAG BSD150-reverse (SEQ. ID. NO. 97): GTAAAATGATATACGTTGACACCAG B) BSD150-forward (SEQ. ID. NO. 98): CTGGTGTCAACGTATATCATTTTAC BSD250-reverse (SEQ. ID. NO. 99): GCCCTGTTCTCGTTTCCGATCGCG C) BSD250-forward (SEQ. ID. NO. 100): CGCGATCGGAAACGAGAACAGGGC BSD350-reverse (SEQ. ID. NO. 101): GCCGTCGGCTGTCCGTCACTGTCC D) BSD350-forward (SEQ. ID. NO. 102): GGACAGTGACGGACAGCCGACGGC BSD399-reverse (SEQ. ID. NO. 103): GATCGAATTCTTAGCCCTCCCACAC GTAACCAGAGGGC

Fragmentene A til D ble isolert fra en agarosegel og blandet sammen. Deretter ble bare primerne SDBamHI-forward og BSD399-reverse benyttet for å skape fullengde-cDNA for blasticidin-resistensproteinet, men med alle de interne ATG-triplettene erstattet. Det rekonstituerte blasticidinet ble deretter kuttet med Eco-RI-BamHI, og klonet inn i pZEO-GTG-d2EGFP, kuttet med EcoRI-BamHI (som frigjør Zeo), noe som resulterte i pBSDmut-d2EGFP. Det komplette blasticidinresistensproteinets åpne leseramme ble så sekvensert for å kunne verifisere at alle ATG-triplettene var erstattet.

Med disse muterte genene som kodet for blasticidin-resistensproteinet (Blas), ble tre klasser av konstrukter laget (Figur 25C-E):

1) ATG som startkodon, men i en ugunstig kontekst etterfulgt av en spacersekvens. Det muterte blasticidin-resistensproteinets åpne leseramme i pBSD-d2EGFP ble amplifisert ved å anvende primerne

BSD-forward-BamHIAvrII-ATGmut/space (SEQ. ID. NO. 104): GATCG-GATCCTAGGTTGGTTTATGTCGATCCAAAGACTGCCAAATCTAGATCCGAGATTTTCAG-GAGCTAAGGAAGCTAAAGCCAAGCCTTTGTCTCAAGAAG, og

BSD399-reverse-EcoRIAvrII (SEQ. ID. NO. 105):

GATCGAATTCCCTAGGTTAGCCCTCCCACACGTAACCAGAGGGC, PCR-produktet ble kuttet med BamHI-EcoRI, ligert inn i pZEO-GTG-d2EGFP, og kuttet med EcoRI-BamHI. Dette resulterte i pBSD-ATGmut/space-d2EGFP.

2) GTG som startkodon i stedet for ATG. Det muterte blasticidin-resistensproteinets åpne leseramme i pBSD-d2EGFP ble amplifisert ved å anvende primerne

BSD-forward-BamHIAvrII-GTG (SEQ. ID. NO. 106):

GATCGGATCCTAGGACCGTGGCCAAGCCTTTGTCTCAAGAAG

og BSD399-reverse-EcoRIAvrII (SEQ. ID. NO. 105), PCR-produktet ble kuttet med BamHI-EcoRI, og ligert inn i pZEO-GTG-d2EGFP, og kuttet med EcoRI-BamHI. Dette resulterte i pBSD-GTG-d2EGFP.

3) TTG som startkodon i stedet for ATG. Den muterte åpne leserammen i pBSD-d2EGFP ble amplifisert ved å anvende primerne

BSD-forward-BamHIAvrII-TTG (SEQ. ID. NO. 107): GATCGGATCCTAGGACCTT-GGCCAAGCCTTTGTCTCAAGAAG

og BSD399-reverse-EcoRIAvrII (SEQ. ID. NO. 105), PCR-produktet ble kuttet med BamHI-EcoRI, og ligert inn i pZEO-GTG-d2EGFP, og kuttet med EcoRI-BamHI. Dette resulterte i pBSD-TTG-d2EGFP.

Resultater

CHO-K1-celler ble transfektert med konstrukter som inneholder GTG Blas (Figur 16A) og TTG Blas (Figur 16B)-genene som seleksjonsgener, der alle ble klonet oppstrøms for d2EGFP-reportergenet. Seleksjon skjedde i nærvær av 20 µg/ml blasticidin. De to konstruktene var uten STAR-elementer (Kontroll) eller med STAR-elementene 7 og 67 oppstrøms for CMV-promotoren og STAR7 nedstrøms for d2EGFP-genet (Figur 16). Figur 16 viser at både kontrollkonstruktene (uten STAR-elementer) med GTG Blas (A) og TTG Blas (B) ga kolonier som uttrykte d2EGFP- protein. Det gjennomsnittlige d2EGFP-signalet til 24 GTG Blas-kolonier var 14,0 (Figur 16A) og til TTG Blas koloniene 81,0 (Figur 16B). Dette høyere gjennomsnittlige ekspresjonsnivået i TTG Blas-koloniene kan reflektere den høyere stringensen til TTG, sammenlignet med GTG (se også Eksempel 9). Imidlertid overlevde bare 8 kolonier under mer stringente TTG-betingelser.

Tilføringen av STAR-elementene 7 og 67 til konstruktene resulterte i kolonier som oppviste høyere midlere d2EGFP ekspresjonsnivåer. Transfeksjon med GTG Blas STAR 7/67/7-konstruktet resulterte i kolonier med et gjennomsnittlig d2EGFP-ekspresjonsnivå på 972 (Figur 16A), som er en faktor på 6,9 ganger høyere enn gjennomsnittet i kontrollcellene (14.0). Tilføring av STAR-elementer til TTG Blaskonstruktet resulterte i et gjennomsnittlig d2EGFP-signal på 234,2 (Figur 16B), som er en faktor på 2,9 høyere enn gjennomsnittet for kontrollcellene (81). Imidlertid skal man igjen merke seg at bare 8 kolonier overlevde de tøffe seleksjonsbetingelsene til TTG Blas, mens 48 kolonier overlevde med TTG Blas STAR 7/67/7. Når bare de fem høyeste verdiene er sammenlignet, var gjennomsnittet av de fem høyeste TTG Blas på 109,1 og gjennomsnittet for de fem høyeste TTG Blas STAR 7/67/7 på 561,2, som er en faktor på 5,1 høyere.

Resultatene indikerer at STAR-elementer tillater et mer stringent seleksjonssystem, noe som resulterer i at man kan plukke kolonier som oppviser et svært høyt gjennomsnittlig ekspresjonsnivå for protein. De viser også at denne seleksjonen ikke er begrenset til zeocin-resistensproteinet alene, men at også andre seleksjonsmarkør-polypeptider, i dette tilfellet blasticidin-resisten-proteinet, kan anvendes.

Eksempel 12: Stabiliteten til d2EGFP-ekspresjonen i det nye seleksjonssystemet

Kolonier som beskrevet i Eksempel 10 ble videre dyrket under flere typer betingelser for å vurdere stabiliteten til d2EGFP-ekspresjonen over en utvidet tidsperiode.

Resultater

TTG Zeo STAR 7/67/7 inneholdende koloniene i Figur 15A ble dyrket i enda 70 dager i nærvær av 100 µg/ml zeocin. Som vist i Figur 17, steg det gjennomsnittlige d2EGFP-signalet fra 560,2 etter 35 dager til 677,2 etter 105 dager. Med unntak av noe sjeldne kolonier, oppviste alle koloniene et høyere d2EGFP-ekspresjonsnivå.

Da nivået av zeocin ble senket til 20 µg/ml zeocin, så man fortsatt en økning i det gjennomsnittlige d2EGFP-ekspresjonsnivået, fra 560,2 etter 35 dager til 604,5 etter 105 dager (Figur 18).

Da ikke noe seleksjonstrykk var til stede i det hele tatt, grunnet fjerningen av zeocin fra dyrkningsmediet, ble omtrent 50% av koloniene mosaiske, dvs. at det innenfor en koloni kom til syne celler som ikke uttrykte d2EGFP. Dette resulterte i en senkning av ekspresjonsnivåene for d2EGFP til mindre enn 50% av de opphavelige nivåene. Hvis signalet ble mindre enn 67% (en minskning på minst en tredjedel) fra det opphavelige signalet, ble kolonien ansett for å være ustabil med hensyn til d2EGFP-ekspresjon. Av de 57 originale koloniene forble 27 kolonier stabile, i henhold til dette kriteriet; det gjennomsnittlige d2EGFP-signalet til disse koloniene etter 35 dager (mens de fortsatt var under seleksjonstrykk) var på 425,6, mens det gjennomsnittlige d2EGFP-signalet uten seleksjonstrykk etter 65 dager var på 290,0. Da man målte etter 105 dager, var det gjennomsnittlige signalet i de 27 koloniene på 300,9. Således forble, etter en initiell senkning, ekspresjonsnivået til de 27 koloniene stabilt, i henhold til dette kriteriet (Figur 19).

Seks av koloniene ble underkastet en runde med subkloning. Cellene ble sådd ut i 96-brønners plater på en slik måte at hver brønn inneholdt omtrent 0,3 celler. Ikke noe zeocin var til stede i mediet, slik at subklonene fra starten kunne vokse uten seleksjonstrykk. Fra hver opphavelige koloni ble seks subkloner tilfeldig isolert og dyrket i 6-brønners plater inntil de ble analysert. I Figur 23 sammenlignet vi de opphavelige verdiene til de originale klonene, som allerede vist i Figur 15A, med en av subklonene. I en av de seks klonene (klon 25), fantes det ingen subkloner der d2EGFP-signalet var til stede i området for den opphavelige klonen. Imidlertid hadde, i fem av seks tilfeller, minst en av subklonene like d2EGFP-ekspresjonsnivåer som den opphavelige klonen. Disse ekspresjonsnivåene ble bestemt 50 dager etter uten seleksjonstrykk. Vi konkluderte derfor med at en runde med subkloning er tilstrekkelig til å oppnå et høyt antall kolonier som forblir stabile hva gjelder høy ekspresjon i fravær av seleksjonstrykk. Dette er blitt bekreftet i et lignende eksperiment (ikke vist).

Vi sammenlignet antallet kopier som integrerte seg i TTG Zeo STAR 7/67/7-koloniene. DNA ble isolert da koloniene hadde vært 105 dager under seleksjonstrykk fra zeocin (se Figur 17). Som vist i Figur 24 kunne to populasjoner skjelnes fra hverandre. I Figur 24 ble “cut off” gjort ved 20 kopier og R2-verdien kalkulert og vist. Også R2-verdien fra data med flere enn 20 kopier er vist. I området fra 100 til 800 d2EGFP-signaler var det en høyere grad av kopitallavhengighet, som antydet av en relativt høy R2-verdi på 0.5685 (Figur 24). Imidlertid ble, i en populasjon av kolonier som fluktuerer rundt et d2EGFP-signal på 800, observert en høy variasjon i kopitallet (Figur 24), som antydet av en lav R2-verdi på 0.0328. Sammen viser disse dataene at det, i det nye seleksjonssystemet, i kolonier som inneholder TTG Zeo STAR 7/67/7-konstrukter, forefinnes konstrukter der kopinummeravhengig d2EGFP-ekspresjon med opp til ~ 20 kopier. I tillegg, selv om kopitall-avhengigheten tapes når mer enn 20 (> 20) kopier er til stede, vil fortsatt en vesentlig del av koloniene med høyt (> 800) d2EGFP-signal ha mer enn 30 kopier (Figur 24). Denne kombinasjonen mellom høy d2EGFP-ekspresjon og lavt kopitall (mellom 10 og 30) kan være av viktighet for å kunne identifisere kolonier som fortsatt vil forbli relativt stabile uten seleksjonstrykk. Det er en fordel å ha kloner med et relativt lavt kopitall (mindre enn omtrent 30, mer foretrukket er rundt 20) som gir høye ekspresjonsnivåer, fordi slike kloner er troende til å være mindre påvirkelige av genetisk labilitet. Det foreliggende seleksjonssystemet tillater at det genereres slike kloner, inkludert kloner fra CHO-celler.

Eksempel 13: Dannelse og testing av zeocin-blasticidin-EpCAM bisistroniske konstrukter med forskjellige translasjonseffektiviteter

For å teste seleksjonssystemet for produksjonen av et antistoff, ble anti-EpCAM antistoffet (se også Eksempel 5) valgt ut som eksempel.

Resultater

Et plasmid ble dannet på hvilket både den tunge kjeden (HC) og lette kjeden (LC) ble plassert, hver i en separat transkripsjonsenehet (Figurene 20-22). Ekspresjon av begge kjedene ble drevet av CMV-promotoren. Oppstrøms for EpCAM-tungkjeden ble zeocin-resistensgenet plassert, enten med ATGmut/space (Figur 20), GTG (Figur 21) eller TTG (Figur 22) som startkodon (se Eksempel 9). Oppstrøms for EpCAM-lettkjeden ble blasticidin-resistensgenet plassert, enten med ATGmut/space (Figur 20), GTG (Figur 21) eller TTG (Figur 22) som startkodon (se Eksempel 11). To typer av konstrukter ble generert, ett konstrukt uten STAR-elementer (Kontroll) og ett konstrukt med en kombinasjon av STAR 7 og 67-elementer. STAR-elementene ble plassert som følger: oppstrøms for hver CMV-promotor (dvs. en for transkripsjonsenheten som består av HC og en for transkripsjonsenheten som består av LC) ble STAR 67 plassert og de resulterende konstruktene ble flankert av et 5’- og 3’- STAR 7-element (Figurene 20-22). Alle konstruktene ble transfektert over i CHO-K1-celler og selektert med 100 μg/ml Zeocin og 20 μg/ml Blasticidin (samtidig). Etter seleksjonen ble uavhengige kolonier isolert og propagert under kontinuerlig seleksjonstrykk (ved bruk av 100 µg/ml zeocin og 20 µg/ml blasticidin). Figur 20 viser at STAR 7/67/7-kombinasjonen hadde en fordelaktig effekt på produksjonen av EpCAM. ATGmut/ space Zeo og ATGmut/space Blas hadde ingen effekt på antallet av kolonier som ble dannet med plasmidene som inneholdt STAR-elementer eller ikke. Imidlertid varierte de gjennomsnittlige EpCAM-ekspresjonsnivåene for enten de 24 kontrollversus STAR 7/67/7-koloniene fra 0,61 pg/celle/dag i kontrollene til 3,44 pg/ celle/dag i STAR7/67/7-konstruktet (Figur 20). Dette er en faktor tilsvarende 5,6 gangers økning. Siden det var mange kolonier i ATGmut/space-kontrollen med 0 pg/celle/dag i ekspresjon, ble også den gjennomsnittlige EpCAM-produksjonen i de fem høyestproduserende koloniene sammenlignet. I kontroll ATGmut/space var denne 3,0 pg/celle/dag, versus 7,8 pg/celle/dag for ATGmut/space STAR 7/67/7-konstruktet, en økning med en faktor på 2,6.

Figur 21 viser også at STAR 7/67/7-kombinasjonen har en fordelaktig effekt på EpCAM-produksjonen, ved å bruke GTG-startkodonet for markørene. Med GTG Zeo og GTG Blas STAR 7/67/7-konstruktene ble omtrent 2 ganger flere kolonier dannet. Likeldes varierte de gjennomsnittlige EpCAM-ekspresjonsnivåene til hver av de 24 kontrollene versus de 24 STAR 7/67/7-koloniene fra 2,44 pg/celle/dag i kontrollene til 6,51 pg/celle/dag i STAR7/67/7-konstruktene (Figur 21). Dette er en faktor på 2,7 gangers økning. Også den gjennomsnittlige EpCAM-produksjonen i de fem høyestproduserende koloniene ble sammenlignet. I kontrollgruppen GTG var den 5,7 pg/celle/dag, versus 13,0 pg/celle/dag for GTG STAR 7/67/7 konstruktet, en økning med en faktor på 2,3. Det skal også bemerkes at den gjennomsnittlige EpCAM-produksjonen mediert via GTG-startkodonet for seleksjonsmarkørene bli signifikant høyere enn den som ble oppnådd via ATGmut/ space startkodonet.

Figur 22 viser at det med TTG Zeo and TTG Blas kontrollkonstruktene ikke ble dannet noen kolonier, dvs. i likhet med Eksempel 9. Med STAR 7/67/7 TTG-konstruktet ble det imidlertid dannet kolonier. De gjennomsnittlige EpCAM-ekspresjonsnivåene for STAR 7/67/7 TTG-koloniene var 10,4 pg/celle/dag (Figur 22). Dette er igjen høyere enn med ATGmut/space og GTG som startkodoner (se Figurene 20 og 21 for sammenligning). Den gjennomsnittlige EpCAM-produksjonen i de fem TTG STAR 7/67/7-koloniene som ga høyest utbytte, hadde en verdi på 22,5 pg/celle/dag.

Resultatene viser at seleksjonssystemet også kan anvendes på to simultant produserte polypeptider, i dette tilfellet to polypeptider tilhørende et multimerisk protein, casu quo et antistoff. EpCAM-produksjonen følger tett de resultatene som ble oppnåd med d2EGFP. TTG som startkodon er mer stringent enn GTG-startkodonet, som i sin tur er mer stringent enn ATGmut/space (se Figurene 12 og 13). Høyere stringens resulterer i et fallende antall av kolonier, med ingen kolonier i tilfellet av TTG kontrollen som ikke har noen STAR-elementer, og høyere stringens for seleksjonsmarkøren som er koblet til høyere ekspresjon av proteinet av interesse.

Eksempel 14: Dannelse og testing av ytterligere GTG zeocin-d2EGFP bisistroniske konstrukter med forskjellige translasjonelle effektiviteter Forskjellige versjoner av zeocin-resistensgenet med muterte startkodoner ble beskrevet i Eksempel 8. I tillegg til de beskrevne GTG-kodonene (Eksempel 8, Figur 33A), er ytterligere modifiserte startkodoner med distinkte translasjonelle effekti viteter mulig å oppnå. Disse forskjellige versjonene av zeocin-resistensgenet ble dannet (Figur 33) og klonet oppstrøms for det modifiserte d2EGFP-genet, som i Eksempel 9.

Materialer og Metoder

Dannelse av plasmider

Ytterligere fire GTG-konstrukter ble dannet:

1) GTG som et startkodon i Zeo-resistensgenet (Figur 33A), men etterfulgt av en spacersekvens (Figur 33B). Den mutspace-Zeo åpne leserammen ble amplifisert med primer-paret GTG-space-BamHIF (SEQ. ID. NO. 122):

GAATTCGGATCCACCGTGGCGATCCAAAGACTGCCAAATCTAG (hvori sekvensen som følger etter den understrekede sekvensen utgjør spacersekvensen), og ZEO-WT-reverse (SEQ. ID. NO. 85), PCR-produktet ble kuttet med EcoRI-BamHI, og ligert inn i pd2EGFP, kuttet med EcoRI-BamHI, noe som skapte pZEO-GTGspaced2EGFP.

2) GTG som startkodon i Zeo-resistensgenet, men i en ugunstig kontekst (TTTGTG) (Figur 33C). Den Zeo åpne leserammen ble amplifisert med primerparet ZEO-TTTGTG-Bam-HIF (SEQ. ID. NO. 123):

GAATTCGGATCCTTTGTGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTCCG og ZEO-WT-reverse (SEQ. ID. NO. 85), PCR-produktet ble kuttet med EcoRI-BamHI, og ligert inn i pd2EGFP, kuttet med EcoRI-BamHI, noe som skapte pZEO(leu)-TTTGTG-d2EGFP.

3) GTG som startkodon i Zeo-resistensgenet, i stedet for ATG (Figur 33A), men med ytterligere en mutasjon i Zeo’s åpne leseramme ved Pro9, som ble erstattet med treonin (Thr) (Figur 33D). Thr9-mutasjonen ble introdusert ved å amplifisere Zeo’s åpne leseramme med primer-paret ZEO-Forward-GTG-Thr9 (SEQ. ID. NO. 124): AATTGGATCCACCGTGGCCAAGTTGACCAGTGCCGT-TACCGTGCTC

og ZEO-WT-reverse (SEQ. ID. NO. 85), PCR-produktet ble kuttet med EcoRI-BamHI, og ligert inn i pd2EGFP, kuttet med EcoRI-BamHI, noe som dannet pZEO-GTG-Thr9-d2EGFP.

4) GTG som startkodon i Zeo’s resistensgen, i stedet for ATG (Figur 33A), men med ytterligere en mutasjon i Zeo’s åpne leseramme ved Pro9, som ble erstattet med fenylalanin (Phe) (Figur 33E). Phe9-mutasjonen ble introdusert ved amplifikasjon av Zeo’s åpne leseramme med primer-paret ZEO-Forward-GTGPhe9 (SEQ. ID. NO. 125): AATTGGATCCACCGTGGCCAAGTTGAC-CAGTGCCGTTTTCGTGCTC

og ZEO-WT-reverse (SEQ. ID. NO. 85), PCR-produktet ble kuttet med EcoRI-BamHI, og ligert inn i pd2EGFP, kuttet med EcoRI-BamHI, noe som skapte pZEO-GTG-Phe9-d2EGFP.

Transfeksjon, dyrking og analyse av CHO-celler

Transfeksjon, dyrking og analyse av CHO-K1-celler ble utført i Eksempel 8.

Resultater

CHO-K1-celler ble transfektert med konstrukter som inneholder GTG Zeo (Figur 33A), GTGspace Zeo (Figur 33B), TTT GTG Zeo (også kalt: GTGmut Zeo) (Figur 33C), GTG Thr9 Zeo(leu) (Figur 33D) og GTG Phe9 Zeo(leu) (Figur 33D)-genene som seleksjonsgener, hvorav alle ble klonet oppstrøms for d2EGFP reportergenet. Disse fem konstruktene var uten STAR-elementer (Kontroll) eller med STAR-elementene 7 og 67 oppstrøms for CMV-promotoren og STAR 7 nedstrøms for d2EGFP-genet (Figur 33). Figur 34 viser at av kontrollkonstrukter uten STAR-elementer ga bare GTG Zeo-konstruktet uten STAR-elementer kolonier som uttrykte d2EGFP-protein. I kontrast til dette ga alle konstruktene som inneholdt STAR-elementer, kolonier som uttrykte d2EGFP-protein. Det midlere d2EGFP-fluorescens-signalet fra 11 GTG Zeo Kontrollkolonier var 203, fra 13 GTG Zeokolonier med STARs 7/67/7 104,9, fra 24 GTG space Zeo 7/67/7-kolonier 201,5, fra 6 TTT GTG Zeo 7/67/7-kolonier 310,5, fra 22 GTG Thr9 Zeo 7/67/7-kolonier 423,0 og fra 16 GTG Phe9 Zeo-kolonier 550,2 (Figur 34).

De høyere stringensene til de nye GTG-mutasjonene korrelerer med høyere midlere fluorescenssignaler (Figur 34). TTT GTG Zeo 7/67/7, imidlertid, ga bare to høy-uttrykkende kolonier og noen få lav-uttrykkende kolonier. Dette kan indikere at denne mutasjonen befinner seg på kanten av den stringensen som disse cellene kan tåle med en fiksert konsentrasjon av zeocin tilsatt til dyrkningsmediet.

Thr9- og Phe9-mutasjonene influerer ikke på translasjonseffektiviteten til Zeomutantene. I stedet reduserer de funksjonaliteten til zeocin-resistensproteinet, ved å hindre en optimal interaksjon mellom to halvdeler av zeocin-resistensproteinet (Dumas et al., 1994). Dette medfører at mer av proteinet må produseres for å oppnå resistens mot zeocin i dyrkningsmediet. Som en konsekvens, må hele kassetten bli transkribert på et høyere nivå, noe som etter hvert resulterer i et høyere d2EGFP-ekspresjonsnivå.

Det kan derfor konkluderes at bruken av de beskrevne translasjonseffektivitetene til mRNA for zeocin-resistensen resulterer i høyere ekspresjonsnivåer av d2EGFP-proteinet, dette i kombinasjon med STAR-elementer.

Dette eksemplet demonstrerer videre muligheten for å sørge for en fininnstilling av stringensen til seleksjonssystemet til oppfinnelsen, i den hensikt å oppnå optimale ekspresjonsnivåer for proteinet av interesse. Tydeligvis vil en person som har dyktiggjort seg i faget, være kapabel til å kombinere disse og andre muligheter innenfor konseptene som er fremsatt i teksten (f.eks. mutere zeocin i posisjon 9 til en annen aminosyre, eller mutere det i andre posisjoner; benytte et GTG-eller et annet startkodon i en ikke-optimal kontekst for initiering av translasjon av zeocin eller andre seleksjonsmarkører; eller mutere andre seleksjonsmarkører for å kunne redusere deres funksjonalitet, f.eks. å bruke en sekvens som koder for et neomycinresistensgen som har en mutasjon i aminosyrerest 182 eller 261 eller begge (se f.eks. WO 01/32901)) og lignende, for å sørge for slik fininnstilling, og ved enkelt sagt å teste eller bestemme seg for en passende kombinasjon av særtrekk for seleksjonsmarkøren, noe som leder til økt ekspresjon av polypeptidet av interesse.

Eksempel 15: Dannelse og testing av ytterligere TTG zeocin-d2EGFP bisistroniske konstrukter med forskjellige translasjonelle effektiviteter

Forskjellige versjoner av zeocin-resistensgenet med muterte startkodoner ble beskrevet i Eksempel 8. Foruten de beskrevne TTG-kodonene (Figur 35A) er ytterligere modifiserte startkodoner med distinkte translasjonelle effektiviteter mulige. Disse forskjellige versjonene av zeocin-resistensgenet ble dannet og klonet oppstrøms for det modifiserte d2EGFP-genet (Figur 35).

Materialer og Metoder

Dannelsen av plasmider

Ytterligere tre TTG-konstrukter ble dannet:

1) TTG som et startkodon i Zeo-resistens-genet (Figur 35A), men etterfulgt av en spacersekvens (Figur 35B). Zeo’s åpne leseramme (med spacersekvensen) ble amplifisert med primer-paret TTG-space-BamHIF (SEQ. ID. NO. 126): GAATTCGGATCCACCTTGGCGATCCAAAGACTGCCAAATCTAG og ZEO-WT-reverse (SEQ. ID. NO. 85), PCR-produktet ble kuttet med EcoRI-BamHI, og ligert inn i pd2EGFP, kuttet med EcoRI-BamHI, noe som dannet pZEO-TTGspace-d2EGFP.

2) TTG som startkodon i Zeo-resistensgenet, i stedet for ATG (Figur 35A), men med ytterligere en mutasjon i Zeo’s åpne leseramme i posisjon Pro9, som ble erstattet med treonin (Thr) (Fig. 35C). Thr9-mutasjonen ble introdusert ved å amplifisere Zeo’s åpne leseramme med primer-paret ZEO-Forward-TTG-Thr9 (SEQ. ID. NO. 127): AATTGGATCCACCTTGGCCAAGTTGACCAGTGCCGT-TACCGTGCTC

og ZEO-WT-reverse (SEQ. ID. NO. 85), PCR-produktet ble kuttet med EcoRI-BamHI, og ligert inn i pd2EGFP, kuttet med EcoRI-BamHI, noe som dannet pZEO-TTG-Thr9-d2EGFP.

3) TTG som startkodon i Zeo-resistensgenet, i stedet for ATG (Figur 35A), men med ytterligere en mutasjon i Zeo’s åpne leseramme i posisjon Pro9, som ble erstattet med fenylalanin (Phe) (Figur 35D). Phe9-mutasjonen ble introdusert ved å amplifisere Zeo’s åpne leseramme med primer-paret ZEO-Forward-TTG-Phe9 (SEQ. ID. NO. 128): AATTGGATCCACCTTGGCCAAGTTGAC-CAGTGCCGTTTTCGTGCTC

og ZEO-WT-reverse (SEQ. ID. NO. 85), PCR-produktet ble kuttet med EcoRI-BamHI, og ligert inn i pd2EGFP, kuttet med EcoRI-BamHI, noe som dannet pZEO-TTG-Phe9-d2EGFP.

Resultater

CHO-K1 celler ble transfektert med konstrukter som inneholder TTG Zeo (Figur 35A), TTGspace Zeo (Figur 35B), TTG Thr9 Zeo (Figur 35C) and TTG Phe9 Zeo (Figur 35D)-genene som seleksjonsgener, hvorav alle blir klonet oppstrøms for d2EGFP-reportergenet. Disse fire konstruktene var uten STAR-elementer (Kontroll) eller med STAR-elementene 7 og 67 oppstrøms for CMV-promotoren og STAR 7 nedstrøms for d2EGFP-genet (Figur 35). Figur 36 viser at av kontrollkonstruktene uten STAR-elementer ga bare TTG Zeo konstruktet uten STAR-elementer kolonier som uttrykte d2EGFP-protein. I kontrast til dette ga alle konstruktene som inneholdt STAR-elementer, kolonier som uttrykte d2EGFP-protein. Det midlere d2EGFP-fluorescenssignalet fra 3 TTG Zeo Kontrollkolonier var 26,8, fra 24 TTG Zeo kolonier med STARs 7/67/7 426,8, fra 24 TTGspace Zeo 7/67/7-kolonier 595,7, fra 2 TTG Thr9 Zeo 7/67/7-kolonier hele 712,1 og fra 3 TTG Phe9 Zeo-kolonier hele 677,1 (Figur 36).

De høyere stringensene fra de nye TTG-mutasjonene korrelerte med høyere gjennomsnittlige fluorescenssignaler (Figur 36). TTG Thr9 Zeo 7/67/7 og TTG Phe9 Zeo 7/67/7 konstruktene ga imidlertid bare to høyproteinuttrykkende kolonier hver og noen få lavproteinuttrykkende kolonier. Dette kan indikere at disse mutasjonene befinner seg på kanten av den stringensen som cellene kan tåle med en fiksert konsentrajon av zeocin tilsatt til dyrkningsmediet.

Man har derfor konkludert med at bruken av det beskrevnee effektiviteten for translasjon av zeocin-resistensgenets korresponderende mRNA resulterer i høyere ekspresjonsnivåer av d2EGFP-protein, dette i kombinasjon med STAR-elementer.

Eksempel 16: Dannelse og testing av puromycin-d2EGFP bisistroniske konstrukter med forskjellige translasjonelle effektiviteter

Det forefinnes tre interne ATG-tripletter i puromycin-resistensgenet, hver av hvilke koder for et metionin (Figur 28 og Figur 37A). Disse ATG-sekvensene må elimineres (Figur 37B,C), siden de vil tjene som startkodoner når ATG-startkodonet (eller konteksten av dette) har blitt modifisert, og dette vil resultere i peptider som ikke ligner puromycin-resistensproteinet. Mer essensielt vil disse ATG-triplettene hindre effektiv translasjon av genet av interesse, som representert ved d2EGFP i dette eksemplet for illustrasjonsformål. Metioninene ble endret til leucin, som i zeocin-resistensproteinet (Eksempel 8). Imidlertid valgte man nå, i stedet for å anvende TTG-kodonet for leucin (f.eks. i zeocin i Eksempel 8), CTG-kodonet for leucin (i mennesker forefinnes eller brukes CTG-kodonet for leucin oftere enn TTG-kodonet). For å eliminere de interne ATG-sekvensene, ble puromycinresistens-proteinets åpne leseramme først amplifisert med 4 primer-par, noe som genererte 4 fragmenter av puromycin-resistensproteinet. Primer-parene var: PUROBamHIF (SEQ. ID. NO. 129): GATCGGATCCATGGTTACCGAG-TACAAGCCCACGGT,

PURO300RLEU (SEQ. ID. NO. 130): CAGCCGGGAACCGCTCAACTCGGCCAGG-CGCGGGC; og

PURO300FLEU (SEQ. ID. NO. 131): CGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGG-CCGCGCAGCAACAGCTGGAAGGCCTC,

PURO600RLEU (SEQ. ID. NO. 132): AAGCTTGAATTCAGGCACCGGGCTT-GCGGGTCAGGCACCAGGTC.

Dette genererte to PCR-produkter, som korresponderte med 5’- og 3’- delen av puromycin-resistens-genet. De to produktene ble satt sammen og amplifisert med PUROBamHIF (SEQ. ID. NO. 129) – PURO600RLEU (SEQ. ID. NO. 132). Det resulterende PCR-produktet ble kuttet med BamHI-EcoRI og ligert, noe som skapte pCMV-ATGPURO (leu). Sekvensering av denne klonen verifiserte at alle de tre interne ATG-triplettene hadde blitt omdannet. Den komplette åpne leserammen for puromycin ble så amplifisert med PUROBamHI TTG1F (SEQ. ID. NO. 133): GAATTCGGATCCACCTTGGTTACCGAGTACAAGCCCACGGTG og

PURO600RLEU (SEQ. ID. NO. 132). Denne primeren introduserer et ekstra kodon (GTT) direkte etter TTG-startkodonet, siden “G” i nukleotidposisjon 4 blir introdusert for å bibringe en optimal kontekst, og således blir de to nukleotidene introdusert for å bevare leserammen.

Resultater

CHO-K1-celler ble transfektert med konstruktet som inneholder TTG Puro (Figur 38)-genet som seleksjonsgen, klonet oppstrøms for d2EGFP-reportergenet. Seleksjon ble utført med 10 µg/ml puromycin til stede. Konstruktet var uten STAR-elementer (Kontroll) eller med STAR-elementene 7 og 67 oppstrøms for CMV-promotoren og STAR 7 nedstrøms for d2EGFP-genet (Figur 38). Figur 38 viser at det gjennomsnittlige d2EGFP-fluorescenssignalet fra 24 TTG Puro-Kontrollkolonier var på 379,0 og fra 24 TTG Puro-kolonier med STARs 7/67/7 på 75,5. Videre, når gjennomsnittet for de fem høyeste verdiene ble beregent, var d2EGFP-fluorescenssignalet fra TTG Puro Kontroll-koloniene på 69,5, og fra TTG Purokoloniene STARs 7/67/7 på 186,1, en nesten tre gangers økning i d2EGFP- fluorescenssignalet. Dette viser at den beskrevne, modifiserte translasjonseffektiviteten til puromycin-resistens-mRNA resultererte i høyere ekspresjonsnivåer av d2EGFP-protein, men da i kombinasjon med STAR-elementer.

Dette eksperimentet demonstrerer at puromycin-resistensgenet kan muteres for å fjerne ATG-sekvensene derfra, mens det fortsetter å være funksjonelt. Videre er det komkludert at seleksjonsmetoden til den foreliggende oppfinnelsen også fungerer med nok en seleksjonsmarkør, puromycin.

Eksempel 17: Dannelse og testing av neomycinkonstrukter med forskjellige translasjonelle effektiviteter

Det forefinnes seksten interne ATGs i neomycin-resistensgenet, hvorav fem av hvilke koder for et metionin i neomycinets åpne leseramme (Figur 31 og Figur 39A). Alle disse seksten ATG-triplettene vil måtte elimineres (Figur 39B,C), siden de ellers ville kunne tjene som startkodoner når ATG-startkodonet (eller konteksten for dette) har blitt forandret, og dette vil kunne resultere i peptider som ikke ligner neomycin-resistensproteinet, og da dette vil redusere translasjonen fra den nedstrøms beliggende åpne leserammen som koder for polypeptidet av interesse i transkripsjonsenhetene i den foreliggende oppfinnelsen. For å eliminere de interne ATGs, ble neomycin-resistensproteinets åpne leseramme syntetisert i sin komplette form ved hjelp av en kommersiell tilvirker (GeneArt, Germany), hvori alle interne kodende ATGs (som koder for Met) ble erstattet med CTGs (som koder for Leu), og ikke-kodende ATGs ble erstattet slik at degenererte kodoner ble anvndt, og dermed ikke resulterte i noen mutasjoner i proteinsekvensen; den syntetiserte sekvensen til neomycin er angitt i SEQ. ID. NO. 134. I den hensikt å erstatte ATG start-kodonet med GTG (Figur 39B) eller TTG (Figur 39C), ble det syntetiserte genet amplifisert med primer-parene NEO-F-HindIII (SEQ. ID. NO. 136): GATCAAGCTTTTGGATCGGCCATTGAAACAAGACGGATTG og

NEO-EcoRI-800R (SEQ. ID. NO. 137): AAGCTTGAATTCTCAGAAGAACTCGT-CAAGAAGGCG.

Resultater

E.coli-bakterier ble anvendt for å teste funksjonaliteten til neomycin-resistensproteinet fra hvilket alle ATGs var blitt fjernet. E.coli-bakterier ble transformert med konstruktet som ikke inneholder GTG Neo (Figur 39B) eller TTG Neo (Figur 39C)-genet som seleksjonsgener. Seleksjon fant sted ved hjelp av bakterier som ble dyrket under nærvær av kanamycin. Bare et funksjonelt neomycinresistensgen kan bibringe resistens mot kanamycin. Transformasjon med enten modifisert Neo-gen resulterte i dannelse av E.coli-kolonier, fra hvilke plasmidet som inneholder genet kunne isoleres. Dette viser at den beskrevne, modisiserte translasjonelle effektiviteten til neomycin-resistens-mRNAs, så vel som fjerning av alle ATGs fra Neo’s åpne leseramme resulterer i produkson av funksjonelt neomycin-resistensprotein.

De muterte neomycin-resistensgenene ble inkorporert i en multisistronisk transkripsjonsenhet, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, og benyttet til å selektere med G418 eller neomycin i eukaryote vertsceller.

Eksempel 18: Dannelse og testing av dhfr-konstrukter med forskjellige translasjonelle effektiviteter

Det forefinnes åtte interne ATGs i dhfr-genet, seks av hvilke koder for et metionin i den åpne leserammen for dhfr (Figur 29 og Figur 40A). Alle disse ATGs vil måtte eleimineres (Figur 40B,C), siden de vil kunne tjene som startkodoner når ATG-startkodonet (eller konteksten til dette) har blitt modifisert, og det ville kunne resultere i peptider som ikke ligner på dhfr-proteinet, og som vil kunne senke translasjonsnivået fra den nedstrøms beliggende åpne leserammen som koder for polypeptidet av interesse i transkripsjonsenheten, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen. For å eliminere de interne ATGs, ble dhfr-proteinets åpne leseramme syntetisert i sin helhet (SEQ. ID. NO. 138), som beskrevet ovenfor for neomycin. I den hensikt å erstatte ATG-startkodonet med GTG (Figur 40B) eller TTG (Figur 40C), ble det syntetiserte DHFR-genet amplifisert med primerne DHFR-F-HindIII (SEQ. ID. NO. 140): GATCAAGCTTTTGTTCGACCATTGAACTGCATCGTC og DHFR-EcoRI-600-R (SEQ. ID. NO. 141): AGCTTGAATTCTTAGTCTTTCTTCTCG-TAGACTTC.

Resultater

E.coli-bakterier ble avbenyttet for å teste funksjonaliteten til dhfr-proteinet fra hvilket alle ATGs var blitt fjernet. E.coli ble transformert med konstrukter som inneholder GTG dhfr (Figur 40B) eller TTG dhfr (Figur 40C)-genet. Seleksjon fant sted ved å dyrke bakteriene under nærvær av trimetoprim (Sigma T7883-56). Bare et funksjonelt dhfr-gen kan bibringe resistens mot trimetoprim. Transformasjon med hver av de modifiserte dhfr-genene resulterte i dannelsen av of E.colikolonier, fra hvilke plasmidet som inneholder genet kunne isoleres. Dette viser at de beskrevne, modifiserte translasjonelle effektivitetene til dhfr-mRNAs, så vel som fjerning av alle ATGs fra den åpne leserammen til dhfr, resulterte i produksjonen av funksjonelt dhfr-protein.

De muterte dhfr-genene ble inkorporert i multisistroniske transkripsjonsenheter, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, og benyttet til å selektere ved hjelp av metotreksat i eukaryote vertsceller.

Eksempel 20: Testing av zeocin- and blasticidinkonstrukter med forskjellige translasjonelle effektiviteter i PER.C6-celler

Forskjellige zeocin- og blasticidingener med muterte startkodoner, alle klonet oppstrøms for d2EGFP-genet ble testet i PER.C6-cellelinjen.

Resultater

GTG zeocin og GTGspace zeocin resistensgenenes modifikasjoner (se også Eksempel 14; Figur 41) og GTG blasticidin and TTG blasticidin resistengenenes modifikasjoner (se også Eksempel 11; Figur 42), alle klonet oppstrøms for d2EGFP-genet ble transfektert inn i PER.C6-celler. Som vist i Figur 41, resulterte transfeksjon med både GTG zeocin og GTGspace zeocingenene i kolonier som uttrykte d2EGFP. Det gjennomsnittlige d2EGFP fluorescenssignalet fra 20 GTG Zeokolonier var på 63,8, mens det gjennomsnittlige d2EGFP-signalet fra 20 GTGspace Zeo-kolonier var på 185, noe som demonstrerte at også i PER.C6-celler har GTGspace Zeo en høyere translasjonsstringens enn GTG Zeo mRNA.

Som vist i Figur 42, resulterte transfeksjon med GTG blasticidin og TTG blasticidingenene i kolonier som uttrykte d2EGFP. Det gjennomsnittlige d2EGFP fluorescenssignalet fra 20 GTG blasticidinkolonier var på 71,4, mens det gjennomsnittlige d2EGFP fluorescenssignalet fra 20 TTG blasticidinkolonier var på 135, noe som demonstrerer at også i PER.C6-celler hadde TTG blasticidin mRNA en høyere translasjonell stringens enn the GTG blasticidin mRNA.

Dette eksemplet demonstrerer at seleksjonssystemet, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, også kan benyttes i andre celler enn CHO-celler.

Eksempel 21: Testing av tilføyelse av et transkripsjonelt pausesignal til et TTG Zeocin-d2EGFP konstrukt

En TRAnskripsjons-Pause (TRAP)-sekvens er tiltenkt, i det minste delvis, å kunne hindre dannelsen av antisens RNA eller, i det minste delvis, å kunne hindre en transkripsjon i å entre nevnte transkripsjonsenhet (se WO 2004/055215). En TRAP-sekvens er funksjonelt definert som en sekvens som, når den er plassert inne i en transkripsjonsenhet, resulterer i et redusert nivå for transkripsjon i den nukleinsyren som er til stede på 3’-siden av TRAP når man sammenligner med nivået for transkripsjon observert i en nukleinsyre på 5’-siden av TRAP, og ikkebegrensende eksempler av TRAP-sekvenser er signaler for terminering av transkripsjon. I den hensikt å kunne funksjonere for å hindre eller redusere transkripsjonen i å entre transkripsjonsenheten, vil TRAP måtte bli plassert oppstrøms for en promotor som driver ekspresjonen til tranksripsjonsenheten og TRAP burde befinne seg i en 5’- til 3’-retning. I den hensikt å hindre, i det minste delvis, dannelsen av antisens RNA, burde TRAP lokaliseres nedstrøms for den åpne leserammen i en transkripsjonsenhet og være til stede i en 3’- til 5’-retning (dvs. i en motsatt orientering i forhold til den normale orienteringen til en transkripsjonell termineringssekvens som vanligvis befinner seg bak den åpne leserammen i en transkripsjonsenhet). En kombinasjon av en TRAP oppstrøms beliggende for promotoren i en 5’- til 3’-orientering og en TRAP nedstrøms beliggende for den åpne leserammen i en 3’- til 5’-orientering er å foretrekke. Å tilføye en TRAP-sekvens til et STAR-element forbedrer effektene av STAR-elementet på ekspresjon av transgener (se WO 2004/055215). Her testet vi effektene av TRAP-sekvensen i konteksten av TTG Zeo resistens- genet.

Resultater

TTG Zeocin-d2EGFP-kassetten som ble flankert av STAR7-elementer (Figur 43) ble modifisert ved å tilføye SPA/pause TRAP sekvensen (se WO 2004/055215); SEQ. ID. NO. 142), begge oppstrøms beliggende for 5’-STAR7 (i 5’- til 3’-retning) og nedstrøms beliggende for 3’-STAR7 (i 3’- til 5’-retning) (Figur 43). Begge STAR 7/7 og TRAP-STAR 7/7-TRAP inneholdende vektorene ble transfektert inn i CHO-K1-celler. Stabile kolonier ble isolert og d2EGFP-fluorescensintensiteten ble målt. Som vist i Figur 43, var det gjennomsnittlige d2EGFP fluorescenssignalet fra 23 TTG Zeo STAR 7/7-kolonier på 455,1, mens det gjennomsnittlige d2EGFP-fluorescenssignalet fra 23 TTG Zeo TRAP-STAR 7/7-TRAP-kolonier var på 642,3. Det gjennomsnittlige d2EGFP-fluorescenssignalet fra de 5 koloniene av typen TTG Zeo STAR 7/7 som ga høyest fluorescens, var på 705,1, mens det gjennomsnittlige d2EGFP-fluorescenssignalet fra de 5 koloniene av typen TTG Zeo TRAP-STAR 7/7-TRAP som ga høyest fluorescens, var på 784,7.

Disse resultatene indikerer at tilføyelsen av TRAPs ikke øker d2EGFP-fluorescenssignalet i de koloniene som fra før avgir høyest flourescens, men at det foreligger en signifikant økning i antallet av høy-uttrykkende kolonier. Mens bare 5 TTG Zeo STAR 7/7-kolonier oppviste et d2EGFP-signal på over 600, viste det seg at hele 17 TTG Zeo TRAP-STAR 7/7-TRAP-kolonier hadde et d2EGFP- fluorescenssignal på over 600.

I eksperimentet ble 3 µg DNA fra hvert plasmid transfektert. Imidlertid, mens transfeksjonseffektiviteten var lik, var det totale antallet av kolonier oppnådd med TTG Zeo STAR 7/7-plasmidet 62, mens det totale antallet av kolonier oppnåd ved hjelp av TTG Zeo TRAP-STAR 7/7-TRAP-plasmidet var 116, noe som utgjorde en tilnærmet fordobling.

Vi konkluderer derfor med at tilføyelsen av TRAP-elementer til STAR-inneholdende plasmider med modifiserte zeocin-resistens-genrelaterte translasjonelle kodoner resulterer i et betydelig høyere signifikant antall kolonier, og at flere kolonier er til stede med høyest mulig oppnåelige ekspresjonsnivåer.

Eksempel 22: Kopitallavhengighet for ekspresjonen

Vi analyserte ekspresjonsnivåene for EpCAM-entistoffet i sammenheng med antallet av integrerte EpCAM-DNA-kopier.

Resultater

Konstruktet som ble testet var TTG-Zeo-Light Chain (LC)-TTG-Blas-Heavy Chain (HC), hvorav begge enhetene sto under kontroll av CMV-promotoren (se Figur 44). Dette konstruktet inneholdt STAR 7 og 67 (se Figur 44). Seleksjonsbetingelsene var arrangert slik at det med 200 µg/ml zeocin og 20 µg/ml blasticidin i kulturmediet ikke noen kontrollkolonier (ingen STARs) overlevde, mens bare kolonier av typen STAR 7/67/7 overlevde.

DNA ble isolert da koloniene hadde vært underkastet 60 dagers seleksjonstrykk med zeocin and blasticidin (se Figur 44). R2-verdien ble kalkulert og er vist i figuren. I hele området fra 5 til 40 pg/celle/dag, viste EpCAM en stor grad av kopitallavhengighet, som tilkjennegitt av en relativt høy R2-verdi på 0.5978 (Figur 44). Dataene viser at det, i det nye seleksjonssystemet for kolonier som inneholder TTG Zeo-TTG Blas EpCAM STAR 7/67/7-konstrukter, eksisterer en kopitallavhengig EpCAM-ekspresjon.

Eksempel 23: Metotreksatinduksjon av høyere EpCAM-ekspresjon

Vi analyserte ekspresjonen av EpCAM-antistoffnivåene oppnådd i nærvær av metotreksat (MTX). Hensikten med dette eksperimentet var å bestemme hvorvidt amplifikasjon av et STAR-inneholdende konstrukt ville kunne resultere i høyere EpCAM-ekspresjon. MTX agerer gjennom inhibering av dhfr geneproduktet. Siden noen CHO-stammer som mangler dhfr har blitt beskrevet, er CHO-K1-cellene anvendt her betegnet som dhfr+. Derfor må relativt høye konsentrasjoner av MTX i dyrkningsmediet være til stede for å selektere for amplifikasjon via økte nivåer av MTX i CHO-K1-celler.

Resultater

Konstruktet som ble testet var TTG-Zeo-Heavy Chain (HC)-TTG-Blas-Light Chain (LC), hvorav begge ekspresjonsenhetene befant seg under kontroll av CMV-promotoren. Oppstrøms beliggende for hver CMV-promotor var STAR67 posisjonert, og STAR7 ble benyttet til å flankere hele kassetten (se også Eksempel 13, Figur 22 for et slikt konstrukt). Dette konstruktet ble videre modifisert ved å plassere en SV40-dhfr-kassett (et murint dhfr-gen under kontroll av en SV40promotor) mellom HC og LC kassettene, oppstrøms beliggende for den andre STAR67-eneheten (Figur 45). CHO-K1-celler ble transfektert. Seleksjon ble utført med 100 µg/ml zeocin og 10 µg/ml blasticidin i dyrknings-mediet. Ingen kontrollkolonier (uten STAR-elementer) overlevde og bare kolonier med konstrukter som inneholder STAR-elementer overlevde. Kolonier ble isolert og propagert før man målte EpCAM-ekspresjonsnivåene. Seks kolonier som produserte mellom 20 og 35 pg/celle/dag, ble overført til medium som inneholdt 100 nM MTX. Denne konsentrasjonen ble økt til 500 nM, 1000 nM og endelig til 2000 nM med to ukers mellomrom mellom hvert trinn. Etter to uker på 2000 nM MTX, ble EpCAM-konsentrasjonene målt. Som angitt i Figur 45, viste fire kolonier økt EpCAM-produksjon. Koloni 13: fra 22 til 30; koloni 14: fra 28 til 42; koloni 17: fra 20 til 67 og koloni 19: fra 37 til 67 pg/celle/dag. Koloniene 4 og 16 viste ingen forøkt EpCAM-ekspresjon. Vi konkluderte derfor med at tilsats av metotreksat til dyrkningsmediet for CHO-K1-kolonier, skapt ved seleksjonssystemet til den foreliggende oppfinnelsen, kan resultere i økt proteinekspresjon. På denne måten kan STAR-elementer og seleksjonsmetoden, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, kombineres med og er kompatible med MTX-indusert forøkning av nivåene for proteinekspresjon.

Eksempel 24: TTG-Zeo seleksjon opererer i konteksten av forskjellige promotorer

Vi analyserte nivåene for d2EGFP-ekspresjon i konteksten til TTG Zeo selesksjonsmarkøren og forskjellige promotorer. Vi sammenlignet effekten av STAR-elementer i konteksten med CMV-enhanceren/promotoren, SV40-enhanceren/promotoren og CMV-enhanceren/ β-actinpromotoren.

Resultater

I Figur 46 indikerte vi at promotorene ble testet i konteksten av TTG Zeo seleksjonsmarkøren. De testede plasmidene besto av de indikerte kontrollkonstruktene med tre forskjellige promotorer og STAR-konstrukter som ble flankert av STAR 7 og STAR 67 ved 5’-enden og STAR 7 ved 3’-enden. Konstruktene ble transfektert over i CHO-K1-celler og seleksjon ble utført med 200 µg/ml zeocin i dyrkningsmediet. Opp til 23 uavhengige kolonier ble isolert og propagert før analyse av d2EGFP-ekspresjonsnivåene ble gjennomført. Som vist i Figur 46, resulterte inkorporering av STAR-elementer i konstruktene med CMV- enhanceren/ promotoren, SV40-enhanceren/promotoren eller CMV-enhanceren/ β-actinpromotoren alle i dannelse av kolonier med høyere ekspresjonsnivå for d2EGFP enn med de korresponderende kontroll-konstruktene. Dette viser at seleksjonssystemet, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, i kombinasjon med STAR-elementer, opererer godt i konteksten av forskjellige promotorer. Videre analyse viste at gjennomsnittet for CMD-drevne d2EGFP-verdier var signifikant høyere enn enn midlere SV40-drevne d2EGFP-verdier (p < 0,05). I kontrast til dette var de midlere CMV-drevne d2EGFP-verdiene ikke signifikant forskjellige fra de CMV/ β-actin-drevne d2EGFP-verdiene (p = 0,2).

Eksempel 25: Sammenligning av forskjellige STAR-elementer i TTG-Zeo seleksjonssystemet

Vi analyserte d2EGFP-ekspresjonsnivåene i konteksten for CMV promotor-TTG Zeo seleksjonsmarkøren og 53 forskjellige STAR-elementer, for å oppnå en bedre innsikt in hvilke STAR-elementer som gir best resultater i denne konteksten.

Resultater

Vi klonet 53 STAR-elementer opp- og nedstrøms for CMV- promotor-TTG Zeod2EGFP-kassetten. Følgende STAR-elementer ble testet i slike konstrukter:

STAR2-12, 14, 15, 17-20, 26-34, 36, 37, 39, 40, 42-49, 51, 52, 54, 55, 57-62, 64, 65 og 67. Konstruktene ble transfektert inn i HO-K1-celler og seleksjon ble utført med 200 µg/ml zeocin i dyrkningsmediet. Opp til 24 uavhengige kolonier ble isolert og propagert før analyse av d2EGFP-ekspresjonsnivåene ble gjennomført. Inkorporering av STAR-elementer i kontruktene resulterte i forskjellige grader av økt d2EGFP-ekspresjon, sammenlignet med kontrollen. Inkorporering av STAR-elementene 14, 18 and 55 i dette eksperimentet resulterte ikke i en økning av gjennomsnittlig d2EGFP-ekspresjon over kontrollen (ikke noe STAR-element). Selv om noen konstrukter (med STAR-elementene 2, 3, 10, 42, 48 og 49) i dette eksperimentet fører til bare noen få kolonier, resulterte alle STAR-elementene med unntak av 14, 18 and 55 i gjennomsnittlige høyere ekspresjonsnivåer for d2EGFP enn hva kontrollene gjorde. Det bør bemerkes at noen STAR-elementer kan virke i flere celletyper på en særskilt måte og at det er mulig at STAR 14, 18 og 55 fungerer bedre i andre celletyper, med andre promotorer, andre seleksjonsmarkører, eller i forskjellige kontekster eller konfigurasjoner enn i det spesielle settet av betingelser som ble testet her. Tiføyelse av 10 STAR-elementer, nemlig STAR-elementene 7, 9, 17, 27, 29, 43, 44, 45, 47 og 61, induserer gjennomsnittlige nivåer for d2EGFP-ekspresjon høyere enn 5 ganger over det gjennomsnittlige d2EGFP-ekspresjonsnivået til kontrollene. Vi tranformerte kontrollen og 7 konstrukter med STAR-elementer og repeterte eksperimentet. Resultatene er vist i Figur 47. Inkorporering av STAR-elementer i konstruktene resulterte i varierende grad av økt d2EGFP-ekspresjon sammenlignet med kontrollen (Figur 47). Det gjennomsnittlige nivået for d2EGFP-ekspresjon i kolonier transfektert med kontrollkonstruktet var 29. Gjennomsnittene for d2EGFP-ekspresjonsnivåene i kolonier med de 7 forskjelleige STAR-konstruktene er rangert mellom 151 (STAR 67) og 297 (STAR 29). Dette er en faktor på 5 til 10 ganger høyere enn gjennomsnittet i kontrollkoloniene.

Vi konkluderer derfor med at a) den største majoriteten av STAR-elementer har en positiv effekt på genenskspresjonsnivåene, b) det forefinnes en variasjon i graden av positive effekter indusert av de forskjellige STAR-elementene, og c) 10 av 53 testede STAR-elementer induserer mer enn 5 ganger gjennomsnittlige d2EGFP-ekspresjons-nivåer, sammenlignet med kontrollen, og at STAR-elementene kan indusere et 10 ganger høyere ekspresjonsnivå for d2EGFP sammenlignet med kontrollen.

Eksempel 26: Andre kromatinkontrollerende elementer i konteksten av et seleksjonssystem, som beskrevet i oppfinnelsen

DNA-elementer slike som det HS4-hypersensitive setet i locus-kontroll-regionen til kylling β-globin-locus (Chung et al., 1997), matrix-“attachment”-regioner (MAR) (Stief et al., 1989) og “ubiquitous chromatin opening element” (UCOE) (Williams et al., 2005) har blitt rapportert å ha fordelaktige effekter på genekspresjon når disse DNA-elementene blir inkorporert i en vektor. Vi kombinerte disse DNA-elementene med seleksjonssystemet, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen.

Resultater

Det 1,25 kb store HS4-elementet ble klonet inn i kassetten som inneholdt CMV-promotoren, TTG Zeo og d2EGFP ved hjelp av et treveis ligeringstrinn for å oppnå et konstrukt med en tandem av to HS4 elementer (Chung et al., 1997). Dette trinnet ble utført både for 5’- og for 3’-enden av kassetten som favnet CMV-promotoren, TTG Zeo og d2EGFP.

Den 2959 bp lange kyllingavledete lysozymale MAR (Stief et al., 1989) ble klonet 5’- og 3’- inn i kassetten som inneholdt CMV-promotoren, TTG Zeo og d2EGFP.

Den 2614 bp lange UCOE (Williams et al., 2005) var et NotI-KpnI-fragment, som ble kuttet ut fra en human BAC-klon (RP11-93D5), og som korresponderte med posisjon 29449 til 32063. Dette fragmentet ble klonet i 5’-retning for CMV-promotoren.

STAR-konstruktet inneholdt STAR7 og STAR67 i 5’-retning for CMV-promotoren og STAR7 i 3’-retning for kassetten. Disse fire konstruktene, så vel som kontrollkonstruktet uten flankerende kromatinkontrollerende DNA-elementer, ble transfektert inn i CHO-K1-celler. Seleksjon ble utført med 200 µg/ml zeocin i dyrkningsmediet. Kolonier ble isolert, propagert og nivået for d2EGFP-ekspresjon ble målt. Som vist i Figur 48, resulterte alle DNA-elementene i dannelse av d2EGFP-uttrykkende kolonier. Imidlertid resulterte inkorporering av 2xHS4-elementet og UCOE ikke i dannelse av kolonier som oppviste høyere nivåer for d2EGFP-ekspresjon sammenlignet med kontrollkolonier. I kontrast til dette resulterte inkorporering av lysozym-MAR i dannelsen av kolonier som uttrykte signifikan høyere d2EGFP-nivåer. Det gjennomsnittlige ekspresjonsnivået indusert av MAR-inneholdende konstrukter var 4 ganger høyere enn i kontrollkoloniene. Best resultater ble imidlertid oppnådd ved inkorporering av STAR 7 og 67 i konstruktet. En tilnærmet 10-fold økning i midlere d2EGFP-ekspresjonsnivået ble observert sammenlignet med kontrollkoloniene.

Vi konkluderer derfor med at andre kromatinkontrollerende DNA-elementer slik som MARs kan anvendes i konteksten av seleksjonssystemet, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen. Imidlertid ble de beste resultatene oppnåd når STAR-elementer ble benyttet som kromatinkontrollerende element.

BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figur 1. Skjematisk diagram over transkripsjonsenhetene uten STAR-elementer. A) Bisistronisk gen som inneholder (fra 5’- til 3’-ende) et transgen (som koder f.eks.vis d2EGFP-genet), en IRES og en selektabel markør (zeo, som bibringer zeocin-resistens) under kontroll av CMV-promotoren. Ekspresjonsenheten har den SV40 transkripsjonelle terminator ved sin 3’-ende (t). Navnet til konstruktet er CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV Kontroll).

B) Konstrukt som i A, men nå er STAR 67 klonet oppstrøms for CMV-promotoren. Navnet på konstruktet er STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV-STAR67).

C) Konstrukt som i B, men oppstrøms og nedstrøms STAR7-elementer er klonet for å flankere hele konstruktet. Navnet på konstruktet er STAR7-STAR67-CMVd2EGFP-ires-Zeo-STAR7 (CMV-STAR67 7/7).

Figur 2. STAR67 forbedrer CMV-drevet d2EGFP-ekspresjon i CHO-celler.

Gjennomsnittet for d2EGFP-signalet for 10 uavhengige stabile kolonier er plottet for de indikerte konstruktene i CHO-celler. A) CMV Kontroll; B) STAR67-CMV. X(10): gjennomsnittlige d2EGFP-ekspresjonsnivåer for de 10 koloniene. Se Eksempel 2 for detaljer.

Figur 3. STAR67 forbedrer EF1 α-drevet d2EGFP-ekspresjon i CHO-celler. Samme som Figur 2, men nå med EF1α-promotor. A) EF1 α Kontroll; B) STAR67- EF1 α.

Figur 4. STAR67 forbedrer UB6-drevet d2EGFP-ekspresjon i CHO-celler. Samme som Figurene 2 og 3, men nå med UB6-promotoren. A) UB6 Kontroll; B) STAR67-UB6.

Figur 5. STAR67 forbedrer CMV-drevet d2EGFP-ekspresjon i PER.C6-celler.

Samme som Figur 2, men nå i PER.C6-celler. A) CMV Kontroll; B) STAR67-CMV.

Figur 6. STAR67 forbedrer EF1 α-drevet d2EGFP-ekspresjon i PER.C6-celler.

Samme som Figur 3, men nå i PER.C6-celler. A) EF1 α Kontroll; B) STAR67-EF1 α.

Figur 7. STAR67 forbedrer UB6-drevet d2EGFP-ekspresjon i PER.C6-celler. Samme som Figur 4, men nå i PER.C6-celler. A) UB6 Kontroll; B) STAR67-UB6.

Figur 8. STAR67 forbedrer SV40-drevet d2EGFP-ekspresjon i CHO-K1-celler i kombinasjon med et annet STAR-element. Ligner Figur 2, men det blir nå benyttet en SV40-promotor i CHO-celler og de indikerte konstruktene. Gjennomsnittet av d2EGFP-signalet er plottet for 18-20 uavhengige stabile kolonier 60 dager etter transfeksjon. A) SV40 Kontroll, SV40-STAR67, SV40-STAR7/7; B) SV40 Kontroll og SV40-STAR67 7/7. Se Eksempel 4 for detaljer.

Figur 9. STAR67 forbedrer UB6-drevne ekspresjonsnivåer av EpCAM-antistoffet i CHO-K1-celler. Se Eksempel 5 for detaljer. A) konstrukter uten STAR-elementer; B) konstrukter med STAR67 oppstrøms for promotor og flankerende STAR7-elementer. Anti-EpCAM antistoffkonsentrasjonen er presentert som pg/celle/dag. X(18): gjennomsnittlig produksjonsnivå fra de 18 koloniene.

Figur 10. STAR67 er ikke en forsterker-blokker, mens STAR 6 og 7 er det. Se Eksempel 6 for detaljer.

Figur 11. STAR67 øker UB6- og CMV-drevne antistoffekspresjonsnivåer i stabilt transfekterte CHO-celler. Se Eksempel 7 for detaljer. A) enkeltstående DNA-molekyl som innneholder anti-EpCAM tungkjede (HC) og lettkjede (LC), hver av disse bak en promotor og hver også knyttet til et forskjellig selektabelt markørgen (samtidig seleksjon ble benyttet for begge markørene): konstrukt uten STAR-elementer. Ingen kolonier ble funnet; B) samme konstrukt med STAR67 mellom de to promotorene. Anti-EpCAM antistoffkonsentrasjonen er presentert som pg/celle/dag. X(19): gjennomsnittlig produksjonsnivå fra de 19 koloniene.

Figur 12. Skjematisk representasjon av bruken av et selektabelt markørgen (zeocin-resistensgenet), i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelsen. A. villtype zeocin-resistensgenet, som har bibeholdt sitt normale sete for translasjonsinitiering (ATG-startkodonet) og ett internt ATG-kodon, som koder for metionin. B. mutant zeocin-resistensgenet, hvori den interne ATG-tripletten har blitt mutert til et kodon for leucin; denne mutanten er et funksjonelt zeocin-resistensgen. C. samme som B, men bestående av et mutert sete for initiering av translasjon, hvori konteksten til ATG-startkodonet har blitt mutert til å redusere translasjonsinitieringen. D. samme som B, men bestående av et mutert startkodon (GTG). E. samme som B, men med et TTG-startkodon. Tallene under figurene C-E indikerer skjematisk en relativ størrelse for initieringsfrekvens (under startkodonet) og “scanne-gjennom”-frekvens (under den kodende sekvensen) oppvist av ribosomene, men bare på en semi-kvantitativ måte, dvs. at de indikerer effektiviteten av translasjonsinitiering sammenlignet med hverandre, men de kvalitative tallene kan avvike fullstendig fra hverandre: tallene tjener bare den hensikt å kunne forklare oppfinnelsen. Se Eksempel 8 for detaljer.

Figur 13. Skjematisk representasjon av en multisistronisk enhet, I samsvar med den foreliggende oppfinnelsen, med mer eller mindre resiprok gjensidig avhengig translasjonseffektivitet. Forklaring som for Figur 12, men nå har et GFP-gen (her gitt som eksempel på et gen av interesse) blitt plassert nedstrøms for den kodende sekvensen for det selektable markørpolypeptidet. Zeocin-resistensgenet består av den interne Met →Leu mutasjonen (se Figur 12B). Se Eksempel 9 for detaljer.

Figur 14. Resultater fra seleksjonssystemet, i samsver med den foreliggende oppfinnelsen, med og uten STAR-elementer. A. zeocin-resistensgenet med ATG startkodonet i en dårlig kontekst (referert til som “ATGmut” i bildet, men inklusive en spacer-sekvens bak ATG-tripletten i den dårlige konteksten, herved generelt referert til i teksten som “ATGmut/space”). B. zeocin-resistensgenet med GTG-startkodonet. C. zeocin-resistens-genet med TTG-startkodonet. d2EGFP-signalet for uavhengige kolonier er vist på den vertikale aksen. Se Eksempel 9 for detaljer.

Figur 15. Resultater for seleksjonssystemet, i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelsen, i et oppskalert eksperiment (A), og sammenligning med seleksjonssystemet i samsvar med tidligere fagkunnskap ved avbenyttelse av en IRES (B). d2EGFP-signalet for uavhengige kolonier er vist på den vertikale aksen. Se Eksempel 10 for detaljer.

Figur 16. Resultater fra seleksjonssystemet med en multisistronisk transkripsjonsenhet, i samsvar med den foreliggende oppfinnelsen, ved avbenyttelse av blasticidin som selektabel markør. A. blasticidin-resistensgenet mutert til å inneholde et GTG-startkodon. B. blasticidin-resistensgenet mutert til å inneholde et TTG-startkodon. Blasticidin-resistensgenet har blitt videre mutert slik at man har fjernet alle interne ATG-sekvenser. d2EGFP-signalet for uavhengige kolonier er vist på den vertikale aksen. Se Eksempel 11 for detaljer.

Figur 17. Stabiliteten til ekspresjonen av flere kloner med en multisistronisk transkripsjonsenhet, i samsvar med den foreliggende oppfinnelsen (inklusive et zeocin med TTG-startkodon). Seleksjonstrykk (100 µg/ml zeocin) var til stede under hele eksperimentet. d2EGFP-signalet for uavhengige kolonier er vist på den vertikale aksen. Se Eksempel 12 for detaljer.

Figur 18. Som Figur 17, men zeocin-konsentrasjonen ble senket til 20 µg/ml etter etablering av klonene.

Figur 19. Som Figur 17, men zeocin var fraværende fra kulturmediet etter etablering av klonene.

Figur 20. Ekspresjon av et antistoff (anti-EpCAM) ved avbenyttelse av et seleksjonssystem med den multisistroniske transkripsjonsenheten, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen. Den tunge kjeden (HC) og den lette kjeden (LC) er polypeptidene av interesse i dette eksemplet. Hver av disse er til stede i separate transkripsjonsenheter, der begge befinner seg på et enkeltstående nukleinsyremolekyl i dette eksemplet. HC befinner seg etter zeocin-resistensgenet som koder for et selektabelt markørpolypeptid, mens LC befinner seg etter blasticidinresistensgenet som koder for et selektabelt markørpolypeptid. Begge resistensgenene har blitt mutert slik at de inneholder et ATG-startkodon i en ikke-optimal kontekst (“mutATG” i figuren, men inklusive en spacersekvens, og på denne måten generelt referert til i teksten som “ATGmut/space”). Hver av de multisistroniske transkripsjonsenhetene er under kontroll av en CMV-promotor. Konstruktene med STAR-sekvenser som indikert ble sammenlignet med konstrukter uten STAR-sekvenser. Antistoffnivåene som ble oppnådd da disse konstruktene ble introdusert inn i vertsceller, er angitt på den vertikale aksen i pg/celle/dag for forskjellige uavhengige kloner. Se Eksempel 13 for detaljer.

Figur 21. Som Figur 20, men begge seleksjonsmørkørgenene har blitt utstyrt med et GTG-startkodon. Se Eksempel 13 for detaljer.

Figur 22. Som Figur 20, men begge seleksjonsmørkørgenene har blitt utstyrt med et TTG-startkodon. Se Eksempel 13 for detaljer.

Figur 23. Stabiliteten av ekspresjonen i subkloner i fravær av seleksjonstrykk (etter etablering av kolonier under seleksjonstrykk, ble noen subklonet i medium som ikke inneholdt noe zeocin). Se Eksempel 12 for detaljer.

Figur 24. Kopitallavhengigheten for ekspresjonsnivåene til en variant av den foreliggende oppfinnelsen. Se Eksempel 12 for detaljer.

Figur 25. Som Figur 12, men for blasticidin-resistensgenet. Ingen av de 4 interne ATG-triplettene i dette genet er i ramme som koder for et metionin, og derfor ble degenerasjonen av (”overfloden i”) den genetiske koden benyttet for å mutere disse ATG-triplettene uten å mutere den interne aminosyrensekvensen til det kodete proteinet.

Figur 26. Kodende sekvens for villtype zeocin-resistensgenet (SEQ. ID. NO. 108). Uthevedt ATG-triplett kode for metionin. Den første uthevete ATG-tripletten er startkodonet.

Figur 27. Kodende sekvens for villtype blasticidin-resistensgenet (SEQ. ID. NO.

110). Uthevet ATG-triplettkode for metionin. Den første uthevede ATG-tripletten er startkodonet. Andre ATG-tripletter i sekvensen er understreket: disse interne ATG-triplettene koder ikke for metionin fordi de befinner i leserammen.

Figur 28. Kodende sekvens for villtype puromycin-resistensgenet (SEQ. ID. NO.

112). Uthevedt ATG-triplettkode for metionin. Den første uthevete ATG-tripletten er startkodonet.

Figur 29. Kodende sekvens for villtype mus DHFR-genet (SEQ. ID. NO. 114). Uthevet ATG-triplettkode for metionin. Den første uthevete ATG-tripletten er startkodonet. Andre ATG-tripletter i sekvensen er understreket: disse interne ATG-triplettene koder ikke for metionin fordi de befinner i leserammen.

Figur 30. Kodende sekvens for villtype hygromycin-resistensgenet (SEQ. ID. NO.

116). Uthevet ATG-triplettkode for metionin. Den første uthevete ATG-tripletten er startkodonet. Andre ATG-tripletter i sekvensen er understreket: disse interne ATG-triplettene koder ikke for metionin fordi de befinner i leserammen.

Figur 31. Kodende sekvens for villtype neomycin-resistensgenet (SEQ. ID. NO.

118). Uthevet ATG-triplettkode for metionin. Den første uthevete ATG-tripletten er startkodonet. Andre ATG-tripletter i sekvensen er understreket: disse interne ATG-triplettene koder ikke for metionin fordi de befinner i leserammen.

Figur 32. Kodende sekvens for villtype glutaminsyntetasegenet (SEQ. ID. NO. 120). Uthevet ATG-triplett kode for metionin. Den første uthevete ATG-tripletten er startkodonet. Andre ATG-tripletter i sekvensen er understreket: disse interne ATG-triplettene koder ikke for metionin fordi de befinner i leserammen.

Figur 33. Skjematisk representasjon av noen videre modifikasjoner av seleksjonsmarkørgenene for zeocin-resistensen med et GTG-startkodon, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, noe som tillater videre finjustering av seleksjonsstringensen. Se Eksempel 14 for detaljer.

Figur 34. Resultater med ekspresjonssystemer som inneholder de videre modifiserte seleksjonsmarkørgenene for zeocin-resistens. Se Eksempel 14 for detaljer. Punkter indikerer individuelle datapunkter; linjer indikerer gjennomsnittlige ekspresjonsnivåer; anvendte konstrukter (se også Figur 33) er indikert på den horisontale aksen (tillegget 7/67/7 ved enden av konstruktnavnet indikerer tilstedeværelsen av STAR-sekvensene 7 og 67 oppstrøms for promotoren og STAR7 nedstrøms for setet for terminering av transkripsjon), og er avbildet skjematisk over hver graf; vertikal akse indikerer d2EGFP-signalet.

Figur 35. Skjematisk representasjon av noen videre modifikasjoner av seleksjonsmarkørgenene for zeocin-resistensen med et TTG-startkodon, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, noe som tillater videre finjustering av seleksjonsstringensen. Se Eksempel 15 for detaljer.

Figur 36. Resultater med ekspresjonssystemer som inneholder de videre modifiserte seleksjonsmarkørgenene for zeocin-resistens. Se Eksempel 15 for detaljer. Punkter indikerer individuelle datapunkter; linjer indikerer gjennomsnittlige ekspresjonsnivåer; anvendte konstrukter er indikert på den horisontale aksen og er avbildet skjematisk over hver graf; vertikal akse indikerer d2EGFP-signalet.

Figur 37. Som Figur 12, men for puromycin-resistensgenet. Alle de tre interne ATG-triplettene koder for metionin (panel A), og er erstattet av CTG-sekvenser som koder for leucin (panel B). Se Eksempel 16 for detaljer.

Figur 38. Resultater oppnådd med ekspresjonskonstrukter som inneholder puromycin-resistensgenet med et TTG-startkodon og ingen interne ATG-kodoner. Se Eksempel 16 for detaljer. Punkter indikerer individuelle datapunktet; linjer indikerer gjennomsnittlige ekspresjonsnivåer; anvendte konstrukter er indikert på den horisontale aksen og skjematisk avbildet over grafen; vertikal akse angir d2EGFP-signalet.

Figur 39. Som Figur 12, men for neomycin-resistensgenet. Se Eksempel 17 for detaljer. A. Villtype neomycin-resistensgenet; ATG-sekvenser er indikert, ATG-tripletter som koder for metionin er angitt med Met over ATG-triplettene. B. Neomycin-resistensgenet uten ATG-sekvenser, og med et GTG-startkodon. C. Neomycin-resistensgenet uten ATG-sekvenser, og med et TTG-startkodon.

Figur 40. Som Figur 12, men for dhfr-genet. Se Eksempel 18 for detaljer. A. Villtype dhfr-genet; ATG-sekvenser er indikert, ATG-tripletter som koder for metionin er angitt med Met over ATG-triplettene. B. dhfr-genet uten ATG-sekvenser, og med et GTG-startkodon. C. Dhfr-genet uten ATG-sekvenser, og med et TTG-startkodon.

Figur 41. Resultater med ekspresjonskonstrukter (zeocin-selektabel markør), i henhold til den foreliggende oppfinnelsen i PER.C6-celler. Se Eksempel 20 for detaljer. Punkter indikerer individuelle datapunkter; linjer angir gjennomsnittlige nivåer; anvendte konstrukter er indikert på den horisontale aksen, og er skjematisk avbildet over grafen; vertikal akse indikerer d2EGFP-signalet.

Figur 42. Resultater med ekspresjonskonstrukter (blasticidin-selektabel markør), i henhold til den foreliggende oppfinnelsen i PER.C6-celler. Se Eksempel 20 for detaljer. Punkter indikerer individuelle datapunkter; linjer angir gjennomsnittlige nivåer; anvendte konstrukter er indikert på den horisontale aksen, og skjematisk avbildet over grafen; vertikal akse indikerer d2EGFP-signalet.

Figur 43. Resultater med ekspresjonskonstrukter, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, som videre omfatter en transkripsjonspasue (TRAP)-sekvens. Se Eksempel 21 for detaljer. Punkter indikerer individuelle datapunkter; linjer angir gjennomsnittlige nivåer; anvendte konstrukter er indikert på den horisontale aksen, og skjematisk avbildet over grafen; vertikal akse indikerer d2EGFP-signalet.

Figur. 44. Kopinummeravhengigheten av ekspresjonen av et antistoff ved avbenyttelse av transkripsjonsenheter, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen. Se Eksempel 22 for detaljer.

Figur. 45. Antistoffekspresjon fra kolonier som inneholder konstrukter, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, hvori kopitallet av ekspresjonskonstruktene blir amplifisert med metotreksat. Se Eksempel 23 for detaljer. Hvite stolper: seleksjon med zeocin og blasticidin; svarte stolper: seleksjon med zeocin, blasticidin og metotreksat (MTX). Antallet av testede kolonier er avbildet på den horisontale aksen.

Figur 46. Resultater med forskjellige promotere. Se Eksempel 24 for detaljer. Punkter indikerer individuelle datapunkter; linjer angir gjennomsnittlige nivåer; anvendte konstrukter er indikert på den horisontale aksen, og skjematisk avbildet over grafen; vertikal akse indikerer d2EGFP-signalet.

Figur 47. Resultater med forskjellige STAR-elementer. Se Eksempel 25 for detaljer. Punkter indikerer individuelle datapunkter; linjer angir gjennomsnittlige nivåer; anvendte konstrukter er indikert på den horisontale aksen, og skjematisk avbildet over grafen; vertikal akse indikerer d2EGFP-signalet.

Figur 48. Resultater med andre kromatinkontrollerende elementer. Se Eksempel 26 for detaljer. Punkter indikerer individuelle datapunkter; linjer angir gjennomsnittlige nivåer; anvendte konstrukter er indikert på den horisontale aksen og skjematisk avbildet over grafen (svarte triangler indikerer forskjellige testede kromatinkontrollerende elementer); vertikal akse indikerer d2EGFP-signalet.

Referanser

Boshart, M, Weber, F, Jahn, G, Dorsch-Hasler, K, Fleckenstein, B, and Schaffner, W. (1985) A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus Cell 41, 521-530.

Chung JH, Whiteley M, and Felsenfeld G. (1993) A 5’ element of the chicken beta-globin domain serves as an insulator in human erythroid cells and protects against position effect in Drosophila. Cell 74: 505-514.

Chung JH, Bell AC, Felsenfeld G. (1997). Characterization of the chicken beta-globin insulator. Proc Natl Acad Sci USA 94: 575-580.

Das, GC, Niyogi, SK, and Salzman, NP. (1985) SV40 promoters and their regulation Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 32, 217-236.

Dumas, P, Bergdoll, M., Cagnon, C and Masson JM. 1994. Crystal structure and site-directed mutagenesis of a bleomycin resistance protein and their significance for drug sequestering. EMBO J 13, 2483-2492.

Gill DR, Smyth SE, Goddard CA, Pringle IA, Higgins CF, Colledge WH, and Hyde SC. (2001) Increased persistence of lung gene expression using plasmids containing the ubiquitin C or elongation factor 1α promoter. Gene Therapy 8: 1539-1546.

Gossen M, and Bujard H. (1992) Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc Natl Acad Sci USA 89: 5547-5551.

Graham FO, Smiley J, Russell W and Nairn R. (1977). Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. J. Gen. Virol.

36, 59-72.

Huls GA, Heijnen IAFM, Cuomo ME, Koningsberger JC, Wiegman L, Boel E, van der Vuurst-de Vries A-R, Loyson SAJ, Helfrich W, van Berge Henegouwen GP, van Meijer M, de Kruif J, Logtenberg T. (1999). A recombinant, fully human monoclonal antibody with antitumor activity constructed from phage-displayed antibody fragments. Nat Biotechnol. 17, 276-281.

Jones D, Kroos N, Anema R, Van Montfort B, Vooys A, Van Der Kraats S, Van Der Helm E, Smits S, Schouten J, Brouwer K, Lagerwerf F, Van Berkel P, Opstelten D-J, Logtenberg T, Bout A (2003) High-level expression of recombinant IgG in the human cell line PER.C6. Biotechnol. Prog. 19: 163-168.

Kaufman, RJ. (2000) Overview of vector design for mammalian gene expression Mol Biotechnol 16, 151-160.

Kaufman, RJ, and Sharp, PA. (1982) Construction of a modular dihydrofolate reductase cDNA gene: analysis of signals utilized for efficient expression Mol Cell Biol 2, 1304-1319.

Kellum R, and Schedl P. (1991) A position-effect assay for boundaries of higher order chromosomal domains. Cell 64: 941-950.

Kim SJ, Kim Ns, Ryu CJ, Hong HJ, Lee GM. 1998. Characterization of chimeric antibody producing CHO cells in the course of dihydrofolate reductasemediated gene amplification and their stability in the absence of selective pressure. Biotechnol Bioeng 58: 73-84.

Kozak M. (1986) Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes. Cell 44: 283-292.

Kozak M. (1987) An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs. Nucleic Acids Res. 15: 8125-8148.

Kozak M. (1989) Context effects and inefficient initiation at non-AUG codons in eucaryotic cell-free translation systems. Mol Cell Biol. 9: 5073-5080.

Kozak M. (1990) Downstream secondary structure facilitates recognition of initiator codons by eukaryotic ribosomes. Proc Natl Acad Sci USA 87:8301-8305.

Kozak M. (1997) Recognition of AUG and alternative initiator codons is augmented by G in position 4 but is not generally affected by the nucleotides in positions 5 and 6.

EMBO J. 16: 2482-2492.

Kozak M. (2002) Pushing the limits of the scanning mechanism for initiation of translation. Gene 299: 1-34.

Kwaks TH, Barnett P, Hemrika W, Siersma T, Sewalt RG, Satijn DP, Brons JF, van Blokland R, Kwakman P, Kruckeberg AL, Kelder A, Otte AP. (2003) Identification of anti-repressor elements that confer high and stable protein production in mammalian cells. Nat Biotechnol 21, 553-558. Erratum in: Nat Biotechnol 21, 822 (2003).

Phi-Van L, Von Kreis JP, Ostertag W, and Strätling WH. (1990) The chicken lysozyme 5’ matrix attachment region increases transcription from a heterologous promoter in heterologous cells and dampens position effects on the expression of transfected genes. Mol. Cell. Biol. 10: 2302-2307.

McBurney, MW, Mai, T, Yang, X, and Jardine, K. (2002) Evidence for repeat-induced gene silencing in cultured Mammalian cells: inactivation of tandem repeats of transfected genes Exp Cell Res 274, 1-8.

Rees, S, Coote, J, Stables, J, Goodson, S, Harris, S, and Lee, MG. (1996) Bicistronic vector for the creation of stable mammalian cell lines that predisposes all antibiotic-resistant cells to express recombinant protein Biotechniques 20, 102-104, 106, 108-110.

Schorpp, M, Jager, R, Schellander, K, Schenkel, J, Wagner, EF, Weiher, H, and Angel, P. (1996) The human ubiquitin C promoter directs high ubiquitous expression of transgenes in mice Nucleic Acids Res 24, 1787-8.

Stief A, Winter DM, Stratling WH, Sippel AE (1989) A nuclear DNA attachment element mediates elevated and position-independent gene activity. Nature 341: 343-345.

Van der Vlag, J, den Blaauwen, JL, Sewalt, RG, van Driel, R, and Otte, AP. (2000) Transcriptional repression mediated by polycomb group proteins and other chromatin-associated repressors is selectively blocked by insulators J Biol Chem 275, 697-704.

West AG, Gaszner M, Felsenfeld G (2002) Insulators: many functions, many mechanisms. Genes Dev. 16: 271-288.

Whitelaw, E, Sutherland, H, Kearns, M, Morgan, H, Weaving, L, and Garrick, D. (2001) Epigenetic effects on transgene expression Methods Mol Biol 158, 351-68.

Williams S, Mustoe T, Mulcahy T, Griffiths M, Simpson D, Antoniou M, Ivine A, Mountain A, Crombie R (2005) CpG-island fragments from the HNRPA2B1/CBX3 genomic locus reduce silencing and enhance transgene expression from the hCMV promoter/enhancer in mammalian cells. BMC Biotechnol.

5:17.

Claims

Patentkrav

1. DNA-molekyl omfattende en multisistronisk transkripsjonsenhet som koder for i) et selektabelt markørpolypeptid som er funksjonelt i en eukaryot vertscelle, og for ii) et polypeptid av interesse,

der polypeptidet av interesse har en translasjonsinitieringssekvens som er separat fra den for det selektable markørpolypeptidet,

k a r a k t e r i s e r t v e d at

a) den kodende sekvensen for polypeptidet av interesse befinner seg nedstrøms for den kodende sekvensen for den selektable markøren i nevnte multisistroniske transkripsjonsenhet, og

b) sekvensen som koder for det selekterbare markørpolypeptid, har ingen ATG-sekvens i den kodende kjede etter startkodonet for det selekterbare markørpolypeptid opp til startkodonet for polypeptidet av interesse, og

hvori sekvensen for translasjonsstart i den kodende kjeden for det selektable markørpolypepetidet er valgt fra gruppen som består av:

a) en sekvens for translasjonsstart omfattende en mutasjon i nukleotidene i posisjonene -3 til -1 og/eller 4 i konsensussekvensen RCCATGG, hvor R er A eller G, og hvor A av ATG-startkodonet er nt 1;

b) et GTG-startkodon;

c) et TTG-startkodon;

d) et CTG-startkodon;

e) et ATT-startkodon; og

f) et ACG-startkodon.

2. DNA-molekyl ifølge krav 1, hvori den resulterende translasjonsstartsekvensen i den kodende kjede for det selektable markørpolypeptidet omfatter et GTG-startkodon eller et TTG-startkodon.

3. DNA-molekyl, ifølge et hvilket som helst av de foregående patentkravene, hvori det selektable markørpolypeptid gir resistens overfor dødelige eller veksthemmende effekter av et selekterende agens, f.eks. et antibiotikum.

4. DNA-molekyl ifølge krav 3, hvori nevnte selekterende agens er valgt fra gruppen som består av: zeocin, puromycin, blasticidin, hygromycin, neomycin, methotrexat, metionin-sulfoximin og kanamycin.

5. DNA-molekyl ifølge krav 4, hvori det selekterende agenset er zeocin.

6. DNA-molekyl ifølge et hvilket som helst av de foregående patentkravene, hvori det selektable markørpolypeptidet videre omfatter en mutasjon som reduserer aktiviteten til det selektable markørpolypeptidet sammenlignet med dets villtypemotstykke, f.eks. hvori det selekterbare markørpolypeptidet er et zeocinresistenspolypeptid hvori prolin i posisjon 9 er forandret til en annen aminosyre.

7. Ekspresjonskassett omfattende et DNA-molekyl, i overensstemmelse med et hvilket som helst av de foregående patentkravene, hvori nevnte ekspresjonskassett videre består av en promotor oppstrøms for nevnte multisistroniske ekspresjonsenhet og en transkripsjons termineringssekvens nedstrøms for den multisistroniske ekspresjonsenhet.

8. Ekspresjonskassett ifølge krav 7, som videre består av minst ett kontrollelement for kromatin, valgt fra gruppen som består av en matrix- eller en stillas-(scaffold) tilknyttende region (MAR/SAR), en isolatorsekvens, et universelt kromatinåpnende element (UCOE), og en anti-repressor- (STAR) sekvens.

9. Ekspresjonskassett ifølge krav 8, hvori nevnte element for kromatinkontroll er en anti-repressorsekvens valgt fra gruppen bestående av:

a) en hvilken som helst av SEQ. ID. NO. 1 gjennom SEQ. ID. NO. 66;

b) fragmenter av en hvilken som helst av SEQ. ID. NO. 1 gjennom SEQ. ID. NO. 66, hvori nevnte fragmenter oppviser anti-repressoraktivitet;

c) sekvenser som er minst 70% identiske i nukelotidsekvens med a) eller b) hvori nevnte sekvenser oppviser anti-repressoraktivitet; og

d) komplementet til en hvilken som helst av a) til og med c).

10. Ekspresjonskassett ifølge ethvert av kravene 7 - 9, hvor polypeptidet av interesse er en del av et multimert protein, f.eks. hvor polypeptidet av interesse er en immunoglobulin lett kjede eller en immunoglobulin tung kjede.

11. DNA-molekyl omfattende en sekvens som koder for et funksjonelt selektabelt markørpolypeptid som er i stand til å bli selektert for i en eukaryot vertscelle,

k a r a k t e r i s e r t v e d at nevnte DNA-molekyl:

i) har en sekvens for translasjonsstart i den kodende kjeden for det selektable markørpolypepetidet valgt fra gruppen som består av:

b) et GTG-startkodon;

c) et TTG-startkodon;

d) et CTG-startkodon;

e) et ATT-startkodon; og

f) et ACG-startkodon, etterfulgt av en ellers funksjonell selekterbar markørkodesekvens, og

ii) i den kodende tråden av sekvensen som definerer det selektable markørpolypeptidet nedstrøms for det ikke-optimale startkodonet og opp til startkodonet er fri for ATG-sekvenser.

12. Vertscelle omfattende et DNA-molekyl eller en ekspresjonskassett i overensstemmelse med et hvilket som helst av de foregående patentkravene, hvor vertscelle fortrinnsvis er en pattedyrvertscelle, f.eks. en kinesisk hamster ovariecelle (CHO)

13. Fremgangsmåte for å generere en vertscelle som uttrykker et polypeptid av interesse, der fremgangsmåten omfatter trinnene:

a) introduksjon inn i et antall forløperceller av et DNA-molekyl, i overensstemmelse med et hvilket som helt av patentkravene 1-6 eller en ekspresjonskassett, i overensstemmelse med et hvilket som helst av patentkravene 7-9, og b) dyrking av genererte celler under betingelser som selekterer for ekspresjon av det selektable markørpolypeptidet, og

c) seleksjon av minst en vertscelle som produserer polypeptidet av interesse.

14. Fremgangsmåte ved fremstilling av et polypeptid av interesse omfattende dyrking av en vertscelle, der nevnte vertscelle består av en ekspresjonskassett, i overensstemmelse med et hvilket som helst av patentkravene 7-9, og som uttrykker polypeptidet av interesse fra ekspresjonskassetten, samt eventuelt å isolere polypeptidet av interesse.